特許 6557235 ｄｅ ｎｏｖｏ脂質生成のバイオマーカーおよびその使用方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6557235

(24)【登録日】2019年7月19日

(45)【発行日】2019年8月7日

(54)【発明の名称】ｄｅ ｎｏｖｏ脂質生成のバイオマーカーおよびその使用方法

(51)【国際特許分類】

   G01N 33/92 20060101AFI20190729BHJP

   G01N 27/62 20060101ALN20190729BHJP

【ＦＩ】

   G01N33/92 Z

   !G01N27/62 V

【請求項の数】33

【全頁数】32

(21)【出願番号】特願2016-541152(P2016-541152)

(86)(22)【出願日】2014年12月18日

(65)【公表番号】特表2017-500567(P2017-500567A)

(43)【公表日】2017年1月5日

(86)【国際出願番号】US2014071035

(87)【国際公開番号】WO2015095451

(87)【国際公開日】20150625

【審査請求日】2017年12月14日

(31)【優先権主張番号】61/934,033

(32)【優先日】2014年1月31日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】61/918,866

(32)【優先日】2013年12月20日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】512080284

【氏名又は名称】メタボロン，インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】110000855

【氏名又は名称】特許業務法人浅村特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】ワトキンス、スティーブン、エム．

【審査官】 海野 佳子

(56)【参考文献】

【文献】 米国特許出願公開第２０１１／０２１３０３２（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 特表２０１０−５２５３３２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 米国特許出願公開第２００９／０２３９２５３（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２００５／１０９００６（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 米国特許出願公開第２００５／０００９００５（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 KENNETH LYONS JONES et al.，Altered lipid metabolism in gastroschisis: a novel hypothesis，american journal of medical genetics part A，２０１３年 ６月２１日，Vol.161,No.8，PP.1860-1865

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｇ０１Ｎ ３３／４８−３３／９８

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

被験者においてｄｅ ｎｏｖｏ脂質生成を推定するための方法であって、
生物学的サンプル中の３種以上のバイオマーカーのレベルを測定する工程であって、前記バイオマーカーが、被験者から採取されたサンプル中の、ミリスチン酸（１４：０）の全レベル、ミリストレイン酸（１４：１ｎ５）の全レベル、パルミテート（１６：０）の全レベル、パルミトレエート（１６：１ｎ７）の全レベル、サピエン酸（１６：１ｎ１０）の全レベル、スクアレンの全レベル、リノレエート（１８：２ｎ６）の全レベル、アラキドン酸（２０：４ｎ６）の全レベル、ドコサヘキサエン酸（２２：６ｎ３）の全レベル、１つ以上の脂質クラスのミリスチン酸（１４：０）のレベル、１つ以上の脂質クラスのミリストレイン酸（１４：１ｎ５）のレベル、１つ以上の脂質クラスのパルミテート（１６：０）のレベル、１つ以上の脂質クラスのパルミトレエート（１６：１ｎ７）のレベル、１つ以上の脂質クラスのサピエン酸（１６：１ｎ１０）のレベル、１つ以上の脂質クラスのスクアレンのレベル、１つ以上の脂質クラスのリノレエート（１８：２ｎ６）のレベル、１つ以上の脂質クラスのアラキドン酸（２０：４ｎ６）のレベルおよび１つ以上の脂質クラスのドコサヘキサエン酸（２２：６ｎ３）のレベルからなる群から選択される、工程と、
前記被験者において以下のモデル：
（ｉ）ＤＮＬ＝ａ（１６：０）＋ｂ（１６：１ｎ７）−ｃ（１８：２ｎ６）、
（ｉｉ）ＤＮＬ＝（ａ（１６：０）＋ｂ（１６：１ｎ７））／ｃ（１８：２ｎ６）、
（ｉｉｉ）ＤＮＬ＝ａ（１６：０）＋ｂ（１６：１ｎ７）−ｃ（１８：２ｎ６）＋ｄ（１４：０）＋ｅ（１４：１ｎ５）、
（ｉｖ）ＤＮＬ＝ａ（１６：０）＋ｂ（１６：１ｎ７）−ｃ（１８：２ｎ６）＋ｄ（１４：０）＋ｅ（１４：１ｎ５）−ｆ（２０：４ｎ６）−ｇ（２２：６ｎ３）、
（ｖ）ＤＮＬ＝ａ（１６：０）＋ｂ（１６：１ｎ１０）−ｃ（１８：２ｎ６）、または
（ｖｉ）ＤＮＬ＝ａ（１６：０）＋ｂ（１６：１ｎ１０）−ｃ（スクアレン）
の１つを用いてｄｅ ｎｏｖｏ脂質生成指標スコアを生成して、前記ｄｅ ｎｏｖｏ脂質生成を推定する工程であって、
式中、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、ｇが定数であり、（１６：０）、（１６：１ｎ７）、１８：２ｎ６）、（１４：０）、（１４：１ｎ５）、（２０：４ｎ６）、（２２：６ｎ３）、（１６：１ｎ１０）およびスクアレンがバイオマーカーアナライトの測定値であり、かつＤＮＬが予測ｄｅ ｎｏｖｏ脂質生成スコアである、工程と
を含む、方法。

【請求項2】

前記バイオマーカーが、血液中のパルミテート（１６：０）、パルミトレエート（１６：１ｎ７）およびリノレエート（１８：２ｎ６）の全レベルを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記バイオマーカーが、血液中のミリスチン酸（１４：０）および（１４：１ｎ５）の全レベルをさらに含む、請求項２に記載の方法。

【請求項4】

前記バイオマーカーが、血液中のアラキドン酸（２０：４ｎ６）およびドコサヘキサエン酸（２２：６ｎ３）の全レベルをさらに含む、請求項３に記載の方法。

【請求項5】

前記生物学的サンプルが、皮脂サンプル、皮膚サンプル、表皮サンプルおよび皮膚細胞サンプルからなる群から選択され、前記３種以上のバイオマーカーが、１６：０、１６：１ｎ７、１６：１ｎ１０、１４：０、１４：１ｎ５、１８：２ｎ６、２０：４ｎ６、スクアレンおよび２２：６ｎ３、ならびにそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。

【請求項6】

前記バイオマーカーが、トリアシルグリセリド、ホスファチジルコリンおよびコレステリルエステルからなる群から選択される１つ以上の個別の脂質クラス内で測定される、請求項１に記載の方法。

【請求項7】

前記バイオマーカーが、その骨格から脂肪酸を分離した後に測定される、請求項１に記載の方法。

【請求項8】

前記バイオマーカーが無傷の複合脂質種として測定される、請求項１に記載の方法。

【請求項9】

前記バイオマーカーが全血中脂質で測定される、請求項１に記載の方法。

【請求項10】

前記ｄｅ ｎｏｖｏ脂質生成指標スコアを用いて疾患を有する個体の疾患状態を評価する、前記疾患が、糖尿病、または肝臓脂肪症およびインスリン感受性からなる群から選択される糖尿病プロセスである、請求項１に記載の方法。

【請求項11】

前記ｄｅ ｎｏｖｏ脂質生成指標スコアを用いて肝臓障害を有する個体の肝臓の健康を評価する、前記肝臓障害が、脂肪症および肝臓インスリン抵抗性からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。

【請求項12】

前記ｄｅ ｎｏｖｏ脂質生成指標スコアを、肝障害を病期分類するために用いる、前記肝障害が、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）および非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。

【請求項13】

前記ｄｅ ｎｏｖｏ脂質生成指標スコアが、ｄｅ ｎｏｖｏ脂質生成および関連疾患病態に関して治療剤に対する反応をモニターするために用いられる、請求項１に記載の方法。

【請求項14】

前記治療剤は低分子阻害剤である、請求項１３に記載の方法。

【請求項15】

前記ｄｅ ｎｏｖｏ脂質生成指標スコアが、ｄｅ ｎｏｖｏ脂質生成を阻害する治療剤の有効性を決定するために用いられる、請求項１に記載の方法。

【請求項16】

前記治療剤が、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣ）、脂肪酸シンターゼ（ＦＡＳ）、ステアロイルＣｏＡデサチュラーゼ（ＳＣＤ）、エロンガーゼ（ＥＬＯＶＬ）、およびジアシルグリセロール：ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ）阻害剤からなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。

【請求項17】

皮脂ｄｅ ｎｏｖｏ脂質生成指標スコアが、モデル（ｖ）または（ｖｉ）を用いることにより計算される、請求項１に記載の方法。

【請求項18】

被験者においてｄｅ ｎｏｖｏ脂質生成を推定するための方法であって、
生物学的サンプル中の３種以上のバイオマーカーのレベルを測定する工程であって、前記３種以上のバイオマーカーが、被験者から採取されたサンプル中の、ミリスチン酸（１４：０）の全レベル、ミリストレイン酸（１４：１ｎ５）の全レベル、パルミテート（１６：０）の全レベル、パルミトレエート（１６：１ｎ７）の全レベル、サピエン酸（１６：１ｎ１０）の全レベル、１８：１ｎ１０の全レベル、スクアレンの全レベル、６−オクタデセン酸（１８：１ｎ１２）の全レベル、リノレエート（１８：２ｎ６）の全レベル、アラキドン酸（２０：４ｎ６）の全レベル、ドコサヘキサエン酸（２２：６ｎ３）の全レベル、１つ以上の脂質クラスのミリスチン酸（１４：０）のレベル、１つ以上の脂質クラスのミリストレイン酸（１４：１ｎ５）のレベル、１つ以上の脂質クラスのパルミテート（１６：０）のレベル、１つ以上の脂質クラスのパルミトレエート（１６：１ｎ７）のレベル、１つ以上の脂質クラスのサピエン酸（１６：１ｎ１０）のレベル、１つ以上の脂質クラスの１８：１ｎ１０のレベル、１つ以上の脂質クラスのスクアレンのレベル、１つ以上の脂質クラスの１８：１ｎ１２のレベル、１つ以上の脂質クラスのリノレエート（１８：２ｎ６）のレベル、１つ以上の脂質クラスのアラキドン酸（２０：４ｎ６）のレベルおよび１つ以上の脂質クラスのドコサヘキサエン酸（２２：６ｎ３）のレベルからなる群から選択される、工程と、
前記被験者において前記３種以上のバイオマーカーの前記測定レベルで構成された統計モデルを用いてｄｅ ｎｏｖｏ脂質生成指標を生成して、前記ｄｅ ｎｏｖｏ脂質生成を推定する工程と
を含む、方法。

【請求項19】

前記バイオマーカーが、血液中のパルミテート（１６：０）、パルミトレエート（１６：１ｎ７）およびリノレエート（１８：２ｎ６）の全レベルを含む、請求項１８に記載の方法。

【請求項20】

前記バイオマーカーが、血液中のミリスチン酸（１４：０）および（１４：１ｎ５）の全レベルをさらに含む、請求項１９に記載の方法。

【請求項21】

前記バイオマーカーが、血液中のアラキドン酸（２０：４ｎ６）およびドコサヘキサエン酸（２２：６ｎ３）の全レベルをさらに含む、請求項２０に記載の方法。

【請求項22】

前記生物学的サンプルが、皮膚サンプル、表皮サンプルおよび皮膚細胞サンプルからなる群から選択され、前記３種以上のバイオマーカーが、１６：０、１６：１ｎ７、１６：１ｎ１０、１８：１ｎ１０、１８：１ｎ１２、１４：０、１４：１ｎ５、１８：２ｎ６、２０：４ｎ６、スクアレンおよび２２：６ｎ３、ならびにそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１８に記載の方法。

【請求項23】

前記バイオマーカーが、トリアシルグリセリド、ホスファチジルコリンおよびコレステリルエステルからなる群から選択される１つ以上の個別の脂質クラス内で測定される、請求項１８に記載の方法。

【請求項24】

前記バイオマーカーが、その骨格から脂肪酸を分離した後に測定される、請求項２３に記載の方法。

【請求項25】

前記バイオマーカーが無傷の複合脂質種として測定される、請求項２３に記載の方法。

【請求項26】

前記バイオマーカーが全血中脂質で測定される、請求項１８に記載の方法。

【請求項27】

前記バイオマーカーが全脂肪酸に対する割合として表される、請求項１８に記載の方法。

【請求項28】

前記割合がモル％単位である、請求項２７に記載の方法。

【請求項29】

前記数学モデルが、前記モデルにおける各バイオマーカーの前記測定レベルの線形結合であり、それにより、陽性マーカーが正の係数を有し、かつ陰性マーカーが負の係数を有する、請求項１８に記載の方法。

