特許 6557682 機能的に統合されたレーザ走査型顕微鏡

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6557682

(24)【登録日】2019年7月19日

(45)【発行日】2019年8月7日

(54)【発明の名称】機能的に統合されたレーザ走査型顕微鏡

(51)【国際特許分類】

   G02B 21/00 20060101AFI20190729BHJP

   G02B 21/18 20060101ALI20190729BHJP

【ＦＩ】

   G02B21/00

   G02B21/18

【請求項の数】10

【全頁数】14

(21)【出願番号】特願2016-569612(P2016-569612)

(86)(22)【出願日】2015年5月22日

(65)【公表番号】特表2017-517767(P2017-517767A)

(43)【公表日】2017年6月29日

(86)【国際出願番号】EP2015061378

(87)【国際公開番号】WO2015181068

(87)【国際公開日】20151203

【審査請求日】2017年5月29日

(31)【優先権主張番号】102014107606.0

(32)【優先日】2014年5月28日

(33)【優先権主張国】DE

(73)【特許権者】

【識別番号】513072123

【氏名又は名称】カール・ツァイス・マイクロスコピー・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング

【氏名又は名称原語表記】Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ＧｍｂＨ

(73)【特許権者】

【識別番号】510339832

【氏名又は名称】カール・ツァイス・アクチェンゲゼルシャフト

【氏名又は名称原語表記】ＣＡＲＬ ＺＥＩＳＳ ＡＧ

(74)【代理人】

【識別番号】100110423

【弁理士】

【氏名又は名称】曾我 道治

(74)【代理人】

【識別番号】100111648

【弁理士】

【氏名又は名称】梶並 順

(74)【代理人】

【識別番号】100147500

【弁理士】

【氏名又は名称】田口 雅啓

(74)【代理人】

【識別番号】100166235

【弁理士】

【氏名又は名称】大井 一郎

(74)【代理人】

【識別番号】100179914

【弁理士】

【氏名又は名称】光永 和宏

(74)【代理人】

【識別番号】100179936

【弁理士】

【氏名又は名称】金山 明日香

(72)【発明者】

【氏名】シュヴェット、ダニエル

(72)【発明者】

【氏名】ヴァルト、マティーアス

(72)【発明者】

【氏名】アンフート、ティーモ

【審査官】 堀井 康司

(56)【参考文献】

【文献】 特開２００８−２４９９６５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００７−５０６１４６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００５−１２１７９６（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｇ０２Ｂ １９／００−２１／００

Ｇ０２Ｂ ２１／０６−２１／３６

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

共焦点、ラインまたは広視野動作を選択可能なモードにおいて、レーザ照射によって試料を走査し、かつ前記選択可能な動作モードのうちの少なくとも２つを有するように設計されている、機能的に統合されたレーザ走査型顕微鏡であって、
− レーザ光源、照射及び検出ビーム経路、検出装置、ならびに少なくとも１つの対物レンズであって、それぞれの場合に前記選択可能な動作モードのそれぞれに対して使用するように設計されている、レーザ光源、照射及び検出ビーム経路、検出装置、ならびに少なくとも１つの対物レンズによって特徴付けられ、
− 前記照射及び検出ビーム経路は、前記レーザ照射の構成のための光学的手段と、前記レーザ照射によって前記試料を走査するための少なくとも１つのスキャナーと、照射光と検出光とを分離するためのビームスプリッターとを含み、
− 前記選択可能な動作モードのそれぞれに対する前記検出ビーム経路は、前記検出装置と同じイメージセンサーで終端し、
− 前記検出ビーム経路には、それぞれの場合に選択された前記動作モードに依存して、検出放射線を異なる検出経路に結合することによってビーム案内を変更するための制御可能な光学的なスイッチング素子が設けられ、
− それぞれの場合に、１つの検出経路が１つの動作モードに永久的に割り当てられ、
− 第１の検出経路では、前記検出放射線の伝達及び影響が、前記ビーム経路に固定して配置された少なくとも１つの光学アセンブリによってもたらされ、及び
− 第２の検出経路では、前記光学アセンブリの周りでの前記検出放射線のルート変更がもたらされ、
− 前記第１の検出経路の規定された位置に像平面が形成され、及び瞳平面が、前記第２の検出経路における前記像平面の前記位置に形成される、機能的に統合されたレーザ走査型顕微鏡。

【請求項2】

− 前記制御可能な光学アセンブリのための制御回路、
− 前記現在の動作モードから別の選択可能な動作モードへの切り替えをもたらすためのコマンド入力装置、ならびに
− 前記検出装置によって発せられた電子画像信号から前記試料の画像を生成するためのハードウェア及びソフトウェア
を備える、請求項１に記載の機能的に統合されたレーザ走査型顕微鏡。

