特許 6553963 改変スターメレラ属微生物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6553963

(24)【登録日】2019年7月12日

(45)【発行日】2019年7月31日

(54)【発明の名称】改変スターメレラ属微生物

(51)【国際特許分類】

   C12N 1/19 20060101AFI20190722BHJP

   C12N 15/31 20060101ALI20190722BHJP

   C12N 15/54 20060101ALI20190722BHJP

   C12P 13/00 20060101ALI20190722BHJP

   C12R 1/01 20060101ALN20190722BHJP

【ＦＩ】

   C12N1/19ZNA

   C12N15/31

   C12N15/54

   C12P13/00

   C12R1:01

【請求項の数】18

【全頁数】28

(21)【出願番号】特願2015-136109(P2015-136109)

(22)【出願日】2015年7月7日

(65)【公開番号】特開2016-54735(P2016-54735A)

(43)【公開日】2016年4月21日

【審査請求日】2018年6月15日

(31)【優先権主張番号】特願2014-181650(P2014-181650)

(32)【優先日】2014年9月5日

(33)【優先権主張国】JP

(73)【特許権者】

【識別番号】000000918

【氏名又は名称】花王株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】110000084

【氏名又は名称】特許業務法人アルガ特許事務所

(74)【代理人】

【識別番号】100077562

【弁理士】

【氏名又は名称】高野 登志雄

(74)【代理人】

【識別番号】100096736

【弁理士】

【氏名又は名称】中嶋 俊夫

(74)【代理人】

【識別番号】100117156

【弁理士】

【氏名又は名称】村田 正樹

(74)【代理人】

【識別番号】100111028

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 博人

(72)【発明者】

【氏名】平野 久美子

(72)【発明者】

【氏名】早瀬 温子

【審査官】 清野 千秋

(56)【参考文献】

【文献】 特開２０１４−００００７６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００２−５１３５７３（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １／１９

Ｃ１２Ｎ １５／０９−１５／９０

Ｃ１２Ｐ １３／００

Ｃ１２Ｒ １／０１

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＷＰＩＤＳ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

スターメレラ属微生物において、以下の（Ａ）〜（Ｆ）：
（Ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（Ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ（Ｄ）〜（Ｆ）のいずれかのポリペプチドと複合体を形成しセリンパルミトイルトランスフェラーゼ活性を発現するポリペプチド、
（Ｃ）配列番号２で示されるアミノ酸配列において、１〜２５個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ（Ｄ）〜（Ｆ）のいずれかのポリペプチドと複合体を形成しセリンパルミトイルトランスフェラーゼ活性を発現するポリペプチド、
（Ｄ）配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（Ｅ）配列番号４で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかのポリペプチドと複合体を形成しセリンパルミトイルトランスフェラーゼ活性を発現するポリペプチド、
（Ｆ）配列番号４で示されるアミノ酸配列において、１〜２８個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかのポリペプチドと複合体を形成しセリンパルミトイルトランスフェラーゼ活性を発現するポリペプチド、より選択されるポリペプチドの発現が強化され、且つ以下の（Ｇ）〜（Ｉ）：
（Ｇ）配列番号６で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（Ｈ）配列番号６で示されるアミノ酸配列において１〜２２個のアミノ酸残基が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（Ｉ）配列番号６で示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド、から選ばれるアミノ酸配列からなり、且つアセチルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子が導入された改変スターメレラ属微生物。

【請求項2】

前記（Ａ）〜（Ｃ）のポリペプチドが、配列番号２の１６３位、またはそれに相当する位置にシステイン残基を有する請求項１記載の改変スターメレラ属微生物。

【請求項3】

前記（Ｄ）〜（Ｆ）のポリペプチドが、ピリドキサール−５’−リン酸結合モチーフ（ＧＴ（Ｆ／Ｌ）ＴＫＳＦＧ）を有する請求項１又は２記載の改変スターメレラ属微生物。

【請求項4】

前記（Ａ）〜（Ｃ）からなる群より選択されるポリペプチドと、前記（Ｄ）〜（Ｆ）からなる群より選択されるポリペプチドとを発現強化する、請求項１〜３のいずれか１項記載の改変スターメレラ属微生物。

【請求項5】

前記（Ａ）〜（Ｆ）から選択されるポリペプチドの発現の強化が、前記スターメレラ属微生物において、該（Ａ）〜（Ｆ）から選択されるポリペプチドをコードする遺伝子の発現量を増加させることである、請求項１〜４のいずれか１項記載の改変スターメレラ属微生物。

【請求項6】

前記（Ａ）〜（Ｃ）からなる群より選択されるポリペプチドをコードする遺伝子と、前記（Ｄ）〜（Ｆ）からなる群より選択されるポリペプチドをコードする遺伝子の発現量を増加させた、請求項５記載の改変スターメレラ属微生物。

【請求項7】

配列番号１で示される塩基配列からなる遺伝子と、配列番号３で示される塩基配列からなる遺伝子の発現量を増加させた、請求項５又は６記載の改変スターメレラ属微生物。

【請求項8】

ＧＡＰＤＨ、ＵＧＴＡ１、ＵＧＴＢ１、ＣＹＰ５２Ｍ１、ＰＨＯ１、ＧＡＬ１、ＧＡＬ１０、ＡＤＨ１、ＴＤＨ３、ＰＧＫ１、ＴＰＩ１、ＰＹＫ１、又はＴＥＦ１のプロモーターのいずれか１以上と連結された前記（Ａ）〜（Ｆ）のポリペプチドをコードする遺伝子を含むベクターまたは該遺伝子を含むＤＮＡ断片を、前記スターメレラ属微生物に導入した、請求項５〜７のいずれか１項記載の改変スターメレラ属微生物。

【請求項9】

スターメレラ属微生物が、スターメレラ ボンビコーラである請求項１〜８のいずれか１項記載の改変スターメレラ属微生物。

【請求項10】

請求項１〜９のいずれか１項記載の改変スターメレラ属微生物を培養する、アセチル化スフィンゴイドの製造方法。

【請求項11】

炭素数１５〜２０の脂肪酸又はそのアルキルエステル、炭素数１５〜２０の一価アルコール、及び炭素数１５〜２０のアルカンから選ばれる１種以上を培地に添加して前記改変スターメレラ属微生物を培養する、請求項１０記載のアセチル化スフィンゴイドの製造方法。

【請求項12】

炭素数１５〜２０の脂肪酸又はそのアルキルエステルが、ペンタデカン酸、ヘキサデカン酸、ヘプタデカン酸、オクタデカン酸、ノナデカン酸若しくはアラキジン酸又はそのエチルエステルであり、炭素数１５〜２０の一価アルコールが、１−ヘプタデカノール又は１−オクタデカノールであり、炭素数１５〜２０のアルカンが、ヘプタデカン又はオクタデカンである、請求項１１記載のアセチル化スフィンゴイドの製造方法。

【請求項13】

更に、非イオン性界面活性剤を培地に添加する、請求項１１又は１２記載のアセチル化スフィンゴイドの製造方法。

【請求項14】

非イオン性界面活性剤が、Ｔｗｅｅｎ８０（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート）である請求項１３記載のアセチル化スフィンゴイドの製造方法。

【請求項15】

スフィンゴイドの炭素鎖長が１８〜２０である請求項１０〜１４のいずれか１項記載のアセチル化スフィンゴイドの製造方法。

【請求項16】

アセチル化スフィンゴイドがアセチルフィトスフィンゴシンである請求項１０〜１５のいずれか１項記載のアセチル化スフィンゴイドの製造方法。

【請求項17】

アセチルフィトスフィンゴシンが、テトラアセチルフィトスフィンゴシン及び／又はトリアセチルフィトスフィンゴシンである請求項１６記載のアセチル化スフィンゴイドの製造方法。

【請求項18】

スターメレラ属微生物が、スターメレラ ボンビコーラである請求項１０〜１７のいずれか１項記載のアセチル化スフィンゴイドの製造方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、アセチル化スフィンゴイドを生産する改変スターメレラ属微生物、及び当該微生物を用いたアセチル化スフィンゴイドの製造方法に関する。

【背景技術】

【0002】

スフィンゴ脂質は、Ｌ-セリンとパルミトイル-ＣｏＡなどのアシル-ＣｏＡの縮合反応から始まる生合成により合成される。基本構造であるスフィンゴイド塩基として、スフィンゴシン、フィトスフィンゴシン、ジヒドロスフィンゴシン（スフィンガニン）、６−ヒドロキシスフィンゴシンなどがあり、主な炭素鎖長はＣ１８であることが知られている。これらスフィンゴイド塩基と脂肪酸がアミド結合することでセラミドが合成される。

【0003】

スフィンゴ脂質は多くの生理機能を有している。特にセラミドおよびスフィンゴイド塩基は皮膚の保湿機能、バリア機能に関与し、皮膚からの水分蒸散を防止し、外界からの様々な刺激から人体を守る役割を担っている。また、フィトスフィンゴシンは、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、化膿レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、ミクロコッカス菌 (Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｔｅｕｓ)、アクネ菌(Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｎｅｓ)、カンジダ症原因菌(Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ)、汗疱状白癬菌(Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｍｅｎｔａｇｒｏｐｈｙｔｅｓ)に対する増殖阻害効果が報告されており（非特許文献１、２）、とくにフィトスフィンゴシンのアクネ菌に対する抗菌効果はマクロライド系抗生物質の一つであるエリスロマイシンの効果よりも高いことが知られている（非特許文献３）。

【0004】

セラミドやスフィンゴイド塩基は、化粧によって補うことで皮膚性状を改善させる効果があることが知られ、また、フィトスフィンゴシンやそのアセチル化物であるテトラアセチルフィトスフィンゴシンは、皮膚に塗ると皮膚に浸透し、セラミドに転換されることが確認されている（特許文献１）。よって、セラミドやスフィンゴイド塩基又はフィトスフィンゴシンのアセチル化物は外用による皮膚性状改善効果、感染原因菌の増殖抑制効果が期待されている。

【0005】

動物および植物由来スフィンゴ脂質は分離精製が困難なため、近年、酵母による発酵を用いたスフィンゴ脂質の生産法の開発が進められている。候補酵母株として、ピチア シフェリイ(Ｐｉｃｈｉａ ｃｉｆｅｒｒｉｉ；現在はウィッカーハモミセス シフェリイ（Ｗｉｃｋｅｒｈａｍｏｍｙｃｅｓ ｃｉｆｅｒｒｉｉ））、カンジダ ユチリス(Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓ)およびサッカロミセス セレビシエ(Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ)が挙げられているが、テトラアセチルフィトスフィンゴシンを菌体外に分泌するウィッカーハモミセス シフェリイを利用してテトラアセチルフィトスフィンゴシンを得る方法の開発が積極的に進められている（特許文献２）。

【0006】

斯かるウィッカーハモミセス シフェリイにおけるテトラアセチルフィトスフィンゴシン合成の律速段階は、生合成経路のｉｎ ｖｉｔｒｏ解析より、セリンとパルミトイル−ＣｏＡの縮合反応及びフィトスフィンゴシンのアセチル化反応であることが明らかにされ（非特許文献４）ている。当該縮合反応は、セリンパルミトイルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．５０）により触媒されており、真核生物のセリンパルミトイルトランスフェラーゼは、ＬＣＢ１、ＬＣＢ２、ＴＳＣ３などのサブユニットから成る複合体でセリンとパルミトイル−ＣｏＡなどアシル−ＣｏＡとの縮合反応の中心的役割を担い、ＴＳＣ３が酵素活性の調節に寄与することが知られている（非特許文献５、非特許文献６）。一方、アセチル化酵素としてＳＬＩ１とＡＴＦ２の二つが見出されている。このうち、ＳＬＩ１は、サッカロマイセス セレビシエにおいて、これを発現させた場合にトリアセチルフィトスフィンゴシンを産生することから（非特許文献７）、フィトスフィンゴシンの３つの水酸基及び１つのアミノ基のうちの何れか３箇所のアセチル化に関与すると考えられている。

