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特許6553018酢酸グラチラマー応答バイオマーカーｍＲＮＡ効力アッセイ

書誌要約請求の範囲詳細な説明課題実施例実施するための形態図面の説明

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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6553018

(24)【登録日】2019年7月12日

(45)【発行日】2019年7月31日

(54)【発明の名称】酢酸グラチラマー応答バイオマーカーｍＲＮＡ効力アッセイ

(51)【国際特許分類】

C12Q 1/6876 20180101AFI20190722BHJP

A61K 38/00 20060101ALI20190722BHJP

A61P 25/00 20060101ALI20190722BHJP

C12N 15/09 20060101ALN20190722BHJP

【ＦＩ】

C12Q1/6876 Z

A61K38/00

A61P25/00

!C12N15/09 Z

【請求項の数】26

【全頁数】114

(21)【出願番号】特願2016-501627(P2016-501627)

(86)(22)【出願日】2014年3月12日

(65)【公表番号】特表2016-512432(P2016-512432A)

(43)【公表日】2016年4月28日

(86)【国際出願番号】US2014024748

(87)【国際公開番号】WO2014159685

(87)【国際公開日】20141002

【審査請求日】2017年3月9日

(31)【優先権主張番号】61/786,108

(32)【優先日】2013年3月14日

(33)【優先権主張国】US

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】508368275

【氏名又は名称】マイラン・インコーポレイテッド

【氏名又は名称原語表記】ＭｙｌａｎＩｎｃ．

(74)【代理人】

【識別番号】100106518

【弁理士】

【氏名又は名称】松谷道子

(74)【代理人】

【識別番号】100122301

【弁理士】

【氏名又は名称】冨田憲史

(74)【代理人】

【識別番号】100157956

【弁理士】

【氏名又は名称】稲井史生

(74)【代理人】

【識別番号】100170520

【弁理士】

【氏名又は名称】笹倉真奈美

(72)【発明者】

【氏名】ジェフリー・ピー・スミス

(72)【発明者】

【氏名】ピーター・イー・リプスキー

【審査官】植原克典

(56)【参考文献】

【文献】特表２００５−５１１０６０（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２００３−５２９３３５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 WIESEMANN，JOURNAL OF NEUROIMMUNOLOGY，２００１年，V119，P137-144

【文献】 MILLER，JOURNAL OF NEUROIMMUNOLOGY，１９９８年，V92，P113-121

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｑ１／６８− １／６８９５

Ｃ１２Ｎ１５／００−１５／９０

ＰｕｂＭｅｄ

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

酢酸グラチラマー（ＧＡ）の試験ロットの効力を決定するための方法であって、
ａ）規定量のＧＡ参照標準ロットを用いて免疫化した試験動物から取り出したリンパ節細胞を培養すること；
ｂ）所定量のＧＡ参照標準ロットの存在下で所定数の培養リンパ節細胞を含有する少なくとも３つの試料の各々をインキュベートし、所定量のＧＡの試験ロットの存在下で所定数の培養リンパ節細胞を含有する少なくとも３つの試料の各々をインキュベートすること；
ｃ）所定量のＧＡ参照標準ロットと共にインキュベートされた培養リンパ節細胞の少なくとも３つの試料の各々中で異なるＧＡ応答バイオマーカーｍＲＮＡ種の量を測定し、所定量のＧＡの試験ロットと共にインキュベートされた培養リンパ節細胞の少なくとも３つの試料の各々中で前記異なるＧＡ応答バイオマーカーｍＲＮＡ種の量を測定すること、ここで、ＧＡ応答バイオマーカーｍＲＮＡ種の少なくとも１つはＩＦＮ−γおよびＩＬ−２から選択されるＴｈ１関連サイトカインをコードする遺伝子から転写され、ＧＡ応答バイオマーカーｍＲＮＡ種の少なくとも１つはＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０およびＩＬ−１３から選択されるＴｈ２関連サイトカインをコードする遺伝子から転写され、ＧＡ応答バイオマーカーｍＲＮＡ種の少なくとも１つはＩＬ−１７であるＴｈ１７関連サイトカインをコードする遺伝子から転写される；および
ｄ）所定量のＧＡの試験ロットと共にインキュベートされたリンパ節細胞中で測定された各ＧＡ応答バイオマーカーｍＲＮＡ種の量と、所定量のＧＡ参照標準ロットと共にインキュベートされたリンパ節細胞中で測定された同じＧＡ応答バイオマーカーｍＲＮＡ種の量とを比較し、
それによって、ＧＡの試験ロットの相対効力を決定すること
を含む方法。

【請求項2】

試験動物がマウスである、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

ＧＡの試験ロットが所望の相対効力を有するかどうかを決定することをさらに含む、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

所望の相対効力が、ＧＡ参照標準ロットの効力の少なくとも約９０％〜約１２５％である、請求項３に記載の方法。

【請求項5】

所望の相対効力が、ＧＡ参照標準ロットの効力の少なくとも約９５％〜約１２５％である、請求項４に記載の方法。

【請求項6】

応答バイオマーカーｍＲＮＡ種をリアルタイムＰＣＲにより測定する、請求項１に記載の方法。

【請求項7】

応答バイオマーカーｍＲＮＡ種を、インキュベーションが開始した後約４時間〜約６時間で測定する、請求項１に記載の方法。

【請求項8】

タンパク質合成阻害剤を、リンパ節細胞とＧＡ参照標準ロットとのインキュベーション、およびリンパ節細胞とＧＡの試験ロットとのインキュベーションに添加する、請求項１に記載の方法。

【請求項9】

参照標準ロットがＣｏｐａｘｏｎｅ（登録商標）であるか、またはＣｏｐａｘｏｎｅ（登録商標）ではないＧＡのロットである、請求項１に記載の方法。

【請求項10】

ＧＡを含有する医薬組成物を調製するための方法であって、ＧＡの試験ロットおよびＧＡ参照標準の相対効力を決定することを含み、
前記方法が、ＧＡの試験ロットの効力を決定し、それを参照標準ロットの効力と比較し、ＧＡの試験ロットおよびＧＡ参照標準の相対効力を得ることを含み、
ＧＡの試験ロットの効力は、規定量のＧＡ参照標準ロットを用いて免疫化されている試験哺乳動物から取り出されているリンパ節細胞の培養物の細胞中で生成された少なくとも３つの異なるＧＡ応答バイオマーカーｍＲＮＡ種の量を測定することにより決定され、前記少なくとも３つの異なるＧＡ応答バイオマーカーｍＲＮＡ種の各々の量を別々の試料において測定され、ここで、試料の各々は、規定量のＧＡ参照標準ロットを用いて免疫化されている試験哺乳動物から取り出されている所定量の培養リンパ節細胞を含有し、各試料を所定量のＧＡの試験ロットの存在下でインキュベートし、
ＧＡの参照標準ロットの効力は、規定量のＧＡ参照標準ロットを用いて免疫化されている試験哺乳動物から取り出されているリンパ節細胞の培養物の細胞中で生成された前記少なくとも３つの異なるＧＡ応答バイオマーカーｍＲＮＡ種の量を測定することにより決定され、前記少なくとも３つの異なるＧＡ応答バイオマーカーｍＲＮＡ種の各々の量を別々の試料において測定され、ここで、試料の各々は、規定量のＧＡ参照標準ロットを用いて免疫化されている試験哺乳動物から取り出されている同じ所定量の培養リンパ節細胞を含有し、各試料を所定量のＧＡの参照標準ロットの存在下でインキュベートし、
ＧＡ応答バイオマーカーｍＲＮＡ種の少なくとも１つはＩＦＮ−γおよびＩＬ−２から選択されるＴｈ１関連サイトカインをコードする遺伝子から転写され、ＧＡ応答バイオマーカーｍＲＮＡ種の少なくとも１つはＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０およびＩＬ−１３から選択されるＴｈ２関連サイトカインをコードする遺伝子から転写され、ＧＡ応答バイオマーカーｍＲＮＡ種の少なくとも１つはＩＬ−１７であるＴｈ１７関連サイトカインをコードする遺伝子から転写され、
前記方法が、所望の相対効力を得られた場合にのみ、ＧＡの試験ロットを医薬組成物に混合することを含む方法。

【請求項11】

試験哺乳動物がマウスである、請求項１０に記載の方法。

【請求項12】

所望の相対効力が、少なくとも約９０％〜約１２５％である、請求項１０に記載の方法。

【請求項13】

所望の相対効力が、少なくとも約９５％〜約１２５％である、請求項１２に記載の方法。

【請求項14】

少なくとも３つのＧＡ応答バイオマーカーｍＲＮＡ種をリアルタイムＰＣＲにより測定する、請求項１０に記載の方法。

【請求項15】

少なくとも３つのＧＡ応答バイオマーカーｍＲＮＡ種を、インキュベーションが開始した後約４時間〜約６時間で測定する、請求項１０に記載の方法。

【請求項16】

タンパク質合成阻害剤を、リンパ節細胞とＧＡ参照標準ロットとのインキュベーション、およびリンパ節細胞とＧＡの試験ロットとのインキュベーションに添加する、請求項１０に記載の方法。

【請求項17】

参照標準ロットがＣｏｐａｘｏｎｅ（登録商標）であるか、またはＣｏｐａｘｏｎｅ（登録商標）ではないＧＡのロットである、請求項１０に記載の方法。

【請求項18】

ＧＡの試験ロットの効力および交差効力を決定するための方法であって、
ａ）規定量のＧＡ参照標準ロットを用いて免疫化されている第１の試験動物から取り出されているリンパ節細胞を培養し、規定量のＧＡ試験ロットを用いて免疫化されている第２の試験動物から取り出されているリンパ節細胞を別途培養すること；
ｂ）所定量のＧＡ参照標準ロットの存在下で免疫化した第１の試験動物に由来する所定数の培養リンパ節細胞を含有する少なくとも３つの試料の各々をインキュベートし、所定量のＧＡ試験ロットの存在下で免疫化した第１の試験動物に由来する所定数の培養リンパ節細胞を含有する少なくとも３つの試料の各々をインキュベートすること；
ｃ）所定量のＧＡ参照標準ロットの存在下で免疫化した第２の試験動物に由来する所定数の培養リンパ節細胞を含有する少なくとも３つの試料の各々をインキュベートし、所定量のＧＡ試験ロットの存在下で免疫化した第２の試験動物に由来する所定数の培養リンパ節細胞を含有する少なくとも３つの試料の各々をインキュベートすること；
ｄ）ｂ）の少なくとも３つの試料の各々において、（ｉ）所定量のＧＡ参照標準ロットと共にインキュベートされた、免疫化した第１の試験動物に由来するリンパ節細胞中の異なるＧＡ応答バイオマーカーｍＲＮＡ種、および（ｉｉ）所定量のＧＡ試験ロットと共にインキュベートされた、免疫化した第１の試験動物に由来するリンパ節細胞中の前記異なるＧＡ応答バイオマーカーｍＲＮＡ種の量を測定すること；
ｅ）ｃ）の少なくとも３つの試料の各々において、（ｉ）所定量のＧＡ参照標準ロットと共にインキュベートされた、免疫化した第２の試験動物に由来するリンパ節細胞中のｄ）において測定された各前記異なるＧＡ応答バイオマーカーｍＲＮＡ種、および（ｉｉ）所定量のＧＡの試験ロットと共にインキュベートされた、免疫化した第２の試験動物に由来するリンパ節細胞中の前記異なるＧＡ応答バイオマーカーｍＲＮＡ種の量を測定すること；
ｆ）ｄ）（ｉ）で測定された各ＧＡ応答バイオマーカーｍＲＮＡ種の量と、ｄ）（ｉｉ）で測定された同じ各ＧＡ応答バイオマーカーｍＲＮＡ種の量とを比較し、それによって、各ＧＡ応答バイオマーカーｍＲＮＡ種についてＧＡの試験ロットの相対効力を決定すること；
ｇ）ｅ）（ｉ）で測定された各ＧＡ応答バイオマーカーｍＲＮＡの量と、ｅ）（ｉｉ）で測定された同じ各ＧＡ応答バイオマーカーｍＲＮＡの量とを比較し、それによって、各ＧＡ応答バイオマーカーｍＲＮＡについてＧＡの参照標準ロットの相対効力を決定すること；
ｈ）ｅ）（ｉｉ）で測定された各ＧＡ応答バイオマーカーｍＲＮＡの量と、ｄ）（ｉｉ）で測定された同じ各ＧＡ応答バイオマーカーｍＲＮＡの量とを比較し、それによって、ＧＡ試験ロットの交差効力を決定すること
を含み、
ここで、ＧＡ応答バイオマーカーｍＲＮＡ種の少なくとも１つはＩＦＮ−γおよびＩＬ−２から選択されるＴｈ１関連サイトカインをコードする遺伝子から転写され、ＧＡ応答バイオマーカーｍＲＮＡ種の少なくとも１つはＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０およびＩＬ−１３から選択されるＴｈ２関連サイトカインをコードする遺伝子から転写され、ＧＡ応答バイオマーカーｍＲＮＡ種の少なくとも１つはＩＬ−１７であるＴｈ１７関連サイトカインをコードする遺伝子から転写される、方法。

【請求項19】

第１の試験動物および第２の試験動物が、同じマウス系統のマウス：ＨＬＡ適合マウス；同腹子；および双子から選択されるマウスである、請求項１８に記載の方法。

【請求項20】

ＧＡ試験ロットが所望の相対効力、所望の交差効力、またはその両方を有するかどうかを決定することをさらに含む、請求項１８に記載の方法。

【請求項21】

ＧＡの試験ロットの所望の相対効力、所望の相対交差効力、またはその両方が、少なくとも約７５％〜約１２５％である、請求項２０に記載の方法。

【請求項22】

所望の相対効力もしくは所望の相対交差効力、またはその両方が、少なくとも約８０％〜約１２０％である、請求項２１に記載の方法。

【請求項23】

応答バイオマーカーｍＲＮＡ種をリアルタイムＰＣＲにより測定する、請求項１８に記載の方法。

【請求項24】

応答バイオマーカーｍＲＮＡ種を、インキュベーションが開始した後約４時間〜約６時間で測定する、請求項１８に記載の方法。

【請求項25】

タンパク質合成阻害剤を、リンパ節細胞とＧＡ参照標準ロットとのインキュベーション、およびリンパ節細胞とＧＡ試験ロットとのインキュベーションに添加する、請求項１８に記載の方法。

【請求項26】

参照標準ロットがＣｏｐａｘｏｎｅ（登録商標）であるか、またはＣｏｐａｘｏｎｅ（登録商標）ではないＧＡのロットである、請求項１８に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本出願は、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．１１９（ｅ）の下で、２０１３年３月１４日に出願された米国仮特許出願第６１／７８６，１０８号の利益を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【背景技術】

【0002】

酢酸グラチラマーは、多発性硬化症を処置するために認可された合成ペプチド薬である。それは、アミノ酸Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−アラニン、Ｌ−チロシン、およびＬ−リシンを含有する合成ポリペプチドの酢酸塩からなる。現在、Ｃｏｐａｘｏｎｅ（登録商標）として販売されている酢酸グラチラマー注射液は、最初の臨床症状を経験し多発性硬化症と一致するＭＲＩ特徴を有する患者を含む、再発寛解型多発性硬化症（ＲＲＭＳ）を有する患者における再発の頻度の軽減に適応がある。

【0003】

酢酸グラチラマーは、疾患の発症の原因となる免疫プロセスを改変することにより、多発性硬化症において作用すると考えられる。特に、多発性硬化症におけるＣｏｐａｘｏｎｅ（登録商標）の作用機構は、Ｔ細胞活性の免疫調節によって少なくとも一部媒介されると考えられる。

【0004】

酢酸グラチラマーの製造期間内に、薬物の作用機構を考慮に入れた、速く、高感度で、信頼性が高く、費用効果のある効力アッセイが、医薬としての使用のための薬物ロット間で一貫した効力を証明するために必要である。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

本発明は、酢酸グラチラマー（ＧＡ）のための新規効力アッセイに関し、ＧＡの試験ロットおよびＧＡの参照標準ロットを用いる刺激に応答してＧＡ特異的Ｔ細胞により発現される少なくとも１つの応答バイオマーカーｍＲＮＡを定量し比較することによってＧＡの試験ロットの効力を決定する。ＧＡ特異的Ｔ細胞は、ＧＡの試験ロットまたは参照標準ロットを用いて免疫化したマウスから得られる。このアッセイにおける使用のためのｍＲＮＡ応答バイオマーカーを同定するための方法も記載される。

【課題を解決するための手段】

【0006】

実施形態において、本発明は、ＧＡの試験ロットの効力を決定するためのプロセスであって、試験動物を、規定量のＧＡ参照標準ロットを用いて免疫化すること；免疫化した試験動物から取り出したリンパ節細胞を培養すること；所定量のＧＡ参照標準ロットの存在下で所定数の培養リンパ節細胞を含有する少なくとも１つの試料をインキュベートし、所定量のＧＡの試験ロットの存在下で所定数の培養リンパ節細胞を含有する少なくとも１つの試料をインキュベートすること；所定量のＧＡ参照標準ロットと共にインキュベートされたリンパ節細胞中の少なくとも１つのＧＡ応答バイオマーカーｍＲＮＡの量を測定し、所定量のＧＡの試験ロットと共にインキュベートされたリンパ節細胞中の少なくとも１つのＧＡ応答バイオマーカーｍＲＮＡの量を測定すること；ならびに所定量のＧＡの試験ロットと共にインキュベートされたリンパ節細胞中で測定された少なくとも１つのＧＡ応答バイオマーカーｍＲＮＡの量と、所定量のＧＡ参照標準ロットと共にインキュベートされたリンパ節細胞中で測定された少なくとも１つのＧＡ応答バイオマーカーｍＲＮＡの量とを比較し、それによって、ＧＡの試験ロットの相対効力を決定することを含むプロセスに関する。

【0007】

関連する実施形態において、試験動物はマウスである。ある特定の実施形態においては、マウスはメスのＳＪＬ／Ｊ、ＢＡＬＢ／ｃＢｙＪ、ＣＤ−１、Ｃ５７ＢＬ／１０Ｊ、または（ＳＪＬ／ＪｘＢＡＬＢ／ｃ）Ｆ１マウスである。実施形態において、少なくとも１つのＧＡ応答バイオマーカーｍＲＮＡは、サイトカインまたはサイトカイン受容体をコードする遺伝子から転写される。関連する実施形態において、少なくとも１つのＧＡ応答バイオマーカーｍＲＮＡは、サイトカインをコードする遺伝子から転写され、ここで、サイトカインは、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１ｂ、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７、またはその任意の組合せである。ある特定の実施形態においては、少なくとも１つの酢酸グラチラマー応答バイオマーカーｍＲＮＡは、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７、ＩＦＮ−γ、またはその任意の組合せをコードする遺伝子から転写される。他の実施形態において、少なくとも１つの酢酸グラチラマー応答バイオマーカーｍＲＮＡは、サイトカイン受容体をコードする遺伝子から転写され、ここで、サイトカイン受容体はＣＤ６９、ＣＤ２５、またはその両方である。実施形態において、少なくとも１つのバイオマーカーｍＲＮＡは、マウスをＧＡ参照標準ロットを用いて免疫化した９〜１１日後にリンパ節細胞の培養物中で測定される。

