特許 6557659 骨移植片の骨形成潜在能の増強

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6557659

(24)【登録日】2019年7月19日

(45)【発行日】2019年8月7日

(54)【発明の名称】骨移植片の骨形成潜在能の増強

(51)【国際特許分類】

   A61L 27/38 20060101AFI20190729BHJP

   C12N 5/077 20100101ALI20190729BHJP

   C07K 14/47 20060101ALI20190729BHJP

   C12N 5/0775 20100101ALI20190729BHJP

   C12N 15/00 20060101ALN20190729BHJP

【ＦＩ】

   A61L27/38 111

   C12N5/077ZNA

   C07K14/47

   C12N5/0775

   !C12N15/00

【請求項の数】16

【全頁数】38

(21)【出願番号】特願2016-527073(P2016-527073)

(86)(22)【出願日】2014年7月16日

(65)【公表番号】特表2016-524989(P2016-524989A)

(43)【公表日】2016年8月22日

(86)【国際出願番号】US2014046852

(87)【国際公開番号】WO2015009829

(87)【国際公開日】20150122

【審査請求日】2017年7月14日

(31)【優先権主張番号】61/957,946

(32)【優先日】2013年7月16日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】503115205

【氏名又は名称】ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ レランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティー

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(72)【発明者】

【氏名】ヘルムズ， ジル

(72)【発明者】

【氏名】ダムディレ， ギリジャ

【審査官】 石井 裕美子

(56)【参考文献】

【文献】 特表２０１０−５２０２８６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 米国特許出願公開第２０１２／０１１５７８８（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 DIMITRIOU ROZALIA，BONE REGENERATION: CURRENT CONCEPTS AND FUTURE DIRECTIONS，BMC MEDICINE，２０１１年 ５月３１日，Vol. 9, No. 66，P1-10

【文献】 LEUCHT PHILIPP，WNT3A REESTABLISHES OSTEOGENIC CAPACITY TO BONE GRAFTS FROM AGED ANIMALS，J. BONE JOINT SURG AM.，２０１３年 ７月１７日，V95，P1278-1288

【文献】 BODINE PETER V N，WNT SIGNALING CONTROL OF BONE CELL APOPTOSIS，CELL RESEARCH，２００８年 １月２２日，V18，P248-253

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｌ １５／００−３３／１８

Ｃ０７Ｋ １／００−１９／００

Ｃ１２Ｎ １／００−７／０８

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ｅｘ ｖｉｖｏでＷｎｔタンパク質を含むリポソームに曝露された高齢骨移植片由来の幹細胞または前駆細胞を含む骨移植片材料であって、前記高齢骨移植片が少なくとも５０歳のヒト被験体から得られる、骨移植片材料。

【請求項2】

前記Ｗｎｔタンパク質がＷｎｔ３ａタンパク質である、請求項１に記載の骨移植片材料。

【請求項3】

前記幹細胞または前駆細胞が、ｅｘ ｖｉｖｏでＷｎｔタンパク質を含むリポソームに曝露されていない幹細胞または前駆細胞を含む骨移植片材料と比べて、Ａｘｉｎ２の発現の増大を有する、請求項１に記載の骨移植片材料。

【請求項4】

前記幹細胞または前駆細胞が、ｅｘ ｖｉｖｏでＷｎｔタンパク質を含むリポソームに曝露されていない幹細胞または前駆細胞を含む骨移植片材料と比べて、Ｒｕｎｘ２またはオステオカルシンの発現の増大を有する、請求項１に記載の骨移植片材料。

【請求項5】

前記幹細胞または前駆細胞が、ｅｘ ｖｉｖｏでＷｎｔタンパク質を含むリポソームに曝露されていない幹細胞または前駆細胞を含む骨移植片材料と比べて、Ｌｅｆ１の発現の増大を有する、請求項１に記載の骨移植片材料。

【請求項6】

前記骨移植片材料が、レシピエントと比べて自家または同種のドナー由来の幹細胞を含む、請求項１に記載の骨移植片材料。

【請求項7】

前記骨移植片材料が間葉系幹細胞、骨細胞または骨前駆細胞を含む、請求項１に記載の骨移植片材料。

【請求項8】

請求項１に記載の骨移植片材料をレシピエントへと移植する工程を含む、移植後の骨形成能を回復させるｅｘ ｖｉｖｏの方法において使用するための骨移植片材料。

【請求項9】

前記骨移植片材料がレシピエントと比べて自家性である幹細胞を含む、請求項８に記載のｅｘ ｖｉｖｏの方法において使用するための骨移植片材料。

【請求項10】

インキュベーション温度が３７℃を超えない、請求項８に記載のｅｘ ｖｉｖｏの方法において使用するための骨移植片材料。

【請求項11】

インキュベーション時間が最長６時間または最長４時間である、請求項８に記載のｅｘ ｖｉｖｏの方法において使用するための骨移植片材料。

【請求項12】

ｅｘ ｖｉｖｏでＷｎｔタンパク質を含むリポソームに曝露された後の前記骨移植片材料がプログラム細胞死を減少させる、請求項８に記載のｅｘ ｖｉｖｏの方法において使用するための骨移植片材料。

【請求項13】

前記レシピエントへの移植後の前記骨移植片材料が細胞生存を促進する、請求項８に記載のｅｘ ｖｉｖｏの方法において使用するための骨移植片材料。

【請求項14】

前記レシピエントへの移植後の前記骨移植片材料が骨形成の増大を有する、請求項８に記載のｅｘ ｖｉｖｏの方法において使用するための骨移植片材料。

【請求項15】

前記レシピエントへの移植後の前記骨移植片材料が、Ｗｎｔタンパク質を含むリポソームへの曝露の非存在下で得られた容量と比べて、１．５倍、２倍、３倍またはそれを超えて増大した骨容量を有する、請求項８に記載のｅｘ ｖｉｖｏの方法において使用するための骨移植片材料。

【請求項16】

前記レシピエントへの移植後の前記骨移植片材料が有糸分裂活性の増大を有する、請求項８に記載のｅｘ ｖｉｖｏの方法において使用するための骨移植片材料。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、リポソームＷｎｔポリペプチドなどのＷｎｔポリペプチドでのｅｘ ｖｉｖｏ処置による、骨移植片の骨形成潜在能の増強に関する。特に、本発明は、Ｗｎｔ３ａタンパク質、好ましくは、リポソームＷｎｔ３ａ（Ｌ−Ｗｎｔ３ａ）での骨移植片のｅｘ ｖｉｖｏ処置に関する。

【背景技術】

【0002】

整形外科インプラントおよび歯科インプラントは、様々な関節および歯の置換に使用されており、特に、股関節および膝関節ならびに歯の置換のために、ヒトおよび動物における骨の修復を促進するのにも使用されている。多くの個体は、合併症のない治癒および機能の回復を経るが、また、関節全置換について１０〜２０％と推定される、高率の合併症も存在する。これらの不全およびその後の修正手術の大半は、インプラント−骨間界面における不全により必要とされる。加えて、歯の矯正移動のための係留デバイスとして使用されるインプラントの不全率は、４０％と推定され、インプラント−骨間界面における不全のために、さらなるインプラントのその後の配置が必要とされている。

【0003】

整形外科インプラントおよび歯科インプラントは、比較的不活性の材料（「無生物」材料）、典型的に、金属材料と、セラミック材料またはプラスチック材料との組合せからなる。整形外科インプラント術のアウトカムを改善するかつての手法は、骨形成を増大させるようにデザインされたインプラント表面への物理的変化に主に焦点を合わせてきた。これらの手法は、多孔性金属表面を有するインプラントを使用して、骨の内部成長を促進するステップと、インプラントをヒドロキシアパタイトプラズマで噴霧するステップとを含む。歯科インプラントを活用する手法はまた、表面あらさをグリットブラスティング、酸エッチング、または酸化などの方法により付与される局所増強型（ｔｏｐｏｇｒａｐｈｉｃａｌｌｙ−ｅｎｈａｎｃｅｄ）チタン表面の使用も含んだ。

【0004】

また、骨結合（ｏｓｓｅｏｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）を促進する取組みでも、インプラント表面は、大きな変化を経ている。例えば、細胞は、ＲＧＤ配列を活用して、細胞外マトリックスに付着するため、アルギニン−グリシン−アスパラギン酸（ＲＧＤ）配列を含有する短鎖ペプチドを、インプラント表面へと付着させる。研究者らは、改変インプラント表面へのこの細胞付着を再現しようと試みたが、この戦略が結果としてもたらしたインプラントによる、骨結合および機械的固定の増大は、わずかなものに過ぎなかった。代替的に、インプラント近傍における血管の内部成長を刺激しようとする試みでは、それらの表面を、血管形成性の増殖因子であるＶＥＧＦを含有するコーティングでコーティングした。食塩溶液中に浸漬されたインプラントが、インプラントの骨結合を増大させる手段として市販されているが、その主張を立証するデータは存在しないか、またはほとんど存在しない。

【0005】

骨結合を刺激するのに援用される別の戦略は、インプラント表面をナノテクスチャリングすることである。この戦略の背景をなす根拠は、テクスチャリングは、表面積を増大させ、したがって、インプラントがインプラント周囲環境内の細胞に対して「スライドすること」を防止することである。しかし、臨床試験では、ナノテクスチャリングは、測定可能な利益を結果としてもたらさない。

【0006】

インプラントの骨結合を刺激する、タンパク質ベースの手法の使用も、集中的な探索下にある。組換え骨形成タンパク質（ＢＭＰ）は、骨格骨折における頑健な骨形成を誘導し、また、インプラント近傍の直接的な骨形成を刺激する取組みにおいても援用されている。ｉｎ ｖｉｔｒｏの結果は有望であるが、ｉｎ ｖｉｖｏのデータは、それほど説得力のあるものではない。組換えＢＭＰは、骨髄腔内の細胞の骨分化を阻害し、結果として、インプラントの骨結合については禁忌である。Ｓｙｋａｒａｓら（２００４年）、Ｃｌｉｎ Ｏｒａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇ、８巻（４号）：１９６〜２０５頁；およびＭｉｎｅａｒら（２０１０年）、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｏｎｅ ａｎｄ Ｍｉｎｅｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２５巻（６号）：１１９６〜２０７頁を参照されたい。ＢＭＰの使用は、異所性骨化および制御されない炎症の発生率の増大と関連しており、より近年のメタデータ解析は、がんの危険性の増大についても同様に裏付けている。

【0007】

Ｗｎｔタンパク質は、Ｆｒｉｚｚｌｅｄおよび低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質（ＬＲＰ）によりコードされる細胞表面受容体に結合する高度に保存された分泌型シグナル伝達分子のファミリーを形成する。ＷＮＴ遺伝子ファミリーは、分泌型シグナル伝達タンパク質をコードする、構造的に類縁の遺伝子からなる。これらのタンパク質は、腫瘍形成、ならびに細胞運命の調節および胚発生時のパターン形成を含む、複数の発生過程に関与している。結合すると、リガンドは、β−カテニンおよびＤＮＡ結合性タンパク質であるＴＣＦの核内活性を介して標的遺伝子の転写を最終的にもたらす、細胞内イベントのカスケードを誘発する（Ｃｌｅｖｅｒｓ Ｈ、２００４年、Ｗｎｔ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ： ｌｇ−ｎｏｒｒｉｎ ｔｈｅ ｄｏｇｍａ、Ｃｕｒｒ Ｂｉｏｌ、１４巻：Ｒ４３６〜Ｒ４３７頁；Ｎｅｌｓｏｎ ＷＪ、Ｎｕｓｓｅ Ｒ、２００４年、Ｃｏｎｖｅｒｇｅｎｃｅ ｏｆ Ｗｎｔ， ｂｅｔａ−ｃａｔｅｎｉｎ， ａｎｄ ｃａｄｈｅｒｉｎ ｐａｔｈｗａｙｓ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３０３巻：１４８３〜１４８７頁；Ｇｏｒｄｏｎ ＭＤ、Ｎｕｓｓｅ、２００６年、Ｗｎｔ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ： Ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｐａｔｈｗａｙｓ， ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ， ａｎｄ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒｓ、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、２８１巻：２２４２９〜２２４３３頁）。

【0008】

Ｗｎｔはまた、骨発生のプログラムと関連した、多種多様な細胞決定にも関与している。例えば、Ｗｎｔは、間葉系前駆細胞の、軟骨形成または骨形成の細胞運命への拘束に影響を及ぼす、ｓｏｘ９およびｒｕｎｘ２の発現レベルを調節する。Ｗｎｔは、骨前駆細胞の分化速度に影響を及ぼす。成体動物では、Ｗｎｔシグナル伝達が、骨量を調節するという十分な証拠が存在する。例えば、ヒトＷｎｔの共受容体であるＬＲＰ５内の機能獲得突然変異は、Ｉ型大理石骨病、および骨内膜性骨化過剰症または常染色体優性骨硬化症を含む、複数の高骨量症候群と関連する。Ｗｎｔ機能喪失突然変異は、骨粗鬆症−偽膠腫を含む、低骨量疾患を引き起こす。Ｗｎｔ阻害剤であるＤｋｋ１の産生の増大は、その顕著な特徴のうちの１つとして、骨吸収を増大させる疾患である、多発性骨髄腫と関連する。さらなる詳細については、Ｓ． Ｍｉｎｅａｒら、Ｗｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｐｒｏｍｏｔｅ ｂｏｎｅ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ、Ｓｃｉ． Ｔｒａｎｓｌ． Ｍｅｄ．、２巻、２９〜３０頁（２０１０年）；Ｚｈａｏら、Ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ ｔｈｅ ｉｎ ｖｉｖｏ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ｗｎｔ ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ、４６５巻：３３１〜４７頁（２００９年）；Ｐｏｐｅｌｕｔら、Ｔｈｅ ａｃｃｅｌｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｍｐｌａｎｔ ｏｓｓｅｏｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｂｙ ｌｉｐｏｓｏｍａｌ Ｗｎｔ３ａ、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ、３１巻、９１７３〜９１８１頁（２０１０年）；およびＭｏｒｒｅｌｌ ＮＴ、Ｌｅｕｃｈｔ Ｐ、Ｚｈａｏ Ｌ、Ｋｉｍ Ｊ−Ｂ、ｔｅｎ Ｂｅｒｇｅ Ｄら（２００８年）、Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ Ｐａｃｋａｇｉｎｇ Ｇｅｎｅｒａｔｅｓ Ｗｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｗｉｔｈ Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｃｔｉｖｉｔｙ、ＰＬｏＳ ＯＮＥ、３巻（８号）：ｅ２９３０頁を参照されたい。

【0009】

Ｗｎｔタンパク質を、脂質小胞（リポソーム）と組み合わせることにより、生物学的活性（Ｍｉｎｅａｒら、２０１０年、前出；およびＰｏｐｅｌｕｔら、２０１０年、前出）を伴うＷｎｔ処方物（Ｍｏｒｒｅｌｌら、２００８年、前出；およびＺｈａｏら、２００９年、前出）が作製されたことが示されている。可溶性ｗｉｎｇｌｅｓｓタンパク質の生物学的活性については、ｖａｎ Ｌｅｅｕｗｅｎら（１９９４年）、Ｎａｔｕｒｅ、３月２４日：３６８巻（６４６９号）：３４２４頁において記載されている。可溶性で生物学的に活性な脊椎動物Ｗｎｔタンパク質を活用する、Ｗｎｔ−Ｆｒｉｚｚｌｅｄ間相互作用の生化学的特徴付けについては、Ｈｓｉｅｈら（１９９９年）、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、９６巻（７号）：３５４６〜５１頁により記載されている。Ｂｒａｄｌｅｙら（１９９５年）、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ、１５巻（８号）：４６１６〜２２頁は、有糸分裂活性を有するＷｎｔタンパク質の可溶性形態について記載している。骨結合を増強するリポソームＷｎｔタンパク質の使用は、米国特許公開第２０１２０１１５７８８号において記載されている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0010】

【特許文献1】米国特許出願公開第２０１２／０１１５７８８号明細書

【非特許文献】

【0011】

【非特許文献1】Ｓｙｋａｒａｓら、Ｃｌｉｎ Ｏｒａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇ（２００４年）８巻（４号）：１９６〜２０５頁

【非特許文献2】Ｍｉｎｅａｒら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｏｎｅ ａｎｄ Ｍｉｎｅｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２０１０年）２５巻（６号）：１１９６〜２０７頁

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0012】

一態様では、本発明は、骨移植片内の細胞の生存を増強する方法であって、骨移植片を、Ｗｎｔポリペプチドでのｅｘ ｖｉｖｏ処置に供するステップを含む方法に関する。別の態様では、本発明は、骨移植片の骨形成潜在能を増強する方法であって、骨移植片を、有効用量の、Ｗｎｔ３Ａを含むがこれらに限定されない、Ｗｎｔポリペプチドでのｅｘ ｖｉｖｏ処置に供するステップを含む方法に関する。さらなる態様では、本発明は、治癒潜在能が低下した被験体に由来する骨移植片を再活性化するための方法であって、骨移植片を、Ｗｎｔポリペプチドでのｅｘ ｖｉｖｏ処置に供するステップを含む方法に関する。全ての態様では、骨移植片は、自家移植片の場合もあり、同種移植片の場合もある。全ての態様では、骨移植片は、例えば、骨髄由来幹細胞集団、例えば、骨髄由来間葉系幹細胞などの幹細胞集団を含みうる。

【0013】

骨移植片は、ヒト被験体に由来することが好ましい。一実施形態では、ヒト被験体は、老齢患者である。ある特定の実施形態では、ヒト被験体は、少なくとも５０歳、少なくとも５５歳、少なくとも６０歳、または少なくとも６５歳、または少なくとも７０歳、または少なくとも７５歳、または少なくとも８０歳、または少なくとも８５歳である。別の実施形態では、ヒト被験体の治癒潜在能は、低下しており、例えば、喫煙者、糖尿病患者、または栄養不良によって特徴付けられるヒトである。

