特許 6553631 光シート顕微鏡検査のための方法および装置

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6553631

(24)【登録日】2019年7月12日

(45)【発行日】2019年7月31日

(54)【発明の名称】光シート顕微鏡検査のための方法および装置

(51)【国際特許分類】

   G02B 21/00 20060101AFI20190722BHJP

   G01N 21/64 20060101ALI20190722BHJP

【ＦＩ】

   G02B21/00

   G01N21/64 E

【請求項の数】12

【全頁数】15

(21)【出願番号】特願2016-553466(P2016-553466)

(86)(22)【出願日】2015年2月19日

(65)【公表番号】特表2017-507361(P2017-507361A)

(43)【公表日】2017年3月16日

(86)【国際出願番号】EP2015053449

(87)【国際公開番号】WO2015124648

(87)【国際公開日】20150827

【審査請求日】2018年1月17日

(31)【優先権主張番号】102014102215.7

(32)【優先日】2014年2月20日

(33)【優先権主張国】DE

(73)【特許権者】

【識別番号】506151659

【氏名又は名称】カール ツァイス マイクロスコピー ゲーエムベーハー

【氏名又は名称原語表記】ＣＡＲＬ ＺＥＩＳＳ ＭＩＣＲＯＳＣＯＰＹ ＧＭＢＨ

(74)【代理人】

【識別番号】100105957

【弁理士】

【氏名又は名称】恩田 誠

(74)【代理人】

【識別番号】100068755

【弁理士】

【氏名又は名称】恩田 博宣

(74)【代理人】

【識別番号】100142907

【弁理士】

【氏名又は名称】本田 淳

(72)【発明者】

【氏名】アンフート、ティーモ

(72)【発明者】

【氏名】カルクブレナー、トーマス

(72)【発明者】

【氏名】シュヴェート、ダニエル

(72)【発明者】

【氏名】ジーベンモルゲン、イェルク

(72)【発明者】

【氏名】リッペルト、ヘルムート

【審査官】 岡田 弘

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２０１３／１５０２７３（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表２００２−５０７７７９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００５−００３９０９（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｇ０２Ｂ １９／００−２１／００

Ｇ０２Ｂ ２１／０６−２１／３６

Ｇ０１Ｎ ２１／６２−２１／７４

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

光シート顕微鏡検査の方法であって、
画像生成対象の試料部（１０）を、照明光によって形成され、かつ対物レンズ（１）の光軸（８）に対して角度δ≠９０°を有する光シート（９）で走査するステップと、
前記光シート（９）は、前記画像生成対象の試料部（１０）全体に伝搬方向において方向付けられ、
前記対物レンズ（１）は、試料部（１０）への照明光および試料部（１０）からの検出光の両方を方向付けし、
照明光は、前記対物レンズ（１）の光軸と平行に、かつ中心を外して前記対物レンズ（１）の入射瞳に入射され、
前記対物レンズ（１）の焦点深度Ｓ_ｏｂｊは、前記試料部（１０）の前記光軸（８）の方向への深さＴより小さく、
検出ビーム経路内の前記焦点深度Ｓ_ｏｂｊを前記試料部（１０）の前記深さＴ以上である焦点深度Ｓ_ｅｆｆへと増大させて、前記試料部（１０）を前記焦点深度Ｓ_ｅｆｆ内に位置付けるステップと、
前記試料部（１０）における光画像信号の発生領域を割り当てつつ、前記増大させた焦点深度Ｓ_ｅｆｆで得られた光画像信号を電子画像信号に変換するステップと、
前記電子画像信号から走査された試料部（１０）の画像を生成するステップと
を含む、方法。

【請求項2】

走査は、前記試料部（１０）中に投射されるか、または走査式に点もしくは線焦点により生成される光シート（９）で実行される、請求項１に記載の光シート顕微鏡検査の方法。

【請求項3】

前記走査された試料部（１０）の２次元画像または３次元画像は、拡張焦点深度技術またはライトフィールド技術に従って、好ましくは回折光学素子（ＤＯＥ）を前記検出ビーム経路中に挿入して、生成される、請求項１または２に記載の光シート顕微鏡検査の方法。

【請求項4】

走査対象の試料部（１０）に応じた方法で、
前記対物レンズ（１）に関する前記光シート（９）の位置がｘ、ｙまたはｚ方向に変化され、および／または
角度δが変化され、および／または
前記試料部（１０）内での前記光シート（９）の空間的広がりが、前記光軸（８）の周囲での回転により変化される、請求項１乃至３の何れか一項に記載の光シート顕微鏡検査の方法。

