特許 6551823 ウイルスＤＮＡの宿主ゲノムへの組み込み部位を決定する方法及びその応用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6551823

(24)【登録日】2019年7月12日

(45)【発行日】2019年7月31日

(54)【発明の名称】ウイルスＤＮＡの宿主ゲノムへの組み込み部位を決定する方法及びその応用

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/6806 20180101AFI20190722BHJP

   C40B 40/06 20060101ALI20190722BHJP

   G01N 33/53 20060101ALI20190722BHJP

   G01N 33/569 20060101ALI20190722BHJP

   C12N 15/09 20060101ALN20190722BHJP

【ＦＩ】

   C12Q1/6806 ZZNA

   C40B40/06

   G01N33/53 M

   G01N33/569 G

   !C12N15/09 Z

【請求項の数】2

【全頁数】14

(21)【出願番号】特願2014-254873(P2014-254873)

(22)【出願日】2014年12月17日

(65)【公開番号】特開2015-133957(P2015-133957A)

(43)【公開日】2015年7月27日

【審査請求日】2017年12月8日

(31)【優先権主張番号】特願2013-261438(P2013-261438)

(32)【優先日】2013年12月18日

(33)【優先権主張国】JP

(73)【特許権者】

【識別番号】596165589

【氏名又は名称】学校法人 聖マリアンナ医科大学

(74)【代理人】

【識別番号】100088155

【弁理士】

【氏名又は名称】長谷川 芳樹

(74)【代理人】

【識別番号】100128381

【弁理士】

【氏名又は名称】清水 義憲

(74)【代理人】

【識別番号】100126653

【弁理士】

【氏名又は名称】木元 克輔

(72)【発明者】

【氏名】伊東 文生

(72)【発明者】

【氏名】渡邊 嘉行

【審査官】 西村 亜希子

(56)【参考文献】

【文献】 Genomics，２０１３年 ７月１５日，Vol.102，pp.338-344

【文献】 Epigenetics，２００８年，Vol.3，pp.125-133

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｑ １／

Ｃ１２Ｎ １５／

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ウイルス核酸の宿主ゲノムへの組み込み部位に対応する、非組み込みアレルにおけるＤＮＡメチル化頻度を測定する方法であって、
ａ）ウイルス核酸とハイブリダイズするプライマーからなるプライマーライブラリーを準備する工程であって、プライマーライブラリーはウイルスの全核酸領域をカバーするものであり、プライマーは標識されている、工程
ｂ）宿主ゲノムを断片化する工程
ｃ）宿主ゲノムの断片化ＤＮＡを増幅する工程
ｄ）宿主ゲノムの断片化ＤＮＡとプライマーをハイブリダイズする工程
ｅ）宿主ゲノムの断片化ＤＮＡ及びプライマーのハイブリッドを回収する工程
ｆ）回収したハイブリッドからプライマーを除去する工程
ｇ）プライマーが除去された宿主ゲノムの断片化ＤＮＡの配列決定を行い、ウイルス核酸の宿主ゲノムへの組み込み部位を決定する工程
ｈ）ウイルス核酸の宿主ゲノムへの組み込み部位に対応する、非組み込みアレルにおいてＤＮＡメチル化頻度を測定する工程
を含む方法。

【請求項2】

ウイルスに感染した患者におけるウイルス関連疾患の発症のリスク又は重症化のリスクの指標を得る方法であって、
ａ）ウイルス核酸とハイブリダイズするプライマーからなるプライマーライブラリーを準備する工程であって、プライマーライブラリーはウイルスの全ＤＮＡ領域をカバーするものであり、プライマーは標識されている、工程
ｂ）患者のゲノムを断片化する工程
ｃ）患者のゲノムの断片化ＤＮＡを増幅する工程
ｄ）患者のゲノムの断片化ＤＮＡとプライマーをハイブリダイズする工程
ｅ）患者のゲノムの断片化ＤＮＡ及びプライマーのハイブリッドを回収する工程
ｆ）回収したハイブリッドからプライマーを除去する工程
ｇ）プライマーが除去された患者のゲノムの断片化ＤＮＡの配列決定を行い、ウイルス核酸の患者のゲノムへの組み込み部位を決定する工程
ｈ）ウイルス核酸の患者のゲノムへの組み込み部位に対応する、非組み込みアレルにおいてＤＮＡメチル化頻度を測定する工程
を含み、
ＤＮＡメチル化頻度をウイルス関連疾患の発症のリスク又は重症化のリスクの指標とする、
方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ウイルスＤＮＡの宿主ゲノムへの組み込み部位を決定する方法及びその応用に関する。