【0008】

実施形態において、本発明のプロセスは、ＧＡの試験ロットが所望の相対効力を有するかどうかを決定することをさらに含む。これらの実施形態において、所望の相対効力は、例えば、ＧＡ参照標準ロットの効力の少なくとも約９０％〜約１２５％であるか、または所望の相対効力は、ＧＡ参照標準ロットの効力の少なくとも約９５％〜約１２５％である。

【0009】

本発明の実施形態において、少なくとも１つの応答バイオマーカーｍＲＮＡは、リアルタイムＰＣＲによって測定される。関連する実施形態において、応答バイオマーカーｍＲＮＡは、インキュベーションが開始された後約４時間〜約６時間で測定される。ある特定の実施形態において、タンパク質合成阻害剤、例えば、シクロヘキシミドを、リンパ節細胞とＧＡ参照標準ロットとのインキュベーション、およびリンパ節細胞とＧＡの試験ロットとのインキュベーションに添加する。

【0010】

本発明のプロセスの実施形態においては、参照標準ロットは、Ｃｏｐａｘｏｎｅである。

【0011】

本発明はさらに、試験動物を、規定量のＧＡ試験ロットを用いて免疫化すること；免疫化した試験動物から取り出したリンパ節細胞を培養すること；所定量のＧＡ試験ロットの存在下で所定数の培養されたリンパ節細胞を含有する少なくとも１つの試料、および所定量のＧＡの参照標準の存在下で所定数の培養されたリンパ節細胞を含有する少なくとも１つの試料をインキュベートすること；所定量のＧＡ試験ロットと共にインキュベートされたリンパ節細胞中の少なくとも１つのＧＡ応答バイオマーカーｍＲＮＡの量、および所定量のＧＡの参照標準と共にインキュベートされたリンパ節細胞中の少なくとも１つのＧＡ応答バイオマーカーｍＲＮＡの量を測定すること；ならびに所定量のＧＡの参照標準と共にインキュベートされたリンパ節細胞中で測定された少なくとも１つのＧＡ応答バイオマーカーｍＲＮＡの量と、所定量のＧＡ試験ロットと共にインキュベートされたリンパ節細胞中で測定された少なくとも１つのＧＡ応答バイオマーカーｍＲＮＡの量とを比較することを含む、ＧＡの参照標準ロットの効力を決定するためのプロセスに関する。

【0012】

関連する実施形態において、試験動物はマウスである。ある特定の実施形態においては、マウスはメスのＳＪＬ／Ｊ、ＢＡＬＢ／ｃＢｙＪ、ＣＤ−１、Ｃ５７ＢＬ／１０Ｊ、または（ＳＪＬ／ＪｘＢＡＬＢ／ｃ）Ｆ１マウスである。実施形態において、少なくとも１つのＧＡ応答バイオマーカーｍＲＮＡは、サイトカインまたはサイトカイン受容体をコードする遺伝子から転写される。関連する実施形態において、少なくとも１つのＧＡ応答バイオマーカーｍＲＮＡは、サイトカインをコードする遺伝子から転写され、ここで、サイトカインは、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１ｂ、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７、またはその任意の組合せである。ある特定の実施形態においては、少なくとも１つのＧＡ応答バイオマーカーｍＲＮＡは、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７、ＩＦＮ−γ、またはその任意の組合せをコードする遺伝子から転写される。他の実施形態において、少なくとも１つのＧＡ応答バイオマーカーｍＲＮＡは、サイトカイン受容体をコードする遺伝子から転写され、ここで、サイトカイン受容体はＣＤ６９、ＣＤ２５、またはその両方である。実施形態において、少なくとも１つのバイオマーカーｍＲＮＡは、マウスをＧＡ参照標準ロットを用いて免疫化した９〜１１日後にリンパ節細胞の培養物中で測定される。

【0013】

【0014】

【0015】

本発明のプロセスの実施形態においては、参照標準ロットは、Ｃｏｐａｘｏｎｅである。

【0016】

また、ＧＡを含有する医薬組成物を調製するためのプロセスであって、プロセス中に、ＧＡの試験ロットを試験して、それがＧＡ参照標準ロットの効力と比べて所望の効力を有するかどうかを決定し、プロセスが、ＧＡの試験ロットの効力を決定すること、およびそれを参照標準ロットの効力と比較することを含み、ＧＡの試験ロットと参照標準ロットの効力が、規定量のＧＡ参照標準ロットを用いて免疫化された試験哺乳動物から取り出したリンパ節細胞の培養物の細胞中で生成された少なくとも１つのＧＡ応答バイオマーカーｍＲＮＡの量を測定することにより決定され、所定数の培養リンパ節細胞を含有する少なくとも１つの試料を、所定量のＧＡ参照標準ロットの存在下でインキュベートし、実質的に同一の所定数の培養リンパ節細胞を含有する少なくとも１つの試料を、同じ所定量のＧＡの試験ロットの存在下でインキュベートし、ＧＡの試験ロットが参照標準ロットの効力と比べて所望の効力を有すると決定された場合にのみ、ＧＡの試験ロットを医薬組成物に混合するプロセスも提供される。

【0017】

関連する実施形態において、試験動物はマウスである。ある特定の実施形態においては、マウスはメスのＳＪＬ／Ｊ、ＢＡＬＢ／ｃＢｙＪ、ＣＤ−１、Ｃ５７ＢＬ／１０Ｊ、または（ＳＪＬ／ＪｘＢＡＬＢ／ｃ）Ｆ１マウスである。実施形態において、少なくとも１つのＧＡ応答バイオマーカーｍＲＮＡは、サイトカインまたはサイトカイン受容体をコードする遺伝子から転写される。関連する実施形態において、少なくとも１つのＧＡ応答バイオマーカーｍＲＮＡは、サイトカインをコードする遺伝子から転写され、ここで、サイトカインは、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１ｂ、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７、またはその任意の組合せである。ある特定の実施形態においては、少なくとも１つのＧＡ応答バイオマーカーｍＲＮＡは、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７、ＩＦＮ−γ、またはその任意の組合せをコードする遺伝子から転写される。他の実施形態において、少なくとも１つのＧＡ応答バイオマーカーｍＲＮＡは、サイトカイン受容体をコードする遺伝子から転写され、ここで、サイトカイン受容体はＣＤ６９、ＣＤ２５、またはその両方である。実施形態において、少なくとも１つのバイオマーカーｍＲＮＡは、マウスをＧＡ参照標準ロットを用いて免疫化した９〜１１日後にリンパ節細胞の培養物中で測定される。

【0018】

実施形態において、本発明のプロセスは、ＧＡの試験ロットが所望の相対効力を有するかどうかを決定することをさらに含む。これらの実施形態において、所望の相対効力は、例えば、酢酸グラチラマー参照標準ロットの効力の少なくとも約９０％〜約１２５％であるか、または所望の相対効力は、酢酸グラチラマー参照標準ロットの効力の少なくとも約９５％〜約１２５％である。

【0019】

【0020】

本発明のプロセスの実施形態においては、参照標準ロットは、Ｃｏｐａｘｏｎｅである。

【0021】

本発明はさらに、ＧＡＴ細胞効力アッセイにおける使用のためのＧＡ応答バイオマーカーｍＲＮＡを同定する方法であって、試験動物を規定量のＧＡを用いて免疫化すること；試験動物を対照抗原を用いて免疫化すること；ＧＡで免疫化した試験動物から取り出したリンパ節細胞を培養し、対照抗原で免疫化した試験動物から取り出したリンパ節細胞を別途培養すること；所定量のＧＡの存在下で、ＧＡで免疫化した試験動物に由来する所定数の培養リンパ節細胞を含有する少なくとも１つの試料、および所定量のＧＡの試験ロットの存在下で、対照抗原で免疫化した試験動物から取り出した所定数の培養リンパ節細胞を含有する少なくとも１つの試料をインキュベートすること；ＧＡで免疫化した試験動物に由来するインキュベートされたリンパ節細胞中で候補応答バイオマーカーｍＲＮＡの量を測定し、対照抗原で免疫化した試験動物に由来するインキュベートされたリンパ節細胞中で候補応答バイオマーカーｍＲＮＡの量を測定すること；ならびにＧＡで免疫化した試験動物に由来するインキュベートされたリンパ節細胞中の候補応答バイオマーカーｍＲＮＡの量を、対照抗原で免疫化した試験動物に由来するインキュベートされたリンパ節細胞中の候補応答バイオマーカーｍＲＮＡの量と比較することを含み、ＧＡで免疫化した試験動物に由来するインキュベートされたリンパ節細胞中で測定された候補応答バイオマーカーｍＲＮＡの量が、対照抗原で免疫化した試験動物に由来するインキュベートされたリンパ節細胞中の候補応答バイオマーカーｍＲＮＡの量よりも有意に高い場合、候補応答バイオマーカーｍＲＮＡが応答バイオマーカーｍＲＮＡとして同定される方法に関する。

【0022】

ある特定の実施形態においては、本発明は、ＧＡの試験ロットの効力および交差効力を決定するためのプロセスであって、第１の試験動物を、規定量のＧＡ参照標準ロットを用いて免疫化すること；第２の試験動物を、規定量のＧＡ試験ロットを用いて免疫化すること；免疫化した第１の試験動物から取り出したリンパ節細胞を培養し、免疫化した第２の試験動物から取り出したリンパ節細胞を別途培養すること；所定量のＧＡ参照標準ロットの存在下で、免疫化した第１の試験動物に由来する所定数の培養リンパ節細胞を含有する少なくとも１つの試料をインキュベートし、所定量のＧＡの試験ロットの存在下で、免疫化した第１の試験動物に由来する所定数の培養リンパ節細胞を含有する少なくとも１つの試料をインキュベートすること；所定量のＧＡ参照標準ロットの存在下で、免疫化した第２の試験動物に由来する所定数の培養リンパ節細胞を含有する少なくとも１つの試料をインキュベートし、所定量のＧＡの試験ロットの存在下で、免疫化した第２の試験動物に由来する所定数の培養リンパ節細胞を含有する少なくとも１つの試料をインキュベートすること；所定量のＧＡ参照標準ロットと共にインキュベートされた、免疫化した第１の試験動物に由来するリンパ節細胞中の少なくとも１つのＧＡ応答バイオマーカーｍＲＮＡの量、および所定量のＧＡの試験ロットと共にインキュベートされた、免疫化した第１の試験動物に由来するリンパ節細胞中の少なくとも１つのＧＡ応答バイオマーカーｍＲＮＡの量を測定すること；所定量のＧＡ参照標準ロットと共にインキュベートされた、免疫化した第２の試験動物に由来するリンパ節細胞中の少なくとも１つのＧＡ応答バイオマーカーｍＲＮＡの量、および所定量のＧＡの試験ロットと共にインキュベートされた、免疫化した第２の試験動物に由来するリンパ節細胞中の少なくとも１つのＧＡ応答バイオマーカーｍＲＮＡの量を測定すること；所定量のＧＡの試験ロットと共にインキュベートされた、免疫化した第１の試験動物に由来するリンパ節細胞中で測定された少なくとも１つのＧＡ応答バイオマーカーｍＲＮＡの量を、所定量のＧＡ参照標準ロットと共にインキュベートされた、免疫化した第１の試験動物に由来するリンパ節細胞中で測定された少なくとも１つのＧＡ応答バイオマーカーｍＲＮＡの量と比較し、それによって、ＧＡの試験ロットの相対効力を決定すること；所定量のＧＡの試験ロットと共にインキュベートされた、免疫化した第２の試験動物に由来するリンパ節細胞中で測定された少なくとも１つのＧＡ応答バイオマーカーｍＲＮＡの量を、所定量のＧＡ参照標準ロットと共にインキュベートされた、免疫化した第２の試験動物に由来するリンパ節細胞中で測定された少なくとも１つのＧＡ応答バイオマーカーｍＲＮＡの量と比較し、それによって、ＧＡの参照標準ロットの相対効力を決定すること；所定量のＧＡの試験ロットと共にインキュベートされた、免疫化した第１の試験動物に由来するリンパ節細胞中で測定された少なくとも１つのＧＡ応答バイオマーカーｍＲＮＡの量を、所定量のＧＡ試験ロットと共にインキュベートされた、免疫化した第２の試験動物に由来するリンパ節細胞中で測定された少なくとも１つのＧＡ応答バイオマーカーｍＲＮＡの量と比較し、それによって、ＧＡの試験ロットの交差効力を決定することを含むプロセスに関する。

【0023】

これらの実施形態において、第１の試験動物および第２の試験動物を、同じマウス系統のマウス：ＨＬＡ適合マウス；同腹子、および双子から選択することができる。実施形態において、第１の試験動物および第２の試験動物は、同じマウス系統のものであり、ここでマウス系統は、メスのＣＳＪＬＦ１／ＪＲｊ、メスのＳＪＬ／Ｊ、メスのＢＡＬＢ／ｃＢｙＪ、メスのＣＤ−１、メスのＣ５７ＢＬ／１０Ｊ、およびメスの（ＳＪＬ／ＪｘＢＡＬＢ／ｃ）Ｆ１から選択される。実施形態において、少なくとも１つのＧＡ応答バイオマーカーｍＲＮＡは、サイトカインまたはサイトカイン受容体をコードする遺伝子から転写される。関連する実施形態においては、少なくとも１つのＧＡ応答バイオマーカーｍＲＮＡは、サイトカインをコードする遺伝子から転写され、ここで、サイトカインはＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１ｂ、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７、またはその任意の組合せである。ある特定の実施形態においては、少なくとも１つのＧＡ応答バイオマーカーｍＲＮＡは、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７、ＩＦＮ−γ、またはその任意の組合せをコードする遺伝子から転写される。他の実施形態においては、少なくとも１つのＧＡ応答バイオマーカーｍＲＮＡは、サイトカイン受容体をコードする遺伝子から転写され、ここで、サイトカイン受容体はＣＤ６９、ＣＤ２５、またはその両方である。実施形態において、少なくとも１つのバイオマーカーｍＲＮＡは、ＧＡ参照標準ロットを用いてマウスを免疫化した９〜１１日後にリンパ節細胞の培養物中で測定される。

【0024】

実施形態において、本発明のプロセスは、ＧＡの試験ロットが所望の相対効力、所望の相対交差効力、またはその両方を有するかどうかを判定することをさらに含む。これらの実施形態においては、所望の相対効力もしくは所望の相対交差効力は、例えば、ＧＡ参照標準ロットの効力の少なくとも約９０％〜約１２５％であるか、または所望の相対効力もしくは所望の相対交差効力は、ＧＡ参照標準ロットの効力の少なくとも約９５％〜約１２５％である。

【0025】

【0026】

本発明のプロセスの実施形態においては、参照標準ロットは、Ｃｏｐａｘｏｎｅである。

【0027】

本発明はまた、ＧＡの第２のロットの効力を決定するためのプロセスであって、試験動物を、規定量の第１のＧＡロットを用いて免疫化すること；免疫化した試験動物から取り出したリンパ節細胞を培養すること；所定量の第１のＧＡロットの存在下で、所定数の培養リンパ節細胞を含有する少なくとも１つの試料を培養し、所定量のＧＡの第２のロットの存在下で、所定数の培養リンパ節細胞を含有する少なくとも１つの試料を培養すること；所定量の第１のＧＡロットと共にインキュベートされたリンパ節細胞中の少なくとも１つのＧＡ応答バイオマーカーｍＲＮＡの量、および所定量のＧＡの第２のロットと共にインキュベートされたリンパ節細胞中の少なくとも１つのＧＡ応答バイオマーカーｍＲＮＡの量を測定すること；ならびに所定量のＧＡの第２のロットと共にインキュベートされたリンパ節細胞中で測定された少なくとも１つのＧＡ応答バイオマーカーｍＲＮＡの量を、所定量の第１のＧＡロットと共にインキュベートされたリンパ節細胞中で測定された少なくとも１つのＧＡ応答バイオマーカーｍＲＮＡの量と比較し、それによって、ＧＡの第２のロットの相対効力を決定することを含むプロセスも提供する。これらの実施形態においては、第１のＧＡロットはＣｏｐａｘｏｎｅ、ＧＡの参照標準ロット、またはＧＡの試験ロットであってもよい。これらの実施形態においては、第２のＧＡロットは、Ｃｏｐａｘｏｎｅ、ＧＡの参照標準ロット、またはＧＡの試験ロットであってもよい。

【0028】

参照による組込み
本明細書に記載の全ての刊行物、特許、および特許出願は、それぞれ個々の刊行物、特許、または特許出願が具体的かつ個別的に参照により組み込まれると示されたと同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。

【0029】

本発明の新規特徴を、添付の特許請求の範囲における特殊性と共に説明する。本発明の特徴および利点のより良好な理解を、本発明の原理が用いられる例示的実施形態を説明する以下の詳細な説明、および以下の添付図面に対する参照により得ることができる。

【図面の簡単な説明】

【0030】

【図1】異なる濃度のＧＡに応答して一次ＬＮ細胞中で発現されるｍＩＬ−２ｍＲＮＡ。この図面は、本明細書の表６に提示されるデータのグラフを示す。ＧＡで免疫化したマウスに由来するＬＮ細胞を、異なる濃度のＧＡまたはＣｏｐａｘｏｎｅでエクスビボ（ｅｘｖｉｖｏ）で刺激し、ｍＩＬ−２ｍＲＮＡを測定した。ＩＬ−２ｍＲＮＡレベルは、ＤＣＣＭ１（培養培地）対照と比較した倍数増加として表される。Ａ．６つのＧＡ濃度（１、２．５、５、１０、１５および２５μｇ／ｍＬ）を、ＬＮ細胞の刺激のために用いた。Ｂ．５つのＧＡ濃度（１、２．５、５、１０および１５μｇ／ｍＬ）を、ＬＮ細胞の刺激のために用いた。ＡとＢの両方について、菱形は、ＧＭＡ（酢酸グラチラマー、ＭｙｌａｎＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）で刺激した第３群の細胞（ＧＡで免疫化したマウスに由来する）中でのｍＩＬ−２ｍＲＮＡの発現を示す。四角は、Ｃｏｐａｘｏｎｅ（ＴｅｖａＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓＵＳＡ，Ｉｎｃ．）で刺激した第３群の細胞中での発現を示す。三角は、ＧＭＡで刺激した第４群の細胞（マンニトールで免疫化したマウスに由来する）中での発現を示す。Ｘは、Ｃｏｐａｘｏｎｅで刺激した第４群の細胞を示す。データは半対数上でプロットされる。さらに、対数トレンドライン／回帰をプロットに加えた。全てのｒ^２値は０．９０％または９０％を超えるものであった。

【図2】ＧＡ刺激に応答して一次ＬＮ細胞中で発現されるサイトカインｍＲＮＡ。この図面は、本明細書の表８〜１２に提示されるデータの概要を示す。ＧＡで免疫化したマウスに由来するＬＮ細胞を、ＧＡでエクスビボで刺激し、サイトカインｍＲＮＡを、示されるように刺激後４時間（明るいバー）および刺激後６時間（暗いバー）で測定した。サイトカインｍＲＮＡレベルは、ＤＣＣＭ１（培養培地）対照と比較した倍数増加として表される。