【0014】

全ての態様および実施形態では、Ｗｎｔポリペプチドは、好ましくは、Ｗｎｔ３ａ、より好ましくは、ヒトＷｎｔ３ａ、最も好ましくは、ヒトリポソームＷｎｔ３ａ（Ｌ−Ｗｎｔ３ａ）である。さらなる態様では、本発明の方法は、骨移植片を、ヒト患者などのレシピエント被験体へと導入するステップをさらに含む。多様な実施形態では、骨移植片は、歯科インプラントを支持し、骨折を修復するのに使用することができる。別の実施形態では、骨移植片を使用して、罹患した骨を修復または再構築する。さらに別の実施形態では、骨移植片は、レシピエントの股関節、膝、または脊柱において使用される。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）
骨移植片内の細胞の生存を増強する方法であって、前記骨移植片を、移植時における前記骨移植片の細胞の生存を増強するのに十分な期間にわたり、有効用量のＷｎｔポリペプチドでのｅｘ ｖｉｖｏ処置に供するステップを含む、方法。
（項目２）
骨移植片の骨形成潜在能を増強する方法であって、前記骨移植片を、移植時における前記骨移植片の細胞の生存を増強するのに十分な期間にわたり、有効用量のＷｎｔポリペプチドでのｅｘ ｖｉｖｏ処置に供するステップを含む、方法。
（項目３）
治癒潜在能が低下した被験体に由来する骨移植片を再活性化するための方法であって、前記骨移植片を、移植時における前記骨移植片の細胞の生存を増強するのに十分な期間にわたり、有効用量のＷｎｔポリペプチドでのｅｘ ｖｉｖｏ処置に供するステップを含む、方法。
（項目４）
前記骨移植片が、自家移植片である、項目１から３のいずれか一項に記載の方法。
（項目５）
前記骨移植片が、同種移植片である、項目１から３のいずれか一項に記載の方法。
（項目６）
前記骨移植片が、幹細胞集団を含む、項目１から３のいずれか一項に記載の方法。
（項目７）
前記骨移植片が、骨髄由来幹細胞集団を含む、項目６に記載の方法。
（項目８）
前記骨移植片が、骨髄由来間葉系幹細胞を含む、項目７に記載の方法。
（項目９）
前記骨移植片が、ヒト被験体に由来する、項目１から３のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０）
前記ヒト被験体が、老齢患者である、項目９に記載の方法。
（項目１１）
前記ヒト被験体が、少なくとも６０歳である、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
前記ヒト被験体が、少なくとも６５歳である、項目１０に記載の方法。
（項目１３）
前記ヒト被験体が、少なくとも７０歳である、項目１０に記載の方法。
（項目１４）
前記ヒト被験体が、少なくとも７５歳である、項目１０に記載の方法。
（項目１５）
前記ヒト被験体が、少なくとも８０歳である、項目１０に記載の方法。
（項目１６）
前記ヒト被験体が、少なくとも８５歳である、項目１０に記載の方法。
（項目１７）
前記ヒト被験体の治癒潜在能が低下している、項目８に記載の方法。
（項目１８）
前記ヒト被験体が、喫煙者である、項目１６に記載の方法。
（項目１９）
前記ヒト被験体が、糖尿病患者である、項目１６に記載の方法。
（項目２０）
前記ヒト被験体が、栄養不良である、項目１６に記載の方法。
（項目２１）
前記Ｗｎｔポリペプチドが、Ｗｎｔ３ａである、項目１から１９のいずれか一項に記載の方法。
（項目２２）
前記Ｗｎｔポリペプチドが、ヒトＷｎｔ３ａである、項目２０に記載の方法。
（項目２３）
前記Ｗｎｔポリペプチドが、ヒトリポソームＷｎｔ３ａ（ＬＷｎｔ３ａ）である、項目２１に記載の方法。
（項目２４）
前記骨移植片を、レシピエント被験体へと導入するステップをさらに含む、項目１から２３のいずれか一項に記載の方法。
（項目２５）
前記レシピエント被験体が、ヒト患者である、項目２４に記載の方法。
（項目２６）
前記骨移植片が、歯科インプラントを支持するかまたは歯科インプラントの支持を増進するために使用される、項目２５に記載の方法。
（項目２７）
前記骨移植片が、骨折を修復するのに使用される、項目２５に記載の方法。
（項目２８）
前記骨移植片が、罹患した骨を修復または再構築するのに使用される、項目２５に記載の方法。
（項目２９）
前記骨移植片が、前記レシピエントの股関節、膝、または脊柱において使用される、項目２７または２８に記載の方法。

【図面の簡単な説明】

【0015】

【図1】図１Ａ〜１Ｊは、骨移植片が、骨形成潜在能を有することを示す図である。図１−Ａは、ベータアクチン増強緑色蛍光タンパク質（β−アクチン−ｅＧＦＰ）雄トランスジェニックマウスから採取された全骨髄の代表的なアリコート中の全ＤＮＡの定量化を示す図であり、各アリコートは、骨移植片を構成する。図１−Ｂは、骨移植片を、直径２ｍｍの臨界サイズの頭蓋冠欠損（円で区切られた）であって、頭頂骨を分断する（垂直方向の白色の破線で明示される）矢状縫合内に創出された頭蓋冠欠損へと移植することを示す図である。黒色の破線は、組織切片の平面を示す。図１−Ｃは、移植後１日目における損傷部位に由来する、代表的な組織切片を示す図であり、ＧＦＰ免疫染色により、ｅＧＦＰドナー（ｎ＝５）に由来する移植細胞を同定し、下方の空隙は、矢状静脈洞を表す。図１−Ｄは、移植後５日目における、代表的な組織切片を示す図であり、ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）についての免疫染色により、Ｓ期の細胞を同定する。図１−Ｅは、移植後７日目に、ＧＦＰ免疫染色により、骨移植片（黄色の点線）が同定されることを示す図であり、図１−Ｅ内の枠囲いされた領域についての高倍率の拡大画像（図１−Ｆ）は、損傷部位内の細胞の大半が、ＧＦＰ陽性移植片に由来することを例示する。図１−Ｇは、移植後１４日目に、ｍｉｃｒｏ−ＣＴの再構成により、２ｍｍの頭蓋冠損傷は、臨界サイズの非治癒性の欠損を構成することが確認される（ｎ＝６）ことを示す図である。図１−Ｈは、骨移植片で処置された、同じサイズの頭蓋冠損傷が治癒する（ｎ＝６）ことを示す図である。図１−Ｉおよび１−Ｊは、移植後７日目に、アニリンブルー染色を使用して、新たな類骨マトリックスを同定したところ、非処置の損傷部位（黄色の点線）内では、類骨マトリックスが形成されなかったことを示す図である。図１−Ｊは、骨移植片で処置された代表的な試料中の、移植後７日目における、目視可能な類骨マトリックスを示す図である。略号：ＩＨＣ＝免疫組織化学。矢印は、無傷の骨の縁辺部を印付ける。スケールバー：２ｍｍ（図１−Ｂ）；２００μｍ（図１−Ｃおよび１−Ｄ）；１００μｍ（図１−Ｅ）；４０μｍ（図１−Ｆ）；２ｍｍ（図１−Ｇ）；および２００μｍ（図１−Ｉおよび１−Ｊ）である。

【図2】図２Ａ〜２Ｉは、骨形成潜在能が、高齢動物に由来する骨移植片内で低減されることを示す図である。移植後７日目（ｄ７）に、アニリンブルー染色は、高齢ドナー（図２−Ｂ）と対比した、若齢ドナー（図２−Ａ）に由来する骨移植片により作り出された類骨マトリックスを示す。図２−Ｃは、若齢骨移植片および高齢骨移植片から形成された新たな骨の量についての組織形態計測解析を示す図である。図２−Ｄは、移植後７日目（ｄ７）に、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）免疫染色により、ドナーが若齢である場合の骨移植片に由来する細胞が、高齢ドナー（図２−Ｅ）と比較して同定されることを示す図である。図２−Ｆは、移植片を若齢（青色のバー、ｎ＝１３）ドナーから採取した場合の、損傷部位内のＧＦＰ陽性（ＧＦＰ^＋ｖｅ）細胞の数を、高齢（白色のバー、ｎ＝１３）ドナーと比較して示す図である。移植後５日目（ｄ５）に、ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）染色により、若齢（図２−Ｇ）ドナーおよび高齢（図２−Ｈ）ドナーに由来する骨移植片内の増殖細胞を同定する。図２−Ｉは、増殖細胞核内抗原（ＰＣＮＡ）についての定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴＰＣＲ）が、若齢動物に由来する骨移植片と、高齢動物に由来する骨移植片とで同等であることを示す図である。単一のアステリスクは、ｐ＜０．０５を描示する。矢印は、無傷の骨の縁辺部を印付ける。スケールバー：２００μｍ（図２−Ａ［図２−Ａ内のスケールバーはまた、図２−Ｂにも適用される］、２−Ｄ［図２−Ｄ内のスケールバーはまた、図２−Ｅにも適用される］、および２−Ｇ［図２−Ｇ内のスケールバーはまた、図２−Ｈにも適用される］）。

【図3】図３は、Ｗｎｔシグナル伝達が、高齢骨移植片内で低減されることを示す図である。図３−Ａは、若齢（青色のバー；ｎ＝３）ドナーおよび高齢（白色のバー；ｎ＝３）ドナーから採取された骨髄（ＢＭ）中のＷｎｔリガンドおよびＷｎｔ標的（図３−Ｂ）遺伝子の相対発現レベルを評価する、定量的ＲＴ−ＰＣＲを示す図である。グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）に対して正規化された遺伝子発現レベルである。アステリスクは、ｐ＜０．０５を描示する。

【図4】図４は、リポソームＷｎｔ３ａが、高齢骨移植片に対して骨形成能を回復させることを示す図である。図４−Ａは、Ｌ−ＰＢＳで処置された高齢骨移植片（ｎ＝５）のアニリンブルー染色を示す図である。図４−Ｂは、Ｌ−Ｗｎｔ３ａで処置された骨移植片（ｎ＝８）中の、新たなアニリンブルー陽性類骨マトリックスを示す図である。図４−Ｃは、移植後７日目および１２日目における、新たな骨マトリックスの組織形態計測による定量化を示す図である。図４−Ｄは、Ｌ−ＰＢＳおよびＬ−Ｗｎｔ３ａ（図４−Ｅ）で処置された骨移植片内の移植後１２日目（ｄ１２）における、アニリンブルー染色を示す図である。図４−Ｆは、骨髄採取物に由来する細胞集団（付着していない浮遊細胞および付着細胞）内で測定される、全ＤＮＡに対して正規化されたベータガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）活性を示す図である。白色のバー（ｎ＝４）は、Ｌ−ＰＢＳ処置後における、Ｗｎｔ応答性を表し、青色のバー（ｎ＝４）は、Ｌ−Ｗｎｔ３ａ処置後における、Ｗｎｔ応答性（Ｗｎｔ３ａの有効濃度：０．１５μｇ／ｍＬ）を表す。図４−Ｇは、骨髄に由来する付着細胞内の幹細胞マーカーである、ＣＤ４５、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、およびＳｔｒｏ１についての免疫染色を示す図である。図４−Ｈは、Ｌ−ＰＢＳ処置後における付着細胞集団（白色のバー、ｎ＝４）内またはＬ−Ｗｎｔ３ａ処置後における付着細胞集団（ｎ＝４；Ｗｎｔ３ａの有効濃度：０．１５μｇ／ｍＬ）内における、全ＤＮＡに対して正規化されたベータガラクトシダーゼ活性を示す図である。図４−Ｉは、代表的な組織切片に対するＸｇａｌ染色により、Ｌ−ＰＢＳで処置された高齢Ａｘｉｎ２^{ＬａｃＺ／＋}マウスに由来する骨移植片内のＷｎｔ応答性細胞が、Ｌ−Ｗｎｔ３ａによる処置（図４−Ｊ）と比較して同定されることを示す図である。図４−Ｋは、代表的な組織切片に対するＸｇａｌ染色により、若齢Ａｘｉｎ２^{ＬａｃＺ／＋}マウスに由来する、Ｌ−ＰＢＳで処置された骨移植片内の、Ｗｎｔ応答性細胞が同定されることを示す図である。単一のアステリスクは、ｐ＜０．０５を描示し、四重のアステリスクは、ｐ＜０．０００１を描示する。略号：Ｌ−ＰＢＳ＝リポソームＰＢＳ；Ｌ−Ｗｎｔ３ａ＝リポソームＷｎｔ３ａ；ＢＭ＝骨髄；およびＤＡＰＩ＝４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール二塩酸塩。矢印は、無傷の骨の縁辺部を印付ける。スケールバー：１００ｍｍ（図４−Ａ［図４−Ａ内のスケールバーはまた、図４−Ｂにも適用される］）；２００ｍｍ（図４−Ｄ［図４−Ｄ内のスケールバーはまた、図４−Ｅにも適用される］）；１００ｍｍ（図４−Ｇ）；および４０ｍｍ（図４−Ｉ［図４−Ｉ内のスケールバーはまた、図４−Ｊおよび４−Ｋにも適用される］）。

【図5】図５は、Ｌ−Ｗｎｔ３ａ処置が、高齢動物に由来する骨移植片に対して骨形成潜在能を回復させることを示す図である。細胞のアポトーシスと関連したＤＮＡの断片化についてアッセイされた、高齢ドナーのウサギに由来する骨髄である。図５−Ａは、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼｄＵＴＰニック末端標識（ＴＵＮＥＬ）染色（ｎ＝４）により、Ｌ−ＰＢＳ（１０ｍＬ）で処置された高齢骨髄内の、Ｌ−Ｗｎｔ３ａ（図５−Ｂ）処置（Ｗｎｔ３ａの有効濃度：０．１５μｇ／ｍＬ）と比較した、アポトーシスの程度が裏付けられることを示す図である。図５−Ｃは、Ｌ−ＰＢＳで処置された高齢骨移植片試料（白色のバー）中またはＬ−Ｗｎｔ３ａで処置された高齢骨移植片試料（青色のバー）中のカスパーゼ活性の測定を示す図である。図５−Ｄ〜５−Ｇは、骨髄を、高齢ウサギから採取し、Ｌ−ＰＢＳまたはＬ−Ｗｎｔ３ａと共に、最長１時間にわたりインキュベートし、次いで、尺骨内に創出された、臨界サイズの欠損へと移植したことを示す図である。図５−Ｄは、骨移植の４週間後におけるＸ線評価を示す図である。Ｌ−ＰＢＳ処置を、Ｌ−Ｗｎｔ３ａ（図５−Ｅ）処置と比較する。図５−Ｆは、骨移植の８週間後における、ｍｉｃｒｏ−ＣＴ等密度面の再構成を示す図である。Ｌ−ＰＢＳ処置を、Ｌ−Ｗｎｔ３ａ（図５−Ｇ）処置と比較する。図５−Ｈは、骨容量（ＢＶ）および骨容量／全容量（ＢＶ／ＴＶ）が、ＧＥ ＭｉｃｒｏＶｉｅｗソフトウェア内の骨解析ツールを活用して計算されることを示す図である。単一のアステリスクは、ｐ＜０．０５を描示する。略号：Ｌ−ＰＢＳ＝リポソームＰＢＳおよびＬ−Ｗｎｔ３ａ＝リポソームＷｎｔ３ａ。矢印は、無傷の骨の縁辺部を印付ける。スケールバー：４０ｍｍ（図５−Ａおよび５−Ｂ）；および５ｍｍ（図５−Ｆおよび５−Ｇ）。

【図6】図６は、Ｌ−Ｗｎｔ３ａで処置された高齢骨移植片に由来する再生骨の組織学的外見を示す図である。Ｌ−ＰＢＳ（図６−Ａ）中またはＬ−Ｗｎｔ３ａ（図６−Ｂ）中でインキュベートされた高齢骨髄で処置された損傷部位（枠囲いされた領域）についてのアニリンブルー染色である。Ｌ−ＰＢＳで処置された高齢骨移植片を施された、高齢宿主の脂肪性骨髄腔（図６−Ｃ）領域および隣接する損傷（図６−Ｄ）領域についてのゴモリトリクローム染色であり、線維性組織は、ターコイズブルーに染色されている。Ｌ−Ｗｎｔ３ａで処置された高齢骨移植片を施された、高齢宿主の脂肪性骨髄腔（図６−Ｅ）領域および隣接する損傷（図６−Ｆ）領域についてのゴモリトリクローム染色であり、成熟類骨マトリックスは、ダークターコイズに染色され、骨細胞核は、赤色に染色される。図６−Ｇは、偏光下では、ピクロシリウスレッド染色により、Ｌ−ＰＢＳで処置された高齢骨移植片から形成された線維性組織が同定されることを示す図である。Ｌ−Ｗｎｔ３ａで処置された高齢骨移植片から形成された類骨マトリックス（図６−Ｈ）と比較する。略号：Ｌ−ＰＢＳ＝リポソームＰＢＳ、およびＬ−Ｗｎｔ３ａ＝リポソームＷｎｔ３ａ。矢印は、無傷の骨の縁辺部を印付ける。スケールバー：５００μｍ（図６−Ａおよび６−Ｂ）；１００μｍ（図６−Ｃ〜６−Ｆ）；および２００μｍ（図６−Ｇおよび６−Ｈ）。

【図7】図７は、骨移植片材料が、幹細胞集団および前駆細胞集団を含有することを示す図である。（Ａ）ラット大腿骨、（Ｂ）ラット腸骨稜、（Ｃ）ラット脛骨から採取されたＢＧＭについてのゴモリ染色を示す図である。（Ｄ）表示の供給源から採取されたばかりのラットＢＧＭ内の内因性骨形成遺伝子の発現についての定量的ＲＴＰＣＲ解析を示す図である。（Ｅ）自家ＢＧＭをラットのＳＲＣへと移植する、実験デザインについての概略図である。（Ｆ）ＢｒｄＵの取込みを検出するように染色された、移植後７日目における腸骨稜ＢＧＭの代表的な組織切片を示す図である。点線は、ＢＧＭ中に含まれる骨梁（ｔｒａｂｅｃｕｌａｒ ｂｏｎｅ）の小片を示す。（Ｇ）Ｒｕｎｘ２、（Ｈ）Ｓｏｘ９、および（Ｉ）ＰＰＡＲγの発現を示す図である。（Ｊ）類骨マトリックスを検出するように、アニリンブルーで染色されたＢＧＭの代表的な組織切片を示す図であり、アステリスクは、新たな骨マトリックスを、古い骨小片（黄色の点線）と対比して示す。腎表面は、このパネルおよびパネルＧにおいて、白色の点線で示される。（Ｋ）プロテオグリカンに富む軟骨（赤色）を検出するサフラニンＯ／Ｆａｓｔ ｇｒｅｅｎ組織学を示す図であり、（Ｌ）脂肪細胞を検出するゴモリトリクローム染色を示す図である。略号：ＢｒｄＵ：ブロモデオキシウリジン；ＰＰＡＲγ：ペルオキシソーム増殖剤活性化タンパク質ガンマ。スケールバー：５０μｍ、アステリスク：ｐ＜０．０５。

【図8】図８は、骨移植片材料が、（Ａ）骨膜および（Ｂ）骨内膜の免疫染色により視覚化された、Ａｘｉｎ２^{ＣｒｅＥＲＴ２}；Ｒ２６ｍ^ＴｍＧマウスにおけるＷｎｔ応答性ＧＦＰ^＋ｖｅ細胞であることを示す図である。（Ｃ）指定された顕微鏡視野内のＧＦＰ^＋ｖｅ細胞／全細胞の定量化を示す図である。（Ｄ）ＢＧＭ内のＧＦＰ^＋ｖｅ細胞を、蛍光により視覚化したことを示す図である。（Ｅ）ＢＧＭ^{ｙｏｕｎｇ}（緑色のバー）中およびＢＧＭ^ａｇｅｄ（グレーのバー）中の内因性Ａｘｉｎ２発現、内因性Ｌｅｆ１発現、および内因性ＧＡＰＤＨ発現についての、定量的絶対ＲＴ−ＰＣＲ結果を示す図である。（Ｆ）ＢＧＭ^{ｙｏｕｎｇ}（緑色のバー）中およびＢＧＭ^ａｇｅｄ（グレーのバー）中の、Ｗｎｔ３ａ、全ベータカテニン、Ａｘｉｎ２、およびベータアクチンについてのウェスタンブロット解析を示す図である。スケールバー＝５０μｍ。アステリスク：ｐ＜０．０５。