【背景技術】

【0002】

Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）は、世界中で２０億人に感染し、そのうち４億人は慢性感染となり、活動性肝炎、肝硬変及び肝細胞癌（ＨＣＣ）のリスクが高い。慢性肝疾患を伴うＨＢＶ感染者は、１００倍高いＨＣＣ発症のリスクを有し、世界で３番目の癌死の原因となっている。ＨＢＶ関連ＨＣＣケースの９０％は、ヒトゲノムへのＨＢＶのＤＮＡの組み込みが認められる。ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）は、子宮頸癌及び尖圭コンジローマの原因ウイルスとして知られている。全世界で年間３億人に対する子宮頸部への感染が認められ、子宮頸癌患者のほぼ１００％からＨＰＶは検出される。子宮頸癌の発症についても、ヒトゲノムへのＨＰＶのＤＮＡの組み込みが原因であることが知られている。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0003】

【非特許文献1】Guerrero et al., "The roleof hepatitis B virus integrations in the pathogenesis of human hepatocellularcarcinoma.", Journal of Hepatology, 42(5), 760-77, 2005.

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0004】

しかしながら、ＨＢＶ及びＨＰＶなどのウイルスのＤＮＡの組み込みはランダムに生じるものであるため、ウイルスのヒトゲノム組み込み部位による発癌への影響に関しては未だ不明である。断片化したヒトゲノムをシークエンス解析し、ウイルスＤＮＡの組み込み部位を特定しようとした場合、大量の解析不能配列の中に、組み込まれたウイルス配列が埋もれてしまい、ウイルスのヒトゲノム組み込み部位を特定することができなかった。

【課題を解決するための手段】

【0005】

本発明者らは、ＨＢＶの全ジェノタイプの配列をもとにプライマーライブラリーを作成し、ＨＢＶのＤＮＡの組み込み部位に関する研究を行った結果、ＨＢＶのＤＮＡの組み込みは確かにランダムに生じるものであるが、ヒトゲノムにおける組み込み部位の相違によってＨＢＶが関連する疾患の重篤度が異なるという知見を得た。より具体的には、メチル化頻度の高いヒトゲノムの領域にＨＢＶのＤＮＡが組み込まれた場合、組み込まれたＨＢＶのＤＮＡのメチル化頻度も高くなり、それによってＨＢＶのＤＮＡの発現が抑制され、ＨＢＶが関連する疾患の重篤度が低かった。一方、メチル化頻度の低いヒトゲノムの領域にＨＢＶのＤＮＡが組み込まれた場合、組み込まれたＨＢＶのＤＮＡのメチル化頻度も低くなり、それによってＨＢＶのＤＮＡの発現が十分抑制されず、ＨＢＶが関連する疾患の重篤度が高かった。また、本発明者らは、ＨＰＶについても同様の方法により、ＨＰＶのＤＮＡの組み込み部位を特定できることを確認した。本発明者らは、この知見をウイルス関連疾患の診断に利用できると考え、本発明を完成するに至った。

【0006】

第一に、本発明は、ウイルス核酸の宿主ゲノムへの組み込み部位を決定する方法を提供する。先に述べたように、ウイルス核酸の宿主ゲノムへの組み込みはランダムに生じるため、診断に先立って宿主ごとの組み込み位置を決定する必要がある。かかる方法は、
ａ）ウイルス核酸とハイブリダイズするプライマーからなるプライマーライブラリーを準備する工程であって、プライマーライブラリーはウイルスの全核酸領域をカバーするものであり、プライマーは標識されている、工程
ｂ）宿主ゲノムを断片化する工程
ｃ）宿主ゲノムの断片化ＤＮＡを増幅する工程
ｄ）宿主ゲノムの断片化ＤＮＡとプライマーをハイブリダイズする工程
ｅ）宿主ゲノムの断片化ＤＮＡ及びプライマーのハイブリッドを回収する工程
ｆ）回収したハイブリッドからプライマーを除去する工程
ｇ）プライマーが除去された宿主ゲノムの断片化ＤＮＡの配列決定を行い、ウイルス核酸の宿主ゲノムへの組み込み部位を決定する工程
を含む。

