特許 6553075 さらなるＣＣＲ３−結合ケモカインを認識する抗エオタキシン−２抗体

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6553075

(24)【登録日】2019年7月12日

(45)【発行日】2019年8月7日

(54)【発明の名称】さらなるＣＣＲ３−結合ケモカインを認識する抗エオタキシン−２抗体

(51)【国際特許分類】

   A61K 39/395 20060101AFI20190729BHJP

   A61P 17/00 20060101ALI20190729BHJP

   A61P 11/00 20060101ALI20190729BHJP

   A61P 9/10 20060101ALI20190729BHJP

   A61P 1/10 20060101ALI20190729BHJP

   A61P 13/12 20060101ALI20190729BHJP

   A61P 3/10 20060101ALI20190729BHJP

   A61P 37/02 20060101ALI20190729BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20190729BHJP

   A61P 37/08 20060101ALI20190729BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20190729BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20190729BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20190729BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20190729BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20190729BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20190729BHJP

   C07K 16/24 20060101ALI20190729BHJP

【ＦＩ】

   A61K39/395 N

   A61P17/00

   A61P11/00

   A61P9/10

   A61P1/10

   A61P13/12

   A61P3/10

   A61P37/02

   A61P29/00

   A61P37/08

   A61P43/00 105

   C12N15/13ZNA

   C12N1/15

   C12N1/19

   C12N1/21

   C12N5/10

   C07K16/24

【請求項の数】17

【全頁数】49

(21)【出願番号】特願2016-555467(P2016-555467)

(86)(22)【出願日】2015年3月4日

(65)【公表番号】特表2017-508461(P2017-508461A)

(43)【公表日】2017年3月30日

(86)【国際出願番号】IL2015050234

(87)【国際公開番号】WO2015132790

(87)【国際公開日】20150911

【審査請求日】2018年2月1日

(31)【優先権主張番号】61/947,852

(32)【優先日】2014年3月4日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】516262000

【氏名又は名称】ケモマブ リミテッド

【氏名又は名称原語表記】ＣｈｅｍｏｍＡｂ Ｌｔｄ．

(74)【代理人】

【識別番号】110001302

【氏名又は名称】特許業務法人北青山インターナショナル

(72)【発明者】

【氏名】モル，アディ

【審査官】 渡邉 潤也

(56)【参考文献】

【文献】 特表２０１３−５０３１９２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１２−５１６１５０（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ３９／００

Ｃ０７Ｋ １／００−１９／００

Ｃ１２Ｎ １５／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

線維性疾患、自己免疫性炎症性疾患、単球関連疾患、又はアレルギー・アトピー性疾患の治療のための医薬組成物であって、前記医薬組成物が（ｉ）少なくとも２つのＣＣＲ３結合ケモカインに結合する単離多重特異性抗体、又はその任意の抗原結合断片、及び（ｉｉ）薬理学的に許容される担体を含み、前記単離多重特異性抗体が、
ａ）配列番号５で表わされるアミノ酸配列を含む相補性決定領域ＶＨ ＣＤＲ１、
ｂ）配列番号６で表わされるアミノ酸配列を含む相補性決定領域ＶＨ ＣＤＲ２、及び
ｃ）配列番号７で表わされるアミノ酸配列を含む相補性決定領域ＶＨ ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに
ｄ）配列番号８で表わされるアミノ酸配列を含む相補性決定領域ＶＫ ＣＤＲ１、
ｅ）配列番号９で表わされるアミノ酸配列を含む相補性決定領域ＶＫ ＣＤＲ２、及び
ｆ）配列番号１０で表わされるアミノ酸配列を含む相補性決定領域ＶＫ ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域
を含む完全ヒト化抗体であることを特徴とする医薬組成物。

【請求項2】

請求項１に記載の医薬組成物において、前記その抗原結合断片が、Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、抗原に結合可能な重鎖可変領域、抗原に結合可能な軽鎖可変領域、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）２’、及びそれらの任意の組み合わせからなる群より選択されることを特徴とする医薬組成物。

【請求項3】

請求項１または２に記載の医薬組成物において、前記線維性疾患が、硬皮症、特発性肺線維症（ＩＰＦ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、糸球体硬化症、肝硬変、及びメタボリックシンドロームからなる群より選択されることを特徴とする医薬組成物。

【請求項4】

請求項１〜３のいずれか一項に記載の医薬組成物において、前記自己免疫性炎症性疾患が、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、関節リウマチ、乾癬、大腸炎、ブドウ膜炎、多発性硬化症、及びタイプＩ糖尿病からなる群より選択されることを特徴とする医薬組成物。

【請求項5】

請求項１または２に記載の医薬組成物において、前記単球関連疾患がアテローム性動脈硬化症であることを特徴とする医薬組成物。

【請求項6】

請求項１または２に記載の医薬組成物において、前記アレルギー・アトピー性疾患が、喘息、アトピー性皮膚炎、蕁麻疹、及び過敏症反応からなる群より選択されることを特徴とする医薬組成物。

【請求項7】

請求項１〜６のいずれか一項に記載の医薬組成物において、前記少なくとも２つのＣＣＲ３結合ケモカインが、エオタキシン１、エオタキシン−２、ＲＡＮＴＥＳ、及びＭＣＰ−３からなる群より選択されることを特徴とする医薬組成物。

【請求項8】

請求項７に記載の医薬組成物において、前記抗体が、エオタキシン１、エオタキシン−２、ＲＡＮＴＥＳ、及びＭＣＰ−３に結合することを特徴とする医薬組成物。

【請求項9】

請求項１〜８のいずれか一項に記載の医薬組成物において、前記抗体が、ＣＣＲ３、ＣＣＲ１、ＣＣＲ２、及びＣＣＲ５を発現する細胞の遊走性を弱めることを特徴とする医薬組成物。

【請求項10】

請求項１に記載の医薬組成物において、前記抗体が配列番号３で表わされる重鎖可変領域及び配列番号４で表わされる軽鎖可変領域を含む完全ヒト化抗体であることを特徴とする医薬組成物。

【請求項11】

少なくとも２つのＣＣＲ３結合ケモカインに結合する単離多重特異性抗体又はその任意の抗原結合断片であって、前記抗体が、完全ヒト化抗体であり、
ａ）配列番号５で表わされるアミノ酸配列を含む相補性決定領域ＶＨ ＣＤＲ１、
ｂ）配列番号６で表わされるアミノ酸配列を含む相補性決定領域ＶＨ ＣＤＲ２、及び
ｃ）配列番号７で表わされるアミノ酸配列を含む相補性決定領域ＶＨ ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに
ｄ）配列番号８で表わされるアミノ酸配列を含む相補性決定領域ＶＫ ＣＤＲ１、
ｅ）配列番号９で表わされるアミノ酸配列を含む相補性決定領域ＶＫ ＣＤＲ２、及び
ｆ）配列番号１０で表わされるアミノ酸配列を含む相補性決定領域ＶＫ ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域
を含む単離多重特異性抗体又はその任意の抗原結合断片。

【請求項12】

請求項１１に記載の前記抗体をコードする核酸分子。

【請求項13】

少なくとも２つのＣＣＲ３結合ケモカインに結合するヒト化抗体をコードする核酸分子であって、配列番号１及び配列番号２で表わされる配列を含む核酸分子。

【請求項14】

請求項１２又は１３のいずれか一項に記載の前記核酸分子を含む発現ベクター。

【請求項15】

請求項１４に記載の前記発現ベクターを含む宿主細胞。

【請求項16】

線維性疾患、自己免疫性炎症性疾患、単球関連疾患、又はアレルギー・アトピー性疾患の治療のための医薬の製造における、請求項１１に記載の前記抗体の使用。

【請求項17】

線維性疾患、自己免疫性炎症性疾患、単球関連疾患、又はアレルギー・アトピー性疾患における、ＣＣＲ３、ＣＣＲ１、ＣＣＲ２、及びＣＣＲ５を発現する細胞の遊走性を弱めるための医薬の製造における、請求項１１に記載の前記抗体の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、線維性疾患、炎症性疾患、自己免疫疾患、及びアレルギー疾患の治療における、他のケモカインに対する多重結合特性を有する抗エオタキシン−２（ＣＣＬ２４）モノクローナル抗体の使用に関する。

【背景技術】

【0002】

自己免疫疾患は、自身の細胞に対して作用する体の過度に活動的な免疫反応によって生じる（１）。自己免疫疾患はほとんどすべてが慢性であり根治しない。全世界で３億人超える患者がこの疾患に罹患している。全自己免疫疾患患者の約７０％〜７５％を女性が占める。

【0003】

エオタキシン−２は、特に好酸球（２〜４）、好塩基球（４）、及びＴｈ２タイプリンパ球（５）の走化性を誘導することによって、細胞移動を促進し、ＣＣＲ３遺伝子複合体部位における炎症活性を制御するケモカインである。

【0004】

これまで、エオタキシン−２はアレルギーとの関連において良く知られていた。アレルギー反応の間にエオタキシン−２のレベルの著しい増加があることが文献的に裏付けられていた（６〜８）。最近、本発明者らはエオタキシン−２が自己免疫疾患及び炎症性疾患にも関与することを発見した（国際公開第２０１０／０８６８５４号）。Ａｂｌｉｎら（９）に記載のように、関節リウマチのラットモデルにおいてエオタキシン−２の阻害は保護効果を示した。くわえて、Ｍａｕｓｎｅｒら（１０）によって報告されたように、エオタキシン−２遮断は実験的自己免疫性脳脊髄炎を弱めることが観察された。

【0005】

強皮症又は全身性強皮症（ＳＳｃ）は、免疫系の活性化、内皮の機能不全、及び線維芽細胞が関与する活発な線維形成過程を特徴とする稀な慢性多臓器自己免疫疾患である（１１）。硬皮症病変の発症の最も初期の段階は内皮細胞の活性化及び血管損傷である。これに続いて、炎症細胞、まず単球、次いでリンパ球の遊走が起こる。最終的には線維芽細胞の集団が活性化される。活性化された線維芽細胞は、硬皮症の究極の線維化病理の根底にある細胞外マトリックスを産生し続ける（１１）。研究から、ヒト皮膚線維芽細胞が恒常的にエオタキシン１、２、及び３のｍＲＮＡを発現することが明らかになった（１３）。くわえて、エオタキシンレベルの上昇が肺線維症及びブレオマイシン誘導強皮症マウスモデルで観察された（１４）。エオタキシン及びＣＣＲ３のノックアウトマウスでは、肺線維症の発症が著しく減少する（１４、１５）。

【0006】

炎症性ＣＣＲ３結合ケモカインであるエオタキシン１、ＲＡＮＴＥＳ、及びＭＣＰ−３は、ＣＣケモカインファミリーにも属し、ＣＣＲ３受容体に対するリガンドとして機能する。これらのキモカインは免疫細胞の遊走にも関わり、前臨床炎症モデルにおけるそれらの有効性を説明する（１６、１７）。

【0007】

特発性肺線維症（ＩＰＦ）は進行性の線維性疾患であり、肺に限局し、高齢者に起こり、男性に多く、予後不良であることを特徴とし、生存中央値が診断後３〜５年である。ＩＰＦを特徴付ける臨床的な特徴としては、息切れ、Ｘ線で明らかなびまん性肺浸潤、及び生検でのさまざまな程度の炎症、線維症、又はその両方が挙げられる。ＩＰＦの原因は現在も不明であるが、線維芽細胞及び免疫細胞の動員及び増殖並びにそれらの病的な分化の機序が疾患の進行の顕著な特質であると考えられている。さらに、サイトカイン、ケモカイン、線維形成因子、凝固タンパク質、オキシダント、及びアポトーシスの制御因子を含む多数のＩＰＦの進行に関わる仲介物質が存在するようである（１８、１９）。また、コラーゲンを含む細胞外マトリックス構成要素の沈着がこの線維化過程に不可欠である（２０）。

【0008】

一般に該疾患の管理としては、対症療法、例えば、酸素補充、肺リハビリテーション、肺移植評価の考慮、並びに可能性のある併存疾患の識別及び治療の幾つかの組み合わせが挙げられる（２１）。ピルフェニドン（エスブリエット）及びニンテダニブのみが、ＩＰＦを有する個人に対して現在使用可能なＦＤＡ／ＥＭＡ認可治療である（２２〜２４）。線維症のさまざまなインビトロ系及び動物モデルでピルフェニドンは繊維症治療薬及び抗炎症薬の特性を有する。

【図面の簡単な説明】

【0009】

本発明を理解し、それが実際にどのように実施されうるかを見るために、非限定的にすぎない例を挙げ、次の添付図面を参照して実施形態を説明する。

【0010】

図１Ａ〜図１Ｃは、酵素結合免疫吸着法（Ｅｌｉｓａ）で測定した、全身性強皮症患者におけるエオタキシン２（図１Ａ）、ＲＡＮＴＥＳ（図１Ｂ）、及びエオタキシン１（図１Ｃ）の全身循環レベルを示すグラフである。結果はミリリットル当たりのピコグラムで示されている。

【0011】

図２Ａ及び図２Ｂは、ブレオマイシン誘導強皮症マウスの予防モデルにおける、さまざまなパラメーターに対するＣＭ１０１治療の効果を示すグラフである。図２Ａは、抗エオタキシン−２モノクローナル抗体（ＣＭ１０１、１０、２０、又は５０μｇ）、ＩｇＧ、及びＰＢＳによる治療の真皮厚に対する効果（±標準誤差）を示すグラフである。図２Ｂは、抗エオタキシン−２モノクローナル抗体（ＣＭ１０１、１０、２０、又は５０μｇ）、ＩｇＧ、及びＰＢＳによる治療のコラーゲン濃度に対する効果（±標準誤差）を示すグラフであり、＊はｐ≦０．０５を示す。（溶媒−治療無し（ＰＢＳ）；ＢＬＭ−ブレオマイシン）。

【0012】

図３Ａ及び図３Ｂは、ブレオマイシン誘導強皮症モデル（予防モード）における、抗エオタキシン−２モノクローナル抗体（ＣＭ１０１、１０μｇ又は５０μｇ）による治療のマウスの気管支肺胞液中のリンパ球（図３Ａ）及び好酸球（図３Ｂ）に対する効果（±標準誤差）を示すグラフである。＊はｐ＜０．０５を示す。（溶媒−治療無し（ＰＢＳ）；ＢＬＭ−ブレオマイシン）。

【0013】

図４は、治療プロトコールにおける、抗エオタキシン−２モノクローナル抗体（ＣＭ１０１、５０μｇ）及びＰＢＳ（溶媒）による治療のマウスの皮膚コラーゲン濃度に対する効果（±標準誤差）を示すグラフである。＊ｐ≦０．０５。（溶媒−治療無し（ＰＢＳ）；ＢＬＭ−ブレオマイシン）。

【0014】

図５Ａ及び図５Ｂは、治療モードにおける、抗エオタキシン−２モノクローナル抗体（ＣＭ１０１、５０μｇ）及びＰＢＳ（溶媒）による治療のマウスの気管支肺胞液内の単核細胞（図５Ａ）及び白血球（ＷＢＣ）（図５Ｂ）浸潤に対する効果（±標準誤差）を示すグラフである。＊ｐ≦０．０５。（溶媒−治療無し（ＰＢＳ）；ＢＬＭ−ブレオマイシン）。図５Ｃ〜図５Ｆは代表的なＦＡＣＳ結果（フローサイトメトリーでの３０秒細胞カウント）である：５Ｃ−ＰＢＳ；５Ｄ−ＢＬＭ ８日；５Ｅ−ＢＬＭ ２１日；５Ｆ−ＢＬＭ＋ＣＭ１０１。

【0015】

図６Ａ〜図６Ｄは、マウス皮膚の代表的な様子（ヘマトキシリン・エオジン（Ｈ＆Ｅ）染色）を示す写真である。図６Ａ−ＰＢＳ；図６Ｂ−ＢＬＭベースライン；図６Ｃ−ＢＬＭ終了時；図６Ｄ ＣＭ１０１で治療したマウス（ＣＭ１０１による治療は疾患が確立された後に開始）。図６Ｅ〜図６Ｈは、マウス皮膚の代表的な様子（マッソントリクローム染色）を示す写真である。図６Ｅ−ＰＢＳ；図６Ｆ−ＢＬＭベースライン；図６Ｇ−ＢＬＭ終了時；図６Ｈ ＣＭ１０１で治療したマウス（ＣＭ１０１による治療は実験的ＳＳｃの確立時に開始）。

【0016】

図７Ａ及び図７Ｂは、ｈＣＭ１０１で染色したＩＰＦ患者の肺病変の写真である。

【0017】

図８は、ＩＰＦの予防モードにおける、抗エオタキシン−２モノクローナル抗体（ＣＭ１０１、１０、１００μｇ）、ＩｇＧ、及びＰＢＳ（溶媒）による治療のマウスコラーゲン濃度に対する効果（±標準誤差）を示すグラフである。＊ｐｖ≦０．０５。＊＊ ＊ｐｖ≦０．０１。（ＢＬＭ−ブレオマイシン）。

