特許 6559063 導入遺伝子のヌクレアーゼ媒介標的化組み込みのための方法および組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6559063

(24)【登録日】2019年7月26日

(45)【発行日】2019年8月14日

(54)【発明の名称】導入遺伝子のヌクレアーゼ媒介標的化組み込みのための方法および組成物

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/09 20060101AFI20190805BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20190805BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/09 100

   C12N5/10ZNA

【請求項の数】13

【全頁数】239

(21)【出願番号】特願2015-511632(P2015-511632)

(86)(22)【出願日】2013年5月7日

(65)【公表番号】特表2015-516162(P2015-516162A)

(43)【公表日】2015年6月11日

(86)【国際出願番号】US2013039979

(87)【国際公開番号】WO2013169802

(87)【国際公開日】20131114

【審査請求日】2016年3月24日

【審判番号】不服2018-1708(P2018-1708/J1)

【審判請求日】2018年2月7日

(31)【優先権主張番号】61/643,812

(32)【優先日】2012年5月7日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】508241200

【氏名又は名称】サンガモ セラピューティクス， インコーポレイテッド

(73)【特許権者】

【識別番号】501035309

【氏名又は名称】ダウ アグロサイエンシィズ エルエルシー

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本 健策

(72)【発明者】

【氏名】コスト， グレゴリー ジェイ．

(72)【発明者】

【氏名】ウルノフ， フィオードル

(72)【発明者】

【氏名】アインリー， ウィリアム エム．

(72)【発明者】

【氏名】ペトリーノ， ジョセフ エフ．

(72)【発明者】

【氏名】サミュエル， ジャヤクマール ポン

(72)【発明者】

【氏名】ウェブ， スティーブン アール．

(72)【発明者】

【氏名】サストリー−デント， ラクシュミ

【合議体】

【審判長】 長井 啓子

【審判官】 小暮 道明

【審判官】 大宅 郁治

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２０１０／１４３９１７（ＷＯ，Ａ２）

【文献】 国際公開第２０１１／０７２２４６（ＷＯ，Ａ２）

【文献】 Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１０，Ｖｏｌ．３８，Ｎｏ．１５，ｅ１５２

【文献】 Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００７年，Ｖｏｌ．３５，Ｎｏ．１５，ｐｐ．５１９２−５２０２

【文献】 Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，２００３年，Ｖｏｌ．１３３，Ｎｏ．３，ｐｐ．１０１１−１０２３

【文献】 Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，２００３年，Ｖｏｌ．１３３，Ｎｏ．３，ｐｐ．９５６−９６５

【文献】 Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｊｏｕｒｎａｌ，２０１２年１月３日，Ｖｏｌ．１０，ｐｐ．３７３−３８９

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

C12N15/

ＣＡＰｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＷＰＩＤＳ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

環状２本鎖ポリヌクレオチドであって、前記環状２本鎖ポリヌクレオチドは、
導入遺伝子と、
第１の配列および第２の配列と
を含み、
ここで、前記第１の配列および前記第２の配列の各々は、１つ以上の二量体化ジンクフィンガーまたはＴＡＬエフェクタードメインヌクレアーゼに対する左および右標的部位を含み、前記左および右標的部位は哺乳動物細胞または植物細胞のゲノム中に存在する配列を含み、
ここで、前記左および右標的部位は、前記左および右標的部位の間にある前記哺乳動物細胞または植物細胞のゲノム中の少なくとも１つのスペーサー配列によって互いに分離されており、前記スペーサー配列は、前記哺乳動物細胞または植物細胞のゲノムであって、前記左および右標的部位に隣接するゲノム中に存在せず、
ここで、前記左および右標的部位は、前記導入遺伝子内にはなく、さらに、前記環状２本鎖ポリヌクレオチドは、相同アームを含まず、
前記導入遺伝子は、前記第１の配列と前記第２の配列との間にあり、前記左および右標的部位は、それぞれ、前記哺乳動物細胞または植物細胞の前記ゲノムへの５０未満の塩基対の相同性を示す、環状２本鎖ポリヌクレオチド。

【請求項2】

前記導入遺伝子は、少なくとも１ｋｂの長さである、請求項１に記載の環状２本鎖ポリヌクレオチド。

【請求項3】

前記環状２本鎖ポリヌクレオチドは、プラスミドである、請求項１または請求項２に記載の環状２本鎖ポリヌクレオチド。

【請求項4】

前記導入遺伝子は、ポリペプチドをコードする、請求項１から３のいずれかに記載の環状２本鎖ポリヌクレオチド。

【請求項5】

前記スペーサー配列は、少なくとも５つのヌクレオチドを含む、請求項１から４のいずれかに記載の環状２本鎖ポリヌクレオチド。

【請求項6】

請求項１から５のいずれかに記載の環状２本鎖ポリヌクレオチドを含む哺乳動物細胞または植物細胞。

【請求項7】

哺乳動物細胞または植物細胞の内因性遺伝子座内に導入遺伝子を組み込むための組成物であって、前記組成物は、請求項１から５のいずれかに記載の環状２本鎖ポリヌクレオチドを含み、前記環状２本鎖ポリヌクレオチドが、１つ以上の二量体化ジンクフィンガーまたはＴＡＬエフェクタードメインヌクレアーゼと組み合わせて前記哺乳動物細胞または植物細胞内に導入されることを特徴とし、前記ヌクレアーゼは、前記導入遺伝子が、相同性非依存性の機構を介して前記内因性遺伝子座内に組み込まれるように、前記環状２本鎖ポリヌクレオチドおよび前記内因性遺伝子座を切断する、組成物。

【請求項8】

前記導入遺伝子は、順方向に組み込まれる、請求項７に記載の組成物。

【請求項9】

前記導入遺伝子は、逆方向に組み込まれる、請求項７に記載の組成物。

【請求項10】

同じヌクレアーゼが、前記内因性遺伝子座および前記環状２本鎖ポリヌクレオチドを切断する、請求項７から９のいずれかに記載の組成物。

【請求項11】

異なるヌクレアーゼが、前記内因性遺伝子座および前記環状２本鎖ポリヌクレオチドを切断する、請求項７から９のいずれかに記載の組成物。

【請求項12】

前記ヌクレアーゼは、前記内因性遺伝子座内に欠失を生成し、前記導入遺伝子は、前記欠失に組み込まれる、請求項７から１１のいずれかに記載の組成物。

【請求項13】

前記植物細胞は、双子葉植物細胞または単子葉植物細胞である、請求項７から１２のいずれかに記載の組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０１２年５月７日に出願された米国仮特許出願第６１／６４３，８１２号の利益を主張し、その開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0002】

連邦政府による資金提供を受けた研究でなされた発明に対する権利の記述
該当なし

【0003】

本開示は、ゲノム操作、特に細胞のゲノムの標的化修飾の分野に含まれる。

【背景技術】

【0004】

生物および細胞株のゲノム内への外来ＤＮＡの組み込みは、生体系の調査および操作のために広く利用されている方法である。従来的には、導入遺伝子の挿入は、導入遺伝子を有し、また所望の組み込み部位に隣接する実質的なＤＮＡ配列同一性を含有するプラスミドの提供により、特定の遺伝子座に標的化される。染色体の自発的破壊、およびそれに続く、プラスミドＤＮＡの相同領域を鋳型として使用した修復は、介在する導入遺伝子のゲノム内への導入をもたらす。例えば、Ｋｏｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９８９） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８６（２２）：８９２７−８９３１、Ｔｈｏｍａｓ ｅｔ ａｌ． （１９８６） Ｃｅｌｌ ４４（３）：４１９−４２８を参照されたい。この種の相同性指向性の標的化組み込みの頻度は、標的領域近傍での２本鎖切断の意図的な形成により、１０^５ 倍まで増加させることができる（Ｈｏｃｋｅｍｅｙｅｒ ｅｔ ａｌ． （２００９） Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ． ２７（９）：８５１−８５７、Ｌｏｍｂａｒｄｏ ｅｔ ａｌ． （２００７） Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ． ２５（１１）：１２９８−１３０６、Ｍｏｅｈｌｅ ｅｔ ａｌ． （２００７） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ １０４（９）：３０５５−３０６０、Ｒｏｕｅｔ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１（１３）：６０６４−６０６８）。

【0005】

２本鎖切断（ＤＳＢ）またはニックは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）もしくはＴＡＬエフェクタードメインヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）等の部位特異的ヌクレアーゼにより、または特定の切断をガイドするための操作されたｃｒＲＮＡ／トラクトＲＮＡ（単一ガイドＲＮＡ）を有するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系を使用して形成され得る。例えば、Ｂｕｒｇｅｓｓ （２０１３） Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １４：８０−８１、Ｕｒｎｏｖ ｅｔ ａｌ． （２０１０） Ｎａｔｕｒｅ ４３５（７０４２）：６４６−５１、米国特許公開第２００３０２３２４１０、同第２００５０２０８４８９号、同第２００５００２６１５７号、同第２００５００６４４７４号、同第２００６０１８８９８７号、同第２００９０２６３９００号、同第２００９０１１７６１７号、同第２０１０００４７８０５号、同第２０１１０２０７２２１号、同第２０１１０３０１０７３号および国際公開第２００７／０１４２７５号を参照されたく、その開示は、全ての目的において参照によりその全体が組み込まれる。多くの生物において、導入遺伝子挿入は、挿入された導入遺伝子が挿入（切断）部位への相同性の領域を含むことを必要とする相同性指向性修復（ＨＤＲ）プロセスを介して達成され得る。しかしながら、いくつかの生物および細胞株は、従来のＨＤＲプロセスを有さず、標的化組み込みは、主に、相同性非依存性の非相同末端結合（ＮＨＥＪ）ＤＮＡ修復機構により生じる。したがって現在まで、ＨＤＲプロセスに抵抗する生物および細胞株（例えば、ＣＨＯ細胞）において、比較的短い（＜１００ｂｐ）オリゴヌクレオチドのみが、標的遺伝子座のヌクレアーゼ媒介切断後に相同性非依存性経路を介して組み込まれていた。例えば、Ｏｒｌａｎｄｏ ｅｔ ａｌ． （２０１０） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ３８（１５）：ｅ１５２および米国特許公開第２０１１０２０７２２１号を参照されたい。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0006】

【特許文献1】米国特許出願公開第２００３／０２３２４１０号明細書

【特許文献2】米国特許出願公開第２００５／０２０８４８９号明細書

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

したがって、例えば従来の相同性主導的手法のない、またはそれが不十分な生物および細胞株における、より大きな導入遺伝子を含む導入遺伝子の切断部位内への直接的な相同性非依存性標的化組み込みのための組成物および方法が、依然として必要とされている。

【課題を解決するための手段】

【0008】

導入遺伝子の相同性非依存性標的化組み込みのための方法および組成物が、本明細書に開示される。

【0009】

一態様において、少なくとも１つのヌクレアーゼを使用したドナーのインビボ切断後の選択された内因性遺伝子座内への組み込みのための２本鎖ドナーポリヌクレオチドが、本明細書に開示される。ドナーポリヌクレオチドは、内因性遺伝子座内に組み込まれる外因性配列（導入遺伝子）を含み、ヌクレアーゼの少なくとも１つの標的部位、例えば、結合部位の近接端を隔てる「スペーサー」配列により隔てられた２つの対になったヌクレアーゼ結合部位を含有する。スペーサーは、任意のサイズであってもよく、例えば、４〜２０塩基対の間（またはその間の任意の値）であってもよい。複数のヌクレアーゼ標的部位を有するドナーは、同じまたは異なる標的部位、例えば、導入遺伝子に隣接する同じ対部位の２つ、または導入遺伝子に隣接する２つの異なる対部位を有してもよい。ドナーヌクレオチドは、導入遺伝子配列に隣接する相同アームの存在を必要としない。ドナー配列に存在し得る唯一の染色体の相同性は、ヌクレアーゼ結合部位（複数可）である。ヌクレアーゼ標的部位がゲノムとの相同性を示す実施形態において、ゲノムへの相同性は、５０から１００の連続塩基対（または５０から１００の間の任意の数の塩基対）未満の長さである。ドナーを切断するために使用されるヌクレアーゼが、染色体を切断するために使用されるヌクレアーゼと同じではないある特定の実施形態において、ヌクレアーゼ（複数可）により切断された染色体座とドナー配列との間の相同性はなくてもよい。さらに、ヌクレアーゼ標的部位（複数可）は、導入遺伝子内にはなく、したがって、標的部位（複数可）に結合するヌクレアーゼ（複数可）によるドナーポリヌクレオチドの切断は、導入遺伝子を修飾しない。ある特定の実施形態において、ドナー核酸は、２つの標的部位を含み、例えばスペーサー配列がゲノム内に存在する２つの標的部位の間のゲノム配列において生じない場合、２つの標的部位の間のスペーサー配列は、非天然型である。ある特定の実施形態において、ドナー分子は、相同性非依存性の機構（例えばＮＨＥＪ）を介して内因性遺伝子座内に組み込まれる。他の実施形態において、２本鎖ドナーは、少なくとも１ｋｂの長さの導入遺伝子、ならびにインビボ切断のための導入遺伝子の３’側および／または５’側にヌクレアーゼ標的部位（複数可）を含む。ある特定の実施形態において、ドナーを切断するために使用されるヌクレアーゼ標的部位（複数可）は、例えば対標的部位間のスペーサーが内因性遺伝子座に存在しない、および／または内因性遺伝子座への相同性を示さない場合、導入遺伝子の組み込み後に再形成されない。ドナー分子は、例えば、プラスミドであってもよい。ある特定の実施形態において、ドナーは、内因性遺伝子座のヌクレアーゼ媒介切断後に組み込まれる。ドナー分子の任意のヌクレアーゼ媒介組み込みにおいて、ドナーを切断するために使用されるヌクレアーゼの１つ以上は、内因性遺伝子座を切断するために使用されるヌクレアーゼの１つ以上と同じであってもよい。代替として、ドナーを切断するために使用されるヌクレアーゼの１つ以上は、内因性遺伝子座を切断するために使用されるヌクレアーゼの１つ以上と異なってもよい。

【0010】

いくつかの実施形態において、ドナーは、プラスミド上に含有される。ドナーは、ヌクレアーゼ媒介切断後に組み込まれてもよく、組み込まれる配列（ドナーまたは導入遺伝子）には、プラスミド内で少なくとも２つのヌクレアーゼ切断部位が隣接している。他の実施形態において、ドナーは、プラスミド上に含有され、ドナーは、ヌクレアーゼ媒介切断後に組み込まれてもよく、組み込まれる配列（ドナーまたは導入遺伝子）は、単一のヌクレアーゼ切断部位を含むプラスミドである。ある特定の実施形態において、ドナープラスミド内のヌクレアーゼ切断部位の配列は、標的化される染色体座内のヌクレアーゼ切断部位の配列と同じである。切断部位がドナーとゲノムとの間と同じである実施形態において、切断部位を隔てる配列は、同じまたは異なってもよい。ある特定の実施形態において、切断部位を隔てる配列（スペーサー）は、ドナーの切断後に、標的部位が再形成されず、ドナーが同じヌクレアーゼ（複数可）により再び切断され得ないように、ゲノムと比較してドナーにおいて異なる。他の実施形態において、ドナー含有プラスミド上でドナーに隣接するヌクレアーゼ切断部位は、染色体内の切断部位と異なる。さらなる実施形態において、ドナー含有プラスミド内のドナーに隣接するヌクレアーゼ切断部位は同じではなく、また染色体内のヌクレアーゼ切断部位と異なってもよい。さらなる実施形態において、ドナーは、少なくとも２つのヌクレアーゼ切断部位が隣接するプラスミド上に含有されてもよく、２つのヌクレアーゼの作用により形成された染色体内の欠失に組み込まれてもよい。この実施形態において、プラスミド上のドナーに隣接するヌクレアーゼ切断部位および染色体内のヌクレアーゼ切断部位は、同じであってもよく、または異なってもよい。

【0011】

ドナー分子の目的配列は、プロモーターありまたはなしで機能性ポリペプチドをコードする１つ以上の配列（例えばｃＤＮＡ）を含んでもよい。ある特定の実施形態において、核酸配列は、抗体、抗原、酵素、成長因子、受容体（細胞表面または核）、ホルモン、リンホカイン、サイトカイン、レポーター、耐虫性遺伝子、除草剤耐性遺伝子、転写因子、隔離タンパク質または上記のいずれかの機能性断片、および上記の組み合わせをコードする配列を含む。ドナー分子の目的配列は、機能性または構造的ＲＮＡ、例えばＲＮＡｉ、ｓＲＮＡｉ、および／またはｍＲＮＡｉをコードするＲＮＡ分子をコードする１つ以上の配列を含んでもよい。機能性ポリペプチドコード化配列がプロモーターを含まない実施形態において、組み込まれた配列の発現は、内因性プロモーターまたは目的領域内の他の調節要素により主導される転写により確保される。他の実施形態において、「縦列」カセットがこのようにして選択された部位内に組み込まれ、カセットの第１の構成要素は、上述のプロモーターのない配列に続く転写停止配列、および自律的発現カセットをコードする第２の配列を含む。２Ａペプチド、ＳＡ部位、ＩＲＥＳ等をコードする配列を含むがこれらに限定されない追加的な配列（コード化または非コード化配列）が、ドナー分子に含まれてもよい。ある特定の実施形態において、ドナー核酸（導入遺伝子）は、機能性ＲＮＡ、例えばｍｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡをコードする配列を含む。

【0012】

別の態様において、相同性非依存性機構を介してドナー核酸（例えば本明細書に記載のドナー分子）を細胞のゲノム内に組み込む方法が、本明細書に記載される。方法は、細胞のゲノム内に２本鎖切断（ＤＳＢ）を形成することと、ドナー核酸がＤＳＢの部位で組み込まれるように、１つ以上のヌクレアーゼを使用してドナー分子を切断することとを含む。ある特定の実施形態において、ドナー核酸は、相同性非依存的方法（例えばＮＨＥＪ）を介して組み込まれる。上述のように、インビボ切断後、ドナー配列は、標的化された様式で、ＤＳＢの場所で細胞のゲノム内に組み込まれ得る。ドナー配列は、ＤＳＢを形成するために使用されるヌクレアーゼの１つ以上に対する同じ標的部位の１つ以上を含み得る。したがって、ドナー配列は、組み込みが望ましい内因性遺伝子を切断するために使用される同じヌクレアーゼの１つ以上により切断され得る。ある特定の実施形態において、ドナー配列は、ＤＳＢを誘導するために使用されるヌクレアーゼと異なるヌクレアーゼ標的部位を含む。標的細胞のゲノム内のＤＳＢは、任意の機構により形成され得る。ある特定の実施形態において、ＤＳＢは、１つ以上のジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）（例えばその二量体化対）、目的領域内の配列に結合するように操作されたジンクフィンガー結合ドメインを含む融合タンパク質、および切断ドメインまたは切断ハーフドメインにより形成される。他の実施形態において、ＤＳＢは、ヌクレアーゼドメイン（ＴＡＬＥＮ）に融合した１つ以上のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン（天然または非天然）により形成される。さらなる実施形態において、切断は、操作されたｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒ ＲＮＡを有するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ等のヌクレアーゼ系を使用して行われる。

【0013】

さらに、本明細書に記載の方法のいずれにおいても、第１および第２の切断ハーフドメインは、タイプＩＩＳ 制限エンドヌクレアーゼ、例えばＦｏｋＩまたはＳｔｓＩからのものであってもよい。さらに、本明細書に記載の方法のいずれにおいても、融合タンパク質の少なくとも１つは、例えば切断ハーフドメインの偏性ヘテロ二量体が形成されるように、切断ハーフドメインの二量体化界面のアミノ酸配列内の改変を含み得る。代替として、本明細書に記載の方法のいずれにおいても、切断ドメインは、天然または非天然（操作された）メガヌクレアーゼであってもよい。

【0014】

本明細書に記載の方法のいずれにおいても、細胞は、任意の真核細胞、例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ（例えば、ＣＨＯ−Ｓ、ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯ−ＤＧ４４、ＣＨＯ−ＤＵＸＢ１１、ＣＨＯ−ＤＵＫＸ、ＣＨＯＫ１ＳＶ）、ＶＥＲＯ、ＭＤＣＫ、ＷＩ３８、Ｖ７９、Ｂ１４ＡＦ２８−Ｇ３、ＢＨＫ、ＨａＫ、ＮＳ０、ＳＰ２／０−Ａｇ１４、ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３（例えば、ＨＥＫ２９３−Ｆ、ＨＥＫ２９３−Ｈ、ＨＥＫ２９３−Ｔ）、およびｐｅｒＣ６細胞、ならびにスポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｆ）等の昆虫細胞、またはサッカロミセス、ピチア、およびシゾサッカロミセス等の真菌細胞を含む、植物細胞または哺乳動物細胞または細胞株であってもよい。ある特定の実施形態において、細胞株は、ＣＨＯ、ＭＤＣＫ、またはＨＥＫ２９３細胞株である。好適な細胞には、一例として、胚幹細胞、人工多能性幹細胞、造血幹細胞、神経幹細胞および間葉幹細胞等の幹細胞も含まれる。さらに、細胞は、細胞周期のＧ２期で停止されてもよい。本明細書に記載の方法のいくつかの実施形態において、細胞は、効率的な相同性ベースＤＮＡ修復を有さないもの、例えばＣＨＯ細胞であってもよい。ある特定の実施形態において、細胞は、優先的にＮＨＥＪ ＤＮＡ修復経路を使用する初代または非分裂細胞であってもよい。いくつかの実施形態において、細胞は、植物また真菌細胞であってもよい。他の実施形態において、本明細書に記載の方法は、配列決定されていないゲノムを有する細胞において使用されてもよい。これらの細胞は、導入遺伝子（複数可）を保持する細胞株および／またはトランスジェニック生物（例えば動物もしくは植物）を作製するために使用され得る。

【0015】

別の態様において、本明細書に記載の方法のいずれかに従って組み込まれた導入遺伝子を含むトランスジェニック生物（例えば植物または動物）が提供される。一実施形態において、選択された遺伝子に対しヘテロ接合遺伝子型を有する細胞、細胞株またはトランスジェニック生物が構築され、一方別の実施形態において、所望の遺伝子座の両方の対立遺伝子に２つの変異体コピーを有するホモ接合細胞、細胞株またはトランスジェニック生物が作製される。

【0016】

また、本発明の方法および組成物を含むキットが提供される。キットは、ヌクレアーゼ（例えば、ＲＮＡ分子、または好適な発現ベクター内に含有されるＺＦＮ、ＴＡＬＥＮもしくはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系コード化遺伝子）、あるいはヌクレアーゼタンパク質のアリコート、ドナー分子、好適な宿主細胞株、本発明の方法を実行するための説明等を含んでもよい。キットはまた、目的ドナー分子（例えば、レポーター遺伝子、特定の導入遺伝子等）を含んでもよい。

【0017】

これらのおよび他の態様は、本開示を全体として考慮すると、当業者に容易に明らかとなろう。
特定の実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
２本鎖ポリヌクレオチドであって、
外因性核酸配列と、
１つ以上のヌクレアーゼに対する１つ以上の標的部位を含む配列とを含み、
前記１つ以上の標的部位は、前記外因性核酸配列内にはなく、さらに、前記２本鎖ポリヌクレオチドは、相同アームを含まない、２本鎖ポリヌクレオチド。
（項目２）
前記外因性核酸配列は、少なくとも１ｋｂの長さである、請求項１に記載の２本鎖ポリヌクレオチド。
（項目３）
前記外因性核酸配列ポリヌクレオチドは、プラスミドである、請求項１または請求項２に記載の２本鎖ポリヌクレオチド。
（項目４）
前記外因性核酸配列は、導入遺伝子を含む、請求項１から３のいずれかに記載の２本鎖ポリヌクレオチド。
（項目５）
前記配列は、２つの標的部位、および前記２つの標的部位の間の少なくとも５つのヌクレオチドのスペーサーを含む、請求項１から４のいずれかに記載の２本鎖ポリヌクレオチド。
（項目６）
請求項１から５のいずれかに記載の２本鎖ポリヌクレオチドを含む細胞。
（項目７）
細胞の内因性遺伝子座内に外因性核酸配列ポリヌクレオチドを組み込む方法であって、
請求項１から５のいずれかに記載の２本鎖ポリヌクレオチドを、前記細胞内に導入する工程と、
１つ以上のヌクレアーゼを前記細胞内に導入する工程とを含み、前記ヌクレアーゼは、前記２本鎖ポリヌクレオチドを切断し、そして前記外因性核酸配列ポリヌクレオチドが前記内因性遺伝子座内に組み込まれるように、前記内因性遺伝子座を切断する、方法。
（項目８）
前記外因性核酸配列ポリヌクレオチドは、順方向に組み込まれる、請求項７に記載の方法。
（項目９）
前記外因性核酸配列ポリヌクレオチドは、逆方向に組み込まれる、請求項７に記載の方法。
（項目１０）
同じヌクレアーゼが、前記内因性遺伝子座およびドナーポリヌクレオチドを切断する、請求項７から９のいずれかに記載の方法。
（項目１１）
異なるヌクレアーゼが、前記内因性遺伝子座およびドナーポリヌクレオチドを切断する、請求項７から９のいずれかに記載の方法。
（項目１２）
前記外因性核酸配列ポリヌクレオチドは、相同性非依存性の機構を介して前記内因性遺伝子座内に組み込まれる、請求項７から１１のいずれかに記載の方法。
（項目１３）
前記２つの標的部位および前記スペーサーを含む前記核酸は、前記標的部位が前記外因性核酸配列ポリヌクレオチドの組み込み後に再形成されないように、非天然型のものである、請求項７から１２のいずれかに記載の方法。
（項目１４）
前記ヌクレアーゼは、前記内因性遺伝子座内に欠失を生成し、前記外因性核酸配列ポリヌクレオチドは、前記欠失に組み込まれる、請求項７から１３のいずれかに記載の方法。
（項目１５）
前記細胞は、真核細胞である、請求項７から１４のいずれかに記載の方法。
（項目１６）
前記細胞は、植物細胞または哺乳動物細胞である、請求項１５に記載の方法。
（項目１７）
前記植物細胞は、双子葉植物細胞または単子葉植物細胞である、請求項１６に記載の方法。
（項目１８）
請求項７から１７のいずれかに記載の方法に従って組み込まれた外因性核酸配列ポリヌクレオチドを含む、トランスジェニック生物。

【図面の簡単な説明】

【0018】

【図1A】（パネルＡ〜Ｆ）Ｋ５６２細胞におけるＡＡＶＳ１遺伝子座でインビボで切断された導入遺伝子の捕捉を示す。図１Ａは、各対がスペーサーにより隔てられた２つの対結合部位（全部で４つの結合部位）を有する例となるドナー分子を示す概略図であり、これらの部位はゲノム内に組み込まれる導入遺伝子に隣接している。標的部位は、同じまたは異なっていてもよい。

【図1B】（パネルＡ〜Ｆ）Ｋ５６２細胞におけるＡＡＶＳ１遺伝子座でインビボで切断された導入遺伝子の捕捉を示す。図１Ｂは、４つの異なるインビボドナー切断技術を示す概略図である。第１の実施形態にいて、染色体およびドナープラスミドの両方がＺＦＮ切断部位（暗灰色の領域）を含有する場合、ドナーおよび染色体の切断が同期し、染色体内へのドナーの効率的な組み込みが可能となる。組み込みは、それぞれ「ＡＢ」および「ＢＡ」と呼ばれる順方向および逆方向の両方で生じ得る。第２の実施形態において、ドナーは、２つ以上のヌクレアーゼ切断部位を含有する。ヌクレアーゼの作用は、ＤＮＡの直線断片を解放し、これが染色体内に組み込まれる。第３の実施形態において、染色体は、２つ以上のヌクレアーゼにより切断され、ドナーは、１つのヌクレアーゼにより切断され、染色体内の欠失へのドナーの組み込みがもたらされる。第４の実施形態において、ドナーＤＮＡおよび染色体ＤＮＡの両方が、２つ以上のヌクレアーゼにより切断され、染色体内の欠失への直線断片の組み込みがもたらされる。

【図1C】（パネルＡ〜Ｆ）Ｋ５６２細胞におけるＡＡＶＳ１遺伝子座でインビボで切断された導入遺伝子の捕捉を示す。図１Ｃは、導入遺伝子の順方向（ＡＢ）組み込みに有利であり、同じヌクレアーゼ標的部位（上パネル）を再形成するドナーと、導入遺伝子の逆方向（ＢＡ）組み込みに有利であり、同じヌクレアーゼ標的部位（下パネル）を再形成しないドナーとの比較を示す。結合部位間の配列（スペーサー）に下線が引かれており、切断後に形成された野生型（上パネル）のオーバーハングおよび逆相補（下パネル）スペーサーは、上および下パネルの右側に示されている。左上に示される配列は、配列番号：１０７および１０８である。右上に示される配列は、配列番号：１０９および１１０である。左下に示される配列は、配列番号：１１１および１１２であり、右下に示される配列は、配列番号：１１３および１１４である。

【図1D】（パネルＡ〜Ｆ）Ｋ５６２細胞におけるＡＡＶＳ１遺伝子座でインビボで切断された導入遺伝子の捕捉を示す。図１Ｄは、ＺＦＮ結合部位（ゲノム内と同じスペーサー配列）の間の野生型（「ｗ．ｔ．」）配列（またはスペーサー）およびＺＦＮ結合部位の間の逆相補（「ｒ．ｃ．」）配列を有するドナーからの標的化組み込みの検出を示すゲルである。示されるように、逆補体オーバーハングヌクレオチドにより、ＢＡ方向においてより多くのシグナルが見られる。

【図1E】（パネルＡ〜Ｆ）Ｋ５６２細胞におけるＡＡＶＳ１遺伝子座でインビボで切断された導入遺伝子の捕捉を示す。図１Ｅは、ＡＡＶＳ特異的ＺＦＮによるインビボ切断後のＡＡＶＳ１でのドナープラスミドの組み込みを示すゲルである。ＡＡＶＳ１ ＺＦＮ部位を含有する、または有さないドナープラスミドは、ＡＡＶＳ１特異的ＺＦＮでＫ５６２細胞内に共トランスフェクトされた。ＡＢおよびＢＡ方向の両方における組み込みは、染色体−ドナー接合点のＰＣＲにより監視した。ＡＢ方向での挿入は、左および右の接合点に対しそれぞれ３９１および４２３ｂｐのＰＣＲ産物を生成し、ＢＡ方向での挿入は、左および右の接合点に対してそれぞれ３６９および４７１ｂｐの接合点ＰＣＲ産物を生成する。「Ａ１」は、ＡＡＶＳ１ＺＦＮ部位を増幅するように設計されたＰＣＲ反応を指し、「ＮＴ」は、ＤＮＡ鋳型を有さない反応を指す。

【図1F】（パネルＡ〜Ｆ）Ｋ５６２細胞におけるＡＡＶＳ１遺伝子座でインビボで切断された導入遺伝子の捕捉を示す。図１Ｆは、３倍体ＡＡＶＳ１遺伝子座の概略図およびサザンブロットにより分析された標的化組み込みの調査の結果の両方を示す。３つのクローンを２回分析した。３つのクローンからのゲノムＤＮＡを、ＢｇｌＩで切断してＡＡＶＳ１特異的プローブで精査する（上のゲル）か、または、ＡｃｃＩで切断して、導入遺伝子特異的プローブ（ｂｌａ）で精査した。

【図2A】（パネルＡおよびＢ）インビボドナー切断が、２つの異なる細胞型におけるいくつかの遺伝子座での導入遺伝子捕捉を促進することを示す。図２Ａは、ＩＬ２Ｒγ、ＣＣＲ５、およびグルタミン合成酵素（ＧＳ）遺伝子座における部位でのＮＨＥＪを介した標的化組み込みが、ドナープラスミドがトランスフェクションの前に切断されるよりも染色体と同時切断された場合により効率的であることを示している。３つ全ての遺伝子座において、各方向に対して１回の接合点ＰＣＲを行ったが、左の接合点はＢＡ方向、右の接合点はＡＢ方向に対するものである。使用した実験条件は、以下のように標示される：「Ｎ」は、ドナーがＺＦＮ部位を有さないトランスフェクションを指し；「ＥＲＶ」は、ドナーが細胞内への導入の前にＥｃｏＲＶで事前に切断された試料を指し；「Ｙ」は、ドナーおよび標的化遺伝子の両方がＺＦＮ部位を含有していたトランスフェクションを指し；「ＮＴ」は、鋳型ＤＮＡのないＰＣＲ反応を指す。組み込みに成功したドナーのＰＣＲ増幅から推定される単位複製配列サイズは、塩基対の各レーンの下に示される（「推定サイズ、ｂｐ」）。示された写真は、臭化エチジウム染色ゲルの色反転画像である。

【図2B】（パネルＡおよびＢ）インビボドナー切断が、２つの異なる細胞型におけるいくつかの遺伝子座での導入遺伝子捕捉を促進することを示す。図２Ｂは、ドナー切断が、染色体内の標的部位を切断するために使用されるものと同じＺＦＮを用いて行われる必要がないことを示す。染色体標的内への導入遺伝子組み込みを検出するため、および組み込まれた導入遺伝子の方向を検出するために、接合点特異的ＰＣＲアッセイを使用した。これらのアッセイは、導入遺伝子がＺＦＮ切断後にいずれの方向においても組み込みし得ることを示した。実験条件は、以下のように標示される：ＧＳ、ＧＳ特異的ＺＦＮまたはＧＳ ＺＦＮ切断部位を有するドナープラスミド；Ａ１、ＡＡＶＳ１特異的ＺＦＮまたはＡＡＶＳ１ＺＦＮ切断部位を有するドナー。

【図3-1】（パネルＡ〜Ｃ）ＣＨＯ−Ｋ１細胞内のＧＳ遺伝子座における高頻度標的化導入遺伝子組み込みを示す。図３Ａは、ＢＡ方向に組み込まれた導入遺伝子を示すＧＳ遺伝子座の概略図である。

【図3-2】（パネルＡ〜Ｃ）ＣＨＯ−Ｋ１細胞内のＧＳ遺伝子座における高頻度標的化導入遺伝子組み込みを示す。図３Ｂは、ＧＳ遺伝子座におけるドナーの標的化組み込みの細胞クローンのサザンブロットアッセイを示す。エキソンＧＳプローブはまた、２つのＧＳ偽遺伝子を検出する。クローンの同じパネルを、大腸菌ｂｌａ遺伝子に対する精査により、全導入遺伝子組み込みに関して分析した（図３Ｃ）。分析した８つのクローンのうちの３つにおけるゲノム内の他の場所における導入遺伝子組み込みと共に、ＧＳ遺伝子座における導入遺伝子の組み込みが見られる。

【図4A】（パネルＡおよびＣ）モノクローナル抗体導入遺伝子のＺＦＮおよびＴＡＬＥＮ媒介標的化挿入による、ＣＨＯ−Ｋ１細胞におけるアルファ−（１，６）−フコシルトランスフェラーゼ（ＦＵＴ８）の妨害を示す。図４Ａは、接合点特異的ＰＣＲによる導入遺伝子挿入について、およびＩｇＧ発現についてスクリーニングされたクローンの間の一致を示す、面積比例ベン図を示す。

【図4B】（パネルＡおよびＣ）モノクローナル抗体導入遺伝子のＺＦＮおよびＴＡＬＥＮ媒介標的化挿入による、ＣＨＯ−Ｋ１細胞におけるアルファ−（１，６）−フコシルトランスフェラーゼ（ＦＵＴ８）の妨害を示す。図４Ｂは、挿入された導入遺伝子（薄灰色で示される）を含有するＦＵＴ８遺伝子座の概略図であり、導入遺伝子の方向は「ＡＢ」または「ＢＡ」の用語のいずれかで標示されており、図４Ｃは、ＦＵＴ８における組み込みのサザンブロットによる確認を示す。ＢＡおよびＡＢ方向に挿入された導入遺伝子を含有する要素が示されている。

【図4C】（パネルＡおよびＣ）モノクローナル抗体導入遺伝子のＺＦＮおよびＴＡＬＥＮ媒介標的化挿入による、ＣＨＯ−Ｋ１細胞におけるアルファ−（１，６）−フコシルトランスフェラーゼ（ＦＵＴ８）の妨害を示す。図４Ｂは、挿入された導入遺伝子（薄灰色で示される）を含有するＦＵＴ８遺伝子座の概略図であり、導入遺伝子の方向は「ＡＢ」または「ＢＡ」の用語のいずれかで標示されており、図４Ｃは、ＦＵＴ８における組み込みのサザンブロットによる確認を示す。ＢＡおよびＡＢ方向に挿入された導入遺伝子を含有する要素が示されている。

【図5A】（パネルＡ〜Ｃ）実施例で説明される実験のＺＦＮ活性を示す。図５Ａは、ＡＡＶＳ１遺伝子座（上）における、およびドナープラスミド（下）のＺＦＮ切断を示す。図５Ａにおける図１Ｄからの対応するレーンは、ゲルの上に示され（例：「１，１２」）、Ｓｕｒｖｅｙｏｒ（商標）ヌクレアーゼ酵素の存在（「Ｙ」）または非存在（「Ｎ」）も同様である。修飾された分子のパーセンテージは、シグナルと共にレーンの下に示されている。

【図5B】（パネルＡ〜Ｃ）実施例で説明される実験のＺＦＮ活性を示す。図５Ｂは、対応する遺伝子特異的ＺＦＮを使用したＩＬ２Ｒγ、ＣＣＲ５、およびＧＳでのＺＦＮ切断を示す。５Ａに関して上述したように、５Ｂにおける図２Ａからの対応するレーンは、ゲルの上に示され、Ｓｕｒｖｅｙｏｒ（商標）ヌクレアーゼ酵素の存在（「Ｙ」）または非存在（「Ｎ」）も同様である。図５Ｂの上段のゲルは、遺伝子座内への組み込みからの結果を示しているが、図の下のゲルは、ドナーにおける切断の結果を示している。

【図5C】（パネルＡ〜Ｃ）実施例で説明される実験のＺＦＮ活性を示す。図５Ｃは、ＧＳでのＺＦＮ切断を示し、左側のゲルは、ＣＨＯ細胞における遺伝子座からの結果を示し、一方右側のゲルは、ドナーのＺＦＮ切断の結果を示している。上述のように、図５Ｃにおける図２Ｂからの対応するレーンは、ゲルの上に示され、Ｓｕｒｖｅｙｏｒ（商標）ヌクレアーゼ酵素の存在（「Ｙ」）または非存在（「Ｎ」）も同様である。矢印は、推定される切断産物を示す。

【図6】図６は、ＨＥＫ２９３およびＣＨＯ−Ｋ１細胞におけるＧＦＰをコードする導入遺伝子の相同性指向性の標的化組み込みを示すグラフである。ＧＦＰ陽性である細胞のパーセンテージは、薄灰色（ＨＥＫ２９３細胞）または暗灰色（ＣＨＯ−Ｋ１細胞）で示されている。使用されたドナーの量は、各分類の下に示されている。

【図7】図７は、ＣＨＯ Ｋ１クローンからの接合点ＰＣＲ産物の部分ＤＮＡ配列を示し、インビボ切断されたドナーがＡＡＶＳ１遺伝子座内に組み込まれた。染色体配列は標準文字で示され、ドナー配列は斜体で示されている。ＺＦＮ結合部位は下線が引かれ、太字で示されている。微小相同性は灰色で網掛けされている。推定されるＡＢ方向の対立遺伝子配列は、ＡＢ群の上の段に示され、５’オーバーハングの完全な連結として定義され；推定されるＢＡ方向の対立遺伝子配列は、ＢＡ群の上の段に示され、５’オーバーハングの除去に続く連結として定義される。配列識別子が図中に示されている。

【図8A】図８（パネルＡ〜Ｃ）は、ＡＡＶＳ１（図８Ａ）、ＣＣＲ５（図８Ｂ）、ＧＳ（図８Ｃ）、およびＩＬ２Ｒγ（図８Ｃ）における導入遺伝子組み込みを有するＣＨＯ Ｋ１細胞プールからの接合点ＰＣＲアッセイのＤＮＡ配列を示す。染色体配列は、標準文字で示され、ドナー配列は斜体で示されている。ＺＦＮ結合部位は下線が引かれ、太字で示されている。推定される対立遺伝子配列は上記のように示され、また図７に関して上で定義された通りである。２回以上単離された同一の配列が示され、配列識別子が図中に示されている。

【図8B】図８（パネルＡ〜Ｃ）は、ＡＡＶＳ１（図８Ａ）、ＣＣＲ５（図８Ｂ）、ＧＳ（図８Ｃ）、およびＩＬ２Ｒγ（図８Ｃ）における導入遺伝子組み込みを有するＣＨＯ Ｋ１細胞プールからの接合点ＰＣＲアッセイのＤＮＡ配列を示す。染色体配列は、標準文字で示され、ドナー配列は斜体で示されている。ＺＦＮ結合部位は下線が引かれ、太字で示されている。推定される対立遺伝子配列は上記のように示され、また図７に関して上で定義された通りである。２回以上単離された同一の配列が示され、配列識別子が図中に示されている。

【図8C】図８（パネルＡ〜Ｃ）は、ＡＡＶＳ１（図８Ａ）、ＣＣＲ５（図８Ｂ）、ＧＳ（図８Ｃ）、およびＩＬ２Ｒγ（図８Ｃ）における導入遺伝子組み込みを有するＣＨＯ Ｋ１細胞プールからの接合点ＰＣＲアッセイのＤＮＡ配列を示す。染色体配列は、標準文字で示され、ドナー配列は斜体で示されている。ＺＦＮ結合部位は下線が引かれ、太字で示されている。推定される対立遺伝子配列は上記のように示され、また図７に関して上で定義された通りである。２回以上単離された同一の配列が示され、配列識別子が図中に示されている。

【図9】図９は、ＧＳ単一細胞由来クローンからの接合点ＰＣＲのＤＮＡ配列を示す。染色体配列は標準文字で示され、ドナー配列は斜体で示されている。ＺＦＮ結合部位は下線が引かれ、太字で示されている。推定されるＡＢ方向の対立遺伝子は、５’オーバーハングの完全な連結として定義され、推定されるＢＡ方向の対立遺伝子は、５’オーバーハングの除去に続く連結として定義される。配列識別子が図中に示されている。

【図10A】（パネルＡおよびＢ）ＦＵＴ８における組み込みを有する単一細胞由来クローンからの接合点ＰＣＲのＤＮＡ配列を示す。染色体配列は標準文字で示され、ドナー配列は斜体で示されている。図１０Ａは、ＦＵＴ８標的化ＺＦＮによる切断後の組み込みを示す（ＺＦＮ結合部位は下線が引かれ、太字で示されている）。

【図10B】（パネルＡおよびＢ）ＦＵＴ８における組み込みを有する単一細胞由来クローンからの接合点ＰＣＲのＤＮＡ配列を示す。染色体配列は標準文字で示され、ドナー配列は斜体で示されている。図１０Ｂは、ＦＵＴ８標的化ＴＡＬＥＮによる切断後の組み込みを示す（ＴＡＬＥＮ結合部位は下線が引かれ、太字で示されている）。配列識別子が図中に示されている。

【図11】図１１は、ｐＤＡＢ１０９３５０のプラスミドマップを示す。

【図12】図１２は、ｐＤＡＢ１０９３６０のプラスミドマップを示す。

【図13】図１３は、ｐＤＡＳ０００１５３のプラスミドマップを示す。

【図14】図１４は、ｐＤＡＳ０００１５０のプラスミドマップを示す。

【図15】図１５は、ｐＤＡＳ０００１４３のプラスミドマップを示す。

【図16】図１６は、ｐＤＡＳ０００１６４のプラスミドマップを示す。

【図17】図１７は、ｐＤＡＳ０００４３３のプラスミドマップを示す。

【図18】図１８は、ｐＤＡＳ０００４３４のプラスミドマップを示す。

【図19A】（パネルＡおよびＢ）ＺＦＮ媒介ＮＨＥＪ指向性ＤＮＡ修復を使用したコムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ）の小麦ゲノムにおける内因性ＡＨＡＳ遺伝子座での外因性マーカー不含逐次的導入遺伝子スタッキングを示す。図１９Ａは、第１の導入遺伝子スタックを示し、図１９Ｂは、第２の導入遺伝子スタックを示す。

【図19B】（パネルＡおよびＢ）ＺＦＮ媒介ＮＨＥＪ指向性ＤＮＡ修復を使用したコムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ）の小麦ゲノムにおける内因性ＡＨＡＳ遺伝子座での外因性マーカー不含逐次的導入遺伝子スタッキングを示す。図１９Ａは、第１の導入遺伝子スタックを示し、図１９Ｂは、第２の導入遺伝子スタックを示す。

【図20A】（パネルＡおよびＢ）ＺＦＮ媒介ＨＤＲ指向性ＤＮＡ修復を使用したコムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ）の小麦ゲノムにおける内因性ＡＨＡＳ遺伝子座での外因性マーカー不含逐次的導入遺伝子スタッキングを示す。図２０Ａは、第１の導入遺伝子スタックを示し、図２０Ｂは、第２の導入遺伝子スタックを示す。

【図20B】（パネルＡおよびＢ）ＺＦＮ媒介ＨＤＲ指向性ＤＮＡ修復を使用したコムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ）の小麦ゲノムにおける内因性ＡＨＡＳ遺伝子座での外因性マーカー不含逐次的導入遺伝子スタッキングを示す。図２０Ａは、第１の導入遺伝子スタックを示し、図２０Ｂは、第２の導入遺伝子スタックを示す。

【図21】図２１は、ｐＤＡＳ０００４３５のプラスミドマップを示す。

【図22】図２２は、ｐＤＡＢ１０７８２７のプラスミドマップを示す。

【図23】図２３は、ｐＤＡＢ１０７８２８のプラスミドマップを示す。

【図24】図２４は、ｐＤＡＳ０００３４０のプラスミドマップを示す。

【図25】図２５は、ｐＤＡＳ０００３４１のプラスミドマップを示す。

【図26】図２６は、ｐＤＡＳ０００３４２のプラスミドマップを示す。

【図27】図２７は、ｐＤＡＳ０００３４３のプラスミドマップを示す。

【図28-1】（パネルＡおよびＢ）プライマーの場所、ならびにＦａｄ３Ｃの開始および停止コドンに対するそれらの位置を示す。図２８Ａは、野生型Ｆａｄ３Ｃ遺伝子座のプライマー部位の場所を示す。図２８Ｂは、ドナー組み込みを確認するためにプライマー部位の場所を示し、またドナーがＦａｄ３Ｃ遺伝子座内に組み込み得る可能な方向を示す。

【図28-2】（パネルＡおよびＢ）プライマーの場所、ならびにＦａｄ３Ｃの開始および停止コドンに対するそれらの位置を示す。図２８Ａは、野生型Ｆａｄ３Ｃ遺伝子座のプライマー部位の場所を示す。図２８Ｂは、ドナー組み込みを確認するためにプライマー部位の場所を示し、またドナーがＦａｄ３Ｃ遺伝子座内に組み込み得る可能な方向を示す。

【図29A】（パネルＡおよびＢ）様々な標的化組み込みの配列アライメントを示す。図２９Ａは、ＺＦＮ ２８０５１−２Ａ−２８０５２により認識される２本鎖切断におけるｐＤＡＳ０００３４１のｔＧＦＰカセットのＦａｄ３Ｃとの接合点から増幅された配列アライメントを示す。示される配列は、上から下に向かって配列番号：４８０から４９３である。「：」は、切断部位に位置する欠失を示す。

【図29B】（パネルＡおよびＢ）様々な標的化組み込みの配列アライメントを示す。図２９Ｂは、ＺＦＮ ２８０５１−２Ａ−２８０５２およびＺＦＮ ２８０５３−２Ａ−２８０５４により認識される２本鎖切断におけるｐＤＡＳ０００３４３のｔＧＦＰカセットのＦａｄ３Ｃとの接合点から増幅された配列アライメントを示す。「：」は、切断部位に位置する欠失を示す。示される配列は、上から下に向かって配列番号：４９４から５０７である。

【図30】（パネルＡおよびＢ） ＺＦＮ ２８０５１−２Ａ−２８０５２により認識される２本鎖切断におけるｐＤＡＳ０００３４０のｈｐｈカセットのＦＡＤ３Ｃとの接合点から増幅された配列アライメントを示す。「：」は、切断部位に位置する欠失を示す。示される配列は、上から下に向かって 配列番号：５０８から５２３である。図３０Ａは、５’接合点に対する配列を示し、図３０Ｂに示される配列は、３’接合点に対するものである。

【図31】（パネルＡおよびＢ） ＺＦＮ ２８０５１−２Ａ−２８０５２および２８０５３−２Ａ−２８０５４により認識される２本鎖切断におけるｐＤＡＳ０００３４のｈｐｈカセットのＦＡＤ３Ｃとの接合点から増幅された配列アライメントを示す。「：」は、切断部位に位置する欠失を示す。示される配列は、上から下に向かって配列番号：５２４から５３２である。図３１Ａに示される配列は、５’接合点に対するものであり、図３１Ｂに示される配列は、３’接合点に対するものである。

【図32】図３２は、Ｃｏｒｎ Ｅｖｅｎｔ ＤＡＳ−５９１３２におけるトランスジェニック挿入物のゲノム遺伝子座に結合するように設計されたＺＦＮの関係を示す。酵母アッセイから６つのＺＦＮ（Ｅ３２ ＺＦＮ１−６）が同定され、４つのＺＦＮを植物における評価に進めた。

【図33】図３３は、ｐＤＡＢ１０５９０６のプラスミドマップを示す。

【図34】図３４は、ｐＤＡＢ１１１８０９のプラスミドマップを示す。

【図35】図３５は、ｐＤＡＢ１００６５５のプラスミドマップを示す。

【図36】図３６は、植物において一時的に発現したＺＦＮの評価を示すグラフを示す。４つのＺＦＮを、ＩＰＰＫ２遺伝子に指向したＺＦＮおよび内部対照ＺＦＮを一時的に発現させることにより、トウモロコシカルスにおいて評価した。ＺＦＮ切断部位の周囲の領域からのＰＣＲ増幅断片の次世代配列決定後に、配列決定されたＰＣＲ増幅断片を、インデルから得られた配列改変体の存在に関してスコア化した。ＩＰＰＫ２ ＺＦＮ活性と比較した、４つのＥ３２ ＺＦＮ対のそれぞれからのインデルの相対的頻度が示されている。２５７１６（’７１６）および２５７１７（’７１７）ジンクフィンガー結合ドメインを含有するＥｖｅｎｔ ３２ ＺＦＮ６は、対照ＩＰＰＫ２ジンクフィンガーヌクレアーゼの３８０倍の効率で、トランスジェニックＣｏｒｎ Ｅｖｅｎｔ ＤＡＳ−５９１３２のゲノム遺伝子座を切断した。

【図37】図３７は、Ｃｏｒｎ Ｅｖｅｎｔ ＤＡＳ−５９１３２のＺＦＮ遺伝子座妨害のグラフを示す。

【図38】図３８は、トウモロコシゲノムのＥＬＰ内へのドナー組み込みのために使用された実験系を示す概略図である。

【図39】図３９は、ｅＺＦＮによるゲノム標的ＤＮＡの切断を示すグラフである。示されるように、各処理群（それぞれ６つの反復実験試料）からＤＮＡを単離した。ＴＡＱＭＡＮ（商標）アッセイを使用して、標的ＤＮＡの切断を測定した。ｅＺＦＮの切断活性は、ドナー ＤＮＡのみの処理と比べたものである。ｅＺＦＮ（ｅＺＦＮ１およびｅＺＦＮ３）レベルは、ドナーＤＮＡに対して１：１または１：１０の比であった。統計的分類は、小文字で示されている。

【図40】図４０は、トウモロコシゲノムのＥＬＰ遺伝子座内のプライマー結合部位を示す。

【図41】図４１は、複製数評価のためのｐＤＡＢ１００６５１断片のプライマー結合部位を示す。

【図42】図４２は、ｅＺＦＮの切断活性が、ドナーＤＮＡのみの処理と比べたものであることを示す。ｅＺＦＮ（ｅＺＦＮ１およびＺＦＮ３）切断レベルは、ドナーＤＮＡに対して１：１または１：１０の比であった。統計的分類は、小文字で示されている。

【図43】（パネルＡおよびＢ）イン−アウトＰＣＲ反応からの接合点配列を示す。左および右の配列は、それぞれＡＡＤ１およびＥＬＰの部分配列である。ｅＺＦＮ結合部位を修復する挿入から推定される配列は、青色フォントで示されている。ｅＺＦＮ結合部位は、緑色ハイライトであり、欠失は黒色のバーである。順方向（図４３Ａ）および逆方向（図４３Ｂ）に対する配列が示されている。配列は、それらがクローン化されたＰＣＲ反応に従うブロック内にある。

【発明を実施するための形態】

【0019】

導入遺伝子のヌクレアーゼ媒介相同性非依存性（例えばＮＨＥＪ捕捉）標的化組み込みのための組成物および方法が、本明細書に開示される。オリゴヌクレオチドの挿入は、ＤＮＡの適合する５’オーバーハングとの単純な共トランスフェクションにより行うことができるが、ここで、導入遺伝子サイズ断片（例えば＞０．５ｋｂ）のＮＨＥＪ捕捉が、染色体の切断に加えてドナープラスミドのインビボヌクレアーゼ媒介切断により大きく促進されることが示された。このようにして、より大きいサイズ（例えば１ｋｂから１４ｋｂの間またはそれ以上の長さ）の導入遺伝子が、標的化された様式で、ＨＤＲベースの組み込みに抵抗する生物および細胞株、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞内に組み込まれ得る。例えば、インビボドナー切断は、さもなければ大型ＤＮＡ配列の標的化挿入に抵抗する細胞型である非選択的ＣＨＯ細胞において、高頻度（６％）での標的化組み込みを可能とした。

【0020】

本明細書に記載の染色体および導入遺伝子含有２本鎖ドナーの同時切断は、選択された宿主細胞における任意の内因性標的遺伝子座内への組み込みの成功をもたらす。本明細書に記載の方法および組成物は、事前に切断されたドナーの単純な共トランスフェクションにより一般には達成不可能である、効率的な非相同性主導的標的化組み込みを可能にする。

【0021】

したがって、本明細書に記載の組成物および方法は、ＺＦＮおよび／またはＴＡＬＥＮ等の操作されたヌクレアーゼにより形成される欠失を含むヌクレアーゼ切断部位内への、大型導入遺伝子の相同性非依存性標的化組み込みを可能にする。代替として、導入遺伝子部分がヌクレアーゼ切断後に解放され、標的化された場所で効率的に組み込まれるように、組み込まれる導入遺伝子に隣接するヌクレアーゼ部位を有するドナープラスミドが使用され得る。さらに、細菌または酵母人工染色体等の大型ドナー分子のヌクレアーゼ媒介インビボ切断を可能にする本発明の方法および組成物の使用により、哺乳動物および植物細胞における大型導入遺伝子の標的化組み込みが可能となる。最後に、説明されるインビボ切断組成物および方法は、他の生物および細胞、特に相同性指向性ＤＮＡ修復を良好には実行しないものの標的化された遺伝子組み換えにおける使用が見出される。

【0022】

概要
本明細書に開示される方法の実践ならびに組成物の調製および使用は、別途指定されない限り、分子生物学、生化学、クロマチン構造および分析、計算化学、細胞培養、組換えＤＮＡ、ならびに当該分野の技術の範囲内である関連分野における従来の技術を用いる。これらの技術は、文献に完全に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ． ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，Ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９および第３版２００１、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８７および定期改訂版、ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹシリーズ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｗｏｌｆｆｅ，ＣＨＲＯＭＡＴＩＮ ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ ＡＮＤ ＦＵＮＣＴＩＯＮ，Ｔｈｉｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，１９９８、ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ，Ｖｏｌ．３０４，“Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ”（Ｐ．Ｍ．Ｗａｓｓａｒｍａｎ ａｎｄ Ａ．Ｐ．Ｗｏｌｆｆｅ，ｅｄｓ．），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，１９９９、ならびにＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｖｏｌ．１１９，“Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ”（Ｐ．Ｂ．Ｂｅｃｋｅｒ，ｅｄ．）Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，１９９９を参照されたい。

【0023】

定義
「核酸」、「ポリヌクレオチド」、および「オリゴヌクレオチド」という用語は、同義に使用され、線状または環状構造であり、かつ一本鎖または２本鎖形態のいずれかである、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドポリマーを指す。本開示の目的のために、これらの用語は、ポリマーの長さに関して限定的であると解釈されるべきではない。この用語は、天然ヌクレオチドの既知の類似体、ならびに塩基部分、糖部分および／またはリン酸部分において修飾されるヌクレオチド（例えば、ホスホロチオエート骨格）を包含することができる。一般に、特定のヌクレオチドの類似体は、同じ塩基対形成特異性を有し、すなわち、Ａの類似体は、Ｔと塩基対形成する。

【0024】

「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基のポリマーを指すために交換可能に使用される。この用語はまた、１つ以上のアミノ酸が、対応する天然型アミノ酸の化学的類似体または修飾誘導体である、アミノ酸ポリマーにも適用される。

【0025】

「結合」は、高分子間（例えば、タンパク質と核酸との間）の配列特異的で非共有結合的な相互作用を指す。相互作用が全体として配列特異的である限り、結合相互作用の全ての構成要素が配列特異的である必要はない（例えば、ＤＮＡ骨格内のリン酸残基との接触）。かかる相互作用は、一般に、１０^−６Ｍ^−１以下の解離定数（Ｋ_ｄ）によって特徴付けられる。「親和性」は、結合の強度を指し、すなわち、結合親和性の増加は、Ｋ_ｄの低下と相関している。

【0026】

「結合タンパク質」は、別の分子に非共有結合的に結合することができるタンパク質である。結合タンパク質は、例えば、ＤＮＡ分子（ＤＮＡ結合タンパク質）、ＲＮＡ分子（ＲＮＡ結合タンパク質）、および／またはタンパク質分子（タンパク質結合タンパク質）に結合することができる。タンパク質結合タンパク質の場合、それは、それ自体に結合する（そしてホモ二量体、ホモ三量体等を形成する）ことができ、かつ／または、それは、異なるタンパク質（単数または複数）の１つ以上の分子に結合することができる。結合タンパク質は、１つより多くの種類の結合活性を有することができる。例えば、ジンクフィンガータンパク質は、ＤＮＡ結合活性、ＲＮＡ結合活性、およびタンパク質結合活性を有する。

【0027】

「ジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質」（または結合ドメイン）は、亜鉛イオンの配位によってその構造が安定化される結合ドメイン内のアミノ酸配列の領域である１つ以上のジンクフィンガーを通じて配列特異的な様態でＤＮＡに結合する、タンパク質またはより大きなタンパク質内のドメインである。ジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質という用語は、しばしば、ジンクフィンガータンパク質またはＺＦＰと省略される。

【0028】

「ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン」または「ＴＡＬＥ」は、１つ以上のＴＡＬＥ反復ドメイン／単位を含むポリペプチドである。反復ドメインは、ＴＡＬＥの、その同族の標的ＤＮＡ配列への結合に関与する。単一の「反復単位」（「反復」とも称される）は、典型的には３３〜３５アミノ酸長であり、天然型ＴＡＬＥタンパク質内の他のＴＡＬＥ反復配列との少なくともある程度の配列相同性を示す。例えば、米国特許公開第２０１１０３０１０７３号を参照されたく、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0029】

ジンクフィンガーおよびＴＡＬＥ結合ドメインは、例えば、天然型ジンクフィンガーの認識へリックス領域の操作（１つ以上のアミノ酸の改変）を介して、所定のヌクレオチド配列に結合するように「操作」することができる。同様に、ＴＡＬＥは、例えば、ＤＮＡ結合に関与するアミノ酸（反復可変二残基またはＲＶＤ領域）の操作によって、所定のヌクレオチド配列に結合するように「操作」することができる。したがって、操作されたＤＮＡ結合タンパク質（ジンクフィンガーまたはＴＡＬＥ）は、非天然型タンパク質である。ＤＮＡ結合タンパク質を操作するための方法の非限定的な例は、設計および選択である。設計されたＤＮＡ結合タンパク質は、その設計／組成が主として合理的基準によってもたらされる、天然には生じないタンパク質である。設計のための合理的基準は、置換規則の適用、ならびに既存のＺＦＰおよび／またはＴＡＬＥ設計および結合データの情報を格納するデータベース内の情報を処理するためのコンピュータアルゴリズムの適用を含む。例えば、米国特許第６，１４０，０８１号、同第６，４５３，２４２号、および同第６，５３４，２６１号を参照されたく、国際公開第ＷＯ９８／５３０５８号、同第ＷＯ９８／５３０５９号、同第ＷＯ９８／５３０６０号、同第ＷＯ０２／０１６５３６号、および同第ＷＯ０３／０１６４９６号、ならびに米国公開第２０１１０３０１０７３号、同第２０１１０２３９３１５号、および同第２０１１９１４５９４０号も参照されたい。

【0030】

「選択された」ジンクフィンガータンパク質またはＴＡＬＥは、その産生が、主としてファージディスプレイ、相互作用トラップ、またはハイブリッド選択等の実験的プロセスからもたらされる、天然には見出されないタンパク質である。例えば、米国特許第５，７８９，５３８号、同第５，９２５，５２３号、同第６，００７，９８８号、同第６，０１３，４５３号、同第６，２００，７５９号、国際公開第ＷＯ９５／１９４３１号、同第 ＷＯ９６／０６１６６号、同第ＷＯ９８／５３０５７号、同第ＷＯ９８／５４３１１号、同第 ＷＯ００／２７８７８号、同第ＷＯ０１／６０９７０号、同第ＷＯ０１／８８１９７号、および同第ＷＯ０２／０９９０８４号、ならびに米国特許公開第２０１１０３０１０７３号、同第２０１１０２３９３１５号および同第２０１１９１４５９４０号を参照されたい。

【0031】

「組換え」は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）および相同組換えによるドナー捕捉を含むがこれらに限定されない、２つのポリヌクレオチド間における遺伝子情報の交換のプロセスを指す。本開示の目的のために、「相同組換え（ＨＲ）」は、例えば、相同性指向性の修復機構を介して細胞内の２本鎖切断の修復中に起こる、かかる交換の特殊な形態を指す。このプロセスは、ヌクレオチド配列相同性を必要とし、「標的」分子（すなわち、２本鎖切断を経験した分子）の鋳型修復のために「ドナー」分子を使用し、ドナーから標的への遺伝子情報の伝達をもたらすため、「非交差遺伝子変換」または「ショートトラクト遺伝子変換」として様々に知られている。いかなる理論にも拘束されることを望むものではないが、かかる伝達は、切断された標的とドナーとの間に形成するヘテロ二重鎖ＤＮＡのミスマッチ修正、および／または、標的の一部になる遺伝子情報を再合成するためにドナーが使用される「合成依存鎖アニーリング」、および／または関連プロセスに関与し得る。かかる特殊なＨＲは、しばしば、ドナーポリヌクレオチドの配列の一部または全てが標的ポリヌクレオチドに組み込まれるように、標的分子の配列の改変をもたらす。ＨＲ指向性組み込みにおいて、ドナー分子は、少なくとも５０〜１００塩基対の長さのゲノムに対する相同性の少なくとも２つの領域（「相同アーム」）を含有する。例えば、米国特許公開第２０１１０２８１３６１号を参照されたい。

【0032】

本開示の方法において、本明細書に記載される１つ以上の標的ヌクレアーゼは、既定の部位において標的配列（例えば、細胞クロマチン）に２本鎖切断を作製し、その切断領域内のヌクレオチド配列と相同性を有する「ドナー」ポリヌクレオチドを細胞に導入することができる。２本鎖切断の存在は、ドナー配列の組み込みを容易にすることが示されている。ドナー配列は、物理的に組み込まれてもよいか、または代替として、ドナーポリヌクレオチドは、相同組換えを介した切断の修復のための鋳型として使用され、その結果、ドナー内のヌクレオチド配列の全てまたは一部の細胞クロマチンへの導入をもたらす。故に、細胞クロマチン内の第１の配列は、改変することができ、特定の実施形態において、ドナーポリヌクレオチド内に存在する配列へと変換することができる。故に、「置換する」または「置換」という用語の使用は、あるヌクレオチド配列の、別のヌクレオチド配列による置換（すなわち、情報の意味における配列の置換）を表すと理解することができ、あるポリヌクレオチドの、別のポリヌクレオチドによる物理的または化学的置換は必ずしも必要ではない。

【0033】

本明細書に記載される方法のいずれにおいても、細胞内のさらなる標的部位のさらなる２本鎖切断のために、ジンクフィンガータンパク質またはＴＡＬＥＮのさらなる対が使用され得る。

【0034】

本明細書に記載の方法のいずれも、任意のサイズのドナーの挿入、および／または目的遺伝子（複数可）の発現を妨害するドナー配列の標的化組み込みによる、細胞内の１つ以上の標的配列の部分的もしくは完全な不活性化に使用され得る。部分的または完全に不活性化された遺伝子を含む細胞株もまた提供される。

