特許 6559241 持続型ＥＰＯ製剤を用いた貧血治療方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6559241

(24)【登録日】2019年7月26日

(45)【発行日】2019年8月14日

(54)【発明の名称】持続型ＥＰＯ製剤を用いた貧血治療方法

(51)【国際特許分類】

   A61K 47/68 20170101AFI20190805BHJP

   A61K 38/22 20060101ALI20190805BHJP

   A61P 7/06 20060101ALI20190805BHJP

   C07K 19/00 20060101ALN20190805BHJP

   C07K 16/00 20060101ALN20190805BHJP

   C07K 14/505 20060101ALN20190805BHJP

【ＦＩ】

   A61K47/68

   A61K38/22

   A61P7/06

   !C07K19/00ZNA

   !C07K16/00

   !C07K14/505

【請求項の数】19

【全頁数】22

(21)【出願番号】特願2017-536578(P2017-536578)

(86)(22)【出願日】2016年1月8日

(65)【公表番号】特表2018-502862(P2018-502862A)

(43)【公表日】2018年2月1日

(86)【国際出願番号】KR2016000175

(87)【国際公開番号】WO2016111575

(87)【国際公開日】20160714

【審査請求日】2017年9月1日

(31)【優先権主張番号】62/101,639

(32)【優先日】2015年1月9日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】517229811

【氏名又は名称】ジェネクシン，インク．

【氏名又は名称原語表記】ＧＥＮＥＸＩＮＥ，ＩＮＣ．

(73)【特許権者】

【識別番号】506379781

【氏名又は名称】グリーン・クロス・コーポレイション

【氏名又は名称原語表記】ＧＲＥＥＮ ＣＲＯＳＳ ＣＯＲＰ．

(74)【代理人】

【識別番号】110000084

【氏名又は名称】特許業務法人アルガ特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】ヤン，サン−イン

(72)【発明者】

【氏名】ウー，ジュン−ウォン

(72)【発明者】

【氏名】ヤン，セ ワン

(72)【発明者】

【氏名】スン，ヨン チュル

(72)【発明者】

【氏名】パク，ドゥ ホン

(72)【発明者】

【氏名】キム，ミン ウー

【審査官】 菊池 美香

(56)【参考文献】

【文献】 特表２０１０−５３１１３４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１２−１０７０４２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 PLoS ONE, 2011, Vol.6, Issue 9, e24574, p.1-13

【文献】 History of Changes for Study: NCT02044653[オンライン］,2014[検索日：2018.12.11］,インターネット：<URL:https://clinicaltrials.gov/ct2/history/NCT02044653?V_1=View#StudyPageTop>

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ３８／２２

Ａ６１Ｋ ４７／６８

Ａ６１Ｐ ７／０６

Ｃ０７Ｋ １４／５０５

Ｃ０７Ｋ １６／００

Ｃ０７Ｋ １９／００

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＥＰＯ（erythropoietin）及び免疫グロブリンハイブリッドＦｃを含む融合ポリペプチドを有効成分として含有する貧血治療剤であって、該融合ポリペプチドが貧血患者に５μｇ／ｋｇ〜９μｇ／ｋｇの用量で２週〜４週間隔で投与されるものであり、該融合ポリペプチドが配列番号３のアミノ酸配列からなる、貧血治療剤。

【請求項2】

前記用量が、５μｇ／ｋｇ〜８μｇ／ｋｇである、請求項１に記載の貧血治療剤。

【請求項3】

前記用量が、５μｇ／ｋｇまたは８μｇ／ｋｇである、請求項１に記載の貧血治療剤。

【請求項4】

前記間隔が、２週または４週である、請求項１に記載の貧血治療剤。

【請求項5】

前記貧血が、腎不全に起因するものである、請求項１に記載の貧血治療剤。

【請求項6】

前記貧血患者が、周期的に腹膜透析または血液透析を行う患者である、請求項１に記載の貧血治療剤。

【請求項7】

前記投与が、静脈投与または皮下投与である、請求項１に記載の貧血治療剤。

【請求項8】

前記貧血治療剤が、血中ヘモグロビン（hemoglobin）値を矯正または維持するものである、請求項１に記載の貧血治療剤。

【請求項9】

前記矯正が、前記ＥＰＯ及び免疫グロブリンハイブリッドＦｃを含む融合ポリペプチドを５μｇ／ｋｇまたは８μｇ／ｋｇの用量で２週間隔で投与、または該ＥＰＯ及び免疫グロブリンハイブリッドＦｃを含む融合ポリペプチドを８μｇ／ｋｇの用量で４週間隔で投与するものである、請求項８に記載の貧血治療剤。

【請求項10】

前記維持が、前記ＥＰＯ及び免疫グロブリンハイブリッドＦｃを含む融合ポリペプチドを５μｇ／ｋｇまたは８μｇ／ｋｇの用量で４週間隔で投与するものである、請求項８に記載の貧血治療剤。

【請求項11】

ＥＰＯ（erythropoietin）及び免疫グロブリンハイブリッドＦｃを含む融合ポリペプチドを有効成分として含有する、貧血患者の血中ヘモグロビン（hemoglobin）値を１０ｇ／ｄｌ〜１２ｇ／ｄｌの範囲に矯正または維持するための治療剤であって、該融合ポリペプチドが貧血患者に５μｇ／ｋｇ〜９μｇ／ｋｇの用量で２週〜４週間隔で投与されるものであり、該融合ポリペプチドが配列番号３のアミノ酸配列からなる、治療剤。

【請求項12】

前記用量が、５μｇ／ｋｇ〜８μｇ／ｋｇである、請求項１１に記載の治療剤。

【請求項13】

前記用量が、５μｇ／ｋｇまたは８μｇ／ｋｇである、請求項１１に記載の治療剤。

【請求項14】

前記間隔が、２週または４週である、請求項１１に記載の治療剤。

【請求項15】

前記貧血が、腎不全に起因するものである、請求項１１に記載の治療剤。

【請求項16】

前記貧血患者が、周期的に腹膜透析または血液透析を行う患者である、請求項１１に記載の治療剤。

【請求項17】

前記投与が、静脈投与または皮下投与である、請求項１１に記載の治療剤。

【請求項18】

前記矯正が、前記ＥＰＯ及び免疫グロブリンハイブリッドＦｃを含む融合ポリペプチドを５μｇ／ｋｇまたは８μｇ／ｋｇの用量で２週間隔で投与、または該ＥＰＯ及び免疫グロブリンハイブリッドＦｃを含む融合ポリペプチドを８μｇ／ｋｇの用量で４週間隔で投与するものである、請求項１１に記載の治療剤。