【0018】

図９は、ＩＰＦモデルの予防モードにおける、抗エオタキシン−２モノクローナル抗体（ＣＭ１０１、１０、１００μｇ）、ＩｇＧ、及びＰＢＳ（溶媒）による治療のマウス気管支肺胞液内の単核細胞に対する効果（±標準誤差）を示すグラフである。＊ｐｖ≦０．０５。（ＢＬＭ−ブレオマイシン）。

【0019】

図１０は、ＩＰＦの予防モードにおける、ＣＭ１０１（１０、１００μｇ）のＢＡＬ液中のエオタキシン２のレベルに対する影響（±標準誤差）を示すグラフである。＊ｐｖ≦０．０５。（ＢＬＭ−ブレオマイシン、溶媒−ＰＢＳ）。

【0020】

図１１は、ＩＰＦの治療モードにおける、抗エオタキシン−２モノクローナル抗体（ＣＭ１０１、５０μｇ）、ＩｇＧ、及びＰＢＳ（溶媒）による治療のマウス肺コラーゲン濃度に対する効果（±標準誤差）を示すグラフである。＊ｐｖ≦０．０５。＊＊ｐｖ≦０．０１。（ＢＬＭ−ブレオマイシン）。

【0021】

図１２Ａ及び図１２Ｂは、ＩＰＦモデルの治療モードにおける、抗エオタキシン−２モノクローナル抗体（ＣＭ１０１、５０μｇ）、ＩｇＧ、及びＰＢＳ（溶媒）による治療のマウス気管支肺胞液内の単核細胞（図１２Ａ）及び多形核細胞（図１２Ｂ）に対する効果（±標準誤差）を示すグラフである。＊ｐｖ≦０．０５。（ＢＬＭ−ブレオマイシン）。

【0022】

図１３Ａ〜図１３Ｈは、ヘマトキシリン・エオジン（Ｈ＆Ｅ）（それぞれ、図１３Ｄ及び図１３Ａ）又はマッソントリクローム染色（それぞれ、図１３Ｈ及び図１３Ｅ）で染色した、ｈＣＭ１０１又はＰＢＳで治療したマウスの肺病変の代表的な様子を示す写真である。Ｈ＆Ｅで染色した、表示日数の期間ブレオマイシン（ＢＬＭ）で治療したマウスの肺病変が図１３Ｂ及び図１３Ｃに示される。マッソントリクローム染色で染色した、表示日数の期間ブレオマイシン（ＢＬＭ）で治療したマウスの肺病変が図１３Ｆ及び図１３Ｇに示される。

【0023】

図１４は、ＩＰＦにおけるマウス肺コラーゲン濃度に対する、ピルフェニドン（１００ｍｇ／ｋｇ／日）と比較したＣＭ１０１（１００μｇ）の効果（±標準誤差）を示すグラフである。＊ｐｖ≦０．０５。（ＢＬＭ−ブレオマイシン）。

【0024】

図１５Ａ〜図１５Ｃは、ＩＰＦモデルにおける、マウス気管支肺胞液内の単核細胞（図１５Ａ）、多形核細胞（図１５Ｂ）、及び白血球（図１５Ｃ）に対する、ピルフェニドン（１００ｍｇ／ｋｇ／日）と比較したＣＭ１０１（１００μｇ）の効果（±標準誤差）を示すグラフである。＊ｐｖ≦０．０５。＊＊ｐｖ≦０．０１。（ＢＬＭ−ブレオマイシン）。

【0025】

図１６は、抗エオタキシン−２ｍＡｂ（ｈＣＭ１０１）のエオタキシン−２への結合を示すグラフである。結果は４０５ｎｍでの光学密度（ＯＤ）測定値として表わされる（±標準誤差）。ｐｖ≦０．０５。（ＢＳＡ−ウシ血清アルブミン）。

【0026】

図１７は、抗エオタキシン−２ｍＡｂ（ｈＣＭ１０１）のエオタキシン−１への結合を示すグラフである。結果は４０５ｎｍでの光学密度（ＯＤ）測定値として表わされる（±標準誤差）。ｐｖ≦０．０５。（ＢＳＡ−ウシ血清アルブミン）。

【0027】

図１８は、抗エオタキシン−２ｍＡｂ（ｈＣＭ１０１）のＲＡＮＴＥＳへの結合を示すグラフである。結果は４０５ｎｍでの光学密度（ＯＤ）測定値（±標準誤差）として表わされる。ｐｖ≦０．０５。（ＢＳＡ−ウシ血清アルブミン）。

【0028】

図１９は、抗エオタキシン−２ｍＡｂ（ｈＣＭ１０１）のＭＣＰ−３への結合を示すグラフである。結果は４０５ｎｍでの光学密度（ＯＤ）測定値（±標準誤差）として表わされる。ｐｖ≦０．０５。（ＢＳＡ−ウシ血清アルブミン）。

【0029】

図２０Ａは、エオタキシン１、エオタキシン２、ＲＡＮＴＥＳ、及びＭＣＰ−３のＮ−ループ中のｈＣＭ１０１の結合部位を図示したものである（タンパク質の構造を重ね合わせている）。図２０Ｂは、４つのタンパク質すべての推定結合エピトープのアミノ酸配列比較を示す。

【0030】

図２１Ａ〜図２１Ｈは、それぞれ、エオタキシン２（図２１Ａ及び図２１Ｅ）、エオタキシン１（図２１Ｂ及び図２１Ｆ）、ＲＡＮＴＥＳ（図２１Ｃ及び図２１Ｇ）、並びにＭＣＰ３（図２１Ｄ及び図２１Ｈ）に対するｈＣＭ１０１の類似結合部位を表わすエピトープマッピングのタンパク質表面及びリボンダイヤグラムを図示したものである。タンパク質表面は電荷に準じて円で囲まれ、太線は正電荷をもつ領域を示す。ターン部位を円で示し、Ｎ−ループ部位を楕円で示す。

【0031】

図２２Ａ及び図２２Ｂは、ｈＣＭ１０１（５、１０、及び５０μｇ）による全身性強皮症血清の代表的なゲル（図２２Ａ）並びにエオタキシン２レベルプルダウンのデンシトメトリー（図２２Ｂ）である。Ｏ．Ｄ．−光学密度。

【0032】

図２３は、ｈＣＭ１０１（２、１、０．５μｇ）によって検出されたエオタキシン１、ＲＡＮＴＥＳ、及びＭＣＰ−３の代表的なドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ゲル分析を示す。

【0033】

図２４は、エオタキシン１及びエオタキシン２の方向への好酸球細胞系の遊走に対するｈＣＭ１０１（１００、５０、及び１０ｎＭ）、ＩｇＧ（５０ｎＭ）、又はＰＢＳ（「０」）の効果（±標準誤差）を示すグラフである。＊ｐｖ≦０．０５。＊＊ｐｖ≦０．０１。

【0034】

図２５は、ＭＣＰ−３及びＲＡＮＴＥＳの方向への単球細胞系の遊走に対するｈＣＭ１０１（１００、５０、及び１０ｎＭ）、ＩｇＧ（５０ｎＭ）、又はＰＢＳ（「０」）の効果（±標準誤差）を示すグラフである。＊ｐｖ≦０．０５。

【0035】

図２６Ａは、ＭＣＰ−３及びＲＡＮＴＥＳの方向へのＣＤ１４＋細胞（全身性強皮症患者から単離）の遊走に対するｈＣＭ１０１（１００及び１０ｎＭ）、ＩｇＧ（５０ｎＭ）、又はＰＢＳ（「０」）の効果（±標準誤差）を示すグラフである。＊ｐｖ≦０．０５。

【0036】

図２６Ｂは、エオタキシン１、２、及びＲＡＮＴＥＳの方向へのＣＤ１４−細胞（全身性強皮症患者から単離）の遊走に対するｈＣＭ１０１（１００及び１０ｎＭ）、ＩｇＧ（５０ｎＭ）、又はＰＢＳ（「０」）の効果（±標準誤差）を示すグラフである。＊ｐｖ≦０．０５。＊＊ｐｖ≦０．０１。

【0037】

図２７Ａは、エオタキシン２の方向への線維芽細胞系の遊走に対するｈＣＭ１０１（１００ｎＭ）又はＰＢＳ（ＥＯＸ−２）の効果（±標準誤差）を示すグラフである。＊＊ｐｖ≦０．０１。図２７Ｂ〜図２７Ｄは、図２７Ａに示した、対照（図２７Ｂ）、ＰＢＳ処理（図２７Ｃ）、及びｈＣＭ１０１処理（図２７Ｄ）線維芽細胞の代表的な図写真である。

【0038】

図２８Ａは、エオタキシン１の方向への線維芽細胞系の遊走に対するｈＣＭ１０１（１００ｎＭ）又はＰＢＳ（ＥＯＸ−１）の効果（±標準誤差）を示すグラフである。＊ｐｖ≦０．０５。図２８Ｂ〜図２８Ｄは、図２８Ａに示した、対照（図２８Ｂ）、ＰＢＳ処理（図２８Ｃ）、及びｈＣＭ１０１処理（図２８Ｄ）線維芽細胞の代表的な写真である。

【0039】

図２９Ａ〜図２９Ｃは、筋線維芽細胞転換の指標としてのα−ＳＭＡの細胞内発現に対するｈＣＭ１０１の効果を示す代表的なＦＡＣＳ図である。ｐｖ≦０．０５。図２９Ａは硬皮症患者から得た血清中の４４％のＳＭＡ陽性細胞を示し、図２９ＢはｈＣＭ１０１（１０μｇ／ｍｌ）で治療した血硬皮症患者から得た血清中の２２％のＳＭＡ陽性細胞を示し、及び図２９ＣはｈＣＭ１０１（５μｇ／ｍｌ）で治療した硬皮症患者から得た血清中の２７％のＳＭＡ陽性細胞を示す。

【0040】

図３０Ａ及び図３０Ｂは、好酸球における、ＣＭ１０１（１００、５０、１０、５、又は０ｎＭ）の影響下の時間分解カルシウム活性化指数（図３０Ａ）及びＣＭ１０１濃度に応じたエオタキシン２誘導カルシウムシグナルの変動（図３０Ｂ）を示すグラフである。ｐｖ≦０．０５。

【0041】

図３１は、ｈＣＭ１０１とインキュベーションした後のＴ細胞の増殖を示すグラフである。結果は刺激指数で表わされている。

【0042】

図３２は、エピスクリーン（Ｅｐｉｓｃｒｅｅｎ）における臨床的免疫原性（抗タンパク質治療用抗体反応）とＴ細胞増殖との間の相関を示すグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0043】

本発明の態様の１つによって、本発明は、線維性疾患、自己免疫性炎症性疾患、単球関連疾患、又はアレルギー・アトピー性疾患の治療で用いる少なくとも２つのＣＣＲ３結合ケモカインに結合する単離多重特異性抗体、又はそのいずれの抗原結合断片を提供する。

【0044】

幾つかの実施形態では、本発明による抗体はモノクローナル抗体である。その他の実施形態では、本発明によるモノクローナル抗体は、キメラ抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、又は完全ヒト化抗体である。

【0045】

さらなる実施形態では、本発明に従って使用される単離多重特異性抗体は、その抗原結合断片が、Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、抗原に結合可能な重鎖可変領域、抗原に結合可能な軽鎖可変領域、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）_２’、及びそれらのいずれの組み合わせからなる群より選択される。

【0046】

幾つかの実施形態では、本明細書において定義される線維性疾患は、硬皮症、特発性肺線維症（ＩＰＦ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、糸球体硬化症、肝硬変、及びメタボリックシンドロームからなる群より選択される。

【0047】

その他の実施形態では、本明細書において定義される自己免疫性炎症性疾患は、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、関節リウマチ、乾癬、大腸炎、ブドウ膜炎、多発性硬化症、及びタイプＩ糖尿病からなる群より選択される。

【0048】

さらなる実施形態では、本発明による単球関連疾患はアテローム性動脈硬化症である。

【0049】

よりさらなる実施形態では、本明細書において定義されるアレルギー・アトピー性疾患は、喘息、アトピー性皮膚炎、蕁麻疹、及び過敏症反応からなる群より選択される。

【0050】

幾つかの実施形態では、本発明に従って使用される単離多重特異性抗体は、少なくとも２つのＣＣＲ３結合ケモカインが、エオタキシン１、エオタキシン−２、ＲＡＮＴＥＳ、及びＭＣＰ−３からなる群より選択される。

【0051】

その他の実施形態では、本発明に従って使用される単離多重特異性抗体は、エオタキシン１、エオタキシン−２、ＲＡＮＴＥＳ、及びＭＣＰ−３に結合する。

【0052】

さらなる実施形態では、本発明において定義されるように使用される単離多重特異性抗体は、ＣＣＲ３、ＣＣＲ１、ＣＣＲ２、及びＣＣＲ５を発現する細胞の遊走性を弱める。

【0053】

幾つかの実施形態では、本明細書において定義される抗体は、
ａ）配列番号５で表わされるアミノ酸配列を含む相補性決定領域ＶＨ ＣＤＲ１又はその変型、
ｂ）配列番号６で表わされるアミノ酸配列を含む相補性決定領域ＶＨ ＣＤＲ２又はその変型、及び
ｃ）配列番号７で表わされるアミノ酸配列を含む相補性決定領域ＶＨ ＣＤＲ３又はその変型を含む重鎖可変領域、並びに
ｄ）配列番号８で表わされるアミノ酸配列を含む相補性決定領域ＶＫ ＣＤＲ１又はその変型、
ｅ）配列番号９で表わされるアミノ酸配列を含む相補性決定領域ＶＫ ＣＤＲ２又はその変型、及び
ｆ）配列番号１０で表わされるアミノ酸配列を含む相補性決定領域ＶＫ ＣＤＲ３又はその変型を含む軽鎖可変領域
を含む完全ヒト化抗体である。

【0054】

その他の実施形態では、本発明による抗体は、配列番号３で表わされる重鎖可変領域又はその変型及び配列番号４で表わされる軽鎖可変領域又はその変型を含む完全ヒト化抗体である。

【0055】

別の１つの本発明の態様では、本発明は、ＣＣＲ３−結合ケモカインのＮ−ループ領域の立体構造エピトープに結合する単離抗体を提供し、前記立体構造エピトープは、前記ＣＣＲ３結合ケモカインのアミノ酸配列のアミノ酸位置１４と２４の間に位置する正電荷をもつアミノ酸残基の比較的高度な集中を特徴とする。

【0056】

幾つかの実施形態では、本明細書において定義される立体構造エピトープは、前記ＣＣＲ３−結合ケモカインのアミノ酸配列のアミノ酸位置１４と２４の間に少なくとも３つの正電荷をもつアミノ酸残基を含む。

【0057】

その他の実施形態では、本明細書において定義される正電荷をもつアミノ酸残基は、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、及びＨｉｓからなる群より選択される。

【0058】

さらなる実施形態では、本明細書において定義される立体構造エピトープは、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、又は配列番号１９で表わされるアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を含む。

【0059】

さらに別の１つの本発明の態様では、本発明は、少なくとも２つのＣＣＲ３結合ケモカインに結合する単離多重特異性抗体又はそのいずれの抗原結合断片を提供し、前記抗体は、完全ヒト化抗体であり、
ａ）配列番号５で表わされるアミノ酸配列を含む相補性決定領域ＶＨ ＣＤＲ１又はその変型、
ｂ）配列番号６で表わされるアミノ酸配列を含む相補性決定領域ＶＨ ＣＤＲ２又はその変型、及び
ｃ）配列番号７で表わされるアミノ酸配列を含む相補性決定領域ＶＨ ＣＤＲ３又はその変型を含む重鎖可変領域、並びに
ｄ）配列番号８で表わされるアミノ酸配列を含む相補性決定領域ＶＫ ＣＤＲ１又はその変型、
ｅ）配列番号９で表わされるアミノ酸配列を含む相補性決定領域ＶＫ ＣＤＲ２又はその変型、及び
ｆ）配列番号１０で表わされるアミノ酸配列を含む相補性決定領域ＶＫ ＣＤＲ３又はその変型を含む軽鎖可変領域
を含む。

【0060】

本発明は、本明細書において定義される抗体をコードする核酸分子をさらに提供する。

【0061】

本発明の態様のさらに別の１つによって、本発明は、少なくとも２つのＣＣＲ３結合ケモカインに結合するヒト化抗体をコードする核酸分子を提供し、前記核酸分子は、配列番号１及び配列番号２で表わされる配列を含む。