【0035】

さらに、本明細書に記載される標的化組み込みの方法を使用して、１つ以上の外因性配列を組み込むこともできる。外因性核酸配列は、例えば、１つ以上の遺伝子もしくはｃＤＮＡ分子、または任意の種類のコードもしくは非コード配列、ならびに１つ以上の調節要素（例えば、プロモーター）を含むことができる。加えて、外因性核酸配列（導入遺伝子）は、１つ以上のＲＮＡ分子（例えば、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、阻害性ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）等）を産生し得る。

【0036】

「切断」は、ＤＮＡ分子の共有結合骨格の破壊を指す。切断は、ホスホジエステル結合の酵素加水分解または化学的加水分解を含むが、これらに限定されない、多様な方法によって開始することができる。一本鎖切断も２本鎖切断もいずれも可能であり、２本鎖切断は、２つのはっきりと異なる一本鎖切断イベントの結果として生じ得る。ＤＮＡ切断は、平滑末端または付着末端のいずれかの生成をもたらし得る。ある特定の実施形態において、融合ポリペプチドが、標的とする２本鎖ＤＮＡ切断に使用される。

【0037】

「切断ハーフドメイン」は、第２のポリペプチド（同一または異なる）と組み合わさって、切断活性（好ましくは、２本鎖切断活性）を有する複合体を形成するポリペプチド配列である。「第１および第２の切断ハーフドメイン」、「＋および−切断ハーフドメイン」、ならびに「右および左切断ハーフドメイン」という用語は、二量体化する切断ハーフドメインの対を指すように交換可能に使用される。

【0038】

「操作された切断ハーフドメイン」は、別の切断ハーフドメイン（例えば、別の操作された切断ハーフドメイン）と共に偏性ヘテロ二量体を形成するように修飾された切断ハーフドメインである。また、米国特許公開第２００５／００６４４７４号、同第２００７０２１８５２８号および同第２００８／０１３１９６２号も参照されたく、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

【0039】

「配列」という用語は、任意の長さのヌクレオチド配列を指し、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得、線状、環状、または分岐状であり得、１本鎖または２本鎖のいずれでもあり得る。「ドナー配列」または「導入遺伝子」という用語は、ゲノムに挿入されるヌクレオチド配列を指す。ドナー配列は、任意の長さ、例えば、２〜１００，０００，０００ヌクレオチド長（またはその間のもしくはそれ以上の任意の整数値）、好ましくは、約１００〜１００，０００ヌクレオチド長（またはその間の任意の整数）、より好ましくは、約２０００〜６０，０００ヌクレオチド長（またはその間の任意の値）、さらにより好ましくは、約３〜１５ｋｂ（またはその間の任意の値）であり得る。

【0040】

「クロマチン」は、細胞ゲノムを含む核タンパク質構造である。細胞クロマチンは、核酸、主にＤＮＡ、ならびにヒストンおよび非ヒストン染色体タンパク質を含むタンパク質を含む。真核細胞クロマチンの大半は、ヌクレオソームの形態で存在し、ヌクレオソームコアは、ヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、およびＨ４をそれぞれ２つ含む八量体と会合した約１５０個の塩基対のＤＮＡを含み、（生物に応じて可変長の）リンカーＤＮＡは、ヌクレオソームコアの間に延在する。ヒストンＨ１の分子は、概して、リンカーＤＮＡと会合している。本開示の目的のために、「クロマチン」という用語は、すべての種類の細胞核タンパク質（原核および真核の両方）を包含するよう意図される。細胞クロマチンは、染色体クロマチンおよびエピソームクロマチンの両方を含む。

【0041】

「染色体」は、細胞のゲノムのすべてまたは一部を含むクロマチン複合体である。細胞のゲノムは、多くの場合、その核型を特徴とし、これは、この細胞のゲノムを含むすべての染色体の集合である。細胞のゲノムは、１つ以上の染色体を含み得る。

【0042】

「エピソーム」は、複製核酸、核タンパク質複合体、または細胞の染色体核型の一部ではない核酸を含む他の構造である。エピソームの例として、プラスミドおよびあるウイルスゲノムが挙げられる。

【0043】

「標的部位」または「標的配列」は、結合のための十分な条件が存在する場合に結合分子が結合する核酸の一部分を定義する核酸配列である。

【0044】

「外因性」分子は、通常は細胞内に存在しないが、１つ以上の遺伝学的方法、生化学的方法、または他の方法によって細胞内に導入することができる分子である。「通常は細胞に存在する」かは、細胞の特定の発達段階および環境条件に関して決定される。したがって、例えば、筋肉の胚発生の間だけ存在する分子は、成体筋細胞に対する外因性分子である。同様に、熱ショックによって誘導される分子は、熱ショックを受けていない細胞に対して外因性分子である。外因性分子は、例えば、機能不全型内因性分子の機能型、または正常機能型内因性分子の機能不全型を含むことができる。

【0045】

外因性分子は、とりわけ、小分子（コンビナトリアル化学プロセスによって生成されるもの等）、または高分子（タンパク質、核酸、炭水化物、脂質、糖タンパク質、リポタンパク質、多糖）、上記分子の任意の修飾誘導体、または上記分子のうちの１つ以上を含む任意の複合体等であってもよい。核酸は、ＤＮＡおよびＲＮＡを含み、１本鎖または２本鎖であり得、線状、分岐状、または環状であり得、任意の長さであり得る。核酸には、二重鎖を形成することができる核酸、ならびに三重鎖形成核酸が含まれる。例えば、米国特許第５，１７６，９９６号および同第５，４２２，２５１号を参照されたい。タンパク質には、ＤＮＡ結合タンパク質、転写因子、クロマチンリモデリング因子、メチル化ＤＮＡ結合タンパク質、ポリメラーゼ、メチラーゼ、デメチラーゼ、アセチラーゼ、デアセチラーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、インテグラーゼ、リコンビナーゼ、リガーゼ、トポイソメラーゼ、ジャイレース、およびヘリカーゼが含まれるが、これらに限定されない。

【0046】

外因性分子は、内因性分子と同じ種類の分子、例えば、外因性タンパク質または核酸であり得る。例えば、外因性核酸は、感染ウイルスゲノム、細胞内に導入されたプラスミドもしくはエピソーム、または通常は細胞内に存在しない染色体を含むことができる。細胞内に外因性分子を導入するための方法は、当業者に既知であり、脂質介在性導入（すなわち、中性脂質および陽イオン性脂質を含むリポソーム）、エレクトロポレーション、直接注入、細胞融合、微粒子銃、リン酸カルシウム共沈、ＤＥＡＥ−デキストラン介在性導入、およびウイルスベクター媒介性導入を含むが、これらに限定されない。外因性分子は、内因性分子と同じ種類の分子でもあり得るが、細胞が由来するものとは異なる種に由来し得る。例えば、ヒト核酸配列は、本来はマウスまたはハムスターに由来する細胞株に導入され得る。

【0047】

対照的に、「内因性」分子は、特定の環境条件下で特定の発達段階にある特定の細胞内に通常存在する分子である。例えば、内因性核酸は、染色体、ミトコンドリア、葉緑体、もしくは他の細胞小器官のゲノム、または天然型エピソーム核酸を含むことができる。さらなる内因性分子には、タンパク質、例えば、転写因子および酵素が含まれ得る。

【0048】

「融合」分子は、好ましくは共有結合的に、２つ以上のサブユニット分子が連結した分子である。サブユニット分子は、同じ化学型の分子であり得るか、または異なる化学型の分子であり得る。第１の型の融合分子の例としては、融合タンパク質（例えば、ＺＦＰまたはＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインと１つ以上の活性化ドメインとの間の融合物）および融合核酸（例えば、上記の融合タンパク質をコードする核酸）が挙げられるが、これらに限定されない。第２の型の融合分子の例としては、三重鎖形成核酸とポリペプチドとの間の融合物、および副溝結合剤と核酸との間の融合物が挙げられるが、これらに限定されない。

【0049】

細胞内の融合タンパク質の発現は、融合タンパク質の細胞への送達からもたらされ得るか、または融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドが細胞に送達され、そのポリヌクレオチドが転写され、その転写物が翻訳されて、融合タンパク質を生成することによってもたらされ得る。トランススプライシング、ポリペプチド切断、およびポリペプチド連結もまた、細胞内のタンパク質の発現に関与する可能性がある。ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの細胞への送達方法は、本開示の他の箇所に提示される。

【0050】

本開示の目的のために、「遺伝子」は、遺伝子産物（下記を参照されたい）をコードするＤＮＡ領域、および遺伝子産物の産生を制御する全てのＤＮＡ領域（かかる制御配列がコード配列および／または転写配列に隣接しているか否かに関わらず）を含む。したがって、遺伝子には、プロモーター配列、ターミネーター、翻訳制御配列（リボソーム結合部位および内部リボソーム進入部位等）、エンハンサー、サイレンサー、インスレーター、境界要素、複製起点、マトリックス付着部位、および遺伝子座調節領域が含まれるが、必ずしもこれらに限定されない。

【0051】

「遺伝子発現」は、遺伝子内に含まれる情報の遺伝子産物への変換を指す。遺伝子産物は、遺伝子の直接転写産物（例えば、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、構造ＲＮＡ、もしくは任意の他の種類のＲＮＡ）、またはｍＲＮＡの翻訳によって産生されるタンパク質であり得る。遺伝子産物にはまた、キャッピング、ポリアデニル化、メチル化、および編集等のプロセスによって修飾されたＲＮＡ、ならびに、例えば、メチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化、ＡＤＰリボシル化、ミリスチン化、およびグリコシル化によって修飾されたタンパク質も含まれる。

【0052】

遺伝子発現の「調節」は、遺伝子の活性における変化を指す。発現の調節には、遺伝子の活性化および遺伝子の抑制が含まれ得るが、これらに限定されない。ゲノム編集（例えば、切断、改変、不活性化、ランダム変異）を使用して発現を調節することができる。遺伝子の不活性化は、本明細書に記載されるＺＦＰを含まない細胞と比較した、遺伝子発現におけるいずれの低減も指す。故に、遺伝子の不活性化は、部分的または完全であり得る。

【0053】

「目的領域」は、細胞クロマチンの任意の領域であり、例えば、外因性分子に結合することが望ましい、遺伝子、または遺伝子内のもしくは遺伝子に隣接する非コード配列等である。結合は、標的化ＤＮＡ切断および／または標的化組換えの目的のためであり得る。目的領域は、例えば、染色体、エピソーム、細胞小器官のゲノム（例えば、ミトコンドリア、葉緑体）、または感染ウイルスゲノム内に存在し得る。目的領域は、遺伝子のコード領域内、転写された非コード領域（例えば、リーダー配列、トレーラー配列、もしくはイントロン等）内、またはコード領域の上流もしくは下流のいずれかの非転写領域内にあり得る。目的領域は、単一のヌクレオチド対ほど小さいか、または最大２，０００ヌクレオチド対長であるか、またはヌクレオチド対の任意の整数値であり得る。

【0054】

「真核」細胞には、真菌細胞（酵母等）、植物細胞、動物細胞、哺乳類細胞、およびヒト細胞（例えば、Ｔ細胞）が含まれるが、これらに限定されない。

【0055】

「作動的な連結」および「作動的に連結された」（または「作動可能に連結された」）という用語は、両方の構成要素が正常に機能し、構成要素のうちの少なくとも１つが、他の構成要素のうちの少なくとも１つに対して発揮される機能を媒介できる可能性を許容するように構成要素が配置された、２つ以上の構成要素（配列要素等）の並置を指して交換可能に使用される。例示説明として、転写制御配列が、１つ以上の転写制御因子の有無に応じてコード配列の転写レベルを調節する場合、プロモーター等の転写制御配列がコード配列に作動的に連結される。転写制御配列は、一般に、コード配列と共にシスに作動的に連結されるが、それに直接隣接する必要はない。例えば、エンハンサーは、たとえそれらが近接していない場合でも、コード配列に作動的に連結された転写制御配列である。

【0056】

融合ポリペプチドに関して、「作動的に連結された」という用語は、構成要素の各々が、そのように連結されていない場合に実行したであろう機能と同じ機能を、他の構成要素との連結において実行するという事実を指すことができる。例えば、ＺＦＰ、ＴＡＬＥまたはＣａｓ ＤＮＡ結合ドメインが活性化ドメインに融合された融合ポリペプチドに関して、融合ポリペプチドにおいて、ＺＦＰ、ＴＡＬＥまたはＣａｓ ＤＮＡ結合ドメイン部分が、その標的部位および／またはその結合部位に結合することができる一方で、活性化ドメインが遺伝子発現を上方制御することが可能である場合、ＺＦＰ、ＴＡＬＥまたはＣａｓ ＤＮＡ結合ドメインと活性化ドメインとは作動的に連結している。ＺＦＰ、ＴＡＬＥまたはＣａｓ ＤＮＡ結合ドメインが切断ドメインに融合された融合ポリペプチドの場合、融合ポリペプチドにおいて、ＺＦＰ、ＴＡＬＥまたはＣａｓ ＤＮＡ結合ドメイン部分が、その標的部位および／またはその結合部位に結合可能である一方で、切断ドメインが、標的部位の近傍でＤＮＡを切断可能である場合、ＺＦＰ、ＴＡＬＥまたはＣａｓ ＤＮＡ結合ドメインと切断ドメインとは作動的に連結している。

【0057】

タンパク質、ポリペプチド、または核酸の「機能的断片」は、その配列が、完全長のタンパク質、ポリペプチド、または核酸と同一ではないが、完全長のタンパク質、ポリペプチド、または核酸と同じ機能を保持するタンパク質、ポリペプチド、または核酸である。機能的断片は、対応する天然の分子よりも多いか、少ないか、もしくは同じ数の残基を有することができ、かつ／または、１つ以上のアミノ酸もしくはヌクレオチドの置換を含有することができる。核酸の機能（例えば、コード機能、別の核酸にハイブリダイズする能力）を決定するための方法は、当該技術分野において周知である。同様に、タンパク質の機能を決定するための方法も周知である。例えば、ポリペプチドのＤＮＡ結合機能は、例えば、フィルタ結合アッセイ、電気泳動移動度シフトアッセイ、または免疫沈降アッセイによって決定することができる。ＤＮＡ切断は、ゲル電気泳動によって評価することができる。上記のＡｕｓｕｂｅｌらを参照されたい。タンパク質が別のタンパク質と相互作用する能力は、例えば、免疫共沈降、ツーハイブリッドアッセイ、または相補性（遺伝子的相補性もしくは生化学的相補性の両方）によって決定することができる。例えば、Ｆｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４０：２４５−２４６、米国特許第５，５８５，２４５号、およびＰＣＴ国際公開第ＷＯ９８／４４３５０号を参照されたい。

【0058】

「ベクター」は、遺伝子配列を標的細胞に導入することが可能である。典型的には、「ベクター構築物」、「発現ベクター」、および「遺伝子導入ベクター」は、目的とする遺伝子の発現を誘導することができ、かつ遺伝子配列を標的細胞に導入し得る任意の核酸構築物を意味する。したがって、この用語は、クローニング、および発現ベヒクル、ならびに組み込みベクターを包含する。

【0059】

「レポーター遺伝子」または「レポーター配列」は、必ずしも必要でないが好ましくは通例のアッセイにおいて、容易に測定される、タンパク質産物を産生する任意の配列を指す。好適なレポーター遺伝子には、抗生物質耐性（例えばアンピシリン耐性、ネオマイシン耐性、Ｇ４１８耐性、ピューロマイシン耐性）を媒介するタンパク質をコードする配列、有色または蛍光または発光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質、高感度緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ）をコードする配列、ならびに向上した細胞成長および／または遺伝子増幅を媒介するタンパク質（例えば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ）が含まれるが、これらに限定されない。エピトープタグには、例えば、ＦＬＡＧ、Ｈｉｓ、ｍｙｃ、Ｔａｐ、ＨＡ、または任意の検出可能なアミノ酸配列の１つ以上のコピーが含まれる。「発現タグ」には、目的遺伝子の発現を監視するために所望の遺伝子配列に作動可能に連結され得るレポーターをコードする配列が含まれる。

【0060】

「セーフハーバー」遺伝子座は、遺伝子が宿主細胞に対するいかなる有害な効果もなしに挿入され得るゲノム内の遺伝子座である。挿入された遺伝子配列の発現が、隣接遺伝子からの任意のリードスルー（ｒｅａｄ−ｔｈｒｏｕｇｈ）発現により不安定化されないセーフハーバー遺伝子座が最も有益である。哺乳動物細胞におけるセーフハーバー遺伝子座の限定されない例は、ＡＡＶＳ１遺伝子（米国特許第８，１１０，３７９号を参照されたい）、ＣＣＲ５遺伝子（米国特許公開第２００８０１５９９９６号を参照されたい）、Ｒｏｓａ遺伝子座（国際公開第ＷＯ２０１０／０６５１２３号を参照されたい）、および／またはアルブミン遺伝子座（米国特許出願第１３／６２４，１９３号）である。植物細胞におけるセーフハーバー遺伝子座の限定されない例は、ＺＰ１５遺伝子座（米国特許第８，３２９，９８６号を参照）である。

【0061】

ヌクレアーゼ
導入遺伝子を有するドナー分子のインビボ切断に有用な組成物、特にヌクレアーゼ、および、導入遺伝子が標的化された様式でゲノム内に組み込まれるような細胞のゲノムの切断のためのヌクレアーゼが記載される。ある特定の実施形態において、ヌクレアーゼの１つ以上は、天然型である。他の実施形態において、ヌクレアーゼの１つ以上は、非天然型である、すなわち、ＤＮＡ結合ドメインおよび／または切断ドメインにおいて操作されている。例えば、天然型ヌクレアーゼのＤＮＡ結合ドメインは、選択された標的部位（例えば、同族の結合部位とは異なる部位に結合するように操作されたメガヌクレアーゼ）に結合するように改変され得る。他の実施形態において、ヌクレアーゼは、異種のＤＮＡ結合ドメインおよび切断ドメイン（例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬ−エフェクタードメインＤＮＡ結合タンパク質、異種の切断ドメインを有するメガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメイン）を含む。

【0062】

Ａ．ＤＮＡ結合ドメイン
ある特定の実施形態において、本明細書に記載の組成物および方法は、ドナー分子への結合および／または細胞のゲノム内の目的領域への結合に、メガヌクレアーゼ（ホーミングエンドヌクレアーゼ）ＤＮＡ結合ドメインを使用する。天然型メガヌクレアーゼは、１５〜４０個塩基対の切断部位を認識し、一般的に、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリー、ＧＩＹ−ＹＩＧファミリー、Ｈｉｓ−Ｃｙｓｔボックスファミリー、およびＨＮＨファミリーの４つのファミリーに分類される。例となるホーミングエンドヌクレアーゼには、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、ＰＩ−ＰｓｐＩ、ＰＩ−Ｓｃｅ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＰａｎＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩ、およびＩ−ＴｅｖＩＩＩが含まれる。これらの認識配列は既知である。また、米国特許第５，４２０，０３２号、米国特許第６，８３３，２５２号、Ｂｅｌｆｏｒｔ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３７９−３３８８、Ｄｕｊｏｎ ｅｔ ａｌ． （１９８９） Ｇｅｎｅ ８２：１１５−１１８、Ｐｅｒｌｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２， １１２５−１１２７、Ｊａｓｉｎ （１９９６） Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．１２：２２４−２２８、Ｇｉｍｂｌｅ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２６３：１６３−１８０、Ａｒｇａｓｔ ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２８０：３４５−３５３、およびＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓカタログを参照されたい。

【0063】

ある特定の実施形態において、本明細書に記載の方法および組成物は、操作された（非天然型）ホーミングエンドヌクレアーゼ（メガヌクレアーゼ）を含むヌクレアーゼを使用する。Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、ＰＩ−ＰｓｐＩ、ＰＩ−Ｓｃｅ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＰａｎＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩおよびＩ−ＴｅｖＩＩＩ等のホーミングエンドヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼの認識配列が知られている。また、米国特許第５，４２０，０３２号、米国特許第６，８３３，２５２号、Ｂｅｌｆｏｒｔ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３７９−３３８８、Ｄｕｊｏｎ ｅｔ ａｌ． （１９８９） Ｇｅｎｅ ８２：１１５−１１８、Ｐｅｒｌｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２， １１２５−１１２７、Ｊａｓｉｎ （１９９６） Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．１２：２２４−２２８、Ｇｉｍｂｌｅ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２６３：１６３−１８０、Ａｒｇａｓｔ ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２８０：３４５−３５３、およびＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓカタログを参照されたい。加えて、ホーミングエンドヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼのＤＮＡ結合特異性は、非天然の標的部位に結合するように操作することができる。例えば、Ｃｈｅｖａｌｉｅｒ ｅｔ ａｌ． （２００２） Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ １０：８９５−９０５、Ｅｐｉｎａｔ ｅｔ ａｌ． （２００３） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１：２９５２−２９６２、Ａｓｈｗｏｒｔｈ ｅｔ ａｌ． （２００６） Ｎａｔｕｒｅ ４４１：６５６−６５９、Ｐａｑｕｅｓ ｅｔ ａｌ． （２００７） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ７：４９−６６、米国特許公開第２００７０１１７１２８号を参照されたい。ホーミングエンドヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼのＤＮＡ結合ドメインは、全体としてのヌクレアーゼという文脈において改変され得るか（すなわち、ヌクレアーゼが同族の切断ドメインを含むように）、または異種の切断ドメインに融合され得る。

【0064】

他の実施形態において、本明細書に記載の方法および組成物において使用されるヌクレアーゼの１つ以上のＤＮＡ結合ドメインは、天然型または操作された（非天然型）ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインを含む。例えば、米国特許公開第２０１１０３０１０７３号を参照されたく、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。キサントモナス属の植物病原性細菌は、重要な作物に多くの病害を引き起こすことが知られている。キサントモナスの病原性は、植物細胞内に２５を超える異なるエフェクタータンパク質を注入する保存されたＩＩＩ型分泌（Ｔ３Ｓ）系に依存する。これらの注入されるタンパク質の中には、植物の転写活性化因子を模倣し、植物のトランスクリプトームを操作する転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクターがある（Ｋａｙ ｅｔ ａｌ （２００７） Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１８：６４８−６５１を参照されたい）。これらのタンパク質は、ＤＮＡ結合ドメインおよび転写活性化ドメインを含有する。最もよく特徴付けされたＴＡＬエフェクターの１つは、キサントモナス・カンペストリス病原型ベシカトリアに由来するＡｖｒＢｓ３である（Ｂｏｎａｓ ｅｔ ａｌ （１９８９） Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ ２１８： １２７−１３６および国際公開第ＷＯ２０１００７９４３０号を参照されたい）。ＴＡＬエフェクターは、縦列反復の集中ドメインを含有し、各反復が、これらのタンパク質のＤＮＡ結合特異性の要である約３４個のアミノ酸を含有する。加えて、これらは、核局在化配列および酸性転写活性化ドメインを含有する（概説についてはＳｃｈｏｒｎａｃｋ Ｓ， ｅｔ ａｌ （２００６） Ｊ Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ １６３（３）： ２５６−２７２を参照されたい）。加えて、植物病原性細菌である青枯病菌において、ｂｒｇ１１およびｈｐｘ１７と表記される２つの遺伝子が、青枯病菌の次亜種１系統ＧＭＩ１０００および次亜種４系統ＲＳ１０００において、キサントモナスのＡｖｒＢｓ３ファミリーと相同であることが見出されている（Ｈｅｕｅｒ ｅｔ ａｌ （２００７） Ａｐｐｌ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒ Ｍｉｃｒｏ ７３（１３）： ４３７９−４３８４を参照されたい）。これらの遺伝子は、ヌクレオチド配列において互いに９８．９％同一であるが、ｈｐｘ１７の反復ドメインにおいて１，５７５ｂｐの欠失分だけ異なる。しかしながら、両方の遺伝子産物が、キサントモナスのＡｖｒＢｓ３ファミリータンパク質と４０％未満の配列同一性を有する。例えば、米国特許公開第２０１１０２３９３１５号、同第２０１１０１４５９４０号および同第２０１１０３０１０７３号を参照されたく、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0065】

これらのＴＡＬエフェクターの特異性は、縦列反復に見出される配列に依存する。反復した配列は、およそ１０２ｂｐを含み、反復は、典型的に互いに９１〜１００％相同である（Ｂｏｎａｓ ｅｔ ａｌ，（同書））。反復の多型性は、通常、１２および１３位に位置し、１２および１３位の超可変二残基（ｄｉｒｅｓｉｄｕｅｓ）の正体と、ＴＡＬエフェクターの標的配列における連続したヌクレオチドの正体との間に１対１の対応関係が存在するように思われる（Ｍｏｓｃｏｕ ａｎｄ Ｂｏｇｄａｎｏｖｅ， （２００９） Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２６：１５０１およびＢｏｃｈ ｅｔ ａｌ （２００９） Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２６：１５０９−１５１２を参照されたい）。実験的に、１２および１３位のＨＤ配列がシトシン（Ｃ）への結合をもたらし、ＮＧがＴに、ＮＩがＡ、Ｃ、ＧまたはＴに結合し、ＮＮがＡまたはＧに結合し、ＩＮＧがＴに結合するように、これらのＴＡＬエフェクターのＤＮＡ認識のための天然コードが決定されている。これらのＤＮＡ結合反復を、新たな反復の組み合わせおよび数を用いてタンパク質へと組み立てて、新たな配列と相互作用し、植物細胞内の非内因性レポーター遺伝子の発現を活性化することが可能である人工転写因子を作製した（Ｂｏｃｈ ｅｔ ａｌ，（同書））。操作されたＴＡＬタンパク質を、ＦｏｋＩ切断ハーフドメインに連結して、酵母レポーターアッセイ（プラスミドベースの標的）において活性を示すＴＡＬエフェクタードメインヌクレアーゼ融合（ＴＡＬＥＮ）を得た。例えば、米国特許公開第２０１１０３０１０７３号、Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ ｅｔ ａｌ （（２０１０）＜ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｅｐｕｂ １０．１５３４／ｇｅｎｅｔｉｃｓ．１１０．１２０７１７）を参照されたい。

【0066】

他の実施形態において、ヌクレアーゼはＣＲＩＳＰＲ （クラスタ化された、等間隔にスペーサーが入った、短い回文型の反復（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ））／Ｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連（ＣＲＩＳＰＲ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ））ヌクレアーゼ系を含む系である。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓは、ゲノム操作に使用され得る細菌系に基づいて操作されたヌクレアーゼ系である。それは、多くの細菌および古細菌の適応的免疫応答の一部に基づく。ウイルスまたはプラスミドが細菌に侵入するとき、侵入体のＤＮＡのセグメントは、「免疫」応答によってＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）に変換される。このｃｒＲＮＡは次いで、部分的に相補的な領域を通じて、ｔｒａｃｒＲＮＡと呼ばれる別の種類のＲＮＡと会合して、Ｃａｓ９ヌクレアーゼを、「プロトスペーサー」と呼ばれる標的ＤＮＡにおけるｃｒＲＮＡと相同な領域に導く。Ｃａｓ９は、ＤＮＡを切断して、ｃｒＲＮＡ転写物内に含有される２０ヌクレオチドガイド配列によって指定される部位でＤＳＢの平滑末端を生成する。Ｃａｓ９は、部位特異的ＤＮＡ認識および切断のために、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡの両方を必要とする。この系は、今では、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡが１つの分子に組み合わされ得るように操作されており（「単一ガイドＲＮＡ」）、単一ガイドＲＮＡのｃｒＲＮＡに匹敵する部分は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼが任意の所望の配列を標的とするように導くように操作され得る（Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ （２０１２） Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３７， ｐ． ８１６−８２１、Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ， （２０１３）， ｅＬｉｆｅ ２：ｅ００４７１、およびＤａｖｉｄ Ｓｅｇａｌ， （２０１３） ｅＬｉｆｅ ２：ｅ００５６３を参照されたい）。故に、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、ゲノム内の所望の標的においてＤＳＢを作製するように操作することができ、ＤＳＢの修復は、修復阻害因子を使用して誤りがちな（ｅｒｒｏｒ ｐｒｏｎｅ）修復の増加を引き起こすことによって影響を受け得る。

【0067】

ある特定の実施形態において、細胞のゲノムのインビボ切断および／または標的化切断に使用されるヌクレアーゼの１つ以上のＤＮＡ結合ドメインは、ジンクフィンガータンパク質を含む。好ましくは、ジンクフィンガータンパク質は、選択の標的部位に結合するように操作されているという点で非天然型である。例えば、例えば、Ｂｅｅｒｌｉ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：１３５−１４１、Ｐａｂｏ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７０：３１３−３４０、Ｉｓａｌａｎ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９：６５６−６６０、Ｓｅｇａｌ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１２：６３２−６３７、Ｃｈｏｏ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１０：４１１−４１６、米国特許第６，４５３，２４２号、同第６，５３４，２６１号、同第６，５９９，６９２号、同第６，５０３，７１７号、同第６，６８９，５５８号、同第７，０３０，２１５号、同第６，７９４，１３６号、同第７，０６７，３１７号、同第７，２６２，０５４号、同第７，０７０，９３４号、同第７，３６１，６３５号、同第７，２５３，２７３号、および米国特許公開第２００５／００６４４７４号、同第２００７／０２１８５２８号、同第２００５／０２６７０６１号を参照されたく、全て参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

【0068】

操作されたジンクフィンガー結合ドメインは、天然型ジンクフィンガータンパク質と比較して新規の結合特異性を有することができる。操作方法は、合理的設計および種々の種類の選択を含むが、これらに限定されない。合理的設計は、例えば、トリプレット（またはカドラプレット）のヌクレオチド配列および個々のジンクフィンガーアミノ酸配列を含むデータベースを使用することを含み、各トリプレットまたはカドラプレットのヌクレオチド配列は、特定のトリプレットまたはカドラプレットの配列に結合するジンクフィンガーの１つ以上のアミノ酸配列と会合している。例えば、譲受人共通の米国特許第６，４５３，２４２号および同第６，５３４，２６１号を参照されたく、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

【0069】

ファージディスプレイおよびツーハイブリッド系を含む、例となる選択方法は、米国特許第５，７８９，５３８号、同第５，９２５，５２３号、同第６，００７，９８８号、同第６，０１３，４５３号、同第６，４１０，２４８号、同第６，１４０，４６６号、同第６，２００，７５９号、および同第６，２４２，５６８号、ならびに国際公開第ＷＯ９８／３７１８６号、同第ＷＯ９８／５３０５７号、同第ＷＯ００／２７８７８号、同第ＷＯ０１／８８１９７号、そして英国特許第ＧＢ２，３３８，２３７号に開示される。加えて、ジンクフィンガー結合ドメインに対する結合特異性の強化は、例えば、譲受人共通の国際公開第ＷＯ０２／０７７２２７号に記載されている。

【0070】

加えて、これらおよび他の参考文献に開示されるように、ジンクフィンガードメインおよび／またはマルチフィンガー型ジンクフィンガータンパク質は、例えば、５アミノ酸長以上のリンカーを含む、任意の好適なリンカー配列を使用して一緒に連結されてもよい。例示の６アミノ酸長以上のリンカー配列については、米国特許６，４７９，６２６号、同第６，９０３，１８５号、および同第７，１５３，９４９号も参照されたい。本明細書に記載されるタンパク質は、タンパク質の個々のジンクフィンガー間の好適なリンカーの任意の組み合わせを含んでもよい。

【0071】

標的部位の選択、ＺＦＰ、ならびに融合タンパク質（およびそれをコードするポリヌクレオチド）の設計および構築の方法は、当業者に知られており、米国特許第６，１４０，０８１号、同第５，７８９，５３８号、同第６，４５３，２４２号、同第６，５３４，２６１号、同第５，９２５，５２３号、同第６，００７，９８８号、同第６，０１３，４５３号、同第６，２００，７５９号、国際公開第ＷＯ９５／１９４３１号、同第ＷＯ９６／０６１６６号、同第ＷＯ９８／５３０５７号、同第ＷＯ９８／５４３１１号、同第ＷＯ００／２７８７８号、同第ＷＯ０１／６０９７０号、同第ＷＯ０１／８８１９７号、同第ＷＯ０２／０９９０８４号、同第ＷＯ９８／５３０５８号、同第ＷＯ９８／５３０５９号、同第ＷＯ９８／５３０６０号、同第ＷＯ０２／０１６５３６号、および同第ＷＯ０３／０１６４９６号に詳述される。

【0072】

加えて、これらおよび他の参考文献に開示されるように、ジンクフィンガードメインおよび／またはマルチフィンガー型ジンクフィンガータンパク質は、例えば、５アミノ酸長以上のリンカーを含む、任意の好適なリンカー配列を使用して一緒に連結されてもよい。例示の６アミノ酸長以上のリンカー配列については、米国特許６，４７９，６２６号、同第６，９０３，１８５号、および同第７，１５３，９４９号も参照されたい。本明細書に記載されるタンパク質は、タンパク質の個々のジンクフィンガー間の好適なリンカーの任意の組み合わせを含んでもよい。

【0073】

系のＲＮＡ構成要素をコードするＣＲＩＳＰＲ（クラスタ化された、等間隔にスペーサーが入った、短い回文型の反復）遺伝子座、およびタンパク質をコードするｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連）遺伝子座（Ｊａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．， ２００２．Ｍｏｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４３： １５６５−１５７５、Ｍａｋａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．， ２００２．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３０： ４８２−４９６、Ｍａｋａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．， ２００６．Ｂｉｏｌ． Ｄｉｒｅｃｔ １： ７、Ｈａｆｔ ｅｔ ａｌ．， ２００５．ＰＬｏＳ Ｃｏｍｐｕｔ．Ｂｉｏｌ． １： ｅ６０）は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ系の遺伝子配列を構成する。微生物宿主におけるＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）遺伝子、およびＣＲＩＳＰＲ媒介核酸切断の特異性をプログラムすることができる非コード化ＲＮＡ要素の組み合わせを含有する。

【0074】

ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲは、最もよく特徴付けされた系の１つであり、４つの逐次的ステップにおいて、標的化ＤＮＡ２本鎖切断を行う。第１に、２つの非コード化ＲＮＡ、ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡアレイおよびｔｒａｃｒＲＮＡが、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座から転写される。第２に、ｔｒａｃｒＲＮＡは、ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡの反復領域にハイブリダイズし、個々のスペーサー配列を含有する成熟ｃｒＲＮＡへのｐｒｅ−ｃｒＲＮＡのプロセシングを媒介する。第３に、成熟ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体は、ｃｒＲＮＡ上のスペーサーと、標的認識のための追加的な要件であるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の隣の標的ＤＮＡ上のプロトスペーサーとの間のワトソン−クリック塩基対形成を介して、Ｃａｓ９を標的ＤＮＡに導く。最後に、Ｃａｓ９は、標的ＤＮＡの切断を媒介し、プロトスペーサー内に２本鎖切断を形成する。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の活性は、（ｉ）「適応」と呼ばれるプロセスにおける、将来の攻撃を防止するための、外来ＤＮＡ配列のＣＲＩＳＰＲアレイへの挿入、（ｉｉ）関連タンパク質の発現、ならびにアレイの発現および処理、またそれに続く（ｉｉｉ）外来核酸へのＲＮＡ媒介干渉という３つのステップを含む。したがって、細菌細胞において、いわゆる「Ｃａｓ」タンパク質のいくつかが、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の自然の機能に関与し、外来ＤＮＡの挿入等の機能において役割を果たす。

【0075】

ある特定の実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、天然型Ｃａｓタンパク質の「機能性誘導体」であってもよい。天然配列ポリペプチドの「機能性誘導体」は、天然配列ポリペプチドと共通した定性的な生物学的特性を有する化合物である。「機能性誘導体」は、これらに限定されないが、天然配列の断片ならびに天然配列ポリペプチドおよびその断片の誘導体を含むが、但し、それらは対応する天然配列ポリペプチドと共通した生物活性を有する。本明細書において企図される生物活性は、ＤＮＡ基質を断片に加水分解する機能性誘導体の能力である。「誘導体」という用語は、ポリペプチドのアミノ酸配列改変体、共有結合修飾、およびその融合物を共に包含する。Ｃａｓポリペプチドまたはその断片の好適な誘導体は、変異体、融合体、Ｃａｓタンパク質の共有結合修飾、またはその断片を含むが、これらに限定されない。Ｃａｓタンパク質またはその断片、およびＣａｓタンパク質またはその断片の誘導体を含むＣａｓタンパク質は、細胞から得ることができる、または化学的に合成され得る、またはこれらの２つの手順の組み合わせにより得ることができる。細胞は、Ｃａｓタンパク質を自然に産生する細胞、またはＣａｓタンパク質を自然に産生し、内因性Ｃａｓタンパク質をより高い発現レベルで産生するように、もしくは外部から導入された核酸からＣａｓタンパク質を産生するように操作された細胞であってもよく、その核酸は、内因性Ｃａｓと同じまたは異なるＣａｓをコードする。いくつかの場合において、細胞は、Ｃａｓタンパク質を自然に産生せず、Ｃａｓタンパク質を産生するように遺伝子操作されている。

【0076】

したがって、ヌクレアーゼは、ドナー（導入遺伝子）を挿入することが望ましい任意の遺伝子における標的部位に特異的に結合するＤＮＡ結合ドメインを含む。

【0077】

Ｂ．切断ドメイン
任意の好適な切断ドメインをＤＮＡ結合ドメインに作動可能に連結して、ヌクレアーゼを形成することができる。例えば、ＺＦＰ ＤＮＡ結合ドメインをヌクレアーゼドメインに融合してＺＦＮが作製されており、これは、その操作された（ＺＦＰ）ＤＮＡ結合ドメインを通じてその意図される核酸標的を認識し、ヌクレアーゼ活性を介してＺＦＰ結合部位付近でのＤＮＡの切断を引き起こすことが可能である、機能的実体である。例えば、Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９３（３）：１１５６−１１６０を参照されたい。より最近では、多様な生物におけるゲノム修飾のためにＺＦＮが使用されている。例えば、米国特許公開第２００３０２３２４１０号、同第２００５０２０８４８９号、同第２００５００２６１５７号、同第２００５００６４４７４号、同第２００６０１８８９８７号、同第２００６００６３２３１号、および国際公開第ＷＯ０７／０１４２７５号を参照されたい。同様に、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインをヌクレアーゼドメインに融合して、ＴＡＬＥＮが作製されている。例えば、米国特許公開第２０１１０３０１０７３号を参照されたい。

【0078】

上述のように、切断ドメインは、ＤＮＡ結合ドメイン、例えば、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインおよびヌクレアーゼの切断ドメイン、またはＴＡＬＥＮ ＤＮＡ結合ドメインおよび切断ドメイン、またはメガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメインおよび異なるヌクレアーゼの切断ドメインに対して異種であり得る。異種切断ドメインは、任意のエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼから得られ得る。切断ドメインが由来し得る例となるエンドヌクレアーゼには、制限エンドヌクレアーゼおよびホーミングエンドヌクレアーゼが含まれるが、これらに限定されない。例えば、２００２−２００３ Ｃａｔａｌｏｇｕｅ，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ、およびＢｅｌｆｏｒｔ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３７９−３３８８を参照されたい。ＤＮＡを切断するさらなる酵素が知られている（例えば、Ｓ１ヌクレアーゼ、マングビーンヌクレアーゼ、膵臓ＤＮａｓｅ Ｉ、小球菌ヌクレアーゼ、酵母ＨＯエンドヌクレアーゼ；またＬｉｎｎ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．）Ｎｕｃｌｅａｓｅｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９３も参照されたい）。これらの酵素（またはそれらの機能的断片）のうちの１つ以上を、切断ドメインおよび切断ハーフドメインの源として使用することができる。

【0079】

同様に、上述のように、切断活性のために二量体化を必要とする切断ハーフドメインは、任意のヌクレアーゼまたはその一部に由来し得る。一般に、融合タンパク質が切断ハーフドメインを含む場合、切断のために２つの融合タンパク質が必要である。代替的に、２つの切断ハーフドメインを含む単一のタンパク質を使用することができる。２つの切断ハーフドメインは、同じエンドヌクレアーゼ（またはその機能的断片）に由来し得るか、または各切断ハーフドメインは、異なるエンドヌクレアーゼ（またはその機能的断片）に由来し得る。加えて、２つの融合タンパク質のそれぞれの標的部位への結合が、例えば、二量体化によって、切断ハーフドメインが機能的切断ドメインを形成することを可能にする互いの空間的配向に切断ハーフドメインを配置するように、２つの融合タンパク質のための標的部位は互いに対して好ましく配置される。故に、ある特定の実施形態において、標的部位の近接する端は、５〜８ヌクレオチドまたは１５〜１８ヌクレオチド分だけ離れている。しかしながら、任意の整数のヌクレオチドまたはヌクレオチド対が、２つの標的部位の間に介在し得る（例えば、２〜５０ヌクレオチド対またはそれよりも多い対）。一般に、切断部位は、標的部位の間に位置する。

【0080】

制限エンドヌクレアーゼ（制限酵素）は、多くの種に存在し、（認識部位で）ＤＮＡに配列特異的に結合すること、および結合部位またはその付近でＤＮＡを切断することが可能である。ある特定の制限酵素（例えば、ＩＩＳ型）は、認識部位から除去された部位でＤＮＡを切断し、分離可能な結合ドメインおよび切断ドメインを有する。例えば、ＩＩＳ型酵素ＦｏｋＩは、一方の鎖上ではその認識部位から９ヌクレオチドで、また他方の鎖上ではその認識部位から１３ヌクレオチドで、ＤＮＡの２本鎖切断を触媒する。例えば、米国特許第５，３５６，８０２号、同第５，４３６，１５０号、および同第５，４８７，９９４号、ならびにＬｉ ｅｔ ａｌ．（１９９２） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：４２７５−４２７９、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：２７６４−２７６８、Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．（１９９４ａ）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９１：８８３−８８７、Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．（１９９４ｂ）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：３１，９７８−３１，９８２を参照されたい。故に、一実施形態において、融合タンパク質は、少なくとも１つのＩＩＳ型制限酵素由来の切断ドメイン（または切断ハーフドメイン）、および操作されていることもされていないこともある１つ以上のジンクフィンガー結合ドメインを含む。

【0081】

切断ドメインが結合ドメインから分離可能である、例となるＩＩＳ型制限酵素は、ＦｏｋＩである。この特定の酵素は、二量体として活性である。Ｂｉｔｉｎａｉｔｅ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９５：１０，５７０−１０，５７５。したがって、本開示の目的のために、開示される融合タンパク質において使用されるＦｏｋＩ酵素の一部分は、切断ハーフドメインとみなされる。故に、ジンクフィンガー−ＦｏｋＩ融合物を使用した細胞配列の標的化２本鎖切断および／または標的化置換のために、各々がＦｏｋＩ切断ハーフドメインを含む２つの融合タンパク質を使用して、触媒的に活性な切断ドメインを再構成することができる。代替的に、ジンクフィンガー結合ドメインおよび２つのＦｏｋＩ切断ハーフドメインを含有する、単一のポリペプチド分子を使用することもできる。ジンクフィンガー−ＦｏｋＩ融合物を使用した標的化切断および標的化配列改変に対するパラメータは、本開示の他の箇所に提供される。

【0082】

切断ドメインまたは切断ハーフドメインは、切断活性を保持するか、または多量体化（例えば、二量体化）して機能的切断ドメインを形成する能力を保持する、タンパク質の任意の部分であり得る。

【0083】

例となるＩＩＳ型制限酵素は、国際公開第ＷＯ０７／０１４２７５号に記載され、その全体が本明細書に組み込まれる。さらなる制限酵素も、分離可能な結合ドメインおよび切断ドメインを含有し、これらは本開示によって企図される。例えば、Ｒｏｂｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１：４１８−４２０を参照されたい。

【0084】

ある特定の実施形態において、切断ドメインは、例えば、米国特許公開第２００５００６４４７４号、同第２００６０１８８９８７号、同第２００７０３０５３４６号および同第２００８０１３１９６２号（これらの全ての開示は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）に記載されるように、ホモ二量体化を最小限に抑えるかまたは防止する１つ以上の操作された切断ハーフドメイン（二量体化ドメイン変異体とも称される）を含む。ＦｏｋＩの４４６、４４７、４７９、４８３、４８４、４８６、４８７、４９０、４９１、４９６、４９８、４９９、５００、５３１、５３４、５３７、および５３８位のアミノ酸残基は、全て、ＦｏｋＩ切断ハーフドメインの二量体化に影響を及ぼすための標的である。

【0085】

偏性のヘテロ二量体を形成するＦｏｋＩの例となる操作された切断ハーフドメインには、第１の切断ハーフドメインがＦｏｋＩの４９０および５３８位のアミノ酸残基に変異を含み、第２の切断ハーフドメインが４８６および４９９位のアミノ酸残基に変異を含む対が含まれる。

【0086】

故に、一実施形態において、４９０における変異はＧｌｕ（Ｅ）をＬｙｓ（Ｋ）に置換し、５３８における変異はＩｓｏ（Ｉ）をＬｙｓ（Ｋ）に置換し、４８６における変異はＧｌｎ（Ｑ）をＧｌｕ（Ｅ）に置換し、４９９位における変異はＩｓｏ（Ｉ）をＬｙｓ（Ｋ）に置換する。具体的には、本明細書に記載される操作された切断ハーフドメインは、１つの切断ハーフドメインにおいて４９０位（Ｅ→Ｋ）および５３８位（Ｉ→Ｋ）を変異させ、「Ｅ４９０Ｋ：Ｉ５３８Ｋ」と表記される操作された切断ハーフドメインをもたらすことによって、また、別の切断ハーフドメインにおいて４８６位（Ｑ→Ｅ）および４９９位（Ｉ→Ｌ）を変異させ、「Ｑ４８６Ｅ：Ｉ４９９Ｌ」と表記される操作された切断ハーフドメインをもたらすことによって、調製された。本明細書に記載される操作された切断ハーフドメインは、異常な切断を最小限に抑えたまたは消滅させた偏性のヘテロ二量体変異体である。例えば、米国特許公開第２００８／０１３１９６２号を参照されたく、その開示は、参照によりその全体が全目的で組み込まれる。ある特定の実施形態において、操作された切断ハーフドメインは、４８６、４９９、および４９６位（野生型ＦｏｋＩに対して付番）に、変異、例えば、４８６位の野生型Ｇｌｎ（Ｑ）残基をＧｌｕ（Ｅ）残基に、４９９位の野生型Ｉｓｏ（Ｉ）残基をＬｅｕ（Ｌ）残基に、および４９６位の野生型Ａｓｎ（Ｎ）残基をＡｓｐ（Ｄ）またはＧｌｕ（Ｅ）残基（それぞれ、「ＥＬＤ」および「ＥＬＥ」ドメインとも称される）に置換する変異を含む。他の実施形態において、操作された切断ハーフドメインは、４９０、５３８、および５３７位（野生型ＦｏｋＩに対して番号付けられた）での変異、例えば、野生型Ｇｌｕ（Ｅ）残基を４９０位でＬｙｓ（Ｋ）残基に、野生型Ｉｓｏ（Ｉ）残基を５３８位でＬｙｓ（Ｋ）残基に、かつ野生型Ｈｉｓ（Ｈ）残基を５３７位でＬｙｓ（Ｋ）残基またはＡｒｇ（Ｒ）残基（それぞれ、「ＫＫＫ」および「ＫＫＲ」ドメインとも称される）に置換する変異を含む。他の実施形態では、操作された切断ハーフドメインは、４９０および５３７位（野生型ＦｏｋＩに対する番号付け）での変異、例えば、野生型Ｇｌｕ（Ｅ）残基を４９０位でＬｙｓ（Ｋ）残基に、かつ野生型Ｈｉｓ（Ｈ）残基を５３７位でＬｙｓ（Ｋ）残基またはＡｒｇ（Ｒ）残基（それぞれ、「ＫＩＫ」および「ＫＩＲ」ドメインとも称される）に置換する変異を含む（米国特許公開第２０１１０２０１０５５号を参照されたい）。他の実施形態において、操作された切断ハーフドメインは、「Ｓｈａｒｋｅｙ」および／または「Ｓｈａｒｋｅｙ’」変異を含む（Ｇｕｏ ｅｔ ａｌ， （２０１０） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４００（１）：９６−１０７を参照されたい）。

【0087】

本明細書に記載される操作された切断ハーフドメインは、任意の好適な方法を使用して、例えば、米国特許公開第２００５００６４４７４号、同第２００８０１３１９６２号、および同第２０１１０２０１０５５号に記載されるように野生型切断ハーフドメイン（ＦｏｋＩ）の部位特異的な変異誘発によって、調製することができる。

【0088】

代替的に、ヌクレアーゼは、いわゆる「スプリット酵素」技術を使用して、核酸標的部位においてインビボで組み立てられてもよい（例えば、米国特許公開第２００９００６８１６４号を参照されたい）。かかるスプリット酵素の構成要素は、別個の発現構築物上で発現されてもよく、または、１つのオープンリーディングフレーム内に連結させることができ、個々の構成要素は、例えば、自己切断２ＡペプチドまたはＩＲＥＳ配列によって分離される。構成要素は、個々のジンクフィンガー結合ドメインであり得るか、またはメガヌクレアーゼ核酸結合ドメインのドメインであり得る。

【0089】

ヌクレアーゼは、例えば、国際公開第ＷＯ２００９／０４２１６３号および同第２００９００６８１６４号に記載の酵母ベースの染色体系において、使用前に活性化についてスクリーニングすることができる。ヌクレアーゼ発現構築物は、当該技術分野で既知の方法を使用して容易に設計することができる。例えば、米国特許公開第２００３０２３２４１０号、同第２００５０２０８４８９号、同第２００５００２６１５７号、同第２００５００６４４７４号、同第２００６０１８８９８７号、同第２００６００６３２３１号、および国際公開第ＷＯ０７／０１４２７５号を参照されたい。ヌクレアーゼの発現は、構成的プロモーターまたは誘導的プロモーター、例えば、ラフィノースおよび／またはガラクトースの存在下で活性化（抑制解除）され、グルコースの存在下で抑制されるガラクトキナーゼプロモーターの調節下にあってもよい。

【0090】

Ｃａｓ９関連ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、２つのＲＮＡ非コード化構成要素、すなわち同一の直接反復（ＤＲ）により離間したヌクレアーゼガイド配列（スペーサー）を含有する、ｔｒａｃｒＲＮＡおよびｐｒｅ−ｃｒＲＮＡアレイを含む。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用してゲノム操作を達成するためには、これらのＲＮＡの両方の機能が存在しなければならない（Ｃｏｎｇ ｅｔ ａｌ， （２０１３） Ｓｃｉｅｎｃｅｘｐｒｅｓｓ １／１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ １２３１１４３を参照されたい）。いくつかの実施形態において、ｔｒａｃｒＲＮＡおよびｐｒｅ−ｃｒＲＮＡは、別個の発現構築物を介して、または別個のＲＮＡとして供給される。他の実施形態において、キメラＲＮＡが構築され、操作された成熟ｃｒＲＮＡ（標的特性を付与する）がｔｒａｃｒＲＮＡ（Ｃａｓ９との相互作用を供給する）に融合されて、キメラｃｒ−ＲＮＡ−ｔｒａｃｒＲＮＡハイブリッド（単一ガイドＲＮＡとも呼ばれる）が形成される。（Ｊｉｎｅｋ （同書）およびＣｏｎｇ， （同書）を参照されたい）。

【0091】

標的部位
上で詳述されるように、ＤＮＡドメインは、選択される任意の配列に結合するように操作され得る。操作されたＤＮＡ結合ドメインは、天然型ＤＮＡ結合ドメインと比較して新規の結合特異性を有することができる。操作方法は、合理的設計および種々の種類の選択を含むが、これらに限定されない。合理的設計は、例えば、トリプレット（またはカドラプレット）のヌクレオチド配列および個々のジンクフィンガーアミノ酸配列を含むデータベースを使用することを含み、各トリプレットまたはカドラプレットのヌクレオチド配列は、特定のトリプレットまたはカドラプレットの配列に結合するジンクフィンガーの１つ以上のアミノ酸配列と会合している。例えば、譲受人共通の米国特許第６，４５３，２４２号および同第６，５３４，２６１号を参照されたく、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。ＴＡＬエフェクタードメインの合理的設計もまた行うことができる。例えば、米国特許公開第２０１１０３０１０７３号を参照されたい。

【0092】

ファージディスプレイおよびツーハイブリッドシステムを含む、ＤＮＡ結合ドメインに適用可能な例となる選択方法は、米国特許第５，７８９，５３８号、同第５，９２５，５２３号、同第６，００７，９８８号、同第６，０１３，４５３号、同第６，４１０，２４８号、同第６，１４０，４６６号、同第６，２００，７５９号、および同第６，２４２，５６８号、ならびに国際公開第ＷＯ９８／３７１８６号、同第ＷＯ９８／５３０５７号、同第ＷＯ００／２７８７８号、同第ＷＯ０１／８８１９７号、そして英国特許第ＧＢ２，３３８，２３７号に開示されている。加えて、ジンクフィンガー結合ドメインに対する結合特異性の強化は、例えば、譲受人共通の国際公開第ＷＯ０２／０７７２２７号に記載されている。

【0093】

標的部位の選択、ヌクレアーゼ、ならびに融合タンパク質（およびそれをコードするポリヌクレオチド）の設計および構築のための方法は、当業者に知られており、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２００５００６４４７４号および同第２００６０１８８９８７号に詳述されている。

【0094】

加えて、これらおよび他の参考文献に開示されるように、ＤＮＡ結合ドメイン（例えば、マルチフィンガージンクフィンガータンパク質）は、例えば、５アミノ酸以上のリンカーを含む、任意の好適なリンカー配列を使用して一緒に連結されてもよい。例えば、６アミノ酸長以上の例となるリンカー配列については、米国特許第６，４７９，６２６号、同第６，９０３，１８５号、および同第７，１５３，９４９号を参照されたい。本明細書に記載されるタンパク質は、タンパク質の個々のＤＮＡ結合ドメイン間の好適なリンカーの任意の組み合わせを含んでもよい。米国特許公開第２０１１０３０１０７３号も参照されたい。

【0095】

上述のように、ヌクレアーゼのＤＮＡ結合ドメインは、任意の遺伝子に標的化され得る。ある特定の実施形態において、ヌクレアーゼ（ＤＮＡ結合ドメイン構成要素）は、例示のみを目的として、ＡＡＶＳ１遺伝子（米国特許第８，１１０，３７９号を参照されたい）、ＣＣＲ５遺伝子（米国特許公開第２００８０１５９９９６号を参照されたい）、Ｒｏｓａ遺伝子座（国際公開第ＷＯ２０１０／０６５１２３号を参照されたい）、および／またはアルブミン遺伝子座（米国特許出願第１３／６２４，１９３号を参照されたい）を含む「セーフハーバー」遺伝子座に標的化される。

【0096】

ドナー
選択された場所内への挿入のための、任意のポリヌクレオチドの標的化挿入の方法が、本明細書に開示される。挿入のためのポリヌクレオチドはまた、「外因性」ポリヌクレオチド、「ドナー」ポリヌクレオチドもしくは分子または「導入遺伝子」と呼ぶこともできる。

【0097】

驚くべきことに、本明細書において、外因性配列（導入遺伝子）に隣接する相同アームを有さない２本鎖ドナーヌクレオチド（例えばプラスミド）は、２本鎖ドナーのインビボ切断後に、細胞のゲノムの選択された標的領域内に効果的に組み込まれ得る。したがって、２本鎖ドナーは、インビボで（細胞内で）のドナーの切断のための１つ以上のヌクレアーゼ結合部位を含む。ある特定の実施形態において、ドナーは、２つのヌクレアーゼ結合部位を含む。ゲノムの標的領域内に２本鎖切断を形成することにより標的化組み込みが達成される方法において（例えば、米国特許第７，８８８，１２１号、同第７，９５１，９２５号、同第８，１１０，３７９号および米国特許公開第２００９０２６３９００号、同第２０１００１２９８６９号および同第２０１１０２０７２２１号を参照されたい）、標的領域を切断するために使用されたヌクレアーゼの１つ以上は、ドナー分子を切断するためにも使用され得る。

【0098】

ある特定の実施形態において、２本鎖ドナーは、１ｋｂを超える、例えば２〜２００ｋｂの間、２〜１０ｋｂの間（またはその間の任意の値）の長さの配列（例えば、導入遺伝子とも呼ばれるコード化配列）を含む。２本鎖ドナーはまた、例えば、少なくとも１つのヌクレアーゼ標的部位を含む。ある特定の実施形態において、ドナーは、例えばＺＦＮまたはＴＡＬＥＮの対に対する少なくとも２つの標的部位を含む。典型的には、ヌクレアーゼ標的部位は、導入遺伝子の切断のために、導入遺伝子配列の外、例えば、導入遺伝子配列に対し５’および／または３’にある。ヌクレアーゼ切断部位（複数可）は、任意のヌクレアーゼ（複数可）に対するものであってもよい。ある特定の実施形態において、２本鎖ドナー内に含有されるヌクレアーゼ標的部位（複数可）は、切断されたドナーが相同性非依存的方法を介して組み込まれる内因性標的を切断するために使用される同じヌクレアーゼ（複数可）に対するものである。

【0099】

上述のように、ドナーは、インビボで切断され、順（「ＡＢ」）または逆（「ＢＡ」）方向でゲノム内に組み込まれ得る。完全に連結されたＡＢ方向の挿入をもたらすインビボドナー切断を介した標的化組み込みは、部位間の元の間隔を有する対になったヌクレアーゼ（例えば、ＺＦＮまたはＴＡＬＥＮ）結合部位を再形成する。そのような再形成された部位は、ヌクレアーゼによる第２ラウンドの切断のための潜在的基質である。再形成された部位におけるヌクレアーゼ切断は、導入遺伝子−染色体接合点におけるＤＮＡ欠失（不正確なＮＨＥＪベース修復の結果）またはさらに導入遺伝子の離断をもたらし得る。対照的に、逆（ＢＡ）方向挿入は、２つの異なるヌクレアーゼ対結合部位（例えば、左および右のヌクレアーゼのホモ二量体）の形成をもたらす。偏性ヘテロ二量体（ＥＬ／ＫＫ、ＥＬＤ／ＫＫＲ等）ＦｏｋＩヌクレアーゼドメインが使用される場合、再形成された結合部位は共にホモ二量体部位であるため、再形成されたＢＡ部位は再切断可能ではない。図１Ｃもまた参照されたい。

【0100】

さらに、野生型（ゲノム）配列と比較して１本鎖５’オーバーハングを構成する導入遺伝子ドナーヌクレアーゼスペーサーにおけるヌクレオチドを野生型配列の逆相補配列に変化させることは、切断されたドナーのＢＡ方向挿入に有利であり（切断された染色体上のオーバーハングとのワトソン−クリック塩基対形成を介して）、これは再切断不可能な導入遺伝子組み込みを形成する（図１Ｃ）。

【0101】

本明細書に記載のドナー配列上に保持される導入遺伝子は、ＰＣＲ等の当該技術分野において知られている標準的技術を使用して、プラスミド、細胞または他の源から単離され得る。使用のためのドナーは、環状超螺旋、環状弛緩、直線等を含む様々な種類のトポロジーを含む。代替として、それらは、標準的なオリゴヌクレオチド合成技術を使用して化学的に合成されてもよい。加えて、ドナーは、メチル化されていてもよく、またはメチル化を有さなくてもよい。ドナーは、細菌または酵母人工染色体（ＢＡＣまたはＹＡＣ）の形態であってもよい。

【0102】

本明細書に記載の２本鎖ドナーポリヌクレオチドは、１つ以上の非天然塩基および／または骨格を含んでもよい。特に、メチル化サイトカインによるドナー分子の挿入は、目的領域内の転写休止の状態を達成するために本明細書に記載の方法を使用して行われてもよい。

【0103】

外因性（ドナー）ポリヌクレオチドは、任意の目的配列（外因性配列）を含んでもよい。例となる外因性配列には、任意のポリペプチドコード化配列（例えばｃＤＮＡ）、プロモーター配列、エンハンサー配列、エピトープタグ、マーカー遺伝子、切断酵素認識部位および様々な種類の発現構築物が含まれるが、これらに限定されない。マーカー遺伝子には、抗生物質耐性（例えば、アンピシリン耐性、ネオマイシン耐性、Ｇ４１８耐性、ピューロマイシン耐性）を媒介するタンパク質をコードする配列、有色または蛍光または発光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質、高感度緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ）をコードする配列、ならびに強化された細胞増殖および／または遺伝子増幅を媒介するタンパク質（例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素）が含まれるが、これらに限定されない。エピトープタグには、例えば、ＦＬＡＧ、Ｈｉｓ、ｍｙｃ、Ｔａｐ、ＨＡ、または任意の検出可能なアミノ酸配列の１つ以上のコピーが含まれる。

【0104】

好ましい実施形態において、外因性配列（導入遺伝子）は、その細胞内での発現が望ましい任意のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、抗体、抗原、酵素、受容体（細胞表面または核）、ホルモン、リンホカイン、サイトカイン、レポーターポリペプチド、成長因子、耐虫性、転写因子、および上記のいずれかの機能性断片を含むが、これらに限定されない。コード化配列は、例えば、ｃＤＮＡであってもよい。

【0105】

例えば、外因性配列は、以下の遺伝的疾患のいずれかを含むがこれらに限定されない遺伝的疾患を有する被験体において欠損している、または非機能的であるポリペプチドをコードする配列を含んでもよい：軟骨形成不全、色覚異常、酸性マルターゼ欠損、アデノシン・デアミナーゼ欠損（ＯＭＩＭ番号１０２７００）、副腎白質ジストロフィー、アイカルディ症候群、α−１抗トリプシン欠乏、α−サラセミア、アンドロゲン不感性症候群、アペール症候群、催不整脈性右室異形成、毛細血管拡張性運動失調、バース症候群、β−サラセミア、青色ゴムまり様母斑症候群、カナヴァン病、慢性肉芽腫症（ＣＧＤ）、猫鳴き症候群、嚢胞性線維症、有痛脂肪症、外胚葉異形成症、ファンコニ貧血、進行性骨化性線維形成異常症、脆弱性Ｘ症候群、ガラクトース血症、ゴーシェ病、全身性ガングリオシドーシス（例えばＧＭ１）、ヘモクロマトーシス、β−グロビン（ＨｂＣ）の６番目のコドンにおけるヘモグロビンＣ変異、血友病、ハンチントン病、ハーラー症候群、低ホスファターゼ血症、クラインフェルター症候群、クラッペ病、ランガー・ギーディオン症候群、白血病接着不全症（ＬＡＤ、ＯＭＩＭ番号１１６９２０）、大脳白質萎縮症、ＱＴ延長症候群、マルファン症候群、メビウス症候群、ムコ多糖症（ＭＰＳ）、爪・膝蓋骨症候群、腎性尿崩症、神経線維腫症、ニーマン・ピック病、骨形成不全症、ポルフィリン症、プラダーウィリ症候群、早老症、プロテウス症候群、網膜芽細胞腫、レット症候群、ルビンシュタイン・テイビ症候群、サンフィリポ症候群、重度複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）、シュワックマン症候群、鎌状赤血球症（鎌状赤血球貧血）、スミス・マゲニス症候群、スティックラー症候群、テイ・サックス病、血小板減少性橈骨欠損症（ＴＡＲ）症候群、トレチャー・コリンズ症候群、トリソミー、結節硬化症、ターナー症候群、尿素サイクル異常症、フォン・ヒッペル・リンドウ病、ワーデンバーグ症候群、ウィリアムズ症候群、ウィルソン病、ウィスコット・アルドリッチ症候群、Ｘ連鎖リンパ増殖性症候群（ＸＬＰ、ＯＭＩＭ番号３０８２４０）。

【0106】

標的化組み込みにより治療され得る追加的な例となる疾患には、後天性免疫不全症、リソソーム蓄積症（例えば、ゴーシェ病、ＧＭ１、ファブリ病、およびテイ・サックス病）、ムコ多糖症（例えば、ハンター病、ハーラー病）、異常ヘモグロビン症（例えば、鎌状赤血球病、ＨｂＣ、α−サラセミア、β−サラセミア）、および血友病が含まれる。

【0107】

ある特定の実施形態において、外因性配列は、標的化組み込みを受けた細胞の選択を可能とするマーカー遺伝子（上述）、およびさらなる機能性をコードする連結された配列を含んでもよい。マーカー遺伝子の限定されない例には、ＧＦＰ、薬物選択マーカー（複数可）等が含まれる。

【0108】

挿入され得る追加的な遺伝子配列には、例えば、変異配列を置き換えるための野生型遺伝子が含まれてもよい。例えば、野生型第ＩＸ因子遺伝子配列が、遺伝子の内因性コピーが変異している幹細胞のゲノム内に挿入されてもよい。野生型コピーは、内因性遺伝子座で挿入されてもよく、または代替として、セーフハーバー遺伝子座に標的化されてもよい。