【請求項30】

前記数学モデルが陽性マーカー対陰性マーカーの比を含む、請求項１８に記載の方法。

【請求項31】

前記比が陽性マーカーの和対陰性マーカーの和からなる、請求項３０に記載の方法。

【請求項32】

ｄｅ ｎｏｖｏ脂質生成指標スコアが、以下のモデル：
（ｉ）ＤＮＬ＝ａ（１６：０）＋ｂ（１６：１ｎ７）−ｃ（１８：２ｎ６）、または
（ｉｉ）ＤＮＬ＝（ａ（１６：０）＋ｂ（１６：１ｎ７））／ｃ（１８：２ｎ６）、
（ｉｉｉ）ＤＮＬ＝ａ（１６：０）＋ｂ（１６：１ｎ７）−ｃ（１８：２ｎ６）＋ｄ（１４：０）＋ｅ（１４：１ｎ５）、
（ｉｖ）ＤＮＬ＝ａ（１６：０）＋ｂ（１６：１ｎ７）−ｃ（１８：２ｎ６）＋ｄ（１４：０）＋ｅ（１４：１ｎ５）−ｆ（２０：４ｎ６）−ｇ（２２：６ｎ３）、
（ｖ）ＤＮＬ＝ａ（１６：０）＋ｂ（１６：１ｎ１０）−ｃ（１８：２ｎ６）、または
（ｖｉ）ＤＮＬ＝ａ（１６：０）＋ｂ（１６：１ｎ１０）−ｃ（スクアレン）
の１つを用いて計算され、式中、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、ｇが定数であり、（１６：０）、（１６：１ｎ７）、１８：２ｎ６）、（１４：０）、（１４：１ｎ５）、（２０：４ｎ６）、（２２：６ｎ３）、（１６：１ｎ１０）およびスクアレンがバイオマーカーアナライトの測定値であり、かつＤＮＬが予測ｄｅ ｎｏｖｏ脂質生成指標スコアである、請求項１８に記載の方法。

【請求項33】

皮脂ｄｅ ｎｏｖｏ脂質生成指標スコアが、以下のモデル：
（ｉ）皮脂ＤＮＬ１＝０．０３９８（１６：０）＋０．０４５５（１６：１ｎ１０）−１．３９８（１８：２ｎ６）、または
（ｉｉ）皮脂ＤＮＬ２＝０．０３９８（１６：０）＋０．０４５５（１６：１ｎ１０）−０．０１１３（スクアレン）
の１つを用いることにより計算され、
式中、（１６：０）、（１６：１ｎ１０）、（１８：２ｎ６）およびスクアレンがバイオマーカーアナライトの測定値である、請求項１８に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０１３年１２月２０日出願の米国仮特許出願第６１／９１８，８６６号明細書および２０１４年１月３１日出願の米国仮特許出願第６１／９３４，０３３号明細書（それらの全内容は本出願をもって参照により本明細書に組み込まれる）の利益を主張する。

【0002】

バイオマーカー、ｄｅ ｎｏｖｏ脂質生成と相関があるバイオマーカーを同定する方法、および同バイオマーカーに基づく方法が本明細書に記載される。

【背景技術】

【0003】

ｄｅ ｎｏｖｏ脂質生成（ＤＮＬ）は、基質から脂肪酸を合成する生理学的プロセスであり、ヒトにおいて主に肝臓で行われるプロセスである。血液中の脂肪の量はＤＮＬに正比例してないため、このプロセスをｉｎ ｖｉｖｏで評価することは困難となっていた。脂質生成はヒトに存在する脂肪酸の一部を提供し、ほとんどの脂肪酸は食事に由来するが、脂質生成のプロセスは、健康状態の重要なインジケーターとなりうる。脂質生成の血液ベースの尺度は、ＤＮＬに及ぼす食事、生活習慣、および治療の影響の測定、ならびに疾患に対するＤＮＬの寄与の評価を可能にするであろう。

【0004】

ヒトにおいて、脂質生成の直接産物でもある脂肪酸を含めて、ほとんどの脂肪酸は食事に由来するため、血液中の個別の脂肪酸の絶対レベルは、ＤＮＬの指標とならない。したがって、血液中の個別の脂肪酸の直接的尺度では、食事由来の脂肪酸源とＤＮＬ由来の脂肪酸源とを区別することができない。さらに、血液中のすべての脂質の絶対レベルは、ＤＮＬに関連しない生物学的性状（たとえば、遅いＶＬＤＬクリアランス）に依存して、高いことも低いこともありうる。

【0005】

この制限を克服するために、ｄｅ ｎｏｖｏ脂質生成の現在の測定手順は、特に重水の摂取を介して安定同位体の使用を必要とする。したがって、この方法は、診察では一般に使用されない。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

ＤＮＬが関与する疾患としては、糖尿病および関連病態、肥満症、肝臓脂肪症、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、癌、心血管疾患（高トリグリセリド血症）、ならびに皮膚障害が挙げられる。最小侵襲法または非侵襲法を用いてヒトにおいてｄｅ ｎｏｖｏ脂質生成の指標となる血液中およびまたは皮膚中の脂肪酸レベルを測定し、かつこれらの測定値を用いた評価で全血中脂質含有率の影響を規格化して個体のｄｅ ｎｏｖｏ脂質生成の量を決定することが望ましい。

【課題を解決するための手段】

【0007】

一実施形態では、本開示は、被験者においてｄｅ ｎｏｖｏ脂質生成レベルを決定する方法を提供する。本方法は、被験者からの生物学的サンプルを分析してサンプル中のｄｅ ｎｏｖｏ脂質生成（ＤＮＬ）の１種以上のバイオマーカーのレベルを決定する工程であって、１種以上のバイオマーカーが、１６：１ｎ１０、１８：１ｎ１０、１８：１ｎ１２、スクアレン、１６：０、１６：１ｎ７、１４：０、１４：１ｎ５、１８：２ｎ６、２０：４ｎ６、および２２：６ｎ３、ならびにそれらの組合せからなる群から選択される、工程と、サンプル中の１種以上のバイオマーカーのレベルと１種以上のバイオマーカーのＤＮＬ陽性および／またはＤＮＬ陰性の参照レベルとを比較して、被験者においてｄｅ ｎｏｖｏ脂質生成レベルを決定する工程とを含む。

【0008】

他の実施形態では、本開示は、被験者がｄｅ ｎｏｖｏ脂質生成に関連する疾患（たとえば、糖尿病、肥満、肝臓脂肪症、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、癌、心血管疾患、高トリグリセリド血症）を発症する素因またはリスクを有するか否かを決定する方法を提供する。本方法は、被験者からの生物学的サンプルを分析してサンプル中のｄｅ ｎｏｖｏ脂質生成（ＤＮＬ）の１種以上のバイオマーカーのレベルを決定する工程であって、１種以上のバイオマーカーが、１６：１ｎ１０、１８：１ｎ１０、１８：１ｎ１２、スクアレン、１６：０、１６：１ｎ７、１４：０、１４：１ｎ５、１８：２ｎ６、２０：４ｎ６、および２２：６ｎ３、ならびにそれらの組合せからなる群から選択される、工程と、サンプル中の１種以上のバイオマーカーのレベルと１種以上のバイオマーカーのＤＮＬ陽性および／またはＤＮＬ陰性の参照レベルとを比較して、被験者がｄｅ ｎｏｖｏ脂質生成に関連する前記疾患を発症する素因を有するか否かを決定する工程とを含む。

【0009】

また、被験者においてＤＮＬ関連の疾患または障害の開始／進行／退縮をモニターする方法も提供される。本方法は、被験者からの生物学的サンプルを分析してサンプル中のＤＮＬの１種以上のバイオマーカーのレベルを決定する工程であって、１種以上のバイオマーカーが、１６：１ｎ１０、１８：１ｎ１０、１８：１ｎ１２、スクアレン、１６：０、１６：１ｎ７、１４：０、１４：１ｎ５、１８：２ｎ６、２０：４ｎ６、および２２：６ｎ３、ならびにそれらの組合せからなる群から選択される、工程と、サンプル中の１種以上のバイオマーカーのレベルとＤＮＬ進行および／またはＤＮＬ退縮の参照レベルとを比較して、被験者においてＤＮＬ関連の疾患または障害の開始／進行／退縮をモニターする工程とを含む。

【0010】

さらに、被験者からの生物学的サンプルを分析してサンプル中の１種以上のＤＮＬバイオマーカーのレベルを決定する工程であって、１種以上のバイオマーカーが、１６：１ｎ１０、１８：１ｎ１０、１８：１ｎ１２、スクアレン、１６：０、１６：１ｎ７、１４：０、１４：１ｎ５、１８：２ｎ６、２０：４ｎ６、および２２：６ｎ３、ならびにそれらの組合せからなる群から選択される、工程と、サンプル中の１種以上のバイオマーカーのレベルと１種以上のバイオマーカーのＤＮＬ陽性および／またはＤＮＬ陰性の参照レベルとを比較して、被験者がＤＮＬ関連の疾患または障害を有するか否かを予測する工程とを含む、被験者がＤＮＬ関連の疾患または障害を有するか否かを予測する方法が提供される。

【0011】

他の実施形態では、１種以上のＤＮＬバイオマーカーまたはそれらの組合せの測定を用いて、被験者においてＤＮＬの評価に使用可能なＤＮＬ指標を生成しうる。本方法は、被験者からの生物学的サンプルを分析してサンプル中の１種以上のバイオマーカーのレベルを決定する工程であって、１種以上のバイオマーカーが、１６：１ｎ１０、１８：１ｎ１０、１８：１ｎ１２、スクアレン、１６：０、１６：１ｎ７、１４：０、１４：１ｎ５、１８：２ｎ６、２０：４ｎ６、および２２：６ｎ３、ならびにそれらの組合せからなる群から選択される、工程と、前記１種以上のバイオマーカーの測定レベルを含む数学モデル（ＤＮＬ指標）を生成する工程と、ＤＮＬ指標に基づいてＤＮＬ指標スコアを計算する工程と、ＤＮＬ指標スコアとＤＮＬ参照レベルとを比較して、被験者においてＤＮＬを評価する工程とを含む。

【0012】

さらに他の実施形態では、本開示は、ＤＮＬ関連の疾患または障害の治療の有効性をモニターする方法を提供する。本方法は、被験者からの第１の生物学的サンプルを分析してサンプル中の１種以上のＤＮＬバイオマーカーのレベルを決定する工程であって、第１のサンプルが第１の時点で被験者から得られ、１種以上のバイオマーカーが、１６：１ｎ１０、１８：１ｎ１０、１８：１ｎ１２、スクアレン、１６：０、１６：１ｎ７、１４：０、１４：１ｎ５、１８：２ｎ６、２０：４ｎ６、および２２：６ｎ３、ならびにそれらの組合せからなる群から選択される、工程と、ＤＮＬ関連の疾患または障害に関して被験者を治療する工程と、被験者からの第２の生物学的サンプルを分析して１種以上のバイオマーカーのレベルを決定する工程であって、第２のサンプルが治療後の第２の時点で被験者から得られる、工程と、第１のサンプル中の１種以上のバイオマーカーのレベルと第２のサンプル中の１種以上のバイオマーカーのレベルとを比較して、ＤＮＬ関連の疾患または障害の治療の有効性を評価する工程とを含む。

【0013】

さらなる実施形態では、本開示は、皮膚中での脂質生成およびそれと皮膚機能との関係を評価する（たとえば、皮脂産生、座瘡リスクなどを評価する）方法を提供する。本方法は、被験者からの皮膚、表皮、皮膚細胞、または皮脂のサンプルを分析してサンプル中の１種以上のＤＮＬバイオマーカーのレベルを決定する工程であって、１種以上のバイオマーカーが、１６：１ｎ１０、１８：１ｎ１０、１８：１ｎ１２、スクアレン、１６：０、１６：１ｎ７、１４：０、１４：１ｎ５、１８：２ｎ６、２０：４ｎ６、および２２：６ｎ３、ならびにそれらの組合せからなる群から選択される、工程と、サンプル中の１種以上のバイオマーカーのレベルと１種以上のバイオマーカーのＤＮＬ陽性および／またはＤＮＬ陰性の参照レベルとを比較して、皮膚中での脂質生成を評価する工程とを含む。

【図面の簡単な説明】

【0014】

【図1】図１は、ｄｅ ｎｏｖｏ脂質生成の異常レベルの決定、治療の推奨、ｄｅ ｎｏｖｏ脂質生成のモニタリング、およびｄｅ ｎｏｖｏ脂質生成に及ぼす治療介入の影響のモニタリングを行う臨床診療のどこでＤＮＬ指標が役立つかを例示する患者管理の医療アルゴリズム例である。

【図2】図２は、細胞のリン脂質画分を用いたＤＮＬ阻害剤処理細胞のＤＮＬ指標スコアを示すグラフである。ボックスは分布の中央５０％を表し、上側および下側の「ウィスカー」はデータ全体の広がりを表す。ハイフンは平均値を表し、丸は外れ値を表す。ｙ軸はメジアンスケール値を表す。

【図3】図３は、細胞のトリグリセリド画分を用いたＤＮＬ阻害剤処理細胞のＤＮＬ指標スコアを示すボックスプロットグラフである。

【図4】図４は、指定用量のＤＮＬ阻害剤で処理された細胞のＤＮＬ指標スコアを示すボックスプロットグラフである。

【図5】図５は、正常対照被験者と比較してＮＡＳＨまたはＮＡＦＬＤを有するヒトのＤＮＬ指標スコアを示すボックスプロットグラフである。

【図6】図６は、糖尿病を予測する３つのモデルの曲線下面積（ＡＵＣ）を示す。受診者動作特性曲線は、急性インスリン反応（ＡＩＲ）およびインスリン感受性（Ｓｉ）に加えて糖尿病を予測するＤＮＬ指標の段階的能力向上を示している。