【請求項3】

前記固定光学アセンブリがレンズアレイとして形成される、請求項１又は２に記載の機能的に統合されたレーザ走査型顕微鏡。

【請求項4】

前記第１の検出経路が、前記共焦点動作モードに割り当てられ、及び前記第２の検出経路が、前記ライン動作モードまたは前記広視野動作モードに割り当てられる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の機能的に統合されたレーザ走査型顕微鏡。

【請求項5】

前記検出ビーム経路には、前記それぞれの動作モードにおいて、前記割り当てられた検出経路を通って転写された前記検出放射線の前記検出装置への規定された結合を行うように設計されている、さらなる制御可能な光学的なスイッチング素子が存在する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の機能的に統合されたレーザ走査型顕微鏡。

【請求項6】

前記照射ビーム経路には、選択されかつ前記制御回路に接続される前記それぞれの動作モードに依存して前記ビーム案内を変更するための制御可能な光学アセンブリが設けられる、請求項２に記載の機能的に統合されたレーザ走査型顕微鏡。

【請求項7】

前記照射ビーム経路では、
− 前記レーザ照射を対物レンズの瞳にわたって、かつ、前記照射ビーム経路内へと動かすように設計された照射スキャナー（Ｓ１）が存在し、前記動きは、それぞれの場合に選択された前記動作モードに依存して予め決められており、
− 前記共焦点動作モード中、レンズアセンブリ（Ｌ３）が旋回され、
− 前記ライン動作モード中、前記レンズアセンブリ（Ｌ３）及び円柱レンズが旋回され、かつ、
− 前記広視野動作モード中、前記レンズアセンブリ（Ｌ３）及び円柱レンズの代わりに、望遠鏡が旋回される、請求項６に記載の機能的に統合されたレーザ走査型顕微鏡。

【請求項8】

− 光電子イメージセンサーであって、そのセンサーピクセルが、好ましくはアバランシェフォトダイオードのアレイの形態で、作動及び作動停止するために個別に制御可能である、光電子イメージセンサー、及び
− それぞれの場合に選択された前記動作モードに依存して、前記個々のセンサーピクセルを作動するための回路
を備える、請求項１〜７のいずれか一項に記載の機能的に統合されたレーザ走査型顕微鏡。

【請求項9】

切替ミラーまたは可動プリズムが、光学的なスイッチング素子として設けられる、請求項１〜８のいずれか一項に記載の機能的に統合されたレーザ走査型顕微鏡。

【請求項10】

励起放射線としての前記照射光と、それにより生じる検出放射線としての蛍光とを備える、蛍光顕微鏡法用に設計されている、請求項１〜９のいずれか一項に記載の機能的に統合されたレーザ走査型顕微鏡。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、共焦点、ライン、または広視野を選択可能な動作モードにおいて、レーザ照射によって試料を走査するように設計されている、機能的に統合されたレーザ走査型顕微鏡に関する。

【背景技術】

【0002】

共焦点レーザ走査型顕微鏡は、それ自体が公知である。ここでは、検査されるべき試料領域は、点に焦点を合わせられたレーザビームによって走査される。走査される箇所の全てに対し、試料物質によって反射され、または蛍光を発した光の特性は、イメージセンサーによって測定されるとともに、試料領域の画像が測定結果から生じる。

【0003】

近年では、例えば細胞の代謝プロセスを研究するために、または細胞生理に対する医薬品の影響を分析するために、生物医学研究においてレーザ走査型顕微鏡を用いる生細胞の研究が科学的関心を集めている。蛍光顕微鏡法は、高レベルの分化可能性で様々な細胞小器官の細胞下の光学的観察を可能にし、かつ顕微鏡は、純粋な撮像システムから重要な測定器具へと発展しているため、蛍光顕微鏡法に特に重要性が与えられている。しかしながら、生細胞の研究は、顕微鏡システムに高い要求を課している。一方では、生物学的プロセスの時間系列に従うことができるように、データ収集が非常に迅速に行われる必要がある。他方では、細胞の寿命が守られるべきであるか、またはその代謝の乱れが最小限にされるべきである。これは、蛍光分子が励起している最中に、細胞への可能な限り最小の光入力を要求するが、これは、可能な限り迅速かつ正確に所望の情報を得ることができるようにするために、信号対雑音比（ＳＮＲ）を損なってはならない。

