特許 6552106 糖尿病を処置するためのモダリティの組み合わせ

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6552106

(24)【登録日】2019年7月12日

(45)【発行日】2019年7月31日

(54)【発明の名称】糖尿病を処置するためのモダリティの組み合わせ

(51)【国際特許分類】

   A61K 38/17 20060101AFI20190722BHJP

   A61K 38/28 20060101ALI20190722BHJP

   A61P 3/10 20060101ALI20190722BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20190722BHJP

【ＦＩ】

   A61K38/17

   A61K38/28ZNA

   A61P3/10

   A61P43/00 121

【請求項の数】17

【全頁数】30

(21)【出願番号】特願2015-520517(P2015-520517)

(86)(22)【出願日】2013年6月27日

(65)【公表番号】特表2015-522027(P2015-522027A)

(43)【公表日】2015年8月3日

(86)【国際出願番号】US2013048247

(87)【国際公開番号】WO2014004866

(87)【国際公開日】20140103

【審査請求日】2016年6月23日

(31)【優先権主張番号】13/534,571

(32)【優先日】2012年6月27日

(33)【優先権主張国】US

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】516117456

【氏名又は名称】ディーエムノーモア リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】110000877

【氏名又は名称】龍華国際特許業務法人

(72)【発明者】

【氏名】オルバン、ティハメル

【審査官】 伊藤 基章

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２０１２／０１５９０３（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第０２／０５３１０６（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表２００５−５２２９８７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 丹原 圭一，虚血性心筋症に対する血管新生療法，医学のあゆみ 第２０６巻・第１０号，医歯薬出版株式会社 ISHIYAKU PUBLISHERS,INC. 藤田 勝治，第206巻

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ３８／００

Ａ６１Ｋ ３９／００

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４（ＣＴＬＡ４）融合タンパク質と、
プレプロインスリン、ＧＡＤ６５、ＩＣＡ５１２／ＩＡ−２、ＨＳＰ６０、カルボキシペプチダーゼＨ、ペリフェリン、およびガングリオシドからなる群から選択される自己抗原またはその免疫活性フラグメントもしくは変異体と、
薬学的に許容される担体と
を備え、
前記自己抗原は、タンパク質またはポリペプチドであり、
前記自己抗原は、プレプロインスリンまたはその免疫活性フラグメントもしくは変異体であり、
Ｉ型糖尿病を処置するための、
医薬組成物。

【請求項2】

前記ＣＴＬＡ４融合タンパク質は、Ｂ細胞上および抗原提示細胞（ＡＰＣ）上の少なくとも一方で発現されるＢ７（ＣＤ８０／８６）抗原と結合する、
請求項１に記載の医薬組成物。

【請求項3】

前記ＣＴＬＡ４融合タンパク質がＣＴＬＡ４の細胞外ドメイン、前記細胞外ドメインの有効フラグメント、または前記細胞外ドメインの免疫活性変異体を含む、
請求項１または２に記載の医薬組成物。

【請求項4】

前記ＣＴＬＡ４融合タンパク質は、アバタセプトである、
請求項１から３のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項5】

前記プレプロインスリンのフラグメントは、インスリンＢ鎖またはその免疫活性フラグメントもしくは変異体である、
請求項１から４のいずれか１項に記載の医薬組成物。

【請求項6】

前記インスリンＢ鎖のフラグメントは、配列番号１のアミノ酸３３から４７を有する、
請求項５に記載の医薬組成物。

【請求項7】

前記薬学的に許容される担体は、油性担体である、
請求項１から６のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項8】

前記油性担体は、ＩＦＡまたはモンタナイドＩＳＡである、
請求項７に記載の医薬組成物。

【請求項9】

２５０ｍｇから２０００ｍｇまでの前記ＣＴＬＡ４融合タンパク質と、
０．５ｍｇから１０ｍｇまでの前記自己抗原とを含む、
請求項１から８のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項10】

対象に
有効量の前記ＣＴＬＡ４融合タンパク質と、
有効量の前記自己抗原と
を投与する段階を備える、
前記対象のＩ型糖尿病を処置する方法において使用するための、
請求項１から９のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項11】

前記対象は、残余β細胞機能を有するＩ型糖尿病に罹患している、
請求項１０に記載の医薬組成物。

【請求項12】

静脈注入、筋肉注射、または皮下注射によって投与される、
請求項１０または１１に記載の医薬組成物。

【請求項13】

前記融合タンパク質が５ｍｇ／ｋｇから２０ｍｇ／ｋｇまでの範囲の用量で、
かつ前記自己抗原が１．０ｍｇ／ｍｌから４．０ｍｇ／ｍｌまでの範囲の用量で、
投与される、
請求項１０から１２のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項14】

前記融合タンパク質が２５０ｍｇから２０００ｍｇまでの範囲の用量で、
かつ前記自己抗原が０．５ｍｇから１０ｍｇまでの範囲の用量で、
投与される、
請求項１０から１２のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項15】

前記方法は、処置の有効性の指標として経時的に前記対象から採取された血液サンプル中のＣペプチド濃度を測定する段階を、
さらに備える、
請求項１０から１４のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項16】

前記対象のＩ型糖尿病を処置する段階は、
Ｉ型糖尿病の発症を防ぐ段階を有する、
請求項１０から１５のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項17】

前記対象のＩ型糖尿病を処置する段階は、
少なくとも６ヶ月間、Ｉ型糖尿病の発症を遅延させる段階を有する、
請求項１０から１６のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、概して、自己免疫疾患の分野、より具体的には、ＣＴＬＡ４融合タンパク質とＩ型糖尿病自己抗原との組み合わせを用いるＩ型糖尿病の処置、予防、または進行の遅延に関する。

【背景技術】

【0002】

Ｉ型糖尿病（Ｔ１ＤＭ）のもっとも一般的な病型は、インスリン分泌β細胞が自己免疫反応によって破壊される免疫介在性疾患である。インスリン分泌β細胞を特異的に標的とする免疫細胞を含んでいる膵島の進行性炎症性浸潤を伴う疾患の発症に関連したいくつかの遺伝的および環境的因子が存在する。この病状は、漠然とした期間（数ヶ月から数年）にわたって発症する。インスリンの発見がＴ１ＤＭの処置を可能にしたが、現在のところ治癒されたことはない。Ｉ型糖尿病のもっとも一般的な病型は、インスリンの産生性β細胞が破壊される免疫介在性である。それでも、診断時に、大部分のペイシェントは、まだかなりの量のインスリンを産生する。残余β細胞機能の温存は、非常に望ましい。なぜなら、それによって疾患の短期および長期の合併症が減らし得るからである。

【0003】

免疫調節薬または抗原に基づく処置によってＩ型糖尿病における自己免疫を抑制するべく、いくつかの臨床試験の試みが行われている。最も注目すべきは、刺激Ｃペプチド分泌が見られたことから明らかなように、抗ＣＤ３、抗ＣＤ２０、およびＧＡＤ−６５抗原ワクチンの試験が、β細胞機能の温存においてかなりの有効性を示したことである。Ｔ細胞は、Ｉ型糖尿病に関連する自己免疫において中心的な役割を担う。

【0004】

インスリンＢ鎖などの自己抗原を含む不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）の再導入も、Ｉ型糖尿病を処置または進行の遅延させるために考えられた。このことは、糖尿病の動物モデル（ＮＯＤマウス）（Muir et al. (1995) J Clin Invest 95:628-634; Orban et al. (1999) Diabetes 48 Supp.1:A216-A217; Ramiya et al. (1996) J Autoimmun 9:349-356）、米国特許公開第２００６／０１８３６７０号、および米国特許公開第２００９／０１４２３０８号、ならびに、ヒトでは、Orban et al., J Autoimmun. (2010 Jun);34(4):408-15で、研究された。

【0005】

しかし、自己免疫β細胞破壊を停止または遅延させることで、Ｉ型糖尿病の発症を防止すること、あるいは、可能な限り長期にわたって疾患の発症を少なくとも抑えることが可能である、Ｉ型糖尿病のさらなる新しい治療法が求められている。

【発明の概要】

【0006】

本発明の特定の実施形態によれば、対象の真正糖尿病を処置する方法に関し、該方法は、ＣＴＬＡ４の細胞外ドメイン、該細胞外ドメインの有効フラグメントまたは該細胞外ドメインの免疫活性変異体などのＴ細胞共刺激アンタゴニスト、および、免疫グロブリン分子の一部分を有する、有効量の融合タンパク質組成物と、プレプロインスリン、ＧＡＤ−６５、ＩＣＡ５１２／ＩＡ−２、ＨＳＰ６０、カルボキシペプチダーゼＨ、ペリフェリン、およびガングリオシドなどの有効量のＩ型糖尿病自己抗原またはその免疫活性フラグメントもしくは変異体とを、対象に投与すること、を備える。いくつかの実施形態では、プレプロインスリンフラグメントは、インスリンＢ鎖、または配列番号１（すなわち、Ｂ鎖２９〜２３）のアミノ酸３３〜４７などのその免疫活性フラグメントもしくは変異体である。

【0007】

いくつかの実施形態では、対象は、残余β細胞機能があるＩ型糖尿病に罹患している。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞共刺激アンタゴニストは、Ｂ細胞上でおよび／または抗原提示細胞（ＡＰＣ）上で発現されるＢ７（ＣＤ８０／８６）抗原と結合する。さらに他の実施形態では、Ｂ７抗原は、Ｂ細胞上およびＡＰＣ上で発現される。

【0008】

いくつかの実施形態では、上記方法は糖尿病発症の防止に有効である。他の実施形態では、方法は、少なくとも、例えば、3ヶ月、６ヶ月、９ヶ月、１年、１．５年、２年、３年、またはそれ以上によって、糖尿病発症の遅延に有効である。いくつかの実施形態では、方法は、さらに、処置の有効性の指標として、経時的に対象から採取された血液サンプル中のＣペプチド濃度を測定することを、さらに備えてもよい。

【0009】

本発明のさらに他の実施形態では、医薬組成物が提供される。この医薬組成物は、（ａ）細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４（ＣＴＬＡ４）融合タンパク質と、（ｂ）プレプロインスリン、ＧＡＤ−６５、ＩＣＡ５１２／ＩＡ−２、ＨＳＰ６０、カルボキシペプチダーゼＨ、ペリフェリン、およびガングリオシドからなる群から選択される自己抗原またはその免疫活性フラグメントもしくは変異体と、（ｃ）薬学的に許容される担体と、を備える。

【0010】

いくつかの実施形態では、医薬組成物は、ＩＦＡまたはモンタナイドＩＳＡなどの油性担体に含まれて提供される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、約２５０ｍｇから約２０００ｍｇまでの融合タンパク質と、約０．５ｍｇから約１０ｍｇまでのＩ型糖尿病自己抗原とを含む。

【0011】

これから明らかになるように、本実施形態のこれらの特徴および本実施形態の他の特徴が、本明細書中に述べられ、かつ説明される。

【図面の簡単な説明】

【0012】

例示を目的として、以下の図面を参照しながら、様々な実施形態の詳細な説明を本明細書中、以下に提供する。当業者は、後述する図面が説明目的だけのためであると理解する。図面は、いかなる形であれ、出願人の教示の範囲を限定することを意図していない。

【0013】

【図1】各処置群について経時的な刺激Ｃペプチド２−ｈ ＡＵＣ平均の母平均である。推定値は、年齢、性別、Ｃペプチドのベースライン値と処置割り当てのために調整されているＡＮＣＯＶＡモデルからある。Ｙ軸は、ｌｏｇ（ｙ＋１）スケールで表す。誤差棒は、９５％ＣＩを示す。ＡＵＣ＝曲線下面積。

【0014】

【図2】各処置群について経時的な刺激Ｃペプチド２−ｈ ＡＵＣ平均の母平均である。推定値は、年齢、性別、Ｃペプチドのベースライン値、および処置割り当てを調整し、かつｌｏｇ（ｙ＋１）スケール上の直線として時間に対する一定の効果を含む混合効果モデルの分析から得られる。ＡＵＣ＝曲線下面積。

【0015】

【図3】各処置群について、経時的に０．２ｎｍｏｌ／Ｌまたはそれ以上に保たれている２−ｈピークＣペプチドを有する参加者の比率である。

【0016】

【図4A】各処置群について、ＨｂＡ１ｃの経時的使用の母平均である。

【図4B】各処置群について、インスリンの経時的使用の母平均である。推定値は、年齢、性別、ＨｂＡ１ｃのベースライン値、および処置割り当てを調整するＡＮＣＯＶＡモデルから得られる。インスリン使用は、３ヶ月の間隔で、体重ｋｇあたりである。誤差棒は、９５％ＣＩを示す。ＨｂＡ１ｃは、糖化ヘモグロビンＡ１ｃである。

【0017】

【図5】所定のベースライン因子のカテゴリーの範囲内での２年刺激ＣペプチドＡＵＣ平均に対する処置効果の比率（アプラセボ対アバタセプト）である。推定値は、年齢、性別、Ｃペプチドのベースライン値、指示分類係数、処置割り当て、処置相互作用項を調整するＣペプチドのＡＮＣＯＶＡモデル化対数から得られる。処置効果の均一性検定は、ＤＲ３対立遺伝子の状態（ｐ＝０．０２５）および人種（ｐ＝０．０００３）で有意であった。ＡＵＣ＝曲線下面積。ＨｂＡ１ｃ＝糖化ヘモグロビンＡ１ｃ。