【請求項5】

前記試料部（１０）が反射光方式を用いて走査される、請求項１乃至４の何れか一項に記載の光シート顕微鏡検査の方法。

【請求項6】

光シート顕微鏡検査のための装置であって、
画像生成対象の試料部（１０）を、照明光によって形成され、かつ対物レンズ（１）の光軸（８）に対して角度δ≠９０°を有する光シート（９）で走査するための手段と、
前記光シート（９）は、前記画像生成対象の試料部（１０）全体に伝搬方向において方向付けられ、
前記対物レンズ（１）は、試料部（１０）への照明光および試料部（１０）からの検出光の両方を方向付けし、
照明光は、前記対物レンズ（１）の光軸と平行に、かつ中心を外して前記対物レンズ（１）の入射瞳に入射され、
前記対物レンズ（１）の焦点深度Ｓ_ｏｂｊは、前記試料部（１０）の前記光軸（８）の方向への深さＴより小さく、
前記対物レンズ（１０）の下流に設置され、前記焦点深度Ｓ_ｏｂｊを前記試料部（１０）の前記深さＴ以上である焦点深度Ｓ_ｅｆｆへと増大させるように具現化された光学装置と、
前記試料部（１０）を前記焦点深度Ｓ_ｅｆｆの領域内に位置付けるための手段と、
前記光学装置の下流に設置された空間分解光電子エリアセンサ（１７）と、
前記エリアセンサ（１７）により出力された電子画像信号から前記試料部（１０）の画像を生成するように具現化されたハードウェアおよびソフトウェアとを含む、装置。

【請求項7】

前記試料部（１０）内へと走査される光シート（９）を生成し、
前記対物レンズ（１）に関する前記光シート（９）のｘ、ｙまたはｚ方向の位置を変化させ、および／または
角度δを変化させ、および／または
前記光軸（８）の周囲での、または前記光軸（８）に平行な軸の周囲での回転により、前記光シート（９）の空間的広がりを変化させるための光学的手段を備える、請求項６に記載の顕微鏡検査のための装置。

【請求項8】

光シート（９）を前記光軸（８）の周囲または前記光軸（８）に平行な軸の周囲で回転させることにより照明光を前記対物レンズ（１）の前記入射瞳（２４）へと入射させる方向を変化させるための装置が設けられている、請求項６または７に記載の装置。

【請求項9】

前記光学装置は、
アキシコン（１９）、または
キューブ位相マスク（２０）、または
マイクロレンズアレイ（２１）
を含む、請求項６乃至８の何れか一項に記載の光シート顕微鏡検査のための装置。

【請求項10】

検出ビーム経路（１２）に直角に、少なくとも実質的に直角に整列された受像面（１８）を有するＣＣＤセンサがエリアセンサ（１７）として提供される、請求項６乃至９の何れか一項に記載の光センサ顕微鏡検査のための装置。

【請求項11】

前記対物レンズ（１）の入射瞳（２４）に照明光を前記光軸（８）に関して中心を外して入射させるために、入射位置を変化させる手段を含む、請求項６乃至１０の何れか一項に記載の装置。

【請求項12】

ＰＣと、２次元画像または３次元画像の電子的保存および視覚的に認識可能な再現のための手段とがハードウェアとして提供され、かつ
前記ソフトウェアは、信号評価と、前記２次元画像または３次元画像の生成とのための所定のアルゴリズムに対応する、請求項６乃至１１の何れか一項に記載の光シート顕微鏡検査のための装置。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、光シート顕微鏡検査のための方法と、この方法を実行するための装置とに関する。

【背景技術】

【0002】

光シート顕微鏡検査は、光シート蛍光顕微鏡法（ＬＳＦＭ：ｌｉｇｈｔ ｓｈｅｅｔ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）または単一平面照明顕微鏡法（ＳＰＩＭ：ｓｉｎｇｌｅ ｐｌａｎｅ ｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）とも呼ばれ、比較的最近開発された蛍光顕微鏡検査の方法および装置として、それ自体すでに知られている。

【0003】

共焦点レーザ走査顕微鏡法または２光子顕微鏡法のような光セクショニングの特性を有する従来の蛍光顕微鏡法と比較して、光シート顕微鏡検査中、試料内の、光シートの厚さに対応する薄い層の照明は、光学断面の測定および表示を可能とし、それと同時に画像背景を抑制する。ここで、褪色または生体試料中の光誘発ストレスの結果としての不利な影響が、その検査中に低減される。検出はワイドフィールドで行うことができるため、比較的大きい試料領域を迅速に検出することがさらに可能である。

【0004】

本発明は、光シートが、検出対物レンズの光軸との角度δ≠９０°を含む励起面を画定し、試料がこの光シートにより走査される、光シート顕微鏡検査の主題領域に関する。
この点に関して、（特許文献１）には照明装置を含む顕微鏡が記載されており、その中では光ストリップが生成され、前記光ストリップが試料を、検出方向に関して９０°以外の角度で傾斜する平面内で照明する。検出方向は、検出光が表面検出器へと到達する際に通過する対物レンズにより画定される。

【0005】

照明面は、回転軸の周囲で回転可能である。異なる設計では、表面検出器が照明面の回転と同期して移動可能であるか、または中間像面もしくは像面の空間状況が、照明平面の向きとは関係なく一定に保たれるような方法で影響される。

【0006】

第一のケースでは、照明面が、例えば光軸に平行な軸の周囲で回転されると、表面検出器も同様に、その光軸に平行な軸の周囲で回転されなければならない。照明面と検出方向との間の角度が変化すると、この角度変化に応じて検出器の表面と入射検出光の伝搬方向との間の角度を更新しなければならない。