【0004】

これらの幾分相容れない条件を満たすことは、レーザ走査型顕微鏡の開発における重要な課題である。

【0005】

共焦点イメージングは、点のような連続的なデータを収集することに起因して、その画像キャプチャーレートが制限されることに問題がある。画像キャプチャーレートは、共振性ガルバノスキャナーによってより迅速に走査することによって高められ得るが、それにより、各イメージセンサーに対する蓄積時間は、対応して削減される。しかしながら、所望の信号対雑音比を達成するために、より集中的な照射が必要とされ、これは結果的に生試料への有害な負荷を増大させる。

【0006】

共焦点像を取得するレートを増大させる別の可能性は、いわゆるスピニングディスク顕微鏡法（ＳＤＭ）によってもたらされている。ここでは、２つの結合された回転ディスクによって（そのうちの第１のディスクがマイクロレンズを有するとともに、第２のディスクには、共焦点絞りがマイクロレンズに割り当てられて配置されている）、画像キャプチャーレートの著しい増加が並列処理によって達成される。しかしながら、画像キャプチャーレートのレベルは、イメージセンサーの特性によって制限される。さらに、スピニングディスク顕微鏡は、イメージングの機能に限定されている。蛍光寿命イメージング顕微鏡法（ＦＬＩＭ）、Ｆｏｅｒｓｔｅｒ共鳴エネルギー移動実験（ＦＲＥＴ）または蛍光相関分光法（ＦＣＳ）など、この範囲を越える測定タスクは使用できないか、または適切に使用できない。

【0007】

最後に、試料の複数の着色を明確に区別できるようにし、かつ細胞内での切替プロセスを分析できるようにするには、分光イメージングも必須である。スピニングディスク顕微鏡法または広視野顕微鏡による分光イメージングは、文献において頻繁に説明されてきたが、これまで商業的に確立することは不可能であった。

【0008】

その結果、それぞれ特定の適用例を専用に扱う個々のレーザ走査型顕微鏡システムは、現在得られる最先端の技術に従って入手可能であるが、より総合的な、より普遍的な条件を満たし、それにより、より多様な適用例を可能にする機能的に統合されたシステムは入手することができない。

【0009】

共焦点から広視野顕微鏡に対して提案された装置の組み合わせは、例えば、Ｎｉｋｏｎ製の共焦点レーザ走査型顕微鏡Ｃ２であり、これは、様々な光学部品からモジュール式に構成されており、これらの光学部品は、適用例に依存して互いに交換できかつ互いに結合することができる。

【0010】

しかしながら、解決すべき問題は依然として、時間のかかるモジュールの交換または装置の修正を最初に行うことを不要として、試料の観察中に共焦点、ラインまたは広視野動作モードを利用可能とすることである。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0011】

これに基づいて、本発明の目的は、それぞれの実験条件に従って、顕微鏡を単純な方法で構成することを可能にする、様々な予め選択可能な動作様式を有するレーザ走査型顕微鏡を提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0012】

この目的は、冒頭で挙げられたタイプのレーザ走査型顕微鏡によって達成され、これは、
− 選択可能な動作モードのそれぞれに対して使用するようにそれぞれ設計されている、レーザ光源、照射及び検出ビーム経路、検出装置、ならびに少なくとも１つの対物レンズを含み、
− 照射及び検出ビーム経路は、レーザ照射の構成のための光学的手段と、レーザ照射によって試料を走査するための少なくとも１つのスキャナーと、照射光と検出光とを分離するためのビームスプリッターとを含み、かつ、
− 検出ビーム経路には、それぞれの場合に選択された動作モードに依存してビーム案内を変更するための制御可能な光学素子が設けられる。

【0013】

制御可能な光学アセンブリは、コマンド入力装置を介して制御回路に接続され、その制御回路は、現在の動作モードを別の所望の動作モードに切り替えるように設計され、かつ、検出装置によって発せられた電子画像信号から試料の画像を生成するためのハードウェア及びソフトウェアが存在する。

【0014】

本発明の意義の範囲内で、レーザ照射という用語は、検査される試料または試料の領域の点、ライン、及びまたフィールド照射を含む。照射光の点、ライン、またはフィールドの構成は、それぞれの場合に予め決められている動作モードに依存して制御可能な光学素子によって生じる。

【0015】

上述の特徴を備える本発明によるレーザ走査型顕微鏡は、単純に個々の動作モードに切り替えることにより、モジュール構成を回避することによって、
− 迅速にかつ試料を損傷させることなく、検査される試料領域の全体像を取得すること、
− ３０ｆｐｓまでの画像キャプチャーレートで、または試料への負荷を最小限にして高信号対雑音比で、分光イメージングによって共焦点像キャプチャーをもたらすこと、
− １００ｆｐｓを上回る画像キャプチャーレートで、分光イメージングによって超高速画像キャプチャーを生成すること、または
− 試料内の所望の領域の平行の２次元画像をキャプチャーすること
を可能にする。