【0007】

次に、本発明は、ウイルス核酸の宿主ゲノムへの組み込み部位に対応する、非組み込みアレルにおけるＤＮＡメチル化頻度を測定する方法を提供する。ウイルス核酸が組み込まれた宿主ゲノムの領域のＤＮＡメチル化頻度を測定することで、組み込まれたウイルス核酸がＤＮＡメチル化を受けやすいかどうかを判断することができる。かかる方法は、
ａ）ウイルス核酸とハイブリダイズするプライマーからなるプライマーライブラリーを準備する工程であって、プライマーライブラリーはウイルスの全核酸領域をカバーするものであり、プライマーは標識されている、工程
ｂ）宿主ゲノムを断片化する工程
ｃ）宿主ゲノムの断片化ＤＮＡを増幅する工程
ｄ）宿主ゲノムの断片化ＤＮＡとプライマーをハイブリダイズする工程
ｅ）宿主ゲノムの断片化ＤＮＡ及びプライマーのハイブリッドを回収する工程
ｆ）回収したハイブリッドからプライマーを除去する工程
ｇ）プライマーが除去された宿主ゲノムの断片化ＤＮＡの配列決定を行い、ウイルス核酸の宿主ゲノムへの組み込み部位を決定する工程
ｈ）ウイルス核酸の宿主ゲノムへの組み込み部位に対応する、非組み込みアレルにおいてＤＮＡメチル化頻度を測定する工程
を含む。

【0008】

さらに、本発明は、ウイルスに感染した患者におけるウイルス関連疾患の発症又は重症化のリスクの指標を得る方法を提供する。この指標を利用して、ウイルス関連疾患の診断を行うことができる。かかる方法は、
ａ）ウイルス核酸とハイブリダイズするプライマーからなるプライマーライブラリーを準備する工程であって、プライマーライブラリーはウイルスの全ＤＮＡ領域をカバーするものであり、プライマーは標識されている、工程
ｂ）患者のゲノムを断片化する工程
ｃ）患者のゲノムの断片化ＤＮＡを増幅する工程
ｄ）患者のゲノムの断片化ＤＮＡとプライマーをハイブリダイズする工程
ｅ）患者のゲノムの断片化ＤＮＡ及びプライマーのハイブリッドを回収する工程
ｆ）回収したハイブリッドからプライマーを除去する工程
ｇ）プライマーが除去された患者のゲノムの断片化ＤＮＡの配列決定を行い、ウイルス核酸の患者のゲノムへの組み込み部位を決定する工程
ｈ）ウイルス核酸の患者のゲノムへの組み込み部位に対応する、非組み込みアレルにおいてＤＮＡメチル化頻度を測定する工程
を含み、
ＤＮＡメチル化頻度をウイルス関連疾患の発症又は重症化のリスクの指標とする。

【0009】

別の態様では、本発明は、上記方法に利用可能なプライマーライブラリーを提供する。かかるプライマーライブラリーは、ウイルス核酸とハイブリダイズするプライマーからなり、プライマーライブラリーはウイルスの全核酸領域をカバーするものであり、プライマーは標識されている。

【発明の効果】

【0010】

本発明にかかるウイルスＤＮＡの宿主ゲノムへの組み込み部位を決定する方法は、ウイルス関連疾患の診断方法として利用することができる。

【図面の簡単な説明】

【0011】

【図1】ＨＢＶのＸ遺伝子プロモーターのＣｐＧアイランドにおけるＤＮＡメチル化頻度の結果を表す図である。１〜１０は患者番号を表す。Ｔは腫瘍組織試料を、Ｎは近接非腫瘍組織試料を表す。

【図2】組み込まれた染色体における、ＨＢＶのＸ遺伝子プロモーターのＣｐＧアイランドにおけるＤＮＡメチル化頻度の結果を表す図である。Ｃｈｒ１、Ｃｈｒ２、Ｃｈｒ４、Ｃｈｒ６、Ｃｈｒ８及びＣｈｒ１２は、それぞれ第１、２、４、６、８及び１２染色体を表す。円グラフの下の数字はメチル化頻度（％）を表す。

