特許 6557683 被験体において血管新生を誘導するための１００００ＤＡ未満の平均分子量を有するデキストラン硫酸の使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6557683

(24)【登録日】2019年7月19日

(45)【発行日】2019年8月7日

(54)【発明の名称】被験体において血管新生を誘導するための１００００ＤＡ未満の平均分子量を有するデキストラン硫酸の使用

(51)【国際特許分類】

   A61K 31/737 20060101AFI20190729BHJP

   A61K 9/08 20060101ALI20190729BHJP

   A61P 9/00 20060101ALI20190729BHJP

   A61P 9/10 20060101ALI20190729BHJP

   A61P 17/02 20060101ALI20190729BHJP

   A61P 21/04 20060101ALI20190729BHJP

【ＦＩ】

   A61K31/737

   A61K9/08

   A61P9/00

   A61P9/10

   A61P17/02

   A61P21/04

【請求項の数】19

【全頁数】39

(21)【出願番号】特願2016-572597(P2016-572597)

(86)(22)【出願日】2015年6月11日

(65)【公表番号】特表2017-518322(P2017-518322A)

(43)【公表日】2017年7月6日

(86)【国際出願番号】SE2015050677

(87)【国際公開番号】WO2015190989

(87)【国際公開日】20151217

【審査請求日】2018年3月22日

(31)【優先権主張番号】1450729-7

(32)【優先日】2014年6月12日

(33)【優先権主張国】SE

(31)【優先権主張番号】1451120-8

(32)【優先日】2014年9月22日

(33)【優先権主張国】SE

(31)【優先権主張番号】1451540-7

(32)【優先日】2014年12月15日

(33)【優先権主張国】SE

(73)【特許権者】

【識別番号】515312807

【氏名又は名称】ティーエックス メディック エービー

(74)【代理人】

【識別番号】100114775

【弁理士】

【氏名又は名称】高岡 亮一

(74)【代理人】

【識別番号】100121511

【弁理士】

【氏名又は名称】小田 直

(74)【代理人】

【識別番号】100202751

【弁理士】

【氏名又は名称】岩堀 明代

(74)【代理人】

【識別番号】100191086

【弁理士】

【氏名又は名称】高橋 香元

(72)【発明者】

【氏名】ワーズ，アンダーズ

(72)【発明者】

【氏名】ブリュス，ラーズ

(72)【発明者】

【氏名】ブリュス，アダム

【審査官】 鶴見 秀紀

(56)【参考文献】

【文献】 特開昭６３−０９６１２８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１２−０２５７５９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 再公表特許第２００６／１３４６９２（ＪＰ，Ａ１）

【文献】 特開２００５−１０４９１０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開平０６−１５７３２２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開平０２−２２３５２５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 European Heart Journal，２００５年，Vol.26,No.21，pp.2334-2343

【文献】 血液と脈管，１９８１年，Vol.12,No.1，pp.127-129

【文献】 血液と脈管，１９８２年，Vol.13,No.4，pp.585-588

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ３１／００−３１／８０

Ａ６１Ｋ ９／００−９／７２

Ａ６１Ｐ ９／００

Ａ６１Ｐ ９／１０

Ａ６１Ｐ １７／０２

Ａ６１Ｐ ２１／０４

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

１００００Ｄａ以下の平均分子量および１５〜２０％の範囲の平均硫黄含量を有するデキストラン硫酸またはその薬学的に許容される塩を含む、被験体の虚血組織または虚血臓器において血管新生を誘導するのに使用するための医薬組成物であって、前記被験体への静脈内投与または皮下投与のために製剤化されている医薬組成物。

【請求項2】

１００００Ｄａ以下の平均分子量および１５〜２０％の範囲の平均硫黄含量を有するデキストラン硫酸またはその薬学的に許容される塩を含む、虚血を患う被験体において血流を増加させるのに使用するための医薬組成物であって、前記被験体への静脈内投与または皮下投与のために製剤化されている医薬組成物。

【請求項3】

前記被験体の虚血組織または虚血臓器において血流を増加させるのに使用するための、請求項２に記載の医薬組成物。

【請求項4】

１００００Ｄａ以下の平均分子量および１５〜２０％の範囲の平均硫黄含量を有するデキストラン硫酸またはその薬学的に許容される塩を含む、被験体における虚血組織の血管新生に使用するための医薬組成物であって、前記被験体への静脈内投与または皮下投与のために製剤化されている医薬組成物。

【請求項5】

前記平均分子量は２０００と１００００Ｄａの範囲内である、請求項１〜４のいずれかに記載の医薬組成物。

【請求項6】

前記平均分子量は３０００と１００００Ｄａの範囲内である、請求項５に記載の医薬組成物。

【請求項7】

前記平均分子量は３５００と９５００Ｄａの範囲内である、請求項６に記載の医薬組成物。

【請求項8】

前記平均分子量は４５００と７５００Ｄａの範囲内である、請求項７に記載の医薬組成物。

【請求項9】

前記平均分子量は４５００と５５００Ｄａの範囲内である、請求項８に記載の医薬組成物。

【請求項10】

前記平均硫黄含量は約１７％である、請求項１〜９のいずれかに記載の医薬組成物。

【請求項11】

前記デキストラン硫酸またはその薬学的に許容される塩は、１８５０と２０００Ｄａの区間内の、核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光法により測定される数平均分子量（Ｍ_ｎ）を有する、請求項１〜４のいずれかに記載の医薬組成物。

【請求項12】

前記デキストラン硫酸またはその薬学的に許容される塩は、平均で５．１のグルコース単位、および２．６〜２．７という１グルコース単位あたりの平均硫酸数を有する、請求項１１に記載の医薬組成物。

【請求項13】

前記デキストラン硫酸またはその薬学的に許容される塩は、注射水溶液として製剤化されている、請求項１〜１２のいずれかに記載の医薬組成物。

【請求項14】

前記デキストラン硫酸またはその薬学的に許容される塩は、前記被験体の体重１ｋｇあたり０．０５〜５０ｍｇの範囲の投与量で投与されるように製剤化されている、請求項１〜１３のいずれかに記載の医薬組成物。

【請求項15】

前記被験体は、ヒト被験体の体内で虚血を引き起こす医学的状態を患うヒト被験体であり、
前記医学的状態は、創傷治癒；末梢性虚血；冠動脈虚血；子供における虚血性疾患；仮死脳症；脳性麻痺；中枢神経系における虚血；筋ジストロフィー症；血栓性、出血性または外傷性の損傷により引き起こされる虚血、からなる群より選択される、
請求項１〜１４のいずれかに記載の医薬組成物。

【請求項16】

前記その薬学的に許容される塩は、デキストラン硫酸のナトリウム塩である、請求項１〜１５のいずれかに記載の医薬組成物。

【請求項17】

被験体の虚血組織または虚血臓器において血管新生を誘導するための被験体への静脈内投与または皮下投与のために製剤化された医薬の製造のための、１００００Ｄａ未満の平均分子量および１５〜２０％の範囲の平均硫黄含量を有するデキストラン硫酸またはその薬学的に許容される塩の使用。

【請求項18】

虚血を患う被験体において血流を増加させるための被験体への静脈内投与または皮下投与のために製剤化された医薬の製造のための、１００００Ｄａ未満の平均分子量および１５〜２０％の範囲の平均硫黄含量を有するデキストラン硫酸またはその薬学的に許容される塩の使用。

【請求項19】

被験体における虚血組織の血管新生のための被験体への静脈内投与または皮下投与のために製剤化された医薬の製造のための、１００００Ｄａ未満の平均分子量および１５〜２０％の範囲の平均硫黄含量を有するデキストラン硫酸またはその薬学的に許容される塩の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本実施形態は一般に、血管新生、特に被験体において血管新生を誘導するためのデキストラン硫酸の使用に関する。

【背景技術】

【0002】

血管新生は新しい血管が先在血管から形成される生理的プロセスである。これは、中胚葉細胞前駆体からの内皮細胞のデノボ形成である脈管形成とは異なる。発生中の胚の最初の血管は脈管形成により形成され、その後、血管新生が発生中の、および疾患におけるほとんどの（全てではないが）血管増殖に関与している。

【0003】

血管新生は成長および発生、ならびに創傷治癒および肉芽組織の形成における正常な生命維持プロセスである。

【0004】

血管新生は伝統的に、発芽血管新生または挿入成長、または分割血管新生のいずれかとして分類される。発芽血管新生は完全に新しい血管を形成し、一方、分割血管新生は１つの既存の血管を２つに分割する。

【0005】

血管新生は、不十分な血管新生または異常な脈管構造のいずれかにより特徴付けられる疾患と闘うための標的となり得る。修復または別の代謝活性組織に血管が存在しないと、修復または他の必須機能が阻害され得る。虚血性慢性創傷などのいくつかの疾患は、失敗した、または不十分な血管形成の結果であり、血管の局所拡張により治療され得、そのため、新しい栄養分がその部位に与えられ、修復が促進される。

【0006】

血管新生の原理の現代の臨床適用は２つの主な領域に分割される：抗血管新生療法および血管新生促進療法。抗血管新生療法は、増殖するのに豊富な酸素および栄養分を必要とする、癌および悪性腫瘍を治療または防止するために使用されており、血管新生促進療法は、例えば、心血管疾患、冠動脈疾患、動脈硬化性疾患、冠動脈心疾患、末梢動脈疾患、創傷治癒障害、などを治療するための選択肢として探究されている。

【0007】

血管新生促進治療における伝統的なアプローチは、とりわけ、増幅または阻害のために対象となる遺伝子を標的にする遺伝子治療；主として血管新生増殖因子を操作するタンパク質療法；ならびに特定の細胞型の埋め込みを含む細胞療法を含む。

【0008】

遺伝子治療に関する依然として重大な未解決問題が存在する。困難としては、治療遺伝子の標的細胞のゲノム中への有効な組込み、遺伝子を埋入するのに使用されるウイルスベクターに関連する望ましくない免疫応答、潜在的な毒性、免疫原性、炎症反応、および発癌のリスクの低減ならびに血管新生の遺伝学的基礎の莫大な複雑さが挙げられる。

【0009】

血管新生促進タンパク質療法は様々な増殖因子、例えば線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）および血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）を使用して、血管新生を促進する。タンパク質療法の障害は、送達方法である。タンパク質投与の経口、静脈内、動脈内、または筋肉内経路は必ずしも有効ではなく、というのも、治療タンパク質は、標的組織に入ることができる前に、代謝または排除される可能性があるからである。細胞ベースの血管新生促進療法は依然として、研究の初期段階にあり、最良の細胞型および使用する投与量に関して多くの未解決の問題が存在する。

【0010】

虚血は組織への血液供給の制限であり、細胞代謝のために必要とされる酸素およびグルコースの不足を引き起こす。虚血は、一般に血管に関連する問題により引き起こされ、組織へのダメージまたはその機能障害が起こる。これはまた、時としてうっ血、例えば血管収縮、血栓症または塞栓症に起因する身体のある部分での局所貧血および低酸素を意味する。

【0011】

長期虚血の期間後の冠動脈血流の回復はしばしば、内皮ダメージおよび凝血促進および炎症促進表現型をとる罹患内皮を引き起こす、いわゆる再灌流傷害を伴う。再灌流は、虚血により誘導される補体活性化および堆積を著しく促進する。

【0012】

デキストラン硫酸はよく知られた補体阻害剤であり、そのため、虚血後再灌流傷害に対して内皮の細胞保護を達成するために提案されてきた。

【0013】

Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２１５， ２９４−３０２ （１９９４）は、硫酸化多糖、例えばヘパリンおよびデキストラン硫酸は、インビトロで、コラーゲンにより誘導される血管形成のために使用することができることを開示する。しかしながら、インビボ実験データは、低分子量硫酸化多糖ヘパリン（２．４ｋＤａ）は血管新生を阻害したことを示した、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ３， ５６７−５７３ （１９９３）， Ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ ２３， １４１−１４９ （１９９３）。

【0014】

米国特許第５，１３５，９２０号は、５０００００Ｄａの平均分子量を有するデキストラン硫酸は血管新生抑制性であり、すなわち血管新生を阻害することを開示する。

【0015】

当技術分野における血管新生の分野内には、依然として改善の余地がある。

【発明の概要】

【0016】

一般的目的は、被験体において血管新生を誘導することである。

【0017】

別の目的は、虚血を患う被験体において血流を増加させることである。

【0018】

これらのおよび他の目的は本明細書で開示される実施形態により満たされる。

【0019】

実施形態の１つの態様は、被験体において血管新生を誘導するための、１００００Ｄａ未満の平均分子量を有する、デキストラン硫酸、またはその薬学的に許容される誘導体に関する。

【0020】

実施形態の別の態様は、被験体において血管新生を誘導するための方法に関する。方法は、１００００Ｄａ未満の平均分子量を有する、デキストラン硫酸、またはその薬学的に許容される誘導体を被験体に投与することを含む。