【0016】

３０ｆｐｓまでのまたは１００ｆｐｓを上回る上述の画像キャプチャーレートは、それぞれの場合に、画像当たり５１２本のラインに関し、ライン速度に起因して、画像キャプチャーレートが制限されると仮定する。平行の２次元画像の生成における画像キャプチャーレートは、イメージセンサーの特定の幾何学的形状によって初めに決定されるが、試料のより大きい領域も、モザイク法によってキャプチャーされ得る。

【0017】

それぞれの場合に選択された動作モードに依存するビーム案内の変更は、制御可能な光学的なスイッチング素子により検出ビームを異なる検出経路に結合することによってもたらされる。検出経路は、ビーム経路に位置する光学アセンブリによって、及び／または、少なくとも１つの像平面及び１つの瞳平面の位置によって異なる。それぞれの場合に、１つの検出経路が１つの動作モードに永久的に割り当てられている。

【0018】

第１の検出経路では、検出放射線の伝達及び影響は、ビーム経路に固定して配置された少なくとも１つの光学アセンブリによってもたらされる一方、第２の検出経路では、この光学アセンブリの周りでの検出放射線のルートが変更されて、影響を回避するようにする。それにより、像平面が第１の検出経路の規定した位置において生成される。瞳平面が、第２の検出経路の像平面の代わりに形成される。レンズアレイは、例えば、固定光学アセンブリとして提供される。

【0019】

第１の検出経路は、好ましくは、共焦点動作モードに割り当てられ、第２の検出経路は、ライン動作モード及び広視野動作モードに割り当てられる。

【0020】

検出ビーム経路のさらなる進路には、第２の光学的なスイッチング素子が存在し得、それを用いて − 切替位置に依存して − それぞれの検出経路を介して到来する検出放射線は、共通の検出装置に結合される。切替ミラーが、例えば、第１のスイッチング素子として存在し、可動プリズムが第２のスイッチング素子として提供され得る。

【0021】

光学的なスイッチング素子は、それぞれの動作モードに依存して切替位置を予め決める制御回路に接続される。制御回路は、動作モードを切り替えるために、コマンド入力装置に結合される。

【0022】

本発明によるレーザ走査型顕微鏡の照射ビーム経路は、対物レンズの瞳にわたってレーザ照射を動かすための、及び／または、それぞれの場合に設定された動作モードへの照射ビーム案内を調整するための照射スキャナーを含む。動きのパターンまたは動きのシーケンスは、それぞれの場合に選択された動作モードに依存する、すなわち、照射スキャナーの作動は、動作モードに依存して起こる。さらに、照射ビーム経路にもまた、制御可能な光学アセンブリが、それぞれの場合に選択された動作モードに依存してビーム案内を変更するために設けられるとともに、制御回路に接続されている。

【0023】

本発明によるレーザ走査型顕微鏡の好ましい実施形態では、
− 共焦点動作モード中、レンズアセンブリが照射ビーム経路へと旋回され、
− ライン動作モード中、レンズアセンブリ及び円柱レンズが旋回され、かつ、
− 広視野動作モード中、レンズアセンブリ及び円柱レンズの代わりに、望遠鏡が旋回される。

【0024】

実施形態の例を参照して、旋回可能なアセンブリの機能及び目的を以下に詳細に説明する。内側及び外側への旋回は、予め決められている動作モードに依存して制御回路によってもたらされる。

【0025】

さらに、空間光変調器（ＳＬＭ）によって、対物レンズの瞳と共役の平面にあるレーザビームの位相を操作することによって、個々の動作モードのためにビーム付形を実行することが考えられるとともに、このことは本発明の範囲内にある。

【0026】

特に好ましい実施形態では、全ての動作モードに共通の検出装置は、光電子イメージセンサーを有し、そのセンサーピクセルは、作動及び作動停止のために個別に制御可能である。イメージセンサーまたは個々のセンサーピクセルの制御は、予め決められている動作モードに依存して制御回路によってもたらされる。

【0027】

イメージセンサーは、センサーピクセルの２次元の配置構成を有し、その結果、スピニングディスク技術によって、試料を損傷させることなく、励起及び検出の並列処理により複数のスポットを備える共焦点像を迅速に取得することが可能となる。有利な実施形態では、各センサーピクセルは、制御回路によって個別に作動または作動停止されることができ、いくつかのセンサーピクセルは、グループで様々に組み合わせられることができるとともに、互いに個別に読み取られるセンサー面上の複数のピクセル領域は、自由にプログラム可能である。