【0062】

本発明は、本発明による核酸分子を含む発現ベクターをさらに提供する。

【0063】

本発明の態様のさらに別の１つによって、本発明は、本発明による核酸分子を含む宿主細胞を提供する。

【0064】

本発明は、本明細書において定義される抗体及び薬理学的に許容される担体を含む医薬組成物をさらに提供する。

【0065】

幾つかの実施形態では、本発明による医薬組成物は、線維性疾患、自己免疫性炎症性疾患、単球関連疾患、又はアレルギー・アトピー性疾患の治療に用いられる。

【0066】

本発明は、本明細書において定義される抗体又は医薬組成物の治療上許容される量を、それを必要としている患者に投与することを含む、線維性疾患、自己免疫性炎症性疾患、単球関連疾患、又はアレルギー・アトピー性疾患を治療する方法をさらに提供する。

【0067】

本発明の態様のさらに別の１つによって、本発明は、線維性疾患、自己免疫性炎症性疾患、単球関連疾患、又はアレルギー・アトピー性疾患における、ＣＣＲ３、ＣＣＲ１、ＣＣＲ２、及びＣＣＲ５を発現する細胞の遊走性を弱める方法を提供し、本明細書において定義される抗体又は医薬組成物の治療上許容される量を、前記疾患の１つを患う患者に投与することを含む方法。

【0068】

本発明は、少なくとも１つの、ＣＣＲ３、ＣＣＲ１、ＣＣＲ２、又はＣＣＲ５を発現する細胞の遊走性を弱めることができる抗体をスクリーニング及び特定する方法をさらに提供し、前記方法は、
ａ．ＣＣＲ３結合ケモカインに対する抗体を得ることと、
ｂ．ＣＣＲ３結合ケモカインのＮ−ループ領域の、前記ＣＣＲ３結合ケモカインのアミノ酸配列のアミノ酸位置１４と２４の間に位置する正電荷をもつアミノ酸残基の比較的高度な集中を特徴とする立体構造エピトープへの前記抗体の結合を評価すること、
ｃ．前記立体構造エピトープに結合する抗体を選択することを含み、
そこにおいて、前記立体構造エピトープに特異的に結合する抗体は、ＣＣＲ３、ＣＣＲ１、ＣＣＲ２、及びＣＣＲ５を発現する細胞の遊走性を効率的に弱めることができる。

【0069】

幾つかの実施形態では、少なくとも１つの、ＣＣＲ３、ＣＣＲ１、ＣＣＲ２、又はＣＣＲ５を発現する細胞の遊走性を弱めることができる抗体をスクリーニング及び特定する方法は、前記立体構造エピトープが、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、及び配列番号１９で表わされるアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。

【0070】

別の態様では、本発明は、立体構造エピトープを含むＣＣＲ３結合ケモカインの単離Ｎ−ループ領域を提供し、前記ＣＣＲ３結合ケモカインに対する抗体を作り出すため、前記立体構造エピトープは、前記ＣＣＲ３結合ケモカインのアミノ酸配列のアミノ酸位置１４と２４の間に位置する正電荷をもつアミノ酸残基の比較的高度な集中を特徴とする。

【0071】

ある実施形態では、前記単離Ｎ−ループ領域は、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、及び配列番号１９で表わされるアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。

【0072】

本発明は、エオタキシン２（ＣＣＬ２４）ポリペプチドの立体構造エピトープに対する抗体が、エオタキシン２にも、さらなる化学誘引物質、炎症性ＣＣＲ３結合ケモカインであるエオタキシン１、ＲＡＮＴＥＳ、及びＭＣＰ−３にも結合し、それらの活性を阻害するという驚くべき発見に基づく。よって、本発明は、細胞の走化性の原因となるケモカインの少なくとも１つを中和することによって、免疫細胞の遊走を防ぐことができる独特の完全ヒト化モノクローナル抗体（本明細書においてｈＣＭ１０１と呼ぶ）を提供する。抗体ｈＣＭ１０１は、これらのＣＣＲ３−結合ケモカイン（幾つかはさらなる受容体に結合する）の、それぞれの受容体への結合を阻害し、ＣＣＲ３、ＣＣＲ１、ＣＣＲ２、及びＣＣＲ５を発現する細胞（好酸球及び単球細胞系並びにヒト線維芽細胞）の遊走性を機能的に弱める。

【0073】

理論に拘束されるものではないが、これらの独特の、非常に優れた抗体の性質は、多重特異性であること、すなわち、数個のケモカインを標的にすること、抗体の有効性及びケモカイン機能の機能重複性を克服する潜在能力を説明しうる。したがって、本抗体は、アレルギー性疾患及び線維性疾患を含む、慢性の炎症に関連し、免疫細胞の遊走及び浸潤を特徴とする自己免疫疾患の治療に有用でありうる。

【0074】

よって、本発明は、線維性疾患、自己免疫性炎症性疾患、単球関連疾患、又はアレルギー・アトピー性疾患の治療で用いる少なくとも２つのＣＣＲ３結合ケモカインに結合する単離多重特異性抗体、又はそのいずれの抗原結合断片を提供する。

【0075】

本明細書で使用される「多重特異性の（ｐｏｌｙｓｐｅｃｉｆｉｃ）（又は多重特異性の（ｐｏｌｙ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ））抗体」という用語は、複数の抗原を認識できる多重反応性抗体を指し、具体的に本発明は、数個の異なる炎症性ＣＣＲ３結合ケモカインを認識できる多重特異性抗体を包含する。本発明の抗体はエオタキシン２に対して作り出され、後になって、さらなるケモカイン（例えば、エオタキシン１、ＲＡＮＴＥＳ、及びＭＣＰ−３）に結合し、それらの活性を効果的に弱めることがわかった。ある実施形態では、本発明の多重特異性抗体は、その多種ケモカインに同様の親和性で結合する。その他の実施形態では、抗体は、その多種ケモカインに対して異なる結合親和力をもつ。１つの特定の実施形態では、抗体は、他の試験したケモカインと比べてエオタキシン２に対してのほうが高い親和性で結合する。どうやら本発明の多重特異性抗体は、これらの炎症性ＣＣＲ３結合ケモカインの交差反応性エピトープを認識するようである。

【0076】

ＣＣＲ３（Ｃ−Ｃケモカイン受容体タイプ３）は、ヒトではＣＣＲ３遺伝子によってコードされるタンパク質である。最近、ＣＣＲ３はＣＤ１９３（ＣＤ分類１９３）に指定された。この遺伝子によってコードされるタンパク質は、Ｃ−Ｃタイプケモカインの受容体である。その受容体は、好酸球並びにマクロファージ及び内皮細胞を含む幅広い細胞タイプによって発現される７回膜貫通Ｇタンパク質共役受容体である。この受容体は、エオタキシン（エオタキシン１又はＣＣＬ１１とも呼ばれる）、エオタキシン−２（ＣＣＬ２４）、エオタキシン−３（ＣＣＬ２６）、ＭＣＰ−３（ＣＣＬ７）、ＭＣＰ−４（ＣＣＬ１３）、及びＲＡＮＴＥＳ（ＣＣＬ５）を含む多様なケモカインと結合して反応する。

【0077】

本明細書で定義される「ＣＣＲ３結合ケモカイン」という用語は、タンパク質ＣＣＲ３に結合するいずれのケモカインを指し、例えば、エオタキシン１、エオタキシン−２、エオタキシン−３、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＣＰ−３、及びＭＣＰ−４を包含するが、これらに限定されない。幾つかのＣＣＲ３結合ケモカインはさらなるケモカイン受容体、例えば、ＣＣＲ１、ＣＣＲ２、又はＣＣＲ５にも結合することが強調されるべきである。

【0078】

よって、幾つかの実施形態では、本発明に使用される単離多重特異性抗体は、少なくとも２つのＣＣＲ３結合ケモカインが、エオタキシン１、エオタキシン−２、ＲＡＮＴＥＳ、及びＭＣＰ−３からなる群より選択される。

【0079】

「エオタキシン２」（好酸球走化性タンパク質２）、「ＣＣＬ２４」（ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド２４）、又は「ＭＰＩＦ−２」（骨髄球系前駆細胞阻止因子２）という用語は互換可能に使用され、ヒト染色体７に位置するヒトＣＣＬ２４遺伝子によってコードされるＣＣケモカインファミリーに属するサイトカインを指す。ＣＣＬ２４はケモカイン受容体ＣＣＲ３と相互作用する。ＣＣＬ２４活性としては、好酸球、好塩基球、Ｔリンパ球、及び好中球における走化性の誘導、並びに内皮細胞及び平滑筋細胞での血管新生反応及び遊走反応の誘導が挙げられる。エオタキシン２のアミノ酸配列（Ｎ末端シグナルペプチドを含まない）は配列番号１１で表わされる。

【0080】

上述のように、本発明に包含されるさらなるＣＣＲ３結合ケモカインは、ほんの数例を挙げれば、エオタキシン１、エオタキシン−３、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＣＰ−３、及びＭＣＰ−４である。

【0081】

本明細書で定義される「エオタキシン１」（Ｃ−Ｃモチーフケモカイン１１及び好酸球走化性タンパク質としても知られる）という用語は、ヒトではＣＣＬ１１遺伝子によってコードされるタンパク質を指す。エオタキシン１は好酸球の走化性を誘導することによって好酸球を選択的に動員し、したがって、アレルギー反応に関係する。エオタキシン１の効果は、それが、ＣＣＲ２、ＣＣＲ３、及びＣＣＲ５を含むケモカイン受容体として知られるＧタンパク質結合受容体に結合することによって媒介される。ヒトエオタキシン１のアミノ酸配列（Ｎ末端シグナルペプチドを含まない）は、例えば、配列番号１２で表わされる。

【0082】

本明細書で定義される「ＲＡＮＴＥＳ」（ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｏｎ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｎｏｒｍａｌ Ｔ ｃｅｌｌ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ａｎｄ ｓｅｃｒｅｔｅｄ）という用語は、ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド５（ＣＣＬ５）とも呼ばれ、ヒトではＣＣＬ５遺伝子によってコードされるタンパク質を指す。ＲＡＮＴＥＳはＴ細胞、好酸球、及び好塩基球の走化性サイトカイン又はケモカインに分類される８ｋＤａタンパク質であり、白血球を炎症部位に動員するのに積極的な役割を担う。ＲＡＮＴＥＳはまた、Ｔ細胞によって放出される特定のサイトカイン（すなわち、ＩＬ−２及びＩＦＮ−ガンマ）と協力して、ある種のナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の増殖及び活性化を誘導してＣＨＡＫ（ＣＣ−ケモカイン活性化キラー）細胞を形成する。ＲＡＮＴＥＳは、中でもＣＣＲ３受容体に結合する。ヒトＲＡＮＴＥＳのアミノ酸配列（Ｎ末端シグナルペプチドを含まない）は、例えば、配列番号１３で表わされる。

【0083】

本明細書で定義される「「ＭＣＰ−３」（単球特異的ケモカイン３）という用語は、ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド７（ＣＣＬ７）とも呼ばれ、ＣＣケモカインとして知られるケモカインのサブファミリーに分類される。ＭＣＰ−３は単球を特異的に誘引し、マクロファージ機能を調節する。ＭＣＰ−３はある種の腫瘍細胞株及びマクロファージによって産生される。このケモカインはヒトでは染色体１７、多くの他のＣＣケモカインを含む大きなクラスターに位置する。ＲＡＮＴＥＳは、中でもＣＣＲ３受容体に結合する。ヒトＭＣＰ−３のアミノ酸配列（Ｎ末端シグナルペプチドを含まない）は、例えば、配列番号１４で表わされる。

【0084】

幾つかの実施形態では、本発明に使用される単離多重特異性抗体は、エオタキシン１、エオタキシン−２、ＲＡＮＴＥＳ、及びＭＣＰ−３に結合する。

【0085】

他の特定の実施形態では、本発明に使用される単離多重特異性抗体は、ＣＣＲ３、ＣＣＲ１、ＣＣＲ２、及びＣＣＲ５を発現する細胞の遊走性を弱める。

【0086】

ＣＣＲ３、ＣＣＲ１、ＣＣＲ２、及びＣＣＲ５を発現する細胞の「遊走性を弱める」という語によって、本発明の抗体が、走化性アッセイで測定できるように細胞遊走を減じることが意味される。そのような走化性アッセイは当該技術分野において周知である。例示的な走化性アッセイは下記の実施例の項に示される。遊走性を弱めることとは、未処理細胞と比較して、細胞遊走のいずれの統計的に有意な減少を意味する。例えば、遊走細胞の数の少なくとも５０％の減少。

【0087】

下記の実施例の項に例示されるように、本発明の抗体は、数個の炎症性ケモカインに結合でき、細胞動員又は走化性（例えば、好酸球又は単球又は線維芽細胞の動員又は走化性）の阻害、線維芽細胞の筋芽細胞への転換の阻害、及び細胞活性化の減少などのその多様な活性を阻害できる。したがって、これらの抗体は、その有害な症状又は影響が少なくとも部分的に炎症性ＣＣＲ３ケモカインによって媒介される疾患の治療に有用であることができる。

【0088】

具体的には、下記の例に示されるように、本発明の抗体は、線維性疾患に分類される特発性肺線維症（ＩＰＦ）及び硬皮症のモデルの幾つかの特徴の著しい減少を引き起こした。

【0089】

線維化は、修復又は反応過程における臓器又は組織の過剰な線維性結合組織の形成である。これは、反応性、良性、又は病的状態でありうる。線維化は、線維組織の過剰な沈着の病的状態及び治癒中の結合組織沈着の過程を表わすのに用いられうる。よって本明細書では、「線維性疾患」という用語は、線維性結合組織が正常な平滑筋又は他の正常な器官組織に広がったり、取って代わったりする異常な状態に関する。線維化は心臓、肺、腹膜、皮膚、又は腎臓を冒しうる。線維性疾患の非限定的な例としては、硬皮症、特発性肺線維症（ＩＰＦ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、糸球体硬化症、肝硬変、及びメタボリックシンドロームが挙げられる。

【0090】

よって幾つかの実施形態では、線維性疾患は、硬皮症、特発性肺線維症（ＩＰＦ）、非アルコール性脂肪性肝炎、糸球体硬化症、肝硬変、及びメタボリックシンドロームからなる群より選択される。

【0091】

本明細書で定義される「強皮症」という用語は、全身性強皮症としても知られ、皮膚（ｓｋｉｎ）（皮膚（ｄｅｒｍａ））の硬化（ｈａｒｄｅｎｉｎｇ）（硬化（ｓｃｌｅｒｏ））を特徴とする慢性の全身性自己免疫疾患を指す。より重症な型では、強皮症は内部臓器も侵す。強皮症は限局性強皮症であることがあり、主に手、腕、及び顔に影響を及ぼす皮膚兆候を含む。或いは強皮症はびまん性硬皮症であることがある。急速に進行し、皮膚の大部分並びに１つ以上の内部臓器、高い頻度で腎臓、食道、心臓、及び／又は肺に影響を及ぼす。この型の硬皮症は日常生活にかなり支障を来す可能性がある。硬皮症自体の治療はなく、器官系合併症が個別に治療される。

【0092】

「特発性肺線維症」（ＩＰＦ）という用語は、進行性の呼吸困難及び致死の可能性の高い酸素欠乏又は右心不全を伴う肺胞壁の進行性線維症を指す。急性の型はハンマン・リッチ症候群と呼ばれる。

【0093】

本明細書で使用される「炎症」という用語は、病原体、（例えば、やけど、外傷、新生物に起因する）損傷細胞又は化学薬品、熱、若しくは低温などの刺激物などの有害な刺激に対する免疫系の複合的な生物学的反応を指す。「炎症性疾患（ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｄｉｓｅａｓｅ）」又は「炎症性疾患（ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｄｉｓｏｒｄｅｒ）」という用語は、炎症に関連する疾患を指し、例えば、自己免疫性炎症性疾患が挙げられるがこれに限定されない。

【0094】

本明細書で使用される自己免疫疾患という用語は、体内に正常に存在する物質及び組織に対する、体の過度に活動的な免疫反応から生じる病態を表わす。免疫系が病原体と体のある部分と誤り、それを攻撃する。これは、ある臓器に限られることもあり、肺と腎臓の両方の基底膜を侵しうる異なる箇所の特定の組織に関わることもある。自己免疫疾患としては、例えば、関節リウマチ、多発性硬化症、セリアック病、１型糖尿病（ＩＤＤＭ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、シェーグレン症候群、チャーグ・ストラウス症候群、橋本甲状腺炎、グレーブス病、乾癬、炎症性腸疾患（潰瘍性大腸炎及びクローン病）、硬皮症、及び天疱瘡が挙げられる。

【0095】

本明細書で使用される「自己免疫性炎症性疾患」という用語は、炎症の増加も特徴する自分の体の組織を攻撃する免疫系に起因する障害に関する。自己免疫性炎症性疾患の非限定的な例としては、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、関節リウマチ、乾癬、大腸炎、ブドウ膜炎、多発性硬化症、及びタイプＩ糖尿病が挙げられる。

