特許 6556160 膵島アミロイドポリペプチド（ＩＡＰＰ）誘導性のβ細胞損傷及び耐糖能障害に拮抗作用を示す新規化合物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6556160

(24)【登録日】2019年7月19日

(45)【発行日】2019年8月7日

(54)【発明の名称】膵島アミロイドポリペプチド（ＩＡＰＰ）誘導性のβ細胞損傷及び耐糖能障害に拮抗作用を示す新規化合物

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/18 20060101AFI20190729BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20190729BHJP

   A61P 3/10 20060101ALI20190729BHJP

   A01K 67/027 20060101ALI20190729BHJP

   C12N 15/12 20060101ALI20190729BHJP

   A61K 31/352 20060101ALI20190729BHJP

   A61K 31/155 20060101ALI20190729BHJP

   A61K 31/426 20060101ALI20190729BHJP

   A61K 31/4439 20060101ALI20190729BHJP

   A61K 38/00 20060101ALI20190729BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20190729BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20190729BHJP

   A61K 49/00 20060101ALI20190729BHJP

   A61K 51/10 20060101ALI20190729BHJP

   C12P 21/08 20060101ALN20190729BHJP

【ＦＩ】

   C07K16/18ZNA

   A61K39/395 N

   A61P3/10

   A01K67/027

   C12N15/12

   A61K31/352

   A61K31/155

   A61K31/426

   A61K31/4439

   A61K38/00

   A61K45/00

   A61P43/00 105

   A61K49/00

   A61K51/10 200

   !C12P21/08

【請求項の数】20

【全頁数】32

(21)【出願番号】特願2016-556885(P2016-556885)

(86)(22)【出願日】2015年3月12日

(65)【公表番号】特表2017-510571(P2017-510571A)

(43)【公表日】2017年4月13日

(86)【国際出願番号】EP2015055238

(87)【国際公開番号】WO2015136055

(87)【国際公開日】20150917

【審査請求日】2016年12月16日

(31)【優先権主張番号】14159194.1

(32)【優先日】2014年3月12日

(33)【優先権主張国】EP

(73)【特許権者】

【識別番号】511029420

【氏名又は名称】ニューリミューン ホールディング エイジー

(73)【特許権者】

【識別番号】507324681

【氏名又は名称】ユニバーシティ・オブ・チューリッヒ

【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＯＦ ＺＵＲＩＣＨ

(74)【代理人】

【識別番号】100114362

【弁理士】

【氏名又は名称】萩野 幹治

(72)【発明者】

【氏名】グリム，ヤン

(72)【発明者】

【氏名】ハイツ，ファブリス

(72)【発明者】

【氏名】ヴィルト，ファビアン

(72)【発明者】

【氏名】ヴェルト，トビアス

【審査官】 藤澤 雅樹

(56)【参考文献】

【文献】 米国特許出願公開第２０１３／００７１４０１（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 特表２００８−５１７８８５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１２／１７０９７７（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１４／０４１０６９（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表２０１０−５０２９３８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２００３／０９２６１９（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表平１０−５０７０８４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Scientific Reports (2014.3.4) Vol.4, No.4267, pp.1-9

【文献】 Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1996) Vol.93, pp.7283-7288

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０７Ｋ １６／００

Ａ０１Ｋ ６７／０２７

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ヒト膵島アミロイドポリペプチド（ｈＩＡＰＰ）抗体又はそのｈＩＡＰＰ結合フラグメントであって、その可変領域に、以下の６つの相補性決定領域（ＣＤＲ）、即ち
ＶＨＣＤＲ１：配列番号２の位置２６−３７，
ＶＨＣＤＲ２：配列番号２の位置５２−６７，
ＶＨＣＤＲ３：配列番号２の位置１００−１１０，
ＶＫＣＤＲ１：配列番号４の位置２４−３８，
ＶＫＣＤＲ２：配列番号４の位置５４−６０，及び
ＶＫＣＤＲ３：配列番号４の位置９３−１０１；
又は、配列番号２に示したＶＨ領域アミノ酸配列及び配列番号４に示したＶＬ領域アミノ酸配列、
を含む、ヒト膵島アミロイドポリペプチド（ｈＩＡＰＰ）抗体又はそのｈＩＡＰＰ結合フラグメント、を有効成分として含み、それが必要な対象において、ｈＩＡＰＰ誘導性の耐糖能障害を回復させること、及び血中グルコースレベルを正常にすること、に使用するための医薬組成物。

【請求項2】

体重増加を正常にするために使用される、請求項１に記載の医薬組成物。

【請求項3】

前記対象が２型糖尿病（Ｔ２Ｄ）に罹患しているか、或いは、２型糖尿病（Ｔ２Ｄ）を発症する危険性を有する、請求項１又は２に記載の医薬組成物。

【請求項4】

ヒト由来モノクローナル抗体、或いはその合成誘導体又は生物工学誘導体である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項5】

前記抗体又はそのｈＩＡＰＰ結合フラグメントが、前記ＶＨ領域及び前記ＶＬ領域に対して、及び／又は、前記６つのＣＤＲに対して異種であるポリペプチド配列を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項6】

前記抗体又はそのｈＩＡＰＰ結合フラグメントが、前記ＶＨ領域及び前記ＶＬ領域に対して、及び／又は、前記６つのＣＤＲに対して異種である定常ドメイン又はその一部を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項7】

前記定常ドメインがヒト定常ドメインである、請求項６に記載の医薬組成物。

【請求項8】

前記定常ドメインがＩｇＧタイプである、請求項７に記載の医薬組成物。

【請求項9】

前記定常ドメインがＩｇＧ１クラス又はＩｇＧ１アイソタイプである、請求項８に記載の医薬組成物。

【請求項10】

前記抗体又はそのｈＩＡＰＰ結合フラグメントが、（ａ）酵素、放射性同位体、蛍光団及び重金属からなる群から選択される検出可能な標識によって検出可能に標識され、又は、（ｂ）薬物に結合させられる、請求項１〜９のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項11】

前記抗体又はそのｈＩＡＰＰ結合フラグメントが、その可変領域に、配列番号６に示したＶＬ領域アミノ酸配列を含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項12】

前記抗体又はそのｈＩＡＰＰ結合フラグメントが、その可変領域に、配列番号２に示したＶＨ領域アミノ酸配列を含む、請求項１１に記載の医薬組成物。

【請求項13】

請求項１１又は１２において定義される抗体又はそのｈＩＡＰＰ結合フラグメント。

【請求項14】

さらに、薬学的に許容される担体を含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項15】

皮下（ｓ．ｃ．）、筋肉内（ｉ．ｍ．）又は静脈内（ｉ．ｖ．）に、並びに／或いは、週に１回、２週間に１回又は月に１回の頻度で投与されるように設計される、請求項１４に記載の医薬組成物。

【請求項16】

膵臓組織における膵島アミロイド原線維、プロト原線維及び／又はアミロイド斑の発症の前に投与されるように設計される、請求項１〜１２、１４又は１５のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項17】

前記組成物がさらに、ＩＡＰＰアミロイド形成を防止することができる、又は低下させることができる薬剤を含む、請求項１６に記載の医薬組成物。

【請求項18】

前記薬剤が、フラボノイド、ＩＡＰＰアナログ、メトホルミン及びチアゾリジンジオン系薬剤（例えば、ロシグリタゾンなど）からなる群から選択される、請求項１７に記載の医薬組成物。

【請求項19】

前記抗体又はそのｈＩＡＰＰ結合フラグメントが、遺伝子組換えｈＩＡＰＰマウスモデルでは１０ｍｇ／ｋｇの投薬量で、及び／又は、遺伝子組換えｈＩＡＰＰラットモデルでは３ｍｇ／ｋｇの投薬量で投与されたときに効果を示し、
前記遺伝子組換えｈＩＡＰＰマウスモデルが、ヒト膵島アミロイドポリペプチド（ｈＩＡＰＰ）をコードするＤＮＡ配列を含む少なくとも１つの導入遺伝子を発現することができること、及び
（ｉ）１月齢及び２月齢のそれぞれにおける、耐糖能障害及び／又は高血糖症によって特徴づけられる糖尿病の自然発症；並びに／或いは
（ｉｉ）２月齢での細胞外のアミロイド沈着物の出現、及び／又は４月齢での広範囲のアミロイドーシス関連のβ細胞喪失、
によって特徴づけられるとともに、
ＦＶＢ／ＮｘＤＢＡ／２Ｊ背景を有し、且つヘミ接合体であり、及び、前記ＤＮＡ配列がラットインスリンＩＩプロモーターに機能的に連結され、
前記遺伝子組換えｈＩＡＰＰラットモデルが、ラットインスリンＩＩプロモーターによって駆動されるｈＩＡＰＰの膵島β細胞での発現を有するヘミ接合型である、
請求項１〜１２、１４〜１８のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項20】

試験化合物（例えば、請求項１〜１９のいずれか一項において定義される抗体又はそのｈＩＡＰＰ結合フラグメント）が、β細胞をｈＩＡＰＰ誘導性の細胞損傷及び／又は膵島アミロイドの毒性影響から保護することができるかどうか、並びに／或いは、ｈＩＡＰＰ誘導性の耐糖能障害を回復することができるかどうかを決定するために使用するための、遺伝子組換えｈＩＡＰＰマウスモデルであって、
ヒト膵島アミロイドポリペプチド（ｈＩＡＰＰ）をコードするＤＮＡ配列を含む少なくとも１つの導入遺伝子を発現することができること、及び
（ｉ）１月齢及び２月齢のそれぞれにおける、耐糖能障害及び／又は高血糖症によって特徴づけられる糖尿病の自然発症；並びに／或いは
（ｉｉ）２月齢での細胞外のアミロイド沈着物の出現、及び／又は４月齢での広範囲のアミロイドーシス関連のβ細胞喪失、
によって特徴づけられるとともに、
ＦＶＢ／ＮｘＤＢＡ／２Ｊ背景を有し、且つヘミ接合体であり、及び、前記ＤＮＡ配列がラットインスリンＩＩプロモーターに機能的に連結される、遺伝子組換えｈＩＡＰＰマウスモデル。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は一般には、アミリンとしてもまた知られているヒト膵島アミロイドポリペプチド（ｈＩＡＰＰ）に特異的に結合する分子に関連し、具体的には、２型糖尿病（Ｔ２Ｄ）に典型的に伴う症状である、膵島アミロイドポリペプチド（ＩＡＰＰ）誘導性のβ細胞損傷及び耐糖能障害に拮抗作用を示すヒト抗体、並びに、そのフラグメント、誘導体及び変異体（バリアント）に関連する。

【背景技術】

【0002】

タンパク質の蓄積、修飾及び凝集は、広く知られている神経変性疾患（例えば、ハンチントン病、アルツハイマー病（ＡＤ）及びパーキンソン病（ＰＤ）など）を含む数多くの代謝疾患の病理学的側面である（非特許文献１）。病理学的なタンパク質凝集はまた、様々な代謝疾患（例えば、２型糖尿病（Ｔ２Ｄ）など）において、また、１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）の個体への臨床的な膵島移植後の膵島拒絶にも関与する。タンパク質の誤った折り畳み及び凝集はアミロイド沈着物の発生を引き起こしており、これらの疾患における細胞毒性に直接的に関連づけられるようである。膵島アミロイドポリペプチド（ＩＡＰＰ又はアミリン）は、膵臓においてβ細胞によってインスリンと一緒に分泌される生理学的なペプチドであり、原線維性の凝集物をＴ２Ｄ患者の膵島（これはランゲルハンス島とも呼ばれる）において形成し、また、疾患の発症において役割を果たすことが示唆されている（非特許文献２）。さらには、前述の通り、ＩＡＰＰ凝集物が、単離された膵島を１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）の患者に移植したときの膵島において見出されている。

【0003】

ヒトＩＡＰＰ（ｈＩＡＰＰ）は、２位及び７位のシステイン残基の間におけるジスルフィド架橋と、アミド化されたＣ末端とを有する、３７個のアミノ酸からなるペプチドホルモンである。膵島は６５％〜８０％がβ細胞から構成され、β細胞により、血中グルコースレベル及び細胞代謝を調節するために不可欠なインスリン及びＩＡＰＰが産生され、分泌される。ＩＡＰＰは、プレプロホルモンのプレプロＩＡＰＰ、すなわち、膵臓のβ細胞において産生される８９アミノ酸の前駆体からプロセシングされる。

【0004】

プレプロＩＡＰＰは、翻訳後、プロ膵島アミロイドポリペプチド（６７アミノ酸のペプチド）に速やかに切断され、このプロ膵島アミロイドポリペプチドはさらなるタンパク質分解及び翻訳後修飾を受けて、ｈＩＡＰＰとなる。増大したインスリン産生が、増大したｈＩＡＰＰレベルを引き起こすように、ｈＩＡＰＰの発現がインスリンと一緒に調節されている。ｈＩＡＰＰは膵臓のβ細胞から血液循環に放出され、胃内容物排出及び満腹の制御を介して、血糖調節にインスリンとの相乗作用で関与する。

【0005】

２型糖尿病（Ｔ２Ｄ）では、遺伝的決定因子及び環境的要因により、インスリン抵抗性の発症が引き起こされ、それに続いて、正常な血中グルコースレベルを維持するために、β細胞量並びにインスリン分泌及びアミリン（ｈＩＡＰＰ）分泌における代償的な増大が生じる。その結果として生じる高濃度のアミリンが、毒性のヒト膵島アミロイドポリペプチド（ｈＩＡＰＰ）オリゴマーの形成、及び、Ｔ２Ｄ患者の９０％超に見出されるｈＩＡＰＰ原線維の沈着に有利に働いている。ｈＩＡＰＰの沈着はインスリン産生β細胞における減少と相関しており、また、１型糖尿病の個体に移植された膵島におけるβ細胞の喪失のための役割を果たすことも提案されている。

【0006】

２型糖尿病は糖尿病の最も一般的な形態であり、全症例の約９０％を占める。この疾患には、世界中で２億人を超える人々が冒されており、その結果、糖尿病による１００万人を超える死者が毎年生じている。３００，０００人を超える患者がスイスでは罹患する。糖尿病の有病率が、人口増加、加齢、都市化、並びに、肥満及び運動不足の増大する蔓延のために先進国及び開発途上国の両方で劇的に増大し続けている。２５０億ＵＳドルという世界的な２型糖尿病市場が、２００９年と２０１６年との間における６．４％の年複利成長率により２０１６年までに３５０億ＵＳドルに達すると予測されている。現在の処置には、食事管理、及び、インスリン感受性を改善するか膵臓を刺激してインスリンを放出させるかのどちらかで血中グルコースレベルを低下させるように種々の経路に作用する薬理学的介入が含まれる。しかしながら、これらの利用可能な処置のどれもがｈＩＡＰＰの凝集及び膵臓β細胞の喪失を阻止することができない。２型糖尿病のための新しい処置戦略には、グルカゴン−ペプチド１（ＧＬＰ−１）のアナログ、及び、ジペプチジルペプチダーゼ４（ＤＰＰ４）（すなわち、内因性ＧＬＰ−１を不活性化する酵素）の阻害剤が含まれる。これらの戦略は、ＧＬＰ−１の強力なインスリン分泌促進効果、及び、ベータ細胞の増殖を高めるその効果に基づいている。