【図3】ＧＡを用いる刺激に応答したＧＡ免疫化ＣＤ−１マウスに由来する一次ＬＮ細胞中の応答バイオマーカーｍＲＮＡ発現レベル：ＩＬ−２およびＩＬ−４。対照に対する倍数変化として表されるｍＲＮＡレベルを、ＧＡ刺激濃度の関数としてプロットする。Ａ．ＣＤ−１マウス系統に由来するＬＮ細胞中でのＩＬ−２ｍＲＮＡ発現。Ｂ．ＣＤ−１マウス系統に由来するＬＮ細胞中でのＩＬ−４ｍＲＮＡ発現。

【図4】ＧＡを用いる刺激に応答したＧＡ免疫化ＣＤ−１マウスに由来する一次ＬＮ細胞中の応答バイオマーカーｍＲＮＡ発現レベル：ＩＬ−５およびＩＬ−１０。対照に対する倍数変化として表されるｍＲＮＡレベルを、ＧＡ刺激濃度の関数としてプロットする。Ａ．ＣＤ−１マウス系統に由来するＬＮ細胞中でのＩＬ−５ｍＲＮＡ発現。Ｂ．ＣＤ−１マウス系統に由来するＬＮ細胞中でのＩＬ−１０ｍＲＮＡ発現。

【図5】ＧＡを用いる刺激に応答したＧＡ免疫化ＣＤ−１マウスに由来する一次ＬＮ細胞中の応答バイオマーカーｍＲＮＡ発現レベル：ＩＬ−１３およびＩＦＮ−γ。対照に対する倍数変化として表されるｍＲＮＡレベルを、ＧＡ刺激濃度の関数としてプロットする。Ａ．ＣＤ−１マウス系統に由来するＬＮ細胞中でのＩＬ−１３ｍＲＮＡ発現。Ｂ．ＣＤ−１マウス系統に由来するＬＮ細胞中でのＩＦＮ−γ ｍＲＮＡ発現。

【図6】ＧＡを用いる刺激に応答したＧＡ免疫化マウスに由来する一次ＬＮ細胞中の応答バイオマーカーｍＲＮＡ発現レベル：ＴＮＦ−αおよびＩＬ−２。対照に対する倍数変化として表されるｍＲＮＡレベルを、ＧＡ刺激濃度の関数としてプロットする。Ａ．ＣＤ−１マウス系統に由来するＬＮ細胞中でのＴＮＦ−α ｍＲＮＡ発現。Ｂ．ＢＡＬＢ／ｃＢｙＪマウス系統に由来するＬＮ細胞中でのＩＬ−２ｍＲＮＡ発現。

【図7】ＧＡを用いる刺激に応答したＧＡ免疫化ＢＡＬＢ／ｃＢｙＪマウスに由来する一次ＬＮ細胞中の応答バイオマーカーｍＲＮＡ発現レベル：ＩＬ−４およびＩＬ−５。対照に対する倍数変化として表されるｍＲＮＡレベルを、ＧＡ刺激濃度の関数としてプロットする。Ａ．ＢＡＬＢ／ｃＢｙＪマウス系統に由来するＬＮ細胞中でのＩＬ−４ｍＲＮＡ発現。Ｂ．ＢＡＬＢ／ｃＢｙＪマウス系統に由来するＬＮ細胞中でのＩＬ−５ｍＲＮＡ発現。

【図8】ＧＡを用いる刺激に応答したＧＡ免疫化ＢＡＬＢ／ｃＢｙＪマウスに由来する一次ＬＮ細胞中の応答バイオマーカーｍＲＮＡ発現レベル：ＩＬ−１０およびＩＬ−１３。対照に対する倍数変化として表されるｍＲＮＡレベルを、ＧＡ刺激濃度の関数としてプロットする。Ａ．ＢＡＬＢ／ｃＢｙＪマウス系統に由来するＬＮ細胞中でのＩＬ−１０ｍＲＮＡ発現。Ｂ．ＢＡＬＢ／ｃＢｙＪマウス系統に由来するＬＮ細胞中でのＩＬ−１３ｍＲＮＡ発現。

【図9】ＧＡを用いる刺激に応答したＧＡ免疫化ＢＡＬＢ／ｃＢｙＪマウスに由来する一次ＬＮ細胞中の応答バイオマーカーｍＲＮＡ発現レベル：ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−α。対照に対する倍数変化として表されるｍＲＮＡレベルを、ＧＡ刺激濃度の関数としてプロットする。Ａ．ＢＡＬＢ／ｃＢｙＪマウス系統に由来するＬＮ細胞中でのＩＦＮ−γ ｍＲＮＡ発現。Ｂ．ＢＡＬＢ／ｃＢｙＪマウス系統に由来するＬＮ細胞中でのＴＮＦ−α ｍＲＮＡ発現。

【図10】ＧＡを用いる刺激に応答したＧＡ免疫化ＳＪＬ／Ｊマウスに由来する一次ＬＮ細胞中の応答バイオマーカーｍＲＮＡ発現レベル：ＩＬ−２およびＩＬ−４。対照に対する倍数変化として表されるｍＲＮＡレベルを、ＧＡ刺激濃度の関数としてプロットする。Ａ．ＳＪＬ／Ｊマウス系統に由来するＬＮ細胞中でのＩＬ−２ｍＲＮＡ発現。Ｂ．ＳＪＬ／Ｊマウス系統に由来するＬＮ細胞中でのＩＬ−４ｍＲＮＡ発現。

【図11】ＧＡを用いる刺激に応答したＧＡ免疫化ＳＪＬ／Ｊマウスに由来する一次ＬＮ細胞中の応答バイオマーカーｍＲＮＡ発現レベル：ＩＬ−５およびＩＬ−１０。対照に対する倍数変化として表されるｍＲＮＡレベルを、ＧＡ刺激濃度の関数としてプロットする。Ａ．ＳＪＬ／Ｊマウス系統に由来するＬＮ細胞中でのＩＬ−５ｍＲＮＡ発現。Ｂ．ＳＪＬ／Ｊマウス系統に由来するＬＮ細胞中でのＩＬ−１０ｍＲＮＡ発現。

【図12】ＧＡを用いる刺激に応答したＧＡ免疫化ＳＪＬ／Ｊマウスに由来する一次ＬＮ細胞中の応答バイオマーカーｍＲＮＡ発現レベル：ＩＬ−１３およびＩＦＮ−γ。対照に対する倍数変化として表されるｍＲＮＡレベルを、ＧＡ刺激濃度の関数としてプロットする。Ａ．ＳＪＬ／Ｊマウス系統に由来するＬＮ細胞中でのＩＬ−１３ｍＲＮＡ発現。Ｂ．ＳＪＬ／Ｊマウス系統に由来するＬＮ細胞中でのＩＦＮ−γ ｍＲＮＡ発現。

【図13】ＧＡを用いる刺激に応答したＧＡ免疫化ＳＪＬ／Ｊマウスに由来する一次ＬＮ細胞中の応答バイオマーカーｍＲＮＡ発現レベル：ＴＮＦ−α。対照に対する倍数変化として表されるｍＲＮＡレベルを、ＧＡ刺激濃度の関数としてプロットする。グラフは、ＳＪＬ／Ｊマウス系統に由来するＬＮ細胞中でのＴＮＦ−α ｍＲＮＡ発現を示す。

【発明を実施するための形態】

【0031】

酢酸グラチラマー（ＧＡ）
ＧＡは、それぞれ、０．１４１、０．４２７、０．０９５、および０．３３８の平均分子画分を有する４つの天然アミノ酸：Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−アラニン、Ｌ−チロシン、およびＬ−リシンを含有する合成ポリペプチドの酢酸塩からなる。ＧＡの平均分子量は、５，０００〜９，０００ダルトンである。化学的には、ＧＡは、Ｌ−アラニン、Ｌ−リシンおよびＬ−チロシン、酢酸（塩）を含むＬ−グルタミン酸ポリマーと指定される。

【0032】

ＧＡの実験式は、（Ｃ_５Ｈ_９ＮＯ_４・Ｃ_３Ｈ_７ＮＯ_２・Ｃ_６Ｈ_１４Ｎ_２Ｏ_２・Ｃ_９Ｈ_１１ＮＯ_３）_ｘ・ｘＣ_２Ｈ_４Ｏ_２（ＣＡＳ−１４７２４５−９２−９、Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓＤｅｓｋＲｅｆｅｒｅｎｃｅ）である。

【0033】

本明細書で用いられる場合、「ＧＡ」とは、特に記述しない限り、例えば、ＭｙｌａｎＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．により製造されるＧＡである「ＧＭＡ」、およびＴｅｖａＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓＵＳＡ，Ｉｎｃ．により製造されるＧＡである「Ｃｏｐ」または「Ｃｏｐａｘｏｎｅ」を含むＧＡを一般に指す。

【0034】

酢酸グラチラマー製造ロットを試験するための効力アッセイ
本発明は、医薬としての使用のために許容されるＧＡの製造における薬物ロット間の一貫した効力を証明するのに有用な効力アッセイに関する。それは、認可プロセス中の薬物の効力試験を要求し、認可後のロット間一貫性を決定するために用いることができる効力アッセイの開発を要求する、薬物認可当局にとって典型的なものである。そのようなアッセイは、日常的な製造中のロット一貫性を確保するだけでなく、製造プロセスの変化後の薬物ロットを評価するためにも有用である。

【0035】

効力は、製品特異的尺度であり、それぞれの製品について個別にアッセイを評価しなければならない。多発性硬化症（ＭＳ）におけるＧＡの作用機構は、Ｔ細胞活性の免疫調節によって一部媒介されると考えられる。従って、ＧＡに対するＴ細胞の免疫応答は、ＧＡ溶液中に存在するエピトープの特異的および高感度の尺度である。溶液中に存在する、異なるが非常に類似するペプチド間を識別するＴ細胞の独自の能力のため、培養物中でのサイトカイン分泌プロファイルおよびＧＡ特異的Ｔ細胞の免疫活性の分析は、ＧＡのロット間の免疫学的に関連する差異を識別することができる。これに関して、例えば、ＧＡの参照標準ロットでプライミングされ、例えば、ＧＡの試験ロットでチャレンジされた、および／またはその逆の、動物におけるＴ細胞応答により示される免疫学的同一性は、参照標準ロットと試験ロットとが同一であることを示してもよい。その後のチャレンジに応答したプライミングされたＴ細胞によるサイトカインの放出は、Ｔ細胞応答の免疫学的同一性の１つのさらなる尺度である。サイトカインの放出プロファイルは、所与のＧＡロット中に存在する特定のエピトープ中のわずかな差異を潜在的に検出することができる。

【0036】

本発明の実施形態において、製造または試験ロットにおけるＧＡの相対効力は、ＧＡの試験ロットに対するＴ細胞の免疫応答を表す値を、ＧＡの参照標準ロットに対するＴ細胞の同応答を表す値と比較することによって決定される。この効力決定は、ＧＡの試験ロットの刺激能力を説明する。本発明の方法においては、試験動物を、規定量、または所定量のＧＡ参照標準ロットで免疫化し、動物から取り出したリンパ節に由来するリンパ節細胞を培養する。培養リンパ節細胞の試料を、規定量、または所定量のＧＡ参照標準ロットとのインキュベーションにより刺激し、培養リンパ節細胞の第２の試料を、同じ規定量、または所定量のＧＡ製造ロットもしくは試験ロットとのインキュベーションにより刺激する。次いで、ＧＡ応答バイオマーカーｍＲＮＡの量を、各試料中で測定し、その量を比較して相対効力に達する。

【0037】

別の実施形態においては、ＧＡの相対交差効力を決定する。相対交差効力は、免疫間の効力を比較する、すなわち、それは、異なる動物から得た試験および／または参照標準ＧＡ刺激Ｔ細胞（または比較される任意の２つのＧＡロットで刺激したＴ細胞）の効力を比較するものであり、ここで、それぞれの動物はＧＡの試験または参照標準ロットのいずれかで免疫化したものである。この尺度は、ＧＡの試験ロットの免疫化能力、例えば、免疫応答を惹起するＧＡ試験ロットの能力における洞察を提供する。この尺度はまた、ＧＡの参照標準ロットの免疫化能力における洞察も提供する。これらの実施形態において、プロセスは、少なくとも２つの試験動物を、第１にＧＡ参照標準ロットを用いて、第２に規定量のＧＡ試験ロットを用いて免疫化することを含む。免疫化した第１および第２の試験動物から取り出したリンパ節細胞を、別々に培養する。所定数の培養リンパ節細胞をそれぞれ含有する、各動物から取り出した培養リンパ節細胞の試料を別々に作成する。各試料を、所定量のＧＡ参照標準ロットおよび所定量のＧＡの試験ロットと共に別々にインキュベートする。従って、少なくとも４つのインキュベーションまたは刺激試料を、例えば、表Ａに示されるように作成する。

【0038】

【表1】

【0039】

少なくとも１つのＧＡ応答バイオマーカーｍＲＮＡの量を、所定量のＧＡ参照標準ロットと共にインキュベートされた、免疫化した第１の試験動物に由来するリンパ節細胞中で測定し（インキュベーションＡで表される）、少なくとも１つのＧＡ応答バイオマーカーｍＲＮＡの量を、所定量のＧＡ試験ロットと共にインキュベートされた、免疫化した第１の試験動物に由来するリンパ節細胞中で測定する（インキュベーションＢで表される）。同様に、少なくとも１つのＧＡ応答バイオマーカーｍＲＮＡの量を、所定量のＧＡ参照標準ロットと共にインキュベートされた、免疫化した第２の試験動物に由来するリンパ節細胞中で測定し（インキュベーションＣで表される）、少なくとも１つのＧＡ応答バイオマーカーｍＲＮＡの量を、所定量のＧＡ試験ロットと共にインキュベートされた、免疫化した第２の試験動物に由来するリンパ節細胞中で測定する（インキュベーションＤで表される）。

【0040】

実施形態において、効力決定は上記のように行われ、ここで、インキュベーションＢにおける少なくとも１つのＧＡ応答バイオマーカーｍＲＮＡの量を、インキュベーションＡにおける少なくとも１つのＧＡ応答バイオマーカーｍＲＮＡの量と比較する。実施形態においては、インキュベーションＣにおける少なくとも１つのＧＡ応答バイオマーカーｍＲＮＡの量を、インキュベーションＤにおける少なくとも１つのＧＡ応答バイオマーカーｍＲＮＡの量と比較する。

【0041】

交差効力を決定するために、インキュベーションＣにおける少なくとも１つのＧＡ応答バイオマーカーｍＲＮＡの量を、インキュベーションＡにおける少なくとも１つのＧＡ応答バイオマーカーｍＲＮＡの量と比較する。実施形態においては、インキュベーションＢにおける少なくとも１つのＧＡ応答バイオマーカーｍＲＮＡの量を、インキュベーションＤにおける少なくとも１つのＧＡ応答バイオマーカーｍＲＮＡの量と比較する。

【0042】

例えば、本明細書の表２９（ＩＬ−２）、表３１（ＩＬ−４）および表３５（ＩＬ−１３）に提示された実施例から取り上げられる、表Ｂに記載のデータを用いて、交差効力の算出を以下に示されるように実行する。

【0043】

【表2】

【0044】

ＩＬ−２について、Ｃｏｐａｘｏｎｅの交差効力は、以下のように算出される。

【0045】

Ｃ／Ａ＝１７．５／２０．０＝０．８７５、または８７．５％。

【0046】

ＩＬ−２について、ＧＭＡの交差効力は、以下のように算出される。

【0047】

Ｂ／Ｄ＝１６．９／１５．７＝１．０８、または１０８％。

【0048】

ＩＬ−４について、Ｃｏｐａｘｏｎｅの交差効力は、以下のように算出される。

【0049】

Ｃ／Ａ＝２１．８／２２．６＝０．９６５、または９６．５％。

【0050】

ＩＬ−４について、ＧＭＡの交差効力は、以下のように算出される。

【0051】

Ｂ／Ｄ＝１８．８／１８．３＝１．０３、または１０３％。

【0052】

ＩＬ−１３について、Ｃｏｐａｘｏｎｅの交差効力は、以下のように算出される。

【0053】

Ｃ／Ａ＝１７．５／１３．５＝１．３、または１３０％。

【0054】

ＩＬ−１３について、ＧＭＡの交差効力は、以下のように算出される。

【0055】

Ｂ／Ｄ＝８．６／１１．５＝０．７４８、または７４．８％。

【0056】

実施形態において、効力は、２つの製造ロットの比較に基づく。実施形態において、本発明のプロセスは、ＧＡの医薬組成物へのＧＡの製造ロットの潜在的な添加の前、添加の後、さもなければ適切と見なされる時点で用いられる。

【0057】

それぞれ「ＰｒｏｃｅｓｓｆｏｒｔｈｅＭｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｏｆｔｈｅＰｏｔｅｎｃｙｏｆＧｌａｔｉｒａｍｅｒＡｃｅｔａｔｅ」の表題の、それぞれ全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第７，４２９，３７４号（２００８年９月３０日発行）、第７，９２３，２１５号（２０１１年４月１２日発行）、および米国特許出願公開第２０１１／０１８９７０６号（２０１１年８月４日公開）は、分泌サイトカイン（タンパク質）レベルを測定するＧＡ効力アッセイを記載する。

【0058】

本発明の方法においては、１または複数の応答バイオマーカーｍＲＮＡの発現レベルを測定する。ｍＲＮＡ発現レベルはタンパク質発現と同等であるとは限らない。従って、ｍＲＮＡ発現レベルを用いて、分泌タンパク質アッセイを用いた場合利用可能ではない応答バイオマーカーに関する情報を提供することができる。例えば、ｍＲＮＡアッセイの１つの利点は、ｍＲＮＡが、ｍＲＮＡから誘導される分泌タンパク質よりもはるかに早い検出に利用可能であり、より迅速なアッセイを得ることができることである。タイミングの問題に加えて、ある特定の応答バイオマーカーの用量応答効果は、２つの型のアッセイ間で異なることが観察された。重要なことは、米国特許第７，４２９，３７４号により検出不可能と記載されたサイトカインが、ＧＡで免疫化したマウスに由来する細胞のＧＡ刺激後に、本明細書に示されるｍＲＮＡアッセイによって明確に検出されたことである。

【0059】

実施形態において、ｍＲＮＡ増幅によって定量を実行する場合、データを、内部対照、例えば、ＧＡＰＤＨまたはβ−アクチンなどの参照またはハウスキーピング遺伝子の発現に対して正規化することができる。さらに、効力または交差効力を、本明細書の実施例に記載のように、ＤＣＣＭ−１非刺激データが対照である、対照と比較した倍数増加を単位として表すことができる。実施形態においては、効力または交差効力は、試料中のＧＡ応答バイオマーカーｍＲＮＡについての対照に対する倍数変化として表される。実施形態においては、試料中のＧＡ応答バイオマーカーｍＲＮＡについての対照に対する倍数変化は、１）同じ試料を用いて得た参照またはハウスキーピング遺伝子に対して応答バイオマーカーｍＲＮＡのレベルを正規化すること、および２）応答バイオマーカーｍＲＮＡの正規化されたレベルを、陰性対照レベルにより除算することにより算出される。実施形態においては、陰性対照レベルは、培養培地対照である。