【0096】

したがって幾つかの実施形態では、本明細書で定義される自己免疫性炎症性疾患は、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、関節リウマチ、乾癬、大腸炎、ブドウ膜炎、多発性硬化症、及びタイプＩ糖尿病からなる群より選択される。

【0097】

本明細書で使用される「単球関連疾患」という用語は、単球及びマクロファージの機能を侵し、細胞内の残屑の蓄積を引き起こし、例えば、脂質蓄積症（ゴーシェ病及びニーマン・ピック病など）又はアテローム性動脈硬化症につながる遺伝子異常に関する。慢性の感染症、自己免疫障害、血液疾患、及びある種のがんに応答して、血液中の単球の増加（単球増加症）が起こる。組織でのマクロファージ増殖が、感染症、サルコイドーシス、及びランゲルハンス細胞組織球症に応答して起こりうる。

【0098】

さらなる実施形態では、本発明による単球関連疾患はアテローム性動脈硬化症である。

【0099】

本明細書で使用される「アテローム性動脈硬化症」（動脈硬化性血管疾患又はＡＳＶＤとしても知られる）という用語は、コレステロールなどの脂肪質の蓄積の結果として動脈壁が厚くなる病態である。この過程は、主にマクロファージの蓄積に起因し、低密度リポタンパク質によって進められ、機能的な高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）によってマクロファージから脂肪及びコレステロールが充分に除去されることがない動脈の壁における慢性の炎症反応の結果である。この動脈の硬化及び閉塞は、動脈内の複数のプラークの形成によって引き起こされる。

【0100】

本明細書で使用される「アレルギー・アトピー性疾患」という用語は、ある種のアレルゲンに対する過感受性の遺伝的素因をもつ人を苦しませるアレルギーの型に関する。アレルギー・アトピー性疾患の非限定的な例としては、喘息、アトピー性皮膚炎、花粉症、蕁麻疹、及び過敏症反応が挙げられる。

【0101】

よって、よりさらなる実施形態では、本発明によるアレルギー・アトピー性疾患は、喘息、アトピー性皮膚炎、蕁麻疹、及び過敏症反応からなる群より選択される。

【0102】

上述のように、本発明は、少なくとも２つの炎症性ＣＣＲ３結合ケモカインに結合する単離多重特異性抗体を提供する。「抗体」という用語は、抗原、すなわち炎症性ＣＣＲ３結合ケモカインに特異的に結合して認識する免疫グロブリン遺伝子によってコードされるポリペプチド又はその機能的断片を指す。具体的には、本発明の抗体は、少なくともエオタキシン２、エオタキシン１、ＲＡＮＴＥＳ、及びＭＣＰ−３に結合して認識する。

【0103】

好ましい実施形態では、本発明の抗体はモノクローナル抗体である。本明細書で定義される「モノクローナル抗体」、「モノクローナル抗体」、又は「ｍＡｂ」という用語は、実質的に均質な抗体の集団を指し、すなわち、その集団を含むそれぞれの抗体は、少量で存在しうる自然に起こる可能性のある変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は単一の抗原決定部位に対する。

【0104】

モノクローナル抗体は、いずれの当該技術分野において公知の方法で調製及び生成されうる。例えば、モノクローナル抗体は、免疫動物（例えば、ラット又はマウス）の脾臓又はリンパ節から取られたＢ細胞から、ハイブリッド細胞の成長に好ましい条件下で不死化Ｂ細胞と融合することによって調製されうる。

【0105】

マウスの免疫付与は、例えば、国際公開第２０１０／０８６８５４号に記載のように実施されうる。手短に、マウスの免疫付与は、例えば、完全フロイントアジュバントで乳化された所望の抗原、すなわち、ＣＣＲ３結合ケモカイン、例えば、エオタキシン２、又はＮ−ループの立体構造エピトープを含むＣＣＲ３結合ケモカインの断片（例えば、５０μｇ）を用いて皮下（ｓ．ｃ．）で一次免疫付与することによって実施されうる。次いで、不完全フロイントアジュバントで乳化された抗原（例えば、５０μｇ）を用いた２回の皮下ブースター注射が２週毎に投与される。中和抗体価が最も高いマウスは、脾臓摘出前の４日、ＰＢＳ中の抗原（例えば、５μｇ） のさらなる静脈内（ｉ．ｖ．）ブースト注射を受ける。

【0106】

最後のブースター注射の後、（例えば、４日）、中和抗体価が最も高いマウスの脾臓が摘出され、以前の記載（Ｋｏｈｌｅｒ， Ｇ． ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ， Ｃ． （１９７５） Ｎａｔｕｒｅ ２５６： ４９５−４９７）のように、脾細胞はポリエチレングリコールを用いてマウス骨髄腫細胞（例えば、ＮＳ０細胞）に融合される。融合した後、ハイブリドーマ細胞はＨＡＴ（ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン）培地中で培養することによって選択される。次に、細胞クローンは、例えば、下記のＥＬＩＳＡアッセイを用いて特異的な抗体産生についてスクリーニングされる。

【0107】

モノクローナル抗体の精製は例えば、親和性クロマトグラフィー、すなわち、特異的エピトープが結合されたアフィニティーカラムを用いることに基づきうる。

【0108】

当該技術分野において公知であるように、例示的な抗体構造単位は四量体を含む。四量体は各々、２つのポリペプチド鎖の同一ペアから成り、各ペアは１つの「軽鎖」及び１つの「重鎖」をもつ。各鎖のＮ末端は、抗原（又はエピトープ）認識に主として関与する約１００〜１１０又はそれより多いアミノ酸の可変領域を定義する。

【0109】

よって、「重鎖可変領域」（ＶＨ）及び「軽鎖可変領域」（ＶＬ）という用語はこれらの重鎖及び軽鎖をそれぞれ指す。より具体的に、可変領域は、超可変領域及びフレームワーク（ＦＲ）領域に細分される。超可変領域は、所与の位置において最も共通するアミノ酸に比較して、その位置における異なるアミノ酸の比率が高い。より安定なアミノ酸配列をもつ４つのＦＲ領域は超可変領域を分割する。超可変領域は抗原の表面の部分に直接接触する。この理由のため、本明細書では、超可変領域は「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」と呼ばれる。

【0110】

Ｎ末端からＣ末端に、軽鎖及び重鎖は両方とも領域ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、及びＦＲ４を含む。ＣＤＲは抗原の主としてエピトープへの結合に関与する。各鎖のＣＤＲは典型的にＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３と呼ばれ、Ｎ末端から順に番号がつけられ、通常特定のＣＤＲが位置する鎖で識別される。

【0111】

よって、相補性決定領域ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３は、抗体の重鎖のＮ末端からの３つの相補性決定領域を指し、相補性決定領域ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３は、抗体の軽鎖のＮ末端からの３つの相補性決定領域を指す。

【0112】

幾つかの実施形態では、本発明による単離多重特異性モノクローナル抗体は、キメラ抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、又は完全ヒト化抗体である。

【0113】

本明細書で定義される「キメラ」抗体という用語は、重鎖及び／又は軽鎖の一部が特定の種に由来し、一方で鎖の残部が別の種に由来する抗体、並びに同じ生体活性を示すそのような抗体の断片を指す。

【0114】

キメラ抗体は、例えば、下記のように、いずれの当該技術分野において公知の方法によって調製されうる。

【0115】

マウス−ヒトキメラ抗体は、抗体可変領域をコードするマウスＶ_Ｈ及びＶ_Ｌ遺伝子を増幅及びクローニングし、続いてマウス−ヒトキメラ抗体を発現することによって調製されうる。この目的のために、トータルＲＮＡは所望の特徴をもつ抗体を分泌することが示されているマウス抗−エオタキシン２ハイブリドーマ細胞から単離され、ｃＤＮＡは、オリゴ（ｄＴ）_１５プライマー、Ｍ−ＭＬＶ、及びＡＭＶ逆転写酵素を用いて合成される。重鎖及び軽鎖可変遺伝子（Ｖ_Ｈ及びＶ_Ｌ）の増幅は、基本的にＢｅｎｈａｒ ａｎｄ Ｒｅｉｔｅｒ（Ｂｅｎｈａｒ， Ｉ． ａｎｄ Ｒｅｉｔｅｒ， Ｙ． （２００２） Ｃｕｒｒ． Ｐｒｏｔｏｃ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｃｈａｐｔｅｒ １０： Ｕｎｉｔ １０ １９Ｂ）に記載のように、各遺伝子のフレームワーク１の５’末端及び３’末端の定常領域（それぞれ、Ｃ_Ｈ１又はＣ_ｋ）を対象にするプライマーのパネルを用いて実行されうる。

【0116】

次いで、可変遺伝子は、例えば、ｐＣＭＶをベースとする抗体発現ベクターにクローニングするために両端に制限酵素認識部位を導入する非縮重プライマーを用いて再び増幅される。

【0117】

増幅された重鎖可変遺伝子及び軽鎖可変遺伝子は別個に精製され、切断され、適切な哺乳類の全長Ｉｇ発現ベクターにクローニングされて、各鎖に対応するシグナルペプチド及び定常遺伝子が与えられ、ＩｇＧ１／ｋマウスヒトキメラ抗体発現をもたらす。

【0118】

大量の抗体を調製するために、細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）をキメラ抗体の重鎖及び軽鎖の両方を含有するＩｇ発現ベクターでトランスフェクションすることによって抗体を発現する安定な細胞系が調製できる。次に、抗エオタキシン２（又は抗体の産生に使用されるいずれの他のＣＣＲ３−結合ケモカイン）抗体を高レベルで作るクローンが、いずれの当該技術分野において公知の方法によって、例えば本明細書において下記に詳説されるように、ＣＣＲ３結合ケモカイン特異的ＥＬＩＳＡアッセイによって試験されるように上清中の抗体レベルに基づいて選択及び拡張されうる。

【0119】

「ヒト化」抗体という用語は、ＣＤＲ及び随意にさらなる関連位置に非ヒト免疫グロブリン由来する最小配列をもつヒト由来免疫グロブリンフレームワークを含有する非ヒト（例えば、マウス）抗体の形を伝統的に指す。通例、ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域からの残基が、所望の特異性、親和性、及び活性をもつ、マウス、ラット、ウサギ、又はヒト以外の霊長類などの非ヒト種（ドナー抗体）の超可変領域からの残基によって置換されたヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。

【0120】

本明細書で使用される「完全ヒト化」抗体という用語は、ヒト配列のみをもつように設計された抗体に関する。本発明の完全ヒト化抗体は、患者における抗体の免疫原性を最小限にするＣｏｍｐｏｓｉｔｅ Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（商標）技術を用いて調製された。このヒト化技術では、関係のないヒト抗体の可変（Ｖ）領域に由来する複数の配列断片が、開始抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）用のアクセプターとして用いられる。ヒト配列断片を注意深く選択すること及びコンピュータツールを適用することを通して、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープが回避され、免疫原性のリスクが標準的なヒト化抗体と比較して低減される一方で抗体親和性及び特異性は維持される。そのような抗体はヒト配列のみを含み、よって「完全ヒト化」と定義される。

【0121】

本明細書で使用される「ヒト抗体」という用語は、ヒトによって作られる抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列をもち、及び／又は当該技術分野において公知であるヒト抗体を作る技法のいずれを用いて作られてきた抗体を指す。この定義は非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を特に除外する。

【0122】

ヒト化抗体及びヒト抗体の調製は、当該技術分野において周知である。抗体はファージディスプレイを用いても調製されうる。当該技術分野において公知であるように、抗体ファージディスプレイ（ＡＰＤ）は、バクテリオファージの遺伝子工学及び抗原誘導選択とファージの増殖の循環過程の繰り返しに基づく。

【0123】

ＡＰＤの過程は、選ばれた細胞源（例えば、末梢血単核細胞）から良質のＲＮＡを調製することによって抗体ライブラリーを調製することで始まる。このＲＮＡはｃＤＮＡに逆転写され、そのｃＤＮＡはコードされる抗体のＶＨ鎖及びＶＬ鎖のＰＣＲに使用される。このステップの後に、可変重（ＶＨ）及び可変軽（ＶＬ）ＰＣＲ産物がファージディスプレイベクターにライゲーションされ、最終段階としてｍＡｂのクローンが解析される。

【0124】

１つの実施形態では、本発明は、配列番号５で表わされるＮＳＧＭＮのアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ１又はその変型、配列番号６で表わされるアミノ酸配列ＷＩＮＴＹＮＧＥＰＴＹＴＤＤＦＫＧを含むＣＤＲＨ２又はその変型、及び配列番号７で表わされるアミノ酸配列ＨＳＹＧＳＳＹＡＭＤＮを含むＣＤＲＨ３又はその変型を含む重鎖可変領域、並びに配列番号８で表わされるアミノ酸配列ＫＡＳＱＳＶＤＹＤＧＤＳＹＭＮを含むＣＤＲＬ１又はその変型、配列番号９で表わされるアミノ酸配列ＶＡＳＮＬＫＳを含むＣＤＲＬ２又はその変型、及び配列番号１０で表わされるアミノ酸配列ＱＱＳＮＥＥＰＷＴを含むＣＤＲＬ３又はその変型を含む軽鎖可変領域を含む単離完全ヒト化多重特異性モノクローナル抗体を提供する。

【0125】

言い換えれば、本発明は、少なくとも２つのＣＣＲ３−結合ケモカインに結合する単離多重特異性抗体又はそのいずれの抗原結合断片を提供し、該抗体は、完全ヒト化抗体であり、
ａ）配列番号５で表わされるアミノ酸配列を含む相補性決定領域ＶＨ ＣＤＲ１又はその変型、
ｂ）配列番号６で表わされるアミノ酸配列を含む相補性決定領域ＶＨ ＣＤＲ２又はその変型、及び
ｃ）配列番号７で表わされるアミノ酸配列を含む相補性決定領域ＶＨ ＣＤＲ３又はその変型を含む重鎖可変領域、並びに
ｄ）配列番号８で表わされるアミノ酸配列を含む相補性決定領域ＶＫ ＣＤＲ１又はその変型、
ｅ）配列番号９で表わされるアミノ酸配列を含む相補性決定領域ＶＫ ＣＤＲ２又はその変型、及び
ｆ）配列番号１０で表わされるアミノ酸配列を含む相補性決定領域ＶＫ ＣＤＲ３又はその変型を含む軽鎖可変領域
を含む。

【0126】

幾つかの実施形態では、本発明は、線維性疾患、自己免疫性炎症性疾患、単球関連疾患、又はアレルギー・アトピー性疾患の治療で用いる、少なくとも２つのＣＣＲ３−結合ケモカインに結合する単離多重特異性抗体又はそのいずれの抗原結合断片を提供し、前記抗体が、完全ヒト化抗体であり、
ａ）配列番号５で表わされるアミノ酸配列を含む相補性決定領域ＶＨ ＣＤＲ１又はその変型、
ｂ）配列番号６で表わされるアミノ酸配列を含む相補性決定領域ＶＨ ＣＤＲ２又はその変型、及び
ｃ）配列番号７で表わされるアミノ酸配列を含む相補性決定領域ＶＨ ＣＤＲ３又はその変型を含む重鎖可変領域、並びに
ｄ）配列番号８で表わされるアミノ酸配列を含む相補性決定領域ＶＫ ＣＤＲ１又はその変型、
ｅ）配列番号９で表わされるアミノ酸配列を含む相補性決定領域ＶＫ ＣＤＲ２又はその変型、及び
ｆ）配列番号１０で表わされるアミノ酸配列を含む相補性決定領域ＶＫ ＣＤＲ３又はその変型を含む軽鎖可変領域
を含む。

【0127】

配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、及び配列番号１０でそれぞれ表わされる上記ＣＤＲ配列ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３は、そのそれぞれの重鎖及び軽鎖配列に照らしても示される。

【0128】

本明細書で例示される単離完全ヒト化多重特異性モノクローナル抗体の重鎖のアミノ酸配列は本明細書において配列番号３で表わされ、アミノ酸配列：

から成る。

【0129】

本明細書で例示される単離完全ヒト化多重特異性モノクローナル抗体の軽鎖のアミノ酸配列は本明細書において配列番号４で表わされ、アミノ酸配列：

から成る。

【0130】

したがって、さらなる実施形態では、本発明に従って使用される単離多重特異性抗体は、配列番号３で表わされる重鎖可変領域又はその変型及び配列番号４で表わされる軽鎖可変領域又はその変型を含む完全ヒト化抗体である。

【0131】

また、本発明は、重鎖及び軽鎖可変領域の変型も包含する。変型は、明細書に記載される抗体の活性を変えない重鎖及び軽鎖の相補性決定領域に又はフレームワーク領域に変異を含みうる。

【0132】

「変型」という用語によって、本明細書で具体的に特定される配列と異なるアミノ酸又はヌクレオチドの配列を意味され、その配列では１つ以上のアミノ酸残基又はヌクレオチドが削除、置換、又は付加される。