【0007】

より最近の有望な戦略には、ＩＬ−１β経路を標的とする抗炎症性薬物又は抗体の開発が含まれる（非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５；非特許文献６；非特許文献７；非特許文献８；非特許文献９）。重要な注目すべきことに、最近の研究では、ｈＩＡＰＰが、自然免疫系の活性化を引き起こすインフラマソーム−ＩＬ−１β系を特異的に誘導することが示されており（非特許文献１０；非特許文献１１）、したがって、このことは、ｈＩＡＰＰ凝集を標的とする治療戦略を裏づけている。

【0008】

従来、ｈＩＡＰＰ及び／又はプロＩＡＰＰを標的とする能動的及び受動的な免疫療法アプローチで、例えば、特許文献１などにおいて教示される免疫療法アプローチは、ｈＩＡＰＰ原線維及び膵島アミロイドの排除に基づいており、ｈＩＡＰＰ原線維及び膵島アミロイドの排除を必要とする。しかしながら、今までのところ、免疫療法が首尾よく用いられ得る実験的証拠は何らもたらされていない。それとは反対に、インビボ研究では、ワクチン接種により、ｈＩＡＰＰ誘導性のβ細胞アポトーシスをｈＩＡＰＰトランスジェニックマウスにおいて妨げない抗毒性ＩＡＰＰオリゴマー抗体を誘導することができたことが示された；非特許文献１２を参照のこと。

【0009】

上記をまとめると、ｈＩＡＰＰにより誘導される様々な障害、例えば、β細胞損傷、耐糖能障害及び異常な体重増加などに対処する新規な治療剤及び治療戦略が緊急に必要となっている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0010】

【特許文献1】国際特許出願公開ＷＯ０３／０９２６１９

【非特許文献】

【0011】

【非特許文献1】Ｔａｙｌｏｒ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９６（２００５）、１９９１〜１９９５

【非特許文献2】Ｗｅｓｔｅｒｍａｒｋ他（２０１１）、Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｖ．９１（３）：７９５〜８２６）

【非特許文献3】Ｄｏｎａｔｈ他（２００８）、Ｎａｔ．Ｃｌｉｎ．Ｐｒａｃｔ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．４（５）：２４０〜２４１

【非特許文献4】Ｅｈｅｓ他（２００９）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０６（３３）：１３９９８〜１４００３

【非特許文献5】Ｏｗｙａｎｇ他（２０１０）、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １５１（６）：２５１５〜２５２７

【非特許文献6】Ｄｉｎａｒｅｌｌｏ他（２０１０）、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｏｂｅｓ．１７（４）：３１４〜３２１

【非特許文献7】Ｂｏｎｉ−Ｓｃｈｎｅｔｚｌｅｒ他（２０１１）、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．９３（１０）：４０６５〜４０７４

【非特許文献8】Ｂｏｎｉ−Ｓｃｈｎｅｔｚｌｅｒ他（２０１２）、Ｂｒ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．

【非特許文献9】Ｃａｖｅｌｔｉ−Ｗｅｄｅｒ他（２０１２）、Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｃａｒｅ

【非特許文献10】Ｍａｓｔｅｒｓ他（２０１０）、Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１（１０）：８９７〜９０４

【非特許文献11】Ｍａｎｄｒｕｐ−Ｐｏｕｌｓｅｎ他（２０１０）、Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１（１０）：８８１〜８８３）

【非特許文献12】Ｌｉｎ他、Ｄｉａｂｅｔｅｓ ５６（２００７）、１３２４〜１３３２

【発明の概要】

【0012】

本発明は、概して、β細胞をｈＩＡＰＰ誘導性の細胞損傷及び／又は膵島アミロイドの毒性影響から保護すること、並びに／或いは、ｈＩＡＰＰ誘導性の耐糖能障害を、その回復を必要とする対象において回復させること、に使用するためのヒト膵島アミロイドポリペプチド（ｈＩＡＰＰ）結合分子であって、好ましくは、ヒト糖尿病対象の膵臓組織における凝集ｈＩＡＰＰと選択的に結合するｈＩＡＰＰ結合分子に関する。

【0013】

本発明はとりわけ、ｈＩＡＰＰ結合分子（例えば、インビトロで形成されるＩＡＰＰ凝集物及び糖尿病患者から得られる膵臓組織におけるインビボＩＡＰＰ凝集物に対する抗ＩＡＰＰ抗体など）の結合レベルがインビボ活性に関して予測的でなく、したがって、治療的有用性を示すという驚くべき知見に基づいている。したがって、インビトロアッセイに基づいた候補化合物の予備的選択では、生物学的に活性な薬剤が、インビトロでのそれらの劣った成績のために最初に選別されることがあるかもしれない。したがって、動物試験は手間及び時間がかかるので、生化学的なインビトロアッセイ及び細胞に基づいたインビトロアッセイが、薬物候補物を選択するための第一選択肢である。このことは、糖尿病のための遺伝子組換えＩＡＰＰ動物モデルについては特に当てはまる。これは、例えば、これまでに利用可能である様々なマウスモデルは糖尿病を自然発症しないか、又は、６月齢〜１０月齢までに高血糖症及び耐糖能障害を伴って糖尿病を自然発症するだけであるかのどちらかであるからである。加えて、多くの場合にはほんの最小限のアミロイド沈着が、糖尿病を自然発症するマウスにおいて認められるか、又は、１２月齢〜２４月齢でのみ認められる。

【0014】

本発明によれば、候補化合物の信頼できるスクリーニングシステムとして有用であり、このため、試験を合理的な時間で可能にし、したがって、工業的規模及び製薬規模でそれぞれ受け入れやすくする新規なＩＡＰＰ遺伝子組換え動物モデルが提供される（実施例を参照のこと）。具体的には、本発明の動物モデルは、耐糖能障害及び高血糖症が１月齢及び２月齢のそれぞれにおいて既に存在することによって特徴づけられる糖尿病を自然発症し（図４）、そして、関連したβ細胞喪失を伴って、細胞外のアミロイド沈着物が２月齢で現れ、かつ、広範囲のアミロイドーシスが４月齢で認められる。したがって、糖尿病に罹患するヒト対象において認められる臨床上の関連した医学的徴候を含めて、本発明の遺伝子組換え動物における病態生理学の発達が比較的短期間であるために、この新しい動物モデルは、抗糖尿病剤のスクリーニング及び有効性確認のために特に適している。当然のことながら、本発明の動物モデルは、ＩＡＰＰ結合分子をアッセイするために特に適しているが、同様に他の候補化合物も試験することができ、例えば、ＩＡＰＰ／インスリンにより標的化される経路の下流側又は上流側で作用し、並びに／或いは、当該動物におけるＩＡＰＰの異種発現によって誘導される医学的徴候に拮抗できるか、又は改善することができる薬剤を試験することができる。

【0015】

実施例で示されるように、本発明によれば、ヒト糖尿病対象の膵臓組織における凝集ＩＡＰＰと選択的に結合するｈＩＡＰＰ結合分子（図２及び図３）は、β細胞をｈＩＡＰＰ誘導性の細胞損傷及び膵島アミロイドの毒性影響から保護することにおいて効果的であること（図７）、ｈＩＡＰＰ誘導性の耐糖能障害を回復させることにおいて効果的であること（図８）、インスリン分泌を増大させることにおいて効果的であること（図７）、空腹時グルコースを低下させることにおいて効果的であること（図８）、並びに、体重増加を正常にすることにおいて効果的であること（図８）が証明され得る。したがって、本発明のｈＩＡＰＰ結合分子は、上述の医学的徴候の１つ又は複数が一般には伴う２型糖尿病（Ｔ２Ｄ）及び／又は高血圧に罹患する対象、或いは、そのような２型糖尿病（Ｔ２Ｄ）及び／又は高血圧を発症する危険性がある対象を処置することにおいて特に有用である。

【0016】

この点において、本発明に従って行われた実験からの予備的結果は、β細胞の保護が膵島アミロイド沈着物の除去とは無関係に達成されることを示唆する。したがって、本発明のＩＡＰＰ結合分子のＩＡＰＰ拮抗効果は実際には、ＩＡＰＰ特異的な抗糖尿病剤の治療的有用性のためには必要であると先行技術では考えられているＩＡＰＰ原線維の排除及び／又はＩＡＰＰ原線維形成の防止によるものではないかもしれない。これらの考察は、２型糖尿病を処置するための医薬品（エキセナチド；ＢＹＥＴＴＡ（登録商標））として承認されるエキセンディン−４について報告される考察に対応する。なお、エキセンディン−４が承認されたのは、エキセンディン−４は膵島アミロイド沈着を増大させるが、生じたβ細胞毒性をヒト膵島アミロイドポリペプチド遺伝子組換えマウスの膵島において相殺するからである（Ａｓｔｏｎ−Ｍｏｕｒｎｅｙ他、Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ、５４（２０１１）、１７５６〜１７６５を参照のこと）。したがって、本発明の１つの実施形態において、ｈＩＡＰＰ結合分子によって媒介されるβ細胞保護は、対象における膵島アミロイドーシスに関係しない。

【0017】

本発明に従って行われたさらなる実験では、本発明のｈＩＡＰＰ結合分子、すなわち、主題抗体ＮＩ−２０３．２６Ｃ１１が、凝集した様々な構造物とそれらの発達の早期段階で結合することができることが示され得る（実施例５を参照のこと）。具体的には、主題抗体ＮＩ−２０３．２６Ｃ１１は、原線維性の特徴を単に示すにすぎない初期の構造物、すなわち、集合して、不溶性線維を形成し、しかし、原線維性の形態学のものではなく、それにもかかわらず、本発明のｈＩＡＰＰ結合分子により検出することができるタンパク質に結合する（図９を参照のこと）。従って、１つの実施形態において、本発明のｈＩＡＰＰ結合分子は、原線維性ＩＡＰＰ構造物の早期検出が可能であり、また、原線維性ＩＡＰＰ構造物の早期検出のために使用される。好ましい実施形態において、ＩＡＰＰ結合分子により、ｈＩＡＰＰの最初の組み立てが行われるときのｈＩＡＰＰ凝集物が検出される。

【0018】

早期の原線維性構造物と結合する主題抗体の性質を考慮すると、１つの実施形態において、本発明のｈＩＡＰＰ結合分子は、ｈＩＡＰＰ誘導性の細胞損傷、膵島アミロイドの毒性影響の処置、保護及び／又は改善において、並びに／或いは、原線維発達の早期段階におけるｈＩＡＰＰ誘導性の耐糖能障害を回復させることにおいて使用される。したがって、本発明によるｈＩＡＰＰ結合分子は好ましくは、ヒト糖尿病対象の膵臓組織における早期の原線維性の凝集ｈＩＡＰＰと選択的に結合する。

【0019】

耐糖能障害は、空腹時血糖が参照基準範囲内にある一方で、食後期が、血中グルコースレベルにおける急速かつ大きい増大によって特徴づけられる。この異常に高いグルコース（血糖）レベルが糖尿病の顕著な兆候であり、これは高血糖症についての特徴である。実施例６及び実施例７において明らかにされ、また、図８及び図１０に示されるように、主題抗ｈＩＡＰＰ抗体のＩＡＰＰ遺伝子組換え動物への投与は血中グルコースレベルを正常にし、したがって、高血糖症の防止又は処置において有用であり得る。したがって、本発明の１つの実施形態において、ｈＩＡＰＰ結合分子が、血中グルコースレベルを正常にすることに使用される。さらには、同様に実施例６において明らかにされ、また、図８に示されるように、主題抗ｈＩＡＰＰ抗体の投与は、動物モデルにおいてｈＩＡＰＰと関連する体重増加の正常化を引き起こした。したがって、１つの実施形態において、ｈＩＡＰＰ結合分子は、典型的にはｈＩＡＰＰと関連するが、体重を正常にするために使用される。

【0020】

原理的には、ヒト糖尿病対象の膵臓組織における凝集ｈＩＡＰＰと選択的に結合する任意のｈＩＡＰＰ結合分子及び任意のｈＩＡＰＰ相互作用分子はそれぞれ、本発明に従って使用され得る。本発明におけるｈＩＡＰＰ結合分子という用語はまた、この分子の任意の前駆体及び個々の成分をも包含することが意図される。例えば、言及されるｈＩＡＰＰ結合分子が、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質（例えば、抗体、ＩＡＰＰ誘導体又はペプチド阻害剤など）であるならば、それぞれの用語にはまた、そのような分子をコードするポリヌクレオチド、当該分子のコード配列を含むベクター（特に発現ベクター）、同様にまた、このポリヌクレオチド又はベクターを含む宿主細胞が含まれる。候補化合物の糖尿病性膵臓組織特異的なｈＩＡＰＰ結合を、図２及び図３に示されるように、また、実施例１に従って明らかにすることができ、そして、この候補化合物の有効性確認を、実施例１及び実施例３において例示されるような本発明の新しい動物モデルを用いて行うことができる。しかしながら、小さい有機分子の場合、膵臓組織の表面／内部におけるｈＩＡＰＰとのそれらの相互作用を明らかにすることは面倒である場合がある。代わりに、当業者は、この技術分野で知られている生化学的な結合アッセイ及び親和性標識化技術に頼る場合がある；例えば、Ｌｏｍｅｎｉｃｋ他、Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｉｒｅｃｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔａｒｇｅｔｓ ｏｆ ｓｍａｌｌ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ（小分子の直接的なタンパク質標的の特定）、ＡＣＳ Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．（２０１１）、３４〜４６、及び、Ｊｉａｎｇ他、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ｂａｓｅｄ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ｆｉｂｅｒ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｔｈａｔ ｒｅｄｕｃｅ ｔｈｅ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｏｆ ａｍｙｌｏｉｄ ｂｅｔａ（アミロイドベータの細胞毒性を低下させる線維結合分子の構造に基づく発見）、ｅＬｉｆｅ ２０１３、２：ｅ００８５７（オンライン発表）を参照のこと。陽性の結果の場合、その後、その化合物が有効性確認のために本発明の動物モデルに適用される場合がある。