【0060】

実施形態においては、効力または交差効力の評価のために、詳細な用量応答曲線の統計的比較を実施して、用量応答曲線の類似性を証明することができる。文献中で、または当業者には公知の任意の方法を用いて、用量応答曲線の類似性を証明することができる。実施形態において、用量応答曲線間の類似性は、用量応答曲線間の０％〜約１５％の分散率に基づいて決定される。実施形態において、用量応答曲線間の類似性は、用量応答曲線間の０％、約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、約１１％、約１２％、約１３％、約１４％、または約１５％の分散率に基づいて決定される。実施形態において、用量応答曲線間の類似性は、用量応答曲線間の０％〜約３％、０％〜約４％、０％〜約５％、０％〜約６％、０％〜約７％、０％〜約８％、０％〜約９％、０％〜約１０％、０％〜約１１％、０％〜約１２％、０％〜約１３％、０％〜約１４％、約１％〜約３％、約１％〜約４％、約１％〜約５％、約１％〜約６％、約１％〜約７％、約１％〜約８％、約１％〜約９％、約１％〜約１０％、約１％〜約１１％、約１％〜約１２％、約１％〜約１３％、約１％〜約１４％、約２％〜約４％、約２％〜約５％、約２％〜約６％、約２％〜約７％、約２％〜約８％、約２％〜約９％、約２％〜約１０％、約２％〜約１１％、約２％〜約１２％、約２％〜約１３％、約２％〜約１４％、約２％〜約１５％、約３％〜約５％、約３％〜約６％、約３％〜約７％、約３％〜約８％、約３％〜約９％、約３％〜約１０％、約３％〜約１１％、約３％〜約１２％、約３％〜約１３％、約３％〜約１４％、約３％〜約１５％、約４％〜約７％、約４％〜約８％、約４％〜約９％、約４％〜約１０％、約４％〜約１１％、約４％〜約１２％、約４％〜約１３％、約４％〜約１４％、約４％〜約１５％、約５％〜約８％、約５％〜約９％、約５％〜約１０％、約５％〜約１１％、約５％〜約１２％、約５％〜約１３％、約５％〜約１４％、約５％〜約１５％、約６％〜約９％、約６％〜約１０％、約６％〜約１１％、約６％〜約１２％、約６％〜約１３％、約６％〜約１４％、約６％〜約１５％、約７％〜約１０％、約７％〜約１１％、約７％〜約１２％、約７％〜約１３％、約７％〜約１４％、約７％〜約１５％、約８％〜約１１％、約８％〜約１２％、約８％〜約１３％、約８％〜約１４％、約８％〜約１５％、約９％〜約１２％、約９％〜約１３％、約９％〜約１４％、約９％〜約１５％、約１０％〜約１３％、約１０％〜約１４％、約１０％〜約１５％、約１１％〜約１４％、約１１％〜約１５％、約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、約１１％、約１２％、約１３％、約１４％、または約１５％の分散率に基づいて決定される。

【0061】

当業界で公知であり、文献中に記載された任意の適切なＲＴ−ＰＣＲ定量法の使用が企図される。定量法は、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Wong and Medrano, 2005, Biotechniques 39: 57-85, 「Real-Time PCR for mRNA Quantitation」に記載されている。

【0062】

実施形態において、公知の方法により当業者によって有用と確認された任意の参照またはハウスキーピング遺伝子を、本発明の方法において用いる。実施形態において、用いられる参照またはハウスキーピング遺伝子は、ＧＡＰＤＨ、β−アクチン、Ａｔｐ５ｂ、ｂ２ｍ、Ｃｙｃ１、Ｈｐｒｔ、Ｇａｐｄｈ、１８ＳＲＮＡ、およびＲｐ１１３ａから選択される。

【0063】

本発明の実施形態において、相対効力および相対交差効力を決定するために行われる比較は、観察されるｍＲＮＡバイオマーカー発現の量の比、割合、またはパーセンテージとして表される。

【0064】

本発明の実施形態において、ＧＡの試験ロットの効力または交差効力を、ＧＡの参照標準ロットの効力または交差効力と比較して、ＧＡの試験ロットの相対効力または交差効力を得る。相対効力または交差効力が１００％（１．０と表すこともできる）である実施形態においては、ＧＡの試験ロットとＧＡの参照標準ロットの効力または交差効力は等しい。実施形態において、望ましい相対効力は約８０％〜約１２０％である。実施形態において、望ましい相対効力は約８５％〜約１１５％である。実施形態において、望ましい相対効力は約９０％〜約１１０％である。実施形態において、望ましい相対交差効力は約７０％〜約１３０％である。実施形態において、望ましい相対交差効力は約６５％〜約１３５％である。ある特定の実施形態において、参照標準ロットの効力または交差効力と比較した望ましい効力または望ましい交差効力（望ましい相対効力または望ましい相対交差効力）は、約もしくは少なくとも約６５％、約もしくは少なくとも約６６％、約もしくは少なくとも約６７％、約もしくは少なくとも約６８％、約もしくは少なくとも約６９％、約もしくは少なくとも約７０％、約もしくは少なくとも約７１％、約もしくは少なくとも約７２％、約もしくは少なくとも約７３％、約もしくは少なくとも約７４％、約もしくは少なくとも約７５％、約もしくは少なくとも約７５％、約もしくは少なくとも約７６％、約もしくは少なくとも約７７％、約もしくは少なくとも約７８％、約もしくは少なくとも約７９％、約もしくは少なくとも約８０％、約もしくは少なくとも約８１％、約もしくは少なくとも約８２％、約もしくは少なくとも約８３％、約もしくは少なくとも約８４％、約もしくは少なくとも約８５％、約もしくは少なくとも約８６％、約もしくは少なくとも約８７％、約もしくは少なくとも約８８％、約もしくは少なくとも約８９％、約もしくは少なくとも約９０％、約もしくは少なくとも約９１％、約もしくは少なくとも約９２％、約もしくは少なくとも約９３％、約もしくは少なくとも約９４％、約もしくは少なくとも約９５％、約もしくは少なくとも約９６％、約もしくは少なくとも約９７％、約もしくは少なくとも約９８％、約もしくは少なくとも約９９％、約もしくは少なくとも約１００％、約もしくは少なくとも約１０１％、約もしくは少なくとも約１０２％、約もしくは少なくとも約１０３％、約もしくは少なくとも約１０４％、約もしくは少なくとも約１０５％、約もしくは少なくとも約１０６％、約もしくは少なくとも約１０７％、約もしくは少なくとも約１０８％、約もしくは少なくとも約１０９％、約もしくは少なくとも約１１０％、約もしくは少なくとも約１１１％、約もしくは少なくとも約１１２％、約もしくは少なくとも約１１３％、約もしくは少なくとも約１１４％、約もしくは少なくとも約１１５％、約もしくは少なくとも約１１６％、約もしくは少なくとも約１１７％、約もしくは少なくとも約１１８％、約もしくは少なくとも約１１９％、約もしくは少なくとも約１２０％、約もしくは少なくとも約１２１％、約もしくは少なくとも約１２２％、約もしくは少なくとも約１２３％、約もしくは少なくとも約１２４％、約もしくは少なくとも約１２５％、約もしくは少なくとも約１２６％、約もしくは少なくとも約１２７％、約もしくは少なくとも約１２８％、約もしくは少なくとも約１２９％、約もしくは少なくとも約１３０％、約もしくは少なくとも約１３１％、約もしくは少なくとも約１３２％、約もしくは少なくとも約１３３％、約もしくは少なくとも約１３４％、または約もしくは少なくとも約１３５％である。実施形態において、望ましい相対効力または交差効力は、約６８％〜約１３２％、約７０％〜約１３０％、約７２％〜約１２８％、約７５％〜約１２５％、約８０％〜約１２０％、約８５％〜約１１５％、約６５％〜約１１０％、約６８％〜約１１０％、約７０％〜約１１０％、約７２％〜約１１０％、約７８％〜約１１０％、約８０％〜約１１０％、約９０％〜約１１０％、約９５％〜約１０５％、約８５％〜約１１０％、約９０％〜約１１０％、約９５％〜約１１０％、約９６％〜約１１０％、約９７％〜約１１０％、約９８％〜約１１０％、約９９％〜約１１０％、約１００％〜約１１０％、約６５％〜約１０５％、約６８％〜約１０５％、約７０％〜約１０５％、約７２％〜約１０５％、約８０％〜約１０５％、約８５％〜約１０５％、約９０％〜約１０５％、約９５％〜約１０５％、約９６％〜約１０５％、約９７％〜約１０５％、約９８％〜約１０５％、約９９％〜約１０５％、約１００％〜約１０５％、約６５％〜約１００％、約６８％〜約１００％、約７０％〜約１００％、約７２％〜約１００％、約７５％〜約１００％、約７８％〜約１００％、約８０％〜約１００％、約８１％〜約１００％、約８２％〜約１００％、約８３％〜約１００％、約８４％〜約１００％、約８５％〜約１００％、約８６％〜約１００％、約８７％〜約１００％、約８８％〜約１００％、約８９％〜約１００％、約９０％〜約１００％、約９１％〜約１００％、約９２％〜約１００％、約９３％〜約１００％、約９４％〜約１００％、約９５％〜約１００％、約９６％〜約１００％、約９７％〜約１００％、約９８％〜約１００％、約９９％〜約１００％、約９５％〜約９９％、約９６％〜約９９％、約９７％〜約９９％、約７０％〜約１３５％、約７５％〜約１３５％、約８０％〜約１３５％、約８５％〜約１３５％、約９０％〜約１３５％、約７５％〜約１３０％、約８０％〜約１３０％、約８５％〜約１３０％、約９０％〜約１３０％、約８０％〜約１２５％、約８５％〜約１２５％、約９０％〜約１２５％、約８５％〜約１２０％、約９０％〜約１２０％、または約９５％〜約１２０％である。

【0065】

動物
本発明による試験動物または試験哺乳動物は、化合物の評価のために用いることができる任意の動物、例えば、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、イヌ、サルなどである。

【0066】

適切な試験動物を、本明細書の実施例に提供される教示と組み合わせた、当業者には公知の方法に従って同定することができる。例えば、多くのマウス系統が当業界で公知であり、ＪａｃｋｓｏｎＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＣｈａｒｌｅｓＲｉｖｅｒ、Ｔａｃｏｎｉｃなどの供給源から購入可能である。入手可能な近交系マウス系統に関する情報は、公開された文献およびＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＭｏｕｓｅＳｔｒａｉｎＲｅｓｏｕｒｃｅ（Eppig JT and Strivens M, 1999, Finding a mouse: the International Mouse Strain Resource (IMSR). Trends in Genetics 15: 81-82）を含むデータベース中で入手可能である。いくつかのマウス系統におけるサイトカイン分泌レベルの増加の評価が、本明細書の実施例に記載される。実施例は、本発明の方法における潜在的な測定のためのサイトカインをコードする遺伝子に由来する応答バイオマーカーｍＲＮＡの評価をさらに記載する。

【0067】

実施形態において、試験動物はマウスである。実施形態において、マウス系統はＭＨＣハプロタイプｂ、ｄ、またはｓ２を有する。実施形態において、マウスの系統は、ＣＳＪＬＦ１／ＪＲｊ、ＳＪＬ／Ｊ、ＢＡＬＢ／ｃＢｙＪ、ＣＤ−１、Ｃ５７ＢＬ／１０Ｊ、または（ＳＪＬ／ＪｘＢＡＬＢ／ｃ）Ｆ１である。実施形態において、マウスは、メスのＣＳＪＬＦ１／ＪＲｊ、メスのＳＪＬ／Ｊ、メスのＢＡＬＢ／ｃＢｙＪ、メスのＣＤ−１、メスのＣ５７ＢＬ／１０Ｊ、またはメスの（ＳＪＬ／ＪｘＢＡＬＢ／ｃ）Ｆ１マウスである。

【0068】

それぞれ異なるＧＡロットで免疫化した異なるマウスに由来する試料中での応答バイオマーカーｍＲＮＡ発現を比較することにより交差効力が決定される実施形態においては、マウスは免疫学的に関連する遺伝子座に関して実質的に同じ遺伝子型のものである。実施形態において、マウスは、同じマウス系統のマウス、ＨＬＡ適合マウス；同腹子；および双子から選択される。実施形態において、マウスは遺伝的に同一であるか、または実質的に遺伝的に同一である。

【0069】

免疫化
本発明の方法において有用な動物免疫化手順は、本明細書ならびに公開された文献、例えば、米国特許第７，４２９，３７４号および第７，９２３，２１５号に記載されている。ＧＡに対してＴ細胞応答を誘導する他の有効な免疫化手順は、当業者によって特定可能である。実施形態においては、マウスを、足蹠（ｆｏｏｔｐａｄ）（足底内）および／または下肢／膝注射により、ＣＦＡ乳濁液中の２５０μｇのＧＡまたはＣＦＡ乳濁液中のマンニトールを用いて免疫化する。実施形態において、マウスを、約２００〜約５００μｇ、約２００〜約４５０μｇ、約２００〜約３５０μｇ、約２００〜約３００μｇ、約２００〜約２５０μｇ、約２５０〜約５００μｇ、約２５０〜約４５０μｇ、約２５０〜約４００μｇ、約２５０〜約３５０μｇ、または約２５０〜約３００μｇのＧＡを用いて免疫化する。

【0070】

実施形態において、２７−Ｇの１／２インチ針を有する１ｍＬの注射筒を用いて４つの足蹠それぞれへの注射により、８週齢の動物を免疫化する。足底内注射のために、０．１ｍＬの全注射容量（それぞれの前足蹠中に約１０μＬ、およびそれぞれの後足蹠中に４０μＬ）を用いてマウスを免疫化することができる。皮下（例えば、下肢）注射のために、それぞれのマウスを、０．１ｍＬの全注射容量（例えば、それぞれの前下肢中に約２５μＬ、および後肢のそれぞれの膝に２５μＬ）を用いて免疫化することができる。

【0071】

Ｔ細胞培養物
本発明の方法において、試験動物中の任意の供給源に由来するＴ細胞のエクスビボでのＧＡ刺激が企図される。実施形態においては、Ｔ細胞は、リンパ節、脾臓、骨髄、または末梢血に由来する。Ｔ細胞を、本明細書の実施例に記載のように、または当業界で公知の任意の方法により、または文献中で公開された方法を用いて取得することができる。

【0072】

例として、Ｔ細胞は、免疫化したマウス、および以下のように調製される一次培養物から得られる：免疫化の１０日後、免疫化した動物を頸椎脱臼により犠牲にする。免疫化したマウスからの腋下（ａｘｉｌｌａｒｙ）および腋窩（ｐｏｐｌｉｔｅａｌ）領域中のリンパ節を除去し、５ｍＬの氷冷滅菌ＲＰＭＩ−１６４０培地を含有するペトリ皿にプールする。無傷のリンパ節を５．０ｍＬの氷冷滅菌ＲＰＭＩ１６４０培地中で３回洗浄する。滅菌注射筒のプランジャ端部でＬＮを圧迫することにより、ＬＮ細胞を単離する。細胞懸濁液を最初に１００μｍのナイロン細胞ストレーナーに通過させた後、４０ｍＬの氷冷ＲＰＭＩ−１６４０培地で１回洗浄する。４℃で１０分間、約２００ｘｇで遠心分離した後、細胞計数のために細胞ペレットを４０ｍＬのＲＰＭＩ−１６４０培地中に再懸濁する。

【0073】

トリパンブルー色素排除法を用いて、以下のように懸濁液中の生細胞の細胞密度を決定することができる：細胞計数のために、０．１ｍＬの細胞懸濁液を、０．６５ｍＬの１ＸＤＰＢＳおよび０．２５ｍＬの４％トリパンブルー溶液を含む清潔な滅菌マイクロ遠心管に移した後、計数チャンバに２０μＬのトリパンブルー細胞懸濁液混合物を添加する。細胞密度および生存能力を、ＡｕｔｏＴ４Ｃｅｌｌｏｍｅｔｅｒを用いて測定する。細胞計数後、ＬＮ細胞を４℃で１０分間、約２００ｘｇで遠心分離し、１．０ｘ１０^７細胞／ｍＬの細胞密度でＤＣＣＭ−１富化培地中に再懸濁する。ＬＮ細胞を、薬物処理（刺激）のために２４穴組織培養プレート中に播種することができる。

【0074】

実施形態において、ＬＮ細胞を、ＧＡに対する免疫応答が生じるのに十分な時間の後、例えば、免疫化の約９〜１１日後にマウスから取得する。

【0075】

酢酸グラチラマー刺激
Ｔ細胞、例えば、ＬＮ細胞を、当業界で公知の、または文献に記載された任意の好適な方法に従って、抗原（ＧＡ）で刺激することができる。例えば、所定数のＬＮ細胞、例えば、ＧＡで免疫化した動物に由来する０．５ｍＬの細胞（５ｘ１０^６細胞／ウェル）を、望み通り所定量のＧＡの参照標準ロットで刺激することができる。別の試料中で、同じ所定数のＬＮ細胞を、同じ所定量のＧＡの試験ロットで刺激することができる。１００μＬのＧＡ（２０ｍｇ／ｍＬ）を１９．９ｍＬのＤＣＣＭ−１富化培地に添加し、望み通りに異なる濃度のＧＡ試料を調製するのに有用な１００μｇ／ｍＬのストック溶液を得ることにより、ＧＡ希釈試料を調製することができる。

【0076】

例えば、２４穴組織培養プレート中で、所定量のＧＡ保存溶液の試験ロットまたは参照標準ロットを、所定数のＬＮ細胞を含有するウェルに添加して、所望の濃度のＧＡを得る。同様にマンニトールで免疫化した対照動物に由来する同じ所定数のＴ細胞を、同じ手順を用いて、同じ所定量のＧＡのロットで処理することができる。

【0077】

本発明の実施形態においては、試験動物を規定量のＧＡ参照標準で免疫化する。免疫化した動物に由来する所定数のリンパ節細胞を含有する少なくとも１つの試料を、ＧＡ参照標準の存在下でインキュベートし、免疫化した動物に由来するリンパ節細胞の少なくとも１つの試料を、ＧＡの試験ロットの存在下でインキュベートする。この刺激は、免疫応答に含まれる分子、例えば、サイトカインおよびサイトカイン受容体をコードするｍＲＮＡの発現を誘導することができる。