【請求項19】

前記維持が、前記ＥＰＯ及び免疫グロブリンハイブリッドＦｃを含む融合ポリペプチドを５μｇ／ｋｇまたは８μｇ／ｋｇの用量で４週間隔で投与するものである、請求項１１に記載の治療剤。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は持続型ＥＰＯ（erythropoietin）製剤を用いて貧血を治療する方法に関する。具体的には、ＥＰＯ及び免疫グロブリンハイブリッドＦｃを含む融合ポリペプチドを貧血患者に投与する段階を含む貧血治療方法及び貧血患者の血中ヘモグロビン値を矯正または維持する方法に関する。

【背景技術】

【0002】

ＥＰＯ（erythropoietin）は赤血球生成を促進する糖タンパク質ホルモンであり、体内の酸素濃度により腎臓で生成されて赤血球の生成を調節する因子としてよく知られている。赤血球は体内の酸素を運搬するのに必須の血球細胞であり、腎不全患者の場合、ＥＰＯを分泌する機能に異常が生じて赤血球生成に影響を及ぼすことになり、そのため貧血症状を示すことになる。

【0003】

貧血は、世界保健機関（ＷＨＯ）により、成人男性及び閉経期女性を基準に血中血色素（hemoglobin）１３．０ｇ／ｄｌ未満または閉経前の女性を基準に１２ｇ／ｄｌ未満と定義されている（World Health Organization. Nutritional Anaemias: Report of a WHO Scientific Group. Geneva, Switzerland: World Health Organization, 1968）。このような基準に基づいて、糸球体濾過量（ＧＦＲ）＜２５〜３０ｍＬ／分（腎不全第４期）の貧血患者の９０％以上で血中血色素は１０ｇ／ｄｌ未満と報告されている（非特許文献１）。

【0004】

貧血症状を緩和するためにＥＰＯ製剤を投与することにより貧血現象を改善することができるため、１９８０年代米国のアムジェン（Amgen）社をはじめに、遺伝子組換えＥＰＯ製品であるエポジェン（Epogen）、ネオレコルモン（Neorecormon）などのような第１世代製品が発売された。しかし、第１世代製品は半減期が短くて週３回ずつ投与するしかないという不便さがあった。ここで、患者の利便性を改善し、１回／週、１回／２週、または１回／月の投与を受けるアラネスプ（Aranesp）とミセラ（Micera）のような持続型ＥＰＯ製品が２０００年代に発売された。しかし、患者の利便性のためには、まだ、より長い半減期を有するＥＰＯ製剤が要求され、化学物質の結合を利用しない生体親和的な持続型ＥＰＯ製剤の開発が必要とされる状況である。また、持続型ＥＰＯ製剤の開発にあって、体内で長く効力を維持することにより、患者の利便性を増大させるべきということに加えて、急激なヘモグロビン上昇や頻繁な濃度変化による心血管系副作用の誘発可能性を最小化するべきということが注目されている。

【0005】

本発明者らは、持続型ＥＰＯ製剤としてＥＰＯタンパク質と免疫グロブリンハイブリッドＦｃが融合されたＥＰＯ-ｈｙＦｃ融合ポリペプチドを開発し（特許文献１、この内容は参照により本明細書に組み込まれる）、これを健康な成人に投与した時、既存市販の製品と同様に薬物による深刻な異常反応が観察されず、かつ、体内持続性が維持される結果を確認した（非特許文献２）。

【0006】

しかし、これは健康な成人を対象にした結果であるため、貧血患者において治療効果が現れるか否かは確認することができず、単回投与を通じた安定性だけを確認しただけで、長期的な投与が必要な治療法において必須である投与周期を確認することはできなかった。また、健康な成人ではＥＰＯ製剤投与により、その濃度が生理的な正常範囲より高くなる場合、恒常性を維持しようとする生理的な調節作用が存在したため、ＥＰＯ-ｈｙＦｃによる薬力学的パラメーターであるヘモグロビン値の変化を正確に確認することができなかった。したがって、健康な成人を対象にした臨床では先行指標として赤血球の前駆体である網状赤血球（reticulocyte）の変化を測定することによりＥＰＯ単回投与の効果を推定するしかなかった。

【0007】

ここで、貧血治療において、より安全で持続可能な適切な有効用量及び周期のＥＰＯ-ｈｙＦｃ融合ポリペプチドの投与方法の確立が要求されてきた。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0008】

【特許文献1】米国特許第７８６７４９１号明細書

【非特許文献】

【0009】

【非特許文献1】Kazmi WH, Kausz AT, Khan S, et al. Anemia: an early complication of chronic renal insufficiency. Am J Kidney Dis 2001; 38:803

【非特許文献2】Clinical Drμｇ Investigation June 2014, Volume 34, Issue 6, pp 373-382

【非特許文献3】Sports Med 2003; 33 (4): 301-315

【非特許文献4】KDOQI clinical practice guidelines and clinical practice recommendations for anemia in chronic kidney disease. Am J Kidney Dis 2006;47(5 suppl 3):S11-145

【非特許文献5】Klinger AS, Foley RN, Goldfarb DS, et al. KDOQI US commentary on the 2012 KDIGO clinical practice guideline for anemia in CKD. Am J Kidney Dis 2013

【非特許文献6】J Am Soc Nephrol, 2009, 20: 479-487

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0010】

本発明者らは、貧血治療において、より安全で持続可能な治療方法を開発するために鋭意努力した結果、ＥＰＯ及び免疫グロブリンハイブリッドＦｃを含む融合タンパク質を貧血患者に投与した時、従来確認できなかった顕著な効果を示す最適の投与用量及び投与周期を確認することにより、本発明を完成した。

【課題を解決するための手段】

【0011】

本発明の目的は、安全で持続可能な有効用量及び周期のＥＰＯ及び免疫グロブリンハイブリッドＦｃを含む、融合ポリペプチドの投与を通じた貧血治療方法を提供することにある。
本発明の他の目的は、前記投与を通じた貧血患者のヘモグロビン値を正常範囲に矯正または維持する方法を提供することにある。

【発明の効果】

【0012】

本発明は貧血患者で優れた安全性を示し、１ヶ月まで体内持続性が維持されながらも、緩やかなヘモグロビン上昇を示すＥＰＯ及び免疫グロブリンハイブリッドＦｃを含む融合ポリペプチドの最適投与用量及び周期に関するもので、前記最適の用量及び周期を用いたＥＰＯ及び免疫グロブリンハイブリッドＦｃを含む融合ポリペプチドの投与方法は貧血患者の治療に効果的に用いられる。