【0028】

広視野走査動作モードの場合、２次元センサーマトリクスの各ピクセルは、１つの試料の位置に割り当てられた放出光の強度を記録する。そのため、センサーから読み取られたデータは、白黒の部分的画像を生じる。共焦点及びライン照射の動作モードでは、規定されたスペクトル帯内の、割り当てられた試料の位置から放出された光の強度は、追加のレンズ系配置構成を介して各センサーピクセルから知り得る。ここでは、スペクトル情報は、センサー面にわたって分布する位置情報に対して本質的に直交している。そのため、分光イメージングは、これらの動作モードにおいて可能になる。

【0029】

これに基づいて、アバランシェフォトダイオードのマトリクスは、好ましくは、イメージセンサーとして考慮されるようになる。しかしながら、さらに、例えば、ハイブリッド型検出器または光電子増倍管のマトリクス配置構成もイメージセンサーとして好適である。

【0030】

光電子増倍管の配置構成を上回るアバランシェフォトダイオードアレイの利点は、
− より小型の高感度素子であり、カメラ型の動作を可能にすること、
− 特定の表面領域上に、より多くの素子が存在することを可能にすること
− 後方照射によって１００％までのフィルファクターが達成され得ること
である。

【0031】

この点において、本発明の概念は、とりわけ、同一のイメージセンサーを用いて、多焦点イメージング、ラインイメージング、ならびに広視野イメージングを実現することにある。いくつかの可変光学アセンブリが作動され、かつイメージセンサーもダイレクトリプログラミングによって調整されるため、これらのモードを単純にかつ迅速に切り替えることが可能である。

【0032】

本発明によるレーザ走査型顕微鏡は、好ましくは、照射光を励起放射線として、かつ、それにより生じる蛍光を検出放射線として備える蛍光顕微鏡法のために設計されている。

【0033】

本発明は、図面を参照して、下記で例としてより詳細に説明される。

【図面の簡単な説明】

【0034】

【図1】本発明によるレーザ走査型顕微鏡の概略図である。

【図2】マルチ共焦点顕微鏡法の動作モード用の照射及び検出ビーム経路の構成の例である。

【図3】広視野顕微鏡法の動作モード用の照射及び検出ビーム経路の構成の例である。

【図4】ライン走査顕微鏡法の動作モード用の照射及び検出ビーム経路の構成の例である。

【図5】マルチ共焦点顕微鏡法の動作モードに関する上述の領域における、検出ビーム経路の実施形態のさらなる例である。

【図6】ライン走査顕微鏡法の動作モードに関する上述の領域における、検出ビーム経路の実施形態の例である。

【発明を実施するための形態】

【0035】

図１に示す図は、例えば蛍光顕微鏡法用に設計されている、本発明によるレーザ走査型顕微鏡の基本構造を示す。

【0036】

共焦点、ライン、または広視野動作モードに対してプログラム可能であるレーザユニット及び検出装置が提供される。すなわち、動作モードの変更時に、異なるレーザユニット及び／または検出装置の交換はもはや必要ではない。

【0037】

本質的には、動作モードが変更されるとき、照射及び検出ビーム経路も変更されないままであり、ビーム経路には、ビーム案内を調整するように設計されているいくつかの可変的に制御可能な光学アセンブリのみが存在する（図２〜図４参照）。制御可能な光学アセンブリは、それ自体が主ビームスプリッターＭＢＳ及びビーム偏向器などの顕微鏡システムの基本的な光学素子であり、また、対物レンズは、選択された動作モードとは無関係に、それらの位置が固定されたままである。現在得られる最先端の技術から公知のように、試料は、位置決めするために、好ましくは、モーター式試料台によって、対物レンズに対して座標ｘ、ｙ、ｚ内で可動である。

【0038】

それぞれの所望の動作モードの手動の事前設定に役立つコマンド入力装置が、制御回路に接続されている。

【0039】

図２は、最適なスペクトル機能の場合に約３０ｆｐｓのフレームレートを可能にする共焦点またはマルチ共焦点顕微鏡法の場合に撮像モードで照射及び検出するためのビーム経路を示す。

【0040】

旋回可能な円柱レンズ（あるいはまた、Ｐｏｗｅｌレンズ）と、照射スキャナーＳ１と、個別のレンズＬ３及びレンズＬ１、Ｌ２からなる望遠鏡を備える、旋回軸によって回転可能に収納された交換可能なレンズ系とが、主ビームスプリッターＭＢＳまでの照射ビーム経路に制御可能な光学アセンブリとして提供される。