【0021】

実施形態のさらなる態様は、被験体において血管新生を誘導するための薬の製造のための１００００Ｄａ未満の平均分子量を有する、デキストラン硫酸、またはその薬学的に許容される誘導体の使用に関する。

【0022】

実施形態のさらに別の態様は、虚血を患う被験体において血流を増加させるための、１００００Ｄａ未満の平均分子量を有する、デキストラン硫酸、またはその薬学的に許容される誘導体に関する。

【0023】

実施形態のさらなる態様は、虚血を患う被験体において血流を増加させるための方法に関する。方法は、１００００Ｄａ未満の平均分子量を有する、デキストラン硫酸、またはその薬学的に許容される誘導体を前記被験体に投与することを含む。

【0024】

実施形態のさらにもう一つの態様は、虚血を患う被験体において血流を増加させるための薬の製造のための、１００００Ｄａ未満の平均分子量を有する、デキストラン硫酸、またはその薬学的に許容される誘導体の使用に関する。

【0025】

実施形態のさらに別の態様は、被験体における虚血組織の血管新生のための、１００００Ｄａ未満の平均分子量を有する、デキストラン硫酸、またはその薬学的に許容される誘導体に関する。

【0026】

実施形態のさらなる態様は、被験体における虚血組織の血管新生のための方法に関する。方法は、１００００Ｄａ未満の平均分子量を有する、デキストラン硫酸、またはその薬学的に許容される誘導体を前記被験体に投与することを含む。

【0027】

実施形態のさらにもう一つの態様は、被験体における虚血組織の血管新生のための薬の製造のための、１００００Ｄａ未満の平均分子量を有する、デキストラン硫酸、またはその薬学的に許容される誘導体の使用に関する。

【0028】

実施形態のさらなる態様は、ある臓器および／または血管柄付組織において血管新生を誘導するためにインビトロまたはエクスビボで使用するための、血管柄付組織および／または臓器において血流を増加させるためにインビトロまたはエクスビボで使用するための、および／または血管柄付組織および／または臓器をインビトロまたはエクスビボで血管新生するための、１００００Ｄａ以下の平均分子量を有する、デキストラン硫酸、またはその薬学的に許容される誘導体およびそのための関連する方法に関する。

【0029】

実施形態は、そのさらなる目的および利点と一緒に、添付の図面と一緒にまとめられた下記説明を参照することにより最もよく理解され得る。

【図面の簡単な説明】

【0030】

【図1】マウス重症四肢虚血モデル全体の平均の体重を示す図である。二元配置ＡＮＯＶＡ、続いてボンフェローニ事後比較より、群間で統計的に有意な差はないことが明らかになった。

【図2】マウス重症四肢虚血モデル全体の研究群による平均血流を示す図である。反復測定のための二元配置ＡＮＯＶＡ、続いてボンフェローニ事後検定が実施された。デキストラン硫酸処置群２Ｍ、３Ｍおよび４Ｍと対照群１Ｍの比較により、第１４日および第２１日から第３５日まで統計的に有意な差が明らかになった（ｐ＜０．００１）。

【図3】重症四肢虚血研究後にＦＩＴＣ標識デキストラン（ＤＡ）による二重染色した群のＣＤ３４毛細血管密度を示す図である。ＤＡバーは機能的毛細血管を表す。統計解析を二元配置ＡＮＯＶＡ、続いてボンフェローニ多重比較を用いて実施した。

【図4】重症四肢虚血研究後にＦＩＴＣ標識デキストラン（ＤＡ）による二重染色した群における、虚血性と非虚血性肢のＣＤ３４毛細血管密度を比較した図である。ＤＡバーは機能的毛細血管を表す。統計解析を二元配置ＡＮＯＶＡ、続いてボンフェローニ多重比較を用いて実施した。

【図5A】重症四肢虚血研究における群のＣＤ３４毛細血管密度を示す（図５Ａ−１Ｍビヒクル対照群からのマウス；図５Ｂ−３Ｍデキストラン硫酸３０ｍｇ／ｋｇ反復群からのマウス；図５Ｃ−４Ｍデキストラン硫酸３０ｍｇ／ｋｇ単回群からのマウス）。左図はＣＤ３４染色を示し、右図はＦＩＴＣ標識デキストラン染色を示す。

【図5B】重症四肢虚血研究における群のＣＤ３４毛細血管密度を示す（図５Ａ−１Ｍビヒクル対照群からのマウス；図５Ｂ−３Ｍデキストラン硫酸３０ｍｇ／ｋｇ反復群からのマウス；図５Ｃ−４Ｍデキストラン硫酸３０ｍｇ／ｋｇ単回群からのマウス）。左図はＣＤ３４染色を示し、右図はＦＩＴＣ標識デキストラン染色を示す。

【図5C】重症四肢虚血研究における群のＣＤ３４毛細血管密度を示す（図５Ａ−１Ｍビヒクル対照群からのマウス；図５Ｂ−３Ｍデキストラン硫酸３０ｍｇ／ｋｇ反復群からのマウス；図５Ｃ−４Ｍデキストラン硫酸３０ｍｇ／ｋｇ単回群からのマウス）。左図はＣＤ３４染色を示し、右図はＦＩＴＣ標識デキストラン染色を示す。

【図6】デキストラン硫酸で処置したＨＬＩ損傷動物における四肢機能スコアを示す図である。第０日に、ＨＬＩを大腿動脈の結紮および切除により誘導した。処置を、第８日に、週１回（１×／ｗ）または週３回（３×／ｗ）のビヒクルまたは１０もしくは３０ｍｇ／ｋｇのデキストラン硫酸を用いて開始した。四肢スコアを、０〜３で段階分けし、ここで、３は最も悪い（足の引きずり）。デキストラン硫酸は、二元配置ＡＮＯＶＡにより計算される、第２１日以降（第７、１４、２１、２８および３５日に分析）著しい改善を誘導した。

【図7】内皮マーカー平滑筋アクチン（ＳＭＡ）の重症四肢虚血研究における群の毛細血管密度を示す図である。二元配置ＡＮＯＶＡ、続いてボンフェローニ多重比較による統計学的有意性。

【図8】左後肢の大腿動脈結紮後３５日に、２匹のマウスにおいて測定した血流を、非接触レーザードップラー画像を用いて比較する。下パネルはビヒクル処置され（１Ｍ群）、上パネルは、デキストラン硫酸による処置を受けた（３Ｍ群）。

【図9】ｔＭＣＡＯ脳卒中率研究のために使用される群における体重の分布を示す。

【図10】ｔＭＣＡＯ脳卒中率研究を通した、処置群によるＮｅｕｒｏｓｃｏｒｅを示す。

【図11】ｔＭＣＡＯ脳卒中率研究を通した、処置群によるステッピングテストを示す。

【図12】ｔＭＣＡＯ脳卒中率研究を通した、処置群による前肢置き直し試験を示す。

【図13】ｔＭＣＡＯ脳卒中率研究を通した、処置群による身体スイングテストデルタ（左旋回−右旋回）を示す。

【図14】第２９日にビヒクル対照と比べた、両方のデキストラン硫酸群における脳血流比および血管平均直径のパーセント変化を示す。

【図15】第３０日に、ビヒクル対照と比べて、毎日デキストラン硫酸１５ｍｇ／ｋｇにより処置したラットにおけるＳＭＡ毛細血管密度を示す。

【図16】第３０日での、デキストラン硫酸処置群対対照ビヒクル群における、ＧＦＡＰ面積（平方ミクロン／×１０視野（ｓｑｕａｒｅ ｍｉｃｒｏｎｓ ｐｅｒ ×１０ ｆｉｅｌｄ）で表される陽性細胞の面積）を示す。

【図17A】ビヒクル対照群（図１７Ａ）およびデキストラン硫酸（１５ｍｇ／ｋｇ、毎日）群（図１７Ｂ）からのラットでの、毛細血管密度に対する処置効果を示す。

【図17B】ビヒクル対照群（図１７Ａ）およびデキストラン硫酸（１５ｍｇ／ｋｇ、毎日）群（図１７Ｂ）からのラットでの、毛細血管密度に対する処置効果を示す。

【図18】ＭＩ誘導後３５日での梗塞サイズを示す。

【図19】ＭＩ誘導後３５日での、デキストラン硫酸処置（１５ｍｇ／ｋｇ ３回／週を３週間）およびビヒクル対照群に対する、ＳＭＡ染色を比較する。

【図20A】２匹のデキストラン硫酸処置（１５ｍｇ／ｋｇ ３回／週を３週間）ラット（図２０Ａ、２０Ｂ）および１匹のビヒクル対照ラット（図２０Ｃ）での血管密度に対するＳＭＡ染色を示す。

【図20B】２匹のデキストラン硫酸処置（１５ｍｇ／ｋｇ ３回／週を３週間）ラット（図２０Ａ、２０Ｂ）および１匹のビヒクル対照ラット（図２０Ｃ）での血管密度に対するＳＭＡ染色を示す。

【図20C】２匹のデキストラン硫酸処置（１５ｍｇ／ｋｇ ３回／週を３週間）ラット（図２０Ａ、２０Ｂ）および１匹のビヒクル対照ラット（図２０Ｃ）での血管密度に対するＳＭＡ染色を示す。

【図21】ラットＨＬＩモデルにおける平均血流を示す。

【図22】ラットＨＬＩモデルにおける四肢スコアを示す。

【図23】ＨＬＩ損傷脚における、ＳＭＡおよび第８因子毛細血管密度示す。

【図24】ＨＬＩ損傷脚における血管造影毛細血管スコアを示す。

【図25A】ビヒクル対照動物（図２５Ａ）および処置群２Ｍ、３Ｍおよび４Ｍにおける動物（図２５Ｂ〜２５Ｄ）の血管造影毛細血管画像を示す。

【図25B】ビヒクル対照動物（図２５Ａ）および処置群２Ｍ、３Ｍおよび４Ｍにおける動物（図２５Ｂ〜２５Ｄ）の血管造影毛細血管画像を示す。

【図25C】ビヒクル対照動物（図２５Ａ）および処置群２Ｍ、３Ｍおよび４Ｍにおける動物（図２５Ｂ〜２５Ｄ）の血管造影毛細血管画像を示す。

【図25D】ビヒクル対照動物（図２５Ａ）および処置群２Ｍ、３Ｍおよび４Ｍにおける動物（図２５Ｂ〜２５Ｄ）の血管造影毛細血管画像を示す。

【0031】

全ての数値は平均＋平均値の標準誤差を示す。

【発明を実施するための形態】

【0032】

本実施形態は一般に、血管新生、特に被験体において血管新生を誘導するためのデキストラン硫酸の使用に関する。

【0033】

本実施形態は、特定の平均分子量の範囲内のデキストラン硫酸は、被験体、好ましくは哺乳類被験体、より好ましくはヒト被験体に投与されると、血管新生誘導効果および血流増加効果を有するという発見に基づく。

【0034】

実施形態のデキストラン硫酸のこの効果は、硫酸化多糖は血管新生をインビボで阻害したこと、および５０００００Ｄａの平均分子量を有するデキストラン硫酸は血管新生抑制性であり、すなわち血管新生を阻害することを開示する先行技術を考慮すると、非常に驚くべきであった。

【0035】

明確な対比で本明細書で提示される実験データは、実施形態のデキストラン硫酸は、虚血モデルおよび脳卒中モデルにおける著しく増加した平均血流、減少した虚血重症度、増加した毛細血管密度ならびに心筋梗塞（ＭＩ）モデルにおける低減した梗塞サイズにより見られるように、血管新生を誘導するのにインビボで効果を有することを示す。実施形態のデキストラン硫酸は、さらに虚血組織で血管を選択的に形成することができ、一方、非虚血組織では有意の血管形成を引き起こさない。

【0036】

したがって、実施形態の１つの態様は、被験体において血管新生を誘導するのに使用するための、１００００未満の平均分子量を有する、デキストラン硫酸、またはその薬学的に許容される誘導体に関する。

【0037】

下記では、デキストラン硫酸の（平均）分子量および硫黄含量への言及は、デキストラン硫酸の任意の薬学的に許容される誘導体にもあてはまる。よって、デキストラン硫酸の薬学的に許容される誘導体は、好ましくは下記実施形態で記載される平均分子量および硫黄含量を有する。

【0038】

実施形態の範囲外のデキストラン硫酸は、劣った血管新生効果を有する、または実に全く血管新生効果を有さないと考えられる。例えば、別の硫酸化多糖であるヘパリンは、平均２．４ｋＤａの分子量を有するが、実際、より大きなデキストラン硫酸分子のように血管新生を阻害した（Ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ ２３， １４１−１４９ （１９９３）；米国特許第５，１３５，９２０号）。