【0007】

第二のケースでは、照明された試料領域を常に検出器表面上に結像させるために、中間像面または像面の空間状況が、例えばプリズムの回転を照明面の回転と同期させることによって影響される。

【0008】

このケースの欠点は、光学画像生成中、特に標準的な結像条件の場合に、共通の直線に沿って像面、物面、および鮮鋭面が共通の直線に沿って交差しなければならないとするシャインフルーク（Ｓｃｈｅｉｍｐｆｌｕｇ）条件を満たすことができない点であり、これは、検出面と光軸との間の角度が非常に大きくなるからである。

【0009】

（特許文献２）には、反射光式の走査顕微鏡が記載されている。その中では、対物レンズが画像生成対象の物体中に長尺状の照明焦点を発生させ、走査装置がこの照明焦点を、照明光が対物レンズの入射瞳に入射するときの射方向を変化させることによって、物体中の照明すべき標的領域にわたり移動させる。入射瞳への照明光の入射位置は、瞳の中心に関して中心を外れるようにずれている。その結果、照明焦点は光シートを生成し、これは、照明光が対物レンズの入射瞳に中心を外れて入射することにより、光軸に関して斜めになるからである。

【0010】

光シートにより照明される標的領域から発せられる蛍光放射は、対物レンズにより検出され、検出光学ユニットへと誘導される。検出光学ユニットは第一の検出用対物レンズを含み、これはチューブレンズシステムの下流に設置される。チューブレンズシステムは２つのチューブレンズからなり、そのうちの一方は対物レンズに関連付けられ、もう一方は第一の検出用対物レンズに関連付けられる。対物レンズと協働して、第一のチューブレンズは第一の中間像を生成する。ここで、第一の検出用対物レンズの光軸は、対物レンズの光軸に垂直である。光シートにより照明される標的領域は対物レンズの光軸に対して斜めに配置されるため、第一の中間像もまた、第一の検出用対物レンズの光軸に対して斜めである。第二のチューブレンズと協働して、第一の検出用対物レンズは、第一の中間像を第二の中間像中に結像し、第二の中間像も同様に第一の検出対物レンズの光軸に対して斜めである。

【0011】

検出光学ユニットはさらに、第二の検出用対物レンズを含み、第二の検出用対物レンズは第二の中間像を別のチューブレンズによって光検出器の検出面上に結像する。ここで、第二の検出用対物レンズの光軸は、第二の中間像に垂直であり、かつ、検出面にも垂直である。２つの検出用対物レンズ間の協働の結果、走査された標的領域の傾き補正された画像が検出面上に生成される。

【0012】

ここでの欠点は、顕微鏡リレイシステムにより生成される中間像を観察するために第二の光顕微鏡構造が必要であるため、画像生成に包括的な技術のための、従ってコストの嵩む支出が必要となることである。

【0013】

さらに、各種の光学ユニット、特に高ＮＡの第二の検出用対物レンズが斜めでなければならないことから、集光ＮＡが制限されるため、検出効率が低く、また光学ユニットが多数必要であるため、システム全体の透過率が低い。また、対物レンズの特性が全体的な構造に依存し、従って、対物レンズを実践上の様々な用途について互換できないため、システムの使用の柔軟性が大きく限定される。さらに、励起形状が検出用対物レンズの配置によってあらかじめ決定されるため、観察試料面を光軸に関して任意の方法で向き付けすることができない。

【0014】

さらには、引用した文献の両方において、記載されている技術的解決策には機械的な移動が必要であり、従って、摩耗損耗および故障が生じやすい。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0015】

【特許文献1】独国特許出願公開第１０ ２００５ ０２７ ０７７ Ａ１号明細書

【特許文献2】独国特許出願公開第１０ ２０１１ ０００ ８３５ Ａ１号明細書

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0016】

背景技術から発展して、本発明の目的は、上述の欠点をもはや有さない光シート顕微鏡検査の方法を開発することにある。本発明の基礎となる他の目的は、その新規な方法を実行するのに適した少なくとも１つの装置を特定することである。

【課題を解決するための手段】

【0017】

冒頭に記したタイプの方法に関して、この目的は、
画像生成対象の試料部を、対物レンズの光軸との角度δ≠９０°を含む光シートで走査するステップであって、
光シートは、画像生成対象の試料部全体を伝搬方向に通過し、
対物レンズの焦点深度Ｓ_ｏｂｊは、この試料部の光軸の方向への深さＴより小さい、走査するステップと、
検出ビーム経路内の焦点深度Ｓ_ｏｂｊをこの試料部の深さＴ以上である焦点深度Ｓ_ｅｆｆへと増大させるステップと、
試料部を焦点深度Ｓ_ｅｆｆ内に位置付けるステップと、
試料部における光画像信号の発生領域を割り当てつつ、増大させた焦点深度Ｓ_ｅｆｆで得られた光画像信号を電子画像信号に変換するステップと、
電子画像信号から走査された試料部の画像を生成するステップと
により達成される。

