特許 6557306 サイズ排除クロマトグラフィーを行うための装置および方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6557306

(24)【登録日】2019年7月19日

(45)【発行日】2019年8月7日

(54)【発明の名称】サイズ排除クロマトグラフィーを行うための装置および方法

(51)【国際特許分類】

   B01J 20/281 20060101AFI20190729BHJP

   B01J 20/285 20060101ALI20190729BHJP

   G01N 30/88 20060101ALI20190729BHJP

   G01N 30/74 20060101ALI20190729BHJP

【ＦＩ】

   B01J20/281 X

   B01J20/281 G

   B01J20/281 Y

   B01J20/285

   G01N30/88 J

   G01N30/88 P

   G01N30/74 Z

【請求項の数】14

【全頁数】46

(21)【出願番号】特願2017-185787(P2017-185787)

(22)【出願日】2017年9月27日

(62)【分割の表示】特願2012-544765(P2012-544765)の分割

【原出願日】2010年12月15日

(65)【公開番号】特開2018-21929(P2018-21929A)

(43)【公開日】2018年2月8日

【審査請求日】2017年10月26日

(31)【優先権主張番号】61/286,582

(32)【優先日】2009年12月15日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】61/355,970

(32)【優先日】2010年6月17日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】509131764

【氏名又は名称】ウオーターズ・テクノロジーズ・コーポレイシヨン

(74)【代理人】

【識別番号】110001173

【氏名又は名称】特許業務法人川口國際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】エドアール・エス・ピー・ブービエ

(72)【発明者】

【氏名】ケビン・デイー・ウインダム

(72)【発明者】

【氏名】トーマス・エイチ・ウオルター

(72)【発明者】

【氏名】ウーベ・デー・ノイエ

【審査官】 磯田 真美

(56)【参考文献】

【文献】 特表２００８−５０１５０９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２００９／１２６２０７（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 米国特許第０６３７５８４６（ＵＳ，Ｂ１）

【文献】 特表２００９−５４０２７６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００８−５０３７１６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００３−２７９５５３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 WYNDHAM, K.D., et al.，Characterization and Evaluation of C18 HPLC Stationary Phases Based on Ethyl-Bridged Hybrid Organic/Inorganic Paricles，analytical chemistry，米国，２００３年１１月１５日，Vol. 75, No. 24，pp. 6781-6788，ＵＲＬ，http://pubs.acs.org/doi/pdf/10.1021/ac034767w

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｇ０１Ｎ ３０／００ − ３０／９６

Ｂ０１Ｊ ２０／２８１− ２０／２９２

ＣＡｐｌｕｓ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

サイズ排除クロマトグラフィーを行うための装置であって、
入口および出口を有するチャンバを画成する少なくとも１つの壁を有するハウジング、
および
前記チャンバ内に保持されたコアおよび表面組成物を含む粒子を含む固定相材料
を含み、
前記固定相材料が、式１：
Ｗ−［Ｘ］−Ｑ
式１
（式中、
Ｘは、シリカコア材料、または金属酸化物コア材料、またはこれらのブロックポリマーの一群を含む表面を有するコア組成物であり；
Ｗは、ヒドロキシルであり；および
Ｑは、−Ｓｉ（ＯＣＨ_３）_２−（ＣＨ_２）_３−Ｏ−ＣＨ_２−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ_２ＯＨ、又は−Ｓｉ（ＯＣＨ_３）_２−（ＣＨ_２）_３−Ｏ−ＣＨ_２−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ_２ＯＨと−Ｓｉ（ＯＣＨ_３）_２−（ＣＨ_２）_３−Ｏ−ＣＨ_２−ＣＨＯＣＨ_２との混合物である。）
によって表され、
固定相材料の粒子が、０．４−３．０マイクロメートルの平均粒径分布を有する直径を有する、サイズ排除クロマトグラフィーを行うための装置。

【請求項2】

ＷおよびＱが、コア組成物（Ｘ）のまたは前記コア組成物の表面の自由原子価を占有する、請求項１に記載のサイズ排除クロマトグラフィーを行うための装置。

【請求項3】

固定相材料の粒子が、１．０−３．０マイクロメートルの平均粒径分布を有する直径を有する、請求項１に記載のサイズ排除クロマトグラフィーを行うための装置。

【請求項4】

固定相材料の粒子が０．８から１．７ｃｍ^３／ｇの細孔容積を有する、請求項１に記載のサイズ排除クロマトグラフィーを行うための装置。

【請求項5】

チャンバが、６，８９５ＭＰａ（１，０００ｐｓｉ）より大きいカラム入口圧でサイズ排除クロマトグラフィーを行うことができる、請求項１に記載のサイズ排除クロマトグラフィーを行うための装置。

【請求項6】

Ｘが、シリカコア、酸化チタンコア、または酸化アルミニウムコアである、請求項１に記載のサイズ排除クロマトグラフィーを行うための装置。

【請求項7】

ハウジングが、固定相材料を収容するために１つ以上のフリットを装備している、請求項１に記載のサイズ排除クロマトグラフィーを行うための装置。

【請求項8】

ハウジングが、試料注入装置、検出器または両方と流体連通した状態に装置を配置することができる１つ以上の取付具を装備している、請求項１に記載のサイズ排除クロマトグラフィーを行うための装置。

【請求項9】

サイズ排除クロマトグラフィーを行う方法であって、
Ａ．）入口および出口を有するチャンバを画成する少なくとも１つの壁を有するハウジングと、前記チャンバ内に保持されたコアおよび表面組成物を含む粒子を含む固定相材料とを用意する段階であり、
前記固定相材料は、式１：
Ｗ−［Ｘ］−Ｑ
式１
（式中、
Ｘは、シリカコア材料、または金属酸化物コア材料、またはこれらのブロックポリマーの一群を含む表面を有するコア組成物であり；
Ｗは、ヒドロキシルであり；および
Ｑは、−Ｓｉ（ＯＣＨ_３）_２−（ＣＨ_２）_３−Ｏ−ＣＨ_２−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ_２ＯＨ、又は−Ｓｉ（ＯＣＨ_３）_２−（ＣＨ_２）_３−Ｏ−ＣＨ_２−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ_２ＯＨと−Ｓｉ（ＯＣＨ_３）_２−（ＣＨ_２）_３−Ｏ−ＣＨ_２−ＣＨＯＣＨ_２との混合物である。）
によって表され、固定相材料の粒子が、０．４−３．０マイクロメートルの平均粒径分布を有する直径を有する、段階；
Ｂ．）前記チャンバ内の前記固定相材料に試料を６，８９５ＭＰａ（１，０００ｐｓｉ）より大きいカラム入口圧で負荷し、および前記固定相媒体を通して前記試料を流す段階；および
Ｃ．）試料をサイズによって１つ以上の組成物に分離する段階
を含む方法。

【請求項10】

Ｄ．）１つ以上の組成物を単離する段階
をさらに含む、請求項９のサイズ排除クロマトグラフィーを行う方法。

【請求項11】

Ｅ．）１つ以上の組成物を検出する段階
をさらに含む、請求項９のサイズ排除クロマトグラフィーを行う方法。

【請求項12】

Ｄ．）１つ以上の組成物を単離する段階；および
Ｅ．）１つ以上の組成物を検出する段階
をさらに含む、請求項９のサイズ排除クロマトグラフィーを行う方法。

【請求項13】

試料がバイオポリマーである、請求項９のサイズ排除クロマトグラフィーを行う方法。

【請求項14】

試料が合成有機ポリマーである、請求項９のサイズ排除クロマトグラフィーを行う方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

（関連出願の相互参照）
本出願は、２００９年１２月１５日に出願された米国特許仮出願第６１／２８６，５８２号、および２００９年６月１７日に出願された同第６１／３５５，９７０号の優先権を主張するものであり、これらの仮出願の全開示をこの参照により本明細書に組み込む。

【0002】

（発明の分野）
本発明は、サイズ排除クロマトグラフィーを行うための装置および方法に関する。本発明の実施形態は、通常の高速液体クロマトグラフィーまたは超高速液体クロマトグラフィー圧でのサイズ排除クロマトグラフィーのための装置および方法、とりわけ小粒子を使用する上記装置および方法を特徴とする。

【背景技術】

【0003】

本出願では以下の用語を使用する。用語は、該用語が出現する本文の文脈が別の意味を必要としない限り下で定義するとおりである。

【0004】

クロマトグラフィーは、混合物中に見出される１つ以上の化合物を濃縮または単離するための分離方法である。化合物は、通常、試料中に存在する。本文書では、個人が分析することを望む任意の混合物を表すために広く「試料」という用語を用いる。用語「混合物」は、１つ以上の溶解した化合物を含有する流体という意味で用いる。この流体は、水ならびに／または他の液体およびガスを含み得る。対象となる化合物を分析物と称する。

【0005】

クロマトグラフィーは、示差泳動法である。混合物中の化合物は、クロマトグラフカラムを異なる速度で通り抜け、この結果、これらの化合物が分離されることとなる。この泳動は、粒子の充填層または多孔質モノリス構造（固定相と呼ばれる。）に関連して、流体相（移動相と称される。）の対流により発生する。一部のクロマトグラフィーモードでは、固定相および移動相と分析物の親和性の差によって示差泳動が発生する。

【0006】

サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）は、混合物中の分析物を流体力学的半径に基づいて分離または単離するタイプのクロマトグラフィーである。ＳＥＣでは、多孔質固定相媒体の容積を探索する分析物の能力の差のため、分離が発生する。例えば、Ａ．Ｍ．Ｓｔｒｉｅｇｅｌ ｅｔ．ａｌ．Ｍｏｄｅｒｎ Ｓｉｚｅ−Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｇｅｌ Ｐｅｒｍｅａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｇｅｌ Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｗｉｌｅｙ，ＮＪ，２００９を参照のこと。ＳＥＣは、一般的に大分子または分子複合体の分離に用いられる。例えば、限定ではないが、生物起源の多くの大分子、例えばデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、タンパク質、多糖類ならびにこれらの断片および複合体がＳＥＣによって分析される。合成ポリマー、プラスチックおよびこれらに類するものもＳＥＣによって分析される。

【0007】

ＳＥＣは、粒子の充填層を有するカラムを使用して通常は行われる。粒子の充填層は、移動相が貫流することとなる分離媒体または固定相である。カラムは、ポンプおよび試料インジェクタと流体連通した状態に配置される。試料混合物は、試料インジェクタにより加圧しながらカラムに負荷され、ポンプによって混合物および移動相がカラムに通される。混合物中の化合物はカラムから脱離または溶出し、最も大きい化合物が最初に出て最も小さい分子が最後に離れる。

【0008】

カラムは、溶液がカラムから出るにつれて溶液の性質の変化を検出することができる検出器と流体連通した状態に配置される。検出器は、これらの変化をクロマトグラムと称されるプロットとして登録および記録することとなり、このクロマトグラムを用いて分析物の存在または不在を判定する。分析物がカラムを離れる時間が、この分子のサイズの指標である。分子の分子量は、標準検量線を用いて概算することができる。サイズ排除クロマトグラフィーに使用される検出器の例は、限定ではないが、屈折率検出器、ＵＶ検出器、光散乱検出器および質量分析計である。

【0009】

分析時間を早めるために５，０００ｐｓｉより大きい圧力および速い流速で動作することができる、ＳＥＣ技術で使用するためのカラムを有することが望まれる。追加のまたは増加された効率および分解能；低減された溶剤使用量；ならびに先進の検出器との向上した互換性を有することも望まれる。高度に再現性のある結果を生じさせるために明確な細孔構造および粒径を有する固定相を備えたカラムを有することが望まれる。最後に、生物学的ポリマーと相溶性である表面修飾が施されている固定相を備えたカラムを有することが望まれる。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0010】

【非特許文献1】Ａ．Ｍ．Ｓｔｒｉｅｇｅｌ ｅｔ．ａｌ．Ｍｏｄｅｒｎ Ｓｉｚｅ−Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｇｅｌ Ｐｅｒｍｅａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｇｅｌ Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｗｉｌｅｙ，ＮＪ，２００９

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0011】

本発明の実施形態は、ＳＥＣを行うための装置および方法に関する。本発明の実施形態は、分析時間を早めるために、約１，０００ｐｓｉから約１０，０００ｐｓｉ以上にわたる通常の高速液体クロマトグラフィー圧（ＨＰＬＣ）および超高速液体クロマトグラフィー圧（ＵＨＰＬＣ）ならびに速い流速で動作する。本発明の実施形態は、高度に再現性のある結果を生じさせるために明確な細孔構造および粒径を有する固定相を特徴とする。また、本発明の実施形態は、生物学的ポリマーと相溶性である表面修飾が施されている固定相を特徴とする。

【課題を解決するための手段】

【0012】

１つの態様において、本発明は、サイズ排除クロマトグラフィーを行うための装置を提供し、この装置は、
入口および出口を有するチャンバを画成する少なくとも１つの壁を有するハウジングと、
前記チャンバ内に保持されたコアおよび表面組成物を含む固定相材料と
を含み、前記固定相材料は、式１：
Ｗ−［Ｘ］−Ｑ
式１
によって表される粒子またはモノリスを含み
式中、
Ｘは、シリカコア材料、金属酸化物コア材料、有機−無機ハイブリッドコア材料またはこれらのブロックポリマーの一群を含む表面を有するコア組成物であり；
Ｗは、水素またはヒドロキシルであり；および
Ｑは、不在であり、または分析物との静電相互作用、ファンデルワールス相互作用、水素結合性相互作用もしくは他の相互作用を最小にする官能基である。

