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特許6556121癌を診断する方法

書誌要約請求の範囲詳細な説明課題実施例実施するための形態図面の説明

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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6556121

(24)【登録日】2019年7月19日

(45)【発行日】2019年8月7日

(54)【発明の名称】癌を診断する方法

(51)【国際特許分類】

G01N 33/574 20060101AFI20190729BHJP

C12Q 1/02 20060101ALI20190729BHJP

A61K 39/395 20060101ALI20190729BHJP

A61P 35/00 20060101ALI20190729BHJP

A61P 35/04 20060101ALI20190729BHJP

A61K 45/00 20060101ALI20190729BHJP

C07K 19/00 20060101ALN20190729BHJP

C07K 16/30 20060101ALN20190729BHJP

C07K 14/705 20060101ALN20190729BHJP

【ＦＩ】

G01N33/574 DZNA

C12Q1/02

A61K39/395 T

A61P35/00

A61P35/04

A61K45/00

!C07K19/00

!C07K16/30

!C07K14/705

【請求項の数】18

【全頁数】26

(21)【出願番号】特願2016-509504(P2016-509504)

(86)(22)【出願日】2014年4月29日

(65)【公表番号】特表2016-524694(P2016-524694A)

(43)【公表日】2016年8月18日

(86)【国際出願番号】EP2014058746

(87)【国際公開番号】WO2014177576

(87)【国際公開日】20141106

【審査請求日】2017年3月29日

(31)【優先権主張番号】13165784.3

(32)【優先日】2013年4月29日

(33)【優先権主張国】EP

(73)【特許権者】

【識別番号】514322124

【氏名又は名称】アポジェニックスアーゲー

(74)【代理人】

【識別番号】100113376

【弁理士】

【氏名又は名称】南条雅裕

(74)【代理人】

【識別番号】100179394

【弁理士】

【氏名又は名称】瀬田あや子

(74)【代理人】

【識別番号】100185384

【弁理士】

【氏名又は名称】伊波興一朗

(74)【代理人】

【識別番号】100137811

【弁理士】

【氏名又は名称】原秀貢人

(72)【発明者】

【氏名】フリッケハラルド

(72)【発明者】

【氏名】ジェファーズクリスチャン

(72)【発明者】

【氏名】シコラヤロミール

【審査官】大瀧真理

(56)【参考文献】

【文献】特表２０１２−５３３６１３（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２０１３／０２２９９５（ＷＯ，Ａ２）

【文献】特表２０１０−５０８８３６（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１０−５１４７２２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 REIMER ET AL.，FasL:Fas ratio--a prognostic factor in breast carcinomas.，CANCER RESEARCH，２０００年２月１５日，vol.60, no.4，PP.822-828

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｇ０１Ｎ３３／４８ − ３３／９８

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

膠芽腫を診断するための検査方法であって、
（ａ）膠芽腫サンプルにおいてＣＤ９５Ｌの発現を判定するステップ、および、
（ｂ）ＣＤ９５Ｌ発現のレベルに従って前記膠芽腫を分類するステップ、ここで、前記膠芽腫はＣＤ９５Ｌ発現のレベルによってＣＤ９５Ｌ陽性膠芽腫またはＣＤ９５Ｌ陰性膠芽腫に分類され、前記サンプル中の細胞の少なくとも５％がＣＤ９５Ｌを発現する場合、および／または、膠芽腫組織サンプル中の腫瘍組織の少なくとも５％の領域にＣＤ９５Ｌが検出される場合に、ＣＤ９５Ｌ陽性とみなされる；
を含む、
方法。

【請求項2】

請求項１に記載の方法であって、
前記膠芽腫サンプルにおけるＣＤ９５Ｌの前記発現は、前記サンプルを、ＣＤ９５Ｌに特異的に結合する作用物質と接触させることにより判定される、
方法。

【請求項3】

請求項２に記載の方法であって、
ＣＤ９５Ｌに特異的に結合する作用物質は、少なくとも細胞外ＣＤ９５ドメインまたはその機能性フラグメントおよび少なくともＦｃドメインまたはその機能性フラグメントを含む融合タンパク質を含み、および／または、抗−ＣＤ９５Ｌ特異的抗体またはＣＤ９５Ｌを認識するそのフラグメントである、
方法。

【請求項4】

請求項３に記載の方法であって、
前記融合タンパク質は、ＡＰＧ１０１、ＡＰＧ１０１に対して少なくとも９０％の同一性を有するポリペプチド、および、ＡＰＧ１０１の機能性フラグメントから選択される、
方法。

【請求項5】

請求項３に記載の方法であって、
前記作用物質は、抗−ＣＤ９５Ｌ特異的抗体またはＣＤ９５Ｌを認識するそのフラグメントであり、ＣＤ９５Ｌの細胞内エピトープに結合する、
方法。

【請求項6】

請求項５に記載の方法であって、
前記の抗−ＣＤ９５Ｌ特異的抗体またはＣＤ９５Ｌを認識するそのフラグメントは、ヒトＣＤ９５ＬのＮ末アミノ酸１３〜１９をコードするエピトープを認識する、
方法。

【請求項7】

ＣＤ９５Ｌ発現のレベルに従って膠芽腫を分類することによる、膠芽腫の診断での使用のための、ＣＤ９５Ｌに特異的に結合する作用物質であって、
ここで、前記膠芽腫はＣＤ９５Ｌ発現のレベルによってＣＤ９５Ｌ陽性膠芽腫またはＣＤ９５Ｌ陰性膠芽腫に分類され、膠芽腫組織サンプル中の細胞の少なくとも５％がＣＤ９５Ｌを発現する場合、および／または、膠芽腫組織サンプル中の腫瘍組織の少なくとも５％の領域にＣＤ９５Ｌが検出される場合に、ＣＤ９５Ｌ陽性とみなされる、
作用物質。

【請求項8】

請求項７に記載の使用のための、ＣＤ９５Ｌに特異的に結合する作用物質であって、
少なくとも細胞外ＣＤ９５ドメインまたはその機能性フラグメントおよび少なくともＦｃドメインまたはその機能性フラグメントを含む融合タンパク質を含み、および／または、抗−ＣＤ９５Ｌ特異的抗体またはＣＤ９５Ｌを認識するそのフラグメントである、
ＣＤ９５Ｌに特異的に結合する作用物質。

【請求項9】

請求項８に記載の使用のための、ＣＤ９５Ｌに特異的に結合する作用物質であって、
前記融合タンパク質は、ＡＰＧ１０１、ＡＰＧ１０１に対して少なくとも９０％の同一性を有するポリペプチド、および、ＡＰＧ１０１の機能性フラグメントから選択される、
ＣＤ９５Ｌに特異的に結合する作用物質。

【請求項10】

請求項８に記載の作用物質であって、
前記作用物質は、抗−ＣＤ９５Ｌ特異的抗体またはＣＤ９５Ｌを認識するそのフラグメントであり、ＣＤ９５Ｌの細胞内エピトープに結合する、
作用物質。

【請求項11】

請求項１０に記載の作用物質であって、
前記の抗−ＣＤ９５Ｌ特異的抗体またはＣＤ９５Ｌを認識するそのフラグメントは、ヒトＣＤ９５ＬのＮ末アミノ酸１３〜１９をコードするエピトープを認識する、
作用物質。

【請求項12】

請求項７から１１のいずれか一項に記載の使用のための、ＣＤ９５Ｌに特異的に結合する作用物質であって、
ＣＤ９５Ｌの阻害剤である、
ＣＤ９５Ｌに特異的に結合する作用物質。

【請求項13】

膠芽腫患者における全生存期間または／および無再発生存期間を予知するための検査方法であって、
前記方法は、
（ａ）膠芽腫サンプルにおいてＣＤ９５Ｌ発現を判定するステップ、
（ｂ）前記膠芽腫を、ＣＤ９５Ｌ発現のレベルによってＣＤ９５Ｌ陽性膠芽腫またはＣＤ９５Ｌ陰性膠芽腫に分類するステップ、および
（ｃ）前記患者の前記生存期間または／および前記無再発生存期間を、ＣＤ９５Ｌ発現のレベルと関連させるステップ（ここで、前記ＣＤ９５Ｌ発現は、前記患者の前記生存期間と負に相関する）、を含む、
方法（ただし、医師によるヒトの診断行為は前記方法から除かれる）。

【請求項14】

請求項１３に記載の方法であって、
ステップ（ａ）の前記ＣＤ９５Ｌ発現は、少なくとも細胞外ＣＤ９５ドメインまたはその機能性フラグメントおよび少なくともＦｃドメインまたはその機能性フラグメントを含む融合タンパク質により判定される、
方法。

【請求項15】

請求項１４に記載の方法であって、
前記融合タンパク質は、ＡＰＧ１０１、ＡＰＧ１０１に対して少なくとも９０％の同一性を有するポリペプチド、および、ＡＰＧ１０１の機能性フラグメントから選択される、
方法。

【請求項16】

請求項１３に記載の方法であって、
ステップ（ａ）の前記ＣＤ９５Ｌ発現は、ＣＤ９５Ｌの細胞内エピトープに結合する、抗−ＣＤ９５Ｌ特異的抗体またはＣＤ９５Ｌを認識するそのフラグメントにより判定される、
方法。

【請求項17】

請求項１６に記載の方法であって、
前記の抗−ＣＤ９５Ｌ特異的抗体またはＣＤ９５Ｌを認識するそのフラグメントは、ヒトＣＤ９５ＬのＮ末アミノ酸１３〜１９をコードするエピトープを認識する、
方法。