【図9】図９は、ＢＧＭの骨分化能が、年齢と共に低下することを示す図である。（Ａ）ＢＧＭ^{ｙｏｕｎｇ}（緑色のバー）中およびＢＧＭ^ａｇｅｄ（グレーのバー）中の、アルカリホスファターゼ、Ｏｓｔｅｒｉｘ、およびオステオカルシンの発現についての、定量的ＲＴ−ＰＣＲ解析を示す図である。（Ｂ）ＡＣＴＢ−ｅＧＦＰマウスから採取され、ＳＲＣへと移植され、明視野下で視覚化されたＢＧＭを示す図であり、（Ｃ）ＢＧＭ内のＧＦＰシグナルを検出する蛍光を示す図である。（Ｄ）ＢＧＭ^{ｙｏｕｎｇ}（Ｎ＝５）および（Ｅ）ＢＧＭ^ａｇｅｄ（Ｎ＝５）に由来する、アニリンブルーで染色（挿入図）された代表的な組織切片を示す図である。点線は、腎表面を示す。（Ｆ）移植後７日目における、ＢＧＭにより占有された全領域内のアニリンブルー^＋ｖｅピクセルについての組織形態計測解析を示す図である。（Ｇ）ＢＧＭ^{ｙｏｕｎｇ}（Ｎ＝５）および（Ｈ）ＢＧＭ^ａｇｅｄ（Ｎ＝５）に由来するＡＬＰ活性を検出するように染色された、代表的な組織切片を示す図である。（Ｉ）移植後７日目における、ＢＧＭにより占有された全領域内のＡＬＰ^＋ｖｅピクセルの定量化を示す図である。（Ｊ）ＢＧＭ^{ｙｏｕｎｇ}（Ｎ＝５）および（Ｋ）ＢＧＭ^ａｇｅｄ（Ｎ＝５）に由来するＧＦＰについて免疫染色された、代表的な組織切片を示す図である。（Ｌ）移植後７日目における、ＢＧＭにより占有された全領域内のＧＦＰ^＋ｖｅピクセルの定量化を示す図である。略号：ＡＬＰ：アルカリホスファターゼ；Ｏｃ：オステオカルシン。スケールバー：１００μｍ。アステリスク：ｐ＜０．０５、二重のアステリスク：ｐ＜０．０１。

【図10】図１０は、ＢＧＭの骨分化が、内因性Ｗｎｔシグナルを必要とすることを示す図である。（Ａ）マウスＩｇＧ２α Ｆｃ断片を発現するアデノウイルス（Ａｄ−Ｆｃ）または（Ｂ）可溶性ＷｎｔアンタゴニストであるＤｋｋ１を発現するアデノウイルス（Ａｄ−Ｄｋｋ１）で処置されたＢＧＭ内のＡＬＰ活性について染色された、代表的な組織切片を示す図である。（Ｃ）Ａｄ−Ｆｃまたは（Ｄ）Ａｄ−Ｄｋｋ１で処置されたＢＧＭ内のＰＰＡＲγについて免疫染色された、代表的な組織切片を示す図である。（Ｅ）Ａｄ−Ｆｃまたは（Ｆ）Ａｄ−Ｄｋｋ１で処置されたＢＧＭ内のＤｌｋ１について免疫染色された、代表的な組織切片を示す図である。（Ｇ）Ａｄ−Ｆｃまたは（Ｈ）Ａｄ−Ｄｋｋ１で処置されたＢＧＭを施された欠損部位内の骨形成を検出する、ｍｉｃｒｏ−ＣＴの再構成を示す図である。元の欠損は、赤色の点線による円で示す。（Ｉ）ｍｉｃｒｏ−ＣＴデータから計算される新たな骨容量（Ｎ＝５）±ＳＥＭを示す図である。（Ｊ）Ａｄ−Ｆｃまたは（Ｋ）Ａｄ−Ｄｋｋ１で処置されたＢＧＭを施された欠損部位に由来する代表的な組織切片に対するアニリンブルー染色を示す図である。（Ｌ）組織形態計測解析（「方法」を参照されたい）を活用する、新たな骨容量の定量化を示す図である。（Ｉ）Ａｄ−Ｆｃまたは（Ｊ）Ａｄ−Ｄｋｋ１で処置されたＢＭ移植片内のＰＰＡＲ−γ発現を示す図である。単一のアステリスク：ｐ＜０．０５。スケールバー：Ａ〜Ｂ：２００μｍ、Ｃ〜Ｆ、Ｊ〜Ｋ：５０μｍ、Ｇ〜Ｈ：２ｍｍ。

【図11-1】図１１は、Ｗｎｔ３ａが、ＢＧＭ^ａｇｅｄを活性化し、その骨分化能を回復させることを示す図である。（Ａ）高齢ＡＣＴＢ−ｅＧＦＰマウスに由来するＢＧＭであって、Ｌ−ＰＢＳまたはＬ−ＷＮＴ３Ａ（０．１５μｇ／ｍｌ）で１時間にわたり処置され、次いで、２４時間後に、ｑＲＴ−ＰＣＲにより、標的遺伝子の発現についてアッセイされるか、または速やかに、ＳＲＣへと７日間にわたり移植されたＢＧＭを示す図である。（Ｂ）Ｌ−ＰＢＳ（グレーのバー）またはＬ−ＷＮＴ３Ａ（青色のバー）で処置されたＢＧＭ^ａｇｅｄ中の、Ａｘｉｎ２発現およびＬｅｆ１発現の倍数変化を示す図である。（Ｃ）Ｌ−ＰＢＳ（グレーのバー）またはＬ−ＷＮＴ３Ａ（青色のバー）で処置されたＢＧＭ^ａｇｅｄ中の、全ベータカテニン、Ａｘｉｎ２、およびベータアクチンについてのウェスタンブロット解析を示す図である。ＢＧＭ^ａｇｅｄを、移植後４日目におけるＳＲＣから採取した後で、（Ｄ）Ｌ−ＰＢＳ（Ｎ＝５）および（Ｅ）Ｌ−ＷＮＴ３Ａ（Ｎ＝５）で処置された試料に由来する代表的な組織切片を、ＢｒｄＵの取込みについて染色した（Ｎ＝５）。（Ｆ）骨移植片内部を中心とする顕微鏡視野内のＢｒｄＵ^＋ｖｅピクセルの定量化を示す図である。（Ｇ）Ｌ−ＰＢＳ（Ｎ＝５）および（Ｈ）Ｌ−ＷＮＴ３Ａ（Ｎ＝５）で処置された試料に由来する代表的な組織切片であって、移植後７日目におけるＢｒｄＵの取込みについて染色された組織切片を示す図である。（Ｉ）上記と同様に、ＢｒｄＵ＋ｖｅピクセルの定量化を示す図である。（Ｊ）Ｌ−ＰＢＳ（Ｎ＝５）および（Ｋ）Ｌ−ＷＮＴ３Ａ（Ｎ＝５）で処置された試料に由来する代表的な組織切片であって、移植後７日目におけるＤｌｋ１の発現について免疫染色された組織切片を示す図である。（Ｌ）移植後７日目における、ＢＧＭにより占有された全領域内のＤｌｋ１＋ｖｅピクセルの定量化を示す図である。（Ｍ）Ｌ−ＰＢＳ（Ｎ＝５）および（Ｎ）Ｌ−ＷＮＴ３Ａ（Ｎ＝５）で処置された試料に由来する代表的な組織切片であって、移植後７日目におけるＯｃの発現について免疫染色された組織切片を示す図である。（Ｏ）Ｄｌｋ１について記載されている通り、Ｏｃ^＋ｖｅピクセルの定量化を示す図である。（Ｐ）Ｌ−ＰＢＳ（Ｎ＝５）および（Ｑ）ＬＷＮＴ３Ａ（Ｎ＝５）で処置された試料中の類骨マトリックスを検出するようにアニリンブルーで染色された、代表的な組織切片を示す図である。（Ｒ）新たな骨マトリックスの、組織形態計測による定量化を示す図であり、詳細については、「方法」を参照されたい。略号は、前出の図についてのキャプションの通りである。スケールバー：１００μｍ。アステリスク：ｐ＜０．０５；二重のアステリスク：ｐ＜０．０１。

【図11-2】図１１は、Ｗｎｔ３ａが、ＢＧＭ^ａｇｅｄを活性化し、その骨分化能を回復させることを示す図である。（Ａ）高齢ＡＣＴＢ−ｅＧＦＰマウスに由来するＢＧＭであって、Ｌ−ＰＢＳまたはＬ−ＷＮＴ３Ａ（０．１５μｇ／ｍｌ）で１時間にわたり処置され、次いで、２４時間後に、ｑＲＴ−ＰＣＲにより、標的遺伝子の発現についてアッセイされるか、または速やかに、ＳＲＣへと７日間にわたり移植されたＢＧＭを示す図である。（Ｂ）Ｌ−ＰＢＳ（グレーのバー）またはＬ−ＷＮＴ３Ａ（青色のバー）で処置されたＢＧＭ^ａｇｅｄ中の、Ａｘｉｎ２発現およびＬｅｆ１発現の倍数変化を示す図である。（Ｃ）Ｌ−ＰＢＳ（グレーのバー）またはＬ−ＷＮＴ３Ａ（青色のバー）で処置されたＢＧＭ^ａｇｅｄ中の、全ベータカテニン、Ａｘｉｎ２、およびベータアクチンについてのウェスタンブロット解析を示す図である。ＢＧＭ^ａｇｅｄを、移植後４日目におけるＳＲＣから採取した後で、（Ｄ）Ｌ−ＰＢＳ（Ｎ＝５）および（Ｅ）Ｌ−ＷＮＴ３Ａ（Ｎ＝５）で処置された試料に由来する代表的な組織切片を、ＢｒｄＵの取込みについて染色した（Ｎ＝５）。（Ｆ）骨移植片内部を中心とする顕微鏡視野内のＢｒｄＵ^＋ｖｅピクセルの定量化を示す図である。（Ｇ）Ｌ−ＰＢＳ（Ｎ＝５）および（Ｈ）Ｌ−ＷＮＴ３Ａ（Ｎ＝５）で処置された試料に由来する代表的な組織切片であって、移植後７日目におけるＢｒｄＵの取込みについて染色された組織切片を示す図である。（Ｉ）上記と同様に、ＢｒｄＵ＋ｖｅピクセルの定量化を示す図である。（Ｊ）Ｌ−ＰＢＳ（Ｎ＝５）および（Ｋ）Ｌ−ＷＮＴ３Ａ（Ｎ＝５）で処置された試料に由来する代表的な組織切片であって、移植後７日目におけるＤｌｋ１の発現について免疫染色された組織切片を示す図である。（Ｌ）移植後７日目における、ＢＧＭにより占有された全領域内のＤｌｋ１＋ｖｅピクセルの定量化を示す図である。（Ｍ）Ｌ−ＰＢＳ（Ｎ＝５）および（Ｎ）Ｌ−ＷＮＴ３Ａ（Ｎ＝５）で処置された試料に由来する代表的な組織切片であって、移植後７日目におけるＯｃの発現について免疫染色された組織切片を示す図である。（Ｏ）Ｄｌｋ１について記載されている通り、Ｏｃ^＋ｖｅピクセルの定量化を示す図である。（Ｐ）Ｌ−ＰＢＳ（Ｎ＝５）および（Ｑ）ＬＷＮＴ３Ａ（Ｎ＝５）で処置された試料中の類骨マトリックスを検出するようにアニリンブルーで染色された、代表的な組織切片を示す図である。（Ｒ）新たな骨マトリックスの、組織形態計測による定量化を示す図であり、詳細については、「方法」を参照されたい。略号は、前出の図についてのキャプションの通りである。スケールバー：１００μｍ。アステリスク：ｐ＜０．０５；二重のアステリスク：ｐ＜０．０１。

【図12-1】図１２は、Ｌ−ＷＮＴ３Ａが、ＢＧＭ幹細胞を刺激し、脊椎固定を改善することを示す図である。（Ａ）ヒトＭＳＣ培養物を、Ｌ−ＰＢＳまたはＬ−ＷＮＴ３Ａにより、３７℃で表示の期間にわたり処置し、Ａｘｉｎ２発現についてのｑＲＴＰＣＲを使用して、Ｗｎｔ応答を決定したことを示す図である。（Ｂ）マウスＳＳＣを、Ｌ−ＰＢＳまたはＬＷＮＴ３Ａにより、３７℃で１２時間にわたり処置し、Ｗｎｔ応答について、Ａｘｉｎ２発現についてのｑＲＴ−ＰＣＲでアッセイしたことを示す図である。（Ｃ）Ｌ−ＰＢＳ（破線）またはＬ−ＷＮＴ３Ａ（０．１５μｇ／ｍＬ；青線）を伴う、室温で１時間にわたるインキュベーションに応答する、Ａｘｉｎ２発現およびＬｅｆ１発現についての定量的絶対ＲＴ−ＰＣＲ解析を示す図である。データは、２４時間にわたるＲＮＡコピー数／全ＲＮＡ含量の比として表す。（Ｄ）ラット棘突起を、最小限の切開を介して露出させ、腸骨稜に由来する標準化容量の自家ＢＧＭを、Ｌ−ＰＢＳまたはＬ−ＷＮＴ３Ａで１時間にわたり処置し、次いで、（Ｅ）Ｌ４椎骨横突起と、Ｌ５椎骨横突起との間に移植したことを示す図である。ＰＯＤ２に、（Ｆ）Ｌ−ＰＢＳおよび（Ｇ）Ｌ−ＷＮＴ３Ａで処置されたグラフ（ピンク）について、ｍｉｃｒｏ−ＣＴの収集を実施したことを示す図である。ＰＯＤ４９に、ｍｉｃｒｏ−ＣＴの収集を再度実施して、（Ｈ）Ｌ−ＰＢＳ（グレー）および（Ｉ）Ｌ−ＷＮＴ３Ａ（青）で処置された移植片の骨成長を評価したことを示す図である。（Ｉ）移植片の成長を、処置群の各々について、ＰＯＤ２における各移植片サイズを、ＰＯＤ４９におけるそのサイズと比較する容量倍数としてグラフ化した（上記で言明された色により示される）ことを示す図である。略号：Ｌ４：第４腰椎、Ｌ５：第５腰椎、ＡＰ：先端突起、ＳＰ：棘突起、ＴＰ：横突起、ＰＯＤ：手術後〜日目。

【図12-2】図１２は、Ｌ−ＷＮＴ３Ａが、ＢＧＭ幹細胞を刺激し、脊椎固定を改善することを示す図である。（Ａ）ヒトＭＳＣ培養物を、Ｌ−ＰＢＳまたはＬ−ＷＮＴ３Ａにより、３７℃で表示の期間にわたり処置し、Ａｘｉｎ２発現についてのｑＲＴＰＣＲを使用して、Ｗｎｔ応答を決定したことを示す図である。（Ｂ）マウスＳＳＣを、Ｌ−ＰＢＳまたはＬＷＮＴ３Ａにより、３７℃で１２時間にわたり処置し、Ｗｎｔ応答について、Ａｘｉｎ２発現についてのｑＲＴ−ＰＣＲでアッセイしたことを示す図である。（Ｃ）Ｌ−ＰＢＳ（破線）またはＬ−ＷＮＴ３Ａ（０．１５μｇ／ｍＬ；青線）を伴う、室温で１時間にわたるインキュベーションに応答する、Ａｘｉｎ２発現およびＬｅｆ１発現についての定量的絶対ＲＴ−ＰＣＲ解析を示す図である。データは、２４時間にわたるＲＮＡコピー数／全ＲＮＡ含量の比として表す。（Ｄ）ラット棘突起を、最小限の切開を介して露出させ、腸骨稜に由来する標準化容量の自家ＢＧＭを、Ｌ−ＰＢＳまたはＬ−ＷＮＴ３Ａで１時間にわたり処置し、次いで、（Ｅ）Ｌ４椎骨横突起と、Ｌ５椎骨横突起との間に移植したことを示す図である。ＰＯＤ２に、（Ｆ）Ｌ−ＰＢＳおよび（Ｇ）Ｌ−ＷＮＴ３Ａで処置されたグラフ（ピンク）について、ｍｉｃｒｏ−ＣＴの収集を実施したことを示す図である。ＰＯＤ４９に、ｍｉｃｒｏ−ＣＴの収集を再度実施して、（Ｈ）Ｌ−ＰＢＳ（グレー）および（Ｉ）Ｌ−ＷＮＴ３Ａ（青）で処置された移植片の骨成長を評価したことを示す図である。（Ｉ）移植片の成長を、処置群の各々について、ＰＯＤ２における各移植片サイズを、ＰＯＤ４９におけるそのサイズと比較する容量倍数としてグラフ化した（上記で言明された色により示される）ことを示す図である。略号：Ｌ４：第４腰椎、Ｌ５：第５腰椎、ＡＰ：先端突起、ＳＰ：棘突起、ＴＰ：横突起、ＰＯＤ：手術後〜日目。

【発明を実施するための形態】

【0016】

定義
本方法について記載する前に、このような方法は、変化することが当然であるので、本発明は、記載される特定の方法に限定されるものではないことを理解されたい。また、本発明の範囲を限定するのは、付属の特許請求の範囲だけであるので、本明細書で使用される用語法は、特定の実施形態だけについて記載することを目的とするものであり、限定的であることを意図するものではないことも理解されたい。値の範囲が提示される場合は、その範囲の上限と下限との間の、文脈によりそうでないことが明確に指示されない限りにおいて、下限の単位の１０分の１までの、各中間の値、およびその言明された範囲内の他の任意の言明された値または中間の値が、本発明に包含されることが理解される。これらのより小さな範囲の上限および下限は、独立に、本発明に包含されるより小さな範囲内に含まれ、言明された範囲内の、任意の具体的に除外された限界により決まる。そうでないことが規定されない限りにおいて、本明細書で使用される技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者により一般に理解される意味と同じ意味を有する。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎら、Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、２版、Ｊ． Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ、１９９４年）は、当業者に、本出願で使用される用語の多くに対する一般的な指針をもたらす。

【0017】

本明細書で言及される全ての刊行物は、刊行物が引用される関連において、方法および／または材料について開示および記載するように、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。

【0018】

Ｗｎｔタンパク質。Ｗｎｔタンパク質は、高度に保存された分泌型シグナル伝達分子であって、胚発生時の細胞間相互作用を調節するシグナル伝達分子のファミリーを形成する。「Ｗｎｔ」または「Ｗｎｔ遺伝子産物」または「Ｗｎｔタンパク質」または「Ｗｎｔポリペプチド」という用語は、互換的に使用され、天然配列のＷｎｔポリペプチド、Ｗｎｔポリペプチド変異体、Ｗｎｔポリペプチド断片、およびキメラＷｎｔポリペプチドを包含する。本発明の一部の実施形態では、Ｗｎｔタンパク質は、システイン残基に共有結合的に結合したパルミテートを含む。「天然配列」のポリペプチドとは、その作製のために使用される方法にかかわらず、天然に由来するＷｎｔポリペプチドと同じアミノ酸配列を有するポリペプチドである。このような天然配列のポリペプチドは、内因性Ｗｎｔタンパク質を産生する細胞から単離することもでき、組換え手段または合成的手段により作製することもできる。したがって、天然配列のポリペプチドは、例えば、天然に存在するヒトポリペプチド、マウスポリペプチド、または他の任意の哺乳動物種、もしくは哺乳動物以外の種、例えば、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ属、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓなどに由来するポリペプチドのアミノ酸配列を有しうる。