【0109】

いくつかの実施形態において、目的ポリペプチドをコードする農作物遺伝子またはヌクレオチド配列を含む外因性核酸配列（導入遺伝子）は、例えば、限定されることなく、有害生物または疾患に対する耐性を付与する遺伝子（例えば、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６６：７８９（クラドスポリウム・フルブムに対する耐性のためのトマトＣｆ−９遺伝子のクローニング）、Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６２：１４３２、Ｍｉｎｄｒｉｎｏｓ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｃｅｌｌ ７８：１０８９（シュードモナス・シリンゲに対する耐性のためのＲＳＰ２遺伝子）、ＰＣＴ国際特許公開第ＷＯ９６／３０５１７号（大豆シスト線虫に対する耐性）、ＰＣＴ国際特許公開第ＷＯ９３／１９１８１号を参照されたい）、バチルス・チューリンゲンシスタンパク質をコードする遺伝子、その誘導体、またはそれに基づきモデル化された合成ポリペプチド（例えば、Ｇｅｉｓｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９８６） Ｇｅｎｅ ４８：１０９（Ｂｔ δ−エンドトキシン遺伝子のクローニングおよびヌクレオチド配列；さらに、δ−エンドトキシン遺伝子をコードするＤＮＡ分子は、例えばＡＴＣＣ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．４００９８、６７１３６、３１９９５、および３１９９８の下で、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から購入可能である）を参照されたい）、レクチンをコードする遺伝子（例えば、Ｖａｎ Ｄａｍｍｅ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ． ２４：２５（いくつかのクリビア・ミニアータマンノース結合レクチン遺伝子のヌクレオチド配列）を参照されたい）、ビタミン結合タンパク質、例えばアビジンをコードする遺伝子（ＰＣＴ国際特許公開第ＵＳ９３／０６４８７号（害虫に対する幼虫駆除剤としてのアビジンおよびアビジンホモログの使用）を参照されたい）、酵素阻害剤、例えばプロテアーゼ、プロテイナーゼ阻害剤、またはアミラーゼ阻害剤をコードする遺伝子（例えば、Ａｂｅ ｅｔ ａｌ． （１９８７） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．２６２：１６７９３（コメシステインプロテイナーゼ阻害剤のヌクレオチド配列）；Ｈｕｕｂ ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ． ２１：９８５（タバコプロテイナーゼ阻害剤ＩをコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列）、Ｓｕｍｉｔａｎｉ ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５７：１２４３（ストレプトミセス ・ニトロスポレウスα−アミラーゼ阻害剤のヌクレオチド配列）および米国特許第５，４９４，８１３号を参照されたい）、昆虫特異的ホルモンまたはフェロモン、例えばエクジステロイドもしくは幼若ホルモン、それらの改変体、それに基づく模倣薬、またはその拮抗薬もしくは作動薬をコードする遺伝子（例えば、Ｈａｍｍｏｃｋ ｅｔ ａｌ． （１９９０） Ｎａｔｕｒｅ ３４４：４５８（クローニングされた幼若ホルモンエステラーゼ、幼若ホルモンの不活性化剤のバキュロウイルス発現）を参照されたい）、発現後に罹患した有害生物の生理学を妨害する昆虫特異的ペプチドまたは神経ペプチドをコードする遺伝子（例えば、Ｒｅｇａｎ （１９９４） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．２６９：９（発現クローニングは、昆虫利尿ホルモン受容体をコードするＤＮＡを生成する）、Ｐｒａｔｔ ｅｔ ａｌ． （１９８９） Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１６３：１２４３（ジプロプテラ・プンタータにおけるアロスタチン）、および米国特許第５，２６６，３１７号（昆虫特異的麻痺性神経毒素をコードする遺伝子）を参照されたい）、蛇、蜂または他の生物により自然に生成された昆虫特異的な毒をコードする遺伝子（例えば、Ｐａｎｇ ｅｔ ａｌ． （１９９２） Ｇｅｎｅ １１６：１６５（サソリの昆虫毒性ペプチドをコードする遺伝子の植物における異種発現）を参照されたい）、モノテルペン、セスキテルペン、ステロイド、ヒドロキサム酸、フェニルプロパノイド誘導体または殺虫活性を有する他の分子の過剰蓄積を担う酵素をコードする遺伝子、生物活性分子の翻訳後修飾を含む修飾に関与する酵素、例えば、糖分解酵素、タンパク質分解酵素、脂質分解酵素、ヌクレアーゼ、シクラーゼ、アミノ基転移酵素、エステラーゼ、加水分解酵素、ホスファターゼ、キナーゼ、ホスホリラーゼ、ポリメラーゼ、エラスターゼ、キチナーゼ、またはグルカナーゼ（天然または合成を問わない）をコードする遺伝子（例えば、ＰＣＴ国際特許公開第ＷＯ９３／０２１９７（カラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列）；さらに、例えばＡＴＣＣから、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．３９６３７および６７１５２の下で、キチナーゼコード化配列を含有するＤＮＡ分子を得ることができる；Ｋｒａｍｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｉｎｓｅｃｔ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ． ２３：６９１（タバコイモムシキチナーゼをコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列）、およびＫａｗａｌｌｅｃｋ ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ． ２１：６７３（パセリｕｂｉ４−２ポリユビキチン遺伝子のヌクレオチド配列）を参照されたい）、シグナル伝達を刺激する分子をコードする遺伝子（例えば、Ｂｏｔｅｌｌａ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ． ２４：７５７（マングビーンカルモジュリンｃＤＮＡクローンのヌクレオチド配列）、およびＧｒｉｅｓｓ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． １０４：１４６７（トウモロコシカルモジュリンｃＤＮＡクローンのヌクレオチド配列）を参照されたい）、疎水性モーメントペプチドをコードする遺伝子（例えば、ＰＣＴ国際特許公開第ＷＯ ９５／１６７７６号（真菌植物病原体を阻害するタキプレシンのペプチド誘導体）、およびＰＣＴ国際特許公開第ＷＯ９５／１８８５５号（疾患耐性を付与する合成抗菌ペプチド）を参照されたい）、膜透過酵素、チャネル形成剤、またはチャネル遮断薬をコードする遺伝子（例えば、Ｊａｙｎｅｓ ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ ８９：４３（トランスジェニックタバコ植物をシュードモナス・ソラナセアラム に対して耐性とするためのセクロピン−β溶解ペプチド類似体の異種発現）を参照されたい）、ウイルス侵襲性タンパク質またはそれに由来する複合毒素をコードする遺伝子（例えば、Ｂｅａｃｈｙ ｅｔ ａｌ． （１９９０） Ａｎｎ． ｒｅｖ．Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌ．２８：４５１を参照されたい）、虫特異的抗体またはそれに由来するイムノトキシンをコードする遺伝子（例えば、Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．， Ａｂｓｔｒａｃｔ ＃４９７， Ｓｅｖｅｎｔｈ Ｉｎｔ’ｌ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｌａｎｔ−Ｍｉｃｒｏｂｅ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ （Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈ， Ｓｃｏｔｌａｎｄ） （１９９４）（トランスジェニックタバコにおける、１本鎖抗体断片の生成を介した酵素不活性化）を参照されたい）、ウイルス特異的抗体をコードする遺伝子（例えば、Ｔａｖｌａｄｏｒａｋｉ ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｎａｔｕｒｅ ３６６：４６９（組み換え抗体遺伝子を発現するトランスジェニック植物は、ウイルス攻撃から保護される）を参照されたい）、病原体または寄生生物により自然に産生される発育抑止タンパク質をコードする遺伝子（例えば、Ｌａｍｂ ｅｔ ａｌ． （１９９２） Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：１４３６（真菌エンドα−１，４−Ｄ−ポリガラクツロナーゼは、植物細胞壁ホモ−α−１，４−Ｄ−ガラクツロナーゼを可溶化することにより真菌コロニー化および植物養分放出を促進する）、Ｔｏｕｂａｒｔ ｅｔ ａｌ． （１９９２） Ｐｌａｎｔ Ｊ． ２：３６７（豆エンドポリガラクツロナーゼ阻害タンパク質をコードする遺伝子のクローニングおよび特性決定）を参照されたい）、植物により自然に産生される発育抑止タンパク質をコードする遺伝子（例えば、Ｌｏｇｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌ． （１９９２） Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：３０５（オオムギリボソーム不活性化遺伝子を発現するトランスジェニック植物は、真菌疾患に対する増加した耐性を有する）を参照されたい）を含んでもよい。

【0110】

いくつかの実施形態において、目的ポリペプチドをコードする農作物遺伝子またはヌクレオチド配列はまた、同時に、および／または代替として、例えば、限定されることなく、除草剤、例えば成長点または分裂組織を阻害する除草剤、例えば、イミダゾリノンまたはスルホニル尿素に対する耐性を付与する遺伝子（このカテゴリー内の例となる遺伝子は、例えば、それぞれＬｅｅ ｅｔ ａｌ． （１９８８） ＥＭＢＯ Ｊ． ７：１２４１、およびＭｉｋｉ ｅｔ ａｌ． （１９９０） Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．８０：４４９により説明されるように、変異体ＡＬＳおよびＡＨＡＳ酵素をコードする）；例えば変異体５−エノールピルビルシキメート−３−ホスフェートシンターゼ（ＥＰＳＰ）遺伝子により付与されるようなグリホセート耐性を付与する遺伝子（組み換え核酸の導入および／または天然ＥＰＳＰ遺伝子の様々な形態のインビボ変異誘発による）；それぞれａｒｏＡ遺伝子およびグリホセートアセチルトランスフェラーゼ（ＧＡＴ）遺伝子）；他のホスホノ化合物、例えばストレプトミセス・ハイグロスコピクスおよびストレプトミセス・ビリドクロモゲネス）を含むストレプトミセス種からのグルホシネートホスフィホトリンアセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＴ）遺伝子；ならびにピリジンオキシまたはフェノキシプロピオン酸およびシクロヘキソン（ＡＣＣａｓｅ阻害剤コード化遺伝子）を含んでもよい。例えば、米国特許第４，９４０，８３５号および同第６，２４８，８７６号（植物にグリホセート耐性を付与し得るＥＰＳＰの形態のヌクレオチド配列）を参照されたい。変異体ａｒｏＡ遺伝子をコードするＤＮＡ分子は、ＡＴＣＣアクセッション番号３９２５６の下で得ることができる。米国特許第４，７６９，０６１号（変異体ａｒｏＡ遺伝子のヌクレオチド配列）もまた参照されたい。欧州特許出願第０３３３０３３号および米国特許第４，９７５，３７４号は、グルタミン合成酵素遺伝子のヌクレオチド配列を開示しており、これは、Ｌ−ホスフィノトリシン等の除草剤に対する耐性を付与し得る。例となるＰＡＴ遺伝子のヌクレオチド配列は、欧州特許出願第０２４２２４６号、およびＤｅＧｒｅｅｆ ｅｔ ａｌ． （１９８９） Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７：６１（ＰＡＴ活性をコードするキメラｂａｒ遺伝子を発現するトランスジェニック植物の産生）に記載されている。フェノキシプロピオン酸およびシクロヘキソン、例えばセトキシジムおよびハロキシホップに対する耐性を付与する遺伝子の例には、Ｍａｒｓｈａｌｌ ｅｔ ａｌ． （１９９２） Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．８３：４３５により説明されるように、Ａｃｃ１−Ｓ１、Ａｃｃ１−Ｓ２およびＡｃｃ１−Ｓ３遺伝子が含まれる。グリホセート耐性を付与することができるＧＡＴ遺伝子は、例えば、国際公開第ＷＯ２００５０１２５１５号に記載されている。２，４−Ｄ、フェノキシプロピオン酸およびピリジルオキシオーキシン除草剤に対する耐性を付与する遺伝子は、例えば、国際公開第ＷＯ２００５１０７４３７号に記載されている。

【0111】

また、目的ポリペプチドをコードする農作物遺伝子またはヌクレオチド配列を含む核酸は、例えば、限定されることなく、光合成を阻害する除草剤、例えばトリアジン（ｐｓｂＡおよびｇｓ＋遺伝子）またはベンゾニトリル（ニトリラーゼ遺伝子）に対する耐性を付与する遺伝子を含み得る。例えば、Ｐｒｚｉｂｉｌａ ｅｔ ａｌ． （１９９１） Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ３：１６９（変異体ｐｓｂＡ遺伝子をコードするプラスミドによるクラミドモナスの形質転換）を参照されたい。ニトリラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列は、米国特許第４，８１０，６４８号に開示されており、これらの遺伝子を含有するＤＮＡ分子は、ＡＴＣＣ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．５３４３５、６７４４１、および６７４４２の下で入手可能である。Ｈａｙｅｓ ｅｔ ａｌ． （１９９２） Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ． ２８５：１７３（グルタチオンＳ−トランスフェラーゼをコードするＤＮＡのクローニングおよび発現）もまた参照されたい。

【0112】

いくつかの実施形態において、目的ポリペプチドをコードする農作物遺伝子またはヌクレオチド配列を含む核酸はまた、同時に、および／または代替として、例えば植物のステアリン酸含量を増加させるためにステアリル−ＡＣＰデサチュラーゼのアンチセンス遺伝子で植物を形質転換することにより、付加価値のある形質、例えば、限定されることなく、修飾脂肪酸代謝を付与する、またはそれに寄与する遺伝子を含んでもよく（例えば、Ｋｎｕｌｔｚｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９２） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８９：２６２４を参照されたい）；低減されたフィチン酸塩含量、例えば、フィターゼコード化遺伝子の導入は、フィチン酸塩の破壊を促進して、形質転換植物に対しより多くの遊離リン酸塩を付加することができ（例えば、Ｖａｎ Ｈａｒｔｉｎｇｓｖｅｌｄｔ ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｇｅｎｅ １２７：８７（黒色アスペルギルスフィターゼ遺伝子のヌクレオチド配列）；遺伝子は、トウモロコシにおけるフィチン酸塩含量を低減するために導入することができ、例えば、これは、クローニングし、次いで、低レベルのフィチン酸を特徴とするトウモロコシ変異体の原因となり得る単一対立遺伝子に関連したＤＮＡを再導入することにより達成され得（Ｒａｂｏｙ ｅｔ ａｌ． （１９９０） Ｍａｙｄｉｃａ ３５：３８３）を参照されたい）；また、例えば、デンプンの分枝パターンを改変する酵素をコードする遺伝子で植物を形質転換することにより、修飾された炭水化物組成が実現される（例えば、Ｓｈｉｒｏｚａ ｅｔ ａｌ． （１９８８） Ｊ． Ｂａｃｔｅｏｌ．１７０：８１０（連鎖球菌変異体フルクトシルトランスフェラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列）、Ｓｔｅｉｎｍｅｔｚ ｅｔ ａｌ． （１９８５） Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ．２０：２２０ （レバンスクラーゼ遺伝子）、Ｐｅｎ ｅｔ ａｌ． （１９９２） Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：２９２（α−アミラーゼ）、Ｅｌｌｉｏｔ ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ． ２１：５１５（トマトインベルターゼ遺伝子のヌクレオチド配列）、Ｓｏｇａａｒｄ ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．２６８：２２４８０（オオムギα−アミラーゼ遺伝子）、およびＦｉｓｈｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． １０２：１０４５（トウモロコシ胚乳デンプン分枝酵素ＩＩ）を参照されたい）。

【0113】

本明細書の教示に従うそのような発現カセットの構築は、分子生物学の技術分野において周知の方法を使用する（例えば、ＡｕｓｕｂｅｌまたはＭａｎｉａｔｉｓを参照されたい）。トランスジェニック動物を産生するための発現カセットの使用の前に、選択された調節要素に関連したストレス誘導因子に対する発現カセットの反応性は、発現カセットを好適な細胞株（例えば、初代細胞、形質転換細胞、または不死化細胞株）に導入することにより試験され得る。

【0114】

さらに、発現に必要とされないが、外因性配列（導入遺伝子）は、転写または翻訳調節配列、例えば、プロモーター、エンハンサー、インシュレーター、内部リボソーム進入部位、２Ａペプチドおよび／またはポリアデニル化シグナルをコードする配列を含んでもよい。さらに、目的遺伝子の調節要素は、レポーター遺伝子に作動的に連結して、キメラ遺伝子（例えばレポーター発現カセット）を形成し得る。

【0115】

非コード化核酸配列の導入遺伝子の標的化挿入もまた達成され得る。ＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ｓｈＲＮＡおよびマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）をコードする導入遺伝子もまた、標的化挿入に使用され得る。

【0116】

さらなる実施形態において、ドナー核酸は、追加的ヌクレアーゼ設計のための特異的標的部位である非コード化配列を含んでもよい。その後、追加的ヌクレアーゼは、元のドナー分子が切断され、別の目的ドナー分子の挿入により修飾されるように、細胞内で発現され得る。このようにして、ドナー分子の反復的組み込みが形成され得、特定の目的遺伝子座における、またはセーフハーバー遺伝子座における形質のスタッキングが可能となる。

【0117】

標的化導入遺伝子組み込みのための方法
本明細書において開示されるドナー分子は、標的化された相同性非依存的方法を介して細胞のゲノム内に組み込まれる。そのような標的化組み込みのために、ゲノムは、ヌクレアーゼを使用して、所望の場所（複数可）で、例えばＤＮＡ結合ドメイン（例えば、ジンクフィンガー結合ドメインまたはＴＡＬエフェクタードメインは、所定の切断部位の、またはその近くの部位に結合するように操作される）とヌクレアーゼドメイン（例えば、切断ドメインまたは切断ハーフドメイン）との間の融合部において切断される。ある特定の実施形態において、それぞれＤＮＡ結合ドメインおよび切断ハーフドメインを含む２つの融合タンパク質が細胞内に発現され、機能性切断ドメインが再構成されてＤＮＡが標的部位（複数可）近傍で切断されるように並置される部位に結合する。一実施形態において、切断は、２つのＤＮＡ結合ドメインの結合部位の間に生じる。ＤＮＡ結合ドメインの１つまたは両方が操作され得る。米国特許第７，８８８，１２１号、米国特許公開第２００５００６４４７４号、ならびに国際特許公開第ＷＯ０５／０８４１９０号、同第ＷＯ０５／０１４７９１号および同第ＷＯ０３／０８０８０９号もまた参照されたい。

【0118】

本明細書に記載のヌクレアーゼは、ポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドとして導入され得る。例えば、それぞれ上述のポリペプチドの１つをコードする配列を含む２つのポリヌクレオチドは、細胞内に導入され得、ポリペプチドが発現してそれぞれその標的配列に結合するときに、標的配列で、またはその近くで切断が生じる。代替として、両方の融合ポリペプチドをコードする配列を含む単一のポリヌクレオチドが細胞内に導入される。ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、または任意の修飾形態または類似体またはＤＮＡおよび／またはＲＮＡであってもよい。

【0119】

目的領域における２本鎖切断の導入後、導入遺伝子は、本明細書に記載の２本鎖ドナー分子の線形化の後、相同性非依存的方法（例えば、非相同末端結合（ＮＨＥＪ））を介して標的化された様式で目的領域内に組み込まれる。２本鎖ドナーは、好ましくは、ヌクレアーゼ、例えばゲノム内に２本鎖破壊を導入するために使用される同じまたは異なるヌクレアーゼの１つ以上により、インビボで線形化される。細胞内の染色体およびドナーの同期切断は、ドナーＤＮＡ分解を制限し得る（細胞内への導入前のドナー分子の線形化と比較して）。ドナーの線形化に使用されるヌクレアーゼ標的部位（複数可）は、好ましくは、導入遺伝子（複数可）配列（複数可）を妨害しない。

【0120】

導入遺伝子は、ヌクレアーゼオーバーハングの単純な連結により推定される方向（「順」もしくは「ＡＢ」方向と表記される）で、または代替の方向（「逆」もしくは「ＢＡ」方向と表記される）で、ゲノム内に組み込まれ得る。ある特定の実施形態において、導入遺伝子は、ドナーおよび染色体オーバーハングの正確な連結後に組み込まれる。他の実施形態において、ＢＡまたはＡＢ方向における導入遺伝子の組み込みは、いくつかのヌクレオチドの欠失をもたらす。

【0121】

送達
ヌクレアーゼ、これらのヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド、ドナーポリヌクレオチド、ならびに本明細書に記載のタンパク質および／またはポリヌクレオチドを含む組成物は、任意の好適な手段によってインビボまたはエクスビボで任意の細胞型に送達され得る。

【0122】

好適な細胞には、真核細胞（例えば、動物もしくは植物）および原核細胞および／または細胞株が含まれる。そのような細胞またはそのような細胞から生成される細胞株の非限定的な例としては、ＣＯＳ、ＣＨＯ（例えば、ＣＨＯ−Ｓ、ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯ−ＤＧ４４、ＣＨＯ−ＤＵＸＢ１１、ＣＨＯ−ＤＵＫＸ、ＣＨＯＫ１ＳＶ）、ＶＥＲＯ、ＭＤＣＫ、ＷＩ３８、Ｖ７９、Ｂ１４ＡＦ２８−Ｇ３、ＢＨＫ、ＨａＫ、ＮＳ０、ＳＰ２／０−Ａｇ１４、ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３（例えば、ＨＥＫ２９３−Ｆ、ＨＥＫ２９３−Ｈ、ＨＥＫ２９３−Ｔ）、およびｐｅｒＣ６細胞、ならびにヨトウガ（Ｓｆ）等の昆虫細胞、またはサッカロミセス属、ピチア属、およびシゾサッカロミセス属等の真菌細胞、ならびにトウモロコシ、大豆、綿、シロイヌナズナ、コムギ、オオムギ、オーツ、サトウキビ、ソルガム、飼料草、アルファルファ、トマト、タバコ、ジャガイモ、コメ、ヒマワリおよびアブラナ属を含むがこれらに限定されない単子葉植物または双子葉植物からの植物細胞が含まれる。ある特定の実施形態において、細胞株は、ＣＨＯ、ＭＤＣＫ、またはＨＥＫ２９３細胞株である。好適な細胞にはまた、例として、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、造血幹細胞、ニューロン幹細胞、および間葉系幹細胞等の、幹細胞が含まれる。ある特定の実施形態において、植物細胞は、懸濁培養物、プロトプラスト、または秩序化した組織、例えば、胚、未熟胚、葉片、子葉、ヒポトコール（ｈｙｐｏｔｃｏｌｓ）、および小胞子であるが、これらに限定されない。本明細書に記載のヌクレアーゼを送達する方法は、例えば、米国特許第第６，４５３，２４２号、同第６，５０３，７１７号、同第６，５３４，２６１号、同第６，５９９，６９２号、同第６，６０７，８８２号、同第６，６８９，５５８号、同第６，８２４，９７８号、同第６，９３３，１１３号、同第６，９７９，５３９号、同第７，０１３，２１９号、および第７，１６３，８２４号に記載されており、これらのすべての開示は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

【0123】

本明細書に記載のヌクレアーゼおよび／またはドナー構築物も、ジンクフィンガータンパク質（複数可）のうちの１つ以上をコードする配列を含有するベクターを用いて送達され得る。プラスミドベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、およびアデノ随伴ウイルスベクター等を含むが、これらに限定されない、任意のベクター系が使用されてもよい。また、米国特許第６，５３４，２６１号、同第６，６０７，８８２号、同第６，８２４，９７８号、同第６，９３３，１１３号、同第６，９７９，５３９号、同第７，０１３，２１９号、および同第７，１６３，８２４号も参照されたく、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。さらに、これらのベクターのいずれも、治療に必要とされる配列のうちの１つ以上を含み得ることが明らかとなろう。したがって、１つ以上のヌクレアーゼおよびドナー構築物が細胞に導入される場合、ヌクレアーゼおよび／またはドナーポリヌクレオチドは、同一のベクター上または異なるベクター上に担持され得る。複数のベクターが使用される場合、各ベクターは、１つまたは複数のヌクレアーゼおよび／もしくはドナー構築物をコードする配列を含み得る。

【0124】

従来のウイルスおよび非ウイルスベースの遺伝子導入方法を用いて、ヌクレアーゼおよびドナー構築物をコードする核酸を細胞（例えば、哺乳類細胞）および標的組織に導入することができる。非ウイルスベクター送達系は、ＤＮＡプラスミド、裸の核酸、およびリポソームまたはポロキサマー等の送達ビヒクルと複合体化された核酸を含む。ウイルスベクター送達系は、細胞への送達後にエピソーム性または組み込まれたゲノムのいずれかを有するＤＮＡおよびＲＮＡウイルスを含む。操作されたＤＮＡ結合タンパク質およびこれらの結合タンパク質を含む融合タンパク質のインビボ送達の総説については、例えば、Ｒｅｂａｒ（２００４） Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｒｕｇｓ １３（７）：８２９−８３９、Ｒｏｓｓｉ ｅｔ ａｌ． （２００７） Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ． ２５（１２）：１４４４−１４５４、ならびにＡｎｄｅｒｓｏｎ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：８０８−８１３ （１９９２）、Ｎａｂｅｌ ＆ Ｆｅｌｇｎｅｒ， ＴＩＢＴＥＣＨ １１：２１１−２１７ （１９９３）、Ｍｉｔａｎｉ ＆ Ｃａｓｋｅｙ， ＴＩＢＴＥＣＨ １１：１６２−１６６ （１９９３）、Ｄｉｌｌｏｎ， ＴＩＢＴＥＣＨ １１：１６７−１７５ （１９９３）、Ｍｉｌｌｅｒ， Ｎａｔｕｒｅ ３５７：４５５−４６０ （１９９２）、Ｖａｎ Ｂｒｕｎｔ， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６（１０）：１１４９−１１５４ （１９８８）、Ｖｉｇｎｅ， Ｒｅｓｔｏｒａｔｉｖｅ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ８：３５−３６ （１９９５）、Ｋｒｅｍｅｒ ＆ Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ， Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ５１（１）：３１−４４ （１９９５）、Ｈａｄｄａｄａ ｅｔ ａｌ．， ｉｎ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｄｏｅｒｆｌｅｒ ａｎｄ Ｂｏｅｈｍ （ｅｄｓ．）（１９９５）、およびＹｕ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １：１３−２６ （１９９４）等の一般的な遺伝子送達に関する参考文献を参照されたい。

【0125】

核酸の非ウイルス性送達の方法には、エレクトロポレーション、リポフェクション、マイクロインジェクション、バイオリスティック、ビロソーム、リポソーム、免疫リポソーム、ポリカチオン、または脂質：核酸結合体、裸のＤＮＡ、人工ビリオン、および薬剤によって強化されたＤＮＡの取り込みを含む。例えば、Ｓｏｎｉｔｒｏｎ ２０００システム（Ｒｉｃｈ−Ｍａｒ）を使用したソノポレーションも、核酸の送達のために使用することができる。

【0126】

さらなる例となる核酸送達系には、Ａｍａｘａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｃｏｌｏｇｎｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ），Ｍａｘｃｙｔｅ，Ｉｎｃ．（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）、ＢＴＸ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ，ＭＡ）、およびＣｏｐｅｒｎｉｃｕｓ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｉｎｃによって提供されるものが含まれる（例えば、米国公開特許第６００８３３６号を参照されたい）。リポフェクションは、例えば、米国特許第５，０４９，３８６号、同第４，９４６，７８７号、および同第４，８９７，３５５号）に記載されており、リポフェクション試薬は、市販されている（例えば、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（商標）およびＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標））。ポリヌクレオチドの効率的な受容体認識リポフェクションに好適である、陽イオン性脂質および中性脂質は、Ｆｅｌｇｎｅｒ、国際公開第ＷＯ９１／１７４２４号、同第ＷＯ９１／１６０２４号のものを含む。

【0127】

免疫脂質複合体等の標的化リポソームを含む脂質：核酸複合体の調製は、当業者に周知である（例えば、Ｃｒｙｓｔａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：４０４−４１０（１９９５）、Ｂｌａｅｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２：２９１−２９７（１９９５）、Ｂｅｈｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．５：３８２−３８９（１９９４）、Ｒｅｍｙ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．５：６４７−６５４（１９９４）、Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２：７１０−７２２（１９９５）、Ａｈｍａｄ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５２：４８１７−４８２０（１９９２）、米国特許第４，１８６，１８３号、同第４，２１７，３４４号、同第４，２３５，８７１号、同第４，２６１，９７５号、同第４，４８５，０５４号、同第４，５０１，７２８号、同第４，７７４，０８５号、同第４，８３７，０２８号、および同第４，９４６，７８７号を参照されたい）。

【0128】

さらなる送達方法は、送達対象の核酸をＥｎＧｅｎｅＩＣ送達ビヒクル（ＥＤＶ）にパッケージングする使用法を含む。これらのＥＤＶは、二重特異性抗体を用いて標的組織に特異的に送達され、この抗体の一方のアームは、標的組織に対する特異性を有し、他方のアームは、ＥＤＶに対する特異性を有する。抗体は、ＥＤＶを標的細胞表面に運び、次いで、エンドサイトーシスによりＥＤＶが細胞内に取り込まれる。一旦、細胞内に取り込まれると、その内容物が放出される（ＭａｃＤｉａｒｍｉｄ ｅｔ ａｌ（２００９）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２７（７）：６４３を参照されたい）。

【0129】

操作されたＺＦＰをコードする核酸を送達するためのＲＮＡまたはＤＮＡウイルスベースの系の使用は、ウイルスを体内の特定の細胞に対して標的化し、ウイルスのペイロードを核に輸送するための高度に進化したプロセスを活用する。ウイルスベクターは、患者に直接投与することができるか（インビボ）、またはそれらは、インビトロで細胞を処理するために使用することができ、修飾細胞が患者に投与される（エクスビボ）。ＺＦＰを送達するための従来のウイルスベースの系には、遺伝子導入のためのレトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ワクシニアウイルス、および単純ヘルペスウイルスベクターが含まれるが、これらに限定されない。宿主ゲノムへの組み込みは、レトロウイルス、レンチウイルス、およびアデノ随伴ウイルスによる遺伝子導入方法を用いて可能であり、挿入された導入遺伝子の長期発現をもたらすことが多い。さらに、多くの異なる細胞型および標的組織において、高い形質導入効率が観察されている。

【0130】

レトロウイルスの指向性は、外来性エンベロープタンパク質を組み込むことによって改変することができ、標的細胞の可能性のある標的集団を拡張する。レンチウイルスベクターは、非分裂細胞を形質導入するか、または感染させることができ、かつ典型的には高いウイルス力価を生成するレトロウイルスベクターである。レトロウイルス遺伝子導入系の選択は、標的組織に依存する。レトロウイルスベクターは、最大６〜１０ｋｂの外来性配列のパッケージング能力を有する、シス作用性の長い末端反復からなる。ベクターの複製およびパッケージングには、最小限のシス作用性ＬＴＲが十分であり、次いでそれらを使用して、治療用遺伝子を標的細胞に組み込んで恒久的な導入遺伝子の発現を提供する。広く使用されているレトロウイルスベクターには、マウス白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、およびそれらの組み合わせに基づくものが含まれる（例えば、Ｂｕｃｈｓｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．６６：２７３１−２７３９ （１９９２）、Ｊｏｈａｎｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．６６：１６３５−１６４０ （１９９２）、Ｓｏｍｍｅｒｆｅｌｔ ｅｔ ａｌ．， Ｖｉｒｏｌ．１７６：５８−５９ （１９９０）、Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．６３：２３７４−２３７８ （１９８９）、Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．６５：２２２０−２２２４ （１９９１）、ＰＣＴ／米国公開第９４／０５７００号を参照されたい）。

【0131】

一過性の発現が好ましい用途では、アデノウイルスベースの系を使用することができる。アデノウイルスベースのベクターは、多くの細胞型において非常に高い形質導入効率が可能であり、細胞分裂を必要としない。かかるベクターを用いて、高力価かつ高レベルの発現が得られている。このベクターは、比較的単純な系において大量に産生することができる。アデノ随伴ウイルス（「ＡＡＶ」）ベクターもまた、例えば、核酸およびペプチドのインビトロ産生において、ならびにインビボおよびエクスビボの遺伝子治療手順のために、標的核酸を用いて細胞に形質導入するために使用される（例えば、Ｗｅｓｔ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １６０：３８−４７（１９８７）、米国特許第４，７９７，３６８号、国際公開第ＷＯ９３／２４６４１号、Ｋｏｔｉｎ，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：７９３−８０１（１９９４）、Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９４：１３５１（１９９４）を参照されたい）。組換えＡＡＶベクターの構築は、米国特許第５，１７３，４１４号、Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３２５１−３２６０（１９８５）、Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：２０７２−２０８１（１９８４）、Ｈｅｒｍｏｎａｔ＆Ｍｕｚｙｃｚｋａ，ＰＮＡＳ ８１：６４６６−６４７０（１９８４）、およびＳａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：０３８２２−３８２８（１９８９）を含む、いくつかの刊行物に記載される。

【0132】

現在のところ、少なくとも６つのウイルスベクターのアプローチが、臨床治験における遺伝子導入に利用可能であり、それらは、ヘルパー細胞株に挿入される遺伝子による欠陥ベクターの補完を伴うアプローチを利用して、形質導入剤を生成する。

【0133】

ｐＬＡＳＮおよびＭＦＧ−Ｓは、臨床治験に使用されてきたレトロウイルスベクターの例である（Ｄｕｎｂａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ８５：３０４８−３０５（１９９５）、Ｋｏｈｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１：１０１７−１０２（１９９５）、Ｍａｌｅｃｈ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ９４：２２ １２１３３−１２１３８（１９９７））。ＰＡ３１７／ｐＬＡＳＮは、遺伝子治療治験で使用された最初の治療用ベクターであった。（Ｂｌａｅｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：４７５−４８０（１９９５））。ＭＦＧ−Ｓをパッケージしたベクターについて５０％以上の形質導入効率が観察されている。（Ｅｌｌｅｍ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．４４（１）：１０−２０（１９９７）、Ｄｒａｎｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１：１１１−２（１９９７）。

【0134】

組換えアデノ関連ウイルスベクター（ｒＡＡＶ）は、欠損性および非病原性パルボウイルスアデノ関連２型ウイルスに基づく有望な代替の遺伝子送達系である。すべてのベクターは、導入遺伝子発現カセットに隣接するＡＡＶの１４５ｂｐの逆方向末端反復のみを保持するプラスミドに由来する。形質導入された細胞のゲノムへの組み込みに起因する効率的な遺伝子導入および安定した導入遺伝子送達が、このベクター系の主要な特徴である。（Ｗａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｌａｎｃｅｔ ３５１：９１１７ １７０２−３ （１９９８）、Ｋｅａｒｎｓ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ９：７４８−５５ （１９９６））。ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、およびＡＡＶｒｈ．１０を含む他のＡＡＶ血清型、ならびに任意の新規なＡＡＶ血清型もまた、本発明に従い使用することができる。

【0135】

複製欠損型組換えアデノウイルスベクター（Ａｄ）は、高力価で産生することができ、いくつかの異なる細胞型に容易に感染する。ほとんどのアデノウイルスベクターは、導入遺伝子がＡｄＥ１ａ、Ｅ１ｂ、および／またはＥ３遺伝子を置換するように操作され、その後、複製欠損型ベクターは、欠失した遺伝子機能をトランスで供給するヒト２９３細胞内で増殖させられる。Ａｄベクターは、例えば、肝臓、腎臓、および筋肉中に見出されるもの等の非分裂の分化細胞を含む、複数の種類の組織にインビボで形質導入することができる。従来のＡｄベクターは、高い輸送能力を有する。臨床治験におけるＡｄベクターの使用の例は、筋肉内注射を用いた抗腫瘍免疫化のためのポリヌクレオチド治療を伴った（Ｓｔｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．７：１０８３−９（１９９８））。臨床治験における遺伝子導入のためのアデノウイルスベクターの使用のさらなる例としては、Ｒｏｓｅｎｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ２４：１ ５−１０（１９９６）、Ｓｔｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．９：７ １０８３−１０８９（１９９８）、Ｗｅｌｓｈ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２：２０５−１８（１９９５）、Ａｌｖａｒｅｚ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．５：５９７−６１３（１９９７）、Ｔｏｐｆ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．５：５０７−５１３（１９９８）、Ｓｔｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．７：１０８３−１０８９（１９９８）が挙げられる。

【0136】

パッケージング細胞を使用して、宿主細胞を感染させることが可能であるウイルス粒子が形成される。そのような細胞は、アデノウイルスをパッケージングする２９３細胞、およびレトロウイルスをパッケージングするψ２細胞またはＰＡ３１７細胞を含む。遺伝子治療に使用されるウイルスベクターは、通常、核酸ベクターをウイルス粒子中にパッケージングする産生細胞株によって生成される。ベクターは、典型的には、パッケージングおよびその後の宿主への組込みに必要な最小限のウイルス配列を含有し（該当する場合）、他のウイルス配列が、発現対象のタンパク質をコードする発現カセットによって置換される。欠落したウイルス機能は、パッケージング細胞株によってトランスで供給される。例えば、遺伝子治療に使用されるＡＡＶベクターは、典型的には、宿主ゲノムへのパッケージングおよび組込みに必要とされる、ＡＡＶゲノムからの逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列のみを有する。ウイルスＤＮＡが細胞株にパッケージングされ、それは他のＡＡＶ遺伝子、つまりｒｅｐおよびｃａｐをコードするが、ＩＴＲ配列が欠如しているヘルパープラスミドを含有する。細胞株はまた、ヘルパーとしてのアデノウイルスにも感染させられる。ヘルパーウイルスは、ＡＡＶベクターの複製およびヘルパープラスミドからのＡＡＶ遺伝子の発現を促進する。このヘルパープラスミドは、ＩＴＲ配列の欠如に起因して、相当な量ではパッケージングされない。アデノウイルスによる汚染は、例えば、ＡＡＶよりもアデノウイルスのほうがより感受性の高い熱処理によって、低減することができる。

【0137】

多くの遺伝子治療の用途において、遺伝子治療ベクターが、特定の組織型に対する高度の特異性をもって送達されることが望ましい。したがって、ウイルスベクターは、ウイルスの外表面上のウイルスのコートタンパク質との融合タンパク質としてリガンドを発現させることにより、所与の細胞型に対して特異性を有するように修飾され得る。リガンドは、目的の細胞型上に存在することが知られている受容体に対する親和性を有するように選定される。例えば、Ｈａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９２：９７４７−９７５１ （１９９５）は、モロニーマウス白血病ウイルスを、ｇｐ７０に融合するヒトヘレグリンを発現するように修飾することができ、この組換えウイルスが、ヒト上皮成長因子受容体を発現するある特定のヒト乳癌細胞に感染することを報告した。この原理は、標的細胞が受容体を発現し、ウイルスが細胞表面受容体に対するリガンドを含む融合タンパク質を発現する、他のウイルス標的細胞対にまで拡張することができる。例えば、線維状ファージは、実質的にいかなる選定された細胞受容体に対しても特異的結合親和性を有する抗体断片（例えば、ＦＡＢまたはＦｖ）を提示するように、操作することができる。上記の説明は、主としてウイルスベクターに適用されるが、同じ原理を非ウイルスベクターに適用することができる。かかるベクターは、特異的な標的細胞による取り込みを選好する特異的な取り込み配列を含有するように操作することができる。

【0138】

遺伝子治療ベクターは、下に記載されるように、典型的には、全身投与（例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、もしくは頭蓋内注入）または局所適用による個々の患者への投与によって、インビボで送達することができる。代替的に、ベクターは、個々の患者から外植された細胞（例えば、リンパ球、骨髄穿刺液、組織生検材料）または万能ドナー造血幹細胞等の細胞にエクスビボで送達することができ、続いて、通常はベクターを組み込んだ細胞の選択後に、細胞が患者に再移植される。

【0139】

ヌクレアーゼおよび／またはドナー構築物を含有するベクター（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、リポソーム等）はまた、インビボでの細胞の形質導入のために生物に直接投与することもできる。代替的に、裸のＤＮＡを投与することができる。投与は、注射、注入、局所適用、およびエレクトロポレーションを含むが、これらに限定されない、血液または組織細胞との最終的な接触に分子を導入するために通常使用される経路のうちのいずれかによる。かかる核酸を投与する好適な方法は、利用可能かつ当業者に周知であり、特定の組成物を投与するために１つを超える経路が使用されてもよいが、特定の経路が、別の経路より即時的かつより効果的な反応を提供できる場合が多い。

【0140】

本明細書に記載のポリヌクレオチド（例えばヌクレアーゼコード化および／または２本鎖ドナー）の導入に好適なベクターには、非組み込み型レンチウイルスベクター（ＩＤＬＶ）が含まれる。例えば、Ｏｒｙ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９３：１１３８２−１１３８８、Ｄｕｌｌ ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．７２：８４６３−８４７１、Ｚｕｆｆｅｒｙ ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．７２：９８７３−９８８０、Ｆｏｌｌｅｎｚｉ ｅｔ ａｌ． （２０００） Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２５：２１７−２２２、米国特許公開第２００９／０５４９８５号を参照されたい。

【0141】

薬学的に許容される担体は、部分的に、投与されている特定の組成物によって、ならびに組成物を投与するために使用される特定の方法によって、決定される。したがって、下に記載されるように、多種多様な好適な医薬組成物の製剤が利用可能である（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１７ｔｈ ｅｄ．，１９８９を参照されたい）。

【0142】

ヌクレアーゼコード化配列およびドナー構築物が同一または異なる系を用いて送達され得ることは明らかであろう。例えば、ヌクレアーゼおよびドナーは、同じベクターにより運ばれてもよい。代替として、ドナーポリヌクレオチドは、プラスミドにより運ばれてもよく、一方、１つ以上のヌクレアーゼは、ＡＡＶベクターにより運ばれてもよい。さらに、同一または異なる経路（筋肉内注射、尾静脈注射、他の静脈内注射、腹腔内投与および／または筋肉内注射）によって異なるベクターが投与されてもよい。ベクターは、同時にまたは任意の逐次的順序で送達されてもよい。

【0143】

したがって、本開示は、治療タンパク質をコードする導入遺伝子の挿入に影響されやすい疾患および状態のインビボまたはエクスビボ治療、例えば第ＶＩＩＩ因子（Ｆ８）等の凝固因子のヌクレアーゼ媒介組み込みによる血友病の治療を含む。組成物は、血清または標的器官または細胞内の所望の濃度の治療ポリペプチドを得るために効果的な量で、ヒト患者に投与される。投与は、ポリヌクレオチドが所望の標的細胞に送達される任意の手段によるものであってもよい。例えば、インビボおよびエクスビボ法の両方が企図される。門脈への静脈内注射が、好ましい投与方法である。他のインビボ投与様式には、例えば、肝葉または胆管への直接注射、および、例えば肝動脈を通した、肝臓より遠位の静脈内注射、肝実質への直接注射、肝動脈を介した注射、ならびに／または胆道系を通した逆行性注射が含まれる。エクスビボ投与形態には、離断肝細胞または肝臓の他の細胞のインビトロでの形質導入に続く、形質導入された離断肝細胞の、ヒト患者の門脈脈管、肝実質または胆道系への再注入が含まれ、例えば、Ｇｒｏｓｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．， （１９９４） Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， ６：３３５−３４１を参照されたい。

【0144】

投与される有効量のヌクレアーゼ（複数可）およびドナーは、患者間で、および目的の治療ポリペプチドにより変動する。したがって、有効量は、組成物を投与する医者によって最も良く決定され、適切な投与量は、当業者により容易に決定され得る。組み込みおよび発現のために十分な時間（例えば、典型的には４〜１５日）経過させた後、治療ポリペプチドの血清または他の組織中のレベルの分析、および投与前の初期レベルとの比較によって、投与されている量が低すぎるか、適正範囲内であるか、または高過ぎるかが決定される。初期および後続の投与に好適なレジメンもまた変動し得るが、必要に応じて、初期投与に続く後の投与により類型化される。後続の投与は、１日〜１年に１回から数年毎までの範囲の可変の間隔で行われ得る。当業者には、送達ベクターの免疫抑制による、形質導入の阻害または遮断を回避するための適切な免疫抑制技術が推奨され得ることが認識され、例えば、Ｖｉｌｑｕｉｎ ｅｔ ａｌ．， （１９９５）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．， ６：１３９１−１４０１を参照されたい。

【0145】

エクスビボおよびインビボ投与用製剤は共に、液体中の懸濁液または乳化液を含む。有効成分は、多くの場合、薬学的に許容され、かつ有効成分と適合性のある賦形剤と混合される。好適な賦形剤には、例えば、水、食塩水、ブドウ糖、グリセロール、エタノール等、およびそれらの組み合わせが含まれる。加えて、組成物は、湿潤剤もしくは乳化剤、ｐＨ緩衝剤、安定剤、または医薬組成物の有効性を増強する他の試薬等の少量の補助物質を含有してもよい。

【0146】

核酸の送達は、本発明の実施形態において、当業者に知られた任意の方法、例えば、限定されることなく、プロトプラストの形質転換により（例えば米国特許第５，５０８，１８４号を参照されたい）、乾燥／阻害媒介ＤＮＡ取り込みにより（例えば、Ｐｏｔｒｙｋｕｓ ｅｔ ａｌ． （１９８５） Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ．１９９：１８３−８を参照されたい）、エレクトロポレーションにより（例えば、米国特許第５，３８４，２５３号を参照されたい）、炭化ケイ素繊維との撹拌により（例えば、米国特許第５，３０２，５２３号および同第５，４６４，７６５号を参照されたい）、アグロバクテリウム媒介形質転換により（例えば、米国特許第５，５６３，０５５号、同第５，５９１，６１６号、同第５，６９３，５１２号、同第５，８２４，８７７号、同第５，９８１，８４０号、および同第６，３８４，３０１号を参照されたい）、ＤＮＡ被覆粒子の加速により（例えば、米国特許第５，０１５，５８０号、同第５，５５０，３１８号、同第５，５３８，８８０号、同第６，１６０，２０８号、同第６，３９９，８６１号、および同第６，４０３，８６５号を参照されたい）、ならびに植物細胞にＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチドおよび／もしくはタンパク質または核酸およびペプチドの組み合わせを送達する方法におけるナノ粒子、ナノ担体および細胞透過性ペプチドにより（国際出願第ＷＯ２０１１２６６４４Ａ２号、同第ＷＯ２００９０４６３８４Ａ１号、同第ＷＯ２００８１４８２２３Ａ１号）、植物細胞内に導入され得る。

【0147】

これらの技術等の技術を適用することにより、事実上いかなる種類の細胞も、安定して形質転換され得る。いくつかの実施形態において、形質転換ＤＮＡは、宿主細胞のゲノム内に組み込まれる。多細胞種の場合、トランスジェニック細胞は、トランスジェニック生物に再生され得る。これらの技術のいずれも、例えば、トランスジェニック植物のゲノム内に本発明の１つ以上の核酸配列を含むトランスジェニック植物を生成するために使用され得る。

【0148】

植物内に発現ベクターを導入するために最も広く使用されている方法は、アグロバクテリウムの天然形質転換系に基づく。Ａ．ツメファシエンスおよびＡ．リゾゲネスは、遺伝子的に植物細胞を形質転換する植物病原性土壌細菌である。Ａ．ツメファシエンスおよびＡ．リゾゲネスのＴ_ｉおよびＲ_ｉプラスミドは、それぞれ、植物の遺伝子的形質転換を担う遺伝子を有する。Ｔ_ｉ（腫瘍誘発）プラスミドは、形質転換植物に移入されるＴ−ＤＮＡとして知られる大きなセグメントを含有する。Ｔ_ｉプラスミドの別のセグメントであるｖｉｒ領域は、Ｔ−ＤＮＡ移入を担う。Ｔ−ＤＮＡ領域には、それぞれ末端反復ヌクレオチド配列で構成される左側および右側境界が隣接する。いくつかの修飾されたバイナリベクターにおいては、腫瘍誘発遺伝子が欠失しており、ｖｉｒ領域の機能を使用して、Ｔ−ＤＮＡ境界配列が隣接する外来ＤＮＡが移入される。Ｔ−領域はまた、例えば、トランスジェニック植物および細胞の効率的な回収のための選択可能マーカー、ならびに、本発明の融合タンパク質をコードする核酸等の、移入のための挿入配列のためのマルチクローニング部位を含有し得る。

【0149】

したがって、いくつかの実施形態において、植物形質転換ベクターは、Ａ．ツメファシエンスのＴ_ｉプラスミド（例えば、米国特許第４，５３６，４７５号、同第４，６９３，９７７号、同第４，８８６，９３７号、および同第５，５０１，９６７号、ならびに欧州特許第ＥＰ０１２２７９１号を参照されたい）またはＡ．リゾゲネスのＲ_ｉプラスミドに由来する。追加的な植物形質転換ベクターは、例えば、限定されることなく、Ｈｅｒｒｅｒａ−Ｅｓｔｒｅｌｌａ ｅｔ ａｌ． （１９８３） Ｎａｔｕｒｅ ３０３：２０９−１３、Ｂｅｖａｎ ｅｔ ａｌ． （１９８３） （上記参照）、Ｋｌｅｅ ｅｔ ａｌ． （１９８５） Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ．３：６３７−４２、および欧州特許第ＥＰ０１２０５１６号により説明されるもの、ならびに前記のいずれかに由来するものを含む。天然で植物と相互作用するシノリゾビウム、リゾビウム、およびメソリゾビウム等の他の細菌は、多くの多様な植物への遺伝子移入を媒介するように修飾され得る。これらの植物関連共生細菌は、無毒化Ｔ_ｉプラスミドおよび好適なバイナリベクターの両方の獲得により、遺伝子移入に有効とすることができる。

【0150】

以下の実施例は、ヌクレアーゼがジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）またはＴＡＬＥＮを含む本開示の例となる実施形態に関する。これは例示目的のために過ぎず、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ系もしくは操作されたＤＮＡ結合ドメインを有するホーミングエンドヌクレアーゼ（メガヌクレアーゼ）、ならびに／または操作されたホーミングエンドヌクレアーゼ（メガヌクレアーゼ）のＤＮＡ結合ドメインおよび異種の切断ドメインの天然に存在する融合物等の他のヌクレアーゼを用いることができることが理解される。

【実施例】

【0151】

実施例１：材料および方法
細胞成長、トランスフェクション、およびＺＦＮ／ＴＡＬＥＮアッセイ。
Ｋ５６２（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２４３）のトランスフェクションは、Ａｍａｘａ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ ＶおよびプログラムＴ−０１６； ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ ＣＣｌ−６１）、Ａｍａｘａ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ ＴおよびプログラムＵ−０２３を使用した。全てのトランスフェクションは、１０^６細胞および以下のプラスミドを含有した：ＡＡＶＳ１、３μｇの２Ａ−連結ＺＦＮおよびドナー；ＩＬ２Ｒγ およびＣＣＲ５、２μｇの各非連結ＺＦＮ プラスミドおよび１０μｇのドナープラスミド； ＧＳ、ＦＵＴ８、３μｇの２Ａ−連結ＺＦＮおよび１０μｇのドナープラスミド。ＺＦＮ設計を含むさらなる詳細については、米国特許第８，１１０，３７９号および米国特許公開第２０１００１２９８６９号および同２００９００４２２５０号、ならびにＤｅＫｅｌｖｅｒ ｅｔ ａｌ． （２０１０） Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ． ２０（８）：１１３３−１１４２、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ． （２００９） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ． １０６（１）：９７−１０５、Ｍａｌｐｈｅｔｔｅｓ ｅｔ ａｌ． （２０１０） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １０６（５）：７７４−８３、Ｐｅｒｅｚ ｅｔ ａｌ． （２００８） Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ． ２６（７）：８０８−８１６、Ｕｒｎｏｖ ｅｔ ａｌ． （２００５） Ｎａｔｕｒｅ ４３５（７０４２）：６４６−６５１を参照されたい。

【0152】

ＦＵＴ８ ＴＡＬＥヌクレアーゼ対（ＳＢＳ １０１０８２およびＳＢＳ １０１０８６）は、ＦＵＴ８のエキソン１０においてＺＦＮ結合部位に直接重複し、Δ１５２／＋６３ ＮおよびＣ末端切断点を使用して構築された（Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ． ２０１１）。ＳＢＳ １０１０８２ ＦＵＴ８ ＴＡＬＥの結合部位は、５’−ｔｇｔ ａｔｃ ｔｇｇ ｃｃａ ｃｔｇ ａｔ−３’（配列番号：１）；ＳＢＳ １０１０８６， ５’− ｔｔｔ ｇｔｃ ｔｔｔ ｇｃｃ ｔｃｃ ｔｔ−３’（配列番号：２）である。

【0153】

ドナープラスミド設計および構築
ＡＡＶＳ１（５’−ｔｇｔ ｃｃｃ ｃｔｃ ｃＡＣ ＣＣＣ ＡＣＡ ＧＴＧ Ｇｇｇ ｃｃａ ｃＴＡ ＧＧＧ ＡＣＡ ＧＧＡ Ｔｔｇ ｇｔｇ ａｃａ ｇａ−３’、配列番号：３）、離間−反転ＡＡＶＳ１（５’−ｔｇｔ ｃｃｃ ｃｔｃ ｃＡＣ ＣＣＣ ＡＣＡ ＧＴＧ Ｇｇｔ ｇｇｃ ｃＴＡ ＧＧＧ ＡＣＡ ＧＧＡ Ｔｔｇ ｇｔｇ ａｃａ ｇａ−３’、配列番号：５４１）、ＧＳ（５’−ｇａｃ ｃＣＣ ＡＡＧ ＣＣＣ ＡＴＴ ＣＣＴ ＧＧＧ Ａａｃ ｔｇｇ ａＡＴ ＧＧＴ ＧＣＡ ＧＧＣ Ｔｇｃ ｃａｔ ａｃｃ ａａ−３’、配列番号：４）、およびＩＬ２Ｒγ（５’−ｇｔｔ ｔｃｇ ｔｇｔ ｔＣＧ ＧＡＧ ＣＣＧ ＣＴＴ Ｔａａ ｃｃｃ ＡＣＴ ＣＴＧ ＴＧＧ ＡＡＧ ｔｇｃ ｔｃａ ｇｃａ ｔｔ−３’、配列番号：５）ＺＦＮ対に対するＺＦＮ標的部位を含有するオリゴを、５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５、および１ｍＭ ＥＤＴＡ中でそれらの逆相補配列にアニールした。米国特許公開第２０１００１２９８６９号、ならびに米国特許第７，９５１，９２５号および同第８，１１０，３７９号も参照されたい。大文字は、ＺＦＮ結合部位を指し、一方小文字は、隣接およびスペーサー配列を指す。

【0154】

次いで、２本鎖産物を、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＫＳ−ベクター（Ａｇｉｌｅｎｔ）のＥｃｏＲＶ部位にクローニングした。ＣＣＲ５ドナープラスミドは、ｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）へのＣＣＲ５ 標的部位オリゴヌクレオチド（５’−ＧＴＣ ＡＴＣ ＣＴＣ ＡＴＣ ＣＴＧ ＡＴＡ ＡＡＣ ＴＧＣ ＡＡＡ ＡＧａ−３’、配列番号：６）；５−ＣＴＴ ＴＴＧ ＣＡＧ ＴＴＴ ＡＴＣ ＡＧＧ ＡＴＧ ＡＧＧ ＡＴＧ ＡＣａ−３’ 配列番号：７の挿入から得られた（米国特許第７，９５１，９２５号も参照されたい）。第２のＡＡＶＳ１ドナープラスミド（図１Ｅを参照されたい）は、ｐＧＫプロモーターにより主導されるＧＦＰオープンリーディングフレームも含有するｐＣＲ２．１ベースプラスミドのＥｃｏＲＶ部位への、上記ＡＡＶＳ１標的部位オリゴの挿入により作製された。

【0155】

ＦＵＴ８ドナープラスミドは、ＺＦＮ／ＴＡＬＥＮ結合部位（５’−ｇｇｃ ＣＧＴ ＧＴＡ ＴＣＴ ＧＧＣ ＣＡＣ ＴＧＡ ＴＧＡ ＣＣＣ ＴＴＣ ＴＴｔ ｇｔｔ ａＡＡ ＧＧＡ ＧＧＣ ＡＡＡ ＧＡＣ ＡＡＡ Ｇｔａ ａ −３’、配列番号：８）の、ＩｇＧおよびピューロマイシン耐性導入遺伝子を含有するドナープラスミドへの挿入により作製された（Ｍｏｅｈｌｅ ｅｔ ａｌ． （２００７） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ １０４（９）：３０５５−３０６０）。

【0156】

標的化組み込みのアッセイ
全てのＰＣＲ反応は、Ａｃｃｕｐｒｉｍｅ ＨｉＦｉ（商標）ポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用し、１００ｎｇのゲノムＤＮＡをテンプレートとして用いて行った。ゲノムＤＮＡは、Ｍａｓｔｅｒｐｕｒｅ（登録商標）キット（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）で精製した。

【0157】

ＡＡＶＳ１（ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃとしても知られる）でのＡＡＶＳ１ ＧＦＰドナープラスミドの標的化組み込みを、ＰＣＲ増幅により４つ全ての可能な染色体−ドナー接合点において分析した。ＰＣＲ反応は、６０°のアニール温度、３０秒の伸長時間、３０サイクルの増幅、および以下のプライマーを使用した：ＡＢ左、ＡＡＶＳ１ ＣＥＬ−Ｉ Ｆ（５’−ｃｃｃ ｃｔｔ ａｃｃ ｔｃｔ ｃｔａ ｇｔｃ ｔｇｔ ｇｃ−３’、配列番号：９）およびＡＡＶＳ１ Ｊｕｎｃｔｉｏｎ Ｒ（５’−ｇｇｃ ｇａｔ ｔａａ ｇｔｔ ｇｇｇ ｔａａ ｃｇ−３’、配列番号：１０）；ＡＢ右、ＡＡＶＳ１ Ｊｕｎｃｔｉｏｎ Ｆ（５’−ｇｇｃ ｃｔｃ ｔｔｇ ｇｔｃ ａａｇ ｔｔｇ ｔｔ−３’、配列番号：１１）およびＡＡＶＳ１ ＣＥＬ−Ｉ Ｒ（５’−ｃｔｃ ａｇｇ ｔｔｃ ｔｇｇ ｇａｇ ａｇｇ ｇｔａ ｇ−３’、配列番号：１２）；ＢＡ左、ＡＡＶＳ１ ＣＥＬ−Ｉ ＦおよびＡＡＶＳ１ Ｊｕｎｃｔｉｏｎ Ｆ；ＢＡ右、ＡＡＶＳ１ Ｊｕｎｃｔｉｏｎ ＲおよびＡＡＶＳ１ ＣＥＬ−Ｉ Ｒ。図８Ａにおける配列に対しては、以下のプライマーを使用した：ＡＢ左、Ｍ１３Ｆ（５’−ｇｔａ ａａａ ｃｇａ ｃｇｇ ｃｃａ ｇｔ−３’、配列番号：１３）およびＡＡＶＳ１ ＣＥＬ−Ｆ；ＢＡ右、Ｍ１３ＦおよびＡＡＶＳ１ ＣＥＬ−Ｉ Ｒ。

【0158】

ＩＬ２Ｒγ、ＣＣＲ５、およびＧＳでの標的化組み込みを、ＰＣＲ増幅により分析した。ＰＣＲ反応は、５８°のアニール温度、３０秒の伸長時間、５％のＤＭＳＯ、２６サイクルの増幅、および以下のプライマーと組み合わせてＭ１３Ｆプライマーを使用した：ＩＬ２Ｒγ ＢＡ左、ＩＬ２ＲγＣＥＬ−Ｉ Ｆ（５’−ａｃｃ ａｇｔ ｇａｇ ｔｔｔ ｔｃａ ｔｔａ ｇｇ−３’、配列番号：１４）；ＩＬ２Ｒγ ＡＢ右、ＩＬ２ＲγＣＥＬ−Ｉ Ｒ（５’−ｔｇｇ ａｇｃ ａａａ ａｇａ ｃａｇ ｔｇｇ ｔｇ−３’、配列番号：１５）；ＣＣＲ５ ＢＡ左、Ｒ５Ｆ（５’−ａａｇ ａｔｇ ｇａｔ ｔａｔ ｃａａ ｇｔｇ ｔｃａ ａｇｔ ｃｃ−３’、配列番号：１６）；ＣＣＲ５ ＡＢ右、Ｒ５Ｒ（５’−ｃａａ ａｇｔ ｃｃｃ ａｃｔ ｇｇｇ ｃｇ−３’、配列番号：１７）；ＧＳ ＢＡ左、ＧＪＣ １７２Ｆ（５’−ａｔｃ ｃｇｃ ａｔｇ ｇｇａ ｇａｔ ｃａｔ ｃｔ−３’、配列番号：１８）；ＧＳ ＡＢ右、ＧＪＣ １７３Ｒ（５’−ｇｔｇ ｔａｔ ｇｔｔ ｃｇｔ ｔｃａ ｃｃｃ ａｃ−３’、配列番号：１９）。

【0159】

ＧＳでのＡＡＶＳ１ドナーの標的化組み込み（図２Ｂ）を、ＰＣＲ増幅により分析した。ＰＣＲ反応は、５８℃のアニール温度、３０秒の伸長時間、５％のＤＭＳＯ、２６サイクルの増幅、および以下のプライマーを使用した：ＡＢ左、Ｊｃｎ１Ｆ（５’−ｃａａ ａｔａ ｇｇａ ｃｃｃ ｔｇｔ ｇａａ ｇｇａ−３’、配列番号：２０）およびＪｃｎ１Ｒ（５’−ｇａｔ ｔａａ ｇｔｔ ｇｇｇ ｔａａ ｃｇｃ ｃａｇ−３’、配列番号：２１）；ＢＡ左、Ｊｃｎ３Ｆ（５’−ａａｔ ａｇｇ ａｃｃ ｃｔｇ ｔｇａ ａｇｇ ａ−３’、配列番号：２２）およびＪｃｎ３Ｒ（５’−ｇｔｇ ｔｇｇ ａａｔ ｔｇｔ ｇａｇ ｃｇｇ ａｔａ−３’、配列番号：２３）。

【0160】

ＦＵＴ８でのＩｇＧドナーの標的化組み込み（図４）を、ＰＣＲ増幅により分析した。ＰＣＲ反応は、６０°のアニール温度、 ３０秒の伸長時間、３０サイクルの増幅（粗溶解物のスクリーニングに関しては３５サイクル）、および以下のプライマーを使用した：ＡＢ左接合点、ＧＪＣ ７５Ｆ（５’−ａｇｔ ｃｃａ ｔｇｔ ｃａｇ ａｃｇ ｃａｃ ｔｇ−３’、配列番号：２４）およびＳＣ ｓｅｑｐｆｚＲ（５’− ａｇａ ｇｔｇ ａｇｇ ｃｔｃ ｔｇｔ ｃｔｃ ａａ−３’、配列番号：２５）；ＡＢ右接合点、ＦＵＴ８ドナーＣＥＬＩＦ２（５’−ｔａｃ ｇｔａ ｔａｇ ｇｃｔ ｇｃｇ ｃａａ ｃｔ−３’、配列番号：２６）およびＧＪＣ １１５Ｒ（５’−ｇｃａ ｃａｔ ｇｔａ ｇｔｃ ｔｔｔ ｇａｔ ｔｔｔ ｇ−３’、配列番号：２７）；ＢＡ左接合点、ＧＪＣ７５ＦおよびＦＵＴ８ドナーＣＥＬＩＦ２；ＢＡ右接合点、ＳＣ ｓｅｑｐｆｚＲおよびＧＪＣ１１５Ｒ。

【0161】

ＡＡＶＳ１におけるＡＡＶＳ１ ＧＦＰドナー組み込みのサザンブロットを、前述の通り精査した（ＤｅＫｅｌｖｅｒ ｅｔ ａｌ． ２０１０， 同書）。このサザンブロットから推定される結果は、以下の通りである：ＡＡＶＳ１プローブは、ＡＢおよびＢＡ方向に対して、それぞれ２０９２または６５９２ｂｐバンドにハイブリダイズする。野生型３倍体ＡＡＶＳ１遺伝子座は、３２８７ｂｐバンドとして観察される。ゲノム内の別の箇所でのＡＡＶＳ１ ＧＦＰドナー組み込みのサザンブロットを、ＧＦＰの完全オープンリーディングフレームで精査した。ＡＡＶＳ１での組み込みは、ＡＢおよびＢＡ方向に対してそれぞれ３３２３または４４８２ｂｐバンドを生成し、ゲノム内の他の箇所での非標的化組み込みは、決定不能なサイズの２次バンドを生成する。ＧＳにおけるＧＳドナー組み込みのサザンブロットを、５’−ｃｔｇ ｃａｇ ｇｔｇ ａａｇ ａｃａ ｇｇａ ｔｇ−３’および５’−ｃｃｃ ａｃｔ ａｇａ ａａｇ ａａｃ ａｔｇ ｔｔ−３’により境界されるＧＳ遺伝子の４２４ｂｐ断片で精査した。ＧＳでの組み込みは、２９３３ｂｐのハイブリダイズするバンドとして明確化され、野生型ＧＳ遺伝子座は、１９７７ｂｐバンドを生成する。ゲノム内の他の箇所におけるＧＳドナー組み込みのサザンブロットを、大腸菌ｂｌａ遺伝子のＢｓａＩ−ＳｃａＩ断片で精査した。正しく組み込まれた導入遺伝子は、２０５５ｂｐバンドを生じ、ＧＳ偽遺伝子への組み込みは、偽遺伝子および挿入方向に依存して、４８７８、４２１４、１００８０、および９４１６ｂｐのバンドを生じ、他の非標的化組み込みは、予測不可能なサイズの単一バンドを生成する。ＦＵＴ８における組み込みのサザンブロットを、ＦＵＴ８遺伝子座の４０７ｂｐ ＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｍｎＩ断片で精査した。両方のＦＵＴ８サザンに対して、ゲノムＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩで切断した。