【請求項18】

ＣＤ９５Ｌ発現のレベルにより膠芽腫を分類することによる、膠芽腫患者における全生存期間または／および無再発生存期間の予知での使用のための、ＣＤ９５Ｌに特異的に結合する作用物質であって、
ここで、前記膠芽腫はＣＤ９５Ｌ発現のレベルによってＣＤ９５Ｌ陽性膠芽腫またはＣＤ９５Ｌ陰性膠芽腫に分類され、膠芽腫組織サンプル中の細胞の少なくとも５％がＣＤ９５Ｌを発現する場合、および／または、膠芽腫組織サンプル中の腫瘍組織の少なくとも５％の領域にＣＤ９５Ｌが検出される場合に、ＣＤ９５Ｌ陽性とみなされる、
作用物質。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、（ａ）癌サンプルにおいてＣＤ９５Ｌの発現を判定するステップ、および、（ｂ）ＣＤ９５Ｌ発現のレベルに従って癌疾患を分類するステップ、を含む、癌疾患を診断する方法に関する。

【0002】

別の態様は、ＣＤ９５Ｌ発現のレベルに従って癌疾患を分類することによる、癌疾患の診断での使用のための、ＣＤ９５Ｌに特異的に結合する作用物質である。

【0003】

さらに別の態様は、癌患者において全生存期間または／および無再発生存期間を予知（ｐｒｏｇｎｏｓｅ）する方法であって、前記方法は、（ａ）癌サンプルにおいてＣＤ９５Ｌの発現を判定するステップ、および、（ｂ）ＣＤ９５Ｌ発現のレベルにより、患者の生存期間または／および無再発生存期間を予知するステップ、を含み、ここで、ＣＤ９５Ｌ発現は、生存期間と負に相関する。

【0004】

本発明のさらに別の態様は、癌の治療方法であって、前記方法は、（ａ）患者から得られた癌サンプルにおいてＣＤ９５Ｌの発現を判定するステップ、および、（ｂ）ステップ（ａ）において、ＣＤ９５Ｌの発現が癌サンプルにおいて検出された場合にＣＤ９５Ｌ阻害剤を投与するステップ、を含む。

【0005】

さらなる態様は、癌疾患の治療での使用のためのＣＤ９５Ｌ阻害剤に関し、ここで癌疾患は、ＣＤ９５Ｌ陽性の癌疾患である。

【背景技術】

【0006】

分離された腫瘍細胞による周辺脳組織の浸潤は、多形膠芽腫（ＧＢＭ）の効果的な治療に対する主な障害の１つを表わす。グリオーマは、中枢神経系（ＣＮＳ）に由来する大部分の腫瘍を含む。成体では、最も一般的な腫瘍は、星状細胞またはオリゴデンドロサイトに由来するハイグレード新生物である。世界保健機関は、これらの悪性腫瘍を、それらの退形成の度合いに従って、グレードＩＩ（びまん性星状細胞腫）、グレードＩＩＩ（未分化星状細胞腫）、および、グレードＩＶ（ＧＢＭ）に分類する（Ｋｌｅｉｈｕｅｓ，Ｐ．，Ｂｕｒｇｅｒ，Ｐ．Ｃ．，＆Ｓｃｈｅｉｔｈａｕｅｒ，Ｂ．Ｗ．ＴｈｅｎｅｗＷＨＯｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｂｒａｉｎｔｕｍｏｒｓＢｒａｉｎＰａｔｈｏｌ．３，２５５−２６８，１９９３）。グリオーマは、全ての脳腫瘍の５０％よりも多くを占め、成体において極めて最も一般的な原発性脳腫瘍である。新規の診断技術の発達にもかかわらず、生存率は非常に低い。診断後５年生存は、たったの３％である。悪性グリオーマの臨床転帰は、正常な（ｎｏｍａｌ）脳組織における、分離された腫瘍細胞の浸潤に依存する。移動する細胞は、腫瘍の外科的アブレーションを逃れることができ、したがって、術後の放射線療法およびアジュバント化学療法の主な標的である。化学療法剤および照射は、主にアポトーシスを誘導することにより作用する。このアポトーシスの誘導は、ＣＤ９５（Ａｐｏ−１／Ｆａｓ）細胞死受容体／リガンドシステムの活性化を含むことが多い。それにもかかわらず、最も悪性のグリオーマ細胞は、ＣＤ９５により誘導されるアポトーシスに対して耐性である。

【0007】

ＣＤ９５Ｌは、癌診断における予後因子として考えられていなかった。ＣＤ９５Ｌ発現は、癌の治療における治療ストラテジーの決定に関連するとはみなされていなかった。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

本発明では、驚くべきことに、癌サンプルにおけるＣＤ９５Ｌの発現が、患者の生存低減と関連することを見いだした。これは、ＣＤ９５Ｌ発現が、癌患者の全生存期間の予後因子であることを意味する。実施例１は、診断「膠芽腫」を有する腫瘍サンプルでの臨床フェーズＩＩ試験において示し、ＣＤ９５Ｌが可変の程度に発現される。

【0009】

さらに、実施例１は、驚くべきことに、ＣＤ９５Ｌ阻害剤（例えばＡＰＧ１０１）が、ＣＤ９５Ｌを発現している癌を患っている癌患者の生存を改善することができることを示す。対照的に、ＣＤ９５Ｌを発現しない癌を患っている患者は、ＣＤ９５Ｌ阻害剤を用いた処置の恩恵を受けない。実施例１は、癌サンプルにおいてＣＤ９５Ｌ発現を判定するステップを含む診断ステップ、および、それから、ＣＤ９５Ｌが発現される場合はＣＤ９５Ｌ阻害剤を用いて患者を処置するステップを含む、治療ストラテジーを可能にする。ＣＤ９５Ｌの発現による癌の診断的区別（ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）が可能になる。これは、ＣＤ９５Ｌ発現の程度による、癌（例えば膠芽腫）の新規の診断分類をもたらし、ＣＤ９５Ｌを発現する癌を患っているこれらの患者の適応された治療をもたらす。治療の成功を期待することができる場合のみＣＤ９５Ｌ阻害剤がこれらの患者に投与されるので、このストラテジーは有利である。ＣＤ９５Ｌを発現していない癌を患っている患者においては、これらの患者はおそらくＣＤ９５Ｌ阻害剤を用いた処置による恩恵を受けないので、これは不利でない。

【0010】

したがって、本発明の課題は、癌の診断および治療の改善に見ることができる。本明細書において提供される解決は、ＣＤ９５Ｌを発現しているサブタイプ、および、ＣＤ９５Ｌを発現しないサブタイプへの、癌の診断的区別を含む。これらのサブタイプは、今までのところ同定されておらず、ＣＤ９５Ｌ発現に基づく特定の治療を必要とするとは考えられていない。本発明において提供される解決は、本発明において同定されるサブタイプの診断に基づく特定の治療を含む。

【課題を解決するための手段】

【0011】

本発明の第１の態様は、癌疾患を診断する方法であって、
（ａ）癌サンプルにおいてＣＤ９５Ｌの発現を判定するステップ、および
（ｂ）ＣＤ９５Ｌ発現のレベルに従って、癌疾患を分類するステップ、
を含む。

【0012】

本発明の好ましい実施態様では、癌疾患を診断する方法は、ステップ（ｃ）、すなわち、診断されている癌のタイプに適切な治療の方法を決定および／または選択するステップ、および／または、その治療を行なうステップを、含んでよい。

【0013】

本発明は、以下の図および実施例によりさらに説明される。

【図面の簡単な説明】

【0014】

【図1】放射線治療（ＲＴ）のみの群（コントロール群）および放射線治療＋ＡＰＧ１０１群（試験群）にランダム化された、ＧＢＭ患者の生存分析（Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒプロット）。（１）試験群。（２）コントロール群。横軸：生存期間（日）。縦軸：生存率。生存率１．０は、１００％生存を示す。

【図2】図１（Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒプロット）に示された患者から得られたＣＤ９５Ｌ陽性患者のサブグループの生存データの比較。（１）試験群、放射線治療＋ＡＰＧ１０１。（２）コントロール群、放射線治療のみ。横軸：生存期間（日）。縦軸：生存率。生存率１．０は、１００％生存を示す。

【図3】図１（Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒプロット）に示された患者から得られたＣＤ９５Ｌ陰性患者のサブグループの生存データの比較。（１）試験群、放射線治療＋ＡＰＧ１０１。（２）コントロール群、放射線治療のみ。横軸：生存期間（日）。縦軸：生存率。生存率１．０は、１００％生存を示す。

【図4】実施例３による膠芽腫組織切片におけるＣＤ９５Ｌ発現レベルの例。高発現（ＣＤ９５Ｌ陽性）および低ＣＤ９５Ｌ発現（ＣＤ９５Ｌ陰性）の例を示す。パネルは、各発現レベルに関する２つの例を示す。

【図5】精製された抗−ＣＤ９５Ｌモノクローナルウサギ抗体の比較。Ａ）精製された抗−ＣＤ９５Ｌウサギモノクローナル抗体の非還元ＳＤＳ−Ｐａｇｅ／Ｓｉｌｖｅｒ染色。レーン１は、ＨＥＫ−細胞での発現後に精製された組み換え抗体（ＡＰＧ１１８１）を示す。レーン３は、ウサギハイブリドーマクローン２４−８の上清から（ｆｏｒｍ）精製された、精製抗体を示す。Ｂ）精製抗体のＥＬＩＳＡ分析：クローン２４−８由来の抗体およびＡＰＧ１１８１を、ウサギの免疫付与に用いた固定化ＣＤ９５Ｌ−ペプチド（ＣＤ９５Ｌ−ＮＴ＿１−２１）を認識するそれらの特異性に関して分析した。両抗体は、固定化ペプチドに特異的に結合する。両抗体に関する特異的認識を、エピトープ特異ペプチド（＋特異ペプチド）の添加による競合により確認した。しかしながら、非特異ペプチドは両抗体に関して有意な競合作用がない。ＡＰＧ１１８１およびクローン２４−８の間に、特異性または感受性の違いを見ることはできなかった。