【0041】

例として、ここで説明する共焦点またはマルチ共焦点レンズスキャンの場合、個別のレンズＬ３が照射ビーム経路へと旋回される。主ビームスプリッターＭＢＳで反射した照射光は、いずれも対物レンズの瞳と共役する平面にある切替ミラーと系スキャナーＳ２とによって対物レンズの方向に偏向される。マルチ共焦点動作モードでは、互いに固定角度関係にある扇状の形態で広がる複数のレーザビームが系に結合される。この扇状ビームは、図２の図面の平面に対して垂直に位置合わせされている、すなわち、複数のレーザビームは、図面の平面において縦に並んでいる。互いに対するビームの角度関係は、レンズアレイのピッチに調整される。照射スキャナーＳ１は、光線束が次に続くレンズ系の軸に沿って案内されるように位置決めされる。

【0042】

Ｌ３とＬ４とからなるレンズ系は、照射スキャナーＳ１の像を切替ミラーに作る一方、Ｌ５は、切替ミラーの像を系スキャナーＳ２に送る。そのため、照射スキャナーＳ１及び切替ミラーは、対物レンズの瞳と共役である。

【0043】

そのため、全ての励起ビームが重なり合う各瞳は、照射スキャナーＳ１上、切替ミラー上、系スキャナーＳ２上、及び対物レンズ内にそれぞれある。そのため、各部分ビームは、物体空間にスポットを生じ、ここでは、スポットは、ある線に沿って配置される。スポットのパターンは、系スキャナーＳ２によって試料にわたって移動される。スポットの数は、部分ビームの作動または減光によって設定される。複数の部分ビームを生じる手段が現在得られる最先端の技術から公知であり、ここでは、これ以上詳細な説明を必要としない。

【0044】

照射光と検出光との分離は、例えばノッチフィルターとして作製され得る主ビームスプリッターＭＢＳにおいて行われる。

【0045】

検出ビーム経路に沿って、切替ミラー及びレンズＬ６が配置され、これらは、スリット絞り（他の２つの動作モードに対して作動されることによって変化する）が配置される像平面を生じさせる。さらに、レンズＬ６の像平面は、それに続くレンズアレイと、ピンホール（他の２つの動作モードに対して作動されることによって変化する）を備えるピンホールレンズ系とのスキャナー側の焦点面内にある。ピンホールは、レンズＬ７のセンサー側の像平面に配置される。ピンホールの下流は、Ｌ８〜Ｌ１０からなるレンズ系であり、これは、放出光の像を検出装置に作る。設定された動作モードに依存して、変位可能なプリズムがセンサーマトリクス上で試料からの放出光の位置を最適にする。

【0046】

物体空間内でのレーザ照射の位置からの放出光は、系スキャナーＳ２によって走査停止され、かつ、ピンホールレンズ系の光軸に沿って、切替ミラーと位置合わせされる。特に、切替ミラーと主ビームスプリッターＭＢＳとの組み合わせは、各部分ビームが、レンズアレイ内でそれに対して割り当てられたレンズを通してコリメートされるように設定される。部分ビームが、レンズアレイの上流のスリット絞りの位置にある中間像の周りをテレセントリックに案内されるため、平行なビーム案内に対する変換がレンズアレイを通して行われる。その後、部分ビームの像は、ピンホールを通って検出装置のイメージセンサーに作られる。検出装置は、好ましくは、イメージセンサーとしてアバランシェフォトダイオードアレイを備え得る。

【0047】

共焦点動作モード及び他の２つの動作モードの両方において、スリット絞りの位置に常に像平面が配置され、これは、同時にまた、レンズアレイの焦点面、そしてまた、レンズＬ７の焦点面にある。

【0048】

図２に示す共焦点動作モードは、原理上、本発明による機能的に統合されたレーザ走査型顕微鏡の基本モードに対応する。このモードでは、図２から分かるように、検出放射線がレンズアレイを通って案内される。レンズアレイのそれぞれの光軸上にあるレーザスポットは、レンズアレイによって部分ビームとしてコリメートされ、さらに、テレセントリックのコリメートされた部分ビームをピンホール平面内の共通の点上に焦点を合わせるレンズＬ７までテレセントリックに案内される。そのため、全ての部分ビームを共焦点式にフィルタリングするために、この１つのピンホールのみが必要とされる。ピンホールのアパーチャは、所望のサイズまで、この動作モードでは例えば１エアリーユニットに対応する開口の直径まで小さくされる。