【0162】

カスタムＰｙｔｈｏｎスクリプトを使用して、ＦＵＴ８、ＧＳ、およびＧＳ偽遺伝子を含有するコンティグを全ＣＨＯゲノム配列決定データから抽出した（Ｘｕ ｅｔ ａｌ． （２０１１） Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２９（８）：７３５−４１）。ＦＵＴ８は、コンティグＡＦＴＤ０１０６５９３２．１上に存在し、ＧＳはコンティグＡＦＴＤ０１１０７１７８．１上に存在する。１つのＧＳ偽遺伝子（ＡＦＴＤ０１０４３５９９．１内に含有される）は、ＺＦＮ結合部位の完全な保存、プローブのエキソン５部分に対する１２０／１２８（９４％）ｂｐの相同性を有し、６３３３ｂｐのＳｃａＩ断片内に存在すると推定される。第２のＧＳ偽遺伝子（ＡＦＴＤ０１１５４８５９．１内に含有される）は、ＺＦＮ結合部位に１つのミスマッチ、プローブのエキソン５部分に対する１１６／１２８（９１％）ｂｐの相同性を有し、１３３２０ｂｐのＳｃａＩ断片内に存在すると推定される。

【0163】

製造者の説明に従いＰｉｅｒｃｅ Ｅａｓｙ−Ｔｉｔｅｒ ＩｇＧ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（２３３１０）を使用して、抗体濃度を測定した。バックグラウンドより少なくとも２倍高いクローンを陽性として分類した。

【0164】

実施例２：２本鎖ドナーのインビボ切断後の標的化組み込み
Ａ．ＡＡＶＳ１
ゲノム標的部位を切断する同じＺＦＮを使用した導入遺伝子のインビボ切断が、ドナーおよび染色体切断を同期化し、分解に対する導入遺伝子の脆弱性を最小化させるかどうかを試験するために、Ｋ５６２細胞を、ＡＡＶＳ１標的化ＺＦＮおよびドナープラスミドのインビボ切断のためのＡＡＶＳ１ ＺＦＮ標的部位を含むドナープラスミドでトランスフェクトした。簡潔に説明すると、実施例１に記載のように、十分特性決定されきわめて活性なＡＡＶＳ１ ＺＦＮの認識部位を、自立的ＧＦＰ発現カセットを含有するがＡＡＶＳ１遺伝子座に対する相同性を有さないドナープラスミドにクローニングした。米国特許第８，１１０，３７９号およびＤｅＫｅｌｖｅｒ ｅｔ ａｌ． （２０１０） Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ． ２０（８）：１１３３−１１４２を参照されたい。ドナープラスミド（ＺＦＮ標的部位を有する、または有さない）を、ＡＡＶＳ１ ＺＦＮをコードする第２のプラスミドと共に、Ｋ５６２細胞に共トランスフェクトした。

【0165】

染色体ＡＡＶＳ１部位への挿入を、実施例１において上述したようにトランスフェクションから３日後に単離されたゲノムＤＮＡから標的化ドナー 組み込みにより形成された固有の接合点のＰＣＲ増幅により分析した。

【0166】

図１に示されるように、同族のＺＦＮと共トランスフェクトされると、ＺＦＮ部位含有ドナープラスミドおよび染色体の両方の同時切断が生じ、染色体へのプラスミドの挿入が可能となる。ＺＦＮオーバーハングの単純な連結により推定される方向でのドナープラスミドの挿入は、ＡＢ方向として表記し、代替の方向は、ＢＡ方向として表記した。図１Ｄに示されるように、標的部位間のヌクレオチド（スペーサー）が ゲノム（野生型）配列の逆相補配列である場合、ＢＡ（逆）方向が有利である。

【0167】

さらに、図１Ｄおよび１Ｅに示されるように（１Ｅのレーン６、８、１０、１７、１９および２１を参照されたい）、切断されたドナーＤＮＡの捕捉の成功と一致して、ＡＢおよびＢＡ方向の両方におけるドナー組み込みにより形成された、推定される５’および３’接合点が検出された。ＢＡ方向は、逆相補配列スペーサーに有利であった（図１Ｄ）。（ｉ）ＡＡＶＳ１ ＺＦＮ部位を有さないドナーは、ＡＡＶＳ１遺伝子座の効率的な切断にもかかわらず組み込まれず（図１Ｅ、レーン５、７、９、ならびにレーン１６、１８、および２０；図５Ａを参照されたい）、（ｉｉ）対応するＺＦＮの共トランスフェクションのないドナーのトランスフェクションもまた、標的化組み込みをもたらさなかったため、ドナー組み込みにはＺＦＮ媒介切断が必要であった。

【0168】

ＺＦＮおよびドナーの両方でトランスフェクトされたプールからの限界希釈法により、細胞クローンを得た（レーン８／１９）。３つのＧＦＰ陽性および接合点ＰＣＲ陽性クローンを、サザンブロットにより２回分析し、ドナープラスミドの組み込みを確認した。クローンは、３つのクラスに分類される：非挿入対立遺伝子に加えて、クローン１は１つのＡＢ挿入を含有し、クローン２は１つのＢＡ挿入を含有し、クローン３はＡＢおよびＢＡ挿入の両方を含有する（図１Ｆ）。

【0169】

３つのクローンを、ＧＦＰ特異的プローブを用いたサザンブロットにより、標的外組み込みについても分析した。クローン１は、ＡＡＶＳ１での推定される挿入のみを含有し、一方クローン２および３は、ＡＡＶＳ１挿入に加えてゲノム内の他の箇所での導入遺伝子挿入を含有した（図１Ｆ）。

【0170】

これらの３つの細胞株からの染色体−ドナー組み込み接合点のＰＣＲ単位複製配列を、クローニングおよび配列決定した。図７に示されるように、クローン１および３は、５’および３’接合点の両方においてドナーおよび染色体オーバーハングの完全な連結を有するＡＢ挿入を含有した。クローン２および３は、左の５’接合点において微小相同性主導的修復により生成された対立遺伝子を有するＢＡ挿入を含有した。

【0171】

Ｂ．ＩＬ２Ｒγ、ＧＳおよびＣＣＲ
切断されたドナーの捕捉が、Ｋ５６２細胞におけるＡＡＶＳ１内への組み込みに制限されないことを実証するために、Ｋ５６２およびＣＨＯ細胞における３つの他の遺伝子座（ＩＬ２Ｒγ、ＣＣＲ およびＧＳ）において類似の実験を行った。成功した標的化組み込みを、上述のように各方向（ＡＢおよびＢＡ）に対して、１つの染色体−ドナー接合点において監視した。

【0172】

ＺＦＮ切断の部位に標的化された部位特異的組み込みが、Ｋ５６２細胞における ＩＬ２ＲγおよびＣＣＲ５遺伝子座、ならびにＣＨＯ−Ｋ１細胞におけるＧＳ遺伝子座に観察された。（図２Ａ、レーン３、７、１１、１５、１９、および２３）。ＡＡＶＳ１への組み込みと同様に、ＩＬ２Ｒγ、ＣＣＲ５、およびＧＳでの組み込みは、ドナープラスミドにおけるＺＦＮ切断部位の含有（図２Ａ、レーン１、５、９、１３、１７、および２１）、ならびにＺＦＮ自体の同時送達に依存した。染色体標的およびドナープラスミド上の両方でのＺＦＮ活性は、全ての試料にわたって本質的に均一であった（図５Ｂ）。

【0173】

これらの遺伝子座から、およびＡＡＶＳ１要素の類似したプールからの染色体−ドナー接合点ＰＣＲ産物の配列決定では、標的化遺伝子座における正しい組み込みと一致する一連の挿入イベントが明らかとなった（図８）。

【0174】

したがって、ＤＳＢにおけるインビボ切断導入遺伝子ドナーを捕捉する能力は、哺乳動物ＤＮＡ修復機構の一般的特性であり、特定の標的部位または細胞型に依存しない。

【0175】

実施例３：インビボおよびインビトロ切断
標的化遺伝子挿入の観察されたレベルを支持するにはインビボ切断が必要であることを確認するために、実施例１に記載のように、インビボ切断ドナー、およびＥｃｏＲＶを使用してインビトロで切断されたドナーを使用して、標的化組み込みの直接比較を行った。

【0176】

図２に示されるように、事前に切断されたドナープラスミドの組み込みが時折検出可能であったが、インビボ切断ドナーと比較して顕著に効率が低かった（図２Ａ、レーン２／３、６／７、１０／１１、１４／１５、１８／１９、および２２／２３を比較されたい）。さらに、事前に切断されたドナーＤＮＡの使用は、染色体捕捉前のドナーＤＮＡ分解のレベルの増加と一致して、接合点ＰＣＲサイズの範囲の増加を示した（例えば、図２Ａ、レーン２２を参照されたい）。

【0177】

標的化組み込みが２つの異なるヌクレアーゼ（ＺＦＮ）の使用により刺激され得ることを確認するために、ＧＳ ＺＦＮ対（実施例１）を使用してＣＨＯ−Ｋ１細胞の染色体を切断し、またＡＡＶＳ１ ＺＦＮ対を使用して同じ細胞におけるドナープラスミドを切断した。ＧＳ ＺＦＮ対が染色体およびドナーを切断した場合（図２Ａの場合のように）、ならびにＧＳ ＺＦＮが染色体を切断し、ＡＡＶＳ１ ＺＦＮがドナーを切断した場合（図２Ｂ、レーン６および８、レーン１５および１７）の両方において、ＧＳにおける組み込みが同様の頻度で検出された。ここでも、ＧＳにおける切断効率は、全てのＧＳ ＺＦＮトランスフェクション試料にわたって均一であった（図５Ｃ）。

【0178】

したがって、インビボ切断は、ドナー分子の事前切断よりも効率的である。

【0179】

実施例４：ＣＨＯ細胞への相同性非依存性標的化組み込み
ＣＨＯ細胞における標的化組み込みは、バイオテクノロジーにおいて特に重要な用途を有するが、ＣＨＯ細胞は、数キロベースの導入遺伝子のＨＤＲベース標的化組み込みを極めて不十分にしか行わない。この点を強調するために、本質的にＭｏｅｈｌｅ ｅｔ ａｌ． （２００７） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ １０４（９）：３０５５−３０６０）に記載されるように、プロモーターを含まないＧＦＰ遺伝子をプロモーター含有アクセプター遺伝子座内に送達するように設計された系を使用しして、ＨＥＫ−２９３細胞およびＣＨＯ−Ｋ１細胞両方におけるＨＤＲ媒介標的化組み込みを比較した。標的化組み込みは、ＧＦＰの発現をもたらし、フローサイトメトリーによる定量化を可能にする。

【0180】

ＺＦＮおよび相同性含有ドナープラスミド（ＨＤＲによる組み込みのため）でトランスフェクトした場合、ＨＥＫ−２９３細胞の０．５％から３％がＧＦＰ陽性となった（図６）。対照的に、ＣＨＯ−Ｋ１細胞はいずれも、同様にトランスフェクトされた場合、ＧＦＰ陽性とならなかった。ＣＨＯ細胞はＨＤＲベース標的化組み込みを不十分にしか行わないが、組み換えタンパク質産生における実用性が証明されていることを考慮して、我々は次に、ドナー ＤＮＡのインビボ切断がＣＨＯ細胞における標的化組み込みを主導するのに利用可能であるかどうか調べた。

【0181】

ＧＳにおける標的化組み込みを有するプールからのＣＨＯ−Ｋ１細胞（図２Ａ、レーン１９／２３）を、制限希釈法によりクローニングし、単一細胞由来クローンを、部位特異的組み込みに関してＰＣＲによりスクリーニングした。ＨＤＲベースの手法で得られた否定的な結果とは対照的に、インビボ切断ドナーＤＮＡの相同性非依存性捕捉は、左染色体−ドナーＢＡ接合点に対しＰＣＲ陽性である１０％（１７／１５７）の単一細胞由来クローン、右ＢＡ接合点に対し陽性である８％（１３）の単一細胞由来クローン、および両方のＢＡ接合点に対し陽性である６％（１０）の単一細胞由来クローンを生成した。これらの１０のクローンのうち８つを、サザンブロットによる分析のために無作為に選択した。８つ全てのクローンが、ＧＳ標的部位における推定標的化導入遺伝子挿入、野生型ＧＳ対立遺伝子、および２つのＧＳ偽遺伝子を含有した（図３）。野生型ＣＨＯ−Ｋ１細胞には、野生型ＧＳ対立遺伝子および偽遺伝子のみが存在する（図３、レーン９）。さらに、導入遺伝子特異的配列で精査した場合、８つのクローンのうち５つは、ＧＳにおいて導入遺伝子のただ１つのコピーを含有し、３つは、ＧＳにおいて導入遺伝子コピーおよびＣＨＯゲノムの他の部位において１つ以上の無作為に組み込まれたコピーを含有することを示し、その１つは、ＧＳ偽遺伝子内への組み込みに対応していた（図３、それぞれレーン１０、１２、１３、１６、１７およびレーン１１、１４、１５）。染色体−導入遺伝子接合部を配列決定したが、これを図９に示す。

【0182】

実施例５：ＦＵＴ８への標的化組み込みおよびその妨害
導入遺伝子を慣習的にＣＨＯ細胞ゲノム内に挿入し、生物薬剤タンパク質、特に抗体を生成する。ＦＵＴ８遺伝子の欠失を有するＣＨＯ細胞は、１００倍高い抗体依存性細胞傷害性を有するフコシル化抗体を生成する（Ｍａｌｐｈｅｔｔｅｓ ｅｔ ａｌ． （２０１０） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １０６（５）：７７４−８３；Ｙａｍａｎｅ−Ｏｈｎｕｋｉ ｅｔ ａｌ． （２００４） Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ． ８７（５）：６１４−２２）。さらに、ＦＵＴ８発現のノックアウトを選択することができ、したがって、標的化組み込みをこの選択可能な形質と結合させることができる。したがって我々は、インビボ切断抗体生成カセットの挿入により、ＦＵＴ８遺伝子を妨害するために、前述のＦＵＴ８特異的ＺＦＮを使用した（Ｍｏｅｈｌｅ ｅｔ ａｌ． （２００７） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ １０４（９）：３０５５−３０６０）。さらに、我々は、インビボ切断ドナーの捕捉が、ＦＵＴ８に特異的なＴＡＬＥヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）により生成された２本鎖切断で生じ得るかどうかを決定することを望んだ。

【0183】

簡潔に説明すると、ＦＵＴ８を切断するＺＦＮまたはＴＡＬＥＮを、実施例１に記載のようにＦＵＴ８ヌクレアーゼ切断部位を含有する抗体発現プラスミドで共トランスフェクトした。レンズマメ（Ｌｅｎｓ ｃｕｌｉｎａｒｉｓ）凝集素および制限希釈法によりクローニングされた細胞を使用して、トランスフェクトされたプールを２対立遺伝子ＦＵＴ８ノックアウトのために選択した（Ｍａｌｐｈｅｔｔｅｓ ｅｔ ａｌ． （２０１０） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １０６（５）：７７４−８３を参照されたい）。左および右導入遺伝子／染色体接合点の両方のＰＣＲにより、クローンをＩｇＧの分泌およびＩｇＧ導入遺伝子の挿入についてスクリーニングした。

【0184】

図４に示されるように、ＺＦＮ処理クローン、２５／９６（２６％）のクローンがＩｇＧを発現し、１４／９６（１５％）のクローンが完全ＩｇＧ導入遺伝子の挿入に陽性であった。ＰＣＲにより挿入に陽性であった全てのクローンのうち１つを除いて、ＩｇＧを発現した。ＦＵＴ８ ＴＡＬＥＮに関しては同様の結果が得られ、３５／１７１（２０％）のクローンがＩｇＧを発現し、完全導入遺伝子挿入を有する１６（９％）全てのクローンが、ＩｇＧを発現した。ＰＣＲにより検出可能な１つ（ただし両方ではない）の導入遺伝子組み込み接合点を有するクローンが、残りのＩｇＧ発現クローンのかなりの割合を占めた（図４Ａ）。

【0185】

また、これらの実験を、ＦＵＴ８に標的化されたＴＡＬＥ−ヌクレアーゼを使用して行った。ＦＵＴ８における導入遺伝子組み込みは、ＴＡＬＥＮ媒介導入遺伝子挿入から得られた１０のＰＣＲおよびＩｇＧ陽性クローンに対するサザンブロット分析により確認された（図４Ｂおよび４Ｃ）。さらに、図１２は、ＺＦＮ（図１０Ａ）またはＴＡＬＥＮ（図１０Ｂ）を使用したＦＵＴ８組み込みドナーのＰＣＲ接合点の配列決定により得られた配列を示す。

【0186】

要約すると、本明細書に記載の方法および組成物は、相同性非依存的方法により、相同性主導的組み込みに対して抵抗性である細胞株（例えばＣＨＯ細胞）を含む、大型導入遺伝子の容易な標的化組み込みを提供する。

【0187】

実施例６：小麦ＡＨＡＳ遺伝子座への標的化組み込みおよびその妨害
ＡＨＡＳゲノム標的配列の特性決定および同定
参照により本明細書に組み込まれる米国仮特許番号第６１／８０９，０９７号に記載のように、３つの同祖ＡＨＡＳ遺伝子の転写された領域を同定および決定し、ジンクフィンガーヌクレアーゼを、ドナー配列のＮＨＥＪ媒介標的化のための部位を結合および切断するように設計した。これらの新規配列は、配列番号：１１６、配列番号：１１７、および配列番号：１１８として列挙される。以前の配列決定研究において、コムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ）からのＡＨＡＳ遺伝子の同祖コピーが同定され、染色体６Ａ、６Ｂおよび６Ｄの長腕に遺伝子的にマッピングされた（Ａｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， （２００４） Ｗｅｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ５２：８３−９０；およびＬｉ ｅｔ ａｌ．， （２００８） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ ２２：２１７−２２５）。発現配列タグ（ＥＳＴ）の配列分析およびＧｅｎｂａｎｋにおいて利用可能なゲノム配列（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ：ＡＹ２１０４０５．１、ＡＹ２１０４０７．１、ＡＹ２１０４０６．１、ＡＹ２１０４０８．１、ＦＪ９９７６２８．１、ＦＪ９９７６２９．１、ＦＪ９９７６３１．１、ＦＪ９９７６３０．１、ＦＪ９９７６２７．１、およびＡＹ２７３８２７．１）を使用して、ＡＨＡＳ遺伝子（配列番号：１１６〜１１８）の同祖コピーの転写された領域を決定した。

【0188】

転写された領域の上流側および下流側に位置する新規な非コード化ＡＨＡＳ遺伝子配列を、初めて特性決定した。これらの非コード化配列を完全に特性決定するために、ＡＨＡＳ遺伝子の３つの同祖コピーのそれぞれの転写された配列を、ＢＬＡＳＴＮ（商標）クエリーとして使用し、コムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ）品種Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｓｐｒｉｎｇの全ゲノムショットガン配列決定から生成された、アセンブルされていないＲＯＣＨＥ ４５４（商標）配列リードをスクリーニングした。コムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ）品種Ｃｈｉｎｅｓｅ ＳｐｒｉｎｇのＲＯＣＨＥ ４５４（商標）配列リードは、５倍配列包括度まで生成された。配列アセンブリは、Ｒｏｃｈｅ ４５４（商標）のＳｅｑｕｅｎｃｈｅｒ ｓｏｆｔｗａｒｅ（商標）（ＧｅｎｅＣｏｄｅｓ、Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ、ＭＩ）を使用して完了させた。有意なＢＬＡＳＴＮ（商標）ヒット（Ｅ値＜０．０００１）を有する配列リードを使用して、これらの非転写領域を特性決定した。ＢＬＡＳＴＮ（商標）分析および配列アセンブリの反復ラウンドを行った。配列の全てが単一の連続した配列としてコンパイルされるように、各反復は、前の反復からのアセンブルされたＡＨＡＳ配列を組み込んだ。全体として、それぞれ染色体６Ａ、６Ｂおよび６Ｄ上に位置する同祖ＡＨＡＳ遺伝子のゲノム配列の４，３８４、７，５９０および６，２０５が特性決定された（配列番号：１１９〜１２１）。

【0189】

コムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ）品種Ｂｏｂｗｈｉｔｅ ＭＰＢ２６ＲＨから単離されたＡＨＡＳ遺伝子の配列分析
コムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ）品種Ｂｏｂｗｈｉｔｅ ＭＰＢ２６ＲＨからＡＨＡＳ遺伝子の同祖コピーをクローニングおよび配列決定して、高度の特異性で配列に結合することができる特異的ジンクフィンガータンパク質を設計するために好適なヌクレオチド配列を得た。コムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ）品種Ｂｏｂｗｈｉｔｅ ＭＰＢ２６ＲＨから得られたＡＨＡＳヌクレオチド配列の配列分析は、Ｇｅｎｂａｎｋ内に存在するヌクレオチドの注釈およびＲＯＣＨＥ ４５４（商標）ＡＨＡＳ遺伝子配列を確認するために、ならびに品種Ｂｏｂｗｈｉｔｅ ＭＰＢ２６ＲＨと、ＧｅｎｂａｎｋおよびＲＯＣＨＥ ４５４（商標）配列が得られる他の小麦品種との間の対立遺伝子変異に起因して必要であった。

【0190】

ＡＨＡＳ遺伝子の増幅のために、ＰＣＲプライマーのコホートを設計した（表１）。プライマーは、ＣＬＵＳＴＡＬＷ（商標）を使用して生成された複数の配列アライメントから生成されたコンセンサス配列から設計された（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， （１９９４） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２２：４６７３−８０）。配列アライメントは、５倍包括度で完了したＲＯＣＨＥ ４５４（商標）配列決定から生成された品種Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｓｐｒｉｎｇ配列決定データからアセンブルされた。

【0191】

表１に示されるように、ＰＣＲプライマーは、３つ全ての同祖配列を増幅するように、または単一の同祖配列のみを増幅するように設計された。例えば、ＡＨＡＳ遺伝子の転写された領域を増幅するために使用されるＰＣＲプライマーは、単一の多重ＰＣＲ反応において３つ全ての同祖コピーを同時に増幅するように設計された。非転写領域を増幅するために使用されるＰＣＲプライマーは、３つ全ての同祖コピーを増幅するように、または単一の同祖コピーのみを増幅するように設計された。ＰＣＲプライマーの全ては、１８〜２７のヌクレオチド長であるように、また６０〜６５℃、最適には６３℃の融点を有するように設計された。さらに、いくつかのプライマーは、最後から２番目の塩基（ホスホロチオエート連結を含有し、表１においてアスタリスク（^＊）として示される）を、各小麦部分ゲノムから遺伝子コピーを区別する１ヌクレオチド配列変異上に位置付けるように設計された。表１は、設計および合成されたＰＣＲプライマーを列挙している。

【表1】

【0192】

部分ゲノム特異的増幅は、最後から２番目の塩基（ホスホロチオエート連結を含有する）を、各小麦部分ゲノムから遺伝子コピーを区別する１ヌクレオチド配列変異上に位置付けるように設計されたプライマーを用い、オン−オフＰＣＲを使用して達成された（Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．， （２００５） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ３２８：２６５−７２）。２つの異なるセットのＰＣＲ条件を使用して、品種Ｂｏｂｗｈｉｔｅ ＭＰＢ２６ＲＨからのＡＨＡＳ遺伝子の同祖コピーを増幅した。転写された領域に対して、ＰＣＲ反応物は、０．２ｍＭのｄＮＴＰ、１×ＩＭＭＯＬＡＳＥ ＰＣＲ（商標）緩衝液（Ｂｉｏｌｉｎｅ、Ｔａｕｎｔｏｎ、ＭＡ）、１．５ｍＭのＭｇＣｌ_２、０．２５単位のＩＭＭＯＬＡＳＥ ＤＮＡ ＰＯＬＹＭＥＲＡＳＥ（商標）（Ｂｉｏｌｉｎｅ、Ｔａｕｎｔｏｎ、ＭＡ）、それぞれ０．２μＭの順方向および逆方向プライマー、ならびに約５０ｎｇのゲノムＤＮＡを含有した。ＡＨＡＳ＿１Ｆ１およびＡＨＡＳ＿１Ｒ１プライマーを含有する反応物に、８％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯを添加した。非転写領域に対して、ＰＣＲ反応物は、０．２ｍＭのｄＮＴＰ、１×ＰＨＵＳＩＯＮ ＧＣ ＢＵＦＦＥＲ（商標）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）、０．５単位のＨＯＴ−ＳＴＡＲＴ ＰＨＵＳＩＯＮ ＤＮＡ（登録商標）ポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、それぞれ０．２μＭの順方向および逆方向プライマー、ならびに約５０ｎｇのゲノムＤＮＡを含有した。ＰＣＲは、ＭＪ ＰＴＣ２００（登録商標）サーモサイクラー（ＢｉｏＲａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を使用して、最終的な２５μｌ反応体積で行った。ＰＣＲサイクリングの後、反応生成物を精製し、ＰＧＥＭ−Ｔ ＥＡＳＹ ＶＥＣＴＯＲ（商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を使用して、大腸菌ＪＭ１０９細胞にクローニングした。ＤＮＡＥＡＳＹ ＰＬＡＳＭＩＤ ＤＮＡ ＰＵＲＩＦＩＣＡＴＩＯＮ ＫＩＴ（商標） （Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を使用してプラスミドＤＮＡを抽出し、ＡＢＩ３７３０ＸＬ（登録商標）自動化キャピラリー電気泳動プラットフォーム上で、ＢＩＧＤＹＥ（登録商標）ｖ３．１化学（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を使用してサンガー配列決定を行った。ＳＥＱＵＥＮＣＨＥＲ ＳＯＦＴＷＡＲＥ（商標）（ＧｅｎｅＣｏｄｅｓ、Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ、ＭＩ）を使用して行われる配列分析を使用して、品種Ｂｏｂｗｈｉｔｅ ＭＰＢ２６ＲＨからの各同祖遺伝子コピー （配列番号：１４０、配列番号：１４１、および配列番号：１４２）のコンセンサス配列を生成した。ＣＬＵＳＴＡＬＷ（商標）を使用して、ＡＨＡＳ遺伝子コピー間を区別する同祖配列変異が確認される複数のコンセンサス配列アライメントを生成した。

【0193】

ＡＨＡＳ遺伝子配列に特異的なジンクフィンガー結合ドメインの設計
ＡＨＡＳ遺伝子の同祖コピーの同定されたＤＮＡ配列に対して指向性であるジンクフィンガータンパク質を、前述のように設計した。例えば、Ｕｒｎｏｖ ｅｔ ａｌ．， （２００５） Ｎａｔｕｒｅ ４３５：６４６−５５１を参照されたい。例となる標的配列および認識へリックスを、表２（認識へリックス領域設計）および表３（標的部位）に示す。表３において、ＺＦＰ認識へリックスに接触する標的部位におけるヌクレオチドは大文字で示され、接触していないヌクレオチドは小文字で示されている。ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）標的部位は、セリン６５３アミノ酸残基 から約５００ｂｐ上流側の領域、セリン６５３アミノ酸残基に隣接する（３０ｂｐ以内）上流側領域、セリン６５３アミノ酸残基に隣接する（８０ｂｐ以内）下流側領域、およびセリン６５３アミノ酸残基から約４００ｂｐ下流側の領域の、ＡＨＡＳ遺伝子の４つの領域に対して設計された。様々なＺＦＰ設計を開発および試験して、参照により本明細書に組み込まれる米国仮特許番号第６１８０９０９７号に記載のように小麦において同定された、２２の異なるＡＨＡＳ標的部位と最も高いレベルの効率で結合したフィンガーを同定した。最も高いレベルの効率でジンクフィンガー認識配列に結合した特異的ＺＦＰ認識へリックス（表２）を、ＮＨＥＪ媒介標的化および小麦ゲノムのＡＨＡＳ遺伝子座内のドナー配列の組み込み（相同性非依存性標的化組み込み）に使用した。

【表2】

【表3】

【0194】

ＡＨＡＳジンクフィンガー設計は、ＣＣＨＣ構造を有する少なくとも１つのフィンガーを有するタンパク質をコードするジンクフィンガー発現ベクター内に組み込まれた。米国特許公開第２００８／０１８２３３２号を参照されたい。特に、各タンパク質における最後のフィンガーは、認識へリックスのＣＣＨＣ骨格を有していた。非正準ジンクフィンガーコード化配列を、ＩＩＳ型制限酵素ＦｏｋＩのヌクレアーゼドメイン（Ｗａｈ ｅｔ ａｌ．， （１９９８） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９５：１０５６４−１０５６９の配列のアミノ酸３８４〜５７９）に、４アミノ酸ＺＣリンカーおよびトウモロコシ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）に由来するｏｐａｑｕｅ−２核局在化シグナルを介して融合させ、ＡＨＡＳジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を形成した。米国特許第７，８８８，１２１号を参照されたい。

【0195】

以前に活性ヌクレアーゼを同定することが示された出芽酵母ベースの系を使用して、最適なジンクフィンガーを切断活性について検証した。例えば、米国特許出願公開第２００９／０１１１１１９号；Ｄｏｙｏｎ ｅｔ ａｌ．， （２００８） Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２６：７０２−７０８；Ｇｅｕｒｔｓ ｅｔ ａｌ．， （２００９） Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２５：４３３を参照されたい。様々な機能性ドメインに対するジンクフィンガーを、インビボでの使用のために選択した。多くのＺＦＮが、設計され、生成され、推定されるＡＨＡＳゲノムポリヌクレオチド標的部位への結合について試験された。上記表２に記載のＺＦＮは、高レベルでインビボ活性を有するものとして特定され、植物体内の固有のＡＨＡＳゲノムポリヌクレオチド標的部位を効率的に結合および切断することができると特徴付けられた。

【0196】

トランジェントアッセイを使用したＡＨＡＳ遺伝子のジンクフィンガーヌクレアーゼ切断の評価
ＺＦＮ構築物アセンブリ：前述のように酵母アッセイを使用して同定されたＺＦＮ遺伝子発現構築物を含有するプラスミドベクターを設計し、当該技術分野において一般的に知られている技術および技法を使用して完成させた。（例えば、ＡｕｓｕｂｅｌまたはＭａｎｉａｔｉｓを参照されたい）。各ＺＦＮコード化配列を、ジンクフィンガーヌクレアーゼの上流側に位置するｏｐａｑｕｅ−２核局在化シグナルをコードする配列に融合させた（Ｍａｄｄａｌｏｎｉ ｅｔ ａｌ．， （１９８９） Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１７：７５３２）。

【0197】

融合タンパク質の発現は、トウモロコシ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）ユビキチン遺伝子（５’非翻訳領域（ＵＴＲ）を含む）からの強力な構成的プロモーターにより主導された（Ｔｏｋｉ ｅｔ ａｌ．， （１９９２） Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ １００；１５０３−０７）。また、発現カセットは、トウモロコシ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）ペルオキシダーゼ５遺伝子（Ｐｅｒ５）遺伝子からの３’ＵＴＲ（転写ターミネーターおよびポリアデニル化部位を含む）を含んでいた（米国特許出願公開第２００４／０１５８８８７号）。Ｔｈｏｓｅａ ａｓｉｇｎａウイルスからのヌクレオチド配列をコードする自己加水分解性２Ａ（Ｓｚｙｍｃｚａｋ ｅｔ ａｌ．， （２００４） Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２２：７６０−７６０）を、構築物にクローニングされた２つのジンクフィンガーヌクレアーゼ融合タンパク質の間に追加した。

【0198】

ＩＮ−ＦＵＳＩＯＮ（商標）Ａｄｖａｎｔａｇｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ）を使用して、プラスミドベクターをアセンブルした。制限エンドヌクレアーゼは、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ（Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）から入手し、Ｔ４ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）をＤＮＡ連結に使用した。プラスミド調製は、供給業者の説明に従い、ＮＵＣＬＥＯＳＰＩＮ（登録商標）Ｐｌａｓｍｉｄ Ｋｉｔ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ Ｉｎｃ．、Ｂｅｔｈｌｅｈｅｍ、ＰＡ）またはＰｌａｓｍｉｄ Ｍｉｄｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して行った。アガローストリス−酢酸ゲル電気泳動後に、ＱＩＡＱＵＩＣＫ ＧＥＬ ＥＸＴＲＡＣＴＩＯＮ ＫＩＴ（商標）（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してＤＮＡ断片を単離した。全ての連結反応のコロニーを、まずミニプレップＤＮＡの制限酵素消化によりスクリーニングした。選択されたクローンのプラスミドＤＮＡは、商業的な配列決定業者（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ ＭＷＧ Ｏｐｅｒｏｎ、Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ、ＡＬ）により配列決定された。配列データをアセンブルし、ＳＥＱＵＥＮＣＨＥＲ（商標）ソフトウェア（Ｇｅｎｅ Ｃｏｄｅｓ Ｃｏｒｐ．、Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ、ＭＩ）を使用して分析した。

【0199】

代表的プラスミドｐＤＡＢ１０９３５０およびｐＤＡＢ１０９３６０を図１１および図１２に示すが、これらは、制限酵素消化およびＤＮＡ配列決定により確認された。

【0200】

トランスフェクションのためのＺＦＮ構築物ＤＮＡの調製
コムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ）プロトプラストへの送達の前に、供給業者の説明に従い、ＰＵＲＥ ＹＩＥＬＤ ＰＬＡＳＭＩＤ ＭＡＸＩＰＲＥＰ ＳＹＳＴＥＭ（登録商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）またはＰＬＡＳＭＩＤ ＭＡＸＩ ＫＩＴ（登録商標）（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を使用して、各ＺＦＮ構築物のためのプラスミドＤＮＡを大腸菌の培養物から調製した。

【0201】

コムギ葉肉プロトプラストの単離
コムギ系統品種Ｂｏｂｗｈｉｔｅ ＭＰＢ２６ＲＨからの葉肉プロトプラストを、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）媒介ＤＮＡ送達を使用したトランスフェクションのために以下のように調製した。

【0202】

成熟種子を、８０％（ｖ／ｖ）エタノール中に３０秒間含浸し、水道水で２回濯ぎ、続いて、旋回振とう機で１４０ｒｐｍで２０分間、２０％ＤＯＭＥＳＴＯＳ（登録商標）（０．８％ｖ／ｖ有効塩素）中で洗浄することにより、表面殺菌した。デカンテーションによりＤＯＭＥＳＴＯＳ（登録商標）を除去し、種を滅菌水で４回濯いだ。種をＷＨＡＴＭＡＮ（商標）濾紙上に置くことにより、過剰の水を除去した。種を、数枚の湿った滅菌ＷＨＡＴＭＡＮ（商標）濾紙上の滅菌ＰＥＴＲＩ（商標）皿内に置き、２４℃で２４時間インキュベートした。インキュベーション後、１５％ＤＯＭＥＳＴＯＳ（登録商標）中で１５分間振とうし、続いて前述のように滅菌水で濯ぐことにより、種を再び表面殺菌した。種を、ムラシゲ・スクーグ（ＭＳ）凝固培地上に、２４℃で２４時間置いた。最後に、１０％ＤＯＭＥＳＴＯＳ（登録商標）中で１０分間振とうし、続いて前述のように滅菌水で濯ぐことにより、種に対し三回目の表面殺菌を行った。しわの側を下にして、ＰＥＴＲＩ（商標）皿当たり１０個の種でＭＳ凝固培地上に種を置き、２４℃で１４〜２１日間、暗所で発芽させた。

【0203】

発芽した種から、約２〜３グラムの葉材を２〜３ｃｍの長さに切断し、事前に秤量したＰＥＴＲＩ（商標）皿内に入れた。葉鞘および黄変した葉材は廃棄した。約１０ｍＬの葉酵素消化ミックス（０．６Ｍマンニトール、１０ｍＭ ＭＥＳ、１．５％ｗ／ｖセルラーゼ Ｒ１０、０．３％ｗ／ｖマセロザイム、１ｍＭ ＣａＣｌ_２、０．１％ウシ血清アルブミン、０．０２５％ｖ／ｖプルロニック酸、５ｍＭβ−メルカプトエタノール、ｐＨ５．７）をＰＥＴＲＩ（商標）皿にピペットで入れ、鋭いメスの刃を使用して葉材を１〜２ｍｍのセグメントに横に切断した。葉材の乾燥からもたらされる細胞の損傷を防止するために、葉消化ミックスの存在下で葉材を切断した。ＰＥＴＲＩ（商標）皿に、新鮮な葉材の重量グラム当たり１０ｍＬの体積まで追加の葉酵素消化ミックスを添加し、真空（２０”Ｈｇ）圧力に３０分間曝露した。ＰＥＴＲＩ（商標）皿をＰＡＲＡＦＩＬＭ（登録商標）で封止し、穏やかな回転振とうで、２８℃で４〜５時間インキュベートした。

【0204】

消化懸濁液を１００ミクロンメッシュを通して５０ｍＬ採取管内に通過させることにより、葉のセグメントから酵素消化ミックス内に放出された葉肉プロトプラストを、植物残骸から単離した。プロトプラストの収量を最大化するために、消化された葉材を３回洗浄した。各洗浄は、１０ｍＬの洗浄緩衝液（２０ｍＭ ＫＣｌ、４ｍＭ ＭＥＳ、０．６Ｍマンニトール、ｐＨ５．６）をＰＥＴＲＩ（商標）皿に加え、１分間穏やかに旋回し、続いて洗浄緩衝液を１００ミクロンの篩を通して同じ５０ｍＬの採取管内に通過させることにより行った。次に、濾過されたプロトプラスト懸濁液を、７０ミクロンの篩に、続いて４０ミクロンの篩に通過させた。次に、濾過されたプロトプラスト懸濁液の６ｍＬのアリコートを、蓋付きの１２ｍＬの丸底遠心管に移し、１２℃で１０分間、７０ｇで遠心分離した。遠心分離後、上澄みを除去し、プロトプラストペレットをそれぞれ７ｍＬ洗浄緩衝液中に再懸濁させた。上述のように遠心分離によりプロトプラストを再びペレット化した。プロトプラストをそれぞれ１ｍＬ洗浄緩衝液中に再懸濁させ、２つの遠心管にプールした。洗浄緩衝液の体積を各管内に７ｍＬの最終体積に調節してから、上述のように遠心分離を行った。上澄みの除去後、プロトプラストペレットを１ｍＬ洗浄緩衝液中に再懸濁させ、単一の管にプールした。葉肉プロトプラストの収量は、Ｎｅｕｂａｕｅｒ血球計を使用して推定した。Ｅｖａｎｓ Ｂｌｕｅ染色を使用して、回収された生細胞の割合を決定した。

【0205】

葉肉プロトプラストのＰＥＧ媒介トランスフェクション
約１０^６の葉肉 プロトプラストを、１２ｍＬの丸底管に加え、７０ｇでの遠心分離によりペレット化してから上澄みを除去した。７０μｇのプラスミドＤＮＡを含有する６００μｌ洗浄緩衝液中に、プロトプラストを穏やかに再懸濁させた。プラスミドＤＮＡは、上述のジンクフィンガーヌクレアーゼ構築物からなっていた。次に、等体積の４０％ＰＥＧ溶液（４０％ｗ／ｖ ＰＥＧ４，０００、０．８Ｍマンニトール、１Ｍ Ｃａ（ＮＯ_３）_２、ｐＨ５．６）を、管の穏やかな回転による混合と同時にプロトプラスト懸濁液にゆっくりと添加した。プロトプラスト懸濁液を、一切撹拌せずに室温で１５分間インキュベートした。

【0206】

追加の６ｍＬ体積の洗浄緩衝液を、１ｍＬ、２ｍＬおよび３ｍＬの逐次的アリコートで プロトプラスト懸濁液にゆっくりと添加した。同時の穏やかな混合を使用して、それぞれの逐次的アリコートに対して均質な懸濁を維持した。プロトプラスト懸濁液の半分を第２の１２ｍＬ丸底管に移し、さらなる３ｍＬ体積の洗浄緩衝液を、穏やかな混合と同時に各管にゆっくりと添加した。プロトプラストを、７０ｇで１０分間の遠心分離によりペレット化し、上澄みを除去した。プロトプラストペレットを、それぞれ１ｍＬ洗浄緩衝液中に再懸濁させてから、対となった丸底管からのプロトプラストを、単一の１２ｍＬ管にプールした。追加の７ｍＬ洗浄緩衝液を、プールしたプロトプラストに添加してから、上述のように遠心分離した。上澄みを完全に除去し、プロトプラストペレットを２ｍＬのＱｉａｏの培地（０．４４％ｗ／ｖ ＭＳおよびビタミン、３ｍＭ ＭＥＳ、０．０００１％ｗ／ｖ ２，４−Ｄ、０．６Ｍグルコース、ｐＨ ５．７）中に再懸濁させた。プロトプラスト懸濁液を滅菌３ｃｍ ＰＥＴＲＩ（商標）皿に移し、２４℃で７２時間、暗所でインキュベートした。

【0207】

葉肉プロトプラストからのゲノムＤＮＡ単離
トランスフェクトされたプロトプラストを、３ｃｍ ＰＥＴＲＩ（商標）皿から２ｍＬ 微量遠心管に移した。細胞を７０ｇでの遠心分離によりペレット化し、上澄みを除去した。トランスフェクトされたプロトプラストの回収を最大化するために、ＰＥＴＲＩ（商標）皿を１ｍＬの洗浄緩衝液で３回濯いだ。各濯ぎは、洗浄緩衝液をＰＥＴＲＩ（商標）皿内で１分間旋回撹拌し、続いて液体を同じ２ｍｌの微量遠心管に移すことにより行った。各濯ぎの最後に、細胞を７０ｇでの遠心分離によりペレット化し、上澄みを除去した。ペレット化されたプロトプラストを液体窒素中で急速凍結してから、ＬＡＢＣＯＮＣＯ ＦＲＥＥＺＯＮＥ ４．５（登録商標）（Ｌａｂｃｏｎｃｏ、Ｋａｎｓａｓ Ｃｉｔｙ、ＭＯ）内で−４０℃および１３３×１０^−３ｍＢａｒの圧力で２４時間フリーズドライした。凍結乾燥された細胞を、製造者の説明に従いＤＮＥＡＳＹ（登録商標）ＰＬＡＮＴ ＤＮＡ ＥＸＴＲＡＣＴＩＯＮ ＭＩＮＩキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してＤＮＡ抽出に供し（但し組織破壊は必要ではない）、プロトプラスト細胞を溶解緩衝液に直接添加した。

【0208】

ＺＦＮ配列切断のためのプロトプラストゲノムＤＮＡのＰＣＲアッセイ
ＡＨＡＳ遺伝子座用に設計されたＺＦＮの切断有効性および標的部位特異性の調査を可能とするために、１つ以上のＺＦＮ標的部位が捕捉される３００ｂｐ断片まで増幅するようにＰＣＲプライマーを設計した。プライマーの１つは、捕捉されたＺＦＮ標的部位（複数可）の１００ｂｐウィンドウ以内となるように設計された。この設計戦略により、Ｉｌｌｕｍｉｎａショートリード技術を使用して、トランスフェクトされたプロトプラストにおける標的ＺＦＮ部位の完全性を評価することができた。さらに、ＰＣＲプライマーは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ配列リードが、それらが由来する小麦部分ゲノムに明白に帰属され得るように、ＡＨＡＳ遺伝子の３つの同祖コピーを増幅し、同祖体間を区別するヌクレオチド配列変異を捕捉するように設計された。

【0209】

全部で４セットのＰＣＲプライマーが、ＺＦＮ標的部位遺伝子座を増幅するように設計された（表４）。各プライマーセットは、Ｉｌｌｕｍｉｎａショートリード配列決定化学との適合性を提供するために、順方向および逆方向プライマーの５’末端にそれぞれＩｌｌｕｍｉｎａ ＳＰ１およびＳＰ２配列を有するように合成された。合成されたプライマーはまた、最後から２番目の５’および３’ヌクレオチドにホスホロチオエート連結を含有した（表４においてアスタリスク（^＊）として示される）。５’ホスホロチオエート連結は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＳＰ１およびＳＰ２配列のエキソヌクレアーゼ分解に対する保護を提供し、一方３’ホスホロチオエート連結は、オン−オフＰＣＲを使用した標的ＡＨＡＳ配列の増幅のためのＰＣＲ特異性を改善した（Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．， （２００５））。全てのＰＣＲプライマーは、１８〜２７のヌクレオチド長であるように、また６０〜６５℃、最適には６３℃の融点を有するように設計された。

【0210】

表４において、ＡＨＡＳ遺伝子に特異的なヌクレオチドは、大文字の書体で示され、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＳＰ１およびＳＰ２配列に対応するヌクレオチドは、小文字の書体で示されている。各プライマーセットは、ＰＣＲ増幅産物のサンガーベースの配列決定により、３つの同祖ＡＨＡＳ遺伝子コピーの増幅に関して実験的に試験された。

【表4】

【0211】

トランスフェクトされた小麦葉肉プロトプラストから抽出されたゲノムＤＮＡからのＺＦＮ標的部位遺伝子座のＰＣＲ増幅を使用して、Ｉｌｌｕｍｉｎａベースの合成による配列決定（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ−ｂｙ−ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）技術のための正しい形式で必要な遺伝子座特異的ＤＮＡ分子を生成した。各ＰＣＲアッセイは、２００ｎｇの開始ＤＮＡ（約１２，５００細胞相当のコムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ）ゲノム）に作用するように最適化された。十分なコムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ）ゲノムのコピーがＺＦＮ効率および標的部位特異性の信頼性のある評価のために分析されることを確実とするために、トランスフェクトされた試料当たり複数の反応を行った。トランスフェクトされた試料当たり、個々のプロトプラストから採取された２００，０００コピーのコムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ）ゲノムに相当する約１６のＰＣＲアッセイを行った。トランスフェクトされた試料それぞれに対して、単一のＰＣＲマスターミックスを調製した。ＺＦＮ標的部位の最適なＰＣＲ増幅を確実とするために（すなわち、ＰＣＲ試薬が限定的となることを防ぐため、およびＰＣＲが指数関数的増幅段階に維持されることを確実とするために）、定量的ＰＣＲ法を使用して最初のアッセイを行い、標的組織に対して行う最適サイクル数を決定した。最初のＰＣＲは、ＭＸ３０００Ｐ ＴＨＥＲＭＯＣＹＣＬＥＲ（商標）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）上で必要な陰性対照反応を用いて行った。定量的ＰＣＲ機器から収集されたデータ出力から、蛍光の相対的増加をサイクル間からプロットし、過剰サイクルおよび一般的分子の偏った増幅を低減する試みにおいて、十分な増幅を提供しながら反応が試薬により制限されないようにするアッセイ当たりのサイクル数を決定した。未使用のマスターミックスは、定量的ＰＣＲ分析が終了し、最適サイクル数が決定されるまで氷上に維持した。次いで、残りのマスターミックスを所望の数の反応管内（ＺＦＮアッセイ当たり約１６）に等分し、ＰＣＲ増幅を最適サイクル数だけ行った。増幅後、同じＺＦＮ標的部位の試料を一緒にプールし、ＺＦＮ当たり２００μｌのプールされた生成物を、製造者の説明に従いＱＩＡＱＵＩＣＫ ＭＩＮＩＥＬＵＴＥ ＰＣＲ ＰＵＲＩＦＩＣＡＴＩＯＮ ＫＩＴ（商標）（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製した。

【0212】

Ｉｌｌｕｍｉｎａショートリード技術を使用して試料が配列決定されることを可能とするために、追加ラウンドのＰＣＲを行って、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｐ５およびＰ７配列を増幅されたＤＮＡ断片上に導入し、配列リードをそれらが由来する試料に明白に帰属させるために使用され得る配列バーコードインデックスを導入した。これは、第１ラウンドの増幅において追加されたＳＰ１およびＳＰ２配列に部分的に相補的であるが、試料インデックスならびにＰ５およびＰ７配列を含有するプライマーを使用して達成された。一般的断片を過剰増幅することなく追加の配列をテンプレートに追加するために必要なＰＣＲサイクルの最適数は、上述のように、定量的ＰＣＲサイクル分析により決定された。増幅後、形成された生成物を、１：１．７のＤＮＡ対ビーズ比を有するＡＭＰＵＲＥ ＭＡＧＮＥＴＩＣ ＢＥＡＤＳ（登録商標）（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して精製した。製造者の説明に従い、ＰＣＲベースライブラリ定量キット（ＫＡＰＡ）を使用して、精製されたＤＮＡ断片をＩｌｌｕｍｉｎａショートリード技術による配列決定のために滴定した。ｃＢｏｔクラスター生成キット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用して、試料を配列決定のために調製し、製造者の説明に従い、ＩＬＬＵＭＩＮＡ ＧＡＩＩ_Ｘ（商標）またはＨＩＳＥＱ２０００（商標）機器（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）上で配列決定して、１００ｂｐの対末端配列リードを生成した。

【0213】

標的ＺＦＮ部位におけるＮＨＥＪを検出するためのデータ分析
トランスフェクトされた葉肉プロトプラストのために調製された試料ライブラリのためのＩｌｌｕｍｉｎａショートリード配列データの生成後、バイオインフォマティクス分析を行って、標的ＺＦＮ部位における欠失したヌクレオチドを同定した。そのような欠失は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）ＤＮＡ修復から得られる植物体内ＺＦＮ活性の指標であることが知られている。

【0214】

ＮＨＥＪ欠失を有する配列リードを同定するために、ＨＩＳＥＱ２０００（商標）機器（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）上で生成された配列データの処理のための製造者により提供されているスクリプトを使用して、まずショート配列リードを、それらが由来するプロトプラスト試料に演算により帰属させた。試料帰属は、前述のように、ライブラリ調製の間に導入されたバーコードインデックス配列に基づいた。ライブラリを調製するために使用された６ｂｐバーコードインデックスは、少なくとも２ステップの配列差により互いから区別されたため、正しい試料帰属が確保された。

【0215】

試料帰属後、全ての配列にわたり品質フィルタが通された。品質フィルタは、特別に開発されたＰＥＲＬスクリプトに実装された。配列リードは、４つ以上の不明瞭な塩基が存在する場合、またはメジアンＰｈｒｅｄスコアが２０未満である場合、または２０未満のＰｈｒｅｄスコアを有する３つ以上の連続塩基が存在する場合、または配列リードが４０ヌクレオチド超より短い場合除外した。

【0216】

次に、品質調整された配列を、それらが由来するコムギ部分ゲノムに帰属させた。これは、第２の特別に開発されたＰＥＲＬスクリプトを使用して達成され、部分ゲノム帰属は、上述のようにＡＨＡＳ遺伝子の３つの同祖コピーを増幅するために使用されたＰＣＲプライマーにより捕捉されたヌクレオチド配列改変体のハプロタイプから決定された。

【0217】

最後に、第３の特別に開発されたＰＥＲＬスクリプト、およびＭｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ ２０１０（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）での手作業のデータ操作を使用して、各試料に対して部分ゲノム帰属配列リード内のＺＦＮ切断部位でのＮＨＥＪ欠失の頻度を決定した。これは、各試料中の各部分ゲノム上での特有のＮＨＥＪ欠失の頻度を数えることにより達成された。

【0218】

試験したＺＦＮの切断効率および特異性を評価するために、２つの手法が使用された。切断効率は、ＺＦＮ標的部位にＮＨＥＪ欠失を含有する部分ゲノム帰属配列の割合として（１００万リードあたりの部で）表現された。観察された切断効率によるＺＦＮの等級序列を使用して、部分ゲノム特異的な様式でＡＨＡＳ遺伝子の４つの標的領域のそれぞれに対して最良の切断活性を有するＺＦＮを同定した。

【0219】

試験したＺＦＮは全て、植物体内ＺＦＮ活性に対して推定されるものと一致するＮＨＥＪ欠失サイズ分布を示した。切断特異性は、３つの部分ゲノムにわたり観察された切断効率の比として表現された。データ分析における生物学的反復実験試料の含有は、試験したＺＦＮの切断活性および特異性の等級序列に実質的に影響しなかった。

【0220】

これらの結果から、３つの小麦部分ゲノムのそれぞれにおける有意なそのゲノムＤＮＡ切断活性の特性を考慮して、プラスミドｐＤＡＢ１０９３５０上にコードされたＺＦＮ（すなわち、ＺＦＮ２９７３２および２９７３０）ならびにｐＤＡＢ１０９３６０上にコードされたＺＦＮ（すなわち、ＺＦＮ３００１２および３００１８）を、後の実験における植物体内標的化に選択した。

【0221】

トランジェントアッセイを使用したＺＦＮ媒介ＡＨＡＳ遺伝子編集のためのドナー設計の評価
小麦における内因性ＡＨＡＳ遺伝子座でのＺＦＮ媒介ゲノム編集を調査するために、一連の実験を行って、非相同末端結合 （ＮＨＥＪ）指向性ＤＮＡ修復の効率に対するドナーデザインの効果を評価した。これらの実験は、小麦における内因性ＡＨＡＳ遺伝子座においてイミダゾリノンクラス除草剤（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．， （２００８） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ ２２：２１７−２２５）に対する耐性を付与する前述のＳ６５３Ｎ変異のＺＦＮ媒介付加、または代替として、標的化ＺＦＮ切断により内因性ＡＨＡＳ遺伝子において形成された２本鎖ＤＮＡ切断における、ＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレアーゼ配列部位のＺＦＮ媒介導入の効率を監視するために、トランジェントアッセイを使用した。

【0222】

ＮＨＥＪ指向性ＤＮＡ修復のドナー設計
２種類のドナーＤＮＡ設計を、ＮＨＥＪ指向性ＤＮＡ修復に使用した。

【0223】

第１の種類のドナー設計は、小麦における内因性ＡＨＡＳ遺伝子との相同性を共有しない４１ｂｐの配列を含む直鎖の２本鎖ＤＮＡ分子であった。２つのドナーＤＮＡ分子は、それぞれＡＨＡＳ遺伝子の３つの同祖コピーを標的化するように設計された。両方のドナーＤＮＡ分子が、ＺＦＮ媒介ＮＨＥＪ指向性ＤＮＡ修復を促進するための連結オーバーハングを提供するために、突出した５’および３’末端を有していた。２つのドナーＤＮＡ分子は、それらの突出３’末端における配列が異なっていた。第１のドナーＤＮＡ分子、ｐＤＡＳ０００１５２（配列番号：１７５および配列番号：１７６）は、ＺＦＮ２９７３２および２９７３０（プラスミドｐＤＡＢ１０９３５０上にコードされている）による内因性ＡＨＡＳ遺伝子の切断によって生成されるものと適合する連結オーバーハングを提供するように、またＮＨＥＪ指向性ＤＮＡ修復を介した２本鎖ＤＮＡ切断の部位での内因性ＡＨＡＳ遺伝子内への４１ｂｐドナー分子の挿入をもたらすように設計された。第２のドナーＤＮＡ分子ｐＤＡＳ０００１４９（配列番号：１７７および 配列番号：１７８）は、ＺＦＮ２９７３２および２９７３０（プラスミドｐＤＡＢ１０９３５０上にコードされている）ならびにＺＦＮ３００１２および３００１８（プラスミドｐＤＡＢ１０９３６０上にコードされている）による内因性ＡＨＡＳ遺伝子の二重切断によって生成されるものと適合する連結オーバーハングを提供するように、またＮＨＥＪ指向性ＤＮＡ修復を介したＺＦＮにより形成された２つの２本鎖ＤＮＡ切断間に含有される内因性ＡＨＡＳ配列の４１ｂｐドナー分子との置き換えをもたらすように設計された。

【0224】

第２の種類のドナーは、小麦における内因性ＡＨＡＳ遺伝子との相同性を共有せず、内因性ＡＨＡＳ遺伝子において２本鎖ＤＮＡ切断を形成するために使用されたＺＦＮ（複数可）により認識された配列によりいずれかの側に隣接した４１ｂｐの配列を含有するプラスミドＤＮＡベクターであった。このドナー設計により、内因性ＡＨＡＳ遺伝子内の標的部位を切断するために使用された同じＺＦＮ（複数可）による、プラスミドＤＮＡ分子からの固有の４１ｂｐ配列の植物体内放出、およびＮＨＥＪ指向性ＤＮＡ修復を介した内因性ＡＨＡＳ遺伝子内への放出された４１ｂｐ配列のオーバーハング連結に好適な突出末端の同時生成が可能であった。２つのプラスミドドナーＤＮＡ分子は、それぞれＡＨＡＳ遺伝子の３つの同祖コピーを標的化するように設計された。第１のプラスミドドナー分子、ｐＤＡＳ０００１５３（配列番号：１７９および配列番号：１８０）（図１３）は、ＺＦＮ２９７３２および２９７３０（プラスミドｐＤＡＢ１０９３５０上にコードされている）による内因性ＡＨＡＳ遺伝子の切断によって生成されるものと適合する、放出された４１ｂｐＤＮＡ断片上の連結オーバーハングを提供するように設計された。第２のプラスミドドナー分子、ｐＤＡＳ０００１５０（配列番号：１８１および配列番号：１８２）（図１４）は、一方の端部でＺＦＮ２９７３２および２９７３０（プラスミドｐＤＡＢ１０９３５０上にコードされている）により生成されるものと適合し、他端部でＺＦＮ３００１２および３００１８（プラスミドｐＤＡＢ１０９３６０上にコードされている）により生成されるものと適合する、放出された４１ｂｐＤＮＡ断片上の連結オーバーハングを提供するように設計された。この設計により、ＺＦＮ２９７３２および２９７３０ならびにＺＦＮ３００１２および３００１８により形成された２つの２本鎖ＤＮＡ切断の間に含有された内因性ＡＨＡＳ配列の、４１ｂｐドナー分子との置き換えが可能であった。

【0225】

ＮＨＥＪ指向性ＤＮＡ修復のためのドナーＤＮＡの合成
当業者により一般的に知られている標準的クローニング方法を使用して、プラスミドベクターを構築した。コムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ）への送達の前に、各ドナー構築物のためのプラスミドＤＮＡを、供給業者の説明に従い、ＰＵＲＥ ＹＩＥＬＤ ＰＬＡＳＭＩＤ ＭＡＸＩＰＲＥＰ ＳＹＳＴＥＭ（登録商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）またはＰＬＡＳＭＩＤ ＭＡＸＩ ＫＩＴ（登録商標）（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を使用して、大腸菌の培養物から調製した。

【0226】

標準的なホスホラミダイト化学を使用して、２本鎖ＤＮＡドナー分子（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡ）を合成的に合成した。各ドナー分子に対して、植物体内エンドヌクレアーゼ分解に対する保護を提供するためにそれぞれ５’末端に２つのホスホロチオエート連結を有する１対の相補的１本鎖ＤＮＡオリゴマーを合成した。１本鎖ＤＮＡオリゴマーを、高速液体クロマトグラフィーにより精製して、全長分子を濃縮し、Ｎａ^＋交換を使用した合成ステップからの化学的キャリーオーバーから精製した。当業者に一般的に知られている標準的方法を使用して、等モル量の２つの相補的１本鎖ＤＮＡオリゴマーをアニールすることにより、２本鎖ドナー分子を形成した。コムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ）への送達の前に、２本鎖ＤＮＡ分子を滅菌水中で必要な濃度まで希釈した。

【0227】

体細胞胚発生カルスに由来する小麦プロトプラストの単離
ドナー小麦系統品種Ｂｏｂｗｈｉｔｅ ＭＰＢ２６ＲＨからの体細胞胚発生カルス （ＳＥＣ）に由来するプロトプラストを、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）媒介ＤＮＡ送達を使用したトランスフェクションのために以下のように調製した。

【0228】

ドナー小麦系統の実生を、１秒当たり８００ｍｍｏｌ ｍ^２で提供される照明とともに１８／１６℃（昼／夜）および１６／８時間（昼／夜）の光周期で維持された環境制御成長室内で成長させた。麦穂を開花から１２〜１４日後に回収し、７０％（ｖ／ｖ）エタノール中に１分間浸漬することにより表面殺菌した。穂を脱穀し、未熟種子を１７％（ｖ／ｖ）漂白剤中で穏やかに振とうさせながら１５分間殺菌した後、滅菌蒸留水で少なくとも３回濯いだ。解剖顕微鏡下で、胚を無菌状態で未熟種子から単離した。鋭いメスを使用して胚軸を除去し、廃棄した。ＴＩＭＥＮＴＩＮ（商標）を含まない２−４培地を含有する９ｃｍ ＰＥＴＲＩ（商標）皿内に、切断されていない胚盤を上方に向けて胚盤を入れた。全部で２５の胚盤をそれぞれの９ｃｍ ＰＥＴＲＩ（商標）皿に播種した。２４℃で３週間暗所でインキュベートすることにより、体細胞胚発生カルス （ＳＥＣ）形成を開始した。３週間後、非胚発生カルスからＳＥＣを分離し、ＴＩＭＥＮＴＩＮ（商標）を含まない新鮮な２−４培地上に置き、２４℃でさらに３週間暗所でインキュベートした。ＳＥＣの二次培養を全部で３回繰り返してから、プロトプラスト調製に使用した。

【0229】

カルスの脱水を防止するために約１０ｍＬの小麦カルス消化ミックス（２．５％ｗ／ｖセルラーゼＲＳ、０．２％ｗ／ｖペクトリアーゼＹ２３、０．１％ｗ／ｖ ＤＲＩＳＥＬＡＳＥ（登録商標）、１４ｍＭ ＣａＣｌ_２、０．８ｍＭ ＭｇＳＯ_４、０．７ｍＭ ＫＨ_２ＰＯ_４、０．６Ｍマンニトール、ｐＨ５．８）を含有する１０ｃｍ ＰＥＴＲＩ（商標）皿内で、鋭いメスの刃を使用して約１グラムのＳＥＣを１〜２ｍｍの切片に切断した。ＰＥＴＲＩ（商標）皿に、新鮮なカルスの重量グラム当たり１０ｍＬの体積まで追加のカルス消化ミックスを添加し、真空（２０”Ｈｇ）圧力に３０分間曝露した。ＰＥＴＲＩ（商標）皿をＰＡＲＡＦＩＬＭ（登録商標）で封止し、３０〜４０ｒｐｍでの穏やかな回転振とうで、２８℃で４〜５時間インキュベートした。

【0230】

消化懸濁液を１００ミクロンメッシュを通して５０ｍＬ採取管内に通過させることにより、カルスから放出されたＳＥＣプロトプラストを単離した。プロトプラストの収量を最大化するために、消化されたカルス材を３回洗浄した。各洗浄は、１０ｍＬのＳＥＣ洗浄緩衝液（０．６Ｍマンニトール、０．４４％ｗ／ｖ ＭＳ、ｐＨ５．８）をＰＥＴＲＩ（商標）皿に加え、１分間穏やかに旋回し、続いてＳＥＣ洗浄緩衝液を１００ミクロンの篩を通して同じ５０ｍＬの採取管内に通過させることにより行った。次に、濾過されたプロトプラスト懸濁液を、７０ミクロンの篩に、続いて４０ミクロンの篩に通過させた。次に、濾過されたプロトプラスト懸濁液の６ｍＬのアリコートを、蓋付きの１２ｍＬの丸底遠心管に移し、１２℃で１０分間、７０ｇで遠心分離した。遠心分離後、上澄みを除去し、約０．５ｍＬの上澄みを後に残し、プロトプラストペレットをそれぞれ７ｍＬの２２％スクロース溶液中に再懸濁させた。２つの溶液が混合しないことを確実にしながら、スクロース／プロトプラスト混合物を２ｍＬのＳＥＣ洗浄緩衝液で慎重に覆った。上述のように遠心分離によりプロトプラストを再び遠心分離した。ＳＥＣ洗浄緩衝液とスクロース溶液との間に観察されるプロトプラストのバンドを、ピペットを使用して回収し、清浄な１２ｍＬ丸底管内に入れた。７ｍＬのＳＥＣ洗浄緩衝液をプロトプラストに添加し、上述のように管を遠心分離した。上澄みを除去し、ＳＥＣプロトプラストを単一の管に合わせ、最終体積１〜２ｍＬのＳＥＣ洗浄緩衝液に再懸濁させた。ＳＥＣプロトプラストの収量は、Ｎｅｕｂａｕｅｒ血球計を使用して推定した。Ｅｖａｎｓ Ｂｌｕｅ染色を使用して、回収された生細胞の割合を決定した。

【0231】

ＳＥＣプロトプラストのＰＥＧ媒介トランスフェクション
約２００万のＳＥＣプロトプラストを、１２ｍＬの丸底管に加え、７０ｇでの遠心分離によりペレット化してから上澄みを除去した。７０ｇのＤＮＡを含有する４８０μｌ ＳＥＣ洗浄緩衝液中に、プロトプラストを穏やかに再懸濁させた。ＤＮＡは、上述のジンクフィンガーヌクレアーゼおよびドナーＤＮＡ構築物からなり、各構築物は、行われている実験に必要なモル比で存在した。次に、７２０μｌの５０％ＰＥＧ溶液（５０％ｗ／ｖ ＰＥＧ４０００、０．８Ｍマンニトール、１Ｍ Ｃａ（ＮＯ_３）_２、ｐＨ５．６）を、管の穏やかな回転による混合と同時にプロトプラスト懸濁液にゆっくりと添加した。プロトプラスト懸濁液を、一切撹拌せずに室温で１５分間インキュベートした。

