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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】6553598
(24)【登録日】2019年7月12日
(45)【発行日】2019年7月31日
(54)【発明の名称】混合物から変異された核酸の富化方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/10 20060101AFI20190722BHJP
C12Q 1/6806 20180101ALI20190722BHJP
C12Q 1/6827 20180101ALI20190722BHJP
C12Q 1/6876 20180101ALI20190722BHJP
【ＦＩ】
C12N15/10 ZZNA
C12Q1/6806 Z
C12Q1/6827 Z
C12Q1/6876 Z
【請求項の数】9
【全頁数】17
(21)【出願番号】特願2016-521352(P2016-521352)
(86)(22)【出願日】2014年11月25日
(65)【公表番号】特表2016-539624(P2016-539624A)
(43)【公表日】2016年12月22日
(86)【国際出願番号】EP2014075460
(87)【国際公開番号】WO2015078831
(87)【国際公開日】20150604
【審査請求日】2017年11月13日
(31)【優先権主張番号】61/909,587
(32)【優先日】2013年11月27日
(33)【優先権主張国】US
(73)【特許権者】
【識別番号】591003013
【氏名又は名称】エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー
【氏名又は名称原語表記】Ｆ． ＨＯＦＦＭＡＮＮ−ＬＡ ＲＯＣＨＥ ＡＫＴＩＥＮＧＥＳＥＬＬＳＣＨＡＦＴ
(74)【代理人】
【識別番号】100099759
【弁理士】
【氏名又は名称】青木 篤
(74)【代理人】
【識別番号】100077517
【弁理士】
【氏名又は名称】石田 敬
(74)【代理人】
【識別番号】100087871
【弁理士】
【氏名又は名称】福本 積
(74)【代理人】
【識別番号】100087413
【弁理士】
【氏名又は名称】古賀 哲次
(74)【代理人】
【識別番号】100117019
【弁理士】
【氏名又は名称】渡辺 陽一
(74)【代理人】
【識別番号】100150810
【弁理士】
【氏名又は名称】武居 良太郎
(74)【代理人】
【識別番号】100134784
【弁理士】
【氏名又は名称】中村 和美
(72)【発明者】
【氏名】ナンシー シェーンブルナー
(72)【発明者】
【氏名】アマル グプタ
(72)【発明者】
【氏名】ケビン ジャンセン
【審査官】
野村 英雄
(56)【参考文献】
【文献】
国際公開第２００２／０８６１６９（ＷＯ，Ａ１）
【文献】
米国特許第０６１２０９９２（ＵＳ，Ａ）
【文献】
国際公開第２００１／００５８００（ＷＯ，Ａ１）
【文献】
米国特許第０６０３１０９８（ＵＳ，Ａ）
【文献】
国際公開第２００７／０８４３８０（ＷＯ，Ａ１）
【文献】
JACKSON, B.A. et al.，"A versatile mismatch recognition agent: specific cleavage of plasmid DNA at a single base mispair."，BIOCHEMISTRY，１９９９年 ４月１３日，Vol.38, No.15，pp.4655-4662，doi: 10.1021/bi990255t
(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）
Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０
Ｃ１２Ｑ １／００− ３／００
ＰｕｂＭｅｄ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
サンプルからの核酸の混合物中の標的核酸の変異体の富化方法であって、前記核酸は単一のヌクレオチド位置で異なる、２種の変異体配列の形で存在し：
前記標的核酸を含むサンプルを提供し、ここで富化されるべき変異体が大過剰の他の変異体中に低存在量でサンプルに存在し；
標的核酸に対してモル過剰で存在する濃度で標的核酸の一方の鎖に対して相補的であるオリゴヌクレオチドを提供し、ここで前記オリゴヌクレオチドは、親和性標的により結合され、そして、富化されるべき変異体と、単一のヌクレオチド位置で完全に一致し、そして他の変異体とは、単一のヌクレオチド位置でミスマッチを有し；
標的核酸への前記オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションのために適切な条件を提供し、前記オリゴヌクレオチド及び前記標的核酸の何れかの変異体の一本鎖から成る二本鎖ポリヌクレオチドを形成させ；
前記二本鎖ポリヌクレオチドと、ミスマッチを含む二本鎖ポリヌクレオチドのみに対して選択的に結合するミスマッチ層間化合物とを接触させ、ここで前記化合物がさらに、前記ミスマッチ部位で前記二本鎖ポリヌクレオチドの一方の鎖の切断を光により触媒することができ；
前記二本鎖ポリヌクレオチドを光に供し、切断された及び未切断の両二本鎖オリゴヌクレオチドを得；
切断された及び未切断の両二本鎖オリゴヌクレオチドを、そのオリゴヌクレオチド上の親和性標識を認識し、そしてそれに結合する親和性マトリックスに適用し；
切断された二本鎖ポリヌクレオチドのみが変性される条件を提供し、そして親和性マトリックスから前記変性された一本鎖を除去し；そして、
未切断ポリヌクレオチド二本鎖を変性する条件下で緩衝液を提供し、そして標的核酸の富化された変異体の一本鎖を含む緩衝液を回収すること、
を含み、
ミスマッチ層間化合物が、図１に示される、Ｒｈ（ｂｐｙ）２（ｃｈｒｙｓｉ）３＋、又はＲｈ（ｂｐｙ）２（ｐｈｚｉ）３＋（ここで、Ｎは窒素を示し、Ｒｈはロジウムを示し、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は各々独立に、水素、アルキル、アリール、固体支持体、親和性標識に結合したリンカーからなる群より選ばれる）である、方法。
前記標的核酸を含むサンプルを提供し、ここで富化されるべき変異体が大過剰の他の変異体中に低存在量でサンプルに存在し；
標的核酸に対してモル過剰で存在する濃度で標的核酸の一方の鎖に対して相補的であるオリゴヌクレオチドを提供し、ここで前記オリゴヌクレオチドは、親和性標的により結合され、そして、富化されるべき変異体と、単一のヌクレオチド位置で完全に一致し、そして他の変異体とは、単一のヌクレオチド位置でミスマッチを有し；
標的核酸への前記オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションのために適切な条件を提供し、前記オリゴヌクレオチド及び前記標的核酸の何れかの変異体の一本鎖から成る二本鎖ポリヌクレオチドを形成させ；
前記二本鎖ポリヌクレオチドと、ミスマッチを含む二本鎖ポリヌクレオチドのみに対して選択的に結合するミスマッチ層間化合物とを接触させ、ここで前記化合物がさらに、前記ミスマッチ部位で前記二本鎖ポリヌクレオチドの一方の鎖の切断を光により触媒することができ；
前記二本鎖ポリヌクレオチドを光に供し、切断された及び未切断の両二本鎖オリゴヌクレオチドを得；
切断された及び未切断の両二本鎖オリゴヌクレオチドを、そのオリゴヌクレオチド上の親和性標識を認識し、そしてそれに結合する親和性マトリックスに適用し；
