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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】6553029
(24)【登録日】2019年7月12日
(45)【発行日】2019年7月31日
(54)【発明の名称】レチノイン酸導入リゾリン脂質を含有する細胞動員剤
(51)【国際特許分類】
A61K 31/685 20060101AFI20190722BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20190722BHJP
A61K 47/42 20170101ALI20190722BHJP
A61K 47/36 20060101ALI20190722BHJP
A61K 47/34 20170101ALI20190722BHJP
【ＦＩ】
A61K31/685
A61P43/00 111
A61K47/42
A61K47/36
A61K47/34
【請求項の数】6
【全頁数】18
(21)【出願番号】特願2016-529565(P2016-529565)
(86)(22)【出願日】2015年6月22日
(86)【国際出願番号】JP2015067851
(87)【国際公開番号】WO2015199020
(87)【国際公開日】20151230
【審査請求日】2018年6月11日
(31)【優先権主張番号】特願2014-128644(P2014-128644)
(32)【優先日】2014年6月23日
(33)【優先権主張国】JP
(73)【特許権者】
【識別番号】000004341
【氏名又は名称】日油株式会社
(73)【特許権者】
【識別番号】599029420
【氏名又は名称】田畑 泰彦
(74)【代理人】
【識別番号】100080791
【弁理士】
【氏名又は名称】高島 一
(74)【代理人】
【識別番号】100125070
【弁理士】
【氏名又は名称】土井 京子
(74)【代理人】
【識別番号】100136629
【弁理士】
【氏名又は名称】鎌田 光宜
(74)【代理人】
【識別番号】100121212
【弁理士】
【氏名又は名称】田村 弥栄子
(74)【代理人】
【識別番号】100163658
【弁理士】
【氏名又は名称】小池 順造
(74)【代理人】
【識別番号】100174296
【弁理士】
【氏名又は名称】當麻 博文
(74)【代理人】
【識別番号】100137729
【弁理士】
【氏名又は名称】赤井 厚子
(74)【代理人】
【識別番号】100151301
【弁理士】
【氏名又は名称】戸崎 富哉
(72)【発明者】
【氏名】義村 耕平
(72)【発明者】
【氏名】田畑 泰彦
【審査官】
古閑 一実
(56)【参考文献】
【文献】
国際公開第００／０２４７５０（ＷＯ，Ａ１）
【文献】
米国特許第０４８８２１６５（ＵＳ，Ａ）
【文献】
米国特許第０５７７６９１５（ＵＳ，Ａ）
【文献】
特開平０７−２０６８７９（ＪＰ，Ａ）
【文献】
特開平０７−１８８２８０（ＪＰ，Ａ）
【文献】
特表２００２−５１４１８３（ＪＰ，Ａ）
【文献】
Charles Pidgeon and C. Anthony Hunt，LIGHT SENSITIVE LIPOSOMES，Photochemistry and Photobiology，１９８２年１１月２９日，Vol.37, No.5，pp.491-494
(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）
Ａ６１Ｋ ３１／００−３３／４４
Ａ６１Ｋ ４７／００−４７／６９
Ａ６１Ｐ １／００−４３／００
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
式（１）および／または式（２）で示されるレチノイン酸導入リゾリン脂質またはその生理学的に許容される塩を有効成分として含有する、細胞動員剤であって、
動員される細胞が血球系細胞、造血幹細胞または間葉系幹細胞である、細胞動員剤。
式（１）
式（２）
（各式中、Ｒ１およびＲ２は、レチノイル基または水素であり、互いに同一でない。）
動員される細胞が血球系細胞、造血幹細胞または間葉系幹細胞である、細胞動員剤。
式（１）
【化1】
式（２）
【化2】
（各式中、Ｒ１およびＲ２は、レチノイル基または水素であり、互いに同一でない。）
【請求項2】
レチノイル基が、ａｌｌ−ｔｒａｎｓ体、７−ｃｉｓ体、９−ｃｉｓ体、１１−ｃｉｓ体、１３−ｃｉｓ体、７，９−ｄｉ−ｃｉｓ体、７，１１−ｄｉ−ｃｉｓ体、７，１３−ｄｉ−ｃｉｓ体、９，１１−ｄｉ−ｃｉｓ体、９，１３−ｄｉ−ｃｉｓ体、１１，１３−ｄｉ−ｃｉｓ体、７，９，１１−ｔｒｉ−ｃｉｓ体、７，９，１３−ｔｒｉ−ｃｉｓ体、７，１１，１３−ｔｒｉ−ｃｉｓ体、９，１１，１３−ｔｒｉ−ｃｉｓ体またはａｌｌ−ｃｉｓ体である、請求項１記載の細胞動員剤。
【請求項3】
細胞動員することによって生体組織修復を促進するための、請求項１または２に記載の細胞動員剤。
【請求項4】
徐放基材を含有する徐放性製剤である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の細胞動員剤。
【請求項5】
徐放基材が、生分解性高分子である、請求項４記載の細胞動員剤。
【請求項6】
生分解性高分子が、ゼラチン、コラーゲン、キチン、キトサン、ヒアルロン酸、ポリアミノ酸、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、乳酸とグリコール酸の共重合体、ポリ−ε−カプロラクトン、それらの誘導体およびそれらの架橋体からなる群から選択される１種または２種以上の生分解性高分子である、請求項５記載の細胞動員剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明はレチノイン酸導入リゾリン脂質を含有する細胞動員剤に関する。【背景技術】
【0002】
創傷の治癒、腫瘍の縮退等といった組織修復過程において、血球系細胞である好中球、好酸球、単球、マクロファージ等の働きが関与していることが知られている。中でも、マクロファージは死細胞や生体内に侵入した異物の貪食、増殖因子等の産生によって創傷の治癒を促進する等、組織修復において重要な役割を担っている。【0003】
したがって、何らかの方法により血球系細胞、特にマクロファージを対象となる患部に遊走させるとともに集積させる、即ち動員させることができれば、組織修復を促進されることが期待される。ここで、マクロファージは血中に存在する単球が各組織へ動員された後に分化した細胞であるため、単球を集積させることでも組織修復を促進させることが可能といえる（非特許文献１）。【0004】