【0007】

一方、スターメレラ（Ｓｔａｒｍｅｒｅｌｌａ）属微生物、例えばスターメレラ ボンビコーラ（Ｓｔａｒｍｅｒｅｌｌａ ｂｏｍｂｉｃｏｌａ）、旧学名カンジダ ボンビコーラ（Ｃａｎｄｉｄａ ｂｏｍｂｉｃｏｌａ）は著量の糖脂質であるバイオサーファクタントを細胞外に生産でき、高い脂質利用性を有する微生物として知られている（非特許文献８）。しかし、該微生物によるセラミド又はスフィンゴ脂質の生産についてはほとんど知られていない。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0008】

【特許文献1】米国特許第５５７８６４１号明細書

【特許文献2】特表平９−５０４４３４号公報

【非特許文献】

【0009】

【非特許文献1】Bibel D.J. et. al., J. Invest. Dermatol., 98, 269, (1992)

【非特許文献2】Bibel D.J. et. al., Clin. Exper. Dermatol., 20, 395, (1995)

【非特許文献3】Park C. et. al., Fragrance journal, 10, 84, (1999)

【非特許文献4】Barenholz, Y. et. al., Biochim. Biophys. Acta, 306, 341, (1973)

【非特許文献5】Biochim. Biophys. Acta, 1632:16-30 (2003)

【非特許文献6】J. Biol. Chem., 275(11):7597-7603 (2000)

【非特許文献7】Veld, F. et. al., Appl. Microbiol, Biotechnol., in press (2013)

【非特許文献8】Udo R. et. al., Biotechnology Letters, 18(2), 149, (1996)

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0010】

本発明は、改変スターメレラ属微生物、特に改変スターメレラ ボンビコーラを用いたアセチル化スフィンゴイドを生産する手段を提供することに関する。

【課題を解決するための手段】

【0011】

本発明者らは、高い脂質利用性を有する微生物として知られているスターメレラ属微生物について検討したところ、該微生物はセラミド又はスフィンゴ脂質を利用可能な量で生産できないことが判明した。そして、更に検討した結果、スターメレラ属微生物において、セリンパルミトイルトランスフェラーゼの発現を強化し、且つウィッカーハモミセス シフェリイ由来のアセチルトランスフェラーゼＳＬＩ１をコードする遺伝子を導入した場合に、意外にも炭素鎖長Ｃ１８〜Ｃ２０のアセチル化スフィンゴイドを良好に生産でき、更に培地に特定の脂肪酸又はそのエステルを添加することにより、当該アセチル化スフィンゴイドの生産性が格段に向上することを見出した。

【0012】

すなわち、本発明は、以下の（１）〜（２）に係るものである。
（１）以下の（Ａ）〜（Ｆ）：
（Ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（Ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ（Ｄ）〜（Ｆ）のいずれかのポリペプチドと複合体を形成しセリンパルミトイルトランスフェラーゼ活性を発現するポリペプチド、
（Ｃ）配列番号２で示されるアミノ酸配列において、１〜複数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ（Ｄ）〜（Ｆ）のいずれかのポリペプチドと複合体を形成しセリンパルミトイルトランスフェラーゼ活性を発現するポリペプチド、
（Ｄ）配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（Ｅ）配列番号４で示されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかのポリペプチドと複合体を形成しセリンパルミトイルトランスフェラーゼ活性を発現するポリペプチド、
（Ｆ）配列番号４で示されるアミノ酸配列において、１〜複数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかのポリペプチドと複合体を形成しセリンパルミトイルトランスフェラーゼ活性を発現するポリペプチド、より選択されるポリペプチドの発現が強化され、且つ以下の（Ｇ）〜（Ｉ）：
（Ｇ）配列番号６で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（Ｈ）配列番号６で示されるアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸残基が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（Ｉ）配列番号６で示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド、から選ばれるアミノ酸配列からなり、且つアセチルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子が導入された改変スターメレラ属微生物。
（２）上記（１）の微生物を培養する、アセチル化スフィンゴイドの製造方法。

【発明の効果】

【0013】

本発明によれば、本来、セラミド又はスフィンゴ脂質を利用可能な量で生産できないスターメレラ属微生物を利用することにより、セラミド合成の中間体或いはセラミド前駆物質として有用なアセチル化スフィンゴイド、好ましくはアセチル化フィトスフィンゴシン、特にトリアセチルフィトスフィンゴシン及びテトラアセチルフィトスフィンゴシンを良好に製造することが可能となる。

【発明を実施するための形態】

【0014】

本明細書において、「アミノ酸配列間の同一性」とは、２つのアミノ酸配列をアラインメントしたときに両方の配列において同一のアミノ酸残基が存在する位置の数の全長アミノ酸残基数に対する割合（％）をいう。具体的には、リップマン−パーソン法（Lipman-Pearson法；Science, 227, 1435, (1985))によって計算され、遺伝情報処理ソフトウェアGenetyx-Win（Ｖｅｒ.５．１．１；ソフトウェア開発）のホモロジー解析（Search homology）プログラムを用いて、Unit size to compare（ktup）を２として解析を行なうことにより算出できる。

【0015】

「遺伝子」とは、二本鎖ＤＮＡのみならず、それを構成するセンス鎖およびアンチセンス鎖といった各一本鎖ＤＮＡを包含する趣旨であり、またその長さに何ら制限されるものではない。また、ポリヌクレオチドとしては、ＲＮＡ、ＤＮＡを例示でき、ＤＮＡは、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡを包含する。
また、本明細書では、アセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子をアセチルトランスフェラーゼ遺伝子ともいい、ＳＬＩ１をコードする遺伝子をＳＬＩ１遺伝子ともいう。

【0016】

本発明において、「１〜複数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列」の複数個とは、対象とするアミノ酸配列の全アミノ酸残基の２０％以下の個数、好ましくは１５％以下の個数、より好ましくは１０％以下の個数、さらに好ましくは５％以下、さらにより好ましくは２％以下の個数が挙げられる。
また、「１〜複数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列」の複数個とは、対象とする塩基配列の全塩基の２０％以下の個数、好ましくは１５％以下の個数、より好ましくは１０％以下の個数、さらに好ましくは５％以下の個数、さらにより好ましくは２％以下の個数が挙げられる。

【0017】

また、本明細書において、「相当する位置」または「相当する領域」は、目的アミノ酸配列を参照配列（配列番号２または４で示されるアミノ酸配列）と比較し、各アミノ酸配列中に存在する保存アミノ酸残基に最大の相同性を与えるように配列を整列（アラインメント）させることにより決定することができる。アラインメントは、公知のアルゴリズムを用いて実行することができ、その手順は当業者に公知である。例えば、アラインメントは、上述のリップマン−パーソン法等に基づいて手作業で行うこともできるが、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗマルチプルアラインメントプログラム（Thompson, J. D. et al, 1994, Nucleic Acids Res. 22:4673-4680）をデフォルト設定で用いることにより行うことができる。Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗは、例えば、欧州バイオインフォマティクス研究所（European Bioinformatics Institute: EBI [www.ebi.ac.uk/index.html]）や、国立遺伝学研究所が運営する日本ＤＮＡデータバンク（DDBJ [www.ddbj.nig.ac.jp/Welcome-j.html]）のウェブサイト上で利用することができる。

【0018】

本明細書において、ポリペプチドまたは遺伝子の「発現強化」または「発現量の増加」とは、当該強化または増加前に比較して、目的のポリペプチドまたは遺伝子の発現を強くすること、または発現量を増加させることを意味する。

【0019】

本発明において、遺伝子改変の対象となるスターメレラ属微生物は、スフィンゴイド、少なくともフィトスフィンゴシンを生産する代謝系を有するものであればよく、例えば、スターメレラ ボンビコーラ、キャンディダ アルビカンス、キャンディダ グラブラーラ等が挙げられ、このうちスターメレラ ボンビコーラが好ましい。具体的には、スターメレラ ボンビコーラ ＫＳＭ３６株（特開昭６１-３１０８４）又はＮＢＲＣ１０２４３株等が挙げられる。斯かるスターメレラ ボンビコーラは、ソホロリピッド（ＳＬ）を生産することが知られているが（非特許文献６）、アセチル化スフィンゴイド生産能は有さない。

【0020】

本発明において、「スフィンゴイド」としては、下記の基：

【0021】

【化1】

【0022】

を有する炭素鎖長が１８〜２０の長鎖アミノアルコールが挙げられ、例えば、炭素鎖長が１８のスフィンゴイドとしては（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）−２−アミノオクタデカン−１，３，４−トリオール（フィトスフィンゴシン）、（２Ｓ，３Ｒ，４Ｅ）−２−アミノ−４−オクタデセン−１，３−ジオール（スフィンゴシン）、（２Ｓ，３Ｒ）−２−アミノオクタデカン−１，３−ジオール（スフィンガニン）、炭素鎖長が１９のスフィンゴイドとしては（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）−２−アミノノナデカン−１，３，４−トリオール（Ｃ１９フィトスフィンゴシン）、（２Ｓ，３Ｒ，４Ｅ）−２−アミノ−４−ノナデセン−１，３−ジオール（Ｃ１９スフィンゴシン）、（２Ｓ，３Ｒ）−２−アミノノナデカン−１，３−ジオール（Ｃ１９スフィンガニン）、炭素鎖長が２０のスフィンゴイドとしては（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）−２−アミノイコサン−１，３，４−トリオール（Ｃ２０フィトスフィンゴシン）、（２Ｓ，３Ｒ，４Ｅ）−２−アミノ−４−イコセン−１，３−ジオール（Ｃ２０スフィンゴシン）、（２Ｓ，３Ｒ）−２−アミノイコサン−１，３−ジオール（Ｃ２０スフィンガニン）などが挙げられ、このうち炭素鎖長が１８〜２０のフィトスフィンゴシンが好ましく、炭素鎖長が１９又は２０のフィトスフィンゴシンがより好ましく、炭素鎖長が２０のフィトスフィンゴシンがさらに好ましい。

【0023】

本発明において、「アセチル化スフィンゴイド」としては、スフィンゴイドが有するアセチル化可能な基（水酸基、アミノ基等）の水素原子の何れか１以上がアセチル基で置換された化合物を意味する。例えば、アセチル化フィトスフィンゴシン、アセチル化スフィンゴシンン、アセチル化スフィンガニンなどが挙げられる。このうち、フィトスフィンゴシンの３つの水酸基及び１つのアミノ基の水素原子の何れか１以上がアセチル基で置換されたアセチル化フィトスフィンゴシンが好ましく、このうち、何れか３箇所がアセチル化されたトリアセチルフィトスフィンゴシン又は４箇所がアセチル化されたテトラアセチルフィトスフィンゴシンがより好ましい。

【0024】

本発明の改変微生物は、スターメレラ属微生物において、スターメレラ ボンビコーラ由来のセリンパルミトイルトランスフェラーゼサブユニットまたはそれに相当するポリペプチドの発現が強化される。