【0133】

本明細書で使用される「付加された」という用語によって、本明細書に記載される配列へのアミノ酸残基のいずれの付加を意味することが理解されるべきである。

【0134】

変型はさまざまなアミノ酸置換を包含する。アミノ酸「置換」は、ある１つのアミノ酸を、同一又は異なる構造的性質及び／又は化学的性質をもつ別のアミノ酸で置き換えた結果である。アミノ酸置換は、関与残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、及び／又は両親媒性における類似性に基づいて行われうる。

【0135】

典型的には、変型は、保存的アミノ酸置換を包含する。機能的に類似するアミノ酸を提供する保存的置換表は当該技術分野において周知である。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、及びメチオニンが挙げられ、極性中性アミノ酸としては、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、及びグルタミンが挙げられ、正電荷をもつ（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、リジン、及びヒスチジンが挙げられ、負電荷をもつ（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸及びグルタミン酸が挙げられる。

【0136】

次の８つの群は各々、相互に保存的置換である他の例示的なアミノ酸を含む。
１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；
２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；
３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；
４）アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）；
５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；
７）セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）；及び
８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）

【0137】

保存的核酸置換は、上記に定義された保存的アミノ酸置換をもたらす核酸置換である。

【0138】

また、本発明による変型は、非極性アミノ酸から極性アミノ酸への置換及びその逆の置換も包含する。

【0139】

本明細書で使用される「アミノ酸」又は「アミノ酸残基」という用語は、天然アミノ酸及び合成アミノ酸、並びに天然アミノ酸と同様に機能するアミノ酸類似体及びアミノ酸模倣物を指す。

【0140】

変型配列は、そのアミノ酸配列又はヌクレオチド配列の、本明細書に記載されるアミノ酸配列又はヌクレオチド配列（例えば、本明細書に記載される抗体の重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列又はヌクレオチド配列）との同一性の％割合によって特徴付けられうるアミノ酸又は核酸配列を指す。

【0141】

幾つかの実施形態では、本明細書で定義される変型配列は、重鎖及び軽鎖可変領域をコードする核酸配列を指し、各々は、本明細書に記載される重鎖及び軽鎖可変領域の配列と比較して少なくとも７０％又は７５％の配列同一性、約８０％又は８５％の配列同一性、約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性をもつヌクレオチドの配列を有する。

【0142】

幾つかの実施形態では、本発明による単離多重特異性ヒト化モノクローナル抗体は、その重鎖可変領域が、配列番号１で表わされる重鎖可変領域の核酸配列と少なくとも７０％同一である核酸配列によってコードされ、その軽鎖可変領域が、配列番号２で表わされる軽鎖可変領域の核酸配列と少なくとも７０％同一である核酸配列によってコードされる。

【0143】

「抗体の活性」という用語によって、少なくとも２つのＣＣＲ３結合ケモカインに結合し、好ましくはそのようなＣＣＲ３結合ケモカイよって媒介される生体機能を阻害する抗体の能力が意味される。

【0144】

そのような生体機能の非限定的な例は、細胞動員又は走化性（例えば、好酸球又は単球又は線維芽細胞の動員又は走化性）の阻害、線維芽細胞の筋芽細胞への転換の阻害、又は（例えば、Ｃａ^＋取り込みによって測定した）細胞活性化の減少である。該生体機能は当該技術分野において周知である方法を用いて生体内又はインビトロで測定できる。そのようなアッセイの幾つかを下記の実施例に記載する。

【0145】

本発明に従って調製される抗体の、その標的タンパク質に対する結合を決定するさらなるインビトロ実験としては、例えば、ＥＬＩＳＡアッセイが挙げられる。

【0146】

さらに本発明は、本発明の単離多重特異性モノクローナル抗体のいずれの抗原結合断片も包含する。そのような抗原結合断片は、例えば、抗原に結合できるＦａｂ及びＦ（ａｂ’）_２でありうる。そのような断片は、当該技術分野において公知のいずれの方法、例えば、パパイン（Ｆａｂ断片を産出）又はペプシン（Ｆ（ａｂ’）_２断片を産出）などの酵素を用いるタンパク質分解的切断によって作られうる。

【0147】

よって幾つかの実施形態では、本発明による単離多重特異性モノクローナル抗体は、抗体断片Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、抗原に結合可能な重鎖可変領域、抗原に結合可能な軽鎖可変領域、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）_２’、及びそれらのいずれの組み合わせからなる群より選択される。

【0148】

興味深いことに、エピトープマッピングを用いて、発明者らは、本発明の抗体（ｈＣＭ１０１）に結合する、エオタキシン１、エオタキシン２、ＲＡＮＴＥＳ、及びＭＣＰ−３中の特異的エピトープを特定した。

【0149】

本発明の抗体（ｈＣＭ１０１）が結合するエピトープは、エオタキシン−２では配列番号１５で表わされるアミノ酸配列ＣＭＦＦＶＳＫＲＩＰを含み、エオタキシン−１ではエピトープは配列番号１６で表わされるアミノ酸配列ＣＦＮＬＡＮＲＫＩＰＬＱＲＬを含み、ＲＡＮＴＥＳではエピトープは配列番号１７で表わされるアミノ酸配列ＡＹＩＡＲＰＬＰＲＡＨＩＫＥＹＦＹ含み、ＭＣＰ３ではエピトープは配列番号１８で表わされるアミノ酸配列ＣＣＹＲＦＩＮＫＫＩ（「Ｎ−ループの第１の部分」）及び配列番号１９で表わされるアミノ酸配列ＳＹＲＲＴＴＳＳＨ（「Ｎ−ループの第２の部分」）を含む。

【0150】

図２０Ｂに示されるこれらのエピトープの配列アラインメントから明らかなように、これらのエピトープのアミノ酸配列は同一ではない。しかし、図２１Ａ〜Ｄに模式的に示されるように、これらのエピトープはすべてＣＣＲ３結合ケモカイン内の同じ領域、すなわち、Ｎ−ループ領域に位置し、ｈＣＭ１０１によって認識される独特の三次元構造を明らかに形成する。言い換えれば、本発明の抗体（ｈＣＭ１０１）が結合する、エオタキシン１、エオタキシン２、ＲＡＮＴＥＳ、及びＭＣＰ−３のＮ−ループに共通する立体構造エピトープが存在する。

【0151】

本明細書で使用される「立体構造エピトープ」という用語は、抗原決定基、抗原のアミノ酸配列の連続又は不連続断片から構成される抗体によって認識される抗原の部分に関する。立体構造エピトープは、抗原の３Ｄ面特徴及び形状又は三次構造に基づいて、抗体の結合部位と相互作用する。場合によっては、そのようなエピトープは、直線配列、ポリペプチドの構造中のその相対的な位置、特定されるエピトープ内に見られる特徴的なアミノ酸によって部分的に特定されうる。

【0152】

「Ｎ−ループ領域」という用語によって、ＣＣＲ３結合ケモカインのＮ末端に位置する最初のβストランドに関してＮ−ループ及びターン（ｔｕｒｎ）が意味される。例えば、図２１Ａ（エオタキシン−２のタンパク質表面が示される）及び図２１Ｅ（エオタキシン−２のリボンダイヤグラム）に示されるように、ＣＣＲ３結合ケモカインエオタキシン−２においてＮ−ループ領域は、配列番号１５で表わされるアミノ酸配列ＣＭＦＦＶＳＫＲＩＰを含む。

【0153】

したがって幾つかの実施形態では、本発明の単離抗体は、立体構造エピトープが、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、又は配列番号１９で表わされるアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を含む。

【0154】

興味深いことに、エオタキシン１、エオタキシン２、ＲＡＮＴＥＳ、及びＭＣＰ−３のＮ−ループ領域に見出される立体構造エピトープのバイオインフォマティクス解析から、上記で定義されたエピトープ連続アミノ酸配列部分内又はその近傍中のいずれかに位置する数個の正電荷をもつアミノ酸残基が明らかになった。そのエピトープは図２０及び図２１に模式的にされる。バイオインフォマティクス解析よれば、抗体は、Ｎ−ループ領域に形成される構造を含むＣＣＲ３−結合ケモカイン内の領域に結合し、エオタキシン２では位置Ｌｙｓ−１４及びＡｒｇ−１５（配列番号１５で表わされるエピトープ内に位置する）及びＡｒｇ−２０、エオタキシン１では位置Ａｒｇ−１６及びＬｙｓ−１７（配列番号１６で表わされるエピトープ内に位置する）及びＡｒｇ−２２、ＲＡＮＴＥＳでは位置Ａｒｇ−１７（配列番号１７で表わされるエピトープ内に位置する）、Ｈｉｓ−２３及びＡｒｇ−２１、並びにＭＣＰ３では位置Ｌｙｓ−１８及びＬｙｓ−１９（配列番号１８で表わされるエピトープ内に位置する）及びＡｒｇ−２４のアミノ酸残基が関与する。エオタキシン２、エオタキシン１、ＲＡＮＴＥＳ、及びＭＣＰ３のアミノ酸配列（Ｎ末端のシグナルペプチドを含まない）にそれぞれ対応する配列番号１１〜１４に示される通り、各ケモカイン配列内の特定アミノ酸位置はＮ末端のシグナルペプチドを含まないケモカイン配列に関連する。

【0155】

「位置」という用語によって、当該技術分野において公知であるように、「１位」はシグナルペプチドの後（すなわち、成熟ポリペプチドのアミノ酸配列）の最初のＮ端アミノ酸残基を示し、「２位」は、Ｎ端アミノ酸残基の下流にあるアミノ酸残基を示すなど、Ｎ末端からＣ末端への方向におけるアミノ酸配列内の位置が意味される。

【0156】

正電荷をもつアミノ酸残基の「比較的高度な集中」という用語によって、少なくとも３つの正電荷をもつアミノ酸残基、例えば３つの正電荷をもつアミノ酸残基が意味される。

【0157】

したがって、本発明の態様の別の１つによって、本発明は、ＣＣＲ３結合ケモカインのＮ−ループ領域の立体構造エピトープに結合する単離抗体を提供し、前記立体構造エピトープは、前記ＣＣＲ３結合ケモカインのアミノ酸配列のアミノ酸位置１４と２４の間に位置する正電荷をもつアミノ酸残基の比較的高度な集中を特徴とする。

【0158】

幾つかの特定の実施形態では、本発明の単離抗体は、立体構造エピトープが、前記ＣＣＲ３結合ケモカインのアミノ酸配列のアミノ酸位置１４と２４の間に少なくとも３つの正電荷をもつアミノ酸残基を含む。

【0159】

他の特定の実施形態では、正電荷をもつアミノ酸残基は、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、及びＨｉｓからなる群より選択される。

【0160】

ある特定の実施形態では、本発明の単離抗体は、エオタキシン２では位置Ｌｙｓ−１４、Ａｒｇ−１５、及びＡｒｇ−２０、エオタキシン１では位置Ａｒｇ−１６、Ｌｙｓ−１７、及びＡｒｇ−２２、ＲＡＮＴＥＳでは位置Ａｒｇ−１７、Ｈｉｓ−２３、及びＡｒｇ−２１、並びにＭＣＰ３では位置Ｌｙｓ−１８、Ｌｙｓ−１９、及びＡｒｇ−２４のアミノ酸残基を含むエピトープに結合する。

【0161】

また、上記で定義される共通エピトープは、数個のＣＣＲ３結合ケモカインに対する多重特異性結合能を有するさらなる抗体スクリーニング及び特定にも役立ちうる。そのような抗体は、それらのケモカインによって媒介される細胞遊走を弱める活性がある可能性が高いと思われる。

【0162】

したがって、別の態様では、本発明は、少なくとも１つのＣＣＲ３、ＣＣＲ１、ＣＣＲ２、又はＣＣＲ５を発現する細胞の遊走性を効率的に弱めることができる抗体をスクリーニング及び特定する方法を提供する。

【0163】

１つの実施形態では、前記方法は、
ａ．ＣＣＲ３結合ケモカインに対する抗体を得ることと、
ｂ．ＣＣＲ３結合ケモカインのＮ−ループ領域の、前記ＣＣＲ３結合ケモカインのアミノ酸配列のアミノ酸位置１４と２４の間に位置する正電荷をもつアミノ酸残基の比較的高度な集中を特徴とする立体構造エピトープへの前記抗体の結合を評価すること、
ｃ．前記立体構造エピトープに結合する抗体を選択することを含み、
そこにおいて、前記立体構造エピトープに特異的に結合する抗体は、ＣＣＲ３、ＣＣＲ１、ＣＣＲ２、及びＣＣＲ５を発現する細胞の遊走性を効率的に弱めることができる。

【0164】

１つの実施形態では、前記立体構造エピトープは、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、及び配列番号１９で表わされるアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。

【0165】

１つの特定の実施形態では、結合を評価する工程は、抗体を前記立体構造エピトープと接触させることによって、例えば、抗体をＮ−ループを含むケモカインの断片とインキュベーションすること、又は抗体を少なくとも１つの配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、及び配列番号１９で表わされるアミノ酸配列とインキュベーションすることによって行われる。インキュベーションは、当該技術分野において公知の、抗原−抗体結合を評価するいずれの方法、例えば、ＥＬＩＳＡによって、又は複数のアミノ酸断片を含有するチップを用いて行われうる。インキュベーションは結合バッファーの存在下で行われ、抗体結合は、例えば、検出可能に標識された二次抗体とさらにインキュベーションすることによって評価される。

【0166】

本明細書で使用される「スクリーニング及び特定すること」という用語は、抗体又は複数の抗体を上記で定義された本発明のエピトープに結合する能力について評価すること及びエピトープに結合することよってケモカインに結合した際にＣＣＲ−結合ケモカインの活性を弱めることが予想される抗体を選択することに関する。

【0167】

ある特定の実施形態では、前記立体構造エピトープは次の位置のアミノ酸残基を含む：エオタキシン２ではＬｙｓ−１４、Ａｒｇ−１５、及びＡｒｇ−２０（そのアミノ酸配列は配列番号１１で表わされる）、エオタキシン１ではＡｒｇ−１６、Ｌｙｓ−１７、及びＡｒｇ−２２（そのアミノ酸配列は配列番号１２で表わされる）、ＲＡＮＴＥＳではＡｒｇ−１７、Ｈｉｓ−２３、及びＡｒｇ−２１（そのアミノ酸配列は配列番号１３で表わされる）、並びにＭＣＰ３ではＬｙｓ−１８、Ｌｙｓ−１９、及びＡｒｇ−２４（そのアミノ酸配列は配列番号１４で表わされる）。

【0168】

また、本発明の特定立体構造エピトープは、少なくとも１つの、ＣＣＲ３、ＣＣＲ１、ＣＣＲ２、又はＣＣＲ５を発現する細胞の遊走性を効率的に弱めることができる抗体を作製するための抗原として使用できる。したがって、別の態様では、本発明は、立体構造エピトープを含むＣＣＲ３結合ケモカインの単離Ｎ−ループ領域を提供し、前記ＣＣＲ３結合ケモカインに対する抗体を作り出すため、前記立体構造エピトープは、前記ＣＣＲ３結合ケモカインのアミノ酸配列のアミノ酸位置１４と２４の間に位置する正電荷をもつアミノ酸残基の比較的高度な集中を特徴とする。特定の実施形態では、前記単離Ｎ−ループ領域は、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、及び配列番号１９で表わされるアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。

【0169】

ある実施形態では、本発明は、立体構造エピトープを含むＣＣＲ３−結合ケモカインの単離Ｎ−ループ領域を提供し、前記立体構造エピトープは、前記ＣＣＲ３結合ケモカインに対する抗体を作り出す方法で用いる、前記ＣＣＲ３結合ケモカインのアミノ酸配列のアミノ酸位置１４と２４の間に位置する正電荷をもつアミノ酸残基の比較的高度な集中を特徴とする。特定の実施形態では、前記単離Ｎ−ループ領域は、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、及び配列番号１９で表わされるアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。

【0170】

よって、本発明は、本発明のエピトープを得ること及び当該技術分野において公知のいずれの方法を用いて前記エピトープに対する抗体を作製することを含む、少なくとも１つの、ＣＣＲ３、ＣＣＲ１、ＣＣＲ２、又はＣＣＲ５を発現する細胞の遊走性を効率的に弱めることができる抗体を作り出す方法をさらに提供する。

【0171】

動物をワクチン接種し、ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を作り出す方法は当該技術分野において周知である。

【0172】

本発明の態様の別の１つでは、本発明は、本発明による抗体又はそのいずれの抗原結合断片をコードするヌクレオチド配列を含む単離核酸分子を提供する。

【0173】

本明細書で定義される「核酸」又は「核酸分子」という用語は、一本鎖でも二本鎖でもよいデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、及び適切な場合にはリボ核酸（ＲＮＡ）などのポリヌクレオチドであるヌクレオチドのポリマーを指す。該用語は、同等のものとして、ヌクレオチド類似体から作られるＲＮＡ又はＤＮＡのいずれかの類似体、及び記載されている実施形態に適用可能の場合、一本鎖（センス又はアンチセンスなどの）及び二本鎖ポリヌクレオチドを含むことが理解されるべきである。また、本明細書で使われるＤＮＡという用語は、ｃＤＮＡ、すなわち、逆転写酵素（ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ）に作用によってＲＮＡ鋳型から作製される相補的ＤＮＡ又はコピーＤＮＡも包含する。