【0018】

画像生成対象の試料部は、検査対象の試料の体積全体か、またはその試料の体積全体中の検査対象の空間部分の何れかである。
本発明の意味において、それぞれ使用される対物レンズの設計により決定される公称焦点深度は、焦点深度Ｓ_ｏｂｊと定義される。例えば、高開口数の無収差対物レンズには下式：

【0019】

【数1】

が当てはまり、式中、αは対物レンズの開き角、ｎはイマージョンリキッドの反射率、ＮＡはα＝ａｒｃｓｉｎ（ＮＡ／ｎ）による開口数である。ＮＡが１．２の水浸対物レンズの場合、Δｚの焦点深度Ｓ_ｏｂｊ＝Ｓ_ｏｂｊ＝０．８３μｍが得られる。本発明による方法に使用できるような標準的な対物レンズの場合、焦点深度Ｓ_ｏｂｊは０．５μｍ〜１７０μｍの範囲内にある。

【0020】

焦点深度Ｓ_ｅｆｆは、検出ビーム経路の過程で得られる有効焦点深度を意味するものと理解され、これは焦点深度Ｓ_ｏｂｊより大きい。本発明によれば、Ｓ_ｅｆｆ≧Ｔが当てはまる。

【0021】

対物レンズの光軸の方向は、デカルト座標系のｚ座標方向に対応する。光シートの空間アラインメントとは、本発明の意味において、光シートとして成形された照明光の伝搬方向により定義される。光シートは、照明ビーム経路のうち、試料部を照明するために提供される領域であり、この領域において、照明光は、検出方向に、すなわち対物レンズの光軸の方向に測定された例えば１０μｍの空間的広がりを超えず、従って、光シート顕微鏡の原理により試料部を検出または測定するのに適している。

【0022】

光シートは様々な手順で生成でき、例えばシリンドリカルレンズによって一方向のみに合焦される拡張コリメートレーザビームの形態で試料部内に投射することも、または点状レーザ焦点を走査式に移動させながら生成することもできる。例えばＳＬＭ（空間光位相変調器）等の光成形素子によって光シートを生成することも想定できる。

【0023】

走査対象の試料部に応じて、
対物レンズに関する光シートのｘ、ｙおよびｚ方向への位置、および／または
角度δ、および／または
光軸の周囲での中心または偏心回転により、前記試料部内での光シートのアラインメント
を変化させることができる。

【0024】

有利な態様では、試料部は反射光方式を用いて走査される。本発明により提供される軸方向に非弁別的な検出により、有利には、既知のチルトでの光シート照明と組み合わせて、試料領域を照明し、画像生成することが可能となり、この試料領域は検出用対物レンズの焦点面にあるだけでなく、軸方向に見たときに試料中の焦点面の上流または下流の様々な深さにある。

【0025】

本発明による方法の代替的な実施形態において、走査される試料部の２次元画像または３次元画像が、エリアセンサの受像面上に検出光を結像するための光学的手段の選択と、信号処理のためのアルゴリズムとによって異なる方法で生成される。拡張焦点深度方式またはライトフィールド技術、例えば回折光学素子（ＤＯＥ）を検出ビーム経路中に組み込んだ技術により、走査対象試料部の２次元画像または３次元画像が生成される実施形態が有利である。

【0026】

透過光で、またはそれ以外に選択的平面照明顕微鏡（ＳＰＩＭ：Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ−Ｐｌａｎｅ−Ｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｏｎ−Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）方式に従って横方向に、対物レンズを通じて試料を照明することは、本発明による方法の範囲内に含まれる。

【0027】

本発明による方法において誘導放出抑制（ＳＴＥＤ：ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ ｅｍｉｓｓｉｏｎ−ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ）の原則を実行することもまた想定できる。ここで、画像生成に貢献する光シートの厚さは、ダブルライトシートのゼロ位置が実質的に励起光シートの位置にあるようにダブルライトシートを励起光シートの上に重ねることにより低減される。信号評価時にダブルライトシートの波長で刺激される発光は考慮されず、その結果、長手方向の分解能が高くなる。さらに、分解能が線形または非線形手段により高められる既知のあらゆる方法を、本発明による方法によって組み合わせることができる。この点で、２Ｄおよび３Ｄの画像を取得するための局在化顕微鏡法に属する方法、例えば光活性化局在化顕微鏡法ＰＡＬＭ（Ｐｈｏｔｏ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）、確率的光学再構築顕微鏡法（ＳＴＯＲＭ：ｓｔｏｃｈａｓｔｉｃ ｏｐｔｉｃａｌ ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）または超解像蛍光強度変動画像構成（ＳＯＦＩ：ｓｕｐｅｒ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｏｐｔｉｃａｌ ｆｌｕｃｔｕａｔｉｏｎ ｉｍａｇｉｎｇ）等が特に好適である。さらに、信号光を生成するための多光子方式、例えば２光子顕微鏡法または３光子顕微鏡法、ＳＨＧ、ＴＨＧ顕微鏡法またはＣＡＲＳ励起等も使用できる。