【図7】図７は、皮脂のＤＮＬ指標１およびＤＮＬ指標２を用いたプラセボ処理皮膚またはＤＮＬ阻害剤処理皮膚の皮脂ＤＮＬ指標スコアを示すボックスプロットグラフである。

【図8】図８は、患者においてヒト血漿サンプルのＤＮＬ指標１、ＤＮＬ指標２、およびＤＮＬ指標３を用いたＤＮＬ指標スコアとｄｅ ｎｏｖｏ脂質生成の寄与率（ｆＤＮＬ）との相関を示すグラフである。

【図9】図９は、ＮＡＳＨ患者および非ＮＡＳＨ患者のＤＮＬ指標スコア値の分布を示すボックスプロット表示である。ＮＡＳＨ患者は左側であり、非ＮＡＳＨ患者は右側である。Ａ．ＤＮＬ指標１、ＤＮＬ指標１スコアとＮＡＳＨの診断との関連のｐ値は０．０２７であった。Ｂ．ＤＮＬ指標２、ＤＮＬ指標２スコアとＮＡＳＨの診断との関連のｐ値は０．００２であった。Ｃ．ＤＮＬ指標３、ＤＮＬ指標３スコアとＮＡＳＨの診断との関連のｐ値は０．００４であった。

【図10】図１０は、患者の脂肪症グレードに対するＤＮＬ指標スコア値の分布を示すボックスプロット表示である。Ａ．はＤＮＬ指標１のプロットであり、Ｂ．はＤＮＬ指標２のプロットであり、Ｃ．はＤＮＬ指標３のプロットである。ＤＮＬ指標スコアはｙ軸上にあり、脂肪症の程度はｘ軸上にある。ＤＮＬ指標１スコアとＮＡＳＨ診断との関連のｐ値は＜０．００１であった。ＤＮＬ指標２スコアとＮＡＳＨ診断との関連のｐ値は＜０．００１であった。ＤＮＬ指標３スコアとＮＡＳＨ診断との関連のｐ値は＜０．００１であった。

【発明を実施するための形態】

【0015】

ＤＮＬのバイオマーカー、ＤＮＬを決定する方法、ＤＮＬに関連する疾患を診断する方法、ＤＮＬに関連する疾患の素因を決定する方法、ＤＮＬに関連する疾患の進行／退縮をモニターする方法、ＤＮＬ関連の疾患または障害を予測する方法、ＤＮＬ指標を生成する方法、ＤＮＬ関連疾患の治療の有効性をモニターする方法、さらにはＤＮＬのバイオマーカーに基づく他の方法が本明細書に記載されている。

【0016】

しかしながら、本発明をさらに詳細に説明する前に最初に以下の用語を定義する。

【0017】

定義：
「ｄｅ ｎｏｖｏ脂質生成」または「ＤＮＬ」とは、基質から脂肪酸を合成する生理学的プロセスを意味する。

【0018】

「分画ＤＮＬ」または「ｆＤＮＬ」とは、ＶＬＤＬ−トリアシルグリセロール中の新たに合成された脂肪酸画分の測定量のことである。この方法では安定同位体が用いられる。

【0019】

「ＤＮＬ指標」とは、ｉｎ ｖｉｖｏでｄｅ ｎｏｖｏ脂質生成の評価を可能にする本明細書に記載のＤＮＬバイオマーカーおよび医療アルゴリズムに基づくｄｅ ｎｏｖｏ脂質生成の尺度を意味する。「ＤＮＬ指標」とは、ＤＮＬバイオマーカーを用いた数式を意味する。「ＤＮＬ指標スコア」とは、ＤＮＬ指標から得られる値またはＤＮＬ指標を使用した結果を意味する。

【0020】

「医療アルゴリズム」または「患者管理アルゴリズム」とは、健康管理に有用な任意の計算、式、統計調査、ノモグラム、またはルックアップテーブルを意味する。医療アルゴリズムには、健康管理処理に対する決定木手法（たとえば、症状Ａ、Ｂ、およびＣが明らかである場合、治療Ｘを使用する）および診断に対する決定木手法（たとえば、症状Ｅ、Ｆ、およびＧが明らかである場合、診断はＺであるか、または行うべき診断検査はＹである）が含まれる。医療アルゴリズムは、たとえば二分決定木の形態で診断ノモグラムまたは診断フローチャートを含みうる。

【0021】

本明細書で用いられる「ＤＮＬ関連疾患」または「ＤＮＬ関連障害」とは、糖尿病および関連病態（前糖尿病、インスリン抵抗性糖尿病、および２型糖尿病を含む）、さらには肥満、肝臓脂肪症、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、癌、および心血管疾患（高トリグリセリド血症、アテローム硬化症、心筋症を含む）、ならびに皮膚障害を意味する。

【0022】

「心血管疾患」とは、心臓または血管の任意の疾患を意味する。心血管疾患または心疾患としては、たとえば、アンギナ、不整脈、冠動脈疾患（ＣＡＤ）、冠性心疾患、心筋症（拡張型心筋症、拘束型心筋症、不整脈原性右室心筋症、および糖尿病性心筋症を含む）、心臓発作（心筋梗塞）、心不全、肥大型心筋症、僧帽弁逆流、僧帽弁逸脱、肺動脈弁狭窄などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。血管疾患としては、たとえば、末梢血管疾患、動脈疾患、頸動脈疾患、深部静脈血栓症、静脈疾患、アテローム硬化症などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。

【0023】

「糖尿病」とは、インスリンの分泌もしくは作用またはその両方の欠損から生じる高血糖（グルコース）レベルにより特徴付けられる代謝性疾患の群を意味する。

【0024】

「２型糖尿病」とは、２つの主要なタイプの糖尿病の１つ、すなわち、膵臓のβ細胞が少なくともその疾患の初期段階ではインスリンを産生するが、生体の細胞がインスリンの作用に耐性があるため、生体がそれを効果的に使用できないタイプを意味する。疾患のより後の段階では、β細胞は、インスリンの産生を停止することがある。２型糖尿病はまた、インスリン抵抗性糖尿病、インスリン非依存性糖尿病、および成人発症型糖尿病としても知られる。

【0025】

「前糖尿病」とは、グルコース利用障害、空腹時グルコースレベルの異常または障害、グルコース耐性障害、インスリン感受性障害、およびインスリン耐性障害を含む１つ以上の初期糖尿病病態を意味する。

【0026】

「インスリン抵抗性」とは、細胞内へのグルコースの取込みを調節するホルモンであるインスリンの作用に対して細胞が抵抗性になる病態または産生されるインスリンの量が正常グルコースレベルの維持に不十分である病態を意味する。細胞は、血液から筋肉および他の組織への糖グルコースの輸送を促進するインスリンの作用に反応する能力が減少する（すなわち、インスリンに対する感受性の減少）。最終的には、膵臓は、正常時よりもはるかに多くのインスリンを産生し、かつ細胞は、抵抗性であり続ける。この抵抗性を克服するのに十分なインスリンが産生されるかぎり、血中グルコースレベルは正常な状態のままである。膵臓がもはや維持できなくなると、血中グルコースは上昇し始めて糖尿病をもたらす。インスリン抵抗性は、正常（インスリン感受性）からインスリン抵抗性（ＩＲ）までの範囲に及ぶ。

【0027】

「インスリン感受性」または「Ｓｉ」とは、グルコースの取込みおよび利用を調節するインスリンの作用に細胞が反応する能力を意味する。インスリン感受性は、正常からインスリン抵抗性（ＩＲ）までの範囲に及ぶ。

【0028】

「グルコース利用」とは、筋肉および脂肪細胞による血液からのグルコースの吸収、ならびに細胞代謝のための糖の利用を意味する。細胞内へのグルコースの取込みは、インスリンにより刺激される。

【0029】

「肥満」とは、過剰量の体脂肪により定義される慢性病態を意味する。体脂肪の正常量（体重に対するパーセントで表される）は、女性では２５〜３０％、男性では１８〜２３％である。体脂肪が３０％を超える女性および体脂肪が２５％を超える男性は、肥満であるとみなされる。

【0030】

「皮膚障害」とは、座瘡、脂漏性湿疹、および油性皮膚を含めて皮脂の産生または質に影響を及ぼす病態、または乾癬、酒さ、乾燥皮膚、頭部粃糠疹、遮水機能などを含めて角質層に影響を及ぼす病態を意味する。ｄｅ ｎｏｖｏ脂質生成に関連する皮膚障害はまた、黒色腫などの癌を含みうる。

【0031】

「体重指数（ＢＭＩ）」とは、個体の身長および体重を用いて個体の体脂肪の量を推定する計算式を意味する。過度の体脂肪（たとえば肥満）は、病気および他の健康問題を引き起こす可能性がある。ＢＭＩは、肥満を研究する多くの医師および研究者に最適な測定量である。ＢＭＩは、個体の身長および体重の両方を考慮に入れた数式を用いて計算される。ＢＭＩは、キログラム単位の個人の体重をメートル単位の身長の二乗で除算した値に等しい。（ＢＭＩ＝ｋｇ／ｍ^２）。１９未満のＢＭＩを有する被験者は低体重であるとみなされ、１９〜２５のＢＭＩを有する被験者は正常体重であるとみなされ、２５〜２９のＢＭＩは一般に過体重であるとみなされ、３０以上のＢＭＩを有する個体は典型的には肥満であるとみなされる。病的肥満とは、４０以上のＢＭＩを有する被験者を意味する。

【0032】

「サンプル」または「生物学的サンプル」または「試料」とは、被験者から単離された生物学的物質を意味する。生物学的サンプルは、所望のバイオマーカーを検出するのに好適な任意の生物学的物質を含有しうると共に、被験者からの細胞物質および／または非細胞物質を含みうる。サンプルは、任意の好適な生物学的な組織または流体から単離可能であり、たとえば、血液、血漿、血清、皮膚、表皮組織、脂肪組織、大動脈組織、肝臓組織、尿、皮脂、細胞などのサンプルでありうる。

【0033】

「被験者」とは、任意の動物を意味するが、好ましくは、哺乳動物、たとえば、ヒト、サル、非ヒト霊長動物、ラット、マウス、ウシ、イヌ、ネコ、ブタ、ウマ、ウサギなどである。

【0034】

１種以上のバイオマーカーの「レベル」とは、サンプル中のバイオマーカーの絶対的または相対的な量または濃度を意味する。

【0035】

バイオマーカーの「参照レベル」とは、特定の疾患状態、表現型、またはそれらの欠如、さらには疾患状態、表現型、またはそれらの欠如の組合せの指標となるバイオマーカーのレベルを意味する。バイオマーカーの「陽性」参照レベルとは、特定の疾患状態または表現型の指標となるレベルを意味する。バイオマーカーの「陰性」参照レベルとは、特定の疾患状態または表現型の欠如の指標となるレベルを意味する。たとえば、バイオマーカーの「ＤＮＬ陽性参照レベル」とは、被験者においてＤＮＬの尺度の増加の指標となるバイオマーカーのレベルを意味し、バイオマーカーの「ＤＮＬ陰性参照レベル」とは、被験者においてＤＮＬの尺度の減少の指標となるバイオマーカーのレベルを意味する。他の例として、バイオマーカーの「ＤＮＬ進行陽性参照レベル」とは、被験者においてＤＮＬの進行の指標となるバイオマーカーのレベルを意味し、バイオマーカーの「ＤＮＬ退縮陽性参照レベル」とは、ＤＮＬの退縮の指標となるバイオマーカーのレベルを意味する。バイオマーカーの「参照レベル」は、バイオマーカーの絶対的または相対的な量または濃度、バイオマーカーの存在または不在、バイオマーカーの量または濃度の範囲、バイオマーカーの最小および／または最大の量または濃度、バイオマーカーの平均の量または濃度、ならびに／あるいはバイオマーカーのメジアンの量または濃度でありうると共に、それに加えて、バイオマーカーの組合せの「参照レベル」もまた、２種以上のバイオマーカーの絶対的または相対的な量または濃度の互いの比でありうる。特定の疾患状態、表現型、またはそれらの欠如に対するバイオマーカーの適切な陽性および陰性の参照レベルは、１つ以上の適切な被験者で所望のバイオマーカーのレベルを測定することにより決定されうると共に、かかる参照レベルは、特定の被験者集団に合わせて調整されうる（たとえば、ある特定の年齢の被験者からのサンプル中のバイオマーカーレベルと、ある特定の年齢群での特定の疾患状態、表現型、またはそれらの欠如に対する参照レベルとの間で比較が行えるように、参照レベルは年齢を一致させうる；同様に、参照レベルは性別または民族性／人種を一致させうる）。

【0036】

「ＤＮＬ陽性マーカー」とは、レベルがＤＮＬと正の相関があるｄｅ ｎｏｖｏ脂質生成のバイオマーカーを意味する（すなわち、バイオマーカーのレベルはＤＮＬの増加と共に増加する）。