【0174】

本発明は、本明細書で定義される単離核酸分子を含む発現ベクターをさらに提供する。

【0175】

本明細書で使用される、時として「発現媒体」又は「発現コンストラクト」と呼ばれる「発現ベクター」は、ＤＮＡ断片の宿主ゲノムへの組み込みを可能にする、プラスミド、ウイルス、バクテリオファージ、組込可能ＤＮＡ断片、及び他の媒体などのベクターを包含する。典型的に発現ベクターは、所望の遺伝子又はその断片を含有する自己複製ＤＮＡ又はＲＮＡコンストラクトであり、適切な宿主細胞中で認識され、所望の遺伝子の発現をもたらす遺伝子制御エレメントに作動可能に連結される。これらの制御エレメントは適切な宿主での発現をもたらすことができる。本発明による発現ベクターは、ほんの数例を挙げれば、細菌、酵母、又は哺乳類宿主細菌での発現に適格でありうる。

【0176】

本発明の態様のさらに別の１つでは、本発明は、本発明による単離核酸分子又は本発明による発現ベクターでトランスフェクションされる宿主細胞を提供する。

【0177】

本明細書で使用される「宿主細菌」という用語は、本発明による単離核酸分子又は本発明による発現ベクターの導入を受けやすい細胞を指す。好ましくは、前記細胞は、哺乳類細胞、例えば、ＣＨＯ細胞又はＮＳ０細胞である。本発明による単離核酸分子又は発現ベクターの宿主細胞へのトランスフェクションは、当該技術分野において公知のいずれの方法で行われうる。

【0178】

本発明の態様のさらに別の１つでは、本発明は、本発明による抗体又はそのいずれの抗原結合断片を含む免疫複合体及びさらなる治療薬、例えば、抗炎症剤を提供する。

【0179】

本明細書で定義される「免疫複合体」という用語は、さらなる薬剤に複合（結合又は連結）する本発明による抗体又はそのいずれの抗原結合断片に指す。免疫複合体は、当業者に公知のいずれの方法、例えば、さらなる薬剤を本発明による抗体への架橋又は組み換えＤＮＡ法によって調製されうる。

【0180】

本発明の多重特異性抗体は、少なくとも１つのさらなる治療薬と併用して投与されうる。

【0181】

本明細書で使用される「さらなる治療薬」という用語は、線維性疾患、自己免疫性炎症性疾患、単球関連疾患、又はアレルギー・アトピー性疾患を治療するために使用されうるいずれの薬剤を指す。幾つかの実施形態では、さらなる治療薬は、さらなる抗炎症剤又は抗線維化薬である。ある実施形態においては、前記少なくとも１つのさらなる治療薬は、化学療法剤、サイトカイン、ペプチド、抗体、及び抗生物質からなる群から選択される。

【0182】

ある実施形態では、前記さらなる治療薬としては、メトトレキサート、ステロイド、シクロスポリン、ＮＳＡＩＤＳ（非ステロイド性抗炎症薬）、ステロイド、インターフェロンベータ、経静脈免疫グロブリン（ＩＶＩＧ）、ピルフェニドン、ニンテダニブ、ボセンタン、又はマシテンタンが挙げられるが、これらに限定されない。

【0183】

ある実施形態では、さらなる治療薬は、さらなる抗体である。本明細書で定義される「さらなる抗体」という用語は、本発明による抗体ではない、本発明の抗体と併用して使用されうる抗体を指す。そのような抗体は、非限定的な例として、ＴＮＦα、ＴＮＦ受容体、ＩＬ６受容体、又はＣＤ２０を対象にしうる。

【0184】

本発明は、本発明の単離多重特異性抗体、又は本明細書で定義されるそのいずれの抗原結合断片若しくは免疫複合体及び薬理学的に許容される担体、賦形剤又は希釈剤を、活性成分として含む医薬組成物をさらに提供する。

【0185】

本発明の「医薬組成物」は、大体において、本明細書で定義される抗体又はそのいずれの抗原結合断片、並びに当該技術分野において公知であるように組成物並びに随意に１つ以上の薬理学的に許容される担体、賦形剤及び／又は希釈剤の容積モル浸透圧濃度を調整する薬剤であるバッファーを含む。

【0186】

本明細書で使用される「薬理学的に許容される担体、賦形剤又は希釈剤」という用語は、当該技術分野において公知であるあらゆる溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌性物質、及び抗真菌薬などを含む。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど）、その適切な混合物、及び植物油を含有する溶媒又は分散媒でありうる。各担体は、他の成分と混合可能で、対象に有害ではないという意味で医薬的にも生理学的にも許容可能であるべきである。従来の媒質又は薬剤が活性成分と混合不能である場合を除き、治療用組成物におけるそのいずれの使用が企図される。

【0187】

その他の実施形態では、本発明による医薬組成物は、さらなる治療薬、例えば、抗炎症剤をさらに含んでなる。

【0188】

特定の実施形態では、本発明は、少なくとも２つの炎症性ＣＣＲ３−結合ケモカインに結合する単離多重特異性ヒト化抗体、又はそのいずれの抗原結合断片を含む医薬組成物に関し、抗体は、配列番号３で表わされるアミノ酸配列の重鎖可変領域又はその変型及び配列番号４で表わされるアミノ酸配列の軽鎖可変領域又はその変型を含む。

【0189】

さらに提供されるのは、本発明による単離多重特異性抗体若しくはそのいずれの抗原結合断片又は医薬組成物の治療有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む、自己免疫性炎症性疾患、単球関連疾患、アレルギー・アトピー性疾患、又は線維性疾患を予防、治療、又は改善する方法である。

【0190】

幾つかの実施形態では、本発明は、少なくとも２つの炎症性ＣＣＲ３結合ケモカインに結合する単離多重特異性ヒト化抗体、又はそのいずれの抗原結合断片の治療有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む、自己免疫性炎症性疾患、単球関連疾患、アレルギー・アトピー性疾患、又は線維性疾患を予防、治療、又は改善する方法を提供し、抗体は、配列番号３で表わされるアミノ酸配列の重鎖可変領域又はその変型及び配列番号４で表わされるアミノ酸配列の軽鎖可変領域又はその変型を含む。

【0191】

「対象」又は「患者」という用語は互換可能に使用され、哺乳類（例えば、イヌ、ネコ、ヒツジ、ブタ、ウマ、ウシ、又はヒト）などの、本発明から利益を享受する可能性のある対象を指す。１つの特定の実施形態では、患者はヒトである。

【0192】

本明細書で定義される「予防」という用語によって、「予防的（ｐｒｅｖｅｎｔｉｖｅ）治療」又は「予防的（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ）治療」、すなわち、自己免疫性炎症性疾患、単球関連疾患、アレルギー・アトピー性疾患、又は線維性疾患、又はそのような疾患の発作を防御又は予防するのに保護的に作用することを提供することが意味される。

【0193】

本明細書で使用される「治療する」、「治療すること」、「治療」、又はその形態という用語は、疾患若しくは病態の有害な影響を軽減すること、予防すること、治癒させること、回復に向かわせること、寛解させること、弱めること、緩和すること、最小限に抑えること、抑制すること、又は食い止めること、又は炎症性ＣＣＲ３結合ケモカインの影響を受ける疾患の１つ以上の臨床的兆候の発症を遅らせることを意味することが理解されるべきである。そのような疾患としては、自己免疫性炎症性疾患、単球関連疾患、アレルギー・アトピー性疾患、又は線維性疾患が挙げられる。

【0194】

本明細書で使用される「治療」という用語は、エオタキシン２によって媒介される疾患又は病態の有害な影響を軽減すること、予防すること、治癒させること、回復に向かわせること、弱めること、緩和すること、最小限に抑えること、抑制すること、又は食い止めることを指す。

【0195】

本発明による投与は、次の経路のいずれかで行われうる：経口投与、静脈内、筋肉内、腹膜内、髄腔内若しくは皮下注射；直腸内投与；鼻腔内投与、点眼、又は局所投与。

【0196】

特定の実施形態では、本発明による投与は静脈内に行われうる。他の特定の実施形態では、投与は腹膜内に行われうる。他の特定の実施形態では、投与は吸入によって行われうる。

【0197】

本明細書で定義される抗体又は抗体断片、それを含むいずれの医薬組成物、又はそれらを含むいずれの複合体は、疾患の発症前に対象に投与してもよく、発症後に対象に投与してもよい。

【0198】

よって幾つかの実施形態では、本発明による、自己免疫性炎症性疾患、単球関連疾患、アレルギー・アトピー性疾患、又は線維性疾患を予防、治療、又は改善する方法は、本発明による前記単離ヒト化多重特異性抗体若しくはそのいずれの抗原結合断片又は本発明による医薬組成物が、疾患の発症前又は後に前記対象に投与される。

【0199】

本発明による単離モノクローナル抗体若しくはそのいずれの抗原結合断片又は本明細書に定義される目的のための本発明による医薬組成物の「治療有効量」は、医学的状態を治癒させる、進行を抑える、又は少なくとも緩和若しくは寛解させるために、当該技術分野において公知であるかかる考慮によって決定される。本発明の方法に使用されるいずれの調製物に関して、投与量又は治療有効量は、インビトロ細胞培養アッセイから、又は本明細書で詳述される動物モデルなどの動物モデルに基づいて、最初に推定できる。

【0200】

幾つかの実施形態では、本発明による治療有効量は０．０１〜１００ｍｇ／ｋｇの範囲にある。

【0201】

その他の実施形態では、本発明による治療有効量は、０．０１〜４０ｍｇ／ｋｇ、０．１〜４０ｍｇ／ｋｇ、又は１〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲にある。

【0202】

その他の実施形態では、本発明による単離ヒト化多重特異性抗体又はそのいずれの抗原結合断片又は本発明による医薬組成物は、単回投与又は複数回投与として対象に投与される。

【0203】

本発明の文脈で「それを必要とする対象」という用語は、自己免疫性炎症性疾患、単球関連疾患、アレルギー・アトピー性疾患、又は線維性疾患を患う、例えば、ラット、マウス、イヌ、ネコ、モルモット、霊長類、及びヒトなどの温血動物を意味する。

【0204】

本発明は、自己免疫性炎症性疾患、単球関連疾患、アレルギー・アトピー性疾患、又は線維性疾患を予防、治療、又は改善する方法で用いる本発明による単離ヒト化多重特異性抗体又はそのいずれの抗原結合断片又は本発明による医薬組成物をさらに提供する。

【0205】

特定の実施形態では、本発明は、少なくとも２つの炎症性ＣＣＲ３結合ケモカインに結合する単離ヒト化多重特異性抗体、又はそのいずれの抗原結合断片を提供し、その抗体は、自己免疫性炎症性疾患、単球関連疾患、アレルギー・アトピー性疾患、又は線維性疾患を予防、治療、又は改善する方法で用いる、配列番号３で表わされるアミノ酸配列の重鎖可変領域又はその変型及び配列番号４で表わされるアミノ酸配列の軽鎖可変領域又はその変型を含む。

【0206】

「精製された」又は「単離された」という用語は、その自然環境から除去され、単離又は分離される、アミノ酸若しくは核酸配列、ペプチド、ポリペプチド、又は抗体などの分子を指すことが理解される。したがって、「単離抗体」は精製された抗体である。本明細書で使用される「精製された」又は「精製する」という用語は、混入物質を試料から除去することも指す。

【実施例】

【0207】

材料及び方法
特異性ＥＬＩＳＡ
ＣＭ１０１の特異性はＥＬＩＳＡで評価する。プレートを次の抗原でコーティングした：エオタキシン１、エオタキシン２、単球化学誘引物質タンパク質−３（ＣＣＬ７）、及びＲＡＮＴＥＳ（ＣＣＬ５）。いずれも、１μｇ ｍｌ−^１で４℃にて一晩コーティングした。洗浄（ＰＢＳ＋０．１％ ツイーン２０）した後、ｈＣＭ１０１（５μｇ）をプレートに１時間加えた。再度洗浄した後、ＣＭ１０１を抗ヒト西洋ワサビペルオキシダーゼ複合体（ＰＢＳで１：５０００希釈して１時間インキュベーション）を用いて検出し、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン基質（シグマケミカル社、ジリンガム、英国）を用いて定量した。１０分後に反応を硫酸（５０μｌ、２Ｍ）で止め、光学密度を４５０ｎＭで測定した。

【0208】

免疫組織化学：
ヒトエオタキシン２／ＣＣＲ３に対する免疫組織化学染色を、硬皮症患者の皮膚／肺生検の５μｍ厚凍結切片で行った。メタノール及びアセトンで固定した後、切片を非免疫ウサギ及びヤギ血清でブロックし、続いてＣＡＳブロッキング試薬とインキュベーションした。その後、一次抗体（抗エオタキシン−２抗体又は抗ＣＣＲ３抗体のいずれか）を室温で１時間加えた。洗浄した後、ビオチン標識したアフィニティー精製ヤギ抗マウス／ウサギ抗体（ジャクソン社）を加えた。次に、スライドを０．３％ Ｈ_２Ｏ_２とインキュベーションした後、さらに洗浄し、ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ複合体（ジャクソン社）と室温で３０分間インキュベーションした。スライドを３−アミノ−９−エチルカルバゾール基質（ダコ社）で１５分間発色させ、ヘマトキシリンで対比染色した。皮膚及び肺切片の肺炎症及び線維症変化の分析にはＨ＆Ｅ及びマッソントリクローム染色を用いた。

【0209】

プルダウンアッセイ
ダイナビーズプロトコール（ライフテクノロジー社）を用いるプルダウンを採用した。ＣＭ１０１の濃度を上げてさまざまな濃度で、磁気ビーズ（１ｍｇ）と室温で１．５時間インキュベーションした。次に、磁気分離を行った後、（全身性強皮症患者の）ヒト血清と一晩インキュベーションした。磁気分離及びビーズからのケモカインの溶出を行い、ニトロセルロース膜に移し、市販の抗Ｅｏｘ２抗体に曝した。また、エオタキシン１、ＲＡＮＴＥＳ、及びＭＣＰ−３に対するｈＣＭ１０１の結合能も、ＳＤＳゲル電気泳動を用いて評価した。

【0210】

走化性アッセイ
ＡＭＬ １４．３Ｄ１０、ＣＣＲ３を安定して発現する好酸性細胞系をＰＢＳで洗浄し、アッセイバッファー（ＲＰＭＩ１６４０、１％エンドトキシンを含まないＢＳＡ、１００Ｕ ｍｌ−^１ペニシリン、及び１００μｇ ｍｌ−^１ストレプトマイシン）に１０^７個の細胞 ｍｌ−^１で再懸濁した。異なる濃度（１０−^７Ｍ〜１０−^９Ｍ）のｈＣＭ１０１を５ｎＭヒトエオタキシン−１及びエオタキシン−２又はＭＣＰ−３及びＲＡＮＴＥＳ（３０分、３７℃）の組み合わせとインキュベーションし、５μｍの細孔をもつ２４ウェルのトランスウェルプレート（コスター社）の下部チャンバーに入れ、１００μｌの細胞（１×１０^６個の細胞）を各トランスウェルプレート上部チャンバーに入れて、アッセイを３７℃で４時間インキュベーションした（５％Ｃ０_２）。下部チャンバーに遊走する生細胞をフローサイトメーター（ＦＡＣＳキャリバー）、ＢＤバイオサイエンス社、カウリー、英国）を用いて数えた。結果は対照（つまり、ケモカインによって誘導された）遊走の％割合として表わされる。

【0211】

また、ＣＣＲ１、ＣＣＲ３、及びＣＣＲ５を発現するＵ９３７単球細胞系でも実験を行った。その細胞の遊走を阻害するｈＣＭ１０１の能力を評価するために、ｈＣＭ１０１を５ｎＭＭＣＰ−３及びＲＡＮＴＥＳの混合物とインキュベーションし、５μｍの細孔をもつ２４ウェルのトランスウェルプレート（コスター社）の下部チャンバーに入れた。アッセイを上記のように行った。

【0212】

ＣＤ１４陽性細胞に関して、我々は硬皮症患者の全血から単離したフィコールＰＢＭＣにＭＡＣＳ分離磁気ビーズ（ミルテニー）を使用した。ＣＤ１４＋細胞のＭＣＰ３及びＲＡＮＥＳへの遊走を上記のように評価した。また、ｈＣＭ１０１で処理した、エオタキシン１、２、及びＲＡＮＴＥＳに対するＣＤ１４−細胞の遊走を調べた。