【図3】ＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞株における、ＨＢＶのＤＮＡのヒトゲノムへの組み込み部位を特定した結果の一例を示す図である。

【図4】ＨＢＶ−ＶＣＣの臨床試料における、ＨＢＶのＤＮＡのヒトゲノムへの組み込み部位を特定した結果の一例を示す図である。

【図5】ＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞株における、ＨＢＶのＤＮＡのヒトゲノムへの組み込み部位におけるメチル化頻度を測定した結果の一例を示す図である。

【図6】ＨＢＶ−ＨＣＣの臨床組織における、ＨＢＶのＤＮＡのヒトゲノムへの組み込み部位におけるメチル化頻度を測定した結果の一例を示す図である。

【図7】各種子宮頸癌細胞株における、ＨＰＶのＤＮＡのヒトゲノムへの組み込み部位を特定した結果の一例を示す図である。Ｃｈｒ．８ｑ２４．２１の表記は、ＨＰＶのＤＮＡが組み込まれたヒト染色体の位置を表す。ＨＰＶ−１８：５７３６及びＨｕｍａｎ Ｃｈｒ．８：１２８２３０６３２の表記は、それぞれ組み込まれた部位におけるＨＰＶ−１８のヌクレオチド位置及びヒト第８染色体のヌクレオチド位置を表す。他の表記も同様である。

【発明を実施するための形態】

【0012】

本発明の対象となるウイルスは、ＤＮＡウイルスでもＲＮＡウイルスでもよい。ＤＮＡウイルスとしては、例えば、ＨＢＶ、ＨＰＶ、ヒトヘルペスウイルス（ＨＨＶ）が挙げられ、ＲＮＡウイルスとしては、例えば、ヒトＴリンパ好性ウイルス（ＨＴＬＶ、特にＨＴＬＶ−１）及びヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）などのレトロウイルスやＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）が挙げられる。

【0013】

本発明の対象となる宿主及び患者は、ウイルスが感染してウイルス核酸がゲノムに組み込まれる限り特に制限されない。宿主及び患者は、哺乳動物であることが好ましく、ヒトであることが最も好ましい。宿主及び患者はイヌ及びネコなどのペットでもよく、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ及びニワトリなどの家畜でもよい。

【0014】

本発明の一実施形態において、ウイルス核酸の宿主ゲノムへの組み込み部位を決定する方法は、
ａ）ウイルス核酸とハイブリダイズするプライマーからなるプライマーライブラリーを準備する工程であって、プライマーライブラリーはウイルスの全核酸領域をカバーするものであり、プライマーは標識されている、工程
ｂ）宿主ゲノムを断片化する工程
ｃ）宿主ゲノムの断片化ＤＮＡを増幅する工程
ｄ）宿主ゲノムの断片化ＤＮＡとプライマーをハイブリダイズする工程
ｅ）宿主ゲノムの断片化ＤＮＡ及びプライマーのハイブリッドを回収する工程
ｆ）回収したハイブリッドからプライマーを除去する工程
ｇ）プライマーが除去された宿主ゲノムの断片化ＤＮＡの配列決定を行い、ウイルス核酸の宿主ゲノムへの組み込み部位を決定する工程
を含む。

【0015】

工程ａでは、ウイルスのゲノム配列に基づいて、宿主に組み込まれたウイルス核酸を釣るためのプライマー（ベイト）を設計及び合成する。各プライマーは１００〜１４０ｍｅｒ、好ましくは１１０〜１３０ｍｅｒ、最も好ましくは約１２０ｍｅｒの核酸である。核酸はＤＮＡでもＲＮＡでもよい。各プライマーは標識されており、この標識により後の工程でウイルス核酸が組み込まれた宿主ゲノムの断片化ＤＮＡを回収することが可能となる。標識は、例えばビオチンを用いることが可能である。プライマーの集合体であるプライマーライブラリーが、ウイルスの全核酸領域をカバーできるように、各プライマーを設計する。このようにすることで、組み込み部位を確実に決定できるようにすることが可能となる。ウイルスが複数の遺伝子型を有する場合、すべての遺伝子型の核酸領域をカバーできるようにプライマーを設計してもよい。例えば、ＨＢＶは、遺伝子型Ａ〜Ｊまで存在することが知られており（具体的には、表１に記載の遺伝子型が知られている）、これらすべての遺伝子型をカバーできるようなプライマーライブラリーを準備することができる。プライマーの設計に際しては、ウイルスの遺伝子データベースに開示されている遺伝子配列情報をもとに、市販のソフトウェアを利用することが可能である。