【0037】

「ＤＮＬ陰性マーカー」とは、レベルがＤＮＬと負の相関があるｄｅ ｎｏｖｏ脂質生成のバイオマーカーを意味する（すなわち、バイオマーカーのレベルはＤＮＬの増加と共に減少する）。

【0038】

Ｉ．バイオマーカー
ＤＮＬに関して本明細書に開示される方法に使用されるバイオマーカーは、脂肪酸１６：１ｎ１０、１８：１ｎ１０、１８：１ｎ１２、スクアレン、１６：０、１６：１ｎ７、１４：０、１４：１ｎ５、１８：２ｎ６、２０：４ｎ６、および２２：６ｎ３、ならびにそれらの組合せおよびサブセットを含む。バイオマーカーは、特定の脂質クラス（たとえば、トリアシルグリセリド（ＴＧ）、リン脂質（ＰＬ）、コレステリルエステル（ＣＥ）、ジグリセリド（ＤＧ）、遊離脂肪酸（ＦＡ）、リゾホスファチジルコリン（ＬＹ）、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、スフィンゴミエリン（ＳＭ）、ワックスエステル（ＷＥ）など）の範囲内でまたは全脂肪酸分析（すべて脂質クラスが分析に含まれる）の一部として測定されうる。脂肪酸は、任意の生物学的サンプルで測定されうる。１６：０、１６：１ｎ７、１４：０、１４：１ｎ５、１６：１ｎ１０、１８：１ｎ１０、１８：１ｎ１２、またはこれらの脂肪酸を含有する無傷の複合脂質（たとえば、トリアシルグリセリド種またはリン脂質種）は、ＤＮＬの陽性マーカーであり（すなわち、ＤＮＬの増加はバイオマーカーのレベルの上昇に関連する）、１８：２ｎ６、２０：４ｎ６、２２：６ｎ３、これらの脂肪酸を含有する無傷の複合脂質、またはスクアレンは、ＤＮＬの陰性マーカーである（すなわち、ＤＮＬの増加はバイオマーカーのレベルの低下に関連する）。一実施形態では、バイオマーカーは、１６：０、１６：１ｎ７、および１８：２ｎ６、ならびにそれらの組合せを含む。

【0039】

さらに、バイオマーカー１６：１ｎ１０、１８：１ｎ１０、１８：１ｎ１２、スクアレン、１６：０、１６：１ｎ７、１４：０、１４：１ｎ５、１８：２ｎ６、２０：４ｎ６、および２２：６ｎ３、ならびにそれらの組合せを用いた本明細書に開示される方法は、ＤＮＬ関連疾患の臨床診断尺度と組み合わせて使用されうる。臨床診断と組み合わせることにより、開示される方法を容易にしうるか、または開示される方法の結果を確認しうる（たとえば、診断を容易にしたりもしくは確認したり、進行もしくは退縮をモニターしたり、および／またはＤＮＬ関連疾患の素因を決定したりしうる）。バイオマーカー１６：１ｎ１０、１８：１ｎ１０、１８：１ｎ１２、スクアレン、１６：０、１６：１ｎ７、１４：０、１４：１ｎ５、１８：２ｎ６、２０：４ｎ６、および２２：６ｎ３、ならびにそれらの組合せを用いた本明細書に開示される方法はまた、患者情報、たとえば、性別、人種、年齢、病歴、家族歴、リスク因子などと組み合わせて使用されうる。

【0040】

本明細書に開示される脂肪酸を無傷の複合脂質クラス（たとえば、ＰＣ１６：０｜１６：１ｎ７などのトリアシルグリセリド種またはリン脂質種）の成分として測定する方法もまた想定される。脂質クラスは、たとえば、中性脂質、リン脂質、遊離脂肪酸、全脂肪酸、トリグリセリド、コレステリルエステル、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ジグリセリド、リゾホスファチジルコリン、またはワックスエステルでありうる。いくつかの実施形態では、脂質クラスは、中性脂質、リン脂質、遊離脂肪酸、全脂肪酸、トリグリセリド、コレステロールエステル、ホスファチジルコリン、およびホスファチジルエタノールアミンからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、脂質クラスは、中性脂質、リン脂質、全脂肪酸、およびコレステロールエステルからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、脂質クラスは、遊離脂肪酸、全脂肪酸、トリグリセリド、コレステロールエステル、ホスファチジルコリン、およびホスファチジルエタノールアミンからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、脂質クラスは、トリグリセリド、遊離脂肪酸、およびワックスエステルからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、脂質クラスは遊離脂肪酸である。いくつかの実施形態では、脂質クラスは全脂肪酸である。いくつかの実施形態では、脂質クラスはトリグリセリドである。いくつかの実施形態では、脂質クラスはコレステリルエステルである。いくつかの実施形態では、脂質クラスはホスファチジルコリンである。いくつかの実施形態では、脂質クラスはホスファチジルエタノールアミンである。いくつかの実施形態では、脂質クラスはリン脂質である。いくつかの実施形態では、脂質クラスは中性脂質である。いくつかの実施形態では、脂質クラスはジグリセリドである。いくつかの実施形態では、脂質クラスはスフィンゴミエリンである。いくつかの実施形態では、脂質クラスはワックスエステルである。接頭辞「ＴＧ」、「ＦＡ」、「ＰＣ」、「ＰＥ」、および「ＣＥ」は、それぞれ、トリグリセリド、遊離脂肪酸、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、およびコレステロールエステルの範囲内に存在する脂肪酸に対応する。したがって、「ＴＧ１４：０」は、トリグリセリドの範囲内に存在する脂肪酸１４：０を表す。

【0041】

ＩＩ．ＤＮＬの評価
ＤＮＬバイオマーカーを用いて被験者においてＤＮＬの評価（または評価支援）を行うことが可能である。健常被験者において（たとえば、ルーチンの体の健康評価の一部として）、無症候被験者において、ＤＮＬ関連疾患を有する疑いがあるかもしくはそのリスクがある被験者において、または組成物もしくは治療的介入に反応する被験者においてＤＮＬを評価することを含めて、任意の被験者において同定されたバイオマーカーを用いてＤＮＬを評価可能であることは理解されよう。被験者がＤＮＬの１つ以上の評価を受けうることもさらに理解されよう。

【0042】

例示的な方法では、被験者においてＤＮＬを評価する工程は、（１）被験者から得られる生物学的サンプルを分析してサンプル中のＤＮＬの１種以上のバイオマーカーのレベルを決定する工程と、（２）サンプル中の１種以上のバイオマーカーのレベルと１種以上のバイオマーカーの参照レベルとを比較して、被験者においてＤＮＬのレベルを評価する工程とを含む。１種以上のバイオマーカーは、１６：１ｎ１０、１８：１ｎ１０、１８：１ｎ１２、スクアレン、１６：０、１６：１ｎ７、１４：０、１４：１ｎ５、１８：２ｎ６、２０：４ｎ６、および２２：６ｎ３、ならびにそれらの組合せからなる群から選択されうる。たとえば、列挙されたバイオマーカーのすべての組合せを含めて、１種のバイオマーカー、２種以上のバイオマーカー、３種以上のバイオマーカー、４種以上のバイオマーカー、５種以上のバイオマーカー、６種以上のバイオマーカーなどのレベルを用いて、ＤＮＬを評価しうる。バイオマーカーの組合せのレベルを決定することにより、本明細書に記載の方法でより大きい感度および特異度を可能にしうる。たとえば、生物学的サンプル中の２種のバイオマーカーのペアワイズ分析またはある特定のバイオマーカー（および非バイオマーカー化合物）のレベルの比により、ＤＮＬの評価でより大きい感度および特異度を可能にしうる。

【0043】

さらに、本開示は、皮膚中でのＤＮＬおよびそれと皮膚機能との関係を評価する（たとえば、皮脂産生、座瘡リスクなどを評価する）方法を提供する。例示的な方法では、被験者においてＤＮＬを評価する工程は、前記被験者からの皮膚または表皮または皮膚細胞のサンプルを分析してサンプル中の１種以上のＤＮＬバイオマーカーのレベルを決定する工程であって、１種以上のバイオマーカーが、１６：１ｎ１０、１８：１ｎ１０、１８：１ｎ１２、スクアレン、１６：０、１６：１ｎ７、１４：０、１４：１ｎ５、１８：２ｎ６、２０：４ｎ６、および２２：６ｎ３、ならびにそれらの組合せからなる群から選択される、工程と、サンプル中の１種以上のバイオマーカーのレベルと１種以上のバイオマーカーのＤＮＬ陽性および／またはＤＮＬ陰性の参照レベルとを比較して、皮膚中での脂質生成を評価する工程とを含む。たとえば、列挙されたバイオマーカーのすべての組合せを含めて、１種のバイオマーカー、２種以上のバイオマーカー、３種以上のバイオマーカー、４種以上のバイオマーカー、５種以上のバイオマーカー、６種以上のバイオマーカーなどのレベルを用いて、ＤＮＬを評価しうる。一実施形態では、１種以上のバイオマーカーは、１６：１ｎ１０、１８：１ｎ１０、１８：１ｎ１２、およびスクアレンからなる群から選択される。他の実施形態では、１６：０、１６：１ｎ７、１４：０、１４：１ｎ５、１８：２ｎ６、２０：４ｎ６、および２２：６ｎ３、ならびにそれらの組合せからなる群から選択される１種以上のバイオマーカーと組み合わせて、１６：１ｎ１０、１８：１ｎ１０、１８：１ｎ１２、およびスクアレンからなる群から選択される１種以上のバイオマーカーが使用される。他の実施形態では、１種以上のバイオマーカーは、１６：０、１６：１ｎ７、および１８：２ｎ６を含む。他の実施形態では、１種以上のバイオマーカーは、１６：０、１６：１ｎ１０、および１８：２ｎ６を含む。他の実施形態では、１種以上のバイオマーカーは、１６：０、１６：１ｎ１０、およびスクアレンを含む。他の実施形態では、１種以上のバイオマーカーは、１６：０、１６：１ｎ７、１８：２ｎ６、１４：０、および１４：１ｎ５を含む。他の実施形態では、１種以上のバイオマーカーは、１６：０、１６：１ｎ７、１８：２ｎ６、１４：０、１４：１ｎ５、２０：４ｎ６、および２２：６ｎ３を含む。バイオマーカーの組合せのレベルを決定することにより、本明細書に記載の方法でより大きい感度および特異度を可能にしうる。たとえば、生物学的サンプル中の２種のバイオマーカーのペアワイズ分析またはある特定のバイオマーカー（および非バイオマーカー化合物）のレベルの比により、ＤＮＬの評価でより大きい感度および特異度を可能にしうる。

【0044】

任意の好適な方法を用いて生物学的サンプルを分析してサンプル中の１種以上のバイオマーカーのレベルを決定しうる。好適な方法としては、クロマトグラフィー（たとえば、ＨＰＬＣ、ガスクロマトグラフィー、キャピラリーガスクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー）、質量分析（たとえば、ＭＳ、ＭＳ−ＭＳ）、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、抗体結合、他の免疫化学的技術、およびそれらの組合せが挙げられる。

【0045】

単純比較（たとえばマニュアル比較）をはじめとする種々の技術を用いて、１種以上のバイオマーカーのレベルとＤＮＬ参照レベルとを比較しうる。また、１つ以上の統計解析（たとえば、ｔ検定、ウェルチのＴ検定、ウィルコクソンの順位和検定、相関分析、ランダムフォレスト、Ｔスコア、Ｚスコア）を用いてまたは数学モデル（たとえば、統計モデル）を用いて、生物学的サンプル中の１種以上のバイオマーカーのレベルと参照レベルとを比較しうる。たとえば、単一のバイオマーカーアナライト測定または複数のバイオマーカーアナライト測定を含む数学モデルを用いて、被験者においてＤＮＬを評価しうる。２種以上のＤＮＬバイオマーカーにより付与される作用を分析する場合、たとえば、各バイオマーカーの作用を定量する種々の数式または数学モデルを用いることにより、これらのバイオマーカーの作用を個別に評価するかまたはこれらのバイオマーカーの正味の作用を得ることが可能である。変数として１種以上のＤＮＬバイオマーカーのレベルを含む式としては、変数として１種以上のバイオマーカーの値を用いて数学または統計学の原理または方法に基づいて確立された任意の数式、モデル、方程式、または表現が挙げられる。

【0046】

本方法の結果は、被験者においてＤＮＬの評価に有用な他の方法（またはその結果）と一緒に使用されうる。たとえば、ｆＤＮＬ、インスリン感受性、および／または急性インスリン反応（ＡＩＲ）の測定、さらには患者情報、たとえば、年齢、ＢＭＩ、性別、人種、または他のリスク因子などは、バイオマーカーと共に使用可能である。