【0078】

実施形態において、リンパ節細胞の試料を、少なくとも約０．３μｇ／ｍＬ〜約１００μｇ／ｍＬの濃度のＧＡと共にインキュベートする。実施形態において、濃度は、少なくとも約０．３μｇ／ｍＬ、少なくとも約０．４μｇ／ｍＬ、少なくとも約０．５μｇ／ｍＬ、少なくとも約０．６μｇ／ｍＬ、少なくとも約０．７μｇ／ｍＬ、少なくとも約０．８μｇ／ｍＬ、少なくとも約０．９μｇ／ｍＬ、少なくとも約１μｇ／ｍＬ、少なくとも約１．５μｇ／ｍＬ、少なくとも約２μｇ／ｍＬ、少なくとも約２．５μｇ／ｍＬ、少なくとも約３μｇ／ｍＬ、少なくとも約３．５μｇ／ｍＬ、少なくとも約４μｇ／ｍＬ、少なくとも約４．５μｇ／ｍＬ、少なくとも約５μｇ／ｍＬ、少なくとも約５．５μｇ／ｍＬ、少なくとも約６μｇ／ｍＬ、少なくとも約６．５μｇ／ｍＬ、少なくとも約７μｇ／ｍＬ、少なくとも約７．５μｇ／ｍＬ、少なくとも約８μｇ／ｍＬ、少なくとも約８．５μｇ／ｍＬ、少なくとも約９μｇ／ｍＬ、少なくとも約９．５μｇ／ｍＬ、少なくとも約１０μｇ／ｍＬ、少なくとも約１０．５μｇ／ｍＬ、少なくとも約１１μｇ／ｍＬ、少なくとも約１１．５μｇ／ｍＬ、少なくとも約１２μｇ／ｍＬ、少なくとも約１２．５μｇ／ｍＬ、少なくとも約１３μｇ／ｍＬ、少なくとも約１３．５μｇ／ｍＬ、少なくとも約１４μｇ／ｍＬ、少なくとも約１４．５μｇ／ｍＬ、少なくとも約１５μｇ／ｍＬ、少なくとも約１５．５μｇ／ｍＬ、少なくとも約１６μｇ／ｍＬ、少なくとも約１６．５μｇ／ｍＬ、少なくとも約１７μｇ／ｍＬ、少なくとも約１７．５μｇ／ｍＬ、少なくとも約１８μｇ／ｍＬ、少なくとも約１８．５μｇ／ｍＬ、少なくとも約１９μｇ／ｍＬ、少なくとも約１９．５μｇ／ｍＬ、少なくとも約２０μｇ／ｍＬ、少なくとも約２１．５μｇ／ｍＬ、少なくとも約２２μｇ／ｍＬ、少なくとも約２２．５μｇ／ｍＬ、少なくとも約２３μｇ／ｍＬ、少なくとも約２４μｇ／ｍＬ、少なくとも約２４．５μｇ／ｍＬ、少なくとも約２５μｇ／ｍＬ、少なくとも約２５．５μｇ／ｍＬ、少なくとも約２６μｇ／ｍＬ、少なくとも約２６．５μｇ／ｍＬ、少なくとも約２７μｇ／ｍＬ、少なくとも約２７．５μｇ／ｍＬ、少なくとも約２８μｇ／ｍＬ、少なくとも約２８．５μｇ／ｍＬ、少なくとも約２９μｇ／ｍＬ、少なくとも約２９．５μｇ／ｍＬ、少なくとも約３０μｇ／ｍＬ、少なくとも約３５μｇ／ｍＬ、少なくとも約４０μｇ／ｍＬ、少なくとも約４５μｇ／ｍＬ、少なくとも約５０μｇ／ｍＬ、少なくとも約５５μｇ／ｍＬ、少なくとも約６０μｇ／ｍＬ、少なくとも約６５μｇ／ｍＬ、少なくとも約７０μｇ／ｍＬ、少なくとも約７５μｇ／ｍＬ、少なくとも約８０μｇ／ｍＬ、少なくとも約８５μｇ／ｍＬ、少なくとも約９０μｇ／ｍＬ、少なくとも約９５μｇ／ｍＬ、または少なくとも約１００μｇ／ｍＬである。実施形態において、濃度は、約０．３〜約１５μｇ／ｍＬ、約０．３〜約１０μｇ／ｍＬ、約０．３〜約８μｇ／ｍＬ、約０．３〜約６μｇ／ｍＬ、約０．３〜約５μｇ／ｍＬ、約０．３〜約４μｇ／ｍＬ、約０．３〜約３μｇ／ｍＬ、約０．３〜約２．５μｇ／ｍＬ、約０．３〜約２μｇ／ｍＬ、約０．３〜約１μｇ／ｍＬ、約１〜約１５μｇ／ｍＬ、約１〜約１０μｇ／ｍＬ、約１〜約９μｇ／ｍＬ、約１〜約８μｇ／ｍＬ、約１〜約７μｇ／ｍＬ、約１〜約６μｇ／ｍＬ、約１〜約５μｇ／ｍＬ、約１〜約４μｇ／ｍＬ、約１〜約３μｇ／ｍＬ、約１〜約２．５μｇ／ｍＬ、約１〜約２μｇ／ｍＬ、約２〜約３０μｇ／ｍＬ、約２〜約２９μｇ／ｍＬ、約２〜約２８μｇ／ｍＬ、約２〜２７μｇ／ｍＬ、約２〜約２６μｇ／ｍＬ、約２〜約２５μｇ／ｍＬ、約２〜約２４μｇ／ｍＬ、約２〜約２３μｇ／ｍＬ、約２〜約２２μｇ／ｍＬ、約２〜約２１μｇ／ｍＬ、約２〜約２０μｇ／ｍＬ、約２〜約１９μｇ／ｍＬ、約２〜約１８μｇ／ｍＬ、約２〜約１７μｇ／ｍＬ、約２〜約１６μｇ／ｍＬ、約２〜約１５μｇ／ｍＬ、約２〜約１４μｇ／ｍＬ、約２〜約１３μｇ／ｍＬ、約２〜約１２μｇ／ｍＬ、約２〜約１１μｇ／ｍＬ、約２〜約１０μｇ／ｍＬ、約２〜約５μｇ／ｍＬ、約２．５〜約３０μｇ／ｍＬ、約２．５〜約２９μｇ／ｍＬ、約２．５〜約２８μｇ／ｍＬ、約２．５〜２７μｇ／ｍＬ、約２．５〜約２６μｇ／ｍＬ、約２．５〜約２５μｇ／ｍＬ、約２．５〜約２４μｇ／ｍＬ、約２．５〜約２３μｇ／ｍＬ、約２．５〜約２２μｇ／ｍＬ、約２．５〜約２１μｇ／ｍＬ、約２．５〜約２０μｇ／ｍＬ、約２．５〜約１９μｇ／ｍＬ、約２．５〜約１８μｇ／ｍＬ、約２．５〜約１７μｇ／ｍＬ、約２．５〜約１６μｇ／ｍＬ、約２．５〜約１５μｇ／ｍＬ、約２．５〜約１４μｇ／ｍＬ、約２．５〜約１３μｇ／ｍＬ、約２．５〜約１２μｇ／ｍＬ、約２．５〜約１１μｇ／ｍＬ、約２．５〜約１０μｇ／ｍＬ、約２．５〜約５μｇ／ｍＬ、約３〜約３０μｇ／ｍＬ、約３〜約２９μｇ／ｍＬ、約３〜約２８μｇ／ｍＬ、約３〜２７μｇ／ｍＬ、約３〜約２６μｇ／ｍＬ、約３〜約２５μｇ／ｍＬ、約３〜約２４μｇ／ｍＬ、約３〜約２３μｇ／ｍＬ、約３〜約２２μｇ／ｍＬ、約３〜約２１μｇ／ｍＬ、約３〜約２０μｇ／ｍＬ、約３〜約１９μｇ／ｍＬ、約３〜約１８μｇ／ｍＬ、約３〜約１７μｇ／ｍＬ、約３〜約１６μｇ／ｍＬ、約３〜約１５μｇ／ｍＬ、約３〜約１４μｇ／ｍＬ、約３〜約１３μｇ／ｍＬ、約３〜約１２μｇ／ｍＬ、約３〜約１１μｇ／ｍＬ、約３〜約１０μｇ／ｍＬ、約３．５〜約３０μｇ／ｍＬ、約３．５〜約２９μｇ／ｍＬ、約３．５〜約２８μｇ／ｍＬ、約３．５〜２７μｇ／ｍＬ、約３．５〜約２６μｇ／ｍＬ、約３．５〜約２５μｇ／ｍＬ、約３．５〜約２４μｇ／ｍＬ、約３．５〜約２３μｇ／ｍＬ、約３．５〜約２２μｇ／ｍＬ、約３．５〜約２１μｇ／ｍＬ、約３．５〜約２０μｇ／ｍＬ、約３．５〜約１９μｇ／ｍＬ、約３．５〜約１８μｇ／ｍＬ、約３．５〜約１７μｇ／ｍＬ、約３．５〜約１６μｇ／ｍＬ、約３．５〜約１５μｇ／ｍＬ、約３．５〜約１４μｇ／ｍＬ、約３．５〜約１３μｇ／ｍＬ、約３．５〜約１２μｇ／ｍＬ、約３．５〜約１１μｇ／ｍＬ、約３．５〜約１０μｇ／ｍＬ、約４〜約３０μｇ／ｍＬ、約４〜約２９μｇ／ｍＬ、約４〜約２８μｇ／ｍＬ、約４〜２７μｇ／ｍＬ、約４〜約２６μｇ／ｍＬ、約４〜約２５μｇ／ｍＬ、約４〜約２４μｇ／ｍＬ、約４〜約２３μｇ／ｍＬ、約４〜約２２μｇ／ｍＬ、約４〜約２１μｇ／ｍＬ、約４〜約２０μｇ／ｍＬ、約４〜約１９μｇ／ｍＬ、約４〜約１８μｇ／ｍＬ、約４〜約１７μｇ／ｍＬ、約４〜約１６μｇ／ｍＬ、約４〜約１５μｇ／ｍＬ、約４〜約１４μｇ／ｍＬ、約４〜約１３μｇ／ｍＬ、約４〜約１２μｇ／ｍＬ、約４〜約１１μｇ／ｍＬ、約４〜約１０μｇ／ｍＬ、約４．５〜約３０μｇ／ｍＬ、約４．５〜約２９μｇ／ｍＬ、約４．５〜約２８μｇ／ｍＬ、約４．５〜２７μｇ／ｍＬ、約４．５〜約２６μｇ／ｍＬ、約４．５〜約２５μｇ／ｍＬ、約４．５〜約２４μｇ／ｍＬ、約４．５〜約２３μｇ／ｍＬ、約４．５〜約２２μｇ／ｍＬ、約４．５〜約２１μｇ／ｍＬ、約４．５〜約２０μｇ／ｍＬ、約４．５〜約１９μｇ／ｍＬ、約４．５〜約１８μｇ／ｍＬ、約４．５〜約１７μｇ／ｍＬ、約４．５〜約１６μｇ／ｍＬ、約４．５〜約１５μｇ／ｍＬ、約４．５〜約１４μｇ／ｍＬ、約４．５〜約１３μｇ／ｍＬ、約４．５〜約１２μｇ／ｍＬ、約４．５〜約１１μｇ／ｍＬ、約４．５〜約１０μｇ／ｍＬ、約５〜約７５μｇ／ｍＬ、約５〜約５０μｇ／ｍＬ、約５〜約４０μｇ／ｍＬ、約５〜約３０μｇ／ｍＬ、約５〜約２９μｇ／ｍＬ、約５〜約２８μｇ／ｍＬ、約５〜２７μｇ／ｍＬ、約５〜約２６μｇ／ｍＬ、約５〜約２５μｇ／ｍＬ、約５〜約２４μｇ／ｍＬ、約５〜約２３μｇ／ｍＬ、約５〜約２２μｇ／ｍＬ、約５〜約２１μｇ／ｍＬ、約５〜約２０μｇ／ｍＬ、約５〜約１９μｇ／ｍＬ、約５〜約１８μｇ／ｍＬ、約５〜約１７μｇ／ｍＬ、約５〜約１６μｇ／ｍＬ、約５〜約１５μｇ／ｍＬ、約５〜約１４μｇ／ｍＬ、約５〜約１３μｇ／ｍＬ、約５〜約１２μｇ／ｍＬ、約５〜約１１μｇ／ｍＬ、約５〜約１０μｇ／ｍＬ、約１０〜約７５μｇ／ｍＬ、約１０〜約５０μｇ／ｍＬ、約１０〜約５０μｇ／ｍＬ、約１０〜約３０μｇ／ｍＬ、約１０〜約２５μｇ／ｍＬ、約１０〜約２０μｇ／ｍＬ、約１０〜約１５μｇ／ｍＬ、約１５〜約７５μｇ／ｍＬ、約１５〜約５０μｇ／ｍＬ、約１５〜約４０μｇ／ｍＬ、約１５〜約３０μｇ／ｍＬ、約１５〜約２５μｇ／ｍＬ、または約１５〜約２０μｇ／ｍＬである。

【0079】

本発明の実施形態において、免疫化のために用いられるＧＡの参照標準ロットは、望み通りＣｏｐａｘｏｎｅまたはＧＡの任意の他のロットである。これらの実施形態において、免疫化した動物に由来する細胞の別の試料を、免疫化のために用いられたＧＡのロットで処理し、細胞の第２の試料を、ＧＡの第２のロット（試験ロット）でそれぞれ処理する。実施形態において、ＧＡの参照標準ロットは、Ｃｏｐａｘｏｎｅではない。これらの実施形態において、試験ロットは、望み通りＣｏｐａｘｏｎｅまたはＧＡの任意の他のロットであってもよい。実施形態において、１つより多いＧＡの試験ロットを、第１の試験ロットと同時に評価する。

【0080】

実施形態において、交差効力を決定する場合、１匹より多いマウスを、それぞれ異なるロットのＧＡで免疫化する。免疫化したマウスのそれぞれから得られるＬＮ細胞の別の試料を、異なるロットのＧＡで刺激し、それぞれの免疫化に由来する細胞をそれぞれ異なるロットのＧＡで別々に刺激する。

【0081】

応答バイオマーカーｍＲＮＡ
ＧＡ刺激により潜在的に調節されるｍＲＮＡ種が、本発明の方法における応答バイオマーカーとしての使用について企図される。実施形態において、応答バイオマーカーは、例えば、ＣＤ２５、ＣＤ６９、ＣＤ７１、ＣＤ８６（ＣＤ８６分子）、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ、誘導性Ｔ細胞共刺激剤）、ＣＤ２７９、ＨＬＡ−ＤＲ、ＧＡＴＡ３（ＧＡＴＡ結合タンパク質３）、ＨＬＡ−ＤＭＡ（主要組織適合複合体、クラスＩＩ、ＤＭアルファ）、ＨＬＡ−ＤＭＢ（主要組織適合複合体、クラスＩＩ、ＤＭベータ）、ＩＦＮ−γ（インターフェロンガンマ）、ＩＦＮ−γＲ２（インターフェロンガンマ受容体）、ＩＬ−２（インターロイキン２）、ＩＬ−４（インターロイキン４）、ＩＬ−５（インターロイキン５）、ＩＬ−６（インターロイキン６）、ＩＬ−８（ＣＸＣＬ−８）、ＲＡＮＴＥＳ（ＣＣＬ５）、ＣＣＬ１、ＣＸＣＬ４、ＣＸＣＬ７、ＩＬ−１０（インターロイキン１０）、ＩＬ−１３（インターロイキン１３）、ＩＬ−１８（インターロイキン１８）、ＩＬ−１２ＲＢ１（インターロイキン１２受容体、ベータ）、ＩＬ−１７Ａ（インターロイキン１７Ａ）、ＩＬ−１７Ｆ（インターロイキン１７Ｆ）、ＩＬ−１８Ｒ１（インターロイキン１８受容体１）、ＩＬ−２ＲＡ（インターロイキン２受容体、アルファ２）、ＩＬ−２ＲＧ（インターロイキン２受容体、ガンマ）、ＩＬ４−Ｒ（インターロイキン４受容体）、ＩＬ−６Ｒ（インターロイキン６受容体）、ＩＬ−２１（インターロイキン２１）、ＩＬ−２２（インターロイキン２２）、ＩＬ−１β（インターロイキン１−ベータ）、Ｔｂｘ２１（Ｔ−ｂｏｘ２１）、ＴＧＦＢＲ２（トランスフォーミング増殖因子、ベータ受容体ＩＩ）、ＴＮＦ（腫瘍壊死因子、ＴＮＦ−α）、ＴＮＦ−β（ＬＴ）、ＴＧＦ−β、ＦＯＸＰ３（フォークヘッドボックスＰ３）、またはＩＬ−１０ＲＢ（インターロイキン１０受容体、ベータ）をコードする遺伝子から転写されるｍＲＮＡである。これらの遺伝子の発現を、購入可能なサービス、試薬および／またはキット、例えば、ＭｏｕｓｅＷＧ−６ｖ２．０ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＢｅａｄＣｈｉｐＫｉｔ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いて評価することができる。

【0082】

実施形態において、応答バイオマーカーｍＲＮＡは、例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、またはＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α（ＴＮＦ）、ＴＮＦ−β（ＬＴ）、ＴＧＦ−β、およびＩＬ−１βから選択されるサイトカインをコードする遺伝子から転写される。実施形態において、応答バイオマーカーｍＲＮＡは、例えば、ＣＤ２５、ＣＤ６９、ＣＤ７１、ＣＤ８６、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、ＣＤ２７８、ＣＤ２７９、ＧＡＴＡ３、Ｔｂｘ２１、ＨＬＡ−ＤＭＡ、ＨＬＡ−ＤＭＢ、ＩＦＮ−γＲ２、ＩＬ−１２ＲＢ１、ＩＬ−２ＲＡ、ＩＬ−２ＲＧ、ＩＬ−４Ｒ、ＩＬ−６Ｒ、ＩＬ−１０ＲＢ、ＴＧＦＢＲ２、ＦＯＸＰ３、およびＨＬＡ−ＤＲから選択される活性化マーカーまたはサイトカイン受容体をコードする遺伝子から転写される。実施形態において、応答バイオマーカーｍＲＮＡは、例えば、ＩＬ−８（ＣＸＣＬ８）、ＲＡＮＴＥＳ（ＣＣＬ５）、ＣＣＬ１、ＣＸＣＬ４、およびＣＸＣＬ７から選択されるケモカインをコードする遺伝子から転写される。実施形態において、応答バイオマーカーｍＲＮＡは、Ｔｈ１関連サイトカイン、Ｔｈ２関連サイトカイン、Ｔｈ１７関連サイトカイン、またはＴ_ＦＨ関連サイトカインをコードする遺伝子から転写される。実施形態において、応答バイオマーカーｍＲＮＡは、Ｔｈ１関連サイトカインをコードする遺伝子から転写され、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、またはＣＸＣＬ１である。実施形態において、応答バイオマーカーｍＲＮＡは、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、またはＩＬ−１３から選択されるＴｈ２関連サイトカインをコードする遺伝子から転写される。実施形態において、応答バイオマーカーｍＲＮＡは、ＩＬ−１７およびＩＬ−２２から選択されるＴｈ１７関連サイトカインをコードする遺伝子から転写される。実施形態において、応答バイオマーカーｍＲＮＡは、ＩＬ−２１であるＴ_ＦＨ関連サイトカインをコードする遺伝子から転写される。実施形態において、応答バイオマーカーｍＲＮＡは、ＩＬ−１０およびＴＧＦ−βから選択される重要な調節関連サイトカインをコードする遺伝子から転写される。