【0025】

ここで、「セリンパルミトイルトランスフェラーゼ」とは、セリンパルミトイルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質またはポリペプチドであり、「セリンパルミトイルトランスフェラーゼサブユニット」とは、複数のサブユニットが複合体を形成しセリンパルミトイルトランスフェラーゼ活性を発現する限りにおいて、全長タンパク質、またはその部分ポリペプチドを含み得る。
ここで、「セリンパルミトイルトランスフェラーゼ活性」とは、Ｌ−セリンとパルミトイル−ＣｏＡなどのアシル−ＣｏＡとの縮合反応を触媒する活性であり得る。「セリンパルミトイルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質またはポリペプチド」とは、Ｌ−セリンとパルミトイル−ＣｏＡなどのアシル−ＣｏＡとの縮合反応による３−ケトスフィンガニンの生産を触媒するタンパク質またはポリペプチド、あるいは複数のタンパク質またはポリペプチドからなる複合体であり得る。タンパク質、ポリペプチドまたはこれらの複合体のセリンパルミトイルトランスフェラーゼ活性は、それらにより生成されるセラミド前駆体（例えば３−ケトスフィンガニン、スフィンガニンなど）を測定することで決定することができる。例えば、一定の条件においてＬ−セリンと、パルミトイル−ＣｏＡと、あるタンパク質との存在下で生成されるセラミド前駆体を測定することにより、当該タンパク質がセリンパルミトイルトランスフェラーゼ活性を有すると判断できる。生成されるセラミド前駆体の量は、反応液からセラミド前駆体を抽出し、高速液体クロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィーなどに供することによって測定することができる。また、基質に放射性同位体を使用すれば、生成物の放射性同位体量を定量することによって生成されるセラミド前駆体の量を測定することができる。例えば、細胞培養液からのセラミド前駆体の抽出には、クロロホルム、メタノール、アセトンなどの有機溶媒を使用することができる。

【0026】

発現強化されるスターメレラ ボンビコーラ由来のセリンパルミトイルトランスフェラーゼサブユニットとしては、（Ａ）：配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドが挙げられる。上記配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、公知のセリンパルミトイルトランスフェラーゼサブユニットとの配列同一性は低いにもかかわらず、セリンパルミトイルトランスフェラーゼのサブユニットＬＣＢ１として機能するポリペプチドである。つまり、後述の（Ｄ）〜（Ｆ）のいずれかのポリペプチドと複合体を形成してセリンパルミトイルトランスフェラーゼ活性を発現することができる。配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドはスターメレラ ボンビコーラ、例えばスターメレラ ボンビコーラ ＮＢＲＣ１０２４３またはスターメレラ ボンビコーラ ＫＳＭ３６株（ＦＥＲＭ ＢＰ−７９９）などから取得することができる。

【0027】

別の実施形態において、本発明で発現強化されるセリンパルミトイルトランスフェラーゼサブユニットとしては、（Ｂ）：配列番号２で示されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ後述の（Ｄ）〜（Ｆ）のいずれかのポリペプチドと複合体を形成しセリンパルミトイルトランスフェラーゼ活性を発現するポリペプチドが挙げられる。好ましい実施形態において、上記（Ｂ）のポリペプチドは、配列番号２で示されるアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらにより好ましくは９８％以上の配列同一性を有する。

【0028】

また別の実施形態において、本発明で発現強化されるセリンパルミトイルトランスフェラーゼサブユニットとしては、（Ｃ）：配列番号２で示されるアミノ酸配列において、１〜複数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ後述の（Ｄ）〜（Ｆ）のいずれかのポリペプチドと複合体を形成しセリンパルミトイルトランスフェラーゼ活性を発現するポリペプチドが挙げられる。ここで、当該複数個とは、前述で定義したとおりであるが、より具体的な例としては１００個、好ましくは７５個、より好ましくは５０個、さらに好ましくは２５個、さらにより好ましくは１０個であり得る。

【0029】

好ましくは、上記（Ａ）〜（Ｃ）のポリペプチドにおいて、配列番号２の１６３位、またはそれに相当する位置のアミノ酸残基はシステインである。上記システイン残基は、上述した公知のセリンパルミトイルトランスフェラーゼＬＣＢ１サブユニットのポリペプチドにおいて高度に保存されているアミノ酸残基である。

【0030】

さらに別の実施形態において、本発明で発現強化されるセリンパルミトイルトランスフェラーゼサブユニットとしては、（Ｄ）：配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドが挙げられる。上記配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、公知のセリンパルミトイルトランスフェラーゼサブユニットとの配列同一性は低いにもかかわらず、セリンパルミトイルトランスフェラーゼのサブユニットＬＣＢ２として機能するポリペプチドである。つまり、前述の（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかのポリペプチドと複合体を形成してセリンパルミトイルトランスフェラーゼ活性を発現することができる。配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、スターメレラ ボンビコーラ、例えばスターメレラ ボンビコーラ ＮＢＲＣ１０２４３またはスターメレラ ボンビコーラ ＫＳＭ３６株（ＦＥＲＭ ＢＰ−７９９）などから取得することができる。

【0031】

さらにまた別の実施形態において、本発明で発現強化されるセリンパルミトイルトランスフェラーゼサブユニットとしては、（Ｅ）：配列番号４で示されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ上記（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかのポリペプチドと複合体を形成しセリンパルミトイルトランスフェラーゼ活性を発現するポリペプチドが挙げられる。好ましい実施形態において、上記（Ｅ）のポリペプチドは、配列番号４で示されるアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらにより好ましくは９８％以上の配列同一性を有する。

【0032】

さらに別の実施形態において、本発明で発現強化されるセリンパルミトイルトランスフェラーゼサブユニットとしては、（Ｆ）：配列番号４で示されるアミノ酸配列において、１〜複数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ上記（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかのポリペプチドと複合体を形成しセリンパルミトイルトランスフェラーゼ活性を発現するポリペプチドが挙げられる。ここで、当該複数個とは、前述で定義したとおりであるが、より具体的な例としては１１５個、好ましくは８６個、より好ましくは５７個、さらに好ましくは２８個、さらにより好ましくは１１個であり得る。

【0033】

好ましくは、上記（Ｄ）〜（Ｆ）のポリペプチドは、ピリドキサール−５’−リン酸結合モチーフ（ＧＴ（Ｆ／Ｌ）ＴＫＳＦＧ）を有する。より好ましくは、当該（Ｄ）〜（Ｆ）のポリペプチドにおけるピリドキサール−５’−リン酸結合モチーフは、配列番号４の３８１位から３８８位、またはそれに相当する領域に存在する。当該ピリドキサール−５’−リン酸結合モチーフは、上述した公知のセリンパルミトイルトランスフェラーゼＬＣＢ２サブユニットのポリペプチドにおいて高度に保存されている。

【0034】

本発明において発現を強化されるセリンパルミトイルトランスフェラーゼサブユニットは、上記（Ａ）〜（Ｆ）からなる群より選択されるポリペプチドのいずれか１つを含み得る。すなわち、本発明において発現を強化されるセリンパルミトイルトランスフェラーゼサブユニットは、上記（Ａ）〜（Ｆ）のポリペプチドのうちのいずれか１つであってもよく、または上記（Ａ）〜（Ｆ）のポリペプチドのうちの２つ以上の組み合わせであってもよい。

【0035】

組み合わせの例としては、上記（Ａ）〜（Ｃ）のポリペプチドのうちのいずれか２つ以上の組み合わせ；上記（Ｄ）〜（Ｆ）のポリペプチドのうちのいずれか２つ以上の組み合わせ；上記（Ａ）〜（Ｃ）のポリペプチドのうちのいずれか１つと、上記（Ｄ）〜（Ｆ）のポリペプチドのうちのいずれか１つとの組み合わせ；上記（Ａ）〜（Ｃ）のポリペプチドのうちのいずれか１つ以上と、上記（Ｄ）〜（Ｆ）のポリペプチドのうちのいずれか１つ以上との組み合わせ、などが挙げられる。このうち、上記（Ａ）〜（Ｃ）のポリペプチドのうちのいずれか１つと上記（Ｄ）〜（Ｆ）のポリペプチドのうちのいずれか１つとの組み合わせが好ましい。

【0036】

本発明において発現を強化されるセリンパルミトイルトランスフェラーゼサブユニットの好ましい例としては、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるセリンパルミトイルトランスフェラーゼサブユニット、配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるセリンパルミトイルトランスフェラーゼサブユニット、およびそれらの組み合わせが挙げられる。

【0037】

上記（Ａ）〜（Ｆ）から選択されるポリペプチドの発現を、スターメレラ ボンビコーラにおいて強化するためには、当該スターメレラ ボンビコーラにおける当該ポリペプチドをコードする遺伝子の発現量を増加させればよい。該遺伝子の発現量を増加させる方法としては、例えば、高発現制御領域の制御下に配置した当該（Ａ）〜（Ｆ）のポリペプチドをコードする遺伝子を含むベクターをスターメレラ ボンビコーラに導入するか、当該（Ａ）〜（Ｆ）のポリペプチドをコードする遺伝子の複数コピーをスターメレラ ボンビコーラのゲノムに導入するか、または、スターメレラ ボンビコーラに内在するセリンパルミトイルトランスフェラーゼサブユニットをコードする遺伝子の発現制御領域を野生型に比較して高発現となる発現制御領域に改変して、該遺伝子の発現を高度に誘導させる方法、さらには上記方法を組み合わせる方法などを挙げることができる。

【0038】

本発明において発現量を増加させるべき上記（Ａ）〜（Ｆ）のポリペプチドをコードする遺伝子の例としては、（ａ）：配列番号１で示される塩基配列からなる遺伝子、および（ｄ）：配列番号３で示される塩基配列からなる遺伝子が挙げられる。配列番号１で示される塩基配列からなる遺伝子、および配列番号３で示される塩基配列からなる遺伝子は、それぞれ、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるセリンパルミトイルトランスフェラーゼサブユニット（ポリペプチド（Ａ））、および配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるセリンパルミトイルトランスフェラーゼサブユニット（ポリペプチド（Ｄ））をコードしている。

【0039】

本発明において発現量を増加させるべき遺伝子の別の例としては、（ｂ）：配列番号１で示される塩基配列と８０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、且つセリンパルミトイルトランスフェラーゼサブユニットの機能を保持するポリペプチド（Ｂ）をコードする遺伝子が挙げられる。好ましい実施形態において、当該遺伝子（ｂ）は、配列番号１で示される塩基配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらにより好ましくは９８％以上の配列同一性を有する塩基配列からなる。

【0040】

本発明において発現量を増加させるべき遺伝子のまた別の例としては、（ｃ）：配列番号１で示される塩基配列において１〜複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、且つセリンパルミトイルトランスフェラーゼサブユニットの機能を保持するポリペプチド（Ｃ）をコードする遺伝子が挙げられる。ここで、当該複数個とは、前述で定義したとおりであるが、より具体的な例としては３０５個、好ましくは２２９個、より好ましくは１５２個、さらに好ましくは７６個、さらにより好ましくは３０個であり得る。

【0041】

本発明において発現量を増加させるべき遺伝子のさらなる例としては、（ｅ）：配列番号３で示される塩基配列と８０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、且つセリンパルミトイルトランスフェラーゼサブユニットの機能を保持するポリペプチド（Ｅ）をコードする遺伝子が挙げられる。好ましい実施形態において、本発明の遺伝子はまた、配列番号３で示される塩基配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらにより好ましくは９８％以上の配列同一性を有する塩基配列からなる。

【0042】

本発明において発現量を増加させるべき遺伝子のさらなる例としては、（ｆ）：配列番号３で示される塩基配列において１〜複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、且つセリンパルミトイルトランスフェラーゼサブユニットの機能を保持するポリペプチド（Ｆ）をコードする遺伝子が挙げられる。ここで、当該複数個とは、前述で定義したとおりであるが、より具体的な例としては３４６個、好ましくは２５９個、より好ましくは１７３個、さらに好ましくは８６個、さらにより好ましくは３４個であり得る。

【0043】

上記（ａ）〜（ｃ）の遺伝子は、好ましくは、配列番号２の１６３位、またはそれに相当する位置のアミノ酸残基がシステインであるポリペプチドをコードしている。
上記（ｄ）〜（ｆ）の遺伝子は、好ましくは、ピリドキサール−５’−リン酸結合モチーフ（ＧＴ（Ｆ／Ｌ）ＴＫＳＦＧ）を有するポリペプチドをコードしている。より好ましくは、当該ピリドキサール−５’−リン酸結合モチーフが配列番号４の３８１位から３８８位、またはそれに相当する領域に存在するポリペプチドをコードしている。