【0028】

本発明の基礎となる目的はさらに、上述の本発明による方法を実行するための装置により達成される。この装置は、
画像生成対象の試料部を、対物レンズの光軸との角度δ≠９０°を含む光シート（９）で走査するための手段であって、
光シートは、画像生成対象の試料部全体を伝搬方向に通過し、
対物レンズの焦点深度Ｓ_ｏｂｊは、この試料部の光軸の方向への深さＴより小さい、走査するための手段と、
対物レンズの下流に設置され、焦点深度Ｓ_ｏｂｊをこの試料部の深さＴ以上である焦点深度Ｓ_ｅｆｆへと増大させるように具現化された光学装置と、
試料部を焦点深度Ｓ_ｅｆｆの領域内に位置付けるための手段と、
光学装置の下流に設置された空間分解光電子エリアセンサと、
エリアセンサにより出力された電子画像信号から試料部の画像を生成するように具現化されたハードウェアおよびソフトウェアと
を含む。

【0029】

例えば、対物レンズの公称焦点深度Ｓ_ｏｂｊは０．５μｍ〜１７０μｍの範囲内にあり、対物レンズの下流に設置された光学装置は、焦点深度Ｓ_ｏｂｊを有効焦点深度Ｓ_ｅｆｆへと係数ａ≧５で増大させるように具現化され、常にＳ_ｅｆｆ≧Ｔが当てはまる。

【0030】

本発明による装置は好ましくは、
試料部内へと走査される光シートを生成し、ならびに
対物レンズに関する光シートのｘ、ｙおよびｚ方向の位置を変化させ、および／または
角度δを変化させ、および／または
光軸の周囲での中心または偏心回転により、試料部内の光シートのアラインメントを変化させるための光学的手段を備える。

【0031】

好ましくは、共通の対物レンズを照明および検出に利用でき、照明光を対物レンズの入射瞳へと対物レンズの光軸に平行にずれた位置において入射させるようになっている。この場合、
照明光の入射位置と対物レンズの光軸との間の距離を変化させ、
瞳面内の入射位置を、照明光の入射位置の光軸からの距離に対応する半径を有する部分円に沿って移動させ、および
照明光を対物レンズの入射瞳へと入射させる方向を変化させる
ように具現化された装置が存在する。

【0032】

本発明による装置の実施形態を動作させる際、光シートの角度δまたは傾斜位置は、照明用兼検出用対物レンズの入射瞳への照明光の中心を外した入射によりあらかじめ決定される。照明光の入射位置を瞳面内の部分円の円周に沿って移動させることにより、光シートが対物レンズの光軸の周囲で回転する。本発明の意味において、光軸と平行に延びる瞳の法線に関する照明光の入射方向または照明光の入射角度を変化させると、楕円ガウス光シートの場合に光シートが移動し、照明内の長尺状の点像分布関数を走査することによって生じる光シートの横方向の広がりに影響を与える。

【0033】

例えば、焦点深度Ｓ_ｏｂｊを増大させるための光学装置は、アキシコン、位相マスク、またはマイクロレンズアレイを含む。ここで、アキシコンまたは位相マスクは、拡張焦点深度方式による２次元画像または３次元画像の生成に関連して使用され、マイクレンズアレイは、ライトフィールド技術に従って２次元画像または３次元画像を生成することに関連して使用される。

【0034】

例えば、キューブ、対数、指数関数、分数乗位相マスクおよび有理数位相マスクを本発明の意味における位相マスクとして、検出ＰＳＦを長くするために使用可能なその他のあらゆる位相マスクと同様に使用できる。さらに、瞳マスクを使用することも可能であり、これは検出されるべき光の振幅に影響を与える。それゆえ、特定の領域における吸収率が増大しており、従ってアポダイゼーションをもたらすか、または対物レンズのＮＡの絞りにつながる瞳マスクが問題となる。ここで、マスクの吸収領域と位相に影響を与える領域との混合を有利に使用することが可能である。

【0035】

エリアセンサの受像面は、長方形であり、検出ビーム経路に少なくとも実質的に直角に整列され、かつ検出ビーム経路中の直角位置に、正確に言えば光のシートの位置もしくは傾斜の変化、すなわち回転に関係なく、固定して配置される。先行技術とは対照的に、光シートを移動させた後にエリアセンサまたは領域を更新する必要がない。その結果、機械的に移動される構成要素が不要となり、装置はよりエラーを発生させにくい。例えば、ＣＣＤセンサをエリアセンサとして提供できる。

【0036】

さらに、中間像を生成するための顕微鏡リレイシステムが不要であり、その結果、このような中間像を観察するための第二の光顕微鏡構造も必要ないため、先行技術と比較して、本発明による解決策に必要な技術的経費は実質的に削減され、その結果、コスト安となる。さらに、検出効率がより高く、それは、複数の光学ユニット、特に高開口数対物レンズの斜めの位置によってＮＡが制限されないからである。必要な光学ユニット数が少なくてよいため、システム全体の透過率が同等の先行技術より高い。