単球やマクロファージを動員させることが可能な生体内物質として、リゾリン脂質の一種である１−ステアロイル−リゾホスホコリン（Ｃ１８：０−ＬｙｓｏＰＣ）やスフィンゴシン−１−リン酸（Ｓ１Ｐ）等が報告されている（非特許文献２、３）。単球やマクロファージはこれらの物質の濃度勾配を認識し、濃厚な部位に動員される性質を持つため、組織修復促進を狙うには局所濃度を増加させる必要がある。また、組織修復促進を行うには継続的に単球やマクロファージを動員させる必要がある。しかし、Ｃ１８：０−ＬｙｓｏＰＣは１０μＭ以上の高濃度条件においてしか効果を示さず、また、より高濃度条件においては細胞障害等の副作用を生じる恐れがある。一方、Ｓ１ＰはＳ１Ｐ受容体１に作用することによってＣ１８：０−ＬｙｓｏＰＣよりも低濃度で効果を示すが、１００ｎＭ以上となっている場合にはＳ１Ｐ受容体２に作用することによって単球やマクロファージの動員を抑制するようになる。その結果、Ｓ１Ｐの有効濃度範囲は１０ｎＭ前後と極めて狭くなっている。さらに、生体に投与した場合には単純な拡散現象に加え、血流によってリゾリン脂質局所濃度が低下してしまうため、前述の有効濃度を保つために断続的な局所投与を行う必要がある。その結果、生活の質（ＱＯＬ）の低下を招くとともに、治療費が増加することとなる。【先行技術文献】
【非特許文献】
【0005】
【非特許文献1】The Journal of International Medical Research. 37, 1528-1542 (2009)
【非特許文献2】The Journal of Biological Chemistry. 283, 5296-5305 (February 2008)
【非特許文献3】The FASEB Journal. 22, 2629-2638 (August 2008)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
本発明の目的は、組織修復に関与する細胞を効率よく継続的に集積させることができる細胞動員剤を提供することである。また、本発明の目的は、副作用が低減でき、断続的な局所投与を必要としない細胞動員剤を提供することである。【課題を解決するための手段】
【0007】
本発明者らは、上記課題解決のために鋭意検討した結果、後述の式（１）および（２）で示されるレチノイン酸導入リゾリン脂質またはその生理学的に許容される塩（以下「Ｒｅｔ−ＬｙｓｏＰＣ」と略称することがある。）が広範な濃度条件で組織修復に関与する細胞を動員させる効果を持つことを見出し、この知見に基づきさらに検討を行って本発明を完成させた。【0008】
すなわち本発明は、以下を提供する。［１］式（１）および／または式（２）で示されるレチノイン酸導入リゾリン脂質またはその生理学的に許容される塩を有効成分として含有する、細胞動員剤。
式（１）
【0009】
【化1】
【0010】
式（２）【0011】
【化2】
【0012】
（各式中、Ｒ１およびＲ２は、レチノイル基または水素であり、互いに同一でない。）［２］レチノイル基が、ａｌｌ−ｔｒａｎｓ体、７−ｃｉｓ体、９−ｃｉｓ体、１１−ｃｉｓ体、１３−ｃｉｓ体、７，９−ｄｉ−ｃｉｓ体、７，１１−ｄｉ−ｃｉｓ体、７，１３−ｄｉ−ｃｉｓ体、９，１１−ｄｉ−ｃｉｓ体、９，１３−ｄｉ−ｃｉｓ体、１１，１３−ｄｉ−ｃｉｓ体、７，９，１１−ｔｒｉ−ｃｉｓ体、７，９，１３−ｔｒｉ−ｃｉｓ体、７，１１，１３−ｔｒｉ−ｃｉｓ体、９，１１，１３−ｔｒｉ−ｃｉｓ体またはａｌｌ−ｃｉｓ体である、上記［１］記載の細胞動員剤。
［３］細胞動員することによって生体組織修復を促進するための、上記［１］または［２］に記載の細胞動員剤。
［４］動員される細胞が血球系細胞、造血幹細胞または間葉系幹細胞である、上記［１］〜［３］のいずれかに記載の細胞動員剤。
［５］徐放基材を含有する徐放性製剤である、上記［１］〜［４］のいずれかに記載の細胞動員剤。
［６］徐放基材が、生分解性高分子である、上記［５］の細胞動員剤。
［７］生分解性高分子が、ゼラチン、コラーゲン、キチン、キトサン、ヒアルロン酸、ポリアミノ酸、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、乳酸とグリコール酸の共重合体、ポリ−ε−カプロラクトン、それらの誘導体およびそれらの架橋体からなる群から選択される１種または２種以上の生分解性高分子である、上記［６］記載の細胞動員剤。
【0013】
本発明はまた、以下に関する。［８］式（１）および／または式（２）で示されるレチノイン酸導入リゾリン脂質またはその生理学的に許容される塩を有効成分として含有する、生体組織修復促進剤。
式（１）
【0014】
【化3】
【0015】
式（２）【0016】
【化4】
【0017】
（各式中、Ｒ１およびＲ２は、レチノイル基または水素であり、互いに同一でない。）［９］レチノイル基が、ａｌｌ−ｔｒａｎｓ体、７−ｃｉｓ体、９−ｃｉｓ体、１１−ｃｉｓ体、１３−ｃｉｓ体、７，９−ｄｉ−ｃｉｓ体、７，１１−ｄｉ−ｃｉｓ体、７，１３−ｄｉ−ｃｉｓ体、９，１１−ｄｉ−ｃｉｓ体、９，１３−ｄｉ−ｃｉｓ体、１１，１３−ｄｉ−ｃｉｓ体、７，９，１１−ｔｒｉ−ｃｉｓ体、７，９，１３−ｔｒｉ−ｃｉｓ体、７，１１，１３−ｔｒｉ−ｃｉｓ体、９，１１，１３−ｔｒｉ−ｃｉｓ体またはａｌｌ−ｃｉｓ体である、上記［８］記載の生体組織修復促進剤。
［１０］さらに徐放基材を含有する徐放性製剤である、上記［８］または［９］に記載の生体組織修復促進剤。
［１１］徐放基材が、生分解性高分子である、上記［１０］記載の生体組織修復促進剤。
［１２］生分解性高分子が、ゼラチン、コラーゲン、キチン、キトサン、ヒアルロン酸、ポリアミノ酸、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、乳酸とグリコール酸の共重合体、ポリ−ε−カプロラクトン、それらの誘導体およびそれらの架橋体からなる群から選択される１種または２種以上の生分解性高分子である、上記［１１］記載の生体組織修復促進剤
【発明の効果】
【0018】