【0232】

追加の７ｍＬ体積のＳＥＣ洗浄緩衝液を、１ｍＬ、２ｍＬおよび３ｍＬの逐次的アリコートでプロトプラスト懸濁液にゆっくりと添加した。同時の穏やかな混合を使用して、各逐次的アリコートに対して均質な懸濁を維持した。プロトプラスト懸濁液の半分を第２の１２ｍＬ丸底管に移し、さらなる３ｍＬ体積のＳＥＣ洗浄緩衝液を、穏やかな混合と同時に各管にゆっくりと添加した。プロトプラストを、７０ｇで１０分間の遠心分離によりペレット化し、上澄みを除去した。プロトプラストペレットを、それぞれ１ｍＬＳＥＣ洗浄緩衝液中に再懸濁させてから、対となった丸底管からのプロトプラストを、単一の１２ｍＬ管にプールした。追加の７ｍＬ ＳＥＣ洗浄緩衝液を、プールしたプロトプラストに添加してから、上述のように遠心分離した。上澄みを完全に除去し、プロトプラストペレットを２ｍＬのＱｉａｏの培地中に再懸濁させた。プロトプラスト懸濁液を滅菌３ｃｍ ＰＥＴＲＩ（商標）皿に移し、２４℃で７２時間、暗所でインキュベートした。

【0233】

未熟接合小麦胚からの胚盤の単離
ドナー小麦系統品種Ｂｏｂｗｈｉｔｅ ＭＰＢ２６ＲＨからの未熟接合小麦胚の胚盤を、バイオリスティック媒介ＤＮＡ送達を使用したトランスフェクションのために以下のように調製した。

【0234】

ドナー小麦系統の実生を、１秒当たり８００ｍｍｏｌ ｍ^２で提供される照明とともに１８／１６℃（昼／夜）および１６／８時間（昼／夜）の光周期で維持された環境制御成長室内で成長させた。麦穂を開花から１２〜１４日後に回収し、７０％（ｖ／ｖ）エタノール中に１分間浸漬することにより表面殺菌した。穂を脱穀し、未熟種子を１７％（ｖ／ｖ）漂白剤中で穏やかに振とうさせながら１５分間殺菌した後、滅菌蒸留水で少なくとも３回濯いだ。解剖顕微鏡下で、胚を無菌状態で未熟種子から単離した。鋭いメスを使用して胚軸を除去し、廃棄した。浸透ＭＳ（Ｅ３マルトース）培地を含有する９ｃｍ ＰＥＴＲＩ（商標）皿内に、切断されていない胚盤を上方に向けて胚盤を入れた。全部で２０の胚盤をそれぞれ９ｃｍ ＰＥＴＲＩ（商標）皿に播種した。調製された胚を、２６℃で最低４時間暗所で前培養してから、バイオリスティック媒介ＤＮＡ送達を使用したトランスフェクションを行った。

【0235】

バイオリスティック媒介ＤＮＡ送達による未熟接合小麦胚の胚盤のトランスフェクション
４０ｍｇの０．６ミクロンコロイド金粒子（ＢｉｏＲａｄ）を１．５ｍＬ微細管内の１ｍＬの滅菌水に添加することにより、バイオリスティック媒介ＤＮＡ送達のための金粒子を調製した。５分間ボルテックスすることにより、金粒子を再懸濁させた。１０回の照射に十分な材料を調製するために、金粒子懸濁液の５０μＬのアリコートを、５μＬの滅菌水中に再懸濁された５μｇのＤＮＡを含有する１．５ｍＬ微細管に移した。ボルテックスによる完全な混合の後、５０μＬの２．５Ｍ ＣａＣｌ_２および２０μＬの０．１Ｍスペルミジンを微細管に添加し、各試薬の添加後に完全に混合した。ＤＮＡ被覆金微粒子を、卓上型微量遠心分離機内で、最大速度で１分間の遠心分離によりペレット化した。上澄みを除去し、１ｍＬの１００％エタノールを添加して、金粒子を洗浄および再懸濁させた。金粒子を上述のように遠心分離によりペレット化し、上澄みを廃棄した。ＤＮＡ被覆金粒子を、１１０μＬの１００％エタノール中に再懸濁させ、氷上に維持した。簡単なボルテックスの後、１０μＬの金粒子溶液を、マイクロキャリア膜の中央に置き、空気乾燥させた。

【0236】

ＰＤＳ−１０００／ＨＥ ＰＡＲＴＩＣＬＥ ＧＵＮ ＤＥＬＩＶＥＲＹ ＳＹＳＴＥＭ（商標）（ＢｉｏＲａｄ）を使用して、バイオリスティック媒介ＤＮＡ送達により未熟接合小麦胚の胚盤をトランスフェクトした。ＤＮＡ被覆金粒子の送達は、以下の設定を使用して行った：ギャップ２．５ｃｍ、停止板開口０．８ｃｍ、標的距離６．０ｃｍ、真空度９１．４〜９４．８ｋＰａ、真空流速５．０および通気流速４．５。未熟接合小麦胚の胚盤は、９００ｐｓｉラプチャーディスクを使用して照射した。２０の胚盤を含有する各ＰＥＴＲＩ（商標）皿を１回照射した。照射された胚盤を２６℃で１６時間暗所でインキュベートしてから、カルス誘導のための培地上に移した。胚盤を、２６℃で７日間、カルス誘導培地上で暗所で培養した。

【0237】

ＳＥＣプロトプラストからのゲノムＤＮＡ単離
葉肉プロトプラストに関して前述した手順を使用して、ゲノムＤＮＡをＳＥＣプロトプラストから抽出した。トランスフェクションに使用したドナーＤＮＡの存在を低減するために、追加の精製ステップを行った。これは、トランスフェクションに使用したドナーＤＮＡからのＳＥＣプロトプラストからゲノムＤＮＡを分離するためのゲル電気泳動を使用して達成された。抽出されたＤＮＡは、０．５Ｘ ＴＢＥを使用して、０．５％アガロースゲル中で３時間電気泳動された。ＤＮＡは、ＳＹＢＲ（登録商標）ＳＡＦＥ染色により可視化し、ＳＥＣプロトプラストからのゲノムＤＮＡに対応するバンドを離断した。製造者の説明に従い、ＱＩＡＱＵＩＣＫ ＤＮＡ ＰＵＲＩＦＩＣＡＴＩＯＮ ＫＩＴ（商標）（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してゲノムＤＮＡをアガロースゲルから精製したが、但しＱＩＡＱＵＩＣＫ（商標）ＤＮＡ精製カラムを、ＤＮＥＡＳＹ ＰＬＡＮＴ ＤＮＡ ＥＸＴＲＡＣＴＩＯＮ ＭＩＮＩ ＫＩＴ（商標）（Ｑｉａｇｅｎ）製のＤＮＡ結合カラムと置き換えた。

【0238】

未熟接合胚の胚盤からのゲノムＤＮＡ単離
各バイオリスティック媒介ＤＮＡ送達のためにトランスフェクトされた未熟接合小麦胚の２０の胚盤を、１５ｍｌ管に移し、液体窒素中で急速凍結してから、ＬＡＢＣＯＮＣＯ ＦＲＥＥＺＯＮＥ ４．５（登録商標）（Ｌａｂｃｏｎｃｏ、Ｋａｎｓａｓ Ｃｉｔｙ、ＭＯ）内で、−４０℃および１３３×１０^−３ｍＢａｒの圧力で２４時間フリーズドライした。凍結乾燥されたカルスを、製造者の説明に従いＤＮＥＡＳＹ（登録商標）ＰＬＡＮＴ ＤＮＡ ＥＸＴＲＡＣＴＩＯＮ ＭＡＸＩ（商標）キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してＤＮＡ抽出に供した。

【0239】

トランスフェクションに使用したドナーＤＮＡの存在を低減するために、追加の精製ステップを行った。これは、トランスフェクションに使用したドナー ＤＮＡからのカルスからゲノムＤＮＡを分離するためのゲル電気泳動を使用して達成された。抽出されたＤＮＡは、０．５Ｘ ＴＢＥを使用して、０．５％アガロースゲル中で３時間電気泳動された。ＤＮＡは、ＳＹＢＲ（登録商標）ＳＡＦＥ染色により可視化し、カルスからのゲノムＤＮＡに対応するバンドを離断した。製造者の説明に従い、ＱＩＡＱＵＩＣＫ（商標）ＤＮＡ ＰＵＲＩＦＩＣＡＴＩＯＮキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してゲノムＤＮＡをアガロースゲルから精製したが、但しＱＩＡＱＵＩＣＫ（商標）ＤＮＡ精製カラムを、ＤＮＥＡＳＹ（登録商標）ＰＬＡＮＴ ＤＮＡ ＥＸＴＲＡＣＴＩＯＮ ＭＡＸＩ（商標）キット（Ｑｉａｇｅｎ）製のＤＮＡ結合カラムと置き換えた。

【0240】

ＺＦＮ媒介ＡＨＡＳ編集のためのゲノムＤＮＡのＰＣＲアッセイ
ＮＨＥＪ指向性ＤＮＡ修復を使用した小麦における内因性ＡＨＡＳ遺伝子におけるＺＦＮ媒介ゲノム編集を調査するために、および各ＤＮＡ修復経路の有効性に対するドナーＤＮＡ設計の効果を評価するために、ＰＣＲアッセイを使用して、トランスフェクトされた小麦細胞のゲノムＤＮＡからの標的ＡＨＡＳ領域を増幅した。前述のようにＰＣＲ分析を行って、Ｉｌｌｕｍｉｎａベースの合成による配列決定（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ−ｂｙ−ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）技術のための正しい形式で必要な遺伝子座特異的ＤＮＡ分子を生成した。各アッセイは、ＡＨＡＳ遺伝子の３つの同祖コピーのそれぞれに対し、ＺＦＮ２９７３２および２９７３０（プラスミドｐＤＡＢ１０９３５０上にコードされている）ならびにＺＦＮ３００１２および３００１８（プラスミドｐＤＡＢ１０９３６０上にコードされている）により標的化された領域を増幅するように設計された、前述のプライマー対（配列番号：１６０および配列番号：１７０）を使用して行った。コムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ）ゲノムの十分なコピーがＺＦＮ媒介遺伝子編集の信頼性のある評価のために分析されることを確実とするために、トランスフェクトされた試料当たり複数の反応を行った。トランスフェクトされたＳＥＣプロトプラストに対して、トランスフェクトされた試料当たり、個々のプロトプラストから採取された２００，０００コピーのコムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ）ゲノムに相当する１６までのＰＣＲアッセイを行った。未熟接合胚のトランスフェクトされた胚盤に対して、トランスフェクトされた試料当たり、個々のプロトプラストから採取された６００，０００コピーのコムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ）ゲノムに相当する約４８のＰＣＲアッセイを行った。ＣＢＯＴ ＣＬＵＳＴＥＲ ＧＥＮＥＲＡＴＩＯＮ ＫＩＴ（商標）（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用して、それぞれのトランスフェクトされた試料を配列決定のために調製し、前述のように、ＩＬＬＵＭＩＮＡ ＧＡＩＩ_Ｘ（商標）またはＨＩＳＥＱ２０００（商標）機器（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）上で配列決定して、１００ｂｐの対末端配列リードを生成した。

【0241】

ＡＨＡＳ遺伝子におけるＺＦＮ媒介ＮＨＥＪ指向性編集を検出するためのデータ分析
トランスフェクトされたＳＥＣプロトプラストおよび未熟接合小麦胚の胚盤のために調製された試料ライブラリのためのＩｌｌｕｍｉｎａショートリード配列データの生成後、標的ＺＦＮ部位におけるＺＦＮ媒介ＮＨＥＪ指向性編集の分子的な証拠を特定するために分析を行った。

【0242】

ＮＨＥＪ指向性遺伝子編集の分子的な証拠を有する配列リードを特定するために、前述のようにショート配列リードをまず演算処理して、各リードを試料およびそれらが由来する部分ゲノムに帰属させ、高品質の配列のみが後の分析に使用されることを確実するために品質フィルタリングを行った。次に、特別に開発されたＰＥＲＬスクリプト、およびＭｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ ２０１０（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）での手作業のデータ処理を使用して、トランスフェクションに使用したドナーＤＮＡ分子および内因性ＡＨＡＳ遺伝子座の両方に対する配列を含有するリードを特定した。編集頻度（１００万リードあたりの部で表現される）は、ＺＦＮ媒介ＮＨＥＪ指向性遺伝子編集の証拠を示す部分ゲノム帰属配列リードの割合として計算された。

【0243】

各直鎖２本鎖ＤＮＡドナー設計に対して行われた３つの生物学的反復実験試料の結果から、配列リードの濃縮に対して分子レベルの証拠が得られ、小麦における内因性ＡＨＡＳ遺伝子の３つの同祖コピーにおけるＺＦＮ媒介ＮＨＥＪ指向性編集が示された（表７および表８）。ｐＤＡＢ１０９３５０およびｐＤＡＳ０００１５２でトランスフェクトされた未熟接合胚のＳＥＣプロトプラストおよび胚盤の両方の試料での、ＺＦＮ２９７３２および２９７３０によるＡＨＡＳ遺伝子の同祖コピーの切断によって形成された２本鎖ＤＮＡ切断の位置における直鎖２本鎖４１ｂｐドナー分子の組み込みに関して、強固な分子レベルの証拠が得られた。これらの試料において、３つの小麦部分ゲノムにわたって同様の編集効率が観察された。対照的に、ｐＤＡＢ１０９３５０およびｐＤＡＳ０００１５３でトランスフェクトされた未熟接合胚のＳＥＣプロトプラストおよび胚盤の試料は、ＺＦＮ媒介ＮＨＥＪ指向性遺伝子編集の乏しい証拠を示し、これは、恐らくは、プラスミド骨格からの４１ｂｐドナー配列の植物体内放出のための前提必要条件に起因する。４１ｂｐドナー分子での内因性ＡＨＡＳ配列の置き換えの分子レベルの証拠は、ｐＤＡＢ１０９３５０、ｐＤＡＢ１０９３６０およびｐＤＡＳ０００１４９でトランスフェクトされた未熟接合胚のＳＥＣプロトプラストおよび胚盤の両方において観察された。しかしながら、編集の頻度は、ｐＤＡＢ１０９３５０およびｐＤＡＳ０００１５２を使用して行われたトランスフェクションにおいて観察されたものより大幅に低かったが、これは恐らくは内因性ＡＨＡＳ配列の二重ＺＦＮ切断の必要性に起因する。ｐＤＡＢ１０９３５０、ｐＤＡＢ１０９３６０およびｐＤＡＳ０００１５０でトランスフェクトされた未熟接合胚のＳＥＣプロトプラストおよび胚盤の試料におけるプラスミド骨格からの植物体内放出を必要とする４１ｂｐドナー分子での内因性ＡＨＡＳ配列の置き換えにおいては、得られる証拠が限られていた。

【表7-1】

【表7-2】

【表8-1】

【表8-2】

【表8-3】

【0244】

総合的に、結果は、小麦における内因性ＡＨＡＳ遺伝子座での正確なＺＦＮ媒介ＮＨＥＪ指向性編集の強力な分子レベルの証拠を示している。これらの結果は、３つ全ての部分ゲノムが単一のＺＦＮおよびドナーにより標的化され得ることを示している。結果は、プラスミドドナーＤＮＡ設計と比較してより高い頻度の、直鎖ドナーＤＮＡ設計の編集を明確に実証している。恐らくは、これらの結果は、ＮＨＥＪ指向性ＤＮＡ修復に関与することができる前の、プラスミドドナー分子の植物体内直鎖化の前提必要条件に起因する。結果はまた、部分ゲノム特異的媒介ＮＨＥＪ指向性遺伝子編集が、２本鎖切断により促進されることを示している。２本鎖ＤＮＡ切断を誘発するように設計されたＺＦＮは、ドナーＤＮＡと共にコムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ）植物細胞に送達されると、部分ゲノム特異的媒介ＮＨＥＪ指向性遺伝子編集をもたらした。

【0245】

ＡＨＡＳ編集植物を生成するための形質転換系の開発
小麦における内因性ＡＨＡＳ遺伝子座は、ＺＦＮ媒介遺伝子編集により誘導される正確なゲノム修飾を有する植物を生成するための形質転換系を開発するためのモデル遺伝子座として選択された。内因性ＡＨＡＳ遺伝子は、選択可能な表現型（すなわち、グループＢ除草剤−ＡＬＳ阻害剤への耐性）を生成するその能力、部分ゲノム特異的遺伝子コード化配列の前提条件情報の知識、および、ＡＨＡＳ遺伝子における化学的に誘導された変異を有する小麦の特性決定からのグループＢ除草剤に耐性を付与する特定の変異の知識により、モデル遺伝子座として選択された。イミダゾリノンクラスの除草剤に対する耐性を付与するＳ６５３Ｎ変異は、正確に編集されたイベントを強化する化学的選択系を開発するための陽性対照として使用され得るＳ６５３Ｎ変異を有する、市販の小麦種の利用可能性に起因して、ＺＦＮ媒介遺伝子編集の標的として選択された。

【0246】

コムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ）品種Ｃｌｅａｒｆｉｅｌｄ Ｊａｎｚの分子特性決定
Ｄ−ゲノムにＳ６５３Ｎ変異を有する市販のパン用小麦種であるコムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ）品種 Ｃｌｅａｒｆｉｅｌｄ Ｊａｎｚは、ＺＦＮ媒介遺伝子編集により生成されるＡＨＡＳ編集小麦植物を強化する化学的選択戦略を開発するための陽性対照としての使用に選択された。純粋な遺伝子種ストックを生成するために、Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ−Ｒｅａｄｙ ＰＣＲ技術（Ｈａｙｄｅｎ ｅｔ ａｌ．， （２００８） ＢＭＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ９；８０）を使用して、４８の実生を９６マイクロサテライト（ＳＳＲ）マーカーでスクリーニングした。同一のＳＳＲハプロタイプを有する実生を使用して、後の実験において使用される種を生成した。

【0247】

種を生成するために使用された小麦植物がＳ６５３Ｎ変異を有することを確実とするために、小麦のＤ−ゲノムからの変異を有するＡＨＡＳ遺伝子の領域を増幅するためのＰＣＲアッセイを開発した。部分ゲノム特異的増幅は、最後から２番目の塩基（ホスホロチオエート連結を有する）を、ＡＨＡＳ遺伝子の同祖コピー間を区別するヌクレオチド配列変異上に位置付けるように設計されたプライマーＡＨＡＳ−ＰＳ−６ＤＦ２およびＡＨＡＳ−ＰＳ−６ＤＲ２（配列番号：１８３および配列番号：１８４）を用い、オン−オフＰＣＲを使用して達成された（Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．， （２００５） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ３２８：２６５−７２）。ＰＣＲプライマーは、１８〜２７のヌクレオチド長であるように、また６０〜６５℃、最適には６３℃の融点を有するように設計された。増幅されたＰＣＲ産物は、ＱＩＡＱＵＩＣＫ ＭＩＮＩＥＬＵＴＥ ＰＣＲ ＰＵＲＩＦＩＣＡＴＩＯＮ ＫＩＴ（商標）（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製され、直接的サンガー配列決定法を使用して配列決定された。配列決定する産物は、ＢＩＧＤＹＥ（登録商標）ｖ３．１プロトコル（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に従ってエタノール、酢酸ナトリウムおよびＥＤＴＡで精製され、ＡＢＩ３７３０ＸＬ（登録商標）自動化キャピラリー電気泳動プラットフォーム上で電気泳動が行われた。

【0248】

ＳＥＱＵＥＮＣＨＥＲ ｖ３．７（商標） （ＧｅｎｅＣｏｄｅｓ、Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ、ＭＩ）を使用した増幅されたＡＨＡＳ遺伝子配列の分析では、Ｓ６５３Ｎ変異の分離が明らかとなり、また、Ｓ６５３Ｎ変異に対しホモ接合性（Ｎ６５３／Ｎ６５３）およびヘテロ接合性（Ｎ６５３／Ｓ６５３）である、または除草剤感受性対立遺伝子に対しホモ接合性（Ｓ６５３／Ｓ６５３）である植物の同定が可能となった。個々の植物からの種の収集は、品種Ｃｌｅａｒｆｉｅｌｄ Ｊａｎｚ遺伝的背景において、Ｓ６５３Ｎ変異に対する異なるレベルの接合性を有する種子源を提供した。

【0249】

ＩＭＡＺＡＭＯＸ（商標）に基づく化学的選択条件の最適化
ＡＨＡＳ編集小麦植物を再生するための最適選択条件を決定するために、一連の実験を行った。これらの実験は、確立された小麦形質転換系のカルス誘導、植物再生および発根段階における、ドナー小麦系統品種Ｂｏｂｗｈｉｔｅ ＭＰＢ２６ＲＨ（Ｓ６５３／Ｓ６５３遺伝子型）のＩＭＡＺＡＭＯＸ（商標）に対する基本的耐性の試験に基づいた。異なる量のＳ６５３Ｎ変異を有する品種Ｃｌｅａｒｆｉｅｌｄ Ｊａｎｚ遺伝子型、すなわちＮ６５３／Ｎ６５３およびＳ６５３／Ｓ６５３遺伝子型を有する植物の基本的耐性および抵抗性を決定するために、同様の実験を行った。

【0250】

カルス誘導段階における、ＩＭＡＺＡＭＯＸ（登録商標）に対するドナー小麦系統品種Ｂｏｂｗｈｉｔｅ ＭＰＢ２６ＲＨの基本的耐性および品種Ｃｌｅａｒｆｉｅｌｄ Ｊａｎｚ（Ｎ６５３／Ｎ６５３）遺伝子型の基本的抵抗性は、以下のように決定された： 各小麦系統からの未熟接合胚の胚盤を前述のように単離し、それぞれ０、５０、１００、２００、３００、４００および５００ｎＭのＩＭＡＺＡＭＯＸ（登録商標）を添加したＣＩＭ培地を含有する１０ｃｍ ＰＥＴＲＩ（商標）皿内に入れた。各ＰＥＴＲＩ（商標）皿内に２０の胚盤を入れた。ドナー小麦系統品種Ｂｏｂｗｈｉｔｅ ＭＰＢ２６ＲＨおよび品種Ｃｌｅａｒｆｉｅｌｄ Ｊａｎｚ遺伝子型のそれぞれから全部で６０の胚盤を、各ＩＭＡＺＡＭＯＸ（登録商標）濃度で、基本的耐性および基本的抵抗性反応について試験した。２４℃で４週間の暗所でのインキュベーション後、各ＩＭＡＺＡＭＯＸ（登録商標）濃度での体細胞胚発生カルス形成（ＳＥＣ）の量を記録した。結果は、品種Ｂｏｂｗｈｉｔｅ ＭＰＢ２６ＲＨのＳＥＣ形成が、１００ｎＭのＩＭＡＺＡＭＯＸ（登録商標）において、未処理試料と比較して約７０％低減されたことを示した。品種Ｃｌｅａｒｆｉｅｌｄ Ｊａｎｚ遺伝子型のカルス形成は、試験された任意のＩＭＡＺＡＭＯＸ（登録商標）濃度において、未処理対照と比較して影響されなかった。

【0251】

植物再生段階におけるドナー小麦系統品種Ｂｏｂｗｈｉｔｅ ＭＰＢ２６ＲＨのＩＭＡＺＡＭＯＸ（登録商標）に対する基本的耐性は、以下のように決定された：ドナー小麦系統からの未熟接合胚の胚盤を前述のように単離し、ＣＩＭ培地を含有する１０ｃｍ ＰＥＴＲＩ（商標）皿内に入れた。２４℃で４週間暗所でインキュベートすることにより、体細胞胚発生カルスを形成させた。それぞれ０、１００、２００、３００、４００、５００および１０００ｎＭのＩＭＡＺＡＭＯＸ（登録商標）を添加したＤＲＭ培地を含有する１０ｃｍ ＰＥＴＲＩ（商標）皿にＳＥＣを移した。各ＰＥＴＲＩ（商標）皿内に２０のＣＩＭを入れた。全部で６０のＣＩＭを、各ＩＭＡＺＡＭＯＸ（登録商標）濃度で、基本的耐性反応について試験した。成長室内で１６／８（明／暗）時間の光周期での２４℃で２週間のインキュベーション後、再生反応を記録した。結果は、植物再生が、２００ｎＭのＩＭＡＺＡＭＯＸ（登録商標）において、未処理試料と比較して約８０％低減されたことを示した。

【0252】

植物再生段階における、ＩＭＡＺＡＭＯＸ（登録商標）に対する品種Ｃｌｅａｒｆｉｅｌｄ Ｊａｎｚ （Ｓ６５３／Ｓ６５３）遺伝子型の基本的耐性および品種Ｃｌｅａｒｆｉｅｌｄ Ｊａｎｚ （Ｎ６５３／Ｎ６５３）遺伝子型の基本的抵抗性は、品種Ｃｌｅａｒｆｉｅｌｄ Ｊａｎｚが組織培養物内で低い植物再生反応（すなわち、低い胚形成）を有することが観察されたため、修正された手法を使用して決定された。各品種Ｃｌｅａｒｆｉｅｌｄ Ｊａｎｚ遺伝子型の種は、小麦葉肉プロトプラストの生成に関して上述した無菌手法を使用して発芽させた。発芽した実生を、増殖培地上での二次培養によりインビトロで増殖させた。増殖後、それぞれ０、１００、３００、６００、９００、１２００、１５００および３０００ｎＭの ＩＭＡＺＡＭＯＸ（登録商標）を添加した植物成長培地（ＭＳ＋１０μＭ ＢＡ＋０．８％寒天）を含有する１０ｃｍ ＰＥＴＲＩ（商標）皿に、各遺伝子型の植物を移した。１０の植物を、各ＰＥＴＲＩ（商標）皿内に入れた。遺伝子型当たり全部で３０の植物を、各ＩＭＡＺＡＭＯＸ（登録商標）濃度における基本的反応について試験した。成長室内で１６／８（明／暗）時間の光周期での２４℃で３週間のインキュベーション後、成長反応を記録した。結果は、品種Ｃｌｅａｒｆｉｅｌｄ Ｊａｎｚ（Ｓ６５３／Ｓ６５３）遺伝子型の植物成長が、少なくとも２００ｎＭの ＩＭＡＺＡＭＯＸ（登録商標）を含有する培地中で、未処理試料と比較して大幅に低減されたことを示した。この反応は、品種．Ｂｏｂｗｈｉｔｅ ＭＰＢ２６ＲＨ（Ｓ６５３／Ｓ６５３）遺伝子型に対して観察された反応と同様であった。対照的に、品種Ｃｌｅａｒｆｉｅｌｄ Ｊａｎｚ（Ｎ６５３／Ｎ６５３）遺伝子型の植物成長は、ＩＭＡＺＡＭＯＸ（登録商標）濃度が２，０００ｎＭを超えるまでは、未処理試料に比べて大きくは抑制されなかった。

【0253】

植物発根段階におけるドナー小麦系統品種Ｂｏｂｗｈｉｔｅ ＭＰＢ２６ＲＨのＩＭＡＺＡＭＯＸ（登録商標）に対する基本的耐性は、以下のように決定された：ドナー小麦系統からの未熟接合胚の胚盤を前述のように単離し、ＣＩＭ培地を含有する１０ｃｍ ＰＥＴＲＩ（商標）皿内に入れた。２４℃で４週間暗所でインキュベートすることにより、体細胞胚発生カルスを形成させた。ＤＲＭ培地を含有する１０ｃｍ ＰＥＴＲＩ（商標）皿にＳＥＣを移し、１６／８（明／暗）時間の光周期で２４℃で２週間インキュベートし、植物再生を生じさせた。それぞれ０、１００、２００、３００、４００、５００ｎＭのＩＭＡＺＡＭＯＸ（登録商標）を添加したＲＭ培地を含有する１０ｃｍ ＰＥＴＲＩ（商標）皿に、再生された植物を移した。２０の再生された植物を、各ＰＥＴＲＩ（商標）皿内に入れた。全部で６０の再生された植物を、各ＩＭＡＺＡＭＯＸ（登録商標）濃度で、基本的耐性反応について試験した。成長室内で１６／８（明／暗）時間の光周期での２４℃で３週間のインキュベーション後、根形成反応を記録した。結果は、根形成が、試験された全てのＩＭＡＺＡＭＯＸ（登録商標）の濃度において、未処理試料と比較して大幅に制限されたことを示した。

【0254】

植物発根段階における、ＩＭＡＺＡＭＯＸ（登録商標）に対する品種Ｃｌｅａｒｆｉｅｌｄ Ｊａｎｚ（Ｓ６５３／Ｓ６５３）遺伝子型の基本的耐性および品種Ｃｌｅａｒｆｉｅｌｄ Ｊａｎｚ（Ｎ６５３／Ｎ６５３）の基本的抵抗性は、品種Ｃｌｅａｒｆｉｅｌｄ Ｊａｎｚが組織培養物内で低い植物体再生反応（すなわち、低い胚形成）を有することが観察されたため、修正された手法を使用して決定された。各品種Ｃｌｅａｒｆｉｅｌｄ Ｊａｎｚ遺伝子型の種は、小麦葉肉プロトプラストの生成に関して上述した無菌手法を使用して発芽させた。発芽した実生を、増殖培地上での二次培養によりインビトロで増殖させた。増殖後、それぞれ０、５０、１００、２００および２５０ｎＭのＩＭＡＺＡＭＯＸ（登録商標）を添加した植物発根培地（１／２ＭＳ、０．５ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ、０．８％寒天）を含有する１０ｃｍ ＰＥＴＲＩ（商標）皿に、各遺伝子型の植物を移した。３つの植物を、各ＰＥＴＲＩ（商標）皿内に入れた。遺伝子型当たり全部で６つの植物を、各ＩＭＡＺＡＭＯＸ（登録商標）濃度における基本的反応について試験した。成長室内で１６／８（明／暗）時間の光周期での２４℃で２週間のインキュベーション後、根形成反応を記録した。

【0255】

結果は、品種Ｃｌｅａｒｆｉｅｌｄ Ｊａｎｚ（Ｎ６５３／Ｎ６５３）遺伝子型の根形成が、２５０ｎＭのＩＭＡＺＡＭＯＸ（登録商標）において、未処理試料と比較して制限されたことを示した。根形成は、品種Ｃｌｅａｒｆｉｅｌｄ Ｊａｎｚ（Ｓ６５３／Ｓ６５３）遺伝子型において、試験された全てのＩＭＡＺＡＭＯＸ（登録商標）の濃度において、未処理試料と比較して大幅に制限された。

【0256】

ＺＦＮ媒介ＡＨＡＳ遺伝子編集のためのドナーＤＮＡの設計および合成
ドナーＤＮＡ分子を、小麦における内因性ＡＨＡＳ遺伝子での正確なＺＦＮ媒介ＮＨＥＪ指向性遺伝子編集を促進するように設計した。ドナー設計により、イミダゾリノンクラス除草剤（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．， （２００８） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ ２２：２１７−２２５）に対する耐性を付与することが知られているＳ６５３Ｎ変異の導入が可能となった。

【0257】

第１の設計は、ＺＦＮ２９７３２および２９７３０（プラスミドｐＤＡＢ１０９３５０上にコードされている）による内因性ＡＨＡＳ遺伝子の同祖コピーの切断により形成された２本鎖ＤＮＡ切断の位置における、９５ｂｐの２本鎖ドナー分子の組み込みに基づいた。ドナーＤＮＡ分子、ｐＤＡＳ０００２６７（配列番号：４２３および配列番号：４２４）は、組み込みドナーポリヌクレオチドの２つの部分を含んでいた。５’末端は、標的ＺＦＮ切断部位から開始してＡＨＡＳ停止コドンで終了する、Ｄ−ゲノム内にコードされた内因性ＡＨＡＳ遺伝子とほぼ同一の配列を含有した。６つの意図的変異がこの配列に導入されたが、２つの変異はＳ６５３Ｎ変異（ＡＧＣ→ＡＡＴ）をコードし、４つの変異は同義的であった（サイレント変異がドナー配列内に組み込まれていた）。ドナー分子の３’末端は、ＺＦＮ媒介ＮＨＥＪ指向性遺伝子編集イベントを検出するための診断ＰＣＲに使用され得る固有配列を含有していた。ドナー分子は、ＺＦＮ媒介ＮＨＥＪ指向性ＤＮＡ修復を促進するための連結オーバーハングを提供するために、突出した５’および３’末端を有するように設計された。

【0258】

第２の設計は、ＺＦＮ標的部位の対の間に位置する内因性 ＡＨＡＳ配列の、７９ｂｐ２本鎖ドナー分子との置き換えに基づいた。具体的には、ドナーは、ＺＦＮ２９７３２および２９７３０（プラスミドｐＤＡＢ１０９３５０上にコードされている）ならびにＺＦＮ３００１２および３００１８（プラスミドｐＤＡＢ１０９３６０上にコードされている）によるＡＨＡＳ遺伝子の同祖コピーの二重切断後にクロマチンから放出された内因性ＡＨＡＳ配列を置き換えるように設計された。ドナー分子、ｐＤＡＳ０００２６８（配列番号：４２５および配列番号：４２６）は、ＺＦＮ２９７３２および２９７３０の切断部位から開始してＺＦＮ３００１２および３００１８の切断部位で終了する、Ｄ−ゲノム内にコードされた内因性ＡＨＡＳ遺伝子とほぼ同一の配列を含んだ。この配列内に、１０の意図的な変異を導入した。６つの変異は、ドナーの５’末端に位置したが、２つの変異はＳ６５３Ｎ変異（ＡＧＣ→ＡＡＴ）をコードし、４つの変異は同義的であった。４つの変異はドナーの３’末端に位置し、非コード化配列に位置した。ドナー分子は、ＺＦＮ媒介ＮＨＥＪ指向性ＤＮＡ修復を促進するための連結オーバーハングを提供するために、突出した５’および３’末端を有するように設計された。

【0259】

標準的なホスホラミダイト化学を使用して、２本鎖ＤＮＡドナー分子（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を合成的に合成した。各ドナー分子に対して、植物体内エンドヌクレアーゼ分解に対する保護を提供するためにそれぞれ５’末端に２つのホスホロチオエート連結を有する１対の相補的１本鎖ＤＮＡオリゴマーを合成した。１本鎖ＤＮＡオリゴマーを、高速液体クロマトグラフィーにより精製して、全長分子を濃縮し、Ｎａ^＋交換を使用した合成ステップからの化学的キャリーオーバーから精製した。当業者に一般的に知られている標準的方法を使用して、等モル量の２つの相補的１本鎖ＤＮＡオリゴマーをアニールすることにより、２本鎖ドナー分子を形成した。コムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ）への送達の前に、２本鎖ＤＮＡ分子を滅菌水中で必要な濃度まで希釈した。

【0260】

ＡＨＡＳ（Ｓ６５３Ｎ）をコードするバイナリベクターの設計および生成
バイナリベクターｐＤＡＳ０００１４３（配列番号：１８５）（図１５）の構築において、標準的クローニング方法を使用した。ＡＨＡＳ（Ｓ６５３Ｎ）遺伝子発現カセットは、トウモロコシ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）由来ユビキチン（Ｕｂｉ）遺伝子からのプロモーター、５’非翻訳領域およびイントロン（Ｔｏｋｉ ｅｔ ａｌ．， （１９９２） Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ １００； １５０３−０７）に続く、アミノ酸残基６５３におけるセリン（Ｓ）からアスパラギン（Ｎ）へのアミノ酸変化を誘導するためにＣＧからＡＴに変異した塩基対１８８０および１１８１を有するコムギ（Ｔ． ａｅｓｔｉｖｕｍ）からのＡＨＡＳ遺伝子のコード化配列（１９３５ｂｐ）からなる。ＡＨＡＳ発現カセットは、Ａ．ツメファシエンスｐＴｉ１５９５５からのノパリンシンターゼ遺伝子（ｎｏｓ）の３’非翻訳領域（ＵＴＲ）を含んでいた。（Ｆｒａｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，（１９８３） Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｕ．Ｓ．Ａ． ８０（１５）；４８０３−４８０７）。選択カセットは、アジアイネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）由来アクチン１（Ａｃｔ１）遺伝子からのプロモーター、５’非翻訳領域およびイントロン （ＭｃＥｌｒｏｙ ｅｔ ａｌ．， （１９９０） Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ２（２）； １６３−１７１）に続く、ホスフィノトリシン、グルホシネート、およびビアラホスを含むグルタミン合成酵素の阻害剤に対する抵抗性を付与するタンパク質をコードする、ストレプトミセス・ビリドクロモゲネスから単離されたホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＴ）遺伝子の合成植物最適化型を含んでいた（Ｗｏｈｌｌｅｂｅｎ ｅｔ ａｌ．， （１９８８） Ｇｅｎｅ ７０（１）； ２５−３７）。このカセットは、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓ遺伝子からの３’ＵＴＲで終端された（Ｃｈｅｎａｕｌｔ ｅｔ ａｌ．， （１９９３） Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ １０１ （４）； １３９５−１３９６）。

【0261】

選択カセットは、商業的な遺伝子合成業者により合成され（ＧｅｎｅＡｒｔ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、Ｇａｔｅｗａｙ有効化バイナリベクターにクローニングされ、ＲｆＡ Ｇａｔｅｗａｙカセットは、トウモロコシ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）由来ユビキチン（Ｕｂｉ）遺伝子と、Ａ．ツメファシエンスｐＴｉ１５９５５由来ノパリンシンターゼ遺伝子（ｎｏｓ）の転写ターミネーターおよびポリアデニル化部位を含む、３’非翻訳領域（ＵＴＲ）との間に位置した。ＡＨＡＳ（Ｓ６５３Ｎ）コード化配列は、隣接ａｔｔＢ部位で増幅され、ｐＤＯＮＲ２２１にサブクローニングされた。得られたＥＮＴＲＹクローンを、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＴ）発現カセットをコードするＧａｔｅｗａｙ有効化バイナリベクターとのＬＲ ＣＬＯＮＡＳＥ ＩＩ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）反応において使用した。全ての連結反応で形質転換された大腸菌細胞のコロニーを、まずミニプレップＤＮＡの制限酵素消化によりスクリーニングした。制限エンドヌクレアーゼは、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓおよびＰｒｏｍｅｇａから入手した。プラスミド調製は、製造者の説明に従い、ＱＩＡＰＲＥＰ ＳＰＩＮ ＭＩＮＩＰＲＥＰ ＫＩＴ（商標）またはＰＵＲＥ ＹＩＥＬＤ ＰＬＡＳＭＩＤ ＭＡＸＩＰＲＥＰ ＳＹＳＴＥＭ（商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ＷＩ）を使用して行われた。選択されたクローンのプラスミドＤＮＡを、ＡＢＩ Ｓａｎｇｅｒ ＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇおよびＢＩＧ ＤＹＥ ＴＥＲＭＩＮＡＴＯＲ ｖ３．１（商標）サイクル配列決定プロトコル（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して配列決定した。配列データをアセンブルし、ＳＥＱＵＥＮＣＨＥＲ ＳＯＦＴＷＡＲＥ（商標） （Ｇｅｎｅ Ｃｏｄｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ、ＭＩ）を使用して分析した。

【0262】

ＡＨＡＳ編集小麦植物を生成するためのバイオリスティック媒介形質転換系
ドナー小麦系統品種Ｂｏｂｗｈｉｔｅ ＭＰＢ２６ＲＨからの未熟接合胚の約２３，０００の胚盤を、前述のようにバイオリスティック媒介ＤＮＡ送達のために調製した。ＤＮＡ被覆金粒子を、以下の製剤を使用して、上述のように調製した。ｐＤＡＳ０００２６７を使用して行われるトランスフェクションにおいては、ドナーＤＮＡをｐＤＡＢ１０９３５０（ＺＦＮ２９７３２および２９７３０をコードする）に対するプラスミドＤＮＡと５：１モル比で混合した。ｐＤＡＳ０００２６８を使用して行われるトランスフェクションにおいては、ドナーＤＮＡをＤＡＢ１０９３５０（ＺＦＮ２９７３２および２９７３０をコードする）ならびにｐＤＡＢ１０９３６０（ＺＦＮ３００１２および３００１８をコードする）に対するプラスミドＤＮＡと１０：１：１モル比で混合した。ｐＤＡＳ０００１４３を使用して行われるトランスフェクションは、ｐＤＡＳ０００１４３に対するプラスミドＤＮＡのみで被覆された金粒子を使用して行われた。

【0263】

バイオリスティック媒介トランスフェクションは、前述のように行われた。全部で１５，６２０の胚盤に、ｐＤＡＳ０００２６７を含有するＤＮＡで被覆された金粒子を照射し、全部で７，３１０の胚盤に、ｐＤＡＳ０００２６８を含有するＤＮＡで被覆された金粒子を照射し、全部で２，１２０の胚盤に、ｐＤＡＳ０００１４３で被覆された金粒子を照射した。照射後、トランスフェクトされた胚盤を２６℃で１６時間暗所でインキュベートしてから、カルス誘導のための培地上に移した。

【0264】

ＩＭＡＺＡＭＯＸ（登録商標）に基づく４つの異なる化学的選択戦略を使用して、ＺＦＮ媒介ＮＨＥＪ指向性遺伝子編集により内因性ＡＨＡＳ遺伝子の１つ以上の同祖コピーに正確に組み込まれたＳ６５３Ｎ変異を有する、再生された小麦植物を濃縮した。４つの化学的選択戦略を、表９に記載する。各戦略において、胚盤を、２４℃で２週間、カルス誘導培地上で暗所で培養した。得られたカルスを、新鮮なカルス誘導培地上で１回二次培養し、さらに２週間、同じ条件に維持した。体細胞胚発生カルス（ＳＥＣ）を植物再生培地上に移し、成長室内で、１６／８（明／暗）時間の光周期で２４℃で２週間培養した。再生された小植物を、発根培地上に写し、同じ条件下で２〜３週間培養した。Ｓ６５３Ｎ変異を有する再生された植物の選択のためのストリンジェンシーを増加させるために、再生された植物の根を除去し、植物を再び同じ条件下で発根培地上で二次培養した。再び発根する小植物を土壌に移し、温室封入条件下で成長させた。異系交配を防止するために個々の穂を袋に入れた後、個々の植物からＴ_１種を収集した。

【0265】

ｐＤＡＳ０００１４３で被覆された金粒子を照射された胚盤外植片を使用して、ＡＨＡＳ Ｓ６５３Ｎ変異を有する小麦植物を再生するための４つの化学的選択戦略にわたる選択ストリンジェンシーを監視した。ｐＤＡＳ０００１４３で形質転換された植物を、上述のプロセスを使用して再生した。

【表9】

【0266】

全体として、１４の推定ＺＦＮ媒介ＮＨＥＪ指向性ＡＨＡＳ編集小麦植物を、ドナー小麦系統品種Ｂｏｂｗｈｉｔｅ ＭＰＢ２６ＲＨからの未熟接合胚の２２，９３０の胚盤のトランスフェクションから回収した。推定編集植物を、ｐＤＡＳ０００２６７を含有するＤＮＡで被覆された金粒子を照射された胚盤の４つ全ての選択戦略から得た。２つの推定編集植物を、ｐＤＡＳ０００２６８を含有するＤＮＡで被覆された金粒子を照射された胚盤の第２の選択戦略から得た。ＡＨＡＳ（Ｓ６５３Ｎ）ドナーポリヌクレオチドの少なくとも１つの無作為に組み込まれたコピーを有する、全部で１２９の推定形質転換小麦植物が、４つの化学的選択戦略にわたって回収された。

【0267】

編集小麦植物の分子特性決定
Ｓ６５３Ｎ変異をコードするドナーポリヌクレオチドによる照射から得られた小麦植物を得、ゲノム２本鎖切断部位におけるドナー組み込みの結果生じたＳ６５３Ｎ変異の組み込みを含む小麦部分ゲノムを同定するために分子的に特性決定した。２つのシリーズの照射を完了した。第１のセットの実験は、ｐＤＡＳ０００１４３を用いて完了し、第２のセットの実験は、ｐＤＡＳ０００２６７およびｐＤＡＳ０００２６８を用いて完了した。両方のセットの実験から個々の小麦植物を得、Ｓ６５３Ｎ変異をコードするＡＨＡＳドナーポリヌクレオチドの組み込まれたコピーを含有する植物を同定するための分子的方法により分析した。

【0268】

定量的ＰＣＲ分析のための加水分解プローブアッセイ（ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）ベースアッセイに類似）を使用して、ｐＤＡＳ０００１４３を照射された回収された小麦植物が、Ｓ６５３Ｎ変異をコードするＡＨＡＳドナーポリヌクレオチドの少なくとも１つの無作為に組み込まれたコピーを有することを確認した。サンガー配列分析による確認では、ｐＤＡＳ０００２６７およびｐＤＡＳ０００２６８を用いて行われた照射から回収された小麦植物が、ＺＦＮ媒介ＮＨＥＪ指向性遺伝子編集が期待される位置に、ＡＨＡＳ遺伝子の同祖コピーの少なくとも１つにおけるＳ６５３Ｎドナーポリヌクレオチドを含んでいることが示された。

【0269】

再生された小麦植物からのゲノムＤＮＡ単離
ゲノムＤＮＡを、再生されたそれぞれの小麦植物から収集されたフリーズドライ葉組織から抽出した。新しく収集された葉組織を液体窒素中で急速凍結し、ＬＡＢＣＯＮＣＯ ＦＲＥＥＺＯＮＥ ４．５（登録商標）（Ｌａｂｃｏｎｃｏ、Ｋａｎｓａｓ Ｃｉｔｙ、ＭＯ）内で−４０℃および１３３×１０^−３ｍＢａｒの圧力で２４時間フリーズドライした。凍結乾燥された材料を、製造者の説明に従いＤＮＥＡＳＹ（登録商標）ＰＬＡＮＴ ＤＮＡ ＥＸＴＲＡＣＴＩＯＮ ＭＩＮＩ ＫＩＴ（商標）（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してＤＮＡ抽出に供した。

【0270】

Ｓ６５３Ｎ変異をコードするＡＨＡＳドナーポリヌクレオチドの無作為な組み込みを確認するためのＰＣＲアッセイ
ｐＤＡＳ０００１４３を用いて行われた照射からの再生された小麦植物が、Ｓ６５３Ｎ変異をコードするＡＨＡＳドナーポリヌクレオチドの少なくとも１つの無作為に組み込まれたコピーを有することを確認するために、二重加水分解プローブｑＰＣＲアッセイ（ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）に類似）を使用して、内因性単一コピー遺伝子、６倍体小麦のＤゲノムからのプロインドリン−ｂ（Ｐｉｎｂ）（Ｇａｕｔｉｅｒ ｅｔ ａｌ．， （２０００） Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ １５３， ８１−９１；順方向および逆方向プライマーならびにプローブ配列に対してそれぞれ配列番号：１８６、配列番号：１８７および配列番号：１８８）、およびｐＤＡＳ０００１４３上に存在するアクチン（Ａｃｔ１）プロモーターの領域（順方向および逆方向プライマーならびにプローブ配列に対してそれぞれ配列番号：１８９、配列番号：１９０および配列番号：１９１）を増幅した。加水分解プローブｑＰＣＲアッセイは、４つの化学的選択戦略のそれぞれから回収された２４の無作為に選択された小麦植物に対して行った。ｐＤＡＳ００１４３の存在およびその推定コピー数の評価は、Ｌｉｖａｋ ａｎｄ Ｓｃｈｍｉｔｔｇｅｎ （２００１） Ｍｅｔｈｏｄｓ ２５（４）：４０２−８に記載の方法に従って行った。

【0271】

結果から、Ｓ６５３Ｎ変異をコードするＡＨＡＳドナーポリヌクレオチドの少なくとも１つのコピーの、試験された小麦植物それぞれのゲノムへの組み込みの決定的な証拠が得られた。これらの結果は、４つの化学的選択戦略が、Ｓ６５３Ｎ変異を発現する植物の回収のためのストリンジェントな選択を提供したことを示している。

【0272】

ＺＦＮ媒介ＡＨＡＳ編集のためのゲノムＤＮＡのＰＣＲアッセイ
回収された小麦植物における部分ゲノム位置およびＺＦＮ媒介ＮＨＥＪ指向性遺伝子編集の結果を特性決定するために、プライマーＡＨＡＳ＿３Ｆ１およびＡＨＡＳ＿３Ｒ１（配列番号：１９２および配列番号：１９３）を用いたＰＣＲを使用して、ＡＨＡＳ遺伝子の同祖コピーからの標的領域を増幅した。得られたＰＣＲ産物は、プラスミドベクターにクローニングし、ＡＢＩ３７３０ＸＬ（登録商標）自動化キャピラリー電気泳動プラットフォーム上で、ＢＩＧＤＹＥ（登録商標）ｖ３．１化学（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用してサンガー配列決定を行った。内因性ＡＨＡＳ同祖体における各対立遺伝子が配列決定されることを確実とするために、１２０までの独立したプラスミドクローンのサンガー配列決定を行った。ＳＥＱＵＥＮＣＨＥＲ ＳＯＦＴＷＡＲＥ（商標）を使用して行われる配列分析を使用して、回収された小麦植物のそれぞれにおけるＡＨＡＳ遺伝子の３つの同祖コピーの各対立遺伝子のコンセンサス配列を生成し、それぞれの編集された対立遺伝子の部分ゲノムの起源および配列を決定した。

【0273】

結果から、内因性ＡＨＡＳ遺伝子座における正確なＺＦＮ媒介ＮＨＥＪ指向性遺伝子編集の決定的な証拠が、ｐＤＡＢ１０９３５０およびｐＤＡＳ０００２６７を使用して形質転換された１２の回収された小麦植物のうち１１に対して（表１０）、ならびに ｐＤＡＢ１０９３５０、ｐＤＡＢ１０９３６０およびｐＤＡＳ０００２６８を使用して形質転換された回収された小麦植物の両方（表１１）に対して実証された。（１）完全な部分ゲノム特異的対立遺伝子編集を有する独立したイベント、（２）Ａ−ゲノム、Ｂ−ゲノムおよびＤ−ゲノムにおける単一の完全な編集を有するイベント、（３）複数の部分ゲノムにおける同時編集を有するイベント、ならびに（４）半接合体およびホモ接合体部分ゲノム特異的対立遺伝子編集を示すイベントを含む、一連の編集結果を有する植物が観察された。小麦植物の３つ全てのゲノム内の遺伝子座を変異させるために使用され得る方法が、初めて開示される。Ｓ６５３Ｎ変異をコードする組み込まれたＡＨＡＳドナーポリヌクレオチドを含む小麦植物が例示され、ポリヌクレオチド配列の組み込みは、イミダゾリノンクラス除草剤に対する耐性を提供する。小麦における内因性遺伝子座でのＺＦＮ媒介ゲノム編集の使用によって、３つ全ての部分ゲノムに形質を移入するために必要な時間の量を増加させ得る戻し交配および遺伝子移入ステップを必要とする、時間のかかる小麦育種技術なしで、（変異を介して）農業形質を導入することができる。編集小麦植物の各部分ゲノムに存在する対立遺伝子のコンセンサスサンガー配列は、表１０および１１において配列番号：１９４〜２７７として記載される。

【表10-1】

【表10-2】

【表11】

【0274】

Ｐ１９７アミノ酸残基をコードするＡＨＡＳ遺伝子における領域に特異的なジンクフィンガー結合ドメインの設計
ＡＨＡＳ遺伝子の同祖コピーのＤＮＡ配列に指向性のジンクフィンガータンパク質を、前述のように設計した。例となる標的配列および認識へリックスを、表１２（認識へリックス領域設計）および表１３（標的部位）に示す。表１３において、ＺＦＰ認識へリックスに接触する標的部位におけるヌクレオチドは大文字で示され、接触していないヌクレオチドは小文字で示されている。ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）標的部位は、プロリン１９７（Ｐ１９７）アミノ酸残基をコードするＡＨＡＳ遺伝子における領域の上流側（２〜５１０ヌクレオチド上流側）に設計された。

【表12】

【表13】

【0275】

ＡＨＡＳジンクフィンガー設計は、ジンクフィンガー発現ベクター内に組み込まれ、前述のように出芽酵母系を使用して切断活性について検証された。設計され、生成され、推定ＡＨＡＳゲノムポリヌクレオチド標的部位への結合が試験された数々のＺＦＮのうち、上述のＺＦＮは、高レベルでインビボ活性を有するものとして特定され、さらなる実験に選択された。これらのＺＦＮは、３つの同祖ＡＨＡＳに結合するように設計され、植物体内で固有ＡＨＡＳゲノムポリヌクレオチド標的部位を効率的に結合および切断することができると特徴付けられた。

【0276】

トランジェントアッセイを使用したＡＨＡＳ遺伝子のジンクフィンガーヌクレアーゼ切断の評価
ＺＦＮ構築物アセンブリ；前述のように、酵母系を使用して切断活性が検証されたＺＦＮ発現構築物を含有するプラスミドベクターが、設計および完成された。得られたプラスミド構築物；ｐＤＡＢ１１１８５５（ＺＦＮ３４４７０−２Ａ−３４４７１）、ｐＤＡＢ１１１８５６（ＺＦＮ３４４７２−２Ａ−３４４７３）、およびｐＤＡＢ１１１８５７（ＺＦＮ３４４７４−２Ａ−３４４７５）は、制限酵素消化およびＤＮＡ配列決定により確認された。

【0277】

トランスフェクションのためのＺＦＮ構築物からのＤＮＡの調製
コムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ）プロトプラストへの送達の前に、各ＺＦＮ構築物のためのプラスミドＤＮＡを、供給業者の説明に従い、ＰＵＲＥ ＹＩＥＬＤ ＰＬＡＳＭＩＤ ＭＡＸＩＰＲＥＰ ＳＹＳＴＥＭ（登録商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）またはＰＬＡＳＭＩＤ ＭＡＸＩ ＫＩＴ（登録商標）（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を使用して、大腸菌の培養物から調製した。

【0278】

小麦葉肉プロトプラストの単離およびトランスフェクション
ドナー小麦系統品種Ｂｏｂｗｈｉｔｅ ＭＰＢ２６ＲＨからの葉肉プロトプラストを、前述のようにポリエチレングリコール（ＰＥＧ）媒介ＤＮＡ送達を使用して調製およびトランスフェクトした。

【0279】

ＺＦＮ配列切断のためのプロトプラストゲノムＤＮＡのＰＣＲアッセイ
トランスフェクトされたプロトプラストからゲノムＤＮＡを単離し、前述のように、Ｐ１９７をコードするＡＨＡＳ遺伝子の領域に対して設計されたＺＦＮの切断効率および標的部位特異性を評価するためのＰＣＲアッセイに使用した。アスタリスク（＊）で示されるホスホロチオエート連結を含有する５セットのＰＣＲプライマーを使用して、ＺＦＮ標的部位遺伝子座を増幅した（表１４）。各プライマーセットは、前述の基準に従い設計された。

【表14】

【0280】

標的ＺＦＮ部位におけるＮＨＥＪを検出するためのデータ分析
トランスフェクトされた葉肉プロトプラストのために調製された試料ライブラリのためのＩｌｌｕｍｉｎａショートリード配列データの生成後、バイオインフォマティクス分析（前述の通り）を行って、標的ＺＦＮ部位における欠失したヌクレオチドを同定した。そのような欠失は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）ＤＮＡ修復から得られる植物体内ＺＦＮ活性の指標であることが知られている。

【0281】

試験したＺＦＮの切断効率および特異性を評価するために、２つの手法が使用された。切断効率は、ＺＦＮ標的部位にＮＨＥＪ欠失を含有する部分ゲノム帰属配列の割合として（１００万リードあたりの部で）表現された（表１５）。観察された切断効率によるＺＦＮの等級序列を使用して、部分ゲノム特異的な様式でＡＨＡＳ遺伝子の標的領域に対して最良の切断活性を有するＺＦＮを同定した。試験したＺＦＮは全て、植物体内ＺＦＮ活性に対して推定されるものと一致するＮＨＥＪ欠失サイズ分布を示した。切断特異性は、３つの部分ゲノムにわたり観察された切断効率の比として表現された。

【表15】

【0282】

これらの結果から、３つの小麦部分ゲノムのそれぞれにおける有意なそのゲノムＤＮＡ切断活性の特性を考慮して、プラスミドｐＤＡＢ１１１８５５（３４４７０−２Ａ−３４４７１）、ｐＤＡＢ１１１８５６ （３４４７２−２Ａ−３４４７３）およびｐＤＡＢ１１１８５７ （３４４７４−２Ａ−３４４７５）上にコードされたＺＦＮを、後の実験における植物体内標的化に選択した。

【0283】

トランジェントアッセイを使用した、内因性ＡＨＡＳ遺伝子座におけるＺＦＮ媒介外因性マーカー不含逐次的導入遺伝子スタッキングの分子的な証拠の生成
相同性指向性ＤＮＡ修復によるコムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ）細胞のゲノム内の内因性ＡＨＡＳ遺伝子座におけるＺＦＮ媒介逐次的外因性マーカー不含導入遺伝子スタッキングの、トランジェントアッセイを使用した分子的な証拠の生成が、以下のように達成された。

【0284】

ドナーｐＤＡＳ０００２６７およびプラスミドｐＤＡＢ１０９３５０上にコードされたジンクフィンガーヌクレアーゼを用いた形質転換により生成されたＡＨＡＳ（Ｓ６５３Ｎ）編集小麦植物は、小麦のゲノムにおける内因性ＡＨＡＳ遺伝子座での逐次的外因性マーカー不含導入遺伝子スタッキングのための第１のステップを示す。これらの編集植物を使用して、前述の方法を使用したトランスフェクションのための外植片材料（例えば、プロトプラストまたは未熟接合胚の胚盤）を生成した。外植片材料は、その後、ドナーＤＮＡ分子、およびＰ１９７アミノ酸残基をコードする領域の上流側のＡＨＡＳ遺伝子に位置するジンクフィンガー結合部位を標的化するように設計されたＺＦＮ（例えば、ｐＤＡＢ１１１８５５、ｐＤＡＢ１１１８５６またはｐＤＡＢ１１１８５７）をコードするプラスミドで共トランスフェクトされる。ＺＦＮは、ＡＨＡＳ遺伝子座を切断し、ドナー分子は、相同性指向性修復によりコムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ）細胞のゲノム内に組み込まれる。ＮＨＥＪ媒介ドナー分子組み込みの結果、スルホニル尿素クラス除草剤に対する耐性を付与するＡＨＡＳ（Ｐ１９７Ｓ）変異が内因性ＡＨＡＳ配列に導入され、同時に、第１ラウンドの導入遺伝子スタッキングにおいて導入されたＡＨＡＳ（Ｓ６５３Ｎ）変異が除去される。その結果、内因性ＡＨＡＳ遺伝子の発現が、イミダゾリノンに対する耐性およびスルホニル尿素への感受性の付与（第１ラウンドの導入遺伝子スタッキングにおける正しく標的化されたコムギ細胞の表現型）から、イミダゾリノンへの感受性およびスルホニル尿素への耐性の付与へと変化し、そのようにして、スルホニル尿素選択試薬を使用した正しく標的化された細胞の再生が可能となる。ドナーＤＮＡの組み込みおよび正しく標的化された小麦細胞の生成の分子的な証拠は、前述の方法を使用して確認される。

【0285】

１つ以上の導入遺伝子を含有するドナーＤＮＡ分子およびジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするプラスミドによる小麦細胞の共トランスフェクションは、倍数体植物種における複数のゲノムにわたる複数の対立遺伝子の同時編集を含む、正確に同じゲノム位置における植物ゲノム内の並行的（同時）または逐次的導入遺伝子組み込み（導入遺伝子スタッキング）の両方を可能とすることが、当業者に理解される。

【0286】

小麦における内因性ＡＨＡＳ遺伝子座での逐次的外因性マーカー不含導入遺伝子スタッキングのための形質転換系の開発
小麦における内因性ＡＨＡＳ遺伝子は、１つ以上の導入遺伝子が同じゲノム位置に正確に位置した植物を生成するための、ＺＦＮ媒介外因性マーカー不含形質転換系を開発するためのモデル遺伝子座として選択された。形質転換系は、グループＢ除草剤に対する耐性を付与するＡＨＡＳ遺伝子における既知の変異を利用することにより、複数の部分ゲノムにわたる複数の対立遺伝子での同時並行または逐次的スタッキングを含む、正確に同じゲノム位置での並行的（１つ以上の導入遺伝子の同時組み込み）または逐次的スタッキング（１つ以上の導入遺伝子の連続的組み込み）を可能とする。ドナーＤＮＡの野生型（除草剤感受性）ＡＨＡＳ遺伝子座へのＺＦＮ媒介組み込みを使用して、イミダゾリノンに対する耐性を付与する内因性ＡＨＡＳ遺伝子に、導入遺伝子（複数可）および変異が導入され、そのようにして、イミダゾリノン選択試薬を使用した正しく標的化された植物の再生が可能となる。ＡＨＡＳ遺伝子座における第２の導入遺伝子（複数可）のスタッキングは、１つ以上の追加の導入遺伝子を導入し、イミダゾリノンに対する感受性を付与するがスルホニル尿素には耐性を付与するドナーＤＮＡの組み込みにより達成され、そのようにして、スルホニル尿素選択試薬を使用した正しく標的化された植物の再生が可能となる。第３の導入遺伝子のスタッキングは、さらなる導入遺伝子（複数可）を導入し、スルホニル尿素に対する感受性およびイミダゾリノンに対する耐性を付与するドナー分子の組み込みにより達成することができ、そのようにして、イミダゾリノン選択試薬を使用した正しく標的化された植物の再生が可能となる。したがって、イミダゾリノンおよびスルホニル尿素選択試薬の間の異なるサイクルで内因性ＡＨＡＳ遺伝子において導入遺伝子（複数可）および変異を導入するドナーＤＮＡの使用により、逐次的導入遺伝子スタッキングの継続的ラウンドが可能である。導入遺伝子は、ＡＨＡＳ遺伝子内に組み込み、ＮＨＥＪ経路を介してスタックすることができる。ＮＨＥＪ修復および組み換え経路は、ドナー導入遺伝子の設計により決定され得る。一実施形態において、ＡＨＡＳ遺伝子内に組み込まれスタックされる導入遺伝子は、ペイロード（例えば、ＡＨＡＳ変異および目的遺伝子）に隣接する単一または二重切断ＺＦＮ部位を含有するように設計される。したがって、そのような設計は、染色体内へのドナーポリヌクレオチドの組み込みおよびスタッキングのために、ＮＨＥＪ経路を使用する。

【0287】

ＡＨＡＳ（Ｐ１９７Ｓ）発現構築物を有する低コピー無作為組み込みＴ−ＤＮＡ小麦植物の生成
ＡＨＡＳ（Ｐ１９７Ｓ）発現およびＰＡＴ選択カセットを含有するバイナリベクターｐＤＡＳ０００１６４（配列番号：３２６、図１６）を設計し、当該技術分野において一般的に知られている技術および技法を使用してアセンブルした。ＡＨＡＳ（Ｐ１９７Ｓ）発現カセットは、トウモロコシ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）由来ユビキチン（Ｕｂｉ）遺伝子からのプロモーター、５’非翻訳領域およびイントロン（Ｔｏｋｉ ｅｔ ａｌ．， （１９９２） Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ， １００； １５０３−０７）に続く、プロリン（Ｐ）からセリン（Ｓ）へのアミノ酸変化を誘導するためにＣからＴに変異したヌクレオチド５１１を有するコムギ（Ｔ． ａｅｓｔｉｖｕｍ）品種Ｂｏｂｗｈｉｔｅ ＭＰＢ２６ＲＨからのＡＨＡＳ遺伝子のコード化配列（１９３５ｂｐ）からなる。ＡＨＡＳ発現カセットは、Ａ．ツメファシエンスｐＴｉ１５９５５からのノパリンシンターゼ遺伝子（ｎｏｓ）を含む３’非翻訳領域（ＵＴＲ）を含んでいた（Ｆｒａｌｅｙ ｅｔ ａｌ．， （１９８３） Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｕ．Ｓ．Ａ． ８０（１５）： ４８０３−４８０７）。選択カセットは、アジアイネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）由来アクチン１（Ａｃｔ１）遺伝子からのプロモーター、５’非翻訳領域およびイントロン（ＭｃＥｌｒｏｙ ｅｔ ａｌ．， （１９９０） Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ２（２）： １６３−１７１）に続く、ホスフィノトリシン、グルホシネート、およびビアラホスを含むグルタミン合成酵素の阻害剤に対する抵抗性を付与するタンパク質をコードする、ストレプトミセス・ビリドクロモゲネスから単離されたホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＴ）遺伝子の合成植物最適化型を含んでいた（Ｗｏｈｌｌｅｂｅｎ ｅｔ ａｌ．， （１９８８） Ｇｅｎｅ ７０（１）： ２５−３７）。このカセットは、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓ遺伝子からの３’ＵＴＲで終端された（Ｃｈｅｎａｕｌｔ ｅｔ ａｌ．， （１９９３） Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ １０１ （４）； １３９５−１３９６）。

