特許 6553085 消化管癌においてバイオマーカーを測定する方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6553085

(24)【登録日】2019年7月12日

(45)【発行日】2019年7月31日

(54)【発明の名称】消化管癌においてバイオマーカーを測定する方法

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/6869 20180101AFI20190722BHJP

   G01N 33/50 20060101ALI20190722BHJP

【ＦＩ】

   C12Q1/6869 ZZNA

   G01N33/50 P

【請求項の数】20

【全頁数】54

(21)【出願番号】特願2016-561581(P2016-561581)

(86)(22)【出願日】2014年12月30日

(65)【公表番号】特表2017-506909(P2017-506909A)

(43)【公表日】2017年3月16日

(86)【国際出願番号】SG2014000625

(87)【国際公開番号】WO2015102536

(87)【国際公開日】20150709

【審査請求日】2017年12月13日

(31)【優先権主張番号】201309689-6

(32)【優先日】2013年12月30日

(33)【優先権主張国】SG

(73)【特許権者】

【識別番号】508320734

【氏名又は名称】エイジェンシー フォー サイエンス，テクノロジー アンド リサーチ

(74)【代理人】

【識別番号】110001737

【氏名又は名称】特許業務法人スズエ国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】タン、ブーン・オイ・パトリック

(72)【発明者】

【氏名】村谷 匡史

(72)【発明者】

【氏名】カムラ、アディティ

【審査官】 松田 芳子

(56)【参考文献】

【文献】 特表２０１１−５０５１３２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２００８／０８３２５１（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 Berg, T., et al.，Characterization Of The Effects Of Mutated EZH2 On Expression and Epigenome In a Mouse Lymphoma Model，Blood，２０１３年１１月１５日，vol.122，346，http://b;oodjournal.org/content/122/21/346.short?sso-checked=true

【文献】 Hart, T., et al.，Finding the active genes in deep RNA-seq gene expression studies，BMC Genomics，２０１３年１１月１１日，vol.14，778

【文献】 Kwon, O., et al.，Aberrant up-regulation of LAMB3 and LAMC2 by promoter demethylation in gastric cancer，Biochem. Biophys. Res. Commun.，２０１１年，vol.406，p.539-545

【文献】 Gal-Yam, EN, et al.，Frequent switching of Polycomb repressive marks and DNA hypermethylation in the PC3 prostate cancer cell line，Proc. Natl. Acid. Sci. USA，２００８年，vol.105, no.35，p.12979-12984

【文献】 Yun, J., et al.，Gene silencing of EREG mediated by DNA methylation and histone modification in human gastric cancers，Laboratory Investigation，２０１２年，vol.92，p.1033-1044

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０１Ｎ １５／０９

Ｃ１２Ｑ １／６８６９

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＷＰＩＤＳ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

非癌性生物サンプルと相対的に、癌性生物サンプル中の少なくとも１つのプロモーターの活性を決定する方法であって、
前記癌性生物サンプルから得られた少なくとも１つのプロモーター配列を含む単離された核酸を、前記非癌性生物サンプルから得られたリファレンス核酸と対照してマッピングし、前記少なくとも１つのプロモーターについて１００万キロベース当たりのリード（ＲＰＫＭ）値又は１００万キロベース当たりのフラグメント（ＦＰＫＭ）値を得ること；及び
前記ＲＰＫＭ又はＦＰＫＭ値を使用して、前記リファレンス核酸配列中の前記少なくとも１つのプロモーターの活性と相対的に、前記核酸中の前記少なくとも１つのプロモーター配列のディファレンシャル活性を決定すること
を含み、
前記少なくとも１つのプロモーター配列のディファレンシャル活性を決定する工程が、前記癌性生物サンプルから得られた当該核酸中の少なくとも１つのプロモーターについての前記ＲＰＫＭ又はＦＰＫＭ値が、
ｉ）前記非癌性生物サンプルから得られた前記リファレンス核酸中の当該少なくとも１つのプロモーターの前記ＲＰＫＭ又はＦＰＫＭ値と相対的に、平均ＲＰＫＭ又はＦＰＫＭ値における変化が１〜２０倍の間、より大きい；及び
ｉｉ）前記非癌性生物サンプルから得られた前記リファレンス核酸中の前記少なくとも１つのプロモーターの前記ＲＰＫＭ又はＦＰＫＭ値と相対的に、ＲＰＫＭ又はＦＰＫＭの範囲が０．１よりも大きい
ことを決定することを含む
方法。

【請求項2】

請求項１の方法であって、前記癌性生物サンプル及び非癌性生物サンプルが、単一細胞、多細胞、細胞の断片、体液又は組織を含む方法。

【請求項3】

請求項１〜２の何れか１項の方法であって、前記癌性生物サンプル及び非癌性生物サンプルが同一の対象から得られる方法。

【請求項4】

請求項１〜３の何れか１項の方法であって、前記癌性生物サンプル及び非癌性生物サンプルがそれぞれ異なる対象から得られる方法。

【請求項5】

請求項１〜４の何れか１項の方法であって、前記核酸は、クロマチンの免疫沈降によって前記癌性生物サンプルから単離され、前記核酸は、前記少なくとも１つのプロモーターを含む方法。

【請求項6】

請求項５の方法であって、クロマチンの免疫沈降が、修飾されたヒストン蛋白質に対して特異的な抗体によって達成される方法。

【請求項7】

請求項６の方法であって、前記修飾されたヒストン蛋白質が、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３、Ｈ３Ｋ４ｍｅ１及びＨ３Ｋ２７ａｃからなる群より選択された少なくとも１つのヒストン修飾を含む方法。

【請求項8】

請求項７の方法であって、前記抗体が、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３、Ｈ３Ｋ４ｍｅ１及びＨ３Ｋ２７ａｃからなる群より選択された少なくとも１つのヒストン修飾に対して特異的である方法。

【請求項9】

請求項１〜８の何れか１項の方法であって、前記少なくとも１つのプロモーターを含む単離された核酸は、少なくとも１つのプライマーで増幅される方法。

【請求項10】

請求項９の方法であって、前記増幅された核酸は、前記増幅された核酸を含む核酸配列ライブラリの構築のために使用される方法。

【請求項11】

請求項１〜１０の何れか１項の方法であって、前記マッピング工程が、前記リファレンス核酸と相対的に、前記マッピングされた核酸中の当該少なくとも１つのプロモーターについての全配列ｔａｇに基づいて前記ＲＰＫＭ値を計算することを含む方法。

【請求項12】

請求項１〜１０の何れか１項の方法であって、前記マッピング工程が、前記リファレンス核酸と相対的に、前記マッピングされた核酸中の当該少なくとも１つのプロモーターに関連する同定された転写配列に基づいて前記ＦＰＫＭ値を計算することを含む方法。

【請求項13】

請求項１〜１２の何れか１項の方法であって、前記少なくとも１つのプロモーターは、当該全プロモーター集団と相対的に、ＳＵＺ１２結合部位の増加を含む方法。

【請求項14】

請求項１〜１３の何れか１項の方法であって、前記少なくとも１つのプロモーターは、細胞種特異化、胚発生又は転写因子に関連する遺伝子に近傍に位置する方法。

【請求項15】

請求項１４の方法であって、前記少なくとも１つのプロモーターは、癌に関連する遺伝子の近傍に位置する方法。

【請求項16】

請求項１５の方法であって、前記遺伝子が、ＮＫＸ６−３、ＳＡＬＬ４、ＨＯＸＢ９、ＭＥＴ、ＴＮＫ２、ＫＬＫ１、ＦＡＲ２、ＨＯＸＡ１１又はＨＯＸＡ１１−ＡＳである方法。

【請求項17】

請求項１〜１６の何れか１項の方法であって、前記癌が胃癌である方法。

【請求項18】

請求項１〜１７の何れか１項の方法であって、前記少なくとも１つのプロモーターが、潜在性プロモーターを含む方法。

【請求項19】

請求項１〜１８の何れか１項の方法であって、
前記非癌性生物サンプル中のそれと相対的な、当該癌性生物サンプル中の前記少なくとも１つのプロモーターの活性の増大が、癌に対する当該対象の感受性を示す
方法。

【請求項20】

請求項１〜１８の何れか１項の方法であって、
前記非癌性生物サンプルのそれと相対的な、前記対象から得られた当該癌性生物サンプル中の当該少なくとも１つのプロモーターの活性の増大が、対象における癌に関連するプロモーターの存在を示す方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

発明の分野
本発明は、分子生物学の分野に関する。とりわけ、本発明は、プロモーターの活性を決定する方法に関する。

【背景技術】

【0002】

発明の背景
胃癌（ＧＣ）は、世界的な癌死亡率の主な原因である。殆どのＧＣは、腺癌であり、最近のエクソーム及び全ゲノム研究が、新規のＧＣドライバー遺伝子及び突然変異シグネチャを明らかにした。蛋白質コード遺伝子に加えて、非コードゲノム領域の調節エレメントもまた、悪性度に寄与するものであると思われ、例えば、これらのエレメントは、クロマチン構造及び遺伝子発現に大いに影響を与え得る。ゲノム規模で胃癌発生期間中に体細胞的に変化する調節エレメントのレパートリーを探索してきた研究は少ない。

【0003】

プロモーター及びエンハンサーを含む調節エレメントは、ヒストン修飾（「クロマチンマーク」）を提示する領域として確認され得る。今まで、殆どの癌におけるクロマチンマーク研究は、不死化細胞株を用いてきたが、それは既存のプロトコールが相当量の生物材料を必要とするからである。しかしながら、インビトロで培養された癌株は、原発腫瘍とは異なるエピジェネティックパターンを示す可能性があり、また、多くの継代のために細胞株がインビトロ適応を受け、遺伝子的及びエピジェネティックな変化を獲得する可能性がある。癌細胞株を使用する体細胞的に得られた変性の同定もまた困難であり、例えば、それらは多くの場合に対応する正常な対象物を欠いている。

【0004】

そのため、上述の１つ以上の不都合を打開する、又は少なくとも改善するクロマチンマークを測定するための方法を提供する必要がある。

【発明の概要】

【0005】

１つの態様において、非癌性生物サンプルと相対的に、癌性生物サンプル中の少なくとも１つのプロモーターの活性を決定する方法であって；前記癌性生物サンプルから得られた少なくとも１つのプロモーター配列を含む単離された核酸を、前記非癌性生物サンプルから得られたリファレンス核酸と対照してマッピングし、前記少なくとも１つのプロモーターについて１００万キロベース当たりのリード（a read per kilo-base per million; ＲＰＫＭ）値又は１００万キロベース当たりのフラグメント（fragments per kilo-base per million; ＦＰＫＭ）値を得ること；及び前記ＲＰＫＭ又はＦＰＫＭ値を使用して、前記リファレンス核酸配列中の当該少なくとも１つのプロモーターの活性と相対的に、前記核酸中の前記少なくとも１つのプロモーターの活性のディファレンシャル活性を決定することを含む方法が提供される。

【0006】

もう１つの態様に従うと、癌に対する対象の感受性を決定する方法であって、対象の癌性生物サンプルから得られた少なくとも１つのプロモーターを含む単離核酸を、非癌性生物サンプルから得られたリファレンス核酸と対照してマッピングし、前記少なくとも１つのプロモーターについてのＲＰＫＭ又はＦＰＫＭ値を得ること；及び前記ＲＰＫＭ又はＦＰＫＭ値を使用して、前記リファレンス核酸中の前記少なくとも１つのプロモーターの活性と相対的に、前記核酸中の当該少なくとも１つのプロモーターのディファレンシャル活性を決定することを含み、ここにおいて、非癌性サンプル中のそれに対して相対的な前記癌性サンプル中の前記少なくとも１つのプロモーターの活性の増大が、癌に対する前記対象の当該感受性を示す方法が提供される。

【0007】

もう１つの態様において、対象において癌に関連する少なくとも１つプロモーターの存在を決定する方法であって、対象の癌性生物サンプルから得られた少なくとも１つプロモーターを含む単離された核酸を非癌性生物サンプルから得られたリファレンス核酸と対照してマッピングし、前記少なくとも１つのプロモーターについてのＲＰＫＭ又はＦＰＫＭ値を得ること；及び前記ＲＰＫＭ又はＦＰＫＭ値を使用して前記リファレンス核酸中の前記少なくとも１つのプロモーターの活性と相対的に、前記核酸中の前記少なくとも１つプロモーターのディファレンシャル活性を決定することを含み、ここにおいて、非癌性生物サンプルのそれと相対的に前記対象から得た癌性生物サンプル中の前記少なくとも１つのプロモーターの活性の増大が、対象における癌に関連するプロモーターの存在を示す方法が提供される。

【0008】

もう１つの態様において、対象において癌を検出するためのバイオマーカーであって、正常な非癌性生物サンプルと相対的に癌性生物サンプル中で活性が増大した少なくとも１つのプロモーターを含み、そこにおいて前記プロモーターが全プロモーター集団と相対的にＳＵＺ１２結合部位の増加を備えるバイオマーカーが提供される。

【0009】

もう１つの態様において、非癌性生物サンプルと相対的に癌性生物サンプル中で癌に関連する少なくとも１つのプロモーターの存在を決定する方法であって、前記非癌性生物サンプルから得られたリファレンス核酸に対照して、前記癌性生物サンプルから得られた少なくとも１つのプロモーター配列を含む単離された核酸をマッピングすること；前記マッピングすることに基づいて前記少なくとも１つのプロモーターについてシーケンシングタグ計数のマトリックスを発生させること；前記シーケンシングタグ計数のマトリックスを解析すること；及び前記シーケンシングタグ計数のマトリックスを使用して前記リファレンス核酸中の前記少なくとも１つのプロモーターと相対的に、前記核酸中の前記少なくとも１つのプロモーターのディファレンシャルエンリッチメント（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）を決定することを含み、ここにおいて、前記非癌性生物サンプルのそれと相対的な、前記対象から得られた当該癌性生物サンプル中の当該少なくとも１つのプロモーターの前記特異的エンリッチメントが、対象における癌に関連するプロモーターの存在を示す方法が提供される。

【0010】

もう１つの態様において、非癌性生物サンプルと相対的に癌性生物サンプル中の少なくとも１つのプロモーターの活性を決定する方法であって、前記非癌性生物サンプルから得られたリファレンス核酸に対照して前記癌性生物サンプルから得られた少なくとも１つのプロモーター配列を含む単離された核酸をマッピングすること；前記マッピングすることに基づいて前記少なくとも１つのプロモーターについてシーケンシングタグ計数のマトリックスを発生させること；前記シーケンシングタグ計数のマトリックスを解析すること；及び前記シーケンシングタグ計数のマトリックスの解析を使用して前記リファレンス核酸中の前記少なくとも１つのプロモーターと相対的に前記核酸中の当該少なくとも１つのプロモーターの当該ディファレンシャル活性を決定することを含む方法が提供される。

【0011】

定義
ここで使用されるとき、用語「抗原結合蛋白質」は、抗体、抗体フラグメント及び他のタンパク質構築物、例えば、抗原に対して結合可能なドメインなどをいう。

【0012】

用語「抗体」は、ここにおいて最も広い意味で使用され、イムノグロブリン様ドメインを含む分子について呼び、モノクローナル、リコンビナント、ポリクローナル、キメラ、ヒト化、二重特異性及びヘテロコンジュゲート抗体；単一可変ドメイン、ドメイン抗体、抗原結合フラグメント、免疫学的に有効なフラグメント、単一鎖Ｆｖ、ディアボディ（ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）、Ｔａｎｄａｂｓ（登録商標）、などを含む（代替「抗体」の構成の概要について、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ａｎｄ Ｈｕｄｓｏｎ， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ２００５， Ｖｏｌ ２３， Ｎｏ． ９， １１２６−１１３６を参照されたい）。

【0013】

語句「単一可変ドメイン」は、抗原結合蛋白質可変ドメイン（例えば、Ｖ_Ｈ、Ｖ_ＨＨ、Ｖ_Ｌ）をいい、これは別の可変領域又はドメインとは関係なく特異的に抗原又はエピトープと結合する。

【0014】

「ドメイン抗体」又は「ｄＡｂ」は、抗原に対して結合可能な「単一可変ドメイン」と同じと見なされ得る。単一可変ドメインは、ヒト抗体可変ドメインであってよいが、また他の種、例えば、げっ歯類（例えば、ＷＯ００／２９００４に開示されるような）、テンジクザメ及びラクダ科のＶ_ＨＨ ｄＡｂｓなどからの単一抗体可変ドメインを含む。ラクダ科のＶ_ＨＨは、免疫グロブリン単一可変ドメインポリペプチドであり、それらは、ラクダ、ラマ、アルパカ、ヒトコブラクダ及びグアナコを含む種に由来し、天然に軽鎖を欠く重鎖抗体を生成する。そのようなＶ_ＨＨは、当該技術において利用可能な標準的な技術に従ってヒト化されてもよく、そのようなドメインは「ドメイン抗体」と見なされる。ここで使用されるとき、Ｖ_ＨＨはラクダ科のＶ_ＨＨドメインを含む。

【0015】

ここで使用されるとき、用語「ドメイン」は、折り畳み蛋白質構造を呼び、それは蛋白質の残りの部分から独立している三次元構造を有する。一般に、ドメインは蛋白質の個々の機能特性に関与し、多くの場合において蛋白質及び／又はドメインの残りの部分の機能を失うことなく、付加、除去又は他の蛋白質へと移動され得る。

【0016】

「単一可変ドメイン」は、抗体可変ドメインの特徴を示す配列を含む折り畳みポリペプチドドメインである。そのためそれは、完全抗体可変ドメイン及び修飾された可変ドメイン、例えば、そこにおいて１つ以上のループが抗体可変ドメインの特徴を示さない配列で置換されているもの、又は抗体可変ドメイン、それは、短縮されているか、若しくはＮ又はＣ末端伸長を有しているもの、並びに可変ドメインの折り畳みフラグメント、それは、少なくとも結合活性と完全長とメインの特異性を維持しているものを含む。ドメインは、別の可変領域若しくはドメインとは独立に抗原又はエピトープに結合できる。