【0047】

一態様では、本明細書に提供されるバイオマーカーを数学または統計学のモデルまたは式（「ＤＮＬ指標」）で用いて、被験者においてＤＮＬのインジケーターとなる数値スコア（「ＤＮＬ指標スコア」）を生成することが可能である。被験者は、ＤＮＬ指標スコアにより低ＤＮＬから正常ＤＮＬ、さらには高ＤＮＬまでの範囲内に割り当てられる。ＤＮＬ指標を生成する方法は、１つ以上の参照コホート（たとえば、健常者、ＤＮＬ関連疾患を有する個体）から生物学的サンプルを得る工程と、サンプル中の１種以上のＤＮＬバイオマーカーのレベルを測定する工程と、１種以上のバイオマーカーの前記測定レベルで構成される測定レベルを数学モデルで使用する工程とを含みうる。たとえば、多変量分散分析、多変量回帰、重回帰などの方法を用いて、ＤＮＬ指標で従属変数と独立変数との関係を決定することが可能である。本方法では、１６：１ｎ１０、１８：１ｎ１０、１８：１ｎ１２、スクアレン、１６：０、１６：１ｎ７、１４：０、１４：１ｎ５、１８：２ｎ６、２０：４ｎ６、および２２：６ｎ３、ならびにそれらの組合せから選択される任意の数のマーカーを利用しうる。回帰分析などの統計的方法を含めて任意の方法により、複数のバイオマーカーとＤＮＬとを相関付けうる。

【0048】

いくつかの実施形態では、１種以上のＤＮＬバイオマーカーを変数として含む式は、回帰分析たとえば線形重回帰を用いて確立される。一実施形態では、バイオマーカーを統計モデルで用いてＤＮＬ指標を生成しうる。たとえば、なんら限定されるものではないが、以下の式をＤＮＬ指標で用いてＤＮＬ指標スコアを生成しうる。
ＤＮＬ指標スコア＝ａ（１６：０）＋ｂ（１６：１ｎ７）−ｃ（１８：２ｎ６）（モル％データを用いるかまたは全量もしくはＴＧに対して規格化する）
ＤＮＬ指標スコア＝（ａ（１６：０）＋ｂ（１６：１ｎ７））／ｃ（１８：２ｎ６）（規格化比）
ＤＮＬ指標スコア＝ａ（ＤＮＬ陽性マーカー）−ｂ（ＤＮＬ陰性マーカー）
ＤＮＬ指標スコア＝ａ（１６：０）＋ｂ（１６：１ｎ１０）−ｃ（１８：２ｎ６）
ＤＮＬ指標スコア＝ａ（１６：０）＋ｂ（１６：１ｎ１０）−ｃ（スクアレン）
ＤＮＬ指標スコア＝ａ（１６：０）＋ｂ（１６：１ｎ７）−ｃ（１８：２ｎ６）
ＤＮＬ指標スコア＝ａ（１６：０）＋ｂ（１６：１ｎ７）−ｃ（１８：２ｎ６）＋ｄ（１４：０）＋ｅ（１４：１ｎ５）
ＤＮＬ指標スコア＝ａ（１６：０）＋ｂ（１６：１ｎ７）−ｃ（１８：２ｎ６）＋ｄ（１４：０）＋ｅ（１４：１ｎ５）−ｆ（２０：４ｎ６）−ｇ（２２：６ｎ３）

【0049】

式中、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、ｇは、各マーカーの標準的ヒトレベルから推定可能なスケーリング係数として機能する係数である。さらに、最適な臨床有用性を提供するように式の結果（ＤＮＬ指標スコア）をスケーリングすることが可能である（たとえば１〜１０）。バイオマーカー代謝物は、定量的または相対的に表すことが可能である（たとえばモル％）。しかしながら、式の係数および形態は、提供されるデータの形態に適合しなければならない。式では、１種以上のＤＮＬバイオマーカー、たとえば、１、２、３、４、５種、またはそれを超えるバイオマーカーを変数として使用しうる。これらの式の定数は、既知のＤＮＬ値からまたはＤＮＬ関連疾患を有するコホートから得られるデータセットを用いて確立可能である。これらの式で使用されるＤＮＬバイオマーカーのレベルは、一定の時点でのレベルまたは一定期間にわたるレベルの変化のいずれかでありうる。

【0050】

他の態様では、たとえば性別および／または人種などの変数をＤＮＬ指標に導入しうる。他の態様では、追加の脂肪酸または脂質の測定結果をＤＮＬ指標に導入しうる。

【0051】

ＤＮＬ指標スコアは、ＤＮＬのレベル（たとえば、正常レベル、低レベル、高レベル）に従って被験者を分類するために使用可能である。ＤＮＬ指標スコアの使用例としては、限定されるものではないが、ＤＮＬの評価、ＤＮＬの分類、ＤＮＬ関連疾患を発症する素因、ＤＮＬ関連疾患の診断、ＤＮＬ関連疾患の進行／退縮のモニタリング、およびＤＮＬ関連疾患の治療の有効性のモニタリングが挙げられる。

【0052】

さらなる態様では、ＤＮＬバイオマーカーまたはＤＮＬ指標は、ＤＮＬ指標およびＤＮＬスコアが臨床診療に組み込まれて有用なメトリックとなる患者管理の医療アルゴリズムに含まれうる。医療アルゴリズムは、１種以上のＤＮＬバイオマーカーアナライトの測定値または計算されたＤＮＬ指標スコアを用いて、診療所または医師を訪れる被験者の追加の検査、評価、および治療の指針を与えうる。単純なアルゴリズム例を図１に示すが、これに限定されるものではない。被験者（１０１）は、症状を有して診療所を訪れうるか、または無症状でありうる（１０２）。被験者は、異常ｄｅ ｎｏｖｏ脂質生成の個人歴または家族歴などのリスク因子を有していることもあれば、リスク因子を有していないこともある（１０２）。被験者がリスク因子を有しておらずかつ無症状である場合、ＤＮＬ指標は決定されず、症状もリスク因子も発生しないかぎり患者は毎年モニターされる（１０３）。被験者が現在症状を有しかつ／またはリスク因子（たとえば個人歴もしくは家族歴）を有する場合、被験者からのサンプルを分析（１０４）して前記被験者のＤＮＬ指標スコア（１０５）を決定する。同様に、被験者が無症状でありかつリスク因子（たとえばその個人歴または家族歴）を有する場合、被験者からのサンプルを分析（１０４）して前記被験者のＤＮＬ指標スコア（１０５）を決定する。ＤＮＬ指標スコア（１０５）がＤＮＬの存在またはＤＮＬ関連疾患の素因の指標となる閾値または参照値を超えない場合、被験者は定期的にモニターされる（１０６）。ＤＮＬ指標スコア（１０５）がＤＮＬの存在またはＤＮＬ関連疾患の素因の指標となる閾値または参照値を超える場合、被験者を追加の検査および評価（１０７）に付して、前記被験者が（たとえば、薬剤および／または生活習慣を変更して）治療を受けるべきか決定する。追加の検査および評価に基づいて治療が必要であると決定された場合（１０８）、治療的介入を指示して（１０９）、治療に対する前記患者の反応をモニターする（１１０）。ＤＮＬバイオマーカー（１０４）を測定してＤＮＬスコア（１０５）を計算することによりＤＮＬ状態を決定するために、前記被験者は定期的に来院する。ＤＮＬスコアと前のＤＮＬスコアとを比較して、治療が有効であるかを決定する。治療介入（１０８）が必要でないと決定された場合、被験者は定期的にモニターされる（１０６）。

【0053】

ＩＩＩ．疾患の進行／退縮のモニタリング
ＤＮＬ指標でＤＮＬバイオマーカーを用いることにより、被験者においてＤＮＬ関連疾患（たとえば、糖尿病および関連病態、肥満、肝臓脂肪症、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、癌、心血管疾患など）の進行／退縮をモニターすることが可能である。被験者において、ＤＮＬ関連疾患、たとえば、糖尿病および関連病態、肥満、肝臓脂肪症、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、癌、心血管疾患、および皮膚障害の進行／退縮をモニターする方法は、（１）被験者からの第１の生物学的サンプルを分析して、第１の時点で被験者から得られる第１のサンプルで、１６：１ｎ１０、１８：１ｎ１０、１８：１ｎ１２、スクアレン、１６：０、１６：１ｎ７、１４：０、１４：１ｎ５、１８：２ｎ６、２０：４ｎ６、および２２：６ｎ３、ならびにそれらの組合せからなる群から選択されるＤＮＬの１種以上のバイオマーカーのレベルを決定する工程と、（２）被験者からの第２の生物学的サンプルを分析して１種以上のバイオマーカーのレベルを決定する工程であって、第２のサンプルが第２の時点で被験者から得られる、工程と、（３）第２のサンプル中の１種以上のバイオマーカーのレベルと、（ａ）第１のサンプル中の１種以上のバイオマーカーのレベルおよび／または（ｂ）ＤＮＬ参照レベルとを比較して、被験者においてＤＮＬ関連疾患の進行／退縮をモニターする工程とを含む。本方法の結果は、被験者においてＤＮＬ関連疾患の経過（すなわち、なんらかの変化がある場合、進行または退縮）の指標となる。

【0054】

第１のサンプルを得た後、１つ以上の追加のサンプルは、より後の時点で被験者から得られうる。一態様では、１つ以上の追加のサンプルは、第１のサンプルの１、２、３、４、５、６日後、またはそれよりも後で得られる。他の態様では、１つ以上のサンプルは、第１のサンプルのまたは組成物による治療開始の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０週間後、またはそれよりも後で得られる。他の態様では、１つ以上の追加のサンプルは、第１のサンプルのまたは組成物による治療開始の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２ヶ月後、またはそれよりも後で得られる。

【0055】

一実施形態では、本方法の結果は、被験者においてＤＮＬのレベルの指標となりかつ経時的にモニター可能なＤＮＬ指標スコアに基づきうる。第１の時点のサンプルのＤＮＬ指標スコアと少なくとも第２の時点のサンプルのＤＮＬ指標スコアとを比較することにより、ＤＮＬ関連疾患の進行または退縮を決定することが可能である。たとえば、被験者において前糖尿病および／または２型糖尿病の進行／退縮をモニターするかかる方法は、（１）被験者からの第１の生物学的サンプルを分析して第１の時点で被験者から得られる第１のサンプルのＤＮＬ指標スコアを決定する工程と、（２）被験者からの第２の生物学的サンプルを分析して第２のＤＮＬ指標スコアを決定する工程であって、第２のサンプルが第２の時点で被験者から得られる、工程と、（３）第１のサンプルのＤＮＬ指標スコアと第２のサンプルのＤＮＬ指標スコアとを比較して、被験者において前糖尿病および／または２型糖尿病の進行／退縮をモニターする工程とを含む。

【0056】

本明細書に記載のバイオマーカーおよびＤＮＬ指標を進行のモニタリングに使用することにより、食事制限、運動、初期薬剤治療などの予防手段を実行する医師の決定に指針を与えたりまたはそれを支援したりしうる。

【0057】

ＩＶ．疾患の素因の決定
本明細書に記載のＤＮＬ指標でのＤＮＬバイオマーカーの使用はまた、ＤＮＬに関連する疾患、たとえば、糖尿病および関連病態、肥満、肝臓脂肪症、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）癌、心血管疾患、および皮膚障害のいずれの症状も示さない被験者がＤＮＬ関連疾患を発症する素因を有するか否かの決定にも利用されうる。ＤＮＬ関連疾患、たとえば、糖尿病および関連病態、肥満、肝臓脂肪症、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、癌、心血管疾患、および皮膚障害の症状を有していない被験者がＤＮＬ関連疾患を発症する素因を有するか否かを決定するかかる方法は、（１）被験者からの生物学的サンプルを分析して、１６：１ｎ１０、１８：１ｎ１０、１８：１ｎ１２、スクアレン、１６：０、１６：１ｎ７、１４：０、１４：１ｎ５、１８：２ｎ６、２０：４ｎ６、および２２：６ｎ３、ならびにそれらの組合せからなる群から選択されるサンプル中の１種以上のバイオマーカーのレベルを決定する工程と、（２）サンプル中の１種以上のバイオマーカーのレベルと１種以上のバイオマーカーのＤＮＬ陽性および／またはＤＮＬ陰性の参照レベルとを比較して、被験者がＤＮＬ関連疾患を発症する素因を有するか否かを決定する工程とを含む。また、バイオマーカーを数学または統計学のモデルまたは式（ＤＮＬ指標）で使用して、ＤＮＬ関連疾患の素因を決定しうる。本方法の結果は、被験者が疾患を発症する素因を有するか否かの臨床決定に有用な他の方法（またはその結果）と一緒に使用されうる。

【0058】

サンプル中の１種以上のバイオマーカーのレベルを決定した後、そのレベルとＤＮＬ陽性および／またはＤＮＬ陰性の参照レベルとを比較して、被験者がＤＮＬ関連疾患、たとえば、糖尿病および関連病態、肥満、肝臓脂肪症、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、癌、心血管疾患、または皮膚障害を発症する素因を有するか否かを予測する。ＤＮＬ陽性参照レベルに対応するサンプル中の１種以上のバイオマーカーのレベル（たとえば、参照レベルと同一のレベル、参照レベルと実質的に同一のレベル、参照レベルの最小および／もしくは最大を上回るおよび／もしくは下回るレベル、ならびに／または参照レベルの範囲内のレベル）は、被験者がＤＮＬ関連疾患を発症する素因を有することの指標となる。ＤＮＬ陰性参照レベルに対応するサンプル中の１種以上のバイオマーカーのレベル（たとえば、参照レベルと同一のレベル、参照レベルと実質的に同一のレベル、参照レベルの最小および／もしくは最大を上回るおよび／もしくは下回るレベル、ならびに／または参照レベルの範囲内のレベル）は、被験者がＤＮＬ関連疾患を発症する素因を有していないことの指標となる。さらに、ＤＮＬ陰性参照レベルと比較して、サンプル中に示差的に存在する（特に統計的に有意なレベルで）１種以上のバイオマーカーのレベルは、被験者がＤＮＬ関連疾患を発症する素因を有することの指標となりうる。ＤＮＬ陽性参照レベルと比較して、サンプル中に示差的に存在する（特に統計的に有意なレベルで）１種以上のバイオマーカーのレベルは、被験者がＤＮＬ関連疾患を発症する素因を有していないことの指標となる。