【0018】

当然のことながら、図面は単なる例示に過ぎず、図面に対する全ての参照は例示のみを目的としたものであり、任意の方法により本明細書中で後述する実施形態の範囲を限定することを意図したものではない。

【発明を実施するための形態】

【0019】

ＣＴＬＡ４分子とＩＦＡのインスリンＢ鎖との組み合わせが対象のＩ型糖尿病の処置、予防、または進行の遅延に用いられ得るということが知られている。

【0020】

残余β細胞機能の温存（ピークＣペプチド≧０．２ｎｍｏｌ／Ｌにより判断）は、非常に望ましい。なぜなら、それによってその疾患の短期および長期の合併症が減少し得るからである。Ｉ型糖尿病における自己免疫を免疫調節薬または抗原に基づく処置によって抑制するべく、いくつかの臨床試験の試みが行われている。最も注目すべきは、抗ＣＤ３、抗ＣＤ２０、およびＧＡＤ−６５抗原ワクチンの試験は、刺激Ｃペプチド分泌が見られたことから明らかなように、β細胞機能の温存においてかなりの有効性を示した。Ｃペプチドは、インスリンとともに体内で生成されるタンパク質である。健康な膵臓で、プレプロインスリンは、Ａ鎖、Ｃペプチド、Ｂ鎖、およびシグナル配列を伴って分泌される。シグナル配列が切り離されて、プロインスリンが残る。続いて、Ｃペプチドが切断されてＡ鎖およびＢ鎖が残り、インスリンを形成する。Ｃペプチドおよびインスリンは、等モル量で存在するので、インスリンの産生および膵臓β細胞の健康状態に関する非常に信頼性の高いマーカーである。

【0021】

Ｔ細胞は、Ｉ型糖尿病に関連する自己免疫において中心的な役割を担う。完全に活性化されて自己攻撃的になるには、Ｔ細胞は少なくとも２つの重要なシグナルを必要とすると考えられている（Marelli-Berg FM, Okkenhaug K, Mirenda V. A Trends Immunol 2007; 28: 267-73）。第１のシグナルは、抗原提示細胞のＭＨＣ分子の溝にある抗原とＴ細胞受容体（ＴＣＲ）との間の相互作用である。最も重要な第２のシグナルは、抗原提示細胞（ＡＰＣ）上のＣＤ８０およびＣＤ８６とＴ細胞上のＣＤ２８との間の相互作用である。この共刺激の第２のシグナルは細胞の完全な活性化に必要とされ、そのような活性化がない場合、Ｔ細胞は機能的にならない。したがって、共刺激遮断は自己免疫および移植のための治療法として提唱された（Bluestone JA, St Clair EW, Turka LA. Immunity 2006; 24: 233-38）。

【0022】

ＣＤ１５２としても知られている細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４（ＣＴＬＡ４）は、免疫系の調節に関係するタンパク質である。天然のＣＴＬＡ４は、米国特許第５，４３４，１３１号、第５，８４４，０９５号、および第５，８５１，７９５号に説明されている。天然ＣＴＬＡ４タンパク質は、ＣＴＬＡ４遺伝子によってコードされている。ＣＴＬＡ４は細胞表面タンパク質であり、Ｎ末端細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、およびＣ末端細胞質ドメインを有する。細胞外ドメインは、ＣＤ８０およびＣＤ８６などと標的抗原と結合、および／または、Ｔ細胞刺激に対する天然のナチュラルブレイクとして機能する。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ４分子の細胞外ドメインは、＋１位のメチオニンで始まり、＋１２４位のアスパラギン酸で終わる。他の実施形態では、細胞外ドメインは−１位のアラニンで始まり、＋１２４位のアスパラギン酸で終わる。

【0023】

ＣＴＬＡ４分子は、細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４（ＣＴＬＡ４）細胞外ドメインを有する分子である。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ４の細胞外ドメインは、Ｂ細胞上および抗原提示細胞（ＡＰＣ）上で発現するＢ７抗原などの少なくとも１つのＢ７（ＣＤ８０／８６）抗原を認識して結合するＣＴＬＡ４タンパク質の一部分を有する。Ｂ細胞およびＡＰＣが活性化されてもよい。細胞外ドメインは、Ｂ７抗原を結合するＣＴＬＡ４のフラグメントまたは誘導体を含んでもよい。ＣＴＬＡ４細胞外ドメインは、ＣＤ８０および／またはＣＤ８６を認識して結合することもできる。細胞外ドメインは、ＣＤ８０および／またはＣＤ８６を結合するＣＴＬＡ４のフラグメントまたは誘導体を含んでもよい。

【0024】

ＣＴＬＡ４分子は融合タンパク質であってもよい。ここで、融合タンパク質は、当該技術分野で周知の方法を用いて連結し合った１または複数のアミノ酸配列と、定義される。そのようにして連結したアミノ酸配列は、１つの融合タンパク質を形成する。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ４分子は、免疫グロブリンの少なくとも一部分、例えば免疫グロブリンのＦｃ部分を含む。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ４分子は、単離および精製されたＣＴＬＡ４分子である。

【0025】

いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ４分子は、免疫グロブリンの少なくとも一部分、例えば免疫グロブリンのＦｃ部分を含むタンパク質である。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ４分子は、単離および精製されたＣＴＬＡ４分子である。

【0026】

いくつかの好ましい実施形態では、ＣＴＬＡ４分子は、アバタセプトである。アバタセプトは、ヒト免疫グロブリンＧ１（ＩｇＧ１）の修飾Ｆｃ（ヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメイン）部分に結合されるヒトＣＴＬＡ−４の細胞外ドメインからなる可溶性融合タンパク質である。アバタセプトは、哺乳動物細胞発現系で組換えＤＮＡ技術によって生成される。アバタセプトのみかけの分子量は、９２キロダルトンである。

【0027】

アバタセプトは、成人性関節リウマチおよび若年性特発性関節炎で用いるために開発され、中等度から重度の活動性関節リウマチの成人ペイシェントにおいて、徴候および症状の軽減、著明な臨床的反応の誘導、構造損傷進行の阻害、および身体機能の改善に適応される。

【0028】

アバタセプトはBristol-Myers Squibbによって開発されて、例えば、米国特許第５，８５１，７９５号、米国特許第７，４５５，８３５号、米国特許出願公開第２００１１／３１１５２９号に開示されている。アバタセプト（商品名ＯＲＥＮＣＩＡ）は、単剤療法として用いてもよく、または、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）アンタゴニスト以外の病態修飾性抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤ）と併用してもよい。アバタセプトは、中等度から重度の活動性多関節型若年性特発性関節炎を患う６歳およびそれ以上の歳の小児科ペイシェントで徴候および症状の軽減にも適応されている。アバタセプトは、単剤療法として使用してもよく、または、メトトレキサート（ＭＴＸ）と併用してもよい。アバタセプトは、選択的な共刺激調節因子であり、Ｔ細胞の共刺激を阻害するので、ＴＮＦアンタゴニストと併用して投与される。

【0029】

アバタセプトは、ＣＤ８０およびＣＤ８６と選択的に結合することによって、ＣＤ２８との間の相互作用を阻害し、Ｔ細胞活性化を妨げる。それはナイーブＴ細胞活性化を抑制するので、幅広い免疫抑制の代わりに、特異的抗原に対するＴ細胞応答を選択的に阻害する可能性がある。エフェクターメモリーＴ細胞応答はＣＤ２８共刺激に対する依存性が低く、おそらく、共刺激遮断による抑制がより少ない（Lo DJ, Weaver TA, Stempora L, 他、Am J Transplant 2011; 11: 22-33）。

【0030】

動物およびヒトの両方における研究は、共刺激の第２のシグナルが妨害されると自己免疫に対して有益な影響を及ぼすことを示した。アバタセプトによる共刺激遮断は、乾癬（Abrams JR, Lebwohl MG, Guzzo CA, et al. J Clin Invest 1999; 103: 1243-52）および乾癬性関節炎（(Mease P, Genovese MC, Gladstein G, et al. Arthritis Rheum 2011; 63: 939-48）において、臨床的有効性を有することが示されており、さらに、関節リウマチの処置に承認されている（Genant HK, Peterfy CG, Westhovens R, et al. Ann Rheum Dis 2008; 67: 1084-89）。このような関節リウマチの措置には、若年性関節リウマチの治療も含まれる（Ruperto N, Lovell DJ, Quartier P, et al. Lancet 2008; 372: 383-91）。その上、共刺激遮断は、同種移植拒絶の制御に有効であった（Vincenti F, Larsen C, Durrbach A. N Engl J Med 2005; 353: 770-81）。さらに、Ｌｅｎｓｃｈｏｗと共同研究者（Lenschow DJ, Ho SC, Sattar H他、J Exp Med 1995; 181: 1145-55）は、生後１０週齢前に投与された場合に、抗Ｂ７−２モノクローナル抗体とＣＴＬＡ４免疫グロブリン融合タンパク質との両方による共刺激阻害がＮＯＤマウスモデルで糖尿病を予防すること、を示した。

【0031】

今や明らかにされていることは、Ｔ細胞共刺激アンタゴニスト（例えば、ＣＴＬＡ−４組成物、および、具体的にはアバタセプト）による共刺激調節が自己攻撃性Ｔ細胞の生成を妨げ、Ｉ型糖尿病であると診断されて間もないペイシェントのＣペプチド分泌の温存をもたらす自己免疫β細胞破壊を停止または遅延させることである（Orban et al., Lancet 2011; 378 (9789): 412-9）。

【0032】

ヒトＩ型糖尿病で重要であると考えられる多くの自己抗原が存在する。いくつかのデータは、インスリンがその疾患の病因に関与している主要抗原であることを示唆している（Muir et al. (1993) Diabetes Metab. Rev 9:279-287）。β細胞特異的腫瘍タンパク質であるインスリンは、単独で用いられる場合に中等度な免疫原性を示し、糖尿病の発症を遅延させる効果があることがヒトでのパイロット試験で示された（Keller et al. (1993) Lancet 341:927-928）。しかし、所望の効果を誘発するには長期にわたって毎日注射しなければならない。インスリンがヒトで用いられる場合、低血糖とその続発症について大きな心配ごとが存在する。

【0033】

血糖低下作用が欠如しているインスリンまたはプレプロインスリンの免疫原性フラグメントまたは変異体は、ヒトでの使用にとって安全な選択肢である。例えば、機能的残余β細胞塊のさらなる減少を予防または遅延させるべく、ヒトにおけるＩ型糖尿病の臨床発症後に、血糖低下作用なしで、インスリンＢ鎖（または代謝作用のない免疫原性フラグメントおよび変異体）を免疫調整薬として用いることができる。ヒト対象に自己抗原（例えば、インスリンＢ鎖）を再導入することで、防御免疫反応を誘因させている自己免疫プロセスを変化させるように作用し得る。Ｔｈ１／Ｔｈ２バランスは、防御Ｔｈ２型細胞応答と調節免疫細胞（Ｔｒｅｇｓ）生成にとって有利になるように変化し得る。

【0034】

インスリン、グルタミン酸脱炭酸酵素（ＧＡＤ）、他の膵島細胞自己抗原（例えば、ＩＣＡ５１２／ＩＡ−２タンパク質チロシン脱リン酸酵素、ＩＣＡ１２、ＩＣＡ６９）に対する自己抗体は、新たに診断された糖尿病ペイシェントでしばしば見つかる。したがって、本発明の方法で有用なＩ型糖尿病自己抗原として、例えば、プレプロインスリンまたはその免疫活性フラグメント（例えば、プレプロインスリンフラグメント、インスリンＢ鎖、Ａ鎖、Ｃペプチド、またはその免疫活性フラグメント）と、他の膵島細胞自己抗原（ＩＣＡ）、例えば、ＧＡＤ６５、膵島チロシンホスファターゼＩＣＡ５１２／ＩＡ−２、ＩＣＡ１２、ＩＣＡ６９、またはその免疫活性フラグメントとが挙げられる。他のＩ型糖尿病自己抗原は、ＨＳＰ６０、カルボキシペプチダーゼＨ、ペリフェリン、ガングリオシド（例えば、ＧＭ１−２、ＧＭ３）またはその免疫活性フラグメントを含む。本明細書中に説明されるＩ型糖尿病自己抗原のいずれか、またはその免疫活性フラグメント、類似体、もしくは誘導体は、本発明の方法および組成物に有用である。

【0035】

インスリンｍＲＮＡは、プレプロインスリンと呼ばれる１１０個のアミノ酸からなる単鎖前駆体として翻訳され、小胞体への挿入過程においてそのシグナルペプチドが除去されることで、プロインスリンが生成する。プロインスリンは、３つのドメイン、すなわちアミノ末端Ｂ鎖と、カルボキシ末端Ａ鎖とＣペプチドとして知られている中央の結合ペプチドと、からなる。小胞体の中で、プロインスリンはＣペプチドを切除するいくつかの特異的エンドペプチダーゼにさらされ、それによって、ＡおよびＢ鎖からなるインスリンの成熟した形状を生成する。インスリンおよび遊離Ｃペプチドは、ゴルジ内で、細胞質に蓄積する分泌顆粒内に包み込まれる。プレプロインスリンペプチド配列は、配列番号１に見出される。