【0017】

抗原結合フラグメントは、非抗体蛋白質骨格、例えば、ドメインなどの上に１以上のＣＤＲを配置することによって提供され得る。ドメインは、ドメイン抗体であってもよく、ＣＴＬＡ−４、リポカリン、ＳｐＡ、アフィボディ（Ａｆｆｉｂｏｄｙ）、アビマー（ａｖｉｍｅｒ）、ＧｒｏＥｌ、トランスフェリン、ＧｒｏＥＳ及びフィブロネクチン／アドネクチンからなる群より選択される骨格の誘導体であるドメインであってもよく、それは、抗原に対する結合を得るために蛋白質工学に供されたものであり得る。

【0018】

抗原結合フラグメント又は免疫学的に有効なフラグメントは、部分的な重鎖又は軽鎖可変配列を含んでもよい。フラグメントは、少なくとも５、６、８又は１０アミン酸長である。或いは、フラグメントは、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも５０、少なくとも７５又は少なくとも１００アミン酸長である。

【0019】

抗原結合蛋白質に関して本明細書を通して使用されるとき、用語「特異的に結合」は、他の蛋白質に対する結合を伴わずに、若しくは顕著な結合を伴わずに抗原結合蛋白質が抗体に対して結合することを意味する。しかしながら当該用語は、抗原結合蛋白質が密接に関連した分子と交差反応性であり得るという事実を排除するものではない。

【0020】

ここで使用されるとき、用語「生体物質」又は「生体サンプル」は、何れかの物質又はサンプルをいい、それはここで定義されるような検体を含む。そのようなサンプルは、例えば、排泄物、全血、血清、血漿、涙液、唾液、鼻汁、痰、耳汁、生殖器液、乳汁、乳、初乳、胎盤液、羊水、汗、滑液、腹水、脳脊髄液、胆汁、胃液、房水、硝子体液、胃腸液、浸出液（ｅｘｕｄａｔｅ）、漏出液（ｔｒａｎｓｕｄａｔｅ）、胸膜液、心嚢液、精液、上気道液、腹膜水、免疫反応の部位から採取された液体、プールされた収集部位から採取された液体、気管支洗浄液、尿、生検材料、例えば、全ての適切な臓器、例えば、肺、筋、脳、肝臓、皮膚、膵臓、胃及び類似物などからのもの、有核細胞サンプル、粘膜面に関連する液体、毛髪又は皮膚などに由来する、又は含むサンプルを含んでもよい。

【0021】

ここで使用されるとき、用語「ＲＰＫＭ」は、リード・パー・キロベース・パー・ミリオン・リード・マップ（Ｒｅａｄｓ Ｐｅｒ Ｋｉｌｏｂａｓｅ ｐｅｒ Ｍｉｌｌｉｏｎ ｒｅａｄｓ ｍａｐｐｅｄ）をいう。用語「ＦＰＫＭ」は、フラグメント・パー・キロベース・パー・ミリオン・フラグメント・マップ（ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｐｅｒ ｋｉｌｏ−ｂａｓｅ ｐｅｒ ｍｉｌｌｉｏｎ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｍａｐｐｅｄ）をいう。ＲＰＫＭ及びＦＰＫＭは、何れかのゲノムの特徴、例えば、エクソン、転写物又はゲノム座標の存在度を定量化するためのユニットであり、それに対して整列している多数のシーケンシング・リードによって決定される。ＲＰＫＭ及びＦＰＫＭ測定は、ゲノムユニットの相対的長さ並びにそれに対するリード・マッピングの総数によって存在量を標準化し、サンプル内又はサンプル間での存在レベルの明白な比較を容易にする。

【0022】

ここで使用されるとき、用語「シーケンシングタグ計数のマトリックス」は、マッピングされた「シーケンシングタグ」のマトリックス状の整数をいう。マトリックスは、行列を備えるテーブルの形式にあってもよく、そこにおいてマトリックスの列（ゲノム領域）及び行（組織サンプル）中の値は、幾つのリードがゲノム領域、例えば、プロモータ領域又はヒストン修飾領域、例えば、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３領域などに対してマッピングされたかを示し得る。同じように、マトリックスの列はまた、結合領域（ＣｈＩＰ−Ｓｅｑを伴う）に対応していてもよい。前述の「シーケンシングタグ」は、ここで使用されるとき、サンプルから単離された短鎖ＤＮＡフラグメントをいい、それはアラインメントツール（ここで開示される方法で言及されるような）を使用してリファレンスゲノムに対してマッピングされる。

【0023】

ここで使用されるとき、実施例との関連において、用語「ベッドツール」は、ゲノム解析のための当該技術において周知である公開された１組のツールをいう。例えば、「ベッドツール」は、ブラウザー・エクステンシブル・データ（Ｂｒｏｗｓｅｒ Ｅｘｔｅｎｓｉｂｌｅ Ｄａｔａ （ＢＥＤ））及びジェネラル・フィーチャー・フォーマット（Ｇｅｎｅｒａｌ Ｆｅａｔｕｒｅ Ｆｏｒｍａｔ （ＧＦＦ））形式でのゲノムの特徴の比較、操作及び注釈のために使用され得る。ベッドツールはまた、ＢＡＭ形式にある配列アラインメントのＢＥＤ及びＧＦＦ特徴両者に対する比較を確かにする。ベッドツールは、極めて効率的であり、使用者が大型データベース（例えば、次世代シーケンシングデータなど）をパブリック及びカスタムゲノム注釈トラックの両者と比較することを可能にする。ベッドツールは、極めて効率的であり、大きなデータベース（例えば、次世代シーケンシングデータなど）とパブリック及びカスタムゲノム注釈トラックの両者と比較することを使用者に可能にする。例えば、「ベッドツール（ｂｅｄｔｏｏｌｓ）」は、「ＢＥＤＴｏｏｌｓ」とも称され、それによりＢＥＤＴｏｏｌｓは、互いに、並びにスタンダードＵＮＩＸコマンドと併用され、それ故に大型ゲノムデータセットの複雑な質問に速く回答できるルーチンゲノミックタスク、並びにパイプラインを容易にできる。とりわけ、そのような「ベッドツール」は、ｈｔｔｐ：／／ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｏｘｆｏｒｄｊｏｕｒｎａｌｓ．ｏｒｇ／ｃｏｎｔｅｎｔ／２６／６／８４１．ｆｕｌｌで見つけることが可能である。

【0024】

ここでしようされるとき、用語「得られた」又は「に由来する」は、包括的に使用されることを意味する。即ち、生物サンプルから直接に単離された何れかの核酸配列または当該サンプルに由来する何れかの核酸配列を包含することが意図される。

【0025】

ここで例示的に記載される本発明は、ここにおいて明確に開示されていない何れかのエレメント又はエレメント群、制限又は制限群の不在において適切に実施され得る。従って、例えば、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」等は広く、制限なく読まれるべきである。加えて、ここにおいて使用される用語及び表現は、説明のための表現として使用されており、制限のために使用されるものではなく、そのような用語の使用において、示され、記載される特徴又はその一部分の何れの均等物を排除する意思はないが、しかしながら権利請求された本発明の範囲内において多様な修飾が可能であることが認められる。従って、本発明は好ましい実施形態及び任意の特徴群によって明確に開示されているものではあるが、ここにおいては、そこにおいて具現化される本発明の修飾物及び変化物が当業者によって採用されてよいこと、並びにそのような修飾物及び変化物が本発明の範囲内のものであると判断されることが理解されるべきである。

【0026】

本発明は、ここにおいて広く且つ一般的に記載されている。一般的な開示内に収まる狭い種及び部分世代集団のそれぞれもまた、本発明の一部分を形成している。これは、削除されるものがここにおいて明確に列挙されているか否かに拘わらず、当該属からの何れかの主題を取り除く条件又は否定的な制限を伴う本発明の一般的な記載も含む。

【0027】

他の実施形態は、以下の特許請求の範囲および非限定的な例の範囲にある。加えて、本発明の特徴又は態様が、マーカッシュ群の観点から記載されている場合には、当業者は、それにより本発明がまた、何れかのマーカッシュ群の個々のメンバー又は下位集団のメンバーに関して記載していることを理解できる。

【図面の簡単な説明】

【0028】

本発明は、当該詳細な説明を参照して、非限定的な例及び添付図面と併せて考えると、よりよく理解できる。そこにおいて：

【図1-1】原発性胃腺癌のナノＣｈＩＰｓｅｑクロマチンプロファイル。（ａ）クロマチンマークの分析。（ｂ）ＧＣ２０００７２１及び対応する正常な組織のクロマチンプロファイル（それぞれＣおよびＮ）。ＣＤＸ２遺伝子の遺伝子座及び近接遺伝子の代表的なＵＣＳＣゲノムブラウザーディスプレイが示されている。ＲｅｆＳｅｑ転写物及びヒストン修飾が表示されている。（ｃ）ＣＤＸ２遺伝子の近景、ＧＣにおけるＨ３Ｋ４ｍｅ３及びＨ３Ｋ２７ａｃ獲得が明らかにされている。（ｄ）クロマチンマークのピークは正常（上部）及びＧＣ（下部）においてオーバーラップしている。ＧＣ２０００７２１が示されている。数字は、第１のセット領域（縦）のフラクションが、第２のセット領域（横）とオーバーラップしていることを示している。白色＝排他的、濃灰色＝オーバーラップ。（ｅ）ＧＣエンハンサー及びプロモーター。プロモーター及びエンハンサー領域は、更にそれらのＨ３Ｋ２７ａｃシグナルとのオーバーラップによって分類された。（ｆ、ｇ）主成分解析は、体細胞的に変化した（ｆ）プロモータ−（Ｈ３Ｋ４ｍｅ３）及び（ｇ）エンハンサー（Ｈ３Ｋ４ｍｅ１）領域に基づいて正常（青色）及びＧＣ（赤色）サンプルを示す。最上から３つの主成分が使用された。（ｈ、ｉ）体細胞的に変化した（ｈ）プロモーター及び（ｉ）エンハンサー（Ｈ３Ｋ４ｍｅ１）領域に基づく及び正常（青色）及びＧＣ（赤色）サンプルのクラスタリングヒートマップ。Ｈ３Ｋ２７ａｃパターンも示される。色の強さは、規格化されたＲＰＫＭ値に対応する。

【図1-2】同上。

【図1-3】同上。

【図1-4】同上。

【図1-5】同上。

【図1-6】同上。

【図2-1】ＧＣ中の癌関連プロモーター。（ａ）癌関連プロモーターは、高頻度に非ＲｅｆＳｅｑ ＴＳＳ（「潜在性プロモーター」）に関連する。全プロモーター（「総」）及び癌におけるプロモーター喪失（「喪失」）に関連する潜在性プロモーター比率は、参考として提供されている。癌関連プロモーターもまた、ＲＮＡｓｅｑデータから発現された非ＲｅｆＳｅｑに関連する（最右の数字）。（ｂ）正常組織と胃腫瘍との間の＞４倍の発現変化を提示する非ＲｅｆＳｅｑ転写物の発現状態を示すヒートマップ（ＦＰＫＭ；１００万のマッピングされたリード当たりのキロベースの転写物当たりのフラグメント）。転写物は、１９２個の癌関連プロモーターに関連する。（ｃ）癌関連プロモーターについてのエンリッチ遺伝子カテゴリーを示すＧＲＥＡＴ解析。オリジナルＧＲＥＡＴアウトプットからのｐ＜６×１０_−６全エンリッチ項目がリストに記載されている。（ｄ、ｅ）潜在性プロモーター稼働性ＭＥＴ発現。ＲＮＡｓｅｑ及びＨ３Ｋ４ｍｅ３トラックが示される。（ｅ）下流ＭＥＴエクソンへのプロモーターの連結を確かにする代表的な「スプリット」ＲＮＡｓｅｑタグを示す、潜在性プロモーター領域の近景。（ｆ）ＭＥＴ機能的ドメイン。予測される潜在性プロモーター稼働性転写物は、Ｓｅｍａドメインを欠くＮ末端トランケート蛋白質をコードする。（ｇ）潜在性プロモーター稼働性ＮＫＸ６−３発現。ＲＮＡｓｅｑ及びＨ３Ｋ４ｍｅ３トラックが示される。ＲＮＡｓｅｑアラインメントは、図１４に提供される。（ｈ）潜在性プロモーター稼働性ＨＯＸＢ９発現。ＲＮＡｓｅｑアラインメントは、図１５に提供される。（ｉ）ＧＣ群（ｎ＝１８５）と対応する正常群（ｎ＝８９）の間のＨ３Ｋ４ｍｅ３マーク遺伝子の発現レベル。遺伝子の有意な比率は、ＧＣにおいて上方に調節される（上方調節遺伝子＝１４３；総ターゲット遺伝子＝２１８；ｐ＝５．６８ｘ１０_−６）。（ｊ）癌関連プロモーターにより稼働される遺伝子の高及び低発現を示す、ＧＣ群と患者群との比較をしている生存率解析。「高」（ｎ＝１５４）及び「低」（ｎ＝２９）エンリッチメントのターゲット遺伝子シグネチャーを含む、シンガポール人集団（総ｎ＝１８３）の内でのクラスターのカプラン・マイヤー生存率解析。シグネチャーは、この集団における予測であり（ログランクｐ値：０．０４１）、シグネチャーのより高エンリッチメントについて観察されるより悪い予後を含む（Ｈ．Ｒ．（９５％Ｃ．Ｉ．）：１．７８（１．０２−３．１３）；ｐ＝０．０４４）。

【図2-2】同上。

【図2-3】同上。

【図2-4】同上。

【図2-5】同上。

【図2-6】同上。

【図2-7】同上。

【図3-1】癌関連調節エレメントの結合部位解析。（ａ）癌関連プロモーターとオーバーラップしているＥＮＣＯＤＥ確定転写因子結合部位（ＥＮＣＯＤＥ−ｄｅｆｉｎｅｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ； ＴＦＢＳ）の頻度（獲得及び喪失）。数値は、１０ｋｂカバレージ当たりのＴＦＢＳの数として示される。ＴＦは、全Ｈ３Ｋ４ｍｅ３確定プロモーターセットにおけるそれらの頻度に従って分類された。ＥＺＨ２、ＳＵＺ１２及びＺＮＦ２１７結合部位は、エンリッチである（ｐ＜０．０５）。完全なＴＦリストは図１８に示される。（ｂ）癌関連エンハンサー領域中のＴＦＢＳ頻度。（ｃ）ＥＳＣ確定ユニビバレント（Ｈ３Ｋ４ｍｅ３のみ、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３のみ）又はビバレント（Ｈ３Ｋ４ｍｅ３及びＨ３Ｋ２７ｍｅ３）領域、並びに（全及び癌関連）ＧＣプロモーター及び（全及び癌関連）ＧＣエンハンサーの間でのオーバーラップ解析。癌関連ＧＣプロモーターは、高い割合のビバレント領域、過度の割合のユニビバレント領域を示す（ｐ＜２．２ｘ１０_−１６）。（ｄ）ＥＳＣ確定ビバレント領域とオーバーラップしている代表的な癌関連プロモーターとしてのＯＮＥＣＵＴ２遺伝子座のゲノムブラウザー図。（ｅ）全プロモーター及び癌関連プロモーター中のＤＮＡメチル化変化（獲得又は喪失）を示すボックスプロット。Ｐ値（ウィルコクソン検定）は、ｐ＝７ｘ１０_−４８（全プロモーター対獲得プロモーター）；ｐ＝０．４８（全プロモーター対喪失プロモーター）；ｐ＝５．３７ｘ１０_−４１（獲得プロモーター対喪失プロモーター）。

【図3-2】同上。

【図3-3】同上。

【図3-4】同上。

【図3-5】同上。

【図3-6】同上。

【図4-1】ＧＣに関連するアレル特異性調節エレメント。（ａ−ｄ）非アレルバイアス及び 非アレルバイアス、並びに（ｅ−ｈ）アレルバイアス調節エレメント。（ａ−ｂ）ＲＮＡｓｅｑ及びＨ３Ｋ４ｍｅ３トラックを示すＴＮＫ２遺伝子座のゲノムブラウザー図。（ｂ）は、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３シーケンシングタグ及びＳＮＰの近景及び視覚化を与える。レファレンス（ｃ）及びｒｓ７６３６６３５（Ｔ）ＳＮＰの同程度の割合が、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３エンリッチ配列リードにおいて観察される。（ｃ）正常組織のジェノタイピングは、正常組織及び腫瘍からのＨ３Ｋ４ｍｅ３エンリッチシーケンシングタグにおける均等なアレルヘテロ接合性を確かにする。（ｄ）定量的ＰＣＲパイロシーケンシングは、正常組織中のＨ３Ｋ４ｍｅ３シグナルの不足、並びにリファレンス（ｃ）と腫瘍からのＨ３Ｋ４ｍｅ３エンリッチ配列リードを含むｒｓ７６３６６３５（Ｔ）アレルとの同等の割合を確かにする。（ｅ、ｆ）ＲＮＡｓｅｑ及びＨ３Ｋ４ｍｅ３トラックを示すＮＵＤＴ４遺伝子座のゲノムブラウザー図。（ｆ）は、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３シーケンシングタグ及びＳＮＰの近景及び可視化を与える。リファレンスアレル（Ｇ）を越えるｒｓ４７６１７０１ ＳＮＰ（Ａ）の高い割合を支持するバイアスが観察される。（ｇ）正常組織のジェノタイピングは、正常組織中の均等なアレルヘテロ接合性を確かにするが、バイアスは、腫瘍からのＨ３Ｋ４ｍｅ３シーケンシングタグ中のｒｓ４７６１７０１ ＳＮＰ（Ａ）に向う。（ｈ）定量的ＰＣＲパイロシーケンシングは、正常組織における最小限のＨ３Ｋ４ｍｅ３シグナル、並びにリファレンスアレルを越える、腫瘍からのＨ３Ｋ４ｍｅ３シグナル中のｒｓ４７６１７０１ ＳＮＰでバイアスされているシーケンシングタグの割合を確かにする。