本発明により、組織修復に関与する細胞を継続的に集積させることが可能となる。例えば、本発明の細胞動員剤を、患部（例えば、軟骨、皮膚、筋肉、骨）またはその周辺部位に、投与（例えば、注射、経皮投与、あるいは埋め込み投与）することで、組織修復に関与する細胞を患部に継続的に集積させることが可能となり、その結果、患部の組織修復を促進させることが可能となる。本発明によれば、有効成分の広範な濃度条件で生体組織修復促進が可能であるので、従来の化合物に比べて、副作用が低減でき、また、断続的な局所投与を必要とせずＱＯＬの低下を防ぐことができる。
本発明の細胞動員剤は、インビトロにおける細胞の集積に利用することもできる。
【図面の簡単な説明】
【0019】
【発明を実施するための形態】
【0020】
本発明の細胞動員剤は、有効成分として、下記の式（１）および／または式（２）で示されるレチノイン酸導入リゾリン脂質またはその生理学的に許容される塩を含有する。式（１）
【0021】
【化5】
【0022】
式（２）【0023】
【化6】
【0024】
（各式中、Ｒ１およびＲ２は、レチノイル基または水素であり、互いに同一でない。）式（１）および（２）で示されるレチノイン酸導入リゾリン脂質には、１−レチノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、２−レチノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１−レチノイル−ｓｎ−グリセロ−２−ホスホコリンが含まれる。式（１）および（２）で示されるレチノイン酸導入リゾリン脂質において、レチノイル基のｃｉｓ／ｔｒａｎｓ異性体により複数の構造異性体が存在するが、いずれであっても良い。
【0025】
レチノイル基の立体構造としてａｌｌ−ｔｒａｎｓ体、７−ｃｉｓ体、９−ｃｉｓ体、１１−ｃｉｓ体、１３−ｃｉｓ体、７，９−ｄｉ−ｃｉｓ体、７，１１−ｄｉ−ｃｉｓ体、７，１３−ｄｉ−ｃｉｓ体、９，１１−ｄｉ−ｃｉｓ体、９，１３−ｄｉ−ｃｉｓ体、１１，１３−ｄｉ−ｃｉｓ体、７，９，１１−ｔｒｉ−ｃｉｓ体、７，９，１３−ｔｒｉ−ｃｉｓ体、７，１１，１３−ｔｒｉ−ｃｉｓ体、９，１１，１３−ｔｒｉ−ｃｉｓ体、ａｌｌ−ｃｉｓ体が挙げられる。７−ｃｉｓ体、９−ｃｉｓ体、１１−ｃｉｓ体、１３−ｃｉｓ体、７，９−ｄｉ−ｃｉｓ体、７，１１−ｄｉ−ｃｉｓ体、７，１３−ｄｉ−ｃｉｓ体、９，１１−ｄｉ−ｃｉｓ体、９，１３−ｄｉ−ｃｉｓ体、１１，１３−ｄｉ−ｃｉｓ体、７，９，１１−ｔｒｉ−ｃｉｓ体、７，９，１３−ｔｒｉ−ｃｉｓ体、７，１１，１３−ｔｒｉ−ｃｉｓ体、９，１１，１３−ｔｒｉ−ｃｉｓ体は、トランス体の表記は省略されている。すなわち、例えば７−ｃｉｓ体は、７−ｃｉｓ−９，１１，１３−ｔｒｉ−ｔｒａｎｓ体を示す。【0026】
式（１）および（２）で示されるレチノイン酸導入リゾリン脂質は天然に得られるものであっても化学合成により製造されるものであってもよい。式（１）および（２）で示されるレチノイン酸導入リゾリン脂質は、例えば、グリセロホスホコリンとレチノイン酸をカルボジイミド等の縮合剤を用いてモノエステル化させた後、シリカゲルクロマトグラフィー等による精製を行うことによって得ることができる。また、グリセロホスホコリンあるいはリゾホスホコリンとレチノイン酸をカルボジイミド等の縮合剤を用いてジエステル化させた後、ホスホリパーゼ等の酵素を用いて位置選択的に加水分解しモノエステル体を得た後、シリカゲルクロマトグラフィー等による精製を行うことによっても得ることができる。【0027】
式（１）および（２）で示されるレチノイン酸導入リゾリン脂質の生理学的に許容される塩としては、例えば、塩酸、臭酸、硫酸、硝酸、リン酸、炭酸、酢酸、クエン酸、酪酸等の酸が付加した塩が挙げられ、また、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム等の塩基が付加した塩が挙げられる。【0028】
本発明の細胞動員剤は、徐放基材を含有する徐放性製剤であることが好ましい。徐放基材としては、生分解性高分子が好ましい。生分解性高分子としては、具体的には、ゼラチン、コラーゲン、キチン、キトサン、ヒアルロン酸、ポリアミノ酸、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、乳酸とグリコール酸の共重合体、ポリ−ε−カプロラクトンおよびそれらの誘導体、架橋体およびそれらの組み合わせが挙げられる。これらは目的とするＲｅｔ−ＬｙｓｏＰＣ徐放特性に応じて適宜選択される。これらは天然に得られるものであっても、微生物を用いた発酵法、あるいは、化学合成により製造されるものであっても良い。
【0029】
生分解性高分子の誘導体について、特に制限はないが、例えば、コハク酸、エチレンジアミン、ジステアロイルホスホエタノールアミン等を導入したものが挙げられる。これらの誘導体は、例えば、生分解性高分子側鎖のアミノ基、ヒドロキシ基、カルボキシル基等に前記化合物をアミド化、エステル化等させることにより得ることができる。これらの誘導体は、誘導体化前に比べてＲｅｔ−ＬｙｓｏＰＣとの物理的／化学的相互作用が変化し、徐放基材からのＲｅｔ−ＬｙｓｏＰＣ徐放特性を変化させることが可能となる。徐放基材としては、ゼラチン誘導体が好ましく、例えば、等電点５ゼラチンハイドロゲル、等電点９ゼラチンハイドロゲル、コハク化ゼラチンハイドロゲル、エチレンジアミン導入ゼラチンハイドロゲル、ジステアロイルホスホエタノールアミン導入ゼラチンハイドロゲルが挙げられる。
これら誘導体は、目的とするＲｅｔ−ＬｙｓｏＰＣ徐放特性（例えば、投与初期は高濃度が必要であるとともに、中期以降は低濃度を持続する必要がある等）に応じて適宜選択される。
ここで、実際に生体に投与した際には、局所においてＲｅｔ−ＬｙｓｏＰＣの有効濃度を保つ必要がある。徐放基材を用いるとＲｅｔ−ＬｙｓｏＰＣを持続的に放出することにより有効濃度を長時間維持することができる。一方、単純に濃度を一定に維持すれば良い症例ではなく、例えば治療初期に多くの細胞を集積させることが重要となる症例においては、投与初期にＲｅｔ−ＬｙｓｏＰＣが多く放出されるような徐放特性をもつ徐放基材を選択すればよい。
【0030】
徐放基材の形状は、特に制限はないが、例えば、円柱状、角柱状、シート状、ディスク状、球状、ペースト状等がある。円柱状、角柱状、シート状、ディスク状のものは、埋込片として用いるのに特に適している。【0031】
本発明において、徐放性製剤は、例えば、上記の徐放基材にＲｅｔ−ＬｙｓｏＰＣ水溶液を滴下するか、あるいは徐放基材をＲｅｔ−ＬｙｓｏＰＣ水溶液中に浸漬させて、徐放基材内にＲｅｔ−ＬｙｓｏＰＣを含浸させることにより得ることができる。また、Ｒｅｔ−ＬｙｓｏＰＣを揮発性の有機溶剤、例えばメタノール、エタノール、テトラヒドロフラン、クロロホルム、アセトン等に溶解させ、徐放基材を浸漬あるいは徐放基材を溶解した溶液と混合した後に溶剤を留去することにより得ることもできる。【0032】