【0021】

「結合分子」は、本発明に関連して使用される場合、主に抗体及びそのフラグメントに関連し、しかし、２型糖尿病（Ｔ２Ｄ）と診断される患者の膵臓における病理学的なｈＩＡＰＰ凝集物を選択的かつ用量依存的に認識し、実施例において例示されるＮＩ−２０３．２６Ｃ１１抗体の機能的性質を示す、他の非抗体分子を示す場合もあり、そのような他の非抗体分子には、ホルモン、受容体、リガンド、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子、シャペロン（例えば、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）など）、同様にまた、細胞−細胞接着分子（例えば、カドヘリンスーパーファミリー、インテグリンスーパーファミリー、Ｃ型レクチンスーパーファミリー及び免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーのメンバーなど）、及び、特に、非免疫グロブリンタンパク質の有望なクラスである設計されたアンキリン反復タンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）の中で、標的結合について抗体を上回る利点をもたらすことができるものが含まれるが、これらに限定されない（総説については、例えば、Ｓｔｕｍｐｐ及びＡｍｓｔｕｔｚ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．Ｄｅｖｅｌ．、１０（２００７）、１５３〜１５９、及び、それに引用される参考文献を参照のこと）。したがって、明瞭性だけのために、また、本発明の範囲を限定することなく、下記の実施形態のほとんどが、治療剤を開発するための好ましい結合分子を代表する抗体及び抗体様分子に関して議論される。本発明の抗体、或いはその抗原結合フラグメント、免疫特異性フラグメント、変異体又は誘導体には、ポリクローナル性、モノクローナル性、多特異性、マウス型、ヒト型、ヒト化型、霊長類化型、マウス化型又はキメラ型の抗体、組換えの完全な抗体（免疫グロブリン）、具体的にはモノクローナルな組換えの完全な抗体（免疫グロブリン）、単鎖抗体、エピトープ結合フラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ’）２）、Ｆｄ、Ｆｖ、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、単鎖抗体、ジスルフィド連結Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、ＶＬドメイン又はＶＨドメインのどちらかを含むフラグメント、Ｆａｂ発現ライブラリーによって作製されるフラグメント、並びに、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体（例えば、本明細書中に開示される抗体に対する抗Ｉｄ抗体を含む）、キメラ抗体、ＣＤＲグラフト化抗体、二価抗体−構築物、合成抗体、交差クローン化（ｃｒｏｓｓ−ｃｌｏｎｅｄ）抗体、完全ヒト型抗体、ヒト化型抗体、異種又はキメラなヒト−マウス抗体、ナノボディー及びジアボディーなどが含まれるが、これらに限定されない。様々なｓｃＦｖ分子がこの技術分野では知られており、例えば、米国特許第５，８９２，０１９号に記載される。本発明の免疫グロブリン分子又は抗体分子は免疫グロブリン分子のどのようなタイプのものも可能であり（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ及びＩｇＹ）、又は、どのようなクラスのものも可能であり（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）、又は、どのようなサブクラスのものも可能である。

【0022】

本発明の好ましい実施形態において、ｈＩＡＰＰ結合分子は、組織化学的染色を受けやすく、それにより、患者から得られる膵臓組織で、ＩＡＰＰ凝集物を含有する膵臓組織に対する結合の容易な特定を可能にするという点で免疫学的に活性である。したがって、本発明の特に好ましい実施形態において、ｈＩＡＰＰ結合分子は抗ｈＩＡＰＰ抗体又はそのｈＩＡＰＰ結合フラグメントである。最も好ましくは、抗体はヒト由来抗体である。本発明のｈＩＡＰＰ結合分子は、特定及び特徴づけがインビトロで行われ、クローン化及び組換え産生が、国際特許出願公開ＷＯ２００８／０８１００８に詳しく記載されるようなＮｅｕｒｉｍｍｕｎｅ’ｓ ＲＴＭ（商標）技術によって行われてもよい。加えて、又は、代替において、ｈＩＡＰＰ結合分子の存在及び親和性についてのスクリーニングプロセスは、この場合には膵島上のアミロイド沈着物について同様に行われる高感度な組織アミロイド斑免疫反応性（ＴＡＰＩＲ）アッセイ（例えば、国際特許出願公開ＷＯ２００４／０９５０３１（その開示内容が参照によって本明細書中に組み込まれる）に記載されるアッセイなど）の工程を含んでもよい。

【0023】

好ましくは、本発明に従って使用されるためのヒト抗ｈＩＡＰＰ抗体が、健康なヒト対象のプールから、又は、Ｔ２Ｄを発症する危険性が高いが、抗体単離時には好ましくはＴ２Ｄの徴候を何ら示さず、しかし、アミロイド沈着を示し、かつ、ＩＡＰＰ特異的な免疫応答を示す肥満患者及び他の患者のプールから単離されている。そのようなヒト由来抗体はまた、そのような抗体が、実際に被験体によって最初に発現されたものであり、例えば、ヒト免疫グロブリン発現ファージライブラリーによって生じるインビトロ選択された構築物、又は、ヒト免疫グロブリンレパートリーの一部を発現する遺伝子組換え動物において生じる異種抗体ではないことを強調するために（なお、それらはこれまで、ヒト様抗体を提供するために試みるための最も一般的な方法を表していた）、「ヒト自己抗体」と呼ばれる場合がある。他方で、本発明のヒト由来抗体は、プロテインＡカラム又は親和性カラムによって精製される場合があるヒト血清抗体そのものから区別するために、合成（的）、組換え（型）及び／又は生物工学（的）であると表現される場合がある。

【0024】

本発明の好ましい実施形態において、ｈＩＡＰＰ結合分子は、本出願人の同時係属中の国際特許出願公開ＷＯ２０１４／０４１０６９に開示されるヒト由来のモノクローナル抗ｈＩＡＰＰ抗体に由来する。なお、国際特許出願公開ＷＯ２０１４／０４１０６９の開示内容は、抗ｈＩＡＰＰ抗体、それらのＣＤＲ及び可変領域のアミノ酸配列、抗ｈＩＡＰＰ抗体の組換え産生、同様にまた、抗ｈＩＡＰＰ抗体及び同等な抗体の免疫学的かつ生物学的な活性を試験するために有用であるアッセイを記載する実施例に関しては特に、参照によって本明細書中に組み込まれる。加えて、別途言及される場合を除き、本明細書中で使用されるような用語、例えば、本明細書中における「ＩＡＰＰ」及び「ＣＤＲ」などには、国際出願公開ＷＯ２０１４／０４１０６９（上掲）において提供されるような定義が与えられる。

【0025】

添付の実施例において示されるように、本発明は、ヒト由来の抗ｈＩＡＰＰ抗体ＮＩ−２０３．２６Ｃ１１により例示される。抗体の結合特異性はほとんど、可変重鎖領域及び可変軽鎖領域を含むその結合ドメインによって、具体的には、それに含有される相補性決定領域（ＣＤＲ）の１つ又は複数によって決定される。この技術分野では知られているように、フレームワーク領域及び／又はＣＤＲにおける変異は実質的な影響を結合特異性に与えない場合があり、それどころか、親和性を高めることまでできるかもしれない。例えば、当業者は、結合親和性が、アミノ酸置換をＣＤＲ内において、又は、Ｋａｂａｔによって定義されるようなＣＤＲと部分的に重なる超可変ループ（Ｃｈｏｔｈｉａ及びＬｅｓｋ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９６（１９８７）、９０１〜９１７）の内部において行うことによって強化される場合があることを理解している；例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ他、Ｎａｔｕｒｅ、３３２（１９８８）、３２３〜３２７を参照のこと。したがって、本発明はまた、元の抗体のＣＤＲの１つ又は複数が１つ又は複数のアミノ酸置換を含む抗体（好ましくは２つ以下のアミノ酸置換を含む抗体）に関する。

【0026】

したがって、１つの実施形態において、本発明の上記ｈＩＡＰＰ結合分子のいずれか１つは、その結合ドメインに、
（ａ）図１に示される重鎖（ＶＨ）領域アミノ酸配列及び／又は軽鎖可変（ＶＬ）領域アミノ酸配列（配列番号１、配列番号３及び配列番号５）の少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）；
（ｂ）図１に示されるＶＨ領域及び／又はＶＬ領域のアミノ酸配列；
（ｃ）（ａ）のアミノ酸配列のいずれか１つの部分的変化から生じるアミノ酸配列からなる少なくとも１つのＣＤＲ；並びに／或いは
（ｄ）（ｂ）のアミノ酸配列のいずれか１つの部分的変化から生じるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び／又は軽鎖可変領域
を含む。

【0027】

抗体ＮＩ−２０３．２６Ｃ１１は、上述の国際特許出願公開ＷＯ２０１４／０４１０６９に開示される抗ｈＩＡＰＰ抗体の１つである。それに記載されるヒト組換え抗体のＩＡＰＰ結合エピトープのペップスキャン分析により、ａａ２−ＣＮＴＡＴＣＡ−８（配列番号７）を含むヒトＩＡＰＰ内の配列が、抗体ＮＩ−２０３．２６Ｃ１１によって認識される特有な線状エピトープとして明らかにされた。抗体ＮＩ−２０３．２６Ｃ１１のエピトープ精密マッピングに関する最近の実験データでは、ＮＩ−２０３．２６Ｃ１１がｈＩＡＰＰとＮ末端で結合し、その際、重要な役割が、２番目、３番目、４番目及び７番目のアミノ酸について有することが明らかにされた。具体的には、例えば、２番目のアミノ酸位置の欠失又は変異は抗体ＮＩ−２０３．２６Ｃ１１のＩＡＰＰ結合を実質的に無効にするので、２番目及び７番目のアミノ酸の存在が、結合のために必要であるようである。したがって、抗体ＮＩ−２０３．２６Ｃ１１と等価な抗ＩＡＰＰ抗体を決定するために、一般的な完了アッセイ（ｃｏｍｐｌｅｔｉｏｎ ａｓｓａｙ）のほかに、抗原結合アッセイが使用される場合があり、特にＥＬＩＳＡが、所与の抗ＩＡＰＰ抗体が結合優先、すなわち、上記必須のアミノ酸位置を有する２−ＣＮＴＡＴＣＡ−８（配列番号７）に対する結合特異性、を実質的に示すかどうかを明らかにするために、使用される場合がある。

【0028】

好ましくは、本発明のｈＩＡＰＰ結合分子は、その免疫グロブリン鎖の一方又は両方において、図１に示されるような可変領域のうちの２つ又は３つすべてのＣＤＲを含む。

【0029】

本発明の好ましい実施形態において、ｈＩＡＰＰ結合分子、例えば、抗ｈＩＡＰＰ抗体などは、表Ｉに示される抗ＩＡＰＰ抗体のＶ_Ｈ領域又はＶ_Ｌ領域のポリヌクレオチド配列を有する核酸を含むポリヌクレオチドによって、或いは、そのような核酸から本質的になるポリヌクレオチドによって、或いは、そのような核酸からなるポリヌクレオチドによってコードされる。これに関連して、当業者は、軽鎖及び／又は重鎖の可変ドメインを少なくともコードするポリヌクレオチドは両方の免疫グロブリン鎖又は一方の免疫グロブリン鎖のみの可変ドメインをコードすることがあることを容易に理解するであろう。したがって、１つの実施形態において、ポリヌクレオチドは、表Ｉに示されるような抗ＩＡＰＰ抗体のＶ_Ｈ領域及びＶ_Ｌ領域のポリヌクレオチド配列を有する核酸を含み、或いは、そのような核酸から本質的になり、或いは、そのような核酸からなる。

【0030】

【表1】

表Ｉ：抗ＩＡＰＰ抗体のＶ_Ｈ領域及びＶ_Ｌ領域のヌクレオチド配列

【0031】

代替において、本発明に従って使用されるためのｈＩＡＰＰ結合分子は、膵臓組織におけるｈＩＡＰＰ凝集物に対する結合について、図１に示されようなＶＨ領域及びＶＬ領域を有する抗体と競合する。そのようなｈＩＡＰＰ結合分子は、特に治療的適用のための抗体（例えば、マウス抗体、ヒト化抗体、異種抗体、キメラなヒト−マウス抗体又は好ましくはヒト由来抗体）である場合がある。しかしながら、診断使用及び研究のためには一般に、マウス抗体が同様に好適である。抗体の抗原結合フラグメントは、例えば、単鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖ）、Ｆ（ａｂ’）フラグメント、Ｆ（ａｂ）フラグメント及びＦ（ａｂ’）２フラグメントである。いくつかの適用のために、抗体の可変領域のみが必要とされ、この場合、抗体の可変領域は、当該抗体を好適な試薬により処理し、その結果、Ｆａｂ’部分、Ｆａｂ部分又はＦ（ａｂ”）_２部分を生じさせるようにすることによって得ることができる。そのようなフラグメントは、例えば、免疫グロブリンの免疫特異性部分を検出用試薬（例えば、放射性同位体など）に連結することを伴う免疫診断手順における使用のために十分である。

【0032】

例示的なＩＡＰＰ結合分子、すなわち、抗ｈＩＡＰＰ抗体はまた、アルツハイマー病のヒト脳における病理学的なＡβ沈着物を認識しないことが示され得る。したがって、１つの実施形態において、本発明のｈＩＡＰＰ結合分子は、アルツハイマー病のヒト脳における病理学的なＡβ沈着物を認識しない。

【0033】

本発明の１つの実施形態において、ｈＩＡＰＰ結合分子は、ｈＩＡＰＰ結合ドメイン（例えば、ＶＨ領域及び／又はＶＬ領域）に対して、及び／又は、少なくとも１つのＣＤＲに対して異種であるポリペプチド配列を含む。異種のポリペプチド配列には、異なる特異性の結合ドメイン、ペプチドリンカー、ペプチドタグ、Ｎ末端及びＣ末端のペプチド部分、並びにＦｃドメインなどが単独又は組合せで含まれるが、これらに限定されない。当然のことながら、加えて、又は、代替において、本発明のＩＡＰＰ結合分子は、化学的又は生化学的な手段及び方法によりインビトロで付加されることがある非ペプチド部分（例えば、ポリエチレングリコールなど）を含有してもよい。

【0034】

本発明に従って使用されるためのｈＩＡＰＰ結合分子又はそれらの対応する免疫グロブリン鎖はさらに、この技術分野で知られている従来の技術を使用して改変することができ、例えば、この技術分野で知られているアミノ酸欠失、アミノ酸挿入、アミノ酸置換、アミノ酸付加及び／又は組換え、並びに／或いはいずれかの他の改変を単独又は組合せでのどちらかで使用することによって改変することができる。そのような改変を免疫グロブリン鎖のアミノ酸配列の根底にあるＤＮＡ配列に導入するための様々な方法が当業者には広く知られている；例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎ．Ｙ．（１９８９）、及び、Ａｕｓｕｂｅｌ、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎ．Ｙ．（１９９４）を参照のこと。本発明の抗体の修飾には、アセチル化、ヒドロキシル化、メチル化、アミド化、及び、炭水化物部分又は脂質部分及び補因子などの結合又は除去を含む側鎖修飾、骨格修飾、並びに、Ｎ末端修飾及びＣ末端修飾を含む、１つ又は複数の構成アミノ酸における化学的及び／又は酵素的な誘導体化が含まれる。同様に、本発明は、上記抗体又はその何らかのフラグメントを異種分子（例えば、カルボキシル末端での免疫刺激リガンドなど）に融合されたアミノ末端において含むキメラなタンパク質の製造を包含する；対応する技術的詳細については、例えば、国際特許出願公開ＷＯ００／３０６８０を参照のこと。