【図6】ＩＨＣに基づく分析での抗−ＣＤ９５Ｌウサギモノクローナル抗体の特異性。血漿細胞のサブセットにおいてＣＤ９５Ｌを発現することが知られているヒト扁桃切片を、示されるように、特異ペプチド（ＣＤ９５Ｌ−ＮＴ＿１−２１）の不存在または存在下で、クローン２４−８由来の精製抗体を用いて分析した。ペプチドの不存在下（クローン２４−８）で見られる特異的なシグナルは、競合ペプチドの存在下で完全に失われ、抗体の特異性を確証する。

【図7】抗−ＣＤ９５Ｌモノクローナルウサギ抗体の精製抗体の比較。精製された抗体ＡＰＧ１１８１およびクローン２４−８由来の抗体を、膠芽腫切片でのＩＨＣ分析において、ＣＤ９５Ｌを認識するそれらの特異性に関して分析した。分析のために、市販のポリクローナル抗−ＣＤ９５Ｌ抗体を用いて、以前にＣＤ９５Ｌ−陰性またはＣＤ９５Ｌ−陽性とそれぞれ分析された２つの膠芽腫切片を選択した。図に示されるように、膠芽腫組織のＩＨＣに基づく分析において、ＡＰＧ１１８１およびクローン２４−８の間に、特異性または感受性の違いを見ることはできなかった。

【図8】ＣＤ９５Ｌ−抗体のエピトープマッピングに用いられるペプチド示されるペプチドを、抗−ＣＤ９５Ｌウサギモノクローナル抗体のエピトープの同定に用いた。ペプチドは、ヒトＣＤ９５ＬのＮ末部分をコードする。第一のペプチドＣＤ９５Ｌ−ＮＴ＿１−２１）を、ウサギモノクローナル抗体を産生するためのウサギの免疫化に用いた。より短いトランケートされたバージョン（ペプチド２〜７）、および、それぞれの並べ替えた（ｐｅｒｍｕｔａｔｅｄ）ペプチド（８〜１１）を、個々の抗体のエピトープのファインマッピングに用いた。

【図9】抗−ＣＤ９５Ｌウサギモノクローナル抗体（ＡＰＧ１１８１）のエピトープマッピング。エピトープマッピングのために、それぞれのペプチド（図８参照）をＢＳＡに連結し、ペプチド−ＢＳＡ−コンジュゲート（示される）をＥＬＩＳＡプレートに固定化し、そして、組み換え抗−ＣＤ９５Ｌウサギモノクローナル抗体（ＡＰＧ１１８１）とともにインキュベートし、特異的なペルオキシダーゼ−コンジュゲート抗−ウサギ二次抗体を続けた。図に示されるように、ＡＰＧ１１８１は、ヒトＣＤ９５ＬのＮ末ａａ１３−１９をコードするエピトープを特異的に認識する。

【図10】抗−ＣＤ９５Ｌウサギモノクローナル抗体（ＡＰＧ１１８１）に関するエピトープのファインマッピング。ペプチド−ＢＳＡ−コンジュゲート（図示）を、ＥＬＩＳＡプレートに固定化し、組み換え抗−ＣＤ９５Ｌウサギモノクローナル抗体（ＡＰＧ１１８１）とともにインキュベートし、特異的なペルオキシダーゼ−コンジュゲート抗−ウサギ二次抗体を続けた。（Ａ）示されるように、ＡＰＧ１１８１は、ヒトＣＤ９５ＬのＮ末ａａ１３−１９をコードするエピトープを特異的に認識する。エピトープのファインマッピングのための、並べ替えたペプチド（８〜１１、図８）の使用は、１３位のＹ（チロシン）がそれぞれの抗体ＡＰＧ１１８１／２４−８の特異性を決めるのに絶対的に必要であることを明らかにする。１４位のＷ（トリプトファン）および１９位のＡ（アラニン）は、それぞれ、抗体の結合特異性（エピトープ）に、あまり重要でない影響を有するだけである。（Ｂ）同様のエピトープを認識するが１３位の「Ｙ」に関する絶対的な必要性を有さない異なる抗体（クローン３９−９）は、驚くべきことに、ＩＨＣに基づく分析において、ＣＤ９５Ｌに対する特異的な反応性を示さない。

【図11】ＩＨＣに基づく分析における、抗−ＣＤ９５Ｌウサギモノクローナル抗体の特異性の比較。クローン２４−８およびクローン３９−９由来の精製抗体を、ヒト扁桃（ｔｏｓｉｌ）切片での血漿細胞のサブセットにおいて、ＣＤ９５Ｌを検出するそれらの能力に関して分析した。両抗体は同様のエピトープを共有するが、ＩＨＣに基づく分析において、クローン３９−９は、驚くべきことに、ＣＤ９５Ｌに対する反応性を示さない。この結果に基づき、１３位の「Ｙ」は、クローン２４−８のＩＨＣ反応性のために必須であると結論付けることができる。

【発明を実施するための形態】

【0015】

本発明では、ＣＤ９５Ｌの発現は、任意の公知の適切な方法により判定することができる。例えば、ＣＤ９５ＬのｍＲＮＡを判定することができる。適切な方法の好ましい例は、組織学的、組織化学的または／および免疫組織化学的な方法である。

【0016】

本明細書に記載される癌の診断で用いられるサンプルは、疾患の、より早期の段階に得られた、アーカイブされた（ａｒｃｈｉｖｅｄ）腫瘍組織、例えばバイオプシーまたはパラフィン中に埋め込まれた外科的処置の材料（ｓｕｒｇｅｒｙｍａｔｅｒｉａｌ）であってよい。

【0017】

癌疾患は、ＣＤ９５Ｌ発現のレベルによって、ＣＤ９５Ｌ陽性の癌疾患またはＣＤ９５Ｌ陰性の癌疾患に分類することができる。

【0018】

特に、ＣＤ９５Ｌ陽性の癌疾患は、細胞表面上にＣＤ９５Ｌを発現している細胞により特徴付けられる。しかしながら、本明細書に記載される方法は、ＣＤ９５Ｌの細胞内エピトープの検出に基づいてもよい。

【0019】

癌は、癌サンプル中の細胞の少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、または少なくとも５０％が、ＣＤ９５Ｌを発現する場合に、ＣＤ９５Ｌ陽性とみなすことができる。ＣＤ９５Ｌ陽性細胞の数は、顕微鏡用切片中の細胞を数えることにより決定することができる。

【0020】

組織サンプルにおいてＣＤ９５Ｌを発現している細胞を本質的に検出することができない場合、または、サンプルが、ＣＤ９５Ｌ陽性サンプルに関して本明細書において定義する基準を満たさないサンプル（非−陽性サンプル）である場合に、ＣＤ９５Ｌ発現は不在（ＣＤ９５Ｌ陰性）であると考えられる。ＣＤ９５Ｌ陰性サンプルにおいては、ＣＤ９５Ｌを発現している腫瘍細胞の数は、ＣＤ９５Ｌ陽性サンプルに関して本明細書において定義される閾値未満、例えば、腫瘍細胞の１％未満、２％未満、３％未満、４％未満、５％未満、または、１０％未満であることができる。

【0021】

細胞でのＣＤ９５Ｌ発現は、実施例２に開示される方法のような組織化学的方法により判定することができる。特に、癌サンプルにおけるＣＤ９５Ｌの発現は、サンプルを、ＣＤ９５Ｌに特異的に結合する作用物質と接触させることにより判定することができる。例えば、本明細書に開示されるＣＤ９５Ｌ阻害剤は、これらの阻害剤はＣＤ９５Ｌに特異的に結合することができるので、ＣＤ９５Ｌの判定に用いることができる。ＣＤ９５Ｌに特異的に結合する抗体を用いることができる。適切な抗体は、公知の方法により調製することができる。適切な抗体の例は、実施例２および７に提供される。そのような抗−ＣＤ９５Ｌ特異的抗体またはＣＤ９５Ｌを認識するそのフラグメントは、ＣＤ９５Ｌの細胞外または細胞内ドメインに結合し得る。好ましい実施態様によれば、抗−ＣＤ９５Ｌ特異的抗体またはＣＤ９５Ｌを認識するそのフラグメントは、ＣＤ９５Ｌの細胞内エピトープに結合する。特に好ましい実施態様によれば、抗−ＣＤ９５Ｌ特異的抗体またはＣＤ９５Ｌを認識するそのフラグメントは、ヒトＣＤ９５ＬのＮ末１３位におけるチロシン（Ｙ）に結合する。１３位におけるこのチロシンは、本発明に係る特に好ましい抗体の特異性を定義するために必要である。特に好ましい実施態様によれば、抗−ＣＤ９５Ｌ抗体またはＣＤ９５Ｌを認識するそのフラグメントは、ヒトＣＤ９５ＬのＮ末アミノ酸１３〜１９をコードするエピトープを認識する（図９を参照）。

【0022】

本発明に係る抗体は、モノクローナル抗体であることが特に好ましい。

【0023】

ＣＤ９５Ｌに特異的に結合する他の適切な作用物質は、ＣＤ９５細胞外受容体ドメインまたはその機能性フラグメントを、例えば、Ｆｃドメインまたはその機能性フラグメントをさらに含む融合ポリペプチド中に含む。適切な融合ポリペプチドの例は、本明細書に記載のＡＰＧ１０１である。適切な標識および染色方法は公知である。ビオチン化二次抗体に結合する、ストレプトアビジンが連結したアルカリフォスファターゼを用いた染色の例は、実施例２に提供される。

【0024】

癌は、組織切片中の腫瘍組織の少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、または少なくとも５０％の面積にＣＤ９５Ｌを検出することができる場合に、ＣＤ９５Ｌ陽性とみなすこともできる。この値は、本明細書において、「腫瘍組織のＣＤ９５Ｌ陽性面積（％）」と呼ばれる。非−腫瘍組織は、この分析において除外される。組織切片は、公知の方法により調製することができる。ＣＤ９５Ｌの検出のための適切な方法は、本明細書中に記載される。例示的な方法は実施例２に記載される。ＣＤ９５Ｌ陽性腫瘍組織の面積の決定の例は、実施例３に提供される。ＣＤ９５Ｌ発現は、組織サンプル中に本質的にＣＤ９５Ｌを検出することができない場合、または、腫瘍組織のＣＤ９５Ｌ陽性面積（％）の値が、ＣＤ９５陽性サンプルに関して定義される閾値未満、例えば、腫瘍面積の１％未満、２％未満、３％未満、４％未満、５％未満、または１０％未満である場合に、不在（ＣＤ９５Ｌ陰性）であると考えることができる。