【図面の簡単な説明】

【0013】

【図1a】図１ａ〜図１ｄはそれぞれ健康な成人における、ＥＰＯ−ｈｙＦｃ融合ポリペプチドの静脈投与及び皮下投与によるヘモグロビン（hemoglobin）及び網状赤血球（reticulocyte）の数値変化を確認したグラフである。図１ａ及び１ｃは静脈投与、図１ｂ及び１ｄは皮下投与の結果である。

【図1b】図１ａ〜図１ｄはそれぞれ健康な成人における、ＥＰＯ−ｈｙＦｃ融合ポリペプチドの静脈投与及び皮下投与によるヘモグロビン（hemoglobin）及び網状赤血球（reticulocyte）の数値変化を確認したグラフである。図１ａ及び１ｃは静脈投与、図１ｂ及び１ｄは皮下投与の結果である。

【図1c】図１ａ〜図１ｄはそれぞれ健康な成人における、ＥＰＯ−ｈｙＦｃ融合ポリペプチドの静脈投与及び皮下投与によるヘモグロビン（hemoglobin）及び網状赤血球（reticulocyte）の数値変化を確認したグラフである。図１ａ及び１ｃは静脈投与、図１ｂ及び１ｄは皮下投与の結果である。

【図1d】図１ａ〜図１ｄはそれぞれ健康な成人における、ＥＰＯ−ｈｙＦｃ融合ポリペプチドの静脈投与及び皮下投与によるヘモグロビン（hemoglobin）及び網状赤血球（reticulocyte）の数値変化を確認したグラフである。図１ａ及び１ｃは静脈投与、図１ｂ及び１ｄは皮下投与の結果である。

【図2a】図２ａ及び図２ｂはＥＰＯ−ｈｙＦｃ融合ポリペプチドを示す。図２ａはＥＰＯ−ｈｙＦｃ融合ポリペプチドの概略図及び構造を示し、図２ｂはＥＰＯ−ｈｙＦｃ融合ポリペプチドのアミノ酸配列を示す。図２ｂで、イタリックはＩｇＤのヒンジ領域（hinge region）を、下線部分はＩｇＤのＣＨ２領域を、ボールドはＩｇＧ４のＣＨ２及びＣＨ３領域をそれぞれ意味する。

【図2b】図２ａ及び図２ｂはＥＰＯ−ｈｙＦｃ融合ポリペプチドを示す。図２ａはＥＰＯ−ｈｙＦｃ融合ポリペプチドの概略図及び構造を示し、図２ｂはＥＰＯ−ｈｙＦｃ融合ポリペプチドのアミノ酸配列を示す。図２ｂで、イタリックはＩｇＤのヒンジ領域（hinge region）を、下線部分はＩｇＤのＣＨ２領域を、ボールドはＩｇＧ４のＣＨ２及びＣＨ３領域をそれぞれ意味する。

【図3】ＥＰＯ−ｈｙＦｃ融合ポリペプチドを腎不全貧血患者に投与して各用量別ヘモグロビン値の変化を確認しようとする臨床試験の構成である。ＨＤは血液透析（Hemodialysis）を、ＰＤは腹膜透析（Peritoneal Dialysis）を、ＣＲＦは慢性腎不全（Chronic Renal Failure）を、Ｑ１Ｗは１週間隔投与、Ｑ２Ｗは２週間隔投与、Ｑ４Ｗは４週間隔投与をそれぞれ意味する。

【図4a】図４ａ及び図４ｂは慢性腎不全貧血患者にＥＰＯ−ｈｙＦｃ融合ポリペプチドを投与した時、用量別ヘモグロビンの変動幅を示したグラフである。ＢＬは基底値（Baseline）を意味する。

【図4b】図４ａ及び図４ｂは慢性腎不全貧血患者にＥＰＯ−ｈｙＦｃ融合ポリペプチドを投与した時、用量別ヘモグロビンの変動幅を示したグラフである。ＢＬは基底値（Baseline）を意味する。

【発明を実施するための形態】

【0014】

前記目的を達成するための本発明の一つの態様は、貧血患者にＥＰＯ（erythropoietin）及び免疫グロブリンハイブリッドＦｃを含む融合ポリペプチドを４μｇ／ｋｇ〜９μｇ／ｋｇの用量で２週〜４週間隔で投与する段階を含む貧血治療方法である。

【0015】

本発明ではＥＰＯ（erythropoietin）及び免疫グロブリンハイブリッドＦｃを含む融合ポリペプチドを貧血患者に投与する場合、血中ヘモグロビン値を正常水準に矯正（correction）または維持することができる最適の投与濃度及び投与周期を確立した。ここで、本発明で確立された前記融合ポリペプチドの投与濃度及び投与周期に従って貧血患者に投与する場合、患者の血中ヘモグロビン値を正常値に矯正または維持することができ、究極的に貧血を治療することができる。以下、本発明を詳細に説明する。

【0016】

本発明における用語、「ＥＰＯ（erythropoietin）」は、糖タンパク質ホルモンであり、赤血球生成に関与するサイトカインをいう。前記ＥＰＯは多様な種から由来してもよく、例えば、ヒト、カニクイザル（Cynomolgus）、マウス、ラットまたはウサギ由来であってもよいが、血中ヘモグロビン値を上昇させることができるものであれば、その由来に特に制限されない。

【0017】

具体的に、これに制限されるものではないが、前記ＥＰＯは配列番号１のアミノ酸配列、または前記配列と７０％以上、具体的には８０％以上、より具体的には９０％以上、もっと具体的には９５％以上、さらに具体的には９８％以上、最も具体的には９９％以上の相同性を示すアミノ酸配列からなるものであってもよい。

【0018】

前記配列と相同性を有する配列として、実質的に配列番号１のタンパク質と同一であるか、相応する生物学的活性を有するアミノ酸配列であれば、一部の配列が欠失、変形、置換または付加されたアミノ酸配列を有する場合も本発明の範囲に含まれるのは自明である。

【0019】

前記の用語、「相同性」は、与えられたアミノ酸配列または塩基配列と一致する程度を意味し、パーセントとして示されうる。本明細書で、与えられたアミノ酸配列または塩基配列と同一であるか、類似な活性を有するその相同性配列が「％相同性」で示される。例えば、％相同性は、点数（score）、同一性（identity）及び類似度（similarity）などのパラメーター（parameter）を計算する標準ソフトウェア、具体的にＢＬＡＳＴ２．０を用いたり、定義された厳しい条件下でサザンハイブリダイゼーション実験により配列を比較することにより確認することができる。定義される適切なハイブリダイゼーション条件は該当技術の範囲内であり、当業者に公知の方法（例えば、J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York）により決定されてもよい。