【0059】

他の実施形態では、バイオマーカーを数学または統計学のモデルまたは式（ＤＮＬ指標）で使用してＤＮＬ関連疾患の素因を決定しうる。本方法は、（１）被験者からの生物学的サンプルを分析して、１６：１ｎ１０、１８：１ｎ１０、１８：１ｎ１２、スクアレン、１６：０、１６：１ｎ７、１４：０、１４：１ｎ５、１８：２ｎ６、２０：４ｎ６、および２２：６ｎ３、ならびにそれらの組合せからなる群から選択されるサンプル中の１種以上のバイオマーカーのレベルを決定する工程と、（２）前記１種以上のバイオマーカーの測定レベルを含む数学モデルを用いてＤＮＬ指標を生成する工程と、（３）前記ＤＮＬ指標からＤＮＬ指標スコアを計算する工程と、（４）サンプルのＤＮＬ指標スコアと１種以上のバイオマーカーのＤＮＬ陽性および／またはＤＮＬ陰性の参照レベルとを比較して、被験者がＤＮＬ関連疾患を発症する素因を有するか否かを決定する工程とを含む。

【0060】

さらに、ＤＮＬ関連疾患、たとえば、糖尿病および関連病態、肥満、肝臓脂肪症、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、癌、心血管疾患、または皮膚障害を有していない被験者がＤＮＬ関連疾患を発症する素因を有するか否かの評価に特有の参照レベルを決定することも可能であろう。たとえば、ＤＮＬ関連疾患の発症に関して被験者において異なるリスク度（たとえば、低リスク、中リスク、高リスク）を評価するためのバイオマーカーの参照レベルを決定することが可能であろう。かかる参照レベルは、被験者からの生物学的サンプル中の１種以上のバイオマーカーのレベルと比較するために使用可能である。

【0061】

Ｖ．治療有効性のモニタリング：
提供されるバイオマーカーはまた、ＤＮＬ関連疾患、たとえば、糖尿病および関連病態、肥満、肝臓脂肪症、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、癌、心血管疾患、または皮膚障害の治療の有効性の評価を可能にする。かかる評価は、たとえば、有効性の研究、生活習慣の変更の影響のモニタリング、さらにはＤＮＬ関連疾患を治療するための組成物のリード選択に使用されうる。たとえば、糖尿病に対してＤＮＬ指標でＤＮＬバイオマーカーを使用することにより、糖尿病の治療の有効性の評価さらには糖尿病の２つ以上の治療の相対有効性の評価を可能にする。治療有効性に関してモニターされる治療は、食事、ライフスタイルの変更、組成物による治療、またはＤＮＬ関連病態の治療に使用される他の治療を含みうる。

【0062】

したがって、（１）ＤＮＬ関連疾患、たとえば、糖尿病および関連病態、肥満、肝臓脂肪症、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、癌、心血管疾患、または皮膚障害を有し、かつ現在または以前、前記疾患の治療を受けている被験者（または被験者群）からの生物学的サンプル（またはサンプル群）を分析して、１６：１ｎ１０、１８：１ｎ１０、１８：１ｎ１２、スクアレン、１６：０、１６：１ｎ７、１４：０、１４：１ｎ５、１８：２ｎ６、２０：４ｎ６、および２２：６ｎ３、ならびにそれらの組合せからなる群から選択される障害の１種以上のバイオマーカーのレベルを決定する工程と、（２）サンプル中の１種以上のバイオマーカーのレベルと、（ａ）被験者から以前採取した生物学的サンプル中の１種以上のバイオマーカーのレベル（ただし、以前採取した生物学的サンプルは、治療開始前に被験者から得たものである）、（ｂ）１種以上のバイオマーカーのＤＮＬ陽性参照レベル、（ｃ）１種以上のバイオマーカーのＤＮＬ陰性参照レベル、（ｄ）１種以上のバイオマーカーのＤＮＬ進行陽性参照レベル、および／または（ｅ）１種以上のバイオマーカーのＤＮＬ退縮陽性参照レベルとを比較する工程とを含む、ＤＮＬ関連疾患、たとえば、糖尿病および関連病態、肥満、肝臓脂肪症、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、癌、心血管疾患、または皮膚障害の治療の有効性を評価する方法もまた提供される。比較の結果は、ＤＮＬ関連疾患の治療の有効性の指標となる。

【0063】

第２のサンプルは、第１のサンプルを得た後の任意の時間で被験者から得られうる。一態様では、第２のサンプルは、第１のサンプルのまたは治療開始の１、２、３、４、５、６日後、またはそれよりも後で得られる。他の態様では、第２のサンプルは、第１のサンプルのまたは治療開始の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０週間後、またはそれよりも後で得られる。他の態様では、第２のサンプルは、第１のサンプルのまたは治療開始の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２ヶ月後、またはそれよりも後で得られる。

【0064】

１種以上のバイオマーカーのレベルの経時変化（もしあれば）は、被験者においてＤＮＬ関連疾患の進行または退縮の指標となりうる。被験者において所与のＤＮＬ関連疾患の経過を特徴付けるために、第１のサンプル中の１種以上のバイオマーカーのレベル、第２のサンプル中の１種以上のバイオマーカーのレベル、ならびに／または第１および第２のサンプル中のバイオマーカーのレベルの比較の結果と、１種以上のバイオマーカーのＤＮＬ陽性および／またはＤＮＬ陰性の参照レベルとを比較しうる。１種以上のバイオマーカーのレベルが経時的に（たとえば、第１のサンプルと第２のサンプルとを比較して）増加または減少してＤＮＬ陽性参照レベルに類似してくる（またはＤＮＬ陰性参照レベルに類似しなくなる）ことが比較から示唆されるのであれば、その結果はＤＮＬ関連疾患の進行の指標となる。１種以上のバイオマーカーのレベルが経時的に増加または減少してＤＮＬ陰性参照レベルに類似してくる（またはＤＮＬ陽性参照レベルに類似しなくなる）ことが比較から示唆されるのであれば、その結果はＤＮＬ関連疾患の退縮の指標となる。

【0065】

他の実施形態では、バイオマーカーを数学または統計学のモデルまたは式（ＤＮＬ指標）で使用してＤＮＬ関連疾患の治療の有効性を決定することができ、本方法は、（１）ＤＮＬ関連疾患、たとえば、糖尿病および関連病態、肥満、肝臓脂肪症、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、癌、心血管疾患、または皮膚障害を有し、かつ現在または以前、前記疾患の治療を受けている被験者（または被験者群）からの生物学的サンプル（またはサンプル群）を分析して、１６：１ｎ１０、１８：１ｎ１０、１８：１ｎ１２、スクアレン、１６：０、１６：１ｎ７、１４：０、１４：１ｎ５、１８：２ｎ６、２０：４ｎ６、および２２：６ｎ３、ならびにそれらの組合せからなる群から選択される障害の１種以上のバイオマーカーのレベルを決定する工程と、（２）前記１種以上のバイオマーカーの測定レベルを含む数学モデルを用いてＤＮＬ指標を生成する工程と、（３）前記ＤＮＬ指標からＤＮＬ指標スコアを計算する工程と、（４）サンプル中の１種以上のバイオマーカーのレベルと、（ａ）被験者から以前採取した生物学的サンプル中の１種以上のバイオマーカーのレベル（ただし、以前採取した生物学的サンプルは、治療開始前に被験者から得たものである）、（ｂ）１種以上のバイオマーカーのＤＮＬ陽性参照レベル、（ｃ）１種以上のバイオマーカーのＤＮＬ陰性参照レベル、（ｄ）１種以上のバイオマーカーのＤＮＬ進行陽性参照レベル、および／または（ｅ）１種以上のバイオマーカーのＤＮＬ退縮陽性参照レベルとを比較する工程とを含む。比較の結果は、ＤＮＬ関連疾患の治療の有効性の指標となる。

【0066】

本明細書に記載の他の方法と同様に、被験者においてＤＮＬ関連疾患、たとえば、糖尿病および関連病態、肥満、肝臓脂肪症、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、癌、心血管疾患、または皮膚障害の治療の治療有効性をモニターする方法で行われる比較は、単純比較、１つ以上の統計解析、およびそれらの組合せを含めて種々の技術を用いて行われうる。

【0067】

本方法の結果は、本明細書に記載の他の方法（もしくはその結果）および／または被験者において疾患もしくは病態の進行／退縮の臨床モニタリングに有用な他の方法と一緒に使用されうる。

【0068】

以上に記載したように、疾患または病態、たとえば、糖尿病および関連病態、肥満、肝臓脂肪症、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、癌、心血管疾患、または皮膚障害の診断（または診断支援）を行う方法に関連して、任意の好適な方法を用いて生物学的サンプルを分析してサンプル中の１種以上のバイオマーカーのレベルを決定しうる。さらに、１６：１ｎ１０、１８：１ｎ１０、１８：１ｎ１２、スクアレン、１６：０、１６：１ｎ７、１４：０、１４：１ｎ５、１８：２ｎ６、２０：４ｎ６、および２２：６ｎ３、またはそれらの任意の部分からなる群から選択されるすべてのバイオマーカーの組合せを含めて、１種以上のバイオマーカーのレベルを決定して、被験者においてＤＮＬ関連疾患の進行／退縮をモニターする方法に使用しうる。

【0069】

かかる方法を行って、被験者において疾患もしくは病態の発症の経過、たとえば、前糖尿病を有する被験者において前糖尿病から２型糖尿病への経過をモニターすることが可能であるか、またはかかる方法を用いて、疾患または病態を有していない被験者（たとえば、疾患もしくは病態を発症する素因を有することが疑われる被験者）において疾患もしくは病態の素因のレベルをモニターすることが可能である。

【0070】

提供されるバイオマーカーはまた、ＤＮＬ関連疾患、たとえば、糖尿病および関連病態、肥満、肝臓脂肪症、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、癌、心血管疾患、または皮膚障害の治療が有効な被験者（すなわち、患者は治療に反応する）の同定を可能にする。かかる評価は、たとえば、ある特定の被験者の疾患または病態を治療するための組成物の選択に使用されうる。

【0071】

ＶＩ．バイオマーカーを他の疾患または病態に使用する方法
他の態様では、本明細書に開示されるＤＮＬバイオマーカーの少なくとも一部は、ＤＮＬに関連することが現在知られていない他の疾患または病態のバイオマーカーにもなりうる。すなわち、ＤＮＬに関する本明細書に記載の方法は、ＤＮＬに関連する疑いのある疾患または病態の診断（または診断支援）、かかる疾患または病態の進行／退縮をモニターする方法、かかる疾患または病態の素因を決定する方法、およびかかる疾患または病態を治療するための組成物の有効性を評価する方法にも使用されうる。かかる方法は、本明細書に記載されるようにインスリン抵抗性に関して実施可能である。

【実施例】

【0072】

Ｉ．一般的方法
簡潔に述べると、クロロホルム：メタノール（２：１ｖ／ｖ）を用いてＦｏｌｃｈらの方法［Ｆｏｌｃｈ，Ｊ．，Ｍ．Ｌｅｅｓ，ａｎｄ Ｇ．Ｈ．Ｓｌｏａｎｅ−Ｓｔａｎｌｅｙ．１９５７．Ａ ｓｉｍｐｌｅ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｏｔａｌ ｌｉｐｉｄｓ ｆｒｏｍ ａｎｉｍａｌ ｔｉｓｓｕｅｓ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２２６：４９７−５０９．］により基準内部標準の存在下で血漿サンプルまたは皮脂サンプルから脂質を抽出した。記載されるようにｓｅｂｕｔａｐｅを用いて皮脂サンプルを採取した［Ｐｉｅｒａｒｄ，Ｇ．Ｅ．，Ｐｉｅｒａｒｄ−Ｆｒａｎｃｈｉｍｏｎｔ，Ｃ．＆Ｋｌｉｇｍａｎ，Ａ．Ｍ．Ｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ ｓｅｂｕｍ ｅｘｃｒｅｔｉｏｎ ｅｖａｌｕａｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅ Ｓｅｂｕｔａｐｅ−Ｃｈｒｏｍａｍｅｔｅｒ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ．Ｓｋｉｎ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ：ｔｈｅ ｏｆｆｉｃｉａｌ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｋｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ Ｓｏｃｉｅｔｙ ６，３８−４４（１９９３）］。１００℃、窒素雰囲気下、密閉バイアル内、メタノール中１％硫酸で全脂質抽出物を４５分間エステル交換した。得られた抽出物を６％炭酸カリウムで中和し、脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）をヘキサンで抽出し、ガスクロマトグラフィーに供すべく調製した。脂肪酸メチルエステルを分離し、３０ｍ ＤＢ−８８ＭＳキャピラリーカラム（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）およびフレームイオン化検出器を備えたキャピラリーガスクロマトグラフィー（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓモデル６８９０）により定量した。各脂肪酸とその内部標準対照とを比較することにより定量結果を得た。ここに提示されたアッセイはすべて、内部精度管理プロトコルに合格したものである。