【0035】

好ましい実施形態において、本発明のｈＩＡＰＰ結合分子は、結合ドメイン（例えば、ＶＨ領域及び／又はＶＬ領域）に対して、及び／又は、少なくとも１つのＣＤＲに対して異種である定常ドメイン又はその一部を含み、この場合、好ましくは、定常ドメインはヒト定常ドメインである。好ましくは、定常ドメインはＩｇＧタイプのものであり、好ましくはＩｇＧ１クラス又はＩｇＧ１アイソタイプである；例えば、Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ及びＬｅ Ｇａｌｌ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２６（２００４）、３９〜６０；Ｃｈａｎ及びＣａｒｔｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １０（２０１０）、３０１〜３１６；Ｖｉｎｃｅｎｔ及びＺｕｒｉｎｉ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｊ．７（２０１２）、１４４４〜１４５０を参照のこと。

【0036】

したがって、本発明は、どのようなｈＩＡＰＰ結合分子であれ、当該分子を、β細胞をｈＩＡＰＰ誘導性の細胞損傷及び／又は膵島アミロイドの毒性影響から保護することにおいて、並びに／或いは、ｈＩＡＰＰ誘導性の耐糖能障害を、それを必要とする対象において回復させることにおいて有用にする機能的特徴及び生物学的特徴を有する本明細書中上記で記載されるような、また、定義されるようなｈＩＡＰＰ結合分子に関連する。

【0037】

本発明のさらなる実施形態において、本発明に従って使用されるためのｈＩＡＰＰ結合分子は検出可能に標識されるか、又は、他の場合には機能的部分（ｍｏｉｅｔｙ）に連結される。様々な標識化剤が本発明のｈＩＡＰＰ結合分子に対して直接的又は間接的のどちらでもカップリングされることが可能である。間接的なカップリングの一例は、スペーサー部分の使用によるものである。さらには、本発明のｈＩＡＰＰ結合分子はさらなるドメインを含むことができ、この場合、前記ドメインは共有結合又は非共有結合によって連結されている。連結は、この技術分野で知られている方法及び上記方法に従った遺伝子融合に基づくことが可能であり、又は、例えば、化学的架橋によって、例えば、国際特許出願公開ＷＯ９４／０４６８６に記載されるような化学的架橋によって行うことができる。本発明のｈＩＡＰＰ結合分子を含む融合タンパク質に存在するさらなるドメインは好ましくは、柔軟なリンカーによって、好都合にはポリペプチドリンカーによって連結される場合があり、この場合、前記ポリペプチドリンカーは、前記さらなるドメインのＣ末端と本発明のｈＩＡＰＰ結合分子のＮ末端との間の距離、又は、逆に、本発明のｈＩＡＰＰ結合分子のＣ末端と前記さらなるドメインのＮ末端との間の距離に広がるために十分である長さのペプチド結合した複数の親水性アミノ酸を含む。治療的又は診断的に活性な薬剤が様々な手段によって本発明のｈＩＡＰＰ結合分子にカップリングされることが可能である。これには、例えば、治療的又は診断的に活性な薬剤に共有結合法（例えば、ペプチド連結など）によってカップリングされる本発明の抗ｈＩＡＰＰ抗体の可変領域を含む単鎖の融合タンパク質が含まれる。さらなる例には、下記の限定されない例示的な列挙における分子を含めて、さらなる分子に共有結合又は非共有結合によりカップリングされる抗原結合フラグメントを少なくとも含む分子が含まれる。Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒ（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｓｕｒｐ．ＳｕＤＰ ７（１９９２）、５１〜５２）は、ＣＤ３に対するＦｖ領域が可溶性ＣＤ４又は他のリガンド（例えば、ＯＶＣＡ及びＩＬ−７など）にカップリングされる二重特異性試薬ヤヌシン（ｊａｎｕｓｉｎ）を記載する。同様に、本発明の抗体の可変領域はＦｖ分子の中に構築され、代替リガンド（例えば、引用された論文において例示されるリガンドなど）にカップリングされることが可能である。Ｈｉｇｉｎｓ（Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１６６（１９９２）、１９８〜２０２）は、ＧＰ１２０のＶ３領域における特異的配列に向けられる抗体に架橋されるＯＫＴ３から構成されるヘテロコンジュゲート抗体を記載した。そのようなヘテロコンジュゲート抗体はまた、本発明の方法の抗ＩＡＰＰ抗体に含有される可変領域を少なくとも使用して構築することができる。特異的抗体のさらなる例には、Ｆａｎｇｅｒ、Ｃａｎｃｅｒ Ｔｒｅａｔ．Ｒｅｓ．６８（１９９３）、１８１〜１９４、及び、Ｆａｎｇｅｒ、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２（１９９２）、１０１〜１２４によって記載される抗体が含まれる。従来の抗体を含む免疫毒素である様々なコンジュゲートがこの技術分野において幅広く記載されている。毒素が従来のカップリング技術によって抗体にカップリングされる場合があり、又は、タンパク質毒素部分を含有する免疫毒素を融合タンパク質として作製することができる。本発明の抗体は、そのような免疫毒素を得るための対応する方法で使用することができる。そのような免疫毒素を例示するものが、Ｂｙｅｒｓ、Ｓｅｍｉｎａｒｓ Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２（１９９１）、５９〜７０、及び、Ｆａｎｇｅｒ、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ １２（１９９１）、５１〜５４によって記載される免疫毒素である。

【0038】

上記の融合タンパク質はさらに、プロテイナーゼのための切断可能なリンカー又は切断部位を含む場合がある。これらのスペーサー部分は同様に、不溶性又は可溶性のどちらでも可能であり（Ｄｉｅｎｅｒ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３１（１９８６）、１４８）、抗ｈＩＡＰＰ抗体からの薬物放出を標的部位において可能にするために選択することができる。免疫療法のために本発明の抗体にカップリングすることができる治療剤の例として、薬物、放射性同位体、レクチン及び毒素が挙げられる。本発明の抗体及び抗原にコンジュゲート化することができる薬物には、マイトマイシンＣ、ダウノルビシン及びビンブラスチンなどの薬物として古典的に言及される化合物が含まれる。放射性同位体とコンジュゲート化された本発明の抗体又は抗原を、例えば、免疫療法のために使用する際には、ある特定の同位体が、白血球分布、同様にまた、安定性及び放射のような要因に依存して、他の同位体よりも好ましい場合がある。自己免疫応答に依存して、いくつかの放射体が他の放射体よりも好ましい場合がある。一般には、α粒子放射性及びβ粒子放射性の放射性同位体が免疫療法において好まれる。好ましい放射体は、短距離高エネルギー放射体であり、例えば、^２１２Ｂｉなどである。治療目的のために本発明の抗体又は抗原に結合させることができる放射性同位体の例が、^１２５Ｉ、^１３１Ｉ、^９０Ｙ、^６７Ｃｕ、^２１２Ｂｉ、^２１２Ａｔ、^２１１Ｐｂ、^４７Ｓｃ、^１０９Ｐｄ及び^１８８Ｒｅである。最も好ましくは、放射性標識は^６４Ｃｕである。エクスビボ及びインビボの治療プロトコルと同様に、本発明の抗体又は抗原にカップリングすることができる他の様々な治療剤が当業者によって知られており、又は、容易に確認されることが可能である。適切な場合には、当業者は、タンパク質性物質そのものの代わりに、本発明のｈＩＡＰＰ結合分子をコードするポリヌクレオチドを使用してもよい。

【0039】

１つの実施形態において、本明細書中に開示されるｈＩＡＰＰ結合分子は、（ａ）検出可能に標識され（この場合、好ましくは、検出可能な標識が、酵素、放射性同位体、蛍光団、核磁性及び重金属からなる群から選択される）、又は、（ｂ）薬物に結合させられる。

【0040】

製薬使用のために、本発明によるｈＩＡＰＰ結合分子は、薬学的に許容され得る担体を必要に応じてさらに含む医薬組成物に配合される。好ましくは、ｈＩＡＰＰ結合分子は、皮下（ｓ．ｃ．）、筋肉内（ｉ．ｍ．）又は静脈内（ｉ．ｖ．）に、並びに／或いは、週に１回、２週間に１回又は月に１回の頻度で投与されるように設計される。１つの実施形態において、ｈＩＡＰＰ結合分子は、膵臓組織における、膵島アミロイド原線維、プトロ原線維及び／又はアミロイド斑の発症の前又は後において投与されるように設計される。実施例２及び図４において示され得るように、耐糖能障害が、２型糖尿病のトランスジェニックマウスモデル（ｈＩＡＰＰトランスジェニックマウス）における膵島アミロイドの沈着に先立つ。したがって、耐糖能障害に罹患し、かつ／又は、健康な対象と比較して、ＩＡＰＰの異常な発現を示す対象が、膵島におけるＩＡＰＰのアミロイド斑形成又は原線維形成が存在しない状態で処置される場合があり、したがって、これにより、糖尿病のより有害な医学的徴候の発症が防止される場合がある。

【0041】

本発明のｈＩＡＰＰ結合分子の１つの実施形態において、医薬組成物はさらに、ＩＡＰＰアミロイド形成を防止することができる、又は低下させることができる薬剤を含み、この場合、好ましくは、前記薬剤は、フラボノイド、ＩＡＰＰアナログ、メトホルミン及びチアゾリジンジオン系薬剤（例えば、ロシグリタゾンなど）からなる群から選択される；例えば、Ｃａｏ及びＲａｌｅｉｇｈ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ５１（２０１２）、２６７０〜２６８３；Ｎｏｏｒ他、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．２１（２０１２）、３７３〜３８２；Ｙａｎ他、ＰＮＡＳ １０３（２００６）、２０４６〜２０５１；並びにＨｕｌｌ他、Ｄｉａｂｅｔｅｓ ５４（２００５）、２２３５〜２２４４を参照のこと。代替において、本発明のｈＩＡＰＰ結合分子は、共投与されるように、すなわち、そのような薬剤を対象に投与する前に、投与するのと併せて、又は投与した後に付随して共投与されるように設計される場合がある。例えば、糖尿病患者は既に抗糖尿病薬物による処置を受けている場合があり、しかしながら、このような処置は、医学的な徴候及び症状のすべてを治療するために成功していること及び／又は十分であることがそれぞれ判明していなかった。この場合、先行処置は、本発明によるｈＩＡＰＰ結合分子の投与により補われる場合がある。併用療法が疾患の進行の期間中には特に好まれる。本特許出願との関連において、２つ以上の化合物の「共投与」は、２つの化合物が１つの配合物において組み合わされるか否かにかかわらず、又は、２つの化合物が２つの別個の配合物に存在するかどうかにかかわらず、これらの化合物の１つをそれぞれが含有する２つの医薬品の個別投与、同様にまた、同時投与を含めて、これら２つ以上の化合物を２４時間以内に患者に投与することとして定義される。２つの化合物の「相乗効果」は、統計学的分析の観点から、これら２つの個々の化合物の効果の和から生じる相加効果よりも大きい効果である。

【0042】

本発明に従って使用されるための所与のｈＩＡＰＰ結合分子が治療的に効果的であり得るか否かが、本発明の動物モデルを使用することによって明らかにされ得るし、また、添付された実施例に開示され得る。好ましくは、ｈＩＡＰＰ結合分子は、抗ｈＩＡＰＰ ＩｇＧ抗体に関して、遺伝子組換えｈＩＡＰＰマウスモデルでは約１０ｍｇ／ｋｇの投薬量で、及び／又は、遺伝子組換えｈＩＡＰＰラットモデルでは約３ｍｇ／ｋｇの投薬量で投与されたときに効果的である。したがって、ｈＩＡＰＰ結合フラグメント（例えば、単鎖抗体など）を使用する場合、又は、小さい有機分子を使用する場合、投薬量は抗体の分子量との関連で調節することができる。

【0043】

典型的な用量が、例えば、０．００１μｇ〜１０００μｇの範囲（或いはこの範囲における発現又は発現阻害のための核酸）であることが可能である；しかしながら、この例示的な範囲よりも少ない用量又は大きい用量が、とりわけ上述の要因を考慮して想定される。一般には、投薬量は、例えば、約０．０００１〜１００ｍｇ／ｋｇ宿主体重の範囲が可能であり、より通常的には０．０１〜５ｍｇ／ｋｇ宿主体重の範囲（例えば、０．０２ｍｇ／ｋｇ宿主体重、０．２５ｍｇ／ｋｇ宿主体重、０．５ｍｇ／ｋｇ宿主体重、０．７５ｍｇ／ｋｇ宿主体重、１ｍｇ／ｋｇ宿主体重、２ｍｇ／ｋｇ宿主体重など）が可能である。例えば、投薬量は、１ｍｇ／ｋｇ体重又は１０ｍｇ／ｋｇ体重であること、或いは、１〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲内であること、好ましくは少なくとも１ｍｇ／ｋｇであることが可能である。上記範囲において中間的である用量もまた、本発明の範囲内であることが意図される。対象には、そのような用量を毎日、隔日、毎週、又は、経験的分析によって決定されるどのような他のスケジュールに従ってでも投与することができる。例示的な処置は、長期間（例えば、少なくとも６ヶ月の長期間）にわたる多数回の投薬での投与を伴う。さらなる例示的な処置計画は、２週間毎に１回、又は、１ヶ月に１回、又は、３ヶ月毎〜６ヶ月毎に１回での投与を伴う。例示的な投薬スケジュールには、連日での１〜１０ｍｇ／ｋｇ又は１５ｍｇ／ｋｇ、１日おきでの３０ｍｇ／ｋｇ、或いは、毎週での６０ｍｇ／ｋｇが含まれる。一部の方法では、異なる結合特異性を有する２つ以上のモノクローナル抗体が同時に投与され、そのような場合、投与されるそれぞれの抗体の投薬量が、上記の範囲内である。進行を定期的な評価によってモニターすることができる。非経口投与のための調製物には、無菌の水性又は非水性の溶液、懸濁物及びエマルションが含まれる。非水性溶媒の例として、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油（例えば、オリーブ油など）、及び、注射可能な有機エステル（例えば、オレイン酸エチルなど）が挙げられる。水性担体には、生理食塩水及び緩衝化媒体を含めて、水、アルコール性溶液／水溶液、エマルション又は懸濁物が含まれる。非経口用ビヒクルには、塩化ナトリウム溶液、リンゲルブドウ糖、ブドウ糖及び塩化ナトリウム、乳酸加リンゲル又は固定油が含まれる。静脈内用ビヒクルには、流体及び栄養補充液、並びに、電解質補充液（例えば、リンゲルブドウ糖に基づくものなど）などが含まれる。保存剤及び他の添加剤もまた存在する場合がある（例えば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート化剤及び不活性ガスなど）。

【0044】

「対象」及び「患者」という用語は本明細書中では交換可能に使用され、代謝疾患の処置を必要とする個体を意味する。好ましくは、対象は哺乳動物であり、特に好ましくはヒトである。