【0020】

本発明における用語、「免疫グロブリンＦｃ断片」または「免疫グロブリンＦｃ」は、免疫グロブリンの重鎖定常領域（ＣＨ）を含み、免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖の可変領域及び軽鎖定常領域（ＣＬ）は含まないタンパク質を意味する。前記Ｆｃはヒンジ領域をさらに含むことができ、本発明の目的上、重鎖定常領域２（ＣＨ２）及び重鎖定常領域３（ＣＨ３）は含むが、重鎖定常領域１（ＣＨ１）は含んでもよく、含まなくてもよい。

【0021】

また、本発明の免疫グロブリンＦｃ断片は天然型糖鎖、天然型に比べて増加した糖鎖、天然型に比べて減少した糖鎖、または糖鎖が除去された形態であってもよい。化学的方法、酵素的方法及び微生物を用いた遺伝工学的エンジニアリング方法などのような当業界に周知の通常の方法で免疫グロブリンＦｃ糖鎖の増加、減少または除去が行われてもよい。Ｆｃ断片からの糖鎖の除去は補体第一成分Ｃ１のＣ１ｑへの結合親和力を急激に減少させ、抗体依存性細胞媒介性細胞障害（antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity、ＡＤＣＣ）または補体依存性細胞障害（complement-dependent cytotoxicity、ＣＤＣ）の減少または消失をもたらし、そのため生体内の不必要な免疫反応を誘導しない。このことから、糖鎖が除去されたり（deglycosylated）非糖鎖化された（aglycosylated）形態での免疫グロブリンＦｃ断片は、薬物の担体として本発明の目的により適合しうる。

【0022】

ここで、「糖鎖の除去（deglycosylation）」は、Ｆｃ断片から酵素的に糖が除去されることを意味し、用語、「非糖鎖化（aglycosylation）」は、Ｆｃ断片が原核生物、好ましくは大腸菌（E.coli）により糖鎖化されてない（unglycosylated）形態で生成されることを意味する。

【0023】

前記免疫グロブリンＦｃは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４のＦｃ領域の中のいずれか一つであってもよい。また、前記Ｆｃ領域はＦｃＲ結合及び/または補体結合が起こらないように変形されたものであってもよい。特に、本発明では、前記免疫グロブリンＦｃとしてハイブリッドＦｃを使用し、これは「免疫グロブリンハイブリッドＦｃ」と呼ばれる。本発明で「免疫グロブリンハイブリッドＦｃ」という用語は、「ｈｙＦｃ」と混用して用いられた。

【0024】

前記免疫グロブリンハイブリッドＦｃはＩｇＧサブクラスの組合せまたはヒトＩｇＤ及びＩｇＧの組合せから誘導されてもよい。一例として、前記免疫グロブリンＦｃ領域はＮ−末端からＣ−末端の方向にヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含んでもよい。ここで、前記ヒンジ領域はヒトＩｇＤヒンジ領域を含んでもよい。また、前記ＣＨ２ドメインはヒトＩｇＤとＩｇＧ４のＣＨ２ドメインのアミノ酸残基部分を含んでもよい。また、前記ＣＨ３ドメインはヒトＩｇＧ４のＣＨ３ドメインのアミノ酸残基部分を含んでもよい。

【0025】

具体的に、前記免疫グロブリンハイブリッドＦｃは、これに制限されるものではないが、配列番号２のアミノ酸配列、または前記配列と７０％以上、具体的には８０％以上、より具体的には９０％以上、もっと具体的には９５％以上、さらに具体的には９８％以上、最も具体的には９９％以上の相同性を示すアミノ酸配列からなるものであってもよい。

【0026】

前記配列と相同性を有する配列として、実質的に配列番号２のタンパク質と同一であるか、相応する生物学的活性を有するアミノ酸配列であれば、一部配列が欠失、変形、置換または付加されたアミノ酸配列を有する場合も本発明の範囲に含まれるのは自明である。

【0027】

前記免疫グロブリンハイブリッドＦｃはＥＰＯタンパク質に結合する場合、ＥＰＯの活性を阻害することなく血清半減期を増加させうる。

【0028】

本発明における用語、「ＥＰＯ及び免疫グロブリンハイブリッドＦｃを含む融合ポリペプチド」は、ＥＰＯタンパク質に免疫グロブリンＦｃを融合したタンパク質を意味する。本発明における「ＥＰＯ及び免疫グロブリンハイブリッドＦｃを含む融合ポリペプチド」の用語は、「ＥＰＯ−ｈｙＦｃ融合ポリペプチド」と混用して使用された。前記融合ポリペプチドは具体的に免疫グロブリンハイブリッドＦｃのＮ−末端とＥＰＯのＣ−末端が結合されたものであってもよいが、これに制限されない。また、前記融合タンパク質は免疫グロブリンハイブリッドＦｃとＥＰＯがリンカー（linker）で連結されたものであってもよい。

【0029】

具体的に、前記ＥＰＯ−ｈｙＦｃ融合ポリペプチドは、これに制限されるものではないが、配列番号３のアミノ酸配列、または前記配列と７０％以上、具体的には８０％以上、より具体的には９０％以上、もっと具体的には９５％以上、さらに具体的には９８％以上、最も具体的には９９％以上の相同性を示すアミノ酸配列からなるものであってもよい。

【0030】

前記配列と相同性を有する配列として実質的に配列番号３のタンパク質と同一であるか、相応する生物学的活性を有するアミノ酸配列であれば、一部配列が欠失、変形、置換または付加されたアミノ酸配列を有する場合も本発明の範囲に含まれるのは自明である。

【0031】

前記ＥＰＯ及び免疫グロブリンハイブリッドＦｃを含む融合ポリペプチドは貧血患者に投与後、抗体の生成が観察されず生体内で非常に安全であり、また既存第１世代のＥＰＯ製品の半減期である約８時間（非特許文献３）に比べて、半減期が１３８〜１５８時間で約１９倍程度長く持続される。