【0029】

（ｉ）サンプル全域でのアレルバイアス分布。腫瘍組織中のＳＮＰタグの上方及び下方発現量をそれぞれ緑色及び青色で標した。（ｊ）変化したプロモーター及びエンハンサー領域に対するｄｂＳＮＰ部位マッピング。ＳＮＰ部位は、Ｘ軸においてはそれらの染色体の位置に従い、Ｙ軸に沿ってそれらの対応するアレルバイアスに従って配置されている。ＳＮＰは、アレルバイアスを示しており（上方の青色の横線）、それらはまたレギュロームＤＢ（ＲｅｇｕｌｏｍｅＤＢ）に基づいて蛋白質結合に影響を与えることが予測され、それらは赤色で標した。（ｋ）体細胞的に変化した調節エレメントに対してマッピングされたアレルバイアスされた部位についてのレギュロームＤＢ予測。

【0030】

（ｌ、ｍ）ＲＮＡｓｅｑ及びＨ３Ｋ４ｍｅ３トラックを示すＫＬＫ１遺伝子座のゲノムブラウザー図。（ｍ）は、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３シーケンシングタグ及びＳＮＰの近景を与える。リファレンスアレル（Ａ）を越える、公知のｅＱＴＬ ＳＮＰ ｒｓ２６５９１０４（Ｇ）の高い割合を支持するバイアスが観察される。（ｎ）定量的ＰＣＲパイロシーケンシングは、正常組織中の最小限のＨ３Ｋ４ｍｅ３シグナル、並びに腫瘍からのＨ３Ｋ４ｍｅ３シグナルにおける親のアレルを越えるシーケンシングタグのｒｓ２６５９１０４ ＳＮＰバイアスされた割合を確かにする。

【図4-2】同上。

【図4-3】同上。

【図4-4】同上。

【図4-5】同上。

【図4-6】同上。

【図4-7】同上。

【図4-8】同上。

【図5-1】ＧＣにおける体細胞調整。（ａ）ＨＯＸＡ遺伝子座のゲノムブラウザー図。（上部）ＲＮＡｓｅｑデー。ＨＯＸＡ１１に対して遠位の（及び含む）ＨＯＸＡ遺伝子は、癌特異的な方法でＧＣ ２０００６３９に発現される。（下部）Ｈ３Ｋ４ｍｅ３シグナルは、この領域における変化されたクロマチンドメインを確かにする。（ｂ）ＨＯＸＡ１１領域の近景。ＧＣ ２０００６３９におけるＨ３Ｋ４ｍｅ３の癌特異的獲得が観察される。（ｃ）Ｈ３Ｋ２７ａｃシーケンシングタグアラインメントは、ｃｈｒ７：２７，２２８，０８５位でのＴアレルの存在を予測する一方で、リファレンス（ｈｇ１９）は、この部位でＡを示す。この部位は、公知のｄｂＳＮＰに対応しない。（ｄ）インプット正常ＤＮＡ、インプット腫瘍ＤＮＡ及びＨ３Ｋ２７ａｃエンリッチＣｈＩＰｓｅｑ ＤＮＡにおけるジェノタイブのサンガーシーケンシング及びパイロシーケンシングバリデーション。正常サンプルは、Ａアレルについてホモ接合性であると同時に、癌は、この位置でのスモールＴシグナルを有する（アレル頻度１０％が推定される）。対照的に、Ｈ３Ｋ２７中心外のＤＮＡは、高い割合のＴアレルを示す（９６％）。（ｅ）リファレンス及び体細胞的変異アレルのためのＴＦＢＩＮＤによるＴＦ部位予測。ＬＹＦ１、ＳＴＡＴ及びＮＦ１部位が獲得されていることが予測されると同時に、ＣＥＢＰ、ＮＦＫＢ及びｐ５３部位が喪失されていることが予測される。（ｆ）野生型及び変異型アレルの調節活性を測定するルシフェラーゼレポーターアッセイ。変異型アレルを含むＤＮＡは、転写活性の増加を与える（＊ｐ＝１．１ｘ１０_−４）。実験は、ＫＡＴＯ−ＩＩＩ ＧＣ細胞中で行われた。

【図5-2】同上。

【図5-3】同上。

【図6-1】Ｎｇら（２０１３）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｃｅｌｌからの１，０００細胞スケールナノＣｈＩＰｓｅｑバリデーション。スモールスケールＣｈＩＰｓｅｑ（即ち、ナノＣｈＩＰｓｅｑ）とスタンダードＣｈＩＰｓｅｑとの比較。

【図6-2】同上。

【図7-1】ナノＣｈＩＰｓｅｑピークコーリング及びピークマージング。（ａ）患者２０００７２１正常（２０００７２１Ｎ）における５ヒストン修飾についてのナノＣｈＩＰｓｅｑタグ密度の代表的なＵＣＳＣブラウザー図。ピーク領域は、各ＣｈＩＰｓｅｑトラックの上に表示されている。遺伝子トラックは、ＲｅｆＳｅｑ転写物を示す（ｂ）６組織サンプルのＨ３Ｋ４ｍｅ３ピークプロファイル。マージしたピーク領域は、ＲｅｆＳｅｑ転写物トラックの下に示される。

【図7-2】同上。

【図8-1】増幅された領域の識別及び除去。組織２０００６３９ＣにおけるＫＲＡＳ遺伝子座（ａ）及び組織２０００９８６ＣのＭＹＣ（ｂ）周辺の増幅された遺伝子座の代表的な図。癌インプットＤＮＡ中で多量のシーケンシングタグを示す領域は、続く解析からは除外された。

【図8-2】同上。

【図9】ＧＣ／正常対におけるクロマチンマークのオーバーラップ。サンプル対２０００６３９（ａ）及び２０００９８６（ｂ）についての正常（上部）及び癌組織（下部）中のクロマチンマーク領域のオーバーラップ。数値は、第２のセット領域（横）とオーバーラップしている第１のセット領域（縦）のフラクションを示す。白色＝排他的、濃灰色＝オーバーラップ。

【図10-1】ナノＣｈＩＰｓｅｑ ＲＰＫＭ前処理。（ａ−ｄ）プロモーター及びエンハンサー領域についての（ＣｏｍＢａｔ正規化後）対数変換されたＣｈＩＰｓｅｑ ＦＰＫＭ値のボックスプロット。（ｅ−ｈ）線形モデルフィッティングからの生ｐ値分布。

【図10-2】同上。

【図11-1】ＧＣ及び正常組織のＰＣＡプロット。（ａ、ｂ）及び（ｄ、ｅ）（ａ）全ての同定された（ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ）Ｈ３Ｋ４ｍｅ３プロモーター及び（ｂ）関連Ｈ３Ｋ２７ａｃ活性；又は（ｄ）全同定されたＨ３Ｋ４ｍｅ１エンハンサー及び（ｅ）関連Ｈ３Ｋ２７ａｃ領域を使用するＧＣ（紫色）及び正常（青色）組織のＰＣＡプロット。（ｃ及びｆ）体細胞的な変化を示すＨ３Ｋ２７ａｃ領域を使用するＰＣＡプロット。

【図11-2】同上。

【図11-3】同上。

【図12-1】非ＲｅｆＳｅｑ転写物のＲＴ−ｑＰＣＲバリデーション。ＲＮＡｓｅｑ解析に由来するＦＰＫＭ値と比較した、ＧＣ及び正常組織における１０個の非ＲｅｆＳｅｑ転写物についてのＲＴ−ｑＰＣＲバリデーション結果。

【図12-2】同上。

【図13-1】ＭＥＴ遺伝子ＲＮＡｓｅｑアラインメント。（ａ）ＭＥＴ遺伝子の遺伝子座で発現されたＲＮＡのエクソンーイントロン構造を支持するＲＮＡｓｅｑタグアラインメント。ＭＥＴＲｅｆＳｅｑ転写物が、最上部の注釈において示されている。（ｂ、ｃ）ＲＮＡｓｅｑアラインメントの近景。潜在性プロモーター稼働性エクソンについてのエクソンーイントロン境界が、シーケンシングタグアラインメントの手動の調査によって確認された。（ｄ）ＲＮＡｓｅｑタグ及びＨ３Ｋ４ｍｅ３エンリッチメントの位置を示す、ＭＥＴ潜在性プロモーターの視覚化。下流ＭＥＴＲｅｆｓｅｑエクソンが示されている。（ｅ）５’ＲＡＣＥ解析。ＲＮＡｓｅｑ及びＨ３Ｋ４ｍｅ３エンリッチリードを含む、潜在性プロモーター近景。５’ＲＡＣＥプライマーの位置を示し、ＭＥＴ発現ラインＨｓ７４６Ｔからの５’ＲＡＣＥ産物の産物を示す。

【図13-2】同上。

【図14-1】ＮＫＸ６−３ＲＮＡｓｅｑアラインメント。（ａ）発現されたＲＮＡのエクソンーイントロン構造を支持する、ＲＮＡｓｅｑタグアラインメント。ＮＫＸ６−３ＲｅｆＳｅｑ転写物（ＮＭ１５２５６８）は緑色で示し、予測される潜在性プロモーター発現性ｍＲＮＡは最上部に示す。（ｂ−ｆ）ＲＮＡｓｅｑアラインメントの近景。エクソンーイントロン境界が、シーケンシングタグアラインメントの手動の調査によって確認された。（ｇ）７つのＧＣ細胞株からの２つの区別される５’ＲＡＣＥ産物のＧｅｌ写真。（ｈ）ＮＵＧＣ３（大きいＲＡＣＥ産物）及びＫＡＴＯＩＩＩ（小さいＲＡＣＥ産物）細胞株からの５’ＲＡＣＥフラグメントの位置を示す、ゲノムブラウザー図。５’ＲＡＣＥプライマーの位置を示す。両産物は、５’非Ｒｅｆｓｅｑエクソンの発現を実証し、そこにおいてＮＵＧＣ３はより大きな産物を有する。転写物５’末端は、赤色矢印により示される。（ｉ）予測ｍＲＮＡ及びポリペプチド構造物。ＮＫＸ６−３ホメオドメインの位置は、ＲｅｆＳｅｑデータベースに基づいて示される。

【図14-2】同上。

【図14-3】同上。

【図14-4】同上。

【図15-1】ＨＯＸＢ９遺伝子座ＲＮＡｓｅｑアラインメント。（ａ）ＲＮＡｓｅｑアラインメントはＨＯＸＢ９遺伝子座に位置する。多重スプライスＲＮＡアイソフォームは、ＲＮＡｓｅｑアラインメントに基づいて予測された。（ｂ−ｈ）エクソンーイントロン境界が、ＲＮＡｓｅｑタグアラインメントによって確認された。（ｉ）この領域におけるそのようなフォールのコーディング可能性。

【図15-2】同上。

【図15-3】同上。

【図16】マイクロアレイバリデーションコホート。独立 マイクロアレイデータにおける上方調節されたＨ３Ｋ４ｍｅ３マーク癌関連遺伝子（ｎ＝２１８）の対数表示のヒートマップ。「癌」（ｎ＝１８５）及び「正常」（ｎ＝８９）サンプルは、シンガポールから来た。「癌」及び「正常」サンプルは、発現の明確なパターンを示し、そこにおいてＨ３Ｋ４ｍｅ３マーク癌関連遺伝子の大多数は、癌において上方調節されている。

【図17-1】癌関連遺伝子の臨床病理学的な特徴との関連性。Ｈ３Ｋ４ｍｅ３マーク癌関連遺伝子との有意な関係性を有する因子のモザイクプロット：（ａ）マステージ（Ｍｓｔａｇｅ）、（ｂ）ローレンの組織病理、及び（ｃ）タンら（Ｔａｎ ｅｔ ａｌ． １４．）からの内因性シグネチャー。高いＭ期（ｐ＝０．０３３）、広範なローレンの組織病理（ｐ＝９．９９ｘ１０_−５）、及びＧＤＩＦＦ内因性シグネチャー分類（ｐ＝１．４６ｘ１０_−１１）は、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３マーク癌関連遺伝子の高発現に有意に関連する。赤色：シグネチャーの高エンリッチメント；青色：シグネチャーの低エンリッチメント。

【図17-2】同上。

【図17-3】同上。

【図18-1】ＧＣプロモーター及びエンハンサーのＥＮＣＯＤＥデータとのオーバーラップ。（ａ）プロモーター領域におけるＴＦＢＳの頻度。（ｂ）エンハンサー領域におけるＴＦＢＳの頻度。

【図18-2】同上。

【図19】ＣＤＨ１０遺伝子座体細胞変異解析。（ａ）ＣＤＨ１０遺伝子座のゲノムブラウザー図。（ｂ）拡大図。（ｃ）バリアント及びアレルバイアスを示す、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３ ＣｈＩＰｓｅｑタグアラインメント。当該変異は、ｈｇ１９リファレンスと比較して、ジヌクレオチド置換であることに留意されたい。（ｄ）正常及び癌インプットＤＮＡ及びＨ３Ｋ４ｍｅ３ ＣｈＩＰ ＤＮＡのサンガー配列トレース。癌インプットは、変異アレルの小さいフラクションを含み、当該変異アレルは、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３ ＣｈＩＰによりエンリッチとなる。

【図20】ＨＯＸＡ５遺伝子座体細胞変異解析。（ａ）ＨＯＸＡ５遺伝子座のゲノムブラウザー図。（ｂ）バリアント及びアレルバイアスを示す、Ｋ４ｍｅ３ ＣｈＩＰｓｅｑタグアラインメント。（ｃ）正常及び癌インプットＤＮＡ及びＨ３Ｋ４ｍｅ３ ＣｈＩＰ ＤＮＡのサンガー配列トレース。癌インプットは、変異アレルの小さいフラクションを含み、当該変異アレルは、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３ ＣｈＩＰによりエンリッチとなる。

【図21】ＦＡＲ２遺伝子座体細胞変異解析。（ａ）ＦＡＲ２遺伝子座のゲノムブラウザー図。（ｂ）拡大図。（ｃ）バリアント及びアレルバイアスを示す、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３ ＣｈＩＰｓｅｑタグアラインメント。（ｄ）正常及び癌インプットＤＮＡ及びＨ３Ｋ４ｍｅ３ ＣｈＩＰ ＤＮＡのサンガー配列トレース。癌インプットは、変異アレルの小さいフラクションを含み、当該変異アレルは、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３ ＣｈＩＰによりエンリッチとなる。.

【図22-1】Ｈ３Ｋ４ｍｅ３同定領域の特徴付け。ａ）ＴＳＳ周辺にエンリッチな標準的に二峰性分布を示すＨ３Ｋ４ｍｅ３及びＨ３Ｋ２７ａｃ。ｂ）癌においてＨ３Ｋ２７ａｃとの強い陽性相関（ｒ＝０．９１、ｐ＜０．００１）を示す、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３。ｃ）コモン（即ち、循環性）ＧＣプロモーター、これはプライベートプロモーターよりも高い、並びに正常サンプル中のプロモーターにおける、活性（即ち、Ｈ３Ｋ２７ａｃ陽性）領域の割合。

【図22-2】同上。

【図22-3】同上。

【図23-1】８つのＧＣ対正常組織における体細胞的に変化したＨ３Ｋ４ｍｅ３領域。ａ）ＧＣと正常との間の５１６のディファレンシャル領域に同定されるＤＥＳｅｑ２、同様な結果はｅｄｇｅＲでの解析においても得られた。ｂ）５１６のディファレンシャル領域におけるＧＣ及び正常組織のＨ３Ｋ４ｍｅ３シグナルの間の区別可能な分離を示す、ヒートマップ。ｃ）ＧＣにおいてＨ３Ｋ４ｍｅ３を獲得した６３％の領域を示すドーナツ型グラフ。ｄ）ディファレンシャル領域と最も近いＴＳＳとの間の距離の分布のドーナツ型グラフ。ｅ）正常組織と比較して、そのＴＳＳでのＲＮＡｓｅｑにおいて一致した獲得を含むＧＣでのＨ３Ｋ４ｍｅ３のエンリッチメントを示すＧＣ関連遺伝子ＣＬＤＮ７についてのベッドグラフトラック。

【図23-2】同上。

【図23-3】同上。

【図23-4】同上。

【図24-1】ＧＣにおけるディファレンシャルＨ３Ｋ４ｍｅ３ ｌｏｃｉでの代替的プロモーター使用。ａ）ＨＮＦ４Ａの短い公知のアイソフォームでのＨ３Ｋ４ｍｅ３の獲得、一方で、カノニカルな長いアイソフォームは、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３について同等の強度ピークを有する。ｂ）ＣＥＡＣＡＭ６の１つの主要なアイソフォームのみでのＨ３Ｋ４ｍｅ３の存在並びに獲得。ｃ）ＧＣにおいてＲＮＡｓｅｑ発現によって裏付けられている、並びにＲｅｆｓｅｑにおいて未知のＭＹＯ１５Ｂの非立証転写物でのＧＣにおけるＨ３Ｋ４ｍｅ３の獲得。

【図24-2】同上。

【図24-3】同上。

【図25-1】ＲＡＳＡ３における新規の５’開始部位の例。ａ）ＧＣにおけるＨ３Ｋ４ｍｅ３獲得の領域は、新規の転写開始の公知のＴＳＳマーキング部位のおおよそ１２７ｋｂ下流で観察された。ＧＣにおける新しいアイソフォームの存在を支持するＲＮＡｓｅｑアッセンブリ。ｂ）１７のエクソンのスキッピングにおいて、短いアイソフォームを形成しているＲＡＳＡ３の蛋白質ドメインのインパクト。当該短いアイソフォームは、ＲＡＳの活性を調節しているＲａｓＧＡＰドメインを失っているが、代わりに予測されるプレクストリン相同ドメインを有する。