【0044】

本発明において上記（Ａ）〜（Ｆ）から選択されるポリペプチドの発現を強化する場合、上記（ａ）〜（ｆ）からなる群より選択される遺伝子のいずれか１つ、または上記（ａ）〜（ｆ）の遺伝子のうちいずれか２つ以上の組み合わせの発現量を増加させればよい。

【0045】

組み合わせの例としては、上記（ａ）〜（ｃ）の遺伝子のうちのいずれか２つ以上の組み合わせ；上記（ｄ）〜（ｆ）の遺伝子のうちのいずれか２つ以上の組み合わせ；上記（ａ）〜（ｃ）の遺伝子のうちのいずれか１つと、上記（ｄ）〜（ｆ）の遺伝子のうちのいずれか１つとの組み合わせ；上記（ａ）〜（ｃ）の遺伝子のうちのいずれか１つ以上と、上記（ｄ）〜（ｆ）の遺伝子のうちのいずれか１つ以上との組み合わせ、などが挙げられる。このうち、上記（ａ）〜（ｃ）の遺伝子のうちのいずれか１つと上記（ｄ）〜（ｆ）の遺伝子のうちのいずれか１つとの組み合わせが好ましい。

【0046】

本発明において発現量を増加させるべき遺伝子の好ましい例としては、配列番号１で示される塩基配列からなるセリンパルミトイルトランスフェラーゼサブユニットをコードする遺伝子、配列番号３で示される塩基配列からなるセリンパルミトイルトランスフェラーゼサブユニットをコードする遺伝子、およびそれらの組み合わせが挙げられる。

【0047】

上記（Ａ）〜（Ｆ）から選択されるポリペプチドをコードする遺伝子は、スターメレラ
ボンビコーラ、例えばスターメレラ ボンビコーラ（ＮＢＲＣ１０２４３）またはスターメレラ ボンビコーラ ＫＳＭ３６株（ＦＥＲＭ ＢＰ−７９９）などから、当該分野で用いられる任意の方法を用いて単離することができる。例えば、上記（ａ）および（ｄ）の遺伝子は、スターメレラ ボンビコーラの全ゲノムＤＮＡを抽出した後、配列番号１または３の塩基配列を元に設計したプライマーを用いたＰＣＲにより標的遺伝子を選択的に増幅し、増幅した遺伝子を精製することで得ることができる。あるいは、上記（ａ）および（ｄ）の遺伝子は、配列番号２または４で示されるセリンパルミトイルトランスフェラーゼサブユニットのアミノ酸配列に基づいて、遺伝子工学的または化学的に合成することができる。

【0048】

上記（ｂ）、（ｃ）、（ｅ）、（ｆ）の遺伝子は、（ａ）または（ｄ）の塩基配列を有する微生物を紫外線照射や薬剤処理による突然変異導入のような公知の突然変異導入法により変異を導入した後、遺伝子を単離することによって作製することができる。または、予め単離または合成された遺伝子（ａ）または（ｄ）の塩基配列に対して、点変異導入やランダム変異導入のような公知の変異導入法により変異を導入することによっても作製することができる。例えば、当該遺伝子は、配列番号１または３で示される塩基配列に公知の方法で変異導入し、得られた塩基配列を発現させてセリンパルミトイルトランスフェラーゼ活性を調べ、所望のセリンパルミトイルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を選択することによって、得ることができる。

【0049】

上記（Ａ）〜（Ｆ）から選択されるポリペプチドをコードする遺伝子（例えば、上記（ａ）〜（ｆ）の遺伝子）を含むベクターは、当該遺伝子をベクターに導入することによって作製することができる。当該遺伝子を導入すべきベクターの種類としては、特に限定されず、タンパク質産生に通常用いられるベクター、例えばプラスミド、コスミド、ファージ、ウイルス、ＹＡＣ、ＢＡＣなどが挙げられる。このうち、プラスミドベクターが好ましく、タンパク質の高発現を誘導するプラスミドベクターがより好ましい。当業者は、宿主細胞の種類にあわせて、好適なベクターを選択することができる。タンパク質発現用プラスミドベクターは、宿主に応じて作製してもよいが、市販品を使用してもよい。

【0050】

上記ベクターにおいては、上記（Ａ）〜（Ｆ）から選択されるポリペプチドをコードする遺伝子の上流に、当該遺伝子の転写を開始させるためのプロモーター領域などの制御配列が作動可能に連結されていてもよい。あるいは、当該ベクターが適切に導入された細胞を選択するためのマーカー（薬剤耐性遺伝子や栄養要求性相補遺伝子など）がさらに組み込まれていてもよい。本明細書において、遺伝子と制御配列が「作動可能に連結されている」とは、当該制御領域による制御の下に発現し得るように当該遺伝子が配置されていることをいう。当該制御配列の例としては、グリセルアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）のプロモーター、酸性ホスファターゼ（ＰＨＯ１）のプロモーター、ガラクトキナーゼ（ＧＡＬ１）のプロモーター、アルドース−１−エピメラーゼ（ＧＡＬ１０）のプロモーター、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ１）のプロモーターなどの、後述する宿主細胞において発現量の多い遺伝子のプロモーターが挙げられる。上記各プロモーターは酵母由来のプロモーターが好ましく、スターメレラ ボンビコーラ、ウィッカーハモミセス シフェリ（Ｗｉｃｋｅｒｈａｍｏｍｙｃｅｓ ｃｉｆｅｒｒｉｉ）、およびサッカロマイセス セレビシエ由来のプロモーターがより好ましく、スターメレラ ボンビコーラ由来のプロモーターがさらに好ましい。

【0051】

上記宿主細胞において発現量の多い遺伝子のプロモーターとしては、上述した制御配列の例に挙げたプロモーターに加えて、トリオースリン酸デヒドロゲナーゼ（ＴＤＨ３）のプロモーター、３−ホスホグリセレートキナーゼ（ＰＧＫ１）のプロモーター、トリオースリン酸イソメラーゼ（ＴＰＩ１）のプロモーター、翻訳伸長因子（ＴＥＦ１）のプロモーター、ピルビン酸キナーゼ（ＰＹＫ１）のプロモーター、Ｐ４５０（ＣＹＰ５２Ｍ１）のプロモーター、ＵＤＰグルコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴＡ１、ＵＧＴＢ１）のプロモーターなどが挙げられる。上記各プロモーターは各遺伝子を有する酵母由来のプロモーターが好ましく、スターメレラ ボンビコーラ、ウィッカーハモミセス シフェリ、およびサッカロマイセス セレビシエ由来のプロモーターがより好ましく、スターメレラ ボンビコーラ由来のプロモーターがさらに好ましい。

【0052】

上記（Ａ）〜（Ｆ）から選択されるポリペプチドをコードする遺伝子（例えば、上記（ａ）〜（ｆ）の遺伝子）を宿主細胞のゲノムに導入する方法としては、特に限定されないが、例えば、ＳＯＥ（splicing by overhang extension）−ＰＣＲ法（Gene, 77, 61, 1989）等により調製された当該遺伝子を含むＤＮＡ断片を用いた二重交差法が挙げられる。当該遺伝子を含むＤＮＡ断片は、上述する宿主細胞において発現量の多い遺伝子のプロモーター配列の下流に導入されてもよく、あるいは、予め当該遺伝子を含むＤＮＡ断片と当該プロモーター配列とを作動可能に連結した断片を作製し、当該断片を宿主のゲノムに導入してもよい。さらに、当該遺伝子を含むＤＮＡ断片はまた、当該遺伝子が適切に導入された細胞を選択するためのマーカー（薬剤耐性遺伝子や栄養要求性相補遺伝子など）と予め連結されていてもよい。

【0053】

上記（Ａ）〜（Ｆ）から選択されるポリペプチドをコードする遺伝子またはそれを含むベクターをスターメレラ ボンビコーラに導入する手段としては、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法、酢酸リチウム法、熱処理法など、通常使用されるいずれの方法でも用いることができる。

【0054】

セリンパルミトイルトランスフェラーゼサブユニットをコードする遺伝子を内在的に有するスターメレラ ボンビコーラにおいては、当該遺伝子（例えば、上記（ａ）または（ｄ）の遺伝子）の上流に、野生型または発現強化前に比較して発現量を多くできるプロモーター、例えば上述した宿主細胞において発現量の多い遺伝子のプロモーター、を導入し、該遺伝子と作動可能に連結することにより、当該内在的遺伝子の発現量を増加させることもできる。これに加えて、さらに上述したように、上記（Ａ）〜（Ｆ）から選択されるポリペプチドをコードする遺伝子を外部から導入してもよい。

【0055】

上記（Ａ）〜（Ｆ）から選択されるポリペプチドをコードする遺伝子の発現を増加させ方法の好ましい例としては、上記（ａ）〜（ｃ）として例示した遺伝子または上記（ｄ）〜（ｆ）として例示した遺伝子を上記ＧＡＰＤＨのプロモーターの下流に連結する方法、当該（ａ）〜（ｃ）の遺伝子と当該（ｄ）〜（ｆ）の遺伝子を両方とも上記ＧＡＰＤＨのプロモーターの下流に連結する方法、当該（ａ）〜（ｃ）の遺伝子と当該（ｄ）〜（ｆ）の遺伝子のぞれぞれの上流にＧＡＰＤＨプロモーターを連結する方法、当該（ａ）〜（ｃ）の遺伝子を上記ＧＡＰＤＨのプロモーターの下流に連結し、且つ当該（ｄ）〜（ｆ）の遺伝子を上記ＴＤＨ３のプロモーターの下流に連結する方法などにより、これらの遺伝子を過剰発現させるベクターを構築するか、またはこれらの遺伝子が過剰発現するようにゲノムを改変する方法を挙げることができる。遺伝子の種類とプロモーターの組み合わせは、上記（Ａ）〜（Ｆ）から選択されるポリペプチドの発現が強化できればどのような組み合わせでも良い。また上記（ａ）〜（ｃ）の遺伝子を含むベクターと、上記（ｄ）〜（ｆ）の遺伝子を含む別のベクターは、それぞれ別個に構築してもよく、１つのベクターとして構築してもよい。

【0056】

上記（Ａ）〜（Ｆ）から選択されるセリンパルミトイルトランスフェラーゼをコードする遺伝子が適切に導入されたスターメレラ ボンビコーラは、当該遺伝子とともに薬剤耐性遺伝子や栄養要求性相補遺伝子などのマーカー遺伝子を導入すれば、当該マーカー遺伝子の発現を指標として選択することができ、あるいは、当該遺伝子の機能を欠損したスターメレラ ボンビコーラに当該遺伝子を導入すれば、フィトスフィンゴシンを添加しない培地での生育を指標として選抜することができる。

【0057】

以上の方法により、スターメレラ ボンビコーラ由来のセリンパルミトイルトランスフェラーゼサブユニットを発現強化したスターメレラ属微生物を得ることができる。

【0058】

本発明においては、更に、アセチルトランスフェラーゼ遺伝子が当該スターメレラ属微生物に導入される。斯かる遺伝子は、ウィッカーハモミセス シフェリイから見出され、ＳＬＩ１と命名されたアセチルトランスフェラーゼ、並びに当該ポリペプチドから演繹されるポリペプチド、具体的には、以下の（Ｇ）〜（Ｉ）から選ばれるアミノ酸配列からなり、且つアセチルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子が挙げられる。
（Ｇ）配列番号６で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（Ｈ）配列番号６で示されるアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸残基が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（Ｉ）配列番号６で示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド

【0059】

ここで、配列番号６で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、ウィッカーハモミセス シフェリイ由来のＳＬＩ１であり、アセチルトランスフェラーゼ活性、好適にはスフィンゴイド、好ましくはフィトスフィンゴシンに対するアセチル化活性を有する。

【0060】

また、（Ｈ）のポリペプチドにおいて、１〜数個とは１〜８８個、好ましくは１〜６６個、さらに好ましくは１〜４４個、さらに好ましくは１〜２２個、さらにより好ましくは８個である。

【0061】

さらに、（Ｉ）の配列番号６で示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列としては、配列番号６で示されるアミノ酸配列において相当する配列を適切にアライメントした時、配列番号６で示されるアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらにより好ましくは９８％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を意味する。
また（Ｇ）〜（Ｉ）のポリペプチドをコードする遺伝子は、アミノ酸配列が（Ｇ）〜（Ｉ）に該当する限り、いかなるコドンを選択してもよい。例えば、スターメレラ属微生物に適したコドンを選択することが好ましい。

【0062】

（Ｈ）及び（Ｉ）のホリペプチドをコードする遺伝子としては、例えば、（ｈ）配列番号５で示される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなり、且つアセチルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチド（Ｈ）をコードする遺伝子、（ｉ）配列番号５で示される塩基配列と８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、且つアセチルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチド（Ｉ）をコードする遺伝子が挙げられる。この場合、１〜数個とは１〜２６５個、好ましくは１〜１９８個、より好ましくは１〜１３２個、さらに好ましくは１〜６６個、さらにより好ましくは２６個である。また、８０％以上の配列同一性としては、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらにより好ましくは９８％以上である。

【0063】

アセチルトランスフェラーゼ活性としては、具体的にはスフィンゴイドに対するアセチル化反応を触媒する活性が挙げられ、好ましくはフィトスフィンゴシンに対するアセチル化反応を触媒する活性、具体的にはフィトスフィンゴシンの３つの水酸基及び１つのアミノ基のうちの３箇所以上をアセチル化する反応を触媒する活性が挙げられる。

【0064】

（Ｇ）のポリペプチドをコードする遺伝子は、配列番号５で示される塩基配列を参考にプライマーを作製し、ウィッカーハモミセス シフェリイのＤＮＡをテンプレートとする常法のＰＣＲ法で容易に得ることができる。
すなわち、例えば、配列番号５に示すＳＬＩ１遺伝子のＮ末端開始コドンを含む配列からなるオリゴヌクレオチドＡ、及び該遺伝子の終始コドンを含む配列と相補的な配列からなるオリゴヌクレオチドＢを化学合成し、これらのオリゴヌクレオチドＡとＢを１セットにし、ウィッカーハモミセス シフェリイのＤＮＡをテンプレートとしてＰＣＲ反応を行なうことにより得ることができる。また、こうして得られる遺伝子断片を効率よくプラスミドベクター等にクローニングを行なうために、オリゴヌクレオチドプライマーの５’末端側に制限酵素切断のための配列を付加して用いることもできる。ここで、プライマーとしては、ＳＬＩ１遺伝子の塩基配列に関する情報をもとにして化学合成されたヌクレオチド等が一般的に使用できるが、既に取得されたＳＬＩ１遺伝子やその断片も良好に利用できる。当該ヌクレオチドとしては、配列番号５に対応する部分ヌクレオチド配列であって、１０〜５０個の連続した塩基、好ましくは１５〜３５個の連続した塩基等が挙げられる。
また、ＰＣＲの条件は、例えば９８℃２分、（９８℃１０秒、５５℃５秒、７２℃１分）×３０サイクルが挙げられる。

【0065】

また、その当該塩基配列又はアミノ酸配列に従い、ＤＮＡ合成機により人工的に合成して得ることもできる。ＤＮＡ合成に際しては、同一のアミノ酸残基であっても、異なるコドンを選択（コドン変換）することができる。前記コドン変換したＤＮＡの一態様として、ウィッカーハモミセス シフェリイのＳＬＩ１をコードするＤＮＡ中に存在するスターメレラ属微生物におけるレアコドン（当該微生物におけるコドンの使用頻度が少ないもの）を、コードするアミノ酸を同一のまま、スターメレラ属微生物の翻訳機構において利用頻度が高いコドンに変換したＤＮＡが挙げられ、具体的には、配列番号７で示される塩基配列からなるＤＮＡが挙げられる。

【0066】

上記（Ｈ）、（Ｉ）のポリペプチドをコードする遺伝子は、上記の手順で単離または合成された遺伝子の塩基配列に対して、公知の変異導入法により変異を導入することによって、作製することができる。例えば、当該遺伝子は、配列番号５で示される塩基配列に公知の方法で変異導入し、得られた塩基配列を発現させてアセチルトランスフェラーゼ活性を調べ、所望のアセチルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を選択することによって、得ることができる。

【0067】

本発明において、アセチルトランスフェラーゼ遺伝子のスターメレラ属微生物への導入は、上記のアセチルトランスフェラーゼ遺伝子を宿主微生物に発現可能なように導入すればよい。例えば、上述したスターメレラ ボンビコーラ由来のセリンパルミトイルトランスフェラーゼサブユニットまたはそれに相当するポリペプチドの発現が強化されたスターメレラ属微生物に対して、上記のアセチルトランスフェラーゼ遺伝子を発現可能に導入する方法が挙げられる。

【0068】

当該遺伝子を発現可能に導入する方法としては、特に限定されず、（ａ）〜（ｆ）の遺伝子を導入する方法として既述した方法が採用できる。例えば、上記のアセチルトランスフェラーゼ遺伝子を含む核酸断片であって、その上流側で、転写開始制御領域若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位を含むＤＮＡ断片と適正な形で結合している核酸断片を導入すればよい。
このような断片は、（１）そのまま核酸断片として、あるいはプラスミドベクター等に導入された核酸断片として導入すること、（２）その両端に宿主が有する染色体の一部配列からなる核酸断片が付加された核酸断片として導入すること、により宿主微生物に遺伝的に安定に保持させることができる。導入する遺伝子のコピー数は何ら限定されず、シングルコピーで当該遺伝子を導入しても良いし、マルチコピーで当該遺伝子を導入しても良い。
（１）の核酸断片の宿主微生物内への導入方法としては、エレクトロポレーション法、酢酸リチウム法等が挙げられる。
また、（２）の断片を導入すれば、核酸断片に付加された宿主染色体が有する配列に相当する部位において相同組換えが起こり、導入した核酸断片が微生物内の染色体に組み込まれる。

【0069】

尚、アセチルトランスフェラーゼ遺伝子の上流に結合する転写開始制御領域若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位としては、宿主微生物において機能を有するものであればよく、例えば、アセチルトランスフェラーゼ遺伝子の本来の転写開始制御領域若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位、又はその他の公知の転写開始制御領域若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位が挙げられる。例えば、グリセルアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）のプロモーター、酸性ホスファターゼ（ＰＨＯ１）のプロモーター、ガラクトキナーゼ（ＧＡＬ１）のプロモーター、アルドース−１−エピメラーゼ（ＧＡＬ１０）のプロモーター、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）のプロモーター、トリオースリン酸デヒドロゲナーゼ（ＴＤＨ３）のプロモーター、３−ホスホグリセレートキナーゼ（ＰＧＫ１）のプロモーター、トリオースリン酸イソメラーゼ（ＴＰＩ１）のプロモーター、翻訳伸長因子（ＴＥＦ１）のプロモーター、ピルビン酸キナーゼ（ＰＹＫ１）のプロモーター、Ｐ４５０（ＣＹＰ５２Ｍ１）のプロモーター、ＵＤＰグルコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴＡ１、ＵＧＴＢ１）のプロモーターを使用することができる。

【0070】

斯くして作製された改変スターメレラ属微生物は、アセチル化フィトスフィンゴシン等のアセチル化スフィンゴイドを良好に生産する能力を有し、当該微生物を培養したときに培地中に当該アセチル化スフィンゴイドを排出する。

【0071】

上述した本発明に係る改変スターメレラ属微生物を培地にて培養し、培地中にアセチル化スフィンゴイドを蓄積させ、培地に含まれるアセチル化スフィンゴイドを回収することにより、アセチル化スフィンゴイドを製造することができる。

【0072】

また、本発明に係る改変スターメレラ属微生物を用いたアセチル化スフィンゴイドの製造においては、脂肪酸又はそのアルキルエステル、アルコール及びアルカンから選ばれる１種以上を培地に添加すること、更にはこれらと非イオン性界面活性剤を組み合わせて培地に添加することにより、アセチル化スフィンゴイドの生産量を格段に向上させることができる。

【0073】

ここで、脂肪酸としては、ペンタデカン酸、ヘキサデカン酸（パルミチン酸）、ヘプタデカン酸、オクタデカン酸（ステアリン酸）、ノナデカン酸、アラキジン酸等の炭素鎖長が１５〜２０の脂肪酸が挙げられ、アルキルエステルとしては、炭素数１〜４のアルキルエステル、好ましくはメチルエステル、エチルエステルが挙げられる。好適な脂肪酸又はそのアルキルエステルとしては、ペンタデカン酸エチル、パルミチン酸エチル、ヘプタデカン酸エチル、ステアリン酸エチルが挙げられる。

【0074】

アルコールとしては、１−ペンタデカノール、１−ヘキサデカノール、１−ヘプタデカノール、１−オクタデカノール、１−ノナデカノール、１−エイコサノール等の炭素数 １５〜２０の一価アルコールが挙げられる。好適には炭素数１５〜１８の一価アルコールが挙げられ、より好ましくは、例えば１−ヘプタデカノール、１−オクタデカノールである。

【0075】

アルカンとしては、ペンタデカン、ヘキサデカン、ヘプタデカン、オクタデカン、ノナデカン、エイコサン等の炭素数１５〜２０のアルカンが挙げられ、直鎖又は分岐の何れでもよい。好適には炭素数１５〜１８の直鎖アルカンが挙げられ、より好ましくは、例えばヘプタデカン、オクタデカンである。

【0076】

また、これらの脂肪酸又はそのアルキルエステル、アルコール又はアルカンは、非イオン系界面活性剤と共に培地に添加することにより、更にアセチル化スフィンゴイドの生産量を向上させることができる。
斯かる非イオン性界面活性剤としては、例えば、ポリオキシアルキレンアルキル（炭素数８〜２０）エーテル、アルキルポリグリコシド、ポリオキシアルキレンアルキル（炭素数８〜２０）フェニルエーテル、ポリオキシアルキレンソルビタン脂肪酸（炭素数８〜２２）エステル、ポリオキシアルキレングリコール脂肪酸（炭素数８〜２２）エステル等が挙げられ、この内、ポリオキシアルキレンソルビタン脂肪酸（炭素数８〜２２）エステルが好ましい。尚、好適に使用できる市販の非イオン性界面活性剤としては、例えばＴｗｅｅｎ２０（ポリオキシエチレンソルビタンモノラウラート）、Ｔｗｅｅｎ４０（ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミタート）、Ｔｗｅｅｎ６０（ポリオキシエチレンソルビタンモノステアラート）、Ｔｗｅｅｎ８０（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート）、Ｔｗｅｅｎ８５（ポリオキシエチレンソルビタントリオレアート）等が挙げられる。

【0077】

ここで、脂肪酸又はそのアルキルエステル、アルコール又はアルカンの添加量は、好ましくは１質量％以上で、好ましくは３０質量％以下、より好ましくは１０質量％以下、更に好ましくは３質量％以下である。また、好ましくは１〜３０質量％、より好ましくは１〜１０質量％、更に好ましくは１〜３質量％である。

【0078】

また、非イオン性界面活性剤の添加量は、好ましくは０．０１質量％以上で、好ましくは１０質量％以下、より好ましくは５質量％以下、更に好ましくは１質量％以下である。また、好ましくは０．０１〜１０質量％、より好ましくは０．１〜５質量％、更に好ましくは０．３〜１質量％である。