【0032】

本発明の具体的な実施例で、慢性腎不全貧血患者を対象にＥＰＯ−ｈｙＦｃ融合ポリペプチドを反復投与することにより、ヘモグロビン値の変化を通じて効力を示す範囲を確認するための試験計画を樹立した（図３）。さらに、これにより、持続力がありながらも急速な効力反応を止揚して、心血管系の副作用の危険を下げることにより、貧血治療に効果的に利用されうるＥＰＯ−ｈｙＦｃ融合ポリペプチドの投与用量及び周期を確認した（表１）。

【0033】

ここで、４μｇ／ｋｇ〜９μｇ／ｋｇのＥＰＯ−ｈｙＦｃ融合ポリペプチドを２週〜４週間隔で貧血患者に投与した時、血中ヘモグロビン値を正常水準に矯正（correction）または維持することにより、貧血を効果的に治療しうることを確認した。

【0034】

本発明における用語、「貧血」は、患者のＥＰＯ生成細胞による機能性ＥＰＯタンパク質の不適切な生成及び/またはＥＰＯタンパク質の全身循環系内への不適切な放出及び/または骨髄内赤芽細胞のＥＰＯタンパク質に対する無能力な反応による、赤血球細胞の数及び/またはヘモグロビン値の欠乏を意味する。貧血症状がある患者は赤血球恒常性を維持することができない。一般的に、貧血は腎臓機能の減退または喪失（例えば、慢性腎不全）、相対的なＥＰＯ欠乏、うっ血性心不全、化学療法または抗ウィルス療法（例えば、ＡＺＴ）のような骨髄抑制性療法、非骨髄性ガン、ＨＩＶのようなウィルス感染、自己免疫疾患（例えば、関節リウマチ）、肝臓疾患、及び多臓器不全などによって発生しうるが、これらに限定されない。

【0035】

本発明で前記貧血患者は周期的に腹膜透析または血液透析を行う患者であってもよいが、これに制限されない。また、前記患者は具体的にヒトであってもよいが、これに制限されない。

【0036】

本発明における用語、「治療」は、本発明に係るＥＰＯ−ｈｙＦｃ融合ポリペプチドまたはこれを含む薬学的組成物の投与により貧血患者の症状が好転したり、有利に変更されるすべての行為を意味する。前記投与は任意の適切な方法で患者に所定の物質を提供することを意味し、本発明のＥＰＯ−ｈｙＦｃ融合ポリペプチドの投与経路は融合ポリペプチドが目的の組織に到達することができる限り、制限されない。例えば、関節内投与、腹腔内投与、静脈投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、経口投与、局所投与、鼻内投与、肺内投与、直腸内投与であってもよく、具体的には、静脈内投与または皮下投与であってもよい。

【0037】

本発明の貧血治療方法は、前記ＥＰＯ−ｈｙＦｃ融合ポリペプチドを貧血患者に４μｇ／ｋｇ〜９μｇ／ｋｇの用量で２週〜４週間隔で投与して行ってもよい。

【0038】

具体的に前記貧血治療方法は、ＥＰＯ−ｈｙＦｃ融合ポリペプチドを５μｇ／ｋｇ〜８μｇ／ｋｇの用量で投与してもよく、より具体的には５μｇ／ｋｇまたは８μｇ／ｋｇの用量で投与するものであってもよい。また、具体的に前記ＥＰＯ−ｈｙＦｃ融合ポリペプチドを２週または４週間隔で投与してもよい。最も具体的には、前記ＥＰＯ−ｈｙＦｃ融合ポリペプチドを５μｇ／ｋｇの用量で２週間隔で投与、８μｇ／ｋｇの用量で２週間隔で投与、５μｇ／ｋｇの用量で４週間隔で投与、または８μｇ／ｋｇの用量で４週間隔で投与するものであってもよい。

【0039】

前記貧血治療方法はＥＰＯ−ｈｙＦｃ融合ポリペプチドの投与を介して患者の血中ヘモグロビン値を正常範囲に矯正したり、または維持することであってもよい。

【0040】

本発明における用語、「矯正」は、異常な状態を正常の状態になるように誘導する行為を意味し、「維持」は、正常的な状態を持続させる行為を意味する。つまり、血中ヘモグロビン値を正常範囲に矯正したり維持することは、すなわち、異常な血中ヘモグロビン値を正常範囲となるように誘導するか、または通常の血中ヘモグロビン値が持続するようにすることをいう。

【0041】

最近ＦＤＡを含む各国の医薬品規制機関ではヘモグロビンが急激に上昇する場合、心血管系の副作用誘発率が増加することがあり、貧血治療剤に対してヘモグロビンの血中濃度をよくモニタリングし、慎重に投与することを勧告しており、特に貧血の程度がやや激しい患者に限ってＥＰＯ製剤を使用することを勧告している。臨床診療ガイドライン（2012 KDIGO Clinical Practice Guideline for Anemia in Chronic Kidney Disease, Page 304）によると、腎不全患者の貧血治療を目的に使用されるＥＰＯ製剤の初期投与目標は投与開始後４週間の血色素上昇が１ｇ／ｄｌ〜２ｇ／ｄｌに達することが望ましいと勧告しているが、実際の臨床報告によると、０．７ｇ／ｄｌ〜２．５ｇ／ｄｌであることが報告されている。

【0042】

腎不全患者の貧血治療の目標は血中血色素が１０ｇ／ｄｌ〜１２ｇ／ｄｌになるように維持することで、１３ｇ／ｄｌ以上に上昇する場合、心血管系副作用及び死亡の危険性が増加することが報告され、最近には１１ｇ／ｄｌ以上に上昇するとＥＰＯ製剤の投与を中断するか、用量を調節することとの、新しいガイドラインが提供された（2011, FDA Drμｇ Safety Communication: Modified dosing recommendations to improve the safe use of Erythropoiesis-Stimulating Agents (ESAs) in chronic kidney disease）。

【0043】

また、米国National Kidney Foundation Kidney disease Outcome Quality Initiative (NFK-K／DOQI)の２００７年治療ガイドラインによるとＨｂ濃度が１１．０ｇ／ｄｌ以下である場合ＥＰＯ製剤による貧血治療を勧めており、治療目標Ｈｂ濃度は１１．０〜１２．０ｇ／ｄｌで、少なくとも月１回以上の濃度測定を勧告している（非特許文献４）。２０１２年ＫＤＩＧＯガイドラインによると、腎不全第５期の成人患者の場合、Ｈｂ濃度が９．０〜１０．０ｇ／ｄｌである時にＥＰＯ製剤投与を勧めており、維持療法の場合、血中血色素濃度が１１．５ｇ／ｄｌを超えないように勧めている（非特許文献５）。