徐放基材に対するＲｅｔ−ＬｙｓｏＰＣの重量比は通常０．１〜０．０００１倍である。Ｒｅｔ−ＬｙｓｏＰＣ水溶液を徐放基材に含浸させる操作は、通常、４〜６０℃で１５分間〜２４時間にて終了し、その間に徐放基材とＲｅｔ−ＬｙｓｏＰＣが物理的／化学的相互作用によって複合体を形成し、Ｒｅｔ−ＬｙｓｏＰＣが徐放基材に固定される。また、Ｒｅｔ−ＬｙｓｏＰＣを揮発性の有機溶剤に溶解させ、徐放基材を浸漬あるいは徐放基材を溶解した溶液と混合した後に溶剤を留去する操作は、通常、−２０〜８０℃で１５分間〜４８時間にて終了し、その間に徐放基材とＲｅｔ−ＬｙｓｏＰＣが物理的／化学的相互作用によって複合体を形成し、Ｒｅｔ−ＬｙｓｏＰＣが徐放基材に固定される。これらの調製方法は用いる徐放基材に応じて適宜選択される。Ｒｅｔ−ＬｙｓｏＰＣと徐放基材との結合には、クーロン力、水素結合力、疎水性相互作用等の物理的／化学的相互作用が単独あるいは複合的に関与していると考えられる。【0033】
上記で得られた徐放性製剤をそのまま、貼付剤等の経皮投与製剤、生体への埋め込み型製剤（移植担体）等として用いることができるが、更に必要に応じて製剤上許容し得る担体（安定化剤、保存剤、可溶化剤、ｐＨ調整剤、増粘剤等）を用いて、公知の方法により徐放性製剤（例えば、注射剤、経皮投与製剤、生体への埋め込み型製剤等）を調製してもよい。そのような担体としては公知のものが使用できる。さらに徐放効果を調節する各種添加剤を含めることもできる。【0034】
本発明において、「細胞動員」とは、細胞を遊走させるとともに集積させることをいう。本発明における「細胞動員」には、インビボにおける細胞動員及びインビトロにおける細胞動員のいずれも含まれる。【0035】
本発明の細胞動員剤は、ヒト、動物（例えば、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、イヌ、トリ等の家畜や家禽、及びマウス、ラット等の実験動物）に対して、注射、経皮投与、あるいは埋め込み投与等、任意の方法で投与することができるが、目的とする部位で持続的に放出させるためには局所投与であることが好ましい。【0036】
本発明の細胞動員剤の投与量は、組織修復を促進するに十分であるように適宜選択することができる。通常、成人患者当たり０．１〜１００００μｇの範囲から投与量が選択され、これを患部またはその周辺部位に留置または注入することができる。また１回の投与で効果が不十分であった場合は、投与を複数回行うことも可能である。【0037】
本発明において、組織修復に関与する細胞としては、単球やマクロファージ等の血球系細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞が挙げられる。前述の通り、創傷の治癒、腫瘍の縮退等といった組織修復過程において、血球系細胞である好中球、好酸球、単球、マクロファージ等の働きが関与していることが知られている（例えば、非特許文献１参照）。従って、本発明の細胞動員剤は、組織修復に関与する細胞を患部に動員（集積）させることによって、組織修復を促進させることが期待される。
造血幹細胞は血球系細胞に分化可能な幹細胞であるため、患部に動員することによって、血球系細胞を動員した際と同様に組織修復を促進することが期待される。
間葉系幹細胞は免疫反応の制御を行うほか、筋肉や骨等の組織に変化するので、間葉系幹細胞を対象となる患部に動員することにより、組織修復を促進することが期待される。
【0038】
本発明の細胞動員剤は、例えば、組織（例えば、皮膚、筋、骨、臓器）の損傷や疾患（例えば、創傷、慢性潰瘍、組織欠損、線維化）の治療薬、固形がん治療薬、医療用デバイス（例えば、移植材の内皮組織化促進）、ワクチン（免疫細胞動員による効率的な抗原提示）として用いることができる。また、本発明の細胞動員剤は、インビトロにおける用途、例えば、研究又は医療用デバイス（例えば、試験キット、移植材）、細胞ソーティング用試薬又は培地（細胞の高純度化）等に用いることができる。
本発明の細胞動員剤をインビトロで用いる場合の使用量は、細胞を集積するに十分であるように適宜選択することができる。
【実施例】
【0039】
以下、実施例、比較例、製造例、試験例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。各実施例、比較例に記載のＲｅｔ−ＬｙｓｏＰＣおよびジレチノイルホスホコリン（以下「Ｒｅｔ−ＰＣ」という。）の代表構造を表１に示す。また、Ｒｅｔ−ＬｙｓｏＰＣおよびＲｅｔ−ＰＣのレチノイル基ａｌｌ−ｔｒａｎｓ体含有率、Ｒｅｔ−ＬｙｓｏＰＣ中の１−レチノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン含有率は、以下の記載に従い算出し、結果は、表２に示した。徐放基材である各ゼラチン誘導体は特許第４３０３１９６号に記載のＴＮＢＳ法によりアミノ基数を求め、修飾率を算出し表３に示した。
（レチノイル基ａｌｌ−ｔｒａｎｓ体含有率の算出方法）
精製後の反応生成物５ｍｇを重溶媒１ｍｌに溶解し、１Ｈ−ＮＭＲ（６００ＭＨｚ、内部標準 ＴＭＳ）を測定した。Ｒｅｔ−ＬｙｓｏＰＣにおいては重メタノールを用いて測定し、δ＝１．０ｐｐｍ（−Ｃ（ＣＨ３）２−）のシグナルの積分値を６．０として、δ＝５．８ｐｐｍ（−ＯＣＯ−ＣＨ＝Ｃ（ＣＨ３）−）のシグナルの積分値（積分値１．０の時１００％）から、ａｌｌ−ｔｒａｎｓ体含有率を算出した。Ｒｅｔ−ＰＣにおいては重クロロホルムを用いて測定し、δ＝１．０ｐｐｍ（−Ｃ（ＣＨ３）２−）のシグナルの積分値を１２．０として、δ＝５．８ｐｐｍ（−ＯＣＯ−ＣＨ＝Ｃ（ＣＨ３）−）のシグナルの積分値（積分値２．０の時１００％）から、ａｌｌ−ｔｒａｎｓ体含有率を算出した。
（Ｒｅｔ−ＬｙｓｏＰＣ中の１−レチノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン含有率の算出方法）
精製後の反応生成物５ｍｇを重メタノール１ｍｌに溶解し、１Ｈ−ＮＭＲ（６００ＭＨｚ、内部標準 ＴＭＳ）を測定した。δ＝１．０ｐｐｍ（−Ｃ（ＣＨ３）２−）のシグナルの積分値を６．０として、δ＝５．０ｐｐｍ（ＨＯ−ＣＨ２−ＣＨ（ＯＣＯ−）−ＣＨ２−Ｏ−）のシグナルの積分値（積分値１．０の時１００％）から、２−レチノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン含有率を算出するとともに、１−レチノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン含有率（１００−（２−レチノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン含有率），％）を算出した。