【0036】

インスリンＡ鎖は、配列番号１のアミノ酸９０〜１１０を含む。Ｂ鎖は、配列番号１のアミノ酸２５〜５４を含む。連結配列（配列番号１のアミノ酸５５〜８９）は、いずれの端部にも一対の塩基性アミノ酸を含む。これらの二塩基配列のプロインスリンのタンパク質分解切断は、インスリン分子と、配列番号１のアミノ酸５７〜８７を含む遊離Ｃペプチドとを遊離する。ヒトプレプロインスリンまたはその免疫活性フラグメント、例えばＢ鎖またはその免疫原性フラグメント、例えば配列番号１のアミノ酸３３〜４７（Ｂ鎖の残基９〜２３に対応）、あるいは、該プレプロインスリンのシグナルペプチド配列または他の配列は、本明細書中に説明する方法および組成物において自己抗原として有用である。

【0037】

Ｇａｄ６５は、インスリン依存性糖尿病の原因となる自己免疫反応に関与する一次β細胞抗原である（Christgau et al. (1991) J Biol. Chem. 266(31):21257-64）。Ｉ型糖尿病の診断方法として、ＧＡＤ−６５に対する自己抗体の存在が利用されている。ＧＡＤ−６５は、配列番号２の５８５個のアミノ酸からなるタンパク質である。自己抗体力価の変化およびＧＡＤ６５ＡＢアイソタイプの変化は、投与の効果を反映するもので、糖尿病ペイシェントまたは糖尿病前症ペイシェントでの自己免疫プロセスの緩解を特徴づけるのに用いられ得る。加えて、自己抗原投与の効果に相関して、刺激サイトカインプロフィール（Ｔｈ２細胞に有利）に変化があり、このことは、後で、Ｉ型糖尿病における自己免疫の退行に関する体液性マーカーとして用いられてもよい。

【0038】

タンパク質チロシン脱リン酸酵素ファミリーの一員であるＩＡ−２／ＩＣＡ５１２は、Ｉ型糖尿病の別の主要自己抗原である（Ｌａｎ ｅｔ ａｌ． DNA Cell Biol 13:505-514, 1994）。糖尿病ペイシェントの７０％は、臨床疾患発症の何年も前にみられるＩＡ−２に対する自己抗体を有している。ＩＡ−２分子（以下の配列番号３）は９７９アミノ酸長であり、細胞内ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞外ドメインからなる（Rabin et al. (1994) J. Immunol. 152 (6), 3183-3188）。通常、自己抗体は、細胞内ドメイン、例えば配列番号３のアミノ酸６００〜９７９およびそのフラグメントを対象とする（Zhang et al. (1997) Diabetes 46:40-43; Xie et al. (1997) J Immunol 159:3662-3667）。ＩＡ−２のアミノ酸配列は、配列番号３に示される。

【0039】

ＩＣＡ１２（Kasimiotis et al. (2000) Diabetes 49 (4): 555-61；Gen bank Accession No. AAD16237；配列番号４）は、糖尿病に関連している複数の膵島細胞自己抗原の１つである。ＩＣＡ１２の配列は、配列番号４として提供される。

【0040】

ＩＣＡ６９は、Ｉ型糖尿病に関連するも別の自己抗原である（Pietropaolo et al. J Clin Invest 1993; 92: 359-371）。ＩＣＡ６９のアミノ酸配列は、配列番号５として提供される。

【0041】

Ｇｌｉｍａ３８は、３８ｋＤａの膵島細胞膜自己抗原であり、前糖尿病ペイシェントおよびＩ型糖尿病と新たに診断されたペイシェントの一部の血清と特異的に免疫沈降する。Ｇｌｉｍａ３８は、両親媒性の膜糖タンパク質であり、特異的に膵島および神経細胞株で発現されるので、ＧＡＤ−６５およびＩＡ２と同じ神経内分泌発現パターンを共有する（Aanstoot et al. J Clin Invest. 1996 June 15; 97 (12): 2772-2783）。

【0042】

ＨＳＰ６０、例えばＨＳＰ６０の免疫活性フラグメント、例えばｐ２７７（Elias et al., Eur J Immunol 1995 25 (10): 2851-7を参照）もまた、本明細書中に説明する方法および組成物における自己抗原として使用できる。ＨＳＰ６０の他の有用なエピトープが、例えば米国特許第６，１１０，７４６号に記載されている。

【0043】

カルボキシペプチダーゼＨは、例えば前Ｉ型糖尿病ペイシェントにおいて、自己抗原として同定されている（Castano et al. (1991) J Clin Endocrinol Metab 73 (6): 1197-201; Alcalde et al. J Autoimmun. 1996 August; 9 (4): 525-8)。したがって、カルボキシペプチダーゼＨまたはその免疫反応性フラグメント（例えば、上掲の Castanoに記載されたカルボキシペプチダーゼＨの１３６個のアミノ酸からなるフラグメント）を本明細書中に説明される方法および組成物に用いることができる。

【0044】

ペリフェリンは、ｎｏｄマウスで同定された５８ＫＤａの糖尿病自己抗原である（Boitard et al. (1992) Proc Natl. Acad. Sci. USA 89 (1): 172-6）。ヒトペリフェリン配列は、配列番号６として示される。

【0045】

ガングリオシドもまた、本明細書に記載する方法または組成物における有用な自己抗原となり得る。ガングリオシドは、疎水性部分であるセラミド、及び親水性部分である例えばオリゴ糖鎖によって形成される含シアル酸糖脂質である。ガングリオシドは特に、膵島の分泌顆粒の細胞質膜で発現される。ガングリオシドに対する自己抗体は、Ｉ型糖尿病に関連して説明されてきた。例えばＧＭ１−２ガングリオシドは、糖尿病自己免疫における膵島自己抗原であり、ヒト天然型β細胞で発現される（Dotta et al. Diabetes. 1996 September; 45 (9): 1193-6）。ガングリオシドＧＴ３、ＧＤ３、およびＧＭ−１もまた、自己免疫性糖尿病に関連した自己抗体の標的である（Dionisi et al. Ann Ist Super Sanita 1997; 33 (3): 433-5で総説）。ガングリオシドＧＭ３は、インスリン耐性の病理症状に関与する（Tagami et al. J Biol Chem 2001 Nov 13；印刷版に先行してオンライン刊行）。

【0046】

インスリンＢ鎖は、好ましい糖尿病自己抗原である。ヒトワクチン用のヒトインスリンＢ鎖は、標準的な固相ペプチド合成によって作製され得る。インスリンＢ鎖を効果的に可溶化する手順を、本明細書中に説明する。いくつかの実施形態では、自己抗原はヒトインスリンＢ鎖（配列番号１のアミノ酸２５〜５４）あるいはその免疫活性フラグメントまたは変異体である。いくつかの実施形態では、Ｂ鎖またはそのフラグメントは、組換え型でない。例えば、Ｂ鎖あるいはその免疫原性フラグメントまたは変異体は合成ペプチドであり、例えば、Ｂ鎖は固相合成によって作られる。いくつかの好ましい実施形態では、Ｂ鎖は尿素で可溶化される。いくつかの実施形態では、例えば、ヒトインスリンＢ鎖は変性され、例えば、尿素およびＤＴＴで可溶化される。好ましい実施形態では、ヒトインスリンＢ鎖は、重量比（ｗ／ｗ）で３０〜７０％の間、好ましくは４０〜６０％の間、より好ましくは４５〜５５％の間である。

【0047】

このように、本明細書中に提供されるのは、ＣＴＬＡ４およびＩ型糖尿病自己抗原を投与することによって糖尿病の進行を処置、予防、または遅延させる方法である。２つの成分は、同時に、経時的に、または、別個の時間経過（例えば、一方を朝にして他方を晩に、互いに関連した他の異なる時間経過）で投与される可能性がある。

【0048】

Ｔ１ＤＭの発症は、より長い期間にわたって対象がインスリンを必要としないように、本明細書中に説明される方法によって遅らせることが可能である。それに代わるものとして、またはそれに加えて、本方法は、既に糖尿病になった対象で「ハネムーン期」を延長することが可能である。ハネムーン期は、インスリンが膵臓によって分泌される期間であり、高血糖値を沈静化させ、インスリン注射および処置に対する応答によって、正常または正常に近い血糖値をもたらす。

【0049】

Ｔ１ＤＭは、発現する糖尿病にかかりやすい対象を最初に選択して、本明細書中に説明されるＣＴＬＡ４分子とＩ型糖尿病自己抗原とを投与することで、対象での予防が可能である。糖尿病にかかりやすい対象は、ＧＡＤ６５自己抗体（ＧＡＡ）、ＩＣＡ５１２自己抗体（ＩＣＡ５１２ＡＡ）、または抗インスリン自己抗体（ＩＡＡ）うちの１または複数の発現によって、選択可能である。これらの自己抗体の各々は、自己免疫Ｉ型糖尿病への進行のリスクに関連している。ＧＡＤ６５自己抗体（ＧＡＡ）、ＩＣＡ５１２自己抗体（ＩＣＡ５１２ＡＡ）、または抗インスリン自己抗体（ＩＡＡ）のうちの２またはそれ以上の発現は、自己免疫Ｉ型糖尿病への進行のリスクが高いことに関連している(Liping Yu et al., Diabetes August 2001 vol. 50 no. 8 1735-1740; Verge CF et al., Diabetes 45:926-933, 199; Verge CF. et al, Diabetes 47:1857-1866, 1998; およびBingley PJ, et al., Diabetes 43:1304-1310, 1994)。

【0050】

Ｔ１ＤＭは、本明細書中に説明される方法によっても、処置されてもよい。この処置は、残余β細胞機能を有する対象用、またはもはや少しのβ細胞機能も持たない対象用である。上記処置は、移植または注射あるいは他のβ細胞置換モダリティ（胚または他の幹細胞療法または他の置換モダリティと同様）を介して外因性β細胞が与えられた対象向けにも提案可能である。

【0051】

本明細書中に説明されるＣＴＬＡ４分子とＴ１ＤＭ自己抗原との組み合わせは、１または複数の医薬組成物の一部として投与可能である。本発明の方法は、糖尿病を予防または遅延、すなわち残余β細胞塊の減失を予防または遅延することができ、短期合併症の低下および／または人生の後半で糖尿病関連合併症の発症を遅らせる、より長い寛解期を提供する。

【0052】

ＣＴＬＡ４分子およびＴ１ＤＭ自己抗原を組み合わせて単一の医薬組成物にしてもよい。あるいは、ＣＴＬＡ４分子は単一の医薬組成物で提供され、Ｔ１ＤＭ自己抗原は別個の医薬組成物で提供される。この代替例において、２つの医薬組成物は、投与の様式および投与の時間経過が同じであっても異なってもよい。

【0053】

本明細書により提供される医薬組成物は、薬学的に許容される担体を含有可能である。「薬学的に許容される担体」という用語は、所望される特定の剤形に適するように、任意の全ての溶媒、希釈剤、または他の液媒体、分散助剤または懸濁助剤、界面活性剤、等張剤、増稠剤または乳化剤、防腐剤、固体結合剤、潤滑剤、およびその他を含む。RemingtonのPharmaceutical Sciences、第１６版、Ｅ．Ｗ．Ｍartin (Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1980）は、医薬組成物の処方およびその調製のための既知の技術に使用される様々な担体を開示している。任意の従来の搬送媒体の使用は、例えば、何らかの望ましくない生体影響を生ずることにより、または、さもなければ有害の方法で医薬組成物の任意の他の成分と相互作用することにより、それが本明細書中に提供される化合物に適合しない場合を除いて、本発明の範囲内であると考えられる。薬学的に許容される担体として機能し得る材料のいくつかの例として、限定されるものではないが、ラクトース、グルコース、およびスクロースなどの糖類；トウモロコシ澱粉およびジャガイモ澱粉などの澱粉類；セルロースとその誘導体、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、および酢酸セルロース；トラガント末；モルト；ゼラチン；タルク；カカオ脂および坐剤ワックスなどの賦形剤；落花生油、綿実油、サフラワー油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油、およびダイズ油などの油類；プロピレングリコールなどのグリコール類；オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチルなどのエステル類；寒天；水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムなどの緩衝剤；アルギン酸；パイロジェンフリー水；等張性食塩水；リンゲル液；エチルアルコール、ならびにリン酸緩衝液、さらに、ラウリル硫酸ナトリウムおよびステアリン酸マグネシウムなどの他の非毒性相溶性潤滑油が挙げられ、さらに、着色剤、離型剤、コーティング剤、甘味剤、香料剤、芳香剤、防腐剤、および抗酸化剤もまた、配合者の判断によって、組成物に存在し得る。

【0054】

薬学的に許容される担体を含む本明細書中に説明される化合物は、多種多様な投与の経路または様式を用いて、ペイシェントに送達され得る。適当な投与経路は、これに限定されるものではないが、吸入、経皮、経口、直腸、経皮、腸、および非経口投与が挙げられ、筋肉内注射、皮下注射、および静脈内注射が含まれる。