【0083】

実施形態において、応答バイオマーカーｍＲＮＡは、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７、ＩＬ−２２、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＣＤ２５、またはＩＬ１−βをコードする遺伝子から転写される。実施形態において、応答バイオマーカーｍＲＮＡは、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７、ＩＬ−２２、ＴＮＦ−α、ＣＤ２５、またはＩＬ１−βをコードする遺伝子から転写される。実施形態において、応答バイオマーカーｍＲＮＡは、ＩＬ−４、ＩＬ−１３、またはＴＮＦ−αをコードする遺伝子から転写される。実施形態において、応答バイオマーカーｍＲＮＡは、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７、ＩＬ−２２、ＩＦＮ−γ、またはＣＤ２５をコードする遺伝子から転写される。実施形態において、応答バイオマーカーｍＲＮＡは、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７、またはＣＤ２５をコードする遺伝子から転写される。実施形態において、応答バイオマーカーｍＲＮＡは、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７、ＩＬ−２２、ＩＦＮ−γ、またはＴＮＦ−αをコードする遺伝子から転写される。実施形態において、応答バイオマーカーｍＲＮＡは、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７、ＩＬ−２２、ＴＮＦ−αをコードする遺伝子から転写される。実施形態において、応答バイオマーカーｍＲＮＡは、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７、またはＩＦＮ−γをコードする遺伝子から転写される。実施形態において、応答バイオマーカーｍＲＮＡは、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはＩＬ−１７をコードする遺伝子から転写される。実施形態において、応答バイオマーカーｍＲＮＡは、ＣＤ２５、ＩＬ−４、またはＩＬ−１３をコードする遺伝子から転写される。実施形態において、応答バイオマーカーｍＲＮＡは、ＩＬ−４、またはＩＬ−１３をコードする遺伝子から転写される。

【0084】

実施形態において、マウス系統は、ＣＳＪＬＦ１／ＪＲｊ、ＳＪＬ／Ｊ、ＢＡＬＢ／ｃＢｙＪ、ＣＤ−１、Ｃ５７ＢＬ／１０Ｊ、または（ＳＪＬ／ＪｘＢＡＬＢ／ｃ）Ｆ１である。実施形態において、マウス系統は、ＣＳＪＬＦ１／ＪＲｊ、ＳＪＬ／Ｊ、ＢＡＬＢ／ｃＢｙＪ、ＣＤ−１、Ｃ５７ＢＬ／１０Ｊ、または（ＳＪＬ／ＪｘＢＡＬＢ／ｃ）Ｆ１であり、応答バイオマーカーｍＲＮＡは、マウスＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、またはＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α（ＴＮＦ）、ＴＮＦ−β（ＬＴ）、ＴＧＦ−β、およびＩＬ−１βをコードする遺伝子から転写される。実施形態において、１つより多い応答バイオマーカーｍＲＮＡを測定する。特定の実施形態において、１つより多い応答バイオマーカーｍＲＮＡを、例えば、多重ＰＣＲにより、同じ試料中で測定する。特定の実施形態においては、試験動物はＳＪＬ／Ｊマウスであり、応答バイオマーカーｍＲＮＡはｍＩＬ−２、ｍＩＬ−４、ｍＩＬ−５、ｍＩＬ−１３、またはｍＩＦＮ−γをコードする遺伝子から転写される。特定の実施形態においては、試験動物はＢＡＬＢ／ｃＢｙＪマウスであり、応答バイオマーカーｍＲＮＡはｍＩＬ−２、ｍＩＦＮ−γ、ｍＩＬ−４、ｍＩＬ−５、ｍＩＬ−１０、またはｍＩＬ−１３をコードする遺伝子から転写される。他の実施形態においては、試験動物はＣＤ−１マウスであり、応答バイオマーカーｍＲＮＡはｍＩＬ−２、ｍＩＦＮ−γ、ｍＩＬ−５、ｍＩＬ−１０、またはｍＩＬ−１３をコードする遺伝子から転写される。ある特定の実施形態において、試験動物はＣ５７ＢＬ／１０Ｊマウスであり、応答バイオマーカーｍＲＮＡはｍＩＬ−２またはｍＩＦＮ−γをコードする遺伝子から転写される。他の実施形態においては、試験動物は（ＳＪＬ／ＪｘＢＡＬＢ／Ｃ）Ｆ１マウスであり、応答バイオマーカーｍＲＮＡはｍＩＦＮ−γ、ｍＴＮＦ−α、ｍＩＬ−４、ｍＩＬ−５、ｍＩＬ−１０、ｍＩＬ−１３、ｍＩＬ−１７、ｍＣＤ６９、またはｍＣＤ２５をコードする遺伝子から転写される。実施形態において、試験動物はＣＳＪＬＦ１／ＪＲｊマウスであり、応答バイオマーカーｍＲＮＡはＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはＩＬ−１７をコードする遺伝子から転写される。

【0085】

本発明の特定の実施形態においては、試験動物は足底内注射により免疫化したＢＡＬＢ／ｃＢｙＪマウスであり、測定される応答バイオマーカーはＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、またはＩＬ−５である。実施形態において、試験動物は下肢注射により免疫化したＢＡＬＢ／ｃＢｙＪマウスであり、測定される応答バイオマーカーはＩＬ−２である。他の実施形態において、試験動物は足底内注射により免疫化したＣＤ−１マウスであり、測定される応答バイオマーカーはＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、ＩＬ−５、またはＩＬ−１０である。

【0086】

本発明はまた、本発明の効力アッセイにおいて測定できる応答バイオマーカーｍＲＮＡ種を同定するための方法にも関する。当業者であれば、さらなる応答バイオマーカーｍＲＮＡを、ＧＡで免疫化したマウスに由来するＴ細胞のＧＡ刺激に応答して増加するサイトカインｍＲＮＡ種の同定を証明する、本明細書に提示される教示に従って同定することができる。実施形態において、本発明の効力アッセイにおける使用のための適切な応答バイオマーカーは、ＧＡで免疫化したマウスに由来するＴ細胞のＧＡ刺激に応答して調節されると決定され、調節が２つ以上の反復試験において一貫することが見出されるｍＲＮＡ種である。実施形態において、ｍＲＮＡ種は、ＧＡ刺激に応答して少なくとも約２倍〜約５０倍、約２倍〜約４５倍、約２倍〜約４０倍、約２倍〜約３５倍、約２倍〜約３０倍、約２倍〜約２５倍、約２倍〜約２２倍、約２倍〜約２０倍、約２倍〜約１５倍、約２倍〜約１２倍、約２倍〜約１０倍、約２倍〜約９倍、約２倍〜約８倍、約２倍〜約７倍、約２倍〜約６倍、約２倍〜約５倍、約２倍〜約４倍、約３倍〜約５０倍、約３倍〜約４５倍、約３倍〜約４０倍、約３倍〜約３５倍、約３倍〜約３０倍、約３倍〜約２５倍、約３倍〜約２２倍、約３倍〜約２０倍、約３倍〜約１５倍、約３倍〜約１２倍、約３倍〜約１０倍、約３倍〜約９倍、約３倍〜約８倍、約３倍〜約７倍、約３倍〜約６倍、約３倍〜約５倍、約４倍〜約５０倍、約４倍〜約４５倍、約４倍〜約４０倍、約４倍〜約３５倍、約４倍〜約３０倍、約４倍〜約２５倍、約４倍〜約２２倍、約４倍〜約２０倍、約４倍〜約１５倍、約４倍〜約１２倍、約４倍〜約１０倍、約４倍〜約９倍、約４倍〜約８倍、約４倍〜約７倍、約４倍〜約６倍、約５倍〜約５０倍、約５倍〜約４５倍、約５倍〜約４０倍、約５倍〜約３５倍、約５倍〜約３０倍、約５倍〜約２５倍、約５倍〜約２２倍、約５倍〜約２０倍、約５倍〜約１５倍、約５倍〜約１２倍、約５倍〜約１０倍、約５倍〜約９倍、約５倍〜約８倍、約５倍〜約７倍、約７倍〜約５０倍、約７倍〜約４５倍、約７倍〜約４０倍、約７倍〜約３５倍、約７倍〜約３０倍、約７倍〜約２５倍、約７倍〜約２２倍、約７倍〜約２０倍、約７倍〜約１５倍、約７倍〜約１２倍、約７倍〜約１０倍、約７倍〜約９倍、約１０倍〜約５０倍、約１０倍〜約４５倍、約１０倍〜約４０倍、約１０倍〜約３５倍、約１０倍〜約３０倍、約１０倍〜約２５倍、約１０倍〜約２２倍、約１０倍〜約２０倍、約１０倍〜約１５倍、約１５倍〜約５０倍、約１５倍〜約４５倍、約１５倍〜約４０倍、約１５倍〜約３５倍、約１５倍〜約３０倍、約１５倍〜約２５倍、約１５倍〜約２２倍、約１５倍〜約２０倍、約２０倍〜約５０倍、約２０倍〜約４５倍、約２０倍〜約４０倍、約２０倍〜約３５倍、約２０倍〜約３０倍、約２０倍〜約２５倍、約２５倍〜約５０倍、約２５倍〜約４５倍、約２５倍〜約４０倍、約２５倍〜約３５倍、約２５倍〜約３０倍、約３０倍〜約５０倍、約３０倍〜約４５倍、約３０倍〜約４０倍、約３０倍〜約３５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１１倍、少なくとも約１２倍、少なくとも約１３倍、少なくとも約１４倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３５倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約４５倍、または少なくとも約５０倍調節される。潜在的な応答バイオマーカーｍＲＮＡの測定は、本明細書の他の場所に記載される。

【0087】

応答バイオマーカーｍＲＮＡの測定
応答バイオマーカーｍＲＮＡ種を、任意数の購入可能なアッセイキットおよびシステムを用いて、または当業界で記載された任意の方法に従って定量的に測定できる。当業界で公知のｍＲＮＡ発現レベルを測定するための任意の適切な定量法の本発明の方法における使用が企図される。例えば、ｍＲＮＡの逆転写および増幅を、ＲＴ−ＰＣＲ、およびリアルタイム逆転写ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）などのＰＣＲ法を用いて実行することができる。遺伝子発現を定量化するためのＰＣＲ法は、例えば、VanGuilder, et al., 2008,「Twenty-five years of quantitative PCR for gene expression analysis」, Biotechniques 44: 619-626、およびBustin, et al., 2005,「Quantitative real-time RT-PCR - a perspective」,Journal of Molecular Endocrinology, 34:597-601に記載されており、それぞれその全体が参照により本明細書に組み込まれる。マウスサイトカインｍＲＮＡの定量的ＰＣＲは、例えば、Overbergh, et al., 1999,「Quantification of murine cytokine mRNAs using real time quantitative reverse transcriptase PCR」,Cytokine 11(4): 305-312に記載されており、これは参照により本明細書に組み込まれ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ｐ４０、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＴＧＦ−βおよびｉＮＯＳを定量化するためのプローブおよびプライマーを記載している。

【0088】

マウスサイトカインＲＴ−ＰＣＲキットは、例えば、ＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、およびＳＡＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから広く入手可能である。例えば、ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓＣｙｔｏｋｉｎｅＭｏｕｓｅ２０−ＰｌｅｘＰａｎｅｌは、ＩＰ−１０、ＭＩＰ−１α、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１３、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１α、ＦＧＦ−Ｂａｓｉｃ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１７、ＭＩＧ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＶＥＧＦ、およびＫＣの測定を同時に可能にするものである。ＳＡＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓＭｏｕｓｅＣｏｍｍｏｎＣｙｔｏｋｉｎｅｓＲＴ^２Ｐｒｏｆｉｌｅｒ（商標）ＰＣＲＡｒｒａｙを、８４のサイトカイン遺伝子のサブセットを測定するためにカスタマイズすることができる。実施形態において、ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから得られるＴａｑＭａｎＵｎｉｖｅｒｓａｌＰＣＲＭａｓｔｅｒＭｉｘ（Ｃａｔ．＃４３０４４３７）およびマウスサイトカインＩＬ−２（Ｃａｔ．＃４３３１１８２；ＩＤＭｍ００４３４２５６＿ｍ１）、ＩＬ−４（Ｃａｔ．＃４３３１１８２；ＩＤＭｍ００４４５２５９＿ｍ１）、ＩＬ−５（Ｃａｔ．＃４３３１１８２；ＩＤＭｍ００４３９６４６＿ｍ１）、ＩＬ−１０（Ｃａｔ．＃４３３１１８２；ＩＤＭｍ００４３９６１４＿ｍ１）、ＩＬ−１３（Ｃａｔ．＃４３３１１８２；ＩＤＭｍ００４３４２０４＿ｍ１）、ＩＦＮ−γ（Ｃａｔ．＃４３３１１８２；ＩＤＭｍ０１１６８１３４＿ｍ１）およびＴＮＦ−α（Ｃａｔ．＃４３３１１８２；ＩＤＭｍ００４４３２６０＿ｇ１）のためのプライマー／プローブを用いる。

【0089】

実施形態において、ＩｌｌｕｍｉｎａＭｏｕｓｅＷＧ−６ｖ２．０ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＢｅａｄＣｈｉｐＫｉｔまたはＭｏｕｓｅＲｅｆ−８ｖ２．０ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＢｅａｄＣｈｉｐＫｉｔ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いて、転写物レベルを評価する。他の方法、例えば、ＲＮＡ−Ｓｅｑ(その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Nagalakshmi, et al., January 2010, RNA-Seq: A Method for Comprehensive Transcriptome Analysis, Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience, Unit 4.11, Supplement 89, Copyright 2010 John Wiley & Sons, Inc.）を用いて、トランスクリプトーム分析を実行することができる。

【0090】

受け入れ基準は、例えば、３組における各刺激の分析、最も高い濃度のＧＡによる誘導よりも高いか、またはそれと同等である陽性対照ＣｏｎＡによる標的遺伝子の誘導、培地対照の２倍未満である陰性対照ＭＢＰによる標的遺伝子の誘導、および検出可能レベル未満であるＮＴＣ（鋳型なしの対照）対照の増幅を含んでもよい。実施形態において、標的遺伝子に関するＰＣＲ実行が上記の受け入れ基準を満たさない場合、特定の実行を反復する。

【0091】

本発明の方法においては、応答バイオマーカーｍＲＮＡを測定して、ＧＡの試験ロットの効力の指示を提供する。ＧＡの試験ロットの効力は、既知の、または適当なＧＡ作用機構と関連する応答を行うその能力によって表される。Ｔ細胞のＧＡ刺激によるＴ細胞サイトカイン発現の特異的誘導はＧＡ試験ロット効力の指示因子として役立ち得るということになる。実施形態において、応答バイオマーカーｍＲＮＡは、バイオマーカー遺伝子から転写されるＲＮＡ種である。実施形態において、測定される応答バイオマーカーｍＲＮＡは、バイオマーカータンパク質をコードする。実施形態において、検出方法は、バイオマーカータンパク質をコードする遺伝子から転写されるｍＲＮＡ転写物の任意の所与の部分を測定する。実施形態においては、測定を、定量可能なシグナルを生成するための好適なｍＲＮＡ転写物の任意の部分にハイブリダイズするプライマーまたはプローブを用いる核酸増幅または当業界で公知の他の検出方法により実行する。

【0092】

ＧＡ刺激時間は重要である。一般に、バイオマーカーｍＲＮＡレベルにおける、容易に検出可能であり、再現性が高い増加または減少が観察される時間枠を選択する。細胞とＧＡとのインキュベーションに対する応答を測定するための、刺激の開始後の最適時間は、特定の応答バイオマーカーｍＲＮＡの発現プロファイルに基づいて変化することが予想される。ある特定のバイオマーカーｍＲＮＡの発現に対する刺激の効果は、インキュベーション時間と共に徐々に減少することが観察され（実施例を参照されたい）、従って、より後の時点は有用ではない可能性がある。

【0093】

本発明の方法の実施形態において、ＧＡ応答バイオマーカーｍＲＮＡを、ＧＡ刺激を開始した後約２４時間前に測定する。本発明の方法の実施形態において、ＧＡ応答バイオマーカーｍＲＮＡを、ＧＡ刺激を開始した後約２３、約２２、約２１、または約２０時間前に測定する。

【0094】

本発明の方法の実施形態において、ＧＡ応答バイオマーカーｍＲＮＡを、ＬＮ細胞と、ＧＡ試験ロットまたは参照標準ロットとのインキュベーション（刺激）の開始後約４時間〜約６時間で測定する。本発明の方法の実施形態において、ＧＡ応答バイオマーカーｍＲＮＡを、ＬＮ細胞と、ＧＡ試験ロットまたは参照標準ロットとのインキュベーションの開始後約１時間〜約２４時間で測定する。実施形態において、ＧＡ応答バイオマーカーｍＲＮＡを、ＬＮ細胞と、ＧＡ試験ロットまたは参照標準ロットとのインキュベーション（刺激）の開始後約１時間、約１．２５時間、約１．５時間、約１．７５時間、約２時間、約２．２５時間、約２．５時間、約２．７５時間、約３時間、約３．２５時間、約３．５時間、約３．７５時間、約４時間、約４．２５時間、約４．５時間、約４．７５時間、約５時間、約５．２５時間、約５．５時間、約５．７５時間、約６時間、約６．２５時間、約６．５時間、約６．７５時間、約７時間、約７．２５時間、約７．５時間、約７．７５時間、約８時間、約８．２５時間、約８．５時間、約８．７５時間、約９時間、約９．２５時間、約９．５時間、約９．７５時間、約１０時間、約１０．２５時間、約１０．５時間、約１０．７５時間、約１１時間、約１１．２５時間、約１１．５時間、約１１．７５時間、約１２時間、約１２．５時間、約１３時間、約１３．５時間、約１４時間、約１４．５時間、約１５時間、約１５．５時間、約１６時間、約１７時間、約１８時間、約１９時間、約２０時間、約２１時間、約２２時間、約２３時間、または約２４時間で測定する。