【0016】

【表1】

【0017】

また、ウイルスが複数の遺伝子型を有する場合、一又は複数の所定の遺伝子型の核酸領域をカバーできるようにプライマーを設計してもよい。所定の遺伝子型は、地域、人種、疾患の種類、疾患のリスクの高さなどを基準に、当業者が適宜選択することが可能である。例えば、日本では、Ａ，Ｂ及びＣ型のＨＢＶの感染が多いことが知られているため、日本でのＨＢＶの診断を目的とする場合は、Ａ，Ｂ及びＣ型のＨＢＶの核酸領域をカバーできるプライマーを設計してよい。また、ＨＰＶのうち１６，１８，３１，３３，３５，３９，４５，５１，５５，５６，５８，５９，６６、６８型などが高リスクであることが知られているため、ＨＰＶの高リスクの患者を診断する目的の場合は、これらの型のＨＰＶの核酸領域をカバーできるプライマーを設計してよい。さらに、子宮頸癌は主として１６及び１８型のＨＰＶが原因であることが知られているため、子宮頸癌の診断を目的とする場合は、１６及び１８型のＨＰＶの核酸領域をカバーできるプライマーを設計してよい。また、尖圭コンジロームは主として６及び１１型のＨＰＶが原因であることが知られているため、尖圭コンジロームの診断を目的とする場合は、６及び１１型のＨＰＶの核酸領域をカバーできるプライマーを設計してよい。

【0018】

工程ｂでは、宿主から採取した試料からゲノムを適切な長さに切断し、配列決定を行いやすくする。断片化は、例えば、超音波処理、制限酵素処理などを利用することが可能である。１００〜１０００ｂｐの長さのＤＮＡ断片とすることが好ましい。

【0019】

工程ｃでは、工程ｂで得られた宿主ゲノムの断片化ＤＮＡを増幅する。ＰＣＲなどの周知の核酸増幅技術を利用することが可能である。

【0020】

工程ｄでは、工程ｃで得られた増幅後の宿主ゲノムの断片化ＤＮＡと工程ａで準備したプライマーライブラリーを混ぜることで、両者のハイブリッド形成を行う。ハイブリダイズの条件は、Green et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, FourthEdition", Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2012等を参照の上、当業者が適宜設定することが可能である。

【0021】

工程ｅでは、工程ｄで得たハイブリッドを回収し、ハイブリッド形成しなかった宿主ゲノムの断片化ＤＮＡを除去する。例えば、プライマーがビオチン標識されている場合、ストレプトアビジンが結合した磁性ビーズを混ぜ、磁力を利用して磁性ビーズを回収することで、ハイブリッドを選択的に回収することが可能である。

【0022】

工程ｆでは、工程ｅで回収したハイブリッドからプライマーを除去し、ウイルス核酸が組み込まれた宿主ゲノムの断片化ＤＮＡを得る。ハイブリッド形成が生じない条件下で、磁力を利用して磁性ビーズを回収することで、ビオチン標識されたプライマーのみを除去することが可能である。

【0023】

工程ｇでは、工程ｆで得たウイルス核酸が組み込まれた宿主ゲノムの断片化ＤＮＡの配列決定を行い、ゲノムアセンブリを行うことで、ウイルス核酸の宿主ゲノムへの組み込み部位を決定する。

【0024】

かかる方法は、Ａｇｉｌｅｎｔ’ｓ ＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ Ｔａｒｇｅｔ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ Ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）を利用して行うことも可能である。

【0025】

本発明の一実施形態において、ウイルス核酸の宿主ゲノムへの組み込み部位に対応する、非組み込みアレルにおけるＤＮＡメチル化頻度を測定する方法は、
ａ）ウイルス核酸とハイブリダイズするプライマーからなるプライマーライブラリーを準備する工程であって、プライマーライブラリーはウイルスの全核酸領域をカバーするものであり、プライマーは標識されている、工程
ｂ）宿主ゲノムを断片化する工程
ｃ）宿主ゲノムの断片化ＤＮＡを増幅する工程
ｄ）宿主ゲノムの断片化ＤＮＡとプライマーをハイブリダイズする工程
ｅ）宿主ゲノムの断片化ＤＮＡ及びプライマーのハイブリッドを回収する工程
ｆ）回収したハイブリッドからプライマーを除去する工程
ｇ）プライマーが除去された宿主ゲノムの断片化ＤＮＡの配列決定を行い、ウイルス核酸の宿主ゲノムへの組み込み部位を決定する工程
ｈ）ウイルス核酸の宿主ゲノムへの組み込み部位に対応する、非組み込みアレルにおいてＤＮＡメチル化頻度を測定する工程
を含む。