【0037】

本発明の実質的な利点はさらに、試料の空間画像が、比較的小さい公称焦点深度Ｓ_ｏｂｊの対物レンズにより得られる点である。その結果、費用対効果の高い標準的な対物レンズまたは標準的な画像生成条件を使用できる。標準的な対物レンズは様々な実践的用途で互換可能であり、これは、対物レンズの特性が全体的な構造と無関係であるからである。その結果、本発明による装置は、実質的により柔軟な方法で使用できる。

【0038】

ＰＣと、２次元画像または３次元画像の電子的保存および視覚的に認識可能な再現のための手段とは、ハードウェアとして機能する。ソフトウェアは、信号評価と、信号評価の結果として２次元画像または３次元画像の生成とのための所定のアルゴリズムに対応する。

【0039】

補足的な実施形態において、本発明による装置は、任意選択により、照明用兼検出用対物レンズの入射瞳に照明光を入射させる位置を変化させ、入射を任意でその光軸に関して中心から外して、または中心で行うことができるようにする装置を有する。その結果、必要に応じて、光シート顕微鏡検査による選択された試料部の走査から従来のレーザ走査方式による走査へと切り替えることが可能である。それゆえ、照明光が中心で対物レンズの入射瞳に入射するときには、共焦点レーザ走査顕微鏡法に従って光学画像信号が得られる。

【0040】

例示として図面に基づいて本発明を以下により詳しく説明する。

【図面の簡単な説明】

【0041】

【図1】本発明による装置の第一の例示的な実施形態を示しており、受像装置がエリアセンサを有し、その上流でアキシコンが検出ビーム経路内に配置されている。

【図2】本発明による装置の第二の例示的な実施形態を示しているが、この場合、エリアセンサの上流で検出ビーム経路内にキューブ位相マスクが配置されている。

【図3】本発明による装置の第三の例示的な実施形態を示しており、この場合、エリアセンサの上流で検出ビーム経路内にマイクロレンズアレイが配置されている。

【図4】対物レンズの光軸に関する試料内の光シートの第一の例示的な位置およびアラインメントの実現例を示す。

【図5】対物レンズの光軸に関する試料内の光シートの第二の例示的な位置およびアラインメントの実現例を示す。

【図6】対物レンズの公称焦点深度Ｓ_ｏｂｊと比較した場合および試料部の深さＴと比較した場合の本発明により得られる焦点深度Ｓ_ｅｆｆと、試料部の深さＴと比較した試料部内の光シートの範囲とを示す。

【発明を実施するための形態】

【0042】

図１に示されている例示的な実施形態は、無限遠に像を結ぶ固定焦点距離を有する対物レンズ１を有し、前記対物レンズは照明用対物レンズと検出用対物レンズとの両方の用途のために提供されている。名目上、これは０．５μｍ〜１７０μｍの範囲の焦点深度Ｓ_ｏｂｊのために設計できる。

【0043】

レーザ光源２、ビーム拡張光学ユニット３、および走査装置４は、照明ビーム経路５を発生させ、これはビームスプリッタ７のスプリッタ面６によって対物レンズ１へと偏向され、対物レンズ１の光軸８から横方向にずれて対物レンズ１の入射瞳２４へと入射する（図４および図５参照）。拡張されたコリメートレーザビームは、例えばシリンドリカルレンズ（図示せず）により一方向のみに合焦し、それゆえ光シート９へと成形されて、対物レンズ１により試料部１０中へと投射される。代替的な実施形態においては、光シート９を、走査式に移動される点状レーザ焦点によって、または他の何れかの光シェーピング手法によって生成できる。

【0044】

光軸８に関して中心を外して入射する照明光によって、光シート９の伝搬方向は光軸８と９０°以外の角度δを含むことになる。ここで、角度δの大きさは、入射瞳２４への照明光の入射位置２３と光軸８との間の距離に応じて異なる。

【0045】

光シート９が光軸８に関して斜めであることによって、光シート９は試料部１０中の、軸方向、すなわちｚ方向の焦点面１１の前方および後方において異なる深さにある領域を照明する。

【0046】

ｘおよび／またはｙ方向への走査移動により、走査装置４は試料部１０内の光シート９の現在の位置およびアラインメントを決定する。前記走査装置４はまた、光シート９を光軸８の周囲または光軸８に平行な軸の周囲で角度φ程度回転させるように具現化される（図４および図５参照）。さらに、走査ユニット４によって、瞳面内の照明光の入射位置２３を、入射位置２３の光軸８からの距離に対応する半径を有する部分円２５の円周に沿って移動できる。

【0047】

ここで、走査装置４は、例示的な方法で、
− 照明光の入射位置２３と光軸８との間の距離を変化させ、
− 瞳面内の入射位置２３を、入射位置２３の光軸８からの距離に対応する半径を有する部分円２５に沿って移動させ、および
− 照明光を対物レンズ１の入射瞳２４への入射方向を変化させる
ように具現化されている。