【0025】

ＣＤ９５Ｌ発現（例えば、組織切片中の細胞の数または表面の観点から）は、公知の方法により、例えば、組織切片の自動化分析に基づく方法により、判定することができる。

【0026】

本発明の方法により、任意のタイプの癌（特に固形腫瘍組織）を、ＣＤ９５Ｌの発現に関して診断することができる。診断または／および治療すべき癌は、リンパまたは骨髄起源の癌であってもよい。

【0027】

ＣＤ９５Ｌの発現に基づく診断は、今までのところＣＤ９５Ｌ発現サブタイプを含むと考えられていなかった癌タイプ、および、診断されるＣＤ９５Ｌ発現サブタイプに適応した特定の治療を必要とすると考えられていなかった癌タイプの、診断および治療に特に重要である。本発明で同定される膠芽腫のＣＤ９５Ｌ発現サブタイプの例は、本明細書に記載の、ＣＤ９５Ｌ陽性膠芽腫およびＣＤ９５Ｌ陰性膠芽腫である。本明細書において提供される解決は、本発明において同定されるＣＤ９５Ｌ発現サブタイプの診断に基づく特定の治療を含む。

【0028】

本発明は、癌細胞におけるＣＤ９５Ｌ発現に基づいて、これまでに知られていない疾患のパターンを提供する。任意のタイプの癌（特に固形腫瘍組織）は、ＣＤ９５Ｌ発現陽性またはＣＤ９５Ｌ発現陰性と判定することができる。癌は、浸潤性増殖により特徴付けることができる。本発明によりＣＤ９５Ｌ陽性癌またはＣＤ９５Ｌ陰性癌と診断される癌疾患は、脳腫瘍、結腸癌、結腸直腸癌、膵癌、乳癌、肺癌、腎臓癌、肝臓癌または／およびそれらの転移性疾患からなる群から選択することができる。具体的には、癌疾患はグリオーマであり、より具体的には膠芽腫である。

【0029】

例えば、本発明によれば、これまでに知られている診断方法による診断脳腫瘍は、本明細書に記載のように、腫瘍サンプルにおけるＣＤ９５Ｌ発現の判定の結果に基づいて、ＣＤ９５Ｌ陽性脳腫瘍またはＣＤ９５Ｌ陰性脳腫瘍であると特定することができる。そのような公知の診断方法は、公知の組織学的または病理組織学的な方法、例えば、組織染色の公知の方法、および、公知の免疫組織化学的方法を含む。

【0030】

本発明によれば、これまでに知られている診断方法により得られる診断グリオーマは、ＣＤ９５Ｌ陽性グリオーマまたはＣＤ９５Ｌ陰性グリオーマであると特定することができる。

【0031】

本発明によれば、これまでに知られている診断方法により得られる診断膠芽腫は、ＣＤ９５Ｌ陽性膠芽腫またはＣＤ９５Ｌ陰性膠芽腫であると特定することができる。

【0032】

本発明によれば、これまでに知られている診断方法により得られる診断結腸直腸癌は、ＣＤ９５Ｌ陽性結腸直腸癌またはＣＤ９５Ｌ陰性結腸直腸癌であると特定することができる。

【0033】

本発明によれば、これまでに知られている診断方法により得られる診断膵癌は、ＣＤ９５Ｌ陽性膵癌またはＣＤ９５Ｌ陰性膵癌であると特定することができる。

【0034】

本発明によれば、これまでに知られている診断方法により得られる診断結腸癌は、ＣＤ９５Ｌ陽性結腸癌またはＣＤ９５Ｌ陰性結腸癌であると特定することができる。

【0035】

本発明によれば、これまでに知られている診断方法により得られる診断乳癌は、ＣＤ９５Ｌ陽性乳癌またはＣＤ９５Ｌ陰性乳癌であると特定することができる。

【0036】

本発明によれば、これまでに知られている診断方法により得られる診断肺癌は、ＣＤ９５Ｌ陽性肺癌またはＣＤ９５Ｌ陰性肺癌であると特定することができる。

【0037】

本発明によれば、これまでに知られている診断方法により得られる診断腎臓癌は、ＣＤ９５Ｌ陽性腎臓癌またはＣＤ９５Ｌ陰性腎臓癌であると特定することができる。

【0038】

本発明によれば、これまでに知られている診断方法により得られる診断肝臓癌は、ＣＤ９５Ｌ陽性肝臓癌またはＣＤ９５Ｌ陰性肝臓癌であると特定することができる。

【0039】

本発明によれば、本明細書に記載の特定のタイプの癌に起因する転移性疾患は、ＣＤ９５Ｌ陽性転移性疾患またはＣＤ９５Ｌ陰性転移性疾患であると特定することができる。

【0040】

本発明において用いられるＣＤ９５Ｌ阻害剤は、少なくとも細胞外ＣＤ９５ドメインまたはその機能性フラグメントおよび少なくともＦｃドメインまたはその機能性フラグメントを含む、融合タンパク質を含むことができる。具体的には、融合タンパク質は、ＡＰＧ１０１、ＡＰＧ１０１に対して少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチド、および、ＡＰＧ１０１の機能性フラグメントから選択される。

【0041】

免疫グロブリンＦｃドメインに融合された細胞死受容体ＣＤ９５（Ａｐｏ−１；Ｆａｓ）の細胞外ドメインを含む融合タンパク質は、ＰＣＴ／ＥＰ０４／０３２３９に記載され、その開示は参照により本明細書中に含まれる。本明細書において用いられる「融合タンパク質」は、融合タンパク質アイソフォームの混合物を含み、各融合タンパク質は、少なくとも細胞外ＣＤ９５ドメイン（ＡＰＯ−１；Ｆａｓ）またはその機能性フラグメント、および、Ｆｃドメインまたはその機能性フラグメントである少なくとも第二のドメイン（約４．０〜約８．５のｐＩ範囲内に分布する）を含む。したがって、Ｆｃドメインが、「第二のドメイン」と呼ばれ得る一方で、本明細書において用いられる細胞外ＣＤ９５ドメインは、「第一のドメイン」とも呼ばれ得る。

【0042】

融合タンパク質の混合物は、組成物中に提供することができる。

【0043】

第一のドメインタンパク質は、細胞外ＣＤ９５ドメインであり、好ましくは哺乳類の細胞外ドメインであり、具体的にはヒトタンパク質であり、すなわち、ヒト細胞外ＣＤ９５ドメインである。融合タンパク質の第一のドメイン（すなわち細胞外ＣＤ９５ドメイン）は、好ましくは、ヒトＣＤ９５（配列番号１）のアミノ酸１７０、１７１、１７２または１７３までのアミノ酸配列を含む。シグナルペプチド（例えば配列番号１の１〜２５位）は、存在してよく、または存在しなくてよい。特に治療目的には、ヒトタンパク質の使用が好ましい。

【0044】

融合タンパク質は、同一または異なってよい１つまたは複数の第一のドメインを含むことができる。１つの第一のドメイン、すなわち１つの細胞外ＣＤ９５ドメインは、融合タンパク質中に存在することが好ましい。

【0045】

好ましい実施態様によれば、Ｆｃドメインまたはその機能性フラグメント、すなわち、本発明に係る融合タンパク質の第二のドメインは、ＣＨ２および／またはＣＨ３ドメイン、および場合によりヒンジ領域の少なくとも一部分、または、それから得られる改変免疫グロブリンドメインを含む。免疫グロブリンドメインはＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、またはＩｇＥ免疫グロブリンドメインまたはそれらから得られる改変免疫グロブリンドメインであってよい。好ましくは、第二のドメインは、定常ＩｇＧ免疫グロブリンドメインの少なくとも一部分を含む。ＩｇＧ免疫グロブリンドメインは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４ドメインまたはそれらから改変されたドメインから選択してよい。好ましくは、第二のドメインは、ヒトＦｃドメイン、例えばＩｇＧのＦｃドメイン、例えば、ヒトＩｇＧ１のＦｃドメインである。

【0046】

融合タンパク質は、同一または異なってよい１つまたは複数の第二のドメインを含むことができる。１つの第二のドメイン、すなわち１つのＦｃドメインは、融合タンパク質中に存在することが好ましい。

【0047】

さらに、第一および第二のドメインの両方とも、好ましくは同一種由来である。

【0048】

第一のドメイン、すなわち細胞外ＣＤ９５ドメインまたはその機能性フラグメントは、Ｎ末またはＣ末に位置してよい。第二のドメイン、すなわちＦｃドメインまたは機能性フラグメントは、融合タンパク質のＣ末またはＮ末に位置してもよい。しかしながら、融合タンパク質のＮ末における細胞外ＣＤ９５ドメインが好ましい。

【0049】

さらに好ましい実施態様によれば、融合タンパク質は、ＡＰＧ１０１（ＣＤ９５−Ｆｃ、配列番号１の２６〜４００位）である。配列番号１により定義されるように、ＡＰＧ１０１は、ヒト細胞外ＣＤ９５ドメイン（アミノ酸２６〜１７２）およびヒトＩｇＧ１のＦｃドメイン（アミノ酸１７２〜４００）を含み、さらに場合により、Ｎ末シグナル配列（例えば配列番号１のアミノ酸１〜２５）を含む、融合タンパク質であってよい。シグナルペプチドの存在は、ＡＰＧ１０１の未熟型を示す。成熟の間に、シグナルペプチドは切断される。特に好ましい実施態様によれば、シグナル配列は切断される。切断されるシグナル配列を有するＡＰＧ１０１は、用語「未修飾ＡＰＧ１０１」によっても構成される。さらなる実施態様では、融合タンパク質は、ＡＰＧ１０１と、少なくとも７０％同一性、より好ましくは７５％同一性、８０％同一性、８５％同一性、９０％同一性、９５％同一性、９６％同一性、９７％同一性、９８％同一性、９９％同一性を有するポリペプチドである。本出願によれば、用語「同一性」は、比較される２つのアミノ酸配列が不変である（換言すれば同一のアミノ酸を同じ位置に共有する）程度に関する。