【図25-2】同上。

【発明を実施するための形態】

【0031】

本発明の詳細な説明
第１の態様において、本発明は、非癌性生物サンプルと相対的に、癌性生物サンプル中の少なくとも１つのプロモーターの活性を決定する方法に言及する。当該方法は、前記癌性生物サンプルから得られた少なくとも１つのプロモーター配列を含む単離された核酸を、前記非癌性生物サンプルから得られるリファレンス核酸と対照してマッピングし、前記少なくとも１つのプロモーターについてリード・パー・キロベース・パー・ミリオン（ＲＰＫＭ）値又はフラグメント・パー・キロベース・パー・ミリオン（ＦＰＫＭ）値を得ること；及び前記ＲＰＫＭ又はＦＰＫＭ値を使用して、前記リファレンス核酸配列中の前記少なくとも１つのプロモーターの活性と相対的に、前記核酸中の前記少なくとも１つのプロモーター配列のディファレンシャル活性を決定すること含み得る。

【0032】

ここにおいて記載される癌性及び非癌性生物サンプルは、単一細胞、多細胞、細胞のフラグメント、体液又は組織を含み得る。幾つかの実施形態において、癌性及び非癌性生物サンプルは、同一の対象、又は、その代わりとして異なる対象から得られ得る。

【0033】

核酸は、クロマチンの免疫沈降によって前記癌性生物サンプルから単離され得る。核酸は、少なくとも１つのプロモーターを含み得る。

【0034】

クロマチンの免疫沈降は、修飾されたヒストン蛋白質に対して特異的な抗原結合蛋白質によって達成され得る。修飾されたヒストン蛋白質は、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３、Ｈ３Ｋ４ｍｅ１及びＨ３Ｋ２７ａｃからなる群より選択された少なくとも１つのヒストン修飾を含み得る。

【0035】

幾つかの実施形態において、抗原結合蛋白質は、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３、Ｈ３Ｋ４ｍｅ１及びＨ３Ｋ２７ａｃからなる群より選択された少なくとも１つのヒストン修飾に対して特異的な抗体であり得る。

【0036】

少なくとも１つのプロモーターを含む単離された核酸は、少なくとも１つのプライマーで増幅され得る。幾つかの実施形態において、増幅された核酸は、前記増幅された核酸を含む核酸配列ライブラリの構築のために使用され得る。

【0037】

幾つかの実施形態において、マッピング工程が、リファレンス核酸と相対的に、マッピングされた核酸中の少なくとも１つのプロモーターについての全配列ｔａｇに基づいてＲＰＫＭ値を計算することを含む。

【0038】

幾つかの実施形態において、マッピング工程が、リファレンス核酸と相対的に、マッピングされた核酸中の少なくとも１つのプロモーターに関連する同定された転写配列に基づいて前記ＦＰＫＭ値を計算することを含む。

【0039】

少なくとも１つのプロモーター配列のディファレンシャル活性を決定する工程が、癌性生物サンプルから得られた核酸中の少なくとも１つのプロモーターについての前記ＲＰＫＭ又はＦＰＫＭ値が、
ｉ）非癌性生物サンプルから得られたリファレンス核酸中の少なくとも１つのプロモーターのＲＰＫＭ又はＦＰＫＭ値と相対的に平均ＲＰＫＭ又はＦＰＫＭ値における変化が１〜２０倍の間、例えば、１倍、２倍、３倍、４倍又は５倍よりも大きい；２）及び、前記非癌性生物サンプルから得られた前記リファレンス核酸中の前記少なくとも１つのプロモーターの前記ＲＰＫＭ又はＦＰＫＭ値と相対的に、ＲＰＫＭ又はＦＰＫＭの範囲が０．１よりも大きいこと；を決定することを含み得る。

【0040】

少なくとも１つのプロモーターは、全プロモーター集団と相対的にＳＵＺ１２結合部位の増加を含み得る。幾つかの実施形態において、少なくとも１つのプロモーターは、細胞種特異化、胚発生又は転写因子に関連する遺伝子に近傍に位置し得る。

【0041】

もう一つの実施形態において、少なくとも１つのプロモーターは、癌に関連する遺伝子に近傍に位置し得る。当該遺伝子は、ＮＫＸ６−３、ＳＡＬＬ４、ＨＯＸＢ９、ＭＥＴ、ＴＮＫ２、ＫＬＫ１、ＦＡＲ２、ＨＯＸＡ１１又はＨＯＸＡ１１−ＡＳから選択され得る。当該癌は、胃癌であり得る。

【0042】

もう一つの実施形態において、少なくとも１つのプロモーターは、潜在性プロモーターを含み得る。

【0043】

また、癌に対する対象の感受性を決定する方法が提供される。当が方法は、対象の癌性生物サンプルから得られた少なくとも１つのプロモーターを含む単離核酸を非癌性生物サンプルから得られたリファレンス核酸に対照してマッピングし、前記少なくとも１つのプロモーターについてのＲＰＫＭ又はＦＰＫＭ値を得ること；及び 前記ＲＰＫＭ又はＦＰＫＭ値を使用して、前記リファレンス核酸中の当該少なくとも１つのプロモーターの活性と相対的に前記核酸中の前記少なくとも１つのプロモーターのディファレンシャル活性を決定すること；を含み、ここにおいて、前記非癌性生物サンプル中のそれと相対的な、当該癌性生物サンプル中の前記少なくとも１つのプロモーターの活性の増大が、癌に対する当該対象の感受性を示す。

【0044】

また、対象において癌に関連する少なくとも１つのプロモーターの存在を決定する方法が提供される。当該方法は、前記対象の癌性生物サンプルから得られた少なくとも１つのプロモーターを含む単離された核酸を非癌性生物サンプルから得られたリファレンス核酸と対照してマッピングし、前記少なくとも１つのプロモーターについてのＲＰＫＭ又はＦＰＫＭ値を得ること；及び前記ＲＰＫＭ又はＦＰＫＭ値を使用して前記リファレンス核酸中の前記少なくとも１つのプロモーターの活性と相対的に、前記核酸中の前記少なくとも１つのプロモーターのディファレンシャル活性を決定すること；を含み、ここにおいて、前記非癌性生物サンプルのそれと相対的な、前記対象から得られた当該癌性生物サンプル中の当該少なくとも１つのプロモーターの活性の増大が、対象における癌に関連するプロモーターの存在を示す。幾つかの実施形態において、癌に関連する少なくとも１つのプロモーターは、当該生物サンプルから得られた当該核酸中の前記１つのプロモーターについてのＲＰＫＭ又はＦＰＫＭ値が、ｉ）非癌性生物サンプルから得られた当該リファレンス核酸中の当該少なくとも１つのプロモーターの当該ＲＰＫＭ又はＦＰＫＭ値と相対的に、平均ＲＰＫＭ又はＦＰＫＭ値の変化が、１〜２０倍の間、例えば、１倍、２倍、３倍、４倍又は５倍よりも大きいとき；及びｉｉ）非癌性生物サンプルから得られた当該リファレンス核酸中の当該少なくとも１つのプロモーターの当該ＲＰＫＭ又はＦＰＫＭ値と相対的にＲＰＫＭ又はＦＰＫＭの範囲が０．１よりも大きいとき；に存在する。

【0045】

また、対象において癌を検出するためのバイオマ−カ−であって、前記バイオマ−カ−は、正常な非癌性生物サンプルと相対的に癌性生物サンプルにおける活性の増大を有する少なくとも１つのプロモーターを含み、前記プロモーターは、全プロモーター集団（population）と相対的にＳＵＺ１２結合部位の増大を含むバイオマ−カ−が提供される。当該少なくとも１つのプロモーターは、全プロモーター集団と相対的に低いＤＮＡメチル化レベルを提示し得る。

【0046】

また、非癌性生物サンプルと相対的に癌性生物サンプル中の癌に関連する少なくとも１つのプロモーターの存在を決定する方法が提供され、当該方法は、前記非癌性生物サンプルから得られたリファレンス核酸に対して、前記癌性生物サンプルから得られた少なくとも１つのプロモーター配列を含む単離された核酸をマッピングすること；前記マッピングすることに基づいて前記少なくとも１つのプロモーターについてシーケンシングタグ計数のマトリックスを発生させること；前記シーケンシングタグ計数のマトリックスを解析すること；及び前記シーケンシングタグ計数のマトリックスの解析を使用して前記リファレンス核酸中の当該少なくとも１つのプロモーターと相対的に前記核酸中の当該少なくとも１つのプロモーターのディファレンシャルエンリッチメント（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）を決定すること；を含み、ここにおいて、非癌性サンプル中のそれと相対的に、当該対象から得られた当該癌性生物サンプル中の前記少なくとも１つのプロモーターの前記ディファレンシャルエンリッチメントが、対象における癌に関連するプロモーターの存在を示す。

【0047】

また、非癌性生物サンプルと相対的に、癌性生物サンプル中の少なくとも１つのプロモーターの活性を決定する方法が提供され、当該方法は、前記非癌性生物サンプルから得られたリファレンス核酸に対して、前記癌性生物サンプルから得られた少なくとも１つのプロモーター配列を含む単離された核酸をマッピングすること；前記マッピングすることに基づいて前記少なくとも１つのプロモーターについてシーケンシングタグ計数のマトリックスを発生させること；前記シーケンシングタグ計数のマトリックスを解析すること；及び前記シーケンシングタグ計数のマトリックスの解析を使用して前記リファレンス核酸中の前記少なくとも１つのプロモーターと相対的に前記核酸中の当該少なくとも１つのプロモーターの当該ディファレンシャル活性（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ活性）を決定すること
を含む。

【0048】

一つの実施形態において、上記方法の前記発生させる工程が、前記リファレンス核酸と相対的に、当該マッピングされた核酸中の少なくとも１つのプロモーターについてのシーケンシングタグ計数に基づく当該マトリックスを計算することを含む。

【0049】

一つの実施形態において、上記方法の前記解析する工程が、ＤＥＳｅｑ２アルゴリズムを使用して当該マトリックスを解析することを含む。ＤＥＳｅｑ２アルゴリズムは、計数データのディファレンシャル解析のための分野において公知のゲノム解析手段であり、分散及び倍率変更（ｆｏｌｄ ｃｈａｎｇｅｓ）について収縮評価を使用して、推量の安定性及び解釈可能性を改善する。ＤＥＳｅｑ２は、ディファレンシャル発現の単なる存在よりも寧ろ強度に目を向けた定量的解析を可能にする。とりわけ、ＤＥＳｅｑ２は、負数の（ｎｅｇａｔｉｖｅ） 二項式一般化線形モデルの使用により、ディファレンシャル発現について検定する方法を提供し；分散及び対数の倍率変更の推量を分布前に稼働されるデータに組み込む。

【0050】

一つの実施形態において、前記少なくとも１つのプロモーターは、癌に関連する遺伝子の近傍に位置し得る。

【0051】

一つの実施形態において、前記遺伝子は、ＲＡＳＡ３、ＧＲＩＮ２Ｄ、ＴＮＮＩ３、ＳＨＤ、ＡＴＰ１０Ｂ、ＳＭＴＮ、ＭＹＯ１５Ｂ、Ｃ２ｏｒｆ６１、ＬＩＮＣ００４４３又はＡＣＨＥであり得る。

【0052】

一つの実施形態において、前記ディファレンシャルエンリッチメントは、１０％のＦＤＲ率及び１．５倍よりも大きい絶対的な変化に基づいて同定される。

【0053】

一つの実施形態において、ディファレンシャル活性は、１０％のＦＤＲ率及び１．５倍よりも大きい絶対的な変化に基づいて同定される。

【0054】

実験の項
例１
方法
組織サンプル
主な患者サンプルは、ザ・サンゲヘルス・ティッシュ・レポジトリー（ｔｈｅ Ｓｉｎｇｈｅａｌｔｈ ｔｉｓｓｕｅ ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ）から入手され、企業研究倫理審査委員会からの承認をもって収集され、患者のインフォームド・コンセントに署名を受けた。

【0055】

この研究において使用された「正常」（非悪性）サンプルは、胃から採取された、腫瘍から離れた部位からの、外科的な評価上で腫瘍の視覚的な兆候又は腸上皮化生／異形成を示してないサンプルをいう。腫瘍サンプルは、低温切開片が＞４０％腫瘍細胞を含むことにより確認された。

【0056】

ナノＣｈＩＰｓｅｑ
ナノＣｈＩＰｓｅｑは、組織分離工程を伴い、従来記載されている通りに行われた。新鮮凍結癌及び正常組織は、液体窒素中でカミソリ刃を使用して切開し、〜５ｍｇの大きさの小片を得た（見掛け容量による〜５μｌ）。組織小片は、１％のホルムアルデヒド／ＴＢＳＥ緩衝液中で１０分間（ｍｉｎ）室温で固定された。固定は、１２５ｍＭの最終濃度にまでグリシンを添加することにより停止した。

【0057】

組織小片をＴＢＳＥ緩衝液で３回洗浄し、リソネーター・カートリッジ（Lysonator cartridges、SG Microlab Devices、シンガポール）内に移した。組織を製造者のガイドラインに従って解離させ（４ＫＨｚ、３分間)、ナノＣｈＩＰアッセイにおける溶解工程に直接に持ち込んだ。溶解された組織は、２００μｌの溶解緩衝液中で溶解され、バイオラピュター（Bioruptor、Diagenode）を使用する超音波処理（６分間）のために２本の１．５ｍｌ試験管内に分配した。各組織について、ＣｈＩＰを以下の抗体：Ｈ３Ｋ４ｍｅ３（07-473、Millipore）；Ｈ３Ｋ４ｍｅ１（ab8895、Abcam)；Ｈ３Ｋ２７ａｃ（ab4729、Abcam）；Ｈ３Ｋ３６ｍｅ３（ab9050、Abcam）；Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３（07-449、Millipore）を使用し、同じクロマチン調製物を使用して行った。

【0058】

ＣｈＩＰ及びインプットＤＮＡの回収の後、全ゲノム増幅をＷＧＡ４キット（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）及びＢｐｍＩ−ＷＧＡプライマーを使用して行った。

【0059】

増幅されたＤＮＡをＢｐｍＩ（Ｎｅｗ ＥｎｇｌｉａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）で消化し、第２のＢｐｍＩアダプターに対してライゲートし、再度消化して、ＷＧＡプライマー領域及びセミランダムプライミング末端をトリミングした。１５ｎｇの増幅ＤＮＡをＣｈＩＰｓｅｑキット（イルミナ）を使用する各イルミナ・シーケンシング・ライブラリーのために使用した。各ライブラリーをＨｉＳｅｑ２０００の１つレーンでシーケンシングして、３６塩基又は１０１塩基シングルリードの何れかを得た。

【0060】

ナノＣｈＩＰｓｅｑリードマッピングとピークコーリング
シーケンシングタグは、ヒトリファレンスゲノム（ｈｇ１９）に対して、バーロウズ・ウィラー・アライナ（Ｂｕｒｒｏｗｓ−Ｗｈｅｅｌｅｒ Ａｌｉｇｎｅｒ、ＢＷＡ）ソフトウェア（バージョン０．７．０）及び「ａｌｎ」アルゴリズムを用いてマッピングされた。１０１塩基リードは、最初及び最後の１０塩基によってトリミングされて、ＳＮＰコーリングパフォーマンスを増大した。独自にマッピングされたタグが、ＣＣＡＴバージョン３．０によるピークコーリングのために使用された。ピーク領域は、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３、Ｈ３Ｋ２７ａｃについて８、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３及びＨ３Ｋ３６ｍｅ３及びについて５、並びにＨ３Ｋ２７ｍｅ３マークのために１．５の上記のインプットカットオフでのフォールド（ｆｏｌｄ）によってフィルタリングされた。Ｈ３Ｋ４ｍｅ３及びＨ３Ｋ４ｍｅ１ヒストン修飾について、全組織サンプルからのピーク領域はプールされ、オーバーラッピングピーク領域は、マージされてプロモーター及びエンハンサー解析のためのその修飾のためにピーク領域の総セットが作出された。同じ折り畳みカットオフを有する正常インプット対癌インプットＣＣＡＴ３領域セットを使用して、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３及びＨ３Ｋ４ｍｅ１領域のための潜在的な増幅領域を除去した。ピークの高さを定量化するために、我々は、カフリンクス（Ｃｕｆｆｌｉｎｋｓ、バージョン２．０．２）を使用してＣｈＩＰｓｅｑデータを解析した。ＲＰＫＭ値は、プロモーター領域のためにＨ３Ｋ４ｍｅ３及びＨ３Ｋ２７ａｃ、エンハンサー領域のためにＨ３Ｋ４ｍｅ１及びＨ３Ｋ２７ａｃが評価された。バッチ効果は、Ｒ（バージョン２．１５）における「ｐｒｃｏｍｐ」機能を使用するプリンシプルコンポーネント解析（ＰＣＡ）を使用して評価され、カフリンクスからのＲＰＫＭ値の対数変換後のＣｏｍＢａｔ３を使用して調整された。３Ｄ−ＰＣＡプロットは、Ｒ（バージョン２．１５）における「ｒｇｌ」パッケージを使用してプロットされた。

【0061】

体細胞的に変化した調節エレメントの同定
体細胞的に変化したプロモーター及びエンハンサーセットは、２つの方法、「スレッシュホールド」法と線形モデルアプローチを用いて同定された。変化したエレメントの終セットは、両方法からの結果を組み合わせることにより生成された。

【0062】

「スレッシュホールド」法
全プロモーター（Ｈ３Ｋ４ｍｅ３マーク）及びエンハンサー（Ｈ３Ｋ４ｍｅ１マーク、しかしながらＨ３Ｋ４ｍｅ３ピーク領域とのオーバーラップはなし）についてのＨ３Ｋ２７ａｃ ＣｈＩＰｓｅｑ ＣｏｍＢａｔ調整ＦＰＫＭ値は、（ｉ）２倍よりも大きい変化（絶対値）及び（ｉｉ）５つの腫瘍及び５つの正常サンプルの間の平均値における０．５よりも大きい差によってフィルタリングされた。これはまた、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３及びＨ３Ｋ４ｍｅ１ ＣｈＩＰｓｅｑデータについても行われた。変化したエレメントは、Ｈ３Ｋ２７ａｃ及びＨ３Ｋ４ｍｅ３検体（プロモーター）又はＨ３Ｋ２７ａｃ及びＨ３Ｋ４ｍｅ１（エンハンサー）について得られた領域の結合物から同定された。