【0044】

本発明では貧血の矯正（Correction）は、正常の血中ヘモグロビン値未満の貧血患者で血中ヘモグロビン値が正常値に到達するようにＥＰＯ−ｈｙＦｃ融合ポリペプチドを投与することと定義することができ、維持（Maintenance）は、血中ヘモグロビン値が正常範囲内にある貧血患者で血中ヘモグロビン値が正常状態に持続するようにＥＰＯ-ｈｙＦｃ融合ポリペプチドを投与することで定義することができる。

【0045】

矯正療法は貧血患者に副作用をもたらさないように異常血中ヘモグロビン値を正常値に到達する速度が非常に重要であり得る。具体的には投与開始後４週に血中ヘモグロビン値が０．７〜２．５ｇ／ｄｌ増加されるものであってもよいが、これに制限されない。

【0046】

維持療法は正常血中ヘモグロビン値を少ない変動幅に維持することが非常に重要であり得る。具体的に投与開始後、血中ヘモグロビン値が±１．１〜１．３ｇ／ｄｌの変動幅を有し、正常値の範囲内で持続的に維持できるものであってもよいが（非特許文献６）、これに制限されない。

【0047】

前記正常血中ヘモグロビン値は、例えば、１０ｇ／ｄｌ〜１２ｇ／ｄｌであってもよいが、この範囲は患者の状態、投与方法、環境などの多様な要因により当業者が適切に変更してもよく、特に制限されることではない。また、本発明のＥＰＯ−ｈｙＦｃ融合ポリペプチドの投与周期または用量を調節して患者のヘモグロビン値を矯正したり維持することも当業者が患者の状態などを考慮して適切に選択することができ、特に、単一の用量または周期に制限されるものではない。

【0048】

本発明の一例によると、任意に選定した正常ヘモグロビン値に対して下回る血中ヘモグロビン値を有する貧血患者にＥＰＯ−ｈｙＦｃ融合ポリペプチドを矯正を目的に特定用量及び周期を選定して投与を行っている途中、患者の血中ヘモグロビン値が正常範囲に到達するとＥＰＯ−ｈｙＦｃ融合ポリペプチドの用量及び周期を変更して維持を目的にして投与を行ってもよく、ヘモグロビン値が過度に増加されたと判断される場合には、一時的に投与を中断してもよい。

【0049】

本発明において、前記矯正は、これに制限されるものではないが、ＥＰＯ及び免疫グロブリンハイブリッドＦｃを含む融合ポリペプチドを５μｇ／ｋｇ〜８μｇ／ｋｇの用量で投与するものであってもよく、前記融合ポリペプチドを２週〜４週間隔で投与するものであってもよい。具体的には、ＥＰＯ及び免疫グロブリンハイブリッドＦｃを含む融合ポリペプチドを５μｇ／ｋｇまたは８μｇ／ｋｇの用量で投与するものであってもよく、前記融合ポリペプチドを２週または４週間隔で投与するものであってもよい。さらに具体的には、ＥＰＯ及び免疫グロブリンハイブリッドＦｃを含む融合ポリペプチドを５μｇ／ｋｇまたは８μｇ／ｋｇの用量で２週間隔で投与、またはＥＰＯ及び免疫グロブリンハイブリッドＦｃを含む融合ポリペプチドを８μｇ／ｋｇの用量で４週間隔で投与するものであってもよい。

【0050】

本発明において前記維持は、これに制限されるものではないが、ＥＰＯ及び免疫グロブリンハイブリッドＦｃを含む融合ポリペプチドを５μｇ／ｋｇ〜８μｇ／ｋｇの用量で投与するものであってもよく、前記融合ポリペプチドを４週間隔で投与するものであってもよい。具体的には、ＥＰＯ及び免疫グロブリンハイブリッドＦｃを含む融合ポリペプチドを５μｇ／ｋｇまたは８μｇ／ｋｇの用量で投与するものであってもよい。さらに具体的には、ＥＰＯ及び免疫グロブリンハイブリッドＦｃを含む融合ポリペプチドを５μｇ／ｋｇまたは８μｇ／ｋｇの用量で４週間隔で投与するものであってもよい。

【0051】

また、具体的に前記貧血治療方法は、ａ）血中ヘモグロビン値が正常範囲未満である貧血患者に、ＥＰＯ及び免疫グロブリンハイブリッドＦｃを含む融合ポリペプチドを５μｇ／ｋｇまたは８μｇ／ｋｇの用量で２週間隔で投与、または８μｇ／ｋｇの用量で４週間隔で投与して矯正する段階；及びｂ）前記ａ）段階を通して血中ヘモグロビン値が正常範囲内に矯正された貧血患者に、ＥＰＯ及び免疫グロブリンハイブリッドＦｃを含む融合ポリペプチドを５μｇ／ｋｇまたは８μｇ／ｋｇの用量で４週間隔で投与して維持する段階を含むものであってもよい。

【0052】

本発明の具体的な一実施例では、腎不全患者に本発明のＥＰＯ−ｈｙＦｃ融合ポリペプチドを３μｇ／ｋｇ、５μｇ／ｋｇまたは８μｇ／ｋｇの用量で２週間隔で反復投与した後、血中ヘモグロビン値を持続的に観察した（図４ａ及び表１）。

【0053】

その結果、３μｇ／ｋｇを投与した場合、投与後、６週が経過した時点でヘモグロビン値は０．７４ｇ／ｄｌ増加して正常値の範囲よりは若干低い９．５０ｇ／ｄｌで確認された。一方、５μｇ／ｋｇを投与した場合には、ヘモグロビン値が１．１４ｇ／ｄｌ増加された９．７４ｇ／ｄｌであり、８μｇ／ｋｇを投与した場合には、ヘモグロビン値が１．２３ｇ／ｄｌ増加された１０．１３ｇ／ｄｌで確認され、５μｇ／ｋｇまたは８μｇ／ｋｇで２週間隔で投与した場合、ヘモグロビン値が正常水準近くに矯正されたことを確認できた。

【0054】

前記結果により、本発明のＥＰＯ−ｈｙＦｃ融合ポリペプチドを２週間隔で貧血患者に投与する場合、ヘモグロビン値矯正のためには５μｇ／ｋｇまたは８μｇ／ｋｇの用量で投与するのが適合であることを確認した。

【0055】

本発明の具体的な他の一実施例では、腎不全患者に本発明のＥＰＯ−ｈｙＦｃ融合ポリペプチドを３μｇ／ｋｇ、５μｇ／ｋｇまたは８μｇ／ｋｇの用量で４週間隔で反復投与した後、血中ヘモグロビン値を持続的に観察した（図４ｂ及び表２）。