【0040】
（実施例１）Ｒｅｔ−ＬｙｓｏＰＣおよび（比較例１）Ｒｅｔ−ＰＣの製造ａｌｌ−ｔｒａｎｓレチノイン酸（東京化成工業株式会社製）１．０ｇに、クロロホルム（アミレン含有）１２ｇ、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩０．３５ｇを加え攪拌した。３時間後、α−グリセロホスホコリン（Ｅｕｔｉｃａｌｓ Ｓ．ｐ．Ａ製）２．６ｇ、ジメチルアミノピリジン０．０８６ｇを加えて攪拌しながら５０℃まで昇温した。６０時間後、加熱を止めて、室温まで冷却した。反応溶液を攪拌しながらα−トコフェロール０．０１０ｇを加えた後、不溶物をろ別した。ろ液の溶剤を留去した後、展開溶剤としてクロロホルム、メタノール、水を用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィー（充填剤：ワコーゲル Ｃ−２００（和光純薬工業株式会社製）１０ｇ）により精製を行った。Ｒｅｔ−ＰＣを含む分画、またはＲｅｔ−ＬｙｓｏＰＣを含む分画を複数に分けて回収した。それぞれの回収分画をイオン交換樹脂ＳＭＮ−１（三菱化学株式会社製）５．５ｇ、イオン交換樹脂ＳＭＮ−１（三菱化学株式会社製）５．５ｇに通液した。その後、溶剤を留去し、目的物（実施例１−１〜１−２および比較例１）を得た。
得られた目的物を１Ｈ−ＮＭＲ（６００ＭＨｚ、重メタノール、内部標準 ＴＭＳ）にて分析し、δ＝１．０ｐｐｍ（６Ｈ，ｓ，−Ｃ（ＣＨ３）２−）、１．５ｐｐｍ（２Ｈ，ｍ，−Ｃ（ＣＨ３）２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−）、１．６ｐｐｍ（２Ｈ，ｍ，−Ｃ（ＣＨ３）２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−）、１．７ｐｐｍ（３Ｈ，ｓ，−ＣＨ２−Ｃ（ＣＨ３）＝）、２．０ｐｐｍ（３Ｈ，ｓ，−ＯＣＯ−ＣＨ＝Ｃ（ＣＨ３）−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ＝Ｃ（ＣＨ３）−）、２．０ｐｐｍ（２Ｈ，ｍ，−Ｃ（ＣＨ３）２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−）、２．３ｐｐｍ（３Ｈ，ｓ，−ＯＣＯ−ＣＨ＝Ｃ（ＣＨ３）−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ＝Ｃ（ＣＨ３）−）、３．２ｐｐｍ（９Ｈ，ｓ，Ｎ（ＣＨ３）３−ＣＨ２−ＣＨ２）、３．６ｐｐｍ（２Ｈ，ｍ，Ｎ（ＣＨ３）３−ＣＨ２−ＣＨ２−）、３．９ｐｐｍ（２Ｈ，ｍ，Ｎ（ＣＨ３）３−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＰＯＯ−Ｏ−ＣＨ２−）、４．０ｐｐｍ（１Ｈ，ｍ，−ＣＨ２−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ２−ＯＣＯ−ＣＨ＝）、４．１，４．２ｐｐｍ（２Ｈ，ｍ，−ＣＨ２−ＯＣＯ−ＣＨ＝）、４．３ｐｐｍ（２Ｈ，ｍ，Ｎ（ＣＨ３）３−ＣＨ２−ＣＨ２−）、５．０−７．８ｐｐｍ（６Ｈ，ｍ，−ＯＣＯ−ＣＨ＝Ｃ（ＣＨ３）−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ＝Ｃ（ＣＨ３）−ＣＨ＝ＣＨ−）から、Ｒｅｔ−ＬｙｓｏＰＣの存在を確認した。
得られた目的物を１Ｈ−ＮＭＲ（６００ＭＨｚ、重クロロホルム、内部標準 ＴＭＳ）にて分析し、δ＝１．０ｐｐｍ（１２Ｈ，ｓ，−Ｃ（ＣＨ３）２−）、１．５ｐｐｍ（４Ｈ，ｍ，−Ｃ（ＣＨ３）２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−）、１．６ｐｐｍ（４Ｈ，ｍ，−Ｃ（ＣＨ３）２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−）、１．７ｐｐｍ（６Ｈ，ｓ，−ＣＨ２−Ｃ（ＣＨ３）＝）、２．０ｐｐｍ（６Ｈ，ｓ，−ＯＣＯ−ＣＨ＝Ｃ（ＣＨ３）−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ＝Ｃ（ＣＨ３）−）、２．０ｐｐｍ（４Ｈ，ｍ，−Ｃ（ＣＨ３）２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−）、２．３ｐｐｍ（６Ｈ，ｓ，−ＯＣＯ−ＣＨ＝Ｃ（ＣＨ３）−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ＝Ｃ（ＣＨ３）−）、３．３ｐｐｍ（９Ｈ，ｓ，Ｎ（ＣＨ３）３−ＣＨ２−ＣＨ２）、３．８ｐｐｍ（２Ｈ，ｍ，Ｎ（ＣＨ３）３−ＣＨ２−ＣＨ２−）、４．０ｐｐｍ（２Ｈ，ｍ，Ｎ（ＣＨ３）３−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＰＯＯ−Ｏ−ＣＨ２−）、４．３，４．４ｐｐｍ（２Ｈ，ｍ，−ＣＨ２−ＯＣＯ−ＣＨ＝）、４．３ｐｐｍ（２Ｈ，ｂｒ，Ｎ（ＣＨ３）３−ＣＨ２−ＣＨ２−）、５．３ｐｐｍ（１Ｈ，ｍ，−ＣＨ２−ＣＨ（ＯＣＯ−ＣＨ＝）−ＣＨ２−ＯＣＯ−ＣＨ＝）、５．０−７．８ｐｐｍ（１２Ｈ，ｍ，−ＯＣＯ−ＣＨ＝Ｃ（ＣＨ３）−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ＝Ｃ（ＣＨ３）−ＣＨ＝ＣＨ−）からＲｅｔ−ＰＣの存在を確認した。
【0041】
（実施例２）Ｒｅｔ−ＬｙｓｏＰＣの製造ａｌｌ−ｔｒａｎｓレチノイン酸（東京化成工業株式会社製）０．６０ｇに、クロロホルム（アミレン含有）１８ｇ、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩０．２１ｇを加え攪拌した。３時間後、溶剤を留去し、濃縮物２．０ｇとした。α−グリセロホスホコリン（Ｅｕｔｉｃａｌｓ Ｓ．ｐ．Ａ製）０．０８３ｇ、ジメチルアミノピリジン０．０５３ｇを加えて攪拌しながら５０℃まで昇温した。３０時間後、加熱を止めて、室温まで冷却した。反応溶液を攪拌しながらα−トコフェロール０．００６ｇを加えた後、不溶物をろ別した。ろ液の溶剤を留去した後、展開溶剤としてクロロホルム、メタノール、水を用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィー（充填剤：ワコーゲル Ｃ−２００（和光純薬工業株式会社製）３．０ｇ）により精製を行った。Ｒｅｔ−ＬｙｓｏＰＣを含む分画を回収し、イオン交換樹脂ＳＭＮ−１（三菱化学株式会社製）３．３ｇ、イオン交換樹脂ＳＭＮ−１（三菱化学株式会社製）３．３ｇに通液した。その後、溶剤を留去し、目的物を得た。