【0063】

線形モデル法
ボックスプロットは、対数変換ＣｈＩＰｓｅｑデータについてプロットされ、経験的ベイズ線形モデルアプローチに適用する前に、正規性前提を評価し、腫瘍サンプルと正常サンプルとの間で個別に変化した領域を得た（図５）。方法が適合された後で、評価も行われて、ｐ値分布が妥当であることが確認された（図５）。変化したプロモーター及びエンハンサーを得るために、ｐ＝０．０５のスレッシュホールドレベルの有意性が選択された。

【0064】

ＲＮＡｓｅｑ
ＲＮＡｓｅｑライブラリーは、イルミナＴｒｕ−ＳｅｑＲＮＡサンプル調製ｖ２プロトコールを使用して、製造者の使用説明書に従って調製された。即ち、ポリＡＲＮＡは、１μｇの総ＲＮＡから、ポリＴオリゴ付着磁性ビーズを使用して回収された。回収されたポリＡＲＮＡは、化学的にフラグメント化され、スーパースクリプトＩＩ及びランダムプライマーを使用してｃＤＮＡに変換された。

【0065】

セカンドストランドは、キットで提供されているザ・セカンド・ストランド・マスター・ミックスを使用して合成され、続いて、ＡＭＰｕｒｅ ＸＰビーズで精製された。ｃＤＮＡの末端は、３’から５’へのエクソヌクレアーゼ活性を使用して修復された。シングルアデノシンが３’末端に加えられ、アダプターがＴ４ＤＮＡリガーゼを使用してｃＤＮＡの末端に対して取り付けられた。

【0066】

両端にライゲートされたアダプターを有するフラグメントはＰＣＲによってエンリッチ化された。ライブラリーは、アジレント・バイオアナライザー（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ、アジレント・テクノロジー、パロ・アルト、ＣＡ)により正当性が確認された。ライブラリーは、１１ｐＭに希釈されて、イルミナ・クラスター・ステーションを使用するイルミナフローセルに用いられた。シーケンシングは、Ｄｕｋｅ−ＮＵＳゲノム・バイオロジー・ファシリティでのイルミナ・Ｈｉｇｈ Ｓｅｑ２０００シーケンサーにおいて、対をなす７６ｂｐリードオプションで行われた。

【0067】

ＲＮＡｓｅｑ解析
リードは、ＴｏｐＨａｔ・ｖ１．２５を使用してヒトリファレンスゲノムに対して位置合わせされた。マッピングされていないリードは、次に潜在的なスプライスジャンクションに対して、位置合わせされ、それらは、（ｉ）Ｅｎｓｅｍｂｌ ６０転写物アノテーション中に存在するか、或いは（ｉｉ）「発現アイランド」、即ち、当該アノテーション中に存在しなかった転写物からのリードのクラスターによって示唆されるかのいずれかであった。ＦＰＫＭ値による転写物存在率は、リファレンス転写物の使用なしに、カフリンクス（バージョン１．０．０）を使用して推量された。腫瘍／正常対からの新しく集合化された転写物は、ＲｅｆＳｅｑ転写物データベースに対してフィルタリングして、非ＲｅｆＳｅｑアノテート領域に同定した。

【0068】

ＲｅｆＳｅｑ ＴＳＳオーバーラップ解析
ＲｅｆＳｅｑ転写物は、ＵＣＳＣブラウザーからダウンロードされ、ＲｅｆＳｅｑアノテートＴＳＳは、転写物開始位置を−／＋５００塩基にまで拡張することにより定義された。体細胞的に変化したＨ３Ｋ４ｍｅ３ピーク領域は、ＲｅｆＳｅｑ ＴＳＳ領域に対して比較され、オーバーラップが決定された。ＲｅｆＳｅｑ ＴＳＳ（−／＋５００塩基）とオーバーラップを持たないＨ３Ｋ４ｍｅ３領域は、非ＲｅｆＳｅｑプロモーター（ａｋａ潜在性プロモーター）と考えた。

【0069】

ＲＮＡｓｅｑリードの新しい集団化は、カフリンクス（バージョン１．０．０）により、リファレンス転写物セットなしで行った。非ＲｅｆＳｅｑ転写物は、カフリンクスエクソンアウトプットをＲｅｆＳｅｑエクソン（最小１塩基オーバーラップ）に対してフィルタリングすることによって定義された。この非ＲｅｆＳｅｑ転写物セットは、癌関連Ｈ３Ｋ４ｍｅ３領域（最小１塩基オーバーラップ）に対して交差させた。

【0070】

定量的ＲＴ−ＰＣＲ
定量的ＰＣＲは、ＳＹＢＲグリーンＰＣＲキット（ライフ・テクノロジー、ＵＳＡ）を使用して行った。ＧＡＰＤＨは、コントロール遺伝子として正規化のために使用された。全ＰＣＲ反応は、トリプリケートで行った。

【0071】

ｃＤＮＡ末端の５’ラピッドアンプリフィケーション（５’ＲＡＣＥ）
５’ＲＡＣＥは、ｃＤＮＡ末端（バージョン２）キット（インビトロジェン）のラピッドアンプリフィケーションのための５’ＲＡＣＥシステムを使用して行った。１μｇの総ＲＮＡは、各逆転写反応のためにモロニ−マウス白血病ウイルス（Ｍ−ＭＬＶ）逆転写酵素、及びＭＥＴ Ｒｅｆｓｅｑエクソン３（５’ＣＴＴＣＡＧＴＧＣＡＧＧＧ３’）又はＮＫＸ６−３ Ｒｅｆｓｅｑエクソン１（５’ＧＡＡＧＧＴＡＧＧＣＴＣＣＴＣ３’）のための遺伝子特異的なプライマーと共に使用された。

【0072】

ＲＮａｓｅ Ｈ及びＲＮａｓｅ Ｔ１は、ＲＮＡの分解に使用され、続いて、Ｓ．Ｎ．Ａ．Ｐカラムでの精製を行った。次にｃＤＮＡのホモプライマーテーリングを使用して、アンカープライマー結合部位の短縮を形成した。ｃＤＮＡのファーストストランドの増幅は、ＳｕｐｅｒＴａｑプラスポリメラーゼ（アプライド・バイオシステムズ）を使用して、５’ＲＡＣＥアウターＰＣＲのために短縮アンカープライマー、並びにＭＥＴエクソン３のための遺伝子特異的プライマー（５’ＧＧＣＴＣＣＡＧＧＧＴＣＴＴＣＡＣＣＴＣＣＡ３’）及びＮＫＸ６−３エクソン１（５’ＣＣＡＧＧＣＴＧＡＧＣＡＣＣＧＡＧＡＡＧＧＣ３’）を用いて行った。その後、５’ＲＡＣＥインナーネステッドＰＣＲを短縮ユニバーサル増幅プライマー（ＡＵＡＰ）、ＭＥＴエクソン３（アウター５’ＰＣＲと同じ）及びＮＫＸ６−３エクソン１（５’ＧＣＴＴＧＣＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＧＣＧＧＡＴ３’）のための遺伝子特異的プライマーを用いて行った。

【0073】

Ｇｅｌ電気泳動を行い、興味のあるＰＣＲバンドをＴＯＰＯ ＴＡクローニングキットでのｐＣＲ ４−ＴＯＰＯベクター（インビトロジェン）を用いたクローニングのために切り出した。最低限５つの独立コロニーを単離し、精製されたプラスミドＤＮＡをＡＢＩ ３７３０自動シーケンサー（アプライド・バイオシステムズ）において双方向でシーケンシングした。

【0074】

マイクロアレイ解析
アフィメトリックス・ヒューマン・ゲノムＵ１３３プラス２．０ジーンチップアレイ上でプロファイルされた２００のＧＣ及び１００の対応正常胃サンプルを解析した（ＧＳＥ １５４５９）。データプレプロセッシングを「ａｆｆｙＰＬＭ」Ｒパッケージ（ｖ２．１５）を使用して実施した。アウトライアーは排除して、下流の解析に利用できる合計１８５のＧＣ及び８９の正常サンプルを得た。ＧＣとサンプルとの間でのディファレンシャル発現解析を「ｌｉｍｍａ」Ｒパッケージ（ｖ２．１５）を使用して行った。見せかけの発見率（ｆａｌｓｅ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｒａｔｅｓ、ＦＤＲ）＜０．０５を有する遺伝子は、差異的に発現していると見做した。ディファレンシャル発現解析に使用された遺伝子は、ＲＮＡｓｅｑ解析からの非Ｒｅｆｓｅｑ転写物のリストにおいて行われたＧＲＥＡＴ（ｖ２．０２）解析から現れたものであった。生存解析のために、ＧＣサンプルは、輪郭幅を最小化するＫを発見することを目的とするＫ−ｍｅｄｏｉｄｓアプローチを使用してクラスター化された。臨床病理学的因子で異なるＧＣ群の相関関係を評価するために、モザイクプロットが、カテゴリー変数についてプロットされた一方で、線形回帰アプローチが連続型変数のために使用された。相関関係の有意差（ｐ＜０．０５）は、ピアソンカイ二乗検定又はｔ検定によって適宜決定された。カプラン−マイヤー生存解析は、成果測定基準としての全生存率と共に使用された。ログランク検定を使用して、カプラン−マイヤー解析の有意差を評価した。一変量及び多変量解析は、コックス回帰を使用して行った。

【0075】

転写因子結合部位（ＴＦＢＳ）解析（ＥＮＣＯＤＥ）
ＥＮＣＯＤＥ ＣｈＩＰｓｅｑ ＴＦＢＳデータセット（Ｔｘｎ Ｆａｃ ＣｈＩＰ Ｖ３転写因子ＣｈＩＰ−ｓｅｑクラスターＶ３、１６１のターゲット、１８９の抗体が、ＵＣＳＣブラウザーから得られた。癌関連プロモーター及びエンハンサー（又は全プロモーター及びエンハンサー）に対するオーバーラップは、それぞれＴＦについて計数された。ＴＦ部位計数は、各対応するプロモーター、エンハンサー又は総セットのベースカバレージ長さによって分けて、１０ｋｂカバレージ当たりのＴＦ部位頻度を計算した。

【0076】

ＤＮＡメチル化プロファイリング
イルミナ・ヒューマン・メチレーション４５０（ＨＭ４５０） インフィニウムＤＮＡメチレーションアレイを使用して、ＤＮＡメチル化レベルを胃腫瘍／正常対の間で評価した。メチル化値は、Ｒパッケージバージョン２．４．０においてｍｅｔｈｙｌｕｍｉパッケージを使用して計算し、バックグラウンド訂正を行った。正規化は、ＢＭＩＱ法（ＲにおけるｗａｔｅＲｍｅｌｏｎパッケージ）を使用して行った。

【0077】

ＳＮＰ及び繰り返しを含むプローブは取り除いた。加えて、Ｘ及びＹ染色体におけるプローブもまた取り除いた。使用されたコントロール群は、全２１，６９２プロモーター領域を含んでいた。各群（コントロール、獲得及び喪失）について、我々は、プロモーター領域とオーバーラップしているＨＭ４５０プローブ（それぞれ全、癌獲得及び癌喪失１３５６０６、２２６８、９６３プローブ）を同定した。検出ｐ値＞０．０５を有するプローブは排除された。腫瘍及び正常対の間での（何れかの方向において）少なくとも０．２のＤＮＡメチル化の平均変化を有するプローブを選択してプロットした。二サンプルウィルコクソン検定を行った。

【0078】

シングルヌクレオチドバリエーション（ＳＮＶ）検出
シーケンシングデータはゲノム解析ツールキット（ＧＡＴＫバージョン２．６）中の最良のワークフローに従って前処理された。特、サムツール（ｓａｍｔｏｏｌｓ）を使い、ＰＣＲ複製を取り除いた。残りの配列は、インデルの存在と、続くベースクオリティスリキャリブレーションのためにコアミスアラインメントを修正した。ＧＣ／正常対におけるシングルヌクレオチドバリアント（ＳＮＶｓ）はＭｕＴｅｃｔ１１を使用してコールした。我々は、ＭｕＴｅｃｔによりレポートされたＳＮＶ特性を使用して、ＳＮＶをｄｂＳＮＰ部位又はプライベートＳＮＶの何れかとして分類した。ｄｂＳＮＰ部位は、以下の基準を有する基準：（ｉ）それは公知のｄｂＳＮＰ部位である、（ｉｉ）部位が変異を検出するための力を受けている（ａ．ｋ．ａカバー部位）、及び（ｉｉｉ）それはＭｕＴｅｃｔにおけるバリアントフィルター手段を通過する。

【0079】

アレルバイアス及びプライベート／体細胞変異の検出
代替アレルフラクションは、各部位での代替アレルフラクションのコンピューティングによって決定された。

【0080】

ＧＣ／正常対において０．９よりも大きい平均代替アレルフラクションを示すホモ接合ｄｂＳＮＰ部位を排除した。我々は、ＧＣ／正常対において０．３よりも大きな代替アレルフラクションディファレンスを示すヘテロ接合部位に注目した。

【0081】

癌関連クロマチンマーク変化を示す領域に対するアレルバイアス部位マッピングは、レグロームＤＢ１２を使用する機能的インパクトについて評価された。レギュロームＤＢヒットについて、我々はまた、インプットＤＮＡ集団におけるアレルバイアスの不足を定量的にパイロシーケンシングすることにより確認した。体細胞変異について、プライベート（非ｄｂＳＮＰ）ＳＮＰに注目した。これらの「プライベート」ＳＮＰは、以下の基準を使用して特定された：（ｉ）それが新規の非ｄｂＳＮＰバリアントである、（ｉｉ）腫瘍における代替アレルフラクションは、カバー部位で０．３よりも大きい、又はカバー部位で０．５である、（ｉｉｉ）部位カバレージがＧＣにおいて少なくとも１４リードを有する、（ｉｖ）正常組織における対照部位に変異アレルがない。ＭｕＴｅｃｔに加えて、プライベートＳＮＰもまたＣＬＣゲノムワークベンチ（ＣＬＣ Ｂｉｏ）を使用して考慮され、特定された。癌関連クロマチンマーク変化を示す領域に対するプライベートＳＮＰマッピングは、候補体細胞変位として看做された。

【0082】

定量的パイロシーケンシング、ＴＦ部位予測
パイロシーケンシングは、ＰｙｒｏＭａｒｋＱ２４（キアゲン）上で行われた。結果は、アレル定量化のためのパイロマークソフトウェアにより解析された。ＣｈＩＰ−ｑＰＣＲ−パイロシーケンシングのために、ＰＣＲプライマーは、ＣｈＩＰ ＤＮＡのリアルタイムＰＣＲ定量化と、テンプレートとしてＷＧ増幅ＤＮＡを用いるパイロシーケンシングアレル定量化の両方のために使用された。定量化結果とアレル表示とを併合して、ＣｈＩＰシグナルにおける２つのアレルのフラクションを推量した。結合部位予測は、ＴＦＢＩＮＤ１３（http://tfbind.hgc.jp/）を使用して行った。

【0083】

ルシフェラーゼアッセイ
ルシフェラーゼレポーターアッセイは、プロメガｐＧＬ３（ホタルルシフェラーゼ）及びＲＬＳＶ４０（レニラルシフェラーゼ）プラスミドを使用して行った。ＦＯＳ遺伝子プロモーターをＰＣＲによってヒトゲノムＤＮＡからＢｇｌＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩリンカープライマーを用いて増幅し、ｐＧＬ３−ＢＡＳＩＣプラスミドにライゲートした。野生型又は変異アレルの何れかを含むＨＯＸＡ１１関連フラグメント（〜３５０ｂｐ）が、ＣｈＩＰ−ＷＧＡ ＤＮＡからＢｇｌＩＩリンカープライマーを用いて増幅され、ＦＯＳプロモーターの上流にクローニングされた。挿入方向及びアレル識別はサンガー配列により確認された。ＫＡＴＯ−ＩＩＩ ＧＣ細胞は、２４ウェルプレート当たり１ｘ１０^６細胞で播種され、ｐＧＬ３レポーター又は派生物（ウェル当たり１００ｎｇ）及びｐＲＬＳＶ４０ （ウェル当たり２０ｎｇ）でリポフェクタミン２０００（インビトロジェン）を使用してトランスフェクトされた。細胞は、トランスフェクション後の４２時間で採取され、デュアル−ルシフェラーゼキット（プロメガ）によって提供されたＰＬＢ緩衝液で溶解され、ルシフェラーゼ活性が測定された。ホタルルシフェラーゼ活性の読み取りは、レニラルシフェラーゼ活性によって割り、トランスフェクション効率を標準化した。

【0084】

考察
ナノＣｈＩＰｓｅｑは、１０００細胞スケールまでを有効にしている（図６）。主要なＧＣ及び正常胃サンプルの５つの対応対がプロファイルされた（臨床詳細については図１ａ）。クロマチンマークは、以下を含む；ｉ）トリメチル化ヒストンＨ３リジン３６（Ｈ３Ｋ３６ｍｅ３）、転写領域に関連する；ｉｉ）トリメチル化ヒストンＨ３リジン２７（Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３）、抑制領域；及びｉｉｉ）ヒストンＨ３ Ｈ３Ｋ４ｍｅ３、Ｈ３Ｋ４ｍｅ１及びＨ３Ｋ２７ａｃ（ａｃ＝アセチル化）、マーキング活性プロモーター及びエンハンサー。各マークについて、イルミナシーケンシングタグによって独自にマッピングされた＞４５ミリオンが、ＣＣＡＴを使用して生成され、ピーク領域を呼ばれた（図７）。ゲノム増幅を反映していると思われるＣｈＩＰインプットタグの異常な存在度を示す腫瘍サンプルにおけるゲノム領域は、下流解析から排除した（図８）。正常及び癌組織の両者についてのゲノム規模のクロマチンプロファイルが、限られた材料にも拘わらず（全てのマークのために〜５ｍｇ組織）、成功裏に得られた（図１ｂ）。例えば、腸の化生に関連するＣＤＸ２遺伝子でのプロモーター活性の癌特異的獲得（増加したＨ３Ｋ４ｍｅ３及びＨ３Ｋ２７ａｃ）が観察された（図１ｃ）。