【0073】

これらの実施例では、モルパーセントデータ（モル％）をすべての解析に使用した。モル％データは、各脂肪酸が全プールに対するパーセントとして表された単純な脂肪酸組成データである。定量脂肪酸濃度をモル％濃度に変換することにより、全血漿中脂質レベルの変化（たとえば、トリアシルグリセリドの増加または減少）の影響を規格化により除去した。他の選択肢として、これらの脂肪酸を無傷の複合脂質（たとえば、ＰＣ１６：０｜１６：１ｎ７などのトリアシルグリセリド種またはリン脂質種）の成分として測定しうる。

【0074】

実施例１：ｄｅ ｎｏｖｏ脂質生成（ＤＮＬ）指標
いくつかの脂肪酸は、一部は順方向に（すなわち、それらはｄｅ ｎｏｖｏ合成される）、一部は逆方向に（すなわち、それらはｄｅ ｎｏｖｏ脂質生成により希釈されるかまたはそのプロセスの阻害剤である）、ｄｅ ｎｏｖｏ脂質生成の影響を受ける。たとえば、脂肪酸のパルミテートおよびパルミトレエート（１６：０および１６：１ｎ７）は、ヒトＤＮＬの産物である（Ａａｒｓｌａｎｄ Ａ，Ｗｏｌｆｅ ＲＲ．Ｈｅｐａｔｉｃ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｏｆ ＶＬＤＬ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄｓ ｄｕｒｉｎｇ ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ ｌｉｐｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ ｍｅｎ．Ｊ Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．１９９８；３９：１２８０−１２８６．；Ｗｕ ＪＨ，Ｌｅｍａｉｔｒｅ ＲＮ，Ｉｍａｍｕｒａ Ｆ，Ｋｉｎｇ ＩＢ，Ｓｏｎｇ Ｘ，Ｓｐｉｅｇｅｌｍａｎ Ｄ，Ｓｉｓｃｏｖｉｃｋ ＤＳ，Ｍｏｚａｆｆａｒｉａｎ Ｄ．Ｆａｔｔｙ ａｃｉｄｓ ｉｎ ｔｈｅ ｄｅ ｎｏｖｏ ｌｉｐｏｇｅｎｅｓｉｓ ｐａｔｈｗａｙ ａｎｄ ｒｉｓｋ ｏｆ ｃｏｒｏｎａｒｙ ｈｅａｒｔ ｄｉｓｅａｓｅ：ｔｈｅ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｔｕｄｙ．Ａｍ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｎｕｔｒ．２０１１；９４：４３１−４３８．）。ミリステートおよびミリストレエートは、１６：０および１６：１ｎ７の１４個の炭素のアナログであり、かなり低い存在量であるがｄｅ ｎｏｖｏ脂質生成を介して産生される。しかしながら、リノール酸（１８：２ｎ６）は排他的に食事に由来する（それは食品供給物の中で最も豊富な多価不飽和脂肪酸である）。１８：２ｎ６は、このセットの他のメンバーと強い相関があるが負の相関があることから、このクラスターは、血流中でＤＮＬ由来の脂肪酸と食事由来の脂肪酸とのバランスを呈することが示唆される。これまでの研究では、ＤＮＬ起源（Ａａｒｓｌａｎｄ Ａ，Ｗｏｌｆｅ ＲＲ．Ｈｅｐａｔｉｃ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｏｆ ＶＬＤＬ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄｓ ｄｕｒｉｎｇ ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ ｌｉｐｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ ｍｅｎ．Ｊ Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．１９９８；３９：１２８０−１２８６．）の脂質のうち１８：２ｎ６は低レベルであることが示されている。

【0075】

ＤＮＬに関連する脂肪酸は、（Ａ）陽性マーカー：１６：０、１６：１ｎ７、１４：０、１４：１ｎ５と、（Ｂ）陰性マーカー：１８：２ｎ６、２０：４ｎ６、２２：６ｎ３とを含む。

【0076】

ＤＮＬの最も一貫性のあるバイオマーカーは、１６：０、１６：１ｎ７、および１８：２ｎ６である。これらのマーカーを例示的なバイオマーカーとして選択し、サンプル中のレベルを測定し、前記測定レベルを指標で使用してＤＮＬを測定した。バイオマーカーは、特定の脂質クラス（たとえば、トリアシルグリセリド（ＴＧ）、リン脂質（ＰＬ）、コレステリルエステル（ＣＥ））の範囲内でまたは全脂肪酸分析（すべて脂質クラスが分析に含まれる）の一部として測定されうる。脂肪酸は、組織中または流体中で測定可能であり、血清または血漿から測定される場合、ＤＮＬの特に有用なバイオマーカーである。この実施例では、これらのバイオマーカーの測定値を統計モデルで用いてＤＮＬ指標を生成する。このＤＮＬ指標は、患者のＤＮＬ状態について臨床医に通知したり、治療的介入に対する反応をモニターしたり、糖尿病および関連病態、肥満、肝臓脂肪症、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、癌、心血管疾患（高トリグリセリド血症）、皮膚障害などの疾患の素因を評価したりするのに有用である。

【0077】

例示的なＤＮＬ指標、すなわち、ＤＮＬ＝ａ（１６：０）＋ｂ（１６：１ｎ７）−ｃ（１８：２ｎ６）を生成した。式中、データ（すなわち、例示的なバイオマーカー１６：０、１６：１ｎ７、１８：２ｎ６の測定レベルの値）は、モル％にスケーリングされた。スケーリングおよび係数は、式中の各成分が等重量に近くなるように式の最終形態で変更される。たとえば、バイオマーカー１６：０が脂肪酸の３０％で存在し、かつバイオマーカー１６：１ｎ７が脂肪酸の１％で存在する場合、１６：１ｎ７の係数は、式の各脂肪酸成分の寄与を等しくするために約３０にすべきである。

【0078】

標準的な脂肪酸分析プラットフォーム（ＧＣ−ＦＩＤまたはＧＣ−ＭＳ）を用いて、バイオマーカーを測定した。プラットフォームは、１回のランでＤＮＬ指標の各成分のデータを生成する。他の選択肢として、ＬＣ−ＭＳプラットフォームを用いてＤＮＬを最もよく反映する脂質種を同定することが可能であり、かつバイオマーカー特異的／最適化ＬＣ−ＭＳアッセイを開発することが可能である。

【0079】

式をスケーリングするための値の初期推定値を導出した。ヒト血清中の各主要ＤＮＬ脂肪酸バイオマーカーの平均濃度（モル％で表される）（平均±ＳＤ）は、以下のとおりである。
１６：０： ２１．６±２．４
１６：１ｎ７： ２．１±１．１
１８：２ｎ６ ３１．９±４．６

【0080】

スケーリング係数は、各脂肪酸成分をその平均濃度で除算する（またはその濃度の逆数を乗算する）程度の単純なものでありうる。したがって、ＤＮＬ指標の例（測定して以上で報告した平均バイオマーカー濃度に基づく）は、ＤＮＬ指標スコア＝０．０４６３（モル％１６：０）＋０．４７６（モル％１６：１ｎ７）−０．０３１３（モル％１８：２ｎ６）である。たとえば、任意のサンプルタイプ中の１６：１ｎ１０、１８：１ｎ１０、１８：１ｎ１２、スクアレン、１６：０、１６：１ｎ７、１４：０、１４：１ｎ５、１８：２ｎ６、２０：４ｎ６、および２２：６ｎ３を含めて任意の脂肪酸に対して、スケーリング係数を計算しうる。

【0081】

この実施例に記載の方法を用いてかつＤＮＬ脂肪酸バイオマーカーの任意の組合せを用いて、任意のサンプルタイプのＤＮＬ指標を生成しうる。

【0082】

実施例２〜３では、以下のＤＮＬ指標を使用した。
ＤＮＬ指標スコア＝０．０４６３（モル％１６：０）＋０．４７６（モル％１６：１ｎ７）−０．０３１３（モル％１８：２ｎ６）。

【0083】

実施例２：ＤＮＬ指標スコアに及ぼすｄｅ ｎｏｖｏ脂質生成阻害の影響
アセチル：ｃｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣ）の化学阻害剤で処理された細胞を用いて２つの実験を行った。ＡＣＣは、ｄｅ ｎｏｖｏ脂質生成に必要とされる基質であるマロニルＣｏＡを産生する反応を触媒する酵素である。ＡＣＣの阻害により、マロニルＣｏＡは産生されなくなるため、結果的にｄｅ ｎｏｖｏ脂質生成は阻害される。

【0084】

第１の実験では、培養下の細胞を阻害剤または媒体単独で２４時間または４８時間処理した。処理後、細胞を採取してバイオマーカーを測定した。バイオマーカーのレベルをＤＮＬ指標で使用してＤＮＬ指標スコアを生成した。ＤＮＬ指標スコアは、阻害剤で処理された細胞では媒体単独の対照細胞よりも有意に低かったことから、ｄｅ ｎｏｖｏ脂質生成は、ＡＣＣ阻害剤で処理された細胞では減少したことが示唆される。２つの脂質画分、すなわちＰＬ画分およびＴＧ画分を用いてＤＮＬ指標スコアを計算したところ、類似の結果が得られた。データは、図２（ＰＬ画分）および図３（ＴＧ画分）にグラフで示される。

【0085】

第２の実験では、培養下の脂腺細胞を３つの用量（低、中、高）の１つのＡＣＣ阻害剤または媒体単独の対照で処理した。処理後、細胞を採取してバイオマーカーを測定した。バイオマーカーレベルをＤＮＬ指標で使用してＤＮＬ指標スコアを生成した。阻害剤で処理された細胞は、媒体単独の細胞で得られたＤＮＬ指標スコアと比較してＤＮＬ指標スコアの用量依存的かつ有意な減少を示した。データは、図４にグラフで示される。

【0086】

実施例３：肝臓障害を有する被験者へのＤＮＬ指標の適用
非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）は、肝臓中への脂肪（一部はＤＮＬ脂肪であると考えられる）の蓄積から開始されて炎症および線維症に進行する疾患である。疾患の病期分類が生検により確認された合計６０名の被験者（１９名のＮＡＳＨ被験者、２名のＮＡＦＬＤ被験者、および３９名の正常被験者）から血漿を採取した。バイオマーカー１６：０、１６：１ｎ７、および１８：２ｎ６を測定し、測定結果をＤＮＬ指標で使用して各被験者のＤＮＬ指標スコアを生成した。正常対照と対比してＮＡＳＨ患者およびＮＡＦＬＤ患者でＤＮＬ指標スコアの明らかな上昇が存在した。結果は図５にグラフで示される。

【0087】

実施例４：インスリン抵抗性および糖尿病性の被験者におけるＤＮＬ指標の開発および適用
他の実施例では、ＤＮＬ指標モデルを作成して７４９名の被験者（そのうち１０２名は５年以内に糖尿病に進行した）で構成されたコホートに適用した。コホートは、５５％の女性、４５％の男性、４２％の白人、３４％の非白人系ヒスパニック人、２４％のアフリカ系アメリカ人で構成され、平均年齢は５５歳であった。最小モデル分析を用いて頻回サンプリング静脈内グルコース耐性試験（ＦＳＩＧＴＴ）によりベースライン時にすべての参加者からインスリン感受性（ＳＩ）および急性インスリン反応（ＡＩＲ）の測定値を得た。糖尿病を発症した１０２名の参加者のうち、より高いＢＭＩの被験者は高齢者であり、空腹時血中グルコース、ＳＩ、およびＡＩＲのベースライン値は、糖尿病を発症しなかった個体とは有意に異なっていた。

【0088】

ベースライン時に７４９名の被験者から採取された血清で実施例１に記載されるように脂肪酸を定量した。脂肪酸濃度は人種／民族間で異なっていた。データは表１に示される。例示されたＤＮＬ指標中で変数として使用される脂肪酸バイオマーカーは、太字フォントに示される。

【0089】

【表1】

【0090】

分析前に代謝物のモル％値を平均値０および分散１に規格化した。ＳｉおよびＡＩＲもまた、ＡＩＲ＝ｓｉｇｎ（ＡＩＲ）＊ｓｑｒｔ（ａｂｓ（ＡＩＲ））およびＳｉ＝ｌｏｇｅ（Ｓｉ＋１）として変換した。ＤＮＬ指標は、ＤＮＬ＝０．０４６４（１６：０）＋０．４８９（１６：１ｎ７）−０．０３３５（１８：２ｎ６）として計算した。