切断された二本鎖ポリヌクレオチドのみが変性される条件を提供し、そして親和性マトリックスから前記変性された一本鎖を除去し；そして、
未切断ポリヌクレオチド二本鎖を変性する条件下で緩衝液を提供し、そして標的核酸の富化された変異体の一本鎖を含む緩衝液を回収すること、
を含み、
ミスマッチ層間化合物が、図１に示される、Ｒｈ（ｂｐｙ）２（ｃｈｒｙｓｉ）３＋、又はＲｈ（ｂｐｙ）２（ｐｈｚｉ）３＋（ここで、Ｎは窒素を示し、Ｒｈはロジウムを示し、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は各々独立に、水素、アルキル、アリール、固体支持体、親和性標識に結合したリンカーからなる群より選ばれる）である、方法。
【請求項2】
前記富化されるべき変異体が変異対立遺伝子であり、前記他の変体が野生型対立遺伝子である、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記変異対立遺伝子が変異ＥＧＦＲ対立遺伝子であり、前記野生型対立遺伝子が野生型ＥＧＦＲ対立遺伝子である、請求項２に記載の方法。
【請求項4】
前記変異対立遺伝子を増幅し、そして検出する工程をさらに含む、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項5】
サンプルからの核酸の混合物中の標的核酸の変異対立遺伝子の検出方法であって、前記変異対立遺伝子が単一のヌクレオチド位置で野生型対立遺伝子とは異なり、そし大過剰の野生型対立遺伝子中に低存在量でサンプルに存在し：
前記サンプル中の変異対立遺伝子を富化し、ここで前記富化が、
標的核酸に対してモル過剰で存在する濃度で標的核酸の一方の鎖に対して相補的であるオリゴヌクレオチドを提供し、ここが前記オリゴヌクレオチドは、親和性標的により結合され、そして、変異対立遺伝子と、単一のヌクレオチド位置で完全に一致し、そして野生型対立遺伝子とは、単一のヌクレオチド位置でミスマッチを有し；
標的核酸への前記オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションのために適切な条件を提供し、前記オリゴヌクレオチド及び前記変異対立遺伝子又は野生型対立遺伝子の何れかの一本鎖から成る二本鎖ポリヌクレオチドを形成させ；
前記二本鎖ポリヌクレオチドと、ミスマッチを含む二本鎖ポリヌクレオチドのみに対して結合することができるミスマッチ層間化合物とを接触させ、ここで前記化合物がさらに、前記ミスマッチ部位で前記二本鎖ポリヌクレオチドの一方の鎖の切断を光により触媒することができ；
前記二本鎖ポリヌクレオチドを光に給し、切断された及び未切断の両二本鎖オリゴヌクレオチドを得；
切断された及び未切断の両二本鎖オリゴヌクレオチドを、そのオリゴヌクレオチド上の親和性標識を認識し、そしてそれに結合する親和性マトリックスに適用し；
切断された二本鎖ポリヌクレオチドのみが変性される条件を提供し、そして親和性マトリックスから前記野生型対立遺伝子の変性された一本鎖を除去し；
未切断ポリヌクレオチド二本鎖を変性する条件下で緩衝液を提供し；そして標的核酸の富化された変異対立遺伝子の一本鎖を含む緩衝液を回収すること
により実施され；そして、
富化された変異対立遺伝子の生成物、又はその増幅された富化変異対立遺伝子から生成されるシグナルを検出すること、
を含み、
ミスマッチ層間化合物が、図１に示される、Ｒｈ（ｂｐｙ）２（ｃｈｒｙｓｉ）３＋、又はＲｈ（ｂｐｙ）２（ｐｈｚｉ）３＋（ここで、Ｎは窒素を示し、Ｒｈはロジウムを示し、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は各々独立に、水素、アルキル、アリール、固体支持体、親和性標識に結合したリンカーからなる群より選ばれる）である、方法。
前記サンプル中の変異対立遺伝子を富化し、ここで前記富化が、
標的核酸に対してモル過剰で存在する濃度で標的核酸の一方の鎖に対して相補的であるオリゴヌクレオチドを提供し、ここが前記オリゴヌクレオチドは、親和性標的により結合され、そして、変異対立遺伝子と、単一のヌクレオチド位置で完全に一致し、そして野生型対立遺伝子とは、単一のヌクレオチド位置でミスマッチを有し；
標的核酸への前記オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションのために適切な条件を提供し、前記オリゴヌクレオチド及び前記変異対立遺伝子又は野生型対立遺伝子の何れかの一本鎖から成る二本鎖ポリヌクレオチドを形成させ；
前記二本鎖ポリヌクレオチドと、ミスマッチを含む二本鎖ポリヌクレオチドのみに対して結合することができるミスマッチ層間化合物とを接触させ、ここで前記化合物がさらに、前記ミスマッチ部位で前記二本鎖ポリヌクレオチドの一方の鎖の切断を光により触媒することができ；
前記二本鎖ポリヌクレオチドを光に給し、切断された及び未切断の両二本鎖オリゴヌクレオチドを得；
切断された及び未切断の両二本鎖オリゴヌクレオチドを、そのオリゴヌクレオチド上の親和性標識を認識し、そしてそれに結合する親和性マトリックスに適用し；
切断された二本鎖ポリヌクレオチドのみが変性される条件を提供し、そして親和性マトリックスから前記野生型対立遺伝子の変性された一本鎖を除去し；
未切断ポリヌクレオチド二本鎖を変性する条件下で緩衝液を提供し；そして標的核酸の富化された変異対立遺伝子の一本鎖を含む緩衝液を回収すること
により実施され；そして、
富化された変異対立遺伝子の生成物、又はその増幅された富化変異対立遺伝子から生成されるシグナルを検出すること、
を含み、
ミスマッチ層間化合物が、図１に示される、Ｒｈ（ｂｐｙ）２（ｃｈｒｙｓｉ）３＋、又はＲｈ（ｂｐｙ）２（ｐｈｚｉ）３＋（ここで、Ｎは窒素を示し、Ｒｈはロジウムを示し、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は各々独立に、水素、アルキル、アリール、固体支持体、親和性標識に結合したリンカーからなる群より選ばれる）である、方法。
【請求項6】
前記変異対立遺伝子が変異ＥＧＦＲ対立遺伝子であり、そして前記野生型対立遺伝子が野生型ＥＧＦＲ対立遺伝子である、請求項５に記載の方法。
【請求項7】
前記増幅工程が、対立遺伝子特異的プライマーにより実施される、請求項５又は６に記載の方法。
【請求項8】
サンプルからの核酸の混合物中の標的核酸の変異体を富化するための反応混合物であって、
前記標的核酸の一方の鎖に対して相補的であるオリゴヌクレオチド、ここで前記標的核酸は、単一のヌクレオチド位置で異なる２種の変異体配列の形で存在し、前記オリゴヌクレオチドは、親和性標識により結合され、そして、富化されるべき変異体と、単一のヌクレオチド位置で完全に一致し、そして他の変異体と単一のヌクレオチド位置でミスマッチを有し；及び
ミスマッチを含む二本鎖ポリヌクレオチドに対して選択的に結合するミスマッチ層間化合物、ここで前記化合物はさらに、光により前記ミスマッチ部位で二本鎖ポリヌクレオチドの一方の鎖の切断を触媒することができ、前記ミスマッチ層間化合物が図１に示される、Ｒｈ（ｂｐｙ）２（ｃｈｒｙｓｉ）３＋、又はＲｈ（ｂｐｙ）２（ｐｈｚｉ）３＋（ここで、Ｎは窒素を示し、Ｒｈはロジウムを示し、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は各々独立に、水素、アルキル、アリール、固体支持体、親和性標識に結合したリンカーからなる群より選ばれる）である、
を含む、反応混合物。
前記標的核酸の一方の鎖に対して相補的であるオリゴヌクレオチド、ここで前記標的核酸は、単一のヌクレオチド位置で異なる２種の変異体配列の形で存在し、前記オリゴヌクレオチドは、親和性標識により結合され、そして、富化されるべき変異体と、単一のヌクレオチド位置で完全に一致し、そして他の変異体と単一のヌクレオチド位置でミスマッチを有し；及び