【0095】

実施形態において、ＧＡ応答バイオマーカーｍＲＮＡを、ＬＮ細胞と、ＧＡ試験ロットまたは参照標準ロットとのインキュベーション（刺激）の開始後約２時間〜約１６時間、約２時間〜約１５時間、約２時間〜約１４時間、約２時間〜約１３時間、約２時間〜約１２時間、約２時間〜約１１時間、約２時間〜約１０時間、約２時間〜約９時間、約２時間〜約８時間、約２時間〜約７時間、約２時間〜約６時間、約２．５時間〜約１６時間、約２．５時間〜約１５時間、約２．５時間〜約１４時間、約２．５時間〜約１３時間、約２．５時間〜約１２時間、約２．５時間〜約１１時間、約２．５時間〜約１０時間、約２．５時間〜約９時間、約２．５時間〜約８時間、約２．５時間〜約７時間、約２．５時間〜約６時間、約２．５時間〜約５．５時間、２．５時間〜約５時間、２．５時間〜約４時間、約３時間〜約１６時間、約３時間〜約１５時間、約３時間〜約１４時間、約３時間〜約１３時間、約３時間〜約１２時間、約３時間〜約１１時間、約３時間〜約１０時間、約３時間〜約９時間、約３時間〜約８時間、約３時間〜約７時間、約３時間〜約６時間、約３時間〜約５．５時間、３時間〜約５時間、３時間〜約４時間、約３．５時間〜約１６時間、約３．５時間〜約１５時間、約３．５時間〜約１４時間、約３．５時間〜約１３時間、約３．５時間〜約１２時間、約３．５時間〜約１１時間、約３．５時間〜約１０時間、約３．５時間〜約９時間、約３．５時間〜約８時間、約３．５時間〜約７時間、約３．５時間〜約６時間、約３．５時間〜約５．５時間、３．５時間〜約５時間、約４時間〜約１６時間、約４時間〜約１５時間、約４時間〜約１４時間、約４時間〜約１３時間、約４時間〜約１２時間、約４時間〜約１１時間、約４時間〜約１０時間、約４時間〜約９時間、約４時間〜約８時間、約４時間〜約７時間、約４時間〜約６時間、約４時間〜約５．５時間、約５時間〜約１６時間、約５時間〜約１５時間、約５時間〜約１４時間、約５時間〜約１３時間、約５時間〜約１２時間、約５時間〜約１１時間、約５時間〜約１０時間、約５時間〜約９時間、約５時間〜約８時間、約５時間〜約７時間、約５時間〜約６時間、約６時間〜約１６時間、約６時間〜約１５時間、約６時間〜約１４時間、約６時間〜約１３時間、約６時間〜約１２時間、約６時間〜約１１時間、約６時間〜約１０時間、約６時間〜約９時間、約６時間〜約８時間、約６時間〜約７時間、約７時間〜約１６時間、約７時間〜約１５時間、約７時間〜約１４時間、約７時間〜約１３時間、約７時間〜約１２時間、約７時間〜約１１時間、約７時間〜約１０時間、約７時間〜約９時間、約７時間〜約８時間、約２時間〜約２４時間、約２時間〜約２０時間、約２時間〜約１８時間、約２時間〜約１６時間、約４時間〜約２４時間、約４時間〜約２０時間、約４時間〜約１８時間、約４時間〜約１６時間、約６時間〜約２４時間、約６時間〜約２０時間、約６時間〜約１８時間、約６時間〜約１６時間、約８時間〜約２４時間、約８時間〜約２０時間、約８時間〜約１８時間、または約８時間〜約１６時間で測定する。

【0096】

応答バイオマーカーｍＲＮＡパネル
実施形態において、バイオマーカーｍＲＮＡ種のパネルを、本発明の方法を用いて測定する。実施形態において、パネル中のｍＲＮＡを、例えば、多重ＰＣＲにより同時に測定する。

【0097】

実施形態において、本発明は、バイオマーカー種のパネルを含む組成物に関する。

【0098】

実施形態において、バイオマーカーｍＲＮＡ種のパネルは、少なくとも２つのｍＲＮＡ種を含む。実施形態において、バイオマーカーｍＲＮＡ種のパネルは、２〜５０のｍＲＮＡ種を含む。実施形態において、バイオマーカーｍＲＮＡ種のパネルは、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、または少なくとも５０のｍＲＮＡ種を含む。実施形態において、バイオマーカーｍＲＮＡ種のパネルは、２〜５０、２〜５、２〜１０、２〜１２、２〜１５、２〜２０、２〜２５、２〜３０、２〜３５、２〜４０、２〜４５、３〜５０、３〜５、３〜１０、３〜１２、３〜１５、３〜２０、３〜２５、３〜３０、３〜３５、３〜４０、３〜４５、４〜５０、４〜１０、４〜１２、４〜１５、４〜２０、４〜２５、４〜３０、４〜３５、４〜４０、４〜４５、５〜５０、５〜１０、５〜１２、５〜１５、５〜２０、５〜２５、５〜３０、５〜３５、５〜４０、５〜４５、６〜５０、６〜１２、６〜１５、６〜２０、６〜２５、６〜３０、６〜３５、６〜４０、６〜４５、７〜５０、７〜１２、７〜１５、７〜２０、７〜２５、７〜３０、７〜３５、７〜４０、７〜４５、８〜５０、８〜１５、８〜２０、８〜２５、８〜３０、８〜３５、８〜４０、８〜４５、９〜５０、９〜１５、９〜２０、９〜２５、９〜３０、９〜３５、９〜４０、９〜４５、１０〜５０、１０〜１５、１０〜２０、１０〜２５、１０〜３０、１０〜３５、１０〜４０、１０〜４５、１２〜５０、１２〜２０、１２〜２５、１２〜３０、１２〜３５、１２〜４０、１２〜４５、１５〜５０、１５〜２５、１５〜３０、１５〜４０、２０〜５０、２０〜２５、２０〜３０、２０〜４０、２５〜５０、２５〜４０、３０〜５０、または３０〜４５のｍＲＮＡ種を含む。

【0099】

実施形態において、バイオマーカーｍＲＮＡ種のパネルは、ＣＤ２５、ＣＤ６９、ＣＤ７１、ＣＤ８６（ＣＤ８６分子）、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ、誘導性Ｔ細胞共刺激剤）、ＣＤ２７９、ＨＬＡ−ＤＲ、ＧＡＴＡ３（ＧＡＴＡ結合タンパク質３）、ＨＬＡ−ＤＭＡ（主要組織適合複合体、クラスＩＩ、ＤＭアルファ）、ＨＬＡ−ＤＭＢ（主要組織適合複合体、クラスＩＩ、ＤＭベータ）、ＩＦＮ−γ（インターフェロンガンマ）、ＩＦＮ−γＲ２（インターフェロンガンマ受容体）、ＩＬ−２（インターロイキン２）、ＩＬ−４（インターロイキン４）、ＩＬ−５（インターロイキン５）、ＩＬ−６（インターロイキン６）、ＩＬ−８（ＣＸＣＬ−８）、ＲＡＮＴＥＳ（ＣＣＬ５）、ＣＣＬ１、ＣＸＣＬ４、ＣＸＣＬ７、ＩＬ−１０（インターロイキン１０）、ＩＬ−１３（インターロイキン１３）、ＩＬ−１８（インターロイキン１８）、ＩＬ−１２ＲＢ１（インターロイキン１２受容体、ベータ）、ＩＬ−１７Ａ（インターロイキン１７Ａ）、ＩＬ−１７Ｆ（インターロイキン１７Ｆ）、ＩＬ−１８Ｒ１（インターロイキン１８受容体１）、ＩＬ−２ＲＡ（インターロイキン２受容体、アルファ２）、ＩＬ−２ＲＧ（インターロイキン２受容体、ガンマ）、ＩＬ４−Ｒ（インターロイキン４受容体）、ＩＬ−６Ｒ（インターロイキン６受容体）、ＩＬ−２１（インターロイキン２１）、ＩＬ−２２（インターロイキン２２）、ＩＬ−１β（インターロイキン１−ベータ）、ＴＢＸ２１（Ｔ−ｂｏｘ２１）、ＴＧＦＢＲ２（トランスフォーミング増殖因子、ベータ受容体ＩＩ）、ＴＮＦ（腫瘍壊死因子、ＴＮＦ−α）、ＴＮＦ−β（ＬＴ）、ＴＧＦ−β、ＦＯＸＰ３（フォークヘッドボックスＰ３）、またはＩＬ−１０ＲＢ（インターロイキン１０受容体、ベータ）をコードする遺伝子からそれぞれ転写される、少なくとも２つのｍＲＮＡ種を含む。これらの遺伝子の発現を、購入可能なサービス、試薬および／またはキット、例えば、ＭｏｕｓｅＷＧ−６ｖ２．０ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＢｅａｄＣｈｉｐＫｉｔ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いて評価することができる。

【0100】

実施形態において、バイオマーカーｍＲＮＡ種のパネルは、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、またはＩＬ−１７、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α（ＴＮＦ）、ＴＮＦ−β（ＬＴ）、ＴＧＦ−β、およびＩＬ−１ｂから選択されるサイトカインをコードする遺伝子から転写される少なくとも１つのｍＲＮＡ種を含む。実施形態において、バイオマーカーｍＲＮＡ種のパネルは、ＣＤ６９、ＣＤ２５、ＣＤ７１、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、ＣＤ２７８、ＣＤ２７９、およびＨＬＡ−ＤＲから選択される活性化マーカーまたはサイトカイン受容体をコードする遺伝子から転写される少なくとも１つのｍＲＮＡ種を含む。実施形態において、バイオマーカーｍＲＮＡ種のパネルは、ＩＬ−８（ＣＸＣＬ８）、ＲＡＮＴＥＳ（ＣＣＬ５）、ＣＣＬ１、ＣＸＣＬ４、およびＣＸＣＬ７から選択されるケモカインをコードする遺伝子から転写される少なくとも１つのｍＲＮＡ種を含む。実施形態において、バイオマーカーｍＲＮＡ種のパネルは、Ｔｈ１関連サイトカインをコードする遺伝子から転写されるｍＲＮＡ種、Ｔｈ２関連サイトカインをコードする遺伝子から転写されるｍＲＮＡ種、Ｔｈ１７関連サイトカインをコードする遺伝子から転写されるｍＲＮＡ種、およびＴ_ＦＨ関連サイトカインをコードする遺伝子から転写されるｍＲＮＡ種から選択される少なくとも１つのｍＲＮＡ種を含む。実施形態において、バイオマーカーｍＲＮＡ種のパネルは、Ｔｈ１関連サイトカインをコードする遺伝子から転写される少なくとも１つのｍＲＮＡ種を含む。実施形態において、Ｔｈ１関連サイトカインは、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、またはＣＸＣＬ１である。実施形態において、バイオマーカーｍＲＮＡ種のパネルは、Ｔｈ２関連サイトカインをコードする遺伝子から転写される少なくとも１つのｍＲＮＡ種を含む。実施形態において、Ｔｈ１関連サイトカインは、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、またはＩＬ−１３である。実施形態において、バイオマーカーｍＲＮＡ種のパネルは、Ｔｈ１７関連サイトカインをコードする遺伝子から転写される少なくとも１つのｍＲＮＡ種を含む。実施形態において、Ｔｈ１７関連サイトカインは、ＩＬ−１７またはＩＬ−２２である。実施形態において、バイオマーカーｍＲＮＡ種のパネルは、Ｔ_ＦＨ関連サイトカインをコードする遺伝子から転写される少なくとも１つのｍＲＮＡ種を含む。実施形態において、Ｔ_ＦＨ関連サイトカインはＩＬ−２１である。実施形態において、バイオマーカーｍＲＮＡ種のパネルは、重要な調節関連サイトカインをコードする遺伝子から転写される少なくとも１つのｍＲＮＡ種を含む。実施形態において、重要な調節関連サイトカインは、ＩＬ−１０およびＴＧＦ−βから選択される。

【0101】

実施形態において、バイオマーカーｍＲＮＡ種のパネルは、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７、ＩＬ−２２、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＣＤ２５、およびＩＬ１−βをコードする遺伝子から転写されるｍＲＮＡ種を含む。実施形態において、バイオマーカーｍＲＮＡ種のパネルは、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７、ＩＬ−２２、ＴＮＦ−α、ＣＤ２５、およびＩＬ１−βをコードする遺伝子から転写されるｍＲＮＡ種を含む。実施形態において、バイオマーカーｍＲＮＡ種のパネルは、ＩＬ−４、ＩＬ−１３、およびＴＮＦ−αをコードする遺伝子から転写されるｍＲＮＡ種を含む。

【0102】

実施形態において、バイオマーカーｍＲＮＡ種のパネルは、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７、ＩＬ−２２、ＩＦＮ−γ、またはＣＤ２５をコードする遺伝子から転写されるｍＲＮＡ種を含む。実施形態において、バイオマーカーｍＲＮＡ種のパネルは、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７、またはＣＤ２５をコードする遺伝子から転写されるｍＲＮＡ種を含む。実施形態において、バイオマーカーｍＲＮＡ種のパネルは、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７、ＩＬ−２２、ＩＦＮ−γ、およびＴＮＦ−αをコードする遺伝子から転写されるｍＲＮＡ種を含む。実施形態において、バイオマーカーｍＲＮＡ種のパネルは、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７、ＩＬ−２２、およびＴＮＦ−αをコードする遺伝子から転写されるｍＲＮＡ種を含む。実施形態において、バイオマーカーｍＲＮＡ種のパネルは、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７、およびＩＦＮ−γをコードする遺伝子から転写されるｍＲＮＡ種を含む。実施形態において、バイオマーカーｍＲＮＡ種のパネルは、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、およびＩＬ−１７をコードする遺伝子から転写されるｍＲＮＡ種を含む。実施形態において、バイオマーカーｍＲＮＡ種のパネルは、ＣＤ２５、ＩＬ−４、およびＩＬ−１３をコードする遺伝子から転写されるｍＲＮＡ種を含む。実施形態において、バイオマーカーｍＲＮＡ種のパネルは、ＩＬ−４およびＩＬ−１３をコードする遺伝子から転写されるｍＲＮＡ種を含む。

【0103】

実施形態において、バイオマーカーｍＲＮＡ種のパネル中のｍＲＮＡ種を、ＬＮ細胞と、ＧＡ試験ロットまたは参照標準ロットとのインキュベーション（刺激）の開始後約４時間〜約６時間で測定する。

【0104】

実施形態において、バイオマーカーｍＲＮＡ種のパネル中のｍＲＮＡ種を、ＬＮ細胞と、ＧＡ試験ロットまたは参照標準ロットとのインキュベーション（刺激）の開始後約６時間で測定する。

【0105】

本発明の方法の実施形態において、応答バイオマーカーｍＲＮＡ種のパネル中のｍＲＮＡ種を、ＧＡ刺激を開始した後約２４時間前に測定する。本発明の方法の実施形態において、応答バイオマーカーｍＲＮＡ種のパネル中のｍＲＮＡ種を、ＧＡ刺激を開始した後約２３、約２２、約２１、または約２０時間前に測定する。

【0106】

本発明の方法の実施形態において、応答バイオマーカーｍＲＮＡ種のパネル中のｍＲＮＡ種を、ＬＮ細胞と、ＧＡ試験ロットまたは参照標準ロットとのインキュベーション（刺激）の開始後約４時間〜約６時間で測定する。本発明の方法の実施形態において、ＧＡ応答バイオマーカーｍＲＮＡを、ＬＮ細胞とＧＡ試験ロットまたは参照標準ロットとのインキュベーションの開始後約１時間〜約２４時間で測定する。実施形態において、ＧＡ応答バイオマーカーｍＲＮＡを、ＬＮ細胞とＧＡ試験ロットまたは参照標準ロットとのインキュベーション（刺激）の開始後約１時間、約１．２５時間、約１．５時間、約１．７５時間、約２時間、約２．２５時間、約２．５時間、約２．７５時間、約３時間、約３．２５時間、約３．５時間、約３．７５時間、約４時間、約４．２５時間、約４．５時間、約４．７５時間、約５時間、約５．２５時間、約５．５時間、約５．７５時間、約６時間、約６．２５時間、約６．５時間、約６．７５時間、約７時間、約７．２５時間、約７．５時間、約７．７５時間、約８時間、約８．２５時間、約８．５時間、約８．７５時間、約９時間、約９．２５時間、約９．５時間、約９．７５時間、約１０時間、約１０．２５時間、約１０．５時間、約１０．７５時間、約１１時間、約１１．２５時間、約１１．５時間、約１１．７５時間、約１２時間、約１２．５時間、約１３時間、約１３．５時間、約１４時間、約１４．５時間、約１５時間、約１５．５時間、約１６時間、約１７時間、約１８時間、約１９時間、約２０時間、約２１時間、約２２時間、約２３時間、または約２４時間で測定する。

【0107】

実施形態において、応答バイオマーカーｍＲＮＡ種のパネル中のｍＲＮＡ種を、ＬＮ細胞とＧＡ試験ロットまたは参照標準ロットとのインキュベーション（刺激）の開始後約２時間〜約１６時間、約２時間〜約１５時間、約２時間〜約１４時間、約２時間〜約１３時間、約２時間〜約１２時間、約２時間〜約１１時間、約２時間〜約１０時間、約２時間〜約９時間、約２時間〜約８時間、約２時間〜約７時間、約２時間〜約６時間、約２．５時間〜約１６時間、約２．５時間〜約１５時間、約２．５時間〜約１４時間、約２．５時間〜約１３時間、約２．５時間〜約１２時間、約２．５時間〜約１１時間、約２．５時間〜約１０時間、約２．５時間〜約９時間、約２．５時間〜約８時間、約２．５時間〜約７時間、約２．５時間〜約６時間、約２．５時間〜約５．５時間、約２．５時間〜約５時間、約２．５時間〜約４時間、約３時間〜約１６時間、約３時間〜約１５時間、約３時間〜約１４時間、約３時間〜約１３時間、約３時間〜約１２時間、約３時間〜約１１時間、約３時間〜約１０時間、約３時間〜約９時間、約３時間〜約８時間、約３時間〜約７時間、約３時間〜約６時間、約３時間〜約５．５時間、約３時間〜約５時間、約３時間〜約４時間、約３．５時間〜約１６時間、約３．５時間〜約１５時間、約３．５時間〜約１４時間、約３．５時間〜約１３時間、約３．５時間〜約１２時間、約３．５時間〜約１１時間、約３．５時間〜約１０時間、約３．５時間〜約９時間、約３．５時間〜約８時間、約３．５時間〜約７時間、約３．５時間〜約６時間、約３．５時間〜約５．５時間、約３．５時間〜約５時間、約４時間〜約１６時間、約４時間〜約１５時間、約４時間〜約１４時間、約４時間〜約１３時間、約４時間〜約１２時間、約４時間〜約１１時間、約４時間〜約１０時間、約４時間〜約９時間、約４時間〜約８時間、約４時間〜約７時間、約４時間〜約６時間、約４時間〜約５．５時間、約５時間〜約１６時間、約５時間〜約１５時間、約５時間〜約１４時間、約５時間〜約１３時間、約５時間〜約１２時間、約５時間〜約１１時間、約５時間〜約１０時間、約５時間〜約９時間、約５時間〜約８時間、約５時間〜約７時間、約５時間〜約６時間、約６時間〜約１６時間、約６時間〜約１５時間、約６時間〜約１４時間、約６時間〜約１３時間、約６時間〜約１２時間、約６時間〜約１１時間、約６時間〜約１０時間、約６時間〜約９時間、約６時間〜約８時間、約６時間〜約７時間、約７時間〜約１６時間、約７時間〜約１５時間、約７時間〜約１４時間、約７時間〜約１３時間、約７時間〜約１２時間、約７時間〜約１１時間、約７時間〜約１０時間、約７時間〜約９時間、約７時間〜約８時間、約２時間〜約２４時間、約２時間〜約２０時間、約２時間〜約１８時間、約２時間〜約１６時間、約４時間〜約２４時間、約４時間〜約２０時間、約４時間〜約１８時間、約４時間〜約１６時間、約６時間〜約２４時間、約６時間〜約２０時間、約６時間〜約１８時間、約６時間〜約１６時間、約８時間〜約２４時間、約８時間〜約２０時間、約８時間〜約１８時間、または約８時間〜約１６時間で測定する。