【0049】

それぞれ線形または平坦な励起による半共焦点またはフィールド走査式の撮像が実施される他の２つの動作モードでは、レンズアレイは、画像フィールドを強力にセグメント化するため、ビーム経路に外乱を引き起こす。そのため、これらの場合、検出放射線は、切替ミラーで別個の検出経路へ向けられるため、レンズアレイを越えて案内される。

【0050】

そのため、共焦点動作モードにある間、レンズＬ７は、全ての部分ビームの像を、ピンホール平面にある光軸上に作るが、レンズＬ７の後焦点面としてピンホール平面は、他の２つの動作モードの対物レンズの瞳と共役である、すなわち、フィールドまたはライン構成にある（図３及び図４に関する説明を参照）。

【0051】

Ｌ８とＬ９とからなるレンズ系は、ピンホール平面の像を検出装置のレンズ系へのインターフェースに作るリレー系である。レンズＬ１０は、検出装置のレンズ系を表す。

【0052】

これは、選択可能な全動作モード間を切り替えるために、本発明による能力を支援する配置構成の以下の有利な特性をもたらす：
− レンズアレイにおける小さいアパーチャ、
− レンズＬ７における大きいアパーチャ、
− 像平面におけるスリット絞り、
− レンズアレイ及びレンズＬ７のスキャナー側の焦点面が共にスリット絞りの位置にあること、
− スリット絞りは、サブフィールドが転写され得るような範囲まで、スリットの周りで制御式に開放されること、
− ピンホールは、少なくともピンホール平面に存在する瞳の境界まで開放され得るように制御され得ること。

【0053】

本説明とは異なる実施形態の変形例として、検出ビーム経路への照射ビームのミラーリングは、レンズアレイとピンホールレンズ系との間で起こり得る。その後、部分ビームは、常に照射ビーム経路に平行に案内される。

【0054】

多焦点イメージングの代わりに、部分ビームの数を削減することによって、当然ながら、レーザ走査型顕微鏡の現在得られる最先端の技術から公知のように、単焦点の動作も実行され得る。

【0055】

図３は、広視野またはフィールド走査顕微鏡法の動作モードにおける照射及び検出ビーム経路の構成の例を示す。

【0056】

ここで示す場合には、個別のレンズＬ３の代わりにレンズＬ１、Ｌ２からなる望遠鏡が、照射ビーム経路に旋回される。主ビームスプリッターＭＢＳによって反射された照射光は、結果的に切替ミラー及び系スキャナーＳ２によって対物レンズの方向に偏向されるが、ここでは、両方に、照射スキャナーＳ１の可能な限り最も迅速な走査の動きで瞳平面にわたって移動するレーザ焦点が生じる。

【0057】

対物レンズのフィールド全体においてそのように励起された蛍光が、試料からの戻り経路上で対物レンズの瞳を完全に照射する。対物レンズの瞳の像が、系スキャナーＳ２及び切替ミラー上の共役面に作られる。図示のフィールド走査の場合、主ビームスプリッターＭＢＳによって伝達される転写可能なフィールドが別個の検出経路上のレンズアレイを越えて軸外に方向付けるように作動することにより、切替ミラーが設定される。

【0058】

検出ビーム経路に配置された可変ピンホール、及びレンズアレイの前にある可変スリット絞りの両方が、ここで示す動作モードにおいて広く開放している。

【0059】

作動によって設定されたオフセット角度によって、系スキャナーＳ２は、顕微鏡の対物レンズの利用可能な物体のフィールドにおいて、撮像されたサブフィールドの位置を決定する。任意選択的に、別の視野絞り（図示せず）も一緒にスキャナーをオフセットさせて、対物レンズの後ろ側の第１の中間像の平面において動かされて、検出可能な物体のフィールド外の試料領域の露光過度を防止または最小限にし得る。

【0060】

あるいは、この点において、照射ズームレンズが設けられて、照射の開口数（ＮＡ）を制限するため、照射された物体のフィールドのサイズを制御し得る。しかしながら、ＮＡの調整も、交換可能なレンズ系において提供され、かつ転写可能なフィールドが完全に照射されるように設計され得る。

【0061】

図４は、ライン走査モード用のビーム経路を示す。この場合、円柱レンズは、照射ビーム経路に位置決めされ、その結果、ライン状の光分布が照射スキャナーＳ１上に生じ、ここでは、照射スキャナーＳ１は、円柱レンズの焦点面にある。交換可能なレンズ系は、個別のレンズＬ３が照射ビーム経路に配置されるように位置する。そのため、結果的に瞳平面は照射スキャナーＳ１上、切替ミラー上、系スキャナーＳ２上、及び対物レンズ内にある。その後、対物レンズは、物体空間にライン状焦点を生じ、これは、系スキャナーＳ２によってライン方向に垂直に走査され、かつオフセット角度によって位置決めされる。