【0039】

さらに、１００００Ｄａを超える分子量のデキストラン硫酸は一般に、より低い平均分子量を有するデキストラン硫酸と比べて、副作用プロファイルに対する効果がより低い。これは、被験体に安全に投与することができるデキストラン硫酸の最高用量は、本範囲内の平均分子量を有するデキストラン硫酸分子と比べて、より大きなデキストラン硫酸分子（＞１００００Ｄａ）ではより低くなることを意味する。結果として、そのようなより大きなデキストラン硫酸分子はデキストラン硫酸が被験体にインビボで投与される臨床使用ではより適切でなくなる。加えて、大きなデキストラン硫酸分子は、事実、米国特許第５，１３５，９２０号から明らかなように、実施形態のデキストラン硫酸と比べて逆効果を有する。

【0040】

このように、デキストラン硫酸が被験体に投与されると、血管新生効果を有するデキストラン硫酸の平均分子量に関しては、その範囲は非常に狭く、実施形態の範囲外のデキストラン硫酸分子は血管新生効果を有さない、または実に、血管新生阻害効果を有すると考えられる。

【0041】

デキストラン硫酸は硫酸化多糖、特に硫酸化グルカン、すなわち多くのグルコース分子からなる多糖である。平均分子量は、本明細書で規定されるように、個々の硫酸化多糖はこの平均分子量とは異なる分子量を有し得るが、平均分子量は硫酸化多糖の平均の分子量を表す。これはさらに、デキストラン硫酸試料に対してこの平均分子量近くの分子量の自然分布が存在することを意味する。

【0042】

デキストラン硫酸の平均分子量（Ｍ_ｗ）は、典型的には、ゲル排除／浸透クロマトグラフィー、光散乱または粘度などの間接的方法を使用して決定される。そのような間接的方法を使用する平均分子量の決定は、カラムおよび溶離液の選択、流速、較正手順、などを含む多くの因子に依存するであろう。

【0043】

平均分子量（Ｍ_ｗ）：

【数1】

数値よりもむしろ分子サイズに感応する方法、例えば光散乱およびサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）法では典型的。正規分布が仮定される場合、そうすると、Ｍ_ｗの両側に同じ重量が存在し、すなわちＭ_ｗ未満の分子量を有する試料中のデキストラン硫酸分子の総重量がＭ_ｗを超える分子量を有する試料中のデキストラン硫酸分子の総重量に等しい。

【0044】

一実施形態では、デキストラン硫酸またはその薬学的に許容される誘導体は２０００と１００００Ｄａの範囲内の平均分子量を有する。別の実施形態では、平均分子量は２５００と１００００Ｄａの範囲内である。特定の好ましい実施形態では、平均分子量は３０００〜１００００Ｄａの範囲内である。

【0045】

任意的であるが、好ましい実施形態では、デキストラン硫酸分子の４０％未満が３０００Ｄａ未満の分子量を有し、好ましくは、デキストラン硫酸分子の３５％未満、例として３０％未満または２５％未満が３０００Ｄａ未満の分子量を有する。加えて、またはその代わりに、デキストラン硫酸分子の２０％未満は、１００００Ｄａ超の分子量を有し、好ましくは、デキストラン硫酸分子の１５％未満、例として１０％未満または５％未満が１００００Ｄａ超の分子量を有する。よって、特定の実施形態では、デキストラン硫酸は平均分子量近くの実質的に狭い分子量分布を有する。

【0046】

特定の実施形態では、デキストラン硫酸、またはその薬学的に許容される誘導体の平均分子量は３５００と９５００Ｄａの範囲内、例えば３５００と８０００Ｄａの範囲内である。

【0047】

別の特定の実施形態では、デキストラン硫酸、またはその薬学的に許容される誘導体の平均分子量は４５００と７５００Ｄａの範囲内である。

【0048】

さらなる特定の実施形態では、デキストラン硫酸、またはその薬学的に許容される誘導体の平均分子量は４５００と５５００Ｄａの範囲内である。

【0049】

よって、現在のところ好ましい実施形態では、デキストラン硫酸、またはその薬学的に許容される誘導体の平均分子量は、好ましくはおよそ５０００Ｄａであり、または少なくとも実質的に５０００Ｄａに近く、例えば５０００±５００Ｄａ、例えば５０００±４００Ｄａ、好ましくは５０００±３００Ｄａまたは５０００±２００Ｄａ、例として５０００±１００Ｄａである。よって、一実施形態では、デキストラン硫酸、またはその薬学的に許容される誘導体の平均分子量は４．５ｋＤａ、４．６ｋＤａ、４．７ｋＤａ、４．８ｋＤａ、４．９ｋＤａ、５．０ｋＤａ、５．１ｋＤａ、５．２ｋＤａ、５．３ｋＤａ、５．４ｋＤａまたは５．５ｋＤａである。

【0050】

特定の実施形態では、以上で提示されるデキストラン硫酸、またはその薬学的誘導体の平均分子量は平均Ｍ_ｗであり、好ましくはゲル排除／浸透クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、光散乱または粘度に基づく方法により決定される。

【0051】

特定の実施形態では、デキストラン硫酸、またはその薬学的に許容される誘導体は、平均して、約５の、またはわずかにこれを超えるグルコース単位から構成され、少なくとも２．０、例えば少なくとも２．５の１グルコース単位あたりの平均硫酸数を有する。

【0052】

デキストラン硫酸はデキストランのポリアニオン性誘導体であり、硫黄を含む。実施形態のデキストラン硫酸の平均硫黄含量は、好ましくは１５〜２０％、より好ましくはおよそ１７％であり、一般に１つのグルコシル残基あたり約２つの硫酸基に対応する。特定の実施形態では、デキストラン硫酸の硫黄含量は好ましくは、デキストラン分子の可能な最大程度の硫黄含量に等しい、または少なくともこれに近い。

【0053】

特定の実施形態では、実施形態のデキストラン硫酸は、１８５０と２０００Ｄａの区間内の、核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光法により測定される数平均分子量（Ｍ_ｎ）を有する。

【0054】

別の特定の実施形態では、実施形態のデキストラン硫酸は、平均して５．１のグルコース単位および２．６〜２．７の１グルコース単位あたりの平均硫酸数を有し、典型的には、１８５０と２０００Ｄａの区間内の核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光法により測定される数平均分子量（Ｍ_ｎ）が得られる。

【0055】

数平均分子量（Ｍ_ｎ）：

【数2】

典型的には、末端基アッセイ、例えばＮＭＲ分光法またはクロマトグラフィーにより誘導される。正規分布が仮定される場合、そうすると、同じ数のデキストラン硫酸分子がＭ_ｎの同じ側に見出すことができ、すなわち、Ｍ_ｎ未満の分子量を有する試料中のデキストラン硫酸分子の数がＭ_ｎを超える分子量を有する試料中のデキストラン硫酸分子の数に等しい。

【0056】

実施形態によるデキストラン硫酸はデキストラン硫酸の薬学的に許容される誘導体として提供することができる。そのような薬学的に許容される誘導体としては、デキストラン硫酸の塩および溶媒和物、例えばナトリウムまたはカリウム塩が挙げられる。

【0057】

実施形態のデキストラン硫酸、またはその薬学的に許容される誘導体は、好ましくは、被験体への注射により、特に静脈内（ｉ．ｖ．）注射、皮下（ｓ．ｃ．）注射または（ｉ．ｐ．）腹腔内注射、好ましくはｉ．ｖ．またはｓ．ｃ．注射により投与される。使用することができる他の非経口投与経路としては、筋肉内および関節内注射が挙げられる。デキストラン硫酸、またはその薬学的に許容される誘導体の注射は、その代わりに、または加えて、直接、例えば、虚血組織または臓器または被験体内の他の部位（そこでは、血管新生および増加した血流が起こるべきである）において起こる。

【0058】

実施形態のデキストラン硫酸、またはその薬学的に許容される誘導体は好ましくは、選択された溶媒または賦形剤と共に注射水溶液として製剤化される。溶媒は便宜的に水性溶媒、特に緩衝溶液である。そのような緩衝溶液の非限定的な例はクエン酸緩衝液、例えばクエン酸一水和物（ＣＡＭ）緩衝液、またはリン酸緩衝液である。例えば、実施形態のデキストラン硫酸は、生理食塩水、例えば０．９％ＮａＣｌ生理食塩水に溶解させることができ、その後任意で７５ｍＭ ＣＡＭで緩衝させ、水酸化ナトリウムを使用してｐＨを約５．９に調整することができる。また、注射水溶液、例えば生理食塩水、すなわちＮａＣｌ（ａｑ）を含む非緩衝液が可能である。さらに、緩衝溶液が所望される場合、ＣＡＭ以外の他の緩衝液系を使用することができる。

【0059】

実施形態は注射に限定されず、他の投与経路をその代わりに使用することができ、経口的、経鼻的、口腔、直腸、経皮的、気管、気管支、または局所が挙げられる。活性化合物、デキストラン硫酸はその後、特定の投与経路に基づき選択された好適な賦形剤または担体と共に製剤化される。

【0060】

実施形態のデキストラン硫酸のための好適な用量範囲は、被験体のサイズおよび体重、被験体が治療される状態、および他の懸案事項により変動し得る。特にヒト被験体では、可能な投与量範囲は１μｇ／ｋｇ〜１５０ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは１０μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ体重とすることができる。

【0061】

好ましい実施形態では、デキストラン硫酸、またはその薬学的に許容される誘導体は、０．０５〜５０ｍｇ／ｋｇ被験体体重、好ましくは０．０５または０．１〜４０ｍｇ／ｋｇ被験体体重、より好ましくは０．０５または０．１〜３０ｍｇ／ｋｇ、または０．１〜２５ｍｇ／ｋｇまたは０．１〜１５ｍｇ／ｋｇまたは０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ被験体体重の範囲の投与量で投与されるように製剤化される。

【0062】

実施形態のデキストラン硫酸、またはその薬学的に許容される誘導体の投与は、好ましくは、被験体において虚血、脳卒中または心血管疾患を引き起こす、または、デキストラン硫酸、またはその薬学的に許容される誘導体の投与により引き起こされる血管新生誘導により治療され得る、または少なくとも軽減され得る医学的状態を引き起こす損傷または他の状態後、できるだけ早くに開始される。

【0063】

デキストラン硫酸、またはその薬学的に許容される誘導体の投与は、必ずしも現在の医学的状態の治療に限定しなくてもよく、その代わりに、または加えて、予防のために使用することができる。言い換えれば、実施形態のデキストラン硫酸は、局所で虚血または他の医学的な効果（血管新生の誘導および／または血流の増加により治療され得る、阻害され得る、または軽減され得る）を引き起こし得る医療処置、例えば外科手術を受ける被験体に投与することができる。

【0064】

実施形態のデキストラン硫酸は、単回投与で、例えば単回ボーラス注射の形態で投与することができる。この急速投与量は、かなり迅速に患者に注射することができるが、便宜的に時間をかけて注入され、そのため、デキストラン硫酸溶液は、数分にわたり、例えば５〜１０分の間、患者に注入される。

【0065】

あるいは、実施形態のデキストラン硫酸は治療期間中、複数回、すなわち少なくとも２回で投与することができる。そのような治療期間の持続期間は、典型的には異なる型における創傷治癒の内因的期間および損傷の原因の型に関連する。好適な治療期間のより多くの情報については、Ｃｈａｐｔｅｒ １ Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ Ｗｏｕｎｄ Ｈｅａｌｉｎｇ ｉｎ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ Ｔｉｓｓｕｅ Ｔｙｐｅｓ， ｐａｇｅｓ ３−４０ ｏｆ Ｉｎｄｗｅｌｌｉｎｇ Ｎｅｕｒａｌ Ｉｍｐｌａｎｔｓ： Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｃｏｎｔｅｎｄｉｎｇ ｗｉｔｈ ｔｈｅ Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ， ｅｄ． Ｗｉｌｌｉａｍ Ｍ． Ｒｅｉｃｈｅｒｔ， ２００８ ｂｙ Ｔａｙｌｏｒ ＆ Ｆｒａｎｃｉｓ Ｇｒｏｕｐ， ＬＬＣ （ＩＳＢＮ： ９７８−０−８４９３−９３６２−４）を参照することができる。

【0066】

よって、実施形態のデキストラン硫酸は、例示的な例として、１日に１回または複数回、１週間に１回または複数回、１ヶ月に１回または複数回投与することができる。

【0067】

一般に、例えば、脳卒中、心筋梗塞（ＭＩ）、細胞および臓器移植における急性虚血を引き起こすものなどの急性疾患では、治療期間の持続期間は単回投与とすることができるが、好ましくは、例えば、１週間、数週間、または１ヶ月の治療期間中、数回投与の形態である。３ヶ月、さらには１年までのより長い治療期間は、さらに治癒および回復を改善することができる。

【0068】

間欠的な型の虚血状態では、予防（防止）としての治療または疾患の増悪のすぐ後の治療を使用する選択肢があり得る。この型の投与プロトコルは多発性硬化症（ＭＳ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）および鎌状赤血球症などの疾患に好適となり得る。治療期間は、増悪後の治療に対しては１〜３ヶ月までとすることができる。疾患の予防では、任意でより長い治療期間を使用することができる。