【0013】

本発明によるサイズ排除クロマトグラフィーを行うための装置の一定の実施形態において、ＷおよびＱは、コア組成物（Ｘ）のまたはコア組成物の表面の自由原子価を占有する。

【0014】

本発明の装置の他の実施形態において、ＷおよびＱは、表面組成物を形成するために選択される。他の実施形態において、Ｘは、ブロックポリマーまたはブロックポリマー群を形成するために選択される。

【0015】

さらに他の実施形態において、固定相材料は、粒子を含む。固定相が粒子を含む本発明の装置の実施形態において、粒状固定相材料の粒子は、０．４−３．０マイクロメートル；０．５−３．０；０．６−３．０；０．７−３．０；０．９−３．０または１．０−３．０マイクロメートルの平均粒径分布を有する直径を有し得る。

【0016】

本発明の装置の他の実施形態において、固定相材料はモノリスを含む。固定相材料が粒子を含む本発明の装置の実施形態において、固定相材料のモノリスは、０．４−３．０マイクロメートル；０．５−３．０；０．６−３．０；０．７−３．０；０．９−３．０または１．０−３．０マイクロメートルの平均粒径分布を有する粒子を充填した粒子層のクロマトグラフィー効率および透過率を示す。本発明の装置の他の実施形態において、固定相材料の粒子またはモノリスは、０．８から１．７ｃｍ^３／ｇ；０．９から１．６ｃｍ^３／ｇ；１．０から１．５ｃｍ^３／ｇ；または１．１から１．５ｃｍ^３／ｇの細孔容積を有する。

【0017】

本発明の装置のさらに他の実施形態において、チャンバは、１，０００ｐｓｉより大きい；２，０００ｐｓｉより大きい；３，０００ｐｓｉより大きい；４，０００ｐｓｉより大きい；５，０００ｐｓｉより大きい；６，０００ｐｓｉより大きい；７，０００ｐｓｉより大きい；８，０００ｐｓｉより大きい；９，０００ｐｓｉより大きい；１０，０００ｐｓｉより大きい；１５，０００ｐｓｉより大きい；または２０，０００ｐｓｉより大きいカラム入口圧でサイズ排除クロマトグラフィーを行うことができる。さらに他の実施形態において、カラム入口圧は、約１，０００ｐｓｉから約２０，０００ｐｓｉ；約５，０００ｐｓｉから約２０，０００ｐｓｉ；約７，０００ｐｓｉから約２０，０００ｐｓｉ；約１０，０００ｐｓｉから約２０，０００ｐｓｉ；約１，０００ｐｓｉから約１５，０００ｐｓｉ；または約５，０００ｐｓｉから約１５，０００ｐｓｉである。

【0018】

本発明の装置の一定の実施形態において、Ｘは、シリカコア、酸化チタンコア、酸化アルミニウムコア、有機−無機ハイブリッドコア、または脂肪族架橋シランを含む有機−無機ハイブリッドコアである。

【0019】

特定の実施形態において、Ｘは、脂肪族架橋シランを含む有機−無機ハイブリッドコアである。一定の他の特定の実施形態において、脂肪族架橋シランの脂肪族基はエチレンである。

【0020】

本発明の装置の他の実施形態において、Ｑは、親水性基、疎水性基または不在である。

【0021】

本発明の一部の実施形態において、Ｑが親水性基である場合、Ｑは脂肪族基である。他の実施形態において、前記脂肪族基は脂肪族ジオールである。

【0022】

さらに他の実施形態において、Ｑは、式２

【0023】

【化1】

によって表され、式中、
ｎ^１は、０−３０の整数であり；
ｎ^２は、０−３０の整数であり；
Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３およびＲ^４の各存在は、水素、フルオロ、低級アルキル、保護もしくは脱保護アルコール、双性イオンまたは基Ｚを独立して表し；
Ｚは、
ａ）固定相材料の表面と式３：
（Ｂ^１）_ｘ（Ｒ^５）_ｙ（Ｒ^６）_ｚＳｉ−
式３：
（式中、
ｘは、１−３の整数であり、
ｙは、０−２の整数であり、
ｚは、０−２の整数であり、および
ｘ＋ｙ＋ｚ＝３であり、
Ｒ^５およびＲ^６の各存在は、メチル、エチル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、イソプロピル、テキシル、置換もしくは非置換アリール、環式アルキル、分岐アルキル、低級アルキル、保護もしくは脱保護アルコールまたは双性イオン基を独立して表し；
Ｂ^１は、−ＯＲ^７、−ＮＲ^７’Ｒ^７’’、−ＯＳＯ_２ＣＦ_３または−Ｃｌを表し、この場合のＲ^７、Ｒ^７’およびＲ^７’’のそれぞれは、水素、メチル、エチル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、イソプロピル、テキシル、フェニル、分岐アルキルまたは低級アルキルを表す。）；
の部分の間での共有もしくは非共有結合の形成により生成される表面連結基；
ｂ）直接炭素−炭素結合形成による、またはヘテロ原子、エステル、エーテル、チオエーテル、アミン、アミド、イミド、尿素、カルボナート、カルバマート、複素環、トリアゾールもしくはウレタン結合によるＸの表面ハイブリッド基への直接的連結；または
ｃ）固定相材料の表面に共有結合で連結されていない吸着基；
ｄ）Ｗが水素であるとき、反応により固定相材料の表面とビニルもしくはアルキニル基の間に共有結合を形成することによって生成される表面連結基
を表し；
Ｙは、直接結合；ヘテロ原子結合；エステル結合；エーテル結合；チオエーテル結合；アミン結合；アミド結合；イミド結合；尿素結合；チオ尿素結合；カルボナート結合；カルバマート結合；複素環結合；トリアゾール結合；ウレタン結合；ジオール結合；ポリオール結合；スチレン、エチレングリコールもしくはプロピレングリコールのオリゴマー；スチレン、エチレングリコールもしくはプロピレングリコールのポリマー；炭水化物基、多分岐型（ｍｕｌｔｉ−ａｎｔｅｎｎａｒｙ）炭水化物、デンドリマーもしくはデンドリグラフ（ｄｅｎｄｒｉｇｒａｐｈ）または双性イオン基を表し；および
Ａは、
ｉ．）親水性末端基；
ｉｉ．）水素、フルオロ、フルオロアルキル、低級アルキルもしくは基Ｚ；または
ｉｉｉ．）官能化可能な基
を表す。

【0024】

本発明の装置の一定の実施形態において、Ｑが式２の脂肪族ジオールである場合、ｎ^１は、２−１８または２−６の整数である。本発明の装置の他の実施形態において、Ｑが式２の脂肪族ジオールである場合、ｎ^２は、０−１８または０−６の整数である。本発明の装置のさらに他の実施形態において、Ｑが式２の脂肪族ジオールである場合、ｎ^１は２−１８の整数であり、およびｎ^２は０−１８の整数である；ｎ^１は２−６の整数であり、およびこの場合のｎ^２は０−１８の整数である；ｎ^１は２−１８の整数であり、およびｎ^２は０−６の整数である；またはｎ^１は２−６の整数であり、およびｎ^２は０−６の整数である。

【0025】

本発明の装置のさらに他の実施形態において、Ｑが式２の脂肪族ジオールである場合、Ａは、ｉ）親水性末端基を表し、および親水性末端基は、保護または脱保護形のアルコール、ジオール、グリシジルエーテル、エポキシ、トリオール、ポリオール、ペンタエリスリトール、ペンタエリスリトールエトキシラート、１，３−ジオキサン−５，５−ジメタノール、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンポリグリコールエーテル、エチレングリコール、プロピレングリコール、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（プロピレングリコール）、一価、二価もしくは多価炭水化物基、多分岐型炭水化物、デンドリマー含有末梢親水性基、デンドリグラフ含有末梢親水性基、または双性イオン基である。

【0026】

本発明の装置のさらに他の実施形態において、Ｑが式２の脂肪族ジオールである場合、Ａは、ｉｉ．）水素、フルオロ、メチル、エチル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、ｉ−プロピル、低級アルキル、フルオロアルキルまたは基Ｚを表す。

【0027】

本発明の装置のさらに他の実施形態において、Ｑが式２のものである場合、Ａは、ｉｉｉ．）官能化可能な基を表し、および官能化可能な基は、保護または脱保護形のアミン、アルコール、シラン、アルケン、チオオール、アジドまたはアルキンである。一部の実施形態において、前記官能化可能な基は、後続の反応段階において新たな表面基を生じさせることができ、反応段階は、カップリング、メタセシス、ラジカル付加、ヒドロシリル化、縮合、クリックまたは重合である。

【0028】

本発明の装置の一定の実施形態において、Ｚは、直接炭素−炭素結合形成による、またはヘテロ原子、エステル、エーテル、チオエーテル、アミン、アミド、イミド、尿素、カルボナート、カルバマート、複素環、トリアゾールもしくはウレタン結合による表面ハイブリッド基への直接的連結を表す。

【0029】

他の実施形態において、Ｚは、材料の表面に共有結合で連結されていない吸着された表面の基を表す。この表面基は、架橋ポリマーまたは他の吸着された表面基であり得る。例としては、アルコール、アミン、チオール、ポリアミン、デンドリマーまたはポリマーが挙げられるが、これらに限定されない。

【0030】

本発明の装置の一部の実施形態において、ハウジングは、固定相材料を収容するために１つ以上のフリットを装備している。他の実施形態において、ハウジングは、試料注入装置、検出器または両方と流体連通した状態に装置を配置することができる１つ以上の取付具を装備している。

【0031】

もう１つの態様において、本発明は、サイズ排除クロマトグラフィーを行う方法を提供し、この方法は、
Ａ．）入口および出口を有するチャンバを画成する少なくとも１つの壁を有するハウジングと、前記チャンバ内に保持されたコアおよび表面組成物を含む固定相材料とを用意する段階であり、
前記固定相材料は、式１：
Ｗ−［Ｘ］−Ｑ
式１
によって表される、コア組成物と表面組成物とを有する、粒子を含み
式中、
Ｘは、シリカコア材料、金属酸化物コア材料、有機−無機ハイブリッドコア材料またはこれらのブロックポリマーの一群を含む表面を有するコア組成物であり；
Ｗは、水素またはヒドロキシルであり；および
Ｑは、不在であり、または分析物との静電相互作用、ファンデルワールス相互作用、水素結合性相互作用もしくは他の相互作用を最小にする官能基である
段階、
Ｂ．）前記チャンバに試料を１，０００ｐｓｉより大きいカラム入口圧で負荷して、固定相媒体を通して試料を流す段階；および
Ｃ．）前記試料をサイズによって１つ以上の組成物に分離する段階
を含む。

【0032】

本発明の方法の一定の実施形態において、カラム入口圧は、２，０００ｐｓｉより大きい；３，０００ｐｓｉより大きい；４，０００ｐｓｉより大きい；５，０００ｐｓｉより大きい；６，０００ｐｓｉより大きい；７，０００ｐｓｉより大きい；８，０００ｐｓｉより大きい；９，０００ｐｓｉより大きい；１０，０００ｐｓｉより大きい；１５，０００ｐｓｉより大きい；または２０，０００ｐｓｉより。さらに他の実施形態において、カラム入口圧は、約１，０００ｐｓｉから約２０，０００ｐｓｉ；約５，０００ｐｓｉから約２０，０００ｐｓｉ；約７，０００ｐｓｉから約２０，０００ｐｓｉ；約１０，０００ｐｓｉから約２０，０００ｐｓｉ；約１，０００ｐｓｉから約１５，０００ｐｓｉ；または約５，０００ｐｓｉから約１５，０００ｐｓｉである。

【0033】

本発明の方法のもう１つの実施形態において、方法は、
Ｄ．）１つ以上の組成物を単離する段階
をさらに含む。

【0034】

本発明の方法のさらにもう１つの実施形態において、方法は、
Ｅ．）１つ以上の組成物を検出する段階
をさらに含む。

【0035】

本発明の方法のさらにもう１つの実施形態において、方法は、
Ｄ．）１つ以上の組成物を単離する段階；および
Ｅ．）１つ以上の組成物を検出する段階
をさらに含む。

【0036】

本発明の方法の一定の実施形態において、この場合の試料はバイオポリマーである。試料がバイオポリマーである実施形態において、Ｑは親水性である。一部の実施形態において、Ｑは脂肪族基である。他の実施形態において、前記脂肪族基は脂肪族ジオールである。さらに他の実施形態において、Ｑは、式２

【0037】

【化2】

によって表され、式中、
ｎ^１は、０−３０の整数であり；
ｎ^２は、０−３０の整数であり；
Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３およびＲ^４の各存在は、水素、フルオロ、低級アルキル、保護もしくは脱保護アルコール、双性イオンまたは基Ｚを独立して表し；
Ｚは、
ａ）固定相材料の表面と式３：
（Ｂ^１）_ｘ（Ｒ^５）_ｙ（Ｒ^６）_ｚＳｉ−
式３：
（式中、
ｘは、１−３の整数であり、
ｙは、０−２の整数であり、
ｚは、０−２の整数であり、および
ｘ＋ｙ＋ｚ＝３であり、
Ｒ^５およびＲ^６の各存在は、メチル、エチル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、イソプロピル、テキシル、置換もしくは非置換アリール、環式アルキル、分岐アルキル、低級アルキル、保護もしくは脱保護アルコールまたは双性イオン基を独立して表し；
Ｂ^１は、−ＯＲ^７、−ＮＲ^７’Ｒ^７’’、−ＯＳＯ_２ＣＦ_３または−Ｃｌを表し、この場合のＲ^７、Ｒ^７’およびＲ^７’’のそれぞれは、水素、メチル、エチル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、イソプロピル、テキシル、フェニル、分岐アルキルまたは低級アルキルを表す。）；
の部分の間での共有もしくは非共有結合の形成により生成される表面連結基；
ｂ）直接炭素−炭素結合形成による、またはヘテロ原子、エステル、エーテル、チオエーテル、アミン、アミド、イミド、尿素、カルボナート、カルバマート、複素環、トリアゾールもしくはウレタン結合によるＸの表面ハイブリッド基への直接的連結；または
ｃ）固定相材料の表面に共有結合で連結されていない吸着基；
ｄ）Ｗが水素であるとき、反応により固定相材料の表面とビニルもしくはアルキニル基の間に共有結合を形成することによって生成される表面連結基
を表し；
Ｙは、直接結合；ヘテロ原子結合；エステル結合；エーテル結合；チオエーテル結合；アミン結合；アミド結合；イミド結合；尿素結合；チオ尿素結合；カルボナート結合；カルバマート結合；複素環結合；トリアゾール結合；ウレタン結合；ジオール結合；ポリオール結合；スチレン、エチレングリコールもしくはプロピレングリコールのオリゴマー；スチレン、エチレングリコールもしくはプロピレングリコールのポリマー；炭水化物基、多分岐型炭水化物、デンドリマーもしくはデンドリグラフまたは双性イオン基を表し；および
Ａは、
ｉ．）親水性末端基；
ｉｉ．）水素、フルオロ、フルオロアルキル、低級アルキルもしくは基Ｚ；または
ｉｉｉ．）官能化可能な基
を表す。