ミスマッチを含む二本鎖ポリヌクレオチドに対して選択的に結合するミスマッチ層間化合物、ここで前記化合物はさらに、光により前記ミスマッチ部位で二本鎖ポリヌクレオチドの一方の鎖の切断を触媒することができ、前記ミスマッチ層間化合物が図１に示される、Ｒｈ（ｂｐｙ）２（ｃｈｒｙｓｉ）３＋、又はＲｈ（ｂｐｙ）２（ｐｈｚｉ）３＋（ここで、Ｎは窒素を示し、Ｒｈはロジウムを示し、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は各々独立に、水素、アルキル、アリール、固体支持体、親和性標識に結合したリンカーからなる群より選ばれる）である、
を含む、反応混合物。
【請求項9】
サンプルからの核酸の混合物中の標的核酸の変異体を富化するためのキットであって、前記標的核酸の一方の鎖に対して相補的であるオリゴヌクレオチド、ここで前記標的核酸は、単一のヌクレオチド位置で異なる２種の変異体配列の形で存在し、前記オリゴヌクレオチドは、親和性標識により結合され、そして、富化されるべき変異体と、単一のヌクレオチド位置で完全に一致し、そして他の変異体と単一のヌクレオチド位置でミスマッチを有し；及び
ミスマッチを含む二本鎖ポリヌクレオチドに対して選択的に結合するミスマッチ層間化合物、ここで前記化合物はさらに、光により前記ミスマッチ部位で二本鎖ポリヌクレオチドの一方の鎖の切断を触媒することができ、前記ミスマッチ層間化合物が図１に示される、Ｒｈ（ｂｐｙ）２（ｃｈｒｙｓｉ）３＋、又はＲｈ（ｂｐｙ）２（ｐｈｚｉ）３＋（ここで、Ｎは窒素を示し、Ｒｈはロジウムを示し、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は各々独立に、水素、アルキル、アリール、固体支持体、親和性標識に結合したリンカーからなる群より選ばれる）である、
を含む、キット。
ミスマッチを含む二本鎖ポリヌクレオチドに対して選択的に結合するミスマッチ層間化合物、ここで前記化合物はさらに、光により前記ミスマッチ部位で二本鎖ポリヌクレオチドの一方の鎖の切断を触媒することができ、前記ミスマッチ層間化合物が図１に示される、Ｒｈ（ｂｐｙ）２（ｃｈｒｙｓｉ）３＋、又はＲｈ（ｂｐｙ）２（ｐｈｚｉ）３＋（ここで、Ｎは窒素を示し、Ｒｈはロジウムを示し、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は各々独立に、水素、アルキル、アリール、固体支持体、親和性標識に結合したリンカーからなる群より選ばれる）である、
を含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
発明の分野本発明は、核酸化学及び核酸増幅の分野に関する。特に、本発明は、核酸における塩基対ミスマッチを検出できる化合物及び方法を用いての低量変異標的核酸の富化に関する。
【背景技術】
【0002】
発明の背景ほとんどのヒト遺伝性疾患及び癌は、核遺伝子の突然変異により引起されることが知られている。一般的に、突然変異は、遺伝子座での特定の多型変異体であると思われる。突然変異は、しばしば点突然変異とも呼ばれる、単一のヌクレオチド差異であり得る。細胞及び組織レベルで、特定の遺伝子座での多型現象は、有意に変更された細胞挙動性を生じさせる可能性がある。しかしながら、比較的小さな細胞又は組織サンプルは、特定の遺伝子座を含む、数百万又は数十億のＤＮＡを含むので、遺伝子座での多型変異体の範囲及び頻度の表示は、非常に低い頻度で潜在的に存在する対立遺伝子を検出する必要がある。ほとんどの場合、生物学的サンプルからの希突然変異の存在の検出は、莫大な過剰量の野生型ＤＮＡの同時存在のために、多大な課題を提供する。
【0003】
従って、低コピー変異体ＤＮＡの存在が増幅反応、例えばＰＣＲの実施に従って検出できるよう、それらの低コピー変異体ＤＮＡを、選択的に及び正確に富化するための方法が、当業界において必要とされる。
【発明の概要】
【0004】
発明の要約本発明は、サンプル中の低量の対立遺伝子（例えば、変異体ＤＮＡ）を富化し、そのような対立遺伝子の続く検出を可能にするための方法に向けられる。第１の側面によれば、本発明は、サンプルからの核酸の混合物中の標的核酸の変異体の富化方法に関し、前記核酸は単一のヌクレオチド位置で異なる、２種の変異体配列の形で存在し、ここで前記方法は、前記標的核酸を含むサンプルを提供し、ここで富化されるべき変異体が大過剰の他の変異体の中で低存在量でサンプルに存在し；標的核酸に対してモル過剰で存在する濃度で標的核酸の一方の鎖に対して相補的であるオリゴヌクレオチドを提供し、ここが前記オリゴヌクレオチドは、親和性標的により結合され、そして好ましくは、富化されるべき変異体と、単一のヌクレオチド位置で一致し、そして他の変異体とは、単一のヌクレオチド位置でミスマッチを有し；標的核酸への前記オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションのために適切な条件を提供し、前記オリゴヌクレオチド及び前記標的核酸の何れかの変異体の一本鎖から成る二本鎖ポリヌクレオチドを生成し；前記二本鎖ポリヌクレオチドと、ミスマッチを含む二本鎖ポリヌクレオチドのみに対して選択的に結合するミスマッチ層間化合物とを接触させ、ここで前記化合物がさらに、前記ミスマッチ部位で前記二本鎖ポリヌクレオチドの一方の鎖の切断を光により触媒することができ；前記二本鎖ポリヌクレオチドを光に供し、切断された及び未切断の両二本鎖オリゴヌクレオチドをもたらし；切断された及び未切断の両二本鎖オリゴヌクレオチドを、そのオリゴヌクレオチド上の親和性標識を認識し、そしてそれに結合する親和性マトリックスに適用し；切断された二本鎖ポリヌクレオチドのみが変性される条件を提供し、そして親和性マトリックスから前記変性された一本鎖を除去し；そして未切断ポリヌクレオチド二本鎖を変性する条件下で緩衝液を提供し；そして標的核酸の富化された変異体の一本鎖を含む緩衝液を集めることを含んで成る。１つの実施形態によれば、前記ミスマッチ層間化合物は、Ｒｈ（ｂｐｙ）２（ｃｈｒｙｓｉ）３＋、Ｒｈ（ｂｐｙ）２（ｐｈｚｉ）３＋、又はそれらのそれぞれの類似体である。別の実施形態によれば、本発明は、標的核酸の富化された変異体を増幅し、そして検出する追加の工程に関する。
【0005】
第２の側面によれば、本発明は、サンプルからの核酸の混合物中の標的核酸の変異対立遺伝子の検出方法に関し、前記変異対立遺伝子が単一のヌクレオチド位置で野生型対立遺伝子とは異なり、そし大過剰の野生型対立遺伝子の中で低存在量でサンプルに存在し、ここで前記方法は、前記サンプル中の変異対立遺伝子を富化し、ここで前記富化が、標的核酸に対してモル過剰で存在する濃度で標的核酸の一方の鎖に対して相補的であるオリゴヌクレオチドを提供し、ここが前記オリゴヌクレオチドは、親和性標的により結合され、そして、変異対立遺伝子と、単一のヌクレオチド位置で完全に一致し、そして野生型対立遺伝子とは、単一のヌクレオチド位置でミスマッチを有し；標的核酸への前記オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションのために適切な条件を提供し、前記オリゴヌクレオチド及び前記変異対立遺伝子又は野生型対立遺伝子の何れかの一本鎖から成る二本鎖ポリヌクレオチドを生成し；前記二本鎖ポリヌクレオチドと、ミスマッチを含む二本鎖ポリヌクレオチドのみに対して結合することができるミスマッチ層間化合物とを接触させ、ここで前記化合物がさらに、前記ミスマッチ部位で前記二本鎖ポリヌクレオチドの一方の鎖の切断を光により触媒することができ；前記二本鎖ポリヌクレオチドを光に供し、切断された及び未切断の両二本鎖オリゴヌクレオチドをもたらし；切断された及び未切断の両二本鎖オリゴヌクレオチドを、そのオリゴヌクレオチド上の親和性標識を認識し、そしてそれに結合する親和性マトリックスに適用し；切断された二本鎖ポリヌクレオチドのみが変性される条件を提供し、そして親和性マトリックスから前記野生型対立遺伝子の変性された一本鎖を除去し；未切断ポリヌクレオチド二本鎖を変性する条件下で緩衝液を提供し；そして標的核酸の富化された変異対立遺伝子の一本鎖を含む緩衝液を集めることにより実施され；富化された変異対立遺伝子の生成物、又はその増幅された富化変異対立遺伝子から生成されるシグナルを検出することを含んで成る。１つの実施形態によれば、前記ミスマッチ層間化合物は、Ｒｈ（ｂｐｙ）２（ｃｈｒｙｓｉ）３＋、Ｒｈ（ｂｐｙ）２（ｐｈｚｉ）３＋、又はそれらのそれぞれの類似体である。