【0050】

用語「ＡＰＧ１０１」は、シグナルペプチドを含んで、および含まずに、配列番号１の２６〜４００位の融合タンパク質を含む。また、用語「ＡＰＧ１０１」は、ＣＤ９５細胞外ドメインのＮ末がトランケートされた形態を含む融合タンパク質も含む。

【0051】

別の好ましい実施態様では、本発明に係る融合タンパク質は、ＡＰＧ１０１の機能性フラグメントである。本明細書において用いられる用語「フラグメント」は、一般に、「機能性フラグメント」、すなわち、対応する野生型または全長タンパク質が有するのと本質的に同一の生物学的活性および／または特性を有する、野生型または全長タンパク質のフラグメントまたは一部分を指す。

【0052】

当業者は、本発明に係る融合タンパク質を設計および生産する方法を知っている。しかしながら、融合タンパク質アイソフォーム（具体的にはＡＰＧ１０１アイソフォーム）の混合物は、例えばＰＣＴ／ＥＰ０４／０３２３９に記載の方法により得ることができ、その開示は参照により本明細書中に含まれる。好ましい実施態様によれば、本発明の融合タンパク質の設計は、第一のドメインおよび第二のドメインの末端アミノ酸（単数または複数）の選択を含む（両ドメイン間に少なくとも１つのアミノ酸オーバーラップを作るため）。第一および第二のドメインの間、または、２つの第一のドメインの間の、オーバーラップは、好ましくは１、２または３アミノ酸の長さを有する。より好ましくは、オーバーラップは、１アミノ酸の長さを有する。オーバーラップするアミノ酸の例は、Ｓ、Ｅ、Ｋ、Ｈ、Ｔ、Ｐ、およびＤである。

【0053】

上記に示されるように、本明細書において用いられる「融合タンパク質」は、アイソフォームの混合物を含む。本明細書において用いられる用語「アイソフォーム」は、同一タンパク質の異なる形態、例えば、ＡＰＧ１０１（具体的には、シグナル配列を有さないＡＰＧ１０１）の異なる形態を指す。そのようなアイソフォームは、例えば、対応する未修飾タンパク質（すなわち、いかなる修飾もされずに所定のコード配列から発現および翻訳されるタンパク質）と比較した場合に、タンパク質長さが異なってよく、アミノ酸が異なってよく（すなわち置換および／または欠失）、および／または、翻訳後の修飾が異なってよい。異なるアイソフォームは、例えば、ＳＤＳ−電気泳動のような電気泳動および／または分画電気泳動（本発明によれば好ましい）によって、区別することができる。

【0054】

タンパク質の長さが異なるアイソフォームは、例えば、対応する未修飾タンパク質と比較した場合に、Ｎ末および／またはＣ末が伸長および／または短縮されてよい。例えば、本発明に係るＡＰＧ１０１アイソフォームの混合物は、未修飾の形態、ならびに、Ｎ末および／またはＣ末が伸長および／または短縮されたその変異型の、ＡＰＧ１０１を含んでよい。従って、好ましい実施態様によれば、本発明に係る混合物は、Ｎ末および／またはＣ末が短縮されたＡＰＧ１０１の変異型を含む。特に好ましいのは、Ｎ末が短縮された融合タンパク質を含む融合タンパク質アイソフォームの混合物である。そのようなＮ末が短縮された融合タンパク質は、未修飾ＡＰＧ１０１の、−１、−２、−３、−４、−５、−６、−７、−８、−９、−１０、−１１、−１２、−１３、−１４、−１５、−１６、−１７、−１８、−１９、−２０、−２１、−２２、−２３、−２４、−２５、−２６、−２７、−２８、−２９、−３０、−３５、−４０、−４５および／または−５０のＮ末が短縮された変異型を含んでよい。特に好ましいのは、−１７、−２１および／または−２６のＮ末が短縮された変異型である。番号は、配列番号１に係るシグナル配列を含むＡＰＧ１０１タンパク質を指す。換言すれば、短縮された融合タンパク質は、配列番号１のＮ末が、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５および／または５０アミノ酸トランケートされた配列を含むことができる。好ましい短縮された融合タンパク質は、Ｎ末が１６、２０、または２５アミノ酸トランケートされた配列番号１を有する。

【0055】

ＡＰＧ１０１アイソフォームのＣ末の短縮の例は、Ｃ末のＬｙｓ−クリッピングである。

【0056】

本発明の好ましい実施態様によれば、本発明に係る融合タンパク質の混合物は、好ましくは、修飾アイソフォームに対して５０モル％の未修飾ＡＰＧ１０１、より好ましくは４０モル％の未修飾ＡＰＧ１０１、より好ましくは３０モル％の未修飾ＡＰＧ１０１、より好ましくは２０、より好ましくは１０モル％の未修飾ＡＰＧ１０１、より好ましくは５モル％の未修飾ＡＰＧ１０１、およびさらにより好ましくは３モル％の未修飾ＡＰＧ１０１、および最も好ましくは１モル％および／またはそれ未満の未修飾ＡＰＧ１０１を含む。最も好ましいのは、未修飾ＡＰＧ１０１を少しも含まない融合タンパク質アイソフォームの混合物を含む実施態様である。

【0057】

上記に概説されるように、アイソフォームは、アミノ酸置換、アミノ酸欠失および／またはアミノ酸の付加によって異なってもよい。そのような置換および／または欠失は、１つまたは複数のアミノ酸を含んでよい。しかしながら、本実施態様によれば、１アミノ酸の置換が好ましい。

【0058】

本発明に係るアイソフォームは、翻訳後修飾に関して異なることもできる。本発明に係る翻訳後修飾は、制限されずに、特に膜局在化（例えば、ミリストイル化、パルミトイル化、イソプレニル化、またはグリピエーション（ｇｌｙｐｉａｔｉｏｎ））のための疎水性基の付加、リポイル化（ｌｉｐｏｙａｔｉｏｎ）などの高い酵素活性のための補助因子の付加、より小さな化学基の付加（例えば、アシル化、ホルミル化、アルキル化、メチル化、Ｃ末でのアミド化、アミノ酸付加、γ−カルボキシル化、グリコシル化、ヒドロキシル化、酸化、グリシル化（ｇｌｙｃｉｌａｔｉｏｎ）、ビオチン化および／またはペグ化）を、含んでよい。

【0059】

本発明によれば、シアル酸の付加、Ｆｃに基づくグリコシル化、具体的にはＦｃに基づくＮ末グリコシル化、および／または、ｐｙｒｏ−Ｇｌｕ−修飾が、翻訳後修飾の好ましい実施態様である。

【0060】

好ましい実施態様によれば、本発明の組成物に含まれる融合タンパク質は、大量のシアル酸を含む。本発明によれば、シアル酸の含有量は、好ましくは約４．０〜７．０モルＮｅｕＡｃ／モルＡＰＧ１０１、より好ましくは、４．５〜６．０モルＮｅｕＡｃ／モルＡＰＧ１０１、および最も好ましくは、約５．０モルＮｅｕＡｃ／モルＡＰＧ１０１である。本明細書において用いられるシアル酸は、ノイラミン酸のＮ−またはＯ−置換誘導体を指す。好ましいシアル酸は、Ｎ−アセチルノイラミン酸（ＮｅｕＡｃ）である。アミノ基は、一般に、アセチルまたはグリコリル基のいずれかを有するが、他の修飾が説明されている。ヒドロキシル置換基は、かなり変化し得る。好ましいヒドロキシル置換基は、アセチル、ラクチル、メチル、サルフェートおよび／またはホスフェート基である。シアル酸の付加は、一般に、よりアニオン性のタンパク質を生じる。生じる負電荷は、この修飾に、結合能力およびタンパク質の表面電荷を変える能力を与える。大量のシアル酸は、より良い血清安定性をもたらし、したがって改善された薬物動態およびより低い免疫原性をもたらす。本発明のＡＰＧ１０１アイソフォームの高度のシアリル化は、大量の二分岐（ｄｉａｎｔｅｎｎａｒｙ）構造により説明することができた。本発明の方法により得られる本発明の組成物におけるＡＰＧ１０１アイソフォームがそのような高度のシアル酸付加を示すことは、非常に驚くべきことと見なされなければならない。

【0061】

本発明によれば、グリコシル化は、融合タンパク質（本明細書に定義される、その機能性フラグメント）の官能基に炭水化物が付加される反応を指す。具体的にはそれは、ＡＰＧ１０１またはそのアイソフォームへの炭水化物の付加に関する。炭水化物は、例えばＮ結合またはＯ結合により付加され得る。Ｎ結合の炭水化物は、アスパラギンまたはアルギニン側鎖の窒素に付加される。Ｏ結合の炭水化物は、セリン、トレオニン、チロシン、ヒドロキシリジンまたはヒドロキシプロリン側鎖の、ヒドロキシ酸素（ｈｙｄｒｏｘｙｏｘｙｇｅｎ）に付加される。本発明によれば、Ｎ結合（特にＦｃに基づくＮ末グリコシル化）が好ましい。特に好ましいＮ結合グリコシル化部位は、ＡＰＧ１０１（配列番号１）のＮ１１８、Ｎ１３６および／またはＮ２５０位に位置する。