【0048】

しかしながら、本発明の範囲は、これらの機能の各々をそのために具現化された個別の装置によって実行することも明確に含む。
照明された試料領域から反射された、散乱した、または励起された光は検出光として対物レンズ１に入る。対物レンズ１は検出ビーム経路１２を形成し、図１に示されるように、スプリッタ面６は検出光を透過させる。対物レンズ１にマッチするチューブ光学ユニット１３が中間像１４を生成するために使用され、これはその後、２つの別のレンズ群１５および１６ａと、アキシコン１９とによってエリアセンサ１７の受像面１８上に結像される。受像面１８は、焦点面１１と共役である対物レンズ１の像面内に固定して位置付けられる。

【0049】

検出ビーム経路中で、アキシコン１９が２つのレンズ群１５、１６ａ間に位置付けられる。アキシコン１９は、検出光を焦点距離の非常に長いベッセル成形光ビームへと変形させ、従って、本発明によれば、対物レンズ１の公称焦点深度Ｓ_ｏｂｊが倍数で焦点深度Ｓ_ｅｆｆまで増大され、その結果、光シート９により走査される試料部１０の全体が受像面１８上に鮮鋭に結像される。

【0050】

試料部１０の照明された各々の薄い断面の深さ分解画像が、エリアセンサ１７により記録された検出ビーム経路１２内の強度分布からの計算によって確立され、前記画像は、観察者が視覚的に認識できるような方法で表現される。このような復元方法はそれ自体知られている。位相マスクによる、いわゆる波面符号化の場合、データレコードはまず、数値的に復号される。これは、マスク、対物レンズ、および顕微鏡システムにより決定される既知の点像分布関数（ＰＳＦ：ｐｏｉｎｔ ｓｐｒｅａｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ）でのデコンボリューションによって実行される。光軸に沿った試料部の投射は、この第一のステップの後に得られる。次のステップにおいて、それぞれの現在の照明形状に関する先験的情報が、各検出イベントの走査された試料部との一意的な空間割当が実行されるように試料復元に含められる。

【0051】

図１からわかるように、この点において、コンピューティングユニット２６が、例えば適当な処理ソフトウェアを備えるＰＣの形態で提供される。コンピューティングユニット２６は、図１に示されている信号経路によるエリアセンサ１７からの画像信号、走査装置４からの照明された試料部１０に関する光シート９の空間状況とアラインメントとに関する情報、および試料台２２からの対物レンズ１に関するｚ方向への試料部１０の位置に関する情報を受け取り、この情報を、走査された試料部１０の２次元画像または３次元画像を得ることを目的として、処理ソフトウェアによって画像信号とリンクさせる。その結果の視覚的に認識可能な表現および／または保存は、コンピューティングユニット２６に接続されたメモリおよび再現ユニット２７によって実行される。

【0052】

具体的な実施形態において、チューブ光学ユニット１３の中間像１４の位置からの距離はｆ_１３＝２００ｍｍである。例えば、レンズ群１５は、中間像１４の位置から距離ｆ_１５＝２００ｍｍにあり、無限ビーム経路を発生させる。アキシコン１９は、レンズ群１５から４１ｍｍの距離にある。アキシコン１９の円錐角は≦２であり、例えば、この場合、０．５である。アキシコン１９と受像面１８との間の距離は、本発明による装置の実施形態に応じて異なり、これを最大５０ｃｍとすることができ、アキシコン１９により生成されるベッセルビームの長さによって決まる。受像面１８は、ベッセルビームの領域内に位置付けられる。

【0053】

レンズ群１５、１６ａは、両方とも複数のレンズで構成でき、個別のレンズとして具現化できる。原則として、レンズ群１６ａは不要であり、本発明の範囲にはまた、レンズまたはレンズ群１６ａのない本発明による装置の実施形態も含まれる。しかしながら、レンズ群１６ａは、有利には、解像度および横倍率等の光学的パラメータの設定に使用できる。

【0054】

図２は、本発明による装置の第二の例示的な実施形態を示す。ここに示されている構成要素が図１の構成要素とその機能に関して同等であるかぎり、これらには図１と同じ参照符号が付与されている。

【0055】

図１による例示的な実施形態との違いは基本的に、ここではアキシコン１９が設けられず、２つのレンズ群１５および１６ｂ間にキューブ位相マスク２０が設けられている点であり、このキューブ位相マスクは、レンズ群１５、１６ｂ間に具現化される瞳の中に位置付けられる。

【0056】

位相マスク２０は、検出光をエアリ形状の光ビームへと変形し、同様に、本発明によれば、対物レンズ１の公称焦点深度Ｓ_ｏｂｊが倍数で焦点深度Ｓ_ｅｆｆまで増大し、その結果、光シート９により走査された試料部１０の全体も、この場合には受像面１８上に鮮鋭に結像される。

【0057】

拡張焦点深度（ＥＤｏＦ：Ｅｘｔｅｎｄｅｄ−Ｄｅｐｔｈ−ｏｆ−Ｆｉｅｌｄ）技術を適用することによって、今度は、試料部１０中の照明された各々の薄い断面の深さ分解画像が、エリアセンサ１７により記録された検出光ビーム内の強度分布からのコンピューティングユニット２６を使った計算によって確立され、前記深さ分解画像は、メモリおよび再現ユニット２７によって観察者により視覚的に認識可能な方法で表現される。