【0045】

「処置」及び「処置する」などは、所望される薬理学的及び／又は生理学的な効果を得ることを一般には意味するように本明細書中では使用される。そのような効果は、疾患又はその症状を完全又は部分的に防止するという点では予防的である場合があり、並びに／或いは、疾患及び／又は当該疾患に起因すると考えられる有害影響を部分的又は完全に治す点では治療的である場合がある。本明細書中で使用される場合、「処置する」又は「処置」という用語は治療的処置及び予防的又は防止的な対策の両方を示し、この場合、その目的は、望まれない生理学的変化又は障害（例えば、代謝疾患の発達又は拡大など）を防止すること又は抑制すること（緩和すること）である。有益な臨床結果又は所望される臨床結果には、検出可能又は検出不能であるかに関わりなく、症状の緩和、疾患の程度の減弱、疾患の安定化された（すなわち、悪化しない）状態、疾患進行の遅延又は緩速化、疾患状態の改善又は緩和、及び、寛解（部分的又は全体的を問わず）が含まれるが、これに限定されない。「処置」はまた、処置を受けない場合の予想される生存と比較して、生存を延ばすことを意味することができる。処置を必要としている人々には、状態又は障害を既に有する人々、同様にまた、状態又は障害を有する傾向がある人々、或いは、状態又は障害の発現が防止されなければならない人々が含まれる。

【0046】

医薬組成物として使用されるために、本発明によるｈＩＡＰＰ結合分子は、必要に応じて他の活性な薬剤と組み合わされて、１つ又は複数の不活性な従来の担体及び／又は希釈剤と一緒に組み込まれる場合がある。薬学的に許容され得る担体及び投与経路を、当業者に知られている対応する文献から選ぶことができる。本発明の医薬組成物は、この技術分野では広く知られている方法に従って配合することができる；例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ（２０００）（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｉｎ Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＩＳＢＮ０−６８３−３０６４７２）；Ｖａｃｃｉｎｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、第２版（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ他、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ、米国、２００３）；Ｂａｎｇａ、Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ，Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ，ａｎｄ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ、第２版（Ｔａｙｌｏｒ及びＦｒａｎｃｉｓ（２００６）、ＩＳＢＮ：０−８４９３−１６３０−８）を参照のこと。好適な医薬用担体の様々な例がこの技術分野では広く知られており、これらには、リン酸塩緩衝化生理食塩水、水、エマルション（例えば、油／水エマルションなど）、様々なタイプの湿潤化剤、無菌溶液などが含まれる。そのような担体を含む組成物を、広く知られている従来の方法によって配合することができる。これらの医薬組成物は好適な用量で対象に投与することができる。好適な組成物の投与は種々の方式によって行われてよい。例には、薬学的に許容され得る担体を含有する組成物を、経口方法、鼻腔内方法、直腸方法、局所的方法、腹腔内方法、静脈内方法、筋肉内方法、皮下方法、真皮下方法、経皮的方法、クモ膜下腔内方法及び頭蓋内方法を介して投与することが含まれる。経口投与用の医薬組成物、例えば、単一ドメイン抗体分子（例えば、「ナノボディー（商標）」）などもまた、本発明において想定される。そのような経口配合物は、錠剤、カプセル、粉末、液体又は半固体の形態である場合がある。錠剤は、固体の担体、例えば、ゼラチン又はアジュバントなどを含む場合がある。様々なタイプの投与のために好適である配合物に関するさらなる指針を、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ、第１７版（１９８５）及び対応する更新版）において見出すことができる。薬物送達のための様々な方法の簡単な総説については、Ｌａｎｇｅｒ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９（１９９０）、１５２７〜１５３３を参照のこと。１つの実施形態において、本発明のｈＩＡＰＰ結合分子及び組成物はヒト患者に１日１回、１日おき、週３回、週２回又は週１回で投与され、好ましくは１日１回よりも少なく投与される。

【0047】

上述の通り、さらなる局面において、本発明は、試験化合物が、β細胞をｈＩＡＰＰ誘導性の細胞損傷及び／又は膵島アミロイドの毒性影響から保護することができるかどうか、並びに／或いは、ｈＩＡＰＰ誘導性の耐糖能障害を回復させることができるかどうかを決定するために使用する遺伝子組換え非ヒト動物に関連し、ただし、前記動物は、ヒト膵島アミロイドポリペプチド（ｈＩＡＰＰ）をコードするＤＮＡ配列を含む少なくとも１つの導入遺伝子を発現することができること、及び、
（ｉ）約１月齢及び約２月齢のそれぞれにおける、耐糖能障害及び／又は高血糖症によって特徴づけられる糖尿病の自然発症；並びに／或いは
（ｉｉ）約２月齢での細胞外のアミロイド沈着物の出現、及び／又は約４月齢での広範囲のアミロイドーシス関連のβ細胞喪失（実施例４及び図４を参照のこと）
によって特徴づけられる。

【0048】

好ましくは、試験化合物は、本明細書中上記で定義されるｈＩＡＰＰ結合分子である。

【0049】

実施例において記載されるように、ｈＩＡＰＰをコードするＤＮＡ配列が好ましくは、ラットインスリンＩＩプロモーターに機能的に連結される。さらには、本発明の遺伝子組換え動物は好ましくはヘミ接合体である；例えば、Ｃｈｏ他、Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｏｃ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．（２００９）、Ｃｈａｐｔｅｒ：ｕｎｉｔ−１９．１１；Ｈａｒｕｙａｍａ他、Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｏｃ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．（２００９）、Ｃｈａｐｔｅｒ：ｕｎｉｔ−１９．１１を参照のこと。

【0050】

これらの実施形態及び他の実施形態が本発明の記載及び実施例によって開示され、また、包含される。本発明に従って用いられるための材料、方法、使用法及び化合物のいずれか１つに関するさらなる文献が、例えば、電子デバイスを使用して、公開されている図書館及びデータベースから検索される場合がある。例えば、公開されているデータベース“Ｍｅｄｌｉｎｅ”が利用される場合がある（このデータベースは国立バイオテクノロジー情報センター及び／又は国立衛生研究所の国立医学図書館によって提供される）。さらなるデータベース及びウェブアドレス、例えば、欧州バイオインフォマティクス研究所（ＥＢＩ）（これは欧州分子生物学研究所（ＥＭＢＬ）の一部である）のデータベースなどが当業者には知られており、これらもまた、インターネット検索エンジンを使用して得ることができる。バイオテクノロジーにおける特許情報、並びに、遡及的検索及び現在の認識のために有用な特許情報の関連原典の調査の概略が、Ｂｅｒｋｓ、ＴＩＢＴＥＣＨ １２（１９９４）、３５２〜３６４に示される。

【0051】

いくつかの文書が本明細書の本文を通して引用される。すべての引用された参考文献（本出願を通して引用されるような文献参照物、発行された特許、公開された特許出願、及び、製造者の仕様書、説明書などを含む）の内容が、本明細書により明示的に、参照によって組み込まれる；しかしながら、どのような文書であれ、引用される文書は実際に本発明に関して先行技術であることを何ら認めるものではない。

【0052】

より完全な理解を、例示のみの目的のために本明細書中に提供され、かつ、本発明の範囲を限定するようには意図されない下記の具体的な実施例及び図を参照することによって得ることができる。

【図面の簡単な説明】

【0053】

【図1】ヒトＩＡＰＰ抗体ＮＩ−２０３．２６Ｃ１１の可変領域（すなわち、重鎖及びカッパ軽鎖）のアミノ酸配列及びヌクレオチド配列。フレームワーク領域（ＦＲ）及び相補性決定領域（ＣＤＲ）が示され、ＣＤＲには下線が引かれている。重鎖連結領域（ＪＨ）及び軽鎖連結領域（ＪＫ）も同様に示される。クローニング戦略に起因して、重鎖及び軽鎖のＮ末端におけるアミノ酸配列は潜在的にはプライマー誘発変化をＦＲ１に含有する場合があり、しかしながら、このプライマー誘発変化は抗体の生物学的活性に実質的な影響を与えていない。コンセンサスなヒト抗体を提供するために、最初のクローンのヌクレオチド配列及びアミノ酸配列をデータベースにおける該当するヒト生殖系列可変領域配列とアラインメントし、それらと一致させた；例えば、ＭＲＣ Ｃｅｎｔｒｅ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、英国）によって提供されるＶｂａｓｅ（ｈｔｔｐ：／／ｖｂａｓｅ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／）を参照のこと。ヒト抗体のアミノ酸配列が示されるが、この場合、Ｎ末端のアミノ酸は、コンセンサスな生殖系列配列からのＰＣＲプライマーに起因する逸脱が潜在的には生じていると見なされ、したがって、プライマー誘発変異補正（ＰＩＭＣ）によって置き換えられている。

【図2】ＮＩ−２０３．２６Ｃ１１抗体は、２型糖尿病（Ｔ２Ｄ）と診断される患者の膵臓における病理学的なｈＩＡＰＰ凝集物を選択的かつ用量依存的に認識する。健康なコントロールには認められない、Ｔ２Ｄ患者の膵島における膵島アミロイドのチオフラビンＳ（ＴｈｉｏＳ、左側パネル、緑色）染色。ＮＩ−２０３．２６Ｃ１１抗体は、膵島アミロイドが多く含まれるＴ２Ｄ膵島（対象１及び対象２）において染色を示し、しかし、膵島アミロイドを欠く健康なコントロールの膵島（対象３及び対象４）においては染色を示さない。３ｎＭ、１０ｎＭ、３０ｎＭ（強い染色）及び１ｎＭ（弱い染色）での組換えマウスキメラ抗体ＮＩ−２０３．２６Ｃ１１によるアミロイド陽性Ｔ２Ｄ膵島におけるｈＩＡＰＰ凝集物の検出（ＮＩ−２０３．２６Ｃ１１−ｃｈ、褐色）。ＮＩ−２０３．２６Ｃ１１抗体は、健康なコントロール膵臓における生理学的なｈＩＡＰＰを認識しない。抗ＩＡＰＰ抗体（１：１００；抗ＩＡＰＰ）及び二次ロバ抗マウス抗体のみ（抗マウス二次）を陽性コントロール及び陰性コントロールとしてそれぞれ使用した。対比染色を行って、細胞の核を可視化した（ｉ．ｏ．ではかすかな青色、本図ではかすかな染色）。スケールバー：１００μｍ。

【図3】ＮＩ−２０３．２６Ｃ１１抗体は、Ｔ２Ｄ患者における病理学的なｈＩＡＰＰ凝集物を選択的に認識する。ＮＩ−２０３．２６Ｃ１１抗体はＴ２Ｄ膵島において染色を示すが、病理学的なｈＩＡＰＰ凝集物を欠く健康なコントロールの膵島においては生理学的なＩＡＰＰを認識しない。組換えマウスキメラ抗体ＮＩ−２０３．２６Ｃ１１によるＴ２Ｄ膵島におけるｈＩＡＰＰ凝集物の検出（ＮＩ−２０３．２６Ｃ１１−ｃｈ、青色；１００ｎＭ；上段パネル）。ｈＩＡＰＰ凝集物のＮＩ−２０３．２６Ｃ１１染色が、β細胞を有しない膵島領域に限定される（どの併合図も、赤色でのインスリン染色を有していない）。抗インスリン抗体（１：３）による膵島β細胞上のインスリンの検出（赤色）。抗ＩＡＰＰ抗体（１：１００；抗ＩＡＰＰ；下段パネル）は、インスリン染色による共局在化によって示されるように、生理学的なｈＩＡＰＰをＴ２Ｄ及び健康なコントロールの膵島β細胞において認識する（赤色でのインスリン染色を有する併合図）。スケールバー：５０μｍ。

【図4】耐糖能障害は２型糖尿病のトランスジェニックマウスモデル（ｈＩＡＰＰトランスジェニックマウス）における膵島アミロイドの沈着に先立つ。（Ａ）膵島アミロイドはｈＩＡＰＰトランスジェニックマウスにおいて、４週齢ではなく、１４週齢で可視化される。野生型マウスは膵島アミロイドを有しない。ｈＩＡＰＰトランスジェニックマウス及び野生型マウスの膵島の代表的な画像で、膵島アミロイド（０．１％ ＴｈｉｏＳ）、インスリン（抗インスリン抗体；１：３；赤色）及びグルカゴン（抗グルカゴン抗体；１：２５００；青色）について染色された画像。（Ｂ）４週齢及び１４週齢のトランスジェニックマウスにおける耐糖能障害。４週齢（上段パネル）及び１４週齢（下段パネル）でのｈＩＡＰＰトランスジェニックマウス及び野生型マウスにおいて行われる経口ブドウ糖負荷試験（ｏＧＴＴ）の期間中における血中グルコースレベル。経口グルコース後の血中グルコースレベルが、４週齢（ｔｇ、ｎ＝１３；ｗｔ、ｎ＝９）及び１４週齢（ｔｇ、ｎ＝２７；ｗｔ、ｎ＝３１）での野生型マウスと比較してｈＩＡＰＰトランスジェニックマウスにおいてはより高かった。空腹時血中グルコースレベルが４週齢では群間において類似するが、１４週齢ではｈＩＡＰＰトランスジェニックマウスにおいて増大した。ｗｔ群と比較した場合、^＊＊ｐ＜０．０１、及び、^＊＊＊ｐ＜０．００１。スケールバー：５０μｍ。

【図5】ＮＩ−２０３．２６Ｃ１１抗体はｈＩＡＰＰトランスジェニックマウスにおいてｈＩＡＰＰ凝集物と選択的に結合する。ＮＩ−２０３．２６Ｃ１１は染色を４週齢及び１６週齢のｈＩＡＰＰトランスジェニックマウスの膵島に対して示し（青色染色、左側パネル）、週齢一致の野生型マウスに対しては染色を示さない（青色染色の非存在；右側パネル）。組換えヒト抗体ＮＩ−２０３．２６Ｃ１１によるトラスジェニック膵島上のｈＩＡＰＰ凝集物の検出（ＮＩ−２０３．２６Ｃ１１；青色；１００ｎＭ）。抗インスリン抗体（１：３）による膵島β細胞上のインスリンの検出（赤色）。スケールバー：５０μｍ。

【図6】ＮＩ−２０３．２６Ｃ１１抗体は凝集ｈＩＡＰＰをｈＩＡＰＰトランスジェニックマウスにおいて単回投与の後で標的化する。組換えヒトＮＩ−２０３．２６Ｃ１１抗体又はアイソタイプコントロール（コントロールＩｇＧ）抗体を１６週齢のｈＩＡＰＰトランスジェニックマウス及び野生型マウスに１０ｍｇ／ｋｇ（ｉ．ｐ．）で投与し、抗体結合を、抗ヒト二次抗体を使用して投与後２日で評価した。組換えヒトＮＩ−２０３．２６Ｃ１１（本図では褐色染色）はトランスジェニック膵島を標的としており、これにより、ＴｈｉｏＳ陽性アミロイドが示される（本図では緑色染色）が、ＴｈｉｏＳ陰性の野生型膵島は示されない。コントロールＩｇＧでは染色は何ら認められなかった。対比染色を行って、細胞の核を可視化した（ｉ．ｏ．ではかすかな青色、本図ではかすかな染色）。