【0055】

本明細書中に説明される組成物は、アジュバントとともに投与されてもよい。「アジュバント」という用語は、単独で投与される有意の活性（significant activity）がない化合物、別の治療薬の活性を増強し得る化合物であり得る。いくつかの実施形態では、アジュバントは緩衝液、抗菌保存剤、界面活性剤、抗酸化剤、持続性制御剤、消毒剤、増粘剤、および粘性改善剤からなる群から選択される。好ましい実施形態では、アジュバントはＩＦＡまたは他の油性アジュバントであり、重量比（ｗ／ｗ）で３０〜７０％の間、好ましくは４０〜６０％の間、より好ましくは４５〜５５％の間で存在する。いくつかの実施形態では、ヒトインスリンＢ鎖とIFAまたは他の油性アジュバントは、約50/50の重量比で存在する。いくつかの実施形態では、医薬組成物は不純物（例えば、パイロジェン）を含まない。

【0056】

いくつかの実施形態では、自己抗原は凍結乾燥される。別の態様において、本発明は、Ｔ１ＤＭ自己抗原と、油性担体、例えばＩＦＡなどの油性アジュバントまたはモンタナイドＩＳＡ（例えば、モンタナイドＩＳＡ５１）などの他の油性アジュバントとを組み合わせる段階、および、インスリンＢ鎖と油性アジュバントとを乳化する段階とを有する方法によって作られる、Ｔ１ＤＭ自己抗原含有医薬組成物を提供する。いくつかの実施形態では、Ｔ１ＤＭ自己抗原は、インスリンＢ鎖および油性アジュバントが乳化される油性担体と組み合わされる、ヒトインスリンＢ鎖もしくはプレプロインスリンまたはそれらの免疫活性フラグメントもしくはその変異体である。好ましい実施形態では、ヒトインスリンＢ鎖と油性アジュバントとの重量比（ｗ／ｗ）は、３０／７０から７０／３０の間、好ましくは４０／６０から６０／４０の間、好ましくは４５／５５から５５／４５の間の間で、さらに好ましくは約５０／５０ｗ／ｗ比で組み合わせられる。好ましい実施形態では、乳化は高圧注射器で行われる。好ましい実施形態では、油性担体またはアジュバント、および、好ましくは、組成物は、細菌成分、例えばミコバクテリア成分を含まない。

【0057】

いくつかの実施形態において、Ｔ１ＤＭ自己抗原は、Ｂ鎖またはプレプロインスリンあるいはその免疫原性活性フラグメントまたは変異体であり、約３Ｍ〜８Ｍの尿素で、好ましくは約３．５Ｍ〜７Ｍの尿素で、または、約４Ｍ〜６Ｍの尿素で可溶化される。好ましい実施形態では、Ｂ鎖またはその免疫原性活性フラグメントもしくは変異体は、約４Ｍの尿素で、好ましくは約３．５Ｍ〜４．５Ｍの尿素で、最も好ましくは約３Ｍ〜５Ｍの尿素で可溶化される。好ましい実施形態では、β鎖またはその免疫原性活性フラグメントもしくは変異体は、５Ｍ〜８Ｍの尿素で、好ましくは約６Ｍ〜７Ｍの尿素で可溶化される。好ましくは、Ｂ鎖は還元剤（例えば、ＤＴＴ）の存在下で可溶化され、すなわち、等量の還元剤（例えば、１〜５ｍｇのＤＴＴ）が可溶化ステップの過程で添加される。

【0058】

いくつかの実施形態では、Ｉ型糖尿病自己抗原および／またはＣＴＬＡ４分子を含む組成物は、油性担体を含む。

【0059】

油性担体は、好ましい一実施形態において治療薬と併用してヒトに投与される、少なくとも１０重量％の天然または合成の油を含む組成物である。好ましい実施形態では、担体は、少なくとも２０、３０、５０、７０、８０、９０、９５、９８、または９９重量％の油を含む。いくつかの実施形態では、油性担体は、７０、６０、５０、４０、３０、または２０重量％未満の油を含み得る。好ましい実施形態では、油は１０〜９５重量％、好ましくは２０〜９０％または３０〜７０％の油の範囲にある。油は、対象に対して投与された場合に該油に分散された物質が徐放されるように、選択されるものとする。適当な油として、鉱油（例えば、Ｄｒａｋｅｏｌ（登録商標）６ ＶＲ軽油）、植物油、スクアレン、または流動パラフィンが挙げられる。いくつかの実施形態では、油性担体は１または複数のタイプの油を含むことができる。いくつかの実施形態では、油性担体は、免疫賦活剤（例えば、免疫賦活性グルカン）を含むことができる。しかし、油性担体が免疫賦活剤（例えば、免疫賦活性グルカン）、細菌成分（例えば、ミコバクテリア成分）を含まないことが、大いに好ましい。好ましい実施形態では、油性担体はミョウバン成分を含まない。

【0060】

理論に縛られることを望むわけではないが、油性担体は、炎症性および防御免疫反応能力に関連している免疫適格細胞を刺激することによって、作用すると考えられている。油性担体は、抗原媒体と徐放または長期抗原提示機構としても作用し得る。対象に注射されると、油性担体と抗原とから構成される組成物は、注射部位で抗原のデポを形成することで、抗原の分解を防ぐことができる。このデポから、抗原は系へゆっくりと放出され得るので、長期間にわたる抗原提示が提供されるとともに、炎症細胞との全接触面積が拡大し、炎症細胞を引き寄せる。マクロファージは、取り込んだ物質の大部分を消化することができ、処理抗原を該マクロファージの表面に示すことができる。このデポから、抗原は系へゆっくり放出され得るので、共刺激調節因子として作用するべく長期間にわたる抗原供給を提供する。

【0061】

油性担体は、乳化剤または界面活性剤成分を任意に含む。油と物質（例えば、抗原製剤）との混合または分散を促進するように、乳化剤または界面活性剤（および乳化剤または界面活性剤の量）が選択される。油性担体は、界面活性剤または乳化剤を０．１〜５０％、好ましくは１〜３０％、より好ましくは５〜２０重量％含むことができる。乳化剤または界面活性剤の例として、アルラセルＡ、オレイン酸マンニド（例えば、モンタミド８０−モノオレイン酸マンニド）、無水マンニトール／オレイン酸エステル、ポリオキシエチレンまたはポリオキシプロピレンが挙げられる。

【0062】

不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）は、ヒトにおける自己抗原のための好ましい送達媒体である。本発明の方法は、糖尿病を予防、すなわち残余β細胞塊の減失を予防または遅延させることができ、人生の後半で糖尿病関連の、通常進行性の合併症の発症を遅延させる、より長い寛解期を提供する。

【0063】

油性担体またはアジュバントは、一般的に、2つの成分、すなわち（１）油と（２）乳化剤または界面活性剤とからなるもので、水と混合されている。適当な油と乳化剤は、当該技術分野で公知である。例えば、油は鉱油、植物油、スクアレン、または流動パラフィンであり得る。乳化剤または界面活性剤は、例えば、アルラセルＡオレイン酸マンニド、無水マンニトール／オレイン酸エステル、ポリオキシエチレン、またはポリオキシプロピレンであり得る。典型的な油性アジュバントは、従来のＩＦＡ、モンタナイドＩＳＡアジュバントまたはハンターのタイターマックスアジュバントを含む。好ましい実施形態では、アジュバントは２０〜９５重量％、好ましくは３０〜９０重量％、より好ましくは４０〜７０重量％の油相と、０．１〜５０重量％、好ましくは１〜３０重量％、より好ましくは５〜２０重量％の界面活性剤または乳化剤とを含む。様々なタイプの油性アジュバントは、例えば、米国特許第５，８１４，３２１号、米国特許第６，２９９，８８４号、米国特許第６，２３５，２８２号、および米国特許第５，９７６，５３８号に記載されている。

【0064】

ＩＦＡは、概して非代謝性油（例えば、鉱油）、水、および界面活性剤（例えば、アルラセルＡ）の混合物である。完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）とは異なり、ＩＦＡは細菌成分（例えば、ミコバクテリウム）を含まない。ＩＦＡを用いた最初の大規模集団ワクチン接種が行われたのは米軍関係者に対してであった（Davenport (1968) Ann Allergy 26:288-292; Beebe et al., (1972) Am J Epidemiol 95:337-346; Salk & Salk (1977) Science 195:834-847）。エビデンスは、悪性腫瘍、アレルギー疾患、および膠原病に関しては陰性であったが、数人の男性の接種部位に嚢胞様の反応があったというエビデンスが存在した。その後の研究は、これらの副作用は、誤った投与によるものであることが確認された。すなわち、筋肉注射の代わりに誤って皮下注射されていた。これらの実験から、ＩＦＡは一部の人々によってヒト目的に不適当であると考えられていたが、それは動物研究で広く使われているままだった。近年、より新しい形態のＩＦＡは、ＨＩＶ免疫療法または治療的ワクチン接種におけるヒト使用で安全であることが示された（Turner et al. (1994) AIDS 8:1429-1435; Trauger et al. (1995) J Acquir Immune Defic Syndr Hum Retrovirol 10 Supp2:S74-82; Trauger et al. (1994) J Infect Dis 169:1256-1264)。

【0065】

モンタナイドＩＳＡアジュバント（Ｓｅｐｐｉｃ、フランスパリ市）は、異なる界面活性剤が非代謝性鉱油、代謝性油、またはこれら２種類の混合物と組み合わせられる一群の油／界面活性剤系アジュバントである。それらは、抗原水溶液エマルジョンとして使用するために調製される。モンタナイドＩＳＡ５０（ＩＳＡ＝不完全セピックアジュバント）用の界面活性剤は、オレイン酸マンニド（フロイントアジュバントに含まれる界面活性剤の主成分）である。モンタナイド群の界面活性剤は、フロイントアジュバントで用いられるアルラセルＡのいくつかのロットで見出されている過剰な炎症を引き起こし得る何らかの物質によるコンタミネーションを防ぐために、厳しい品質管理を受ける。アジュバントの種々のモンタナイドＩＳＡ群は、油中水型乳剤、水中油型乳剤、または水中油中水型乳剤として使われる。異なるアジュバントは、界面活性剤と油との組み合わせが豊富であることから、異なる水相/油相比率に適応する。

【0066】

ハンターのタイターマックス（CytRx Corp., Norcross, Ga.）は、従来のフロイントアジュバントに用いられるものと類似の方法で油中水型乳剤として調製される油／界面活性剤系アジュバントである。しかし、それは代謝性油（スクアレン）と、良好なタンパク質抗原結合能およびアジュバント活性を持つ非イオン性界面活性剤とを使用する。アジュバント活性は、脾臓およびリンパ節の濾胞性樹状細胞を抗原が標的とするのをこのことが促すので、補体を活性化して補体成分を結合する界面活性剤の能力に、ある程度関連していると思われる。市販のアジュバントで用いられる界面活性剤は、ハンターによって開発されたポリオキシエチレンとポリオキシプロピレンとから構成されるいくつかの合成非イオン性ブロックコポリマーのうちの1つである（Hunter et al., 1991 Vaccine 9:250-256）。エマルジョンを安定させる共重合体被覆微粒子の利用は、２０％未満の油（注射されるアジュバントの総量を最小にする重要な因子）を有する安定なエマルジョンの形成を可能にする。

【0067】

アジュバントは、抗原とともに用いられて、細胞媒介性免疫と防御アイソタイプ（マウスのＩｇＧ２ａと霊長類のＩｇＧ１）の抗体産生とを引き出し得る。異なるタイプのアジュバントは、類似の副作用（例えば注射部位での反応と発熱原性）を共有する。また、ヒトワクチンに一般に用いられるアジュバントであるミョウバンは、注射部位で顕著な肉芽腫性応答をもたらす（Allison & Byars (1991) Mol Immunol 28:279-284)。不完全フロイントアジュバントの作用様式は、特異的免疫反応と同様に非特異的免疫反応に関係する。ＩＦＡは、防御能のみならず炎症性に関連がある免疫適格細胞を刺激することによって、作用するように思われる。ＩＦＡも、抗原媒体と徐放または長期抗原提示機構として作用する。ペイシェントにＩＦＡと抗原化合物とを注射すると、それが注射部位に抗原のデポを形成して、抗原の分解を防ぐ。このデポから、抗原は系へゆっくりと放出され得るので、長期間にわたる抗原提示が提供されるとともに、炎症細胞との全接触面積が拡大し、炎症細胞を引き寄せる。マクロファージは、取り込んだ物質の大部分を消化することができ、処理抗原を該マクロファージの表面に示すことができる。

【0068】

抗原免疫原性に対するＩＦＡの特異的増強効果は、体液性免疫（優先的な防御抗体産生；ヒトにおけるＩｇＧ１とマウスにおけるＩｇＧ２ａ）を高めること、特異的細胞性免疫（優先してＴｈ２タイプおよびＴｒｅｇｓ）を誘発することである。具体的には、ＩＦＡのヒト組換え型インスリンＢ鎖は、ＮＯＤマウス膵島で、結果としてＴｈ２サイトカインパターンになる（Ramiya et al. (1996) J Autoimmun 9:349-356)。ＩＦＡは、動物モデルで糖尿病予防に試用されるアジュバントのなかでもユニークな存在である。ラミヤおよび共同研究者（上掲）は、アジュバントとしてのミョウバンおよびＤＰＴの両方が使用抗原とは無関係な「非特異的」防御効果を有するけれども、ＩＦＡが動物の糖尿病予防に抗原特異的防御効果を示す唯一のものであると結論した。