【0079】

培養に用いる培地は、炭素源、窒素源、無機塩類、その他必要に応じてアミノ酸、ビタミン等の有機微量栄養素を含有する通常の培地を用いることができる。合成培地または天然培地のいずれも使用可能である。培地に使用される炭素源および窒素源は培養する菌株が利用可能であるものならばいずれの種類を用いてもよい。

【0080】

炭素源としては、グルコース、グリセロール、フラクトース、スクロース、マルトース、マンノース、ガラクトース、澱粉加水分解物、糖蜜等の糖類が使用でき、その他、酢酸、クエン酸等の有機酸、エタノール等のアルコール類も単独あるいは他の炭素源と併用して用いることができる。窒素源としては、アンモニア、硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、酢酸アンモニウム等のアンモニウム塩または硝酸塩等が使用することができる。有機微量栄養素としては、アミノ酸、ビタミン、脂肪酸、核酸、更にこれらのものを含有するペプトン、カザミノ酸、酵母エキス、大豆たん白分解物等が使用でき、生育にアミノ酸などを要求する栄養要求性変異株を使用する場合には要求される栄養素を補添することが好ましい。無機塩類としてはリン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、鉄塩、マンガン塩等が使用できる。

【0081】

培養は、好ましくは、培養温度２０〜３３℃に制御することが好ましい。このような条件下で、好ましくは２４時間〜２００時間程度培養することにより、培養液中にアセチル化フィトスフィンゴシンを蓄積することができる。

【0082】

培養終了後の培養液からアセチル化スフィンゴイドを回収する方法は、特に限定されないが、公知の回収方法に従って行えばよい。例えば、培養液から菌体を除去した後に濃縮晶析する方法あるいはイオン交換クロマトグラフィー等によってアセチル化スフィンゴイドを回収することができる。

【0083】

上述した実施形態に関し、本発明においては以下の態様が開示される。
＜１＞スターメレラ属微生物において、以下の（Ａ）〜（Ｆ）：
（Ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
（Ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ（Ｄ）〜（Ｆ）のいずれかのポリペプチドと複合体を形成しセリンパルミトイルトランスフェラーゼ活性を発現するポリペプチド
（Ｃ）配列番号２で示されるアミノ酸配列において、１〜複数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ（Ｄ）〜（Ｆ）のいずれかのポリペプチドと複合体を形成しセリンパルミトイルトランスフェラーゼ活性を発現するポリペプチド
（Ｄ）配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
（Ｅ）配列番号４で示されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかのポリペプチドと複合体を形成しセリンパルミトイルトランスフェラーゼ活性を発現するポリペプチド
（Ｆ）配列番号４で示されるアミノ酸配列において、１〜複数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかのポリペプチドと複合体を形成しセリンパルミトイルトランスフェラーゼ活性を発現するポリペプチドより選択されるポリペプチドの発現が強化され、且つ以下の（Ｇ）〜（Ｉ）：
（Ｇ）配列番号６で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（Ｈ）配列番号６で示されるアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸残基が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（Ｉ）配列番号６で示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド、から選ばれるアミノ酸配列からなり、且つアセチルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子が導入された改変スターメレラ属微生物。
＜２＞上記（Ａ）〜（Ｃ）のポリペプチドが、配列番号２の１６３位、またはそれに相当する位置にシステイン残基を有する＜１＞の改変スターメレラ属微生物。
＜３＞上記（Ｄ）〜（Ｆ）のポリペプチドが、ピリドキサール−５’−リン酸結合モチーフ（ＧＴ（Ｆ／Ｌ）ＴＫＳＦＧ）を有する＜１＞又は＜２＞の改変スターメレラ属微生物。
＜４＞上記（Ｂ）のポリペプチドは、配列番号２で示されるアミノ酸配列と、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらにより好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上、なお好ましくは９８％以上の配列同一性を有し、上記（Ｅ）のポリペプチドは配列番号４で示されるアミノ酸配列と、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上、なお好ましくは９８％以上の配列同一性を有する、＜１＞〜＜３＞の改変スターメレラ属微生物。
＜５＞上記（Ａ）〜（Ｃ）からなる群より選択されるポリペプチドと、上記（Ｄ）〜（Ｆ）からなる群より選択されるポリペプチドが発現強化された、＜１＞〜＜４＞の改変スターメレラ属微生物。
＜６＞上記（Ａ）〜（Ｆ）から選択されるポリペプチドの発現の強化が、上記スターメレラ属微生物において、該（Ａ）〜（Ｆ）から選択されるポリペプチドをコードする遺伝子の発現量を増加させた、＜１＞〜＜５＞の改変スターメレラ属微生物。
＜７＞上記（Ａ）〜（Ｃ）からなる群より選択されるポリペプチドをコードする遺伝子と、上記（Ｄ）〜（Ｆ）からなる群より選択されるポリペプチドをコードする遺伝子の発現量を増加させた、＜５＞又は＜６＞の改変スターメレラ属微生物。
＜８＞配列番号１で示される塩基配列からなる遺伝子と、配列番号３で示される塩基配列からなる遺伝子の発現量を増加させた、＜５＞〜＜７＞の改変スターメレラ属微生物。
＜９＞ＧＡＰＤＨ、ＵＧＴ、ＰＨＯ、ＧＡＬ１、ＡＤＨ１、ＴＤＨ３、ＰＧＫ１、ＴＰＩ１、又はＴＥＦ１のプロモーターのいずれか１以上と連結された上記遺伝子を含むベクターまたは該遺伝子の断片を導入した、＜６＞〜＜８＞の改変スターメレラ属微生物。
＜１０＞ＧＡＰＤＨのプロモーターと連結された上記遺伝子を含むベクターまたは該遺伝子の断片を導入した、＜６＞〜＜９＞の改変スターメレラ属微生物。
＜１１＞（Ｇ）の１〜数個が、１〜８８個、好ましくは１〜６６個、さらに好ましくは１〜４４個、さらに好ましくは１〜２２個、さらにより好ましくは８個である、＜１＞〜＜１０＞の改変スターメレラ属微生物。
＜１２＞（Ｈ）のポリペプチドが、配列番号６のアミノ酸配列と好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列である、＜１＞〜＜１０＞の改変スターメレラ属微生物。
＜１３＞スターメレラ属微生物が、スターメレラ ボンビコーラである＜１＞〜＜１２＞の改変スターメレラ属微生物。
＜１４＞スターメレラ ボンビコーラがスターメレラ ボンビコーラ ＫＳＭ３６株又はスターメレラ ボンビコーラ ＮＢＲＣ１０２４３株である＜１３＞の改変スターメレラ属微生物。
＜１５＞さらにｃｙｐ５２Ｍ１遺伝子が欠失又は不活性化されている、＜１＞〜＜１４＞の改変スターメレラ属微生物。
＜１６＞＜１＞〜＜１５＞の改変スターメレラ属微生物を培養する、アセチル化スフィンゴイドの製造方法。
＜１７＞炭素数１５〜２０の脂肪酸又はそのアルキルエステル、炭素数１５〜２０の一価アルコール、及び炭素数１５〜２０のアルカンから選ばれる１種以上を培地に添加して前記改変スターメレラ属微生物を培養する、＜１６＞のアセチル化スフィンゴイドの製造方法。
＜１８＞炭素数１５〜２０の脂肪酸又はそのアルキルエステルが、ペンタデカン酸、ヘキサデカン酸、ヘプタデカン酸、オクタデカン酸、ノナデカン酸若しくはアラキジン酸又はそのエチルエステルであり、炭素数１５〜２０の一価アルコールが、１−ヘプタデカノール又は１−オクタデカノールであり、炭素数１５〜２０のアルカンが、ヘプタデカン又はオクタデカンである、＜１７＞のアセチル化スフィンゴイドの製造方法。
＜１９＞更に、非イオン性界面活性剤を培地に添加する、＜１７＞又は＜１８＞のアセチル化スフィンゴイドの製造方法。
＜２０＞非イオン性界面活性剤がＴｗｅｅｎ８０（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート）である＜１９＞のアセチル化スフィンゴイドの製造方法。
＜２１＞スフィンゴイドの炭素鎖長が１８〜２０である＜１６＞〜＜２０＞の製造方法。
＜２２＞アセチル化スフィンゴイドがアセチルフィトスフィンゴシンである＜１６＞〜＜２１＞の製造方法。
＜２３＞アセチルフィトスフィンゴシンが、テトラアセチルフィトスフィンゴシン及び／又はトリアセチルフィトスフィンゴシンである＜２２＞の製造方法。
以下、実施例によって本発明の内容をさらに詳細に説明する。

【実施例】

【0084】

実施例１：ウラシル要求性株の取得
（１）ウラシル要求性株の取得
スターメレラ ボンビコーラ ＫＳＭ３６株（ＦＥＲＭ ＢＰ−７９９）を０．６８％
Ｙｅａｓｔ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｂａｓｅ ｗ／ｏ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ、２％ グルコース、０．０３％ウラシルおよび１．５％Ａｇａｒを含むＳＤ−Ｕ寒天培地に接種したのち、３０℃で１ヶ月間培養し、得られた菌体を１ｍＬの０．８％食塩水に一白金耳懸濁し、０．６８％Ｙｅａｓｔ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｂａｓｅ ｗ／ｏ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ、２％グルコース、０．０３％ウラシル、および５−フルオロオロチン酸、１．５％Ａｇａｒを含むＳＤ-ＵＦ寒天培地に１００μＬ塗抹し３０℃で２週間培養した。生育したコロニーを再度ＳＤ−ＵＦ寒天培地で培養した後、それぞれについてウラシル要求性、５−フルオロオロチン酸耐性を確認し、ウラシル要求性株を取得した。
スターメレラ ボンビコーラ ＫＳＭ３６株および得られたウラシル要求性株を５ｍＬのＹＰＤ培地（２％Ｇｌｕｃｏｓｅ、２％ Ｂａｃｔｏ Ｐｅｐｔｏｎｅ、１％ Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ）を含む１００ｍＬ容試験管に一白金耳植菌し、３０℃、２５０ｒｐｍで４８時間培養した。培養液１ｍＬを５０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心して集めた菌体からＧｅｎとるくん^ＴＭ（ＴＡＫＡＲＡバイオ）を用い、添付のマニュアルに従ってゲノムＤＮＡを抽出した。表１記載のプライマー（配列番号８、９）およびＫＯＤ−ｐｌｕｓ．ｖｅｒ２（ＴＯＹＯＢＯ）を用いてウラシル生合成に関わるオロチジンデカルボキシラーゼをコードするＵＲＡ３遺伝子を増幅し、ＰＣＲ産物を鋳型としてＵＲＡ３遺伝子の配列をシーケンス解析し、スターメレラ ボンビコーラ ＮＢＲＣ１０２４３株の配列（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＤＱ９１６８２８）と比較した。その結果、スターメレラ ボンビコーラ ＫＳＭ３６株はスターメレラ ボンビコーラ ＮＢＲＣ１０２４３株のＵＲＡ３遺伝子と同じ配列を有すること、ウラシル要求性株は皆５４位のシステインがチロシンに変異していることが確認された。得られた変異体をスターメレラ ボンビコーラ ＫＳＭ３６−ｕｒａ３株として取得した。