【0019】

「天然配列のＷｎｔポリペプチド」という用語は、限定なしに述べると、ヒトＷｎｔポリペプチドおよびマウスＷｎｔポリペプチドを含む。ヒトＷｎｔタンパク質は、以下：Ｗｎｔ１：Ｇｅｎｂａｎｋ参照番号ＮＰ００５４２１．１；脳の視床内、胎児および成体の肺内、ならびに胎盤内で発現する、Ｗｎｔ２：Ｇｅｎｂａｎｋ参照番号ＮＰ００３３８２．１；Ｗｎｔ２Ｂの２つのアイソフォーム：Ｇｅｎｂａｎｋ参照番号ＮＰ００４１７６．２およびＮＰ０７８６１３．１を含む。アイソフォーム１は、成体の心臓内、脳内、胎盤内、肺内、前立腺内、精巣内、卵巣内、小腸内、および結腸内で発現する。成体の脳内では、アイソフォーム１は主に、尾状核内、視床下核内、および視床内で見出される。また、胎児の脳内、肺内、および腎臓内でも検出される。アイソフォーム２は、胎児の脳内、胎児の肺内、胎児の腎臓内、尾状核内、精巣内、およびがん細胞系内で発現する。Ｗｎｔ３とＷｎｔ３Ａとは、発生しつつある神経管の形態形成時の細胞間シグナル伝達において、顕著に異なる役割を果たし、それぞれ、Ｇｅｎｂａｎｋ参照番号ＮＰ１１０３８０．１および同Ｘ５６８４２（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ：Ｐ５６７０４）を有する。

【0020】

天然ヒトＷｎｔ３Ａのアミノ酸配列およびヌクレオチド配列はそれぞれ、配列番号１および２として具体的に開示される。Ｗｎｔ３Ａは、骨髄内で発現する。Ｗｎｔ４は、Ｇｅｎｂａｎｋ参照番号ＮＰ１１０３８８．２を有する。Ｗｎｔ５ＡおよびＷｎｔ５Ｂは、Ｇｅｎｂａｎｋ参照番号ＮＰ００３３８３．１および同ＡＫ０１３２１８を有する。Ｗｎｔ６は、Ｇｅｎｂａｎｋ参照番号ＮＰ００６５１３．１を有し、Ｗｎｔ７Ａは、胎盤内、腎臓内、精巣内、子宮内、胎児の肺内、ならびに胎児および成体の脳内で発現し、Ｇｅｎｂａｎｋ参照番号ＮＰ００４６１６．２を有する。Ｗｎｔ７Ｂは、胎児の脳内で中程度に発現し、胎児の肺内および腎臓内で弱く発現し、成体の脳内、肺内、および前立腺内で軽微に発現し、Ｇｅｎｂａｎｋ参照番号ＮＰ４７８６７９．１を有する。Ｗｎｔ８Ａは、２つの代替的な転写物である、Ｇｅｎｂａｎｋ参照番号ＮＰ１１４１３９．１および同ＮＰ４９０６４５．１を有する。Ｗｎｔ８Ｂは、前脳で発現し、Ｇｅｎｂａｎｋ参照番号ＮＰ００３３８４．１を有する。Ｗｎｔ１０Ａは、Ｇｅｎｂａｎｋ参照番号ＮＰ０７９４９２．２を有する。Ｗｎｔ１０Ｂは、大半の成体組織内で検出され、心臓内および骨格筋内のレベルが最も高い。Ｗｎｔ１０Ｂは、Ｇｅｎｂａｎｋ参照番号ＮＰ００３３８５．２を有する。Ｗｎｔ１１は、胎児の肺内、腎臓内、成体の心臓内、肝臓内、骨格筋内、および膵臓で発現し、Ｇｅｎｂａｎｋ参照番号ＮＰ００４６１７．２を有する。Ｗｎｔ１４は、Ｇｅｎｂａｎｋ参照番号ＮＰ００３３８６．１を有する。Ｗｎｔ１５は、胎児の腎臓内および成体の腎臓内で中程度に発現し、また、脳内でも見出される。Ｗｎｔ１５は、Ｇｅｎｂａｎｋ参照番号ＮＰ００３３８７．１を有する。Ｗｎｔ１６は、２つのアイソフォームである、Ｗｎｔ−１６ａおよびＷｎｔ−１６ｂを有し、代替的なスプライシングにより産生される。アイソフォームであるＷｎｔ−１６Ｂは、脾臓、虫垂、およびリンパ節などの末梢リンパ器官内、腎臓内で発現するが、骨髄内では発現しない。アイソフォームであるＷｎｔ−１６ａは、膵臓内に限り、著明なレベルで発現する。Ｇｅｎｂａｎｋ参照番号は、ＮＰ０５７１７１．２およびＮＰ４７６５０９．１である。列挙される、全てのＧｅｎＢａｎｋによる配列、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔによる配列、および他のデータベースによる配列は、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。

【0021】

「天然配列のＷｎｔタンパク質」または「天然配列のＷｎｔポリペプチド」という用語は、Ｎ末端の開始メチオニン（Ｍｅｔ）を伴う天然タンパク質またはこれを伴わない天然タンパク質、および天然のシグナル配列を伴う天然タンパク質またはこれを伴わない天然タンパク質を含む。用語は、３５２アミノ酸の長さの天然ヒトＷｎｔ３ａポリペプチドであって、そのＮ末端のメチオニン（Ｍｅｔ）を伴うポリペプチドまたはこれを伴わないポリペプチド、および天然のシグナル配列を伴うポリペプチドまたはこれを伴わないポリペプチドを具体的に含む。

【0022】

「変異体」ポリペプチドとは、下記で規定される、生物学的に活性なポリペプチドであって、天然配列のポリペプチドとの配列同一性が１００％未満であるポリペプチドを意味する。このような変異体は、１または複数のアミノ酸残基を、天然配列のＮ末端もしくはＣ末端において、または天然配列内に付加しており、約１〜４０アミノ酸残基を欠失させており、任意選択で、１または複数のアミノ酸残基で置換したポリペプチド；および上記のポリペプチドの誘導体であって、結果として得られる産物が、天然に存在しないアミノ酸を有するように、アミノ酸残基を共有結合的に修飾した誘導体を含む。通常、生物学的に活性なＷｎｔ変異体は、天然配列のＷｎｔポリペプチドとの、少なくとも約９０％、好ましくは、少なくとも約９５％、より好ましくは、少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有するであろう。

【0023】

「キメラ」Ｗｎｔポリペプチドとは、Ｗｎｔポリペプチドまたはその部分（例えば、１または複数のドメイン）を含むポリペプチドであって、異種ポリペプチドへと融合または結合させたポリペプチドである。キメラＷｎｔポリペプチドは、天然配列のＷｎｔポリペプチドと共通の、少なくとも１つの生物学的特性を一般に共有するであろう。キメラポリペプチドの例は、Ｗｎｔポリペプチドの一部を、免疫グロブリン配列と組み合わせる、イムノアドヘシン、およびエピトープタグ付けされたポリペプチドであって、「タグポリペプチド」へと融合させたＷｎｔポリペプチドまたはその部分を含むポリペプチドを含む。タグポリペプチドは、それに対する抗体を作製しうるエピトープをもたらすのに十分な残基を有するが、Ｗｎｔポリペプチドの生物学的活性に干渉しないように十分に短い。適切なタグポリペプチドは一般に、少なくとも６アミノ酸残基を有し、通常、約６〜６０アミノ酸の間の残基を有する。

【0024】

天然配列のＷｎｔポリペプチドの「機能的誘導体」とは、天然配列のＷｎｔポリペプチドと共通の定性的生物学的特性を有する化合物である。「機能的誘導体」は、それらが、対応する天然配列のＷｎｔポリペプチドと共通の生物学的活性を有することを条件として、天然配列のＷｎｔポリペプチドの断片、ならびに天然配列のＷｎｔポリペプチドおよびその断片の誘導体を含むがこれらに限定されない。「誘導体」という用語は、Ｗｎｔポリペプチドのアミノ酸配列の変異体およびその共有結合的修飾の両方を包含する。

【0025】

生物学的に活性なＷｎｔ。本発明の方法は、動物、例えば、ヒトなどの哺乳動物へと、ｉｎ ｖｉｖｏで投与されると、活性となるＷｎｔ組成物を提供する。組成物中のＷｎｔタンパク質の比活性は、機能アッセイ、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイにおいて、または試験モデル、例えば、骨再生の加速化、幹細胞増殖の上方調節などにおけるｉｎ ｖｉｖｏ投与の後で、活性のレベルを決定し、非機能的アッセイ、例えば、免疫染色、ＥＬＩＳＡ、クーマシー染色ゲル上または銀染色ゲル上の定量化などにおいて存在するＷｎｔタンパク質の量を定量化し、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて生物学的に活性なＷｎｔの、全Ｗｎｔに対する比を決定することにより決定することができる。

【0026】

脂質構造。本発明の方法で使用される通り、脂質構造は、ｉｎ ｖｉｖｏ投与後におけるＷｎｔタンパク質の活性の維持において重要であることが見出されている。Ｗｎｔタンパク質は、これらの構造の水性相中で被包されず、むしろ脂質膜へと組み込まれ、膜の外層内に挿入される場合もある。このような構造は、タンパク質を、例えば、リポソーム内で処方する従来の方法からは予測されない。本明細書では、このような脂質構造を伴うＷｎｔポリペプチドを、Ｌ−Ｗｎｔ３ａなど、Ｌ−Ｗｎｔと称する。Ｗｎｔタンパク質を、リポソームまたはミセルの外部表面へと係留するために使用される方法では、タンパク質のリポソーム外における提示を強調するような配列を活用することができるが、この方法では、まず、粗リポソームをあらかじめ形成し、次いで、Ｗｎｔタンパク質を、リポソーム外Ｗｎｔの付加に好適な粗混合物へと付加した後、多様な処方ステップであって、サイズ濾過、透析などを含みうる処方ステップを施す。適切な脂質は、脂肪酸、トリアシルグリセロールなどの中性脂肪、脂肪酸エステルおよび石鹸、長鎖（脂肪）アルコールおよび蝋、スフィンゴイドおよび他の長鎖塩基、糖脂質、スフィンゴ脂質、カロテン、ポリプレノール、ステロールなどのほか、テルペンおよびイソプレノイドを含む。例えば、ジアセチレンリン脂質などの分子を使用することができる。脂質、合成脂質、および脂質類似体を含むカチオン性分子であって、疎水性部分および親水性部分、正味の正電荷を有し、水中で二重層小胞またはミセルへと、それ自体で自発的に形成されうるカチオン性分子が含まれる。中性電荷を伴って製造されたリポソーム、例えば、ＤＭＰＣが好ましい。用語はまた、リン脂質と組み合わせた脂質ミセルまたは脂質二重層へと安定的に組み込まれうる任意の両親媒性分子であって、その疎水性部分を、内部のミセル膜または二重層膜の疎水性領域と接触させ、その極性ヘッド基部分を、外部の極性の膜表面へと配向させた、両親媒性分子も含む。

【0027】

「カチオン性両親媒性分子」という用語は、生理学的ｐＨで正に帯電した分子であり、より特定すれば、構成的に正に帯電した分子であって、例えば、四級アンモニウム塩部分を含む分子を包含することを意図する。カチオン性両親媒性分子は、親水性の極性ヘッド基と、親油性の脂肪族鎖とからなることが典型的である。同様にまた、カチオン性の極性ヘッド基を有するコレステロール誘導体も、有用でありうる。例えば、Ｆａｒｈｏｏｄら（１９９２年）、Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ、１１１１巻：２３９〜２４６頁；Ｖｉｇｎｅｒｏｎら（１９９６年）、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． （ＵＳＡ）、９３巻：９６８２〜９６８６頁を参照されたい。目的のカチオン性両親媒性分子は、例えば、イミダゾリニウム誘導体（ＷＯ９５／１４３８０）、グアニジン誘導体（ＷＯ９５／１４３８１）、ホスファチジルコリン誘導体（ＷＯ９５／３５３０１）、およびピペラジン誘導体（ＷＯ９５／１４６５１）を含む。本発明で使用されうるカチオン性脂質の例は、ＤＯＴＩＭ（また、ＢＯＤＡＩとも呼ばれる）（Ｓａｌａｄｉｎら、（１９９５年）、Ｂｉｏｃｈｅｍ．、３４巻：１３５３７〜１３５４４頁）、ＤＤＡＢ（Ｒｏｓｅら、（１９９１年）、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１０巻（４号）：５２０〜５２５頁）、ＤＯＴＭＡ（米国特許第５，５５０，２８９号）、ＤＯＴＡＰ（ＥｉｂｌおよびＷｏｏｌｅｙ（１９７９年）、Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．、１０巻：２６１〜２７１頁）、ＤＭＲＩＥ（Ｆｅｉｇｎｅｒら、（１９９４年）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６９巻（４号）：２５５０〜２５６１頁）、ＥＤＭＰＣ（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ、Ａｌａｂａｓｔｅｒ、Ａｌａ．から市販されている）、ＤＣＣ ｈｏｉ（ＧａｕおよびＨｕａｎｇ（１９９１年）、Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍ．、１７９巻：２８０〜２８５頁）、ＤＯＧＳ（Ｂｅｈｒら、（１９８９年）、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、８６巻：６９８２〜６９８６頁）、ＭＢＯＰ（また、ＭｅＢＯＰとも呼ばれる）（ＷＯ９５／１４６５１）、およびＷＯ９７／００２４１において記載されているカチオン性脂質を含む。

【0028】

活性のために必要とされるわけではないが、一部の実施形態では、脂質構造は、標的化基、例えば、親水性ヘッド基に共有結合的または非共有結合的に結合させた標的化部分を含みうる。標的化部分に結合させるのに有用なヘッド基は、例えば、ビオチン、アミン、シアノ、カルボン酸、イソチオシアネート、チオール、ジスルフィド、ハロカルボニル（ａｈａｌｏｃａｒｂｏｎｙｌ）化合物、ａ，ｐ−不飽和カルボニル化合物、アルキルヒドラジンなどを含む。標的化部分を両親媒性分子へと連結するときに使用される化学基はまた、当技術分野で公知の、カルバメート；アミド（アミン＋カルボン酸）；エステル（アルコール＋カルボン酸）、チオエーテル（ハロアルカン＋スルフヒドリル；マレイミド＋スルフヒドリル）、シッフ塩基（アミン＋アルデヒド）、尿素（アミン＋イソシアネート）、チオ尿素（アミン＋イソチオシアネート）、スルホンアミド（アミン＋スルホニルクロリド）、ジスルフィド；ヒドラゾン、脂質なども含む。例えば、標的化分子は、ＤＡＧＰＥ、ＰＥＧ−ＰＤＡアミン、ＤＯＴＡＰなど、市販の脂質を、イソシアネートへと転換した後で、トリエチレングリコールジアミンスペーサーによって処理して、アミンを末端とするチオカルバメート脂質を生成させ、ここから、標的化部分の、パラ−イソチオシアノフェニルグリコシドによる処理によって、所望の標的化糖脂質を生成させることにより、形成することができる。この合成により、水溶性の可撓性リンカー分子であって、ナノ粒子へと組み込まれる両親媒性分子と、細胞表面受容体に結合するリガンドとの間を隔て、リガンドを、細胞表面上のタンパク質受容体へとたやすく接近可能とする、リンカー分子がもたらされる。リポソームＷｎｔ組成物およびそれらの使用についてのさらなる情報は、米国出願公開第２０１２０１１５７８８号において見出される。

【0029】

本明細書では、「骨移植片」という用語は、最も広い意味で使用され、それぞれ、患者自身の骨、または移植片を施される個体以外の個体であって、遺体を含む個体から採取された、自家移植片および同種移植片を具体的に含む。「骨移植片」という用語また、自家または同種の多能性幹細胞集団、例えば、骨髄から採取された幹細胞、例えば、骨髄由来間葉系幹細胞も含む。骨移植片は、リーマー法、潅流法、吸引法を含むがこれらに限定されない、多様な手段により、ドナーから得ることができる。

【0030】

実施形態の詳細な説明
骨形成能力は、骨移植のための細胞を、有効用量のＷｎｔタンパク質、例えば、Ｌ−Ｗｎｔ３Ａと共に、骨形成潜在能を増強するのに十分な期間にわたり、インキュベートすることにより増強される。

【0031】

本明細書で使用される骨移植片材料とは、ドナーから得られた細胞組成物を指し、ドナーは、生体の場合もあり、遺体の場合もある。骨移植片材料は、複雑な細胞集団を含むことが典型的であり、間葉系幹細胞などの幹細胞を含み、また、骨細胞およびそれらの前駆細胞も含みうる。ドナーは、レシピエントと比べて、同種の場合もあり、自家の場合もある。骨移植片のための細胞の量は、ドナー、レシピエント、移植の目的などにより変化しうる。骨移植片は、最大約１０^３、最大約１０^４、最大約１０^５、最大約１０^６、最大約１０^７、最大約１０^８、最大約１０^９、最大約１０^１０個またはこれを超える細胞を含みうる。

【0032】

骨移植片材料は、ドナー、例えば、腸骨稜、おとがい結合（顎領域）から得られ、大腿骨および／または脛骨、腓骨、肋骨、下顎枝前部；背骨の部分、例えば、手術時に摘出される部分、遺体の骨などのリーミング、吸引、および潅流から得られる。移植片材料は、骨髄、例えば、適切な骨の骨内膜面からこすり取られた骨髄の場合もあり、骨髄および骨の小ブロックを含有するブロック移植片の場合もある。同種移植骨は、遺体、骨バンクなど、例えば、股関節置換術による大腿骨頭から採取することができる。骨移植片材料は、採取直後に使用することもでき、当技術分野で公知の通り、必要となるまで低温保存することもできる。

【0033】

骨移植片の細胞は、有効用量のリポソームＷｎｔタンパク質、例えば、Ｌ−Ｗｎｔ３Ａの存在下で、適切な培養培地中に懸濁させる。例えば、ＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ、ＰＢＳなど、任意の適切な培地を使用することができる。細胞は、インキュベーション手順中の生存可能性を維持する濃度、例えば、１ｍｌ当たり最大約１０^４個、１ｍｌ当たり最大約１０^５個、１ｍｌ当たり最大約１０^６個、１ｍｌ当たり最大約１０^７個で再懸濁させることが典型的である。インキュベーション温度は、通常、約３７℃を超えず、これより低温、例えば、最大約３２℃、最大約２５℃、最大約１５℃、最大１０℃、最大約４℃でありうるが、具体的に低温保存のために調製するのでない限り、氷点を上回ることが典型的である。

【0034】

Ｗｎｔタンパク質の有効用量は、供給源、純度、調製法などに応じて変化しうる。Ｗｎｔタンパク質がＬ−Ｗｎｔ３Ａである場合、有効用量は、通常、少なくとも約０．１μｇ／ｍｌ、少なくとも約０．５μｇ／ｍｌ、少なくとも約１μｇ／ｍｌ、少なくとも約２．５μｇ／ｍｌ、少なくとも約５μｇ／ｍｌ、少なくとも約７．５μｇ／ｍｌ、少なくとも約１０μｇ／ｍｌ、少なくとも約１５μｇ／ｍｌであり、少なくとも約２５μｇ／ｍｌ、少なくとも約５０μｇ／ｍｌ、少なくとも約１００μｇ／ｍｌでありうる。

【0035】

骨移植片材料は、Ｗｎｔタンパク質と共に、骨形成能を増強するのに十分な期間にわたり、インキュベートする。増強は、多様な方式で測定することができ、例えば、Ａｘｉｎ２の発現の増大により測定することもでき、骨移植片材料内の有糸分裂活性（移植後約２日目〜約６日目に測定する）の増大により測定することもでき、移植後における骨形成の増大により測定することもでき、Ｒｕｎｘ２またはオステオカルシンの発現の増大により測定することもでき、移植後におけるアポトーシスの低減により測定することもでき、移植後に産生された骨の容量により測定することもできる。増大した骨の容量は、ｗｎｔ処置の非存在下で得られる容量と比べて、約１．５倍、約２倍、約３倍であるか、またはこれを超えることが可能である。