得られた目的物を１Ｈ−ＮＭＲ（６００ＭＨｚ、重メタノール、内部標準 ＴＭＳ）にて分析し、δ＝１．０ｐｐｍ（６Ｈ，ｓ，−Ｃ（ＣＨ３）２−）、１．５ｐｐｍ（２Ｈ，ｍ，−Ｃ（ＣＨ３）２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−）、１．６ｐｐｍ（２Ｈ，ｍ，−Ｃ（ＣＨ３）２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−）、１．７ｐｐｍ（３Ｈ，ｓ，−ＣＨ２−Ｃ（ＣＨ３）＝）、２．０ｐｐｍ（３Ｈ，ｓ，−ＯＣＯ−ＣＨ＝Ｃ（ＣＨ３）−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ＝Ｃ（ＣＨ３）−）、２．０ｐｐｍ（２Ｈ，ｍ，−Ｃ（ＣＨ３）２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−）、２．３ｐｐｍ（３Ｈ，ｓ，−ＯＣＯ−ＣＨ＝Ｃ（ＣＨ３）−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ＝Ｃ（ＣＨ３）−）、３．２ｐｐｍ（９Ｈ，ｓ，Ｎ（ＣＨ３）３−ＣＨ２−ＣＨ２）、３．６ｐｐｍ（２Ｈ，ｍ，Ｎ（ＣＨ３）３−ＣＨ２−ＣＨ２−）、３．９ｐｐｍ（２Ｈ，ｍ，Ｎ（ＣＨ３）３−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＰＯＯ−Ｏ−ＣＨ２−）、４．０ｐｐｍ（１Ｈ，ｍ，−ＣＨ２−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ２−ＯＣＯ−ＣＨ＝）、４．１，４．２ｐｐｍ（２Ｈ，ｍ，−ＣＨ２−ＯＣＯ−ＣＨ＝）、４．３ｐｐｍ（２Ｈ，ｍ，Ｎ（ＣＨ３）３−ＣＨ２−ＣＨ２−）、５．０−７．８ｐｐｍ（６Ｈ，ｍ，−ＯＣＯ−ＣＨ＝Ｃ（ＣＨ３）−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ＝Ｃ（ＣＨ３）−ＣＨ＝ＣＨ−）から、Ｒｅｔ−ＬｙｓｏＰＣの存在を確認した。
【0042】
【表1】
【0043】
【表2】
【0044】
（実施例３）Ｒｅｔ−ＬｙｓｏＰＣによる単球動員効果の評価ヒト急性単球性白血病細胞株（以下「ＴＨＰ−１」という。）（ＡＴＣＣ製）の細胞懸濁液を遠心分離した後、上澄みを廃棄し、０．１％ウシ血清アルブミン（脂肪酸不含、ＳＩＧＭＡ ＡＬＤＲＩＣＨ製）含有ＲＰＭＩ−１６４０（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）を加えて分散させた。再び遠心分離を行い、上澄みを廃棄し細胞ペレットを得た。０．１％ウシ血清アルブミン含有ＲＰＭＩ−１６４０を加えて細胞密度を１ｘ１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌに調整した。トランズウェル（Ｃｏｒｎｉｎｇ製、φ６．５ｍｍ、ｐｏｒｅ ｓｉｚｅ φ８．０μｍ）に同細胞懸濁液１００μｌ／ｗｅｌｌを加えた。３７℃、５％ＣＯ２条件下にて３０分間インキュベートした後、下部のマルチプルウェルプレート内に測定溶液（ａｌｌ−ｔｒａｎｓレチノイン酸（東京化成工業株式会社製）（以下「ＲＡ」という）、比較例１のＲｅｔ−ＰＣまたは実施例１−２のＲｅｔ−ＬｙｓｏＰＣをそれぞれ１０ｎＭとなるように０．１％ウシ血清アルブミン含有ＲＰＭＩ−１６４０に溶解したもの、ならびに、０．１％ウシ血清アルブミン含有ＲＰＭＩ−１６４０単独）６００μｌ／ｗｅｌｌを加えた。３７℃、５％ＣＯ２条件下にて３時間インキュベートした後、マルチプルウェルプレート内の細胞懸濁液を採取し、ヘマサイトメーターにて細胞密度を測定し、細胞の遊走率を求めた。なお、細胞の遊走率は以下のように定義した。
細胞遊走率（％）＝（マルチプルウェルプレート内の細胞数）／（トランズウェルに加えた細胞数）
【0045】
図１に各測定溶液における細胞の遊走率測定結果を示す。なお、ｃｏｎｔｒｏｌとは０．１％ウシ血清アルブミン含有ＲＰＭＩ−１６４０に何も添加していないものをいう。ＲＡ（１０ｎＭ）、Ｒｅｔ−ＰＣ（１０ｎＭ）では細胞が遊走されておらず、単球動員効果を示さないのに対し、Ｒｅｔ−ＬｙｓｏＰＣ（１０ｎＭ）ではｃｏｎｔｒｏｌに比べて有意（Ｐ＜０．０５）に細胞が遊走された。よって、Ｒｅｔ−ＬｙｓｏＰＣは単球動員効果を有することが分かった。【0046】
（実施例４）レチノイル基ａｌｌ−ｔｒａｎｓ体含有率による単球動員効果への影響評価ＴＨＰ−１の細胞懸濁液を遠心分離した後、上澄みを廃棄し、０．１％ウシ血清アルブミン含有ＲＰＭＩ−１６４０を加えて分散させた。再び遠心分離を行い、上澄みを廃棄し細胞ペレットを得た。０．１％ウシ血清アルブミン含有ＲＰＭＩ−１６４０を加えて細胞密度を１ｘ１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌに調整した。トランズウェル（Ｃｏｒｎｉｎｇ製、φ６．５ｍｍ、ｐｏｒｅ ｓｉｚｅ φ８．０μｍ）に同細胞懸濁液１００μｌ／ｗｅｌｌを加えた。３７℃、５％ＣＯ２条件下にて３０分間インキュベートした後、下部のマルチプルウェルプレート内に測定溶液（実施例１−１および１−２のＲｅｔ−ＬｙｓｏＰＣをそれぞれ１０ｎＭとなるように０．１％ウシ血清アルブミン含有ＲＰＭＩ−１６４０に溶解したもの、ならびに、０．１％ウシ血清アルブミン含有ＲＰＭＩ−１６４０単独）６００μｌ／ｗｅｌｌを加えた。３７℃、５％ＣＯ２条件下にて３時間インキュベートした後、マルチプルウェルプレート内の細胞懸濁液を採取し、ヘマサイトメーターにて細胞密度を測定し、細胞の遊走率を求めた。
【0047】
図２に各測定溶液における細胞遊走率測定結果を示す。なお、ｃｏｎｔｒｏｌとは０．１％ウシ血清アルブミン含有ＲＰＭＩ−１６４０に何も添加していないものをいう。いずれのＲｅｔ−ＬｙｓｏＰＣ（１０ｎＭ）においても細胞の遊走が確認された。ａｌｌ−ｔｒａｎｓ体含有率の高いものでは単球の動員効果が高い傾向にあるものの、ａｌｌ−ｔｒａｎｓ体含有率の少ないものであっても有意な細胞の遊走が確認されており、その他の異性体であっても単球動員効果を有することが示唆された。【0048】