【0062】

本発明に係るフコシル化は、分子へのフコース糖単位の付加に関する。本発明に関して、融合タンパク質（具体的にはＡＰＧ１０１）へのフコース糖単位のそのような付加は、グリコシル化の特に好ましいタイプを表わす。フコシル化された形態の大部分は、抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）の低減をもたらす。したがって、融合タンパク質アイソフォームの混合物は、低減したＡＤＣＣにより特徴付けられ、それは、製剤および診断の用途に有益である。

【0063】

本明細書に定義される第一および第二のドメインの他に、本発明に係る融合タンパク質は、さらなる標的化ドメインなどのさらなるドメイン、例えば単鎖抗体またはそのフラグメントおよび／またはシグナルドメインを含んでよい。さらなる実施態様によれば、本発明により用いられる融合タンパク質は、組み換え体の発現後に宿主細胞からの分泌を可能にするＮ末シグナル配列を含んでよい。シグナル配列は、融合タンパク質の第一のドメインと相同のシグナル配列であってよい。あるいは、シグナル配列は、異種のシグナル配列であってもよい。異なる実施態様では、融合タンパク質は、シグナルペプチドのようなさらなるＮ末配列がない。

【0064】

本明細書に記載の融合タンパク質は、Ｎ末がブロックされた融合タンパク質（プロテアーゼによるＮ末分解に関して、より高い安定性を提供する）、および、Ｎ末フリーの融合タンパク質（プロテアーゼによるＮ末分解に関して、より高い安定性を提供する）であってよい。

【0065】

タンパク質のＮ末をブロックする修飾は、当業者に公知である。しかしながら、Ｎ末をブロックする、本発明に係る好ましい翻訳後修飾は、ｐｙｒｏ−Ｇｌｕ−修飾である。Ｐｙｒｏ−Ｇｌｕは、ピロリドンカルボン酸とも呼ばれる。本発明に係るＰｙｒｏ−Ｇｌｕ−修飾は、側鎖カルボキシル基とα−アミノ基の濃縮を介した、グルタミンの環化によるＮ末グルタミンの修飾に関する。修飾タンパク質は、半減期の増大を示す。そのような修飾は、グルタミン酸残基にも生じることができる。特に好ましいのは、Ｎ末が短縮された融合タンパク質−２６に関する、ｐｙｒｏ−Ｇｌｕ−修飾、すなわちピロリドンカルボン酸である。

【0066】

本明細書に記載の混合物は、８０〜９９モル％のＮ末がブロックされた融合タンパク質および／または１〜２０モル％のＮ末フリーの融合タンパク質を含んでよい。

【0067】

さらに好ましい実施態様によれば、本明細書に記載の混合物は、０．０〜５．０モル％、より好ましくは０．０〜３．０モル％、およびさらにより好ましくは０．０〜１．０モル％の、融合タンパク質の高分子量の形態、例えば凝集体を含む。好ましい実施態様では、混合物は、融合タンパク質アイソフォームのいかなる凝集体も含まず、具体的には、ＡＰＧ１０１のいかなる二量体または凝集体も含まない。二量体または凝集体は、それらは溶解度および免疫原性に対して負の効果を有するので、一般に望ましくない。

【0068】

ＡＰＧ１０１の機能的形態は、本明細書に記載のように、ヒンジ領域において、２つの分子の配列番号１に関する１７９位または／および１８２位でジスルフィド架橋により連結された、２つの融合タンパク質を含む。ジスルフィド架橋は、２つの分子の配列番号１に関する１７３位で形成されてもよく、改善された安定性をもたらす。配列番号１に関する１７３位でのジスルフィド架橋が必要でない場合は、この位置でのＣｙｓ残基を別のアミノ酸により置換することができ、または欠失させることができる。

【0069】

本発明によれば、融合タンパク質アイソフォームの混合物は、約４．０〜約８．５のｐＩ範囲内に分布する。さらなる実施態様では、本発明に係る組成物に含まれる融合タンパク質アイソフォームの混合物のｐＩ範囲は、約４．５〜約７．８、より好ましくは約５．０〜約７．５である。

【0070】

等電点（ｐＩ）は、特定の分子または表面が電荷を持たないｐＨ値により定義される。周囲媒質のｐＨ範囲に応じて、タンパク質のアミノ酸は、異なる正電荷または負電荷を有し得る。タンパク質の全電荷の合計は、特定のｐＨの範囲（その等電点、すなわちｐＩ値）ではゼロである。電界中のタンパク質分子は、このｐＨ値を有する媒質のポイントに到達すると、その電気泳動移動度が低下し、この場所に留まる。当業者は、所定のタンパク質のｐＩ値を決定する方法、例えば分画電気泳動を熟知している。本技術は極めて高い分解度が可能である。電荷が１つ異なるタンパク質を、分離および／または分画することができる。

【0071】

本発明のさらに別の態様は、ＣＤ９５Ｌ発現のレベルに従って癌疾患を分類することによる、癌疾患の診断での使用のための、ＣＤ９５Ｌに特異的に結合する作用物質である。本態様では、癌疾患は、ＣＤ９５Ｌ発現のレベルにより、ＣＤ９５Ｌ陽性の癌疾患またはＣＤ９５Ｌ陰性の癌疾患に分類することができる。

【0072】

本態様では、癌は、本明細書に記載の任意の癌であってよい。具体的には、癌疾患は、脳腫瘍、結腸癌、結腸直腸癌、膵癌、乳癌、肺癌、腎臓癌、肝臓癌または／およびそれらの転移性疾患からなる群から選択される。より具体的には、癌疾患はグリオーマであり、最も具体的には膠芽腫である。

【0073】

本態様では、作用物質は、本明細書に記載のＣＤ９５Ｌに特異的に結合する作用物質であってよい。作用物質は、本明細書に記載の任意のＣＤ９５Ｌ阻害剤であってよい。

【0074】

特に、ＣＤ９５Ｌに特異的に結合する作用物質は、少なくとも細胞外ＣＤ９５ドメインまたはその機能性フラグメントおよび少なくともＦｃドメインまたはその機能性フラグメントを含む、本明細書に記載の融合タンパク質を含む。より具体的には、融合タンパク質は、ＡＰＧ１０１、ＡＰＧ１０１に対して少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチド、および、ＡＰＧ１０１の機能性フラグメントから選択される。

【0075】

本発明の別の態様は、ＣＤ９５Ｌ発現のレベルによって患者の癌疾患を分類することによる、癌患者における全生存期間または／および無再発生存期間の予知での使用のための、ＣＤ９５Ｌに特異的に結合する作用物質である。

【0076】

【0077】

【0078】

具体的には、ＣＤ９５Ｌに特異的に結合する作用物質は、少なくとも細胞外ＣＤ９５ドメインまたはその機能性フラグメントおよび少なくともＦｃドメインまたはその機能性フラグメントを含む、本明細書に記載の融合タンパク質を含む。より具体的には、融合タンパク質は、ＡＰＧ１０１、ＡＰＧ１０１に対して少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチド、および、ＡＰＧ１０１の機能性フラグメントから選択される。

【0079】

本発明では、全生存期間（ＯＳ）は、癌を患っている個体のグループに関する生きる見込みを表わす。それは、特定の期間後に生きている可能性がある、グループ内の個体の割合を表わす。

【0080】

本発明のさらに別の態様は、癌患者における全生存期間または／および無再発生存期間を予知する方法であって、前記方法は、
（ａ）癌サンプルにおいてＣＤ９５Ｌ発現を判定するステップ、および、
（ｂ）ＣＤ９５Ｌ発現のレベルによって、患者の生存期間または／および無再発生存期間を予知するステップ（ここでＣＤ９５Ｌ発現は、患者の生存期間と負に相関する）
を含む。

【0081】

本発明の本態様では、癌サンプルを患者から得ることができる。好ましくは、その方法は、患者から癌サンプルを得るステップを含まない。

【0082】

本態様では、癌疾患は、ＣＤ９５Ｌ発現のレベルにより、ＣＤ９５Ｌ陽性の癌疾患またはＣＤ９５Ｌ陰性の癌疾患に分類することができる。

【0083】

【0084】

【0085】

具体的には、ＣＤ９５Ｌ阻害剤に特異的に結合する作用物質は、少なくとも細胞外ＣＤ９５ドメインまたはその機能性フラグメントおよび少なくともＦｃドメインまたはその機能性フラグメントを含む、本明細書に記載の融合タンパク質を含む。より具体的には、融合タンパク質は、ＡＰＧ１０１、ＡＰＧ１０１に対して少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチド、および、ＡＰＧ１０１の機能性フラグメントから選択される。

【0086】

本発明のさらなる態様は、癌の治療方法であって、前記方法は、
（ａ）患者から得られる癌サンプルにおいてＣＤ９５Ｌの発現を判定するステップ、および、
（ｂ）ステップ（ａ）において、癌サンプルにおけるＣＤ９５Ｌの発現が検出された場合にＣＤ９５Ｌ阻害剤を投与するステップ、
を含む。

【0087】

本発明のさらに別の態様は、癌疾患の治療での使用のためのＣＤ９５Ｌ阻害剤であって、ここで、癌疾患はＣＤ９５Ｌ陽性の癌疾患である。癌疾患は、本明細書に記載の任意の癌疾患であってよい。ＣＤ９５Ｌ阻害剤は、本明細書に記載の任意のＣＤ９５Ｌ阻害剤であってよい。

【0088】

本発明のさらなる態様は、癌疾患の治療のための薬剤の製造に関するＣＤ９５Ｌ阻害剤の使用に関し、ここで癌疾患は、ＣＤ９５Ｌ陽性の癌疾患である。ＣＤ９５Ｌ阻害剤は、本明細書に記載の任意のＣＤ９５Ｌ阻害剤であってよい。

【0089】

本明細書に記載の、診断または／および治療される癌患者は、癌（例えば膠芽腫）の第一または第二の再発または進行を有する患者であってよい。患者は、例えば膠芽腫の治療において、放射線療法（例えば６０Ｇｙ）または／およびテモゾロミドを含む標準的な治療が失敗している患者であってよい。具体的には、患者は、例えば膠芽腫の治療のための再照射の候補者である。