【図7】ＮＩ−２０３．２６Ｃ１１抗体はβ細胞喪失をｈＩＡＰＰトランスジェニックマウスにおいて防ぐ。（Ａ）β細胞を可視化するために抗インスリン抗体により染色されたマウス膵島の代表的な画像（ｉ．ｏ．では赤色、本図では強い染色）。（Ｂ）ｈＩＡＰＰトランスジェニックマウスにおける組換えマウスキメラＮＩ−２０３．２６Ｃ１１抗体による週１回の処置（ｔｇ ＮＩ−２０３．２６Ｃ１１−ｃｈ、ｎ＝２３；１０ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｐ．、１２週間）は、ＰＢＳを受けるｈＩＡＰＰトランスジェニックマウス（ｔｇ ＰＢＳ、ｎ＝２８）と比較して、膵臓のインスリンを増大させ（％膵臓領域及び％膵島領域におけるインスリン陽性領域；上段左側パネル及び上段中央パネル）、膵島領域を増大させ（平均膵島領域；上段右側パネル）、インスリン分泌を増大させる（血漿中インスリンレベル；下段左側パネル）。膵島密度及び膵臓質量はＮＩ−２０３．２６Ｃ１１−ｃｈ処置の後で変化していなかった（それぞれ、下段中央パネル及び下段右側パネル）。ｔｇ ＰＢＳ群と比較した場合、^＊ｐ＜０．０５、及び、^＊＊ｐ＜０．０１。スケールバー：５０μｍ。

【図8】ＮＩ−２０３．２６Ｃ１１抗体はｈＩＡＰＰトランスジェニックマウスにおいて空腹時血中グルコースを低下させ、耐糖能を改善し、体重増加を正常にする。組換えマウスキメラＮＩ−２０３．２６Ｃ１１抗体を週１回、ｈＩＡＰＰトランスジェニックマウスに投与した（ｔｇ ＮＩ−２０３．２６Ｃ１１−ｃｈ、ｎ＝２４；１０ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｐ．）。ＰＢＳをビヒクルとして使用した（ｔｇ ＰＢＳ、ｎ＝２７）。（Ａ）ＮＩ−２０３．２６Ｃ１１抗体は空腹時血中グルコースをＰＢＳ群と比較してｈＩＡＰＰトランスジェニックマウスにおいて８週間及び１２週間の処置の後で有意に低下させる。血中グルコースレベルを一晩の絶食の後で測定した。（Ｂ）ＮＩ−２０３．２６Ｃ１１抗体は耐糖能をＰＢＳ群と比較してｈＩＡＰＰトランスジェニックマウスにおいて有意に改善する。１０週間の処置の後でｈＩＡＰＰトランスジェニックマウスにおいて行われる経口ブドウ糖負荷試験（ｏＧＴＴ）の期間中の血中グルコースレベル。（Ｃ）体重増分（％）が、ＰＢＳが注入される野生型マウス（ｗｔ ＰＢＳ、ｎ＝３１）と比較した場合、１２週間の処置の間、ＮＩ−２０３．２６Ｃ１１処置のｈＩＡＰＰトランスジェニックマウスにおいて正常化された。ＰＢＳ処置のもとにあるｈＩＡＰＰトランスジェニックマウスは、野生型マウスと比較して、損なわれた体重増加を示した。ｔｇ ＮＩ−２０３．２６Ｃ１１−ｃｈをｔｇ ＰＢＳと比較した場合：^＊ｐ＜０．０５、及び、^＊＊ｐ＜０．０１；ｔｇ ＰＢＳをｗｔ ＰＢＳと比較した場合：＃ ｐ＜０．０５、及び、＃＃＃ ｐ＜０．００１；ｔｇ ＮＩ−２０３．２６Ｃ１１−ｃｈをｗｔ ＰＢＳと比較した場合：§ ｐ＜０．０５。

【図9】ＮＩ−２０３．２６Ｃ１１は、主に早期の原線維性のｈＩＡＰＰ凝集物化学種を認識する。（Ａ）古典的なＳ字形凝集曲線をｈＩＡＰＰ（■）については有するが、凝集を齧歯類ＩＡＰＰ（□；ｒＩＡＰＰ）については示さないチオフラビン−Ｔ（Ｔｈｉｏ−Ｔ）凝集アッセイ。（Ｂ）示された時点でＴｈｉｏ−Ｔ実験から採取されたサンプル（１：３の希釈系列）のドットブロット分析では、集められたすべてのｈＩＡＰＰサンプルに対する抗ＩＡＰＰ抗体の非選択的な結合、同様にまた、２０分後に採取されたｒＩＡＰＰに対する抗ＩＡＰＰ抗体の非選択的な結合が明らかにされた。対照的に、ＮＩ−２０３．２６Ｃ１１は、選択的な結合を、ｈＩＡＰＰ凝集の成長期（５’）で採取されたｈＩＡＰＰ調製物について示し、その後の時点（１０’及び２０’）で採取されたｈＩＡＰＰサンプルに対しては低下した結合を示した。重要なことに、ＮＩ−２０３．２６Ｃ１１は、非凝集ｈＩＡＰＰの画分（０’）については免疫陰性のままであり、ｒＩＡＰＰに対しては反応しなかった。フィルター遅延アッセイ（ＦＲＡ）において、抗ＩＡＰＰ抗体はＳＤＳ抵抗性の原線維性ｈＩＡＰＰ化学種をアッセイされたすべての時点で認識し、これに対して、これらのｈＩＡＰＰ化学種に対してＮＩ−２０３．２６Ｃ１１については反応性を認めることができなかった。（Ｃ）Ｔｈｉｏ−Ｔ凝集アッセイから採取されたサンプルの透過電子顕微鏡法（ＴＥＭ）分析では、多様な形態学的スペクトルが明らかにされた。大きい原線維性凝集物を、凝集前（０’）に採取されたｈＩＡＰＰについて検出することができず、また、後期段階（２０’）で採取されたｒＩＡＰＰについても検出することができなかった。中間的なｈＩＡＰＰ化学種は、不定形の非原線維性特徴、同様にまた、原線維性特徴の両方を示し（５’）、一方で、平衡期に至る境界（１０’）又は平衡期の範囲内（２０’）で採取されたサンプルは原線維性の形態学を主に示した。

【図10】ＮＩ−２０３．２６Ｃ１１抗体は耐糖能を２型糖尿病のトランスジェニックラットモデル（ｈＩＡＰＰトランスジェニックラット）において正常にする。組換えラットキメラＮＩ−２０３．２６Ｃ１１抗体を週１回、ｈＩＡＰＰトランスジェニックラット（ｔｇ ＮＩ−２０３．２６Ｃ１１−ｒ、ｎ＝９；３ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｐ．）及び野生型ラット（ｗｔ ＮＩ−２０３．２６Ｃ１１−ｒ；ｎ＝４；３ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｐ．）に投与した。ＰＢＳをｈＩＡＰＰトランスジェニックラット（ｔｇ ＰＢＳ、ｎ＝１０）及び野生型ラット（ｗｔ ＰＢＳ、ｎ＝５）においてビヒクルとして使用した。（Ａ）同等の血中グルコースレベルを示す、３月齢のｈＩＡＰＰトランスジェニックラット及び野生型ラットにおける処置前の経口ブドウ糖負荷試験（ｏＧＴＴ）。（Ｂ）ＮＩ−２０３．２６．Ｃ１１抗体は、ｔｇ ＰＢＳラット及びｗｔ ＰＢＳラットと比較した場合、血中グルコースレベルを８週間の処置の後で行われたｏＧＴＴの期間中、ｈＩＡＰＰトランスジェニックラットにおいて正常にする。ＮＩ−２０３．２６Ｃ１１−ｒ抗体は血中グルコースレベルを野生型ラット（ｗｔ ＮＩ−２０３．２６Ｃ１１−ｒ）において影響を与えない。ｔｇ ＮＩ−２０３．２６Ｃ１１−ｒをｔｇ ＰＢＳと比較した場合：^＊＊ｐ＜０．０１。

【発明を実施するための形態】

【0054】

方法
抗体
ヒトＩＡＰＰ（ｈＩＡＰＰ）の凝集型化学種を標的とするヒト由来抗体を、高齢ヒト対象の臨床的に選択された集団に由来するヒトメモリーＢ細胞レパートリーの全補体のハイスループット分析によって同定した。ｈＩＡＰＰ反応性のメモリーＢ細胞に由来する抗体ｃＤＮＡを結合特性の決定のために発現させた。ヒトＩｇＧに対するマウス及びラットの抗ヒト抗体応答を中和するのを避けるために、ヒト可変ドメインと、マウス又はラットの定常領域とからなるキメラ抗体をタンパク質工学によって作製した。ｈＩＡＰＰ反応性ＩｇＧクローンをトランスジェニックマウス及びトランスジェニックラットにおけるインビトロ特徴づけ研究及びインビボ有効性確認研究のためにＣＨＯにおいて組換え産生させた。タンパク質発現を、１００ｍｇ規模での抗体の産生に備えるために２０リットルのウェーブリアクター（ｗａｖｅ ｒｅａｃｔｏｒ）にまでスケールアップした。抗体をアフィニティークロマトグラフィーによってエンドトキシンフリーとなるように精製した。

【0055】

マウス
マウスを、Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ）から得た。ラットインスリンＩＩプロモーターによって駆動されるｈＩＡＰＰの膵島β細胞での発現を有するヘミ接合型の遺伝子組換えオスマウス（Ｆ１）と、ＦＶＢ／ＮｘＤＢＡ／２Ｊ背景の野生型オスマウス（Ｆ１）とを、ｈＩＡＰＰ遺伝子組換えＦＶＢ／Ｎ（ＦＶＢ／Ｎ−Ｔｇ（Ｉｎｓ２−ＩＡＰＰ）ＲＨＦＳｏｅｌ／Ｊ）のオスをＤＢＡ／２Ｊの野生型メスマウスと交配することによって作製した。遺伝子組換え状態を、ｈＩＡＰＰ導入遺伝子に対するオリゴヌクレオチドプライマーを使用するゲノムＤＮＡのＰＣＲによって明らかにした。

【0056】

マウスは代謝表現型の早期発症を示した。すなわち、マウスは、１月齢及び２月齢で既に存在する耐糖能障害及び高血糖症によって特徴づけられる糖尿病を自然発症した。以前に記載されたマウスモデルは、ここに記載されるマウスモデルと比較して、糖尿病を自然発症せず、また、高血糖症及び耐糖能障害を伴う糖尿病を６月齢〜１０月齢までに自然発症しなかった。例えば、Ｃｏｕｃｅ他、Ｄｉａｂｅｔｅｓ ４５（１９９６）、１０９４〜１１０１；Ｓｏｅｌｌｅｒ他、Ｄｉａｂｅｔｅｓ ４７（１９９８）、７４３〜７５０；Ｈｕｌｌ他、Ｄｉａｂｅｔｅｓ ５２（２）（２００３）、３７２〜３７９；Ｈｕｌｌ他、Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａｂ ２８９（２００５）、７０３〜７０９；Ｂｕｔｌｅｒ他、Ｄｉａｂｅｔｅｓ ５２（２００３）、２３０４〜２３１４；Ｈｏｐｐｅｎｅｒ他、Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ ４２（４）（１９９９）、４２７〜４３４；及びＪａｎｓｏｎ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３（１４）（１９９６）、７２８３〜７２８８を参照のこと。加えて、本発明のマウスモデルは、最小限のアミロイド沈着が糖尿病自然発症マウスにおいて認められた、以前に記載されたマウスモデルとの比較において、２月齢における細胞外アミロイド沈着物の出現及び４月齢で認められる広範囲のアミロイドーシスを、関連したβ細胞喪失を伴って示し、同様にまた、１２月齢における細胞外のアミロイド沈着（アミロイド重篤度＝１〜５％及びアミロイド保有率＝４０〜６０％）を、関連したβ細胞喪失を伴って示し、かつ、１６月齢〜１９月齢における細胞外のアミロイド沈着（アミロイド保有率＝２５〜８５％）を、関連したβ細胞喪失を伴って示した；例えば、Ｈｕｌｌ他、Ｄｉａｂｅｔｅｓ ５２（２）（２００３）、３７２〜３７９；Ｈｕｌｌ他、Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａｂ ２８９（２００５）、７０３〜７０９；Ｈｏｐｐｅｎｅｒ他、Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ ４２（４）（１９９９）、４２７〜４３４を参照のこと。

【0057】

以前のモデル（総説、Ｍａｔｖｅｙｅｎｋｏ他（２００６）、ＩＬＡＲ Ｊ．４７（３）：２２５〜２３３を参照のこと）に対する本マウスモデルの新規な特徴には、下記が含まれる：
１）異なる遺伝的背景：
・本発明者らのマウスモデル：ＦＶＢ／ＮｘＤＢＡ／２Ｊ背景のもとでのヘミ接合性のｈＩＡＰＰ遺伝子組換え体。
・以前に記載されたマウスモデル：ＦＶＢ／Ｎ背景のもとでのヘミ接合性のｈＩＡＰＰ遺伝子組換え体（Ｃｏｕｃｅ他（１９９６）、Ｄｉａｂｅｔｅｓ ４５：１０９４〜１１０１）、ＦＶＢ／Ｎ／Ａ^ｖｙ／Ａ背景のもとでのヘミ接合性のｈＩＡＰＰ遺伝子組換え体（Ｓｏｅｌｌｅｒ他（１９９８）、Ｄｉａｂｅｔｅｓ ４７：７４３〜７５０）、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ背景のもとでのヘミ接合性のｈＩＡＰＰ遺伝子組換え体（Ｈｕｌｌ他（２００５）、Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａｂ ２８９：７０３〜７０９）、ＤＢＡ／２Ｊ背景のもとでのヘミ接合性のｈＩＡＰＰ遺伝子組換え体（Ｈｕｌｌ他（２００５）、Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａｂ ２８９：７０３〜７０９）、Ｃ５７ＢＬ／６ＪｘＤＢＡ／２Ｊ背景のもとでのヘミ接合性のｈＩＡＰＰ遺伝子組換え体（Ｈｕｌｌ他（２００３）、Ｄｉａｂｅｔｅｓ ５２（２）：３７２〜３７９；Ｈｕｌｌ他（２００５）、Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａｂ ２８９：７０３〜７０９）、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ／Ａ^ｖｙ／Ａ背景のもとでのヘミ接合性のｈＩＡＰＰ遺伝子組換え体（Ｂｕｔｌｅｒ他（２００３）、Ｄｉａｂｅｔｅｓ ５２：２３０４〜２３１４）、及び、ｏｂ／ｏｂ背景のもとでのヘミ接合性のｈＩＡＰＰ遺伝子組換え体（Ｈｏｐｐｅｎｅｒ他（１９９９）、Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ ４２（４）：４２７〜４３４）。ＦＶＢ／Ｎ背景のもとでのホモ接合のｈＩＡＰＰ遺伝子組換え体（Ｊａｎｓｏｎ他（１９９６）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３（１４）：７２８３〜７２８８）。