【0085】

（２）ウラシル要求性株の取得方法
（１）において、ウラシル要求性株の変異位置が確定されたので、例えば下記の遺伝子組換え手段を用いて容易にウラシル要求性株の調製が可能である。
スターメレラ ボンビコーラ ＫＳＭ３６株のゲノムＤＮＡをテンプレートとしてＵｒａ３遺伝子を配列番号８、９のプライマーを用いて増幅する。増幅した遺伝子断片を適当なベクターに導入し、５４位のシステインをチロシンに点変異を導入する。点変異を導入したベクターを配列番号８、９のプライマーを用いて増幅し、ＵＲＡ３遺伝子に変異の導入された形質転換断片を得る。スターメレラ ボンビコーラ ＫＳＭ３６を、５ｍＬのＹＰＤ培地を含む１００ｍＬ形試験管に一白金耳植菌し、３０度、２５０ｒｐｍで２４時間培養する。得られた培養液を、ＹＰＤ培地５０ｍＬを含む坂口フラスコに１％植菌し、３０℃、１２０ｒｐｍでＯＤ６００＝１〜２になるまで培養する。増殖した菌体を３０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心して集菌した後、氷上で冷やした滅菌水２０ｍＬで２回洗浄する。菌体を氷冷した１ｍＬの１Ｍソルビトール溶液に懸濁し、５０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心し、上清を捨てたのち、４００μＬの１Ｍソルビトール溶液を加えて氷上におき、ピペッティングで懸濁する。この酵母懸濁液を５０μＬずつ分注し、形質転換用のＤＮＡ溶液を１μｇ加える。酵母懸濁液を氷冷した０．２ｃｍギャップのチャンバーに移したのち、ＧＥＮＥ ＰＵＬＳＥＲ ＩＩ（ＢＩＯ−ＲＡＤ）を用いて２５ｕＦ，３５０Ω、２．５ｋＶのパルスをかける。氷冷した１Ｍソルビトール入りＹＰＤ培地を加えて１．５ｍＬ容チューブに移し、３０℃で２時間振とうした後、５０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心して菌体を回収し、２００μＬの１Ｍソルビトール溶液に再懸濁して１００μＬずつ選択培地に塗抹し、３０℃で約１週間培養する。選択培地には、０．６８％Ｙｅａｓｔ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｂａｓｅ ｗ／ｏ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ、２％グルコース、０．０３％ウラシル、および５−フルオロオロチン酸、１．５％Ａｇａｒを含むＳＤ-ＵＦ寒天培地を使用する。生育したコロニーを再度ＳＤ−ＵＦ寒天培地で培養した後、それぞれについてウラシル要求性、５−フルオロオロチン酸耐性を確認し、ウラシル要求性株を取得する。

【0086】

実施例２ ＬＣＢ１およびＬＣＢ２過剰発現株の作製
（１）ＬＣＢ１またはＬＣＢ２欠損用プラスミドの作製
スターメレラ ボンビコーラ ＫＳＭ３６株ゲノムＤＮＡを鋳型に、配列番号１０と１１および１２と１３のプライマーを用いて、ＬＣＢ１遺伝子の上流領域および下流領域を増幅した。同様に、配列番号１４と１５および１６と１７のプライマーを用いて、ＬＣＢ２遺伝子の上流領域および下流領域を増幅した。さらに、配列番号１８と１９および２０と２１のプライマーを用いて、当該プライマー領域を含むＵＲＡ３遺伝子領域を増幅した。次に得られたＰＣＲ産物を鋳型にＳＯＥ-ＰＣＲによってＬＣＢ１遺伝子上流領域とＵＲＡ３遺伝子とＬＣＢ１遺伝子下流領域（配列番号１０、１３のプライマー）、または本発明のＬＣＢ２遺伝子上流領域とＵＲＡ３遺伝子とＬＣＢ２遺伝子下流領域（配列番号１４、１７のプライマー）の組み合わせでＤＮＡを連結させ、ｐＴＡ２ベクターとライゲーションすることによって（ＴＯＹＯＢＯ）、ｐＴＡ２-ｌｃｂ１：：ＵＲＡ３プラスミドおよびｐＴＡ２-ｌｃｂ２：：ＵＲＡ３プラスミドを構築した。さらに、ｐＴＡ２-ｌｃｂ１：：ＵＲＡ３プラスミドを鋳型に配列番号１０、１３のプライマーを使用してＬＣＢ１遺伝子欠損用カセットを増幅し、またｐＴＡ２-ｌｃｂ２：：ＵＲＡ３プラスミドを鋳型に配列番号１４、１７のプライマーを使用してＬＣＢ２遺伝子欠損用カセットを増幅したのち、Ｈｉｇｈ ｐｕｒｅ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ）を用いて精製した。

【0087】

（２）ＬＣＢ１欠損株の作製
実施例１（１）記載のスターメレラ ボンビコーラ ＫＳＭ３６−ｕｒａ３株に、実施例１（２）記載の方法でＬＣＢ１遺伝子欠損用断片を形質転換した。選択培地には、０．６８％ Ｙｅａｓｔ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｂａｓｅ ｗ／ｏ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ，２％ グルコース、０．０７７％ ＣＳＭ−ｕｒａ（フナコシ）、２０〜２００μＭ フィトスフィンゴシン（Ｃｏｓｍｏｆｅｒｍ）、０．０５％ レオドールＯ３２０Ｖ（花王）、および１．５％ Ａｇａｒを含むＳＤ-ｕｒａ+ＰＨＳ寒天培地を使用した。生育したコロニーをＳＤ-ｕｒａ+ＰＨＳ培地および０．６８％ Ｙｅａｓｔ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｂａｓｅ ｗ／ｏ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ，２％ グルコース、０．０７７％ ＣＳＭ−ｕｒａ（フナコシ）、および１．５％ Ａｇａｒを含むＳＤ-ｕｒａ寒天培地にレプリカし、３０℃で約１週間培養した後、ＳＤ-ｕｒａ+ＰＨＳ培地のみで生育するコロニーを選抜した。選抜した変異株は、の配列番号１０と１３のプライマーでＫＯＤ-ＦＸ-Ｎｅｏ（ＴＯＹＯＢＯ）を用いてコロニーＰＣＲし、増幅される配列長が変化していること、およびシーケンス解析により配列が設計どおりに変異していることを確認したのち、スターメレラ ボンビコーラ ＫＳＭ３６−Δｌｃｂ１株を得た。

【0088】

（３）ＬＣＢ１またはＬＣＢ２過剰発現用プラスミドの作製
スターメレラ ボンビコーラ ＫＳＭ３６株ゲノムＤＮＡを鋳型に、配列番号１０と１３のプライマーを用いて、上流および下流領域を含むＬＣＢ１遺伝子を、配列番号１４と１７のプライマーを用いて、上流および下流領域を含むＬＣＢ２遺伝子を増幅した。ＬＣＢ１またはＬＣＢ２を含む遺伝子増幅断片をそれぞれｐＴＡ２ベクターにライゲーションし、ｐＴＡ２−ＬＣＢ１プラスミドおよびｐＴＡ２−ＬＣＢ２プラスミドを構築した。次に、配列番号２２と２３または２４と２５のプライマーを用いてグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）のプロモーター領域を増幅した。さらに、ｐＴＡ２−ＬＣＢ１プラスミドには配列番号２６と２７のプライマー、ｐＴＡ２−ＬＣＢ２プラスミドには配列番号２８と２９のプライマーで、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍａｘ ＤＮＡ
Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ）を用いて変異導入することにより各遺伝子のＯＲＦ開始点に制限酵素ＮｄｅＩ用サイトを導入した。それぞれの改変プラスミドをＮｄｅＩで切断した後、ＧＡＰＤＨプロモーター領域をＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて連結した。シーケンス解析によってＧＡＰＤＨプロモーター領域が正しく挿入されたプラスミドを選抜し、ｐＴＡ２−５’ＧＡＰＤＨ−ＬＣＢ１プラスミドおよびｐＴＡ２−５’ＧＡＰＤＨ−ＬＣＢ２プラスミドとした。それぞれのプラスミドを鋳型に配列番号１０と１３または１４と１７のプライマーを用いてＧＡＰＤＨプロモーターを含むＬＣＢ１遺伝子およびＬＣＢ２遺伝子を増幅し、Ｈｉｇｈ
ｐｕｒｅ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ）を用いて精製した。

【0089】

（４）ＬＣＢ１過剰発現株の作製
上記実施例２（２）で作製したスターメレラ ボンビコーラ ＫＳＭ３６−Δｌｃｂ１株に対して、実施例１（２）記載の方法でＬＣＢ１過剰発現用ＤＮＡ断片を形質転換した。選択培地にはＹＰＤ培地を使用し、生育したコロニーをＳＤ-ｕｒａ培地および０．６８％ Ｙｅａｓｔ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｂａｓｅ ｗ／ｏ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ，２％ グルコース、０．０７７％ ＣＳＭ（フナコシ）、および１．５％ Ａｇａｒを含むＳＤ-ＣＳＭ寒天培地にレプリカし、３０℃で約１週間培養した後、ＳＤ−ＣＳＭ寒天培地のみで生育するコロニーを選抜した。選抜した変異株は、配列番号１０と１３のプライマーでＫＯＤ-ＦＸ-Ｎｅｏ（ＴＯＹＯＢＯ）を用いてコロニーＰＣＲし、増幅される配列長が変化していること、およびシーケンス解析により配列が設計どおりに変異していることを確認したのち、スターメレラ ボンビコーラ ＫＳＭ３６−ＬＣＢ１ＯＥ株を得た。

【0090】

（５）ＬＣＢ１過剰発現ＬＣＢ２欠損株の作製
上記実施例２（４）で作製したスターメレラ ボンビコーラ ＫＳＭ３６−ＬＣＢ１ＯＥ株を培養し、実施例１（２）記載の方法でＬＣＢ２遺伝子欠損用のＤＮＡ断片を形質転換した。選択培地には、ＳＤ-ｕｒａ+ＰＨＳ寒天培地を使用した。生育したコロニーをＳＤ-ｕｒａ+ＰＨＳ培地およびＳＤ-ｕｒａ寒天培地にレプリカし、３０℃で約１週間培養した後、ＳＤ-ｕｒａ＋ＰＨＳ培地のみで生育するコロニーを選抜した。選抜した変異株は、表２記載の配列番号１４、１７のプライマーでＫＯＤ-ＦＸ-Ｎｅｏ（ＴＯＹＯＢＯ）を用いてコロニーＰＣＲし、増幅される配列長が変化していること、およびシーケンス解析により配列が設計どおりに変異していることを確認したのち、スターメレラ ボンビコーラ ＫＳＭ３６−ＬＣＢ１ＯＥ−Δｌｃｂ２株を得た。

【0091】

（６）ＬＣＢ１およびＬＣＢ２過剰発現株の作製
上記実施例２（５）で作製したスターメレラ ボンビコーラ ＫＳＭ３６−ＬＣＢ１ＯＥ−Δｌｃｂ２株を培養し、実施例１（２）記載の方法でＬＣＢ２過剰発現用のＤＮＡ断片を形質転換した。選択培地にはＹＰＤ培地を使用し、生育したコロニーをＳＤ-ｕｒａ+ＰＨＳ培地およびＳＤ-ｕｒａ寒天培地にレプリカし、３０℃で約１週間培養した後、ＳＤ-ｕｒａ+ＰＨＳ培地のみで生育するコロニーを選抜した。選抜した変異株は、配列番号１４、１７のプライマーでＫＯＤ-ＦＸ-Ｎｅｏ（ＴＯＹＯＢＯ）を用いてコロニーＰＣＲし、増幅される配列長が変化していること、およびシーケンス解析により配列が設計どおりに変異していることを確認したのち、スターメレラ ボンビコーラ ＫＳＭ３６−ＬＣＢ１ＯＥ−ＬＣＢ２ＯＥ株を得た。