【0038】

本発明の他の実施形態において、試料は合成有機ポリマーである。試料が合成有機ポリマーである実施形態において、Ｑは疎水性部分であり得る。

【0039】

もう１つの態様において、本発明は、サイズ排除クロマトグラフィー排除クロマトグラフィー中に光散乱検出器によって得られるノイズの発生率を低減する方法を提供し、この方法は、
Ａ．）入口および出口を有するチャンバを画成する少なくとも１つの壁を有するハウジングと、前記チャンバ内に保持されたコアおよび表面組成物を含む固定相材料とを用意する段階であり、
前記固定相材料は、式１：
Ｗ−［Ｘ］−Ｑ
式１
によって表される粒子またはモノリスを含み
式中、
Ｘは、シリカコア材料、金属酸化物コア材料、有機−無機ハイブリッドコア材料またはこれらのブロックポリマーの一群を含む表面を有するコア組成物であり；
Ｗは、水素またはヒドロキシルであり；および
Ｑは、不在であり、または分析物との静電相互作用、ファンデルワールス相互作用、水素結合性相互作用もしくは他の相互作用を最小にする官能基である
段階、
Ｂ．）前記チャンバ内の前記固定相材料に試料を１，０００ｐｓｉより大きいカラム入口圧で負荷し、固定相媒体を通して試料を流す段階；
Ｃ．）試料をサイズによって１つ以上の組成物に分離する段階；および
Ｄ．）光散乱検出器を使用して１つ以上の組成物を検出する段階
を含む。

【0040】

さらにもう１つの態様において、本発明は、排除クロマトグラフィー中に光散乱検出器によって得られるゴーストピークの発生率を低減する方法を提供し、この方法は、
Ａ．）入口および出口を有するチャンバを画成する少なくとも１つの壁を有するハウジングと、前記チャンバ内に保持されたコアおよび表面組成物を含む固定相材料とを用意する段階であり、
前記固定相材料は、式１：
Ｗ−［Ｘ］−Ｑ
式１
によって表される粒子またはモノリスを含み
式中、
Ｘは、シリカコア材料、金属酸化物コア材料、有機−無機ハイブリッドコア材料またはこれらのブロックポリマーの一群を含む表面を有するコア組成物であり；
Ｗは、水素またはヒドロキシルであり；および
Ｑは、不在であり、または分析物との静電相互作用、ファンデルワールス相互作用、水素結合性相互作用もしくは他の相互作用を最小にする官能基である
段階、
Ｂ．）前記チャンバ内の前記固定相材料に試料を１，０００ｐｓｉより大きいカラム入口圧で負荷し、前記固定相媒体を通して試料を流す段階；
Ｃ．）試料をサイズによって１つ以上の組成物に分離する段階；および
Ｄ．）光散乱検出器を使用して１つ以上の組成物を検出する段階
を含む。

【0041】

本発明のこれらおよび他の特徴および利点は、下に記載する図面を見ることおよび後続の詳細な説明を読むことにより、当業者にははっきりと理解できるであろう。

【図面の簡単な説明】

【0042】

【図1】本発明による装置を示す図である。

【図2】本発明によるＳＥＣの結果を示す図である。

【図3】本発明に従って製造したプロトタイプ「Ｋ」を充填したカラムについてのＨ−ｕ曲線を示す図である。カラム寸法４．６×１５０ｍｍ。流速範囲０．１−０．７ｍＬ／分。

【図4】プロトタイプ「Ｄ」のＨ−ｕ曲線を示す図である。カラム寸法４．６×１５０ｍｍ。流速範囲０．１−０．７ｍＬ／分。

【図5】表６に記載するとおりの材料を充填したカラムについての正規化検量線を示す図である。各曲線の線形領域から勾配を得た。

【図6】図５に示した各曲線について得られた比細孔容積に対する正規化勾配を示す図である。各曲線の線形範囲についての勾配を決定した。

【図7】本発明に従って製造したプロトタイプ「Ｋ」を充填したカラム、４．６×１５０ｍｍでのモノクローナル抗体単量体と二量体の分離に対する流速の効果を示す図である。

【図8】比較カラム「Ｌ」、４．６×３００ｍｍでのモノクローナル抗体単量体と二量体の分離に対する流速の比較効果を示す図である。

【図9】プロトタイプ「Ｋ」、４．６×１５０を充填したカラムでの段高さおよびモノクローナル抗体単量体と二量体の分離についての分解能に対する流速の効果を示す図である。

【図10】比較カラム「Ｌ」、４．６×３００での段高さおよびモノクローナル抗体単量体と二量体の分離についての分解能に対する流速の効果を示す図である。

【図11】（１）サイログロブリン、（２）ＩｇＧ１、（３）ＢＳＡ、（４）ミオグロブリン、（５）ウラシルの分離に対する温度の効果を示す図である。上：プロトタイプ「Ｋ」、４．６×１５０ｍｍを充填したカラム。下：比較カラム「Ｌ」、４．６×３００ｍｍ。

【図12】分析物の保持に対する塩タイプの効果を示す図である。移動相は、２００ｍＭの所与の塩を有する１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．８から成った。リン酸塩の場合、塩濃度は１００ｍＭであった。

【図13】分析物の保持に対する塩タイプの効果をさらに示す図である。移動相は、２００ｍＭの所与の塩を有する１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．８から成った。リン酸塩の場合、塩濃度は１００ｍＭであった。

【図14A】（ａ）本発明に従って製造したカラム；および（ｂ）比較カラムを使用する塩基性タンパク質リゾチームの保持に対するイオン強度の効果を示す図である。

【図14B】（ａ）本発明に従って製造したカラム；および（ｂ）比較カラムを使用する塩基性タンパク質リゾチームの保持に対するイオン強度の効果を示す図である。

【図15】プロトタイプ「Ｋ」を有するカラムを使用して０．２ｍＬ／分の流速で実行したＢＳＡの分離からのクロマトグラムを示す図である。この図は、ＵＶ検出器と光散乱検出器両方からのトレースを示す。

【図16】プロトタイプ「Ｋ」を有するカラムを使用して０．５ｍＬ／分の流速で実行したＢＳＡの分離からのクロマトグラムを示す図である。この図は、ＵＶ検出器と光散乱検出器両方からのトレースを示す。

【図17】比較カラムＬを使用して０．３ｍＬ／分の流速で実行したＢＳＡの分離からのクロマトグラムを示す図である。この図は、ＵＶ検出器と光散乱検出器両方からのトレースを示す。

【図18】比較カラムＭを使用して０．３ｍＬ／分の流速で実行したＢＳＡの分離からのクロマトグラムを示す図である。この図は、ＵＶ検出器と光散乱検出器両方からのトレースを示す。

【図19】比較カラムＮを使用して０．３ｍＬ／分の流速で実行したＢＳＡの分離からのクロマトグラムを示す図である。この図は、ＵＶ検出器と光散乱検出器両方からのトレースを示す。

【発明を実施するための形態】

【0043】

ここに、本発明の実施形態を、ＳＥＣを行うための装置および方法として、このような装置および方法が好ましい装置および方法であるという了解のもとで詳細に説明する。このような装置および方法は、本発明者らが、本発明の最良の実施様式であると今考えているものである。このような装置および方法に修飾および改変が可能であることは当業者には理解されるであろう。

【0044】

ここで図１においては、本発明の特徴を具現する装置（番号１１によって全体を示す。）が図示されている。ＳＥＣを行うための装置１１は、次の主要要素および成分を含む：ハウジング１３および粒状固定相媒体１５。

【0045】

ハウジング１３は、チャンバ１９を画成する少なくとも１つの壁１７を有する。図示されているように、壁１７は、内面２１および外面２３を有するシリンダーの形である。ここではカラムとして記載するが、ハウジング１３、およびチャンバ１９を画成する壁１７には任意の形状が想定される。例えば、限定ではないが、ハウジング１３は、中にチャンバ１９が形成されている平面状チップ様構造であってもよい。

【0046】

図示されているように、少なくとも１つの壁１７は、入口開口部２５および出口開口部２７を有するチャンバを画成する。入口開口部２５は図１では見えにくいが、入口開口部２５および出口開口部２７は幾つかの特徴を共有する。入口開口部２５および出口開口部２７はフリットを有し、これらのうち出口開口部２７に関するフリット２９のみが示されている。図示されているように、フリット２９は、カラム内の固定相を収容するが移動相の通過を可能ならしめる要素である。一定の実施形態において、このフリットは、焼成金属または同様の金属から成り得る。他の実施形態において、このフリットは、層を通る流体流を可能ならしめるほどに多孔質であるがこの層内に粒子を共に保持する、バインダーまたは接着剤から成り得る。さらに他の実施形態において、固定相材料はモノリスであり得る。このような実施形態では、フリット要素を必要としないことがある。

【0047】

少なくとも１つの壁１７は、入口開口部２５にまたは付近に第一接続手段、および出口開口部２７にまたは付近に第二接続手段を有する。第一接続手段は、共働ねじ山［図示なし］により少なくとも１つの壁１７に保持された取付用ナット３７を含む。同様に、第二接続手段は、共働ねじ山４１により少なくとも１つの壁１７に保持された第二取付用ナット３９を含む。第一および第二接続手段は、共働取付具、クランプ、係止溝およびこれらに類するもの［図示なし］を含むことがある。第一接続手段および第二接続手段は、はめ輪、シール、Ｏリングおよびこれらに類するもの［図示なし］も含むことがあり、これらは簡略化のために図から省いた。

【0048】

チャンバ１７の入口開口部２５は、流体および試料の供給源（番号４３によりブロック略図形式で図示する。）と流体連通している。流体および試料の好ましい供給源は、約５，０００ｐｓｉの通常のＨＰＬＣまたはＵＰＬＣ範囲の動作圧を有する。しかし、粒子および装置１１には、１，０００ｐｓｉより大きい；２，０００ｐｓｉより大きい；３，０００ｐｓｉより大きい；４，０００ｐｓｉより大きい；５，０００ｐｓｉより大きい；６，０００ｐｓｉより大きい；７，０００ｐｓｉより大きい；８，０００ｐｓｉより大きい；９，０００ｐｓｉより大きい；または１０，０００ｐｓｉより大きい動作圧が可能である。本発明の装置のさらに他の実施形態において、粒子および装置は、約１，０００ｐｓｉから約１５，０００ｐｓｉ；約５，０００ｐｓｉから約１５，０００ｐｓｉ；約７，０００ｐｓｉから約１５，０００ｐｓｉ；約１０，０００ｐｓｉから約１５，０００；約１，０００ｐｓｉから約１０，０００ｐｓｉ；または約５，０００ｐｓｉから約１０，０００ｐｓｉの圧力で動作することができる。

【0049】

ある特定の実施形態において、流体および試料の供給源は、ＡＣＱＵＩＴＹ（登録商標）ＵＰＬＣ（登録商標）分離モジュール（米国マサチューセッツ州ミルフォードのＷａｔｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）である。

【0050】

チャンバ１７の出口開口部２７は、検出器４５と流体連通している。非常に多くの検出器を利用できるが、具体的な検出器は、ＡＣＱＵＩＴＹ（登録商標）ＵＰＬＣ（登録商標）Ｔｕｎａｂｌｅ ＵＶ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ（米国マサチューセッツ州ミルフォードのＷａｔｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）である。

【0051】

粒状固定相媒体１５がチャンバ１７内に保持される。この粒状媒固定相媒体１５は粒子を含み、これらの粒子は図１に定尺で描かれていない。これらの粒子は一般に球形であるが、クロマトグラフィーに有用ないずれの形状であってもよい。これらの粒子は一般に粒径分布を有し、平均直径は１−３マイクロメートルである。