【図面の簡単な説明】
【0006】
【発明を実施するための形態】
【0007】
定義特にことわらない限り、本明細書において使用される全ての技術的及び科学的用語は、当業者により通常理解される意味を有する。次の参考文献は、本発明で使用される用語の多くの一般的定義を、当業者に提供する：Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2nd ed. 1994); The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker ed., 1988); The Glossary of Genetics, 5th Ed., R. Rieger et al. (eds.), Springer Verlag (1991);及びHale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991)。本明細書において使用される場合、次の用語は、特にことわらない限り、それらに与えられた意味を有する。
【0008】
用語「核酸（nucleic acid）」とは、直鎖状又は分岐鎖状の様式で一緒に共有結合されるヌクレオチドを含む、ヌクレオチドのポリマー（例えば、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、等）を言及し、そしてデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、アプタマー、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ＰＮＡ−ＤＮＡ接合体、ＰＮＡ−ＲＮＡ接合体、等を包含する。核酸は典型的には、一本鎖又は二本鎖であり、そして一般的には、ホスホジエステル結合を含むが、但しある場合、別の主鎖、例えばホスホルアミド（Beaucage et al. (1993), Tetrahedron 49(10):1925）、ホスホロチオエート（Mag et al. (1991), Nucleic Acids Res. 19:1437; 及び米国特許第５，６４４，０４８号）、ホスホロジチオエート（Briu et al. (1989), J. Am. Chem. Soc. 111:2321）、Ｏ−メチルホスホルアミダイト結合（Eckstein, Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, Oxford University Press (1992)を参照のこと）、及びペプチド核酸主鎖及び結合（Egholm (1992), J. Am. Chem. Soc. 114:1895を参照のこと）を有することができる核酸類似体が包含される。他の類似体核酸は、正に荷電された主鎖（Denpcy et al. (1995), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 6097）；非イオン性主鎖（米国特許第５，３８６，０２３号、第５，６３７，６８４号、第５，６０２，２４０号、第５，２１６，１４１号及び第 ４，４６９，８６３号）及び非リボース主鎖を有するそれら、例えば米国特許第５，２３５，０３３号及び第５，０３４，５０６号に記載されたそれらを包含する。１又は２以上の炭素環式糖を含む核酸もまた、核酸の定義内に包含され（Jenkins et al. (1995), Chem. Soc. Rev. pp. 169-176を参照のこと）、そして類似体はまた、例えばRawls, C & E News Jun. 2, 1997, 35頁に記載されている。リボース−リン酸主鎖の修飾は、追加の部分、例えば標識の付加を促進するか、又は生理学的環境下でそのような安定性及び半減期を変えるために行われ得る。
【0009】
核酸に、典型的には見出される天然に存在する複素環式塩基（例えば、アデニン、グアニン、チミン、シストシン、及びウラシル）の他に、ヌクレオチド類似体はまた、天然に存在しない複素環式塩基、例えば、Seela et al. (1999), Helv. Chim. Acta 82:1640に記載されるそれらも包含することができる。ヌクレオチド類似体に使用される特定の塩基は、融点（Ｔｍ）モディファイアとして作用する。例えば、それらのいくつかは、７−デアザプリン（例えば、７−デアザグアニン、７−デアザアデニン、等）、ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン、プロピニル−ｄＮ（例えば、プロピニル−ｄＵ、プロピニル−ｄＣ、等）、及び同等のものを包含する。例えば、米国特許第５，９９０，３０３号を参照のこと。他の代表的な複素環式塩基は、例えば次のものを包含する：ヒポキサンチン、イノシン、キサンチン; ２−アミノプリン、２，６−ジアミノプリン、２−アミノ−６−クロロプリン、ヒポキサンチン、イノシン及びキサンチンの８−アザ誘導体；アデニン、グアニン、２−アミノプリン、２，６−ジアミノプリン、２−アミノ−６−クロロプリン、ヒポキサンチン、イノシン及びキサンチンの７−デアザ−８−アザ誘導体；６−アザシチジン; ５−フルオロシチジン； ５−クロロシチジン; ５−ヨードシチジン; ５−ブロモシチジン; ５−メチルシチジン； ５−プロピニルシチジン; ５−ブロモビニルウラシル; ５−フルオロウラシル;５−クロロウラシル; ５−ヨードウラシル；５−ブロモウラシル；５−トリフルオロメチルウラシル; ５−メトキシウラシル; ５−エチニルウラシル; ５−プロピニルウラシル、及び同等のもの。
【0010】
「ヌクレオシド（nucleoside）」とは、糖部分（リボース糖又はデオキシリボース糖）、糖部分の誘導体、又は糖部分の機能的同等物（例えば、炭素環）に対して共有結合される塩基又は塩基性基（少なくとも１つの炭素環、少なくとも１つの複素環、少なくとも１つのアリール基、及び／又は同様のものを包含する）を含む核酸成分を意味する。例えば、ヌクレオシドが糖部分を含む場合、塩基は典型的には、糖部分の１′−位置に結合される。上記のように、塩基は、天然に存在する塩基又は天然に存在しない塩基であり得る。典型的にヌクレオシドは、リボヌクレオシド、デオキシリボヌクレオシド、ジデオキシリボヌクレオシド及び炭素環ヌクレオシドを包含する。
【0011】
「ヌクレオチド（nucleotide）」とは、ヌクレオシドのエステル、例えばヌクレオシドの糖部分の５′位置に共有結合される、１，２，３又はそれ以上のリン酸基を有するヌクレオシドのリン酸エステルを言及する。
【0012】
用語「ポリヌクレオチド（polynucleotide）」及び「オリゴヌクレオチド（oligonucleotide）」は、交換可能的に使用される。「オリゴヌクレオチド」は、より短いポリヌクレオチドを記載するために時々使用される用語である。オリゴヌクレオチドは、指定されたヌクレオチド配列の領域に対応する、少なくとも６個のヌクレオチド、例えば少なくとも約１０〜１２個のヌクレオチド、又は少なくとも約１５〜３０個のヌクレオチドを含んでも良い。