【0026】

工程ａ〜工程ｇは、ウイルス核酸の宿主ゲノムへの組み込み部位を決定する方法で説明した通りである。

【0027】

工程ｈは、工程ｇで決定されたウイルス核酸の宿主ゲノムへの組み込み部位に対応する、ウイルス核酸の組み込みが生じていないアレルにおいてＤＮＡメチル化頻度を測定する。この測定には、重亜硫酸塩処理−パイロシーケンス法とアレル特異的ＰＣＲとを組み合わせたアレル特異的ＤＮＡメチル化分析を利用することが可能である。

【0028】

本発明の一実施形態において、ウイルスに感染した患者におけるウイルス関連疾患の発症又は重症化のリスクの指標を得る方法は、
ａ）ウイルス核酸とハイブリダイズするプライマーからなるプライマーライブラリーを準備する工程であって、プライマーライブラリーはウイルスの全ＤＮＡ領域をカバーするものであり、プライマーは標識されている、工程
ｂ）患者のゲノムを断片化する工程
ｃ）患者のゲノムの断片化ＤＮＡを増幅する工程
ｄ）患者のゲノムの断片化ＤＮＡとプライマーをハイブリダイズする工程
ｅ）患者のゲノムの断片化ＤＮＡ及びプライマーのハイブリッドを回収する工程
ｆ）回収したハイブリッドからプライマーを除去する工程
ｇ）プライマーが除去された患者のゲノムの断片化ＤＮＡの配列決定を行い、ウイルス核酸の患者のゲノムへの組み込み部位を決定する工程
ｈ）ウイルス核酸の患者のゲノムへの組み込み部位に対応する、非組み込みアレルにおいてＤＮＡメチル化頻度を測定する工程
を含み、
ＤＮＡメチル化頻度をウイルス関連疾患の発症又は重症化のリスクの指標とする。

【0029】

工程ａ〜工程ｈは、宿主を患者に置き換えた点以外は、ウイルス核酸の宿主ゲノムへの組み込み部位に対応する、非組み込みアレルにおけるＤＮＡメチル化頻度を測定する方法で説明した通りである。

【0030】

非組み込みアレルにおけるＤＮＡメチル化頻度を測定することで、組み込まれたウイルス核酸がＤＮＡメチル化を受けやすいか否かを予測することが可能となり、組み込まれたウイルス核酸が発現し易いか否か、ひいてはウイルス関連疾患の発症又は重症化につながるか否かを予測することが可能となる。ＤＮＡメチル化頻度の高い領域に組み込まれたウイルス核酸は、その後ＤＮＡメチル化を受けやすくなり、ウイルス核酸の発現が抑制されることとなり、ウイルス関連疾患の発症又は重症化のリスクが低いと判断できる。逆に、ＤＮＡメチル化頻度の低い領域にウイルス核酸が組み込まれると、ウイルス関連疾患の発症又は重症化のリスクが高いと判断できる。

【0031】

ここで、ウイルス関連疾患とは、ウイルスの種類に応じて異なる。例えば、ウイルスがＨＢＶ及びＨＣＶの場合は、代表的な疾患は肝炎、肝硬変及び肝細胞癌であり、ウイルスがＨＰＶの場合は、代表的な疾患は尖圭コンジローマ及び子宮頚癌であり、ウイルスがＨＴＬＶの場合は、代表的な疾患は成人Ｔ細胞白血病であり、ウイルスがＨＩＶの場合は、代表的な疾患は後天性免疫不全症候群であり、ウイルスがＨＨＶ６の場合は、代表的な疾患は突発性発疹である。