【0052】

定義
上で用いたような用語「脂肪族基」は、１個と２２個の間の炭素原子を概して有する直鎖または分岐鎖を特徴とする有機化合物を含む。

【0053】

脂肪族基は、アルキル基、アルケニル基およびアルキニル基を含む。複雑な構造の場合、鎖は分岐または架橋していることがある。直鎖アルキル基および分岐鎖アルキル基を含めて、アルキル基は、１個以上の炭素原子を有する飽和炭化水素を含む。このような炭化水素部分は、１つ以上の炭素原子が例えばハロゲン、ヒドロキシル、チオール、アミノ、アルコキシ、アルキルカルボキシ、アルキルチオまたはニトロ基で置換されていることがある。炭素数に特に別の指定がない限り、本明細書で用いる場合の「低級脂肪族」は、１から６個の炭素原子を有することを除いて上で定義したとおりの脂肪族基（例えば、低級アルキル、低級アルケニル、低級アルキニル）を意味する。このような低級脂肪族基、例えば低級アルキル基の代表は、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、２−クロロプロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、２−アミノブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、３−チオペンチルおよびこれらに類するものである。本明細書で用いる場合、用語「ニトロ」は、−ＮＯ_２を意味し；用語「ハロゲン」は、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒまたは−Ｉを示し；用語「チオール」は、ＳＨを意味し；および用語「ヒドロキシル」は、−ＯＨを意味する。従って、本明細書で用いる場合の用語「アルキルアミノ」は、上で定義したとおりのアルキル基であって、基に連結されたアミノ基を有するものであるアルキル基を意味する。適するアルキルアミノ基としては、１から約１２個の炭素原子または１から約６個の炭素原子を有する基が挙げられる。用語「アルキルチオ」は、上で定義したとおりのアルキル基であって、基に連結されたスルフヒドリル基を有するものであるアルキル基を意味する。適するアルキルチオ基としては、１から約１２個の炭素原子または１から約６個の炭素原子を有する基が挙げられる。本明細書で用いる場合の用語「アルキルカルボキシル」は、上で定義したとおりのアルキル基であって、基に連結されたカルボキシル基を有するものであるアルキル基を意味する。本明細書で用いる場合の用語「アルコキシ」は、上で定義したとおりのアルキル基であって、基に連結された酸素原子を有するものであるアルキル基を意味する。代表的なアルコキシ基としては、１から約１２個の炭素原子または１から約６個の炭素原子を有する基、例えばメトキシ、エトキシ、プロポキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシおよびこれらに類するものが挙げられる。用語「アルケニル」および「アルキニル」は、アルキルに類似しているが少なくとも１つの二重または三重結合をそれぞれ含有する不飽和脂肪族基を指す。適するアルケニルおよびアルキニル基としては、２から約１２個の炭素原子または１から約６個の元素原子を有する基が挙げられる。

【0054】

用語「脂環式基」は、炭素原子３個以上の閉環構造を含む。脂環式基は、飽和環式炭化水素であるシクロパラフィンまたはナフテン、２つ以上の二重結合を伴う不飽和であるシクロオレフィン、および三重結合を有するシクロアセチレンを含む。これらは芳香族基を含まない。シクロパラフィンの例としては、シクロプロパン、シクロヘキサンおよびシクロペンタンが挙げられる。シクロオレフィンの例としては、シクロペンタジエンおよびシクロオクタジエンが挙げられる。脂環式基は、縮合環構造および置換脂環式基、例えばアルキル置換脂環式基も含む。脂環式化合物の場合、このような置換基は、低級アルキル、低級アルケニル、低級アルコキシ、低級アルキルチオ、低級アルキルアミノ、低級アルキルカルボキシ、ニトロ、ヒドロキシル、−ＣＦ_３、−ＣＮまたはこれらに類するものをさらに含むことがある。

【0055】

用語「複素環式基」は、環内の原子の１個以上が炭素以外の元素、例えば窒素、硫黄または酸素である閉環構造を含む。複素環式基は、飽和されているまたは不飽和であることがあり、ならびにピロールおよびフランなどの複素環式基を有し得る。これらは、縮合環構造、例えば、キノリンおよびイソキノリンを含む。複素環式基の他の例としては、ピリジンおよびプリンが挙げられる。複素環式基は、１個以上の構成原子が例えばハロゲン、低級アルキル、低級アルケニル、低級アルコキシ、低級アルキルチオ、低級アルキルアミノ、低級アルキルカルボキシル、ニトロ、ヒドロキシル、−ＣＦ_３、−ＣＮまたはこれらに類するもので置換されていることもある。適するヘテロ芳香族およびヘテロ脂環式基は、１環につき３から約８の構成員を有するおよび１個以上のＮ、ＯまたＳ原子を有するものである、１から３個の別個のまたは縮合した環を一般に有するであろう（例えば、クマリニル、キノリニル、ピリジル、ピラジニル、ピリミジル、フリル、ピロリル、チエニル、チアゾリル、オキサゾリル、イミダゾリル、インドリル、ベンゾフラニル、ベンゾチアゾリル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロピラニル、ピペリジニル、モルホリノおよびピロリジニル）。

【0056】

用語「芳香族基」は、１個以上の環を含有する不飽和環式炭化水素を含む。芳香族基は、０から４個のヘテロ原子を含むことがある５員および６員単環基、例えば、ベンゼン、ピロール、フラン、チオフェン、イミダゾール、オキサゾール、チアゾール、トリアゾール、ピラゾール、ピリジン、ピラジン、ピリダジンおよびピリミジンならびにこれらに類するものを含む。芳香族環は、１つ以上の環位置が例えばハロゲン、低級アルキル、低級アルケニル、低級アルコキシ、低級アルキルチオ、低級アルキルアミノ、低級アルキルカルボキシル、ニトロ、ヒドロキシ、−ＣＦ_３、−ＣＮまたはこれらに類するもので置換されていることがある。

【0057】

用語「アルキル」は、直鎖アルキル基、分岐鎖アルキル基、シクロアルキル（脂環式）基、アルキル置換シクロアルキル基およびシクロアルキル置換アルキル基をはじめとする、飽和脂肪族基を含む。一定の実施形態において、直鎖または分岐鎖アルキルは、アルキルの主鎖に３０個以下の炭素原子、例えば直鎖についてはＣ_１−Ｃ_３０または分岐鎖についてはＣ_３−Ｃ_３０を有する。一定の実施形態において、直鎖または分岐鎖アルキルは、アルキルの主鎖に２０個以下の炭素原子、例えば直鎖についてはＣ_１−Ｃ_２０または分岐鎖についてはＣ_３−Ｃ_２０、および一部の実施形態では１８個以下の炭素原子を有する。同様に、特定のシクロアルキルは、環構造内に４−１０個の炭素原子を有し、一部の実施形態では環構造内に４−７個の炭素原子を有する。用語「低級アルキル」は、鎖内に１から６個の炭素原子を有するアルキル基、および環構造内に３から６個の炭素原子を有するシクロアルキルを指す。

【0058】

さらに、本明細書および請求項全体を通して用いる場合の用語「アルキル」（「低級アルキル」を含む。）は、「非置換アルキル」と「置換アルキル」の両方を含み、これらのうちの後者（置換アルキル）は、炭化水素主鎖の１個以上の炭素上の水素を置換している置換基を有するアルキル部分を指す。このような置換基としては、例えば、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、アルコキシカルボニルオキシ、アリールオキシカルボニルオキシ、カルボキシラート、アルキルカルボニル、アルコキシカルボニル、アミノカルボニル、アルキルチオカルボニル、アルコキシ、ホスファート、ホスホナト、ホスフィナト、シアノ、アミノ（アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノおよびアルキルアリールアミノを含む。）、アシルアミノ（アルキルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、カルバモイルおよびウレイドを含む。）、アミジノ、イミノ、スルフヒドリル、アルキルチオ、アリールチオ、チオカルボキシラート、スルファート、スルホナト、スルファモイル、スルホンアミド、ニトロ、トリフルオロメチル、シアノ、アジド、ヘテロシクリル、アラルキル、または芳香族もしくはヘテロ芳香族部分を挙げることができる。炭化水素鎖に対する置換部分自体が、適宜、置換されていることがあることは、当業者には理解されるであろう。シクロアルキルは、例えば上で説明した置換基でさらに置換されていることがある。「アラルキル」部分は、例えば１から３個の別個のまたは縮合した環と６から１８個の炭素環原子とを有するアリールで置換されているアルキル、例えばフェニルメチル（ベンジル）である。

【0059】

用語「アリール」は、０から４個のヘテロ原子を含むことがある５員および６員単環芳香族基、例えば、非置換または置換ベンゼン、ピロール、フラン、チオフェン、イミダゾール、オキサゾール、チアゾール、トリアゾール、ピラゾール、ピリジン、ピラジン、ピリダジンおよびピリミジンならびにこれらに類するものを含む。アリール基は、多環式縮合芳香族基、例えば、ナフチル、キノリル、インドリルおよびこれらに類するものも含む。この芳香族環は、１つ以上の環位置において、例えばアルキル基について上で説明したような置換基で、置換されていることがある。適するアリール基としては、非置換および置換フェニル基が挙げられる。本明細書で用いる場合の用語「アリールオキシ」は、上で定義したとおりのアリール基であって、基に連結された酸素原子を有するものであるアリール基を意味する。

【0060】

本明細書で用いる場合の用語「アラルコキシ」は、上で定義したとおりのアラルキル基であって、基に連結された酸素原子を有するものであるアラルキル基を意味する。適するアラルコキシ基は、１から３個の別個のまたは縮合した環および６から１８個の炭素環原子を有する（例えばＯ−ベンジル）。

【0061】

本明細書で用いる場合の用語「アミノ」は、式−ＮＲ_ａＲ_ｂの非置換または置換部分を指し、この式中、Ｒ_ａおよびＲ_ｂは、それぞれ独立して、水素、アルキル、アリールもしくはヘテロシクリルであり、またはＲ_ａおよびＲ_ｂは、これらが連結されている窒素原子と一緒になって、環内に３から８個の原子を有する環式部分を形成する。従って、用語「アミノ」は、別の言明がない限り、環式アミノ部分、例えばピペリジニルまたはピロリジニルを含む。「アミノ置換アミノ基」は、Ｒ_ａおよびＲ_ｂの少なくとも一方がアミノ基でさらに置換されているアミノ基を指す。

【0062】

用語「保護基」は、本明細書で用いる場合、有機合成分野において周知である官能基の化学修飾を指す。例示的保護基は様々であり得、一般に、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ［Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ，１９９９］に記載されている。

【0063】

「有機−無機ハイブリッド材料」を含めて、「ハイブリッド」は、有機官能基がハイブリッド材料表面ばかりでなく内部または「骨格」無機構造両方に不可欠である、無機ベースの構造を含む。ハイブリッド材料の無機部分は、例えば、アルミナ、シリカ、チタン、セリウムもしくはジルコニウムまたはこれらの酸化物、またはセラミック材料であり得る。「ハイブリッド」は、有機官能基がハイブリッド材料表面ばかりでなく内部または「骨格」無機構造両方に不可欠である、無機ベースの構造を含む。上で述べたような例示的ハイブリッド材料は、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏｓ．４，０１７，５２８、６，５２８，１６７、６，６８６，０３５および７，１７５，９１３に示されている。

【0064】

用語「ＢＥＨ」は、本明細書で用いる場合、エチレン架橋ハイブリッド材料である有機−無機ハイブリッド材料を指す。

【0065】

用語「吸着基」は、本明細書で用いる場合、コア材料に非共有結合で連結されている、架橋されているまたは架橋されていないモノマー、オリゴマーまたはポリマーを表す。本発明の一定の実施形態において、Ｚが吸着基を表す場合、この基は、コア材料（Ｘ）に吸着されていることがあり、コア材料（Ｘ）の表面に吸着されていることがあり、または固定相材料の表面に吸着されていることがある。例としては、アルコール、アミン、チオール、ポリアミン、デンドリマー（ｄｅｄｒｉｍｅｒ）またはポリマーが挙げられるが、これらに限定されない。

【0066】

用語「官能化基」または「官能化可能な基」は、一定のクロマトグラフィー官能性を固定相に付与する有機官能基を含む。

【0067】

用語「末端基」は、本明細書で用いる場合、さらなる反応することができない基を表す。一定の実施形態において、末端基は親水性末端基である。親水性末端基としては、保護または脱保護形のアルコール、ジオール、グリシジルエーテル、エポキシ、トリオール、ポリオール、ペンタエリスリトール、ペンタエリスリトールエトキシラート、１，３−ジオキサン−５，５−ジメタノール、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンポリグリコールエーテル、エチレングリコール、プロピレングリコール、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（プロピレングリコール）、一価、二価もしくは多価炭水化物基、多分岐型炭水化物、デンドリマー含有末梢親水性基、デンドリグラフ含有末梢親水性基、または双性イオン基が挙げられるが、これらに限定されない。

【0068】

用語「表面連結基」は、本明細書で用いる場合、コア材料、コア材料の表面、または固定相材料の表面に共有結合、非共有結合、吸着または別様に連結するように反応させることができる基を表す。一定の実施形態において、表面連結基は、シロキサン結合によってコア材料の表面に連結される。

【0069】

本明細書で用いる場合の用語「ノイズの発生率を低減すること」は、検出器によって得られるノイズの量または感度の低下または減少を指す。このような低減を、通常の当業者は、Ｔｏｓｈｏ ＴＳＫｇｅｌ（Ｒ）ＳｕｐｅｒＳＷ３０００、４．６×３００ｍｍ、Ｐ／Ｎ １８６７５などの従来のＳＥＣカラムを用いて同じ条件（温度、濃度、流速など）下で試料を比較することによって、容易に判定することができる。

【0070】

用語「ゴーストピークの発生率を低減すること」は、検出器によって得られるゴーストピークの量または感度の低下または減少を指す。このような低減を、通常の当業者は、Ｔｏｓｈｏ ＴＳＫｇｅｌ（Ｒ）ＳｕｐｅｒＳＷ３０００、４．６×３００ｍｍ、Ｐ／Ｎ １８６７５などの従来のＳＥＣカラムを用いて同じ条件（温度、濃度、流速など）下で試料を比較することによって、容易に判定することができる。

【0071】

固定相材料
本発明の装置および方法は、固定相材料を利用する。このような材料は、モノリス、１個以上の粒子、１個以上の球形粒子、または１個以上の薄膜状粒子であり得る。