【0013】
用語「標的核酸配列の変異体を富化する（enriching a variant of a target nucleic acid sequence）」とは、標的核酸配列の所望する変異体の量を高めること、及びサンプル中の所望しない変異体に対する所望の変異体の比率を高めることを意味する。一般的に、富化されるべき所望の変異体は、所望しない変異体よりも、核酸サンプルにおいてあまり優勢的ではなく、そして標的核酸配列の全ての変異体の合計量の５０％未満を構成する。多くの場合、所望する変異体は、変異対立遺伝子を意味し、そして所望しない変異体は野生型対立遺伝子を意味する。
【0014】
用語「野生型（wild type）」とは、本明細書において使用される場合、天然に存在する源から単離される場合、その遺伝子又は対立遺伝子の特性を有する遺伝子又は対立遺伝子を意味する。野生型遺伝子又は野生型対立遺伝子とは、集団において、最も頻繁には観察され、そして遺伝子又は対立遺伝子の「正常」又は「野生型」として任意には企画されるものである。
【0015】
対照的には、用語「変異体（mutant）」又は「突然変異誘発された（mutated）」とは、野生型遺伝子又は対立遺伝子に比較される場合、配列において修飾を示す遺伝子又は対立遺伝子を意味する。用語「突然変異（mutation）」とは、正常（変更されていない）又は野生型配列から分化されるような変異体の形成をもたらす、通常保存された核酸配列のヌクレオチドの配列の変化を意味する。突然変異は一般的に、２種の一般的クラス、すなわち後者は、１〜いくつかのヌクレオチド対の挿入又は欠失を伴う。
【0016】
用語「対立遺伝子（allele）」とは、わずか１個又は数個の塩基により異なる２種の配列を意味する。
【0017】
用語「ミスマッチ（mismatch）ＤＮＡ又は「ヘテロ二本鎖（heteroduplex）」ＤＮＡとは、１又は２以上のミスマッチ塩基対合を含むＤＮＡを意味する。ミスマッチ塩基対合は、ＤＮＡ二重鎖の場合、水素結合された塩基対、ＴとＡ又はＧとＣの対の１つを形成することができない、反対側の塩基の特定対を意味する。ヘテロ二重鎖ＤＮＡは、反対側の鎖に比較して、１つの鎖における挿入又は欠失のために、１つの鎖における１又は２以上の塩基が反対側の鎖における塩基を補充するか又は補充していない二本鎖ＤＮＡ、及び何れかの鎖中の１又は２以上の塩基が反対側の塩基を有するか又は有さない二本鎖ＤＮＡを包含する。対照的に、ホモ二本鎖ＤＮＡとは、各鎖が他の鎖の完全な補体であり、そして各塩基が反対側の塩基と水素結合された塩基対を形成する二本鎖ＤＮＡを意味する。
【0018】
用語「分子結合パートナー（molecular binding partners）」及び「特異的結合パートナー（specific binding partners）」とは、特異的結合を示す、分子対、典型的には、生体分子対を意味する。非制限的側として、受容体及びリガンド、抗体及び抗原、ビオチン及びアビジン、及びビオチン及びストレプタビジンを挙げることができる。分子結合パートナーはまた、下記に定義されるような、「親和性標識（affinity label）」と「親和性マトリックス（affinity matrix）」との間の結合により表され得る。
【0019】
「親和性（affinity）」標識とは、その分子結合パートナーに対して特異的に結合する分子である。結合は、共有又は非共有（例えば、イオン、水素、等）結合を介してであり得る。本明細書において使用される場合、親和性標識、例えばビオチンは、親和性マトリックス、例えばストレプタビジン被覆のビーズ又は粒子に対して選択的に結合することができる。親和性標識は、オリゴヌクレオチドの３′末端、５′又は内部位置に結合され得る。
【0020】
「親和性マトリックス（affinity matrix）」とは、本明細書において使用される場合、その分子結合パートナーに対して特異的に結合できる、固体支持体又は固体マトリックス（例えば、磁気ラテックス粒子、ガラスビーズ）の表面に結合される分子を言及する。結合は、共有又は非共有結合を介してであり得る。本明細書において使用される場合、親和性マトリックス、例えばストレプタビジン被覆の磁気ラテックス粒子は、親和性標識、例えばビオチンに対して、選択的に結合することができる。
【0021】
「アルキル基（alkyl group）」とは、線状、分岐状、又は環状飽和炭化水素部分を言及し、そして全ての位置異性体、例えばメチル、エチル、プロピル、ブチル、１−メチルプロピル、２−メチルプロピル、１，１−ジメチルエチル、ペンチル、１−メチルブチル、２−メチルブチル、３−メチルブチル、２，２−ジメチルプロピル、１−エチルプロピル、ヘキシル、１，１−ジメチルプロピル、１，２−ジメチルプロピル、１−メチルペンチル、２−メチルペンチル、３−メチルペンチル、４−メチルペンチル、１，１−ジメチルブチル、１，２−ジメチルブチル、１，３−ジメチルブチル、２，２−ジメチルブチル、２，３−ジメチルブチル、３，３−ジメチルブチル、１−メチルブチル、２−メチルブチル、１，１，２−トリメチルプロピル、１，２，２−トリメチルプロピル、１−エチル−１−メチルプロピル及び１−エチル−２−メチルプロピル、ｎ−ヘキシル、シクロヘキシル、ｎ−ヘプチル、ｎ−オクチル、２−エチルヘキシル、ｎ−ノニル、ｎ−デシル、及び同様のものを包含する。アルキル基は典型的には、約１−２０個の炭素原子を含み、そしてより典型的には、約２−１５個の炭素原子を含む。アルキル基は、置換されるか、又は非置換され得る。
【0022】
「アリール基（aryl group）」とは、芳香族化合物に由来する原子又は部分の置換基を言及する。典型的なアリール基は、例えばフェニル基、又は同様のものを包含する。アリール基は任意には、複数の芳香族環（例えば、ジフェニル基、等）を包含する。さらに、アリール基は、置換されるか、又は非置換され得る。
【0023】
「ＰＣＲ増幅（ＰＣＲ amplification）」又は単純に、「ＰＣＲ」とは、核酸配列に対する多数の補体を生成するための鋳型としての核酸配列の使用を包含するポリメラーゼ鎖反応を意味する。鋳型は、鋳型配列の一部に対して相補的な配列を有するプライマーにハイブリダイズされ得、そしてｄＮＴＰ及びポリメラーゼ酵素を含む適切な反応混合物と接触され得る。プライマーは、元の鋳型に対して相補的な核酸を生成するポリメラーゼ酵素により伸長される。二本鎖核酸分子の両鎖の増幅のためには、２つのプライマーが使用され、それらの個々は、１つの核酸鎖の一部に対して相補的である配列を有することができる。核酸分子の鎖は、例えば加熱により変性され、そしてその工程が、今度は、続く工程において鋳型として作用する前の工程の新しく合成された鎖により反復される。ＰＣＲ増幅プロトコルは、十分な量の標的核酸を生成するために、変性ハイブリダイゼーション及び伸長反応の少数〜多数のサイクルを包含することができる。
【0024】
用語「対立遺伝子−特異的プライマー（allele-specific primer）」又は「ＡＳプライマー（ＡＳ primer）」とは、標的配列の２つ以上の変異体に対してハイブリダイズするが、標的配列の変異体間を区別できるプライマーのことであり、ここで前記変異体の１つによってのみ、プライマーは適切な条件下で核酸ポリメラーゼにより効果的に延長される。標的配列の他の変異体によれば、その延長は低効率的又は非効率的である。
【0025】
用語「共通プライマー（common primer）」とは、対立遺伝子特異的プライマーを含むプライマー対における第二プライマーのことである。共通プライマーは、対立遺伝子特異的ではなく、すなわち対立遺伝子特異的プライマーが区別する標的配列の変異体間を区別しない。