【0213】

エオタキシン２に反応した付着細胞（線維芽細胞−ＮＨＤＦ）走化性を評価するために、我々は、フィブロネクチンでコーティングした細孔径が８μｍのトランスウェル（コスター社）を使用した。エオタキシン２をｈＣＭ１０１と３０分間インキュベーションした後、ＮＨＤＦ細胞（５×１０４個の細胞）を上部チャンバーに加え、３７℃で４時間インキュベーションした。次に、非遊走細胞を綿棒でインサート膜から取り除いた。その膜を４％パラホルムアルデヒドで固定し、次に遊走した細胞をクマシーブルーで染色した。倒立顕微鏡を用いて無作為に選んだ３つの視野で遊走している細胞の数を数え、イメージプロソフトウェアを使用して解析した。

【0214】

カルシウム活性化アッセイ：
細胞（２×１０^６個の細胞／ｍＬ）をカルシウムセンサー（Ｆｌｏｕ４−ＡＭ、インビトロジェン）を４μΜの最終濃度で含むＰＢＳ＋／＋（カルシウム マグネシウム ＋＋）中で３７^０にて３０分間インキュベーションした。次に細胞を洗い、３７^０にて５００ｕｌのＰＢＳ＋／＋中でさらに３０分間インキュベーションした。細胞をフローサイトメーターを用いて３０秒間（４８８レーザー、フィルター５２０）解析し、次に（ｈＣＭ１０１とのプレインキュベーションをした後又はプレインキュベーションをせずに）、１００ｎｇ／ｍｌのエオタキシン２で刺激し、直ちにフローサイトメトリーの読み取りに進んだ。

【0215】

フローサイトメトリー細胞内染色：
線維芽細胞をＣＭ１０１（１０又は５μｇ／ｍｌ）及びヒト血清と２４時間インキュベーションした。次に、細胞をトリプシン処理し、７０％ エタノールで固定し、細胞付き抗αＳＭＡ抗体（ａｎｔｉ α ＳＭＡ Ａｂ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｃｅｌｌｓ）（バイオレジェンド社）と室温にて０．５時間インキュベーションした。次に細胞を洗浄し、二次抗体Ｃｙｅ３ロバαウサギＩｇＧ（ＰＢＳ中１：３００）に室温にて０．５時間供した。フローサイトメーターによって細胞を解析した。

【0216】

生体内硬皮症モデル
ブレオマイシン（シグマ社）をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に１００μｇ／ｍｌで溶かした。

【0217】

予防モデル：
５０μｇのブレオマイシンを６週齢の雌Ｃ３Ｈマウスに２１日間、毎日皮下注射して全身性硬化症を誘導した。ブレオマイシン注射の開始と同時に、ＣＭ−１０１（５μｇ、１０μｇ、２０μｇ、又は５０μｇの投与量）、免疫グロブリンＧ１（ＩｇＧ１）、又はＰＢＳを１日おきに注射した（１日目から開始）。

【0218】

治療モデル：
６週齢の雌Ｃ３Ｈマウスをブレオマイシン（１日当たり５０μｇ）の皮下注射で２０日間治療した。ブレオマイシンの連日投与の開始後８日から始めて、マウスを１００μｌの腹腔内注射中５０μｇ／日のＣＭ−１０１又はＰＢＳで毎日治療し、２１日目に犠牲にした。重大なことには、ＣＭ−１０１での治療の開始が疾患症状の発症後であった。

【0219】

次いでマウスを犠牲にし、全層６ｍｍパンチ生検を注射部位から得た。パラフィン及び凍結ブロック用並びにコラーゲンアッセイ用の皮膚組織採取。くわえて、血液を眼窩静脈叢から集めた。そして最後に、肺を組織学的検査用に採取した。白血球の％割合を調べるために気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）を（０．１％ ＢＳＡ及び０．０５ｍＭ ＥＤＴＡを含有するＰＢＳで）行った。

【0220】

生体内ＩＰＦモデル：
予防モデル−
７週齢の雄Ｃ５７ＢＬマウスをイソフルレン麻酔下で気管内注射によってＢＬＭの単回投与（６０μｇ／マウス）で治療した。ＢＬＭはＰＢＳに溶かした。注射後、マウスを立向き姿勢（ｖｅｒｔｉｃａｌ ｐｏｓｉｔｉｏｎ）にして１分間回転した。ブレオマイシン注射の開始と同時に、ＣＭ−１０１（１０μｇ、５０μｇ、又は１００μｇの投与量）、免疫グロブリンＧ１（ＩｇＧ１）、又はＰＢＳを１日おきに注射した（１日目にから開始）。

【0221】

治療モデル：
７週齢の雄Ｃ５７ＢＬマウスをイソフルレン麻酔下で気管内注射によってＢＬＭの単回投与（６０μｇ／マウス）で治療することになる。ＢＬＭはＰＢＳに溶かした。注射後、マウスを立向き姿勢にして１分間回転した。ブレオマイシン投与後９日、マウスを１００μｌ腹腔内注射中１０又は５０μｇ／日のＣＭ−１０１、ＩｇＧ、又はＰＢＳで毎日治療し、２１日目に犠牲にした。重大なことには、ＣＭ−１０１での治療の開始が疾患症状の発症後であった。ブレオマイシン注射の９日後、ベースライン線維症及び炎症を評価するためにＰＢＳ群及びブレオマイシン群を犠牲にした。２１日目に残りの群も犠牲にした。

【0222】

マウスを犠牲にし、肺を組織学的検査用及びコラーゲン測定（ｓｉｒｃｏｌ）用に採取した。白血球の％割合を調べるために気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）を（０．１％ ＢＳＡ及び０．０５ｍＭ ＥＤＴＡを含有するＰＢＳで）行った。

【0223】

コラーゲン含有量の測定
可溶性コラーゲンはＳｉｒｃｏｌ可溶性コラーゲンアッセイ（Ｂｉｏｃｏｌｏｒ社、ベルファスト、英国）を用いて定量した。皮膚試料をＣＭ１０１（５、２０、又は１００μｇ／ｍｌ）、ＩｇＧ、又はＰＢＳのいずれかで治療した強皮症マウスから得た。試料は酸・ペプシン溶液に抽出した。その試料を製造業者のプロトコールに従ってコラーゲン含有量について分析した。手短に言うと、１００μｌの試料を１ｍｌの比色試薬（ピクリン酸中の色素ＳＲ）に加え、３０分間撹拌した後、１０，０００ｇで１０分間遠心分離した。アルカリ試薬（１Ｎ ＮａＯＨ）を用いてＳＲ色素をペレットから放出させ、マイクロプレートリーダー上で５５５ｎｍにて分光光度の読み取りを行った。

【0224】

ＢＡＬアッセイ：
ＢＡＬアッセイを以前の記述（Ｋｏｍａｉら、２０１０年）の通り行った。気管にカニューレを挿入し、肺を０．１％ ＢＳＡ及び０．０５ｍＭ ＥＤＴＡ−２Ｎａを含有する０．５ｍｌのカルシウムもマグネシウムも含まないＰＢＳで４時間洗浄した。この手順を３回繰り返した（合計体積：１．３ｍｌ、回収率＞８５％）。各動物からのＢＡＬをプラスチックチューブに集め、氷上で冷やし、４℃で１０分間遠心分離した（１５０×ｇ）。細胞ペレットを同じバッファー（０．５ｍｌ）に懸濁した。分画細胞カウントをフローサイトメトリーで行った。

【0225】

ケモカインレベル
エオタキシン−１、エオタキシン−２、及びＲＡＮＴＥＳレベルを、次の酵素結合免疫吸着法キットを製造業者のプロトコールに従って用いて硬皮症患者及び健康なドナーの血清中で決定した：ＱｕａｎｔｉｋｉｎｅヒトＣＣＬ１１／エオタキシン、ＣＣＬ２４／エオタキシン−２、及びＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳ（Ｒ＆Ｄ社）。

【0226】

エピトープマッピング
ＣＨＩＰ ＫＭＣを、ｐＨ７．０のＴＢＳバッファー中の０．０５％ ツイーン−２０、０．０５％ トリトンＸ−１００で４℃にて一晩ブロックした。０．０５％ ツイーン−２０及び０．０５％ トリトンＸ−１００を含む１ｍＬのｐＨ７．０の１ｘＴＢＳでＣＨＩＰを洗浄し、６３５ｎｍ及びＰＭＴ７００にてスキャンした。次に、ＣＭ１０１のエピトープ結合を検出するために、ＣＨＩＰを１ｍｌの結合バッファーで４℃にて２０分間で洗浄し、結合バッファー（ｐＨ７．４）中１μｇ／ｍｌのｈＣＭ１０１と４℃で２時間インキュベーションした。インキュベーションに続いて、ＣＨＩＰを洗浄し、結合バッファー（ｐＨ７．４）中の１０ｎｇ／ｍｌ 抗ヒトＩｇＧ Ａｌｅｘａ６４７複合体と４℃で１時間インキュベーションした。再度ＣＨＩＰを洗い、６３５ｎｍ及びＰＭＴ７００にてスキャンした。

【0227】

ビアコアアッセイ
ｈＣＭ１０１又はマウスＣＭ１０１の親和定数をビアコアＴ１００を用いて評価した。この方法は表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）電気光学現象を使用して、結合相手間の結合定数及びオン／オフレート（ｏｎ／ｏｆｆ ｒａｔｅ）を測定する。エオタキシン２をＣＭ−５チップの表面に共有結合的に固定し、ＣＭ１０１の溶液をその表面上に通した。ＳＰＲ角の変化を測定し、ＫＤを決定可能になった。

【0228】

エピスクリーン（Ｅｐｉｓｃｒｅｅｎ）経時変化Ｔ細胞増殖アッセイ
２０名の健康なドナーのＰＢＭＣを解凍してカウントし、生存能力を評価した。各ドナーについて、１ｍｌの増殖細胞ストックを２４ウェルプレートの適切なウェルに加えたバルク培養を確立した。０．５ｍｌの培養培地及び０．５ｍｌの希釈したＣＭ１０１の各々をＰＢＭＣに加えて、試料当たり５０ｕｇ／ｍｌの最終濃度を得た。各ドナーについて、再現性対照（１００ｕｇ／ｍｌ ＫＬＨ）及び培養培地のみのウェルも含んだ。培養を合計８日間、３７℃にて５％ＣＯ２インキュベーションした。５、６、７、及び８日目に、各ウェルの細胞を１００ｕｌのＡＩＭ−Ｖ培養培地中の０．７５ｕＣｉ［３Ｈ］−チミジン（パーキンエルマー社、英国）でパルスし、ＴｏｍＴｅｃ Ｍａｃｈ ＩＩＩを用いて収穫する前に１８時間インキュベーションした。カウント毎分（ｃｐｍ）をシンチレーション測定Ｍｅｌｔｉｌｅｘ（パーキンエルマー社、英国）で決定した。

【0229】

実施例１ マウスモデルにおいて抗エオタキシン２ ｍＡｂ ＣＭ１０１での治療は強皮症の特徴を軽減する。
強皮症におけるＣＣＲ３結合ケモカインの関与の可能性を調べるために、硬皮症患者の血清中でエオタキシン１、２、及びＲＡＮＴＥＳのレベルを健康な対象と比較して評価した。それぞれ図１Ａ及び１Ｂに示されるように、結果は、エオタキシン２及びＲＡＮＴＥＳレベルの著しい増加（ｐｖ＜０．０５）を示した。くわえて、エオタキシン２及びその受容体であるＣＣＲ３の両方の著しく上昇した発現が硬皮症患者から取った皮膚生検で検出された（データ示さず）。よって、エオタキシン−２／ＣＣＲ３経路の活性化が硬皮症において働いている可能性がある。

【0230】

エオタキシン２の硬皮症への関連性をＣＭ１０１を用いてさらに評価した。ＣＭ１０１はエオタキシン２に対するマウスモノクローナル抗体である（国際公開第２０１０／０８６８５４号）。ＣＭ−１０１のマウスエオタキシン−２に対する親和定数（Ｋｄ）をビアコアで求め、７ｎＭであることがわかった。硬皮症対するＣＭ１０１での治療の効果を評価するために、ブレオマイシン誘導強皮症マウスモデルを使用した。５０μｇのブレオマイシンをＣ３Ｈマウスに２１日間、連日注射して強皮症を誘導した。ＣＭ１０１（ｌ０μｇ、２０μｇ、若しくは５０μｇ）、ＩｇＧ、又はＰＢＳを１日おきに腹膜内に注射した。ブレオマイシン注射の開始の２１日後、皮膚及びＢＡＬ液試料をすべての群から得た。線維症及び気管支肺胞炎症を評価するためにマウスを犠牲にした。

【0231】

ＩｇＧ１又はＰＢＳで治療したマウスと比較して、ＣＭ−１０１で治療したマウスでは硬皮症関連特徴の重症度の著しい減少が観察された。図２及び図３に示されるように、ＣＭ−１０１は、試験したすべてのパラメーター（真皮厚、皮膚コラーゲン含有量、及び肺への白血球浸潤）の増加を防いだ。真皮厚テスト（図２Ａ）では、ＣＭ−１０１のすべての投与量で、ＰＢＳ又は対照ＩｇＧ１での治療と比較して統計的に有意な差（ｐ＜０．０５）が得られた。また、投与量依存的な皮膚コラーゲン濃度の著しい減少（図２Ｂに示されるように、ＣＭ−１０１の１０μｇ、２０μｇ、及び５０μｇの投与量レベルで、それぞれ３０％、６０％、及び８４％の減少）からＣＭ−１０１の予防効果は明らかであった。マウス気管支肺胞洗浄液中の異なる白血球サブセットの判定から、リンパ球及び好酸球％割合が投与量に応答して著しく減少することが明らかになった（それぞれ、図３Ａ及び３Ｂ）。

【0232】

治療モードでは、ブレオマイシン注射の８日後、皮膚及びＢＡＬ液試料を第１群（ＰＢＳ）及び第２群（ブレオマイシンのみ）から得た。ブレオマイシン注射の開始の２１日後、皮膚及びＢＡＬ液試料を第３群（ブレオマイシン）及び第４群（ブレオマイシン＋ＣＭ１０１）から得た。線維症及び気管支肺胞炎症を評価するためにマウスを犠牲にした。ブレオマイシン２１日間治療群と比較して、ＣＭ−１０１治療群では皮膚コラーゲン濃度は６０％の著しい減少を来した（図４）。

【0233】

また、フローサイトメトリー解析を用いて、ＢＡＬ液を白血球の存在について試験した。図５Ａ及び図５Ｂに示されるように、ブレオマイシン治療群と比較して、ＣＭ−１０１治療群では単核細胞及び白血球浸潤は著しく減少した（それぞれ、５５％及び３０％）。代表的なフローサイトメトリー図を図５Ｃ〜図５Ｆに示す。

【0234】

真皮厚を評価するために、皮膚病変においてヘマトキシリン・エオジン（Ｈ＆Ｅ、図６Ａ〜Ｄ）及びマッソントリクローム（図６Ｅ〜Ｈ）での組織病理学的染色を行った。まず最初に、図６Ｃ及び図６Ｇに見られるように、２１日間のブレオマイシン治療後に真皮厚に著しい上昇が観察された。マウスを８日目からＣＭ−１０１で治療した場合、この上昇は観察されなかった。くわえて、Ｈ＆Ｅ及びマッソントリクローム染色から、ＢＬＭ治療群と比較して、ＣＭ−１０１治療群の皮膚病変における炎症及び線維症が著しく弱まることが明らかになった（図６Ｄ及び６Ｈ）。

【0235】

実施例２ マウスモデルにおける抗エオタキシン２ ｍＡｂ ＣＭ１０１での治療はＩＰＦを軽減する
特発性肺線維症（ＩＰＦ）におけるエオタキシン２の関与の可能性を調べるために、エオタキシン−２のレベルをＩＰＦ患者の肺生検で評価した。ＩＰＦ患者から取った皮膚生検においてエオタキシン−２の発現の著しい上昇が見られた（図７に示す）。これらのデータは、エオタキシン−２経路がＩＰＦで活性化されうるという考えを支持する。

【0236】

広く用いられているブレオマイシン誘導肺線維症モデルを使用して、ＣＭ１０１の有効性を評価した。１日目に、ブレオマイシン（マウス１頭当たり６０μｇ）をＣ５７／Ｂ１マウスに気管内注射した。予防プロトコールでは、１日目から１４日目までＣＭ１０１又はＩｇＧをＩＰ注射した。ブレオマイシン注射の１４日後、すべての群から肺及びＢＡＬ液試料を得た。線維症及び気管支肺胞炎症を評価するためにマウスを犠牲にした。