【0072】

一定の実施形態において、前記固定相材料は、式１：
Ｗ−［Ｘ］−Ｑ
式１
によって表される、コア組成物と表面組成物とを有する粒子またはモノリスを含み、
式中、
Ｘは、シリカコア材料、金属酸化物コア材料、有機−無機ハイブリッドコア材料またはこれらのブロックポリマーの一群を含む表面を有するコア組成物であり；
Ｗは、水素またはヒドロキシルであり；および
Ｑは、不在であり、または分析物との静電相互作用、ファンデルワールス相互作用、水素結合性相互作用もしくは他の相互作用を最小にする官能基である。

【0073】

さらに、一定の実施形態において、ＷおよびＱは、コア組成物（Ｘ）のまたはコア組成物の表面の自由原子価を占有する。本発明の装置の他の実施形態において、ＷおよびＱは、表面組成物を形成するために選択される。他の実施形態では、ブロックポリマーまたはブロックポリマー群を形成するためにＸを選択することができる。

【0074】

本発明の態様において、固定相が粒状であるとき、粒状固定相材料の粒子は、０．４−３．０マイクロメートル、０．５−３．０；０．６−３．０；０．７−３．０；０．９−３．０または１．０−３．０マイクロメートルの平均粒径分布を有する直径を有し得る。

【0075】

本発明の装置の他の実施形態において、固定相材料はモノリスを含む。固定相材料が粒子を含む本発明の装置の実施形態において、固定相材料のモノリスは、０．４−３．０マイクロメートル、０．５−３．０；０．６−３．０；０．７−３．０；０．９−３．０または１．０−３．０マイクロメートルの平均粒径分布を有する粒子を充填した粒子層のクロマトグラフィー効率および透過率を示す。

【0076】

本発明の装置の他の実施形態において、固定相材料は、０．８から１．７ｃｍ^３／ｇ；０．９から１．６ｃｍ^３／ｇ；１．０から１．５ｃｍ^３／ｇ；または１．１から１．５ｃｍ^３／ｇの細孔容積を有する。

【0077】

固定相材料の一定の実施形態において、Ｘは、シリカ、酸化チタン、酸化アルミニウム、または脂肪族架橋シランを含む有機−無機ハイブリッドコアである。

【0078】

特定の実施形態において、Ｘは、脂肪族架橋シランを含む有機−無機ハイブリッドコアである。一定の他の特定の実施形態において、脂肪族架橋シランの脂肪族基はエチレンである。

【0079】

一定の他の実施形態において、コア材料（Ｘ）は、酸化セリウム、酸化ジルコニウムまたはセラミック材料である。一定の他の実施形態において、コア材料（Ｘ）は、クロマトグラフィー向上性細孔幾何形状（ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃａｌｌｙ ｅｎｈａｎｃｉｎｇ ｐｏｒｅ ｇｅｏｍｅｔｒｙ）（ＣＥＰＧ）を有し得る。ＣＥＰＧは、例えば当技術分野における他のクロマトグラフ媒体とは区別されるような、材料のクロマトグラフ分離能力を向上させることが分かっている幾何形状を含む。例えば、形状を形成、選択または構築することができ、ならびに様々な特性および／または因子を用いて、材料のクロマトグラフ分離能力が例えば当技術分野において公知のまたは従来用いられている幾何形状と比較して「向上された」かどうかを判定することができる。これらの因子の例としては、（例えば低減された帯域拡張および良好なピーク形状によって、証明されるような）高い分離効率、より長いカラム寿命および高い物質移動特性が挙げられる。当技術分野において認知されている技術を用いて、これらの特性を測定または観察することができる。例えば、本多孔質無機／有機ハイブリッド粒子のクロマトグラフィー向上性細孔幾何形状は、「インクボトル」または「シェル形」細孔幾何形状または形態（これらは両方とも、例えば物質移動速度を低減して効率低下をもたらすため、望ましくない。）の不在によって先行技術粒子とは区別される。クロマトグラフィー向上性細孔幾何形状は、ミクロ細孔の小集団しか含有しないハイブリッド材料に見出される。ミクロ細孔の小集団は、ハイブリッド材料において約＜３４Åの直径の全細孔が材料の比表面積の約１１０ｍ^２／ｇ未満を占めるときに達成される。このような低いミクロ細孔表面積（ＭＳＡ）を有するハイブリッド材料は、（例えば低減された帯域拡張および良好なピーク形状によって、証明されるような）高い分離効率および良好な物質移動特性をはじめとするクロマトグラフィー向上をもたらす。ミクロ細孔表面積（ＭＳＡ）は、ＢＪＨ法を用いて吸着等温線（ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ ｌｅｇ）から多点窒素吸着分析により判定して、３４Å以下の直径を有する細孔における表面積と定義される。本明細書で用いる場合、頭字語「ＭＳＡ」および「ＭＰＡ」を、「ミクロ細孔表面積」を示すために同義で用いる。

【0080】

一定の実施形態において、コア材料（Ｘ）は、式Ｚ_ａ（Ｒ’）_ｂＳｉ−Ｒ’’（式中、Ｚ＝Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｃ_１−Ｃ_５アルコキシ、ジアルキルアミノまたはトリフルオロメタンスルホナート；ａおよびｂは、それぞれ、０から３の整数であるが、但しａ＋ｂ＝３であることを条件とし；Ｒ’は、Ｃ_１−Ｃ_６直鎖、環式または分岐アルキル基であり、ならびにＲ’’は、官能化基である。）を有する表面修飾剤で表面修飾され得る。

【0081】

もう１つの実施形態において、コア材料（Ｘ）は、ポリマーでコーティングすることにより表面修飾され得る。

【0082】

一定の実施形態において、表面修飾剤は、オクチルトリクロロシラン、オクタデシルトリクロロシラン、オクチルジメチルクロロシランおよびオクタデシルジメチルクロロシランから成る群から選択される。一部の実施形態において、表面修飾剤は、オクチルトリクロロシランおよびオクタデシルトリクロロシランから成る群から選択される。他の実施形態において、表面修飾剤は、イソシアナートまたは１，１’−カルボニルジイミダゾール（特に、ハイブリッド基が（ＣＨ_２）_３ＯＨ基を含有するとき）から成る群から選択される。

【0083】

もう１つの実施形態において、材料は、有機基修飾とシラノール基修飾の併用により表面修飾されている。

【0084】

さらにもう１つの実施形態において、材料は、有機基修飾とポリマーでのコーティングの併用により表面修飾されている。さらなる実施形態において、前記有機基はキラル部分を含む。

【0085】

さらにもう１つの実施形態において、材料は、シラノール基修飾とポリマーでのコーティングの併用により表面修飾されている。

【0086】

他の実施形態において、材料は、材料上の有機基と修飾剤との間の有機共有結合の形成により表面修飾されている。

【0087】

さらに他の実施形態において、材料は、有機基修飾とシラノール基修飾とポリマーでのコーティングの併用により表面修飾されている。

【0088】

もう１つの実施形態において、材料は、シラノール基修飾により表面修飾されている。

【0089】

一定の実施形態において、表面修飾層は、多孔質であることがあり、または無孔であることがある。

【0090】

固定相材料の他の実施形態において、Ｑは、親水性基、疎水性基または不在である。

【0091】

固定相材料の一部の実施形態において、Ｑが親水性基である場合、Ｑは脂肪族基である。他の実施形態において、前記脂肪族基は脂肪族ジオールである。

【0092】

さらに他の実施形態において、Ｑは、式２

【0093】

【化3】

によって表され、式中、
ｎ^１は、０−３０の整数であり；
ｎ^２は、０−３０の整数であり；
Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３およびＲ^４の各存在は、水素、フルオロ、低級アルキル、保護もしくは脱保護アルコール、双性イオンまたは基Ｚを独立して表し；
Ｚは、
ａ）固定相材料の表面と式３：
（Ｂ^１）_ｘ（Ｒ^５）_ｙ（Ｒ^６）_ｚＳｉ−
式３：
（式中、
ｘは、１−３の整数であり、
ｙは、０−２の整数であり、
ｚは、０−２の整数であり、および
ｘ＋ｙ＋ｚ＝３であり、
Ｒ^５およびＲ^６の各存在は、メチル、エチル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、イソプロピル、テキシル、置換もしくは非置換アリール、環式アルキル、分岐アルキル、低級アルキル、保護もしくは脱保護アルコールまたは双性イオン基を独立して表し；
Ｂ^１は、−ＯＲ^７、−ＮＲ^７’Ｒ^７’’、−ＯＳＯ_２ＣＦ_３または−Ｃｌを表し、この場合のＲ^７、Ｒ^７’およびＲ^７’’のそれぞれは、水素、メチル、エチル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、イソプロピル、テキシル、フェニル、分岐アルキルまたは低級アルキルを表す。）；
の部分の間での共有もしくは非共有結合の形成により生成される表面連結基
ｂ）直接炭素−炭素結合形成による、またはヘテロ原子、エステル、エーテル、チオエーテル、アミン、アミド、イミド、尿素、カルボナート、カルバマート、複素環、トリアゾールもしくはウレタン結合によるＸの表面ハイブリッド基への直接的連結；または
ｃ）固定相材料の表面に共有結合で連結されていない吸着基；
ｄ）Ｗが水素であるとき、反応により固定相材料の表面とビニルもしくはアルキニル基の間に共有結合を形成することによって生成される表面連結基
を表し；
Ｙは、直接結合；ヘテロ原子結合；エステル結合；エーテル結合；チオエーテル結合；アミン結合；アミド結合；イミド結合；尿素結合；チオ尿素結合；カルボナート結合；カルバマート結合；複素環結合；トリアゾール結合；ウレタン結合；ジオール結合；ポリオール結合；スチレン、エチレングリコールもしくはプロピレングリコールのオリゴマー；スチレン、エチレングリコールもしくはプロピレングリコールのポリマー；炭水化物基、多分岐型炭水化物、デンドリマーもしくはデンドリグラフまたは双性イオン基を表し；および
Ａは、
ｉ．）親水性末端基；
ｉｉ．）水素、フルオロ、フルオロアルキル、低級アルキルもしくは基Ｚ；または
ｉｉｉ．）官能化可能な基
を表す。

【0094】

本発明の装置の一定の実施形態において、Ｑが式２の脂肪族ジオールである場合、ｎ^１は、２−１８または２−６の整数である。本発明の装置の他の実施形態において、Ｑが式２の脂肪族ジオールである場合、ｎ^２は、０−１８または０−６の整数である。本発明の装置のさらに他の実施形態において、Ｑが式２の脂肪族ジオールである場合、ｎ^１は２−１８の整数であり、およびｎ^２は０−１８の整数である；ｎ^１は２−６の整数であり、およびこの場合のｎ^２は０−１８の整数である；ｎ^１は２−１８の整数であり、およびｎ^２は０−６の整数である；またはｎ^１は２−６の整数であり、およびｎ^２は０−６の整数である。

【0095】

本発明の固定相材料のさらに他の実施形態において、Ｑが式２の脂肪族ジオールである場合、Ａは、ｉ）親水性末端基を表し、および親水性末端基は、保護または脱保護形のアルコール、ジオール、グリシジルエーテル、エポキシ、トリオール、ポリオール、ペンタエリスリトール、ペンタエリスリトールエトキシラート、１，３−ジオキサン−５，５−ジメタノール、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンポリグリコールエーテル、エチレングリコール、プロピレングリコール、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（プロピレングリコール）、一価、二価もしくは多価炭水化物基、多分岐型炭水化物、デンドリマー含有末梢親水性基、デンドリグラフ含有末梢親水性基、または双性イオン基である。

【0096】

本発明の固定相材料のさらに他の実施形態において、Ｑが式２の脂肪族ジオールである場合、Ａは、ｉｉ．）水素、フルオロ、メチル、エチル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、ｉ−プロピル、低級アルキルまたは基Ｚを表す。

【0097】

本発明の固定相材料のさらに他の実施形態において、Ｑが式２の脂肪族ジオールである場合、Ａは、ｉｉｉ．）官能化可能な基を表し、および官能化可能な基は、保護または脱保護形のアミン、アルコール、シラン、アルケン、チオオール、アジドまたはアルキンである。一部の実施形態において、前記官能化可能な基は、後続の反応段階において新たな表面基を生じさせることができ、反応段階は、カップリング、メタセシス、ラジカル付加、ヒドロシリル化、縮合、クリックまたは重合である。

【0098】

さらに他の実施形態において、基Ｑは表面修飾剤であり得る。これらの材料に利用することができる表面修飾剤の非限定的な例としては以下のものが挙げられる：
Ａ．）親水性表面修飾を生じさせる結果となるシラン

【0099】

【化4】

【0100】

【表1】

ここでＡは、次のものから選択される：

【0101】

【化5】

または
Ｂ．）疎水性表面修飾または親水性／疎水性混合型表面修飾を生じさせる結果となるシラン

【0102】

【化6】

【0103】

【表2】

ここでＡは、次のものから選択される：Ｈ、フェニル、ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨＲ^８、ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ^８、ＯＣ（Ｏ）ＮＨＲ^８、ＯＣ（Ｏ）ＯＲ^８またはトリアゾール−Ｒ^８（ここでのＲ^８は、オクタデシル、ドデシル、デシル、オクチル、ヘキシル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、フェニル、ベンジル、フェネチル、フェニルエチル、フェニルプロピル、ジフェニルエチル、ビフェニルである。）。

【0104】

本発明の装置の一定の実施形態において、Ｚは、表面有機官能性ハイブリッド基への直接炭素−炭素結合形成によるまたはヘテロ原子、エステル、エーテル、チオエーテル、アミン、アミド、イミド、尿素、カルボナート、カルバマート、複素環、トリアゾールもしくはウレア結合による連結を表す。