【0036】

骨移植片材料は、通常、Ｗｎｔタンパク質と、少なくとも約１時間、少なくとも約２時間、および最長約３６時間、最長約２４時間、最長約１８時間、最長約１５時間、最長約１２時間、最長約８時間、最長約６時間、最長約４時間にわたり接触させる。

【0037】

インキュベーション後、骨移植片材料は、例えば、背骨の修復、骨折、歯科支持体などのための従来のプロトコールにしたがって、レシピエントへと移植することができる。

【0038】

Ｗｎｔタンパク質を伴うインキュベーションにより、特に、高齢骨移植片に対し骨形成能を回復させる。まず、リポソームＷｎｔ３ａ処置により、高齢骨移植片内の細胞死を低減する。その後の移植後、リポソームＷｎｔ３ａで処置された骨移植片により、有意に多くの骨（ｐ＜０．０５）が産生された。実施例から明らかとなる通り、リポソームＷｎｔ３ａ処置により、移植片内の細胞の生存が増強され、高齢動物に由来する移植片の骨を形成する能力が再確立された。

【0039】

したがって、本発明は、高齢患者に由来する骨移植片、および治癒潜在能が低下した他の患者であって、例えば、喫煙者、糖尿病患者、または栄養不良を伴う患者などの患者に由来する骨移植片を再活性化するための、安全で、有効で、臨床的に適用可能な、再生医療ベースの戦略を提供する。

【0040】

本明細書で引用される、全ての学術刊行物、ならびに特許公開、特許、および特許出願は、各個別の刊行物が、参照により組み込まれることが具体的に、かつ、個別に示された場合と同様に、参照により本明細書に組み込まれる。本発明のさらなる詳細については、以下の非限定的な実施例に提示する。

【実施例】

【0041】

（実施例１）
Ｗｎｔ３ａは、高齢動物に由来する骨移植片に対して骨形成能を再確立する
加齢に伴う骨髄の脂肪変性は、老齢者における骨折治癒の遅延および骨粗鬆症関連骨折に寄与する。この脂肪変化の根底をなす機構は、高齢骨髄腔内のＷｎｔシグナル伝達レベルと関連する可能性がある。若齢では、長骨は、ヘムに富む骨髄で満たされているが、年齢と共に、脂肪性骨髄で置きかえられる。骨髄の加齢に伴う脂肪変性は、老齢者における骨格治癒の遅延および骨粗鬆症関連骨折と強く関連し、これは、生物医学的負荷の増大を構成する。結果として、骨髄の、主に脂肪性の組織への転換を理解しようと、多大な努力がなされている。この骨髄の脂肪変性は、骨形成潜在能の喪失と並行して生じ、これは、骨髄を、骨移植の目的で、臨床的に使用する場合に明らかとなる。

【0042】

患者自身の骨および骨髄は、「ゴールドスタンダード」と考えられているが、患者が老齢者である場合、これらの自家移植片は、多くの場合、不適切である。骨髄腔には、少なくとも複数の、顕著に異なる幹細胞集団／前駆細胞集団であって、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を含む細胞集団が存在する。ＭＳＣは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養されると、軟骨細胞、骨細胞、脂肪細胞、および筋細胞を発生させうるが、骨髄腔内に存在するＭＳＣ自体は、骨形成または脂肪形成系統だけに分化し、ますます多くの証拠により、この脂肪形成−骨形成運命の決定は、ベータカテニン依存性のＷｎｔシグナル伝達により調節されることが示されている。例えば、Ｗｎｔ ＬＲＰ５受容体内の活性化変異により、Ｗｎｔシグナル伝達を増強すると、ヒトにおいて、高骨量の表現型がもたらされる。ｉｎ ｖｉｔｒｏでは、この同じ活性化変異は、ヒト間葉系幹細胞の脂肪細胞への分化を抑圧する。他方、例えば、溶骨性疾患である多発性骨髄腫における、Ｗｎｔシグナル伝達の低減は、侵襲性の骨喪失、および造血を犠牲にした、骨髄における脂肪形成の共時的な増大と関連する。まとめると、これらの観察は、Ｗｎｔシグナル伝達が、骨形成の刺激および脂肪形成の阻害において、肯定的な役割を果たすという仮説を裏付ける。

【0043】

トランスジェニックマウスを、同系骨移植片モデルと共に使用して、生着に関与する細胞の運命を追跡した。免疫組織化学を、定量的アッセイと共に使用して、若齢マウスおよび高齢マウスに由来する骨移植片内のＷｎｔシグナル伝達ならびに脂肪形成遺伝子および骨形成遺伝子の発現を評価した。リポソームＷｎｔ３ａタンパク質（Ｌ−Ｗｎｔ３ａ）を、それが、マウスおよびウサギにより創出された臨界サイズ欠損モデルにおける高齢骨移植片に対して骨形成潜在能を回復させる能力について調べた。Ｘ線撮影、ｍｉｃｒｏ−ＣＴの再構成、組織学、および組織形態計測による測定を使用して、Ｌ−Ｗｎｔ３ａ処置または対照であるＬ−ＰＢＳ処置から生じる骨治癒を定量化した。骨移植片の遺伝子発現プロファイリングにより、老化は、骨形成プロファイルから遠ざかり、脂肪形成プロファイルへと向かうシフトと関連することが裏付けられた。この加齢に伴う脂肪形成へのシフトには、高齢動物に由来する骨移植片内の、Ｗｎｔ発現およびＷｎｔ活性の有意な低減（ｐ＜０．０５）が随伴した。

【0044】

トランスジェニックマウスを、同系骨移植片モデルと共に使用して、生着に関与する細胞の運命を追跡した。免疫組織化学を、定量的アッセイと共に使用して、若齢マウスおよび高齢マウスに由来する骨移植片内のＷｎｔシグナル伝達ならびに脂肪形成遺伝子および骨形成遺伝子の発現を評価した。リポソームＷｎｔ３ａタンパク質（Ｌ−Ｗｎｔ３ａ）を、それが、マウスおよびウサギにより創出された臨界サイズ欠損モデルにおける高齢骨移植片に対して骨形成潜在能を回復させる能力について調べた。Ｘ線撮影、微量定量コンピュータ断層撮影（ｍｉｃｒｏ−ＣＴ）の再構成、組織学、および組織形態計測による測定を使用して、Ｌ−Ｗｎｔ３ａ処置または対照物質（リポソームリン酸緩衝食塩液［Ｌ−ＰＢＳ］）から生じる骨治癒を定量化した。

【0045】

骨移植片内の細胞の遺伝子発現プロファイリングにより、年齢と共に、骨形成遺伝子プロファイルから遠ざかり、脂肪形成のものと向かうシフトが裏付けられた。この加齢に伴う脂肪形成へのシフトには、Ｗｎｔシグナル伝達の有意な低減（ｐ＜０．０５）および骨形成潜在能の喪失が随伴した。大型動物モデルおよび小型動物モデルのいずれにおいても、幹細胞因子であるＷｎｔ３ａを伴う、短時間のインキュベーションにより、高齢骨移植片に対して骨形成能力を回復させた。加えて、リポソームＷｎｔ３ａにより、骨移植片内の細胞死が有意に低減される結果として、対照と比較して有意により骨性の再生物がもたらされた。

【0046】

高齢患者に由来する骨移植片を再活性化するための、有効で、臨床的に適用可能な、再生医療ベースの戦略では、リポソームＷｎｔ３ａにより、細胞の生存が増強され、高齢動物に由来する骨移植片の骨形成能が再確立される。

【0047】

材料と方法
動物：全ての手順は、Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ Ａｎｉｍａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈにより承認された。Ａｘｉｎ２^{ＬａｃＺ／＋}マウスについては、記載されている。ベータ−アクチン増強緑色蛍光タンパク質（ＡＣＴＢ−ｅＧＦＰ）トランスジェニックマウス（Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｓａｃｒａｍｅｎｔｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）は、骨内、骨髄内、および他の関与性の細胞集団内のＧＦＰの頑健な発現レベルのために選択した。ＡＣＴＢ−ｅＧＦＰトランスジェニックマウスを、Ａｘｉｎ２^{ＬａｃＺ／＋}マウスと交配させて、Ａｘｉｎ２^{ＬａｃＺ／＋}マウス、Ａｘｉｎ２^{ＬａｃＺ／＋}／ＡＣＴＢ−ｅＧＦＰマウス、ＡＣＴＢ−ｅＧＦＰマウス、および野生型（ＷＴ）マウスを得；１２〜１６週齢のマウスを、若齢と考え、４０週齢を超えるマウスは、高齢と考えた。高齢（８カ月齢）のニュージーランドホワイトウサギも使用した。ウサギ１匹を、骨移植片ドナーとして用い、ウサギ９匹を、実験動物として用いた。

【0048】

マウスにおける骨移植：ケタミン（８０ｍｇ／ｋｇ）およびキシラジン（１６ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射により、宿主マウス（雄だけ）に麻酔をかけた。３ｍｍの切開を施して、頭頂骨を露出させ、マイクロダイセクション用穿頭器を使用して、直径を２ｍｍとする、環状の全層欠損を創出したが、硬膜は攪乱させなかった。骨移植片を、大腿骨および脛骨から採取し、プールし、アリコートへと分割した。２０μＬずつのアリコートを、３７℃、リポソームリン酸緩衝食塩液（Ｌ−ＰＢＳ）またはリポソームＷｎｔ３ａタンパク質（Ｌ−Ｗｎｔ３ａ）（有効濃度＝０．１５μｇ／ｍＬ）を含有する１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）１０μＬ中でインキュベートする一方で、頭蓋冠欠損を調製した。骨移植片を、頭蓋冠欠損へと移植し、皮膚を閉止した。

【0049】

ウサギにおける骨移植：宿主ウサギに、グリコピロレート（０．０２ｍｇ／ｋｇ）およびブプレノルフィン（０．０５ｍｇ／ｋｇ）の皮下注射、ケタミン（３５ｍｇ／ｋｇ）およびキシラジン（５ｍｇ／ｋｇ）の筋内注射、ならびにセファゾリン（２０ｍｇ／ｋｇ）の静脈内注射で麻酔をかけ、１％〜３％のイソフルラン下で維持した。２．５ｃｍの切開を施し、尺側縁を視覚化し、振動鋸（Ｓｔｒｙｋｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ ５、Ｋａｌａｍａｚｏｏ、Ｍｉｃｈｉｇａｎ）により１．５ｃｍの部分欠損を創出した。部分を、その骨膜組織と共に摘出した。骨移植片を、骨盤および大腿骨から採取し、プールし、アリコートへと分割した。およそ４００ｍｇずつのアリコートを、Ｌ−ＰＢＳ（５００μＬ）またはＬ−Ｗｎｔ３ａ（有効濃度＝０．５μｇ／ｍＬ）と組み合わせ、バックテーブル上の氷上で維持する一方で、宿主ウサギにおいて、尺骨欠損を創出した。骨移植片を、尺骨欠損へと移植し、筋肉および皮膚を閉止した。手順は、左右に実施した（すなわち、両側に、Ｌ−ＰＢＳまたはＬ−Ｗｎｔ３ａを施した）。この手法により、いかに遠隔なものであれ、骨移植片に、予期しない全身性の影響が及ぶ可能性を排した。

【0050】

ウサギ骨髄のｉｎ ｖｉｔｒｏでのＷｎｔ刺激：高齢ウサギに由来する骨髄を、Ｌ−ＰＢＳまたはＬ−Ｗｎｔ３ａ（有効濃度＝０．１５μｇ／ｍＬ）と共に、３７℃で１２時間にわたりインキュベートした。全ＤＮＡについては、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ ｄｓＤＮＡキット（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を使用することによりアッセイして、移植片が同等の細胞容量を有することを確認した。カスパーゼ活性については、標準的なキット（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、Ｉｎｄｉａｎａ）を使用することによりアッセイした。

【0051】

組織の調製：安楽死（各実験で指定された時点）の直後、筋肉、結合組織、および／または硬膜を含む、骨格の全要素を採取し、その表皮を除去し、４％のパラホルムアルデヒド中、４℃で１２時間にわたり固定した。パラフィン中または最適切断温度（ＯＣＴ）の化合物中に包埋する前に、試料を、１９％ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）中で脱灰した。切片は、１０μｍの厚さとした。

【0052】

組織学解析、免疫組織化学解析、および組織形態計測解析：免疫組織化学は、既に記載されている通りに実施した。使用される抗体は、ウサギポリクローナル抗緑色蛍光タンパク質（抗ＧＦＰ）（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｄａｎｖｅｒｓ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）、ウサギポリクローナル抗ＤＬＫ１（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）、抗ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体−γ（抗ＰＰＡＲ−γ）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、および抗Ｋｉ６７（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を含んだ。ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｍａｒｉｌｌｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）アッセイおよび末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼｄＵＴＰニック末端標識（ＴＵＮＥＬ）（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）アッセイは、製造元の指示書に従い実施した。

【0053】

モバットペンタクローム染色、アニリンブルー染色、Ｘｇａｌ染色、およびアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）染色は、既に記載されている通りに実施した。組織切片は、Ｌｅｉｃａ ＤＭ５０００Ｂデジタル画像化システム（Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｗｅｔｚｌａｒ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して写真撮影した。試料１例当たり最低５つずつの組織切片を、組織形態計測解析に使用した。

【0054】

微量定量コンピュータ断層撮影（ｍｉｃｒｏ−ＣＴ）解析：マウスに、２％のイソフルランで麻酔をかけ、４０ｍｍの分解能で、マルチモードポジトロン断層法−コンピュータ断層撮影データ収集システム（Ｉｎｖｅｏｎ ＰＥＴ−ＣＴ；Ｓｉｅｍｅｎｓ、Ｅｒｌａｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して走査した。データは、ＭｉｃｒｏＶｉｅｗソフトウェア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｃｈｉｃａｇｏ、Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）で解析した。三次元関心領域ツールを使用して、各試料について、構造および骨容量を割り当てた。

【0055】

再生骨容量画分（全骨容量を、再生骨容量で除することにより計算される百分率［ＢＶ／ＴＶ、％］）の評価は、高分解能のｍｉｃｒｏ−ＣＴ（ｖｉｖａＣＴ ４０；Ｓｃａｎｃｏ Ｍｅｄｉｃａｌ、Ｂｒｕｅｔｔｉｓｅｌｌｅｎ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、ならびに７０ｋＶｐ、５５μＡ、２００ミリ秒の積分時間、および１０．５μｍのイソトロピックボクセルサイズを使用して実施した。関心領域は、２ｃｍの長さであり、欠損の縁辺部の近位２５０μｍから、欠損の反対側の縁辺部を越えた遠位２５０μｍへと広がる（全直径を１．５ｃｍとする）。骨は、１ｃｍ^３当たりのヒドロキシアパタイト２７５ｍｇの閾値を使用して、軟組織から区分した。走査および解析は、公表されているガイドラインに準拠した。

【0056】

定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）：組織試料は、ＴＲＩｚｏｌ溶液（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中でホモジナイズした。ＲＮＡを単離し（ＲＮｅａｓｙ；Ｑｉａｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ、Ｍａｒｙｌａｎｄ）、逆転写は、既に記載されている通りに実施した（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ Ｐｌａｔｉｎｕｍ Ｔｗｏ−Ｓｔｅｐ ｑＲＴ−ＰＣＲ Ｋｉｔ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。

【0057】

統計学的解析：結果は、平均＋標準偏差として提示し、「ｎ」は、解析される試料の数を意味する。データセット間の有意差は、両側スチューデントのｔ検定およびノンパラメトリックのウィルコクソン検定を使用して決定した。有意性は、ｐ＜０．０５のときに達せられ、全ての統計学的解析は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）により実施した。

【0058】

結果
骨髄移植片は、骨形成潜在能を有する：骨移植片材料の運命を追跡するために、本発明者らは、全骨髄を、ＡＣＴＢ−ｅＧＦＰトランスジェニックマウスから採取し、等サイズのアリコートへと細分し（図１−Ａ）、次いで、同系宿主マウスの頭蓋冠内に創出された、非治癒性の、臨界サイズの骨格欠損へと移植した（図１−Ｂ）。生存可能な移植細胞およびそれらの後代は、それらのＧＦＰ標識により、損傷部位内で同定可能であった（図１−Ｃ）。ドナーと宿主とが遺伝子的に同一でない場合、移植細胞の大半は死滅したが、この理由で、同系であり、免疫学的に適合性のドナー−宿主の組合せだけを使用した。

【0059】

移植後１日目には、ＧＦＰ陽性細胞は、ＧＦＰ陽性ドナーに由来する間質組織と共に、損傷部位を占有した（図１−Ｃ）。５日目には、ＢｒｄＵ染色により、欠損部位内の細胞の頑健な増殖を確認した（図１−Ｄ）。７日目には、ＧＦＰ免疫染色により、移植細胞またはそれらの後代が、欠損部位に存続していることを確認した（図１−Ｅおよび１−Ｆ）。移植細胞および／またはそれらの後代は最終的に、骨芽細胞へと分化し、欠損を治癒させ（図１−Ｈおよび１−Ｊ）、骨移植片の非存在下では、欠損は治癒しないであろう（図１−Ｇおよび１−Ｉ）。

【0060】

高齢骨移植片は、脂肪変性を呈示する：老化と共に、ヒト骨髄は、脂肪変性および骨形成潜在能の喪失を経る。マウスにおいて、同等な加齢に伴う変化が観察され、ここでは、マウス骨髄の巨視的な外見は、若齢動物における、ヘムに富み、脂肪を含まない組織から、高齢動物における脂肪性骨髄へと変化する。骨移植片を構成する不均質な細胞集団についての定量的ＲＴ−ＰＣＲ解析により、若齢動物に由来する試料と比べて、高齢動物に由来する試料は、脂肪形成遺伝子である、脂肪酸結合性タンパク質４（Ｆａｂｐ４）（ｐ＜０．０１）およびペルオキシソーム増殖剤活性化受容体ガンマ（ＰＰＡＲ−γ）（ｐ＜０．０１）の有意に高度な発現を示すことが示された。この脂肪形成へのシフトと同時に、高齢マウスに由来する骨移植片はまた、骨形成遺伝子である、ＡＬＰ（ｐ＜０．０５）、オステオカルシン（ｐ＜０．０１）、およびｏｓｔｅｒｉｘ（ｐ＜０．０５）の発現レベルの有意な低減も示した。したがって、ヒトにおいて観察される骨髄の脂肪変性は、マウスにおいても、巨視的な形態レベルおよび定量可能な分子レベルの両方で反復されている。

【0061】

脂肪変性は、骨移植片内の骨形成潜在能の低減と関連する：若齢動物に由来する移植片の骨形成能と比較して、高齢動物に由来する移植片が発生させる新たな骨は、有意に少なかった（図２−Ａおよび２−Ｂ；２−Ｃで定量化されている；ｐ＜０．０５）。この、加齢に伴う骨形成潜在能の低減は、生着効率の差異には直接帰せられなかった。ＧＦＰ免疫染色を使用して、移植細胞を同定したところ、ＧＦＰ陽性細胞の分布および数は、若齢マウスに由来する骨移植片と、高齢マウスに由来する骨移植片との間でほぼ同等であった（図２−Ｄおよび２−Ｅ；２−Ｆで定量化されている）。加齢に伴う骨形成潜在能の変化はまた、移植片の拡大の差異にも帰せられなかった：ＢｒｄＵ取込み（図２−Ｇおよび２−Ｈ）および増殖細胞核内抗原（ＰＣＮＡ）についてのｑＲＴ−ＰＣＲ（図２−Ｉ）の両方を使用したところ、本発明者らは、若齢動物に由来する骨移植片と、高齢動物に由来する骨移植片とで、ほぼ同等レベルの細胞増殖を見出した。