【0056】

その結果、３μｇ／ｋｇを投与した場合、投与後、８週が経過した時点でヘモグロビン値は０．７４ｇ／ｄｌ減少して貧血治療効果がなく症状がむしろ悪化することを確認した。一方、５μｇ／ｋｇを投与した場合には、ヘモグロビン値が０．０１ｇ／ｄｌ減少して、９．２３ｇ／ｄｌの投与前のヘモグロビン値を維持することを確認した。さらに、８μｇ／ｋｇを投与した場合には、ヘモグロビン値が０．７９ｇ／ｄｌ増加された１０．１７ｇ／ｄｌで確認され、ヘモグロビン値が正常水準に矯正または維持されることを確認できた。

【0057】

前記結果により、本発明のＥＰＯ−ｈｙＦｃ融合ポリペプチドを４週間隔で貧血患者に投与する場合、５μｇ／ｋｇの用量はヘモグロビン値を維持し、５μｇ／ｋｇまたは８μｇ／ｋｇの用量はヘモグロビン値を矯正または維持するのに適合することを確認した。

【0058】

本発明の他の一つの態様は、貧血患者にＥＰＯ（erythropoietin）及び免疫グロブリンハイブリッドＦｃを含む融合ポリペプチドを４μｇ／ｋｇ〜９μｇ／ｋｇの用量で２週〜４週間隔で投与する段階を含む、貧血患者のヘモグロビン（hemoglobin）値を１０ｇ／ｄｌ〜１２ｇ／ｄｌの範囲に矯正または維持する方法である。

【0059】

貧血患者、融合ポリペプチド及び投与に関しては前述した通りである。

【0060】

具体的に、前記矯正はＥＰＯ及び免疫グロブリンハイブリッドＦｃを含む融合ポリペプチドを５μｇ／ｋｇまたは８μｇ／ｋｇの用量で２週間隔で投与、またはＥＰＯ及び免疫グロブリンハイブリッドＦｃを含む融合ポリぺプチドを８μｇ／ｋｇの用量で４週間隔で投与するものであってもよく、前記維持はＥＰＯ及び免疫グロブリンハイブリッドＦｃを含む融合ポリペプチドを５μｇ／ｋｇまたは８μｇ／ｋｇの用量で４週間隔で投与するものであってもよい。

【実施例】

【0061】

以下、下記実施例により本発明をさらに詳細に説明する。これらの実施例は本発明を例示するためのものであり、本発明の範囲がこれら実施例により制限されるものに解釈されない。

【0062】

実施例１．腎不全貧血患者に対するＥＰＯ−ｈｙＦｃ融合ポリペプチドの反復投与方法
１−１．ＥＰＯ−ｈｙＦｃ融合ポリペプチドの製造
本発明者らの先行特許である特許文献１の実施例３及び実施例４のようにＥＰＯ−ｈｙＦｃ融合ポリペプチドを製造した（図２ａ）。前記ＥＰＯ−ｈｙＦｃ融合ポリペプチドの全体配列（配列番号３）は図２ｂに示した通りである。

【0063】

１−２．単回投与方法
前記製造したＥＰＯ−ｈｙＦｃ融合ポリペプチドの薬力学的、薬物動態学的反応を確認するために、健康な男性成人を対象にＥＰＯ−ｈｙＦｃ融合ポリペプチドを投与した。静脈にそれぞれの用量（０．３、１、３、５または８μｇ／ｋｇ）と皮下にそれぞれの用量（１、３、５または８μｇ／ｋｇ）で単回投与した後、ヘモグロビン値を評価した（図１ａ及び図１ｂ）。

【0064】

その結果、ＥＰＯ−ｈｙＦｃ融合ポリペプチド静脈投与及び皮下投与時、試験したすべての用量範囲で安定性を示した。静脈投与の場合、用量が増加することに応じて体内曝露が増加した。用量補正したＣ_ｍａｘの場合、用量による差異を示さなかったが、用量補正したＡＵＣ_ｌａｓｔの場合、用量による差異を示した（P-value<0.001）。ＧＣ１１１３皮下投与群を投与用量で補正したＣ_ｍａｘの場合、用量による差異を示さなかったが、用量補正したＡＵＣ_ｌａｓｔの場合、用量により統計的に有意な差異を示した（P-value=0.016）。薬力学／薬物動態学的な相関関係を比較した時、静脈投与の場合、Ｃ_ｍａｘ、ＡＵＣ_ｌａｓｔと基準補正したＥｍａｘ（baseline corrected Emax）、ＡＵＥＣとの間に量の相関関係を示し、皮下投与の場合、Ｃｍａｘ、ＡＵＣ_ｌａｓｔと基準補正したＥｍａｘ（baseline corrected Emax）、ＡＵＥＣとの間に単純相関関係は観察されなかった（p-value>0.05）。

【0065】

投与後、抗体生成は観察されず、静脈投与（ＩＶ）１μｇ／ｋｇ群と静脈投与ＮＥＳＰ３０μｇ群が類似な体内曝露を示した。薬力学的パラメーターである網状赤血球（reticulocyte）の計数の結果、静脈投与３〜５μｇ／ｋｇ群と静脈投与ＮＥＳＰ３０μｇ群が類似な様相を示した（図１ｃ及び図１ｄ）。皮下投与の場合は、時間に応じた網状赤血球変化の様相がＮＥＳＰ３０μｇ群とは相違した。網状赤血球−時間プロファイル（Reticulocyte-time profile）及び累積時間区間別のＡＵＥＣ変化値に基づいて判断したとき、低用量群（１、３μｇ／ｋｇ群）での網状赤血球の増加の最大効果は、ＮＥＳＰ３０μｇ群に比べて低くて遅く示される傾向があり、高用量群（５、８μｇ／ｋｇ群）での網状赤血球の増加の最大効果は、ＮＥＳＰと同様でありながら、より持続的な効果が示されることを確認した。

【0066】

１−３．反復投与方法
前記製造したＥＰＯ−ｈｙＦｃ融合ポリペプチドの慢性腎不全貧血患者でのヘモグロビン値の変化及びこれを通じた貧血の治療効果を確認するために、図３に記載された用量及び周期で前記融合ポリペプチドを慢性腎不全貧血患者に投与した。

【0067】

パートＡでは、各用量及び投与周期グループ別１０人ずつ常時的に透析を実施する腎不全患者にそれぞれの用量（３、５または８μｇ／ｋｇ）を２週または４週間隔で投与し、薬物投与前に比べヘモグロビンの変化を測定して、その中で最も良い結果を示した二つのグループを選別してパートＢ研究で活性対照群との比較研究を行った。