【0105】

他の実施形態において、Ｚは、材料の表面に共有結合で連結されていない吸着された表面基を表す。この表面基は、架橋ポリマーである場合があり、または他の吸着された表面基である場合がある。例としては、アルコール、アミン、チオール、ポリアミン、デンドリマー（ｄｅｄｒｉｍｅｒｓ）またはポリマーが挙げられるが、これらに限定されない。

【0106】

ハウジング、検出器および試料注入装置
本発明の装置の一部の実施形態において、ハウジングは、固定相材料を収容するために１つ以上のフリットを装備している。固定相材料がモノリスである実施形態では、１つ以上のフリットを含めずにハウジングを用いることができる。

【0107】

他の実施形態において、ハウジングは、装置を試料注入装置、検出器または両方と流体連通した状態に配置することができる１つ以上の取付具を装備している。

【0108】

サイズ排除クロマトグラフィーに使用される検出器の例は、限定ではないが、屈折率検出器、ＵＶ検出器、光散乱検出器および質量分析計である。

【0109】

注入装置の例としては、オン・カラム・インジェクタ、ＰＴＶインジェクタ、ガス採取弁、パージ・アンド・トラップ・システム、マルチインジェクタ、スプリットインジェクタ、スプリットレスインジェクタおよびスプリット／スプリットレスインジェクタが挙げられるが、これらに限定されない。

【0110】

サイズ排除クロマトグラフィーを行うための方法
もう１つの態様において、本発明は、サイズ排除クロマトグラフィーを行う方法を提供し、この方法は、
Ａ．）入口および出口を有するチャンバを画成する少なくとも１つの壁を有するハウジングと、前記チャンバ内に保持されたコアおよび表面組成物を含む固定相材料とを用意する段階であり、
前記固定相材料は、式１：
Ｗ−［Ｘ］−Ｑ
式１
によって表される、コア組成物と表面組成物とを有する、粒子を含み
式中、
Ｘは、シリカコア材料、金属酸化物コア材料、有機−無機ハイブリッドコア材料またはこれらのブロックポリマーの一群を含む表面を有するコア組成物であり；
Ｗは、水素またはヒドロキシルであり；および
Ｑは、不在であり、または分析物との静電相互作用、ファンデルワールス相互作用、水素結合性相互作用もしくは他の相互作用を最小にする官能基である
段階、
Ｂ．）前記チャンバに試料を１，０００ｐｓｉより大きいカラム入口圧で負荷して、固定相媒体を通して試料を流す段階；および
Ｃ．）試料をサイズによって１つ以上の組成物に分離する段階
を含む。

【0111】

本発明の方法の一定の実施形態において、カラム入口圧は、２，０００ｐｓｉより大きい；３，０００ｐｓｉより大きい；４，０００ｐｓｉより大きい；５，０００ｐｓｉより大きい；６，０００ｐｓｉより大きい；７，０００ｐｓｉより大きい；８，０００ｐｓｉより大きい；９，０００ｐｓｉより大きい；１０，０００ｐｓｉより大きい；１５，０００ｐｓｉより大きい；または２０，０００ｐｓｉより。さらに他の実施形態において、カラム入口圧は、約１，０００ｐｓｉから約２０，０００ｐｓｉ；約５，０００ｐｓｉから約２０，０００ｐｓｉ；約７，０００ｐｓｉから約２０，０００ｐｓｉ；約１０，０００ｐｓｉから約２０，０００ｐｓｉ；約１，０００ｐｓｉから約１５，０００ｐｓｉ；または約５，０００ｐｓｉから約１５，０００ｐｓｉである。

【0112】

本発明の方法のもう１つの実施形態において、方法は、
Ｄ．）１つ以上の組成物を単離する段階
をさらに含む。

【0113】

本発明の方法のさらにもう１つの実施形態において、方法は、
Ｅ．）１つ以上の組成物を検出する段階
をさらに含む。

【0114】

本発明の方法のさらにもう１つの実施形態において、方法は、
Ｄ．）１つ以上の組成物を単離する段階；および
Ｅ．）１つ以上の組成物を検出する段階
をさらに含む。

【0115】

本発明の方法の一定の実施形態において、試料はバイオポリマーである。試料がバイオポリマーである実施形態において、Ｑは親水性である。一部の実施形態において、Ｑは脂肪族基である。他の実施形態において、前記脂肪族基は脂肪族ジオールである。さらに他の実施形態において、Ｑは、式２

【0116】

【化7】

によって表され、式中、
ｎ^１は、０−３０の整数であり；
ｎ^２は、０−３０の整数であり；
Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３およびＲ^４の各存在は、水素、フルオロ、低級アルキル、保護もしくは脱保護アルコール、双性イオンまたは基Ｚを独立して表し；
Ｚは、
ａ）固定相材料の表面と式３：
（Ｂ^１）_ｘ（Ｒ^５）_ｙ（Ｒ^６）_ｚＳｉ−
式３：
（式中、
ｘは、１−３の整数であり、
ｙは、０−２の整数であり、
ｚは、０−２の整数であり、および
ｘ＋ｙ＋ｚ＝３であり、
Ｒ^５およびＲ^６の各存在は、メチル、エチル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、イソプロピル、テキシル、置換もしくは非置換アリール、環式アルキル、分岐アルキル、低級アルキル、保護もしくは脱保護アルコールまたは双性イオン基を独立して表し；
Ｂ^１は、−ＯＲ^７、−ＮＲ^７’Ｒ^７’’、−ＯＳＯ_２ＣＦ_３または−Ｃｌを表し、この場合のＲ^７、Ｒ^７’およびＲ^７’’のそれぞれは、水素、メチル、エチル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、イソプロピル、テキシル、フェニル、分岐アルキルまたは低級アルキルを表す。）；
の部分の間での共有もしくは非共有結合の形成により生成される表面連結基
ｂ）直接炭素−炭素結合形成による、またはヘテロ原子、エステル、エーテル、チオエーテル、アミン、アミド、イミド、尿素、カルボナート、カルバマート、複素環、トリアゾールもしくはウレタン結合によるＸの表面ハイブリッド基への直接的連結；または
ｃ）固定相材料の表面に共有結合で連結されていない吸着基；
ｄ）Ｗが水素であるとき、反応により固定相材料の表面とビニルもしくはアルキニル基の間に共有結合を形成することによって生成される表面連結基
を表し；
Ｙは、直接結合；ヘテロ原子結合；エステル結合；エーテル結合；チオエーテル結合；アミン結合；アミド結合；イミド結合；尿素結合；チオ尿素結合；カルボナート結合；カルバマート結合；複素環結合；トリアゾール結合；ウレタン結合；ジオール結合；ポリオール結合；スチレン、エチレングリコールもしくはプロピレングリコールのオリゴマー；スチレン、エチレングリコールもしくはプロピレングリコールのポリマー；炭水化物基、多分岐型炭水化物、デンドリマーもしくはデンドリグラフまたは双性イオン基を表し；および
Ａは、
ｉ．）親水性末端基；
ｉｉ．）水素、フルオロ、メチル、エチル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、ｉ−プロピル、低級アルキルもしくは基Ｚ；または
ｉｉｉ．）官能化可能な基
を表す。

【0117】

本発明の他の実施形態において、試料は合成有機ポリマーである。試料が合成有機ポリマーである実施形態において、Ｑは疎水性部分であり得る。

【0118】

もう１つの態様において、本発明は、サイズ排除クロマトグラフィー排除クロマトグラフィー中に光散乱検出器によって得られるノイズの発生率を低減する方法を提供し、この方法は、
Ａ．）入口および出口を有するチャンバを画成する少なくとも１つの壁を有するハウジングと、前記チャンバ内に保持されたコアおよび表面組成物を含む固定相材料とを用意する段階であり、
前記固定相材料は、式１：
Ｗ−［Ｘ］−Ｑ
式１
によって表される粒子またはモノリスを含み
式中、
Ｘは、シリカコア材料、金属酸化物コア材料、有機−無機ハイブリッドコア材料またはこれらのブロックポリマーの一群を含む表面を有するコア組成物であり；
Ｗは、水素またはヒドロキシルであり；および
Ｑは、不在であり、または分析物との静電相互作用、ファンデルワールス相互作用、水素結合性相互作用もしくは他の相互作用を最小にする官能基である
段階、
Ｂ．）前記チャンバ内の前記固定相材料に試料を１，０００ｐｓｉより大きいカラム入口圧で負荷し、固定相媒体を通して試料を流す段階；
Ｃ．）試料をサイズによって１つ以上の組成物に分離する段階；および
Ｄ．）光散乱検出器を使用して１つ以上の組成物を検出する段階
を含む。

【0119】

さらにもう１つの態様において、本発明は、サイズ排除クロマトグラフィー排除クロマトグラフィー中に光散乱検出器によって得られるゴーストピークの発生率を低減する方法を提供し、この方法は、
Ａ．）入口および出口を有するチャンバを画成する少なくとも１つの壁を有するハウジングと、前記チャンバ内に保持されたコアおよび表面組成物を含む固定相材料とを用意する段階であり、
前記固定相材料は、式１：
Ｗ−［Ｘ］−Ｑ
式１
によって表される粒子またはモノリスを含み
式中、
Ｘは、シリカコア材料、金属酸化物コア材料、有機−無機ハイブリッドコア材料またはこれらのブロックポリマーの一群を含む表面を有するコア組成物であり；
Ｗは、水素またはヒドロキシルであり；および
Ｑは、不在であり、または分析物との静電相互作用、ファンデルワールス相互作用、水素結合性相互作用もしくは他の相互作用を最小にする官能基である
段階、
Ｂ．）前記チャンバ内の前記固定相材料に試料を１，０００ｐｓｉより大きいカラム入口圧で負荷し、固定相媒体を通して試料を流す段階；
Ｃ．）前記試料をサイズによって１つ以上の組成物に分離する段階；および
Ｄ．）光散乱検出器を使用して前記１つ以上の組成物を検出する段階
を含む。

【0120】

特定の実施形態において、ノイズまたはゴーストピークの低減は、標準的な従来のＳＥＣカラムを使用して測定される。他の実施形態において、ノイズまたはゴーストピークの低減は、標準的な従来のＳＥＣカラムを使用してカラムを予洗せずに測定される。いずれにせよ、ノイズまたはゴーストピークの低減は、通常の当業者に公知であるだろうように、実質的に等価の条件（温度、入口圧、カラム寸法など）下で共通の試料を使用して測定される。

【0121】

本発明のこれらおよび他の特徴および利点は、下に記載する図面を見ることおよび後続の詳細な説明を読むことにより、当業者にははっきりと理解できるであろう。

【実施例】

【0122】

クロマトグラフィー装置および方法を説明する以下の非限定的実施例により、本発明をさらに例証することができる。

【0123】

材料
すべての試薬は、別の注記がない限り、受け取ったままで使用した。下記の供給物および供給業者と等価のものが存在することおよび従って下に列挙する供給業者を限定と解釈すべきでないことは、当業者には認識されよう。