【0062】

本発明者らは、骨髄細胞における１９種の哺乳動物Ｗｎｔ遺伝子の発現レベルを評価したところ、高齢骨移植片の脂肪変性および骨形成潜在能の喪失についての基礎に対する洞察を得た。Ｗｎｔ遺伝子のサブセットは、高齢動物に由来する骨髄内では、若齢動物と比較して弱く発現した（ｐ＜０．０５；図３−Ａ）。このＷｎｔ遺伝子発現の低減は、Ｗｎｔの直接的な標的遺伝子である、Ｔｃｆ４、Ｌｅｆ１、およびＡｘｉｎ２の発現の有意な減殺（ｐ＜０．０５；図３−Ｂ）により測定される通り、Ｗｎｔ応答性の低減と匹敵した。これらの結果は、Ｗｎｔシグナル伝達が、高齢骨髄内で低減されることを裏付ける。

【0063】

Ｌ−Ｗｎｔ３ａは、高齢マウスに由来する骨移植片の骨形成能を回復させる：精製される最初のＷｎｔタンパク質は、Ｗｎｔ３ａであった。Ｗｎｔ３ａは、「正準な」経路またはベータ−カテニン依存性経路を介して作用し、周知の骨形成刺激である。高齢骨髄内でＷｎｔシグナル伝達が低減されることを踏まえ、本発明者らは、外因性Ｗｎｔタンパク質の添加で、高齢動物に由来する骨移植片の骨形成潜在能を再確立するのに十分であるのかどうかという疑問を呈した。

【0064】

全ての脊椎動物Ｗｎｔタンパク質は、疎水性であり、担体なしでは、疎水性のＷｎｔ３ａは、急速に変性し、不活性となる。本発明者らは、疎水性のＷｎｔ３ａを、脂質粒子内に封入することにより、このｉｎ ｖｉｖｏにおける送達の問題を解決した。このヒトＷｎｔ３ａタンパク質の処方物である、リポソームＷｎｔ３ａ（Ｌ−Ｗｎｔ３ａ）は、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて安定であり、改変骨折モデルにおける頑健な骨再生を促進する。外因的に適用されるＷｎｔ３ａは、治療用タンパク質としての大きな潜在的可能性を有するが、安全性は、依然として主要な懸念である。高濃度の強力な増殖因子の、骨格損傷部位への送達は、これに、患者に対する潜在的な腫瘍学の危険性も伴う。増殖因子への、長期にわたる、または無制御の曝露と関連した問題を回避するため、本発明者らは、Ｌ−Ｗｎｔ３ａを、ｅｘ ｖｉｖｏで送達した。これは、レシピエント部位を調製する一方で、高齢骨移植片を、採取の直後に、Ｌ−Ｗｎｔ３ａ（ｎ＝３０）と共にインキュベートすることにより達成した。対照の骨移植片を、Ｌ−ＰＢＳ（ｎ＝３０）へと、同じ持続時間にわたり曝露した。

【0065】

Ｌ−ＰＢＳで処置された高齢移植片（図４−Ａ）と比較して、Ｌ−Ｗｎｔ３ａで処置された高齢移植片は、新たな骨形成の劇的な増強を示した（図４−Ｂ）。７日以内に、Ｌ−Ｗｎｔ３ａで処置された移植片を施された欠損部位には、Ｌ−ＰＢＳで処置された移植片を施された部位の２倍の新たな骨がもたらされた（図４−Ｃ）。１２日目までに、Ｌ−Ｗｎｔ３ａで処置された移植片は、Ｌ−ＰＢＳで処置された移植片と比較して、１．５倍の新たな骨をもたらした（図４−Ｄおよび４−Ｅ；４−Ｃで定量化されている）。

【0066】

骨髄由来幹細胞は、Ｗｎｔ応答性である：骨移植片内のどの細胞集団が、Ｗｎｔによる刺激に応答したのかに対する洞察を得るために、本発明者らは、骨髄の異なる画分を、Ｗｎｔ応答性についてアッセイした。全骨髄では、Ｗｎｔ応答性は、検出可能なレベルを下回った。本発明者らは、全骨髄を、非接着集団へと分離したが、ここでもまた、Ｗｎｔ応答性は、検出限界を下回った（図４−Ｆ）。しかし、結合組織前駆細胞を含有する接着集団^{５３、５４}では、Ｗｎｔ応答性が検出された（図４−Ｆ）。次いで、本発明者らは、確立されたプロトコールを使用して、付着集団に由来する骨髄幹細胞および／または骨髄間質細胞についてさらに濃縮した。ＣＤ４５（−）、ＣＤ７３（＋）、ＣＤ１０５（＋）、およびＳｔｒｏ１（＋）についての免疫染色を使用して、本発明者らは、この集団が、骨髄由来幹細胞について濃縮されることを確認した（図４−Ｇ）。ＰＢＳで処置されたＣＤ４５（−）、ＣＤ７３（＋）、ＣＤ１０５（＋）、およびＳｔｒｏ１（＋）細胞と比べて、Ｗｎｔ３ａで処置された集団は、Ｗｎｔ応答性の１０倍の増大を示した（図４−Ｈ）。

【0067】

本発明者らはまた、Ａｘｉｎ２^{ＬａｃＺ／＋}マウスに由来する骨髄のＸｇａｌ染色を活用して、骨移植片内のＷｎｔ応答性もモニタリングした。高齢骨移植片内で見出されるＸｇａｌ^＋ｖｅ細胞は、極めて少数であった（図４−Ｉ）が、若齢骨移植片内のＸｇａｌ^＋ｖｅ細胞は、極めて多かった（図４−Ｋ）。曝露後におけるＸｇａｌ^＋ｖｅ細胞の増大により示される（図４−Ｊ）通り、高齢骨移植片は、Ｌ−Ｗｎｔ３ａによる刺激に応答することが可能であった。マウス骨髄腔内の幹細胞の存在度は極めて低度であるため、Ｗｎｔ応答性集団は、ＣＤ４５（−）、ＣＤ７３（＋）、ＣＤ１０５（＋）、およびＳｔｒｏ１（＋）集団の細胞をより多く含んだ可能性が高い。

【0068】

Ｌ−Ｗｎｔ３ａは、骨移植片内のアポトーシスを防止する：Ｌ−Ｗｎｔ３ａの頑健な骨誘導能は、本発明者らの研究を、大型動物の長骨モデルへと拡張するように促した。ヒトにおける場合と同様に、高齢ウサギも、それらの骨髄の脂肪変性を経験する。本発明者らは、臨界サイズの尺骨欠損モデルを活用し、Ｌ−ＰＢＳまたはＬ−Ｗｎｔ３ａと共にインキュベートされた高齢骨移植片を、欠損へと移植した。本発明者らはまず、骨移植片を採取すると、凝集物全体にわたり、広範なプログラム細胞死が見られる（図５−Ａ）ことに注目した。Ｌ−Ｗｎｔ３ａを添加することにより、この移植片のアポトーシスが有意に低減された（ｐ＜０．０５）（図５−Ｂ）。本発明者らは、カスパーゼ活性を、細胞のアポトーシスの尺度として活用して、Ｌ−Ｗｎｔ３ａのこの生存促進効果を検証した。Ｌ−Ｗｎｔ３ａにより、骨移植片の細胞内のカスパーゼ活性が有意に低減された（ｐ＜０．０５；図５−Ｃ）。

【0069】

Ｌ−Ｗｎｔ３ａは、高齢骨移植片の骨形成能を強化する：Ｌ−Ｗｎｔ３ａおよびＬ−ＰＢＳで処置されたウサギ骨移植片を、臨界サイズの欠損へと導入し、複数の時点で再生を評価した。４週でのＸ線評価により、Ｌ−Ｗｎｔ３ａで処置された移植片を施された部位内では、架橋性の仮骨の存在が明らかにされた（図５−Ｅ）が、これに対し、Ｌ−ＰＢＳで処置された骨移植片を施された部位で示された仮骨形成は最小限であった（図５−Ｄ）。

【0070】

８週では、ｍｉｃｒｏ−ＣＴ解析により、Ｌ−ＰＢＳ骨移植片で処置された部位内のギャップの存続が裏付けられた（図５−Ｆ）のに対し、Ｌ−Ｗｎｔ３ａ骨移植片で処置された部位は、頑健な骨形成を呈示した（図５−Ｇ）。組織形態計測解析により、骨容量および全容量で除した骨容量のいずれでも、２群間の有意差が確認された（図５−Ｈ）。

【0071】

本発明者らは、骨再生物の質を評価した。対照（図６−Ａ）と比較して、Ｌ−Ｗｎｔ３ａで処置された損傷部位は、新たな骨で満たされた（図６−Ｂ）。宿主ウサギの骨髄は、脂肪変性を生じ（図６−Ｃ）、同様の外見は、Ｌ−ＰＢＳで処置された再生物でも見られた（図６−Ｄ）。Ｌ−Ｗｎｔ３ａで処置された試料（図６−Ｅ）では、宿主の骨髄は、対照動物において見られるのと同様レベルの脂肪変性を示したが、Ｌ−Ｗｎｔ３ａ骨移植片に由来する再生物は、網状骨（図６−Ｆ）であり、部分欠損部位内のその位置およびその網状の外見のいずれにおいても、既存の層板骨から識別可能であった。偏光下では、ピクロシリウスレッド染色により、Ｌ−Ｗｎｔ３ａで処置された骨移植片内で見出される成熟類骨組織（図６−Ｈ）が、Ｌ−ＰＢＳで処置された骨移植片の線維性組織（図６−Ｇ）から識別された。

【0072】

骨移植片内の幹細胞集団および／または前駆細胞集団：哺乳動物の骨髄腔は、複数の幹細胞集団および／または前駆細胞集団を支持する、機能的なニッチである。天然では不均質である、骨髄由来の骨移植片は、いくつかの幹細胞および／または前駆細胞を含む、複数の集団を含有する。しかし、これらの幹細胞および／または前駆細胞の、骨性再生物への寄与について、依然として未知である。複数の骨髄由来幹細胞集団は、Ｗｎｔ応答性であり、確立されたプロトコールを活用して、本発明者らは、骨髄内の、少なくともＣＤ４５（−）、ＣＤ７３（＋）、ＣＤ１０５（＋）、およびＳｔｒｏ１（＋）である幹細胞集団および／または間質細胞集団がＷｎｔ応答性であることを確認した（図４）。

【0073】

Ｗｎｔシグナル伝達および骨髄の加齢に伴う脂肪変性：ｉｎ ｖｉｔｒｏでは、Ｗｎｔシグナル伝達の消滅は、間葉系幹細胞を、脂肪細胞へと分化させるが、Ｗｎｔシグナル伝達の強化は、間葉系幹細胞を、骨芽細胞へと分化させる。これは、直接的な臨床的関与性を有する：年齢と共に、ヒト骨髄は、脂肪変性を生じ、その骨形成潜在能を喪失する。本発明者らのデータは、この高齢骨移植片による骨形成潜在能の喪失が、部分的に、Ｗｎｔシグナル伝達レベルの低減によることを示す：若齢マウスに由来する骨移植片と比較して、高齢骨移植片は、Ｗｎｔ遺伝子発現およびＷｎｔ応答性の劇的な低減を示す（図３）。Ｌ−Ｗｎｔ３ａを、高齢骨髄へと添加することにより、その骨形成の能力が再確立される（図４、５、および６）。

【0074】

また、床上安静の延長など、運動の減少と関連する状態、および骨粗鬆症も、骨髄の脂肪変性と関連する。いくつかのデータは、少なくとも実験では、脂肪変性が可逆性であることを示唆する。明らかに、この変性についての基礎（および骨格内の加齢に伴う変化が低減されうる程度）を理解することは、老齢患者における骨損傷のための新たな処置の案出において、多大な重要性を持ちうるであろう。

【0075】

増殖因子により増進する骨再生：安全第一：近年、骨格の治癒を増進させる増殖因子の使用をめぐり、安全性の懸念が持ち上がっている。増殖因子による刺激は大部分、損傷部位内に存在する細胞の増殖を誘導すると考えられているが、無制御の増殖は、発がん性の形質転換に特徴的であるため、この増殖性のバーストは、空間的にも時間的にも制御しなければならない。この理由で、本発明者らは、Ｌ−Ｗｎｔ３ａへの全身曝露を制限する手法をデザインした。標的化される細胞は、骨移植片自体の中の細胞であり、これを、Ｌ−Ｗｎｔ３ａと共に、ｅｘ ｖｉｖｏでインキュベートする。次いで、活性化細胞（増殖因子自体ではなく）を、欠損部位へと再導入する。このｅｘ ｖｉｖｏ法により、Ｌ−Ｗｎｔ３ａによる刺激が、空間的に（宿主組織ではなく、移植片自体に）、かつ、時間的に（Ｗｎｔによる刺激への曝露は、インキュベーション時間中でだけ生じる）制限される。このｅｘ ｖｉｖｏ法は、臨床的使用に応じて調整され、第２の手順を必要としない。したがって、Ｗｎｔタンパク質を、脂質粒子へと封入することにより、骨格の損傷、とりわけ、治癒潜在能が低下した個体における損傷を処置するための実現可能な戦略が構成される。

【0076】

（実施例２）
自家骨移植片の、幹細胞活性化剤であるＷＮＴ３Ａによるリエンジニアリング
自家骨移植は、骨欠損を処置するのに、最も一般に使用される手順であるが、老齢患者では信頼できないと考えられている。自家移植片の有効性は、材料内に存在する多能性幹細胞に由来し得る。老化により、これらの幹細胞の生存可能性および機能が弱まることから、骨癒合率は一定でなくなる。本発明者らは、自家移植片の有効性における加齢に伴う変化には、材料内の内因性Ｗｎｔシグナル伝達の喪失が随伴することを示す。本発明者らは、Ｗｎｔ阻害剤であるＤｋｋ１を過剰発現させることにより、内因性Ｗｎｔシグナル伝達のこの喪失を模倣し、Ｗｎｔシグナル伝達が、自家移植片の骨分化に必要であることを見出した。本発明者らは、ｅｘ ｖｉｖｏの薬物送達系を開発し、そこで、自家移植片を、ＷＮＴ３Ａタンパク質の安定化処方物中でインキュベートし、次いで、これを、ｉｎ ｖｉｖｏに導入した。生物工学的に操作された（ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）自家移植片は、受容部位内の生存の著明な改善を示した。ＷＮＴ活性化自家移植片では、有糸分裂活性および骨分化は、自家移植片単独と比較して、著明に増強された。脊椎固定モデルでは、Ｌ−ＷＮＴ３Ａで処置された高齢自家移植片は、自家移植片単独と比較して、優れた骨形成の能力を示した。したがって、Ｌ−ＷＮＴ３Ａ中の短時間のインキュベーションは、自家骨移植の有効性を確実に改善し、これは、老齢者における患者ケアを著明に改善する潜在的可能性を有する。

【0077】

非癒合、遅延した癒合および後部頸椎固定のための最も一般的な処置は、自家骨移植または自家移植である。自家移植片は、大多数の症例で奏効するが、それらの骨を形成する（骨形成）能力についての基礎が完全に明確なわけではない。自家移植片とは、骨髄血液産物、結合組織性間質、骨性細胞外マトリックス、ならびに様々な造血系幹細胞集団、脈管系幹細胞集団、および骨形成性幹細胞集団の不均質な集合体であり、これらは、骨誘導性、骨伝導性（ｏｓｔｅｏｃｏｎｄｕｃｔｉｖｅ）、および骨形成性として、様々に記載されている。しかし、これらの用語は、細胞過程だけについて記載するものであり、自家移植片の骨形成能についての基礎に対する洞察をもたらすものではない。

【0078】

老齢の患者では、自家移植片は、信頼できるものとはならず、この変性状態には、複数の寄与因子が存在する可能性が高い。いくつかのデータは、自家移植片の骨形成能が、骨移植片材料内に含有される、幹細胞または前駆細胞の存在に依存し、幹細胞数は、部分的には、最終的には細胞周期の停止およびアポトーシスを結果としてもたらす、ＤＮＡ損傷の蓄積のために、年齢と共に低下すると考えられることを示唆する。他のデータからは、年齢と共にもたらされるのは、幹細胞数の減少よりも、それらの機能の劣化であることが論じられる。高齢幹細胞はまた、それらの環境内の、増殖因子による刺激に対する応答性も小さく、同様に、老齢者では、これらの増殖因子による刺激の局所レベルまたは全身レベルも低下しうる。加齢はまた、幹細胞の有糸分裂能にも影響を及ぼし、幹細胞の老化は、部分的には、テロメラーゼ活性の低減、およびその後におけるテロメアの短縮のために、年齢と共に増大する。幹細胞機能のこれらの低減は、腸および筋肉などの組織の、正常では頑健な再生応答を制約する。老化はまた、幹細胞の有糸分裂能にも影響を及ぼす。同様の機構は、自家移植片の骨形成能の喪失の一因ともなりうる。

【0079】

本実施例では、本発明者らは、自家移植片の骨形成潜在能が、移植片材料内の骨形成性幹細胞に帰せられ、老化は、これらの幹細胞集団／前駆細胞集団のＷｎｔ応答性状態に影響を及ぼし、ＷＮＴに媒介される幹細胞の活性化により、老齢動物に由来する自家移植片に対して骨を形成する潜在能を回復させうるという仮説について調べた。

【0080】

方法
動物のケア：全ての手順は、Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ Ａｎｉｍａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈにより承認されたプロトコールに従った。ベータ−アクチン増強緑色蛍光タンパク質（ＡＣＴＢ−ｅＧＦＰ；Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｓａｃｒａｍｅｎｔｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）およびＣＤ１野生型同系マウスを使用した。マウス＜３カ月齢を若齢と考え、マウス＞１０カ月間を高齢と考えた。Ａｘｉｎ２^{ＣｒｅＥＲＴ／＋}；Ｒ２６ＲｍＴｍＧ／＋マウスは、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓから購入した。高齢野生型Ｌｅｗｉｓラット（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒｓ、ＭＡ製の「引退した種畜」）は、ＡＡＵＣガイドラインおよびＩＵＰＡＣガイドライン（プロトコール：１３１４６）に従う脊椎固定術のために活用した。

【0081】

齧歯動物モデルのための、骨移植片材料（ＢＧＭ）の回収および処置：この研究では、ラットおよびマウスの両方を使用した。マウスモデルの使用により、広範なスペクトルにわたる分子解析が可能となるが、自家移植片は、これらの小型動物には高度に侵襲性であるため、本発明者らは、自家移植を実施する場合は、ラットを使用し（例えば、図７および１２）、先進的な分子的技法を使用する場合は、同系マウスを使用した（図８〜１１）。全ての例において、骨移植片材料（ＢＧＭ）は、骨を長手方向に引き裂き、骨内膜面を、鋭利な器具で静かにこすり取り、骨髄内容物を、回収ディッシュへと潅流することにより、大腿骨、脛骨、および腸骨稜から採取した。この方法では、ヒトにおいて使用されるＲＩＡ法を模倣した。