（実施例５）Ｒｅｔ−ＬｙｓｏＰＣによる間葉系幹細胞動員効果の評価ヒト骨髄由来間葉系幹細胞株（ＵＥ７Ｔ−１３）（医薬基盤研究所ＪＣＲＢ細胞バンク製）を予め血清不含ＤＭＥＭ（ＳＩＧＭＡ ＡＬＤＲＩＣＨ製）を用いて２４時間培養した後、０．２５％トリプシン／１ｍＭ ＥＤＴＡ溶液（ＳＩＧＭＡ ＡＬＤＲＩＣＨ製）を用いて同細胞の懸濁液とした。１０％血清含有ＤＭＥＭ（Ｐｏｗｅｒｅｄｂｙ１０培地；グライコテクニカ製）を加え、細胞懸濁液を遠心分離した後、上澄みを廃棄し、０．１％ウシ血清アルブミン（脂肪酸不含、ＳＩＧＭＡ ＡＬＤＲＩＣＨ製）含有ＤＭＥＭ（ＳＩＧＭＡ ＡＬＤＲＩＣＨ製）を加えて分散させた。再び遠心分離を行い、上澄みを廃棄し細胞ペレットを得た。０．１％ウシ血清アルブミン含有ＤＭＥＭを加えて細胞密度を４ｘ１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌに調整した。トランズウェル（Ｃｏｒｎｉｎｇ製、φ６．５ｍｍ、ｐｏｒｅ ｓｉｚｅ φ８．０μｍ）に同細胞懸濁液１００μｌ／ｗｅｌｌを加えた。３７℃、５％ＣＯ２条件下にて３０分間インキュベートした後、下部のマルチプルウェルプレート内に測定溶液（実施例１−２のＲｅｔ−ＬｙｓｏＰＣを１０ｎＭとなるように０．１％ウシ血清アルブミン含有ＤＭＥＭに溶解したもの、または、０．１％ウシ血清アルブミン含有ＤＭＥＭ単独）６００μｌ／ｗｅｌｌを加えた。３７℃、５％ＣＯ２条件下にて４時間インキュベートした後、インサート内の上清を除去した。メンブレン上側の細胞を除去した後、メンブレン下側の細胞を４％パラホルムアルデヒド溶液を用いて固定化し、クリスタルバイオレット溶液を用いて染色した。水洗した後に乾燥させ、顕微鏡観察にて１視野あたりの細胞数を計測した。なお、遊走細胞比は以下のように定義した。
遊走細胞比＝（各測定溶液を用いた際のメンブレン１視野あたりの細胞数）／（ｃｏｎｔｒｏｌのメンブレン１視野あたりの細胞数）
ここで、ｃｏｎｔｒｏｌとは０．１％ウシ血清アルブミン含有ＤＭＥＭに何も添加していないものをいう。
【0049】
図３に各測定溶液における遊走細胞比測定結果を示す。Ｒｅｔ−ＬｙｓｏＰＣ（１０ｎＭ）はｃｏｎｔｒｏｌに比べて有意（Ｐ＜０．０１）に細胞が遊走された。よって、Ｒｅｔ−ＬｙｓｏＰＣは間葉系幹細胞動員効果を有することが分かった。【0050】
（製造例１）ゼラチンハイドロゲル乾燥体の製造Ｒｅｔ−ＬｙｓｏＰＣの徐放基材として、以下に示すゼラチンハイドロゲル乾燥体を製造し、実施例５に示す徐放試験に使用した。
・等電点５ゼラチンハイドロゲル乾燥体（以下、「ｐＩ５ゲル」という。）
・等電点９ゼラチンハイドロゲル乾燥体（以下、「ｐＩ９ゲル」という。）
・コハク化ゼラチンハイドロゲル乾燥体（以下、「Ｓｕｃゲル」という。）
・エチレンジアミン導入ゼラチンハイドロゲル乾燥体（以下、「Ｅ５０ゲル」という。）
・ジステアロイルホスホエタノールアミン導入ゼラチンハイドロゲル乾燥体（以下、「ＤＳＰＥゲル」という。）
【0051】
（製造例１−１）コハク化ゼラチンの製造等電点５のゼラチン（牛骨由来、平均分子量約１０万：新田ゼラチン株式会社製）１．０ｇをジメチルスルホキシド１４ｇに溶解させた。無水コハク酸０．０１４ｇをジメチルスルホキシド４．５ｇに溶解させた後、この溶液をゼラチン溶液に添加した。３７℃、１時間攪拌した後、透析膜で包み、外相に水を用いて３日間の透析を行った。透析終了後、内相を回収し、凍結乾燥することによってコハク化ゼラチンを得た。当該ゼラチンの修飾率を表３に示す。
【0052】
（製造例１−２）カチオン化ゼラチンの製造等電点９のゼラチン（豚皮由来、平均分子量約１０万：新田ゼラチン株式会社製）１．０ｇを２４ｍｌの０．１Ｍリン酸緩衝水溶液（ｐＨ５．０）に溶解させた。次に、ゼラチンのカルボキシル基に対して５０等量のエチレンジアミンを加えた後、１１Ｍの塩酸水溶液を用いて溶液のｐＨを５．０に調整した。その後、ゼラチンのカルボキシル基に対して３等量の１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩を添加し、０．１Ｍリン酸緩衝水溶液（ｐＨ５．０）を加えることによりゼラチンの最終濃度を２ｗｔ％とした。３７℃、４時間攪拌を行った後、反応物を透析膜で包み、外相に水を用いて３日間の透析を行った。透析終了後、内相を回収し、凍結乾燥することによってカチオン化ゼラチンを得た。当該ゼラチンの修飾率を表３に示す。
【0053】
（製造例１−３）ジステアロイルホスホエタノールアミン導入ゼラチンの製造等電点５のゼラチン（牛骨由来、平均分子量約１０万：新田ゼラチン株式会社製）１．０ｇをジメチルスルホキシド３０ｇに溶解させた。ここにＮ−（スクシンイミジロキシグルタリル）−ホスホエタノールアミン，ジステアロイル（ＣＯＡＴＳＯＭＥ ＦＥ−８０８０ＳＵ５；日油株式会社製）０．６７ｇを加え、２５℃、１８時間攪拌した。当該反応液を透析膜で包み、外相に水を用いて３日間の透析を行った。透析終了後、内相を回収し、凍結乾燥することによってジステアロイルホスホエタノールアミン導入ゼラチンを得た。当該ゼラチンの修飾率を表３に示す。
【0054】
【表3】
【0055】
（製造例１−４）ハイドロゲル乾燥体の製造製造例１−１で製造したコハク化ゼラチン０．５ｇを水９．５ｇで溶解した後、５Ｍ水酸化ナトリウム水溶液を用いて、溶液のｐＨを５．０に調整した。２５％グルタルアルデヒド水溶液４５μｌを加え、３０秒間静かに撹拌した。その後、反応液を分注し、遮光して、室温で３０分間静置後、４℃で１２時間架橋反応を行った。当該ゲルを０．１Ｍグリシン水溶液５００ｍｌに投入し、室温で１時間振盪することにより架橋反応を停止させた。その後、グリシン水溶液を純水に置換し、室温で１時間の振盪を３回繰り返した。得られたハイドロゲルを凍結乾燥することによって、Ｓｕｃゲルを得た。
【0056】
その他のゼラチンについても同様の手法で架橋および精製を行い、等電点５のゼラチン（牛骨由来、平均分子量約１０万：新田ゼラチン株式会社製）よりｐＩ５ゲル、等電点９のゼラチン（豚皮由来、平均分子量約１０万：新田ゼラチン株式会社製）よりｐＩ９ゲル、製造例１−２のゼラチン誘導体よりＥ５０ゲル、製造例１−３のゼラチン誘導体よりＤＳＰＥゲルを得た。【0057】
（実施例６）Ｒｅｔ−ＬｙｓｏＰＣ含有ゼラチンハイドロゲルの徐放試験徐放性製剤の一例として、ゼラチン誘導体を徐放基材として用いたＲｅｔ−ＬｙｓｏＰＣ含有徐放性製剤を作成し、徐放試験を実施した。即ち、製造例１に示した種々のゼラチンハイドロゲル乾燥体を徐放基材としてＲｅｔ−ＬｙｓｏＰＣ水溶液を含浸させ、リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４、以下「ＰＢＳ」という。）中および１０μｇ／ｍｌコラゲナーゼ含有ＰＢＳにおける徐放特性を評価した。