【0124】

物性評価
下記の計器および供給業者と等価のものが存在することおよび従って下に列挙する計器を限定と解釈すべきでないことは、当業者には認識されよう。

【0125】

％Ｃ値は、燃焼分析（ＣＥ−４４０ Ｅｌｅｍｅｎｔａｌ Ａｎａｌｙｚｅｒ；マサチューセッツ州ノース・チェルムズフォードのＥｘｅｔｅｒ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｉｎｃ．）によってまたはＣｏｕｌｏｍｅｔｒｉｃ Ｃａｒｂｏｎ Ａｎａｌｙｚｅｒ（モジュールＣＭ５３００、ＣＭ５０１４、イリノイ州ジョリエットのＵＩＣ Ｉｎｃ．）によって測定した。臭素および塩素含有量は、フラスコ燃焼、続いてのイオンクロマトグラフィー（ジョージア州ノルクロスのＡｔｌａｎｔｉｃ Ｍｉｃｒｏｌａｂ）によって決定した。これらの材料の比表面積（ＳＳＡ）、比細孔容積（ＳＰＶ）および平均細孔直径（ＡＰＤ）は、多点Ｎ_２吸着法（Ｍｉｃｒｏｍｅｒｉｔｉｃｓ ＡＳＡＰ２４００；ジョージア州ノルクロスのＭｉｃｒｏｍｅｒｉｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｃ．）を用いて測定した。ＳＳＡはＢＥＴ法を用いて算出し、ＳＰＶはＰ／Ｐ_０＞０．９８について決定した一点値であり、およびＡＰＤは、ＢＪＨ法を用いて脱着等温線から算出した。ミクロ細孔表面積（ＭＳＡ）は、比表面積（ＳＳＡ）から＜３４Åの細孔についての累積吸着細孔直径データを引いたものとして決定した。メジアンメソ細孔直径（ＭＭＰＤ）およびメソ細孔の細孔容積（ＭＰＶ）はＭｅｒｃｕｒｙ Ｐｏｒｏｓｉｍｅｔｒｙ（Ｍｉｃｒｏｍｅｒｉｔｉｃｓ ＡｕｔｏＰｏｒｅ ＩＩ ９２２０またはＡｕｔｏＰｏｒｅ ＩＶ、ジョージア州ノルクロスのＭｉｃｒｏｍｅｒｉｔｉｃｓ）によって測定した。骨格密度は、Ｍｉｃｒｏｍｅｒｉｔｉｃｓ ＡｃｃｕＰｙｃ １３３０ Ｈｅｌｉｕｍ Ｐｙｃｎｏｍｅｔｅｒ（Ｖ２．０４Ｎ、ジョージア州ノルクロス）を使用して測定した。粒径は、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｍｕｌｔｉｓｉｚｅｒ ３分析器（３０μｍ アパーチャ、７０，０００ カウント；フロリダ州マイアミ）を使用して測定した。粒子直径（ｄｐ_５０）は、容積に基づく粒径分布の５０％累積直径として測定した。分布の幅は、９０％累積容積直径を１０％累積容積直径で割ったものとして測定した（９０／１０比を意味する。）。これらの材料についての粘度を、Ｂｒｏｏｋｆｉｅｌｄデジタル粘度計Ｍｏｄｅｌ ＤＶ−ＩＩ（マサチューセッツ州ミドルバラ）を使用して決定した。ｐＨの測定は、Ｏａｋｔｏｎ ｐＨ１００ Ｓｅｒｉｅｓ ｍｅｔｅｒ（Ｃｏｌｅ−Ｐａｌｍｅｒ、イリノイ州ヴァーノン・ヒルズ）によって行い、使用直前に周囲温度でＯｒｉｏｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ、マサチューセッツ州ベヴァリー）ｐＨ緩衝標準物質を用いて較正した。滴定は、Ｍｅｔｒｏｈｍ ７１６ ＤＭＳ Ｔｉｔｒｉｎｏ自動滴定装置（スイス、ＨｅｒｓａｕのＭｅｔｒｏｈｍ）を使用して実施した。１グラム当たりのミリ当量（ｍｅｑｕｉｖ／ｇ）として報告する。多核（^１３Ｃ、^２９Ｓｉ）ＣＰ−ＭＡＳ ＮＭＲスペクトルは、Ｂｒｕｋｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ａｖａｎｃｅ−３００スペクトル分光計（７ｍｍ 二重広帯域プローブ）を使用して得た。スピン速度は、一般に、５．０−６．５ｋＨｚであり、待ち時間は５秒であり、交差分極接触時間は６ミリ秒であった。報告された^１３Ｃおよび^２９Ｓｉ ＣＰ−ＭＡＳ ＮＭＲスペクトルシフトは、外標準アダマンタン（^１３Ｃ ＣＰ−ＭＡＳ ＮＭＲ、□３８．５５）およびヘキサメチルシクロトリシロキサン（^２９Ｓｉ ＣＰ−ＭＡＳ ＮＭＲ、□−９．６２）を使用してテトラメチルシランと比べて記録した。異なるケイ素環境の集団を、ＤＭＦｉｔソフトウェアを使用してスペクトルデコンボリューションにより評価した［Ｍａｓｓｉｏｔ，Ｄ．；Ｆａｙｏｎ，Ｆ．；Ｃａｐｒｏｎ，Ｍ．；Ｋｉｎｇ，Ｉ．；Ｌｅ Ｃａｌｖｅ，Ｓ．；Ａｌｏｎｓｏ，Ｂ．；Ｄｕｒａｎｄ，Ｊ．−Ｏ．；Ｂｕｊｏｌｉ，Ｂ．；Ｇａｎ，Ｚ．；Ｈｏａｔｓｏｎ，Ｇ．Ｍａｇｎ．Ｒｅｓｏｎ．Ｃｈｅｍ．２００２，４０，７０−７６］。

【0126】

［実施例１］
Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００（Ｘ１００、ミシガン州ミッドランドのＤｏｗ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）と脱イオン水とエタノール（ＥｔＯＨ；無水、ニュージャージー州フィリップスバーグのＪ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ）の水性混合物を５５℃で０．５時間加熱した。別のフラスコの中で、ＵＳ ６，６８６，０３５ Ｂ２からの実施例１ｈに詳述されているとおりに調製したＰＯＳを０．５時間、トルエン（Ｔｏｌ；ＨＰＬＣグレード；ニュージャージー州フィリップスバーグのＪ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ）と混合することにより、油相溶液を調製した。急速攪拌しながらこの油相溶液をＥｔＯＨ／水／Ｘ１００混合物に添加し、ロータ／スタータミキサー（モデル１００Ｌ、ニューヨーク州ホーポージのＣｈａｒｌｅｓ Ｒｏｓｓ ＆ Ｓｏｎ Ｃｏ．）を使用して水性相に乳化させた。その後、このエマルジョンに３０％水酸化アンモニウム（ＮＨ_４ＯＨ；ニュージャージー州フィリップスバーグのＪ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ）を添加した。溶液に懸濁させて、ゲル化した生成物をフラスコに移し、５５℃で１８時間攪拌した。結果として生じた、式｛（Ｏ_１．５ＳｉＣＨ_２ＣＨ_２ＳｉＯ_１．５）（ＳｉＯ_２）_４｝の球形多孔質ハイブリッド無機／有機粒子を、０．５μｍ濾紙で回収し、水およびメタノール（ＨＰＬＣグレード；ニュージャージー州フィリップスバーグのＪ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ）で順次洗浄した。その後、生成物を真空オーブンにおいて８０℃で一晩乾燥させた。これらの生成物を調製するために使用した出発原料の具体的な量を表３に列挙する。これらの材料の％Ｃ値、非表面積（ＳＳＡ）、比細孔容積（ＳＰＶ）および平均細孔直径（ＡＰＤ）を表１に列挙する。このアプローチによって調製した生成物は、ＳＥＭにより確認したところ、高球形易流動性粒子であった。

【0127】

トルエン／ＰＯＳの質量比の増加は、１．０７から１．６８ｃｍ^３／ｇへのＳＰＶの増加を生じさせた。粒子多孔度増加の必要性は、ＳＥＣ分離分野では周知である。

【0128】

【表3】

【0129】

［実施例２］
実施例１において調製した生成物の球形態およびＳＰＶは多くの高品質ＳＥＣ充填材料に匹敵するが、これらの生成物の大部分についてのＡＰＤは、より大きな分子（例えば１００−４５０Å）の分離のために設計された大部分の商用充填材料より小さい。より大きな分子のＳＥＣのためにより有用なＳＥＣ範囲内でＡＰＤを増加させるために、この実施例ではこれらの材料に対する熱水処理の使用の開発を例証する。

【0130】

実施例１の多孔質粒子を分粒して、１．５−３．０マイクロメートルの粒径分布を生じさせた。任意の数の周知分粒技術を用いることができる。このような分粒技術は、例えば、Ｗ．Ｇｅｒｈａｒｔｚ，ｅｔ ａｌ．（ｅｄｉｔｏｒｓ）Ｕｌｌｍａｎｎ’ｓ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，５^ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｖｏｌｕｍｅ Ｂ２：Ｕｎｉｔ Ｏｐｅｒａｔｉｏｎｓ Ｉ，ＶＣＨ Ｖｅｒｌａｇｓｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｉｔ ｍｂＨ，（Ｗｅｉｎｈｅｉｍ ，Ｆｅｄ．Ｒｅｐ．Ｇｅｒｍ．１９８８）に記載されている。これらの粒子をトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ＴＲＩＳ；ウィスコンシン州ミルウォーキーのＡｌｄｒｉｃｈ）またはトリエチルアミン（ＴＥＡ；ウィスコンシン州ミルウォーキーのＡｌｄｒｉｃｈ）のいずれかの水溶液と混合してスラリーを得た。スラリーのｐＨを必要に応じて希酢酸の添加により調整した。その後、得られた懸濁液をステンレス鋼オートクレーブに移し、２０−４１時間、１２０−１５５℃の間に加熱した。反応２ａおよび２ｃはガラス器具で行った。オートクレーブが室温に冷却した後、生成物を０．５μｍ濾紙で単離し、水およびメタノール（ＨＰＬＣグレード；ニュージャージー州フィリップスバーグのＪ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ）を使用して繰り返し洗浄し、その後、８０℃、真空下で２０時間乾燥させた。具体的な熱水条件を表２に列挙する（塩基溶液ｍＬ／粒子グラム、最初の塩基溶液の濃度およびｐＨ、反応温度ならびに反応保持時間）。これらの材料の比表面積（ＳＳＡ）、比細孔容積（ＳＰＶ）、平均細孔直径（ＡＰＤ）、ミクロ細孔表面積（ＭＳＡ）および％Ｃを表２に列挙する。

【0131】

【表4】

【0132】

［実施例３］
実施例２に従って調製した多孔質粒子を２０時間、９８℃で１モルの塩酸溶液（ウィスコンシン州ミルウォーキーのＡｌｄｒｉｃｈ）に分散させた。酸処理が完了した後、粒子を水で洗浄して中性ｐＨにし、その後、アセトン（ＨＰＬＣグレード；ニュージャージー州フィリップスバーグのＪ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ）で洗浄した。アセトンでの沈降分離により粒子をさらに処理してサブミクロンの微粉を除去した。その後、粒子を８０℃、真空下で１６時間乾燥させた。これらの材料についての具体的な特性付けデータを表３に列挙する。

【0133】

【表5】

【0134】

［実施例４］
実施例２に従って調製した多孔質粒子を、７０℃で６０分間予混した２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５；酢酸および酢酸ナトリウム、Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒを使用した調製したもの）中のグリシドキシプロピルトリメトキシシラン（ＧＬＹＭＯ、ウィスコンシン州ミルウォーキーのＡｌｄｒｉｃｈ）の溶液に、分散させた。この混合物を７０℃で２０時間保持した。その後、反応物を冷却し、生成物を濾過し、水およびメタノール（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ）で順次洗浄した。その後、生成物を８０℃、減圧下で１６時間乾燥させた。反応データを表４に列挙する。元素分析により測定した表面修飾前と後の粒子％Ｃの差によって５．７２−６．０９μｍｏｌ／ｍ^２の表面被覆率を決定した。^１３Ｃ ＣＰ−ＭＡＳ ＮＭＲ分光法によるこれらの材料の分析は、エポキシ基とジオール基の混合物がこれらの材料には存在することを示す。

【0135】

【表6】

【0136】

［実施例５］
実施例２に従って調製した多孔質粒子を、７０℃で６０分間予混した酢酸緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ５．５、希釈度５ｍＬ／ｇ；酢酸および酢酸ナトリウム、Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒを使用した調製したもの）中のグリシドキシプロピルトリメトキシシラン（ＧＬＹＭＯ、ウィスコンシン州ミルウォーキーのＡｌｄｒｉｃｈ）の溶液に、分散させた。反応５ｅには６０ｍＭ緩衝溶液を使用した。混合物を７０℃で２０時間保持した。その後、反応物を冷却し、生成物を濾過し、水およびメタノール（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ）で順次洗浄した。その後、この材料を０．１Ｍ酢酸溶液（希釈度５ｍＬ／ｇ；Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ）中、７０℃で２０時間、還流させた。生成物５ｑ−５ｓは２時間、還流させた。その後、反応物を冷却し、生成物を濾過し、水およびメタノール（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ）で順次洗浄した。その後、生成物を８０℃、減圧下で１６時間乾燥させた。反応データを表５に列挙する。元素分析により測定した表面修飾前と後の粒子％Ｃの差によって０．５５−７．０５μｍｏｌ／ｍ^２の表面被覆率を決定した。^１３Ｃ ＣＰ−ＭＡＳ ＮＭＲ分光法によるこれらの材料の分析は、生成物５ａ−５ｐには測定可能な量のエポキシ基は存在せず、これらの材料にはジオール基のみが存在したことを示す。生成物５ｑ−５ｓには少量のエポキシ基が存在した。生成物５ｑ−５ｓについては酢酸加水分解段階を繰り返し、２０時間保持した。これらの反応の生成物は、同等の表面被覆率を有し、および^１３Ｃ ＣＰ−ＭＡＳ ＮＭＲ分光法により、残存する測定可能な量のエポキシ基を有さなかった。生成物５ａには、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０、希釈度１０ｍＬ／ｇ）中、７０℃で２時間加熱することによるさらなる処理を施した。得られた材料は、生成物５ａと同等の表面被覆率を有した。

【0137】

【表7】

【0138】

［実施例６］
多孔質シリカまたはハイブリッド粒子をトルエン（１７５ｍＬ、ニュージャージー州フェアローンのＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で１時間、還流させた。ディーン・スターク・トラップを使用して混合物から微量の水を除去した。冷却したら、イミダゾール（ウィスコンシン州ミルウォーキーのＡｌｄｒｉｃｈ）および１つ以上の修飾剤を添加した。その後、反応物を１６−１８時間、加熱して還流させた。その後、反応物を冷却し、生成物を濾過し、トルエン、水およびアセトン（すべてＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃからの溶剤）で順次洗浄した。この材料をアセトン／０．１２Ｍ酢酸アンモニウム水溶液（ミズーリ州セントルイスのＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）中で２時間さらに還流させた。反応物を冷却し、生成物を水およびアセトン（すべてＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃからの溶剤）で順次洗浄した。生成物を７０℃、減圧下で１６時間乾燥させた。元素分析を用いて表面修飾前と後の粒子％Ｃの差により表面被覆率を決定した。生成物を同様の条件下でトリメチルクロロシラン、トリメチルクロロシラン、トリ−ｎ−ブチルクロロシラン、トリ−ｉ−プロピルクロロシラン、ｔ−ブチルジメチルクロロシランまたはヘキサメチルジシラザンと反応させて、表面シラノール基をさらに反応させた。

【0139】

この一般アプローチを様々な異なる多孔質材料に適用することができる。この様々な材料には、シリカまたはハイブリッド無機／有機材料である球形、顆粒および不規則材料が含まれる。球形、顆粒および不規則材料についての粒径は、０．４−３．０μｍ；または１−３μｍと様々であり得る。これらの材料についてのＡＰＤは、５０から２，０００Å；または９０から１０００Å；または１２０から４５０Åと様々であり得る。これらの材料についてのＴＰＶは、０．５から１．７ｃｍ^３／ｇ；または１．０から１．５ｃｍ^３／ｇ；または１．１から１．４ｃｍ^３／ｇと様々であり得る。