【0082】

Ａｘｉｎ２^{ＣｒｅＥＲＴ／＋}；Ｒ２６Ｒ^{ｍＴｍＧ／＋}マウスにおける組換えを誘導する（図８）ため、動物に、連続５日間にわたるＩＰ注射または強制経口投与を介して、体重１ｇ当たり１６０μｇのタモキシフェンを施した。組織は、最初の処置の７日後に採取し、ＧＦＰ免疫染色または蛍光法により解析した。

【0083】

ＳＲＣへの移植のためのＢＧＭアリコートが、細胞含量に関して同等であることを確実にするため、３匹のマウス（同腹仔）に由来するＢＧＭをプールし、次いで、移植アッセイにおける場合とまったく同様に、２０μＬのアリコートへと分割した。ＤＮＡ内容物は、ＤＮｅａｓｙ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）により抽出し、相対ＤＮＡ濃度は、Ｑｕａｎｔ−ｉＴ ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ ｄｓＤＮＡ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびマイクロプレート蛍光リーダー（ＢＥＲＴＨＯＬＤ、Ｂａｄ Ｗｉｌｄｂａｄ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を活用して測定した。ＤＮＡ含量のパーセント変動は、＜２０％であった。ＢＧＭ^ＡＣＴを得るために、採取されたばかりのＢＧＭを、リン酸緩衝食塩水（Ｌ−ＰＢＳ）またはＷＮＴ３Ａ（Ｌ−ＷＮＴ３Ａ、Ｌ−ＷＮＴ３Ａの有効濃度＝０．１５μｇ／ｍＬ）のいずれかのリポソーム処方物を含有する、２０μＬの培養培地中に入れ、２３℃で１時間にわたり維持した。

【0084】

定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）：組織試料は、ＴＲＩｚｏｌ溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中でホモジナイズした。既に記載されている通りに、ＲＮＡを単離し（ＲＮｅａｓｙ；Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ；ＱＩＡＧＥＮ、ＭＤ、ＵＳＡ）、逆転写を実施した（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ ｆｏｒ ｑＲＴ−ＰＣＲ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。定量的リアルタイムＰＣＲは、Ｐｒｉｓｍ ７９００ＨＴ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ、ＵＳＡ）およびＰｏｗｅｒ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を活用して実行した。遺伝子発現のレベルは、ＣＴ法およびそれらのＧＡＰＤＨ値に対する正規化により決定した。全ての反応は、三連で実施し、平均および標準偏差を計算した。プライマー配列（５’から３’へ）は、以下：Ａｘｉｎ２：［ｆｏｒ−ＴＣＡＴＴＴＴＣＣＧＡＧＡＡＣＣＣＡＣＣＧＣ］、［ｒｅｖ−ＧＣＴＣＣＡＧＴＴＴＣＡＧＴＴＴＣＴＣＣＡＧＣＣ］；Ｌｅｆ１：［ｆｏｒ−ＡＧＧＡＧＣＣＣＡＡＡＡＧＡＣＣＴＣＡＴ］、［ｒｅｖ−ＣＧＴＧＣＡＣＴＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＡＴ］；ＧＡＰＤＨ：［ｆｏｒ−ＡＣＣＣＡＧＡＡＧＡＣＴＧＴＧＧＡＴＧＧ［ｒｅｖ−ＧＧＡＴＧＣＡＧＧＧＡＴＧＡＴＧＴＴＣＴ］；ＡＬＰ［ｆｏｒ−ＡＣＣＴＴＧＡＣＴＧＴＧＧＴＴＡＣＴＧＣ、［ｒｅｖ−ＣＡＴＡＴＡＧＧＡＴＧＧＣＣＧＴＧＡＡＧＧ］；Ｏｓｔｅｒｉｘ：［ｆｏｒ−ＧＧＡＧＡＣＣＴＴＧＣＴＣＧＴＡＧＡＴＴＴＣ］、［ｒｅｖ−ＧＧＧＡＴＣＴＴＡＧＴＧＡＣＴＧＣＣＴＡＡＣ］；オステオカルシン：［ｆｏｒ−ＴＧＴＧＡＣＧＡＧＣＴＡＴＣＡＡＡＣＣＡＧ］、［ｒｅｖ−ＧＡＧＧＡＴＣＡＡＧＴＴＣＴＧＧＡＧＡＧＣ］の通りである。

【0085】

ウェスタン解析：ＢＧＭを、若齢（Ｎ＝５）マウスおよび高齢（Ｎ＝５）マウスから採取し、次いで、１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、および１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを含有するダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）に入れ、５％のＣＯ２中、３７℃でインキュベートした。２４時間後、非接着細胞を除去し、培地を置きかえ、接着細胞を、それらがコンフルエンスに達するまで継代培養した。培地は、３日ごとに交換した。一部の実験では、継代３代目の後の細胞を、Ｌ−ＰＢＳまたはＬ−ＷＮＴ３Ａ（有効濃度＝０．０３μｇ／ｍＬ）で処置した。これらの実験では、細胞を２４時間後に回収し、ＲＩＰＡ緩衝液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）を活用して溶解させた。ウェスタン解析のために、全タンパク質を抽出した。汎アクチンを、内部対照として使用して、タンパク質の完全性を確実にした。ＷＮＴ３Ａに対する抗体（Ｒ＆Ｄ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ、ＵＳＡ）、非リン酸化β−カテニンに対する抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、Ｄａｎｖｅｒｓ、ＭＡ、ＵＳＡ）、およびＡｘｉｎ２に対する抗体（Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ、ＵＳＡ）を使用した。積分強度は、ＩｍａｇｅＪ（Ｎａｔｉｏｎａｌ ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、ＵＳＡ ｖｅｒｓｉｏｎ １．４７ｖ）により解析して、ウェスタンブロット法による結果を定量化した。

【0086】

腎被膜下移植術：場合によっては、腎被膜下アッセイ（ＳＲＣＡ）を使用して、その分化能についてアッセイした。同系宿主マウスに麻酔を吸入させた後、胸郭に対してすぐの尾側の左脇腹に皮膚切開を施した。腹腔を開いて、腎臓を露出させた。腎被膜に小さな切開を施し、軟性プラスチックチューブを活用して、ＢＧＭを、被膜下に、注意深く入れた。次いで、腎臓を、腹腔へと戻し、腹膜および皮膚を、縫合糸により閉止した。麻酔のためには、ブプレノルフィン（０．０５ｍｇ／ｋｇ）を使用した。ＢＧＭを、Ａｘｉｎ２^{ＣｒｅＥＲＴ２}；Ｒ２６^ｍＴｍＧドナーから採取する場合は、その後、宿主に、０日目に開始して５日間にわたる強制経口投与（１０ｍｇ／ｍＬで１００μＬ）により、タモキシフェンを施した。ＳＲＣ移植片は、表示の時点に採取した。２．６ Ｗｎｔシグナル伝達のアデノウイルスに媒介される阻害、ＤＫＫ１および陰性対照であるＦｃのアデノウイルス構築物については、既に記載された。アデノウイルス構築物を、２９３Ｔ細胞へとトランスフェクトした。２日後、細胞を回収し、溶解させ、遠心分離により沈殿させた。精製アデノウイルスをアリコートにし、−８０℃で保存した。Ｗｎｔの阻害は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける、ＢＧＭの、Ａｄ−Ｄｋｋ１および対照Ａｄ−Ｆｃとの、２時間にわたるインキュベーションにより達成し、次いで、ＢＧＭアリコートを、頭蓋冠欠損へと移植した。

【0087】

頭蓋冠の臨界サイズ欠損術：マウスに麻酔をかけ、３ｍｍの切開を施して、頭頂骨を露出させた。マイクロダイセクション用穿頭器を使用して、直径を２ｍｍとする、環状の全層欠損を創出したが、硬膜は攪乱させなかった。ＢＧＭアリコートを、Ａｄ−Ｄｋｋ１および対照Ａｄ−Ｆｃと共に、２時間にわたりインキュベートした。次いで、ＢＧＭアリコートを、頭蓋冠欠損へと移植し、縫合糸により皮膚を閉止した。手術からの回復後、麻酔のために、マウスにブプレノルフィンを施した。ｍｉｃｒｏ−コンピュータ断層撮影（ｍｉｃｒｏ−ＣＴ）解析は、既に記載されている通りに実施した。

【0088】

脊椎固定術：７０〜１００ｍｇ／ｋｇのケタミンと、５〜１０ｍｇ／ｋｇのキシラジンとのカクテルを活用して、Ｌｅｗｉｓラットに麻酔をかけた。次いで、ラットの腰部領域を剃毛し、Ｂｅｔａｄｉｎｅに浸漬したガーゼで消毒した。皮膚を切開する前に、ラットに、麻酔剤である０．０２ｍｇ／ｋｇのブプレノルフィンをＳＣ／ＩＰ注射した。まず、骨移植片材料（ＢＧＭ）を、腸骨稜から採取した。略述すると、左腸骨棘を触診し、垂直方向の皮膚切開を施し、腸骨棘の背側稜にアクセスし、ブラントダイセクションにより露出させた。付着した筋肉および骨膜を持ち上げ、０．３ｇのＢＧＭを、骨鉗子で採取し、少量に分配した。次いで、ＢＧＭを、１００μＬのＬ−ＰＢＳまたは１００μＬ［０．１５μｇ／ｍＬ］のＬ−ＷＮＴ３Ａと共にインキュベートする一方で、横突起を露出させた。横突起を露出させるために、後側部のブラントダイセクションを実行し、反射した傍脊柱筋を、開創器により、その場に保持した。Ｌ４〜Ｌ５にわたる横突起から、骨膜を取り除き、高速バーで皮質を除去した。ＢＧＭを、Ｌ４〜Ｌ５の横突起の上および間に塗布した。傍脊柱筋を、吸収性縫合糸（４−０ Ｖｉｃｒｙｌ）で閉止し、皮膚を、結節非吸収性縫合糸（４−０ Ｎｙｌｏｎ）で閉止した。手術部位を、抗生剤軟膏で処置した。１０ｍｇ／ｋｇのＢａｙｔｒｉｌを、皮下送達した。ブプレノルフィン（０．０２ｍｇ／ｋｇ）を、手術後３日間にわたり投与し、その後の用量は、疼痛をコントロールする必要に応じて施した。

【0089】

試料の調製、組織の加工、組織学：組織は、４％のパラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）中、４℃で一晩にわたり固定した。試料は、１９％のＥＤＴＡ中で、１日間にわたり脱灰した。検体は、昇順のエタノール系列により脱水してから、パラフィン包埋した。８ミクロンの厚さの長手方向の切片を切り出し、組織学のために、Ｓｕｐｅｒｆｒｏｓｔ−ｐｌｕｓスライド上に回収した。サフラニンＯ染色、アニリンブルー染色、およびゴモリ染色は、既に記載されている通りに実施した。組織切片は、Ｌｅｉｃａ ＤＭ５０００Ｂデジタル画像化システム（Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏ−ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｗｅｔｚｌａｒ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を活用して写真撮影した。

【0090】

ＡＬＰ染色、ＴＲＡＰ染色、およびＴＵＮＥＬ染色：アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）活性は、ニトロブルーテトラゾリウムクロリド（ＮＢＴ；Ｒｏｃｈｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ、ＵＳＡ）、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート（ＢＣＩＰ；Ｒｏｃｈｅ）、およびＮＴＭ緩衝液（１００ｍＭのＮａＣｌ、１００ｍＭのトリスｐＨ９．５、５ｍＭのＭｇＣｌ）中のインキュベーションにより検出した。酒石酸耐性酸性ホスファターゼ（ＴＲＡＰ）活性は、製造元の指示書に従って、白血球酸性ホスファターゼ染色キット（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）を活用して観察した。発色の後、スライドを、エタノールの系列中で脱水し、Ｃｉｔｒｉｓｏｌｖ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で清浄化し、Ｐｅｒｍｏｕｎｔ封入剤（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）でカバースリップ処理した。ＴＵＮＥＬ染色のために、０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（Ｓｉｇｍａ）および０．１％のクエン酸ナトリウム（ｓｉｇｍａ）を活用して、切片を透過処理し、ＴＵＮＥＬ反応混合物（Ｉｎ Ｓｉｔｕ Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ、Ｒｏｃｈｅ）と共にインキュベートした。切片は、ＤＡＰＩ封入剤（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）で封入し、落射蛍光顕微鏡下で視覚化した。ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）アッセイのために、マウスに、ＢｒｄＵ標識化試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣＡ、ＵＳＡ）の腹腔内注射を施し、注射の４時間後に安楽死させた。ＢｒｄＵの検出は、製造元の指示書に従って、ＢｒｄＵ Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣＡ、ＵＳＡ）を活用して実行した。

【0091】

免疫組織化学：組織切片を脱パラフィンし、ＰＢＳ中で再び湿潤化させた。内因性ペルオキシダーゼ活性を、３％の過酸化水素により、５分間にわたりクェンチングし、次いで、ＰＢＳ中で洗浄した。スライドを、５％のヤギ血清（Ｖｅｃｔｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）により、室温で１時間にわたりブロッキングした。適切な一次抗体を添加し、４℃で一晩にわたりインキュベートした。次いで、試料を、適切なビオチン化二次抗体（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）およびアビジン（ａｄｖｉｄｉｎ）／ビオチン化酵素複合体（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と共にインキュベートし、ＤＡＢ基質キット（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で発色させた。使用される抗体は、ＧＦＰ（ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、ならびにＤＬＫ１（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、Ｒｕｎｘ２（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）、Ｓｏｘ９（Ａｂｃａｍ）、およびＰＰＡＲ−γ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）を含む。

【0092】

移植片成長についてのｍｉｃｒｏ−ＣＴ解析および定量化：走査および解析は、公表されているガイドラインに準拠した。マウスに、２％のイソフルランで麻酔をかけ、４０ｍｍの分解能で、マルチモードポジトロン断層法コンピュータ断層撮影データ収集システム（Ｉｎｖｅｏｎ ＰＥＴ−ＣＴ；Ｓｉｅｍｅｎｓ、Ｅｒｌａｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して走査した。各試料内で生じた移植片成長を画定するために、時点ＰＯＤ２およびＰＯＤ４９の走査データを、Ｏｓｉｒｉｘソフトウェアｖｅｒｓｉｏｎ５．８（Ｐｉｘｍｅｏ、Ｂｅｒｎｅｘ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）へとエクスポートし、セグメンテーションのために、同じ配向性で登録した。形成された新たな骨を、移植された初期のＢＧＭ容量と比較した。データセット間の差異は、ＸＬＳｔａｔソフトウェアバージョン（Ａｄｄｉｎｓｏｆｔ、Ｐａｒｉｓ、Ｆｒａｎｃｅ）内のマン−ホイットニー検定を活用することにより決定した。ｐ値＜０．０５を、統計学的に有意と考えた。

【0093】

定量化および統計学的解析：ＧＦＰ染色、ＢｒｄＵ染色、ＴＵＮＥＬ染色、ＤＬＫ１染色、オステオカルシン染色、およびアニリンブルー染色を定量化した。Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ ＣＳ５（Ａｄｏｂｅ、ｖｅｒｓｉｏｎ１０．０．１）を使用して、損傷部位における関心領域（ＲＯＩ）内のピクセル数を決定した。ｍａｇｉｃ ｗａｎｄツールを使用して、ＲＯＩ内の陽性ピクセルの面積を割り当てた。陽性シグナルピクセルの、ＲＯＩピクセルに対する比を、百分率として表した。損傷部位にわたり等間隔を置いた、少なくとも５つの切片を定量化して、各試料の平均値を決定した。各群に５例ずつの試料を組み入れた（ｎ＝５）。結果は、平均±ＳＤとして提示する。本稿で記載される通り、スチューデントのｔ検定を使用して、差異を定量化した。Ｐ≦０．０５を、有意と考えた。

【0094】

結果
骨移植片材料は、複数の幹細胞集団／前駆細胞集団を含有する：自家移植片を採取するのに最適な解剖学的部位は、ドナー部位の罹患状態および骨備蓄の利用可能性を含む、多数の因子に依存する。本発明者らは、改変リーマー潅流吸引（ＲＩＡ：ｒｅａｍｅｒ−ｉｒｒｉｇａｔｏｒ−ａｓｐｉｒａｔｏｒ）法を活用して、ＢＧＭを、３カ所の解剖学的部位から採取したところ、大腿骨、腸骨稜、および脛骨は、組織学的外見が顕著に異なるＢＧＭをもたらすことに注目した。造血細胞に加えて、大腿骨のＢＧＭは、若齢動物から採取する場合であってもなお、脂肪細胞を含有した（図７Ａ）。腸骨稜のＢＧＭは大部分、緊密な接着細胞で覆われた骨梁断片を含んだ（図７Ｂ）。脛骨に由来するＢＧＭは、大量の線維性間質、および小型の無核細胞（図７Ｃ）を含有した。本発明者らは、定量的ＲＴ−ＰＣＲを使用して、内因性骨形成遺伝子の発現を評価し、３つの供給源のうち、腸骨稜のＢＧＭが、アルカリホスファターゼおよびオステオカルシンを、有意に高レベルで発現することを見出した（図７Ｄ）。一般に、自家移植片の骨形成特性は、骨移植片材料（ＢＧＭ）内の幹細胞集団／前駆細胞集団および骨芽細胞に帰せられると広く考えられる。本発明者らは、ＢＧＭを、腎被膜下（ＳＲＣ）アッセイへと移植することにより、この仮説について直接調べた。ＳＲＣは、移植された組織へと血管供給を提供し、細胞の、複数の種類の組織であって、骨、皮膚、筋肉、歯、器官、および腫瘍を含む組織への分化を支援する。ＢＧＭを、腸骨稜から採取し、次いで、動物の腎臓被膜下へと移植し（図７Ａ）、７日間にわたり発生させた。ＢｒｄＵの取込みにより、自家ＢＧＭ内の細胞の高度な有糸分裂活性が裏付けられた（図７Ｂ）。Ｒｕｎｘ２（図７Ｃ）、Ｓｏｘ９（図７Ｄ）、およびＰＰＡＲγ（図７Ｅ）についての免疫染色により、ＢＧＭ内細胞のサブセットは、骨形成、軟骨形成、および脂肪形成への拘束と関連した遺伝子マーカーを発現することが裏付けられた。７日目には、ＢＧＭ由来細胞の部分集団は、骨（図７Ｆ）、軟骨（図７Ｇ）、および脂肪（図７Ｈ）へと分化していた。まとめると、これらのデータにより、ＢＧＭは、３つの系統全てへと分化することが可能な幹細胞／前駆細胞を含有することが裏付けられた。