【0069】

ＩＦＡ、好ましくはヒト使用に承認されているＩＦＡ、例えばモンタナイド（例えば、モンタナイドＩＳＡ５１、Ｓｅｐｐｉｃ社、フランス）または同等の組成物）は、本明細書中に説明される方法およびワクチンに用いられる好ましいアジュバントである。モンタナイドＩＳＡ５１は、我々の動物において、および、我々のヒト研究で、全身性または有意な局所有害作用を示さなかった。

【0070】

経口投与用に、化合物は、活性化合物と当該技術分野で周知の薬学的に許容される担体とを組わせることによって、容易に処方することができる。そのような担体は、治療されるペイシェントによる経口摂取用に、錠剤、丸剤、糖衣錠、カプセル、液剤、ゲル、シロップ剤、スラリー、懸濁液、およびその他として、本発明の化合物が処方されることを可能にする。経口用の医薬製剤を固体賦形剤として得ることができ、錠剤または糖衣錠核を得ることが望まれる場合、結果として生じた混合物を任意に粉砕し、適当な助剤を添加した後に、顆粒の混合物を加工処理する。適当な賦形剤は、具体的には、ラクトース、スクロース、マンニトール、またはソルビトールを含む糖類などの充填剤、セルロース製剤、例えば、トウモロコシ澱粉、小麦澱粉、米澱粉、ジャガイモ澱粉、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムなど、および／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）である。所望により、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸もしくはその塩（例えば、アルギン酸ナトリウム）などの崩壊剤を加えてもよい。

【0071】

化合物は、例えばボーラス注射または持続静注などの注射による非経口投与用に処方してもよい。注射（静脈または皮下）は、本発明の組成物を投与するための好ましい方法である。注射用の調製物は、単位剤形、例えば、添加防腐剤とともに、アンプルまたは複数回投与用容器で提供されてよい。組成物は、油性または水性媒体中の懸濁液、溶液、またはエマルジョンなどの形態であってもよく、さらに、懸濁剤、安定化剤、および／または分散剤などの配合剤を含有してもよく、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、あるいはアルギン酸またはその塩（例えば、アルギン酸ナトリウム）を添加してもよい

【0072】

いくつかの実施形態では、本明細書中に説明される組み合わせは、皮下注射または筋肉注射によって非経口投与してもよい。いくつかの実施形態では、投与の好ましい方法は、筋注である。例えば、本明細書中に説明されるＩ型糖尿病自己抗原は、少量（例えば、１ｍｌ）の筋肉注射（好ましくは深部筋肉注射）によって投与することができる。自己抗原は、１回または複数回投与し得る。それは、例えば、Ｉ型糖尿病の発症の前に、または、その後に、投与し得る。

【0073】

投与量は、投与経路に依存してもよく、また、宿主の大きさによって変わる。例えば、２ｍｇのヒトインスリンＢ鎖溶液を、ヒト成人に投与することができる。本発明に係る免疫原性組成物に含まれる活性成分タンパク質の濃度は、概して、約１〜９５％である。

【0074】

ワクチンは、アジュバント、例えば、油性アジュバント（例えば、ＩＦＡ）を含み得る。好ましくは、ワクチンはヒト使用に適し、かつ承認されたＩＦＡ、例えばモンタナイドＩＳＡ５１または同等の組成物を含む。

【0075】

ワクチンは、ヒト投与にふさわしい条件の下で調製される。好ましくは、ワクチン注射は、滅菌条件下で、インスリンＢ鎖／ＩＦＡの５０／５０（ｗ／ｗ）エマルジョンとして、高圧滅菌シリンジを用いて投与の直前のエマルジョンとして調製される。

【0076】

本明細書中に説明される方法およびワクチンは、自己免疫疾患（例えば、糖尿病）の発症を防止するのに用いられ得る。方法およびワクチンは、組織（例えば、膵臓β細胞）の自己免疫性の破壊を抑えるのに用いられ得る。方法およびワクチンは、後期でさえ、自己免疫性の破壊の抑制に有用である。例えば、Ｉ型糖尿病の臨床発症時に、有意な数のインスリン産生β細胞が破壊されるが、約１５％、おそらく４０％ほどが依然としてインスリンの産生可能である。これらの細胞は、自己免疫プロセスがたとえその後期においても抑制され得る場合、保存され得る。β細胞は、複製能がある程度限定されており、前駆体は新しいβ細胞を形成可能である。

【0077】

非経口投与に適当な医薬製剤として、水溶性である活性化合物の水溶液が挙げられる。さらに、活性化合物の懸濁液は、適当な油性注射懸濁液として調製されてもよい。適当な親油性溶媒または媒体としては、ゴマ油などの脂肪油またはオレイン酸エチルもしくはトリグリセリドなどの合成脂肪酸エステルまたはリポゾームが挙げられる。水性注射懸濁液は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストランなどの懸濁液の粘度を増加する物質を含んでよい。必要に応じて、懸濁液は、化合物の溶解度を高めて高度に濃縮された溶液の調製を可能にする適当な安定剤または薬剤を含んでもよい。注射用に、本発明の薬剤は、水溶液として、好ましくは、ハンクス液、リンゲル液、または生理食塩緩衝液などの生理学的適合性のある緩衝液として、処方されてもよい。あるいは、活性成分は、使用前に、適当な媒体、例えば滅菌パイロジェンフリー水とともに構成するために粉末状であってもよい。

【0078】

対象に投与されるＣＴＬＡ４分子とインスリンＢ鎖との組み合わせの量は、対象の大きさおよび重さの両方と病勢悪化とに依存する。本明細書中に説明される化合物に関して、治療有効量は、最初に、生体外アッセイから決定され得る。本発明の化合物は、吸収度が低く、かつバイオアベイラビリティが低くいと考えられるので、化合物またはその代謝産物の糞便中の濃度から、あるいは血液由来のバイオマーカからその治療有効量が決定されてもよい。当該技術分野で周知であることから、ヒト用の治療有効量は動物モデルからも決定され得る。治療有効量は、類似の薬理活性を示すことが知られている化合物に関するヒトデータからも、決定され得る。投与量は、既知の化合物と比較して、投与された化合物の相対的な効力に基づいて、調整され得る。

【0079】

本明細書中に説明される化合物を非経口投与する場合のペイシェント服用量は、典型的には約１ｍｇ／日から約１０，０００ｍｇ／日まで、より典型的には約１０ｍｇ／日から約１，０００ｍｇ／日までまたは約２５０ｍｇ／日から約２，０００ｍｇ／日まで、最も典型的には約５０ｍｇ／日から約５００ｍｇ／日までまたは約０．５ｍｇ／日から約１０ｍｇ／日までの範囲である。ペイシェント体重に関して述べられる場合、典型的な投与量範囲は、約０．０１から約１５０ｍｇ／ｋｇ／日まで、より典型的には約０．１から約１５ｍｇ／ｋｇ／日まで、さらに、最も典型的には約１から約１０ｍｇ／ｋｇ／日（例えば５ｍｇ／ｋｇ／日または３ｍｇ／ｋｇ／日）までの範囲である。

【0080】

ＣＴＬＡ４分子およびインスリンＢ鎖は、単回投与で投与可能であり、あるいは、それらを別々に投与してもよく、その場合、別々の投与とは、ほぼ同時に投与、または時間をずらして、例えば一方を朝にして他方を晩に、もしくは一方を１日に２回にして他方を１日に一回にするというように、投与することを意図している。これら２種類の薬は、同時または異なる順番で投与可能である。すなわち、異なる時点で、ＣＴＬＡ４−Ｉｇを最初に、その後にインスリンＢ鎖含有ＩＦＡを投与、またはインスリンＢ鎖を投与して次にＣＴＬＡ４−Ｉｇを投与してもよい。

【0081】

投薬は、ある期間にわたって、例えば１ヶ月に１回または２８日ごとでもよい。いくつかの実施形態において、追加用量（例えば、ボーラス投薬）を処置の開始時に投与してもよい。いくつかの実施形態では、融合タンパク質が約１、３、５、１０、２０、３０、５０、１００ｍｇ／ｋｇ、１回の用量に含まれている。いくつかの実施形態では、糖尿病自己抗原が約１、３、５、１０、２０、３０、４０、５０、１００、５００μｇ／ｋｇ、１回の用量に含まれている。

【0082】

本明細書中で用いられる用語の定義は、化学および薬学分野において各用語について認められる現在最高水準の定義が包含されるものとする。必要に応じて、実例を示す。本明細書中に用いられる用語には、特定の例で別段の定めがない限り、個々に、または、より大きな群の一部として、この明細書全体を通して用いられるように、定義が適用される。

【0083】

本明細書中に用いられるように、用語「投与すること」または「投与」は、意図した作用部位に化合物を直接または間接的に送達することについての全ての手段を包含することを意図している。

【0084】

本明細書中で用いられる「自己抗原」は、正常細胞または組織の構成要素であるにもかかわらず、対象の体液性または細胞性免疫反応の標的になり得るタンパク質である。例えば、糖尿病Ｉ型自己抗原は、典型的に、膵臓細胞の正常なタンパク質構成要素である。本明細書中に説明される自己抗原の「免疫活性フラグメント」は１または複数のアミノ酸残基が欠失した自己抗原であり、フラグメントは、免疫細胞もしくは自己抗原抗体と反応する能力、または、自己抗原に対する抗体産生を刺激する能力を保持する。例えば、免疫活性フラグメントは、複数の残基がアミノ末端および／またはカルボキシル末端から連続して欠失していながら免疫原性活性を実質的に保持している自己抗原ポリペプチドであり得る。例えば、インスリンＢ鎖（配列番号１のアミノ酸２５〜５４）はプレプロインスリンの免疫活性フラグメントであり、配列番号１の３３〜４７のアミノ酸を含むポリペプチドはＢ鎖の免疫活性フラグメントであり、配列番号３の約６００〜９７９のアミノ酸を含むポリペプチドはＩＡ−２の免疫活性フラグメントを含む。好ましい実施形態では、免疫活性フラグメントは配列番号１〜６のいずれかのフラグメントである。好ましいフラグメントは、生来の自己抗原の１または複数の生物活性を欠いているが、自己抗原抗体および免疫細胞と反応する能力を保持する。例えば、好ましいインスリンフラグメントまたは変異体は、血糖低下作用がない。好ましくは、本明細書中に説明される自己抗原の免疫活性フラグメントの長さは、４から４００アミノ酸残基の間、より好ましくは長さ１０から３００アミノ酸残基の間、より好ましくは長さ３０から２００アミノ酸残基の間である。

【0085】

糖尿病の進行を遅延させるという文脈において本明細書中に用いられる文言である「進行の遅延」は、Ｉ型糖尿病の臨床発症後に機能的な残余β細胞塊の減失が遅れることを意味する。Ｔ１ＤＭの進行の遅延は、例えばＣペプチド産生を測定することで、判断され得る。

【0086】

本明細書中に説明される自己抗原の「免疫活性変異体」は、自己抗原であり、この自己抗原は、天然の自己抗原において１または複数のアミノ酸残基が付加、修飾、または置換されることによって変化されており、また、免疫細胞または自己抗原抗体と反応する能力、あるいは、自己抗原に対する抗体産生を刺激する能力を保持する。本明細書中に説明される変異体は、対立遺伝子変異体および多型変異体、さらには突然変異タンパク質および融合タンパク質を包含し、それらは自己抗原抗体と結合する能力、または、ヒトの自己抗原に対する免疫反応を生じる能力を保持する。変異体が、例えばヒトにおいて自己抗原と結合する能力または自己抗原に対する免疫反応をもたらす能力を保持する限り、例えば自己抗原のアミノ酸残基の２０％まで、好ましくは10%までを、代替アミノ酸で置換し得る。変異体としては、本明細書中に説明される自己抗原またはそのフラグメントを挙げることができ、該自己抗原は、１または複数のアミノ酸が挿入または付加されているもので、例えば、担体ペプチドに結合または融合した自己抗原である。修飾を有する変異体であり、そのような修飾の例として、人為的なアミノ酸残基、またはリン酸化、スルホン化、もしくはビオチニル化されたアミノ酸残基の取り込みが挙げられる。アミノ酸残基の修飾としては、カルボキシル末端のまたはカルボキシル側鎖含有残基の脂肪族エステルまたはアミド、ヒドロキシル基含有残基のＯ−アシル誘導体、およびアミノ末端アミノ酸またはアミノ基含有残基（例えば、リシンまたはアルギニン）のＮ−アシル誘導体を挙げることが可能である。他の修飾としては、他の部分、特に自己抗原の免疫原性を高めると思われる部分の添加が挙げられる。好ましい変異体は、天然自己抗原の１または複数の生物活性がないが、自己抗原抗体または免疫細胞と反応する能力を保持する。例えば、好ましいインスリン変異体は、血糖低下作用がない。