【0069】

被験体における実施形態のデキストラン硫酸、またはその薬学的に許容される誘導体の投与による血管新生の誘導は、好ましくはヒト被験体の体内で虚血を引き起こす疾患、障害または医学的状態を患うヒト被験体において起こる。

【0070】

虚血は組織への血液供給の制限であり、細胞代謝に必要とされる酸素およびグルコースの不足を引き起こす。虚血は一般に血管の問題により引き起こされ、結果として、組織または臓器へのダメージまたはその機能障害が起こる。それはまた、時として、うっ血、例えば血管収縮、血栓症または塞栓症に起因する身体のある部分での局所貧血および低酸素を意味する。

【0071】

虚血の有効な治療、または虚血を患うリスク防止する、または少なくとも低減させるのに有効なアプローチは、血管新生を誘導するものである。血管新生は関連組織において血流の増加を引き起こし、よって、疾患、障害または医学的状態により引き起こされた、組織への血液供給のいずれの制限にも対抗することができる。

【0072】

虚血を引き起こし得る疾患、障害または医学的状態の非限定的であるが例示的な例としては、下記が挙げられる：創傷治癒；末梢性虚血、例えば臓器、組織または細胞の移植後の虚血、末梢動脈疾患、四肢虚血、下肢静止不能、レイノー症候群、鎌状赤血球症、または閉塞性血栓血管炎；冠動脈虚血、例えばうっ血性心不全、心筋梗塞または冠動脈疾患により引き起こされるもの；子供における虚血性疾患、例えば周産期または新生児疾患、小児疾患、例えば新生児低酸素または虚血性脳損傷、仮死脳症、脳性麻痺；中枢神経系における虚血、例えば外傷性脳損傷、側頭動脈炎により引き起こされるもの、多発性硬化症により引き起こされる低酸素、脳卒中、筋萎縮性側索硬化症；または筋ジストロフィー症；血栓性、出血性または外傷性障害により引き起こされる虚血。

【0073】

創傷治癒は一般に、典型的には初期相、炎症相、増殖相ならびに成熟および再構築相で示される４つの相を含む。血管新生は増殖相中に起こるプロセスの１つである。デキストラン硫酸、またはその薬学的に許容される誘導体の投与は、創傷治癒のサブプロセスの１つとして起こる血管新生効果を促進する。血管新生のプロセスは、内皮細胞が創傷の領域に遊走した時に、創傷治癒中線維芽細胞増殖と同時に起こる。線維芽細胞および上皮細胞の活性には酸素および栄養分が必要とされるので、血管新生は、上皮および線維芽細胞遊走のような、創傷治癒における他の段階のために避けられない。

【0074】

末梢性虚血は、一般に心臓（冠動脈虚血）および中枢神経系（ＣＮＳ虚血）とは異なる組織および臓器において起こる虚血状態を示す。末梢性虚血の様々な原因が存在し得る。典型的な例は臓器または組織の被験体への移植である。移植された臓器または組織はその後、典型的には、移植の時点から新しい血管が移植された臓器または組織の周囲に形成されるまで起こる初期生着プロセス中に、虚血にさらされる。十分な血液供給が移植後間もなく確立されないと、虚血および低酸素が原因の、臓器または組織へのダメージまたはその機能障害の高いリスクが存在する。よって、移植と関連して、実施形態によるデキストラン硫酸、またはその薬学的に許容される誘導体による血管新生の誘導は、虚血および／または低酸素による、移植された臓器または組織へのダメージまたはその機能障害のリスクを著しく低減させる。実施形態による、デキストラン硫酸、またはその薬学的に許容される誘導体の投与は、実際の移植イベント前に、移植部位で血管新生を誘導し、血流増加を提供するために、移植前に起こり得る。そのような場合、実施形態のデキストラン硫酸により誘導される血流の増加は、移植された臓器または組織への虚血性ダメージを防止する、または少なくとも低減させるのに十分なものとなり得る。

【0075】

末梢血管疾患（ＰＶＤ）は、一般に、末梢動脈疾患（ＰＡＤ）または末梢動脈閉塞性疾患（ＰＡＯＤ）または末梢閉塞性動脈症と呼ばれ、冠動脈、大動脈弓脈管構造、または脳内にない大きな動脈の閉塞を示す。ＰＶＤは、アテローム性動脈硬化、狭窄に至る炎症プロセス、塞栓症、または血栓形成に起因し得る。これは、急性または慢性虚血のいずれかを引き起こす。ＰＶＤの効率的な治療は、実施形態による、デキストラン硫酸、またはその薬学的に許容される誘導体の投与により血流を回復させるものである。

【0076】

四肢虚血は、しばしば急性四肢虚血と呼ばれ、四肢への血流の突然の欠如が存在すると起こる。急性四肢虚血は典型的には、塞栓症または血栓症のいずれかに起因する。血栓症は通常末梢血管疾患（血管封鎖に至る動脈硬化性疾患）により引き起こされるが、塞栓症は空気、外傷、脂肪、羊水、または腫瘍に起因し得る。四肢虚血を患う被験体は、実施形態のデキストラン硫酸、またはその薬学的に許容される誘導体の投与から恩恵を受けるであろう。

【0077】

医学では、レイノー現象は低温または情動ストレスに応じて過度に低減された血流であり、手指、つま先、および時折他の領域の変色を引き起こす。レイノー現象はそれ自体、症状を伴う一徴候（低灌流）にすぎない。病原性と関連されると、それは、レイノー病（一次性レイノー現象としても知られている）の一部となり得、原因がわからない場合、レイノー症候群（二次性レイノー現象）の一部となり得、それは、公知の原因疾患、最も一般的には結合組織障害、例えば全身性エリテマトーデスにより引き起こされる症候群である。交感神経系の過剰活性化は、末梢血管の極度の血管収縮を引き起こし、組織低酸素に至らしめる。レイノー現象の慢性、再発症例は皮膚、皮下組織、および筋肉の萎縮を引き起こす可能性があり、おそらく、潰瘍形成および虚血性壊疽を引き起こす。実施形態のデキストラン硫酸、またはその薬学的に許容される誘導体の投与は、レイノー症候群または病の症状を患うリスクを低減させる、これを治療する、または少なくとも軽減させる効率的な手段となり得る。

【0078】

鎌状赤血球症（ＳＣＤ）、または鎌状赤血球貧血（ＳＣＡ）または鎌状血球症は、異常な、剛性の、鎌状形状の赤血球により特徴付けられる遺伝性血液障害である。鎌状化は赤血球の柔軟性を減少させ、身体の一部への血液の不十分な流れのリスクを引き起こす。実施形態のデキストラン硫酸、またはその薬学的に許容される誘導体を使用した血管新生の誘導を使用して、ＳＣＤを患う被験体において末梢性虚血を発症するリスクを低減させることができる。

【0079】

閉塞性血栓血管炎は、バージャー病または初老性壊疽としても知られており、手および足の小および中動脈および静脈の再発する進行性炎症および血栓症（凝血）である。閉塞性血栓血管炎はそのため、これらの四肢の血流の制限のために、手および足において虚血を引き起こし得る。実施形態のデキストラン硫酸、またはその薬学的に許容される誘導体の投与は手および足への血流を増加させるための効率的な手段となり得る。

【0080】

冠動脈虚血は冠動脈を通る十分な血液を有さないことに対する医学用語である。冠動脈虚血は心疾患ならびに心臓発作と関連する。心虚血としても知られている。冠動脈疾患（ＣＡＤ）は、脂肪分が冠動脈の壁に付着した時に起こり、これにより、動脈が狭くなり、血流が制限される。これにより、心臓への酸素および血液の欠如が引き起こされ、心筋梗塞（心臓発作）が起こり得る。ＣＡＤは動脈の狭窄を引き起こし、これは動脈を通って流れる血液ならびに酸素の欠如、アテローム性動脈硬化と呼ばれるプロセスにつながる。アテローム性動脈硬化は冠動脈虚血の最も一般的な原因である。実施形態のデキストラン硫酸、または薬学的に許容される誘導体の投与により引き起こされる血管新生の誘導により心筋における血流を増加させることは、冠動脈虚血のリスクを低減させるまたはこれにより引き起こされるダメージを低減させるのに重要なものとなり得る。また、血栓症は冠動脈虚血の原因となり得る。

【0081】

心筋梗塞（ＭＩ）または急性心筋梗塞（ＡＭＩ）は、一般に、心臓発作として知られており、心臓の一部への血流が止まり、心筋へのダメージを引き起こした時に起こる。ほとんどのＭＩは冠動脈疾患が原因で起こる。ＭＩのメカニズムはしばしば、動脈硬化プラークの破裂を伴い、冠動脈の完全封鎖に至らしめる。実施形態のデキストラン硫酸、またはその薬学的に許容される誘導体の投与は梗塞サイズを低減させる。したがって、ＭＩにより引き起こされる心筋への永久的ダメージは、実施形態により、著しく低減させることができる。

【0082】

ＣＮＳにおける虚血は様々な原因によるものであり得る。例えば、外傷性脳損傷は脳の一部への血流において封鎖または制限を引き起こし得る。血流におけるそのような制限は、低酸素が脳で起きた場合に重大な結果を有し得る。よって、実施形態のデキストラン硫酸、またはその薬学的に許容される誘導体の投与により引き起こされる血流の増加を使用して、外傷性脳損傷後の虚血により引き起こされる脳への永久的ダメージのリスクを低減させることができる。

【0083】

側頭動脈炎は、巨細胞性動脈炎（ＧＣＡ）、頭部動脈炎またはホートン病とも呼ばれ、最も一般的に頭の大および中動脈、主に外頸動脈の分枝が関与する血管の炎症疾患である。これは血管炎の形態である。実施形態のデキストラン硫酸、またはその薬学的に許容される誘導体の投与により引き起こされる血管新生の誘導および血流の増加は側頭動脈炎を患う被験体に有益なものとなり得る。

【0084】

脳卒中は、時として脳血管障害（ＣＶＡ）、脳血管発作（ＣＶＩ）または口語的に脳発作と呼ばれ、これは脳への血液供給における妨害による脳機能の損失である。この妨害は虚血または出血のいずれかが原因である。虚血は血栓症または動脈塞栓症による血管の封鎖、または全身低灌流により引き起こされる。出血性卒中は、脳実質中、または脳組織を取り囲むくも膜下腔中への直接的な脳の血管の放血により引き起こされる。脳卒中を患う被験体は、不十分な血液供給により引き起こされるダメージのリスクを低減させるために脳への血流を増加させる治療から恩恵を受けるであろう。結果として、実施形態のデキストラン硫酸、またはその薬学的に許容される誘導体の投与は脳卒中を患う被験体に行うのが好適である。

【0085】

様々な神経障害が、脳の一部などのＣＮＳへの血液供給において制限を引き起こし得る。例えば、Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ２０１３， １−６ （２０１３）は、初期多発性硬化症（ＭＳ）病変は、低酸素と関連することを開示する。よって、ＭＳを患う被験体は、ＭＳと関連する低酸素を治療する、または少なくとも低減または阻害するための増加した血流から恩恵を受けることができる。

【0086】

筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）は、運動ニューロン疾患（ＭＮＤ）およびルー・ゲーリック病とも呼ばれ、様々な原因を有する神経変性疾患である。それは筋萎縮および筋痙縮による急速な進行性脱力、話すこと（構音障害）、嚥下（嚥下障害）、および呼吸（呼吸困難）における困難により特徴付けられる。実験により、ＡＬＳは、例えば、運動前野前頭葉領域における血流の低減と関連することが示されている、Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａ Ｓｃａｎｄｉｎａｖｉａ １１６， ３４０−３４４ （２００７）。血管新生の誘導による血流の増加はＡＬＳを患う被験体にとって有益となり得ることが推測される。

【0087】

実施形態による血管新生の誘導はさらに、様々な医療装置、センサ、などの埋め込みと合わせて使用することができ、この場合、インプラントに向かう、またはこれと関連する微小循環を誘導することが有利となり得る。

【0088】

よって、実施形態のデキストラン硫酸は様々な虚血性疾患、障害および状態、ならびに様々な疾患、障害および状態における虚血要素を治療、阻害または防止するために使用することができる。

【0089】

本実施形態の著しい利点は、実施形態のデキストラン硫酸は被験体において選択的に血管新生を誘導する、すなわち、血管新生が必要とされる組織または臓器などの部位で血管新生を誘導することができることである。例えば、血管新生は、図４に例示されるように、虚血組織で誘導されて起こるが、非虚血組織は起こらず、図では、小毛細血管形成の存在が示され（ＣＤ−３４により示される）、機能する、活性な毛細血管（ＤＡにより示される）が虚血右肢で確認されたが、非虚血左肢では確認されない。

【0090】

実施形態の別の態様は、被験体において血管新生を誘導するための方法に関する。方法は、１００００Ｄａ未満の平均分子量を有する、デキストラン硫酸、またはその薬学的に許容される誘導体を被験体に投与することを含む。

【0091】

実施形態のさらなる態様は、被験体において血管新生を誘導するための薬の製造のための１００００Ｄａ未満の平均分子量を有する、デキストラン硫酸、またはその薬学的に許容される誘導体の使用に関する。