Ｒｅｔ−ＬｙｓｏＰＣ濃度が５００μＭとなるようＲｅｔ−ＬｙｓｏＰＣ（実施例１−２）をＰＢＳに溶解した。この５００μＭ Ｒｅｔ−ＬｙｓｏＰＣ水溶液１００μｌをゼラチンハイドロゲル（１０ｍｇ）に滴下し、３７℃、１時間含浸させた。ＰＢＳ（５００μｌ）を加えた後、３７℃、遮光条件下にて所定時間静置した（徐放試験開始）。その後、４℃、５０００ｒｐｍ、１０分間の遠心分離にかけ、上清全量を回収した後、新しいＰＢＳ（５００μｌ）を添加した。この操作を所定回数繰り返した。徐放試験開始１２時間後、上清を回収した後、Ｓｕｃゲル、Ｅ５０ゲル、ＤＳＰＥゲルを用いた試験について１０μｇ／ｍｌコラゲナーゼＬ（新田ゼラチン株式会社製）含有ＰＢＳ（５００μｌ）を添加した後、同様に所定時間静置した。同様に上清を回収するとともに、新しい１０μｇ／ｍｌコラゲナーゼＬ含有ＰＢＳ（５００μｌ）を添加した。この操作を徐放基材が消失するまで、または徐放試験開始から６０時間後まで繰り返した。回収した上清中のＲｅｔ−ＬｙｓｏＰＣ濃度を逆相ＨＰＬＣにて測定することによって、Ｒｅｔ−ＬｙｓｏＰＣ徐放率を求めた。
【0058】
図４および図５に各回収時間におけるＲｅｔ−ＬｙｓｏＰＣの徐放率を示す。ゼラチン種によってＲｅｔ−ＬｙｓｏＰＣの徐放特性が大きく異なることが分かった。これは徐放基材とＲｅｔ−ＬｙｓｏＰＣとの相互作用が異なるためである。また、コラゲナーゼの添加により徐放基材を分解させたところ、それに伴ってＲｅｔ−ＬｙｓｏＰＣが徐放されることが確認された。【0059】
（試験例１）各リゾリン脂質の単球動員効果の比較試験ヒト急性単球性白血病細胞株（ＴＨＰ−１）（ＡＴＣＣ製）を用いて各検体の単球遊走効果を評価した。ＴＨＰ−１の細胞懸濁液を遠心分離した後、上澄みを廃棄し、０．１％ウシ血清アルブミン含有ＲＰＭＩ−１６４０を加えて分散させた。再び遠心分離を行い、上澄みを廃棄し細胞ペレットを得た。０．１％ウシ血清アルブミン含有ＲＰＭＩ−１６４０を加えて細胞密度を１ｘ１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌに調整した。トランズウェル（Ｃｏｒｎｉｎｇ製、φ６．５ｍｍ、ｐｏｒｅ ｓｉｚｅ φ８．０μｍ）に同細胞懸濁液１００μｌ／ｗｅｌｌを加えた。３７℃、５％ＣＯ２条件下にて３０分間インキュベートした後、下部のマルチプルウェルプレート内に測定溶液（Ｃ１８：０−ＬｙｓｏＰＣ（ＣＯＡＴＳＯＭＥ ＭＣ−８０Ｈ；日油株式会社製）、実施例２のＲｅｔ−ＬｙｓｏＰＣまたはＳ１Ｐ（Ｔｏｒｏｎｔｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ製）を０．１％ウシ血清アルブミン含有ＲＰＭＩ−１６４０に溶解したもの、ならびに、０．１％ウシ血清アルブミン含有ＲＰＭＩ−１６４０単独）６００μｌ／ｗｅｌｌを加えた。３７℃、５％ＣＯ２条件下にて３時間インキュベートした後、マルチプルウェルプレート内の細胞懸濁液を採取し、ヘマサイトメーターにて細胞密度を測定し、細胞の遊走率を求めた。
【0060】
図６および図７に各測定溶液における細胞遊走率測定結果を示す。なお、ｃｏｎｔｒｏｌとは０．１％ウシ血清アルブミン含有ＲＰＭＩ−１６４０に何も添加していないものをいう。図６より、Ｃ１８：０−ＬｙｓｏＰＣ（１００ｎＭ）では単球の動員効果を示さないが、Ｒｅｔ−ＬｙｓｏＰＣ（１００ｎＭ）では単球の動員効果を示すことが分かる。また、図７より、Ｓ１Ｐは１、１００ｎＭにおいては有意（ｐ＜０．０５）な単球動員効果を示さないのに対し、Ｒｅｔ−ＬｙｓｏＰＣでは１〜１００ｎＭのいずれにおいても有意な単球動員効果を示すことが明らかとなった。【0061】
（試験例２）各リゾリン脂質の間葉系幹細胞動員効果の比較試験ヒト骨髄由来間葉系幹細胞株（ＵＥ７Ｔ−１３）（医薬基盤研究所ＪＣＲＢ細胞バンク製）を予め血清不含ＤＭＥＭ（ＳＩＧＭＡ ＡＬＤＲＩＣＨ製）を用いて２４時間培養した後、０．２５％トリプシン／１ｍＭ ＥＤＴＡ溶液（ＳＩＧＭＡ ＡＬＤＲＩＣＨ製）を用いて同細胞の懸濁液とした。１０％血清含有ＤＭＥＭ（Ｐｏｗｅｒｅｄｂｙ１０培地；グライコテクニカ製）を加え、細胞懸濁液を遠心分離した後、上澄みを廃棄し、０．１％ウシ血清アルブミン（脂肪酸不含、ＳＩＧＭＡ ＡＬＤＲＩＣＨ製）含有ＤＭＥＭ（ＳＩＧＭＡ ＡＬＤＲＩＣＨ製）を加えて分散させた。再び遠心分離を行い、上澄みを廃棄し細胞ペレットを得た。０．１％ウシ血清アルブミン含有ＤＭＥＭを加えて細胞密度を４ｘ１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌに調整した。トランズウェル（Ｃｏｒｎｉｎｇ製、φ６．５ｍｍ、ｐｏｒｅ ｓｉｚｅ φ８．０μｍ）に同細胞懸濁液１００μｌ／ｗｅｌｌを加えた。３７℃、５％ＣＯ２条件下にて３０分間インキュベートした後、下部のマルチプルウェルプレート内に測定溶液（実施例１−２のＲｅｔ−ＬｙｓｏＰＣまたはＳ１Ｐ（Ｔｏｒｏｎｔｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ製）をそれぞれ所定濃度になるように０．１％ウシ血清アルブミン含有ＤＭＥＭに溶解したもの、ならびに、０．１％ウシ血清アルブミン含有ＤＭＥＭ単独）６００μｌ／ｗｅｌｌを加えた。３７℃、５％ＣＯ２条件下にて４時間インキュベートした後、インサート内の上清を除去した。メンブレン上側の細胞を除去した後、メンブレン下側の細胞を４％パラホルムアルデヒド溶液を用いて固定化し、クリスタルバイオレット溶液を用いて染色した。水洗した後に乾燥させ、顕微鏡観察にて１視野あたりの細胞数を計測した。なお、遊走細胞比は以下のように定義した。
遊走細胞比＝（各測定溶液を用いた際のメンブレン１視野あたりの細胞数）／（ｃｏｎｔｒｏｌのメンブレン１視野あたりの細胞数）
ここで、ｃｏｎｔｒｏｌとは０．１％ウシ血清アルブミン含有ＤＭＥＭに何も添加していないものをいう。
【0062】
図８に各測定溶液における遊走細胞比測定結果を示す。図８より、Ｓ１Ｐは１０、１００ｎＭにおいては有意（ｐ＜０．０５）な間葉系幹細胞動員効果を示さないのに対し、Ｒｅｔ−ＬｙｓｏＰＣでは１〜１００ｎＭのいずれにおいても有意な間葉系幹細胞動員効果を示すことが明らかとなった。【0063】
本出願は、日本で出願された特願２０１４−１２８６４４を基礎としており、その内容は本明細書にすべて包含されるものである。