【0288】

選択カセットは、商業的な遺伝子合成業者により合成され（例えば、ＧｅｎｅＡｒｔ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ等）、トウモロコシ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）由来ユビキチン（Ｕｂｉ）遺伝子と、Ａ．ツメファシエンスｐＴｉ１５９５５由来ノパリンシンターゼ遺伝子（ｎｏｓ）の転写ターミネーターおよびポリアデニル化部位を含む、３’非翻訳領域（ＵＴＲ）との間に位置するＲｆＡ Ｇａｔｅｗａｙカセットを有するＧＡＴＥＷＡＹ（登録商標）有効化バイナリベクターにクローニングされた。ＡＨＡＳ（Ｐ１９７Ｓ）コード化配列は、隣接ａｔｔＢ部位で増幅され、ｐＤＯＮＲ２２１にサブクローニングされた。得られたＥＮＴＲＹクローンを、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＴ）発現カセットをコードするＧａｔｅｗａｙ有効化バイナリベクターとのＬＲ ＣＬＯＮＡＳＥ ＩＩ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）反応において使用した。全てのアセンブルされたプラスミドのコロニーを、まずミニプレップＤＮＡの制限酵素消化によりスクリーニングした。制限エンドヌクレアーゼは、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ（ＮＥＢ；Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）およびＰｒｏｍｅｇａ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ＷＩ）から入手した。プラスミド調製は、供給業者の説明に従い、ＱＩＡＰＲＥＰ ＳＰＩＮ ＭＩＮＩＰＲＥＰ ＫＩＴ（登録商標）（Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ）またはＰＵＲＥ ＹＩＥＬＤ ＰＬＡＳＭＩＤ ＭＡＸＩＰＲＥＰ ＳＹＳＴＥＭ（登録商標） （Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ＷＩ）を使用して行われた。選択されたクローンのプラスミドＤＮＡを、ＡＢＩ Ｓａｎｇｅｒ ＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇおよびＢＩＧ ＤＹＥ ＴＥＲＭＩＮＡＴＯＲ Ｖ３．１（登録商標）サイクル配列決定プロトコル（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して配列決定した。配列データをアセンブルし、ＳＥＱＵＥＮＣＨＥＲ（商標）ソフトウェア（Ｇｅｎｅ Ｃｏｄｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ、ＭＩ）を使用して分析した。

【0289】

得られたバイナリ発現クローンｐＤＡＳ０００１６４を、アグロバクテリウム・ツメファシエンス株ＥＨＡ１０５に形質転換した。無作為に組み込まれたＴ−ＤＮＡを有するトランスジェニック小麦植物は、Ｗｕ ｅｔ ａｌ． （２００８） Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １７：４２５−４３６と同様のプロトコルに従い、ドナー小麦系統品種Ｂｏｂｗｈｉｔｅ ＭＰＢ２６ＲＨを使用して、アグロバクテリウム媒介形質転換により生成された。ＡＨＡＳ（Ｐ１９７）発現構築物を発現する推定Ｔ_０トランスジェニックイベントを、ホスフィノトリシン（ＰＰＴ）耐性、ＰＡＴ選択可能マーカーにより付与される表現型のために選択し、土壌に移した。Ｔ_０植物を温室封入条件下で成長させ、Ｔ_１種を生成した。

【0290】

各Ｔ_０植物からのゲノムＤＮＡを上述のように葉組織から抽出し、アグロバクテリウム・ツメファシエンスの存在、およびＡＨＡＳ（Ｐ１９７Ｓ）をコードするＴ−ＤＮＡの組み込まれたコピーの数について試験した。Ａ． ツメファシエンスの存在は、二重加水分解プローブｑＰＣＲアッセイ（ＴＡＱＭＡＮ（商標）に類似）を使用して行い、小麦ゲノム由来内因性ユビキチン遺伝子（順方向および逆方向プライマーならびにプローブ配列に対してそれぞれ配列番号：３２７、配列番号：３２８、および配列番号：３２９）、およびｐＴｉＢｏ５４２由来ｖｉｒＣ（順方向および逆方向プライマーならびにプローブ配列に対してそれぞれ配列番号：３３０、配列番号：３３１、および配列番号：３３２）を増幅した。組み込まれたＴ−ＤＮＡコピーの数は、前述のように、６倍体小麦のＤゲノムからのプロインドリン−ｂ（Ｐｉｎｂ）およびｐＤＡＳ０００１６４上に存在するアクチン（Ａｃｔ１）プロモーターの領域に基づき、二重加水分解プローブｑＰＣＲアッセイを使用して推定された。全体として、無作為に組み込まれたＴ−ＤＮＡのコピーが３未満である３５の独立したＴ_０イベントが生成された。

【0291】

スルホメツロンメチルに基づく化学的選択条件の最適化
スルホニル尿素クラス除草剤に対する耐性を付与するＡＨＡＳ（Ｐ１９７Ｓ）変異を発現する小麦植物を再生するための最適な選択条件を決定するために、一連の実験を行った。これらの実験は、確立された小麦形質転換系のカルス誘導、植物再生および発根段階における、野生型ドナー小麦系統品種Ｂｏｂｗｈｉｔｅ ＭＰＢ２６ＲＨ（スルホニル尿素に対する感受性を付与するＰ１９７／Ｐ１９７遺伝子型）の基本的耐性の試験に基づいた。スルホニル尿素選択試薬に対する耐性を付与するＡＨＡＳ（Ｐ１９７）変異を発現するＴ−ＤＮＡが無作為に組み込まれたトランスジェニック品種Ｂｏｂｗｈｉｔｅ ＭＰＢ２６ＲＨイベントの基本的耐性を決定するために、同様の実験を行った。

【0292】

カルス誘導段階における野生型ドナー小麦系統のスルホメツロンメチルに対する基本的耐性は、以下のように決定された：未熟接合胚の胚盤を前述のように単離し、それぞれ０、１００、５００、１０００、１５００および２０００ｎＭのスルホメツロンメチルを添加したＣＩＭ培地を含有する１０ｃｍ ＰＥＴＲＩ（商標）皿内に入れた。各ＰＥＴＲＩ（商標）皿内に２０の胚盤を入れた。全部で６０の胚盤を、各スルホメツロンメチル濃度で試験した。２４℃で４週間の暗所でのインキュベーション後、各スルホメツロンメチル濃度での体細胞胚発生カルス形成（ＳＥＣ）の量を記録した。結果は、品種Ｂｏｂｗｈｉｔｅ ＭＰＢ２６ＲＨのＳＥＣ形質転換が、１００ｎＭのスルホメツロンメチルにおいて、未処理試料と比較して約７０％低減されたことを示した。

【0293】

植物再生段階における野生型ドナー小麦系統のスルホメツロンメチルに対する基本的耐性は、以下のように決定された：ドナー小麦系統からの未熟接合胚の胚盤を単離し、ＣＩＭ培地を含有する１０ｃｍ ＰＥＴＲＩ（商標）皿内に入れた。２４℃で４週間暗所でインキュベートすることにより、体細胞胚発生カルスを形成させた。それぞれ０、１００、５００、１０００、１５００、２０００、２５００および３０００ｎＭのスルホメツロンメチルを添加したＤＲＭ培地を含有する１０ｃｍ ＰＥＴＲＩ（商標）皿にＳＥＣを移した。各ＰＥＴＲＩ（商標）皿内に２０のＣＩＭを入れた。全部で６０のＣＩＭを、各スルホメツロンメチル濃度で、基本的耐性反応について試験した。成長室内で１６／８（明／暗）時間の光周期での２４℃で２週間のインキュベーション後、再生反応を記録した。結果は、植物再生が、２０００ｎＭのスルホメツロンメチルにおいて、未処理試料と比較して約８０％低減されたことを示した。

【0294】

植物発根段階における野生型ドナー小麦系統のスルホメツロンメチルに対する基本的耐性は、以下のように決定された：未熟接合胚の胚盤を単離し、ＣＩＭ培地を含有する１０ｃｍ ＰＥＴＲＩ（商標）皿内に入れた。２４℃で４週間暗所でインキュベートすることにより、体細胞胚発生カルスを形成させた。ＤＲＭ培地を含有する１０ｃｍ ＰＥＴＲＩ（商標）皿にＳＥＣを移し、１６／８（明／暗）時間の光周期で２４℃で２週間インキュベートし、植物再生を生じさせた。それぞれ０、１００、２００、２５０、３００、４００、５００、１０００および２０００ｎＭのスルホメツロンメチルを添加したＲＭ培地を含有する１０ｃｍ ＰＥＴＲＩ（商標）皿に、再生された植物を移した。１０の再生された植物を、各ＰＥＴＲＩ（商標）皿内に入れた。全部で３０の再生された植物を、各スルホメツロンメチル濃度で、基本的耐性反応について試験した。成長室内で１６／８（明／暗）時間の光周期での２４℃で３週間のインキュベーション後、根形成反応を記録した。結果は、スルホメツロンメチルの濃度が４００ｎＭを超えると、根形成が非処理試料と比較して大幅に阻害されたことを示した。

【0295】

植物発根段階における、ＡＨＡＳ（Ｐ１９７Ｓ）変異を発現する無作為に組み込まれた低コピー（≦３）Ｔ−ＤＮＡを有するトランスジェニック小麦イベントの、スルホメツロンメチルに対する基本的耐性は、以下のように決定された：４つの独立したトランスジェニックイベントを無作為に選択し、増殖培地上での二次培養によりインビトロで増殖させた。増殖後、それぞれ０、４００、４５０、５００、５５０および６００ｎＭのスルホメツロンメチルを添加したＲＭ培地を含有する１０ｃｍ ＰＥＴＲＩ（商標）皿に、各イベントに対する植物を移した。４つの植物（４つのイベントのそれぞれから１つ）を、各ＰＥＴＲＩ（商標）皿内に入れた。イベント当たり全部で３つの植物を、各スルホメツロンメチル濃度で、基本的耐性について試験した。成長室内で１６／８（明／暗）時間の光周期での２４℃で２週間のインキュベーション後、根形成反応を記録した。結果は、根形成が、試験された全ての濃度において、未処理対照と比較して制限されないことを示したが、これは、ＡＨＡＳ（Ｐ１９７Ｓ）変異がスルホメツロンメチルに対する高い耐性を付与したことを示している。

【0296】

ＮＨＥＪ指向性ＤＮＡ修復を使用した内因性ＡＨＡＳ遺伝子座における第１の逐次的導入遺伝子スタッキングのためのドナーＤＮＡの設計および合成
第１ラウンドの導入遺伝子スタッキングのためのドナーＤＮＡは、ＺＦＮ媒介ＮＨＥＪ指向性修復による内因性ＡＨＡＳ遺伝子座における正確なドナー組み込みを促進するように設計される。設計は、ＺＦＮ２９７３２および２９７３０（プラスミドｐＤＡＢ１０９３５０上にコードされている）による内因性ＡＨＡＳ遺伝子の同祖コピーの切断により形成された２本鎖ＤＮＡ切断の位置における、２本鎖ドナー分子の組み込みに基づく。ドナー分子（ｐＤＡＳ０００４３３；配列番号：３３３、図１７）は、ポリヌクレオチド配列のいくつかの部分を含む。５’末端は、標的ＺＦＮ切断部位から開始してＡＨＡＳ停止コドンで終了する、Ｄ−ゲノム内にコードされた内因性ＡＨＡＳ遺伝子とほぼ同一の配列を含有する。７つの意図的変異をこの配列に導入するが、２つの変異は、Ｓ６５３Ｎ変異およびＺＦＮ２９７３２の結合部位にわたって位置する５つのコドン最適化同義変異をコードし、組み込まれたドナーの再切断を防止する。停止コドンの後に、ＡＨＡＳ同祖体にわたる保存された３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）に対応する３１６ｂｐの非コード化配列がある。３’ＵＴＲ配列の後に、ＺＦＮ３４４８０および３４４８１（プラスミドｐＤＡＢ１１１８６０上にコードされている）ならびにＺＦＮ３４４８２および３４４８３（プラスミドｐＤＡＢ１１１８６１上にコードされている）に対するジンクフィンガー結合部位がある。これらのジンクフィンガー結合部位は、次のラウンドの導入遺伝子スタッキング中に内因性遺伝子座において組み込まれたドナー由来ＡＨＡＳ（コード化および３’ＵＴＲ）配列の自己離断を可能にする。自己離断ジンクフィンガー結合部位の後に、２つの固有の制限エンドヌクレアーゼ切断部位に隣接し、ドナー分子への導入遺伝子発現カセット（例えば、前述のようなＰＡＴ発現カセット）の挿入を可能にする、いくつかの追加的なジンクフィンガー結合部位（そのそれぞれは１００ｂｐの無作為配列により隔てられている）がある。追加的なジンクフィンガー結合部位は、逐次的マーカー不含導入遺伝子スタッキングにより、または交互スタッキング方法を使用した同じゲノム位置における継続的な逐次的導入遺伝子スタッキングにより、ＡＨＡＳ遺伝子座において組み込まれた導入遺伝子の将来の離断を可能にする。

【0297】

ドナーカセットは、商業的遺伝子サービス業者により（例えば、ＧｅｎｅＡｒｔ、Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ等）、内因性ＡＨＡＳ遺伝子座の切断後に、ＺＦＮ２９７３２および２９７３０（プラスミドｐＤＡＢ１０９３５０上にコードされている）により生成された連結オーバーハングに適合する、突出した５’および３’末端を有するドナー分子の生成を可能とするために、５’および３’末端における短く伸びた追加的な隣接配列を有するように合成される。突出した５’および３’末端を有するドナー分子は、当業者に知られている標準的方法を使用して、ドナー分子を含有するプラスミドＤＮＡを、制限エンドヌクレアーゼＢｂｓＩで消化させることにより生成される。

【0298】

ＮＨＥＪ指向性ＤＮＡ修復を使用した内因性ＡＨＡＳ遺伝子座における第２の逐次的導入遺伝子スタックのためのドナーＤＮＡの設計および合成
第２ラウンドの導入遺伝子スタッキングのためのドナーＤＮＡは、ＺＦＮ媒介ＮＨＥＪ指向性修復による第１の導入遺伝子スタックにおいて標的化される同じＡＨＡＳ遺伝子座における正確なドナー組み込みを促進するように設計される。設計は、ＺＦＮ３４４８０および３４４８１（プラスミドｐＤＡＢ１１１８６０上にコードされている）またはＺＦＮ３４４８２および３４４８３（プラスミドｐＤＡＢ１１１８６１上にコードされている）による第１のスタックされた導入遺伝子を含有するＡＨＡＳ遺伝子コピーの切断によって形成された２本鎖ＤＮＡ切断における、２本鎖ドナー分子の組み込みに基づく。ドナー分子（ｐＤＡＳ０００４３４；配列番号：３３４、図１８）は、ポリヌクレオチド配列のいくつかの部分を含む。５’末端は、標的ＺＦＮ切断部位から開始してＡＨＡＳ停止コドンで終了する、Ｄ−ゲノム内にコードされた内因性ＡＨＡＳ遺伝子とほぼ同一の配列を含有する。いくつかの意図的変異、すなわちＰ１９７Ｓ変異ならびにＺＦＮ３４４８１および３４４８３の結合部位にわたって位置するコドン最適化同義変異をこの配列に導入し、組み込まれたドナーの再切断を防止する。停止コドンの後に、ＡＨＡＳ同祖体における保存された３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）に対応する３１６ｂｐの非コード化配列がある。３’ＵＴＲ配列の後に、ＺＦＮ３４４７４および３４４７５（プラスミドｐＤＡＢ１１１８５７上にコードされている）ならびにＺＦＮ３４４７６および３４４７７（プラスミドｐＤＡＢ１１１８５８上にコードされている）に対するジンクフィンガー結合部位がある。これらのジンクフィンガー結合部位は、次のラウンドの導入遺伝子スタッキングにおいて内因性遺伝子座に組み込まれたドナー由来ＡＨＡＳ（コード化および３’ＵＴＲ）配列の自己離断を可能にする。自己離断ジンクフィンガー結合部位の後に、固有の制限エンドヌクレアーゼ切断部位に隣接し、導入遺伝子発現カセット（例えば、特許出願第１３７５７５３６号に記載のようなＤＧＴ−２８発現カセット）の挿入を可能にする、いくつかの追加的なジンクフィンガー結合部位（そのそれぞれは１００ｂｐの無作為配列により隔てられている）がある。追加的なジンクフィンガー結合部位は、逐次的マーカー不含導入遺伝子スタッキングにより、または交互スタッキング方法を使用した同じゲノム位置における継続的な逐次的導入遺伝子スタッキングにより、ＡＨＡＳ遺伝子座において組み込まれ得る導入遺伝子の将来の離断を可能にする。ドナーカセットは、商業的遺伝子サービス業者により（例えば、ＧｅｎｅＡｒｔ、Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、内因性ＡＨＡＳ遺伝子座の切断後に、ＺＦＮ３４４７４および３４４７５（プラスミドｐＤＡＢ１１１８５７上にコードされている）またはＺＦＮ３４４７６および３４４７７（プラスミドｐＤＡＢ１１１８５８上にコードされている）により生成された連結オーバーハングに適合する、突出した５’および３’末端を有するドナー分子の生成を可能とするために、５’および３’末端における短く伸びた追加的な隣接配列を有するように合成される。突出した５’および３’末端を有するドナー分子は、当業者に知られている標準的方法を使用して、ドナー分子を含有するプラスミドＤＮＡを、制限エンドヌクレアーゼＢｂｓＩで消化させることにより生成される。

【0299】

ＮＨＥＪ指向性ＤＮＡ修復を使用した小麦における内因性ＡＨＡＳ遺伝子座での外因性マーカー不含逐次的導入遺伝子スタッキングのための形質転換系
ドナーｐＤＡＳ０００４３３ならびにＺＦＮ２９７３２および２９７３０（プラスミドｐＤＡＢ１０９３５０上にコードされている）を用いた形質転換による外因性マーカー不含逐次的導入遺伝子スタッキングによって、同じ内因性ＡＨＡＳ遺伝子座にスタックされた複数の導入遺伝子によるトランスジェニック小麦イベントが生成される。正確なＺＦＮ媒介ＮＨＥＪ指向性ドナー組み込みにより、第１の導入遺伝子およびイミダゾリノンに対する耐性を付与するＳ６５３Ｎ変異がＡＨＡＳ遺伝子座に導入され、そのようにして、前述のようにＩＭＡＺＡＭＯＸ（登録商標）を選択試薬として使用した正しく標的化された植物の再生が可能となる。図１９ａは、その組み込みを示す。ドナーｐＤＡＳ０００４３４ならびにＺＦＮ３４４８０および３４４８１（プラスミドｐＤＡＢ１１１８６０上にコードされている）を用いた、第１の導入遺伝子のスタックイベントに由来する小麦細胞のその後の形質転換は、Ｐ１９７の上流側に位置するＺＦＮ結合部位と、ドナー分子による第１の導入遺伝子スタックの間に組み込まれた自己離断部位との間に位置する内因性クロマチンの置き換えをもたらす。これは、第２の導入遺伝子およびスルホニル尿素に対する耐性を付与するＰ１９７Ｓ変異の組み込みをもたらし、そのようにして、スルホメツロンメチルを選択試薬として使用した正しく標的化された植物の再生が可能となる。同時に、第２のドナーの組み込みによりＳ６５３Ｎ変異が除去され、そのようにしてイミダゾリノンに対する感受性が回復する（図１９Ｂ）。第３の導入遺伝子のスタッキングは、適切なジンクフィンガーヌクレアーゼ、ならびに追加的な導入遺伝子を含有し、スルホニル尿素に対する感受性およびイミダゾリノンに対する耐性を付与するドナーを用いた形質転換により達成することができ、そのようにして、ＩＭＡＺＡＭＯＸ（登録商標）を選択試薬として使用した正しく標的化された植物の再生が可能となることが、当業者に理解される。したがって、イミダゾリノンおよびスルホニル尿素選択試薬の間の異なるサイクルで内因性ＡＨＡＳ遺伝子において導入遺伝子および変異を導入するドナーを用いた形質転換により、逐次的導入遺伝子スタッキングの継続的ラウンドが可能である。

【0300】

ＨＤＲ指向性ＤＮＡ修復を使用した内因性ＡＨＡＳ遺伝子座における第１の逐次的導入遺伝子スタッキングのためのドナーＤＮＡの設計および合成
第１ラウンドの導入遺伝子スタッキングのためのドナーＤＮＡは、ＺＦＮ媒介修復による内因性ＡＨＡＳ遺伝子座における正確なドナー組み込みを促進するように設計される。設計は、ＺＦＮ２９７３２および２９７３０（プラスミドｐＤＡＢ１０９３５０上にコードされている）による内因性ＡＨＡＳ遺伝子の同祖コピーの切断により形成された２本鎖ＤＮＡ切断の位置における、２本鎖ドナー分子の組み込みに基づく。ドナー分子（ｐＤＡＳ０００４３５；配列番号：３３５、図２１）は、配列がｐＤＡＳ０００４３３（配列番号：３３３）と同一である。

【0301】

ＨＤＲ指向性ＤＮＡ修復を使用した小麦における内因性ＡＨＡＳ遺伝子座での外因性マーカー不含逐次的導入遺伝子スタッキングのための形質転換系
ドナーｐＤＡＳ０００４３５ならびにＺＦＮ２９７３２および２９７３０（プラスミドｐＤＡＢ１０９３５０上にコードされている）を用いた形質転換による外因性マーカー不含逐次的導入遺伝子スタッキングによって、同じ内因性ＡＨＡＳ遺伝子座にスタックされた複数の導入遺伝子によるトランスジェニック小麦イベントが生成される。正確なＺＦＮ媒介ＨＤＲ指向性ドナー組み込みにより、第１の導入遺伝子およびイミダゾリノンに対する耐性を付与するＳ６５３Ｎ変異がＡＨＡＳ遺伝子座に導入され、そのようにして、前述のようにＩＭＡＺＡＭＯＸ（登録商標）を選択試薬として使用した正しく標的化された植物の再生が可能となる。図２０ａは、その組み込みを示す。ドナーｐＤＡＳ０００４３６ならびにＺＦＮ３４４８０および３４４８１（プラスミドｐＤＡＢ１１１８６０上にコードされている）を用いた、第１の導入遺伝子のスタックイベントに由来する小麦細胞のその後の形質転換は、Ｐ１９７の上流側に位置するＺＦＮ結合部位と、ドナー分子による第１の導入遺伝子スタックの間に組み込まれた自己離断部位との間に位置する内因性クロマチンの置き換えをもたらす。これは、第２の導入遺伝子およびスルホニル尿素に対する耐性を付与するＰ１９７Ｓ変異の組み込みをもたらし、そのようにして、スルホメツロンメチルを選択試薬として使用した正しく標的化された植物の再生が可能となる。同時に、第２のドナーの組み込みによりＳ６５３Ｎ変異が除去され、そのようにしてイミダゾリノンに対する感受性が回復する（図２０ｂ）。当業者には明らかなように、第３の導入遺伝子のスタッキングは、適切なジンクフィンガーヌクレアーゼ、ならびに追加的な導入遺伝子を含有し、スルホニル尿素に対する感受性およびイミダゾリノンに対する耐性を付与するドナーを用いた形質転換により達成することができ、そのようにして、ＩＭＡＺＡＭＯＸ（登録商標）を選択試薬として使用した正しく標的化された植物の再生が可能となる。したがって、イミダゾリノンおよびスルホニル尿素選択試薬の間の異なるサイクルで内因性ＡＨＡＳ遺伝子において導入遺伝子および変異を導入するドナーを用いた形質転換により、逐次的導入遺伝子スタッキングの継続的ラウンドが可能である。

【0302】

正確なゲノム修飾の特定の組み合わせを有するトランスジェニック植物を回収するための、人工交雑および分子分析
ドナーＤＮＡおよびジンクフィンガーヌクレアーゼ構築物を用いた形質転換により生成されるコムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ）イベントは、標的内因性遺伝子座の１つ以上のコピーにおけるドナー分子配列の組み込みをもたらす。以前に示したように、ＺＦＮ媒介ゲノム修飾は、複数の部分ゲノムにわたる複数の対立遺伝子の同時編集を含み得る。その後、形質転換イベントの人工交雑が、正確なゲノム修飾の特定の組み合わせを選択するために使用され得る。例えば、Ｓ６５３Ｎ変異で正確に修飾されたＡＨＡＳ遺伝子を有する、生成された形質転換イベントの人工交雑を使用して、特定の部分ゲノム上、複数の部分ゲノム上、または３つ全ての部分ゲノム上にＳ６５３Ｎ変異を有する小麦植物を生成することができる。その後の形質転換イベントの人工交雑は、正確なゲノム修飾の特定の組み合わせを有する植物の生成を促進する。当業者は、例えば前述のような分子アッセイを展開して、その後の世代における人工交雑の間の特定のゲノム修飾の遺伝を追跡することができる。

【0303】

実施例７：セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）オメガ−３脂肪酸デサチュラーゼ（Ｆａｄ３）への標的化組み込みおよびその妨害
Ｆａｄ３ＣおよびＦａｄ３Ａに特異的なジンクフィンガー結合ドメインの選択
同祖Ｆａｄ３遺伝子の転写された領域を同定および特性決定し、本明細書に記載のドナー配列のＮＨＥＪ媒介標的化のためのそれらの部位を結合および切断するように設計されたジンクフィンガーヌクレアーゼを、設計および構築した。参照により本明細書に組み込まれる米国仮特許番号第６１／６９７，８５４号を参照されたい。Ｆａｄ３配列の同祖体からのＤＮＡ配列に指向性のジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）を設計し、米国仮特許番号第６１／６９７，８５４号において以前に説明されたように試験した。的確な活性を示すＺＦＮから、Ｆａｄ３標的を高効率で切断するジンクフィンガータンパク質を選択した：ＺＦＰ２８０５１−２Ａ−２８０５２は、配列番号：３３６ ５’−ＧＣＣＣＡＡＧＧＡＡＣＣＣＴＴＴＴＣＴＧＧＧＣＣＡＴＣＴＴＣＧＴＡＣＴＣＧＧＣＣＡＣＧＡＣＴＧＧＴＡＡＴＴＴＡＡＴ−３’を認識し、Ｆａｄ３Ｃゲノム遺伝子座を特異的に結合および切断することが以前に示された。同様に、ジンクフィンガータンパク質２８０５３−２Ａ−２８０５４は、配列番号：３３７ ５’−ＡＧＣＧＡＧＡＧＡＡＡＧＣＴＴＡＴＴＧＣＡＡＣＴＴＣＡＡＣＴＡＣＴＴＧＣＴＧＧＴＣＧＡＴＣＧＴＧＴＴＧＧＣＣＡＣＴＣ−３’を認識し、Ｆａｄ３ＡおよびＦａｄ３Ｃゲノム遺伝子座を特異的に結合および切断することが以前に示された。ＺＦＰ認識へリックスに接触する標的部位におけるヌクレオチドを、表１６に示す。

【表16】

【0304】

Ｆａｄ３ＣおよびＦａｄ３Ａに特異的なジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする発現ベクターの設計および構築
Ｆａｄ３ジンクフィンガー設計は、ＣＣＨＣ構造を有する少なくとも１つのフィンガーを有するタンパク質をコードするジンクフィンガー発現ベクター内に組み込まれた（米国特許公開第２００８／０１８２３３２号）。具体的には、各タンパク質における最後のフィンガーは、認識へリックスのＣＣＨＣ骨格を有していた。非正準ジンクフィンガーコード化配列を、ＩＩＳ型制限酵素ＦｏｋＩのヌクレアーゼドメイン（Ｗａｈ ｅｔ ａｌ．， （１９９８） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９５：１０５６４−１０５６９の配列のうち、アミノ酸３８４−５７９）に、４アミノ酸ＺＣリンカーおよびｓｏｐ２核局在化シグナルを介して融合させた。Ｔｈｏｓｅａ ａｓｉｇｎａウイルスからのヌクレオチド配列をコードする自己加水分解性２Ａ（Ｓｚｙｍｃｚａｋ ｅｔ ａｌ．， ２００４）を、２つのジンクフィンガーヌクレアーゼ融合タンパク質の間に添加した。ＺＦＮの発現は、キャッサバ葉脈モザイクウイルス（Ｃａｓｓａｖａ Ｖｅｉｎ Ｍｏｓａｉｃ Ｖｉｒｕｓ）からの強力な構成的プロモーターおよび５’非翻訳領域（ＵＴＲ）により主導され（Ｖｅｒｄａｇｕｅｒ ｅｔ ａｌ， Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １９９６， ３１（６）； １１２９−１１３９）、これには、アグロバクテリウム・ツメファシエンスｐＴｉ１５９５５のオープンリーディングフレーム２３（ＯＲＦ２３）からの３’ＵＴＲ（転写ターミネーターおよびポリアデニル化部位を含む）が隣接していた（Ｂａｒｋｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １９８３， ２（６）； ３３５−５０）。

【0305】

ＩＮ−ＦＵＳＩＯＮ（商標）Ａｄｖａｎｔａｇｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ）を使用して、ベクターをアセンブルした。制限エンドヌクレアーゼは、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ（ＮＥＢ；Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）から入手し、Ｔ４ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をＤＮＡ連結に使用した。プラスミド調製は、供給業者の説明に従い、ＮＵＣＬＥＯＳＰＩＮ（登録商標）Ｐｌａｓｍｉｄ Ｋｉｔ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ Ｉｎｃ．、Ｂｅｔｈｌｅｈｅｍ、ＰＡ）またはＰＬＡＳＭＩＤ ＭＩＤＩ ＫＩＴ（商標）（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して行った。アガローストリス−酢酸ゲル電気泳動後に、ＱＩＡＱＵＩＣＫ ＧＥＬ ＥＸＴＲＡＣＴＩＯＮ ＫＩＴ（商標）（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してＤＮＡ断片を単離した。アセンブルされたプラスミドのコロニーを、まずミニプレップＤＮＡの制限消化によりスクリーニングした。選択されたクローンのプラスミドＤＮＡは、商業的な配列決定業者（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ ＭＷＧ Ｏｐｅｒｏｎ、Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ、ＡＬ）により配列決定された。配列データをアセンブルし、ＳＥＱＵＥＮＣＨＥＲ（商標）ソフトウェア（Ｇｅｎｅ Ｃｏｄｅｓ、Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ、ＭＩ）を使用して分析した。得られたプラスミド構築物：ｐＤＡＢ１０７８２７（ＺＦＮ２８０５１−２Ａ−２８０５２、図２２、配列番号：３５０）、およびｐＤＡＢ１０７８２８（ＺＦＮ ２８０５３−２Ａ−２８０５４、図２３、配列番号：３５１）は、制限酵素消化およびＤＮＡ配列決定により確認された。

【0306】

ＮＨＥＪ指向性ＤＮＡ修復のための「ドナー」ベクターの設計および構築
Ｆａｄ３へのＤＮＡの組み込みの２つの戦略、すなわち発現カセットが単一ＺＦＮ誘導２本鎖切断内に挿入される遺伝子スプライシング、および遺伝子の一部が２つのＺＦＮ誘導２本鎖切断の使用により除去され、ギャップを修復するために発現カセットが挿入される遺伝子編集を行った。

【0307】

各組み込み方法、遺伝子スプライシングまたは遺伝子編集に対し、２つのベクターを構築した。第１のベクターは、ｔｕｒｂｏＧＦＰ（ｔＧＦＰ）遺伝子発現カセットをコードし、第２のベクターは、抗生物質ハイグロマイシンに対する耐性を付与するための遺伝子発現カセットをコードした。ｔＧＦＰ発現カセットは、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）ポリユビキチン１０（ＵＢＱ１０）遺伝子からのプロモーター、５’非翻訳領域およびイントロン（Ｎｏｒｒｉｓ ｅｔ ａｌ， Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １９９３， ２１（５）， ８９５−９０６）に続く、ｔＧＦＰコード化配列（Ｅｖｒｏｇｅｎ、Ｍｏｓｃｏｗ、Ｒｕｓｓｉａ）からなっていた。ｔＧＦＰコード化配列は、双子葉植物における発現に対してコドン最適化され、３’非翻訳領域（ＵＴＲ）は、Ａ． ツメファシエンスｐＴｉ１５９５５のオープンリーディングフレーム２３（ＯＲＦ２３）の転写ターミネーターおよびポリアデニル化部位を含んだ（Ｂａｒｋｅｒ ｅｔ ａｌ， Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １９８３， ２（６）， ３３５−５０）。ハイグロマイシン抵抗性遺伝子発現カセットは、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）からの５’ＵＴＲを含む１９Ｓプロモーター（Ｃｏｏｋ ａｎｄ Ｐｅｎｏｎ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １９９０ １４（３）， ３９１−４０５）に続く、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｈｐｈ）遺伝子からなっていた（Ｋａｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １９８３ １１ （１９）， ６８９５−６９１１）。ｈｐｈ遺伝子は、双子葉植物における発現のためにコドン最適化され、Ａ． ツメファシエンスｐＴｉ１５９５５のオープンリーディングフレーム１（ＯＲＦ１）の転写ターミネーターおよびポリアデニル化部位を含む３’ＵＴＲが隣接していた（Ｂａｒｋｅｒ ｅｔ ａｌ， Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １９８３， ２（６）， ３３５−５０）。カセットは両方とも、商業的遺伝子合成業者により合成された（ＧｅｎｅＡｒｔ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｒｅｇｅｎｓｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）。

【0308】

遺伝子スプライシングのためのベクターは、ベクターｐＤＡＢ１０７８２内にコードされたＺＦＮにより標的化されたＺＦＮ認識配列の２つの縦列コピーをクローニングすることにより構築された。遺伝子編集のためのベクターは、ベクターｐＤＡＢ１０７８２７およびｐＤＡＢ１０７８２８内にコードされたＺＦＮにより標的化されたＺＦＮ認識配列のそれぞれの１つのコピーをクローニングすることにより構築された。いずれの場合も、２つのＺＦＮ認識配列は、ＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩ制限エンドヌクレアーゼの認識配列により隔てられていた。ｔＧＦＰおよびＨＰＨカセットを、各ベクターのＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩ部位にクローニングし、４つの「ドナー」ベクター：ｐＤＡＳ０００３４０（ハイグロマイシン抵抗性遺伝子スプライシングドナー：配列番号：３５２、図２４）、ｐＤＡＳ０００３４１（ｔＧＦＰレポーター遺伝子スプライシングドナー：配列番号：３５３、図２５）、ｐＤＡＳ００３４２（ハイグロマイシン抵抗性遺伝子編集ドナー：配列番号：３５４、図２６）およびｐＤＡＳ０００３４３（ｔＧＦＰレポーター遺伝子編集ドナー：配列番号：３５５、図２７）を得た。

【0309】

アセンブルされたプラスミドのコロニーを、まず、大腸菌の一晩の培養から精製されたＤＮＡの制限エンドヌクレアーゼ消化によりスクリーニングした。制限エンドヌクレアーゼは、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ（ＮＥＢ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）およびＰｒｏｍｅｇａ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ＷＩ）から入手した。プラスミド調製は、供給業者の説明に従い、ＱＩＡＰＲＥＰ ＳＰＩＮ ＭＩＮＩＰＲＥＰ ＫＩＴ（商標）（Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）またはＰＵＲＥ ＹＩＥＬＤ ＰＬＡＳＭＩＤ ＭＡＸＩＰＲＥＰ ＳＹＳＴＥＭ（商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ＷＩ）を使用して行われた。得られた断片のアガロースゲル電気泳動により制限断片が確認された後、選択されたクローンのプラスミドＤＮＡを、ＡＢＩ Ｓａｎｇｅｒ ＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇおよびＢＩＧ ＤＹＥ ＴＥＲＭＩＮＡＴＯＲ Ｖ３．１（商標）サイクル配列決定プロトコル（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して配列決定した。配列データをアセンブルし、Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ（商標）ソフトウェア（Ｇｅｎｅ Ｃｏｄｅｓ、Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ、ＭＩ）を使用して分析した。

【0310】

プロトプラスト単離のための植物材料の維持
葉肉由来プロトプラストを、セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）（ＤＨ１０２７５）の３週齢無菌苗条培養物から単離した。対応する種を本明細書に記載の方法に従い発芽させた。７０％エタノールを１分間使用して種を表面殺菌し、穏やかに振とうし、続いて滅菌再蒸留水中で３〜４回濯いだ。その後、２０％漂白剤および１０μｌのＴｗｅｅｎ２０を使用して殺菌した。種をさらに卓上振とう機上で約１００ＲＰＭで１５分間漂白剤で処理し、続いて滅菌再蒸留水中で３〜４回濯ぎ、種を滅菌濾紙に慎重に移して過剰の水分を除去し、種発芽培地（１／２強度ＭＳ／Ｂ５ビタミン＋１％スクロース＋０．８％寒天、ｐＨ５．８）上に播種した。

【0311】

約５０〜６０ｍｌの培地を各ＰＥＴＲＩ（商標）皿（１５×１００ｍｍ）内に注ぎ、支持体を使用して若干角度を付けて設置した。プレート当たり約５０の種を置いた。プレートを１６時間／日の光（２０μｍｏｌ ｍ−２ ｓ−１）で２２℃で６日間、立ててインキュベートした。０．５ｃｍのサイズの胚軸セグメントを、６日齢の実生から切除し、苗条誘導培地（ＭＳ／Ｂ５ビタミン＋３％スクロース＋５００ｍｇ／Ｌ ＭＥＳ＋ＢＡＰ（１３μｍ）＋Ｚｅａｔｉｎ（５μｍ）＋硝酸銀（５ｍｇ／Ｌ）＋０．８％寒天（ｐＨ ５．８））上で培養した。培地を１００×２０ｍｍの滅菌ＰＥＴＲＩ（商標）皿に注ぎ、プレート当たり約２０の外植片を置いた。３〜４週間後に現れた苗条分裂組織を、苗条伸長培地（ＭＳ／Ｂ５ビタミン＋２％スクロース＋５００ｍｇ／Ｌ ＭＥＳ＋ＢＡＰ（２μｍ）＋ＧＡ−３（０．１μｍ）＋０．８％寒天（ｐＨ５．８）、２５０ｍｌの培養容器に注いだもの）に移し、培養物をこの培地内で１ラウンドの二次培養を間に挟んで４週間維持した。次いで、２〜３ｃｍの高さの苗条を、根の成長のために発根開始培地（１／２強度ＭＳ／Ｂ５ビタミン＋１％スクロース＋５００ｍｇ／Ｌ ＭＥＳ＋ＩＢＡ（２．５μｍ）＋０．６％寒天（ｐＨ５．８）、７００ｍｌ培養容器に注いだもの）に移した。使用前２〜３ラウンドの間、茎切断部として、発根した苗条を新鮮な発根開始培地中で３〜４週間間隔で二次培養した。培養物を期間中ずっと１６時間／日の光（３０μｍｏｌ ｍ−２ ｓ−１）で２２℃で維持した。

【0312】

葉肉プロトプラストの単離および精製
インビトロ成長ＤＨ１２０７５セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）植物を、葉肉プロトプラストを単離するための外植片源として使用した。プロトプラストを単離するために、３〜４週齢の小植物からの第３から第４の上部の完全に開いた葉を、鋭いメスを用いてプロトプラスト単離用の小ストリップ（０．５〜１ｍｍ）に切断した。２５０〜５００ｍｇの葉材を、２５ｍｌの消化緩衝液（Ｋ４培地に溶解した１．２％（ｗ／ｖ）セルラーゼ「ＯＮＯＺＵＫＡ（商標）」Ｒ１０および０．２％（ｗ／ｖ）ＭＡＣＥＲＯＺＹＭＥ（登録商標）Ｒ１０（供給元−Ｄｕｃｈｅｆａ））で処理することにより、酵素消化を行った（Ｓｐａｎｇｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．， １９９８）。葉材および消化緩衝液を含有するＰＥＴＲＩ（商標）皿を、ＰＡＲＡＦＩＬＭ（商標）で封止し、室温で１２〜１５時間、暗所でインキュベートした。一晩のインキュベーション後、消化物をＢＤ（登録商標）細胞濾過器（メッシュサイズ７０μｍ）を通して濾過した。１４ｍｌの丸底管内に収集されたプロトプラスト懸濁液（５〜６ｍｌ）の上に、１ｍｌのＷ５洗浄緩衝液（１５４ｍＭ ＮａＣｌ、１２５ｍＭ ＣａＣｌ_２、５ｍＭ ＫＣｌおよび５ｍＭグルコース；ｐＨ５．８、Ｍｅｎｚｅｌ ｅｔ ａｌ． （１９８１））を重ねた。

【0313】

プロトプラスト懸濁液をさらに４００ＲＰＭで１０分間遠心分離した。遠心分離後、中間相中に浮遊するプロトプラストを採取し、１０ｍｌのＷ５緩衝液を使用した４００ＲＰＭで１０分間の遠心分離により洗浄した。最終洗浄後、単離されたプロトプラストを、Ｗ５緩衝液のｍＬ当たり１×１０^６プロトプラストの密度で再懸濁させ、トランスフェクション前に１時間インキュベートした。

【0314】

プロトプラストの収量および生存能力の評価
プロトプラストの収量を、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ， （２００６）の方法に従い、血球計を使用して評価した。細胞の生存能力を、Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９６）により説明されるように、プロトコルにいくつか小さな修正を加えて、０．５Ｍのマンニトールに溶解した４００ｍｇ／ＬのＥｖａｎｓブルー染料を使用して試験した。

【0315】

ＰＥＧ４０００媒介ＤＮＡ送達
セイヨウアブラナ（Ｂ． ｎａｐｕｓ）プロトプラストへの送達前に、各ドナーおよびＺＦＮ構築物のプラスミドＤＮＡを、大腸菌の培養物から、供給業者の説明に従いＰＵＲＥ ＹＩＥＬＤ ＰＬＡＳＭＩＤ ＭＡＸＩＰＲＥＰ ＳＹＳＴＥＭ（登録商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を使用して調製した。ドナーおよびＺＦＮプラスミドＤＮＡのアリコートは、１：１（３０μｇの各プラスミド）、５：１（ドナープラスミド対ＺＦＮプラスミド、全部で３０μｇまでのプラスミドＤＮＡ ）および１０：１（ドナープラスミド対ＺＦＮ プラスミド、全部で３０μｇまでのプラスミドＤＮＡ）の３つのモル比で調製した。さらに、ドナーのみ、およびＺＦＮのみのアリコート（３０μｇ）を対照として調製した。ＰＥＧ４０００媒介形質転換によりセイヨウアブラナ（Ｂ． ｎａｐｕｓ）プロトプラストに送達されたＤＮＡの量を、表１７に要約する。

【表17】

【0316】

プラスミドＤＮＡの各アリコートを、１００μｌの形質転換緩衝液（１５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．１％（ｗ／ｖ） モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）および０．５ Ｍマンニトール；ｐＨ５．８）、続いて１５０μｌのＰＥＧ溶液（０．４Ｍマンニトールおよび０．１Ｍ Ｃａ（ＮＯ３）２（ｐＨ６〜７）中の４０％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ４０００）に懸濁された１００万プロトプラスト（生存率≧９５）に適用した（Ｓｐａｎｇｅｎｂｅｒｇ ａｎｄ Ｐｏｔｒｙｋｕｓ （１９９５））。室温で１０〜１５分のインキュベーション後、５ｍｌのＷ５緩衝液を滴下により添加し、プロトプラストを穏やかに混合した。プロトプラスト懸濁液に、さらに５ｍｌのＷ５緩衝液をゆるやかな流れとして添加した。プロトプラストを穏やかに混合し、４００ＲＰＭで１０分間遠心分離し、Ｗ５上澄みを慎重に除去して、プロトプラストをペレットの形態で残した。次いで、トランスフェクトされたプロトプラストを、ビーズ型培養物中に埋没するまで、１ｍｌのＷ５緩衝中で室温でインキュベートした。トランスフェクトされたプロトプラストを、後述のようにアルギン酸ナトリウム法に従って埋没させた。

【0317】

生存可能なマイクロカルスを回収するための、葉肉由来プロトプラストの培養
トランスフェクトされたプロトプラストを埋没させる前に、４００ＲＰＭで１０分間遠心分離し、Ｗ５緩衝液を慎重に除去した。次いで、プロトプラストを１．０ｍｌの０．５Ｍマンニトール中に再懸濁させ、氷上でインキュベートした。これに、等体積の１．０％アルギン酸ナトリウムを添加し、穏やかに混合した。プロトプラスト懸濁液を、埋没するまで氷上でインキュベートした。血清用ピペットを使用して、ビーズ形成溶液（０．４Ｍマンニトール＋５０ｍＭ ＣａＣｌ_２（ｐＨ５．８））を、滅菌６ウェルプレートに移した（ウェル当たり３〜４ｍｌ）。１ｍｌピペットを使用して、正確に１．０ｍｌのプロトプラスト懸濁液をビーズ形成溶液に滴下により添加し、ウェル当たりそれぞれのトランスフェクトされた試料（約５×１０５プロトプラスト）を埋没させた。プロトプラスト懸濁液を室温で１〜２時間インキュベートして、アルギン酸ナトリウムビーズを形成した。インキュベーション期間後、ビーズ形成溶液を慎重に除去し、１．５ｍｇ／Ｌのハイグロマイシンを添加したＫ３＋Ｈ：Ａ培地（Ｓｐａｎｇｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ １９９８）の１：２混合物４〜５ｍｌと置き換えた。振とう機（５０ＲＰＭ）内で、プロトプラストを２２℃で３〜４週間、暗所で培養した。３〜４週間後、解重合緩衝液（０．３Ｍマンニトール＋２０ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ５．８））で処理することにより抵抗性マイクロカルス（０．５〜１．０ｍｍ）が放出された。液体培地を除去した後、３〜４ｍｌの解重合緩衝液を、ビーズ型培養物を含有する各ウェルに添加し、室温で２時間インキュベートした。滅菌鉗子を使用してビーズを穏やかに混合し、マイクロカルスの効率的放出を促進した。次に、滅菌１．０ｍｌピペットを使用して、解重合緩衝液中に放出されたゲル化剤を穏やかに混合し、その後除去した。５ｍｌの液体Ａ培地を使用してマイクロカルスを２回洗浄し、十分な量の液体Ａ（１ｍｌの沈殿細胞体積（ＳＣＶ：これは全ての放出されたマイクロカルスを滅菌５０または１５ｍｌファルコン管に移し、５分間沈殿させた後に測定された）に対し５０ｍｌの液体Ａを使用した）にマイクロカルスを再懸濁させた。マイクロカルスを均一に混合した後、液体Ａ培地に懸濁した０．５ｍｌのマイクロカルスをＢ１培地（ＭＳ／ＭＳビタミン＋３．５％スクロース＋５００ｍｇ／Ｌ ＭＥＳ＋ＢＡＰ（５μｍ）＋ＮＡＡ（５μｍ）＋２，４−Ｄ（５μｍ）＋１．５ｍｇ／Ｌハイグロマイシン＋０．７％アガロースＩ型（ｐＨ６．０）１００×２０ｍｍ滅菌ＰＥＴＲＩ（商標）皿に注いだもの）に移し、１〜２ｍｌの追加の液体Ａ培地を使用して、マイクロカルスをＢ１培地内に均一に分布させ、過剰の液体Ａ培地を各プレートから慎重に除去した。プレートをマイクロポアテープを使用して封止し、これにより胚成熟が促進された。培養物を１６時間／日の光（３０μｍｏｌ ｍ−２ ｓ−１）で２２℃で維持した。

【0318】

葉肉由来プロトプラストからの苗条の増殖および再生
２〜３週間のインキュベーション後、ハイグロマイシン抵抗性コロニーをＢ１培地（ＳＡおよびＳＰ法の両方から得られたマイクロカルス）から採取し、Ｂ２培地（ＭＳ／ＭＳビタミン＋３．０％スクロース＋５００ｍｇ／Ｌ ＭＥＳ＋５００ｍｇ／Ｌ ＰＶＰ＋５ｍｇ／Ｌ硝酸銀＋５ｍｇ／Ｌ ２ｉＰ＋ＮＡＡ（０．５μｍ）＋ＧＡ−３（０．３μｍ）＋１．５ｍｇ／Ｌハイグロマイシン＋０．７％アガロースＩ型（ｐＨ５．８）、１００×２０ｍｍ滅菌ＰＥＴＲＩ（商標）皿に注いだもの）に移した。プレート当たり約２５〜３０のカルスを置き、ＰＡＲＡＦＩＬＭ（商標）を使用してプレートを封止し、１６時間／日の光（３０μｍｏｌ ｍ−２ ｓ−１）で２２℃でインキュベートした。その後、２週間間隔の５〜６ラウンドのＢ２中での二次培養後に、ハイグロマイシン抵抗性コロニーを回収した。プレート当たりのカルスの数は、第３ラウンドの二次培養後に１２〜１５に低減された。１０〜１２週間後に現れた苗条原基を残留カルスと共に慎重に回収し、苗条伸長培地（ＭＳ／Ｂ５ビタミン＋２％スクロース＋５００ｍｇ／Ｌ ＭＥＳ＋ＢＡＰ（２μｍ）＋ＧＡ−３（０．１μｍ）＋３００ｍｇ／Ｌチメンチン＋１．５ｍｇ／Ｌハイグロマイシン＋０．８％寒天（ｐＨ５．８）、２５０ｍｌの培養容器に注いだもの）に移した。２〜３ラウンドのハイグロマイシン選択後に生存した苗条を発根培地（１／２強度ＭＳ／Ｂ５ビタミン＋１％スクロース＋５００ｍｇ／Ｌ ＭＥＳ＋ＩＢＡ（２．５μｍ）＋１．５ｍｇ／Ｌハイグロマイシン＋０．６％寒天（ｐＨ ５．８）、７００ｍｌ培養容器に注いだもの）に移した。

【0319】

葉肉プロトプラストからのゲノムＤＮＡの単離
トランスフェクトされたプロトプラストを、３ｃｍ ＰＥＴＲＩ（商標）皿から２ｍＬ微量遠心管に移した。細胞を７０ｇでの遠心分離によりペレット化し、上澄みを除去した。トランスフェクトされたプロトプラストの回収を最大化するために、ＰＥＴＲＩ（商標）皿を１ｍＬの洗浄緩衝液で３回濯いだ。各濯ぎは、洗浄緩衝液をＰＥＴＲＩ（商標）皿内で１分間旋回撹拌し、続いて液体を同じ２ｍｌの微量遠心管に移すことにより行った。各濯ぎの最後に、細胞を７０ｇでの遠心分離によりペレット化し、上澄みを除去した。ペレット化されたプロトプラストを液体窒素中で急速凍結してから、ＬＡＢＣＯＮＣＯ ＦＲＥＥＺＯＮＥ ４．５（登録商標）（Ｌａｂｃｏｎｃｏ、Ｋａｎｓａｓ Ｃｉｔｙ、ＭＯ）内で−４０℃および１３３×１０^−３ｍＢａｒの圧力で２４時間フリーズドライした。凍結乾燥された細胞を、製造者の説明に従いＤＮＥＡＳＹ（登録商標）ＰＬＡＮＴ ＤＮＡ ＥＸＴＲＡＣＴＩＯＮ ＭＩＮＩキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してＤＮＡ抽出に供し（但し組織破壊は必要ではない）、プロトプラスト細胞を溶解緩衝液に直接添加した。

【0320】

カルス組織からのゲノムＤＮＡの単離
個々のカルスを液体窒素中で急速凍結してから、ＬＡＢＣＯＮＣＯ ＦＲＥＥＺＯＮＥ ４．５（登録商標）（Ｌａｂｃｏｎｃｏ、Ｋａｎｓａｓ Ｃｉｔｙ、ＭＯ）内で−４０℃および１３３×１０^−３ｍＢａｒの圧力で２４時間フリーズドライした。凍結乾燥されたカルスを、製造者の説明に従いＤＮＥＡＳＹ（登録商標）ＰＬＡＮＴ ＤＮＡ ＥＸＴＲＡＣＴＩＯＮ ＭＡＸＩキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用してＤＮＡ抽出に供した。

【0321】

葉組織からのゲノムＤＮＡの単離
再生された植物からの３０ｍｇの若い葉組織を液体窒素中で急速冷凍してから、ＬＡＢＣＯＮＣＯ ＦＲＥＥＺＯＮＥ ４．５（登録商標）（Ｌａｂｃｏｎｃｏ、Ｋａｎｓａｓ Ｃｉｔｙ、ＭＯ）内で−４０℃および１３３×１０^−３ｍＢａｒの圧力で２４時間フリーズドライした。凍結乾燥されたカルスを、製造者の説明に従いＤＮＥＡＳＹ（登録商標）ＰＬＡＮＴ ＤＮＡ ＥＸＴＲＡＣＴＩＯＮ ＭＡＸＩキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用してＤＮＡ抽出に供した。

【0322】

Ｆａｄ３ＣのＮＨＥＪ媒介スプライシングおよび編集のためのゲノムＤＮＡのＰＣＲアッセイ
セイヨウアブラナ（Ｂ． ｎａｐｕｓ）のＦａｄ３Ｃ遺伝子に対するドナーＤＮＡの組み込みの検出を、一連のＰＣＲにより行ったが、少なくとも１つのプライマーはＦａｄ３Ｃ遺伝子座に特異的であり（表１８）、第２のプライマーはｇｆｐカセットのプロモーターまたはターミネーターのいずれかに特異的であった（表１８および図２８Ａ）。最後の塩基対が、Ｆａｄ３Ｃゲノム配列をＦａｄ３遺伝子の他のコピーから差別化するＳＮＰに整列させ、アスタリスク（＊）により示されるこの塩基対の前のホスホロチオエートヌクレオチド間連結を含むオリゴヌクレオチドを設計することにより、特異性が得られた。この設計は、校正活性を有するポリメラーゼと組み合わせて使用すると、各Ｆａｄ３ＣまたはＦａｄ３Ａ対立遺伝子の特異的増幅を誘導し、述べたような他のＦａｄ３コピーを除外した。各プライマーセットは、野生型セイヨウアブラナ（Ｂ． ｎａｐｕｓ）から得られたＰＣＲ増幅産物のサンガーベースの配列決定により、正しい遺伝子コピーの増幅に関して実験的に試験された。

【表18】

【0323】

プロトプラストにおける非相同末端結合によるＦａｄ３Ｃへの遺伝子付加の検出
ゲノムＤＮＡを、機能性ｔＧＦＰレポーターカセット（ｐＤＡＳ０００３４１もしくはｐＤＡＳ０００３４３）をコードするドナーＤＮＡ、ＺＦＮ ＤＮＡ（ｐＤＡＢ１０７８２７もしくはｐＤＡＢ１０７８２８）またはドナーおよびＺＦＮ ＤＮＡの混合物が２４時間前に送達されたプロトプラストプール（プール当たり１００万プロトプラスト）から抽出した。形質転換のために送達されたＤＮＡの量は、上述の通りである。ＰＣＲ産物は、プラスミドベクターにクローニングされた。ゲノム編集は、プラスミドベクターへのクローニングにより、各細胞において独立して生じ、様々な異なる挿入イベントを引き起こし、各ゲノム編集は、明確に配列決定され得る。いくつかのクローンを、ＡＢＩ３７３０ＸＬ（登録商標）自動化キャピラリー電気泳動プラットフォーム上で配列決定した。遺伝子配列の分析は、ＳＥＱＵＥＮＣＨＥＲ ＳＯＦＴＷＡＲＥ Ｖ５．０（商標） （ＧｅｎｅＣｏｄｅｓ、Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ、ＭＩ）を使用して行った。

【0324】

編集またはスプライシングによるＦａｄ３Ｃ遺伝子座への遺伝子付加の証拠は、表１８に記載のプライマーを使用してプロトプラストから抽出されたゲノムＤＮＡからの、５’および３’Ｆａｄ３Ｃカセット接合点の両方の増幅により提供された。プライマー「ＦＡＤ３ＣＮＨＥＪ−Ｌ４−Ｆ２」および「ＡｔＵｂｉＮＨＥＪ−Ｒ１」 によるＰＣＲ増幅の産物を、ｔＧＦＰカセットおよびＦａｄ３Ｃの５’接合点を増幅するように完了した。プライマー「ＦＡＤ３ＣＮＨＥＪ−Ｌ４−Ｒ２」および「ＡｔＯＲＦ２３ｔＮＨＥＪ−Ｆ１」 によるＰＣＲ増幅は、ｔＧＦＰカセットおよびＦａｄ３Ｃの３’接合点を増幅するように完了した。プライマー「ＦＡＤ３ＣＮＨＥＪ−Ｌ４−Ｆ２」および「ＦＡＤ３ＣＮＨＥＪ−Ｌ４−Ｒ２」によるＰＣＲ増幅は、ＺＦＮ２８０５１−２Ａ−２８０５２により誘導された２本鎖切断にわたり増幅するように完了した。ＺＦＮプラスミドまたはドナープラスミドのみが送達されたプロトプラストからは、増幅は観察されなかった。全ての接合点配列は、ＮＨＥＪ媒介修復経路によるＦａｄ３Ｃ遺伝子座におけるｔＧＦＰカセットの挿入を示した。ゲノムおよびカセットのいずれかまたは両方からの様々な長さの欠失が観察されると共に、ベクター骨格（ドナーまたはＺＦＮからの）に由来する配列の付加が、ゲノムとカセットとの間に挿入された。

【0325】

プロトプラストから再生されたカルス組織における非相同末端結合によるＦａｄ３Ｃへの遺伝子付加の検出
Ｆａｄ３Ｃ遺伝子座のスプライシングおよび編集のさらなる証拠は、ｈｐｈカセットをコードするドナーＤＮＡ（ｐＤＡＳ０００３４０もしくはｐＤＡＳ０００３４２）、ＺＦＮ ＤＮＡのみ（ｐＤＡＢ１０７８２７もしくはｐＤＡＢ１０７８２８）またはドナーおよびＺＦＮ ＤＮＡが送達された（送達されるＤＮＡの量は表１７に示される）選択後のプロトプラストから再生された（上述のように１．５ｍｇ／Ｌハイグロマイシン）カルス組織から得られた。プロトプラストトランスフェクションから４週間後に、カルスが生存しなかった編集の１：１：１を除く各比に対して約８０のカルスからＤＮＡを抽出した。

【0326】

セイヨウアブラナ（Ｂ． ｎａｐｕｓ）ゲノムへのｈｐｈカセットの組み込み（ｆｗａｔ Ｆａｄ３Ｃまたは無作為）は、ｈｐｈ遺伝子に特異的なプライマー（配列番号：４０２；Ｆ−５’ＣＴＴＡＣＡＴＧＣＴＴＡＧＧＡＴＣＧＧＡＣＴＴＧ ３’、配列番号：４０３；Ｒ−５’ＡＧＴＴＣＣＡＧＣＡＣＣＡＧＡＴＣＴＡＡＣＧ ３’）およびプローブ（配列番号：４０４；５’ ＣＣＣＴＧＡＧＣＣＣＡＡＧＣＡＧＣＡＴＣＡＴＣＧ ３’）を使用したＴＡＱＭＡＮ（商標）ｑＰＣＲにより確認された。これらのプライマー−プローブ対を、Ａゲノム上の単一コピーとして存在するセイヨウアブラナ（Ｂ． ｎａｐｕｓ）高移動度群タンパク質Ｉ／Ｉ（ＨＭＧ Ｉ／Ｙ）に特異的なプライマー（配列番号：４０５；Ｆ−５’ ＣＧＧＡＧＡＧＧＧＣＧＴＧＧＡＡＧＧ ３’、配列番号：４０６；Ｒ−５’ ＴＴＣＧＡＴＴＴＧＣＴＡＣＡＧＣＧＴＣＡＡＣ ３’）およびプローブ（配列番号：４０７；５’ ＡＧＧＣＡＣＣＡＴＣＧＣＡＧＧＣＴＴＣＧＣＴ ３’）を用いた二重反応において使用した（Ｗｅｎｇ ｅｔ ａｌ．， ２００４， Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ）。増幅は、Ｃ１０００サーマルサイクラー上で、ＣＦＸ９６またはＣＦ３８４ ＲＥＡＬ−ＴＩＭＥ ＰＣＲ ＤＥＴＥＣＴＩＯＮ ＳＹＳＴＥＭ（商標）（ＢｉｏＲａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）により行った。ＣＦＸ ＭＡＮＡＧＥＲ（商標）（ＢｉｏＲａｄ）ソフトウェアパッケージを使用して、結果を分析した。２^{−ΔΔＣｔ}法（Ｌｉｖａｋ ａｎｄ Ｓｃｈｍｉｔｔｇｅｎ， ２００１）に従って相対的定量を計算したが、これはゲノムに挿入されたｈｐｈカセットのコピーの数の推定値を提供した。Ｆａｄ３ＣのＮＨＥＪ媒介スプライシングおよび編集の証拠は、Ｆａｄ３Ｃに特異的な１つのプライマーおよびｈｐｈカセットのプロモーターまたはターミネーターに特異的な第２のプライマーを用いてＰＣＲアッセイを行うことにより得られた（表１７および図２８Ｂ）。カルス組織から得られる限定された量のＤＮＡに起因して、センス方向における組み込みのみが分析された。ＰＣＲ産物は、ＱＩＡＱＵＩＣＫ ＭＩＮＩＥＬＵＴＥ ＰＣＲ ＰＵＲＩＦＩＣＡＴＩＯＮ ＫＩＴ（商標）（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してゲル精製され、直接的サンガー配列決定法を使用して配列決定された。配列決定する産物は、ＢＩＧＤＹＥ（登録商標）ｖ３．１プロトコル（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に従ってエタノール、酢酸ナトリウムおよびＥＤＴＡで精製され、上述のように配列決定および分析された。

【0327】

各実験におけるドナーカセットを含有するカルスの数を、表１８に示す。編集および／またはスプライシングによるＦａｄ３Ｃ遺伝子座へのドナー遺伝子付加の証拠は、ＺＦＮ切断部位、ならびに５’および３’Ｆａｄ３Ｃ−ｈｐｈカセット接合点の両方にわたるＰＣＲ増幅（プライマーは表１９に示される）により提供された。ｈｐｈプラスミド（ｐＤＡＳ０００３４０およびｐＤＡＳ０００３４２）のみ、またはＺＦＮプラスミド（ｐＤＡＢ１０７８２７およびｐＤＡＢ１０７８２８）のみで形質転換された対照プロトプラストから回収されたカルス組織から単離されたゲノムＤＮＡのＰＣＲ増幅は、ＰＣＲ増幅産物の生成をもたらさなかった。

【0328】

５’および３’Ｆａｄ３Ｃ−ｈｐｈカセット接合点の増幅から生成されたＰＣＲ単位複製配列をアガロースゲルから精製し、Ｆａｄ３Ｃゲノム遺伝子座内の組み込みの特異性を確認するために配列決定した。ＰＣＲ産物の配列決定分析の結果は、個々に形質転換されたプロトプラストから生成されたそれぞれの単離されたカルスは、単一のＰＣＲ増幅産物を生成するのみであり、混合遺伝子型の細胞を含有しないことを示した。

【0329】

Ｆａｄ３Ｃゲノム遺伝子座内のドナー配列のＮＨＥＪ媒介組み込み実験において、標的遺伝子座への付加の頻度（標的遺伝子座から増幅されているドナーＤＮＡベクターの任意の部分により定義される）は、１：１、５：１、および１０：１（ドナー ＤＮＡ：ＺＦＮ ＤＮＡ）のＤＮＡ濃度に対してそれぞれ４２％、４６％および３２％であった。表２０を参照されたい。的確なスプライシングの頻度は、両方のカセット接合点が増幅可能であるかどうかを分析することにより、およびＰＣＲ産物の配列決定から決定された。これらの結果は、カセットが、正しい方向で標的遺伝子座に挿入されたことを実証した。組み込みの頻度は、１：１、５：１および１０：１のドナープラスミドＤＮＡ：ＺＦＮプラスミドＤＮＡ濃度に対して、それぞれ４％、３％および３％と計算された。遺伝子編集実験において、標的遺伝子座から増幅されているドナーＤＮＡベクターの任意の部分により定義される標的遺伝子座への付加の頻度は、５：１：１および１０：１：１のドナープラスミドＤＮＡ：ＺＦＮプラスミドＤＮＡ濃度に対してそれぞれ６６％および６５％であった。表２１を参照されたい。的確な編集の頻度は、増幅可能であり、ＰＣＲ産物の配列を生成する両方のカセット接合点により決定される。これらの結果は、カセットが、５：１：１および１０：１：１のドナープラスミドＤＮＡ：ＺＦＮプラスミドＤＮＡ濃度に対してそれぞれ３％および６％の頻度で、正しい方向で標的遺伝子座に挿入されたことを実証した。プロトプラストアッセイにおいて観察されたように、ＺＦＮによるゲノム遺伝子座の切断の結果、塩基対が欠失するか、または追加的な塩基がゲノムとカセットとの間に挿入された（図３０〜３１）。

【0330】

ある特定の場合において、ＰＣＲ産物は、標的遺伝子座内のヌクレオチド配列の追加をもたらすか、ＰＣＲ産物がないか、または野生型試料において観察されたものより大きいＰＣＲ産物が観察された。切断部位に隣接するプライマーを使用したＰＣＲ増幅から生成されたこれらの結果は、染色体の両方の対において遺伝子座が妨害されたことを示していた（図３０〜３１）。ある場合においては、スプライス接合点において２つ以上のバンドが増幅され（図３０〜３１）たが、これは、異なる挿入がゲノムのそれぞれのコピーにおいて独立して生じたことを示している。