【0090】

本明細書に記載の治療用途では、ＣＤ９５Ｌ阻害剤は、例えば注入または注射により、全身に投与することができる。

【実施例】

【0091】

実施例１
癌の治療のためのＡＰＧ１０１（ＣＤ９５リガンド阻害剤）：フェーズＩＩ試験
フェーズＩＩ試験は、膠芽腫の第一または第二の再発または進行を有する患者の治療における、ランダム化したオープン−ラベルの多施設治験の、毎週のＡＰＧ１０１＋再照射（ＡＰＧ１０１＋ＲＴ群、試験群）、対、再照射のみ（ＲＴ群、コントロール群）であった。合計で９１人の患者を本試験に含めた。ＩＴＴ個体群は８４人患者から構成され、ＡＰＧ１０１＋ＲＴ群が５８人、ＲＴ群が２６人であった。腫瘍切除が適さないか、または、切除後に肉眼的な残留腫瘍を有するかのいずれかの、第一または第二の再発の膠芽腫を有する男性および女性患者が、この試験の候補者であった。適格な患者は、標準的な治療（放射線療法（６０Ｇｙ）およびテモゾロミドを含んでいなければならない）に失敗していなければならず、そして、再照射の候補者とならなければならなかった。試験に含まれる患者は、再照射のみ、または、再照射＋進行するまで週１回の３０分の静脈内（ｉ．ｖ．）注入として投与される４００ｍｇのＡＰＧ１０１の、いずれかを受けた。

【0092】

組織学的分析のためのアーカイブされた腫瘍組織は、膠芽腫診断を確証するために、（ＩＴＴ個体群の）８１人の患者から入手可能であった。中央組織学診断（ｃｅｎｔｒａｌｈｉｓｔｏｌｏｇｙｒｅｖｉｅｗ）に関して、バイオプシーまたはパラフィン中に埋め込まれた外科的処置の材料は、膠芽腫の一次診断を確証するために、中央診断（ｃｅｎｔｒａｌｒｅｖｉｅｗ）に利用可能でなければならない。得られた全てのサンプルは、最初の外科的処置および疾患診断または試験前の外科的切除に由来する、アーカイブされたサンプルであった。患者の登録後に、パラフィン包埋された腫瘍サンプルを、試験センターにより回収した。組織切片をこれらの腫瘍サンプルから調製して、免疫組織化学染色（ＩＨＣ）を用いて、ＣＤ９５Ｌを含む様々な「マーケット」を評価した。

【0093】

この臨床試験に参加している多形膠芽腫（ＧＢＭ）患者を、コントロール群および試験群にランダム化した。

【0094】

結果
図１は、コントロール群および試験群（全生存率、ＯＳ）の患者の生存率を示す。図は、ＡＰＧ１０１および放射線治療を受ける試験群の患者は、放射線治療のみを受けるコントロール群と比較して、改善された生存率を有することを示す（表１参照）。

【0095】

【表1】

【0096】

コントロール群患者および試験群患者のＧＢＭ腫瘍サンプルの切片を、ＣＤ９５リガンド（ＣＤ９５Ｌ）の存在に関して、免疫組織化学的染色により分析した（実施例２参照）。

【0097】

驚くべきことに、ＣＤ９５Ｌ発現のレベルおよび分布は、患者間で大きく異なることが見いだされた。約３分の１の患者は、腫瘍組織において強い陽性のＣＤ９５Ｌ発現を示した。さらに別の３分の１の患者は、ＣＤ９５Ｌ陰性の表現型を示した。残りの患者は、ＣＤ９５Ｌのわずかな発現を示した。この表現型は、「低陽性」表現型と呼ぶことができた。

【0098】

放射線治療に加えてＡＰＧ１０１を受ける試験群患者（Ｎ＝５８）では、１８人の患者が、腫瘍組織において、強い陽性のＣＤ９５Ｌ発現の表現型を示した。１８人の患者は、ＣＤ９５Ｌ陰性の表現型を示した。コントロール群（Ｎ＝２６）では、１０人の患者が強い陽性のＣＤ９５Ｌの表現型を示し、９人の患者がＣＤ９５Ｌ陰性の表現型を示した（表２）。

【0099】

【表2】

【0100】

驚くべきことに、コントロール群ＧＢＭ患者の全生存期間は、ＣＤ９５Ｌ発現のレベルと負に相関した。ＧＢＭの、強いＣＤ９５Ｌ陽性の表現型を示す患者は、ＣＤ９５Ｌ陰性ＧＢＭの患者より悪い予後を有した。ＣＤ９５Ｌ陽性の患者は２５０日生存し、ＣＤ９５Ｌ陰性の患者は４６０日生存した（表２参照）。

【0101】

試験群では、ＧＢＭの、強いＣＤ９５Ｌ陽性の表現型を示す患者は、治療の恩恵を受けた。ＣＤ９５Ｌ陽性患者は３５０日生存した。

【0102】

図２のＫａｐｌａｎ−Ｍｅｙｅｒプロットは、コントロール群および試験群における、ＣＤ９５Ｌ陽性患者において得られた生存データを比較する。ＡＰＧ１０１での治療において、曲線は、より長い生存期間にシフトする。これは、ＧＢＭのＣＤ９５Ｌ陽性の表現型を示す患者が、ＡＰＧ１０１の投与の恩恵を受けたことを意味する。メジアン全生存期間は、２５０日（コントロール群）から３５０日に増加した。

【0103】

試験群では、ＣＤ９５陰性患者でのメジアン全生存は４１０日であった。陰性ＣＤ９５Ｌ表現型を示すコントロール群患者と比較して、メジアン全生存は、ＡＰＧ１０１での治療において、４６０日から４１０日に減少した。データを図３のＫａｐｌａｎ−Ｍｅｙｅｒプロットに示す。この図は、試験群およびコントロール群の曲線が大きく重なり、統計的に有意でないことを示す。

【0104】

要約
本実施例は、癌におけるＣＤ９５Ｌの発現が、患者の生存の減少と関連することを示す。これは、ＣＤ９５Ｌが癌における予後因子として適切であることを意味する。これは、特に、可変の程度にＣＤ９５Ｌを発現する癌タイプ（例えば膠芽腫）において重要である。したがって、本発明は、ＣＤ９５Ｌの発現による、癌の診断的区別を可能にする。これは、ＣＤ９５Ｌ陽性癌およびＣＤ９５Ｌ陰性癌における、癌（例えば膠芽腫）の新規の診断的区別をもたらす。

【0105】

したがって、本実施例は、驚くべきことに、ＣＤ９５Ｌ阻害剤（例えばＡＰＧ１０１）が、ＣＤ９５Ｌを発現している癌を患っている患者において、癌の生存を改善することができることを示す。対照的に、ＣＤ９５Ｌを発現しない癌を患っている患者は、ＣＤ９５Ｌ阻害剤を用いた治療による恩恵を受けない。本実施例は、癌サンプルにおいてＣＤ９５Ｌ発現を判定するステップ、および、ＣＤ９５Ｌが発現される場合に患者を治療するステップを含む、治療ストラテジーを可能にする。このストラテジーは、治療の成功を期待することができる患者にＣＤ９５Ｌ阻害剤を投与することができるので、有利である。これは、ＣＤ９５Ｌを発現していない癌を患っている患者にとって、これらの患者は、ＣＤ９５Ｌ阻害剤を用いた治療から恩恵をおそらく受けないので、不利でない。

【0106】

実施例２
ＣＤ９５Ｌの免疫組織化学的判定

【0107】

ＣＤ９５Ｌは、以下の手順を行なうことにより、組織切片（例えば腫瘍組織切片）において判定することができる：
・組織サンプルを、４％緩衝ホルムアルデヒド中に固定し、パラフィン中に埋め込んだ。

【0108】

・３μｍの厚い切片を脱脂（ｄｅｗｏｘｅｄ）した：
１．キシロール１０分。
２．キシロール１０分。
３．キシロール１０分。
１．エタノール１００％５分。
２．エタノール１００％５分。
エタノール９６％５分。
エタノール９０％５分。
エタノール７０％５分。
１．Ｈ_２Ｏｄｅｓｔ．１分
２．Ｈ_２Ｏｄｅｓｔ．５分。

【0109】

・高温抗原脱マスキング手順：
クエン酸（Ｃｉｔｒａｔ）ｐＨ６．０（標的回復溶液（ＴａｒｇｅｔＲｅｔｒｉｅｖａｌＳｏｌｕｔｉｏｎ）、９９℃、（ＤＡＫＯ，カタログ番号Ｓ１６９９）、２５分。

【0110】

・室温で冷却１５分

【0111】

・ＰＢＳ中で洗浄２×５分

【0112】

・高い内因性ビオチンを有する組織に関して：例えば、膵臓、肝臓、腎臓由来のサンプルに関して、Ｂｉｏｔｉｎ−Ｂｌｏｃｋ（ＤＡＫＯ，ＢｉｏｔｉｎＢｌｏｃｋｉｎｇＳｙｓｔｅｍ，Ｘ０５９０）
・アビジン１０分。室温（ＲＴ）
・ＰＢＳ中でリンス１×５分
・ビオチン１０分。ＲＴ
・ＰＢＳ中でリンス１×５分

【0113】

・非特異の抗体結合をブロックするために、切片を、ブロッキング溶液１（ＰＢＳ，ＢＳＡ２０ｍｇ／ｍｌ；Ｓｅｒｖａ，Ｇｅｒｍａｎｙ，カタログ番号１１９２４）、ヒトＩｇＧ１ｍｇ／ｍｌ、（Ｇａｍｍｕｎｅｘ１０％，Ｔａｌｅｃｒｉｓ）とともに、２０分間、インキュベートした。