【0085】

活性な転写の領域（Ｈ３Ｋ３６ｍｅ３）が明らかになったクロマチンマークの比較は、抑制的なクロマチンの領域（Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３）に限定されている（図１ｂ、ｄ、ＧＣ２０００７２１；図９参照）。潜在的なプロモーター（Ｈ３Ｋ４ｍｅ３によりマークされる）及びエンハンサー領域（Ｈ３Ｋ４ｍｅ１陽性であるが、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３陰性）を明確にするために、５つの組織対からのＨ３Ｋ４ｍｅ３及びＨ３Ｋ４ｍｅ１ピーク領域を交差させた（図１ｅ）。＞２１Ｋプロモーター及び＞１２５Ｋエンハンサー領域が同定された。６４％のプロモーターが活性であり（Ｈ３Ｋ２７ａｃ−陽性）及び１９％の推定エンハンサーがＨ３Ｋ２７ａｃによって少なくとも１つの組織においてマークされた（図１ｅ）。

【0086】

ＧＣにおける体細胞的に変化したプロモーター及びエンハンサーの同定のために、シーケンシングタグ密度が、定量化され、ＧＣと正常組織との間で比較された（ｒｅａｄ ｐｅｒ ｋｉｌｏ−ｂａｓｅ ｐｅｒ ｍｉｌｌｉｏｎ ｔａｇｓ， ＲＰＫＭ）（図１ｂ、１０、１１）。ＧＣと正常組織との間でのディファレンシャルなＨ３Ｋ４ｍｅ３及びＨ３Ｋ２７ａｃ修飾が示された６３９のプロモーター、並びに９７５の体細胞的に変化したエンハンサーが同定された（方法を参照されたい）。これらの体細胞的に変化したエレメントを使用する主成分解析（ＰＣＡ）及びクラスタリング解析により、正常組織ＧＣと対応する正常組織との間に分離が確認された（図１ｆ−ｉ、１１）。

【0087】

主なＧＣにおける新規のプロモーターの獲得は、プロモーター喪失を上回っていた（４７２の獲得対１６７の喪失、図２ａ）。予想外に、大部分の獲得プロモーター（５８％）は、Ｒｅｆｓｅｑにおいて見出されたアノテート転写開始部位（ＴＳＳ）、転写配列リファレンスデータベース（転写物配列）からの領域＞５００ベースペア（ｂｐ）に局在していた。獲得プロモーターにおける「潜在性プロモーター」のフラクションは、全体的なプロモーター集団又はＧＣにおけるプロモータ喪失の何れかよりも有意に大きかった（〜４４％、ｐ＜７．１ｘ１０_−６、フィッシャーイグザクト検定）。癌関連プロモーター（潜在性プロモーターを含む）は、真実のＲＮＡ転写物に関連しているのかどうかを問うために、ＲＮＡシーケンシング（ＲＮＡｓｅｑ）を次に、インデックス５ＧＣを含む１２の腫瘍／正常対において行った。大部分のプロモーター（５９．５％、３８０のプロモーター)は、検出可能なＲＮＡ転写物に関連していた（図２ａ）。正常組織に比較してＧＣにおいて＞４倍の発現変化が示された１９２の転写物が同定され、これらの半分程度（４８％、９２のプロモーター）は、潜在性プロモーターに起因しており、それらの癌特異性性質を支持していた（図２ｂ）。ターゲットｑＰＣＲを使用して、１０の潜在性プロモーター稼働性転写物が実験的に実証された（図１２）。

【0088】

癌関連プロモーター近くに位置する遺伝子は、胃腸腫瘍／消化器系癌に関連する遺伝子が有意にエンリッチであった（図２ｃ；ＧＲＥＡＴ解析により、ｐ＜１ｘ１０_−５）。潜在性プロモーターは、変化した５’構造を有する非カノニカルｍＲＮＡアイソフォームを介して、高い頻度でこれらの近くの遺伝子の発現を促進させる。例えば、ＧＣ２０００７２１は、内在的な潜在性プロモーターを介してＭＥＴ受容体の腫瘍特異的な発現を示し（図２ｄ−ｆ、１３）、受容体の二量化及びシグナリングを制御するＮ末Ｓｅｍａドメインを欠いているトランケーテットアイソフォームを産生した。ＭＥＴ発現Ｈｓ７４６Ｔ ＧＣ細胞の５’ＲＡＣＥ（ｃＤＮＡ末端の迅速な増幅）解析が、このトランケーテットＭＥＴアイソフォームの発現を確認した（図１３）。興味深いことに、癌関連プロモーター近くに位置する遺伝子はまた、転写因子機能、胚発生及び細胞種特異化において有意な機能的なエンリッチメントを示した（ｐ＜２×１０_−６、ＦＤＲ ｑ＜１×１０_−３；図２ｃ）。例えば、ＮＫＸ６−３、神経系及び胃組織発達レギュレータ、は、カノニカルＲｅｆＳｅｑ ＮＫＸ６．３ 第１のエクソンをスキッピングする新規の５’エクソンを介して、癌特異的発現を示し（図２ｇ、１４）、ホメオボックスドメインを修飾する新規の１８４アミノ酸Ｎ末端修飾をもたらす（図１４）。ＲＡＣＥを使用して、ＧＣラインにおけるこれらの新規の５’エクソンの発明が確認された（図１４）。同様の５’転写物構造が、ホメオボックス転写因子ＨＯＸＢ９について観察された（図２ｈ、１５）。これらの結果は、ＧＣにおける潜在性プロモーター活性化を証明する。これらのプロモーターによって生成された非カノニカル転写物アイソフォームはまた、変化した細胞機能を有する蛋白質を産生する。

【0089】

これらの発現パターンを確認するために、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３マーク癌関連プロモーターにより稼働される遺伝子が、１８５のＧＣ及び８９の正常胃組織の拡張されたマイクロアレイコホートにおいて同様な腫瘍上方調節を示すことを確認した（ｐ＝５．６８ｘ１０^−６；図２ｉ、１６）。Ｈ３Ｋ４ｍｅ３マーク遺伝子の高い発現を示すＧＣは、高いＭ期（ｐ＝０．０３３；図１７）、広範なローレンの組織病理（ｐ＝９．９９ｘ１０_−５；図１７）、及びＧＣと比較したより悪い全生存率を示したが、ここにおいてこれらの遺伝子は、低く発現された（図２ｊ；ｌｏｇランク検定、ｐ値＝０．０４）。多変量コックス回帰解析は、生存転帰は腫瘍の病期から独立していないことが明らかになった（ｐ＝０．７４）。ＧＣにおいてＨ３Ｋ４ｍｅ３マークプロモーターにより稼働される遺伝子は従って、ＧＣの病理学的及び臨床的な特徴に寄与している。

【0090】

１６１の転写因子（ＥＮＣＯＤＥ コンソーシアム）のゲノム占有データに対してマッピングされたとき、癌関連プロモーターは、既定の転写因子結合部位の一般化された減少を示すが（図３ａ、１８ａ）、しかしながらＳＵＺ１２及びＥＺＨ２結合においては、有意なエンリッチメントが示された（ＳＵＺ１２及びＥＺＨ２についてｐ＝１．２×１０^−２４及びｐ＝１．１×１０^−４、訂正ボンフェローニ）。ＳＵＺ１２及びＥＺＨ２は、ポリコンボコンプレックス２（ＰＲＣ２）の成分であり、これは、胚幹細胞（ＥＳＣ）における主要な発生遺伝子をターゲットにしており、また癌の進行にも関与している。対照的に、ＧＣ関連エンハンサーは、ＳＵＺ１２／ＥＺＨ２エンリッチメントを示さず、しかしながら、フォルクヘッド（ｆｏｒｋｈｅａｄ、ＦＯＸ）、ＧＡＴＡファミリーメンバー、及びＦＯＳ及びＪＵＮ細胞周期調節因子を含む発生レギュレーターに関与した（ｐ＜０．０５）（図３ｂ）。

【0091】

ＧＣ関連プロモーターとＥＳＣにおけるＰＲＣ２ターゲット領域との間で幾つかの共通性が存在した。第一に、ＧＣプロモーターとオーバーラップしているＳＵＺ１２部位は、ＥＳＣ及び胚癌細胞から供給され、他のＥＮＣＯＤＥ細胞種（例えば、リンパ芽球株）からではなかった。第二に、ＥＳＣにおいて、ＰＲＣ２結合は、二価／転写準備状態クロマチン状態（Ｈ３Ｋ４ｍｅ３及びＨ３Ｋ２７ｍｅ３陽性）に関連し、同様にＧＣプロモーターは、ＥＳＣにおいてＨ３Ｋ４ｍｅ３及びＨ３Ｋ２７ｍｅ３二価性を示す領域でエンリッチであり（ｐ＜２．２ｘ１０^−１６；図３ｃ）、例は、ホメオボックス遺伝子ＯＮＥＣＵＴ２について示す（図３ｄ）。第三に、ＥＳＣにおいて、ＰＲＣ２ターゲット領域は、ＤＮＡメチル化喪失を示す。イルミナメチレーションアレイを使用して、確認されたＧＣ関連プロモーターはまた、全体集団と相対的に、ＤＮＡメチル化レベルの減少を示した（ｐ＝７．０７ｘ１０^−４８）（図３ｅ）。ＧＣにおける癌関連プロモーターは従って、幹細胞におけるＰＲＣ２ターゲット領域と類似し得る。

【0092】

ナノＣｈＩＰｓｅｑ データにおけるシングルヌクレオチドバリアント（ＳＮＶ）を同定するために、ＭｕＴｅｃｔに基づいて解析的パイプラインが開発された、感受性変異／バリアント同定アルゴリズム。３３５，９１８の独自のＳＮＶが、併合したＨ３Ｋ４ｍｅ３、Ｈ３Ｋ４ｍｅ１、Ｈ３Ｋ２７ａｃ及びインプットデータにおいて同定された。バリアントコーリングパイプラインの精度を支持して、９９．８％のＳＮＶ（３３５，２４７）が公知のＳＮＰ（ｄｂＳＮＰ１３７）に対応した。同定されたｄｂＳＮＰのうちで、おおよそ〜２５１，８００は、少なくとも１つのサンプルにおいてヘテロ接合であった。

【0093】

調節エレメントに対するヘテロ接合ＳＮＰのマッピングは、非アレルバイアス部位とアレルバイアス部位とに分けることが可能であることが明らかにされた。非バイアス部位では、ナノＣｈＩＰｓｅｑ 配列リードは、リファレンスとバリアントアレルとの均等な割合を示した。例えば、ＧＣ２０００６３９は、ＴＮＫ２遺伝子遺伝子座での癌関連プロモーターを示した（図４ａ、ｂ）。この患者からの正常ＤＮＡにおいて、この領域は、ｄｂＳＮＰ ｒｓ７６３６６３５（図４ｃ）についてヘテロ接合であり、且つ同様に腫瘍においては、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３エンリッチリードは、リファレンス及びｒｓ７６３６６３５アレルの両者を持つリードの均等な割合によって導かれた（図４ｃ、ｄ）。対照的に、アレルバイアス部位は、一方のアレルの方向に歪められたナノＣｈＩＰｓｅｑリードを表示した。これは、ＮＵＤＴ４遺伝子座での癌関連プロモーターにおいて観察された（図４ｅ、ｆ）。この患者からの正常ＤＮＡの解析は、ｒｓ４７６１７０１についてのヘテロ接合性を確認したが（Ｆｉｇ． ４ｇ）、しかしながら腫瘍においては、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３エンリッチリードは、リファレンスアレルよりも寧ろｒｓ４７６１７０１アレルを持つリードによって主に導かれた（図４ｇ、ｈ）。

【0094】

癌サンプルにおけるアレルバイアス部位は、ヘテロ接合性の喪失（ＬＯＨ）、又はクロマチンマークのための特異的なアレルの活性なエンリッチメント（アレル特異的調節エレメント）の何れかにより引き起こされ得ることは筋が通っていた。癌に関連するアレル特異的調節エレメントを同定するために、アレルバイアスを示すヘテロ接合性部位（＞３０％のＳＮＰ上方発現（ｏｖｅｒ−ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）；図４ｉ）が、ＧＣと正常組織との間のクロマチンマーク変化を示す領域とオーバーラップしていた。１５１の候補部位のうち（図４ｊ）、特に興味のある１７のアレル（１１％）をレギュロームＤＢ、ヒト調節バリアントのデータベース、によって蛋白質ＤＮＡ結合に影響を与えることについて予測されるものとして注目した（レギュロームＤＢスコア１又は２）（図４ｋ）。これらの１７部位のうちの１２は、更に定量的パイロシーケンシング（５部位は、ＰＣＲ又はシーケンシングの不成功のために分析できなかった）によって確認でき、残りの１２のＣｈＩＰエンリッチリード内の９の部位（７５％）中のアレルバイアスの存在を、しかしながら癌においではなく、正常インプットＤＮＡにおいて、確認され、このバイアスが癌組織におけるＬＯＨに起因するものではないことが示される。４のアレルが、以前に同定されたｅＱＴＬに対応しており（図４ｋ）、ｅＱＴＬ ｄｂＳＮＰｒｓ２６５９１０４についてのアレルバイアスが示されたＫＬＫ１遺伝子を含んでいた（図４ｌ−ｎ）。これらの結果は、ＧＣ遺伝子発現のコントロールパターン中のアレル特異的調節エレメントについての潜在的な役割を強調し、アレルバイアス部位に関連する幾つかの遺伝子は、ＧＣにおいて予てより関連している見なされてきた通りである（例えば、ＣＬＤＮ４、ＭＴＡＰ、ＳＥＲＰＩＮＢ５）。

【0095】

ｄｂＳＮＰに加えて、ＧＣ関連調節エレメントにオーバーラップするプライベート（非ｄｂＳＮＰ）ＳＮＶｓもまた同定された。４つのプライベートＳＮＶが真の体細胞変位であることが確認され、それは、ＧＣにおいて存在するが、正常組織では存在せず、ＣＨＤ１０、ＨＯＸＡ５、ＦＡＲ２及びＨＯＸＡ１１に関連する非コーディング領域において生じた（図５、１９−２１）。これらのうちで、ＣＨＤ１０及びＦＡＲ２変異は、インプット腫瘍ＤＮＡと相対的なＨ３Ｋ４ｍｅ３エンリッチリードにおけるアレルバイアスと、更に腫瘍関連遺伝子発現を示した。ＨＯＸＡ１１関連Ａ−Ｔ変異は、多数の癌におけるＨＯＸＡ１１の関与の理由から注目された。５つのラインのエビデンスは、この体細胞変異が機能的であり、バイスタンダー変化ではないことを示唆する。第一に、ＧＣ２０００６３９におけるこの変異の存在が、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３及びＨ３Ｋ２７ａｃプロモーターマーク獲得に関与した（図５ａ−ｃ）。第二に、この変異の存在が、ＧＣにおける上方調節されたＨＯＸＡ１１遺伝子座ＲＮＡ発現に関連した（図５ａ）。第三に、Ｈ３Ｋ２７ａｃシーケンスリードにおいて、Ｔ変異アレルは、アレルバイアスを示し、これは、インプット腫瘍ＤＮＡと相対的に高い上方発現（９６％）であり、そこにおいてその体細胞変異 アレル頻度は、〜１０％又はそれ未満である（図５ｃ−ｄ）。

【0096】

第四に、この変異の存在は転写因子結合を変化させることが予測される（図５ｅ）。第五に、ルシフェラーゼレポータアッセイにおいて、変異Ｔアレルを持つゲノムＤＮＡフラグメントが、野生型Ａアレルを持つゲノムＤＮＡと比較して有意に大きな転写活性を示した（ｐ＝１．１ｘ１０_−４、図５ｆ）。これらの結果は、ナノＣｈＩＰｓｅｑがＧＣにおける機能的調整力のある体細胞変異を同定できることを明示する。
調節エレメントは、ヒトゲノムの１．５〜１０％を占めること、及び発生及び疾病に強く影響を与えることが推測される。しかしながら、これらのエレメントを位置付けること、それらの活性の生物学的状態を明確にすることは、依然として重要な課題として残っている。ここで、ナノＣｈＩＰｓｅｑを使用し、初期のＧＣにおけるクロマチン変化の初回通過調査を行った。将来においては、ナノＣｈＩＰｓｅｑは、他の腫瘍種類に、またより少ない細胞数にまで拡大され、診断生検及び薬物耐性クローニングの解析を容易にし得る。翻訳の観点から、我々の所見はまた潜在性プロモーター及びそれらに関連する非カノニカル転写物が癌診断のためのバイオマーカーとして利用できると考えられることを示唆する。

【0097】

例２
方法
組織サンプル
主な患者サンプルは、ザ・サンゲヘルス・ティッシュ・レポジトリー（the Singhealth tissue repository）から入手され、企業研究倫理審査委員会からの承認をもって収集され、患者のインフォームド・コンセントに署名を受けた。

【0098】

この研究において使用された「正常」（非悪性）サンプルは、胃から採取された、腫瘍から離れた部位からの、外科的な評価上で腫瘍の視覚的な兆候又は腸上皮化生／異形成を示してないサンプルをいう。腫瘍サンプルは、低温切開片が＞４０％腫瘍細胞を含むことにより確認された。