【0237】

免疫グロブリン（ＩｇＧ）又はＰＢＳで治療したマウスと比較して、ＣＭ−１０１で治療したマウスではＩＰＦに関連する特徴の著しい阻害が観察された。図８及び図９に示されるように、試験したすべてのパラメーター（コラーゲン濃度及び肺への白血球浸潤）でＣＭ−１０１による阻害が明らかであった。投与量依存的なコラーゲン濃度の著しい減少からＣＭ−１０１の阻害効果は明らかであった（図８に示されるように、ＣＭ−１０１の１０μｇ及び１００μｇ投与量レベルで、それぞれ６０％及び７０％の減少）。マウス気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）における単核細胞の測定から、ＣＭ１０１治療後の著しい減少（図９）が明らかになった。ＢＡＬ液内のエオタキシン２レベルの測定から、ＣＭ１０１治療群ではＢＡＬ液内のエオタキシン２が減少することを明らかになった（図１０）。

【0238】

疾患発症後のＣＭ１０１有効性を評価するために、ＢＬＭ気管内注射の僅か１０日後、ＣＭ１０１を２週間、毎日投与する治療プロトコールを行った。肺コラーゲン評価から、５０μｇのＣＭ１０１の連日治療後の著しい減少（７５％）が明らかになった（図１１）。

【0239】

また、フローサイトメトリー分析を用いて白血球の存在についてＢＡＬ液を試験した。図１２Ａ及び図１２Ｂに示されるように、ブレオマイシン治療群に比較して、ＣＭ−１０１治療群では単核細胞及び多形核細胞の浸潤が著しく減少した（それぞれ、５５％及び６５％）。病理染色を各群の肺切片で行い、図１３に示されるように、炎症（Ｈ＆Ｅ染色）及びコラーゲン沈着（マッソントリクローム染色）の著しい減少が示された。

【0240】

実施した第３の生体内モデルでは、ＣＭ１０１を、最近認可されたＩＰＦ治療であるピルフェニドンと比較した。ピルフェニドン（５−メチル−１−フェニルピリジン−２［１Ｈ］−オン）はＩＰＦ患者での進行を遅くすることを明らかに示すことから、ＩＰＦ治療にＦＤＡ及びＥＭＡから認可されている、抗線維性及び幾分のヒドロキシルスカベンジャー特性をもつ低分子である。

【0241】

以前の実験で記載されているようにＩＰＦを誘導した。ＢＬＭ注射前に、マウスに１００μｇのＣＭ１０１を注射するか、１００ｍｇ ｋｇ／日のピルフェニドンとともに毎日に餌を与えた。抗体注射は週に３回、２週間行った。一方で、ピルフェニドン経口強制飼養を２週間、毎日行った。

【0242】

図１４及び図１５に示されるように、試験したすべてのパラメーターにおいてＣＭ１０１はピルフェニドンより優れていた。ピルフェニドン治療マウスと比較して、ＣＭ１０１治療マウスにおいて肺コラーゲン濃度は大きく減少した。くわえて、マウス気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）中の単核細胞、白血球（ＷＢＣ）、及び多形核細胞の測定から、ピルフェニドン治療群とは対照的なＣＭ１０１治療群での著しい減少を明らかになった（図１５）。組織学的染色は、ピルフェニドン治療群と比較してＣＭ１０１治療群から得られた肺病変において炎症及び線維症が少ないことを示すこれらの結果を支持する（データ示さず）。

【0243】

実施例３ ヒト化ｍＡｂ ｈＣＭ１０１の作製
マウス抗体ＣＭ１０１の可変（Ｖ）領域遺伝子をアンチトープ（Ａｎｔｉｔｏｐｅ）ベクターにクローニングして、ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域及びκ軽鎖定常領域と併せてマウスＶ領域を含むキメラ抗体を作り出した。アンチトープのＩｇＧ１ ＶＨ及びＶκ鎖発現ベクターにクローニングするための隣接制限酵素部位を導入したプライマーを用いて、マウスＣＭ１０１抗体のＶＨ及びＶκ配列をＰＣＲ増幅した。ＶＨ領域はＭｌｕＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ部位を用いてクローニングし、Ｖκ領域はＢｓｓＨＩＩ及びＢａｍＨＩ制限酵素認識部位を用いてクローニングした。両方のコンストラクトをＤＮＡシークエンシングで確認した。くわえて、一連の４つのヒト化ＩｇＧ１用ＶＨ領域及び４つのヒト化ＶＫ領域を設計し、Ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（商標）技術（アンチトープ社）を用いて構築した。

【0244】

キメラ抗体及びヒト化Ｖ領域遺伝子の組み合わせ（計１６抗体）をＮＳ０細胞に発現して精製し、競合ＥＬＩＳＡアッセイでヒトエオタキシン−２への結合について試験した。結合データを用いて、キメラＣＭ１０１抗体と比較してヒト化ＣＭ１０１変型をランク付けした。重鎖及び軽鎖バンドの質の有意な違いはＳＤＳ ＰＡＧＥで検出されなかった（データ示さず）。

【0245】

結合データに基づいて、ヒト化変型ＶＨ１／ＶＫ３（ｈＣＭ１０１）を機能アッセイで試験するリード化合物として選択した。

【0246】

ＶＨ１／ＶＫ３配列：
配列番号１：

【0247】

配列番号２：

＊ＣＤＲヌクレオチド配列は太字で下線が引かれている。

【0248】

配列番号３：

【0249】

配列番号４：

【0250】

ＶＨ変型１の上記核酸配列（重鎖又はＶＨ）は、本明細書において配列番号１として定義される。

【0251】

ＶＫ変型３の上記核酸配列（軽鎖）は、本明細書において配列番号２として定義される。

【0252】

ＶＨ変型１の上記アミノ酸配列（重鎖又はＶＨ、１１３個のアミノ酸）は、本明細書において配列番号３として定義される。

【0253】

ＶＫ変型３の上記ミノ酸配列（軽鎖、１０７個のアミノ酸）は、本明細書において配列番号４として定義される。

【0254】

ＶＨ変型１（重鎖）は次の３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。
ＶＨ ＣＤＲ１はアミノ酸配列ＮＳＧＭＮ（配列番号５）をもつ。
ＶＨ ＣＤＲ２はアミノ酸配列ＷＩＮＴＹＮＧＥＰＴＹＴＤＤＦＫＧ（配列番号６）をもつ。
ＶＨ ＣＤＲ３はアミノ酸配列ＨＳＹＧＳＳＹＡＭＤＮ（配列番号７）をもつ。

【0255】

ＶＫ変型３（軽鎖）は次の３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。
ＶＫ ＣＤＲ１はアミノ酸配列ＫＡＳＱＳＶＤＹＤＧＤＳＹＭＮ（配列番号８）をもつ。
ＶＫ ＣＤＲ２はアミノ酸配列ＶＡＳＮＬＫＳ（配列番号９）をもつ。
ＶＫ ＣＤＲ３はアミノ酸配列ＱＱＳＮＥＥＰＷＴ（配列番号１０）をもつ。

【0256】

実施例４ ｈＣＭ１０１の親和性及び結合特異性
ｈＣＭ１０１のエオタキシン−２に対する結合親和力及び他の関連ケモカインに対する結合親和力を調べるために、幾つかの異なる方法：酵素結合免疫吸着法、ビアコア、及びＣＨＩＰによるエピトープマッピングを用いた。ビアコアによって、抗体のエオタキシン２に対する相当な結合が示され（図１６）、酵素結合免疫吸着法によって、親和定数が３×１０−^９Ｍであることが明らかとなった。

【0257】

驚いたことには、ｈＣＭ１０１が他の関連ケモカインにも中程度の親和性で結合することがわかった。酵素結合免疫吸着法によって示されるように、ｈＣＭ１０１はエオタキシン１（図１７）、ＲＡＮＴＥＳ（図１８）、及びＭＣＰ３（図１９）に結合することがわかった。

【0258】

エピトープマッピング解析から、これらの４つのケモカインの共通する特徴が明らかになった。エオタキシン１、２、ＲＡＮＴＥＳ、及びＭＣＰ−３は、Ｎ−ループ内に位置するエピトープ部位を提示するようである（図２０）。この相互結合部位は、ほぼ同じ位置にある正電荷をもつ残基の高度な集中を特徴とする（図２１）。

【0259】

これらの結果は、酵素結合免疫吸着法によって明らかに示されるように、ｈＣＭ１０１がエオタキシン２と高い親和性で結合し、他の関連ケモカインとも結合する多重特異性抗体であることを示唆する。理論に拘束されるものではないが、この特徴により、ｈＣＭ１０１がケモカインの機能重複性を克服して有効性を実現することが可能になりうる。

【0260】

ｈＣＭ１０１の結合特異性を生体外で評価するために、全身性強皮症患者の代表的な血清から、完全ヒト化ＣＭ１０１（ｈＣＭ１０１）抗体を用いて循環エオタキシン２のプルダウンを行った。我々はｈＣＭ１０１によるエオタキシン２の投与量依存的な認識を見出した。

【0261】

この結果はｈＣＭ１０１の血清内エオタキシン２に対する高い特異性を示唆する（図２２）。

【0262】

くわえて、ニトロセルロース膜電気泳動アッセイを用いて、エオタキシン１、ＲＡＮＴＥＳ、及びＭＣＰ−３の濃度の濃度を上げてさまざまな濃度でｈＣＭ１０１に曝した。ｈＣＭ１０１のこれらのケモカインへの結合を増加させる特有の投与量が見出しされた（図２３）。

【0263】

実施例５ ｈＣＭ１０１を用いた機能アッセイ
エオタキシン１及びエオタキシン２は、ＣＣＲ３と結合して活性化することを通して組織に好酸球を動員することに関与するケモカインである。

【0264】

ｈＣＭ１０１の潜在的な抗遊走機能を調査するために、抗体をこれらのケモカインと３０分間、３７℃でインキュベーションし、好酸球走化性を調べた。結果は、ｈＣＭ１０１の好酸球遊走に対する顕著な投与量依存的阻害効果示す。それぞれ、１６％〜４５％の細胞の遊走が１０−^７〜１０−^８Ｍ抗体治療において観察された（図２４）、ｐｖ≦０．０５。

【0265】

ＲＡＮＴＥＳ及びＭＣＰ−３がＣＣＲ１、２、３、５受容体に結合することによって、単球系の細胞はそれらの一次標的であることが知られている。よって、Ｕ９３７単球細胞系の遊走に対するｈＣＭ１０１の効果はを、抗体をＭＣＰ−３及びＲＡＮＴＥＳとインキュベーションすることによって調べた。単球走化性は著しく弱まり、１０−^７のｈＣＭ１０１濃度において僅か２６％の遊走を示した（図２５）。

【0266】

また、インビトロ単球走化性アッセイを、単離したヒト単球及びその関連化学誘引物質を用いて行った。

【0267】

この目的のために、さまざまな投与量のｈＣＭ１０１の存在下又はｈＣＭ１０１の非存在下で、硬皮症患者から得たＰＢＭＣから分別したＣＤ１４＋単球を、誘引物質としてのヒトＭＣＰ−３及びＲＡＮＴＥＳの方向に遊走させた。ｈＣＭ１０１での処理により、単球走化性は著しく弱まり、高投与量では−５５％であった（図２６Ａ）。

【0268】

ＣＤ１４陰性細胞（大部分がリンパ球）のエオタキシン１、エオタキシン２、及びＲＡＮＴＥＳへの方向への遊走について、同様の実験を行った。高抗体投与量ではｈＣＭ１０１が約９０％の著しい減少を来たすことがわかった（図２６Ｂ）。

【0269】

強皮症及びＩＰＦは線維芽細胞の増殖及び遊走を明確な特徴とする線維性疾患である。線維芽細胞の遊走に対するｈＣＭ１０１の効果を調べるために、ｈＣＭ１０１の存在下又は非存在下でエオタキシン２の方向への走化性アッセイを行った。ｈＣＭ１０１を加えた場合、遊走の著しい減少が観察され、対照と比較して僅か９％の細胞がトランスウェルに付着した（図２７）。ｈＣＭ１０１のエオタキシン−１への効果を検討すると、線維芽細胞遊走の６０％の阻害が示された（図２８）。

【0270】

線維芽細胞の筋線維芽細胞への転換は、平滑筋アクチンの発現の上昇に反映される。

【0271】

線維芽細胞の筋線維芽細胞への転換は、アルプァ−平滑筋アクチン（α−ＳＭＡ）の発現を伴い、線維化における重要な過程である。その出現は、血清中のサイトカイン及びケモカインの存在に誘導されうる。線維芽細胞の筋線維芽細胞への転換に対するｈＣＭ−１０１の影響を評価するために、ｈＣＭ−１０１をＳＳｃ患者の血清とインキュベーションし、次にこの血清をヒト線維芽細胞とインキュベーションして、α−ＳＭＡを誘導する能力を測定した。α−ＳＭＡ発現をフローサイトメトリーで評価した。図３０（エラー！参照元が見当たらず）に明らかに示されるように、血清をｈＣＭ−１０１（１０μｇ／ｍｌ）とインキュベーションしたとき、α−ＳＭＡの上昇は５０％弱くなった。これらの結果は、ＣＭ−１０１は全身性強皮症（ＳＳｃ）患者の血清によって刺激された線維芽細胞の筋線維芽細胞への転換を弱めることを示唆する。この転換はＳＳｃを特徴付ける細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の過剰な合成及びリモデリングに関与している。

【0272】

典型的にケモカインの活性化能は、細胞質基質へのカルシウム取り込みによって測定される。ＣＣＲ３発現細胞のエオタキシン−２及びさまざまな濃度のｈＣＭ−１０１とのインキュベーションは、図３０に示されるように、カルシウム取り込み（細胞活性化を示す）の著しい減少を明らかに示した。

【0273】

実施例６ ｈＣＭ１０１は、エピスクリーン（Ｅｐｉｓｃｒｅｅｎ）免疫原性試験で測定される免疫原性を示さない
免疫原性の相対的なリスクを決定するために、リード完全ヒト化抗エオタキシン−２抗体（ｈＣＭ１０１）を、エピスクリーン（商標）経時変化Ｔ細胞アッセイを用いて２０名の健康なドナーのコホートに対して試験した。試料は最終濃度５０μｇ／ｍｌのｈＣＭ１０１で試験した。これはこの飽和濃度が検出可能な抗体特異的Ｔ細胞応答を刺激するのに充分であることを示した以前の研究に基づいた。各試料の潜在的な免疫原性を評価するために、エピスクリーン（商標）経時変化Ｔ細胞アッセイを増殖の分析とともに使用してＴ細胞活性化を測定した。

【0274】

図３１は全時間経過を通したｈＣＭ１０１に対するドナーＳＩ反応を図示する。増殖アッセイにおいて、いずれのドナーでも完全ヒト化抗エオタキシン−２抗体は、ＳＩ≧２．０、ｐ＜０．０５の閾値で陽性反応を誘導しなかった。

【0275】

さまざまな生物製剤を用いた以前のエピスクリーン（商標）経時変化Ｔ細胞アッセイ（図３２）は、エピスクリーン（商標）アッセイのドナーＴ細胞反応％割合と、臨床で見られる免疫原性のレベル（抗タンパク質治療用抗体反応）との間に明らかな相関を示している。キャンパスなどの免疫原性抗体についてのエピスクリーン（商標）アッセイでは高い頻度のドナー反応が観察された一方で、ゾレア及びハーセプチンなどの非免疫原性抗体に関しては相対的に低い頻度のドナー反応が観察された。一般的には、エピスクリーン（商標）アッセイにおいて＜１０％陽性反応を誘発するタンパク質治療薬は臨床での免疫原性リスクが低い。今回の試験は、エピスクリーン（商標）アッセイで試験した他のタンパク質治療薬（図３２）と比較して、完全ヒト化抗エオタキシン−２抗体ｈＣＭ１０１はゾレア、ハーセプチン、及びアバスチンと同じ範囲に入り、免疫原性のリスクが低いとみなされると思われる。

【0276】

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２４． Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ Ｈ， Ｅｂｉｎａ Ｍ， Ｋｏｎｄｏｈ Ｙ， Ｏｇｕｒａ Ｔ， Ａｚｕｍａ Ａ， Ｓｕｇａ Ｍ， ｅｔ ａｌ． Ｐｉｒｆｅｎｉｄｏｎｅ ｉｎ ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｆｉｂｒｏｓｉｓ． Ｅｕｒ Ｒｅｓｐｉｒ Ｊ ２０１０； ３５（４）：８２１−８２９．

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5-1】

【図5-2】

【図6A】

【図6B】

【図6C】

【図6D】

【図6E】

【図6F】

【図6G】

【図6H】

【図7A】

【図7B】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13A】

【図13B】

【図13C】

【図13D】

【図13E】

【図13F】

【図13G】

【図13H】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図20A】

【図21】

【図21B】

【図21C】

【図21D】

【図21E】

【図21F】

【図21G】

【図21H】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27】

【図28】

【図29A】

【図29B】

【図29C】

【図30】

【図31】

【図32】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]