【0058】

図３は、第三の例示的な実施形態を示す。ここでも、構成要素について、図１および図２の構成要素と同等であるかぎり、これらには同じ参照符号が使用される。
図３による例示的な実施形態の図１および図２による前述の例示的な実施形態との違いは、アキシコン１９も位相マスク２０も設けられず、その代わりに受像面１８の上流にマイクロレンズアレイ２１が配置されている点である。

【0059】

マイクロレンズアレイ２１は、光シート９により走査された試料部１０が全体として受像面１８上に結像されることによって、対物レンズ１の焦点深度Ｓ_ｏｂｊを倍数により焦点深度Ｓ_ｅｆｆへと増大させる。以降、照明された薄い断面の深さ分解画像が検出光ビームの記録された強度分布のライトフィールド手法により計算されること、および前記深さ分解画像が視覚的に認識可能な方法で表現されることによって、この体積の３次元再構築が行われる。

【0060】

ここで述べるケースにおいて、図１に基づいて詳しく上述したように、それぞれの現在の照明形状に関する先験的情報の取得および使用を、３次元試料表現の結果を改善するために含めることができる。

【0061】

ここでも、走査された試料部１０の２次元画像または３次元画像が、コンピューティングユニット２６によって得られる。
図４および図５は、例示的かつ全体的に、試料部１０の走査中に光シート９が光軸８および試料台２２に関して取り得る２つの位置およびアラインメントを示している。明瞭にするために、対物レンズと、試料台２２上に載せられ、光シート９によって走査される試料とは、図４および図５には描かれていない。

【0062】

対物レンズの入射瞳２４の平面図において、図４ａは入射瞳２４への照明ビーム経路５の入射位置２３を示しており、入射位置２３は角度φと光軸８からの距離とによって決まり、その結果として図４ｂに示される試料内の光シート９の位置およびアライメントが得られる。

【0063】

これに対して、図５ａは、同じ入射瞳２４の平面図において、入射瞳２４への照明ビーム経路５の入射位置２３を示しており、この入射位置２３もまた、角度φと光軸８からの距離とによって決まるが、入射位置２３は、このケースでは図５ｂに示される試料内の光シート９の位置およびアラインメントをもたらす。

【0064】

両方のケースにおいて、この瞳照明は例示的な方法で、傾斜した楕円ガウス光シートの生成を示している。
図４および図５からわかるように、走査される試料部１０に対する光シート９の位置およびアラインメントを、入射位置２３を変化させることによって、ここでは例えば角度φを変化させることによって適応させることが可能であるが、光軸８と光シート９との間の角度δが保持される。対物レンズ１の焦点面から離れた試料面に関する光シート９の交差点は、このケースでは円形経路に沿って延びる。

【0065】

光軸８からの入射位置２３の距離の変化により、光シート９と光軸８との間の角度δが変化する。光シート９の位置を、ｘおよびｙ方向に延びる試料部１０に関して適応させることは、対物レンズ１の瞳面への照明光の入射角を変化させることによって実現される。焦点面１１または焦点深度Ｓ_ｏｂｊ、Ｓ_ｅｆｆの領域の試料に関するｚ方向への移動は、試料台２２をｚ方向に移動させることによって得られる。

【0066】

図６において、本発明により得られる有効焦点深度Ｓ_ｅｆｆは、対物レンズ１の公称焦点深度Ｓ_ｏｂｊおよび試料台２２の上に載せられた試料の照明された体積１０の深さＴと比較する目的で対比されている。

【0067】

さらに、図６から、光シート９が試料部１０の深さＴ全体にわたって延びていることを確認することができる。図６において、光シート９はｚ方向へと、Δｚ＝Ｌの範囲にわたって延び、Ｌは試料部１０の深さＴを含み、それによって光シート９は試料部１０をその深さＴ全体にわたり照明する。

【0068】

この条件はまた、Ｌ＝Ｔの場合によっても満たされ、従って、同様に本発明の範囲に含まれる。
領域Ｌ内で、光シート９の光軸８の方向への空間的広がりは例えば１０μｍの数値を超えず、従って、光シート顕微鏡の原理によって試料部１０を検出または測定するのに適している。

【0069】

角度φの変化と光シート９または試料のｘまたはｙ方向への移動とを組み合わせて、焦点深度Ｓ_ｅｆｆ≧Ｔにより試料部１０全体の検出および結像が可能となる。

【符号の説明】

【0070】

１ 対物レンズ
２ レーザ光源
３ ビーム拡張光学ユニット
４ 走査装置
５ 照明ビーム経路
６ スプリッタ面
７ ビームスプリッタ
８ 光軸
９ 光シート
１０ 試料部
１１ 焦点面
１２ 検出ビーム経路
１３ チューブ光学ユニット
１４ 中間像
１５ レンズ群
１６ レンズ群
１７ エリアセンサ
１８ 受像面
１９ アキシコン
２０ 位相マスク
２１ マイクロレンズアレイ
２２ 試料台
２３ 入射位置
２４ 入射瞳
２５ 部分円
２６ コンピューティングユニット
２７ メモリおよび再現ユニット

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】