【0092】

実施形態のさらに別の態様は、虚血を患う被験体において血流を増加させるのに使用するための、１００００Ｄａ未満の平均分子量を有する、デキストラン硫酸、またはその薬学的に許容される誘導体に関する。

【0093】

実施形態の関連する態様は、虚血を患う被験体において血流を増加させるための方法を規定する。方法は、１００００Ｄａ未満の平均分子量を有する、デキストラン硫酸、またはその薬学的に許容される誘導体を被験体に投与することを含む。実施形態の別の関連する態様は、虚血を患う被験体において血流を増加させるための薬の製造のための、１００００Ｄａ未満の平均分子量を有する、デキストラン硫酸、またはその薬学的に許容される誘導体の使用を規定する。

【0094】

特定の実施形態では、デキストラン硫酸、またはその薬学的に許容される誘導体は被験体の虚血組織または臓器において血流を増加させることができる。

【0095】

組織または臓器は、前記で記載されるように、末梢臓器、心臓またはＣＮＳ組織、例えば脳とすることができる。

【0096】

実施形態のさらにもう一つの態様は、被験体において虚血組織を血管新生するための、１００００Ｄａ未満の平均分子量を有する、デキストラン硫酸、またはその薬学的に許容される誘導体に関する。

【0097】

実施形態の関連する態様は、被験体において虚血組織を血管新生するための方法を規定する。方法は、１００００Ｄａ未満の平均分子量を有する、デキストラン硫酸、またはその薬学的に許容される誘導体を被験体に投与することを含む。実施形態の別の関連する態様は、被験体において虚血組織を血管新生するための薬の製造のための、１００００Ｄａ未満の平均分子量を有する、デキストラン硫酸、またはその薬学的に許容される誘導体の使用を規定する。

【0098】

虚血組織は、前記で記載されるように、末梢臓器、心臓またはＣＮＳ組織、例えば脳とすることができる。

【0099】

実施形態のデキストラン硫酸により誘導される、または引き起こされる血管新生、すなわち小毛細血管の形成は、被験体における虚血組織では起こるが、被験体の非虚血、すなわち健康な組織では起こらないという観点から選択的である。よって、実施形態により誘導される血管新生は必要とされる部位（複数可）で起こり、健康な組織は影響されないままである（著しい血管新生はない）。

【0100】

被験体は好ましくは哺乳類被験体、より好ましくは霊長類、特にヒト被験体である。しかしながら、本実施形態は、獣医用途においても使用することができる。動物被験体の非限定的な例としては、霊長類、ネコ、イヌ、ブタ、ウマ、マウス、ラットが挙げられる。

【0101】

実施形態はまた、血管柄付組織および／または臓器において血管新生を誘導する、血管柄付組織および／または臓器において血流を増加させる、および／または血管柄付組織および／または臓器の血管新生のために、血管柄付組織および／または臓器のインビトロおよび／またはエクスビボ治療に適用することができる。

【0102】

そのような場合、デキストラン硫酸、またはその薬学的に許容される誘導体は、血管柄付組織および／または臓器に様々なインビトロまたはエクスビボ適用で添加することができる。例えば、デキストラン硫酸、またはその薬学的に許容される誘導体は、血管柄付組織および／または臓器がインビトロで浸漬され、または接触される培地に添加することができる。その代わりに、または加えて、血管柄付組織および／または臓器に、デキストラン硫酸、またはその薬学的に許容される誘導体を含む溶液を噴霧することができる。さらに、血管柄付組織および／または臓器は、体外循環ポンプまたは体外式膜型人工肺（ＥＣＭＯ）装置に接続され、その後、デキストラン硫酸、またはその薬学的に許容される誘導体は、血管柄付組織および／または臓器を通ってポンピングされる血液に添加することができる。

【0103】

実験
実施例１
重症後肢虚血マウスモデルにおける血管新生の評価
末梢動脈疾患（ＰＡＤ）は末梢血管疾患（ＰＶＤ）の一形態であり、この場合、四肢、通常下肢への血液供給の部分または完全封鎖があり、組織において血流障害および低酸素が引き起こされる。ＰＡＤが進行すると、皮膚潰瘍、壊疽および避けられない肢切断を伴う重症四肢虚血（ＣＬＩ）の段階に至る。治療的血管新生が、虚血組織において新血管新生を促進する非侵襲性手段として出現した。本研究において開示されるように、デキストラン硫酸の全身皮下投与は、微小血管の形成および内皮細胞の増殖を引き起こす血管新生を促進する。現在の研究では、安定な重症虚血モデル（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ３１， １２８−１３２ （２００６））が適用され、デキストラン硫酸の血管新生および機能的帰結に対する安全性および効力が評価された。

【0104】

材料
５〜７ｋＤａの範囲内の平均分子量を有するデキストラン硫酸を、ｐＫ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ａ／Ｓ、デンマークから入手した。図１〜４、６、７では、デキストラン硫酸は、ＴＭ−７００と示される。

【0105】

デキストラン硫酸の注射溶液を研究開始の前の日に調製した。ビヒクルとして、０．９％ＮａＣｌ（生理食塩水）（Ｔｅｖａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ Ｌｔｄ）を使用した。注射溶液を適切な体積のＮａＣｌを秤量した化合物に添加し、投与のための標的濃度を得ることにより調製した（１０もしくは３０ｍｇ／ｋｇ体重）。デキストラン硫酸をボルテックスする、または単純に管を数回、回転させることにより溶解させた。溶液を、凝集物を安定化させるために２〜８℃で夜通し貯蔵した。次の日、管をボルテックスし、溶液を、０．２μｍフィルタに通して濾過し、滅菌溶液を得た。溶液を第７日に調製し、第８〜２１日に使用し、第２の調製物を第２１日に調製し、第２２〜３５日に使用した。溶液を、使用日の間２〜８℃で貯蔵した。

【0106】

研究開始時（第０日）に２４．７ｇの平均体重を有する、合計６０匹の雄Ｂａｌｂ／ｃマウス、９週齢を、Ｈａｒｌａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、イスラエルから入手した。各群で記録された最低および最高体重は群平均値の±２０％の範囲内であった。動物の取扱は国立保健研究所（ＮＩＨ）および実験動物ケア評価認証協会（ＡＡＡＬＡＣ）に従った。動物を４２．５×２６５．６×１８．５ｃｍの大きさのポリスルホン（ｐｏｌｙｓｕｆｏｎｅ）（ＰＳＵ）ケージ（５／ケージ）において飼育し、ケージはガラス透明ポリカーボネート瓶に入ったペレット食物および飲料水のための設備を有するステンレス鋼上面グリルを備える；寝床：蒸気滅菌した清浄な籾殻（Ｈａｒｌａｎ， Ｓａｎｉ−ｃｈｉｐ， Ｃａｔ＃： １０６Ｓ８２１６）を使用し、寝床材料をケージと共に少なくとも週２回交換した。動物には自由に市販の齧歯類食事を与えた（Ｔｅｋｌａｄ Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ Ｇｌｏｂａｌ１８％ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｉｅｔ ｃａｔ ＃： １０６Ｓ８２１６）。動物は、地方自治体供給源から得られたオートクレーブ処理され、酸性化された飲料水（２．５〜３．５のｐＨ）を自由に利用することができた。動物を、空調管理され、フィルタ処理された標準研究室条件下で（ＨＥＰＡ Ｆ６／６）十分な新鮮空気の供給を用い（最低１５回の空気交換／時間）飼育した。動物を温度と湿度が調節された環境において維持した。温度範囲を２０〜２４℃とし、ＲＨ範囲を３０〜７０％とし、１２時間の明および１２時間の暗サイクルを用いた。

【0107】

外科的処置
外科手術の日に麻酔を、１．５〜３．０％イソフルラン、１．５％Ｎ_２Ｏおよび０．５％Ｏ_２により誘導した。麻酔下で、マウスを腹側を上にして置いた。鼠径部の皮膚を０．５〜１．０ｃｍ切開した。大腿動脈を腸骨動脈の遠位部分の直後近位で、深在性大腿動脈とのその分岐の後遠位で６−０絹糸を用いて結紮し、２つの結紮術間で切断し、切除した。創傷を４−０絹糸で閉じ、マウスを回復させた。

【0108】

デキストラン硫酸処置
第８日に、外科手術後第２週に、２Ｍおよび３Ｍ群内の各動物にデキストラン硫酸溶液をｓ．ｃ．で週３回注射した。４Ｍ群内の動物にｓ．ｃ．で週１回注射し、１Ｍ群はビヒクル処置を受けた（ＮａＣｌ）。表１を参照されたい。

【表1】

【0109】

体重測定
体重を外科手術前の研究第−１日に、およびその後、週１回測定した。第０日と第７日の間で、全ての動物群１Ｍ、２Ｍ、３Ｍおよび４Ｍにおいて、１．１ｇ〜１．６ｇの範囲の平均体重のわずかな低減が観察された。図１を参照されたい。第１４日以降、体重の漸次増加が観察された。したがって、第０日〜第３５日で、体重の平均増加は０．４ｇ〜１．７ｇの範囲であった。表２を参照されたい。

【表2】

【0110】

血流測定
両側からの下肢における血流を、非接触レーザードップラーと用いて、外科手術前の第−１日におよび手術後第１、７、１４、２１、２８および３５日に測定した。血流測定値を、虚血肢における流れの正常肢における流れに対する比として表した。

【0111】

全ての動物群１Ｍ、２Ｍ、３Ｍおよび４Ｍは、第１日〜第３５日に手術された四肢において平均血流の増加を示した。図２を参照されたい。平均血流は、外科手術後ベースラインから、ビヒクル対照群１Ｍでは１９．５単位の増加に比べ、デキストラン硫酸処置群２Ｍ（１０ｍｇ／ｋｇ ３回／週）において４６．７単位だけ；デキストラン硫酸処置群３Ｍ（３０ｍｇ／ｋｇ ３回／週）において５９．３単位だけ、デキストラン硫酸処置群４Ｍ（３０ｍｇ／ｋｇ １回／週）において５１．１単位だけ増加した。これは、デキストラン硫酸処置による、それぞれ、平均血流の２．２、３．０および２．８倍の増加を表す。表３および図２を参照されたい。

【表3】

【0112】

図８は対照マウス（１Ｍ群）および３Ｍ群によるデキストラン硫酸で処置したマウスにおいて測定した血流を比較する。図は、左後肢の大腿動脈結紮後３５日の、非接触レーザードップラー画像を示す。

【0113】

虚血重症度の肉眼的評価
虚血肢の肉眼的評価を、第７日に、およびその後週１回、壊死性領域に対する形態学的グレードを用いることにより実施した。表４を参照されたい。

【表4】

【0114】

虚血肢を肉眼的に毎週、第７日から第３５日まで、壊死性領域に対する段階的形態学的スケールを使用することにより評価した。表４を参照されたい。ビヒクルおよびデキストラン硫酸で処置した全ての動物群において、つま先壊死または足切断が見られた（１〜２のグレード、表６を参照されたい）。各処置群における足切断のパーセント率を表５および表６に示す。足切断はビヒクル処置対照群１Ｍ（１５．４％）およびデキストラン硫酸処置群４Ｍ（３０ｍｇ／ｋｇ １回／週）（７．１％）において見られた。ビヒクル処置対照群１Ｍにおけるつま先壊死率は２３．１％動物であることが見出された。デキストラン硫酸により処置された動物群２Ｍおよび３Ｍでは、ＨＬＩ誘導後３５日で、つま先壊死率はそれぞれ２１．４％および１４．３％であった。デキストラン硫酸により処置した動物群４Ｍでは、つま先壊死の発生率はなかった（表６）。

【表5】

【表6】

【0115】

四肢機能および虚血性ダメージのインビボ評価
虚血肢の障害された使用の半定量的評価を外科手術後週１回、下記スケールを使用して実施した。表７を参照されたい。

【表7】

【0116】

四肢機能を、一部または完全四肢切断の場合、「不適用」として段階分けした。そのような場合、血流測定値は、統計解析に含めなかった。

【0117】

血流測定と並行して、ビヒクル対照群１Ｍと比較して、全てのデキストラン硫酸処置群２Ｍ、３Ｍおよび４Ｍは四肢機能改善においてより良好な結果を示した。下記表８および表９ならびに図６を参照されたい。

【表8】

【表9】

【0118】

免疫組織化学および毛細血管密度の分析
マウスを第３６日の研究終了時に屠殺した。フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）−デキストラン５０００００Ｄａコンジュゲート１０ｍｇ／ｍｌをｉ．ｖ．で２００μｌ／マウスの用量にて屠殺前５分に、全ての動物に注射した。四頭筋を冠動脈部分まで解剖した。筋肉を２．５％新鮮パラホルムアルデヒド（ｐＨ７．４）中で２４時間固定し、その後、パラフィン中に、平滑筋アクチン（ＳＭＡ）に対しマウスモノクローナル抗体（抗ＳＭＡ Ａｂ−１、クローン１Ａ４、１：８００、Ｔｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、およびＣＤ３４に対し抗ＣＤ３４（１：２００、Ｃｅｄｒａｌｅｎｅ）免疫染色を用いて包埋した。パラフィン包埋を標準包埋手順に従い実施した。