【表19】

【表20】

【表21】

【0331】

植物における非相同末端結合によるＦａｄ３Ｃへの遺伝子付加の検出
プロトプラストから再生された植物からＤＮＡを抽出し、栽培培地に移した（上述の通り）。回収された植物の過半数は、ドナーＤＮＡにコードされたｈｐｈカセットのわずか１〜２つのコピーを含有すると推定された。カルス組織について説明したのと同じ一連のアッセイ、およびカセットがアンチセンス方向に挿入された、またはドナーがＦａｄ３Ａ遺伝子座で組み込まれたかを決定するためのアッセイにより、植物を分析した。

【表22】

【0332】

ｈｐｈカセットがいずれかの方向でＦａｄ３Ｃに挿入された的確なスプライシングの頻度は、１：１、５：１および１０：１の濃度でのドナーＤＮＡ：ＺＦＮ ＤＮＡに対して、それぞれ５１％、３２％および５６％であった（表２３）。これらの結果のうち、３５％、３２％および５０％（１：１、５：１および１０：１）は、順方向に挿入された（表２３）。

【0333】

ｈｐｈカセットがいずれかの方向でＦａｄ３Ｃに挿入され、エリアが遺伝子座４から遺伝子座６に置き換えられた的確な編集の頻度は、５：１：１および１０：１：１の濃度でのドナーＤＮＡ：ＺＦＮ ＤＮＡ：ＺＦＮ ＤＮＡに対して、それぞれ２％および０％であった（表２４）。さらに、両方のＺＦＮが５：１：１で送達された場合、２％が遺伝子座４にスプライスされ、また１０％が遺伝子座６にスプライスされ、また両方のＺＦＮが１０：１：１で送達された場合、１０％が遺伝子座４にスプライスされ、１５％が遺伝子座６にスプライスされた。

【0334】

得られたバンドは、完全な境界の数を決定するために配列決定され得る。さらに、植物を的外れの挿入に関してスクリーニングし、Ｆａｄ３以外の部位でのｈｐｈの組み込みの頻度、およびＦａｄ３ＣではなくＦａｄ３Ａにおける組み込みの頻度を決定することができる。

【表23】

【表24】

【0335】

実施例８：Ｃｏｒｎ Ｅｖｅｎｔ ＤＡＳ−５９１３２への標的化組み込みおよびその妨害
遺伝子標的化のための内因性ゲノム遺伝子座の特性決定
Ｃｏｒｎ Ｅｖｅｎｔ ＤＡＳ−５９１３２のゲノム遺伝子座は、国際特許出願第ＷＯ２００９／１００１８８Ａ２号に記載されている。Ｃｏｒｎ Ｅｖｅｎｔ ＤＡＳ−５９１３２は、Ｃｒｙ３４Ａｂｌ、Ｃｒｙ３５Ａｂｌ、およびＰＡＴ導入遺伝子発現カセットを含む。これらの導入遺伝子発現カセットは、全長Ｔ鎖挿入物として、Ｈｉ−ＩＩトウモロコシ生殖質のＢ７３トウモロコシゲノム由来領域の染色体８に組み込まれた（Ｄ．Ｄ．Ｓｏｎｇｓｔａｄ， Ｗ．Ｌ．Ｐｅｔｅｒｓｅｎ， Ｃ． Ｌ．Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ， Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｏｔａｎｙ， Ｖｏｌ． ７９， ｐｐ． ７６１−７６４， １９９２）。さらに、トランスジェニック遺伝子座の周囲のゲノムＤＮＡは、天然Ｂ７３配列に比べ任意の大きな欠失を有さず、一般に、単一の小さな反復要素以外の反復要素を含まない。

【0336】

Ｃｏｒｎ Ｅｖｅｎｔ ＤＡＳ−５９１３２が組み込まれたゲノム遺伝子座は、遺伝子標的化のための内因性ゲノム遺伝子座として選択された。この内因性ゲノム遺伝子座の選択は、Ｃｏｒｎ Ｅｖｅｎｔ ＤＡＳ−５９１３２の特性決定に基づいた。このイベントは、内因性ゲノム遺伝子座へのＴ鎖の組み込み、およびその後の３つの導入遺伝子発現カセットの発現から得られた。さらに、Ｃｏｒｎ Ｅｖｅｎｔ ＤＡＳ−５９１３２を含むトウモロコシ植物の正常な成長および発達の改変は最小限であった。イベントは、農業および育種特性を維持し、農業上の性能において非形質転換対照植物に匹敵した。

【0337】

本開示の実施形態は、導入遺伝子の組み込みのために標的化され得るポリヌクレオチド配列を含む。Ｃｏｒｎ Ｅｖｅｎｔ ＤＡＳ−５９１３２、ゲノム隣接配列の３’末端、およびＰＨＩ１７６６２Ａ／３’トウモロコシゲノム接合点を形質転換するために使用された全長ＤＮＡ分子（ＰＨＩ１７６６２Ａ）が、国際特許出願第ＷＯ２００９／１００１８８Ａ２号の開示において説明され、この出願においてそれぞれ配列番号：４２７、配列番号：４２８および配列番号：４２９として開示された。ゲノム隣接配列の５’末端、およびＣｏｒｎ Ｅｖｅｎｔ ＤＡＳ−５９１３２がトウモロコシゲノムに組み込まれたゲノム遺伝子座は、この出願においてそれぞれ配列番号：４３０および配列番号：４３１として開示されている。配列番号：４３１として列挙されるゲノム遺伝子座を使用して、遺伝子標的化のためのジンクフィンガータンパク質を設計した。

【0338】

Ｃｏｒｎ Ｅｖｅｎｔ ＤＡＳ−５９１３２に対するゲノム遺伝子座を結合させるように設計されたジンクフィンガータンパク質の生成
Ｃｏｒｎ Ｅｖｅｎｔ ＤＡＳ−５９１３２に対するゲノム遺伝子座を含むＤＮＡ配列に対して指向性であるジンクフィンガータンパク質（図３２を参照されたい）を、前述のように設計した。例えば、Ｕｒｎｏｖ ｅｔ ａｌ． （２００５） Ｎａｔｕｒｅ ４３５：６４６−６５１を参照されたい。例となる標的配列および認識へリックスを、表２５Ａ（認識へリックス領域設計）および表２５Ｂ（標的部位）に示す。表２５Ｂにおいて、ＺＦＰ認識へリックスに接触する標的部位におけるヌクレオチドは大文字で示されている。

【表25A】

【表25B】

【0339】

Ｃｏｒｎ Ｅｖｅｎｔ ＤＡＳ−５９１３２ジンクフィンガー設計は、ＣＣＨＣ構造を有する少なくとも１つのフィンガーを有するタンパク質をコードするベクターに組み込まれた。米国特許公開第２００８／０１８２３３２号を参照されたい。特に、各タンパク質における最後のフィンガーは、認識へリックスのＣＣＨＣ骨格を有していた。非正準ジンクフィンガーコード化配列を、ＩＩＳ型制限酵素ＦｏｋＩのヌクレアーゼドメイン（Ｗａｈ ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９５：１０５６４−１０５６９の配列のアミノ酸３８４〜５７９）に、４アミノ酸ＺＣリンカーおよびトウモロコシ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）に由来するｏｐａｑｕｅ−２核局在化シグナルを介して融合させ、Ｃｏｒｎ Ｅｖｅｎｔ ＤＡＳ−５９１３２ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を形成した。Ｓｈｕｋｌａ ｅｔ ａｌ． （２００９） Ｎａｔｕｒｅ ４５９：４３７−４４１において説明されるような、２Ａリボソーム断続シグナルを使用した２シストロン性発現構築物における融合タンパク質の発現は、ＣｓＶＭＶプロモーター等の比較的強力な構成的および異所性プロモーターにより主導される。

【0340】

以前に活性ヌクレアーゼを同定することが示された出芽酵母ベースの系を使用して、最適なジンクフィンガーを切断活性について検証した。例えば、米国特許公開第２００９０１１１１１９号；Ｄｏｙｏｎ ｅｔ ａｌ． （２００８） Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２６：７０２−７０８；Ｇｅｕｒｔｓ ｅｔ ａｌ． （２００９） Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２５：４３３を参照されたい。様々な機能性ドメインに対するジンクフィンガーを、インビボでの使用のために選択した。設計され、生成され、推定Ｃｏｒｎ Ｅｖｅｎｔ ＤＡＳ−５９１３２ゲノムポリヌクレオチド標的部位への結合が試験された数々のＺＦＮのうち、４つの対のＺＦＮは、高レベルでインビボ活性を有するものとして特定され、さらなる実験に選択された。表２５Ａを参照されたい。これらのＺＦＮは、植物体内で４つの固有のＣｏｒｎ Ｅｖｅｎｔ ＤＡＳ−５９１３２ゲノムポリヌクレオチド標的部位を効率的に結合および切断することができると特徴付けられた。

【0341】

図１は、４つのＺＦＮ対のＺＦＮポリヌクレオチド結合／標的部位に対する、Ｃｏｒｎ Ｅｖｅｎｔ ＤＡＳ−５９１３２遺伝子座のゲノム構成を示す。第１の３つのＺＦＮ対（Ｅ３２ ＺＦＮ１、Ｅ３２ ＺＦＮ２、およびＥ３２ ＺＦＮ３）は、Ｃｏｒｎ Ｅｖｅｎｔ ＤＡＳ−５９１３２ Ｔ鎖挿入物の上流側に結合し、第２の３つのＺＦＮ対（Ｅ３２ ＺＦＮ４、Ｅ３２ ＺＦＮ５、およびＥ３２ ＺＦＮ６）は、Ｃｏｒｎ Ｅｖｅｎｔ ＤＡＳ−５９１３２ Ｔ鎖挿入物の下流側に結合する。出芽酵母アッセイにおいてＺＦＮ対を試験した後、Ｃｏｒｎ Ｅｖｅｎｔ ＤＡＳ−５９１３２遺伝子座に最適に結合したＺＦＮ対を、一時的トウモロコシ形質転換アッセイにおける試験に進めた。

【0342】

トウモロコシにおける発現のためのジンクフィンガーヌクレアーゼ構築物
実施例２に記載のように酵母アッセイを使用して同定された、４つの例となるジンクフィンガーヌクレアーゼのＺＦＮ発現構築物を含有するプラスミドベクターを設計し、当該技術分野において一般的に知られている技術および技法を使用して完成させた。各ジンクフィンガーコード化配列を、ジンクフィンガーヌクレアーゼの上流側に位置するｏｐａｑｕｅ−２核局在化シグナルをコードする配列に融合させた（Ｍａｄｄａｌｏｎｉ ｅｔ ａｌ． （１９８９） Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１７（１８）：７５３２）。

【0343】

次に、ｏｐａｑｕｅ−２核局在化シグナル：：ジンクフィンガーヌクレアーゼ融合配列を、相補的ｏｐａｑｕｅ−２核局在化シグナル：：ジンクフィンガーヌクレアーゼ融合配列と対にした。したがって、各構築物は、Ｔｈｏｓｅａ ａｓｉｇｎａウイルスからの２Ａ配列により隔てられた２つのｏｐａｑｕｅ−２核局在化シグナル：：ジンクフィンガーヌクレアーゼ 融合配列を含む単一オープンリーディングフレームからなっていた（Ｍａｔｔｉｏｎ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．７０：８１２４−８１２７）。ＺＦＮコード化配列の発現は、高発現性の構成的なトウモロコシ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）ユビキチン１プロモーターにより主導され（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ． （１９９２） Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １８（４）：６７５−８９）、トウモロコシ（Ｚｅａ ｍａｙｓ） Ｐｅｒ ５ ３’ポリＡ非翻訳領域が隣接した（米国特許第６，６９９，９８４号）。得られた４つのプラスミド構築物は、制限酵素消化およびＤＮＡ配列決定により確認された。図３３および３４は、完成されたプラスミド構築物の図形表現を示す。プラスミド構築物、ｐＤＡＢ１０５９０６（図３３）内に発現したＺＦＮは、野生型ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼである「Ｆｏｋ−Ｍｏｎｏ」を含有する。プラスミド構築物、ｐＤＡＢ１１１８０９（図３４）内に発現したＺＦＮは、修飾されたＦｏｋＩエンドヌクレアーゼである「Ｆｏｋ１−ＥＬＤ」を含有する。修飾されたＦｏｋ１エンドヌクレアーゼは、Ｄｏｙｏｎ Ｙ．， Ｖｏ Ｔ．， Ｍｅｎｄｅｌ Ｍ．， Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ Ｓ．， Ｗａｎｇ Ｊ．， Ｘｉａ Ｄ．， Ｍｉｌｌｅｒ Ｊ．， Ｕｒｎｏｖ Ｆ．， Ｇｒｅｇｏｒｙ Ｐ．， ａｎｄ Ｈｏｌｍｅｓ Ｍ．（２０１０） Ｅｎｈａｎｃｉｎｇ ｚｉｎｃ−ｆｉｎｇｅｒ−ｎｕｃｌｅａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｗｉｔｈ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｏｂｌｉｇａｔｅ ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｃ ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ．Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ， ８（１）； ７４−７９に記載のような変更を含有する。

【0344】

ドナー構築物は、Ｃｏｒｎ Ｅｖｅｎｔ ＤＡＳ−５９１３２ゲノム遺伝子座のＺＦＮ切断ゲノムＤＮＡに組み込まれるように設計された。図３５は、単一遺伝子発現カセットからなるドナー構築物、ｐＤＡＢ１００６５５を示す。この単一遺伝子発現カセットは、トウモロコシ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）ユビキチン１プロモーター（Ｚｍ Ｕｂｉ１プロモーター）：：ａａｄ−１コード化配列（ＡＡＤ１；米国特許第７，８３８，７３３号）：：により主導され、トウモロコシ（Ｚｅａ ｍａｙｓ） Ｐｅｒ ５ ３’非翻訳領域（ＺｍＰｅｒ５ ３’ＵＴＲ）により終端される。構築物は、ａａｄ−１遺伝子発現カセットの下流側に含まれる反復Ｅ３２ ＺＦＮ６結合配列の対を含有する。様々な遺伝子要素が、高いコピー数のｐＵＣベースプラスミドでアセンブルされた。

【0345】

ＺＦＮ効率を決定するためのトウモロコシの一時的形質転換
トウモロコシＨｉ−ＩＩ胚発生培養物を、米国特許第７，１７９，９０２号に記載のように生成し、異なるＺＦＮの効率を評価および試験するために使用した。ｐＤＡＢ１０５９０１、ｐＤＡＢ１０５９０２、ｐＤＡＢ１０５９０３、ｐＤＡＢ１０５９０４、ｐＤＡＢ１０５９０５およびｐＤＡＢ１０５９０６からなるプラスミドＤＮＡを、トウモロコシカルス細胞に一時的に形質転換して、米国特許出願第２０１１／０１１９７８６号に記載のようにトウモロコシゲノム内のイノシトールポリリン酸２−キナーゼ遺伝子座に対して設計された標準的な被試験ＺＦＮ、ｐＤＡＢ７４３０に対する異なるＺＦＮの切断頻度を比較した。

【0346】

培養物から、事前に凍結保存された細胞株からの１２ｍＬの充填細胞容積（ＰＣＶ）および２８ｍＬの馴化培地を、５００ｍＬエルレンマイヤーフラスコ内で、８０ｍＬのＧＮ６液体培地（Ｎ６培地（Ｃｈｕ ｅｔ ａｌ．， （１９７５） Ｓｃｉ Ｓｉｎ．１８：６５９−６６８）、２．０ｍｇ／Ｌ ２，４−Ｄ、３０ｇ／Ｌスクロース、ｐＨ６．０）中で二次培養し、２８℃で１２５ｒｐｍの振とう機上に設置した。このステップは、全部で３６ｍＬのＰＣＶが３つのフラスコにわたり分配されるように、同じ細胞株を使用して２回繰り返した。２４時間後、内容物を滅菌ＰＥＴＲＩ（商標）皿内に注ぎ、ＧＮ６液体培地を除去した。若干湿らせたカルスを、濾紙を含有するＧＮ６ Ｓ／Ｍ固体培地（Ｎ６培地（Ｃｈｕ ｅｔ ａｌ．， （１９７５） Ｓｃｉ Ｓｉｎ．１８：６５９−６６８）、２．０ｍｇ／Ｌ ２，４−Ｄ、３０ｇ／Ｌスクロース、４５．５ｇ／Ｌソルビトール、４５．５ｇ／Ｌマンニトール、１００ｍｇ／Ｌ ｍｙｏ−イノシトール、２．５ｇ／Ｌゲルライト、ｐＨ６．０）上の直径２．５ｃｍの円に移した。プレートを、２８℃で４時間、暗所でインキュベートした。

【0347】

金マイクロ粒子（０．６ミクロン、ＢｉｏＲａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を、２１ｍｇを滅菌シリコン処理１．７ｍＬ微小遠心管（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）内に量り取ることによりＤＮＡ沈殿用に調製し、３５０μＬの氷冷１００％エタノールを添加し、１分間ボルテックスした。ＭＩＮＩＳＰＩＮ（商標）遠心分離機（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、Ｈａｕｐｐａｕｇｅ、ＮＹ）を使用した１０，０００ｒｐｍで１５秒間の遠心分離により、金をペレット化した。上澄みを除去した後、３５０μＬの氷冷滅菌水を添加し、ピペットで吸引および排出して混合し、１０，０００ｒｐｍで１５秒間遠心分離した。洗浄ステップをもう一度繰り返してから、金を３５０μＬの氷冷滅菌水に懸濁させた。次いで、洗浄された金を、必要となるまで−２０℃で保存した。

【0348】

各ＤＮＡ沈殿において、シリコン処理１．７ｍＬ微小遠心管（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）内に、５０μＬ水中３ｍｇの金を等分した。プラスミドＤＮＡ（２．５μｇのプラスミドｐＤＡＢ１０５９０１、ｐＤＡＢ１０５９０２、ｐＤＡＢ１０５９０３、ｐＤＡＢ１０５９０４、ｐＤＡＢ１０５９０５またはｐＤＡＢ１０５９０６内のＥ３２ ＺＦＮおよび２．５μｇのプラスミドｐＤＡＢ７４３０内のＩＰＰＫ２ ＺＦＮ）を、０．６ｍＬ微小遠心管（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｎａｚａｒｅｔｈ、ＰＡ）内で事前に混合し、金懸濁液に添加して、ピペットにより穏やかに５〜１０回吸引および排出し、完全に混合した。次いで、２０マイクロリットル（２０μＬ）の低温０．１Ｍスペルミジンを添加し、ピペットにより穏やかに５〜１０回吸引および排出することにより混合した。５０マイクロリットル（５０μＬ）の氷冷２．５Ｍ塩化カルシウムをゆっくりと添加し、ピペットにより穏やかに５〜１０回吸引および排出することにより混合した。次いで、管に蓋をし、室温で１０分間インキュベートした。１０，０００ｒｐｍで１５秒間遠心分離した後、上澄みを慎重に除去し、６０μＬの氷冷１００％エタノールを添加した。ピペットにより穏やかに５〜１０回吸引および排出することにより、金ＤＮＡ混合物を再懸濁させた。

【0349】

マイクロ粒子照射のために、滅菌マクロキャリア（ＢｉｏＲａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）をステンレススチールホルダ（ＢｉｏＲａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）に装着し、オートクレーブ処理した。９マイクロリットル（９μＬ）の金／ＤＮＡ懸濁液を、アリコート間で懸濁液の十分な混合が維持されるように確実にピペットにより吸引および排出しながら、マクロキャリアの中央に均一に伸ばした。次いで、マクロキャリアを、１４０×２５ｍｍのガラスＰＥＴＲＩ（商標）皿内の８メッシュＤＲＩＥＲＩＴＥ（商標） （Ｗ．Ａ Ｈａｍｍｏｎｄ Ｄｒｉｅｒｉｔｅ Ｃｏ．、Ｘｅｎｉａ、ＯＨ）のベッド上の滅菌１２５ｍｍ Ｗｈａｔｍａｎ ＃４濾紙（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ、ＵＫ）の切片上に置いた。金／ＤＮＡを、約５〜１０分間完全に乾燥させた。ラプチャーディスク（１１００ｐｓｉ、ＢｉｏＲａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を、イソプロピルアルコール中に数秒間浸漬することにより殺菌し、次いで、マイクロ粒子照射デバイス（ＰＤＳ−１０００、ＢｉｏＲａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）の保持キャップ内に装填した。オートクレーブ処理した停止スクリーン（ＢｉｏＲａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）および装填されたマクロキャリアを、発射アセンブリ内に設置し、蓋をねじ込み、ノズルの真下にある照射チャンバ内にスライドさせた。標的を含有するＰＥＴＲＩ（商標）皿のカバーを取り、ノズルから６ｃｍ下の照射チャンバ内に設置した。真空に引き（−０．９バール）、デバイスを作動させた。ブラストされる各標的に対し、ステップを繰り返した。同じブラスト培地上で、標的を２８℃の温度で２４時間暗所でインキュベートした。ブラストされた細胞を、回収ＧＮ６固体回収培地（Ｎ６培地（Ｃｈｕ ｅｔ ａｌ．， （１９７５） Ｓｃｉ Ｓｉｎ．１８：６５９−６６８）、２．０ｍｇ／Ｌ ２，４−Ｄ、３０ ｇ／Ｌスクロース、２．５ｇ／Ｌゲルライト、ｐＨ ６．０）に移し、さらに２８℃で４８時間、暗所でインキュベートした。照射から７２時間後、細胞を２ｍＬのＥＰＰＥＮＤＯＲＦ ＭＩＣＲＯＦＵＧＥ ＳＡＦＥ ＬＯＣＫ ＴＵＢＥＳ（商標）内に採取し、ＶＩＲＴＩＳ ＭＯＤＥＬ ＃ ５０Ｌ ＶＩＲＴＵＡＬ ＸＬ−７０ ＬＹＯＰＨＩＬＩＺＥＲ（商標）（ＳＰ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｇａｒｄｉｎｅｒ ＮＹ）内で４８時間凍結乾燥した。

【0350】

一時的に形質転換されたトウモロコシの次世代配列決定（ＮＧＳ）分析
一時的に形質転換されたトウモロコシカルス組織を分析して、ジンクフィンガーヌクレアーゼタンパク質の切断効率を決定した。

【0351】

試料調製
ＺＦＮ構築物および２つの対照ベクター、ｐＤＡＢ１００６６４およびｐＤＡＢ１００６６５で一時的に形質転換されたトウモロコシカルス組織を、２ｍＬのＥＰＰＥＮＤＯＲＦ（商標）管に収集し、４８時間凍結乾燥した。製造者の仕様書に従い、ＱＩＡＧＥＮ ＰＬＡＮＴ ＤＮＡ ＥＸＴＲＡＣＴＩＯＮ ＫＩＴ（商標）（Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を使用して、凍結乾燥された組織からゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を抽出した。単離されたｇＤＮＡを２００μｌの水に再懸濁し、ＮＡＮＯＤＲＯＰ（登録商標） 分光光度計（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を使用して濃度を決定した。０．８％アガロースＥ−ゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上で全ての試料を泳動することにより、ＤＮＡの完全性を推定した。全てのｇＤＮＡ試料は、ＰＣＲ増幅のために正規化し（２５ｎｇ／μｌ）、ＩＬＬＵＭＩＮＡ（商標）配列決定（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）により分析される単位複製配列を生成した。

【0352】

それぞれの試験されたＺＦＮ切断部位および対照試料にわたるゲノム領域の増幅のためのＰＣＲプライマーは、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡ）から購入した。プライマーの最適な増幅条件は、２３．５μＬの反応物中の０．２μＭの適切なプライマー、ＡＣＣＵＰＲＩＭＥ ＰＦＸ ＳＵＰＥＲＭＩＸ（商標）（１．１Ｘ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および１００ｎｇのテンプレートゲノムＤＮＡを使用したグラジエントＰＣＲにより特定された。サイクリングパラメータは、９５℃（５分）における最初の変性に続く、３５サイクルの変性（９５℃、１５秒）、アニール（５５〜７２℃、３０秒）、伸長（６８℃、１分）および最終伸長（７２℃、７分）であった。増幅産物を、３．５％ＴＡＥアガロースゲル上で分析した。最適アニール温度を特定した後、各セットのＰＣＲプライマーを検証するため、およびＩＬＬＵＭＩＮＡ（商標）配列決定単位複製配列を生成するために、調製ＰＣＲ反応を行った。

【0353】

調製ＰＣＲのために、上述の条件を使用して各テンプレートに対し８つの個々の小規模ＰＣＲ反応を行い、得られたＰＣＲ産物を一緒にプールし、製造者の推奨に従いＱＩＡＧＥＮ ＭＩＮＥＬＵＴＥ ＧＥＬ ＥＸＴＲＡＣＴＩＯＮ／ＰＵＲＩＦＩＣＡＴＩＯＮ ＫＩＴ（商標）を使用して３．５％アガロースゲル上でゲル精製した。ゲル精製された単位複製配列の濃度を、ＮＡＮＯＤＲＯＰ（商標）により決定し、ＩＬＬＵＭＩＮＡ（商標）配列決定試料を、ＺＦＮ標的化および対応する野生型対照からの約１００ｎｇのＰＣＲ単位複製配列をプールすることにより調製した。ＰＣＲ単位複製配列生成に使用されたプライマーを、以下の表２６に示す。

【表26】

【0354】

ＩＬＬＵＭＩＮＡ（商標）配列決定および分析：
ＺＦＮを、トランスジェニックＣｏｒｎ Ｅｖｅｎｔ ＤＡＳ−５９１３２のゲノム遺伝子座内の特定のＤＮＡ配列を認識、結合および修飾するように設計した。４つのＺＦＮがゲノム遺伝子座を切断する効率を分析して、どのＺＦＮが最も効率的に切断したかを決定した。ＩＬＬＵＭＩＮＡ（商標）配列決定は、Ｃｏｆａｃｔｏｒ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）において行われ、配列分析スクリプトを使用して配列が分析された。低品質の配列はフィルタにより除去し、固有ＤＮＡ配列識別子に従い残った配列を解析した。次いで、固有ＤＮＡ配列識別子を参照配列と整列させ、挿入／欠失（インデル）についてスコア化した。切断活性のレベルを決定するために、ＺＦＮ切断部位の周囲の領域を、ＩＮＤＥＬから得られた配列改変体の存在についてスコア化した。研究における各ＺＦＮの切断活性は、インデルを有する配列／１Ｍ高品質配列の数として、またはインデルを有する高品質配列のパーセントとして計算された。次に、米国特許公開第２０１１／０１１９７８６号に記載のＩＰＰ２−Ｋ遺伝子に指向されたＺＦＮの活性で切断活性のＺＦＮレベルを正規化することにより、切断効率のレベルが決定された。図３６および表２７は、試験されたＺＦＮの切断効率を示す。

【0355】

２５７１６および２５７１７ジンクフィンガー結合ドメインを含有するＥｖｅｎｔ ３２ ＺＦＮ６は、トランスジェニックＣｏｒｎ Ｅｖｅｎｔ ＤＡＳ−５９１３２のゲノム遺伝子座を最も高い効率で切断した。このＺＦＮは、対照ＩＰＰＫ２ジンクフィンガーヌクレアーゼの３８０倍の効率で機能した。Ｅｖｅｎｔ ３２ ＺＦＮ６の驚異的に高いレベルの切断活性を考慮して、このＺＦＮは、非相同末端結合によるゲノム遺伝子座へのドナーＤＮＡ断片の組み込みの試験に進むために選択された。

【表27】

【0356】

プロトプラストにおけるＺＦＮの形質転換
Ｃｏｒｎ Ｅｖｅｎｔ ＤＡＳ−５９１３２の内因性ゲノム遺伝子座を標的化し、トウモロコシにおけるドナー標的化パラメータを最適化するために、遺伝子標的化のためのシステムを確立した。Ｃｏｒｎ Ｅｖｅｎｔ ＤＡＳ−５９１３２におけるゲノム内に２本鎖切断を形成し、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）または相同性依存的修復（ＨＤＲ）により修復した。

【0357】

プロトプラスト単離：
トウモロコシＨｉ−ＩＩ胚発生懸濁培養物を得、３．５日維持スケジュールで維持した。５０ｍＬの滅菌円錐管内で、１０ｍＬの滅菌６％（ｗ／ｖ）セルラーゼ溶液および１０ｍＬの滅菌０．６％（ｗ／ｖ）ペクトリアーゼ酵素溶液を、１０ｍＬピペットチップを使用して円錐管内に滴下した。次に、消化溶液を含有する５０ｍＬの管内に４充填細胞容積（ＰＣＶ）のＨｉ−ＩＩ懸濁細胞を添加し、パラフィルムで包装した。管をプラットフォームロッカー上に一晩室温で約１６〜１８時間置いた。翌朝、管を振とう機から取り出した。滅菌５０ｍＬ円錐管内で、細胞および酵素溶液を１００μｍ細胞濾過器を通してゆっくりと濾過した。次に、１００μｍ細胞濾過器を使用して、濾過器を通して１０ｍＬのＷ５培地を滴下することにより、細胞を濯いだ。滅菌５０ｍＬ円錐管内で、細胞および酵素溶液を７０μｍ細胞濾過器を通してゆっくりと濾過した。この濾過ステップに続いて、第２の濾過ステップを行い、４０μｍ細胞濾過器を通して細胞および酵素溶液を５０ｍＬ円錐管内にゆっくりと濾過した。１０ｍＬピペットチップを使用して、４０μｍ細胞濾過器を１０ｍＬのＷ５培地で濯いで４０ｍＬの最終体積とし、管を反転させた。非常にゆっくりと、８ｍＬのスクロースクッションをプロトプラスト／酵素溶液の底に添加した。スイングアーム式バケットロータを備える遠心分離機を使用して、管を１５００ｒｐｍで１５分間回転させた。５ｍＬの狭口径ピペットチップを使用して、プロトプラスト細胞を除去した。プロトプラストベーンとして観察されるこれらの細胞（７〜８ｍＬ）を非常にゆっくりと除去し、滅菌５０ｍＬ円錐管内に入れた。次に、２５ｍＬのＷ５培地を使用して、管を洗浄した。Ｗ５培地を添加し、管をゆっくりと反転させ、１５００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上澄みを除去し、１０ｍＬのＭＭＧ溶液を添加し、管をゆっくりと反転させてプロトプラストペレットを再懸濁させた。血球計を使用してプロトプラストの密度を決定し、４ＰＣＶで約３０００万のプロトプラストが得られた。

【0358】

プロトプラスト形質転換：
ＭＭＧ溶液を使用してプロトプラスト細胞をｍｌ当たり１６０万のプロトプラストに希釈した。管をゆっくりと反転させることにより、プロトプラストを静かに再懸濁させた。次に、３００μＬのプロトプラスト（約５００ｋのプロトプラスト）を滅菌２ｍＬ管に添加し、管を反転させてプロトプラスト細胞を均一に分布させた。ＴＥ緩衝液中に懸濁させた約４０〜８０μｇの濃度のプラスミドＤＮＡを、プロトプラストに添加した。異なる実験条件を、表２８に記載する。管をゆっくり回転させてＤＮＡとプロトプラストを懸濁させ、管を室温で５〜１０分間インキュベートした。次に、３００μＬのＰＥＧ溶液をプロトプラスト／ＤＮＡ溶液に添加した。全てのＰＥＧ溶液が添加されたら、管を静かに反転させることによりＰＥＧ溶液をプロトプラスト溶液と混合した。定期的に管（複数可）を反転させながら、カクテルを室温で１５〜２０分間インキュベートした。インキュベーション後、１ｍＬのＷ５溶液を管にゆっくりと添加し、管を静かに反転させた。最後に、溶液を１０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。細胞ペレットを乱さないように、上澄みを慎重に除去した。最後に、１ｍＬの洗浄／インキュベーション溶液を添加した。管を静かに反転させて、細胞ペレットを再懸濁させた。管をアルミニウム箔で覆っていかなる光への曝露も排除し、管の側面を下にしてラック上に置き、一晩インキュベートした。形質転換から２４時間後、分子分析のために細胞を採取した。

【表28】

【0359】

標的化の配列検証
上述の次世代配列決定プロトコルを使用して、トウモロコシプロトプラストにおけるＺＦＮ切断活性の結果を確認した。配列決定されたＰＣＲ増幅断片を、インデルから得られた配列改変体の存在に関してスコア化した。Ｅｖｅｎｔ ３２ ＺＦＮ６は、トランスジェニックＣｏｒｎ Ｅｖｅｎｔ ＤＡＳ−５９１３２のゲノム遺伝子座を、約１．５％のＮＨＥＪ／１０ｎｇの標的化単位複製配列で切断した。

【0360】

非相同末端結合（ＮＨＥＪ）を介したＨｉ−ＩＩトウモロコシトランスジェニック細胞懸濁液中のトランスジェニックＣｏｒｎ Ｅｖｅｎｔ ＤＡＳ−５９１３２のゲノム遺伝子座へのＡＡＤ−１ドナーカセットの標的化を、イン−アウトＰＣＲ反応により確認した。第１のＰＣＲ反応がＡＡＤ−１ドナーおよびトランスジェニックＣｏｒｎ Ｅｖｅｎｔ ＤＡＳ−５９１３２のゲノム遺伝子座の接合点を増幅するように設計されたイン−アウトＰＣＲ反応を完了させた。得られた単位増幅配列を、プライマーが第１の単位増幅配列内で内部的に結合するように設計された第２のＰＣＲ反応に供した。２つの独立したＰＣＲ反応の組み合わせは、偽陽性となり得るバックグラウンド増幅の除去をもたらした。プロトプラスト形質転換実験のイン−アウトＰＣＲの結果は、トランスジェニックＣｏｒｎ Ｅｖｅｎｔ ＤＡＳ−５９１３２のゲノム遺伝子座が、ＤＮＡ（ｐＵＣ１９プラスミドＤＮＡまたはサケ精子ＤＮＡを含むフィラーＤＮＡを含む、および含まない）の１：１０μｇの比で、５．３ ｋｂ ＡＡＤ１プラスミドドナーおよびＥ３２ ＺＦＮ６ジンクフィンガーヌクレアーゼで再現可能に標的化され得ることを示した。ＮＨＥＪ法による標的化は、両方向でのＡＡＤ−１ドナーカセットの挿入により明らかとなった。ＰＣＲ反応から生成された配列データは、３例のドナーＤＮＡの完全な組み込みをもたらした。したがって、ＮＨＥＪ−ＤＳＢ修復機構による、ＺＦＮを使用した内因性トウモロコシ遺伝子座へのドナー標的化を実証することができた。

【0361】

標的化組み込みのためのＺＦＮおよびドナーのＷＨＩＳＫＥＲＳ（商標）媒介安定形質転換
トランスジェニックイベントを、Ｃｏｒｎ Ｅｖｅｎｔ ＤＡＳ−５９１３２の内因性ゲノム遺伝子座に標的化した。実施例２に記載の構築物は、ドナー配列（ｐＤＡＢ１００６５５）およびＥｖｅｎｔ ３２ ＺＦＮ ６（ｐＤＡＢ１０５９０６）を含む。

【0362】

事前に凍結保存された細胞株からの１２ｍＬの充填細胞容積（ＰＣＶ）および２８ｍＬの馴化培地からなるトウモロコシカルス細胞を、５００ｍＬエルレンマイヤーフラスコ内で、８０ｍＬのＧＮ６液体培地（Ｎ６培地（Ｃｈｕ ｅｔ ａｌ．， （１９７５） Ｓｃｉ Ｓｉｎ．１８：６５９−６６８）、２．０ｍｇ／Ｌの２，４−Ｄ、３０ｇ／Ｌスクロース、ｐＨ５．８）中で二次培養し、２８℃で１２５ｒｐｍの振とう機上に設置した。このステップは、全部で３６ｍＬのＰＣＶが３つのフラスコにわたり分配されるように、同じ細胞株を使用して２回繰り返した。２４時間後、ＧＮ６液体培地を除去し、７２ｍＬのＧＮ６ Ｓ／Ｍ浸透培地（Ｎ６培地、２．０ｍｇ／Ｌ ２，４−Ｄ、３０ｇ／Ｌスクロース、４５．５ｇ／Ｌソルビトール、４５．５ｇ／Ｌマンニトール、１００ｍｇ／Ｌ ｍｙｏ−イノシトール、ｐＨ６．０）で置き換えた。フラスコを、適度に撹拌しながら（１２５ｒｐｍ）、２８℃で３０〜３５分間暗所でインキュベートした。インキュベーション期間中、炭化ケイ素ＷＨＩＳＫＥＲＳ（商標） （Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ， ＬＬＣ、Ｇｒｅｅｒ、ＳＣ）の５０ｍｇ／ｍＬ懸濁液を、８．１ｍＬのＧＮ６ Ｓ／Ｍ液体培地を４０５ｍｇの滅菌炭化ケイ素ＷＨＩＳＫＥＲＳ（商標）に添加することにより調製した。

【0363】

ＧＮ６ Ｓ／Ｍ浸透培地中でのインキュベーション後、各フラスコの内容物を２５０ｍＬ遠心ボトル内にプールした。フラスコ内の全ての細胞が底に沈殿した後、約１４ｍＬのＧＮ６ Ｓ／Ｍ液を上回る内容物体積を取り出し、将来の使用のために滅菌１Ｌフラスコ内に回収した。事前に湿潤させたＷＨＩＳＫＥＲＳ（商標）の懸濁物を、ボルテックス上で最大速度で６０秒間混合し、次いで遠心ボトルに加えた。

【0364】

この例において、１５９μｇのｐＤＡＢ１００６５５（ドナー配列）および１１μｇのｐＤＡＢ１０５０６（ＺＦＮ）プラスミドＤＮＡを各ボトルに加えた。プラスミドＤＮＡを添加したら、改良されたＲＥＤ ＤＥＶＩＬ ５４００（商標）商用塗料混合器（Ｒｅｄ Ｄｅｖｉｌ Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ Ｃｏ．、Ｐｌｙｍｏｕｔｈ、ＭＮ）内にボトルを速やかに設置し、１０秒間撹拌した。撹拌後、細胞、培地、ＷＨＩＳＫＥＲＳ（商標）およびプラスミドＤＮＡのカクテルを、１２５ｍＬの新鮮なＧＮ６液体培地と共に１Ｌフラスコの内容物に添加し、浸透圧調節物質を低減した。細胞を、１２５ｒｐｍに設定された振とう機上で２時間回復させた。６ｍＬの分散懸濁液を、ボトル当たり６０のフィルタが得られるように、家庭用真空ラインに接続されたガラスセル回収器ユニットを使用して、Ｗｈａｔｍａｎ ＃４濾紙（５．５ｃｍ）上で濾過した。フィルタをＧＮ６固体培地（２．５ｇ／Ｌのゲルライトゲル化剤以外ＧＮ６液体培地と同じ）の６０×２０ｍｍプレート上に置き、２８℃で１週間、暗所条件下で培養した。

【0365】

Ｃｏｒｎ Ｅｖｅｎｔ ＤＡＳ−５９１３２ゲノム遺伝子座内に組み込まれた推定標的化イベントの特定および単離
ＤＮＡ送達から１週間後、選択剤を含有するＧＮ６（１Ｈ）選択培地（Ｎ６培地、２．０ｍｇ／Ｌ ２，４−Ｄ、３０ｇ／Ｌスクロース、１００ｍｇ／Ｌ ｍｙｏ−イノシトール、２．５ｇ／Ｌゲルライト、ｐＨ５．８）の６０×２０ｍｍプレートに、濾紙を移した。これらの選択プレートを、２８℃で１週間、暗所でインキュベートした。暗所で１週間の選択後、各プレートからの細胞の１／２を、３７〜３８℃に保持された３．０ｍＬのＧＮ６アガロース培地（Ｎ６培地、２．０ｍｇ／Ｌ ２，４−Ｄ、３０ｇ／Ｌスクロース、１００ｍｇ／Ｌ ｍｙｏ−イノシトール、７ｇ／Ｌ ＳＥＡＰＬＡＱＵＥ（登録商標）アガロース、ｐＨ５．８、１２１℃で１０分間オートクレーブ処理された）を含む管内にかき出すことにより、組織を新鮮な培地上に埋没させた。

【0366】

アガロース／組織混合物をスパチュラにより破壊し、その後３ｍＬのアガロース／組織混合物を、ＧＮ６（１Ｈ）培地を含有する１００×２５ｍｍ ＰＥＴＲＩ（商標）皿の表面上に均一に注いだ。このプロセスを各プレートの半分の両方に対して繰り返した。全ての組織が埋没したら、プレートを２８℃で１０週間まで、暗所条件下でインキュベートした。これらの選択条件下で成長した推定形質転換分離株を、埋没したプレートから取り出し、６０×２０ｍｍプレート内の新鮮な選択培地に移した。約２週間後に持続的な成長が明らかである場合、イベントは、適用した除草剤（選択剤）に抵抗性であると見なされ、その後遺伝子型分析のために細胞のアリコートを採取した。この例において、処理された６つのボトルから２４のイベントが回収された。Ｃｏｒｎ Ｅｖｅｎｔ ＤＡＳ−５９１３２のゲノム遺伝子座内のＡＡＤ−１遺伝子の組み込みを確認するために、これらのイベントを分子分析に進めた。

【0367】

Ｃｏｒｎ Ｅｖｅｎｔ ＤＡＳ−５９１３２ゲノム遺伝子座のＮＨＥＪ標的化の分子分析
上述のようにＷＨＩＳＫＥＲＳ（商標）媒介形質転換から回収された２４のイベントを、いくつかの異なる分子確認ツールを使用して分析した。分析の結果、Ｃｏｒｎ Ｅｖｅｎｔ ＤＡＳ−５９１３２ゲノム遺伝子座内に組み込まれた１コピーのＡＡＤ−１導入遺伝子を含有するイベントが特定された。まず、２４の様々なイベントが、１コピーのＡＡＤ−１導入遺伝子を含有することを確認し、次に、イベントを、１コピーのＡＡＤ−１導入遺伝子を示唆するＣｏｒｎ Ｅｖｅｎｔ ＤＡＳ−５９１３２のゲノム遺伝子座がＮＨＥＪによりトウモロコシ細胞のゲノム内に組み込まれたかどうかを決定するために分析した。Ｃｏｒｎ Ｅｖｅｎｔ ＤＡＳ−５９１３２のゲノム遺伝子座内に１コピーのＡＡＤ−１導入遺伝子を含有することが特定されたイベントを、さらにイン−アウトＰＣＲおよびサザンブロット反応により確認した。これらのアッセイにより、イベントが、ＮＨＥＪ機構によりＣｏｒｎ Ｅｖｅｎｔ ＤＡＳ−５９１３２ゲノム遺伝子座内に組み込まれた１コピーのＡＡＤ−１導入遺伝子を含有することが確認された。

【0368】

ＤＮＡ抽出：製造者の推奨に従い、ＱＩＡＧＥＮ ＢＩＯＳＰＲＩＮＴ ９６（商標）ＤＮＡ単離キットを使用して、凍結乾燥されたトウモロコシカルス組織からＤＮＡを抽出した。自動化抽出のために事前に定義されたプログラムを使用し、ＤＮＡを２００μｌの１：１ ＴＥ緩衝液／蒸留水中に溶出した。２マイクロリットル（２μＬ）の各試料を、ＴＨＥＲＭＯＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ ＮＡＮＯＤＲＯＰ ８０００（商標）上で定量し、ＱＩＡＧＥＮ ＢＩＯＲＯＢＯＴ ３０００（商標）を使用して試料を１００ｎｇ／μＬに正規化した。正規化されたＤＮＡを、さらなる分析まで４℃で保存した。

【0369】

コピー数推定：ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）アッセイに類似した加水分解プローブアッセイによる導入遺伝子コピー数決定を、ＬＩＧＨＴＣＹＣＬＥＲ（登録商標）４８０システム（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を使用したリアルタイムＰＣＲにより行った。アッセイは、ＬＩＧＨＴＣＹＣＬＥＲ（登録商標）Ｐｒｏｂｅ Ｄｅｓｉｇｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ２．０を使用して、ＡＡＤ−１および内部標準遺伝子インベルターゼ用に設計された増幅のために、ＬＩＧＨＴＣＹＣＬＥＲ（登録商標）４８０ Ｐｒｏｂｅｓ Ｍａｓｔｅｒミックス（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を、０．４μＭの各プライマーおよび０．２μＭの各プローブを含有する１０μＬ体積多重反応物中の最終濃度×１で調製した（表２９）。蛍光捕捉により、６０℃で４０秒間の伸長で２段階増幅反応を行った。リアルタイムＰＣＲコピー数データの分析は、相対定量モジュールを使用してＬＩＧＨＴＣＹＣＬＥＲ（登録商標）ソフトウェアリリース１．５を使用して行い、またΔΔＣｔ法に基づく。このため、単一コピー標準物質および既知の２コピーチェックからのｇＤＮＡの試料が、各試行に含まれた。

【表29】

【0370】

Ｃｏｒｎ Ｅｖｅｎｔ ＤＡＳ−５９１３２ゲノム遺伝子座妨害アッセイ：
Ｃｏｒｎ Ｅｖｅｎｔ ＤＡＳ−５９１３２のゲノム遺伝子座妨害アッセイを、ＬＩＧＨＴＣＹＣＬＥＲ（登録商標）４８０システム（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を使用したリアルタイムＰＣＲにより行った。アッセイは、ＬＩＧＨＴＣＹＣＬＥＲ（登録商標）Ｐｒｏｂｅ Ｄｅｓｉｇｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ２．０を使用して、Ｅｖｅｎｔ ３２ ＺＦＮ６（２５７１６／２５７１７）がＣｏｒｎ Ｅｖｅｎｔ ＤＡＳ−５９１３２遺伝子座のゲノム配列、および内部標準遺伝子ＩＶＦに結合および切断する特異性を監視するように設計された。増幅のために、ＬＩＧＨＴＣＹＣＬＥＲ（登録商標）４８０ Ｐｒｏｂｅｓ Ｍａｓｔｅｒミックス（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を、０．４μＭの各プライマーおよび０．２μＭの各プローブを含有する１０μＬ体積多重反応物中の最終濃度×１で調製した（表３０）。蛍光捕捉により、５５℃で３０秒間の伸長で２段階増幅反応を行った。標的対標準比を使用して、妨害アッセイのための分析を行った（図３７）。８つのイベントのうち４つが、Ｃｏｒｎ Ｅｖｅｎｔ ＤＡＳ−５９１３２のゲノム遺伝子座に組み込まれたＡＡＤ−１導入遺伝子を含有するものとして特定された。Ｃｏｒｎ Ｅｖｅｎｔ ＤＡＳ−５９１３２のゲノム遺伝子座内のＡＡＤ−１導入遺伝子の組み込みを確認するために、Ｅｖｅｎｔ １００６５５／１０５９０６［１］−００１、Ｅｖｅｎｔ １００６５５／１０５９０６［５］−０１３、Ｅｖｅｎｔ １００６５５／１０５９０６［５］−０１５、およびＥｖｅｎｔ １００６５５／１０５９０６［３］−０１８からなるイベントを、さらなる分子分析に進めた。

【0371】

Ｃｏｒｎ Ｅｖｅｎｔ ＤＡＳ−５９１３２遺伝子座特異的イン−アウトＰＣＲ：
ＮＨＥＪによるＣｏｒｎ Ｅｖｅｎｔ ＤＡＳ−５９１３２のゲノム遺伝子座内のＡＡＤ−１ドナーの挿入は、２つの方向のうちの１つで生じ得る。ＡＡＤ−１導入遺伝子の組み込みおよびこの組み込みの方向を、イン−アウトＰＣＲアッセイで確認した。イン−アウトＰＣＲアッセイは、Ｃｏｒｎ Ｅｖｅｎｔ ＤＡＳ−５９１３２標的配列のゲノム遺伝子座に結合するように設計された「アウト」プライマーを使用する。さらに、「イン」プライマーは、ＡＡＤ−１ドナー配列に結合するように設計された。これらのプライマーを使用して完了された増幅反応は、標的部位に挿入されたドナー遺伝子のみを増幅した。得られたＰＣＲ単位複製配列は、２つのプライマーから生成され、挿入の接合点にわたる配列からなっていた。各試料に対して、２セットのイン−アウトＰＣＲプライマーが１つの反応に多重化され、２つの異なる方向のうちの１つで生じ得るＮＨＥＪ媒介ドナー挿入を検出するために使用された。陽性および陰性対照がアッセイに含まれた。２つの陽性対照プラスミド、ｐＤＡＢ１００６６４およびｐＤＡＢ１００６６５を構築して、２つの異なる方向のうちの１つでのＣｏｒｎ Ｅｖｅｎｔ ＤＡＳ−５９１３２のゲノム遺伝子座におけるドナー挿入をシミュレートした。

【0372】

蛍光検出能力を有するサーモサイクラー上でリアルタイムで増幅を検出するために、ＤＮＡ挿入染料ＳＹＴＯ−１３をＰＣＲミックス中に使用した。さらに、融点（Ｔｍ）分析プログラムを通常のＰＣＲプログラムに組み合わせ、増幅産物がそのＴｍプロファイルについて分析され得るようにした。未知試料と陽性対照試料との間のＴｍプロファイルにおける類似性は、未知試料が陽性対照と同じ増幅産物を有することを強く示唆している。ＰＣＲ反応は、１０ｎｇのテンプレートゲノムＤＮＡ、０．２μＭのｄＮＴＰ、０．２μＭの順方向および逆方向プライマー、４μＭのＳＹＴＯ−１３ならびに０．１５μｌのＥｘ Ｔａｑ ＨＳを使用して行った。反応は２つのステップで完了したが、第１のステップは、９４℃（２分）での１サイクル、ならびに９８℃（１２秒）、６６℃（３０秒）および６８℃（１．３分）での３５サイクルからなり、第２のステップは、６０〜９５℃に続く６５℃（３０秒）および７２℃（１０分）を含むＴｍプログラムであった（表３０）。単位複製配列を配列決定に送り、ＡＡＤ−１遺伝子がＣｏｒｎ Ｅｖｅｎｔ ＤＡＳ−５９１３２のゲノム遺伝子座内に組み込まれたことを確認した。

【0373】

ＡＢＩソフトウェアを使用して、リアルタイムイン−アウトＰＣＲ単位複製配列の結果を可視化した。これらの結果は、単位複製配列を１．２％ＴＡＥゲル上で泳動したゲルシフトアッセイを使用してさらに確認された。推定される単位複製配列サイズは、第１の方向（ｐＤＡＢ１００６６４のように）において約１．８ｋｂであり、第２の方向（ｐＤＡＢ１００６６５のように）において２ｋｂであった。ゲルシフトアッセイの結果により、リアルタイム、イン−アウトＰＣＲ反応データが確認された。両方のデータのセットは、１コピーのＡＡＤ−１導入遺伝子がＮＨＥＪによりＣｏｒｎ Ｅｖｅｎｔ ＤＡＳ−５９１３２のゲノム遺伝子座においてトウモロコシ細胞のゲノム内に組み込まれたことを示唆していた。

【表30】

【0374】

サザンブロット分析：サザンブロットアッセイを使用して、上で特定されたトウモロコシカルスイベントをさらにスクリーニングした。このアッセイは、ＡＡＤ−１導入遺伝子がＮＨＥＪによりＣｏｒｎ Ｅｖｅｎｔ ＤＡＳ−５９１３２のゲノム遺伝子座においてトウモロコシ細胞のゲノム内に組み込まれたことをさらに確認するために使用した。サザンブロット分析実験により、大豆ゲノム内のＡＡＤ−１導入遺伝子の組み込みおよび完全性を実証するデータが生成された。

【0375】

ＤＮＡ抽出：それぞれの個々のイベントから採取されたカルス組織から、ゲノムＤＮＡを抽出した。まず、組織試料を２ｍＬ管に収集し、２日間凍結乾燥した。ＫＬＥＣＯ ＴＩＳＳＵＥ ＰＵＬＶＥＲＩＺＥＲ（商標）およびタングステンビーズ（Ｋｌｅｃｏ、Ｖｉｓａｌｉａ、ＣＡ）を用いて、組織浸軟を行った。組織浸軟後、製造者の提案するプロトコルに従いＤＮＥＡＳＹ ＰＬＡＮＴ ＭＩＮＩ ＫＩＴ（商標）（Ｑｉａｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ、ＭＤ）を使用してゲノムＤＮＡを単離した。

【0376】

サザンブロット：ＱＵＡＮＴ−ＩＴ ＰＩＣＯ ＧＲＥＥＮ ＤＮＡ ＡＳＳＡＹ ＫＩＴ（商標）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を使用して、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を定量した。定量したｇＤＮＡを、サザンブロット分析のために４μｇに調節した。次いで、ＮｃｏＩ制限酵素（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）を使用して３７℃で一晩ＤＮＡ試料を消化させ、続いて、製造者の提案するプロトコルに従いＱＵＩＣＫ−ＰＲＥＣＩＰ（商標）（Ｅｄｇｅ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）を使用して清浄化した。ＤＮＡを１×染料に再懸濁させ、低温の部屋で、０．８％ＳＥＡＫＥＭ ＬＥ ＡＧＡＲＯＳＥ ＧＥＬ（商標） （Ｌｏｎｚａ、Ｒｏｃｋｌａｎｄ、ＭＥ）上で１１０ボルトで５時間電気泳動させた。ゲルを変性させ、中和し、次いでナイロン荷電膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）に一晩移し、ＵＶ ＳＴＲＡＴＡ ＬＩＮＫＥＲ １８００（商標）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）を使用してＤＮＡを膜に架橋させ、ブロットを２０ｍＬのＰＥＲＦＥＣＴＨＹＢ ＰＬＵＳ（商標）（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）でプレハイブリダイズした。製造者の提案するプロトコルに従いＰＲＩＭＥ−ＩＴ ＲＭＴ ＲＡＮＤＯＭ（商標）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）を使用して、２２６ｂｐプローブ（配列番号：４６４）を標識化し、製造者の提案するプロトコルに従いＰＲＯＢＥ ＱＵＡＮＴ Ｇ−５０ ＭＩＣＲＯ ＣＯＬＵＭＮＳ（商標）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ、ＵＫ）を使用して精製した。約２０，０００，０００ｃｐｍの標識化プローブをブロットに添加し、一晩インキュベートした。ブロットを、洗浄当たり１５分間、２回洗浄し、蛍光体画像スクリーン上に２４時間置き、ＳＴＯＲＭ ８６０ ＳＣＡＮＮＥＲ（商標）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ）により分析した。

【0377】

ＮｃｏＩ消化およびプローブによる推定および観察された断片サイズは、既知の制限酵素部位ＡＡＤ−１およびＣｏｒｎ Ｅｖｅｎｔ ＤＡＳ−５９１３２に基づいてサザンブロットから得られた。これらの消化およびハイブリダイゼーションから、２つのＤＮＡ断片を特定した。約２．９および５．５ｋｂのサイズのバンドを有する結果を生成したサザンブロットは、ＡＡＤ−１導入遺伝子が、ＮＨＥＪ機構によりＣｏｒｎ Ｅｖｅｎｔ ＤＡＳ−５９１３２のゲノム遺伝子座に組み込まれたことを示していた。

【0378】

実施例９： トウモロコシ操作ランディングパッドの標的化組み込みおよび妨害
ＥＬＰゲノム標的配列の特性決定
操作されたランディングパッド（ＥＬＰ）が組み込まれた遺伝子座を、遺伝子標的化のための内因性ゲノム遺伝子座として選択した。ジンクフィンガーヌクレアーゼタンパク質に加え、ジンクフィンガー結合部位（ｅＺＦＮ１およびｅＺＦＮ３）、ならびにジンクフィンガー結合部位に隣接する約１．０ｋｂの無作為人工配列を含むＥＬＰ配列の構築は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる国際特許出願第ＷＯ２０１１０９１３１７号に記載されている。ＥＬＰ遺伝子座内のＮＨＥＪ媒介標的化組み込みを試験するために、２つのドナーＤＮＡを構築し、それらは共に、除草剤ハロキシホップに対する耐性を付与するａａｄ−１ 遺伝子を含む５．３ｋｂプラスミド内の２つのｅＺＦＮ結合部位のうちの１つを含有する。図３８は、組み込みの代表的な概略図を示す。

【0379】

ＥＬＰを含むトランスジェニック植物イベントの再生
ｐＤＡＢ１００６４０、ｐＤＡＢ１００６４１およびｐＤＡＢ１０６６８５（各ＥＬＰに対し２つ）の形質転換から生成された４つのトランスジェニックＥＬＰイベントを、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる国際特許出願第ＷＯ２０１１０９１３１７号に記載のように生成した。イベントが得られ、単一コピーであり、ＥＬＰを含有する無傷ＰＴＵを含有することが確認された。これらのイベントを再生して、標的化のためのドナー材料を生成した。健康な成長組織をまず２８（１Ｈ）（ＭＳ培地（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ ａｎｄ Ｓｋｏｏｇ （１９６２） Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｐｌａｎｔ １５：４７３−４９７）、０．０２５ｍｇ／Ｌ ２，４−Ｄ、５ｍｇ／Ｌ ＢＡＰ、１．０ｍｇ／Ｌ Ｈｅｒｂｉａｃｅ、３０ｇ／Ｌスクロース、２．５ｇ／Ｌゲルライト、ｐＨ５．７）に移し、低光量下（１４μＥ／ｍ^２・秒１６時間光周期）で７日間、続いて高光量下（８９μＥ／ｍ^２・秒１６時間光周期）でさらに７日間インキュベートした。緑化構造を、２８（１Ｈ）からＢＡＰおよび２，４−Ｄを抜いたものと同じである３６（１Ｈ）に移し、苗条構造が温室への移植に十分な根を発達させるまで、高光量下（４０μＥ／ｍ^２・秒１６時間光周期）でインキュベートした。９５％ＭＥＴＲＯ−ＭＩＸ ３６０（登録商標）および５％クレイ／ローム土のミックスを使用して、植物を温室内で成熟するまで成長させ、植物の健康に依存して受粉させた。活発に成長した植物を自家受粉または同種交配させ（同じイベントからの植物）、より活発でない植物をＨｉ−ＩＩまたはＡ１８８と交配させて、ドナー材料の胚発生能を維持した。Ｔ_１種を４インチの鉢に植え、発芽した実生を接合性についてｑＰＣＲによりスクリーニングした。ＰＡＴ遺伝子に対しホモ接合性であると決定された実生を、５ガロンの鉢に移し、生殖期まで成長させ、Ｈｉ−ＩＩに異種交配させ、Ｔ_２胚をＮＨＥＪ媒介組み込みによる標的化に使用した。

【0380】

ＥＬＰプロトプラストのＮＨＥＪ標的化
トウモロコシ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）Ｈｉ−ＩＩプロトプラストを入手し、前述のプロトプラスト形質転換プロトコルを使用して形質転換した。ｐＤＡＢ１００６５１のドナープラスミドＤＮＡを、ｐＤＡＢ１０５９４１のＺＦＮプラスミド ＤＮＡで形質転換した。同様に、ｐＤＡＢ１００６５２のドナープラスミドＤＮＡを、ｐＤＡＢ１０５９４３のＺＦＮプラスミドＤＮＡで形質転換した。ドナーＤＮＡを、ジンクフィンガーヌクレアーゼでＥＬＰトランスジェニック植物に形質転換した。ドナーＤＮＡおよびｅＺＦＮの導入後、ゲノム標的ＤＮＡ内に組み込まれたドナーＤＮＡおよびＥＬＰ遺伝子座の両方を切断した。その後、ドナーＤＮＡをゲノム標的に挿入した。ＥＬＰゲノム遺伝子座内のドナーＤＮＡの挿入は、いずれの方向においても生じ得る。順方向でのドナーＤＮＡの挿入は、ＺＦＮ切断から生成された４ｂｐの１本鎖相補末端の推定されるアニールおよび連結に対応する接合点配列をもたらす。接合点における挿入および欠失（インデル）は一般的である。逆方向でのドナーＤＮＡの挿入は、インデルを含有する両方の接合点部分をもたらす。

【0381】

プロトプラスト単離：トウモロコシＨｉ−ＩＩ胚発生懸濁培養物を得、３．５日維持スケジュールで維持した。５０ｍＬの滅菌円錐管内で、１０ｍＬの滅菌６％（ｗ／ｖ）セルラーゼ溶液および１０ｍＬの滅菌０．６％（ｗ／ｖ）ペクトリアーゼ酵素溶液を、１０ｍＬピペットチップを使用して円錐管内に滴下した。次に、消化溶液を含有する５０ｍＬの管内に４充填細胞容積（ＰＣＶ）のＨｉ−ＩＩ懸濁細胞を添加し、パラフィルムで包装した。管をプラットフォームロッカー上に一晩室温で約１６〜１８時間置いた。翌朝、管を振とう機から取り出した。滅菌５０ｍＬ円錐管内で、細胞および酵素溶液を１００μｍ細胞濾過器を通してゆっくりと濾過した。次に、１００μｍ細胞濾過器を使用して、濾過器を通して１０ｍＬのＷ５培地を滴下することにより、細胞を濯いだ。滅菌５０ｍＬ円錐管内で、細胞および酵素溶液を７０μｍ細胞濾過器を通してゆっくりと濾過した。この濾過ステップに続いて、第２の濾過ステップを行い、４０μｍ細胞濾過器を通して細胞および酵素溶液を５０ｍＬ円錐管内にゆっくりと濾過した。１０ｍＬピペットチップを使用して、４０μｍ細胞濾過器を１０ｍＬのＷ５培地で濯いで４０ｍＬの最終体積とし、管を反転させた。非常にゆっくりと、８ｍＬのスクロースクッションをプロトプラスト／酵素溶液の底に添加した。スイングアーム式バケットロータを備える遠心分離機を使用して、管を１５００ｒｐｍで１５分間回転させた。５ｍＬの狭口径ピペットチップを使用して、プロトプラスト細胞を除去した。プロトプラストベーンとして観察されるこれらの細胞（７〜８ｍＬ）を非常にゆっくりと除去し、滅菌５０ｍＬ円錐管内に入れた。次に、２５ｍＬのＷ５培地を使用して、管を洗浄した。Ｗ５培地を添加し、管をゆっくりと反転させ、１５００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上澄みを除去し、１０ｍＬのＭＭＧ溶液を添加し、管をゆっくりと反転させてプロトプラストペレットを再懸濁させた。血球計を使用してプロトプラストの密度を決定し、４ＰＣＶで約３０００万のプロトプラストが得られた。

【0382】

プロトプラスト形質転換：ＭＭＧ溶液を使用してプロトプラスト細胞をｍｌ当たり１６０万のプロトプラストに希釈した。管をゆっくりと反転させることにより、プロトプラストを静かに再懸濁させた。次に、３００μＬのプロトプラスト（約５００ｋのプロトプラスト）を滅菌２ｍＬ管に添加し、管を反転させてプロトプラスト細胞を均一に分布させた。ＴＥ緩衝液中に懸濁させた約８０μｇの濃度のプラスミドＤＮＡを、プロトプラストに添加した。ＺＦＮおよびドナープラスミド構築物の両方を形質転換した。ｅＺＦＮ発現プラスミド（ｐＤＡＢ１０５９４１およびｐＤＡＢ１０５９４３）を、ｅＺＦＮ１およびｅＺＦＮ３処理のそれぞれにおいて、単体またはドナーＤＮＡ（ｐＤＡＢ１００６５１およびｐＤＡＢ１００６５２）対ｅＺＦＮ ＤＮＡの１：１もしくは１０：１比の組み合わせで添加した。ｅＺＦＮの有効性は以前に試験されており、国際特許出願第ＷＯ２０１１０９１３１７号においてより詳細に説明されており、図３９は、ドナーＤＮＡに対するｅＺＦＮの表現として示されている。管をゆっくり回転させてＤＮＡとプロトプラストを懸濁させ、管を室温で５〜１０分間インキュベートした。次に、３００μＬのＰＥＧ溶液をプロトプラスト／ＤＮＡ溶液に添加した。全てのＰＥＧ溶液が添加されたら、管を静かに反転させることによりＰＥＧ溶液をプロトプラスト溶液と混合した。定期的に管（複数可）を反転させながら、カクテルを室温で１５〜２０分間インキュベートした。インキュベーション後、１ｍＬのＷ５溶液を管にゆっくりと添加し、管を静かに反転させた。最後に、溶液を１０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。細胞ペレットを乱さないように、上澄みを慎重に除去した。最後に、１ｍＬの洗浄／インキュベーション溶液を添加した。管を静かに反転させて、細胞ペレットを再懸濁させた。管をアルミニウム箔で覆っていかなる光への曝露も排除し、管の側面を下にしてラック上に置き、一晩インキュベートした。形質転換から２４時間後、ＮＨＥＪ媒介ＤＮＡ修復により組み込まれたドナーを含有するＥＬＰ遺伝子座を特定する分子分析のために細胞を採取した。