【0095】

骨移植片材料内のＷｎｔシグナル伝達は、年齢と共に減衰する：Ｗｎｔは、骨分化を誘導する分子シグナルのうちで、最もよく研究されている。Ａｘｉｎ２^{ＣｒｅＥＲＴ２}；Ｒ２６ｍ^ＴｍＧレポーターマウスを使用して、本発明者らは、組換えを誘導し（「方法」を参照されたい）、次いで、骨膜（図８Ａ）内および骨内膜（図８Ｂ）内のＧＦＰ^＋ｖｅ前骨芽細胞を同定した。骨内膜内のＧＦＰ^＋ｖｅ細胞の頻度は、約０．１％であった（図８Ｃ）。ＧＦＰ^＋ｖｅ細胞はまた、採取されたばかりのＢＧＭ内でも同定された（図８Ｄ）。したがって、不均質なＢＧＭ内の細胞のサブセットは、Ｗｎｔ応答性である。本発明者らは、若齢（＜３カ月齢）マウスに由来するＢＧＭのＷｎｔ応答性状態と、高齢（＞１０カ月齢）マウスに由来するＢＧＭのＷｎｔ応答性状態とを比較した。定量的絶対ＲＴ−ＰＣＲにより、高齢マウス（ＢＧＭ^ａｇｅｄ）から採取されたＢＧＭ内では、Ｗｎｔの標的遺伝子である、Ａｘｉｎ２およびＬｅｆ１の発現は、若齢マウス（ＢＧＭ^{ｙｏｕｎｇ}；図８Ｆ）と対比して、ほぼ２分の１であることが裏付けられた。ウェスタン解析により、ＢＧＭ^ａｇｅｄ内のＷｎｔ３ａ、リン酸化ベータカテニン、およびＡｘｉｎ２の発現は全て、ＢＧＭ^{ｙｏｕｎｇ}と比較して、有意に低度であることが確認された（図８Ｇ）。したがって、ＢＧＭの内因性Ｗｎｔ応答性状態は、年齢と共に劣化する。

【0096】

骨分化能もまた、年齢と共に低下する：ヒトでは、骨治癒速度は、年齢と共に低下する。本発明者らは、ＢＧＭの骨形成能の、同様な加齢に伴う低下を見出した。採取されたばかりのＢＧＭ^ａｇｅｄは、骨形成遺伝子である、アルカリホスファターゼ、Ｏｓｔｅｒｉｘ、およびオステオカルシンの、採取されたばかりのＢＧＭ^{ｙｏｕｎｇ}と比較して、有意に低い発現レベルを示した（図９Ａ）。骨形成遺伝子の発現の低減が、ＢＧＭの骨形成能に影響を及ぼすのかどうかについて調べるために、本発明者らは、ＳＲＣアッセイへと戻った。しかし、マウスにおいて自家移植を実施することは、過剰に外傷性である。自家移植を模倣するために、本発明者らは、同系のドナーおよび宿主を使用した。同系動物は、極めて近縁であるため、それらの組織は、免疫学的に適合性であり、組織の移植は、免疫応答を引き起こさない。ドナーとして用いられたＡＣＴＢ−ｅＧＦＰマウスおよびＢＧＭは、そのＧＦＰ蛍光により、ＳＲＣ内でたやすく同定可能であった（図９Ｂ、Ｃ）。

【0097】

移植の７日後、ＢＧＭを採取し、骨形成の証拠について解析した。アニリンブルー染色された類骨マトリックスは、ＢＧＭ^{ｙｏｕｎｇ}内では明らか（図９Ｄ）であったが、ＢＧＭ^ａｇｅｄ内では見られなかった（図９Ｅ；Ｆで定量化されている）。ＢＧＭ^{ｙｏｕｎｇ}内の類骨マトリックスは、ＡＬＰ染色により示される（図９Ｇ）通り、石灰化を生じつつあったが、ＢＧＭ^ａｇｅｄは、ＡＬＰ染色を示さなかった（図９Ｈ；Ｉで定量化されている）。本発明者らは、ＢＧＭ^ａｇｅｄと、ＢＧＭ^{ｙｏｕｎｇ}との生着効率により、骨分化の差異が説明されうるのかどうかという疑問を呈したが、ＧＦＰ免疫染色により、ＢＧＭ^{ｙｏｕｎｇ}（図９Ｊ）およびＢＧＭ^ａｇｅｄ（図９Ｋ）のいずれにおいても、生存ドナー細胞の数は同様であることが裏付けられた（図９Ｌで定量化されている）。まとめると、これらのデータは、ＢＧＭの骨形成遺伝子の発現および骨形成能が、年齢と共に低下することを示す。

【0098】

Ｗｎｔシグナル伝達は、ＢＧＭの骨形成能に必要である：ＢＧＭの内因性Ｗｎｔ応答性および骨形成能は、年齢と共に減殺される。Ｗｎｔシグナル伝達の低減が、この加齢に伴う骨形成潜在能の低下に寄与するのかどうかについて調べるために、本発明者らは、ＢＧＭ内の内因性Ｗｎｔシグナル伝達を遮断した。他の研究者らと本発明者らは、Ｗｎｔの阻害剤であるＤｋｋ１の過剰発現を使用して、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるＷｎｔシグナル伝達を、一過性に消滅させた。本発明者らは、Ａｄ−Ｄｋｋ１またはＡｄ−Ｆｃ（対照）を、若齢マウスの骨髄腔へと送達し、次いで、２４時間後にＢＧＭ^{ｙｏｕｎｇ}を採取し、アリコートを、臨界サイズ（非治癒性）の骨格欠損へと移植した。対照ＢＧＭ^{ｙｏｕｎｇ}が、ＡＬＰ活性について強く陽性となった（図１０Ａ）、７日後において、Ａｄ−Ｄｋｋ１で処置されたＢＧＭ^{ｙｏｕｎｇ}は、最小の活性を示した（図１０Ｂ）。代わりに、Ａｄ−Ｄｋｋ１で処置されたＢＧＭ^{ｙｏｕｎｇ}は、脂肪形成タンパク質であるＰＰＡＲ−γ（図１０Ｃ、Ｄ）およびＤｌｋ１（図１０Ｅ、Ｆ）の広範な発現を示した。ＢＧＭについてのｍｉｃｒｏ−ＣＴ（図１０Ｇ、Ｈ；Ｉで定量化されている）および組織形態計測解析（図１０Ｊ、Ｋ；Ｌで定量化されている）により示される通り、骨形成は、Ａｄ−Ｄｋｋ１処置により抑圧された。したがって、ＢＧＭの骨形成能は、内因性Ｗｎｔシグナルに依拠する。

【0099】

ＢＧＭ^ａｇｅｄ内の内因性Ｗｎｔシグナルを増進させることにより、その骨形成能を回復させる：内因性Ｗｎｔシグナル伝達は、ＢＧＭが、その骨形成能を呈示するのに必要である（図１０Ｊ〜Ｌ）。次に、本発明者らは、Ｗｎｔによる刺激が、ＢＧＭの有効性を増強するのに十分であるのかどうかについて調べた。ＢＧＭ^ａｇｅｄを採取し、Ｌ−ＷＮＴ３ＡまたはリポソームＰＢＳ（Ｌ−ＰＢＳ）で処置し、次いで、３７℃でインキュベートした（図１１Ａ）。絶対ｑＲＴ−ＰＣＲ解析により、Ａｘｉｎ２発現のわずかではあるが有意な上昇が明らかにされた（図１１Ｂ）。Ｌｅｆ１は、Ｌ−ＷＮＴ３Ａに応答して、わずかに上昇した（図１１Ｂ）。ウェスタン解析は、ベータカテニンタンパク質およびＡｘｉｎ２タンパク質のいずれもが、Ｌ−ＷＮＴ３Ａに応答して上昇することを示した（図１１Ｃ）。ＢＧＭ内の有糸分裂活性は、Ｌ−ＷＮＴ３Ａ処置により増大した。移植後４日目に、Ｌ−ＷＮＴ３Ａで処置されたＢＧＭ^ａｇｅｄでは、細胞増殖が、ＬＰＢＳで処置されたＢＧＭ^ａｇｅｄと比較して有意に増大した（図１１Ｄ、Ｅ；Ｆで定量化されている）。細胞周期に対する影響は、一過性であった：移植後７日目までに、ＢｒｄＵの取込みは、Ｌ−ＰＢＳ試料とＬ−ＷＮＴ３Ａ試料との間で同等であった（図１１Ｇ、Ｈ；Ｉで定量化されている）。ＢＧＭ^ａｇｅｄ内の細胞分化について評価した。Ｌ−ＷＮＴ３Ａで処置されたＢＧＭ^ａｇｅｄ内では、脂肪形成タンパク質であるＤｌｋ１の発現は低度であり（図１１Ｊ、Ｋ；Ｌで定量化されている）、骨形成タンパク質であるオステオカルシンの発現は高度であった（図１１Ｍ、Ｎ；Ｏで定量化されている）。新たな骨形成は、Ｌ−ＷＮＴ３Ａで処置されたＢＧＭ^ａｇｅｄ内だけで見出された（図１１Ｐ、Ｑ；Ｒで定量化されている）。ＬＷＮＴ３Ａによる処置は、生着効率に影響を及ぼさなかったが、プログラム細胞死についての解析により、Ｌ−ＷＮＴ３Ａで処置されたＢＧＭ^ａｇｅｄが有するＴＵＮＥＬ^＋ｖｅ細胞は、Ｌ−ＰＢＳで処置された試料より有意に少ないことが裏付けられた。アポトーシスの低減はまた、移植後７日目においても観察された。新たな骨形成は、破骨細胞に媒介される骨のリモデリングのための刺激として用いられ、本発明者らが、新たに形成された類骨マトリックスの近傍においてＴＲＡＰ活性を観察したのは、Ｌ−ＷＮＴ３Ａで処置されたＢＧＭ^ａｇｅｄ試料内だけであった。したがって本発明者らは、Ｌ−ＷＮＴ３Ａは、ＢＧＭの骨形成能を増強するのに十分であると結論する。

【0100】

Ｌ−ＷＮＴ３Ａは、ＢＧＭａｇｅｄ内の幹細胞を活性化し、脊椎固定モデルにおける骨の発生を改善する：本発明者らは、ＢＧＭ内の細胞集団であって、Ｌ−ＷＮＴ３Ａに媒介される骨形成能の急な増大の一因となる集団を同定しようと試みた。本発明者らは、標準的な手順を活用して、３つの幹細胞集団を、ＢＧＭから単離し、次いで、ＬＰＢＳ（対照としての）またはＬ−ＷＮＴ３Ａを活用して、それらのＷｎｔ応答性について評価した。かつての実験では、本発明者らは、幹細胞集団内のＡｘｉｎ２発現を確実に活性化する、Ｌ−ＷＮＴ３Ａの用量を決定した。時間経過についての解析により、幹細胞の、Ｌ−ＷＮＴ３Ａ処置への応答が明らかにされた：Ｌ−ＷＮＴ３Ａへの曝露の１５時間以内に、Ａｘｉｎ２の４倍の活性化が観察され、３６時間後には、最大のＡｘｉｎ２の活性化が達成された（図１２Ａ）。６０時間後の時点における、幹細胞内のＡｘｉｎ２発現の低下により示される通り、効果は一過性であった（図１２Ａ）。

【0101】

本発明者らは、ＢＧＭから単離された第２の幹細胞集団を使用して、幹細胞がＬ−ＷＮＴ３Ａに応答することを検証した（図１２Ｂ）。ＢＧＭの活性化状態は、ｑＲＴ−ＰＣＲにより示された。ＢＧＭ^ａｇｅｄを採取し、Ｌ−ＷＮＴ３ＡまたはＬ−ＰＢＳで処置し、次いで、Ａｘｉｎ２発現およびＬｅｆ１発現を活用して、そのＷｎｔ応答性状態について解析した（図１２Ｃ）。１２時間以内に、Ｌｅｆ１の有意な上昇が検出可能となり、２４時間以内に、Ａｘｉｎ２およびＬｅｆ１のいずれもが、有意に上昇した（図１２Ｃ）。これらの解析により、ＷＮＴに媒介されるＢＧＭの活性化状態が確認されるが、本明細書の以下では、本発明者らは、この材料を、ＢＧＭ^ＡＣＴと称する。本発明者らの次の実験では、ラット脊椎固定モデルにより、ＢＧＭ^ＡＣＴの治療的可能性について調べた。第４腰椎および第５腰椎（例えば、Ｌ４〜５）の横突起から、皮質を除去し（図１２Ｄ）、この手順中に、腸骨稜に由来する自家ＢＧＭ^ａｇｅｄを採取し、Ｌ−ＷＮＴ３Ａ（またはＬ−ＰＢＳ）で、１時間にわたり処置した。次いで、結果として得られる材料であるＢＧＭ^ＡＣＴ（またはＢＧＭ^ａｇｅｄ）を、Ｌ４突起およびＬ５突起、ならびにＬ４突起〜Ｌ５突起の間へと移植した（図１２Ｅ）。手術後２日目に、ｍｉｃｒｏ−ＣＴにより、ＢＧＭの容量について評価し、これらの解析により、ＢＧＭ^ａｇｅｄ（図１２Ｆ）およびＢＧＭ_ＡＣＴ（図１２）が、当初は、同等量の石灰化組織を含有したことを確認した。手術後４９日目に、新たな骨形成の容量について再評価した。ｍｉｃｒｏ−ＣＴデータの三次元再構成により、ＢＧＭ^ａｇｅｄで処置された部位内の骨再生は乏しく（グレー；図１２Ｇ）、脊椎固定を経る老齢患者に由来する同様のデータと符合することが裏付けられた。これに対し、ＢＧＭ^ＡＣＴで処置された部位は、頑健な骨形成および横突起の融合の証拠を示した（青色；図１２Ｈ）。横突起間の新たな骨の容量を定量化したところ、ＢＧＭ^ａｇｅｄと比較して、ＢＧＭ^ＡＣＴは、有意に石灰化が高度なマトリックスをもたらした（図１２Ｉ）。したがって、Ｌ−ＷＮＴ３Ａ処置は、高齢動物に由来する自家移植片の骨形成能を改善する。

【0102】

毎年ほぼ５０万件の骨移植手順が実施されており、自家移植片は、米国内で移植された２番目に多い組織となっている（ＡＡＴＢによる年次調査）。自家移植片は、同種移植片および合成代用骨を凌駕する著明な利点を有するが、老齢者および基礎骨疾患または基礎代謝疾患を伴う患者では禁忌されている。本実施例では、本発明者らは、本発明者らの取組みを、自家移植片の有効性に重要な因子の理解、および自家移植片の有効性を改善する方法の検証へと方向付けた。４つの主要な因子：第１に、自家移植片が採取される部位；第２に、自家移植片が採取の後でどのように操作されるのか；第３に、自家移植片の増殖因子構成；および第４に、自家移植片内の幹細胞の活性化状態が、自家移植片の骨形成能に影響を及ぼす。本実施例では、本発明者らは、ＷＮＴシグナルが、これらの４つの最重要変数のうちの３つに影響を及ぼしうるという証拠を提示する。

【0103】

自家移植片の採取および操作の最適化：自家移植片の骨形成能、したがって、自家移植片の有効性は、採取の部位および方法の影響を受ける。大半の、血管形成されていない自家移植片は、腸骨稜から採取されるが、リーマー／潅流／吸引（ＲＩＡ）手法により、大腿骨髄腔および脛骨髄腔にもまた、アクセスすることができる。ＲＩＡにより回収された自家移植片の骨形成能と、従来の採取法により回収された自家移植片の骨形成能とは、同等である。シミュレートされたＲＩＡ手法を使用することにより、本発明者らは、腸骨稜、大腿骨、および脛骨から採取されたＢＧＭの細胞構成の顕著に異なる差異を観察した。さらに、腸骨稜のＢＧＭは、大腿骨または脛骨に由来するＢＧＭと比較して、有意に高レベルの同化性の骨形成遺伝子の発現を示した（図７）。しかし、これらのＢＧＭアリコートの全ては、腎被膜下（ＳＲＣ）アッセイ（図７）において、骨を形成する潜在能を呈示した。自家移植片の有効性はまた、患者へと移植し戻す前の、材料の不適切な操作によっても損なわれる可能性がある。例えば、採取されたばかりのＢＧＭを、室温で維持する場合であってもなお、著明な細胞のアポトーシスが見られる。ＢＧＭを、Ｌ−ＷＮＴ３Ａで処置することにより、細胞の生存が有意に改善される：例えば、ＢＧＭ単独と比較して、ＢＧＭ^ＡＣＴは、約５０％少ないＴＵＮＥＬ陽性細胞を呈示する。ＢＧＭ^ＡＣＴ内ではまた、有糸分裂活性も、Ｌ−ＰＢＳで処置されたＢＧＭと対比して有意に高度である（図１１Ｄ〜Ｆ）。まとめると、この細胞増殖の増大および共時的な細胞死の低減は、ＢＧＭの生存可能性の増大へと変換され、したがって、自家移植片の有効性の改善へと変換される。

【0104】

自家移植片内の増殖因子活性の最適化：自家移植片の有効性はまた、材料内の増殖因子の存在にも依存すると考えられる。採取されたばかりの自家移植片内では、形質転換増殖因子ベータ、骨形成性タンパク質、血管内皮増殖因子、および血小板由来増殖因子を含む、多種多様な増殖因子が同定されている。しかし、脱灰凍結乾燥同種移植片内では、これらの因子は、欠如するか、または測定可能な最小量で存在する。本発明者らの知る限りにおいて、自家移植片内または同種移植片内の内因性ＷＮＴシグナル伝達レベルについて報告する研究は見られない。しかし、多数の研究が、老齢者では、Ｗｎｔ阻害剤の血清レベルが上昇し、これにより、おそらく、Ｗｎｔシグナル伝達活性が減殺されることについて明確に裏付けている。これらの臨床的知見は、ＢＧＭ内の内因性Ｗｎｔ活性が年齢と共に低下することを示す、本発明者らのデータ（図８）と符合する。結果として、ＷＮＴ応答性を上昇させる手法は、自家移植片に対して骨形成能を回復させる。本発明者らは、Ｌ−ＷＮＴ３Ａによる処置が、ＢＧＭ内のＷｎｔシグナル伝達を活性化し、これは、ＳＲＣ（図１１）および脊椎固定モデル（図１２）における頑健な骨発生と相関することを裏付けた。

【0105】

自家移植片の幹細胞の、Ｌ−ＷＮＴ３Ａによる活性化：自家移植片の有効性の少なくとも一部は、材料内の幹細胞／間質細胞に由来し得る。骨髄腔では、骨形成性幹細胞／骨格幹細胞は、骨内膜面に接着するかまたは骨内膜面に埋め込まれている。結果として、吸引のみに依拠する採取法は、これらの接着幹細胞集団を回収できないことが典型的である。実際、現行の推定値では、骨髄吸引物中の幹細胞数は、有核細胞５０，０００個当たり１個とされており、老齢患者では、この数は、わずかに、有核細胞１，０００，０００個当たり１個まで低下する。ＲＩＡ採取では、骨内膜面を意図的に摘出するので、骨形成性幹細胞集団を含有する可能性が高い。本発明者らは、Ｗｎｔ応答性細胞が存在する骨内膜面を摘出する改変ＲＩＡ手法を使用し（図８）、次いで、この方式で回収されたＢＧＭが、幹細胞集団／前駆細胞集団を含有し、頑健に骨形成性であり（図７）、これは、具体的には、内因性Ｗｎｔシグナルのためである（図１０）ことを裏付けた。

【0106】

自家移植片は、骨再構成のための古典的範例を表し続けているが、なお、自家移植片の有効性には、多大な改善の余地がある。本明細書で示したデータは、ｅｘ ｖｉｖｏにおけるＬ−ＷＮＴ３Ａへの曝露により、細胞の生存可能性が改善され、採取されたばかりの自家移植片内の幹細胞集団が活性化され、ついには、骨形成活性の増大がもたらされることを裏付ける。これらのデータは、とりわけ、その固有の骨形成の能力が、疾病、疾患、または老化により低減される危険性がある患者集団に由来する自家移植片のための直接的な臨床的適用をもたらす。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11-1】

【図11-2】

【図12-1】

【図12-2】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]