【0087】

「薬学的に許容される」という文言は、哺乳類（例えば、ヒト）などの動物に投与された場合に生理学的に許容されて、概してアレルギーまたは類似の有害反応、例えば異常行進、めまい感、およびその他を生ずることがない添加剤または組成物のことを指す。「薬学的に許容される担体」という用語は、所望される特定の剤形に適するように、任意または全ての溶媒、希釈剤、または他の液媒体、分散助剤または懸濁助剤、界面活性剤、等張剤、増稠剤または乳化剤、防腐剤、固体結合剤、潤滑剤、およびその他を含む。Remington's, The Science and Practice of Pharmacy, （Gennaro, A. R., ed., 19^th edition, 1995, Mack Pub. Co.)）は、医薬組成物の処方に用いられる様々な担体とその調製に関する既知の技術とを開示している。任意の従来の搬送媒体の使用は、例えば、何らかの望ましくない生体影響を生ずることにより、または、さもなければ有害の方法で医薬組成物の任意の他の成分と相互作用することにより、それが本明細書中に提供される化合物に適合しない場合を除き、この発明の範囲内であると考えられる。薬学的に許容される担体として機能し得る材料のいくつかの例として、限定されるものではないが、ラクトース、グルコース、およびスクロースなどの糖類;トウモロコシ澱粉およびジャガイモ澱粉などの澱粉類;セルロースとその誘導体、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、および酢酸セルロース;トラガント末;モルト;ゼラチン;タルクが挙げられる。カカオ脂および坐剤ワックスなどの賦形剤;落花生油、綿実油、サフラワー油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油およびダイズ油などの油類;プロピレングリコールなどのグリコール類;オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチルなどのエステル類;寒天;水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムなどの緩衝剤;アルギン酸;パイロジェンフリー水;等張性食塩水;リンゲル液;エチルアルコール、ならびにリン酸緩衝液、さらに、ラウリル硫酸ナトリウムおよびステアリン酸マグネシウムなどの他の非毒性相溶性潤滑油が挙げられる。さらに、着色剤、離型剤、コーティング剤、甘味剤、香料剤、芳香剤、防腐剤、ならびに抗酸化剤もまた、配合者の判断によって、組成物に存在し得る。

【0088】

用語「医薬組成物」は、他の薬剤（例えば担体および／または賦形剤）を伴う本明細書中に説明される組成物またはその薬学的に許容される塩類を指す。好ましくは、医薬組成物は、少なくとも９５％の純度または９８％純度または９９％純度、またはそれ以上で存在する有効成分を有する。

【0089】

本明細書中で用いられる用語「対象」は、糖尿病、糖尿病前症、または糖尿病の素因を有するヒトまたは他の動物である。したがって、いくつかの実施形態では、対象は、本明細書中に提供される治療処置を必要とする。好ましいペイシェントは、哺乳類である。ペイシェントの例としては、限定されるものではないが、ヒト、ウマ、サル、イヌ、ネコ、マウス、率、ウシ、ブタ、ヤギ、およびヒツジが挙げられる。いくつかの実施形態では、「対象」は通常、糖尿病を罹患しているヒト患者である。いくつかの実施形態では、「対象」は、２００、１００または５０日以内にＴ１ＤＭと診断されたヒト患者である。いくつかの実施形態では、「対象」は、糖尿病と診断されたが、まだ残余β細胞機能があるヒト患者である。そのようないくつかの実施形態では、残余β細胞機能は検出可能であるか、または、完全に機能している膵臓の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、またはそれ以上のβ細胞である。

【0090】

用語「治療有効量」は、細胞培養、組織系、動物、またはヒトにおいて所望の生物学的または医学的応答（例えば、所望の治療結果）を達成するべく、投与量で、かつ必要な期間にわたって、有効な量を指す。組成物の治療有効量は、個人の疾患状態、年齢、性別、および体重、ならびに、該個人において所望の応答を誘発するＣＴＬＡ４分子および／または糖尿病自己抗原の能力などの因子によって、変化する場合がある。治療有効量は、薬物のあらゆる中毒性または有害な影響よりも治療的に有益な効果が上回るものでもある。いくつかの実施形態では、反応としては、処置されている疾患、状態、または障害の１または複数の症状の発症の軽減および／または遅延が挙げられる。

【0091】

本明細書中で用いられる用語「処置」または「処置している」は、対象に対する治療薬の適用もしくは投与として、または、糖尿病、疾患の症状または疾患に関する素因を有する対象からの単離組織または細胞株に対する治療薬の適用もしくは投与として定義される。処置は、疾患の発症を予防したり、進行を遅らせたり、後退させたり、あるいはさもなければ、疾患、疾患の症状、または疾患に関する素因の改善、向上、または影響を及ぼすことを包含するように、意図されている。例えば、本明細書中に説明される組成物による対象、例えばヒト対象の処置は、自己免疫疾患の進行、例えば、Ｉ型糖尿病の臨床発症の前、その間、またはその後の対象の膵臓β細胞に対する反応を遅らせたり、改善したり、または止めたりすることができる。

【0092】

用語「約」または「ほぼ」は、当業者によって決定される特定の値に関する許容誤差範囲内にあることを意味しており、それは、どのようにして値が測定または決定されたか、例えば、測定系の限界または特定の目的に必要とされる精度に、部分的には依存する。例えば、当該技術分野における慣例にしたがって、標準偏差１または２の範囲内であることを意味し得る。あるいは、「約」は、所与の値の最大で２０％まで、好ましくは最大で１０％まで、より好ましくは最大で５％までの範囲を意味し得る。特定の値が本出願および特許請求の範囲に記載されている場合、特に明記しない限り、特定の値の許容誤差範囲内であることを意味する用語「約」が想定されるものとする。

【0093】

本明細書中および添付の特許請求の範囲中で用いられるように、英語の"ａ"、"ａｎ"、および"ｔｈｅ"に相当する単数表現は、その内容について別段のはっきりした指示がない限り、複数の指示対象を含む。このように、例えば、「分子」への言及は、そのような分子を１または複数含み、また「樹脂」は、そのような樹脂を１または複数種類含む。さらに、「方法」への言及は、本明細書中に説明される方法に変更または置き換え可能であり、当業者に公知の、同等のステップおよび方法に対する言及を含む。

【0094】

上記の説明は、例および種々の実施形態の具体的な詳細を提供するが、それは説明された実施形態のいくつかの特徴および／または機能が、説明された実施形態の範囲から逸脱することなく変更を認めることはいうまでもない。上記説明は、本発明を例示することを意図され、その範囲は、添付の特許請求の範囲の文言によってのみ限定される。実施例

【0095】

出願人の教示の態様は、以下の実施例に照らして理解可能であり、該実施例は、いかなる形であれ、本出願人の教示の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。実施例１−アバタセプトの投与

【0096】

本研究のために、過去１００日以内にＩ型糖尿病と診断された患者（６〜４５歳）を並行して検査した。患者の本研究参加資格は、該患者が少なくとも１つの糖尿病関連自己抗体（微量検定されたインスリン抗体［インスリン療法の継続が７日未満である場合］グルタミン酸脱炭酸酵素−６５［ＧＡＤ−６５］抗体、膵島細胞抗原−５１２［ＩＣＡ５１２］抗体、または膵島細胞自己抗体）を有するとともに、糖尿病と診断されてから少なくとも２１日後かつランダム化の３７日以内に、混合食負荷試験（ＭＭＴＴ）実施中に測定された刺激Ｃペプチド濃度が０．２ｎｍｏｌ／Ｌまたはそれ以上であった場合とした。

【0097】

血液サンプルがＢ型肝炎表面抗原、Ｃ型肝炎、またはＨＩＶに対する血清抗体が陽性であると判断された人々は参加させなかった。サンプルを、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）についても検査した。スクリーニング時にＥＢＶ感染のエビデンスがあった人を不適格とした。ランダム化の後、ＥＢＶ感染の徴候を示した参加者に対して、消散されるまで、さらなる試験薬の投与を行わなかった。

【0098】

二重盲検プロトコルを用いて、アバタセプトまたはプラセボで実験的処置を受けるべく、2:1の比率（参加拠点によって層化）で、患者を無作為に割り当てた。表１は、参加者の基準人口統計学的および研究室的特性を提供する。

【表1】

【0099】

データは、ｎ（％）、平均（ＳＤ）または中央値（範囲）である。ＡＵＣ＝曲線下面積ＨｂＡ１ｃ＝糖化ヘモグロビンＡ１ｃ

【0100】

＊示された変数のデータが欠けている参加者を除外（不明数：人種、１；ＨｂＡ１ｃ、２；インスリン使用、１；ＨＬＡ対立遺伝子の状態、４）。†蛍光抗体法による検査が実施されていない患者１６人の膵島細胞自己抗体（カウントが陰性であるとみなす）。‡アバタセプト群の範囲５１〜１０８およびプラセボ群の範囲３８〜１０７。

【0101】

アバタセプト（オレンシア、ブリストル・マイヤーズスクイブ社、米国ニュージャージー州プリンストン市）を、０．９％塩化ナトリウム注入液１００ｍＬ中１０ｍｇ／ｋｇ（１回の投薬あたり最大１０００ｍｇ）の用量で３０分間静脈注入することにより、１日目、１４日目、および２８日目、さらにその後２８日ごとに投与し、７００日目に最終の投薬とした（総投薬回数２７）。通常の生理食塩溶液注入液を、プラセボとして用いた。患者は、いかなる前投薬も受けなかった。

【0102】

すべての患者は、集中糖尿病管理を受けた。 目的は、米国糖尿病協会によって推奨されるように、集中的血糖管理を成し遂げることであった（American Diabetes Association. Diabetes Care 2011; 33 (suppl 1): S11-61）。患者は、インスリン頻回注射またはインスリン注入ポンプを使用した。血糖モニタリングは、頻繁な日常的血糖モニタリングによっておこなった。血糖管理に影響を及ぼす非インスリン医薬の使用を認めなかった。

【0103】

血液サンプルを中心的に分析した。Ｃペプチド濃度を、二部位免疫酵素測定装置（トーソー・バイオサイエンス社、米国カリフォルニア州サウスサンフランシスコ市）により、凍結血漿から測定した。糖化ヘモグロビンＡ１ｃ（ＨｂＡ１ｃ）を、イオン交換高速液体クロマトグラフィ（Ｖａｒｉａｎｔ ＩＩ、バイオラッド・ダイアクソスティック社、米国カリフォルニア州ハーキュリーズ）で測定した。各アッセイの信頼度係数は、分割二重反復サンプル（split duplicate samples）から０．９９を上回った。生化学的自己抗体（微量検定インスリン抗体、ＧＡＤ６５抗体、ICA５１２抗体）を放射免疫結合アッセイで測定し、膵島細胞自己抗体（ＩＣＡ）を間接蛍光抗体法で測定した。ルーチンの化学検査を実施した（ロッシュ・ダイアグノスティックス社［米国インディアナ州インディアナポリス］のＨｉｔａｃｈｉ ９１７ Ａｎａｌｙｚｅｒおよび試薬）。ＨＬＡクラスＩＩ対立遺伝子を、ＰＣＲ増幅および配列特異的雑種形成で測定した。β細胞機能を、刺激Ｃペプチド分泌によって評価した。本研究の事前に明示された主要転帰を、２４ヶ月の来診時に実施された４−ｈ ＭＭＴＴ２の最初の２時間にわたる刺激Ｃペプチド応答の曲線下面積（ＡＵＣ）の対照とした。４−ｈ ＭＭＴＴを、ベースラインの時点および２４ヶ月の時点に実施した。２−ｈ ＭＭＴＴを、３、６、１２、および１８ヶ月の時点で得た。２年間の来診ＭＭＴＴを完了した患者を主要転帰の評価に含んだ。２年間の処置期間完了後、参加者は２年間の追跡調査期間に入り、６ヶ月ごとにＭＭＴＴを含む安全性および有効性の評価を続けた。事前特定された二次転帰には、経時的なＣペプチドの傾き、０．２ｎｍｏｌ／Ｌ未満へピークＣペプチドが減失する発生率における群間の差、経時的なＨｂＡ１ｃおよびインスリン投与量の差ならびに安全性が含まれた。事前特定されたサブグループ因子は、年齢、性別、人種、ベースラインＣペプチド、ベースラインインスリン使用、ベースラインＨｂＡ１ｃ、およびＨＬＡ型を含んだ。