【表31】

【0383】

プロトプラストにおけるＮＨＥＪによるトウモロコシＥＬＰ標的化の分子確認
ＤＮＡ抽出：Ｑｉａｇｅｎ ＢＩＯＳＰＲＩＮＴ ９６（商標）ロボットを使用して、自動化によりトウモロコシ組織からＤＮＡを抽出し、ＤＮＡを２００μｌの１：１ ＴＥ緩衝液／蒸留水中に溶出した。各試料のＤＮＡを、ＴＨＥＲＭＯＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ ＮＡＮＯＤＲＯＰ ８０００（商標）上で定量し、ＱＩＡＧＥＮ ＢＩＯＲＯＢＯＴ ３０００（商標）を使用して試料を１００ｎｇ／μＬに正規化した。正規化されたＤＮＡを、さらなる分析まで４℃で保存した。

【0384】

ＥＬＰ遺伝子座妨害アッセイ：２４時間の時点でプロトプラストを採取した後、ＤＮＡを抽出し、妨害アッセイ、ＰＣＲを使用した接合点分析、および接合点ＰＣＲにより生成されたＤＮＡの配列決定を使用して分析した。妨害アッセイは、相対的ｅＺＦＮ切断活性の間接的測定法である。ＴＡＱＭＡＮ（商標）ベースアッセイは、末端の連結後に生じ得るＤＮＡ末端の不適切な修復に起因することが推定されるような、標的ＤＮＡにおける無傷ｅＺＦＮ結合部位の喪失を決定する。

【0385】

ＴＡＱＭＡＮ（商標）ベースアッセイからのデータは、ｅＺＦＮ１が、ｅＺＦＮ３よりも高い活性を有すること、またさらに、ドナー単体試料と比較したｅＺＦＮ試料におけるシグナルの統計的に有意な低減により実証されるように、ｅＺＦＮによる標的ＤＮＡの有意な切断があることを示唆している。

【0386】

ｅＺＦＮによるゲノム標的ＤＮＡの切断。示されるように、各処理群（それぞれ６つの反復実験試料）からＤＮＡを単離した。Ｔａｑｍａｎアッセイを使用して、標的ＤＮＡの切断を測定した。ＬＩＧＨＴＣＹＣＬＥＲ（登録商標）４８０システム（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を使用して、リアルタイムＰＣＲによりＥＬＰ遺伝子座妨害アッセイを行った。アッセイは、ＬＩＧＨＴＣＹＣＬＥＲ（登録商標）Ｐｒｏｂｅ Ｄｅｓｉｇｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ２．０を使用して、ＥＬＰ１内のｅＺＦＮ１およびｅＺＦＮ３結合配列ならびに内部標準遺伝子ＩＶＦを監視するように設計された。増幅のために、ＬＩＧＨＴＣＹＣＬＥＲ（登録商標）４８０ Ｐｒｏｂｅｓ Ｍａｓｔｅｒミックス（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を、０．４μＭの各プライマーおよび０．２μＭの各プローブを含有する１０μＬ体積多重反応物中の最終濃度×１で調製した（表３３）。蛍光捕捉により、５５℃で３０秒間の伸長で２段階増幅反応を行った。標的対標準比を使用して、妨害アッセイのための分析を行った。プライマーの場所を、図４０に示す。

【表33】

【0387】

遺伝子座特異的イン−アウトＰＣＲ：ＮＨＥＪ媒介修復を使用した推定ＥＬＰ部位でのドナー挿入は、２つの異なる方向で生じ得る。２つの陽性対照プラスミド、ｐＤＡＢ１００６６０およびｐＤＡＢ１００６６２を構築し、植物内に形質転換して、ＥＬＰ部位内のドナー挿入をシミュレートした。ｐＤＡＢ１００６６０およびｐＤＡＢ１００６６２対照構築物で生成されたトランスジェニック植物を、イン−アウトＰＣＲ設計を使用してアッセイし、イン−アウトＰＣＲアッセイのための条件を、これらの植物材料に対して決定した。

【0388】

イン−アウトＰＣＲアッセイはＥＬＰ配列内に「アウト」プライマーを有し、一方「イン」プライマーはドナー配列内に位置し、ドナーが標的部位に挿入された時のみ２つのプライマーが挿入の接合点にわたる配列を増幅するようにする（表３４）。各試料に対して、２つの異なる方向を有するドナー挿入を検出するために、２つのイン−アウトＰＣＲ反応を使用した。陽性および陰性対照がアッセイに含まれた。

【0389】

蛍光検出能力を有するサーモサイクラー上でリアルタイムで増幅を検出するために、ＤＮＡ挿入染料ＳＹＴＯ−１３をＰＣＲミックス中に使用した。さらに、融点（Ｔｍ）分析プログラムを通常のＰＣＲプログラムに組み合わせ、増幅産物がそのＴｍプロファイルについて分析され得るようにした。未知試料と陽性対照との間のＴｍプロファイルの類似性は、未知試料が陽性対照と同じ増幅産物を有することを強く示唆している。リアルタイム、イン−アウトＰＣＲアッセイにおいて特定された陽性標的化試料を、ゲルシフト分析を使用してさらに可視化した。推定される単位複製配列サイズは、方向１（ｐＤＡＢ１００６６２のように）において約１．５ｋｂであり、方向２（ｐＤＡＢ１００６６０のように）において約１．４ｋｂである。

【表34】

【0390】

ＰＣＲ反応は、１０ｎｇのテンプレートゲノムＤＮＡ、０．２μＭのｄＮＴＰ、０．２μＭの順方向および逆方向プライマー、４μＭのＳＹＴＯ−１３ならびに０．１５μｌのＥｘ Ｔａｑ ＨＳを使用して行った。反応は２つのステップで完了したが、第１のステップは、９４℃（２分）での１サイクル、ならびに９８℃（１２秒）、６６℃（３０秒）および６８℃（１．３分）での３５サイクルからなり、第２のステップは、６０〜９５℃に続く６５℃（３０秒）および７２℃（１０分）を含むＴｍプログラムであった。ＡＢＩソフトウェアを使用して、および１．２％ＴＡＥゲル上で泳動することにより、産物を可視化した。

【0391】

ドナーＤＮＡのみ、ｅＺＦＮのみ、またはドナーＤＮＡおよびｅＺＦＮ ＤＮＡ（１：１もしくは１０：１のいずれかの比）を含むドナー処理のＮＨＥＪ指向性標的化のｅＺＦＮ１およびｅＺＦＮ３に対するイン−アウトＰＣＲ接合点分析を、アガロースゲル上で行った。結果は、ドナーおよびｅＺＦＮ ＤＮＡのＰＣＲ単位複製配列サイズが、ＮＨＥＪ標的化イベントに対して推定されるものであることを示した。

【0392】

標的／ドナー接合点の配列：イン−アウトＰＣＲ分析により確認されたＥＬＰ標的化イベントから、ＰＣＲ単位複製配列産物を配列決定により確認し、標的−ドナー接合点を、標準サンガー配列決定により検証した。簡潔に説明すると、各処理群の全ての反復実験試料に対して接合ＰＣＲ分析を行った。ＰＣＲプライマーは、順方向または逆方向のいずれかである挿入接合点配列の片側を増幅するように選択された。ＰＣＲ産物は、ｅＺＦＮおよびドナーＤＮＡ試料から生成された試料において観察されたが、ドナーＤＮＡ単体またはｅＺＦＮ単体試料を含む対照試料から生成された試料においては観察されなかった。ＰＣＲ産物は、使用したｅＺＦＮおよびドナーＤＮＡの両方の比からの反復実験試料の過半数において明らかであった。

【0393】

ＰＣＲ産物の代表的試料をクローニングおよび配列決定した。順方向および逆方向の両方に対し、４つの異なる反応からのＰＣＲ産物の配列を図４１に示す。接合末端への不適切な修復から推定されるように、順方向の挿入物について、９つの固有ハプロタイプが観察された。１６の配列のうち３つが、挿入されたドナーＤＮＡおよび標的配列の無傷末端のアニールおよび連結から推定される配列に整列した。ドナーＤＮＡおよび標的ＤＮＡの一本鎖末端は相補的ではないため、逆方向のＰＣＲ産物の全ての配列は、推定されるように接合点においてインデルを有していた。

【0394】

トウモロコシプロトプラストにおけるＮＨＥＪ媒介ドナー標的化の結果
レポーター遺伝子の高度の再現可能な発現を示す、トウモロコシプロトプラストベースのトランジェントアッセイ系を開発した。ＤＡＳで発生させたＨｉ−ＩＩトウモロコシ懸濁培養物から、プロトプラストを得た。ＥＬＰの挿入物を内包するトウモロコシのトランスジェニック系統（トウモロコシ系統１０６６８５［１］−００７）を、ドナーＤＮＡ配列のＮＨＥＪ媒介組み込みに使用した。

【0395】

マイクロ粒子照射によるＥＬＰ胚のＮＨＥＪ標的化
マイクロ粒子照射の３日前に、１．５〜２．２ｍｍの胚を表面殺菌された穂から単離し、２．０ｍｇ／Ｌ ２，４−Ｄ、２．８ｇ／Ｌプロリン、３０ｇ／Ｌスクロース、１００ｍｇ／Ｌカゼイン酵素加水分解物、１００ｍｇ／Ｌ ｍｙｏ−イノシトールおよび４．２５ｍｇ／Ｌ硝酸銀を含む、２．５ｇ／Ｌ Ｇｅｌｚａｎ（Ｐｈｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｓｈａｗｎｅｅ Ｍｉｓｓｉｏｎ、ＫＳ）で固化されたＮ６基礎培地およびビタミン（Ｐｈｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｓｈａｗｎｅｅ Ｍｉｓｓｉｏｎ、ＫＳ）上に（胚盤を上にして）置いた。マイクロ粒子照射の４時間前に、約３５〜４０の胚を、３６．４ｇ／Ｌソルビトールおよび３６．４ｇ／Ｌマンニトールを添加した同じ培地を含有する１００×１５ｍｍ Ｐｅｔｒｉ皿の中央に（胚盤を上にして）置いた。

【0396】

金マイクロ粒子（０．６ミクロン、ＢｉｏＲａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を、１５ｍｇを滅菌シリコン処理１．７ｍＬ微小遠心管（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）内に量り取ることによりＤＮＡ沈殿用に調製し、５００μＬの氷冷１００％エタノールをゆっくりと添加した。ＦＳ−１４超音波水浴（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｎａｚａｒｅｔｈ、ＰＡ）内での１５秒間の超音波照射後、金を室温で３０分間沈殿させてから、ＭｉｎｉＳｐｉｎ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、Ｈａｕｐｐａｕｇｅ、ＮＹ）を使用して、３，０００ｒｐｍで６０秒間遠心分離した。上澄みを除去した後、１ｍＬの氷冷滅菌水を添加し、ピペットで吸引および排出して混合し、３〜５分間沈殿させてから、３，０００で６０秒間遠心分離した。洗浄ステップをもう一度繰り返してから、金を５００μＬの氷冷滅菌水に懸濁させた。次いで、ピペットで吸引および排出することにより、管の間で金が十分混合された状態を維持するように気を付けながら、洗浄された金を別個の１．７ｍＬ滅菌シリコン処理微小遠心管（管当たり５０μＬ）に等分した。次いで、洗浄された金（５０μＬ当たり約１．５ｍｇ）を、必要となるまで−２０℃で保存した。

【0397】

ＤＮＡ沈殿のために、照射されるそれぞれの１０個の標的に対し、５０μＬ水中約１．５ｍｇの金を含有する１つの管を解凍し、超音波水浴内で１５秒間超音波照射し、次いで氷上に置いた。プラスミドＤＮＡ（０．５μｇのＺＦＮ＋４．５μｇのドナー）を、０．６ｍＬ微小遠心管（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｎａｚａｒｅｔｈ、ＰＡ）内で事前に混合し、金懸濁液に添加して、ピペットにより穏やかに数回吸引および排出し、完全に混合した。５０μＬの氷冷２．５Ｍ塩化カルシウムを添加し、ピペットにより穏やかに数回吸引および排出することにより混合した。次いで、２０μＬの低温０．１Ｍスペルミジンを添加し、ピペットにより穏やかに数回吸引および排出することにより混合した。次いで、管に蓋をし、Ｖｏｒｔｅｘ Ｇｅｎｉｅ ２（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｃ．、Ｂｏｈｅｍｉａ、ＮＹ）上に置き、１０分間混合し（「振とう２」に設定）、その後混合物を３〜５分間沈殿させた。５，０００ｒｐｍで１５秒間遠心分離した後、上澄みを慎重に除去し、２５０μＬの氷冷１００％エタノールを添加し、管に蓋をし、手で激しく混合してペレットを除去した。５，０００ｒｐｍで１５秒間の第２の遠心分離後、１２０μＬの氷冷１００％エタノールを添加し、管に蓋をし、手で激しく混合してペレットを除去した。

【0398】

マイクロ粒子照射のために、滅菌マクロキャリア（ＢｉｏＲａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）をステンレススチールホルダ（ＢｉｏＲａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）に装着し、オートクレーブ処理した。１０μＬの金／ＤＮＡ懸濁液を、十分な混合を維持するために確実にピペットにより吸引および排出しながら、マイクロキャリアの中央に均一に伸ばし、次いで、１４０×２５ｍｍのガラスＰｅｔｒｉ皿内の８メッシュＤｒｉｅｒｉｔｅ（Ｗ．Ａ Ｈａｍｍｏｎｄ Ｄｒｉｅｒｉｔｅ Ｃｏ．、Ｘｅｎｉａ、ＯＨ）のベッド上の滅菌１２５ｍｍ Ｗｈａｔｍａｎ ＃４濾紙（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ、ＵＫ）の切片上に置いた。金／ＤＮＡを、約１０分間完全に乾燥させた。ラプチャーディスク（６５０ｐｓｉ、ＢｉｏＲａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を、イソプロピルアルコール中に数分間浸漬することにより殺菌し、次いで、マイクロ粒子照射デバイス（ＰＤＳ−１０００、ＢｉｏＲａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）の保持キャップ内に装填した。オートクレーブ処理した停止スクリーン（ＢｉｏＲａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）および装填されたマクロキャリアを、発射アセンブリ内に設置し、蓋をねじ込み、ノズルの真下にある照射チャンバ内にスライドさせた。スクリーンで覆った葉標的を含有するＰｅｔｒｉ皿のカバーを取り、ノズルから６ｃｍ下の照射チャンバ内に設置した。真空に引き（−０．９バール）、デバイスを作動させた。

【0399】

翌日（照射から１６〜２０時間後）、照射された胚を、２．０ｍｇ／Ｌ ２，４−Ｄ、２．８ｇ／Ｌプロリン、３０ｇ／Ｌスクロース、１００ｍｇ／Ｌカゼイン酵素加水分解物、１００ｍｇ／Ｌ ｍｙｏ−イノシトールおよび４．２５ｍｇ／Ｌ硝酸銀を含む、２．５ｇ／Ｌ Ｇｅｌｚａｎ（Ｐｈｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｓｈａｗｎｅｅ Ｍｉｓｓｉｏｎ、ＫＳ）で固化されたＮ６基礎培地およびビタミン（Ｐｈｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｓｈａｗｎｅｅ Ｍｉｓｓｉｏｎ、ＫＳ）に（胚盤を上にして）移した。照射から７日〜８日後、培養開始から１１日後に、胚を、２．０ｍｇ／Ｌ ２，４−Ｄ、２．８ｇ／Ｌプロリン、３０ｇ／Ｌスクロース、１００ｍｇ／Ｌカゼイン酵素加水分解物、１００ｍｇ／Ｌ ｍｙｏ−イノシトール、４．２５ｍｇ／Ｌ硝酸銀および０．０３６２ｍｇ／Ｌ Ｒ−ハロキシホップ酸を含む、２．５ｇ／Ｌ Ｇｅｌｚａｎ（Ｐｈｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｓｈａｗｎｅｅ Ｍｉｓｓｉｏｎ、ＫＳ）で固化された選択培地、Ｎ６基礎培地およびビタミン（Ｐｈｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｓｈａｗｎｅｅ Ｍｉｓｓｉｏｎ、ＫＳ）に移した。２週間後、胚を、２．０ｍｇ／Ｌ ２，４−Ｄ、２．８ｇ／Ｌプロリン、３０ｇ／Ｌスクロース、１００ｍｇ／Ｌカゼイン酵素加水分解物、１００ｍｇ／Ｌ ｍｙｏ−イノシトール、４．２５ｍｇ／Ｌ硝酸銀および０．１８１ｍｇ／Ｌ Ｒ−ハロキシホップ酸を含む、２．５ｇ／Ｌ Ｇｅｌｚａｎ（Ｐｈｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｓｈａｗｎｅｅ Ｍｉｓｓｉｏｎ、ＫＳ）で固化された新鮮な選択Ｎ６基礎培地およびビタミン（Ｐｈｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｓｈａｗｎｅｅ Ｍｉｓｓｉｏｎ、ＫＳ）に移し、さらに２週間後、それらを同じ組成の新鮮な培地に移した。

【0400】

０．１８１ｍｇ／Ｌ Ｒ−ハロキシホップ上で成長するカルスを、分子分析のために採取した。採取は、ＰＣＲ分析用に約５０ｍｇを１．２ｍＬクラスター管に、またはサザンブロット分析用に約２００ｍｇを２．０ｍＬ Ｓａｆｅ Ｌｏｃｋ管（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、Ｈａｕｐｐａｕｇｅ、ＮＹ）（急速冷凍のためにドライアイスで囲まれている）に入れることを含む。次いで、管を３Ｍマイクロポアテープ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｎａｚａｒｅｔｈ、ＰＡ）で覆い、Ｖｉｒｔｕａｌ ＸＬ−７０（ＶｉｒＴｉｓ、Ｇａｒｄｉｎｅｒ、ＮＹ）内で４８時間凍結乾燥した。組織が凍結乾燥されたら、管に蓋をして、分析まで８℃で保存した。

【0401】

植物におけるＮＨＥＪによるトウモロコシＥＬＰ標的化の分子確認
ＤＮＡ抽出：Ｑｉａｇｅｎ ＢＩＯＳＰＲＩＮＴ ９６（商標）ロボットを使用して、自動化によりトウモロコシ組織からＤＮＡを抽出し、ＤＮＡを２００μｌの１：１ ＴＥ緩衝液／蒸留水中に溶出した。各試料の２μＬを、ＴＨＥＲＭＯＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ ＮＡＮＯＤＲＯＰ ８０００（商標）上で定量し、ＱＩＡＧＥＮ ＢＩＯＲＯＢＯＴ ３０００（商標）を使用して試料を１００ｎｇ／μＬに正規化した。正規化されたＤＮＡを、さらなる分析まで４℃で保存した。

【0402】

コピー数推定：ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）アッセイに類似した加水分解プローブアッセイによる導入遺伝子コピー数決定を、ＬＩＧＨＴＣＹＣＬＥＲ（登録商標）４８０システム（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を使用したリアルタイムＰＣＲにより行った。アッセイは、ＬＩＧＨＴＣＹＣＬＥＲ（登録商標）ＰＲＯＢＥ ＤＥＳＩＧＮ ＳＯＦＴＷＡＲＥ ２．０を使用して、ａａｄ−１導入遺伝子および内部標準遺伝子インベルターゼ用に設計された。増幅のために、ＬＩＧＨＴＣＹＣＬＥＲ（登録商標）４８０ Ｐｒｏｂｅｓ Ｍａｓｔｅｒミックス（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を、０．４μＭの各プライマーおよび０．２μＭの各プローブを含有する１０μＬ体積多重反応物中の最終濃度×１で調製した（表３２）。蛍光捕捉により、６０℃で４０秒間の伸長で２段階増幅反応を行った。リアルタイムＰＣＲコピー数データの分析は、相対定量モジュールを使用してＬＩＧＨＴＣＹＣＬＥＲ（登録商標）ソフトウェアリリース１．５を使用して行い、またΔΔＣｔ法に基づく。このため、単一コピー標準物質および既知の２コピーチェックからのｇＤＮＡの試料が、各試行に含まれた。プライマーの場所を、図４１に示す。

【表32】

【0403】

ＥＬＰ遺伝子座妨害アッセイ：上で前述したように、ＬＩＧＨＴＣＹＣＬＥＲ（登録商標）４８０システム（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を使用して、リアルタイムＰＣＲによりＥＬＰ遺伝子座妨害アッセイを行った。アッセイは、ＬＩＧＨＴＣＹＣＬＥＲ（登録商標）Ｐｒｏｂｅ Ｄｅｓｉｇｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ２．０を使用して、ＥＬＰ１内のｅＺＦＮ１およびｅＺＦＮ３結合配列ならびに内部標準遺伝子ＩＶＦを監視するように設計された。標的対標準比を使用して、妨害アッセイのための分析を行った。結果を図４２に示す。

【0404】

遺伝子座特異的イン−アウトＰＣＲ：イン−アウトＰＣＲアッセイは、上で前述したように完了した。ドナーＤＮＡのみ、ｅＺＦＮのみ、またはドナーＤＮＡおよびｅＺＦＮ ＤＮＡ（１：１もしくは１０：１のいずれかの比）を含むドナー処理のＮＨＥＪ指向性標的化のｅＺＦＮ１およびｅＺＦＮ３に対するイン−アウトＰＣＲ接合点分析を、アガロースゲル上で行った。結果は、ドナーおよびｅＺＦＮ ＤＮＡのＰＣＲ単位複製配列サイズが、ＮＨＥＪ標的化イベントに対して推定されるものであることを示した。

【0405】

標的／ドナー接合点の配列：イン−アウトＰＣＲ分析により確認されたＥＬＰ標的化イベントから、ＰＣＲ単位複製配列産物を配列決定により確認し、標的−ドナー接合点を、標準サンガー配列決定により検証した。簡潔に説明すると、各処理群の全ての反復実験試料に対して接合ＰＣＲ分析を行った。ＰＣＲプライマーは、順方向または逆方向のいずれかである挿入接合点配列の片側を増幅するように選択された。ＰＣＲ産物は、ｅＺＦＮおよびドナーＤＮＡ試料から生成された試料において観察されたが、ドナーＤＮＡ単体またはｅＺＦＮ単体試料を含む対照試料から生成された試料においては観察されなかった。ＰＣＲ産物は、使用したｅＺＦＮおよびドナーＤＮＡの両方の比からの反復実験試料の過半数において明らかであった。

【0406】

ＰＣＲ産物の代表的試料をクローニングおよび配列決定した。順方向および逆方向の両方に対し、４つの異なる反応からのＰＣＲ産物の配列を図４３に示す。接合末端への不適切な修復から推定されるように、順方向の挿入物について、９つの固有ハプロタイプが観察された。１６の配列のうち３つが、挿入されたドナーＤＮＡおよび標的配列の無傷末端のアニールおよび連結から推定される配列に整列した。ドナーＤＮＡおよび標的ＤＮＡの一本鎖末端は相補的ではないため、逆方向のＰＣＲ産物の全ての配列は、推定されるように接合点においてインデルを有していた。

【0407】

サザンブロットアッセイ：最初に遺伝子座特異的妨害アッセイおよびイン−アウトＰＣＲアッセイによりＥＬＰ遺伝子座内に組み込まれたドナー配列を含有するものとして特定されたトウモロコシカルスを、標的化組み込み（ＴＩ）サザンブロットによるさらなる分析に選択した。Ｔ_１サザンのために、ＤＮＡを標的遺伝子座において酵素およびプローブで消化および精査した。サザン用のＤＮＡ抽出のために、組織試料を２ｍｌエッペンドルフ管（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）に収集し、２日間凍結乾燥した。Ｋｌｅｃｏ組織粉砕機およびタングステンビーズ（Ｋｌｅｃｏ、Ｖｉｓａｌｉａ、ＣＡ）を用いて、組織浸軟を行った。組織浸軟後、製造者の提案するプロトコルに従いＤＮＥＡＳＹ ＰＬＡＮＴ ＭＩＮＩ ＫＩＴ（商標）（Ｑｉａｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ、ＭＤ）を使用してゲノムＤＮＡを単離した。

【0408】

ＱＵＡＮＴ−ＩＴ ＰＩＣＯ ＧＲＥＥＮ ＤＮＡ（商標）アッセイキット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）により、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を定量した。定量したｇＤＮＡを、サザンブロット分析のために４μｇに調節した。次いで、ＰｍｅＩ制限酵素（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）を使用して３７℃で一晩ＤＮＡ試料を消化させ、続いて、製造者の提案するプロトコルに従いＱＵＩＣＫ−ＰＲＥＣＩＰ（商標）（Ｅｄｇｅ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）を使用して清浄化した。次いでＤＮＡを１×染料に再懸濁させ、低温の部屋で、０．８％ＳＥＡＫＥＭ ＬＥアガロースゲル（Ｌｏｎｚａ、Ｒｏｃｋｌａｎｄ、ＭＥ）上で１１０ボルトで５時間電気泳動させた。ゲルを変性させ、中和し、次いでナイロン荷電膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）に一晩移し、ＵＶ ＳＴＲＡＴＡ ＬＩＮＫＥＲ １８００（商標）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）を使用してＤＮＡを膜に架橋させ、ブロットを２０ｍＬのＰＥＲＦＥＣＴＨＹＢ ＰＬＵＳ（商標）（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）でプレハイブリダイズした。製造者の提案するプロトコルに従いＰＲＩＭＥ−ＩＴ ＲＭＴ（商標）ランダム（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）を使用してプローブを標識化し、製造者の提案するプロトコルに従いＰＲＯＢＥ ＱＵＡＮＴ Ｇ−５０ ＭＩＣＲＯ ＣＯＬＵＭＮＳ（商標）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ、ＵＫ）を使用して精製した。約２０，０００，０００ｃｐｍの標識化プローブをブロットに添加し、一晩インキュベートした。ブロットを、洗浄当たり１５分間、２回洗浄し、蛍光体画像スクリーン上に２４時間置き、ＳＴＯＲＭ ８６０ ＳＣＡＮＮＥＲ（商標）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ）により分析した。結果は、標的化組み込みのための推定されるバンドを示した（約６．９ｋＢ）。

【0409】

ＮＨＥＪ媒介組み込みによるＥＬＰ遺伝子座標的化の結果
この試験の結果は、標的ＤＮＡおよびドナーＤＮＡのインビボ ＺＦＮ生成切断後の、ＮＨＥＪによるドナーＤＮＡプラスミドのトウモロコシにおける正確な挿入を実証する。ドナーＤＮＡの標的化は、２つの異なるドナーＤＮＡ（どのｅＺＦＮ結合配列がＥＬＰ内に含有されたかにより異なる）、ならびにプロトプラストおよびトウモロコシ胚内の２つの異なるｅＺＦＮを使用して生じた。ＮＨＥＪ修復機構によるＥＬＰ遺伝子座内の組み込みは、両方の方向で生じた。ドナーＤＮＡ挿入物は、試験された試料において、これらの方向の両方で検出された。

【0410】

異なる植物種の組織におけるＮＨＥＪ修復機構を使用した遺伝子の正確な標的化は、相同性組み換え媒介修復等の既知の修復機構に勝る大きな利点を提供する。ＮＨＥＪ修復機構は、植物組織の全てではないが、そのほとんどにおいて機能する支配的な修復機構である。逆に、相同性組み換え媒介修復経路の活性は、植物における細胞周期のＧ２期にわたり機能する。その結果、形質転換可能な多くの植物組織は、活発に細胞分裂せず、したがって、相同性組み換え媒介修復経路による遺伝子標的化を支持しない。植物のゲノム内のドナー挿入のためのＮＨＥＪ修復媒介経路の別の利点は、ＮＨＥＪ媒介修復が、相同性組み換え媒介修復経路とは異なり、広範囲の相同性領域を必要としないことであり、これにより、ゲノム挿入に必要なドナーＤＮＡ配列のサイズが低減される。最後に、相同性組み換え媒介修復経路と比較して、ＮＨＥＪ修復媒介経路を使用し、より大きなサイズのドナーＤＮＡ配列がゲノム遺伝子座内に成功裏に挿入され得る。相同性組み換え媒介修復経路によるゲノム遺伝子座内のドナーＤＮＡ媒介組み込みには、ＤＮＡポリメラーゼが、ドナーＤＮＡ内に含有されるＤＮＡテンプレートをコピーすることが必要である。対照的に、ＮＨＥＪ修復媒介経路は、ドナーＤＮＡと標的ＤＮＡとの２つの点（それらの末端）での相互作用のみを必要とし、テンプレート依存的ＤＮＡ合成を必要としない。従って、ＮＨＥＪ修復媒介経路を使用して、より大きなサイズのドナーＤＮＡ配列を標的化ゲノム遺伝子座内に組み込むことができる。

【0411】

実施例１０：例となる配列
配列番号１１６
ＴＣＧＣＣＣＡＡＡＣＣＣＴＣＧＣＣＧＣＣＧＣＣＡＴＧＧＣＣＧＣＡＧＣＣＡＣＣＴＣＣＣＣＣＧＣＣＧＴＣＧＣＡＴＴＣＴＣＧＧＧＣＧＣＣＡＣＣＧＣＣＧＣＣＧＣＣＡＴＧＣＣＣＡＡＡＣＣＣＧＣＣＣＧＣＣＡＴＣＣＴＣＴＣＣＣＧＣＧＣＣＡＣＣＡＧＣＣＣＧＴＣＴＣＧＣＧＣＣＧＣＧＣＧＣＴＣＣＣＣＧＣＣＣＧＣＧＴＣＧＴＣＡＧＧＴＧＴＴＧＣＧＣＣＧＣＧＴＣＣＣＣＣＧＣＣＧＣＣＡＣＣＴＣＣＧＣＣＧＣＧＣＣＴＣＣＣＧＣＡＡＣＣＧＣＧＣＴＣＣＧＧＣＣＡＴＧＧＧＧＣＣＣＧＴＣＣＧＡＧＣＣＣＣＧＣＡＡＧＧＧＣＧＣＣＧＡＣＡＴＣＣＴＣＧＴＣＧＡＧＧＣＧＣＴＣＧＡＧＣＧＣＴＧＣＧＧＣＡＴＣＧＴＣＧＡＣＧＴＣＴＴＣＧＣＣＴＡＣＣＣＣＧＧＣＧＧＣＧＣＣＴＣＣＡＴＧＧＡＧＡＴＣＣＡＣＣＡＧＧＣＧＣＴＧＡＣＧＣＧＣＴＣＧＣＣＣＧＴＣＡＴＣＡＣＣＡＡＣＣＡＣＣＴＣＴＴＣＣＧＣＣＡＣＧＡＧＣＡＧＧＧＧＧＡＧＧＣＧＴＴＣＧＣＧＧＣＧＴＣＣＧＧＣＴＡＣＧＣＣＣＧＣＧＣＧＴＣＣＧＧＣＣＧＣＧＴＣＧＧＣＧＴＣＴＧＣＧＴＣＧＣＣＡＣＣＴＣＣＧＧＣＣＣＧＧＧＧＧＣＣＡＣＣＡＡＣＣＴＣＧＴＣＴＣＣＧＣＧＣＴＣＧＣＣＧＡＣＧＣＣＣＴＣＣＴＣＧＡＣＴＣＣＡＴＣＣＣＣＡＴＧＧＴＣＧＣＣＡＴＣＡＣＧＧＧＣＣＡＧＧＴＣＣＣＣＣＧＣＣＧＣＡＴＧＡＴＣＧＧＣＡＣＧＧＡＣＧＣＧＴＴＣＣＡＧＧＡＧＡＣＧＣＣＣＡＴＡＧＴＧＧＡＧＧＴＣＡＣＧＣＧＣＴＣＣＡＴＣＡＣＣＡＡＧＣＡＣＡＡＣＴＡＣＣＴＧＧＴＣＣＴＴＧＡＣＧＴＧＧＡＧＧＡＴＡＴＣＣＣＣＣＧＣＧＴＣＡＴＣＣＡＧＧＡＡＧＣＣＴＴＣＴＴＣＣＴＴＧＣＡＴＣＣＴＣＴＧＧＣＣＧＣＣＣＧＧＧＧＣＣＧＧＴＧＣＴＡＧＴＴＧＡＴＡＴＣＣＣＣＡＡＧＧＡＣＡＴＣＣＡＧＣＡＧＣＡＧＡＴＧＧＣＴＧＴＧＣＣＣＧＴＣＴＧＧＧＡＣＡＣＴＣＣＡＡＴＧＡＧＴＴＴＧＣＣＡＧＧＧＴＡＣＡＴＣＧＣＣＣＧＣＣＴＧＣＣＣＡＡＧＣＣＡＣＣＡＴＣＴＡＣＴＧＡＡＴＣＧＣＴＴＧＡＧＣＡＧＧＴＣＣＴＧＣＧＴＣＴＧＧＴＴＧＧＣＧＡＧＴＣＡＣＧＧＣＧＣＣＣＡＡＴＴＣＴＧＴＡＴＧＴＴＧＧＴＧＧＴＧＧＣＴＧＣＧＣＴＧＣＧＴＣＴＧＧＣＧＡＧＧＡＧＴＴＧＣＧＣＣＧＣＴＴＴＧＴＴＧＡＧＣＴＴＡＣＴＧＧＧＡＴＴＣＣＡＧＴＴＡＣＡＡＣＴＡＣＴＣＴＧＡＴＧＧＧＣＣＴＴＧＧＣＡＡＣＴＴＣＣＣＣＡＧＣＧＡＣＧＡＣＣＣＡＣＴＧＴＣＴＣＴＧＣＧＣＡＴＧＣＴＴＧＧＧＡＴＧＣＡＴＧＧＣＡＣＴＧＴＧＴＡＴＧＣＡＡＡＴＴＡＴＧＣＡＧＴＡＧＡＴＡＡＧＧＣＴＧＡＣＣＴＧＴＴＧＣＴＣＧＣＡＴＴＴＧＧＴＧＴＧＣＧＧＴＴＴＧＡＴＧＡＴＣＧＴＧＴＧＡＣＴＧＧＧＡＡＡＡＴＣＧＡＧＧＣＴＴＴＴＧＣＡＡＧＣＡＧＧＴＣＣＡＡＧＡＴＴＧＡＧＣＡＣＡＴＴＧＡＣＡＴＴＧＡＣＣＣＡＧＣＴＧＡＧＡＴＴＧＧＣＡＧＡＡＣＡＡＧＣＡＧＣＣＡＣＡＴＧＴＣＴＣＣＡＴＴＴＧＴＧＣＡＧＡＴＧＴＴＡＡＧＣＴＴＧＣＴＴＴＡＣＡＧＧＧＧＴＴＧＡＡＴＧＡＴＣＴＡＴＴＡＡＡＴＧＧＧＡＧＣＡＡＡＧＣＡＣＡＡＣＡＧＧＧＴＣＴＧＧＡＴＴＴＴＧＧＴＣＣＡＴＧＧＣＡＣＡＡＧＧＡＧＴＴＧＧＡＴＣＡＧＣＡＧＡＡＧＡＧＧＧＡＧＴＴＴＣＣＴＣＴＡＧＧＡＴＴＣＡＡＧＡＣＴＴＴＴＧＧＣＧＡＧＧＣＣＡＴＣＣＣＧＣＣＧＣＡＡＴＡＴＧＣＴＡＴＣＣＡＧＧＴＡＣＴＧＧＡＴＧＡＧＣＴＧＡＣＡＡＡＡＧＧＧＧＡＧＧＣＧＡＴＣＡＴＴＧＣＣＡＣＴＧＧＴＧＴＴＧＧＧＣＡＧＣＡＣＣＡＧＡＴＧＴＧＧＧＣＧＧＣＴＣＡＧＴＡＴＴＡＣＡＣＴＴＡＣＡＡＧＣＧＧＣＣＡＣＧＧＣＡＧＴＧＧＣＴＧＴＣＴＴＣＧＴＣＴＧＧＴＴＴＧＧＧＧＧＣＡＡＴＧＧＧＡＴＴＴＧＧＧＴＴＡＣＣＡＧＣＴＧＣＡＧＣＴＧＧＣＧＣＴＧＣＴＧＴＧＧＣＣＡＡＣＣＣＡＧＧＴＧＴＴＡＣＡＧＴＴＧＴＴＧＡＣＡＴＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＡＧＴＴＴＣＣＴＣＡＴＧＡＡＣＡＴＴＣＡＧＧＡＧＴＴＧＧＣＧＴＴＧＡＴＣＣＧＣＡＴＴＧＡＧＡＡＣＣＴＣＣＣＡＧＴＧＡＡＧＧＴＧＡＴＧＡＴＡＴＴＧＡＡＣＡＡＣＣＡＧＣＡＴＣＴＧＧＧＡＡＴＧＧＴＧＧＴＧＣＡＧＴＧＧＧＡＧＧＡＴＡＧＧＴＴＴＴＡＣＡＡＧＧＣＣＡＡＴＣＧＧＧＣＧＣＡＣＡＣＡＴＡＣＣＴＴＧＧＣＡＡＣＣＣＡＧＡＡＡＡＴＧＡＧＡＧＴＧＡＧＡＴＡＴＡＴＣＣＡＧＡＴＴＴＴＧＴＧＡＣＧＡＴＴＧＣＴＡＡＡＧＧＡＴＴＣＡＡＣＧＴＴＣＣＡＧＣＡＧＴＴＣＧＡＧＴＧＡＣＧＡＡＧＡＡＧＡＧＣＧＡＡＧＴＣＡＣＴＧＣＡＧＣＡＡＴＣＡＡＧＡＡＧＡＴＧＣＴＴＧＡＧＡＣＣＣＣＡＧＧＧＣＣＡＴＡＣＴＴＧＴＴＧＧＡＴＡＴＣＡＴＡＧＴＣＣＣＧＣＡＴＣＡＧＧＡＧＣＡＣＧＴＧＣＴＧＣＣＴＡＴＧＡＴＣＣＣＡＡＧＣＧＧＴＧＧＴＧＣＴＴＴＣＡＡＧＧＡＣＡＴＧＡＴＣＡＴＧＧＡＧＧＧＴＧＡＴＧＧＣＡＧＧＡＣＣＴＣＧＴＡＣＴＧＡＡＡＴＴＴＣＧＡＣＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＴＡＣＡＡＧＴＧＴＧＡＣＡＴＧＣＧＣＡＡＴＣＡＧＣＡＴＧＡＴＧＣＣＣＧＣＧＴＧＴＴＧＴＡＴＣＡＡＣＴＡＣＴＡＧＧＧＧＴＴＣＡＡＣＴＧＴＧＡＧＣＣＡＴＧＣＧＴＴＴＴＣＴＡＧＴＴＴＧＣＴＴＧＴＴＴＣＡＴＴＣＡＴＡＴＡＡＧＣＴＴＧＴＡＴＴＡＣＴＴＡＧＴＴＣＣＧＡＡＣＣＣＴＧＴＡＧＴＴＴＴＧＴＡＧＴＣＴＡＴＧＴＴＣＴＣＴＴＴＴＧＴＡＧＧＧＡＴＧＴＧＣＴＧＴＣＡＴＡＡＧＡＴＧＴＣＡＴＧＣＡＡＧＴＴＴＣＴＴＧＴＣＣＴＡＣＡＴＡＴＣＡＡＴＡＡＴＡＡＧＴＡＣＴＴＣＣＡＴＧＮＡＡＮＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ

【0412】

配列番号１１７
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配列番号１１９
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配列番号１２１
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配列番号１４０
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配列番号１４２
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配列番号１８４
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【0430】

配列番号１８５
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【0431】

配列番号１８６
ＡＴＴＴＴＣＣＡＴＴＣＡＣＴＴＧＧＣＣＣ

【0432】

配列番号１８７
ＴＧＣＴＡＴＣＴＧＧＣＴＣＡＧＣＴＧＣ

【0433】

配列番号１８８
ＡＴＧＧＴＧＧＡＡＧＧＧＣＧＧＴＴＧＴＧＡ

【0434】

配列番号１８９
ＣＴＣＣＣＧＣＧＣＡＣＣＧＡＴＣＴＧ

【0435】

配列番号１９０
ＣＣＣＧＣＣＣＣＴＣＴＣＣＴＣＴＴＴＣ

【0436】

配列番号１９１
ＡＡＧＣＣＧＣＣＴＣＴＣＧＣＣＣＡＣＣＣＡ

【0437】

配列番号１９２
ＡＹＣＡＧＡＴＧＴＧＧＧＣＧＧＣＴＣＡＧＴＡＴ

【0438】

配列番号１９３
ＧＧＧＡＴＡＴＧＴＡＧＧＡＣＡＡＧＡＡＡＣＴＴＧＣＡＴＧＡ

【0439】

配列番号１９４
ＡＣＣＡＧＡＴＧＴＧＧＧＣＧＧＣＴＣＡＧＴＡＴＴＡＣＡＣＴＴＡＣＡＡＧＣＧＧＣＣＡＣＧＧＣＡＧＴＧＧＣＴＧＴＣＴＴＣＧＴＣＴＧＧＴＴＧＧＧＧＧＣＡＡＴＧＧＧＡＴＴＴＧＧＧＴＴＡＣＣＡＧＣＴＧＣＡＧＣＴＧＧＣＧＣＴＧＣＴＧＴＧＧＣＣＡＡＣＣＣＡＧＧＴＧＴＴＡＣＡＧＴＴＧＴＴＧＡＣＡＴＴＧＡＴＧＧＡＧＡＴＧＧＴＡＧＴＴＴＣＣＴＣＡＴＧＡＡＣＡＴＴＣＡＧＧＡＧＴＴＧＧＣＡＴＴＧＡＴＣＣＧＴＡＴＴＧＡＧＡＡＣＣＴＣＣＣＴＧＴＧＡＡＧＧＴＧＡＴＧＡＴＡＴＴＧＡＡＣＡＡＣＣＡＧＣＡＴＣＴＧＧＧＡＡＴＧＧＴＧＧＴＧＣＡＡＴＧＧＧＡＧＧＡＴＡＧＧＴＴＴＴＡＣＡＡＧＧＣＣＡＡＴＣＧＧＧＣＧＣＡＣＡＣＡＴＡＣＣＴＴＧＧＣＡＡＣＣＣＡＧＡＡＡＡＴＧＡＧＡＧＴＧＡＧＡＴＡＴＡＴＣＣＡＧＡＴＴＴＴＧＴＧＡＣＧＡＴＴＧＣＴＡＡＡＧＧＡＴＴＣＡＡＣＧＴＴＣＣＧＧＣＡＧＴＴＣＧＴＧＴＧＡＣＧＡＡＧＡＡＧＡＧＣＧＡＡＧＴＣＡＣＴＧＣＡＧＣＡＡＴＣＡＡＧＡＡＧＡＴＧＣＴＴＧＡＧＡＣＣＣＣＡＧＧＧＣＣＡＴＡＣＴＴＧＴＴＧＧＡＴＡＴＣＡＴＣＧＴＣＣＣＧＣＡＴＣＡＧＧＡＧＣＡＣＧＴＧＣＴＧＣＣＴＡＴＧＡＴｔＣＣｃＡａｔＧＧｃＧＧｃＧＣＴＴＴＣＡＡＧＧＡＣＡＴＧＡＴＣＡＴＧＧＡＧＧＧＴＧＡＴＧＧＣＡＧＧＡＣＣＴＣＧＴＡＣＴＧＡＡＡＴＧＧＴＣＣＧＡＡＧＧＴＣＣＡＣＧＣＣＧＣＣＡＡＣＴＡＣＧＡＧＴＡＴＧＡＴＣＣＣＡＡＧＣＧＧＴＧＧＴＧＣＴＴＴＣＡＡＧＧＡＣＡＴＧＡＴＣＡＴＧＧＡＧＧＧＴＧＡＴＧＧＣＡＧＧＡＣＣＴＣＧＴＡＣＴＧＡＡＡＴＴＴＣＧＡＣＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＴＡＣＡＡＧＴＧＴＧＡＣＡＴＧＣＧＣＡＡＴＣＡＧＣＡＴＧＧＴＧＣＣＣＧＣＧＴＧＴＴＧＴＡＴＣＡＡＣＴＡＣＴＡＧＧＧＧＴＴＣＡＡＣＴＧＴＧＡＡＣＣＡＴＧＣＧＴＴＴＴＣＴＡＧＴＴＴＧＣＴＴＧＴＴＴＣＡＴＴＣＡＴＡＴＡＡＧＣＴＴＧＴＧＴＴＡＣＴＴＡＧＴＴＣＣＧＡＡＣＣＣＴＧＴＡＧＣＴＴＴＧＴＡＧＴＣＴＡＴＧＣＴＣＴＣＴＴＴＴＧＴＡＧＧＧＡＴＧＴＧＣＴＧＴＣＡＴＡＡＧＡＴＡＴＣＡＴＧＣＡＡＧＴＴＴＣＴＴＧＴＣＣＴＡＣＡＴＡＴＣ

【0440】

配列番号１９５
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【0441】

配列番号１９６
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配列番号１９８
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配列番号２０４
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配列番号２０５
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配列番号２０６
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配列番号２０７
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配列番号２１２
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配列番号２１３
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配列番号２２３
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配列番号２２５
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配列番号２２６
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【0487】

配列番号２４２
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配列番号２４３
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配列番号２４４
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配列番号２５０
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配列番号２５１
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配列番号２５２
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配列番号２５３
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配列番号２５４
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配列番号２５９
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配列番号２６０
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配列番号２６１
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配列番号２６２
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配列番号２６３
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配列番号２６４
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配列番号２６５
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配列番号２６６
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配列番号３２６
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【0525】

配列番号３２７
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配列番号３２８
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【0527】

配列番号３２９
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【0528】

配列番号３３０
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【0529】

配列番号３３１
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【0530】

配列番号３３２
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【0531】

配列番号３３３
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配列番号３３４
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配列番号３５０
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【0536】

配列番号３５２
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【0537】

配列番号３５３
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【0538】

配列番号３５４
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【0539】

配列番号３５５
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【0540】

配列番号３７５
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配列番号３７６
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【0542】

配列番号３７７
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【0543】

配列番号３７８
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【0544】

配列番号３７９

【0545】

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【0546】

配列番号３８０
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配列番号３８１
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【化1】

【0550】

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【0554】

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【0556】

配列番号３９４
ＡＧＧＴＡＡＴＴＴＡＡＴＧＧＡＴＣＣＡＣＴＡＧＴＡＡ

【0557】

配列番号３９５
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【0558】

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配列番号３９８
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【0561】

配列番号３９９
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【0562】

配列番号４００
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【0563】

配列番号４０１
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【0565】

配列番号４０３
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【0567】

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配列番号４０８
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配列番号４０９
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【0572】

配列番号４１０
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配列番号４１１
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【0574】

配列番号４１２
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【0575】

配列番号４１３
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配列番号４１４
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【0577】

配列番号４１５
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【0578】

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【0581】

配列番号４１９
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：：ＧＴＡＣＴＣＧＧＣＣＡＣＧＡＣＴＧＧＴＡＡＴＴＴＡＡＴＴＴＴ：：：：：：：：：：：ＴＣＴＴＴＣＡＡＣＴＴＣＴＴＡ

【0583】

配列番号４２１
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配列番号４２２
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【0585】

配列番号４２３
ｔｎａｎｔｇａｔｔｃ ｃｃａａｔｇｇｃｇｇ ｃｇｃｔｔｔｃａａｇ ｇａｃａｔｇａｔｃａ ｔｇｇａｇｇｇｔｇａ ｔｇｇｃａｇｇａｃｃｔｃｇｔａｃｔｇａａ ａｔｇｇｔｃｃｇａａ ｇｇｔｃｃａｃｇｃｃ ｇｃｃａａｃｔａｃｇ ａｇ

【0586】

配列番号４２４
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【0587】

配列番号４２５
ｔｎａｎｔｇａｔｔｃ ｃｃａａｔｇｇｃｇｇ ｃｇｃｔｔｔｃａａｇ ｇａｃａｔｇａｔｃａ ｔｇｇａｇｇｇｔｇａ ｔｇｇｃａｇｇａｃｃ ｔｃｇｔａｃｔｇａａ ａｔｔｔｇｃａｇｇｔ ａｃａａｇ

【0588】

配列番号４２６
ａｎｇｎｇｔｃｔｔｇ ｔａｃｃｔｇｃａａａ ｔｔｔｃａｇｔａｃｇ ａｇｇｔｃｃｔｇｃｃ ａｔｃａｃｃｃｔｃｃ ａｔｇａｔｃａｔｇｔｃｃｔｔｇａａａｇｃ ｇｃｃｇｃｃａｔｔｇ ｇｇａａｔ

【0589】

配列番号４２７
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【0591】

配列番号４２９
ｃｇｔｇｃａａｇｃｇｃｔｃａａｔｔｃｇｃｃｃｔａｔａｇｔｇａｇｔｃｇｔａｔｔａｃａａｔｃｇｔａｃｇｃａａｔｔｃａｇｔａｃａｔｔａａａａａｃｇｔｃｃｇｃａａｔｇｔｇｔｔａｔｔａａｇｔｔｇｔｃｔａａｇｃｇｔｃａａｔｔｔｇｔｔｔａｃａｃｃａｇａｇｇｃｃｇａｃａｃｇｇｃａｃａｃａｃｇｇｃｇａｃａｔｔｃａｃｃｇｃｃｇｇｃｔｔｃｃｔｃｃｇｔｃｇｃｃａｃｔｃｇｇｃａｃａａｇｇｃｔｃａｔｃａｇｔｃｇｃｃｇａｔｇｃｃｃｇａｔｇｃｇａｔｃａａｃｇｇａａｇｃｇｇａｔｇｇｃｃｃｇｃｔｔｃｔｔｔａｇａａｔｔｇｇｃａｃａｇｇａａｃａｃｔｇｇｃｃａｃｔｇｃｃｃｔｔｇａｔｇｔｇｃａａｔｔａｔｇｃｃｔｇｃｇａａａｇｃｃｔａｇｇｃａａｃａｃａｃｇｃｇａａｔａａａｃｇａｇｃｇａａｔｇａｃａｃｇｇａａａｇｃｔｇａｔｇｔｇｇｔａｔｇａａｔｔａｔａｃａａｃａｔｔａｔｇｇｇｃｃａａａａｔａｔｔａｔｔｃｔａｔｃｃａｃｃａｔｔｇｔｇｔａｇｃｃａｃａｇｃａｔｃｇｇｔａｔｔｔｇａｇｔｔｇｔｇｃｇａｇｇａｃａａａｔｃｃｃｔｃｇｔｇａｇｇｔｃａａａａａｃａｇｃａａａｔａａｔａａａｃｃｃａｔｃｔｃｃｔｇａａｇａｃａｃｃａａａａａａａａｇｇａｇｃａｇｃｔｃｃｔｃｇｔｇｔｃａａｔｇａａｃａａｇｃｇｔｃａｃａａｇａａａａｇｇｇａｇｃａｃｇｔａａａｔａａｃｃｔｃｔｔｃａａｔｔｇｃｔｔｃａｇｃａｔｇａａａａｇａａｃｇｇｇａａｇａａａｔｇｃａａｇｔｃｔａｃａｇａｇｇａａａｇｔｇｃａｇｃｔｇｔｔｔｃｇｇｃｔｇｃｃａｔｇｇｃａａｇｔｔｃｃｔａｃａｔｇｇｇｃｇａｇｇａａａａｇｃｔｇａａｃｔｇｇａｔｔｃｃａｇｔｃｔｔｃｇｃｇｃｔｇｔｃａｔｇｃｔｃａｇｃｔｔｇｃｔｔｔａｇｇａｔｇｃｇｇｃａａｔａｇｔｔｃａｃｃｔｇｇａｔｇａａａａａｇａｔａｃａａｇｔｔａｇｔｃｔｔｇａａｇｃａｇｔｃｇａｇｔｇｇａｃａｔｃｃａａａｇｔａｔｃａａａａｔｃｇａａａｇｃｔｔｇｔａａａｔｇｇｇｇａａｇｇａａａｔａｔａｃｃｔｃｔａｃｃｃｇｇａａａａｇｔｔｔｇｇｔａｇｇｃａａａａｔａａｔｃｃｃａａｃｇｃｃａｇｃａｇａｇｃｔｃ

【0592】

配列番号４３０
ａｇｔｔｇｇｇａａｇｇｃａａａａｃｇａａｔａｔａａｇｔｇｃａｔｔｃｇｇａｔｔａｃｔｇｔｔｔａｇｔｃｇａｇｔｃａｔａｔｔｔａａｇｇａａｔｔｃａｔｔｇｔａａａｔｇｔｔｃｔａａｃｃｔａａｃｃｔａａｇｔａｔｔａｇｇｃａｇｃｔａｔｇｇｃｔｇａｔａｔｇｇａｔｃｔｇａｔｔｇｇａｃｔｔｇａｔｔｔａｔｃｃａｔｇａｔａａｇｔｔｔａａｇａｇｃａａｃｔｃａａａｇａｇｇｔｔａｇｇｔａｔａｔａｔｇｇｔｔｔｔｇｔａａａｇｇｔａａａｔｔｔａｇｔｔａａｔａｔｔａｇａａａａａａａａａｇｔｇｔａｔｃｃａａｔａｇｇｃｔｃｔａｔａａａｃａａｃｔｃｔｔｃａａａｔｔｔａｇｔｇｇｃｔｔｔｃｔａｔｃｃａｔｃｃａｃｃｔｔｔｇｃｔｃｔｃｔａｔｔｔｔｔｇｇａｔａｇｃｃｔｇａｔｔｔａｃｔｃｔｃｔａｔｔｃａｇｔｃｃｇｔａｇｇｔｔｔａａｔｇａｇｔｃｔｇｔｔｇｇａｔｔａｇｃｃｔａｃａｃｔｔｔｔｔｃｔｇｔａａａａｔｃｔａｔｔｔｔａｇａｔａｇｔａｇｃｔａａａｔｃａｇｔａａａｔｔｔｇｇｃｔａｇｔａｔｔｔｔｔａｇｃｔａｔｔｃｔｃｔｔｇｇａｇｔｔｔｇｃｔａｔａａｇａｃｃａｇａａｃａｔｇｔａａａｔｔｇｇａａｇｔｔｔｇｔｇｇａｃｃｃｇｇａｃｇａｇａａｔｇｃａｔｇａｃａａａｔｃｃａｇａｇｔａｔｔｇａｔｇａｔｇｇａａｔｔｃａｃｃｔａｔｔｔｔａｃｃｃｇａｃｔｃｔｔｃｃａｔｔｇｔｇｔｃｃａｔｔｔｃｔｃａｔｃａｔｃｃｃｃｇｇｇｃｇｃｔｔｔｃｔｇｃａｔｃｃｇｇｔａｃａｇｃｔｇａｃａｔｇａｃａｃｇｔｔｃａｃｇｃｇｔｔａｃａｔｇｇｃｔｇａｔｇｇｃｔｃａｃａａｇｔｃａｃｃｃｃｃａｃａｔｇｔｃｔａｇｔｇｔｔｃｇｃｃｃａｇｇｃａｇａｔｃｇｔｃｃｔｃｇｇｃｃｔｇｃｇｃｔｇｃｃｇｔｇｃｔｃｔｔｇｃｃｇｃｃｇｃｔｔｇｃｔｔｇｇｇｃｃｃｔｇｃｔｇｇｃｇｃｃｃｇｃｔｇｃｃｇａｔｃａｃａｃｇｇｃｃｔａｃｇｃｇｇｔｇｃａｇｇｃａｇｃｇｃｃａｃｃｇａａｃｃｃｇｃａｇｔｃｔｔｇｔｔｇｔｇｃｃｇａｔａｇｇｔｇｇｃａｇｔｇｇｃａｇｔｇｇｃａｃｔｇｇｃａｃｇｇｃａｃｇｃｇａｔｃｇａｔｃｇｃｔｃｃｇｃｔｃａｔｃｔｇｃｔｇａｃａｇｔｇｇａｔａｇａｇｃａｇｃｇｔｔｇｇｃｃｇｔｔｇｇｇｇｃｃｇｇａｔｃｔｃｃｇｔｇａａｇｃｇｇｔｃｇｔｃｃｃｔｇｃｔｇｔａｃｔｇｔｇｃｃｇｃｔａｔｇｇｃｇｔｇｔｃｇｃｔｔｔｃｇｃｃａｔｇｔｔｔｔｃｔｔｔｔｃｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｃｔｔｔｔｔｃｔｔｔｔｔｇｃｔａｇｇｇｃｇｇｔｔｔｃｔｃｇｔｔｃｇｃｔｇｇｔａａｃａｇｇｇａｃｃａｃｔｔｃｇｇｔｔｇａｔｃｃｇｔｔｇａａｔｔｔａｃｔｇａａａｇａｇａｔｇｇｇａａｔｇｇｔｃｇｃｔｇｔｇｃｃｃｇｇｇａｃａｔｔｇａａｔｇａｇａｔｇｔｔｇｔｇｔａａｇｔｇａａｔａｔｇｇｃｔｔｔａｇｃｃｔｔｔｔｇｃｇａｇｔｇｇｇａａｔｇｇａｔｇｃｔａａａｃｇａａｃａｃａａａｃｃｇｇｇｔｔｔａａａｃｃａｇａｇｇｃｃｇａｃａｃｇｇｃａｃａｃａｃｇｇｃｇａｃａｔｔｃａｃｃｇｃｃｇｇｃｔｔｃｃｔｃｃｇｔｃｇｃｃａｃｔｃｇｇｃａｃａａｇｇｃｔｃａｔｃａｇｔｃｇｃｃｇａｔｇｃｃｃｇａｔｇｃｇａｔｃａａｃｇｇａａｇｃｇｇａｔｇｇｃｃｃｇｃｔｔｃｔｔｔａｇａａｔｔｇｇｃａｃａｇｇａａｃａｃｔｇｇｃｃａｃｔｇｃｃｃｔｔｇａｔｇｔｇｃａａｔｔａｔｇｃｃｔｇｃｇａａａｇｃｃｔａｇｇｃａａｃａｃａｃｇｃｇａａｔａａａｃｇａｇｃｇａａｔｇａｃａｃｇｇａａａｇｃｔｇａｔｇｔｇｇｔａｔｇａａｔｔａｔａｃａａｃａｔｔａｔｇｇｇｃｃａａａａｔａｔｔａｔｔｃｔａｔｃｃａｃｃａｔｔｇｔｇｔａｇｃｃａｃａｇｃａｔｃｇｇｔａｔｔｔｇａｇｔｔｇｔｇｃｇａｇｇａｃａａａｔｃｃｃｔｃｇｔｇａｇｇｔｃａａａａａｃａｇｃａａａｔａａｔａａａｃｃｃａｔｃｔｃｃｔｇａａｇａｃａｃｃａａａａａａａａｇｇａｇｃａｇｃｔｃｃｔｃｇｔｇｔｃａａｔｇａａｃａａｇｃｇｔｃａｃａａｇａａａａｇｇｇａｇｃａｃｇｔａａａｔａａｃｃｔｃｔｔｃａａｔｔｇｃｔｔｃａｇｃａｔｇａａａａｇａａｃｇｇｇａａｇａａａｔｇｃａａｇｔｃｔａｃａｇａｇｇａａａｇｔｇｃａｇｃｔｇｔｔｔｃｇｇｃｔｇｃｃａｔｇｇｃａａｇｔｔｃｃｔａｃａｔｇｇｇｃｇａｇｇａａａａｇｃｔｇａａｃｔｇｇａｔｔｃｃａｇｔｃｔｔｃｇｃｇｃｔｇｔｃａｔｇｃｔｃａｇｃｔｔｇｃｔｔｔａｇｇａｔｇｃｇｇｃａａｔａｇｔｔｃａｃｃｔｇｇａｔｇａａａａａｇａｔａｃａａｇｔｔａｇｔｃｔｔｇａａｇｃａｇｔｃｇａｇｔｇｇａｃａｔｃｃａａａｇｔａｔｃａａａａｔｃｇａａａｇｃｔｔｇｔａａａｔｇｇｇｇａａｇｇａａａｔａｔａｃｃｔｃｔａｃｃｃｇｇａａａａｇｔｔｔｇｇｔａｇｇｃａａａａｔａａｔｃｃｃａａｃｇｃｃａｇｃａｇａｇｃｔｃｃｇｇａａｃｇｔｔｔｇｃｃｇａａａｔｔｃａｇａａｇｃｃｇａａａａｇｔｔｃｔｔｇｔａｃｔｃａｃｃｃｔｃｃｇａｃａｇｔｔｔｃｇｃａａｇｇｔｔｔｃｃａｇｃａｇｔａａｇｇａａｔｇｃｇｔｇｇｃｃａｔｇｇａｔｔｃｃａｇｃｇｔｃｔｃｔｇａａｔａｔｃｔｔｇａｇｇｇｇｃａｇａｔｃａａａａｇａａａｇｇｔｃａｇｃｇａａｇｇｃａｇａｃａｃｇｇｃｃａｇａｔｃａｃｃｔｃｃｃａａｇｔａａｔｃｃｃｔｔｃｃａｇｇｇｔｃａｇｃｃｇａｇｃｃａｃｔｃｔｃｃｇａｇｔｔａｔｔａａｇｇａｃａｔｇｃｃｔｃｃｇｃｇｃｃｔｃｔｇｔｔｇｇｇｃｃａａｃｔｃｃｃｃｔｔａａｔｃｔｇａａａｃｃｃａｇｃａｇａｇａｔｇａｃｇｇｔｃｃｇｃｃｃａａｇｃｔｇｃａｃａｃｔｇｇａｇａａｇａａｔｔａｃｃｔｃｃａａｇａｔａａａａｃｃｔｃｔｃｔｇｇｃａｃｔｇａｔｇａａｇｔｃｇａａｔｔｃａｔｇａａｔｃｃｃｃｃｔｇｃａａｇｃｇｇｔａａａａｔｇａｃａｃｃｃｇｃｔｃｃｔａｃａｃｃａａｃｇｔｔｇａｇａｇｃａｇｃａｃｔａｔａａａａｔｃｃｃａａａｇｇｃａｃａｇｃａｃｃａｃｇｔａｃａｔｃｇａａｃｔｃｃｔｇａｇａｇｃａａａｃｃｃａａｃｇｇｃａａｔａｔｔｔｔｃｔａａｃｇｇａｃａｃｃａａｃｃａｇｃｇａａｃｃａｇｃａｇｃｇｔｃｇｃｇｔｃｇｇｇｃｃａａｇｃｇａａｇｃａｇａｃｇｇｃａｃｇｇｃａｔｃｔｃｔｇｔｃｇｃｔｇｃｃｔｃｔｇｇａｃｃｃｃｔｃｔｃｇａｇａｇｔｔｃｃｇｃｔｃｃａｃｃｇｔｔｇｇａｃｔｔｇｃｔｃｃｇｃｔｇｔｃｇｇｃａｔｃｃａｇａａａｔｔｇｃｇｔｇｇｃｇｇａｇｃｇｇｃａｇａｃｇｔｇａｇｃｃｇｇｃａｃｇｇｃａｇｇｃｇｇｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｔｃａｃｇｇｃａｃｃｇｇｃａｇｃｔａｃｇｇｇｇｇａｔｔｃｃｔｔｔｃｃｃａｃｃｇｃｔｃｃｔｔｃｇｃｔｇｔｃｃｃｔｔｃｃｔｃｇｃｃｃ

【0593】

配列番号４３１
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【0594】

配列番号４６４
ｇｔｇｃａｔｔｃｇｇａｔｔａｃｔｇｔｔｔａｇｔｃｇａｇｔｃａｔａｔｔｔａａｇｇａａｔｔｃａｔｔｇｔａａａｔｇｔｔｃｔａａｃｃｔａａｃｃｔａａｇｔａｔｔａｇｇｃａｇｃｔａｔｇｇｃｔｇａｔａｔｇｇａｔｃｔｇａｔｔｇｇａｃｔｔｇａｔｔｔａｔｃｃａｔｇａｔａａｇｔｔｔａａｇａｇｃａａｃｔｃａａａｇａｇｇｔｔａｇｇｔａｔａｔａｔｇｇｔｔｔｔｇｔａａａｇｇｔａａａｔｔｔａｇｔｔａａｔａｔｔａｇａａａａａａａａａｇｔｇｔａｔｃｃａａｔａｇｇｃｔｃｔａｔａａａｃａ

【0595】

本明細書において言及された全ての特許、特許出願、および刊行物は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

【0596】

理解の明確さを目的として、例示説明および実施例を用いてある程度詳細に開示を提供してきたが、当業者には、本開示の趣旨または範囲から逸脱することなく、種々の変更および修正が実施され得ることは明白であろう。したがって、前述の説明および実施例は、限定的であると解釈されるべきではない。

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図1D】

【図1E】

【図1F】

【図2A】

【図2B】

【図3-1】

【図3-2】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図5A】

【図5B】

【図5C】

【図6】

【図7】

【図8A】

【図8B】

【図8C】

【図9】

【図10A】

【図10B】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19A】

【図19B】

【図20A】

【図20B】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27】

【図28-1】

【図28-2】

【図29A】

【図29B】

【図30】

【図31】

【図32】

【図33】

【図34】

【図35】

【図36】

【図37】

【図38】

【図39】

【図40】

【図41】

【図42】

【図43】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]