【実施例】

【0032】

実施例１：ＨＢＶ−ＨＣＣ組織における腫瘍関連遺伝子のＣｐＧアイランドのＤＮＡメチル化頻度の測定
メチル化ＣｐＧアイランド（ＣＧＩ）増幅マイクロアレイ（ＭＣＡＭ）分析を行って、ＨＢＶ抗原陽性のヒト肝細胞癌由来であるＰＬＣ／ＰＲＦ／５（別名Ａｌｅｘａｎｄｅｒ）細胞株及び一次ＨＣＣ試料（ＨＢＶ陽性がｎ＝４、ＨＣＶ陽性がｎ＝５）におけるメチル化遺伝子の選別を行った。健常ボランティアの末梢血リンパ球（ＰＢＬ）混合物又は近接非腫瘍試料のＣＧＩのＤＮＡメチル化状態と比較して、ＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞株及びＨＢＶ−ＨＣＣ試料では、顕著なＤＮＡメチル化の頻度は少なかった。重亜硫酸塩処理−パイロシーケンス法でも、ＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞株及びＨＢＶ−ＨＣＣ試料において、候補遺伝子のメチル化頻度は高くなかった。

【0033】

これらの結果は、腫瘍関連遺伝子のプロモーターＣＧＩは、ＨＣＶ−ＨＣＣと比較して、ＨＢＶ−ＨＣＣでは通常メチル化していないことを示唆している。

【0034】

実施例２：ＨＢＶのＸ遺伝子プロモーターにおけるＤＮＡメチル化
ＨＢＶのＸ遺伝子プロモーターのＤＮＡメチル化レベルを、重亜硫酸塩処理−パイロシーケンス法により、１６のＨＢＶ−ＨＣＣ試料、１５の近接非腫瘍試料及びＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞株について分析した。結果を図１に示す。ほとんどのＨＢＶゲノムにおいて、前がん病変よりもメチル化しているものの、非メチル化状態のＨＢ−ＸをコードするＨＢＶ遺伝子を保有していた。

【0035】

さらに、組み込まれた染色体に基づいて、Ｘ遺伝子のＤＮＡメチル化レベルを調べた。結果を図２に示す。驚いたことに、組み込まれたＸ遺伝子のＤＮＡメチル化レベルは、組み込まれた染色体によって異なっていた。これらの結果は、組み込み部位に依存してＨＢＶのメチル化の広がりに関して何らかの規則があることを示唆している。

【0036】

Ｘ遺伝子プロモーターのメチル化レベルとＬＩＮＥ−１及びＡｌｕリピートのメチル化レベルとの関係についても調べたが、両者には何の関係も見出せなかった。

【0037】

実施例３：ＨＢＶ組み込みのＦＩＳＨ分析
ＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞株にＨＢＶが存在することを確かめるために、蛍光インサイチューハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を行った。ＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞株において、ＨＢＶ配列がヒトゲノムに組み込まれていることを確認した。

【0038】

実施例４：Ａｌｕ−ＰＣＲ及びＮＧＳによるＨＢＶ ＤＮＡ組み込み部位配列の分析
Ａｌｕ−ＰＣＲにより、ＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞株におけるＨＢＶ ＤＮＡ組み込み部位の分析を行った。しかしながら、一つのＨＢＶ ＤＮＡ組み込み部位配列の増幅しかできなかった。そこで、ＨＢＶ ＤＮＡ組み込み部位配列のための、次世代シーケンサー（ＮＧＳ）分析を開発した。Ａｇｉｌｅｎｔ’ｓ ＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ Ｔａｒｇｅｔ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ Ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）はＮＧＳを最適化するための高度に効率的なハイブリッド選択技術である。本発明者らは、このシステム及びＨＢＶの遺伝子型ＡからＪのＤＮＡ配列をカバーする１２３９１個のカスタムベイトを利用し、ＦＬＸチタニウムＮＧＳシステム（ロシュ）に実験を最適化した。２つの細胞株及び４つの対臨床試料において、断片化したＨＢＶ配列の組み込みを特徴づけることができた。平均読み込み長さは３３３．１４であった。ＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞株における、ＨＢＶのＤＮＡの組み込み部位を特定した結果の一例を図３に示し、ＨＢＶ−ＶＣＣの臨床試料における、ＨＢＶのＤＮＡの組み込み部位を特定した結果の一例を図４に示す。ＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞株の場合、組み込みが起きたのは、インタージェニック（４０％）、イントロン（４０％）、プロモーター（７％）、双方向性プロモーター（１３％）及びエクソン（０％）であった。ＤＮＡ組み込みパターンはＨＢＶ−ＨＣＣの臨床試料と酷似しているため、ＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞株は、肝細胞癌発症におけるＨＢＶの役割を明らかにするのに役立つモデルシステムであると考えられる。