【0119】

染色した切片を、ＣＣＤカメラ（ＤＭＸ１２００Ｆ；Ｎｉｋｏｎ）に接続されたｐｌａｎ ｆｌｕｏｒ対物レンズを備えた蛍光顕微鏡（Ｅ６００；Ｎｉｋｏｎ、東京、日本）により評価し、撮影した。これらの条件下では、Ｃｙ３は鮮赤色蛍光を示し：Ｅｘ（ｍａｘ）：５４３ｎｍ；Ｅｍ（ｍａｘ）５７０ｎｍ、一方フルオレセインデキストランは強い緑色蛍光を示す（Ｅｘ（ｍａｘ）：４８８ｎｍ；Ｅｍ（ｍａｘ）：５３０ｎｍ）。デジタル画像を集めて、Ｉｍａｇｅ Ｐｒｏ＋ソフトウェアを用いて解析した。４つの切片の筋肉試料を群１Ｍ、３Ｍおよび４Ｍ由来の８匹の動物の同じ領域から取得した。血管の面積を測定した。密度は一視野あたりの毛細血管の平均数として表した。総血管は測定した領域内の全ての血管を表す。

【0120】

ＣＤ３４陽性毛細血管の数は、研究の第３５日に、対照群１Ｍに比べ、デキストラン硫酸処置群３Ｍおよび４Ｍでは大きかった。図３、４および５Ａ〜５Ｃを参照されたい。ＣＤ３４陽性染色は小毛細血管形成に対する指標として考えられ、よって、得られた結果はデキストラン硫酸で処置した動物群において観察される血流改善を支持する。デキストラン染色により、これらの毛細血管は、機能しており、活性であることが確認された。ＳＭＡ染色はＣＤ３４染色と同じ毛細血管形成の増加を明らかにした。図７を参照されたい。

【0121】

図４は明らかに、実施形態のデキストラン硫酸のみが、虚血組織、すなわち右肢において血管新生を誘導し、非虚血組織、すなわち左肢では誘導しないことを示す。よって、実施形態のデキストラン硫酸は必要とされるところでのみ血管新生の選択的誘導を引き起こす。

【0122】

血管新生障害は虚血性疾患の特徴の１つである。治療的血管新生のためのほとんどの確立された標的はＶＥＧＦおよびその受容体であった。しかしながら、虚血を軽減させるための臨床試験は期待外れであり、虚血性疾患を治療するための新しい治療標的の必要性が示された。

【0123】

この研究では、デキストラン硫酸の効力を評価するために、マウス後肢虚血モデルにおける血流改善を検査した。３０ｍｇ／ｋｇの用量のｓ．ｃ．での反復（週３回）または（週１回）デキストラン硫酸投与は、ビヒクル処置対照に比べ、血液灌流を著しく回復させた。第３５日に、対照群に比べ、２．５から最大３倍まで高い血流灌流値が、デキストラン硫酸処置群において観察され、統計的に有意な効果は処置後１４日から開始した。

【0124】

研究の集約的なデータにより、Ｂａｌｂ／ｃマウス動物モデルにおいて閉塞性末梢動脈疾患の治療のためにｓ．ｃ．で与えられたデキストラン硫酸の治療的効力が確認された。自発的肢切断またはつま先壊死率もまた、対照群に比べ、デキストラン硫酸処置動物において減少した。デキストラン硫酸処置は薬物処置動物群全てにおいて、ビヒクル処置対照に比べ、四肢機能回復を改善した。デキストラン硫酸処置は、処置動物において有害作用を引き起こさなかった。

【0125】

免疫組織化学所見により、インビボ結果が確認された。集約的に、この研究のデータはマウスモデルにおける閉塞性末梢動脈疾患の治療のためのデキストラン硫酸の治療的効力を確認した。

【0126】

後肢虚血を有するマウスにおけるデキストラン硫酸処置により、レーザードップラーにより測定され、四肢虚血重症度の減少およびより迅速な四肢機能改善によっても証明される、血流の著しく、迅速な回復が得られた。

【0127】

全体的な健康に対する有害作用は、群のいずれにおいても記録されなかった。これらのデータは、免疫組織化学評価により確認された。所見は血管形態の変化、すなわち毛細血管密度増加、および血管新生を反映する。

【0128】

実施例２
ラット脳卒中モデルにおける血管新生効率の評価
脳卒中ｔＭＣＡＯラット−モデルを使用して、デキストラン硫酸処置の効力を評価した。ラットを、外科的処置後２時間に開始して２８日日間皮下注射により、３０ｍｇ／ｋｇ週３回または１５ｍｇ／ｋｇの１日用量のいずれかでデキストラン硫酸で処置した。研究中、神経、運動および体性感覚機能を、一連の行動試験においてモニターした。

【0129】

デキストラン硫酸で処置した群とビヒクル処置対照群との間で明確な差が証明された。Ｎｅｕｒｏｓｃｏｒｅ、ステッピングテストおよび身体スイングテストにより評価される運動機能の改善が両方の薬物処置群において証明された。感覚運動機能もまた、デキストラン硫酸処置後に回復した。デキストラン硫酸処置の効果はそれらの血管新生活性に起因する可能性がある。この結果は、影響を受けた半球における脳血液灌流および平滑筋アクチン（ＳＭＡ）陽性毛細血管密度の増加により支持された。デキストラン硫酸処置はまた、ビヒクル処置対照に比べ、炎症反応を低減させた。

【0130】

これらの所見を考慮すると、デキストラン硫酸処置はラット脳卒中モデルにおいて、運動および体性感覚欠損ならびに脳血液灌流および血管新生活性を明確に改善したと結論付けられ得る。

【0131】

脳卒中は、米国では、重篤な、長期身体障害の顕著な原因であり、第３の死亡の主因である。脳卒中による身体障害に対する総健康コストは毎年５３６億と推定される。虚血性脳卒中は全脳卒中の８８％超を占め、そのため、最も一般的な型の脳血管損傷となっている。脳における虚血状態は神経細胞死を引き起こし、永久的感覚運動欠損に至らしめる。今や、脳卒中患者に対する緊急治療は、しばしば、臨床設定では不可能であることが明らかである。医師は脳卒中治療に対する新しい治療戦略を緊急に必要とする。

【0132】

いくつかの動物モデルが、その病態生理を理解し、虚血性ダメージの重症度を最小に抑えるための治療戦略を同定するために、脳虚血を研究するために使用されている。局所虚血は限局性脳梗塞を引き起こし、これは、ラットにおいて中大脳動脈閉塞（ＭＣＡＯ）により誘導される。これは、ヒトにおける半球梗塞に対するモデルとしてますます承認を得ている。ＭＣＡＯ後、一時的、および空間的進行を有する皮質および線条体梗塞が、中大脳動脈により供給される血管領域内で起こる。

【0133】

この１０年で、脳卒中動物試験における行動評価に対する証拠が相次いで集められている。機能改善は、治療的効力に対する尺度として非常に信頼できることが見出された。脳卒中における血管合併症に対する最も有望な革新的治療の１つは治療的血管新生であり、これは虚血組織において新血管新生を促進するための非侵襲性手段として現れた。

【0134】

この研究では、デキストラン硫酸の神経保護およびリハビリテーションの可能性を一過性ＭＣＡＯラット脳卒中モデルにおいて研究した。

【0135】

材料
５〜７ｋＤａの範囲内の平均分子量を有するデキストラン硫酸を、ｐＫ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ａ／Ｓ、デンマークから入手した。図９〜１６では、デキストラン硫酸は、ＴＭ−７００と示される。

【0136】

デキストラン硫酸を、０．９％ＮａＣｌ（生理食塩水）（Ｔｅｖａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ Ｌｔｄ）に、週３回注射のために６０ｍｇ／ｍｌおよび毎日注射のために３０ｍｇ／ｍｌの濃度まで溶解した。製剤は１週間の間安定である。動物は３０および１５ｍｇ／ｋｇ体重に等しい０．５ｍｌ／ｋｇを受けた。

【0137】

研究開始時（第０日）に３４２ｇの平均体重を有する合計４６匹の雄ＳＤラットを、Ｈａｒｌａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、イスラエルから入手した。各群で記録された最低および最高体重は群平均体重の±２０％の範囲内であった。動物の取扱は、国立保健研究所（ＮＩＨ）および実験動物ケア評価認証協会（ＡＡＡＬＡＣ）のガイドラインに従った。動物を３５×３０×１５ｃｍの大きさのポリエチレンケージ（５／ケージ）において飼育し、ケージは、プラスチック瓶内のペレット食物および飲料水を促進するステンレス鋼上面グリルを備える；寝床：蒸気滅菌した清浄な籾殻（Ｈａｒｌａｎ， Ｓａｎｉ−ｃｈｉｐ， Ｃａｔ＃：２０１８ＳＣ＋Ｆ）を使用し、寝床材料をケージと共に少なくとも週２回交換した。動物には自由に市販の齧歯類食事を与えた（Ｔｅｋｌａｄ Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ Ｇｌｏｂａｌ１８％ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｉｅｔ ｃａｔ ＃：１０６Ｓ８２１６）。動物は、地方自治体供給源から得られた、オートクレーブ処理され、酸性化された飲料水（２．５〜３．５のｐＨ）を自由に利用することができた。動物を、空調管理され、フィルタ処理された標準研究室条件下で（ＨＥＰＡ Ｆ６／６）十分な新鮮空気の供給を用い（最低１５回の空気交換／時間）飼育した。動物を温度と湿度が調節された環境において維持した。温度範囲を２０〜２４℃とし、ＲＨ範囲を３０〜７０％とし、１２時間の明および１２時間の暗サイクルを用いた。

【0138】

外科的処置
外科手術の日に、麻酔を、４％イソフルランを含む、７０％Ｎ_２Ｏおよび３０％Ｏ_２の混合物により誘導し、１．５〜２％イソフルランにより維持した。

【0139】

一過性中大脳動脈閉塞を、Ｓｔｒｏｋｅ ２９， ２１６２−２１７０ （１９９８）において前に記載される方法に従い実施した。右総頸動脈（ＣＣＡ）を正中線頸部切開により露出させ、注意深く周囲の神経および筋膜から−その分岐から頭蓋底まで切断した。外頸動脈（ＥＣＡ）の後頭動脈分枝をその後隔離し、これらの分枝を切断し、凝固した。ＥＣＡをさらに遠位で切断し、末端舌および顎動脈分枝と共に凝固させ、これをその後分割した。内頸動脈（ＩＣＡ）を隔離し、隣接する迷走神から注意深く分離し、翼口蓋動脈を、５−０ナイロン縫合糸（ＳＭＩ、ベルギー）を用いてその開始点近くで結紮した。次に、４−０絹縫合糸を、動態化させたＥＣＡ断端の周りに緩く縛り、４ｃｍ長さの４−０モノフィラメントナイロン縫合糸（挿入前に、縫合糸の先端を炎を用いることにより丸くし、縫合糸をポリリジンでコートした）を近位ＥＣＡからＩＣＡ中に、そこからウィリス動脈輪中に挿入し、効果的にＭＣＡを閉塞させた。手術創を閉じ、動物をそれらのケージに戻し、麻酔から回復させた。閉塞後２時間で、ラットを再び麻酔し、モノフィラメントを取り除き、再灌流させ、手術創を閉じ、ラットをそれらのケージに戻した。

【0140】

閉塞後１時間で、動物を、「除外基準のためのＮｅｕｒｏｓｃｏｒｅ」を使用する神経評価に供した。≧１０の総合スコアを有する動物のみを研究に含めた。

【0141】

デキストラン硫酸処置
閉塞（再灌流の直後）後２時間に開始して、２Ｍおよび３Ｍ群における動物（３０ｍｇ／ｋｇ週３回または１５ｍｇ／ｋｇ毎日の用量でのデキストラン硫酸）および１Ｍ群における動物（ビヒクル対照）に皮下注射した。表１０を参照されたい。

【表10】

【0142】

データ分析
別途規定されない限り、全ての統計分析を、反復測定のための二元配置ＡＮＯＶＡ、続いてボンフェローニ事後比較検定を使用して実施した。

【0143】

体重
研究を通して、様々な処置群間で体重の統計的に有意な差は観察されなかった。図９を参照されたい。

【0144】

神経学的試験スコア（Ｎｅｕｒｏｓｃｏｒｅ）
評価：手術前、閉塞後１時間、ならびに第７、１４、２１および２８日
修正神経学的評価尺度（ｍＮＲＳ）を実施した。行動評価を受けた個体は与えた薬物／用量を知らなかった（盲検試験）。総スコア１８のＮｅｕｒｏｓｃｏｒｅを、Ｓｔｒｏｋｅ３２，１００５−１０１１（２００１）に従い実施した。