【0092】

実施例３ ＬＣＢ１およびＬＣＢ２過剰発現かつＳＬＩ１導入株の作製
（１）ｃｙｐ５２Ｍ１：：ｐＧＡＰＤＨ−ＳＬＩ１−ＵＲＡ３断片の作製
スターメレラ ボンビコーラのコドン使用頻度に合わせて人工合成したウィッカーハモミセス シフェリイ由来アセチルトランスフェラーゼ遺伝子（ＷｃＳＬＩ１）（配列番号７）をテンプレートとして配列番号３０、３１のプライマーを用いてＰＣＲすることにより、ＷｃＳＬＩ１遺伝子断片を得た。ＰＣＲの条件は、例えば９８℃２分、（９８℃１０秒、５５℃５秒、７２℃１分）×３０サイクルが挙げられる。ＳＬＩ１の発現には、Ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（５’−ＧＡＰＤＨ）遺伝子のプロモータ、およびをＣｙｔｏｃｈｒｏｍｅ ｃ（３’−ＣＹＣ）のターミネータを使用した。これらの配列は、配列番号３２、３３および３４、３５のプライマーを用いてスターメレラ ボンビコーラ ＫＳＭ３６株のゲノムＤＮＡをテンプレートとしてＰＣＲすることにより得た。これらをＳＯＥ−ＰＣＲを用いて連結し、［５’−ＧＡＰＤＨ］［ＷｃＳＬＩ１］［３’−ＣＹＣ］の遺伝子断片を得た。この遺伝子断片とプラスミドｐＨｓｐ７０Ａ／ＲｂｃＳ２−Ｃｈｌａｍｙ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｅｎｔｅｒ）を制限酵素ＳａｃＩとＮｃｏＩで処理したものをｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて連結させ、プラスミド１を得た。さらに、配列番号３６、３７のプライマーを用いてスターメレラ
ボンビコーラ ＫＳＭ３６株のゲノムＤＮＡをテンプレートにＰＣＲにてＣＹＰ５２Ｍ１遺伝子の上流部分を増幅させ、配列番号３８、３９のプライマーで増幅させたプラスミド１とｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて連結することにより、ＧＡＰＤＨプロモーターの前方にＣＹＰ５２Ｍ１遺伝子の上流部分を挿入し、プラスミド１−Ａとした。次に、ＵＲＡ３遺伝子のプロモータ、ターミネータを含む領域を、配列番号４０、４１でスターメレラ ボンビコーラ ＫＳＭ３６株のゲノムＤＮＡをテンプレートとしてそれぞれＰＣＲにて増幅した。さらに、プラスミドｐＵＣ−Ａｒｇ７−ｌｏｘ−Ｂ ＡＲＧ７を配列番号４２、４３のプライマーを用いたＰＣＲでＡＲＧ７以外の領域を増幅し、ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いてＳＯＥ−ＰＣＲの増幅物と連結し、プラスミド２を得た。さらに、配列番号４４、４５のプライマーを用いてスターメレラ ボンビコーラ ＫＳＭ３６株のゲノムＤＮＡをテンプレートにＰＣＲにてＣＹＰ５２Ｍ１遺伝子の下流部分を増幅させ、配列番号４６、４７のプライマーを用いて増幅させたプラスミド２をｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて連結することにより、ＵＲＡ３ターミネータの後方にＣＹＰ５２Ｍ１遺伝子の下流部分を挿入し、プラスミド２−Ａとした。プラスミド１−Ａおよび２−ＡをＣｒｅ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ反応によって連結させ、プラスミド３とした。配列番号４８、４９のプライマーを用いてプラスミド３をテンプレートにＰＣＲにてｃｙｐ５２Ｍ１：：ｐＧＡＰＤＨ−ＷｃＳＬＩ１断片を得た。

【0093】

（２）ＬＣＢ１およびＬＣＢ２過剰発現かつＳＬＩ１導入株の作製
スターメレラ ボンビコーラ ＫＳＭ３６-ｕｒａ３株および実施例２（６）で得たスターメレラ ボンビコーラ ＫＳＭ３６−ＬＣＢ１ＯＥ−ＬＣＢ２ＯＥ株を培養し、実施例１（２）記載の方法でｃｙｐ５２Ｍ１：：ｐＧＡＰＤＨ−ＷｃＳＬＩ１断片を形質転換した。選択培地には、０．６８％ Ｙｅａｓｔ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｂａｓｅ ｗ／ｏ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ，２％ グルコース、０．０７７％ ＣＳＭ−ｕｒａ（フナコシ），及び１．５％ Ａｇａｒを含むＳＤ−ｕｒａ寒天培地を使用した。生育したコロニーを配列番号４８、４９のプライマーを用いてＫＯＤ−ＦＸ−Ｎｅｏ（ＴＯＹＯＢＯ）によりコロニーＰＣＲし、導入した遺伝子がゲノムに正しく挿入されていることを確認したのち、スターメレラ ボンビコーラ ＫＳＭ３６ ｃｙｐ５２Ｍ１：：ｐＧＡＰＤＨ−ＷｃＳＬＩ１株およびスターメレラ ボンビコーラ ＫＳＭ３６ ＬＣＢ１ＯＥ−ＬＣＢ２ＯＥ ｃｙｐ５２Ｍ１：：ｐＧＡＰＤＨ−ＷｃＳＬＩ１株を得た。

【0094】

【表1】

【0095】

実施例４：アセチル化スフィンゴイドの生産性評価
（１）作製した菌株の培養実施例３で作製したスターメレラ ボンビコーラ ＫＳＭ３６ ｃｙｐ５２Ｍ１：：ｐＧＡＰＤＨ−ＷｃＳＬＩ１株とスターメレラ ボンビコーラ ＫＳＭ３６ ＬＣＢ１ＯＥ−ＬＣＢ２ＯＥ ｃｙｐ５２Ｍ１：：ｐＧＡＰＤＨ−ＷｃＳＬＩ１株をＹＰＤ寒天培地に塗抹し、生育したコロニーを５ｍＬのＹＰＤ培地を含む１００ｍＬ容試験管に一白金耳植菌し、３０度、２５０ｒｐｍで２４時間培養した。得られた培養液５００μＬを５ｍＬの改良ＹＰＤ培地（１０％Ｇｌｕｃｏｓｅ、２％ Ｂａｃｔｏ Ｐｅｐｔｏｎｅ、１％ Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ、２５ｍＭ 塩化カルシウム二水和物および５０ｍＭ Ｌ−セリン）を含む１００ｍＬ容試験管に植菌し、３０℃、２５０ｒｐｍで５日間培養し、脂質の組成を解析した。

【0096】

（２）アセチル化フィトスフィンゴシンの定量
培養液を１ｍＬ回収後、クロロホルム：メタノール（２：１）混合溶液を４ ｍＬ添加し、ボルテックスした後、１５分静置した。３０００ｒｐｍ、１５分遠心し、下層（クロロホルム層）を回収した。回収した液を窒素にて乾固させた後、１ｍＬのメタノールに懸濁、適宜希釈し、フィルターろ過後のサンプルをＬＣＭＳにて測定した。ＬＣＭＳの条件は以下の通りである。

【0097】

ＬＣ条件：Ｃａｐｃｅｌｌ ｃｏｒｅ Ｃ１８ ２．７ ｕｍφ２．１×５０ｍｍ（資生堂）、Ｏｖｅｎ Ｔｅｍｐ． ４０℃、Ｓｏｌ．Ａ： ０．１％ ＨＣＯ_２Ｈ ｉｎ ｗａｔｅｒ、Ｓｏｌ．Ｂ： ＭＥＣＮ、（Ａ６０％、Ｂ４０％） ０．５ｍｉｎ→［（Ａ６０％、Ｂ４０％）→（Ａ０％、Ｂ１００％）５．５ｍｉｎ］→Ｂ１００％ ２ｍｉｎ、［（Ａ０％、Ｂ１００％）→（Ａ６０％、Ｂ４０％）０．０１ｍｉｎ］→（Ａ６０％、Ｂ４０％）２ｍｉｎ、Ｆｌｏｗ ｒａｔｅ ０．６ｍｌ／ｍｉｎ．、Ｉｎｊｅｃｔ ５μｌ、ＭＳ／ＭＳ装置：ＡＰＩ３２００ＱＴｒａｐ（ＡＢ ＳＣＩＥＸ）

【0098】

【表2】

【0099】

表３としてアセチル化フィトスフィンゴシンの生産量および鎖長組成を示した。分析の結果、スターメレラ ボンビコーラ ＫＳＭ３６ ＬＣＢ１ＯＥ−ＬＣＢ２ＯＥ ｃｙｐ５２Ｍ１：：ｐＧＡＰＤＨ−ＷｃＳＬＩ１株はスターメレラ ボンビコーラ ＫＳＭ３６ｃｙｐ５２Ｍ１：：ｐＧＡＰＤＨ−ＷｃＳＬＩ１株に比して約２．３倍のアセチル化フィトスフィンゴシンの生産性を示すことが確認された。ＬＣＢ１およびＬＣＢ２遺伝子過剰発現の効果により、スフィンゴ脂質生合成が強化された結果と考えられる。

【0100】

【表3】

【0101】

実施例５：脂肪酸エステル添加時のアセチル化フィトスフィンゴシンの生産性評価
実施例３で作製したスターメレラ ボンビコーラ ＫＳＭ３６ ｃｙｐ５２Ｍ１：：ｐＧＡＰＤＨ−ＷｃＳＬＩ１株とスターメレラ ボンビコーラ ＫＳＭ３６ ＬＣＢ１ＯＥ−ＬＣＢ２ＯＥ ｃｙｐ５２Ｍ１：：ｐＧＡＰＤＨ−ＷｃＳＬＩ１株を実施例４（１）と同様の方法で培養評価を行った。ここでは、改良ＹＰＤ培地に５０ｍＭのペンタデカン酸エチル、パルミチン酸エチル、ヘプタデカン酸エチルオクタデカン酸エチル、ノナデカン酸エチル、アラキジン酸エチルのいずれかを添加した。評価結果を表４に示す。
スターメレラ ボンビコーラ ＫＳＭ３６ ＬＣＢ１ＯＥ−ＬＣＢ２ＯＥ ｃｙｐ５２Ｍ１：：ｐＧＡＰＤＨ−ＷｃＳＬＩ１株では スターメレラ ボンビコーラ ＫＳＭ３６
ｃｙｐ５２Ｍ１：：ｐＧＡＰＤＨ−ＷｃＳＬＩ１株に比べてトリアセチルフィトスフィンゴシン類の生産性は向上するが、さらにそれぞれの株に各種炭素鎖長の脂肪酸エチルエステルを添加すると生産性は大幅に向上し、スターメレラ ボンビコーラ ＫＳＭ３６ ｃｙｐ５２Ｍ１：：ｐＧＡＰＤＨ−ＷｃＳＬＩ１株の脂肪酸添加に比べて約４〜５０倍生産性が向上した。

【0102】

【表4】

【0103】

実施例６：脂肪酸エステル添加時のアセチル化フィトスフィンゴシンの生産性評価
実施例３で作製したスターメレラ ボンビコーラ ＫＳＭ３６ ＬＣＢ１ＯＥ−ＬＣＢ２ＯＥ ｃｙｐ５２Ｍ１：：ｐＧＡＰＤＨ−ＷｃＳＬＩ１株を実施例４（１）と同様の方法で培養評価を行った。ここでは、改良ＹＰＤ培地に５０ｍＭのヘプタデカン酸、ヘプタデカン酸エチル、１−ヘプタデカノール、ヘプタデカン、オクタデカン酸、オクタデカン酸エチル、１−オクタデカノール、オクタデカンのいずれかを添加した。また、これらに加えて、更にＴｗｅｅｎ８０（東京化成工業）を０．５質量％濃度でそれぞれ添加し、同様に評価を行った。結果を表５に示す。
脂肪酸又はそのアルキルエステル、アルコール、アルカンの添加により、トリアセチルフィトスフィンゴシン類の生産性が向上し、その効果は、非イオン性界面活性剤（Ｔｗｅｅｎ８０）を組み合わせて添加することにより、大幅に向上した。

【0104】

【表5】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]