【0099】

ナノＣｈＩＰｓｅｑ
ナノＣｈＩＰｓｅｑは、組織分離工程を伴い、従来記載されている通りに行われた。新鮮凍結癌及び正常組織は、液体窒素中でカミソリ刃を使用して切開し、〜５ｍｇの大きさの小片を得た（見掛け容量による〜５μｌ）。組織小片は、１％のホルムアルデヒド／ＰＢＳ緩衝液中で１０分間（ｍｉｎ）室温で固定された。固定は、１２５ｍＭの最終濃度にまでグリシンを添加することにより停止した。

【0100】

組織小片をＴＢＳＥ緩衝液で３回洗浄し、リソネーター・カートリッジ（Ｌｙｓｏｎａｔｏｒ ｃａｒｔｒｉｄｇｅｓ、ＳＧ Ｍｉｃｒｏｌａｂ Ｄｅｖｉｃｅｓ、シンガポール）内に移した。組織を製造者のガイドラインに従って解離させ（４ＫＨｚ、３分間)、ナノＣｈＩＰアッセイにおける溶解工程に直接に持ち込んだ。溶解された組織は、２００μｌの溶解緩衝液中で溶解され、バイオラピュター（Ｂｉｏｒｕｐｔｏｒ、Ｄｉａｇｅｎｏｄｅ）を使用する超音波処理（６分間）のために２本の１．５ｍｌ試験管内に分配した。各組織について、ＣｈＩＰを以下の抗体：Ｈ３Ｋ４ｍｅ３（０７−４７３、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）；Ｈ３Ｋ４ｍｅ１（ａｂ８８９５、Ａｂｃａｍ）；Ｈ３Ｋ２７ａｃ（ａｂ４７２９、Ａｂｃａｍ）；Ｈ３Ｋ３６ｍｅ３（ａｂ９０５０、Ａｂｃａｍ）；Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３（０７−４４９、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用し、同じクロマチン調製物を使用して行った。

【0101】

ＣｈＩＰ及びインプットＤＮＡの回収の後、全ゲノム増幅をＷＧＡ４キット（Sigma-Aldrich）及びＢｐｍＩ−ＷＧＡプライマーを使用して行った。

【0102】

増幅されたＤＮＡをＢｐｍＩ（Ｎｅｗ ＥｎｇｌｉａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）で消化した。１０ｎｇの増幅ＤＮＡを各イルミナ・シーケンシング・ライブラリーのために使用した。ライブラリー調製は、Ｅ６２４０ニュー・イングランド・バイオラボ・キットを使用して行われ、次に、Ｅ７３３５ニュー・イングランド・バイオラボ・キットのを使用するシーケンシングの前にマルチプレックスされた。

【0103】

ナノＣｈＩＰｓｅｑリードマッピングとピークコーリング
シーケンシングタグは、ヒトリファレンスゲノム（ｈｇ１９）に対して、バーロウズ・ウィラー・アライナ（Ｂｕｒｒｏｗｓ−Ｗｈｅｅｌｅｒ Ａｌｉｇｎｅｒ、ＢＷＡ）ソフトウェア（バージョン０．７．０）及び「ａｌｎ」アルゴリズムを用いてマッピングされた。２０のＭＡＰＱフィルターが適用されて、低質のリードを除去し、全ＰＣＲ複製物もまた、ピカードからのマークダップ（ＭａｒｋＤｕｐ、Ｐｉｃａｒｄ）を使用して除去された。独自にマッピングされたタグが、ＣＣＡＴバージョン３．０によるピークコーリングのために、ヒストン修飾のための５０ｂｐの移動工程を伴って、フラグメントサイズ２００ｂｐ及び５００ｂｐのスライディングウィンドウと共に使用された。ピーク領域は、見せかけの発見率（ｆａｌｓｅ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｒａｔｅｓ、ＦＤＲ）５％によりフィルタリングされた。

【0104】

ＣｈｉｐＳｅｑシグナル解析
転写開始部位（ＴＳＳ）周辺でのＨ３Ｋ４ｍｅ３及びＨ３Ｋ２７ａｃシグナル強度プロットを、し、Ｒｅｆｓｅｑにおける全アノテートＴＳＳ周辺の各クロマチンマークの平均カバレージを計算することによってプロットした。公知のＴＳＳ周辺の６ｋｂウィンドウは、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３及びＨ３Ｋ２７ａｃの両者についての１００ｂｐ及びカバレージのビンに分配し、計算して、各ビンを交差して平均にした。

【0105】

全Ｈ３Ｋ４ｍｅ３領域をＧＣサンプル及び正常サンプルのそれぞれについてベッドツールを使用してマージし、オーバーラップしている領域をコモン領域として計数した。何れのオーバーラップのない領域をプライベート領域と称する。サンプルのうちのＨ３Ｋ４ｍｅ３領域間でのオーバーラップについてゲノムｎｕｌｌ予測を提供するために、コンセンサス領域をベットツールからのシャッフルベッドを使用して、全体のリファレンスゲノムに亘ってシャッフルしたが、しかしなら、ＥＮＣＯＤＥ ＤＡＣブラックリスト領域及びｇａｐ領域（ダンハム，Ｉらからの公表された領域のセットがある（Ｄｕｎｈａｍ， Ｉ．， ｅｔ ａｌ． Ａｎ ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ ＤＮＡ ｅｌｅｍｅｎｔｓ ｉｎ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｇｅｎｏｍｅ． Ｎａｔｕｒｅ ４８９， ５７−７４ （２０１２））については除外した。当該領域は、１０００回シャッフルし、経験的ｐ値をオーバーラップ分布を使用して発生させた。

【0106】

体細胞的に変化したプロモーターの同定
癌対正常サンプルにおいてディファレンシャルエンリッチメントを有するＨ３Ｋ４ｍｅ３領域をバイオコンダクターからのＤＥＳｅｑ２アルゴリズムを使用して同定した。エンリッチメントは、癌性サンプル対非癌性サンプルにおけるＨ３ｋ４ｍｅ３の獲得である。シーケンシングタグ計数のマトリックスは、１）全ＧＣ及び正常サンプルを横切る全同定プライベートを結合させること；及び２）全サンプル横切る各領域におけるシーケンシングリードの数を決定することにより生成された。工程１）及び２）の両者は、ベットツールを使用して行われた。

【0107】

ＤＥＳｅｑ２検定は、ＣｈＩＰｓｅｑを含む種々のシーケンシングアッセイおいて、負数の二項式一般化線形モデルの使用により、ディファレンシャルエンリッチメントを決定する。全サンプルからのシーケンシングタグ計数のマトリックスは、ベッドツールを使用する複製を交差して同定されたＨ３ｋ４ｍｅ３の結合を得ること、及び各得られたプライベート領域におけるシーケンシングリードの数を計数することにより、ＤＥＳｅｑ２検定のためのインプットとして生成され、ここにおいて、ＤＥＳｅｑ２検定は、負数の二項式一般化線形モデルに適合し、プライベート領域を明らかにし、それらは、胃癌と正常サンプルとの間で統計的に異なり、即ち、体細胞的に変化したプロモーターである。統計的に異なるとは、見せかけの発見率（Ｆａｌｓｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｒａｔｅ）が１０％、即ち、ｐ値が０．１、並びに絶対倍率変化が１．５である統計的閾値をいう。

【0108】

ディファレンシャル領域は、腫瘍及び正常群、並びに個々のサンプル特異的ピークの両者から同定された。

【0109】

代替プロモーター同定
ＧＥＮＣＯＤＥ転写物は、それらのｆｔｐサイトからダウンロートされ、一方で、Ｒｅｆｓｅｑ転写物は、ＵＣＳＣブラウザーからダウンロードされた。ＧＥＮＣＯＤＥ転写物転写についてのサポートレベル情報は、ＵＣＳＣ ｆｔｐサイトからダウンロードした。アノテートＴＳＳは、転写物開始位置を−／＋５００塩基にまで拡張することにより定義された。ディファレンシャルなエンリッチＨ３Ｋ４ｍｅ３ピーク領域は、ＴＳＳ領域に対して比較され、オーバーラップが決定された。ＲＮＡｓｅｑリードの新しい集団化は、カフリンクス−２．２．０．１２によって行われ、非アノテートＨ３Ｋ４ｍｅ３ディファレンシャル領域は、クラスコード「ｊ」又は「ｕ」を有する新規集団の第１のエクソンとのオーバーラップによってフィルタリングされた。
ＲＮＡｓｅｑ解析
リードは、独自のマッピングを使用するＴｏｐＨａｔ２−２．０．１２を使用してヒトリファレンスゲノムに対して位置合わせされた。トランスクリプトームは、カフリンクス２−２．０．１２を使用して新たに集団化され、全ＧＣ転写物アッセンブリは、「カフリンクス２−２．０」を使用してマージされ、コンセンサストランスクリプトームを得た。ＴＣＧＡ胃腺癌についての生ＲＮＡｓｅｑデータは、ＴＣＧＡレポジトリー（ｈｔｔｐ：／／ｃａｎｃｅｒｇｅｎｏｍｅ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）からダウンロードされた。

【0110】

ポイズドプロモーター解析（Ｐｏｉｓｅｄ Ｐｒｏｍｏｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ）
ディファレンシャルエンリッチ領域は、３サンプルからのＣＣＡＴ３コールＨ３Ｋ２７ｍｅ３ピークとオーバーラップしており（１ｂｐのオーバーラップ）その存在又は不在が決定される。

【0111】

考察
ＧＣにおけるプロモーター領域の同定
ナノＣｈＩＰｓｅｑを使用し、８つのＧＣ及び対応する正常サンプルの拡大されたコホートを使用して、胃癌（ＧＣ）のプロモーターエレメントをマーク、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３及びＨ３Ｋ２７ａｃに関連する２つのプロモーターで特徴付けした。ピークは、ＣＣＡＴ３を使用してコールし、サンプル当たりの平均１１ｋのＨ３Ｋ４ｍｅ３及び３４ｋのＨ３Ｋ２７ａｃピークを同定した。７０〜８０％のＨ３Ｋ４ｍｅ３領域がＧＣ及び正常組織の両者においてサンプル間で共通し、偶然に予期よりも大きい（ｐ＜０．００１）。

【0112】

Ｈ３Ｋ４ｍｅ３及びＨ３Ｋ２７ａｃの両者は、転写開始部位（ＴＳＳ）周辺でエンリッチなスタンダード二峰性分布を示した（図２２ａ）。Ｈ３Ｋ２７ａｃは、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３に比較して弱いシグナルを示したが、これは、一定のそれの広範に及ぶ多量な全活性調整領域のマーキングが予期される。９９％よりも大きな全Ｈ３Ｋ４ｍｅ３領域は、ＤＮＡｓｅＩ過感受性部位（ＥＮＣＯＤＥより）とオーバーラップした。ＧＣ（ｒ＝０．９１、ｐ＜０．００１）（図２２ｂ）及び正常サンプル（ｒ＝０．９１、ｐ＜０．００１）の両者は、強い陽性の相関関係をＨ３Ｋ４ｍｅ３及びＨ３Ｋ２７ａｃ有する。Ｈ３ｋ２７ａｃの存在を含む全Ｈ３Ｋ４ｍｅ３領域は、活性なプロモーター領域としてマークされた。コモン（即ち、反復性（ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ））ＧＣプロモーターにおける活性（即ち、Ｈ３Ｋ２７ａｃ陽性）領域の割合領域は、プライベートプロモーター、並びに正常サンプルにおけるプロモーターよりも高かった（図２２ｃ）。

【0113】

ＧＣにおける体細胞的に変化したプロモーターの同定
ゲノム規模での体細胞的に変化したプロモーターの同定のために、シーケンシングタグ計数のマトリックスを主なＧＣと対応する胃正常組織との間で比較し、負数の二項式分布 （ＤＥＳｅｑ２アルゴリズムによる解析されたとき）を推測した。正常組織のプールに対して全８ＧＣサンプルを比較すると、５１６の確実に体細胞的に変化した領域（ｑ＜０．１、倍率変化＞１．５）が得られ、それらの〜６０％は、ＧＣにおいて獲得されたか、後成的に活性化されたものであった（図２３ｃ）。
同定領域についてサンプルを交差するＨ３Ｋ４ｍｅ３シグナルのクラスタリングは、区別可能な分離を確認した（図２３ｂ）。同様な結果（９５％コンコーダンス）は、代替的な計数ベースディファレンシャルアルゴリズムを使用して得られ、我々の結果が強固であり方法独立性であることを確保している（図２３ａ）。

【0114】

２４９の体細胞的に変化した領域（４８％）は、２倍ＦＰＫＭベースシーケンシングタグ密度比較で使用された例１の６３９のプロモーターの同定のために追加された。主なＧＣ新規のプロモーターの獲得は再度、プロモーター喪失を上回り、即ち、１４８（６０％）獲得対１０１喪失であった。全体の６２０のプロモーター領域は、ＧＣにおいて獲得され（７０％）、対してＧＣにおいて２６０の喪失であった。

【0115】

転写物のより包括的なデータベースを使用して、体細胞的に変化した領域を、公知のＧＥＮＣＯＤＥ ＴＳＳ周辺の１ｋｂウィンドウとオーバーラップさせて、それらに注釈をつけた（アノテートした）。６２％の体細胞的に変化したプロモーター領域は、公知の転写物にオーバーラップした。しかしながら、実質的に３８％がアノテートＴＴＳの５００ｂｐを越えて存在した（図２３ｄ）。

【0116】

特定のｌｏｃｉでのＨ３Ｋ４ｍｅ３エンリッチメントは、ＧＣ影響転写物セレクションにおける代替プロモーター使用のパタンの観察に役立った。５５３の（ＧＣにおける６３％獲得）体細胞的に変化したプロモーター領域が、公知の転写物にオーバーラップした。優先的な活性化／抑制が、１つの転写物はマルチ転写遺伝子における他のもの、例えば、ＨＮＦ４Ａを越えて観察された。ＨＮＦ４Ａは、周知の転写因子遺伝子であり、肝臓、腎臓及び腸の発生を調節する。ＧＣにおいて、ＨＮＦ４Ａは、過発現することが報告されており、近年の免疫組織化学的研究は、そのマーカーとしての可能性を示しており、乳癌組織からＧＣ組織を区別している。

【0117】

ＧＣにおけるＨ３Ｋ４ｍｅ３エンリッチメント（ＦＣ２．５２、ｑ＜０．００１）がカノニカルＨＮＦ４ＡアイソフォームＴＳＳのおおよそ４５ｋｂ下流のプロモーターで観察された。カノニカルプロモーターは、他方で、ＧＣ及び正常における同等のリジントリメチル化が示され、下流プロモーターのＧＣ特異的使用、従って、ＨＮＦ４Ａの短い蛋白質コーディングアイソフォームであることが際立たされた（図２４ａ）。

【0118】

そのような代替プロモーター使用を例を伴う他の癌関連遺伝子は、とりわけＥＰＣＡＭ（ＦＣ１．６４、ｑ＜０．００１）、ＫＲＴ７（ＦＣ２．００、ｑ＜０．００１）、ＡＩＭ１Ｌ（ＦＣ１．９５、ｑ＜０．００１）であった。ＦＣ及びｑ値統計は、ＤＥＳｅｑ２解析に由来し、そこにおいてＦＣは倍率変化を定義する。

【0119】

体細胞的に変化したプロモーターまた頻繁に、マルチ転写物に関連する遺伝子における１つの転写物のみとオーバーラップし、主要プロモーター及び癌特異的アイソフォームをマーキングする（図２４ｂ）。ＣＥＡＣＡＭ６は、この現象の目立つ例であり、２つの公知の蛋白質コーディング転写物のうちの一方のアイソフォームだけが、ＧＣにおけるＨ３Ｋ４ｍｅ３エンリッチメントを示した（ＦＣ ２．５６， ｑ＜０．００１）。多様なそのような例が、ＧＣにおけるカノニカルアイソフォームを越える公知の代替転写物の使用が観察されているが、それらは、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３、例えば、ＣＬＤＮ４（ＦＣ２．７１、ｑ＜０．００１）、ＳＨＤ（ＦＣ２．１４、ｑ＜０．００１）、ＣＥＡＣＡＭ１８（ＦＣ２．１０、ｑ＜０．０１）及びＳＵＬＴ２Ｂ１（ＦＣ２．３３、ｑ＜０．００１）によるそれらのプロモーター領域の後成的な活性化又は抑制により決定される。

【0120】

非常に転写サポートエビデンスに乏しい（ｔｓｌ ２以上）ＧＥＮＣＯＤＥ転写物とオーバーラップしている体細胞的に変化した領域の例も観察された。そのようなＧＥＮＣＯＤＥ転写物アノテーションは、殆どない、又はｍＲＮＡのサポートがないが、Ｒｅｆｓｅｑなどの更にキュレーテッドなデータベータにもしばしば含まれていない。

【0121】

そのような転写物のＴＳＳとオーバーラップしている１０９エンリッチ領域が観察され、ＧＣにおけるＲＮＡ発現によりサポートされ、それはこれらのＧＣ特異的使用、さもなくば非サポートのアイソフォームが際立つ。１つのそのような例は、ＭＹＯ１５Ｂであり、転写された偽遺伝子であり、その非サポートのアイソフォームプロモーターでＧＣにおけるＨ３Ｋ４ｍｅ３の有意な獲得（ＦＣ２．１６、ｑ＜０．０１）を示し、一方で、そのカノニカルアイソフォームではＨ３Ｋ４ｍｅ３は完全に不在であった（図２４ｃ）。