【0104】

Ｓｐｏｔｆｉｒｅ Ｓ＋ ８．１（統計解析ソフトウェア）を、すべての分析に用いた。８５％検定力を提供してプラセボ群に対して幾何平均Ｃペプチドの５０％増加を検出するべく、標本の大きさを参加者１０８人と計画した。この際、追跡調査に対する１０％の減失と処置群ｖｓ対照群に対する２：１の割り当てとによる０．０５水準（片側）での検定（変換スケールで推定平均値０．２４８とＳＤ０．１７９に基づく）を用いた。すべての分析は、既知の測定で事前特定されたＩｎｔｅｎｔｉｏｎ−ｔｏ−Ｔｒｅａｔコホートに基づいた。欠測値は、ランダムに失われていると想定した。試験の設計が片側仮説検定に基づいたにもかかわらず、主要および副次的エンドポイントのIｎｔｅｎｔｉｏｎ−ｔｏ−Tｒｅａｔ処置比較と関連したｐ値は両側性である。オブライエン−フレミング境界線によるＬａｎとＤｅＭｅｔｓの方法に基づいて一度、エンドポイント処置効果の中間解析を実施し、データおよび安全モニタリング委員会に報告した（Lan KKG、DeMets DL。Biometrika 1983; 70：659-63）。Ｃペプチド平均ＡＵＣ、ＨｂＡ１ｃ、および総１日インスリン投与量に関する事前特定された分析法は、年齢、性別、従属変数のベースライン値、および処置割り当てを調整する共分散分析モデルであった。各処置群の推定平均および関連９５％信頼区間（ＣＩ）を、他の共変量の平均で確立した。処置効果に関連した有意水準を、ウォールド試験（適したモデルから）から得た。ｌｏｇ（ＸＣ−Ｐｅｐ＋１）の正規化変換を、ＣペプチドＡＵＣ平均について事前特定し、残余の正常なプロットはそれが十分なことを示唆した。Ｃペプチド平均ＡＵＣは、２時間間隔で割ったＡＵＣ（すなわち、ＡＵＣ／１２０）に等しい。ＡＵＣの計算は、ＭＭＴＴの過程でＣペプチドの指定時刻測定から台形法を用いておこなった。０．２ｎｍｏｌ／Ｌ未満である第１の刺激ピークＣペプチド（それを上回る値は糖尿病制御および合併症トライアルにおける合併症のリスクの減少に関連）に対する時間を、標準生存方法（Standard survival method）（Ｃｏｘモデルおよびカプラン―マイヤー法）で分析した。有害事象等級を、ウィルコクソン順位和検定で分析した（Agresti A. Categorical data analysis. New York, NY, USA: John Wiley and Sons, 1990）。６から２４ヶ月のＣペプチド平均ＡＵＣの平均変化率を、年齢、性別、ベースラインＣペプチド平均ＡＵＣ、および処置割り当てに合わせて調整されるランダムな切片および傾きの両方を有する混合効果モデルで推定した。最初の適合度は、処置と時間との一定の相互作用効果が含まれるが、ゼロ以外であることの何らかの統計的証拠が欠如していることから、それを取り除いた。全ての時間にわたる処置効果を評価するために、我々は、構成なしで時間を定義して、かつ６ヶ月間隔までにグループ化された差で、類似の混合模型をデータに合わせた。

【0105】

本研究で登録される患者１１２人のうち、７７人がアバタセプトによる実験的処置を受けられるように無作為に割り当て、３５人がプラセボを受けられるように割り当てた。表１は、２つの群のベースライン特性をまとめたものである。唯一の注目すべきアンバランスは、アバタセプト群よりもプラセボ群において男性の比率が高く、また平均HbA1cがプラセボ群でより高かった。処置群によって実際に投与された注入の数を、ウィルコクソン順位和検定を使用して比較したところ、有意差は、検出されなかった（ｐ＝０．６１）。全体として、３０２４の可能な注入のうちの２５１４（８３％）を投与し、投与されていない多くは、パープロトコルであった（例えば、患者はＥＢＶ感染を発症または妊娠した）。７３８の予想ＭＭＴＴのうちの６８９（９３％）が実施された。２年時の一義的分析において、アバタセプトに割り当てられる参加者の幾何平均刺激Ｃペプチド２−ｈ ＡＵＣは、０．３７５ｎｍｏｌ／Ｌ（９５％ＣＩ ０．２９０〜０．４６５）であり、それに対して、プラセボに割り当てられたものでは、０．２６６ｎｍｏｌ／Ｌの（０．１７１〜０．３６８）であった。２年時の調整母集団Ｃペプチド平均２−ｈ ＡＵＣは、アバタセプト群では０．３７８ｎｍｏｌ／Ｌであり、プラセボ群では０．２３８ｎｍｏｌ／Ｌであった。このように、２年時のＣペプチドＡＵＣは、アバタセプト（ｐ＝０．００２９）よりも５９％（９５％ＣＩ ６．１〜１１２）高かった。ベースラインＨｂＡ１ｃが共変量として加えられた場合、結果は不変かつ有意（ｐ＝０．００２８）のままであった。ベースラインから２年の評価（主要エンドポイント）までＣペプチド濃度の差に対処するために、３、６、１２、および１８ヶ月間のＣペプチド結果を、別々にモデル化した。

【0106】

図１は、２年を上回る調整母集団Ｃペプチド平均２−ｈ ＡＵＣを示す。アバタセプトを投与された患者は、プラセボに割り当てられた患者よりも、６、１２、および１８ヶ月での平均ＡＵＣが有意に高く、集計のすべての時点にわたっていた（ｐ＝０．００２２）。Ｃペプチド減少の遅延に対する処置効果を算出するために、我々は経時的に処置群によって平均ＣペプチドＡＵＣの予測母平均を算出した（図２）。直線は、６、１２、１８、および２４ヶ月時にＭＭＴＴからの利用可能なデータすべてを用いて、混合線形モデルのあてはめに基づいている。傾きと処置との間の相互作用項の適合における改善を試験したところ（すなわち、２種類の処置群が異なるＣペプチド崩壊速度を有したという証拠を試験）、この結果は有意でなかった（ｐ＝０．８５）。したがって、同一の傾きを仮定しているより単純なモデルを用いた。さらに、図２はこれらの結果を示す。したがって、プラセボ群の平均における推定遅延時間と同じレベルまで落ちるアバタセプト群の平均における推定遅延時間は、９．６ヶ月（９５％ＣＩ ３．４７〜１５．６）であった。２４ヶ月の評価によって、アバタセプト群の患者（３２％）は、プラセボ群の患者１５人（４３％）と比較して、０．２ｎｍｏｌ／Ｌ未満のＡＵＣピーク刺激Ｃペプチドを有した（図３）。０．２ｎｍｏｌ／Ｌ未満であるピークＣペプチド落下の調整された相対的（アバタセプト群とプラセボ群との間）リスクは、０．４３３（９５％ＣＩ０．２１８〜０．８６１）であった。追跡調査の２４ヶ月の間に、アバタセプト群はプラセボ群よりも、低い補正平均ＨｂＡ１ｃ（図４Ａおよび図４Ｂ）を有した（集計内のすべての時点で、ｐ＝０．００２）。しかし、ＨｂＡ１ｃはベースラインよりも低かった。それにもかかわらず、ベースラインの差の補正後さえ、２４ヶ月に関する処置群差は、残存する（ｐ＝０．００７１）。試験終了時、アバタセプトの患者３４人（４７％）は、プラセボの８人（２６％）と比較して、ＨｂＡ１ｃが７％未満であった。すべての患者の８６％が１８歳未満であったので、これは特に注目に値する。この群では、このＨｂＡ１ｃは、年齢別ＡＤＡがＨｂＡ１ｃを目標とするということである。アバタセプト群の参加者は本研究の間、いくつかの時点（６ヶ月および１２ヶ月）でインスリン投与量が少なかった。しかし、２４ヶ月では、２つの群のインスリン投与量は類似していた（図４Ａおよび図４Ｂ、２４ヶ月目でｐ＝ＮＳ、しかし、より早い時点での差を理由として、集計内の全ての時点に関してｐ＝０．０４０）。

【0107】

図５は、年齢、性別、人種、ベースラインＣペプチド、ベースラインインスリン使用、ベースラインＨｂＡ１ｃ、およびＨＬＡ型に対する処置効果の均一性検定の結果を示す。白人でない参加者におけるアバタセプトの明らかな有害作用は、仮説を立てることになるかもしれない。しかし、群の大きさは小さかった。

【0108】

表２および表３は、安全性と有害事象をまとめたものである。アバタセプトは忍容性が高かった。注入関連の有害事象は低頻度（患者２７人が関与する２５１４回の注入のうち４７回［２％］）で生じ、臨床的に有意ではなかった。これらのうち、アバタセプトの患者７７人のうちの１７人（２２％）に３６の反応が生じ、１１の反応がプラセボの患者３５人のうちの６人（１７％）に生じた（フィッシャー正確検定による参加者の比率についてｐ＝０．６２）。全体の有害事象率（検査室異常を含む）は、２群間の差が無く低かった。具体的には、感染（ＥＢＶを含む）の増加は無く、または好中球減少症の増加は無かった（生じたのはアバタセプトの患者７人［９％］、プラセボの５人［１４％］）。有害事象として報告される７例の低血糖があり、そのうちの２つは重篤な低血糖（各群に１例）であった。表２は、有害作用の最悪等級による患者数を示す。

【表2】

【0109】

データは、n（%）である。処置群による最悪等級は、ウィルコクソン順位和検定と統計学的に異ならなかった。＊事故死（研究に無関係）。表３は、事象の数と有害事象別の患者とを示す。

【表3】

【0110】

データは、ｎまたはｎ（％）である。処置群による有害作用カテゴリーは、片側（アバタセプト群ではより高い頻度の代わり）フィッシャー正確検定で試験した。全身症状だけは、有意だった（ｐ＝０．０４９）。＊事故死（研究に無関係）。†低血糖以外。

【0111】

結果は、アバタセプトによる２年を上回る共刺激調節は、９．６ヶ月までの発症間もないＩ型糖尿病のβ細胞機能の減少を遅らせることを、示している。初期の有益な効果は、疾患経過がおそらく数年間進行中だった場合であっても、Ｔ細胞活性化が依然としてＩ型糖尿病の臨床診断の前後に生ずることが示唆される。しかし、２４ヶ月にわたるアバタセプトの連続投与にもかかわらず、６ヶ月から２４ヶ月までの時間間隔を含んだ混合モデルの結果に基づいて、アバタセプト群のβ細胞機能の低下はプラセボ群のそれに匹敵する。β細胞機能におけるこの後続減少は、我々に疾患の臨床経過が進行するにつれて、継続的なＴ細胞活性化がおさまると推測させる。にもかかわらず、プラセボ群との差は、投薬の間、維持される。さらに観察することで、月々のアバタセプト注入を停止した後でも有益な効果が続くかどうかが立証されよう。これらの患者の追跡は、薬の有益な効果が少なくとも1年間にわたる投薬を越えて続くことを示している。

【0112】

有害事象において２群間に差が無く、アバタセプトは忍容性が高かった。しかし、臨床適用性に対する潜在的限界は、アバタセプト処置の３ヶ月以内に生ワクチンを使うことができないということである。この因子は、目標集団の幼齢を鑑みて重要かもしれない。主作用は、β細胞機能の低下のその後の再開で処置の開始の後早く起こるようである。このパターンは、抗ＣＤ３、抗ＣＤ２０、およびＧＡＤ−６５ワクチンの効果を思わせ、それらの全てが対照群の場合に匹敵するβ細胞機能の減少が後に追従するある程度の有効性を示した。しかし、採用した他のインターベンションとは異なり、ほとんどこれといった副作用がないことから、このアプローチは目立つ。この知見は、Ｔ細胞活性化が顕著であるという診断後に早い好機があるという我々の認識と一致する。我々の研究において２４ヶ月目のアバタセプトによる平均ＡＵＣ Ｃペプチドがプラセボによるものよりも59%高いということは、他のそれらのインターベンションで見られるものと類似しているが、研究を直接比較するのは難しい。その理由として、年齢、無作為化時の疾患期間、およびベースラインＨｂＡ１ｃを含む重要なベースライン特性に差があるからである。さらに、我々の研究は、それらの研究と以下の点で異なる。すなわち、本研究の全体を通じてアバタセプトを連続投与し、一方、抗ＣＤ３、抗ＣＤ２０、ＧＡＤ−６５ワクチンの場合、薬の投与は、無作為化後２〜４週以内に完了した。重要なことは、我々の研究は、短期間処置プロトコルは２年を上回るＣペプチド分泌を維持するのに十分かどうか、または、処置の継続が２年を越えて必要であるかどうかを確証するべく、設計されなかったとことである。アバタセプトによる経過が完了した全患者で、本研究の進行中の追跡調査期間は、改善されたＣペプチド分泌が本剤の中断後も持続し、かつどれぐらい長く持続するかを調査する。１回の抗ＣＤ３試験における患者の長期追跡調査は、処置群とプラセボ群との間のＣペプチド分泌の差が３年後に減弱していることを示した。このことは、アバタセプトの場合は異なる。１年おきの処置に関するデータは、有益な効果が維持されており、アバタセプト処置群とプラセボ群との間のＣペプチド温存の差は減少しなかった（３年目においてアバタセプト群はプラセボ群よりも62%多くＣペプチドを有する）。