【0058】

２）早期発症する代謝表現型：
・本発明者らのマウスモデル：マウスは、１月齢及び２月齢で既に存在する耐糖能障害及び高血糖症によって特徴づけられる糖尿病を自然発症する。
・以前に記載されたマウスモデル：
○マウスは糖尿病を自然発症しない：ＦＶＢ／Ｎ背景のもとでのヘミ接合性のｈＩＡＰＰ遺伝子組換え体（Ｃｏｕｃｅ他（１９９６）、Ｄｉａｂｅｔｅｓ ４５：１０９４〜１１０１）、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ背景のもとでのヘミ接合性のｈＩＡＰＰ遺伝子組換え体（Ｈｕｌｌ他（２００５）、Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａｂ ２８９：７０３〜７０９）、及び、ＤＢＡ／２Ｊ背景のもとでのヘミ接合性のｈＩＡＰＰ遺伝子組換え体（Ｈｕｌｌ他（２００５）、Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａｂ ２８９：７０３〜７０９）。
○マウスは、高血糖症及び耐糖能障害を伴う糖尿病を６月齢〜１０月齢までに自然発症する：ＦＶＢ／Ｎ／Ａ^ｖｙ／Ａ背景のもとでのヘミ接合性のｈＩＡＰＰ遺伝子組換え体（Ｓｏｅｌｌｅｒ他（１９９８）、Ｄｉａｂｅｔｅｓ ４７：７４３〜７５０）、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ／Ａ^ｖｙ／Ａ背景のもとでのヘミ接合性のｈＩＡＰＰ遺伝子組換え体（Ｂｕｔｌｅｒ他（２００３）、Ｄｉａｂｅｔｅｓ ５２：２３０４〜２３１４）、Ｃ５７ＢＬ／６ＪｘＤＢＡ／２Ｊ背景のもとでのヘミ接合性のｈＩＡＰＰ遺伝子組換え体（Ｈｕｌｌ他（２００３）、Ｄｉａｂｅｔｅｓ ５２（２）：３７２〜３７９；Ｈｕｌｌ他（２００５）、Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａｂ ２８９：７０３〜７０９）、及び、ｏｂ／ｏｂ背景のもとでのヘミ接合性のｈＩＡＰＰ遺伝子組換え体（Ｈｏｐｐｅｎｅｒ他（１９９９）、Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ ４２（４）：４２７〜４３４）。

【0059】

３）早期発症し、かつ、より顕著な膵島病理：
・本発明者らのマウスモデル：関連するβ細胞喪失を伴って、２月齢での細胞外アミロイド沈着物の出現及び約４月齢で認められる広範囲のアミロイドーシス。
・以前に記載されたマウスモデル：糖尿病を自然発症するマウスにおいて認められる最小限のアミロイド沈着。Ｃ５７ＢＬ／６ＪｘＤＢＡ／２Ｊ背景のもとでのヘミ接合性のｈＩＡＰＰ遺伝子組換え体（Ｈｕｌｌ他（２００３）、Ｄｉａｂｅｔｅｓ ５２（２）：３７２〜３７９；Ｈｕｌｌ他（２００５）、Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａｂ ２８９：７０３〜７０９）は、関連したβ細胞喪失を伴って、１２月齢での細胞外のアミロイド沈着を示した（アミロイド重篤度＝１〜５％及びアミロイド保有率＝４０〜６０％）。ｏｂ／ｏｂ背景のもとでのヘミ接合性のｈＩＡＰＰ遺伝子組換え体（Ｈｏｐｐｅｎｅｒ他（１９９９）、Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ ４２（４）：４２７〜４３４）は、関連したβ細胞喪失を伴って、１６月齢〜１９月齢での細胞外のアミロイド沈着を示した（アミロイド保有率＝２５〜８５％）。

【0060】

マウスを１２時間照明のスケジュールで飼育し、マウスには、（総カロリー［ｋｃａｌ］の百分率として）７％の脂肪及び１８％のタンパク質からなる通常の固形飼料（ＫＬＩＢＡ ＮＡＦＡＧ）を与えた。すべてのマウスが食物及び水を自由に摂取した。

【0061】

ラット
ラットインスリンＩＩプロモーターによって駆動されるｈＩＡＰＰの膵島β細胞での発現を有するヘミ接合型のトランスジェニックラット（Ｍａｔｖｅｙｅｎｋｏ他、Ｄｉａｂｅｔｅｓ（２００９）、１６０４〜１６１５；Ｂｕｔｌｅｒ他、Ｄｉａｂｅｔｅｓ（２００４）、１５０９〜１５１６）、及び、野生型Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙオスラットを、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ドイツ）から得た。ラットを１２時間照明のスケジュールで飼育し、ラットには、通常の固形飼料を与えた。すべてのラットが食物及び水を自由に摂取した。

【0062】

処置
トランスジェニックマウスは、組換えマウスキメラＩｇＧ２ａ抗体ＮＩ−２０３．２６Ｃ１１−ｃｈの週１回の投与（１０ｍｇ／ｋｇ体重；ｉ．ｐ．）を４週齢で開始して、研究の継続期間にわたって受けた。ビヒクル処置のトランスジェニックマウス及び野生型マウスには生理食塩水（ＰＢＳ）を腹腔内投与した。
トランスジェニックラット及び野生型ラットは、組換えラットキメラＩｇＧ２ｂ抗体ＮＩ−２０３．２６Ｃ１１−ｒの週１回の投与（３ｍｇ／ｋｇ体重；ｉ．ｐ．）を１２週齢で開始して、研究の継続期間にわたって受けた。ビヒクル処置のトランスジェニックラット及び野生型ラットには生理食塩水（ＰＢＳ）を腹腔内投与した。

【0063】

経口ブドウ糖負荷試験、空腹時血中グルコース、血漿中インスリン及び血漿中ｈＩＡＰＰ
ブドウ糖負荷試験のために、５時間絶食マウス及び一晩絶食ラットに２ｇ／ｋｇのグルコース溶液を経口投与した。血液サンプルをグルコース注入前、並びに、グルコース注入後１０分、３０分、６０分、１２０分及び２４０分においてマウスの尾静脈から集めた。ラット血液をグルコース注入前、並びに、グルコース注入後３０分、６０分、１２０分及び２４０分において舌下静脈からガス麻酔下で集めた。血中グルコースを、グルコメーター（ＣＯＮＴＯＵＲ ＸＴセンサー、Ｂａｙｅｒ）を使用して測定した。空腹時血中グルコースを、一晩絶食の後で集められた血液サンプルから測定した。非絶食時の血漿中のインスリンレベル及びｈＩＡＰＰレベルを、マウスインスリンの酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）キット（Ｍｅｒｃｏｄｉａ）及びヒトアミリンの酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）キット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して求めた。

【0064】

組織学
マウスを屠殺し、膵臓を解剖し、（膵臓質量を算出するために）重量測定し、４％（ｗｔ／ｖｏｌ．）リン酸塩緩衝化パラホルムアルデヒドにおいて固定処理し、パラフィンに包埋し、３μｍの切片を切り出した。パラフィン包埋されたヒト組織を、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｂａｓｅｌ（ＵＨＢ、Ｂａｓｅｌ、スイス）から得て、３μｍの切片を切り出した。切片を０．１％（ｗｔ／ｖｏｌ．）チオフラビンＳにより染色して、アミロイド沈着物、ポリクローナルなモルモット抗インスリン抗体（１：３；ＦＬＥＸ；Ｄａｋｏ）、マウスモノクローナル抗ＩＡＰＰ抗体（１：１００；Ｒ１０／９９；Ａｂｃａｍ）、ポリクローナルなウサギ抗グルカゴン抗体及び組換えＮＩ−２０３．２６Ｃ１１（ヒト又はマウスのキメラ）抗体を可視化した。一次抗体に続いて、スライス物を、ＴＲＩＴＣコンジュゲート化ロバ抗モルモット抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｅｕｒｏｐｅ Ｌｔｄ．、英国）、Ｃｙ５コンジュゲート化ロバ抗マウス抗体又はビオチン化ロバ抗マウス抗体、Ｃｙ５コンジュゲート化ヤギ抗ウサギ抗体、Ｃｙ５コンジュゲート化ロバ抗ヒト抗体又はビオチン化ロバ抗ヒト抗体とインキュベーションした。ストレプトアビジン−ビオチン−ペルオキシダーゼ反応（Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ ＡＢＣキット、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂ Ｉｎｃ．、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、米国）をビオチン化二次抗体と一緒に使用し、切片をヘマトキシリンにより対比染色して、細胞の核を可視化した。画像分析を、Ｉｍａｇｅ Ｊソフトウエアを使用して行った。ＴｈｉｏＳ陽性アミロイド領域、インスリン陽性領域、平均膵島領域及び膵島密度を定量化するために、膵臓切片あたりのすべての膵島（動物あたり５つの切片）を２０倍の倍率で詳しく調べた。ＴｈｉｏＳ陽性アミロイド領域及びインスリン陽性領域を、事前に設定された閾値を超える蛍光に対応する領域としてコンピュータ計算した。膵島領域を、膵島の輪郭が明瞭に視認される場合には、ＴｈｉｏＳチャネルで可視化される膵島の輪郭を手で描くことによって求めた。ＴｈｉｏＳ染色が膵臓領域及びインスリン領域に関連して表された。インスリン染色が膵臓領域及び膵島領域に関連して表された。

【0065】

統計学的分析
データが平均±ＳＥＭとして表される。群の対の間における有意差を、スチューデントｔ検定を使用して求めた。耐糖能のデータを、反復測定ＡＮＯＶＡを使用して分析した（調べたときの時間及び処置を独立変数とした）。すべての統計学的分析を、Ｐｒｉｓｍソフトウエア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、米国）を使用して行った。ｐ＜０．０５を、有意であると見なした。

【0066】

実施例１：ヒト組織における病理学的ｈＩＡＰＰについての抗体の親和性及び選択性の有効性確認
ＮＩ−２０３．２６Ｃ１１抗体が病理学的なｈＩＡＰＰ凝集物を選択的かつ用量依存的に認識するかどうかを検討するために、ヒト組織、すなわち、２型糖尿病（Ｔ２Ｄ）と診断された患者の膵臓におけるヒト組織であって、ＴｈｉｏＳ染色時に認められる膵島におけるアミロイド負荷を示すＴ２Ｄと診断された患者（対象１及び対象２）のパラフィン包埋された膵臓切片を、ＮＩ−２０３．２６Ｃ１１抗体結合について試験した。コントロールとして、Ｔ２Ｄと診断されない患者（対象３及び対象４）のパラフィン包埋された膵臓切片を使用した（図２）。

【0067】

ギ酸による前処理の後、切片をＮＩ−２０３．２６Ｃ１１−ｃｈ抗体と種々の濃度で、すなわち、１ｎＭ、３ｎＭ、１０ｎＭ及び３０ｎＭでインキュベーションし、又は、マウスモノクローナル抗ＩＡＰＰ抗体（１：１００；Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、英国）及び二次のロバ抗マウス抗体をコントロールとして使用し、その後、ビオチン化されたロバ抗ヒト二次抗体（１：５００；Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｎｅｗｍａｒｋｅｔ、英国）又はビオチン化されたヤギ抗マウス二次抗体（１：５００；Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｎｅｗｍａｒｋｅｔ、英国）とインキュベーションした。抗体シグナルを、Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ ＡＢＣ−ＡＰキット（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、米国）により増幅し、ジアミノベンジジン基質（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国）により検出した。アビジン／ビオチンブロッキング（Ａｖｉｄｉｎ／Ｂｉｏｔｉｎブロッキングキット、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、米国）のとき、膵島β細胞を、ビオチン化されたロバ抗モルモット二次抗体（１：５００；Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、米国）にカップリングされるポリクローナルなモルモット抗インスリン抗体（１：５；Ｄａｋｏ、米国）を使用して可視化し、抗体シグナルを、Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ ＡＢＣ−ＡＰキット（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、米国）により増幅し、アルカリホスファターゼ基質（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、米国）により検出した。

【0068】

ＮＩ−２０３．２６Ｃ１１抗体は、用量依存的な染色を、膵島アミロイドが多く含まれるＴ２Ｄ膵島（対象１及び対象２）において示すが、膵島アミロイドを欠く健康なコントロールの膵島（対象３及び対象４）においては示さなかった（図２）。しかしながら、ＮＩ−２０３．２６Ｃ１１抗体は、図２（２つの下段列）に示されるように、健康なコントロール膵臓における生理学的なｈＩＡＰＰを認識しなかった。

【0069】

加えて、ＮＩ−２０３．２６Ｃ１１抗体の選択性を免疫蛍光染色によって検討した（図３）。組織切片を、ＮＩ−２０３．２６Ｃ１１抗体、マウスモノクローナル抗ＩＡＰＰ抗体（１：１００；Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、英国）及び二次のロバ抗マウス抗体、並びに、膵島β細胞のためのポリクローナルなモルモット抗インスリン抗体（１：５；Ｄａｋｏ、米国）を利用してＩＡＰＰ及び膵島β細胞に対して標識した。可視化を、蛍光標識された二次抗体を用いて行った。

【0070】

簡単に記載すると、パラフィン包埋切片をＮＩ−２０３．２６Ｃ１１抗体又はマウスモノクローナル抗ＩＡＰＰ抗体（１：１００；Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、英国）で標識化し、続いて、Ｃｙ５標識された二次のロバ抗マウスＩｇＧによって標識化した。膵島β細胞、すなわち、インスリンの、ＩＡＰＰとの共局在化を、ＴＲＩＴＣ標識されたロバ抗モルモット二次抗体（１：５００；Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、米国）にカップリングされるポリクローナルなモルモット抗インスリン抗体（１：５；Ｄａｋｏ、米国）を使用して求めた。染色されたサンプルを、Ｔｒｉｓ緩衝化グリセロール（０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．５）と、５０ｍｇ／ｍＬの没食子酸ｎ−プロピルが補充されたグリセロールとの３：７の混合物）とともにカバーガラスにより覆った。

【0071】

結果として、組換えマウスキメラ抗体ＮＩ−２０３．２６Ｃ１１（ＮＩ−２０３．２６Ｃ１１−ｃｈ；青色；１００ｎＭ；図３、上段パネル）により、Ｔ２Ｄ膵島におけるｈＩＡＰＰ凝集物が検出された。具体的には、染色が、β細胞を有しない膵島領域に限定された（どの併合図も、赤色でのインスリン染色を有していない）。しかしながら、染色が、病理学的なｈＩＡＰＰ凝集物を欠く健康なコントロール膵島における生理学的なＩＡＰＰに対しては視認されなかった。

【0072】

実施例２：耐糖能障害が２型糖尿病のトランスジェニックマウスモデルにおけるＴｈｉｏＳ陽性物の沈着に先立つ
トランスジェニックマウスモデルにおける膵島アミロイドの沈着を試験するために、膵島アミロイドを、ｈＩＡＰＰトランスジェニックマウスにおいて４週齢ではなく、１４週齢で、膵島アミロイド（０．１％ ＴｈｉｏＳ）、インスリン（抗インスリン抗体、１：３；赤色）及びグルカゴン（抗グルカゴン抗体；１：２５００；青色）について染色されるｈＩＡＰＰトランスジェニックマウス及び野生型マウスの膵島を利用して上記で記載されるように、免疫蛍光染色を利用して可視化した。図４を参照のこと。図４（Ａ）に示されるように、野生型マウスは、トランスジェニックマウスと比較して、膵島アミロイドを欠いていた。