【0091】

パルミチン酸（１６：０）およびパルミトレイン酸（１６：１ｎ７）は、インスリン感受性と強い逆相関があり（−０．３９および−０．２５のβ_０標準化係数、ｐ＜０．００１）、新規発症糖尿病の有意な陽性予測因子であった（ＲＲ１．６４および１．７７、ｐ＜０．０００１）。リノール酸（１８：２ｎ６）は、インスリン感受性と強い正の相関があり（０．３８のβ_０標準化係数、ｐ＜０．００１）、糖尿病の有意な逆予測因子であった（ＲＲ０．６１、ｐ＜０．００１）。データは表２に示される。例示されたＤＮＬ指標中で変数として使用される脂肪酸バイオマーカーは、太字フォントに示される。

【0092】

【表2】

【0093】

ＤＮＬバイオマーカーをＤＮＬ指標で使用した。ＤＮＬ指標の相関をロジスティック回帰により評価した。２つのモデルを評価した。すなわち、一方は、未調整ＤＮＬ指標（ＤＮＬ指標スコア＝０．０４６４（１６：０）＋０．４８９（１６：１ｎ７）−０．０３３５（１８：２ｎ６））、他方はＳｉおよびＡＩＲで調整されたＤＮＬ指標である。未調整ＤＮＬ指標は、新規発症糖尿病の有意な予測因子であった（表３、ＯＲ：１．５９８２、ｐ値：＜０．００１）。ＤＮＬ指標は、ＳｉおよびＡＩＲで調整した後も依然として有意であり、１．３９８７（ｐ値：０．００５４）のオッズ比を有していた。ＤＮＬ指標は、インスリン感受性（Ｓｉ）およびβ細胞機能（ＡＩＲ）に依存しない新規発症糖尿病の予測因子であることがデータから示唆される。

【0094】

【表3】

【0095】

糖尿病予測モデルで曲線下面積（ＡＵＣ）を評価した。受診者動作特性曲線（ＲＯＣ）のグラフ図は図６に示される。ＡＩＲおよびＳｉのみを含むモデル１のＡＵＣは０．８１６であった。ＳｉおよびＡＩＲで調整されたＤＮＬ指標であるモデル２のＡＵＣは０．８３７であった。したがって、モデル１とモデル２との間のＲＯＣの有意な増加により示されるように、数学モデルにＤＮＬ指標を組み込むことにより糖尿病（インスリン抵抗性、β細胞機能および肥満）の周知の病原基準よりも優れた糖尿病のリスクのさらなる識別が提供された。

【0096】

したがって、ｄｅ ｎｏｖｏ脂質生成のマーカー（１８：２ｎ６、１４：０、１６：０、１４：１ｎ５、および１６：１ｎ７）は、インスリン抵抗性およびβ細胞反応障害のよく知られた経路に依存せずに新規発症糖尿病と相関があった。脂肪酸バイオマーカーは、ＳＩの横断的相関因子および糖尿病の予測因子であった。前記バイオマーカーで構成されたＤＮＬ指標を前記被験者に適用した結果、ＤＮＬ指標は、ａ）インスリン抵抗性と相関があり、かつｂ）インスリン感受性およびβ細胞機能に依存せずに将来の糖尿病の予測因子となることが示された。ＤＮＬ指標は、糖尿病を発症するリスクを評価したり、その変化をモニターしたりするために測定されるべき、糖尿病プロセスの新しい生理学的属性となる。

【0097】

実施例５．皮脂ＤＮＬ指標の開発および適用
他の実施例では、皮脂ＤＮＬ指標モデルを用いて、皮膚中の皮脂の産生／分泌を阻害する脂質生成阻害剤の影響を評価した。コホートは、皮脂分泌の低減治療として脂質生成の阻害剤の臨床試験に登録された２０名の被験者で構成された。１０名の被験者はプラセボを摂取し、１０名の被験者は治療剤を摂取した。ベースライン時に採取されたサンプルおよび治療後に採取されたサンプルで皮脂ＤＮＬ指標スコアを計算した。以下の２つの皮脂ＤＮＬ指標モデルを作成して評価した。
皮脂ＤＮＬ指標１（ＳＤＩ１）：ＤＮＬスコア＝０．０３９８（１６：０）＋０．０４５５（１６：１ｎ１０）−１．３９８（１８：２ｎ６）
皮脂ＤＮＬ指標２（ＳＤＩ２）：ＤＮＬスコア＝０．０３９８（１６：０）＋０．０４５５（１６：１ｎ１０）−０．０１１３（スクアレン）。

【0098】

ベースライン時および治療後、Ｓｅｂｕｔａｐｅを用いて参加者からサンプルを採取した。このＳｅｂｕｔａｐｅは、参加者の前頭部に３０分間適用してから除去され、一般的方法に記載のものと同一の方法で処理された。次いで、皮脂ＤＮＬ指標モデルのそれぞれに示されるバイオマーカー変数に対して得られた測定値を用いて、ＤＮＬ指標スコアを計算した。例示的な皮脂ＤＮＬ指標モデルの両方を用いて、各群でベースラインの時点と治療後の時点とを比較する対応のあるスチューデントのｔ検定に基づいて、治療群ではＤＮＬスコアの有意な減少（ｐ＜０．０１）が観測されたが、プラセボ群ではＤＮＬ指標スコアの変化が観測されなかった（ＳＤＩ１ではｐ＝０．６６、ＳＤＩ２ではｐ＝０．９３）。皮脂ＤＮＬ指標１では、治療によりスコアの有意な減少が測定されたが（ｐ＜０．０１）、ＳＤＩ１スコアに及ぼすプラセボの影響はなかった（ｐ＝０．６６）。結果のグラフ図は図７に示されている。同様に、治療に反応して皮脂ＤＮＬ指標２から得られたスコアの有意な減少が測定されたが（ｐ＜０．０１）、プラセボ治療ではＳＤＩ２スコアは変化しなかった（ｐ＝０．９３）。データのグラフ図は図７に示される。ＳＤＩ１およびＳＤＩ２で得られたこれらの結果は、プラセボと比較された治療の効果と一致する。

【0099】

実施例６．正常ヒト集団でのＤＮＬ指標の性能
全血漿中脂質組成に対するｄｅ ｎｏｖｏ脂質生成の寄与率（ｆＤＮＬ）が分かっている１１名の患者からのヒト血漿サンプルを分析に使用した。［Ｍ．Ｋ．Ｈｅｌｌｅｒｓｔｅｉｎ，Ｄｅ ｎｏｖｏ ｌｉｐｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ ｈｕｍａｎｓ：ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ａｎｄ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ａｓｐｅｃｔｓ．Ｅｕｒｏｐｅａｎ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ ５３ Ｓｕｐｐｌ １，Ｓ５３−６５（１９９９）］に記載されるようにｆＤＮＬを決定した。ｆＤＮＬ評価を行うと同時に脂肪酸分析用の血漿サンプルを得た。各サンプルで脂肪酸分析を行って、１６：０、１６：１ｎ７、１８：２ｎ６、１４：０、１４：１ｎ５、１８：１ｎ９、２０：４ｎ６、および２２：６ｎ３の濃度を決定した。

【0100】

本明細書に記載の方法を用いて、脂肪酸組成データから以下の３通りのＤＮＬ指標を計算した。
ＤＮＬ指標１スコア＝ａ（１６：０）＋ｂ（１６：１ｎ７）−ｃ（１８：２ｎ６）
ＤＮＬ指標２スコア＝ａ（１６：０）＋ｂ（１６：１ｎ７）−ｃ（１８：２ｎ６）＋ｄ（１４：０）＋ｅ（１４：１ｎ５）
ＤＮＬ指標３スコア＝ａ（１６：０）＋ｂ（１６：１ｎ７）−ｃ（１８：２ｎ６）＋ｄ（１４：０）＋ｅ（１４：１ｎ５）−ｆ（２０：４ｎ６）−ｇ（２２：６ｎ３）

【0101】

ＤＮＬ指標で使用される係数は、研究コホートからのサンプル全体にわたる各脂肪酸の平均モル％濃度の逆数に等しかった。すなわち、ａ＝０．０４３８７００６８、ｂ＝０．５７６７０６４５５、ｃ＝０．０３００６７７６６、ｄ＝０．８８７５２８９２１、ｅ＝１６．６４６９１４８１、ｆ＝０．１７８１８３３４５、ｇ＝０．６７０４９９８５５であった。

【0102】

１１名の各患者のＤＮＬ指標スコアを３つの例示的なＤＮＬ指標で計算した。表４には、各患者に対する３つのＤＮＬ指標スコア、ならびに１６：０、１６：１ｎ７、１８：２ｎ６、１４：０、１４：１ｎ５、２０：４ｎ６、および２２：６ｎ３の脂肪酸濃度が示されている。

【0103】

【表4】

【0104】

３つの各ＤＮＬ指標およびｆＤＮＬを用いて相関分析を行った。３つのＤＮＬ指標はすべて、ｆＤＮＬと有意に正の相関があった。ＤＮＬ指標１は、ｆＤＮＬとの相関係数が０．６２（ｐ＝０．０４）であった。ＤＮＬ指標２は、ｆＤＮＬとの相関係数が０．７７（ｐ＝０．０１）であった。ＤＮＬ指標３は、ｆＤＮＬとの相関係数が０．６２（ｐ＝０．０４）であった。図８は、ＤＮＬ指標１、ＤＮＬ指標２、およびＤＮＬ指標３の相関プロットのグラフ図を示している。

【0105】

実施例７．ＮＡＳＨの疑いのある患者集団でのＤＮＬ指標の性能
他の実施例では、３つのＤＮＬ指標モデルを評価して各指標とＮＡＳＨ対非ＮＡＳＨ（二元分類）の診断および脂肪症の病期との相関を決定した。ＮＡＳＨを有する疑いのある２１３名の被験者の肝生検および組織診断によりＮＡＳＨの診断および脂肪症のグレードを決定した。生検が行われたのと同一の日に絶食時血清サンプルを被験者から採取した。血清サンプルの脂肪酸組成プロファイリングを行って、３つの各ＤＮＬ指標例およびＤＮＬ指標を構成する各脂肪酸と、ＮＡＳＨの存在（存在または不在の二分アウトカム）および脂肪症グレード（０、１、２、３）との相関を決定した。

【0106】

以下の３つのＤＮＬ指標を用いる。
ＤＮＬ指標１スコア＝ａ（１６：０）＋ｂ（１６：１ｎ７）−ｃ（１８：２ｎ６）
ＤＮＬ指標２スコア＝ａ（１６：０）＋ｂ（１６：１ｎ７）−ｃ（１８：２ｎ６）＋ｄ（１４：０）＋ｅ（１４：１ｎ５）
ＤＮＬ指標３スコア＝ａ（１６：０）＋ｂ（１６：１ｎ７）−ｃ（１８：２ｎ６）＋ｄ（１４：０）＋ｅ（１４：１ｎ５）−ｆ（２０：４ｎ６）−ｇ（２２：６ｎ３）

【0107】

ＤＮＬ指標で使用される係数は、研究コホートからのサンプル全体にわたる各脂肪酸の平均モル％濃度の逆数に等しかった。すなわち、ａ＝０．０４３８７００６８、ｂ＝０．５７６７０６４５５、ｃ＝０．０３００６７７６６、ｄ＝０．８８７５２８９２１、ｅ＝１６．６４６９１４８１、ｆ＝０．１７８１８３３４５、ｇ＝０．６７０４９９８５５であった。

【0108】

実施例６に記載されるように、２１３名の各患者のＤＮＬ指標スコアを計算した。ロジスティック回帰分析を用いて、３つの各ＤＮＬ指標およびＤＮＬ指標の個別の脂肪酸成分とＮＡＳＨ診断とを関連付けた。データは表５に示される。結果は、図９にグラフで示される。このグラフは、ＤＮＬ指標１、２、および３のスコアのそれぞれについてＮＡＳＨおよび非ＮＡＳＨに値の分布のボックスプロットを示している。ＤＮＬ指標１、２、および３のスコアはすべて、ＮＡＳＨ診断と有意に相関があり、それぞれ、０．０２７、０．００２、および０．００４のｐ値を有する。

【0109】

【表5】

【0110】

肝生検および組織学的分析に基づいて患者を脂肪症グレード（グレード０＆１、グレード２、およびグレード３）により分類した。ＡＮＯＶＡ分析を用いて、３つの各ＤＮＬ指標およびＤＮＬ指標の個別の脂肪酸成分と脂肪症グレードとを関連付けた。データは表６に示される。結果は図１０にグラフで示される。このグラフは、ＤＮＬ指標１、２、および３のスコアのそれぞれについて脂肪症グレード０＆１、グレード２、およびグレード３の値の分布のボックスプロットを示している。ＤＮＬ指標１、２、および３のスコアはすべて、脂肪症グレードと有意に相関があり、すべての指標で０．００１未満のｐ値を有する。

【0111】

【表6】

【0112】

本発明についてその特定の実施形態を参照しながら詳細に説明してきたが、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく種々の変更形態および修正形態をなしうることは、当業者には明らかであろう。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】