【0062】

ライン状焦点からの放出光は、系スキャナーＳ２によって走査停止され、かつ、切替ミラーの対応する位置によって、レンズアレイを越えるように方向付けられる。レンズアレイの前にある中間像のスリット絞りは、所望の幅へ引き寄せられて半共焦点方向を得る。下流のピンホールは、その最大まで開く。変位可能なプリズムは、線分布の中心を検出レンズ系のイメージセンサーの軸上に引き寄せる。ライン走査モードの場合、イメージセンサーは、スリットと共役の像平面にある。

【0063】

同様に発明概念の範囲内にある、図２〜図４を参照した上述の説明とは異なる実施形態の変形例では、変位可能なプリズムの好ましい位置は、動作モードに依存して、転写されたフィールドの中心をそれに続くレンズ系の軸上に向ける位置ではなく、イメージセンサーがそれぞれの場合に選択された動作モードに対して最も効率的に使用され得るようにする位置である。具体的には、これは、
ａ．フィールド走査の場合、転写可能なフィールドの像が、イメージセンサーの中心に対して対称的にイメージセンサー上に作られること、
ｂ．ライン走査の場合、線状の放出光の分布が、線形アライメントに対して垂直なプリズムまたはグレーティングによってスペクトルで分散され、及びスペクトルで分割されたラインの像が、センサーの中心に対して対称的にイメージセンサーに作られるか、または選択した開始波長によってセンサーの縁で始まること、
ｃ．多焦点走査の場合、個々の部分ビームが、さらなるレンズアレイを通して案内される一方、その後、それに続いて、ライン走査の説明と類似して、放出光分布の分光イメージングが起こること
を意味する。

【0064】

ｂ）及びｃ）に必要な検出ビーム経路の切り替えは、例えば、変位可能なプリズムによって起こり得る。これは、図５及び図６に概略的に示される。

【0065】

図５は、より詳細に、例を参照して、変位可能なプリズムから多焦点動作用のセンサー平面までの光路を示す。図５の（ａ）は上面図を示す一方、図５の（ｂ）は検出ビーム経路の側面図を示す。変位可能なプリズムの下流には、レンズの複数対Ｌ１１／Ｌ１２及びＬ１３／１４からなる２つのリレーレンズ系があり、これらは、放出光の像をセンサー平面に作る。２つのリレーレンズ系の間には、固定して配置されたレンズアレイがある。

【0066】

ここで示す多焦点動作の場合、変位可能なプリズムは、放出光がレンズアレイを通って案内されるように設定される。そのため、部分ビームの像は、それに続くリレーレンズ系の焦点面に作られる。レンズＬ１３及びＬ１４の間では、部分ビームがここではコリメートされ、かつ互いに対して固定角度関係で案内される。Ｌ１３及びＬ１４の共通の焦点面には、部分ビームに案内される放出光をそのスペクトル成分に分解する分散素子、例えばプリズムがある。有利には、分散方向は、部分ビームによって広がった扇状に対して垂直にある。レンズＬ１４は、スペクトルで分散した放出光の像をセンサーに作る。スポット及びスペクトルは、有利には、互いに対して垂直に配置される。

【0067】

ここでは、センサーは、選択された動作モードとは無関係に、試料と共役する平面にある。対照的に、他の２つの動作モード、すなわちライン及びフィールド走査を用いて、検出放射線は、このレンズアレイを越えて案内される。

【0068】

ライン走査動作モードでは、図６に示すような変位可能なプリズムが、放出光がレンズアレイを越えて案内されるように設定される。イメージセンサー上のスペクトル成分は、マルチ共焦点動作モード（図５）及びライン走査動作モード（図６）と同じ分散素子を用いて生じる。センサーマトリクス上のスペクトルの位置は、必要な場合、マルチ共焦点モードに関する図５によって、かつ、ライン走査モードに関する図６によって示されるような分散レンズ系の回転によって得られる。フィールド走査モードでは、分散素子は、ビーム経路から取り除かれる。

【0069】

瞳とフィールドとの間の切り替えは、原理上、旋回可能なベルトランレンズを用いて、または切り替え可能な光路によって起こり得る。切り替えに好適な要素は、既に特定したように、角度の分離のためのミラー（好ましくはＭＥＭＳ）、横方向の分離のための平面板、または両方のためのプリズムである。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】