【0026】
用語「相補的（complementary）」又は「相補性（complementarity）」は、ワトソン−クリック塩基対規則により関連するポリヌクレオチドの逆平行鎖に関連して使用される。用語「完全に相補的」（perfectly complementary）又は「１００％相補的」（１００％ complementary）とは、逆平行鎖間のすべての塩基のワトソン−クリック対を有する相補的配列のことであり、すなわちポリヌクレオチド二重鎖における任意の２つの塩基間にミスマッチは存在しない。しかしながら、二重鎖は、完全な相補性の不在下でさえ、逆平行鎖間で形成される。用語「部分的に相補的」（partially complementary）又は「不完全に相補的」（incompletely complementary）とは、１００％未満、完全である逆平行ポリヌクレオチド鎖間の塩基の任意の配置のことである（例えば、ポリヌクレオチド二重鎖に少なくとも１つのミスマッチ又はマッチしない塩基が存在する）。部分的に相補的な鎖間の二重鎖は一般的に、完全に相補的な鎖間の二重鎖よりも低い安定性を有する。
【0027】
用語「サンプル（sample）」とは、核酸を含むか又は含むと推定される任意の組成物のことである。これは、個人から単離された組織又は体液、例えば皮膚、血漿、血清、脊髄液、リンパ液、滑液、尿、涙、血液細胞、器官及び腫瘍のサンプル、並びに、ホルマリン固定パラフィン包埋組織（ＦＦＰＥＴ）又はコア針生検を含む、個人から採取された細胞から確立されたインビトロ培養物、及びそれらから単離される核酸のサンプルのことである。
【0028】
用語「一次配列（primary sequence）」とは、ポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドにおけるヌクレオチドの配列のことである。ヌクレオチド修飾、例えば窒素含有塩基修飾、糖修飾又は他のバックボーン修飾は、一次配列の一部ではない。標識、例えばオリゴヌクレオチドに接合される発色団 (chromophore) もまた、一次配列の一部ではない。従って、２つのオリゴヌクレオチドは、同じ一次配列を共有することができるが、修飾及び標識に関しては異なることができる。
【0029】
用語「プライマー（primer）」とは、標的核酸における配列とハイブリダイズし、そして核酸の相補鎖に沿って合成の開始点として、そのような合成のために適切な条件下で作用することができるオリゴヌクレオチドのことである。本明細書において使用される場合、用語「プローブ」（probe）とは、標的核酸における配列とハイブリダイズし、そして通常、検出可能に標識されるオリゴヌクレオチドのことである。プローブは、修飾、例えば核酸ポリメラーゼによってプローブを延長できなくさせる修飾、及び１つ又は２つ以上の発色団を有することができる。同じ配列を有するオリゴヌクレオチドは、１つのアッセイにおけるプライマーとして、及び異なったアッセイにおけるプローブとして作用することができる。
【0030】
本明細書において使用される場合、用語（「標的配列（target sequence）」、「標的核酸（target mucleic acid）」又は「標的（target）」とは、増幅されるか、検出だれるか、又はその両者がなされる核酸配列の一部を言及する。
【0031】
用語「ハイブリダイズされる（hybridized）」及び「ハイブリダイゼーション（hybridization）」とは、二重鎖の形成をもたらす、２つの核酸間の塩基対合相互作用のことである。２種の核酸は、ハイブリダイゼーション及び鎖伸長を達成するために、それらの全長にわたって１００％の相補性を有することは必要条件ではない。
【0032】
用語「選択的ハイブリダイゼーション（selective hybridization）」及び「特異的ハイブリダイゼーション（specific hybridization）」とは、他の核酸もまた存在する複合混合物に存在する特定の核酸に対する、主に（ハイブリダイズする分子の５０％又はそれ以上）、又はほぼ独占的に（ハイブリダイズする分子の９０％又はそれ以上に）、核酸のハイブリダイゼーションを意味する。例えば、典型的なＰＣＲ条件下で、プライマーは、溶液にまた存在する非標的核酸の排除のために、標的核酸に対して特異的にハイブリダイズする。特異的にハイブリダイズされたプライマーは、少なくとも優勢的な増幅生成物であり、そして好ましくは、ほぼ独占的な（例えば、サンプル中のすべての増幅生成物の９０％又はそれ以上を表す）増幅生成物である標的核酸の増幅生成物を生成するために標的核酸の増幅を駆動する。好ましくは、非特異的増幅生成物は、検出され得ないか、又は特異的増幅生成物から容易に区別できるような小量で検出されるかどうかであるような小量で存在する。同様にプローブは、反応混合物にまた存在する非標的核酸の排除のために標的核酸に対して特異的にハイブリダイズする。特異的にハイブリダイズされたプローブは、少なくとも最も優勢的なシグナルであり、そして好ましくは、ほぼ独占的な（例えば、サンプル中のすべての増幅生成物の９０％又はそれ以上を表す）シグナルである検出可能シグナルを生成するために、標的核酸の特異的検出を可能にする。
【0033】
高精度と感度を伴って、種々のタイプの癌に関連する希体細胞突然変異を検出できる新規方法を開発するための継続的な必要性がある。より感度の高い検出方法についての特定の必要性が、周辺流体、例えば血液、癌及び尿からの癌バイオマーカー検出の分野にある。過去数年の間、血液中の定義される突然変異をモニターすることにより、治療予測、薬剤耐性の開発の治療モニターリング、及び腫瘍力学及び癌再発についての血液ベースの癌バイオマーカー検出の価値を明確に確立して来た多くの研究が公開されている。さらに、周辺生物学的流体からの突然変異検出のための高感度方法は、いつか、癌スクリーニング及び早期癌検出のための「液体生検」アプローチの約束を果たすことができる。
【0034】
希突然変異検出の感度を高めるための多くの方法が、長年にわたって開発されて来た。それらの方法のほとんどは一般的に、対立遺伝子−特異的ＰＣＲ（ＡＳ−ＰＣＲ）と、通常、呼ばれる、ＰＣＲの間、プライマー又はプローブベースの識別を使用することにより、変異体と野生型との間の配列ベースの差異の活用に焦点を当てて来た。それらの方法は、０．１−１％の変異体レベルまで成功しているが、しかしさらなる改良が、酵素に基く制限又はＰＣＲ誤差により制限されている。Bert Vogelsteinにより今日まで開発されたデジタルＰＣＲは、希対立遺伝子検出の感度を都合良く高める最も有望な技法となっている。これは、サンプルを、数千のより小さな増幅反応に分割することにより達成される。この方法は、実質的に野生型ＤＮＡを希釈し、そして野生型に対する変異体の比率を高める。現在、提案されている別のアプローチは、変異ＤＮＡを富化し、そしてそれにより、下流のアッセイにおいて検出の困難性を低減する先行サンプル調製方法を用いることである。
【0035】
ＰＣＲは、多くの異なった様式において、所望する配列の性質はバックグラウンドＤＮＡとは有意に異なるが、多量のバックグラウンドＤＮＡの存在下で特定の配列の単一のコピーを、文字通りに容易に検出できる強力な技法である。これは、過剰のヒトゲノムＤＮＡをまた含む生物学的検体から外因性病原性配列の存在を検出しようとする場合の事例である。しかしながら、目的の配列が、希体細胞突然変異の検出の場合に良くあるが、バックグラウンドＤＮＡに存在する配列に、ますます類似するようになる場合、問題がますます課題になっている。一般的に、突然変異状態は、大過剰の野生型配列をまた含むサンプルにおいて決定されるべきである。これは、現在利用できる突然変異検出のための方法は変異配列のために選択的であるが、それらは特異性において絶対的ではなく、そして変異体に対する野生型の比率が上昇するにつれて、野生型ＤＮＡから変異体を区別することは、ますます困難になっているので、課題である。