【0039】

実施例５：ＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞株における組み込まれたＨＢＶのＤＮＡメチル化
ディープ重亜硫酸塩処理−パイロシーケンス法により、組み込まれたＨＢＶのＤＮＡメチル化を分析した。ヒトゲノムに組み込まれたＨＢＶ配列は低メチル化及び高メチル化の両方があることを見出した。共通したＨＢＶ組み込み部位は存在しなかった。一方、メチル化の広がりには何らかの規則がありそうであった。そこで、アレル特異的ＤＮＡメチル化分析により、ＨＢＶゲノムのメチル化状態をさらに決定した。結果を図５に示す。最も重要なことに、メチル化されたヒトゲノムに組み込まれた場合、ＨＢＶゲノムは顕著なメチル化を受けているのに対して、非メチル化ヒトゲノムに組み込まれた場合、ＨＢＶゲノムは非メチル化のままであった。一方、ＨＢＶのメチル化パターンとヒトゲノムのヒストン修飾とは何の相関もなかった。

【0040】

実施例６：ＨｅｐＧ２．２．１５細胞株における組み込まれたＨＢＶのＤＮＡメチル化
ＨＢＶ抗原陰性のヒト肝癌株であるＨｅｐＧ２にＨＢＶ ＤＮＡをトランスフェクトしたＨｅｐＧ２．２．１５細胞株について、組み込まれたＨＢＶのＤＮＡメチル化を分析した。ＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞株の結果と同様に、メチル化されたヒトゲノムに組み込まれた場合、ＨＢＶゲノムは顕著なメチル化を受けているのに対して、非メチル化ヒトゲノムに組み込まれた場合、ＨＢＶゲノムは非メチル化のままであった。ＨｅｐＧ２．２．１５細胞株は、マルチコピーのＨＢＶ ＤＮＡが安定的にトランスフェクトされた細胞株であるため、自然のＨＢＶ感染を模したものである。そうであっても、ＨＢＶの組み込みとヒト及びＨＢＶの両方のエピゲノムとの関連は、臨床試料においてさらに調べる必要がある。

【0041】

実施例７：ＨＢＶ−ＨＣＣ組織における組み込まれたＨＢＶのＤＮＡメチル化
上記のインビトロの結果が、実際のヒト腫瘍と関連しているのかを決定するため、ＨＣＣ及び近接非腫瘍組織からなる外科検体対におけるＨＢＶ及びヒトのゲノムメチル化状態を調べた。結果を図６に示す。ＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞株及びＨｅｐＧ２．２．１５細胞株の結果と同様に、メチル化されたヒトゲノムに組み込まれた場合、ＨＢＶゲノムは顕著なメチル化を受けているのに対して、非メチル化ヒトゲノムに組み込まれた場合、ＨＢＶゲノムは非メチル化のままであった。

【0042】

実施例８：ＮＧＳによるＨＰＶ ＤＮＡ組み込み部位配列の分析
実施例４と同様に、Ａｇｉｌｅｎｔ’ｓ ＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ Ｔａｒｇｅｔ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ Ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）と、ＨＰＶ−１６のＤＮＡをカバーする３９１個及びＨＰＶ−１８のＤＮＡ配列をカバーする３９７個の計７８８個のカスタムベイトを利用し、ＦＬＸチタニウムＮＧＳシステム（ロシュ）に実験を最適化した。ＨＰＶ抗原陽性のヒト子宮頚癌由来であるＨｅＬａ、ＳｉＨａ、ＳＫＧ−Ｉ、ＳＫＧ−ＩＩ及びＳＫＧ−ＩＩＩａの５つの細胞株全てにおいて、断片化したＨＰＶ配列の組み込みを特徴づけることができた。平均読み込み長さは３５０．９３であった。ＨｅＬａ、ＳｉＨａ、ＳＫＧ−Ｉ、ＳＫＧ−ＩＩ及びＳＫＧ−ＩＩＩａ細胞株における、ＨＰＶのＤＮＡの組み込み部位を特定した結果の一例を図７に示す。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]