【0145】

Ｎｅｕｒｏｓｃｏｒｅは、試験される処置の効果を評価するために使用された、１組の臨床−神経学的試験（運動、感覚性、反射および平衡試験を合わせたもの）を含んだ。Ｎｅｕｒｏｓｃｏｒｅを、０〜１８のスケールで段階分けした（この場合、正常スコアは０であり、最大欠損スコアは、１８により表される）。予想通りに、ラットの全ての群において、ｔＭＣＡＯ誘導後２時間に神経機能の急激な低下が観察され、その後、時間と共に、自然に回復した。統計的に有意な差が３０ｍｇ／ｋｇデキストラン硫酸で週３回処置された２Ｍ群および１５ｍｇ／ｋｇデキストラン硫酸で毎日処置された３Ｍ群において、ビヒクル処置対照と比べて、第７日の最初の試験から研究を通して第２８日まで示された。図１０を参照されたい。２つの投与スケジュール２Ｍと３Ｍ間で、統計的な差は見られなかった。

【0146】

ステッピングテスト
評価：手術前ならびに第７、１４、２１および２８日
動物を、前肢無動に対してステッピングテストを使用して試験した。動物をその後肢で持ち、１つの前肢を一つの手で固定し、無拘束の前肢をテーブルに沿って引いた。両方の前肢に対しフォアハンドおよびバックハンドの方向で動物を横向きにテーブル表面に沿って移動させながら（およそ５秒で８５ｃｍ）、調整したステップの数をカウントした。

【0147】

動物を、動物の運動機能に対する指標として、神経筋機能の測定のために一般的に使用されるステッピングテストにおいて、前肢無動に対して試験した。運動機能のいくらかの改善が時間をかけて、大部分は自然機能回復の結果として、ｔＭＣＡＯに供した全ての動物において観察された。しかしながら、デキストラン硫酸で処置したラットの機能改善は、ビヒクル処置対照に比べより顕著であった。動物の両方の処置群、２Ｍおよび３Ｍ群では、この改善は、対照に比べ、統計学的有意性に到達し、これは第７日の最初の試験で始まり、第２８日の研究終了まで改善し続けた。図１１を参照されたい。２つの投与スケジュール２Ｍと３Ｍ間で、統計的な差は見られなかった。

【0148】

前肢置き直し
評価：手術前ならびに第７、１４、２１および２８日
前肢置き直し試験では、試験者はラットをテーブル表面近くで持ち、ラットの、頬髭、視覚、触覚、または固有受容性刺激に応じて前肢をテーブル表面で置き直す能力をスコア化する。別のサブスコアを各感覚入力モードに対して得て、加算し、総スコアを与えた（０＝正常、１２＝最大障害）。
前肢置き直し試験（０〜１２）：
頬髭置き直し（０〜２）；
視覚性置き直し（前方（０〜２）、横向き（０〜２））
触覚性置き直し（背側（０〜２）、外側（０〜２））
固有受容性置き直し（０〜２）。
各サブテストに対し、動物を、下記の通りスコア化した：
０．０＝即応
０．５＝２秒以内の応答
１．０＝２〜３秒の応答
１．５＝＞３の応答秒
２．０＝応答なし

【0149】

前肢置き直し試験を使用して、体性感覚および感覚運動欠損を評価した。他の試験と同様に、感覚運動欠損のいくらかの自然回復が、ｔＭＣＡＯに供した全ての動物において、時間と共に観察された。しかしながら、デキストラン硫酸で処置した全てのラットは、ビヒクル対照処置に比べ、統計的に有意な改善を示し、これは第１４日に始まり、第２８日の研究終了まで続いた。図１２を参照されたい。３Ｍ群では、感覚運動欠損の改善は、統計学的有意性に、すでに第７日の最初の試験で到達した。

【0150】

身体スイングテスト
評価：手術前ならびに第７、１４、２１および２８日
ラットをその尾の付け根からおよそ１インチで持った。これをその後、テーブルの表面より１インチ上まで上昇させた。ラットを、左または右側のいずれかに対して１０°以下として規定される垂直軸内で持った。スイングを、ラットがその頭を垂直軸からはずれてどちらかの側に動すたびに、記録した。別のスイングをしようとする前に、次のスイングをカウントするために、ラットを垂直位に戻した。２０回の総スイングをカウントした。正常ラットは典型的には両側に等しい数のスイングを有する。局所虚血後、ラットは、反対側にスイングする傾向がある（この場合左側）。身体スイングスコアを、総スイングに対する右方向のパーセンテージとして表した。脳卒中後、最初の１ヶ月中、身体スイングスコアの自然部分回復が存在した（５０％に向かって）。

【0151】

動物を、神経筋機能の測定のために一般的に使用される身体スイングテストにおいて、前肢無動について試験した。運動機能のいくらかの自然回復が、ｔＭＣＡＯに供した全ての動物において、時間と共に観察された。しかしながら、デキストラン硫酸で処置した全てのラットはビヒクル対照処置に比べ、統計的に有意な改善を示し、これは第７日の最初の試験で始まり、第２８日の研究終了まで続いた。図１３を参照されたい。２つの投与群２Ｍと３Ｍの間で統計的な差は見られなかった。

【0152】

脳血流評価
評価：第２９日
大脳皮質および血管狭窄に対する血流の評価をＦｌｏｗ−Ｒレーザードップラーシステムを用いて実施した。この場合、頭蓋内血流および血管直径（狭窄／拡張）をモニターした。これは、脳卒中開始後第２９日に実施した。動物がイソフルラン麻酔下にある間に、ドップラー手順を実施した。

【0153】

動物はまた、第２９日にダメージを受けた半球での脳血流回復について検査した。脳血液灌流速度の統計的に有意な改善が、対照ビヒクル処置群１Ｍと対比して、ｔＭＣＡＯに供し、デキストラン硫酸で処置した全ての動物において（２Ｍおよび３Ｍ群）観察された。血管直径比もまた、対照と対比して、デキストラン硫酸処置動物で増加した。図１４および１５を参照されたい。

【0154】

試料採取および屠殺
ＭＣＡＯ後第３０日に、ラットを、ケタミン／キシラジンにより麻酔し、緩衝パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）４％により経心的に灌流させた。免疫染色および組織学的評価のために、脳を採取し、４％緩衝ＰＦＡ中で固定した。

【0155】

脳試料の２つの切片を、１Ｍおよび３Ｍ群由来の６匹の動物の同じ領域から入手した。毛細血管を顕微鏡下で、各切片由来の合計３つのランダム視野でカウントした。密度を、毛細血管の平均数／視野として表した。デキストラン硫酸１５ｍｇ／ｋｇによる毎日の処置により、脳卒中後３０日に、ビヒクル処置対照群と比べて毛細血管の数が増加した。

【0156】

血管新生効果の結果として、ビヒクル処置対照群と比べて、ｔＭＣＡＯに供し、デキストラン硫酸１５ｍｇ／ｋｇで毎日処置した動物において、３０μｍ未満の直径を有するＳＭＡ毛細血管の数の改善が観察された。図１６を参照されたい。

【0157】

図１７Ａおよび１７Ｂは、ビヒクル対照群（図１７Ａ）およびデキストラン硫酸（１５ｍｇ／ｋｇ、毎日）群（図１７Ｂ）からのラットに対する、毛細血管密度に対する治療効果を示す。

【0158】

死亡率および臨床徴候
１８匹のラットが研究中に死亡した。１匹のラットが再灌流直後、投与前に死亡し、１７匹のラットが投与後１０時間以内に死亡した（１Ｍ群で６匹、２Ｍ群で６匹および３Ｍ群で５匹）。モデルに無関係の有害臨床徴候は、全ての動物群において、観察されなかった。

【0159】

脳卒中ｔＭＣＡＯラットモデルは、薬物治療の神経保護およびリハビリテーション効力を評価するための、伝統的に受け入れられているモデルである。このモデルを、この研究では、デキストラン硫酸処置の２つの投与スケジュールでの効力を評価するために使用した。ラットを２８日間、皮下注射により、外科的処置後２時間に開始し、３０ｍｇ／ｋｇ週３回または１５ｍｇ／ｋｇの１日用量のいずれかでデキストラン硫酸で処置した。研究中、神経、運動および体性感覚機能を、一連の行動試験においてモニターした。

【0160】

予想通りに、脳卒中誘導後２８日の追跡中、神経機能のいくらかの自然回復が観察された。しかしながら、デキストラン硫酸で処置した群とビヒクル処置対照群との間で明確な差が証明された。しかしながら、２つの投与スケジュール間で統計的に有意な差は指摘されなかった。Ｎｅｕｒｏｓｃｏｒｅ、ステッピングテストおよおび身体スイングテストにより評価される運動機能の改善が両方の薬物処置群において証明された（図１０、１１および１３）。感覚運動機能もまた、デキストラン硫酸処置後に回復した（図１２）。有益な効果が観察され、これは処置の第７日の最初の試験で始まり、第２８日の研究終了まで改善し続けた。観察された効果はラットの全体的健康の差に起因するとすることができない。というのも、全ての群は、同じ速度で、体重が増加し、それらの間に有意の差はないからである（図９）。加えて、一般的な臨床徴候における差も観察されなかった。デキストラン硫酸処置の効果は、それらの血管新生活性に起因する可能性がある。この結果は、影響を受けた半球における脳血液灌流およびＳＭＡ陽性毛細血管密度の増加により支持された。デキストラン硫酸処置はまた、ビヒクル処置対照に比べ、炎症反応を低減させた。

【0161】

これらの所見を考慮すると、デキストラン硫酸処置は明らかに、ラット脳卒中モデルにおける運動および体性感覚欠損ならびに脳血液灌流および血管新生活性を改善したと結論付けられ得る

【0162】

よって、実施形態のデキストラン硫酸は、ＣＬＩ（実施例１）および脳卒中（実施例２）モデルにおいて、血管新生を選択的に誘導することが示された。実験結果により、遅延処置（結紮後第１５日に開始）であっても有効であることが示される。３〜３０ｍｇ／ｋｇ（ｓ．ｃ．）の区間内の用量が有効であり、単回投与、週１回および週３回の投与プロトコルは全て有効である。組織学は新たに形成された機能血管形成を実証する。よって、実施形態のデキストラン硫酸は虚血領域において選択的効果を提供する。

【0163】

実施例３
心筋梗塞モデルにおけるデキストラン硫酸の評価
本研究は、心筋梗塞のラットモデルにおいてデキストラン硫酸処置の血管新生効力を評価した。

【0164】

心臓は制限された再生能を有し、そのため、急性心筋梗塞（ＭＩ）となった筋肉は典型的には、血管新生が制限されている非収縮性瘢痕組織に置き換えられる。血管新生および組織灌流の増加を促進することは、ＭＩ後の心臓修復に対する有望な戦略となる。

【0165】

材料および方法
ラットにおける心筋梗塞モデルは、壁内縫合糸による左冠動脈の永久的結紮を伴った。外科手術は血流の閉塞を引き起こし、その後に、重篤な虚血性ダメージおよび心臓壁梗塞に至った。

【0166】

研究開始時（第０日）に１７８ｇの平均体重を有する合計１５０匹の雌ＳＤラットを、Ｈａｒｌａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、イスラエルから入手した。動物には自由に市販の齧歯類食事を与えた（Ｔｅｋｌａｄ Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ Ｇｌｏｂａｌ １８％ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｉｅｔ）。動物は、地方自治体供給源から得られた酸性化飲料水（２．５〜３．５のｐＨ）を自由に利用することができた。動物を標準研究室条件下で飼育した。温度範囲を２０〜２４℃とし、ＲＨ範囲を３０〜７０％とし、１２時間の明および１２時間の暗サイクルを用いた。

【0167】

５〜７ｋＤａの範囲内の平均分子量を有するデキストラン硫酸を、ｐＫ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ａ／Ｓ、デンマークから入手した。デキストラン硫酸を、１５ｍｇ／ｋｇまたは３ｍｇ／ｋｇの用量で皮下注射するために、０．９％ＮａＣｌ（生理食塩水）（Ｔｅｖａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ Ｌｔｄ）に溶解した。

【0168】

外科手術の日に、動物を９０ｍｇ／ｋｇケタミンおよび１０ｍｇ／ｋｇキシラジンの組み合わせで麻酔した。ＭＩを誘導するために、麻酔および鎮痛下で、ラット胸部を左開により開き、心膜を除去し、近位左冠動脈を、壁内縫合糸で永久的に閉塞させた（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １１７， １３８８−１３９６ （２００８））。外科手術後２時間に、全ての処置群の各動物に、表１１に従い、デキストラン硫酸または生理食塩水ビヒクルを、ｓ．ｃ．注射した。

【表11】

【0169】

ＭＩ誘導後第３６日に、ラットをＣＯ_２吸入により屠殺し、心臓を回収し、４％緩衝ホルマリン溶液で固定した。ルーチンパラフィン包埋を、標準組織学的手順を使用して実施した。