【0073】

加えて、耐糖能をトランスジェニックマウスにおいて測定した。図４（Ｂ）を参照のこと。簡単に記載すると、グルコースを５時間絶食の動物に体重１グラムあたり２ｍｇで腹腔内投与し、その後、動物の血液（末梢血）におけるグルコースレベル（血中グルコース濃度）を、市販の測定装置（Ｍｅｄｉｓａｆｅ Ｒｅａｄｅｒ、Ｔｅｒｕｍｏ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）を使用して２４０分間にわたって１５分毎に求めた。市販の測定装置を利用する測定は比色分析に基づく。測定用チップが準備され、チップ上に、グルコースオキシダーゼ及びペルオキシダーゼが触媒として、また、４−アミノアンチピリン及びＮ−エチル−Ｎ（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−トルイジンが発色剤として置かれる。毛管現象により吸収される血液サンプルがこのチップに置かれるとき（この場合には４μｌ）、その後、血液中のグルコースがグルコースオキシダーゼによって酸化される。その後、チップ上の発色剤が、この時に生じる過酸化水素と、ペルオキシダーゼとによって酸化され、これにより、赤紫色が生じる。血液中のグルコースの量が、この色の濃淡の程度を測定することによって計算される。経口ブドウ糖負荷試験を４週齢（上段パネル）及び１４週齢（下段パネル）でのトランスジェニックマウス及び野生型マウスにおいて行った。図４（Ｂ）を参照のこと。結果は、経口グルコース後の血中グルコースレベルが、４週齢（ｔｇ、ｎ＝１３；ｗｔ、ｎ＝９）及び１４週齢（ｔｇ、ｎ＝２７；ｗｔ、ｎ＝３１）での野生型マウスと比較してｈＩＡＰＰトランスジェニックマウスにおいてはより高かったことを示した。加えて、空腹時血中グルコースレベルが４週齢では群間において類似するが、１４週齢ではｈＩＡＰＰトランスジェニックマウスにおいて増大した。

【0074】

実施例３：ｈＩＡＰＰトランスジェニックマウスにおけるｈＩＡＰＰ凝集物についての抗体の親和性及び選択性の有効性確認
ｈＩＡＰＰトランスジェニックマウスにおけるｈＩＡＰＰ凝集物に対するＮＩ−２０３．２６Ｃ１１抗体の親和性及び選択性を試験するために、遺伝子組換え体の膵島におけるｈＩＡＰＰ凝集物を検出するための組換えヒト抗体ＮＩ−２０３．２６Ｃ１１（ＮＩ−２０３．２６Ｃ１１；青色；１００ｎＭ）、及び、膵島β細胞におけるインスリンを検出するための抗インスリン抗体（１：３；赤色）を利用する免疫蛍光分析及び免疫組織化学的分析を行った。図５を参照のこと。結果は、４週齢及び１６週齢のｈＩＡＰＰトランスジェニックマウスにおける膵島に対するＮＩ−２０３．２６Ｃ１１染色（青色染色；左側パネル、図５）を示し、週齢一致の野生型マウスに対しては染色が認められなかった（青色染色の非存在；右側パネル、図５）。

【0075】

加えて、ＮＩ−２０３．２６Ｃ１１抗体を１６週齢のｈＩＡＰＰトランスジェニックマウス及び野生型マウスに単回投与（１０ｍｇ／ｋｇ（ｉ．ｐ．））で投与し、その結合を、抗ヒト二次抗体を使用して投与後２日で評価した。図６を参照のこと。

【0076】

組換えヒトＮＩ−２０３．２６Ｃ１１（褐色染色、図６）は遺伝子組換え体の膵島を標的とし、これにより、ＴｈｉｏＳ陽性アミロイドが示される（緑色染色、図６）が、ＴｈｉｏＳ陰性の野生型膵島は示されないことが示された。加えて、染色はコントロールＩｇＧにより何ら認められなかった。

【0077】

実施例４：本発明の抗体の投与はβ細胞喪失をｈＩＡＰＰトランスジェニックマウスにおいて防ぐ
ｈＩＡＰＰトランスジェニックマウスにおけるβ細胞に対するＮＩ−２０３．２６Ｃ１１の影響を試験するために、膵臓インスリン、膵島領域及びインスリン分泌を、ｈＩＡＰＰトランスジェニックマウスにおいて組換えマウスキメラＮＩ−２０３．２６Ｃ１１抗体による週１回の処置の後で測定した（ｔｇ ＮＩ−２０３．２６Ｃ１１−ｃｈ、ｎ＝２３；１０ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｐ．、１２週間）；図７を参照のこと。

【0078】

簡単に記載すると、パラフィン包埋切片をポリクローナルなモルモット抗インスリン抗体（１：５；Ｄａｋｏ、米国）で標識し、続いて、ＴＲＩＴＣ標識されたロバ抗モルモット二次抗体（１：５００；Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、米国）によって標識した。染色されたサンプルを、Ｔｒｉｓ緩衝化グリセロール（０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．５）と、５０ｍｇ／ｍＬの没食子酸ｎ−プロピルが補充されたグリセロールとの３：７の混合物）とともにカバーガラスにより覆った。膵臓領域及び膵島領域との関連でのインスリン陽性領域、平均膵島領域及び膵臓密度の定量化が方法の節に記載されている。

【0079】

結果は、膵臓のインスリン（％膵臓領域及び％膵島領域におけるインスリン陽性領域；上段左側パネル及び上段中央パネル）、膵島領域（平均膵島領域；上段右側パネル）及びインスリン分泌（血漿中インスリンレベル；下段左側パネル）が、ＰＢＳを受けるｈＩＡＰＰトランスジェニックマウス（ｔｇ ＰＢＳ、ｎ＝２８）と比較して増大したことを示した。しかしながら、膵島密度及び膵臓質量はＮＩ−２０３．２６Ｃ１１−ｃｈ処置の後で変化していなかった（下段中央パネル及び下段右側パネル、それぞれ；図７）。

【0080】

実施例５：本発明の抗体は主に早期の原線維性ＩＡＰＰを認識する
抗体ＮＩ−２０３．２６Ｃ１１がどのｈＩＡＰＰ凝集物化学種に結合するかを検討するために、チオフラビン−Ｔ（Ｔｈｉｏ−Ｔ）凝集アッセイを行った。簡単に記載すると、合成ｈＩＡＰＰの自発的凝集を、アミロイド原線維形成をアミロイド特異的色素チオフラビン−Ｔ（Ｔｈｉｏ−Ｔ）の蛍光の増大によりモニターすることによって評価した。凍結乾燥された合成ｈＩＡＰＰペプチド（Ｂａｃｈｅｍ、スイス）を純ＤＭＳＯにおいて再構築し、Ｔｈｉｏ−Ｔ溶液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）における２０μＭ Ｔｈｉｏ−Ｔ）と混合して、２０μＭの最終ペプチド濃度にした。０．２２μｍのフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）でろ過した後、凝集溶液を蛍光用石英キュベットに直ちに移し、凝集を、４８９ｎｍでの蛍光放射波長（４５６ｎｍでの励起）をＲＴで１分毎に測定するＣａｒｙ Ｅｃｌｉｐｓｅ蛍光分光光度計（Ａｇｉｌｅｎｔ）で撹拌下において記録した。アッセイは、図９Ａに示されるように、古典的なＳ字形凝集曲線をｈＩＡＰＰについて示し、齧歯類ＩＡＰＰ（ｒＩＡＰＰ）については示さなかった。

【0081】

加えて、ドットブロット分析を、Ｔｈｉｏ−Ｔ実験からのサンプルを利用して行った。ドットブロット分析を下記のように行った。凝集アッセイからのｈＩＡＰＰ調製物を連続希釈し、ＰＢＳ−Ｔ（ＰＢＳにおける０．１％のＴｗｅｅｎ−２０）で事前に平衡化されたニトロセルロースメンブラン（０．１μｍの細孔サイズ）でろ過した。ウエルをＰＢＳ−Ｔで洗浄し、サンプルを加えた。完全なろ過の後、メンブランを３回洗浄した。続いて、メンブランをＲＴで１５分間にわたって手短に風乾し、ブロッキング緩衝液（ＰＢＳにおける３％のＢＳＡ、０．１％のＴｗｅｅｎ−２０）においてＲＴで１時間インキュベーションし、その後、マウスキメラＮＩ−２０３．２６Ｃ１１抗体（ブロッキング緩衝液における５μｇ／ｍｌ）とＲＴで１時間インキュベーションした。コントロール抗体として、ニワトリ抗ＩＡＰＰ抗体（１：１０００；Ｐ１０９９７、Ａｇｒｉｓｅｒａ）を使用した。洗浄後、メンブランをＨＲＰコンジュゲート化抗マウスＩｇＧ二次抗体及びＨＲＰコンジュゲート化抗ニワトリＩｇＧ二次抗体（１：１００００の希釈；Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）とＲＴで１時間インキュベーションした。ＨＲＰ基質（ＥＣＬ）の転換を、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ ＬＡＳ４０００での検出（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して分析した。図９Ｂに示されるように、ｈＩＡＰＰ凝集の早期段階におけるｈＩＡＰＰ調製物についての選択的結合が示され得る一方で、低下した結合が成長の後期段階で認められた。しかしながら、抗体ＮＩ−２０３．２６Ｃ１１は非凝集ｈＩＡＰＰ画分（０’）については免疫陰性のままであり、また、ｒＩＡＰＰに対しては反応しなかった。

【0082】

さらには、フィルター遅延アッセイ（ＦＲＡ）を、２％のＳＤＳに混合される凝集アッセイからのｈＩＡＰＰ調製物を使用して行った。その後、サンプルを酢酸セルロースメンブランでろ過し、メンブランをブロッキング緩衝液（ＰＢＳにおける３％のミルク、０．１％のＴｗｅｅｎ−２０）とＲＴで１時間ブロッキング処理した。ＳＤＳ耐性ｈＩＡＰＰ集合物の検出をドットブロット分析について記載されるように行った。ＦＲＡは、抗ＩＡＰＰ抗体はＳＤＳ抵抗性の原線維性ｈＩＡＰＰ化学種を評価されたすべての時点で認識したが、これらのｈＩＡＰＰ化学種に対して抗体ＮＩ−２０３．２６Ｃ１１については反応性が認められ得ないことを示した。例えば、図９Ｂを参照のこと。

【0083】

ｈＩＡＰＰ集合物の形態学を透過電子顕微鏡法（ＴＥＭ）分析によって評価した。簡単に記載すると、サンプルをグロー放電による炭素被覆の銅グリッドに吸着させ、過剰なサンプルを、ろ紙で拭き取ることによって除いた。グリッドを２％（ｗ／ｖ）酢酸ウラニルにより６０秒間染色し、過剰な溶液を、ｄｄＨ２０で洗浄することによって除いた。風乾後、グリッドを、１００ｋＶの加速電圧を用いるＰｈｉｌｉｐ社のＣＭ１００透過型電子顕微鏡により画像化した。図９Ｃに示されるように、多様な形態学的スペクトルがＴＥＭにより評価できた。具体的には、凝集前の時点を示す０分の時点では、大きい原線維性凝集物が存在しない。５分後では、無定形の非原線維性の特徴が原線維性の特徴と同様に、認められた。原線維性の形態が、その後の時点で、すなわち、１０分及び２０分で採取されたサンプルにおいて認められた。

【0084】

実施例６：本発明の抗体の投与は糖尿病に伴う症状を防止する
ＮＩ−２０３．２６Ｃ１１抗体の投与が糖尿病に関連する症状を改善し得るかどうかを試験するために、組換えマウスキメラＮＩ−２０３．２６Ｃ１１抗体をｈＩＡＰＰトランスジェニックマウス（ｔｇ ＮＩ−２０３．２６Ｃ１１−ｃｈ、ｎ＝２４；１０ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｐ．）に週１回で投与し、血中グルコース、耐糖能、体重を、上記で既に記載されたように評価した。図８を参照のこと。

【0085】

８週間及び１２週間の処置の後、ＮＩ−２０３．２６Ｃ１１抗体は、ＰＢＳ群と比較されるｈＩＡＰＰトランスジェニックマウスにおける一晩の絶食の後で測定される空腹時血中グルコースの有意な低下を示した。加えて、１０週間の処置の後での耐糖能が有意に改善された。

【0086】

さらには、正常になった体重が、ＮＩ−２０３．２６Ｃ１１により処置されるｈＩＡＰＰトランスジェニックマウスにおいて認められた。すなわち、体重増分（％）が、ＰＢＳが注入される野生型マウス（ｗｔ ＰＢＳ、ｎ＝３１）と比較された場合、１２週間の処置の間処置されたＮＩ−２０３．２６Ｃ１１において正常化された。具体的には、ＰＢＳ処置のもとにあるｈＩＡＰＰトランスジェニックマウスは、野生型マウスと比較して、損なわれた体重増大を示した。図８を参照のこと。

【0087】

したがって、結果として、ＮＩ−２０３．２６Ｃ１１抗体はｈＩＡＰＰトランスジェニックマウスにおいて空腹時血中グルコースを低下させ、耐糖能を改善し、かつ、体重増加を正常にすることが示された。

【0088】

実施例７：本発明の抗体は耐糖能をｈＩＡＰＰトランスジェニックラットにおいて正常にする
加えて、トランスジェニックマウスにおいて示される結果をさらに改善するために、２型糖尿病のトランスジェニックラットモデル（ｈＩＡＰＰトランスジェニックラット）におけるＮＩ−２０３．２６Ｃ１１抗体の影響を評価した。図１０を参照のこと。具体的には、組換えラットキメラＮＩ−２０３．２６Ｃ１１抗体を週１回、ｈＩＡＰＰトランスジェニックラット（ｔｇ ＮＩ−２０３．２６Ｃ１１−ｒ、ｎ＝９；３ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｐ．）及び野生型ラット（ｗｔ ＮＩ−２０３．２６Ｃ１１−ｒ；ｎ＝４；３ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｐ．）に投与した。

【0089】

耐糖能を試験するために、経口ブドウ糖負荷試験（ｏＧＴＴ）を、同等の血中グルコースレベルを示す３月齢のｈＩＡＰＰトランスジェニックラット及び野生型ラットにおいて処置前に行った。結果として、ＮＩ−２０３．２６Ｃ１１−ｒ抗体は、ＰＢＳ処置のｈＩＡＰＰトランスジェニックラット（ｔｇ ＰＢＳ、ｎ＝１０）及びＰＢＳ処置の野生型ラット（ｗｔ ＰＢＳ、ｎ＝５）と比較した場合、血中グルコースレベルを８週間の処置の後で行われたｏＧＴＴの期間中のｈＩＡＰＰトランスジェニックラットにおいて正常にした。加えて、ＮＩ−２０３．２６Ｃ１１−ｒ抗体は野生型ラット（ｗｔ ＮＩ−２０３．２６Ｃ１１−ｒ）において血中グルコースレベルに影響を与えないことが示された。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]