【0108】

実施形態において、ＬＮ細胞を、ＧＡを用いる刺激の後に、またはその際に、タンパク質合成、例えば、シクロヘキシミドの阻害剤で処理する。

【実施例】

【0109】

実施例Ｉ．酢酸グラチラマーを用いるチャレンジ後の酢酸グラチラマーで免疫化したマウスに由来するリンパ節細胞中の応答バイオマーカーｍＲＮＡを測定する酢酸グラチラマー効力アッセイの開発
ＧＡで免疫化した（ＳＪＬ／ＪｘＢＡＬＢ／Ｃ）Ｆ１マウス系統に由来するＴ細胞のＧＡチャレンジ後に応答バイオマーカーｍＲＮＡ発現レベルを測定する酢酸グラチラマー（ＧＡ）のための効力アッセイを開発した。免疫化したマウスから得たＬＮ細胞により、ＧＡ刺激に応答したサイトカインｍＲＮＡレベルの実質的な増加が、刺激後、早くも２時間で、４時間までに確実に示された。

【0110】

アッセイの開発
３つの実験を行って、異なる時点、応答バイオマーカーｍＲＮＡ、アッセイ形式、および効力アッセイにおける使用のための試薬を評価した。表１は、３つの試験のための実験設計、およびそれぞれ実行された免疫化を示す。

【0111】

【表3】

GA=酢酸グラチラマー (GMA, Mylan Pharmaceuticals, Inc.); CFA=完全Freundアジュバント

【0112】

表１にまとめられた３つの実験のそれぞれについて、メスの（ＳＪＬ／ＪｘＢＡＬＢ／Ｃ）Ｆ１ハイブリッド（ＪａｃｋｓｏｎＬａｂｏｒａｔｏｒｙ）マウスを、足蹠注射により、２５０μｇのＧＭＡ（ＭｙｌａｎＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）およびＣＦＡ（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ）、またはマンニトールおよびＣＦＡ（陰性対照として）を用いて免疫化した。ＧＡ溶液を、Ｄｕｌｂｅｃｃｏのリン酸緩衝生理食塩水を用いて５ｍｇ／ｍＬに希釈した。次いで、良好に乳化するまで、希釈されたＧＡ溶液（５ｍｇ／ｍＬ）およびＣＦＡ（１：１）を混合することにより、用量溶液を調製した。それぞれのマウスは、０．１ｍＬ（２５０μｇのＧＡ）の全注射容量を受容した。動物を、０日目に免疫化した。免疫化の後、１０日目に頸椎脱臼により免疫化した動物を犠牲にした。腋下および腋窩領域中のリンパ節を、浄化クリーンベンチ中で無菌的に取り出し、約５ｍＬの滅菌ＲＰＭＩ１６４０培地を含有する滅菌ペトリ皿に移した。ＬＮを約５ｍＬのＲＰＭＩ培地で３回洗浄し、ＬＮを注射筒プランジャで圧迫することにより、ＬＮ細胞を単離した。細胞懸濁液を滅菌５０ｍＬ円錐チューブに移し、約４℃で１０分間、約２００ｘｇで遠心分離することにより約４０ｍＬのＲＰＭＩ１６４０培地中で洗浄し、細胞計数のためにＲＰＭＩ１６４０培地中に再懸濁した。細胞懸濁液を約４℃で１０分間、約２００ｘｇで遠心分離し、氷冷ＤＣＣＭ−１富化培地中に再懸濁した。ＬＮ細胞（２．５ｘ１０^６細胞／ｃｍ^２）を、４８穴組織培養プレートのウェル中に播種し、ＧＡまたは対照で刺激した。

【0113】

示された時間にわたって加湿されたＣＯ_２インキュベータ中、約３７℃でインキュベートした後、全ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙＭｉｎｉＫｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｃａｔ．＃７４１０４）を用いて処理された細胞から単離した。細胞をＲＮＡ溶解バッファー中で溶解し、Ｑｉａｇｅｎスピンカラムに移し、洗浄し、ＤＥＰＣ処理された水を用いてカラムからＲＮＡを溶出させた。ＨｉｇｈＣａｐａｃｉｔｙｃＤＮＡＲｅｖｅｒｓｅＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎＫｉｔ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃａｔ．＃４３６８８１４）を用いて、各ＲＮＡ試料からｃＤＮＡを合成した。ＰＣＲ反応を、ＴａｑＭａｎＵｎｉｖｅｒｓａｌＰＣＲＭａｓｔｅｒＭｉｘ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃａｔ．＃４３０４４３７）ならびに標的サイトカインおよび参照内部対照のための特異的プライマー／プローブを用いて実行した。マウスサイトカインＩＬ−２（Ｃａｔ．＃４３３１１８２；ＩＤＭｍ００４３４２５６＿ｍ１）、ＩＬ−４（Ｃａｔ．４３３１１８２；ＩＤＭｍ００４４５２５９＿ｍ１）、ＩＬ−５（Ｃａｔ．＃４３３１１８２；ＩＤＭｍ００４３９６４６＿ｍ１）、ＩＦＮ−γ（Ｃａｔ．＃４３３１１８２；ＩＤＭｍ０１１６８１３４＿ｍ１）、ＩＬ−１０（ＩＤＭｍ００４３９６１４＿ｍ１）、およびＴＮＦ−α（Ｍｍ００４４３２６０＿ｇ１）のためのプライマー／プローブを、ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手した。サイトカインｍＲＮＡの発現を、リアルタイムＰＣＲシステム（７５００、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて定量的に分析した。

【0114】

実験１（１Ａ群マウス）において用いられた刺激およびｍＲＮＡ発現の結果を、表２〜５に示す。１）マウスサイトカインアンプリコンのレベルを、同じ試料に由来するＧＡＰＤＨのための内部プローブに対して正規化すること、および２）サイトカインのｍＲＮＡ発現レベルを、ＤＣＣＭ１（培地）対照（ＢｅｉｔＨａｅｍｅｋＬｔｄ．からのＤＣＣＭ１；カタログ番号０５０１０１１Ａ）中で観察されたレベルで除算することにより、各サイトカインに関する、対照に対する倍数変化を算出した。２時間群についてはＭＢＰ処理はなかった（ＢａｃｈｅｍからのＭＢＰ；カタログ番号Ｈ−１９６４．０００１）。それぞれの評価時間について、ＤＣＣＭ１を試験し、比較すると、すなわち、２時間はＤＣＣＭ１で２時間、４時間＝４時間などを表し、各時点について代表的な対照として役立った。

【0115】

表２は、示された刺激後、２、４、６、および２４時間でＬＮ細胞中で検出されたマウスＩＬ−２ｍＲＮＡレベルを示す。ＤＣＣＭ１陰性対照と比較したｍＩＬ−２ｍＲＮＡ発現の約５．３倍〜約２０．８倍の増加が、これらの時点で観察され、最大の増加は６時間で観察された。２４時間までに、増加は２時間で観察されたものよりも下まで低下した。

【0116】

【表4】

省略:MBP=ミエリン塩基性タンパク質(陰性対照);ConA=コンカナバリンA(陽性対照);GA=酢酸グラチラマー(GMA、Mylan Pharmaceuticals,Inc.);SD=標準偏差;NA=適用せず(n<3)。

【0117】

表３は、示された刺激後、２、４、６および２４時間でＬＮ細胞中で検出されたマウスＩＬ−４ｍＲＮＡレベルを示す。ＤＣＣＭ１対照と比較したｍＩＬ−４ｍＲＮＡ発現の約１０倍〜約１６．５倍の増加が、これらの時点で観察され、最大の増加は刺激後６時間で観察された。

【0118】

【表5】

【0119】

表４は、示された刺激後、２、４、６および２４時間でＬＮ細胞中で検出されたマウスＩＬ−５ｍＲＮＡレベルを示す。ＤＣＣＭ１対照と比較したｍＩＬ−５ｍＲＮＡ発現の約１．６倍〜約５．１倍の増加が、これらの時点で観察され、最大の増加は刺激後６時間で観察された。２４時間までに、増加は２時間で観察されたものの１．９近くにまで低下した。

【0120】

【表6】

【0121】

表５は、示された刺激後、２、４、６および２４時間でＬＮ細胞中で検出されたマウスＩＦＮ−γ ｍＲＮＡレベルを示す。ＤＣＣＭ１対照と比較したＩＦＮ−γ発現の約１．３倍〜約４．６倍の増加が、これらの時点で観察された。６時間で、増加の規模は安定することが観察された。

【0122】

時間経過試験中の試料から単離した全ＲＮＡを用いて、ｍＩＬ−１０およびｍＴＮＦ−αに由来するｍＲＮＡ発現のレベルも測定した。結果は、ＧＡを用いる刺激後、ＬＮ細胞中のｍＲＮＡレベルの有意な増加を示さなかった（データは示さず）。刺激後６時間および２４時間の両方でのモック処理対照（ＤＣＣＭ１）ＬＮ細胞中のものと比較した、ＧＡで処理されたＬＮ細胞中のｍＲＮＡレベルの倍数変化は、約１以下であった。

【0123】

【表7】

【0124】

実験１について用いられたのと同様の条件下で実行された、実験２（２Ａ群マウスを用いる；設計については表１を参照されたい）において、４６穴および９８穴プレート形式を比較した（データは示さず）。ｍＩＬ−２およびｍＩＬ−４ｍＲＮＡのレベルを、ＧＡ（１０μｇ／ｍｌ）、ＭＢＰ（１０μｇ／ｍｌ）、およびＣｏｎＡ（２．５μｇ／ｍｌ）を用いる刺激後４時間および６時間の両方で、４６穴プレート形式（ＲＮｅａｓｙＭｉｎｉＫｉｔ、Ｑｉａｇｅｎ）、および９８穴プレート形式（ＳＶ９６ＴｏｔａｌＲＮＡＩｓｏｌａｔｉｏｎＳｙｓｔｅｍ、Ｐｒｏｍｅｇａ）中で測定し、ＤＣＣＭ１対照と比較した。ＧＡで処理された試料中、４時間でのＩＬ−２発現は、それぞれ、４８穴形式で対照の１６．３倍、および９６穴形式で２９．５倍で観察され、６時間では、それぞれ、４８穴形式で対照の２１．０倍、および９６穴形式で４１．７倍であった。ＧＡで処理された試料中、４時間でのＩＬ−４発現は、それぞれ、４８穴形式で対照の８．５倍、および９６穴形式で８．０倍で観察され、６時間では、それぞれ、４８穴形式で対照の１４．０倍、および９６穴形式で１６．５倍であった。

【0125】

実験３（３Ａ群および４Ａ群のマウス；設計については表１を参照されたい）において、様々な濃度のＧＡで刺激したＬＮ細胞中で、ｍＩＬ−２ｍＲＮＡを測定した。表６は、実験３の結果を示す。この試験は、第２のロットのＧＡ、Ｃｏｐ（Ｃｏｐａｘｏｎｅ、ＴｅｖａＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓＵＳＡ，Ｉｎｃ．、発売された製品）で刺激した試料を含んでいた。Ｃｏｐ試料セットにより、サイトカイン生成に対する、異なるロットのＧＡで免疫化および刺激する効果の比較が可能になった。

【0126】

【表8】

省略:MBP=ミエリン塩基性タンパク質(陰性対照);ConA=コンカナバリンA(陽性対照);GA=酢酸グラチラマー(GMA、Mylan Pharmaceuticals,Inc.);SD=標準偏差。
*免疫されていない動物

【0127】

表６は、示された刺激後６時間でＬＮ細胞中で検出されたｍＩＬ−２ｍＲＮＡレベルを示す。前述のように、１）マウスサイトカインアンプリコンのレベルを、同じ試料に由来するＧＡＰＤＨのための内部プローブに対して正規化すること、および２）サイトカインのｍＲＮＡ発現レベルを、ＤＣＣＭ１対照のＧＡ刺激に応答して観察されたレベルで除算することにより、対照に対する倍数変化を算出した。実験３については、９６穴プレート形式を使用し、ＲＮＡ単離を、ＳＶ９６ＴｏｔａｌＲＮＡＩｓｏｌａｔｉｏｎＳｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて実行した。３Ａ群および４Ａ群の免疫化を、表１に記載する。図１Ａおよび図１Ｂは、実験３で検出されたｍＩＬ−２ｍＲＮＡの発現レベルを比較するグラフである（表６に記載）。ｍＩＬ−２ｍＲＮＡを、ＣｏｐおよびＧＡ（ＭｙｌａｎＧＭＡ）により同等に刺激した。Ｙ軸：ｍＩＬ−２の線形ｍＲＮＡ倍数変化。Ｘ軸：ｌｏｇＣｏｐおよびＧＡ（ＭｙｌａｎＧＭＡ）濃度値。データセットに関する最良適合を、対数モデルを用いて実施した。全濃度を用いて回帰を実施した場合、勾配値はそれぞれ、ＧＡ（ＭｙｌａｎＧＭＡ）について６．７７９、およびＣｏｐ処理された試料について５．６８３４であった。５つの濃度（１〜１５μｇ／ｍＬ）を用いて回帰を実施した場合、勾配値はそれぞれ、ＧＡ（ＭｙｌａｎＧＭＡ）について６．２１４、およびＣｏｐ処理された試料について５．９６２であった。図１Ａおよび図１Ｂ中のグラフは、第１のロットのＧＡを免疫化のために用いた場合、第１のロットまたは第２のロットのＧＡのいずれかの濃度を増加させることにより、処理された細胞からのＩＬ−２ｍＲＮＡが、刺激と共に用量依存的様式で増加したことを示す。

【0128】

他の実験により、処理された細胞に由来する分泌ＩＬ−２が、第１のロットのＧＡ（ＧＭＡ、ＭｙｌａｎＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）および第２のロットのＧＡ（Ｃｏｐａｘｏｎｅ、ＴｅｖａＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓＵＳＡ，Ｉｎｃ．）の濃度の増加と共に用量依存的様式で増加することが示された（データは示さず）。この用量依存的応答は、Ｃｏｐａｘｏｎｅ（登録商標）またはＭｙｌａｎＧＭＡを免疫化抗原として用いたかどうかに関係なく、試験化合物と参照化合物の両方について一致していた。

【0129】

第２のシリーズの実験において、１０μｇ／ｍＬのＧＡで刺激した後、４時間および６時間で、ＬＮ細胞中でのｍＩＬ−２、ｍＩＬ−４、ｍＩＬ−５、ｍＩＬ−１０およびｍＩＦＮ−γ ｍＲＮＡの発現を評価した。この結果は、ＧＡで免疫化したマウスに由来するＬＮ細胞のＧＡ刺激が、サイトカインｍＲＮＡレベルの特異的増加を引き起こすことを示している。実験設計を表７に示す。

【0130】

【表9】

NA=適用せず;GA=酢酸グラチラマー;MBP=ミエリン塩基性タンパク質(陰性対照);ConA=コンカナバリンA(陽性対照)

【0131】

１Ｂ群の動物は、２５０μｇのＧＡおよびＣＦＡ、またはマンニトールおよびＣＦＡ（陰性対照として）のいずれかで足蹠注射により免疫化したメスの（ＳＪＬ／ＪｘＢＡＬＢ／Ｃ）Ｆ１ハイブリッド（ＪａｃｋｓｏｎＬａｂｏｒａｔｏｒｙ）マウスであった。用量溶液を、希釈されたＧＡ溶液（５ｍｇ／ｍＬ）およびＣＦＡ（１：１）を混合することにより調製した。それぞれのマウスは、１ｍＬ（２５０μｇのＧＡ）の全注射容量を受容した。動物を、０日目に免疫化した。免疫化した動物を、免疫化後１０日目に頸椎脱臼により犠牲にした。免疫化したマウスに由来するリンパ節を取り出し、単離した。ＬＮ細胞（２．５ｘ１０^６細胞／ｃｍ^２）を、ＧＡを用いる刺激のために４８穴組織培養プレートのウェル中に播種した。

【0132】

全ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙＭｉｎｉＫｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｃａｔ．＃７４１０４）を用いて、処理された細胞から単離した。細胞をＲＮＡ溶解バッファー中で溶解し、Ｑｉａｇｅｎスピンカラムに移し、洗浄し、ＤＥＰＣ処理された水を用いてカラムからＲＮＡを溶出させた。ＨｉｇｈＣａｐａｃｉｔｙｃＤＮＡＲｅｖｅｒｓｅＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎＫｉｔ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃａｔ．＃４３６８８１４）を用いて、それぞれのＲＮＡ試料からｃＤＮＡを合成した。ＴａｑＭａｎＵｎｉｖｅｒｓａｌＰＣＲＭａｓｔｅｒＭｉｘ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃａｔ．＃４３０４４３７）ならびに標的サイトカインおよび参照内部対照のための特異的プライマー／プローブを用いて、ＰＣＲ反応を実行した。

【0133】

リアルタイムＰＣＲシステム（７５００、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｔｅｍｓ）を用いて、サイトカインｍＲＮＡの発現を４時間および６時間後に定量的に分析した。

【0134】

表８〜１２は、１Ｂ群のマウスのために用いられた刺激（表７に記載）、および得られたｍＲＮＡ発現の結果を示す。１）マウスサイトカインアンプリコンのレベルを、同じ試料に由来する１８ＳＲＮＡまたはＧＡＰＤＨｍＲＮＡのための内部プローブに対して正規化すること、および２）サイトカインのｍＲＮＡ発現レベルを、同じハウスキーピング遺伝子ｍＲＮＡに対して正規化されたＤＣＣＭ１（培養培地）対照に応答して観察されたレベルで除算することにより、各サイトカインに関する、対照に対する倍数変化を算出した。

【0135】

表８は、示された刺激後４時間および６時間でＬＮ細胞中で検出されたｍＩＬ−２ｍＲＮＡレベルを示す。ＧＡで免疫化したマウス（１Ｂ群）に由来するＧＡ刺激細胞中のｍＩＬ−２ｍＲＮＡレベルは、これらの時点でＤＣＣＭ−１で刺激した対照と比較して少なくとも１０倍増加した。ＧＡ刺激は、マンニトール＋ＣＦＡで免疫化した対照マウス（２Ｂ群）に由来する細胞中で検出されたｍＩＬ−２ｍＲＮＡの実質的な増加をもたらさなかった。さらに、ｍＩＬ−２ｍＲＮＡの発現は、ＣｏｎＡ陽性対照細胞中では実質的に増加したが、ＭＢＰ陰性対照細胞中では増加しなかった。ｍＩＬ−２ｍＲＮＡ発現のより大きな増加が、６時間よりも４時間においてＧＡ刺激細胞中で観察された。内部対照（参照遺伝子）は１８ＳｒＲＮＡであった。

【0136】

【表10】