【0114】

・ブロッキング溶液１中に希釈された一次抗体
・抗ＣＤ９５ａＡＰＧ１０１ウサギＦｃ除去（ｄｅｐｌｅｔｅｄ）２μｇ／ｍｌ
・抗ＣＤ９５Ｌポリクローナルウサギ（Ｄｉａｎｏｖａ，カタログ番号ＤＬＮ−１４０４７）１：１００
・ウサギＩｇＧアイソタイプコントロール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｚｙｔｏｍｅｄ），カタログ番号０８−６１９９）

【0115】

・室温でインキュベーション６０分。

【0116】

・ＰＢＳ中で洗浄２×５分

【0117】

・ブロッキング溶液２を用いて２０分間ブロッキング。ブロッキング溶液２を用いたブロッキング＝ブロッキング溶液１＋２０％正常ヤギ血清，Ｄｉａｎｏｖａ，カタログ番号００５−０００−１２１を用いたブロッキング。

【0118】

・ブロッキング溶液２、例えばヤギＦ（ａｂ’）_２抗＿ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ鎖）ビオチン化（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ，カタログ番号４０５２−０８）中に希釈された二次抗体１：１００、室温でインキュベーション３０分

【0119】

・ＰＢＳ中で洗浄２×５分

【0120】

・ストレプトアビジン−アルカリフォスファターゼ（濃縮ＡＰラベル，ＢｉｏＧｅｎｅｘ，カタログ番号ＨＫ３２１−ＵＫ）、ブロッキング溶液１に希釈、室温でインキュベーション３０分

【0121】

・ＰＢＳ中で洗浄２×５分

【0122】

・アルカリフォスファターゼ基質（ＤＡＫＯＬｉｑｕｉｄＰｅｒｍａｎｅｎｔＲｅｄ，ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎＧｍｂＨ，Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ，カタログ番号Ｋ０６４０）を用いたインキュベーション

【0123】

・ヘマトキシリン（Ｍｅｒｃｋ，ＭａｙｅｒｓＨａｍａｌａｕｎｌｏｓｕｎｇカタログ番号１．０９２４９．０５００）を用いた対比染色

【0124】

・全細胞数に対する染色された細胞数（ＣＤ９５Ｌ陽性細胞（％））、または／および、全面積に対する染色された面積のサイズ（ＣＤ９５Ｌ陽性面積（％））の判定。腫瘍組織を試験する場合：腫瘍細胞の全数に対する染色された腫瘍細胞の数（ＣＤ９５Ｌ陽性腫瘍細胞（％））、または／および、腫瘍組織の全面積に対する腫瘍組織の染色された面積のサイズ（腫瘍組織のＣＤ９５Ｌ陽性面積（％））の判定。非−腫瘍組織は無視する。

【0125】

実施例３
ＣＤ９５Ｌの免疫組織化学的に染色されたスライドの評価
１．一般面
全てのＣＤ９５Ｌの染色されたスライド（実施例２参照）は、神経腫瘍学（Ｃ．Ｈ．）の分野で広範囲の経験を持つ１人の（ｓｉｎｇｌｅ）認定神経病理医により評価された。全体的な評価は、単一の切片においてスライドごとに（ｓｌｉｄｅ−ｂｙ−ｓｌｉｄｅ）行なった。評価プロセス全体において最も長い中断は、間が６０分より長くなかった。神経病理医は、患者の臨床データを知らされなかった。同一の神経病理医は、以前に、Ｍｉｂ１−、ＧＦＡＰ−およびＩＤＨ１Ｒ１３２Ｈ免疫組織化学と組み合わせたＨ＆Ｅ−および銀染色に基づいて、基準の組織学診断を作り出している。しかしながら、ＣＤ９５Ｌの評価の時点で、これらの診断に関するスライドは利用可能でなかった。神経病理医は、診断について、個人的な通知（ｐｅｒｓｏｎａｌｎｏｔｉｃｅ）のみ利用可能であった。さらに、神経病理医は、ＭＧＭＴ状態を評価していて、この分析による結果は、ＣＤ９５Ｌスライドが評価されるときに知られていた。

【0126】

２．較正画像（ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎｆｉｇｕｒｅ）の作成
ＣＤ９５Ｌの免疫組織化学染色は、Ａｐｏｇｅｎｉｘ社により確立された。評価する神経病理医（Ｃ．Ｈ．）は、染色の技術面に関与せず、用いられたプロトコルに関して知らなかった。ＣＤ９５Ｌの免疫組織化学を確立するプロセスの完了後、品質チェックのために、少数のＣＤ９５Ｌ染色スライドを神経病理医にコミットした。神経病理医は、用いた免疫組織化学が、高品質の結果を可能にすることを確認し、このプロトコルが、さらなるＣＤ９５Ｌ染色に関する標準になると定義することを検討した。

【0127】

品質評価のために作成されたこれらのスライドに基づき、ＣＤ９５Ｌの免疫組織化学強度の比較を可能にする較正画像を作成した。ソフトウェアＡｘｉｏＶｉｓｉｏｎ４．８を用いて、ＡｘｉｏＣａｍＨＲデジタルカメラを有するＣａｒｌＺｅｉｓｓＡｘｉｏＰｌａｎ２顕微鏡上で写真を撮った。未修整の写真を、ＣｏｒｅｌＤｒａｗｖ１４．０に直接組み込んで並べた。ＣＤ９５Ｌの免疫組織化学の強度が同様の、異なるサンプル由来の２枚の写真を１列に並べた。要約すると、ＣＤ９５Ｌの免疫組織化学の強度「ＣＤ９５Ｌ陽性（高）」または「ＣＤ９５Ｌ陰性（低）」を表わす２列の写真が作成された（図４参照）。

【0128】

３．概略および組織選択
最初のステップにおいて、スライドを低解像度で顕微鏡（ＯｌｙｍｐｕｓＢＸ４６）の下でスキャンし、固形腫瘍組織の量を評価した。正常の脳実質組織の面積および腫瘍浸潤の面積を、さらなる分析から除外した。腫瘍組織は、以下の基準が満たされる場合に、さらなる評価に選択した：
・低酸素ダメージに関する兆候なくバイタルに見えた腫瘍組織
・切除により誘導される鮮血（ｆｒｅｓｈｂｌｅｅｄｉｎｇ）がない腫瘍組織
・切断により誘導されるアーティファクトの兆候がない腫瘍組織

【0129】

４．単一のスライドの評価−基準「強度」
各スライドの適切な腫瘍組織を、ＣＤ９５Ｌ陽性またはＣＤ９５Ｌ陰性の染色強度に関して評価した。ＣＤ９５Ｌ較正画像を用いて評価を標準化した。ほとんどの腫瘍が別々の面積において異なる染色強度を示したので、これらの合計した面積のパーセンテージを測定した。それぞれの腫瘍は、ＣＤ９５Ｌ陽性またはＣＤ９５Ｌ陰性の染色強度を示す面積を表わす特定の値（％）が与えられた：

【0130】

【表3】

【0131】

最後に、結果を中央病理診断（ｃｅｎｔｒａｌｐａｔｈｏｌｏｇｙｒｅｖｉｅｗ）のフォームで通知した。

【0132】

５．単一スライドの評価−基準「分布パターン」
神経膠腫（例えば膠芽腫）は、腫瘍細胞突起（ｔｕｍｏｒｃｅｌｌｐｒｏｃｅｓｓｅｓ）の線維性マトリックスおよび腫瘍細胞からなる。光学顕微鏡を用いて、これらの突起（ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ）は、通常、特定の腫瘍細胞に割り当てることができない。ＣＤ９５Ｌ抗体の結合が主にマトリックスのそのような細胞区画に見られた場合、その染色パターンを「びまん性」と定義した。その代わり、明らかに腫瘍細胞がＣＤ９５Ｌにより標識された場合は、その染色パターンを「局所性」と定義した。腫瘍組織中にＣＤ９５Ｌ標識が本質的に見られなかった場合、または、ＣＤ９５Ｌ陽性の面積が腫瘍組織の２％より低かった場合、その分布パターンは評価しなかった。最後に、結果を中央病理診断のフォームで通知した。

【0133】

６．ＣＤ９５Ｌの結果の報告
ＣＤ９５Ｌの評価による結果を、中央病理診断のフォーム（上記参照）で通知した。フォームは、責任のある神経病理医により日付が入れられ、署名された。

【0134】

７．ＩＨＣに基づく分析に適した特異的ＣＤ９５Ｌ−抗体の生成
ヒトＣＤ９５Ｌの最初の２１ａａ（ＣＤ９５Ｌ＿ＮＴ１−２１：ＭＱＱＰＦＮＹＰＹＰＱＩＹＷＶＤＳＳＡＳＳ）をコードする合成Ｎ末ペプチドでのウサギの免疫化を用いて、ＣＤ９５Ｌ特異的ウサギモノクローナル抗体を開発した。ＩＨＣに基づくアッセイでのＣＤ９５Ｌの検出に適する適切な抗体の選択のために、候補の抗−ＣＤ９５Ｌウサギモノクローナル抗体の徹底的な特性化（ＩＨＣ分析を含む）を行なった。スクリーニングプロセスは、免疫化に用いたＮ末ペプチドを特異的に認識する非常に多くの抗体を同定した。しかしながら、１つのウサギモノクローナル抗体「クローン２４−８」が、ＩＨＣに基づく分析でのＣＤ９５Ｌの検出に特に適した。

【0135】

持続する抗体供給を確実にするために、クローン２４−８に由来する抗体の組み換え発現をＨＥＫ細胞において行なった。クローン２４−８に由来する組み換え抗体は、それぞれのＩｇＧ重鎖および軽鎖の配列に基づき、そして、ＡＰＧ１１８１と指定された。組み換え抗体の特異性は、ハイブリドーマクローン２４−８に由来する抗体と同一である（図５および図７参照）。抗体の特異性は、ＥＬＩＳＡ、ＩＨＣ分析、および、特異的エピトープのマッピングにより、特徴付けられた。

【図1】