【0036】
本発明に記載される方法は、以下に開示されるように、バルキーロジウム（III）錯体の使用に基かれている：米国特許第６，０３１，０９８号、第６，３０６，６０１号、Nature Protocols 2: 357-371, 2007、ここでBartonなどは、それぞれ、Ｒｈ（ｂｐｙ）２（ｃｈｒｙｓｉ）３＋又はＲｈ（ｂｐｙ）２（ｐｈｚｉ）３＋を生成するために、１対のバルキー層間リガンド、５，６−クリセンキノンジイミン（chrysi）及び３，４−ベンゾ［ａ］フェナジンキノンジイミン（phzi）に基く２つのファミリーのミスマッチ−特異的ロジウム−ベースのインターカレーターの合成及び機能を記載している。それらの化合物は、ＤＮＡ二重鎖内のヌクレオチドミスマッチにより創造される隆起中に選択的にそれ自体を挿入するそれらの能力について知られている。結合機構は、複数のＮＭＲ及び結晶学に基く調査により評価されており、そして結果は顕著であった。結合剤が主要溝からＤＮＡ二重鎖に入り、そして塩基対間にインターカレートする従来の層間結合モードとは異なって、それらの新規化合物は、ＤＮＡのマイナーな溝に入り、バルキー芳香族リガンドを挿入し、そしてミスマッチされた塩基を、主要溝中に取り出す。光活性化に基いて、複合体は、二重鎖内の単一塩基ミスマッチ部位での直接的鎖切断を促進する。部位特異的切断は、ナノモル濃度で明白である。それらのロジウム化合物の使用についてのこれまでの主な焦点は、単一ヌクレオチド多型現象（ＳＮＰ）及び新規化学療法の検出にあった（Boon, EM et al., Methods in Enzymology, 353:506-522, 2002, 米国特許第６，４４４，６６１号、米国特許第６，７７７，４０５号）。
【0037】
本発明においては、それらのロジウム化合物が、希対立遺伝子（例えば、希変異対立遺伝子）の富化のために適用されて来た。この研究のために選択される化合物の構造は、図１に示されており、ここでＲ１、Ｒ２、Ｒ３は、Ｈ、アルキル、アリール又は固相、又は親和性標識を有するリンカー（例えば、ビオチン）であり得る。記載される化合物は、ミスマッチＤＮＡ二重鎖に結合し、そして光切断を触媒できることが、これまで示されて来たが、光切断は２本の鎖の１つのみの切断を単にもたらすこともまた、示されている。切断されていない野生型鎖はまだ存在し、そして増幅のための鋳型として機能できるので、これは、変異ＤＮＡの富化適用において少なからずとも有用である。
【0038】
本発明の全体的戦略は、図２上にグラフで示されており、そして目的の塩基ミスマッチ領域へのそれらのロジウム錯体化合物の結合する能力を活用し、そして光活性化に基いて、特定のホスホジエステル結合の切断を引起す。ここに記載される方法によれば、標的核酸が野生型対立遺伝子（センス鎖「ＷＴ−Ｓ」上に「Ｃ」ヌクレオチドを、及びアンチセンス鎖「ＷＴ−ＡＳ」上に「Ｇ」ヌクレオチドを有するものとして図２に示される）、及び変異対立遺伝子（センス鎖「Ｍ−Ｓ」上に「Ｔ」ヌクレオチドを、及びアンチセンス鎖「Ｍ−ＡＳ」上に「Ａ」ヌクレオチドを有するものとして示される）の両者を含むサンプルが提供される。
【0039】
次に、富化されるべき変異対立遺伝子の１つの鎖に対応し、そして親和性リガンド（例えば、ビオチン）を含む一本鎖オリゴヌクレオチド（Ｍ−ＡＳ−ビオチンとして図２に示される）が、サンプル中の標的核酸の量に対して過剰に提供される。（図２は、その３′末端上にビオチン標識を有するアンチセンス鎖に対応するオリゴヌクレオチドを示すが、その方法はまた、変異部位以外の任意の位置で結合されるビオチン標識を有する変異対立遺伝子のセンス鎖の配列を有するオリゴヌクレオチドによって実施され得る。）次に、混合物は、すべての二本鎖サンプルＤＮＡを変性するために、まず加熱され、そして次に、相補的一本鎖のアニーリングを可能にするために、冷却される。Ｍ−ＡＳ−ビオチンオリゴヌクレオチドは過剰に存在するので、標的核酸のほとんどすべてのセンス鎖（野生型対立遺伝し、ＷＴ−Ｓ及び変異対立遺伝子、Ｍ−Ｓの両者）は、オリゴヌクレオチドにハイブリダイズされるであろう。変異センス鎖二重鎖は好ましくは、一致するが、野生型センス鎖は突然変異の位置で単一の塩基ミスマッチを有するであろう。
【0040】
次に、ロジウム錯体化合物（「Ｒｈ（ｂｐｙ）２」として図２に示される）が、混合物に添加される。光活性化に基いて、ミスマッチ−含有二重鎖がＭ−ＡＳ−ビオチンオリゴヌクレオチド（図２に示されるような）又は野生型センス鎖、ＷＴ−Ｓ上で切断されるが、ところが変異センス鎖、Ｍ−Ｓに結合されるＭ−ＡＳ−ビオチンオリゴヌクレオチドを有する二重鎖は、突然変異位置で、完全な一致のために切断されないであろう。オリゴヌクレオチドの親和性部分（図２においてビオチンとして示される）を用いて、すべてのオリゴヌクレオチド結合配列（すなわち、野生型及び変異センス鎖）が、固相（ストレプタビジン被覆固体支持体として図２に示される）上に捕捉され、そして全ての過剰野生型及び変異アンチセンス鎖が洗浄される。次の工程において、固相が適切な緩衝液に配置され、そして温度が、捕捉された野生型センス鎖のみが、切断−含有二重鎖の低い溶融温度のために開放されるまで、高められる。次に、これが洗浄され、支持体上に変異センス鎖のみを残す。最終的二、変異センス鎖が、温度又はアルカリ性ｐＨ溶出工程の何れかにより、緩衝液に回収される。
【0041】
図２は変異センス鎖の富化のためへのアンチセンス鎖オリゴヌクレオチドの使用を示すと共に、同様に、センス鎖オリゴヌクレオチドが変異アンチセンス鎖の富化のために使用され得る。一般的に、オリゴヌクレオチドのために使用する鎖の選択は、最高の結合親和性を有する、最も熱力学的に不安定化されたミスマッチ部位と共に、ミスマッチ位置へのロジウム錯体化合物の結合親和性に依存する（さらなる詳細については、Jackson, B.A. and Barton, J.K., Biochemistry 39: 6176-6182, 2000を参照のこと）。
【0042】
次の実施例及び図は、本発明の理解を助けるために提供され、本発明の真の範囲は、添付される請求の範囲に示される。修飾が、本発明の精神から逸脱することなく示される手順に従って行われ得ることが理解される。
【実施例】
【0043】
実施例１：一本鎖オリゴヌクレオチドを用いての制御実験変異オリゴヌクレオチドに完全に一致し、そして野生型オリゴヌクレオチドと１塩基一致を有する、親和性標識されたアンチセンス鎖（ＡＬ−ＡＳ）オリゴヌクレオチドを用いることにより、センス鎖野生型（ＷＴ−Ｓ）オリゴヌクレオチドの存在下でセンス鎖変異（ＭＵ−Ｓ）オリゴヌクレオチドを富化するために、次の実験を用いる。オリゴヌクレオチドの配列は次の通りである（ミスマッチ部位は太字である）：
【0044】
【表1】
【0045】
１０μlの１５０ｍＭグリシン、ｐＨ９．５、２μlの５Ｍ ＮａＣｌ及び５５μlの水により、反応混合物を調製する。この溶液に、１０μlの１０μＭ ＷＴ−Ｓ、１０μlの１０μＭ ＭＵ−Ｓ、及び１０μlの５０μＭ ＡＬ−ＡＳ及び３μlの１００μＭ Ｒｈ（ｂｐｙ）２（ｐｈｚｉ）３＋を添加する。この溶液をボルテックスし、そして室温で５分間インキュベートする。（最終濃度：１５μＭのグリシンｐＨ９．５、１００μＭのＮａＣｌ、１μＭのＷＴ−Ｓ、１μＭのＭＵ−Ｓ、５μＭのＡＬ−ＡＳ及び３μＭのＲｈ（ｂｐｙ）２ｐｈｚｉ３＋）。次に、反応混合物を、３６５ｎｍの電球を用いて、３０分間、Stratagene UV Stratalinker 1800において照射し、ミスマッチを含むセンス−アンチセンス二重鎖の１つの鎖を切断する。