【0140】

これらの反応に使用した表面修飾剤は、本明細書に記載するとおりの式２を有するシランを含む。

【0141】

［実施例７ａ］
実施例５における試験材料５ｇからの多孔質粒子の試料をタンパク質の混合物の分離に使用した。スラリー充填技術を用いて４．６×１５０ｍｍクロマトグラフカラムに充填した。クロマトグラフシステムは、ＡＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ（登録商標）ＳｙｓｔｅｍおよびＡＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ（登録商標）Ｔｕｎａｂｌｅ ＵＶ検出器から成った。Ｅｍｐｏｗｅｒ ２ Ｃｈｒｏｍａｔｇｒａｐｈｙ Ｄａｔａ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｂｕｉｌｄ ２１５４）をデータ収集および分析に使用した。移動相条件は、１００ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ６．８；流速：０．３０ｍＬ／分；温度：３０℃；検出：２８０ｎｍ；分析物：サイログロブリン、ＩｇＧ、ウシ血清アルブミン、ミオグロビンおよび尿素であった。結果を図２に示す。

【0142】

［実施例７ｂ］
Ｃ１８修飾表面の含有からの多孔質粒子の試料をポリスチレン標準物質の混合物の分離に使用した。スラリー充填技術を用いて４．６×１５０ｍｍクロマトグラフカラムに充填した。クロマトグラフシステムは、ＡＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ（登録商標）ＳｙｓｔｅｍおよびＡＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ（登録商標）Ｔｕｎａｂｌｅ ＵＶ検出器から成った。Ｅｍｐｏｗｅｒ ２ Ｃｈｒｏｍａｔｇｒａｐｈｙ Ｄａｔａ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｂｕｉｌｄ ２１５４）をデータ収集および分析に使用した。移動相はテトラヒドロフランから成った。流速は０．３０ｍＬ／分であった；温度：３０℃；検出２６０ｎｍ；分析物：分子量が５００Ｄａから２，０００，０００Ｄａの範囲にわたるポリスチレン標準物質。

【0143】

［実施例８］
本明細書に記載するクロマトグラフ媒体は、ＵＰＬＣ用途のための１．７マイクロメートル粒子について必要な機械的強度要件を維持することを示した。同様に、ＢＥＨ粒子に関しての、従来のシリカと比較して低減されたシラノール酸性度は、荷電分析物についての二次的相互作用を減少させる結果となる。

【0144】

図１４は、塩基性タンパク質リゾチームの保持に対するイオン強度の効果を示す。低塩の場合、固定相表面の負電荷を有するシラノールと正電荷を有するリゾチームとの間の静電相互作用は最大である。移動相のイオン強度を増加させると、分析物と固定相の間の静電相互作用は弱くなってくる。この図は、シリカから製造されたＳＥＣジオール材料の場合、ＢＥＨから製造された材料よりシラノール相互作用が有意に大きいことを示している。

【0145】

［実施例９］
この実施例では、クロマトグラフ分解能に対する粒径、細孔容積および細孔径分布の効果、ならびにＳＥＣ性能に対する温度の効果を考察する。モノクローナル抗体単量体の凝集体からの分離を含む、サイズに基づく分離の例を与える。

【0146】

材料の特性
異なる総細孔容積、平均細孔径、表面積および平均粒径を有する固定相粒子を合成した。低いタンパク質結合を示す安定した化学的表面を生じさせるためにすべての材料にジオールを結合させた。

【0147】

【表8】

【0148】

効率に対する粒径および細孔直径の効果
２マイクロメートル粒子および超高速液体クロマトグラフィー計器装備の導入は、逆相クロマトグラフィーについて従来のＨＰＬＣ分離と比較してクロマトグラフィー効率および処理量の有意な向上をもたらした。しかし、今日まで、同様の利点はサイズ排除クロマトグラフィーなどの他のクロマトグラフィーモードについて実証されていない。Ｈｅｌｄらによる最近の発表は、このような利点は２マイクロメートルより小さい粒子を充填したＳＥＣ用カラムでは達成できないと述べている。（Ｄ Ｈｅｌｄ，Ｇ Ｒｅｉｎｈｏｌｄ ａｎｄ Ｐ Ｋｉｌｚ，「Ｕ−ＧＰＣ？ Ｍａｋｉｎｇ ＧＰＣ／ＳＥＣ Ｆａｓｔｅｒ」，Ｔｈｅ Ｃｏｌｕｍｎ（Ａｐｒｉｌ ６，２０１０）１０−１４）

【0149】

ある範囲の孔径および粒径の粒子を充填したカラムでの様々なタンパク質のクロマトグラフ分離に対する流速の効果を評価した。保持時間およびピーク幅データをシステム効果について先ず補正した。（５０％ピーク高で測定した）隙間線速に対する段高さのプロットを図３および４に示す。結果は、２．６μｍ粒子と比較して１．７μｍ粒子を有するカラムについて有意に向上した性能を示す。タンパク質については、用いた流速が拡散限界領域より有意に高かったので、データは線形方程式、Ｈ＝Ａ＋Ｃ・ｕに適合しなかった。理論では、ＡおよびＣ項が１／ｄ_ｐおよび１／ｄ_ｐ^２にそれぞれ比例すると予測される。実験データは、この予想によく適合する。孔径が流速の関数としてクロマトグラフィー性能に対して制限された影響力を有することも観察された。

【0150】

【表9】

【0151】

【表10】

【0152】

選択性に対する細孔容積の効果
表６に示すように、総細孔容積が０．６８−１．６３ｃｍ^３／ｇと様々である材料Ａ−Ｉを充填したカラムについてタンパク質の保持時間を判定した。ｌｏｇ ＭＷに対する保持容積のプロットを材料それぞれについてプロットした（図５）。各曲線の（代表線形領域における）勾配を各カラムについて決定した。図６は、勾配に対する細孔容積のプロットを示す。

【0153】

分かるように、良好な相関がこれら２因子間で観察される。

【0154】

Ｍａｂ単量体／凝集体分離
モノクローナル抗体単量体と二量体の分解能に対する流速の効果を、プロトタイプ「Ｋ」を充填したカラム、４．６×１５０ｍｍおよび比較カラム「Ｌ」、４．６×３００ｍｍカラムについて比較した。前のほうのカラム（プロトタイプ「Ｋ」充填カラム）のより短いカラム長にもかかわらず、同一の流速で動作したときに２つのカラムについて同等の分解能が見出された。プロトタイプ「Ｋ」を充填したカラム内のより小さい粒子は、必要な分解能を依然として達成しながら、より速い流速での動作を可能にすることによって、よりいっそう短い実行時間に備えたものであった。

【0155】

図７および８は、モノクローナル抗体単量体と二量体の分離に対する流速の効果を示す。

【0156】

図９および１０は、段高さに対するおよびモノクローナル抗体単量体と二量体の分離についての分解能に対する流速の効果を示す。

【0157】

温度の影響
クロマトグラフ分離に対する温度の影響を式：
ｌｎ ｋ＝ΔＨ．／ＲＴ−ΔＳ．／Ｒ＋ｌｎ（φ）
（式中、ΔＨ°およびΔＳ°は、それぞれの標準エンタルピーおよびエントロピーであり、Ｒはモル気体定数であり、Ｔは絶対温度であり、ならびにφはカラムの相比である。）によって熱力学的に決定する。

【0158】

吸着クロマトグラフィーでは、エントロピー項を通常は無視することができ、エンタルピー項に関しても無視できる。しかし、ＳＥＣモードでは、逆が真である。従って、ＳＥＣなどのエントロピー駆動型分離では、保持は、本来、温度から独立していなければならない。しかし、クロマトグラフィー材料は、表面にイオン性または他の官能基を有することがあり、これらの官能基は結合を誘導し得る。理想的には、固定相およびクロマトグラフィー条件を、吸着相互作用を防止するように最適化する。

【0159】

異なる温度での保持を調査することにより、吸着が発生するかどうかについての情報が得られる。保持の温度誘導変化、例えば配座の変化または水和層の変化に寄与し得る他の要因も考えられる。

【0160】

図１１に示すクロマトグラムは、タンパク質試験ミックス（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｅｓｔ Ｍｉｘ）の保持に対する温度の効果を示すものである。上のクロマトグラムは、プロトタイプ「Ｋ」を充填したカラムを使用して得たが、下のクロマトグラムは、比較カラム「Ｌ」からのものであった。後者（比較カラム「Ｌ」）の場合のほうが有意に大きい保持変化が観察された。この観察結果は、タンパク質と相互作用し得るおよびタンパク質を吸着し得る、固定相のシラノールのより大きい酸性度に帰する。

【0161】

両方の場合にウラシル保持が温度による影響を受けたことに留意すること。理論による制限を受けないが、このことはＨ結合相互作用のためであると考えられる。

【0162】

塩の影響
移動相への異なる塩添加物の効果を探査した。保持とピーク形状の両方が塩タイプによる影響を受けることが判明した。

【0163】

クロマトグラムを、アニオンおよびカチオンについてのホフマイスター系列の順序：
ＳＯ_４^２−＞ＰＯ_４^２−＞ＯＣＡ⁻＞Ｃｌ⁻＞ＣｌＯ_４⁻
に従って、図１２および１３に示す。一般に、ホフマイスター系列に従って保持の減少が観察されたが、塩化ナトリウムは注目に値する例外であった。この場合、保持は他の分析物でより長かった。加えて、ピークが有意に広かった。

【0164】

［実施例１０］
ノイズ低減、カラムブリードおよびゴーストピークに対する効果
ＳＥＣカラムが使用中に粒子を放出することは公知である。ＭＡＬＳ検出器は、これらの粒子に対して高感度である。この研究では、「カラムブリード」をベースラインノイズの発生率を増加させる結果となる粒子のランダムな放出と定義する。ＬＣカラムへの注入を行ったときにも粒子放出が発生する場合がある。この結果が、排除マーカーの保持時間で溶出する広い「ゴーストピーク」である。ゴーストピークは、排除ウィンドウ付近で溶出する分析物の定量を妨げる。ゴーストピークの原因は、カラムを通り抜けて検出器に進む粒子のバンドを生じさせる、注入中に発生する圧力衝撃からの結果であると考えられる。カラム製造業者は、カラムブリードおよびゴーストピークを低減するために使用前にカラムを十分に洗浄することを提唱している。

【0165】

実験：
ＬＣシステム：Ｗａｔｅｒｓ ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ（登録商標）Ｈ−Ｃｌａｓｓ Ｂｉｏ
移動相：１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．８
温度：周囲温度
流速：０．２−０．５ｍＬ／分
試料：ＢＳＡ ３ｍｇ／ｍＬ
注入容積：１０μＬ
カラム平衡：０．２ｍＬ／分で２０分
検出器１：Ｗａｔｅｒｓ ＡＣＱＵＩＴＹ ＰＤＡ、２８０ｎｍ
検出器２：Ｗｙａｔｔ ｍｉｎｉＤＡＷＮ（商標）ＴＲＥＯＳ ＭＡＬＳ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ、入射から９０°
ＭＡＬＳデータ収集速度：１５Ｈｚ
プロトタイプ「Ｋ」を有する４．６×１５０ｍｍカラムを、３つの４．６×３００ｍｍカラム（比較カラム「Ｌ」、「Ｍ」および「Ｎ」）と共に試験した。

【0166】

結果：
図１５−１９は、プロトタイプ「Ｋ」を有するカラムならびに比較カラム「Ｌ」、「Ｍ」および「Ｎ」を使用するＢＳＡの分離からのクロマトグラムを示す。図１５および１６は、０．２および０．５ｍＬ／分の流速でそれぞれ実行したときのプロトタイプ「Ｋ」での結果を示す。図１７、１８および１９は、０．３ｍＬ／分の流速で実行したときの比較カラムＬ、ＭおよびＮからの結果を示す。これらの図は、ＵＶ検出器と光散乱検出器の両方からのトレースを示す。カラムブリードは、ノイズの頻度と大きさの両方によって測定したとき、３つの比較カラムと比較してプロトタイプ「Ｋ」カラムでのほうが相当少ないことが判明した。プロトタイプカラム「Ｋ」は、比較カラムと比較してＲＭＳノイズのおよびランダムノイズ頻度の５倍を超える低減を示した。

【0167】

プロトタイプカラムＫは、試験した条件下でゴーストピークを示さなかったが、先行技術カラムＬおよびＮは、ゴーストピークの形跡を示した。広いピークが図１７と１９の両方で観察され、保持時間はそれぞれ４．９および５．５分であった。

【0168】

等価物
幾つかの要素の機能を、代替実施形態では、より少ない要素によってまたは単一要素によって行うことができる。同様に、一部の実施形態では、任意の機能要素を、例証実施形態に関して説明したものより少ない、または例証実施形態に関して説明したものとは異なる、動作で行うことができる。また、例証のために別個のものとして示した機能要素（モジュール、コンピュータおよびこれらに類するもの）を、他の機能要素内に組み込むことができ、異なるハードウェアに分けることができ、または特定の実装の際に分配することができる。

【0169】

本発明による一定の実施形態を説明したが、本発明は、説明した実施形態だけに限定されない。説明した実施形態のいずれに対しても、本発明の精神および範囲を逸脱することなく様々な変更および／または修飾を施すことができる。また、説明した実施形態の要素、段階、特徴および／または態様の様々な組み合わせが可能であり、このような組み合わせが本明細書中ではっきりと特定されていなくても考えられる。

【0170】

参照による組み込み
本明細書に引用したすべての特許、公開特許出願および他の参考文献の全内容は、本宣言により、これら全体が参照により本明細書に明確に組み込まれる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14A】

【図14B】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】