【0113】

アバタセプト群において、平均ＨｂＡ１ｃは、試験期間中、プラセボ群よりも低く、たとえベースラインでも、より低かった。研究参加者９６人（８６％）が１８歳またはそれ以下であったことから、アバタセプト処置群において１８ヶ月間にわたってＨｂＡ１ｃが７％未満に維持されていることは、注目に値する。このレベルでのＨｂＡ１ｃの臨床的重要性は、文書で十分に裏付けられている（The Diabetes Control and Complications Trial Research Group. N Engl. J Med 1993; 329: 977-86）。インスリン使用は２群で類似しており、ＨｂＡ１ｃの差に関与しなかった。我々の試験では、Ｉ型糖尿病の発症間もないアバタセプト処置患者は、試験薬投与２年間の間、Ｃペプチドで測定される内因性インスリンの産生がより多かった。これらの患者の進行中の追跡調査において、アバタセプト中断後のこれらの効果の持続時間を試験した。１年おきの治療データは、アバタセプト群において３年目の有意に良好なＨｂＡ１ｃを含むアバタセプトの有益な効果が投薬後少なくとも１年間にわたって持続することを示している。患者は、さらに経過観察されている。アバタセプトを２年以上投与することで、Ｉ型糖尿病患者で優れた安全性プロフィールが示された。その主作用は、処置の開始の後早く起こると思われる。しかし、この薬が自己免疫を遅くする際にどの程度自己免疫プロセスに有効でありえるかについて調べるためにさらなる研究が必要である。これらのアプローチは、アバタセプトの皮下バージョンで、より容易に試験可能である。実施例２ インスリンＢ鎖の調製

【0114】

ヒトインスリンの作製を、標準的な固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）方法によりおこなった。この方法は、本明細書中に説明され、かつ参照により本明細書中に援用される米国特許出願公開第２００６／０１８３６７０号で説明されている。ＡＢＩ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ Ｉｎｃ．）−Ｆｍｏｃ／Ｔｈｒをタンパク質合成で用いられるアセンブリ戦略とした。Ｆｍｏｃ基は、アミノ酸のα−アミノ基を保護する。ペプチドの合成は、固体担体（樹脂）に結合した開始アミノ酸のα−カルボキシル基を用いて、Ｃ末端からＮ末端に向けておこなった。この合成に用いた樹脂は、大きさが４００〜１０００ミクロンであり、かつＮＭＰ（Ｎ−メチルピロリドン）による洗浄後に膨潤する不溶性支持体である、ポリスチレンビーズである。この樹脂を、第１のアミノ酸（Ｔｈｒ）でＣ末端からプレロードした。

【0115】

２つのステップを、滅菌条件下での鎖合成および精製とした。

【0116】

鎖合成の第１のステップは脱保護または保護基の除去である。Ｆｍｏｃ保護基を、２２％ピペリジンによって除去する。ピペリジン／ＮＭＰによりＦｍｏｃ基の除去を介して形成されるカルバミン酸塩の電気伝導度フィードバックは、結合有効性を示した。脱保護の後、次のアミノ酸が活性化されて、成長するペプチドの脱保護されたアミノ末端に結合してペプチド結合を形成する。入って来るアミノ酸カルボキシル基の活性化を、ＨＢＴＵ／ＨＯＢｔによって達成した。結合と結合との間に、樹脂を膨潤させて残基を洗い落とすメタノールおよびＮＭＰ（Ｎ−メチルピロリドン）で、カラムを洗浄した。

【0117】

所望の長さのペプチドが達成されるまで、サイクルを繰り返した。樹脂からＮＭＰを除去するＤＣＭ（ジクロロメタン）により洗浄し、続けて、蒸発して乾燥する除去容易な溶媒である高揮発性メタノールで徹底的に洗浄するステップを実施した。

【0118】

樹脂からの分割と側鎖保護基の除去。分割混合物を調製した（０．７５ｇ結晶フェノール＋０．２５ｇエタンジチオール＋０．５ｍｌチオアニソールｌ＋０．５ｍｌは、脱イオンＨ_２Ｏ＋１０ｍｌトリフルオロ酢酸）。乾燥ペプチド樹脂を、１．５時間、氷浴の冷フラスコでインキュベートした（１０ｍｌ混合物／１００〜１５０ｍｇペプチド樹脂）。次に、高真空下、ガラス漏斗濾過によって、ペプチドを反応混合物から単離した。ペプチドを冷メチルｔ−ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）で沈殿させ、真空乾燥した。

【0119】

滅菌条件下の精製ステップを逆相ＨＰＬＣでおこなった。緩衝Ａ＝０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）および緩衝Ｂ＝７０％アセトニトリル、３０％のＨ_２Ｏ、０．０９％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）。Ｃ１８カラムを用いて、サンプルの溶離は、疎水性に基づいた（疎水性サンプルは、より早く溶出する）。ピークの検出を、２１４ｎｍでペプチド結合の吸光度測定によって実施し、質量分析法により同定した。所望の画分を滅菌バイアルにプールし、該画分をＡＡＡ（アミノ酸分析）分析ｒｐＨＰＬＣおよび質量分析法用に採取したサンプルとともに凍結乾燥した。

【0120】

生じたＢ鎖の品質管理試験の結果によれば、ｐＨ３．５〜４．５の透明な溶液であり、Bio-Rad Assay Bio-Rad Laboratoriesを用いて測定されたタンパク質濃度が３．５〜４．５ｍｇ／ｍｌ（３．８２ｍｇ／ｍｌ）であることが示された。ヒトインスリンＲＩＡの免疫反応性／効力は、Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓｋｉｔを用いたところ、１０〜３０ｕＵ／ｍｇタンパク質／ｍｌ（８０．２μＵ／ｍｌ）であった。ＨＰＬＣを使用して純度を測定し、＜５００ｐｐｍ（＜２０ｐｐｍ）に対応して少なくとも９５％（＞９９％）の領域ｐ ％を得た。Ｂ鎖の同一性を、質量分析法を用いて確認したところ、質量が３４００〜３４５０Ｄａ（単一主要ピーク３４２８．７Ｄａ）であることが示された。アミノ酸配列分析装置によってヒトＢ鎖インスリン配列が３０個のアミノ酸からなることが示された。パイロジェンを標準的なＵＳＰ方法で測定したところ、パイロジェンが無であるという要件を満たしている。パイロジェンが無である場合の滅菌性も測定し、そのペプチドが無菌であるとわかった。

【0121】

インスリンＢ鎖を処理して、その溶解性を高めること、例えば、その疎水性の効果を無効にすることができる。このことは、二量体化を回避するべく、酸性化によって、および／または、４Ｍ尿素を用いて、および／または、ＤＴＴによりシステインを還元することによって、実行し得る。実施例3−インスリンＢ鎖の投与

【0122】

糖尿病を起こしやすいＢＢＤＰ／ＷＯＲラット（ＮＯＤマウスとは別のＩ型糖尿病の唯一の他の動物モデル）に対して、該ラットの一生涯において糖尿病およびインスリン炎に罹患していない時期に、ＩＢＣ（ＩＦＡのインスリンＢ鎖）ワクチンを投与したところ、低用量も高用量も、初期のインスリン炎または糖尿病を誘発しなかった。

【0123】

ＢＢＤＰ／ＷＯＲラット（ラット６匹／群）から得た血清サンプルをインスリン抗体について分析した。有意差が、媒体対照群と１００μｇインスリンＢ鎖／ラット投与量および５００μｇインスリンＢ鎖／ラットとの間にあった（２３．６μＵ／ｍｌ＋３．９ＳＥ対３７．９μＵ／ｍｌ＋４．５ＳＥおよび４４．５μＵ／ｍｌ＋３．３ＳＥ、それぞれの有意差ｐ＝０．０３およびｐ＝０．００２、インスリン抗体価において低用量群と高用量群との間に有意差はない）。ＩＢＣワクチンを、動物に注射する前に新しくて調製した。標本は、１日目および１４日目にサンプリングした。

【0124】

パイロジェンについても、標準的なＵＳＰ方法にしたがってインスリンＢ鎖を分析し、このインスリンＢ鎖がパイロジェン非存在の要件を満たしていることを報告した。

【0125】

ヒト使用に承認されたIFAを用いたので、これらの介入戦略を、ヒト糖尿病で直接適用することができる。ＩＦＡは、ヒトにおいて安全かつ有効である。ＩＦＡは、ＦＤＡで承認されたＨＩＶおよび他のワクチン接種試験（バージニア大学でのペプチド系黒色腫ワクチン）で、現在用いられている。潜在的な局所有害作用は、一般に用いられるいずれのアジュバントワクチン接種（ミョウバンが現在ヒトワクチンで使用されている）にも類似しており、そのような副作用として、硬化、中等度の疼痛、および微熱を挙げることができる。注射は、深い筋肉内腔に少量（１ｍｌ）投与し得るので、局所有害作用が最小化される。

【0126】

組成物は、２つの成分、すなわちアジュバントおよびインスリンＢ鎖を含み、この組成物を、ヒト投与に適した条件下で調製した。第１の成分は、実施例２で説明したように調製および可溶化されたインスリンＢ鎖である。

【0127】

第２の成分は、ＩＦＡ、例えばモンタナイドＩＳＡ５１（Seppic Inc. France; Drug Master-file No: 10870DMF）または同等の組成物である。このＩＦＡを我々の動物試験で使用したところ、全身性または有意な局所有害作用を示さなかった。注射剤は、１８ゲージのスペースコネクタ付き高圧滅菌シリンジを用いて、クリーンベンチ内の滅菌条件下で、 エマルジョンとして投与直前に新しく調製した。２ｍｇのインスリンＢ鎖（０．５ｍｌ）を、モンタナイドＩＳＡ５１（０．５ｍｌ）と混合した。同等の組成物を用いることができる。エマルジョンは、５０／５０の（重量比）エマルジョンである。成人ヒト対象の大腿部にエマルジョンを１ｍｌの量で筋肉注射した。

【0128】

本明細書中に説明されるワクチンに対して包括的な毒性学／安全性研究を実施した。インスリンＢ鎖／ＩＦＡワクチンの筋肉注射をオスＢＢＤＰ／ＷＯＲおよびＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットに対して、１日目、７日目、および１４日目に１００および５００μｇ／ラットの用量で投与し、その後、１４日間の観察したところ、臨床観察、体重、摂取量、臨床病理（血液学、凝固、および臨床化学）、ならびに臓器重量に対する毒性学的な有意な効果は得られなかった。肉眼的評価（全ての動物）および顕微鏡的評価（低用量群、高用量群、および媒体対照群のＢＢＤＰ／ＷＯＲラット）によれば、注射部位に変化が生ずることが示された。実施例4−併用の前臨床研究

【0129】

完全に糖尿病であるＮＯＤマウスにおけるヒトインスリンＢ鎖ワクチン併用療法によるＣＴＬＡ４−Ｉｇは、これらの動物で糖尿病を改善するようには思えない。したがって、この併用療法では、すでに糖尿病に罹患しているＮＯＤマウスは治癒されなかった。抗ＣＤ３のような強力な免疫抑制のみがＮＯＤ集団の糖尿病を治癒すると既に観察されていたので、そのような結果は、驚くべきものではない。しかし、単独でアバタセプトまたはＢ鎖ワクチンであるより、生存はＢ鎖ワクチンが続くアバタセプトから始めている併用療法でより良好だった。このように、臨床的に有用効果を提供した。ＮＯＤの糖尿病は、ヒトにおける糖尿病と比較して、顕症期の自己免疫プロセスである。糖尿病発症直後のＮＯＤマウス（＞１０週齢； Ｌｅｎｓｃｈｏｗ他）に単独投与されたアバタセプトは、これらの動物にいて疾患の過程を変えることなかった。しかし、アバタセプト単独は、糖尿病の臨床発症後でさえ、ヒトにおいて非常に有効であった。したがって、この研究でＮＯＤ糖尿病を治癒しなかったアバタセプトは、本明細書中に説明された併用が進行期（すなわち、後臨床発症）においてさえ、ヒト疾患において非常に有効であるという知見に対して、関連性が低い。したがって、処置効果は、ヒトにおいて臨床診断の前、または後に期待される（ＮＯＤにおいて生存期間が延びることは、それらの自己インスリンの産生がより長く続いたことを意味）（Clin Immunol. 2012 Mar;142(3):402-3を参照)。実施例5−ヒト試験

【0130】

第１相安全性臨床試験で新たにＩ型糖尿病であると診断された患者に対して、ヒトインスリンＢ鎖含ＩＦＡ（モンタナイドＩＣＡ５１）を投与した。プラセボを対照とした二重盲検試験では、対象に対して、診断３ヶ月以内に単回筋肉内注射として、２ｍｇヒトインスリンＢ鎖含ＩＦＡまたは媒体含ＩＦＡを投与した。患者の経過観察を２年間おこなった。ワクチン接種は、優れた安全プロフィールを示した。ワクチンは、非常に望ましい免疫効果を誘発し、インスリンＢ鎖特異的調節性Ｔ細胞を生成した。抗原特異的調節性Ｔ細胞は、自己免疫を制御して、抑制する「聖杯」と考えられる。この研究に関する詳細は、本明細書中に援用されるOrban et al., Lancet 2011; 378 (9789): 412-9に見出される。

【0131】

本明細書中で使用される節の見出しは、構成目的のみのためであり、決して記載の主題を限定するものとして解釈されるべきではない。

【0132】

出願人の教示は、様々な実施形態に関連して説明されるが、それは、出願人の教示がそのような実施形態に限定されることを意図していない。当業者によって理解されるように、逆に、出願人の教示は、様々な代替物、改変物、および均等物を包含する。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4A】

【図4B】

【図5】