【0046】
２５μｌの１０ｍｇ／ｍｌ Solulinkストレプタビジン磁気ビーズの別の溶液を、１ｍｌの１５μＭグリシン（ｐＨ９．５）緩衝液により洗浄し、そしてビーズを、磁石を用いて、上清液から分離する。切断された及び切断されていないオリゴヌクレオチド二重鎖を有する反応混合物を、磁気ビーズペレットに添加し、そして混合する。得られる混合物を、室温で３０分間インキュベートする。その後、その溶液を、６０℃に、又は切断されたＡｌ−ＡＳ鎖に結合される切断されていないＷＴ−Ｓ鎖（又は切断されていないＡＬ−ＡＳ鎖に結合される切断されたＷＴ−Ｓ鎖）の決定された溶液温度に加熱し、磁気的に分離し、そして上清液を除去し、その結果、切断されていないＭＵ−Ｓ鎖のみが磁気ビーズ上の切断されていないＡＬ−ＡＳ鎖にまだ結合されている。ＭＵ−Ｓ鎖を、１００μｌの２０μＭのＮａＯＨにより磁気ビーズを処理し、溶液を磁気的に分離し、そしてさらなる分析のために、上清液を試験管中にデカントすることにより除去する。
【0047】
実施例２：二本鎖オリゴヌクレオチドを用いて制御実験ＭＵ−ＡＳオリゴヌクレオチドに対して同一の配列を有し、そしてＷＴ−ＡＳオリゴヌクレオチドと１塩基一致を有する、親和性標識されたアンチセンス鎖（ＡＬ−ＡＳ）オリゴヌクレオチドを用いることにより、センス鎖野生型（ＷＴ−Ｓ）オリゴヌクレオチド、アンチセンス鎖野生型（ＷＴ−ＡＳ）オリゴヌクレオチド及びアンチセンス鎖変異（ＷＴ−ＡＳ）オリゴヌクレオチドの存在下でセンス鎖変異（ＭＵ−Ｓ）オリゴヌクレオチドを富化するために、次の実験を用いる。オリゴヌクレオチドの配列は次の通りである（ミスマッチ部位は太字である）：
【0048】
【表2】
【0049】
反応混合物を、１０μｌの１５０ｍＭグリシンｐＨ９．５及び５７μｌの水により調製する。この溶液に、１０μＭのＷＴ−Ｓ及びＷＴ−ＡＳの混合物１０μｌ、１０μＭのＭＵ−Ｓ及びＭＵ−ＡＳの混合物１０μｌ、及び１０μｌの１００μＭのＡＬ−ＡＳを添加する。得られる溶液を、９５℃で５分間インキュベートし、二本鎖オリゴヌクレオチドを一本鎖に解離し、そして次に、その溶液を室温に冷却し、一本鎖オリゴヌクレオチドの再アニーリングを可能にする。３μｌの１００μｌのＲｈ（ｂｐｙ）２ｐｈｚｉ３＋を、溶液に添加し、その溶液をボルテックスし、そして室温で５分間インキュベートする。（最終濃度：１５μＭのグリシンｐＨ９．５、１μＭのＷＴ−Ｓ、１μＭのＷＴ−ＡＳ、１μＭのＭＵ−Ｓ、１μＭのＭＵ−ＡＳ、１０μＭのＡＬ−ＡＳ及び３μＭのＲｈ（ｂｐｙ）２ｐｈｚｉ３＋）。次に、反応混合物を、３６５ｎｍの電球を用いて、１５分間、Stratagene UV Stratalinker 1800において照射し、ミスマッチを含むセンス−アンチセンス二重鎖の１つの鎖を切断する。１０倍濃度過剰のＡＬ−ＡＳオリゴヌクレオチドは、ＭＵ−Ｓ鎖のほとんどがＵＭ−ＡＳ鎖よりもむしろＡＬ−ＡＳに結合する確率を高めるよう作用する。
【0050】
５０μｌの１０ｍｇ／ｍｌ Solulinkストレプタビジン磁気ビーズの別の溶液を、１ｍｌの１５μＭグリシン（ｐＨ９．５）緩衝液により洗浄し、そしてビーズを、磁石を用いて、上清液から分離する。切断された及び切断されていないオリゴヌクレオチド二重鎖を有する反応混合物を、磁気ビーズペレットに添加し、そして混合する。得られる混合物を、室温で３０分間インキュベートする。その後、その溶液を、６０℃に、又は切断されたＡｌ−ＡＳ鎖に結合される切断されていないＷＴ−Ｓ鎖（又は切断されていないＡＬ−ＡＳ鎖に結合される切断されたＷＴ−Ｓ鎖）の決定された溶液温度に加熱し、磁気的に分離する。全てのＷＴ−ＡＳ、ＭＵ−ＡＳ及びＷＴ−Ｓ鎖を上清液により除去し、その結果、切断されていないＭＵ−Ｓ鎖のみが磁気ビーズ上の切断されていないＡＬ−ＡＳ鎖にまだ結合されている。ＭＵ−Ｓ鎖を、１００μｌの２０μＭのＮａＯＨにより磁気ビーズを処理し、溶液を磁気的に分離し、そしてさらなる分析のために、上清液を試験管中にデカントすることにより除去する。
【0051】
実施例３：ＥＧＦＲ変異ＤＮＡの富化及び検出核酸、例えばヒトゲノムＤＮＡの混合物が抽出され得るサンプルを供給する。サンプルは、組織、例えば皮膚、器官及び腫瘍、又は流体、例えば血液、血漿、血清、尿、又は核酸を含むか又は含むと推定される任意の組成物からであり得る。核酸のこの混合物から、目的の標的遺伝子、例えばヒトＥＧＦＲ遺伝子は、特定の変動、例えば非変異又は野生型遺伝子である、大過剰の遺伝子の他の変異体中で小量で存在する点突然変異を含むことができる。癌の発生に臨床学的関連性を有するＥＧＦＲ遺伝子変異の例は、Ｔ７９０Ｍの突然変異である。
【0052】
ＥＧＦＲ遺伝子の低量Ｔ７９０Ｍ変異対立遺伝子を富化するために、Ｔ７９０Ｍ変異対立遺伝子のセンス鎖に相補的であり、そして完全に一致する、過剰のビオチン標識アンチセンス鎖オリゴヌクレオチド（ＢＬ−ＡＳ）を、抽出されたゲノムＤＮＡを含む溶液に添加する。次に、その溶液を、９０℃又はより高い温度に加熱し、二本鎖ゲノムＤＮＡを変性し、そして次に、室温に徐々に冷却し、発生する単一のＤＮＡ鎖のアニーリングを可能にする。アニーリング工程の間、ＢＬ−ＡＳ鎖は、完全に一致するＴ７９０変異センス鎖、及びまた、点突然変異の位置でミスマッチを有するであろう野生型センス鎖の両者で二重鎖を形成することができる。
【0053】
次に、ロジウムキレーターＲｈ（ｂｐｙ）２（ｐｈｚｉ）３＋を、溶液に添加し、そしてインキュベートし、その結果、キレーターは、ミスマッチの位置でＢＬ−ＡＳ：野生型センス鎖二重鎖に対してのみ結合できる。次に、反応混合物を、３６５ｎｍの電球を用いて、１５分間、Stratagene UV Stratalinker 1800において照射し、ＢＬ−ＡＳ：野生型センス鎖二重鎖の１つの鎖を切断する。次に、ストレプタビジンにより被覆された固体マトリックスを添加する。そのような固体マトリックスの例は、ストレプタビジン被覆磁気粒子、例えばInvitrogen からのストレプタビジン−カップリングされたDynabeads（登録商標）、 Promega からのストレプタビジンMagneSphere（登録商標）常磁性粒子、及びSolulinkからの NanoLink（登録商標）及び MagnaLink（登録商標）ストレプタビジン磁気ビーズであり得る。インキュベーション（例えば、４０℃で１時間）に続いて、磁石を用いて、粒子を分離し、そして変異及び野生型アンチセンス鎖及び任意の余分なＢＬ−ＡＳを含む、粒子に結合されていないすべての核酸を洗浄する。野生型センス鎖（ミスマッチ部位で切断されるか、又は切断されたＢＬ−ＡＳオリゴヌクレオチドに結合されている）を、ミスマッチ二重鎖の溶融温度に対応する温度で、適切な溶出緩衝液を用いて、磁気粒子から溶出する。結果的に、Ｔ７９０Ｍセンス鎖のみが、切断されていないビオチン標識Ｔ７９０Ｍアンチセンスオリゴヌクレオチドにハイブリダイズされることにより、磁気粒子に結合されたまま存続する。次に、粒子を、高温又はアルカリ性ｐＨ溶液のいずれかにゆだねることにより、Ｔ７９０Ｍセンス鎖は、ＢＬ−ＡＳオリゴヌクレオチドから解離することができ、そして検出のための増幅反応への使用のために集められる。
【0054】
本発明は特定の実施例を参照して詳細に記載されて来たが、種々の修飾が本発明の範囲内で行われ得ることは、当業者に明らかであろう。従って、本発明の範囲は、本明細書に記載される制限されるものではない。
【配列表】
[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]