【0122】

更なる潜在性プロモーターは、ＧＣ特異的アイソフォームの新規の５’開始部位のマーキングにより同定され、これは真のＲＮＡ転写物に関連した。目立つ例は、Ｒａｓ ＧＴＰａｓｅ活性化蛋白質３（ＲＡＳＡ３）であり、これはＧＣ組織においてのみ転写される新規の非常に短いアイソフォームを形成するカノニカル転写開始部位からおおよそ１２７ｋｂ下流のプロモーター領域で、ＧＣサンプル中でディファレンシャルＨ３Ｋ４ｍｅ３エンリッチメントを示した。カノニカルアイソフォームは、ＧＣ及び正常組織の両者における等量のＨ３Ｋ４ｍｅ３を示した。そのような新規の５’開始部位アイソフォームの他の例は、ＧＲＩＮ２Ｄ（ＦＣ２．５２、ｑ＜０．００１）、ＯＮＥＣＵＴ３（ＦＣ２．５２、ｑ＜０．００１）及びＴＮＮＩ３（ＦＣ２．５２、ｑ＜０．００１）であった。

【0123】

代替プロモーター使用はまた、代替ＧＣ特異的アイソフォームの蛋白質を変化させる。公知又は新規に集合化され、代替プロモーターから発生するアイソフォームのゲノム配列が使用されることにより、蛋白質ドメインの存在が予測され、ドメイン組成がカノニカルアイソフォームのそれと比較され、蛋白質変化の例が見いだされる。

【0124】

代替アイソフォームがＲＮＡｓｅｑによりサポートされている場合、次に、蛋白質組成物変化内容について選択される。１０のそのような高い確かさの遺伝子は、ＲＡＳＡ３を含む蛋白質ドメイン多様性を示すことについて同定される（図２５ｂ、表１）。

【表1】

【0125】

ＧＣ特異的の短いアイソフォームは、ＲａｓＧＡＰドメインを欠いており、それは、Ｒａｓの活性を下方調節する分子スイッチとして作用する。このドメインの不在において、それは、ＧＴＰ結合ＲＡＳの発現の増大が引き起こされ、ひいては異常な細胞増殖が引き起こされ得る。

【0126】

また、体細胞的に変化した領域におけるＨ３Ｋ２７ｍｅ３マークの存在も観察された。多くの場合において、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３マークは、ＧＣ又は正常組織の何れかにおいて観察され、それは、一価の状態から二価の準備状態又はその逆も同様に、プロモーターの変化を潜在的にマーキングする。例えば、ＴＮＦＳＦ９、腫瘍ネクローシスファクター結合に関与するサイトカインであり、ＧＣに関与するエプスタイン・バー・ウイルス（ＥＢＶ）において発現されることが示されており、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３の獲得及びＧＣにおけるＨ３Ｋ２７ｍｅ３の存在が示されており、その一方で、抑制的なトリメチル化マークが正常組織には不在である。ＴＮＦＳ９は、コンコーダンスな低レベルＲＮＡｓｅｑ発現（ＦＰＫＭ ４．９）を有し、ＧＣにおいて準備された後成的な状態を備える。
同定された体細胞的に変化したプロモーターは、ＧＣにおける広範な代替プロモーターの使用で際立ち、且つ裏付けられ、同時に代替プロモーターの使用が得られる蛋白質の蛋白質ドメインのインパクトとなり、それがＧＣに対して特異的であり得ることが明らかである。

【0127】

そのようなものとして、上記の観察及び実験データに基づいて、対応する正常サンプルとの比較において、８の主要な胃癌（ＧＣ）の拡張されたコホートを使用することにより、アルゴリズム（Ｄｅｓｅｑ２）に基づいて計算されたリード計数マトリックスが、付加的な体細胞的に変化したプロモーター領域を同定することを可能にする。体細胞的に変化したプロモーター領域の同定は、癌に特異的な幅広い代替プロモーターの使用を際立たせ、且つ裏付けられ、それは１つの転写物のプロモーターの優先的な変更を経るか、又はマルチ転写遺伝子における使用における主要な転写産物のプロモーターの変更によるかの何れかによって、胃癌に関して例証された通りであり、更に、付加的な「潜在性プロモーター」は、非カノニカルアイソフォームの５’開始部位をマーキングする拡大されたコホートにおいて同定された。

【0128】

上記の非カノニカルアイソフォームは、特定の癌に特異的であり得る、得られる蛋白質のドメイン組成における変化を示したが、例えば、表１においては、ＧＣに特異的であり得る蛋白質を説明している。これらの潜在性プロモーター及び関連する非カノニカル転写物は、ターゲットセラピー及び癌診断のためのバイオマーカーとして使用され得る。そのようなものとして、ここに開示された本発明及び方法は、対象における癌の検出及び診断を可能にするためのバイオマーカーとして特定されるものであり、且つ提供されるものである。
以下に、本願出願の当初の特許請求の範囲に記載された発明を付記する。
［１］
非癌性生物サンプルと相対的に、癌性生物サンプル中の少なくとも１つのプロモーターの活性を決定する方法であって、
前記癌性生物サンプルから得られた少なくとも１つのプロモーター配列を含む単離された核酸を、前記非癌性生物サンプルから得られたリファレンス核酸と対照してマッピングし、前記少なくとも１つのプロモーターについて１００万当たりのキロベース当たりのリード（ＲＰＫＭ）値又は１００万当たりのキロベース当たりのフラグメント（ＦＰＫＭ）値を得ること；及び
前記ＲＰＫＭ又はＦＰＫＭ値を使用して、前記リファレンス核酸配列中の前記少なくとも１つのプロモーターの活性と相対的に、前記核酸中の前記少なくとも１つのプロモーター配列のディファレンシャル活性を決定すること
を含む方法。
［２］
［１］の方法であって、前記癌性生物サンプル及び非癌性生物サンプルが、単一細胞、多細胞、細胞のフラグメント、体液又は組織を含む方法。
［３］
［１」〜［２］の何れか１つの方法であって、前記癌性生物サンプル及び非癌性生物サンプルが同一の対象から得られる方法。
［４］
［１］〜［３］の何れか１つの方法であって、前記癌性生物サンプル及び非癌性生物サンプルがそれぞれ異なる対象から得られる方法。
［５］
［１］〜［４］の何れか１つの方法であって、前記核酸は、クロマチンの免疫沈降によって前記癌性生物サンプルから単離され、前記核酸は、前記少なくとも１つのプロモーターを含む方法。
［６］
［５］の方法であって、クロマチンの免疫沈降が、修飾されたヒストン蛋白質に対して特異的な抗体によって達成される方法。
［７］
［６］の方法であって、前記修飾されたヒストン蛋白質が、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３、Ｈ３Ｋ４ｍｅ１及びＨ３Ｋ２７ａｃからなる群より選択された少なくとも１つのヒストン修飾を含む方法。
［８］
［７］の方法であって、前記抗体が、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３、Ｈ３Ｋ４ｍｅ１及びＨ３Ｋ２７ａｃからなる群より選択された少なくとも１つのヒストン修飾に対して特異的である方法。
［９］
［１］〜［８］の何れか１つの方法であって、前記少なくとも１つのプロモーターを含む単離された核酸は、少なくとも１つのプライマーで増幅される方法。
［１０］
［９］の方法であって、前記増幅された核酸は、前記増幅された核酸を含む核酸配列ライブラリの構築のために使用される方法。
［１１］
［１］〜［１０］の何れか１つの方法であって、前記マッピング工程が、前記リファレンス核酸と相対的に、前記マッピングされた核酸中の当該少なくとも１つのプロモーターについての全配列ｔａｇに基づいて前記ＲＰＫＭ値を計算することを含む方法。
［１２］
［１］〜［１０］の何れか１つの方法であって、前記マッピング工程が、前記リファレンス核酸と相対的に、前記マッピングされた核酸中の当該少なくとも１つのプロモーターに関連する同定された転写配列に基づいて前記ＦＰＫＭ値を計算することを含む方法。
［１３］
［１］〜［１２］の何れか１つの方法であって、前記少なくとも１つのプロモーター配列のディファレンシャル活性を決定する工程が、前記癌性生物サンプルから得られた当該核酸中の少なくとも１つのプロモーターについての前記ＲＰＫＭ又はＦＰＫＭ値が、
ｉ）前記非癌性生物サンプルから得られた前記リファレンス核酸中の当該少なくとも１つのプロモーターの前記ＲＰＫＭ又はＦＰＫＭ値と相対的に、平均ＲＰＫＭ又はＦＰＫＭ値における変化が１〜２０倍の間、例えば、１倍、２倍、３倍、４倍又は５倍よりも大きい；及び
ｉｉ）前記非癌性生物サンプルから得られた前記リファレンス核酸中の前記少なくとも１つのプロモーターの前記ＲＰＫＭ又はＦＰＫＭ値と相対的に、ＲＰＫＭ又はＦＰＫＭの範囲が０．１よりも大きい
ことを決定することを含む方法。
［１４］
［１］〜［１３］の何れか１つの方法であって、前記少なくとも１つのプロモーターは、当該全プロモーター集団と相対的に、ＳＵＺ１２結合部位の増加を含む方法。
［１５］
［１］〜［１４］の何れか１つの方法であって、前記少なくとも１つのプロモーターは、細胞種特異化、胚発生又は転写因子に関連する遺伝子に近傍に位置する方法。
［１６］
［１５］の方法であって、前記少なくとも１つのプロモーターは、癌に関連する遺伝子に近傍に位置する方法。
［１７］
［１６］の方法であって、前記遺伝子が、ＮＫＸ６−３、ＳＡＬＬ４、ＨＯＸＢ９、ＭＥＴ、ＴＮＫ２、ＫＬＫ１、ＦＡＲ２、ＨＯＸＡ１１又はＨＯＸＡ１１−ＡＳである方法。
［１８］
［１］〜［１７］の何れか１つの方法であって、前記癌が胃癌である方法。
［１９］
［１］〜［１８］の何れか１つの方法であって、前記少なくとも１つのプロモーターが、潜在性プロモーターを含む方法。
［２０］
癌に対する対象の感受性を決定する方法であって、
前記対象の癌性生物サンプルから得られた少なくとも１つのプロモーターを含む単離核酸を非癌性生物サンプルから得られたリファレンス核酸に対照してマッピングし、前記少なくとも１つのプロモーターについてのＲＰＫＭ又はＦＰＫＭ値を得ること；及び
前記ＲＰＫＭ又はＦＰＫＭ値を使用して、前記リファレンス核酸中の当該少なくとも１つのプロモーターの活性と相対的に前記核酸中の前記少なくとも１つのプロモーターのディファレンシャル活性を決定すること；
を含み、
ここにおいて、前記非癌性生物サンプル中のそれと相対的な、当該癌性生物サンプル中の前記少なくとも１つのプロモーターの活性の増大が、癌に対する当該対象の感受性を示す
方法。
［２１］
対象において癌に関連する少なくとも１つのプロモーターの存在を決定する方法であって、
前記対象の癌性生物サンプルから得られた少なくとも１つのプロモーターを含む単離された核酸を非癌性生物サンプルから得られたリファレンス核酸と対照してマッピングし、前記少なくとも１つのプロモーターについてのＲＰＫＭ又はＦＰＫＭ値を得ること；及び
前記ＲＰＫＭ又はＦＰＫＭ値を使用して前記リファレンス核酸中の前記少なくとも１つのプロモーターの活性と相対的に、前記核酸中の前記少なくとも１つのプロモーターのディファレンシャル活性を決定すること；
を含み、
ここにおいて、前記非癌性生物サンプルのそれと相対的な、前記対象から得られた当該癌性生物サンプル中の当該少なくとも１つのプロモーターの活性の増大が、対象における癌に関連するプロモーターの存在を示す方法。
［２２］
［２１］の方法であって、前記癌に関連する少なくとも１つのプロモーターは、
当該生物サンプルから得られた当該核酸中の前記１つのプロモーターについてのＲＰＫＭ又はＦＰＫＭ値が、
ｉ）非癌性生物サンプルから得られた当該リファレンス核酸中の当該少なくとも１つのプロモーターの当該ＲＰＫＭ又はＦＰＫＭ値と相対的な平均ＲＰＫＭ又はＦＰＫＭ値の変化が１〜２０倍の間、例えば、１倍、２倍、３倍、４倍又は５倍よりも大きいとき；及び
ｉｉ）非癌性生物サンプルから得られた当該リファレンス核酸中の当該少なくとも１つのプロモーターの当該ＲＰＫＭ又はＦＰＫＭ値と相対的にＲＰＫＭ又はＦＰＫＭの範囲が０．１よりも大きいとき；
に存在する方法。
［２３］
対象において癌を検出するためのバイオマ−カ−であって、前記バイオマ−カ−は、正常な非癌性生物サンプルと相対的に癌性生物サンプルにおける活性の増大を有する少なくとも１つのプロモーターを含み、前記プロモーターは、全プロモーター集団と相対的に、増大したＳＵＺ１２結合部位を含むバイオマ−カ−。
［２４］
［２３］のバイオマーカーであって、当該少なくとも１つのプロモーターが、全プロモーター集団と相対的に低いＤＮＡメチル化レベルを提示するバイオマ−カ−。
［２５］
［２３］又は［２４］の何れかのバイオマ−カ−であって、前記少なくとも１つのプロモーターが、細胞種特異化、胚発生又は転写因子に関連する遺伝子の近傍に位置しているバイオマ−カ−。
［２６］
［２５］のバイオマ−カ−であって、当該遺伝子が、ＮＫＸ６−３、ＳＡＬＬ４、ＨＯＸＢ９、ＭＥＴ、ＴＮＫ２、ＫＬＫ１、ＦＡＲ２、ＨＯＸＡ１１又はＨＯＸＡ１１−ＡＳであるバイオマ−カ−。
［２７］
［２３］〜［２６］の何れかのバイオマーカーであって、前記少なくとも１つのプロモーターが潜在性プロモーターを含むバイオマーカー。
［２８］
非癌性生物サンプルと相対的に癌性生物サンプル中の癌に関連する少なくとも１つのプロモーターの存在を決定する方法であって、
前記非癌性生物サンプルから得られたリファレンス核酸に対して、前記癌性生物サンプルから得られた少なくとも１つのプロモーター配列を含む単離された核酸をマッピングすること；
前記マッピングすることに基づいて前記少なくとも１つのプロモーターについてシーケンシングタグ計数のマトリックスを発生させること；
前記シーケンシングタグ計数のマトリックスを解析すること；及び
前記シーケンシングタグ計数のマトリックスの解析を使用して前記リファレンス核酸中の当該少なくとも１つのプロモーターと相対的に前記核酸中の当該少なくとも１つのプロモーターのディファレンシャルエンリッチメントを決定すること；
を含み、ここにおいて、非癌性サンプル中のそれと相対的に、当該対象から得られた当該癌性生物サンプル中の前記少なくとも１つのプロモーターの前記ディファレンシャルエンリッチメントが、対象における癌に関連するプロモーターの存在を示す
方法。
［２９］
非癌性生物サンプルと相対的に、癌性生物サンプル中の少なくとも１つのプロモーターの活性を決定する方法であって、
前記非癌性生物サンプルから得られたリファレンス核酸に対して、前記癌性生物サンプルから得られた少なくとも１つのプロモーター配列を含む単離された核酸をマッピングすること；
前記マッピングすることに基づいて前記少なくとも１つのプロモーターについてシーケンシングタグ計数のマトリックスを発生させること；
前記シーケンシングタグ計数のマトリックスを解析すること；及び
前記シーケンシングタグ計数のマトリックスの解析を使用して前記リファレンス核酸中の前記少なくとも１つのプロモーターと相対的に、前記核酸中の当該少なくとも１つのプロモーターの当該ディファレンシャル活性を決定すること
を含む方法
［３０］
［２８］又は［２９］の方法であって、前記発生させる工程が、前記リファレンス核酸と相対的に、当該マッピングされた核酸中の少なくとも１つのプロモーターについてのシーケンシングタグ計数に基づく当該マトリックスを計算することを含む方法。
［３１］
［２８］又は［２９］に記載の方法であって、前記解析する工程が、ＤＥＳｅｑ２アルゴリズムを使用して当該マトリックスを解析することを含む方法。
［３２］
［２８］又は［２９］の方法であって、前記少なくとも１つのプロモーターは、癌に関連する遺伝子の近傍に位置している方法。
［３３］
［３２］の方法であって、前記遺伝子は、ＲＡＳＡ３、ＧＲＩＮ２Ｄ、ＴＮＮＩ３、ＳＨＤ、ＡＴＰ１０Ｂ、ＳＭＴＮ、ＭＹＯ１５Ｂ、Ｃ２ｏｒｆ６１、ＬＩＮＣ００４４３又はＡＣＨＥである方法。
［３４］
［２８］の方法であって、前記ディファレンシャルエンリッチメントは、１０％のＦＤＲ率及び１．５倍よりも大きい絶対的な変化に基づいて同定される方法。
［３５］
［２９］の方法であって、前記ディファレンシャル活性は、１０％のＦＤＲ率及び１．５倍よりも大きい絶対的な変化に基づいて同定される方法。

【図1-1】

【図1-2】

【図1-3】

【図1-4】

【図1-5】

【図1-6】

【図2-1】

【図2-2】

【図2-3】

【図2-4】

【図2-5】

【図2-6】

【図2-7】

【図3-1】

【図3-2】

【図3-3】

【図3-4】

【図3-5】

【図3-6】

【図4-1】

【図4-2】

【図4-3】

【図4-4】

【図4-5】

【図4-6】

【図4-7】

【図4-8】

【図5-1】

【図5-2】

【図5-3】

【図6-1】

【図6-2】

【図7-1】

【図7-2】

【図8-1】

【図8-2】

【図9】

【図10-1】

【図10-2】

【図11-1】

【図11-2】

【図11-3】

【図12-1】

【図12-2】

【図13-1】

【図13-2】

【図14-1】

【図14-2】

【図14-3】

【図14-4】

【図15-1】

【図15-2】

【図15-3】

【図16】

【図17-1】

【図17-2】

【図17-3】

【図18-1】

【図18-2】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22-1】

【図22-2】

【図22-3】

【図23-1】

【図23-2】

【図23-3】

【図23-4】

【図24-1】

【図24-2】

【図24-3】

【図25-1】

【図25-2】