【0170】

ＭＩサイズ同定のために、マッソントリクローム染色を使用した。処置（２Ｍ）群の９つの心臓および未処置（１Ｍ）群の８つを横方向に切開し、パラフィンに包埋させた５つの切片とした。５μｍの５つのパラフィン切片はＬｉｋａミクロトーム上で実施した。全ての切片を標準マッソントリクロームプロトコルに従い染色した。切片をコンピュータ−画像システムにおいて視覚化し、梗塞サイズをＩｍａｇｅＪプログラムを使用して指し示し、計算した。梗塞サイズを総左心室領域に対する梗塞領域（未染色）のパーセンテージとして表した。各動物に対し、結紮術を含むものを含む５つの連続する切片を分析し、各心臓に対する全ての切片の平均値を計算した。免疫組織化学マーカー（平滑筋アクチン−ＳＭＡ）を血管密度カウントを評価するために使用した。

【0171】

影響を受けた心筋領域の梗塞病変の縁で、１ｍｍ角について、血管密度カウントを実施した。Ｏｌｙｍｐｕｓ ＢＸ４３顕微鏡を使用し、×４０対物レンズ倍率を用いて写真を撮った。ＳＭＡ陽性血管の血管密度カウントを、Ｍｅｄｉａ Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓによる画像解析ソフトウェア−Ｉｍａｇｅ Ｐｒｏ Ｐｌｕｓ ５．１を使用して実施した。

【0172】

結果
図１８は、ＭＩ誘導後３５日の梗塞サイズを示す。全ての処置群は、未処置対照群と比べて、より小さな平均梗塞サイズを有した。処置群２Ｍと対照群１Ｍの間に有意差が存在した。

【0173】

図１９は、処置群２Ｍおよび対照群１Ｍに対して、ＭＩ誘導後３５日でのＳＭＡ染色を比較する。デキストラン硫酸処置により、ビヒクル対照と比べて、より高いＳＭＡ毛細血管密度が得られた。

【0174】

図２０Ａ〜２０Ｃは、２Ｍ処置群における２匹のラット（図２０Ａおよび２０Ｂ）および１Ｍ対照群における１匹のラット（図２０Ｃ）について血管密度のためのＳＭＡ染色の写真を示す。デキストラン硫酸処置により、ビヒクル対照と比べて、より高いＳＭＡ血管密度が得られた。

【0175】

デキストラン硫酸は、対照ビヒクル処置群と比べて、ラットにおける心筋梗塞後の処置群２Ｍにおける梗塞体積を著しく減少させた。同じデキストラン硫酸処置群は、対照ビヒクル処置群に比べ、心臓の梗塞領域における毛細血管密度の増加傾向を明らかにした。よって、デキストラン硫酸は心筋梗塞後の梗塞領域での、心筋および血管修復を促進し、血管新生を増強する。これにより、長期左心室の再構築が改善され得、左心室機能の回復が増強され得る。

【0176】

実施例４
ラット後肢虚血モデルにおける血管新生効力の評価
実施例１において以上で記載される研究では、デキストラン硫酸の血管新生効力が、マウスにおける安定な重症虚血モデルにおいて証明された。この研究では、ラットにおける安定な重症虚血モデル（Ｔｏａｋａｉ Ｊ Ｅｘｐ Ｃｌｉｎ Ｍｅｄ ３１（３）， １２８−１３ （２００６））を適用して、異なる動物の種を用いることによる、血管新生および機能的帰結に対するデキストラン硫酸の効力を評価した。

【0177】

材料
デキストラン硫酸溶液を研究開始の前の日に調製した。ビヒクルとして、０．９％ＮａＣｌ（生理食塩水）を使用した。関連体積のＮａＣｌを、秤量した化合物に添加し、６および６０ｍｇ／ｍｌの濃度を得た。これは、それぞれ、３および３０ｍｇ／ｋｇの用量を得るための０．５ｍｌ／ｋｇの投与に対応する。デキストラン硫酸（５〜７ｋＤａの範囲内の平均分子量を、ｐＫ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ａ／Ｓ、デンマークから入手した）を、ボルテックスする、または単純に管を数回、回転させることにより溶解させた。溶液を、４℃で一晩貯蔵し、凝集物を安定化させた。次の日、管をボルテックスし、０．２μｍフィルタに通して濾過し、滅菌溶液を得た。調製物は、４℃で貯蔵すると、最大１５日までの間信頼できると考えた。溶液を第７日に調製し、８〜２１日に使用し；第２の調製物を第２１日に作製し、２２〜２８日に使用した。

【0178】

研究開始時（第０日）に２７７ｇの平均体重を有する９０匹のＳＤラットを、Ｈａｒｌａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、イスラエルから入手した。動物には自由に市販の齧歯類食事を与えた（Ｔｅｋｌａｄ Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ Ｇｌｏｂａｌ １８％ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｉｅｔ）。動物は、酸性化飲料水（２．５〜３．５のｐＨ）を自由に利用することができた。

【0179】

動物の取扱は、国立保健研究所（ＮＩＨ）および実験動物ケア評価認証協会（ＡＡＡＬＡＣ）のガイドラインに従った。動物を３５×３０×１５ｃｍの大きさのポリエチレンケージ（３／ケージ）で飼育し、ケージはプラスチック瓶内のペレット食物および飲料水を促進するステンレス鋼上面グリルを備える；寝床：蒸気滅菌した清浄な籾殻（Ｈａｒｌａｎ， Ｓａｎｉ−ｃｈｉｐ， Ｃａｔ＃：７０９０Ａ）を使用し、寝床材料を、少なくとも週２回、ケージと共に交換した。動物には自由に市販の齧歯類食事を与えた（Ｔｅｋｌａｄ Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ Ｇｌｏｂａｌ１８％ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｉｅｔ ｃａｔ ＃：１０６Ｓ８２１６）。動物は、地方自治体供給源から得られた、オートクレーブ処理され、酸性化された飲料水（２．５〜３．５のｐＨ）を自由に利用することができた。動物を空調管理され、フィルタ処理された標準研究室条件下で（ＨＥＰＡ Ｆ６／６）十分な新鮮空気の供給を用い（最低１５回の空気交換／時間）飼育した。動物を温度と湿度が調節された環境において維持した。温度範囲は２０〜２４℃とし、相対湿度（ＲＨ）範囲は３０〜７０％とし、１２時間の明および１２時間の暗サイクルを有した。

【0180】

全ての外科的処置は、麻酔および鎮痛下（１．５〜３．０％イソフルラン、１．５％Ｎ_２Ｏおよび０．５％Ｏ_２）で実施した。鼠径部の皮膚を０．５〜１．０ｃｍ切開した。大腿動脈および静脈を２回４−０絹糸を用いて結紮し、結紮術間で切除した。創傷を３−０絹糸を用いて閉じ、ラットを回復させた。

【0181】

外科手術後第８日、第２週に、群１Ｍ、２Ｍ、および３Ｍにおける各動物を週３回ｓ．ｃ．注射した。４Ｍおよび５Ｍ群における動物に第８日に１回ｓ．ｃ．注射した。表１２を参照されたい。

【表12】

【0182】

血流測定
両側からの下肢における血流を非接触レーザードップラーを用いて、外科手術前の第−１日に、ならびに手術後第１、７、１４、２１および２８日に測定した。血流測定値を、正常肢における血流に対する虚血肢における血流の比として表した。

【0183】

全ての処置動物群は、ビヒクル処置対照に比べ、第１日と第２８日の間で、手術された四肢において血流の著しい増加を示した。表１３および図２１を参照されたい。ビヒクル処置対照に比べ、デキストラン硫酸で処置した全ての群間で統計的に有意な差があった。

【表13】

【0184】

図２１は非接触レーザードップラーにより測定された、非損傷脚と対比したＨＬＩ損傷脚の血流の比を示す。異なる群を反復測定のための二元配置ＡＮＯＶＡ、続いてボンフェローニ事後検定を用いて比較した。デキストラン硫酸処置群２Ｍ、３Ｍ、４Ｍおよび５Ｍの対照群１Ｍとの比較により、第１４日から第２８日まで、統計的に有意な差が明らかになった（^＊Ｐ＜０．０５；^＊＊Ｐ＜０．０１；^＊＊＊Ｐ＜０．００１）。

【0185】

虚血重症度
虚血肢を毎週、第７日から第２８日まで、壊死性領域に対する段階的な形態学的スケールを用いることにより肉眼により評価した（表４を参照されたい）。デキストラン硫酸およびビヒクルで処置した全ての動物群において、つま先壊死または足切断は見られなかった。

【0186】

四肢機能および虚血性ダメージのインビボ評価
虚血肢の障害された使用の半定量的評価を、外科手術後週１回、表７で提示されたスケールを用いて実施した。スコアリングは、処置について知らされていない人員により実施された。

【0187】

デキストラン硫酸で処置した全ての動物群は、ビヒクル処置対照に比べ、第１日と第２８日の間で、四肢機能改善を有した。表１４および図２２を参照されたい。

【表14】

【0188】

異なる群を、反復測定について二元配置ＡＮＯＶＡ、続いてボンフェローニ事後検定を用いて比較した。デキストラン硫酸処置群２Ｍ、３Ｍ、４Ｍおよび５Ｍの対照群１Ｍとの比較により、第１４日から第２８日まで、統計的に有意な差が明らかになった（^＊Ｐ＜０．０５；^＊＊Ｐ＜０．０１；^＊＊＊Ｐ＜０．００１）。

【0189】

免疫組織化学および毛細血管密度の分析
筋肉試料の４つの切片を群１Ｍ、２Ｍ、３Ｍ、４Ｍ、５Ｍ由来の６匹の動物の同じ領域から取得し、血管に対し、ＳＭＡおよび第８因子に対する抗体を使用して染色した。血管の面積を画像解析を用いて評価した。密度を毛細血管の平均数／視野として表した。総血管は測定した領域内の全ての血管を表した。右虚血肢におけるＳＭＡおよび第８因子陽性毛細血管の数は、全てのデキストラン硫酸処置群２Ｍ−５Ｍにおいて、対照群１Ｍに比べ、研究の第２８日に、より大きかった。図２３を参照されたい。ＳＭＡおよび第８因子陽性染色はラットにおける小毛細血管形成の指標と考えられ、よって、得られた結果により、デキストラン硫酸で処置した動物群において観察された血流改善が支持された。統計解析を二元配置ＡＮＯＶＡ、続いてボンフェローニ多重比較を用いて実施した。^＊／^＊＊はｐ＜０．０５／０．０１を示す。

【0190】

血管造影解析
造影剤充填血管間の交差の数を後肢虚血の誘導後２８日に、画像解析により決定した。血管造影により、ビヒクル処置対照群に比べ、デキストラン硫酸で処置したラットでは、影響を受けた四肢において有意に多い側枝が明らかになった（一元配置ＡＮＯＶＡ、続いてボンフェローニ事後検定により、ｐ＜０．０１およびｐ＜０．００１）。図２４および２５Ａ〜２５Ｄを参照されたい。

【0191】

血管新生障害は虚血性疾患の特徴の１つである。治療的血管新生のためのほとんどの確立された標的はＶＥＧＦおよび受容体であった。しかしながら、虚血を軽減させるための臨床試験は期待外れであり、虚血性疾患を治療するための新しい治療標的の必要性が示された。

【0192】

この研究では、２つの異なる用量および治療レジームでのデキストラン硫酸の効力を評価するために、ラット後肢虚血モデルにおける血流改善を検査した。３０および３ｍｇ／ｋｇの用量でｓ．ｃ．にて週３回または第８日での単回投与におけるデキストラン硫酸投与は、ビヒクル処置対照に比べ、外科手術後第１４日から、血液灌流を著しく回復させ、四肢機能スコアを改善した。どちらの用量および投与レジメンも有効であった。自発的肢切断またはつま先壊死は処置または対照動物群のいずれにおいても起こらなかった。デキストラン硫酸処置は、処置動物において有害作用を引き起こさなかった。血管造影スコア（側枝動脈拡張の尺度）は、ビヒクル処置群に比べ、デキストラン硫酸で処置した全ての動物群において著しく大きく、様々な処置群間では統計学的な差はなかった。ＳＭＡおよび第８因子毛細血管密度もまた、デキストラン硫酸処置後に増加した。集約的に、この研究のデータにより、ラット後肢虚血モデルにおける閉塞性末梢動脈疾患の治療に対するデキストラン硫酸の治療的効力が確認された。

【0193】

以上で記載される実施形態は、本発明の例示的な数例として理解されるべきである。当業者であれば、様々な改変、組み合わせおよび変更が本発明の範囲から逸脱せずに、実施形態に対して可能であることが理解されるであろう。特に、他の構成において、異なる実施形態における異なる部分解を、技術的に可能な場合、組み合わせることができる。しかしながら、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲により規定される。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5A-5C】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17A】

【図17B】

【図18】

【図19】

【図20A】

【図20B】

【図20C】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25A】

【図25B】

【図25C】

【図25D】