【0068】

既存のＥＰＯ製剤を投与されている患者の場合には、休薬期（Wash-out）を経た後、研究に参加した。休薬期は８週以上が付与されたが、休薬期が４週以上であり、３回以上血色素変化値が測定された患者として血色素検査値が１０g／ｄｌ未満の場合には８週以上の休薬期が経過しなくても採用した。

【0069】

１−４．腹膜透析患者群に対する投与方法
常時的に腹膜透析を行う患者を対象に、体内ヘモグロビン（hemoglobin）の変化量を調査するために、次のような臨床研究を実施した。

【0070】

各用量及び投与周期グループ別１０人ずつ常時的に腹膜透析を実施する腎不全患者に潜在的に選定された各用量（３、５または８μｇ／ｋｇ）を２週または４週間隔で３回（１日目、１５日目、２９日目）または２回（１日目、２９日目）皮下（ＳＣ）経路で投与し、投与前に比べ４週後のヘモグロビンの変化を６週または８週後に調査して、体内ヘモグロビン値の変化によりＥＰＯ−ｈｙＦｃ融合ポリペプチドの体内持続性及び効力を評価した。

【0071】

腹膜透析腎不全患者を対象にするパートＡの場合、計６回の訪問で構成されており、訪問１から訪問５までに血色素の増加効果を評価するための採血を行い、各訪問時、血液の損失や輸血施行するかどうかの評価を並行した。

【0072】

以降、ヒトにおいてＥＰＯ−ｈｙＦｃ融合ポリペプチドの用量別反復投与による体内持続性がヘモグロビンの変化に及ぼす影響を確認するために、前記パートＡにより選定された２つの用量をグループ別２５人ずつ腹膜透析中の腎不全患者の皮下（ＳＣ）経路で投与した後、投与前に比べ１２週後のヘモグロビンの変化を調査した。

【0073】

パートＢの場合、計１０回の訪問で構成されており、投薬のための訪問は、訪問２と訪問８との間に２週間隔で実施した。訪問１から訪問９までに血色素の増加効果を評価するための採血を行い、各訪問時、血液の損失や輸血施行するかどうかの評価を並行した。

【0074】

１−５．血液透析患者群に対する投与方法
周期的に血液透析を行う患者を対象に、体内ヘモグロビン（hemoglobin）の変化及びこれを通じた貧血治療効果を確認するために、次のような臨床研究を実施した。

【0075】

ヒトにおいてＥＰＯ−ｈｙＦｃ融合ポリペプチドの用量別反復投与による体内持続性がヘモグロビンの変化に及ぼす影響を確認するために、前記腹膜透析パートＡにより潜在的に選ばれた各用量（５、８μｇ／ｋｇ）を１週または２週間隔で１３回（１日目、８日目、１５日目、２２日目、２９日目、３６日目、４３日目、５０日目、５７日目、６４日目、７１日目、７８日目、８５日目）または７回（１日目、１５日目、２９日目、４３日目、５７日目、７１日目、８５日目）静脈（ＩＶ）経路で投与し、投与前に比べ１２週後のヘモグロビンの変化を１３週または１４週目に調査して体内ヘモグロビン値の変化によりＥＰＯ−ｈｙＦｃ融合ポリペプチドの体内持続性及び効力を評価した。

【0076】

血液透析腎不全患者を対象にしたパートＢの場合、計１６回（１週間の投与間隔対象者）または１０回の訪問（２週間の投与間隔対象者）で構成されており、投薬のための訪問は、訪問２及び訪問１４の間に、毎週または隔週で実施した。訪問１から訪問１５までに血色素の増加効果を評価するための採血を行い、各訪問時、血液の損失や輸血施行するかどうかの評価を並行した。

【0077】

実施例２．ＥＰＯ−ｈｙＦｃ反復投与による慢性腎不全貧血患者のヘモグロビン変化
前記実施例１のようにＥＰＯ−ｈｙＦｃ融合ポリペプチドを、それぞれの用法に合わせて反復投与した後、自動血球分析装置により採血された患者の血液からヘモグロビンを計数し、これにより、融合ポリペプチドの投与によるヘモグロビン値の変化を確認した。その結果、下記表１及び表２のようなヘモグロビン値の変化を観察した。

【0078】

【表1】

【0079】

臨床診療ガイドラインに従う時、投与４週後の血中ヘモグロビン値の推奨変化量が１ｇ／ｄｌ〜２ｇ／ｄｌであり、市販の薬品に対する実際の臨床報告に従う時の変化量が０．７ｇ／ｄｌ〜２．５ｇ／ｄｌであることを結果の解釈の参考にした。

【0080】

特に、矯正療法の場合には投与後１２週を基準に、正常値範囲である１０〜１２ｇ／ｄｌの範囲に到達することを目指しており、これに基づいてデータを解析した。

【0081】

３μｇ／ｋｇのＥＰＯ−ｈｙＦｃ融合ポリペプチドを２週間隔で３回投与した群の場合、６週後にヘモグロビンの変化を最終分析した結果値で平均０．７４ｇ／ｄｌヘモグロビン値が増加して９．５０ｇ／ｄｌになり、正常値よりも低い値で確認された。しかし、同じ期間中に５μｇ／ｋｇを２週間隔で投与した群では、平均１．１４ｇ／ｄｌ、８μｇ／ｋｇを２週間隔で投与した群では、平均１．２３ｇ／ｄｌ増加したことを確認した。これにより、慢性腎不全貧血患者にＥＰＯ−ｈｙＦｃ融合ポリペプチドを投与した時、濃度依存的にヘモグロビンの濃度が増加することを確認し、特に５μｇ／ｋｇ及び８μｇ／ｋｇのＥＰＯ−ｈｙＦｃ融合ポリペプチドを投与した場合には、ヘモグロビン値が正常範囲まで回復されることが確認できた。

【0082】

前記結果は、２週間隔で投与した場合、５μｇ／ｋｇ及び８μｇ／ｋｇの濃度で急激なヘモグロビンの変化（change）なしに貧血を治療しうることを意味する。既存のＥＰＯ製剤を投与されていた患者で８週間の休薬期（Wash-out）後、ヘモグロビン値が９ｇ／ｄｌ未満まで減少したが、ＥＰＯ−ｈｙＦｃ融合ポリペプチドを５μｇ／ｋｇ及び８μｇ／ｋｇ濃度で２週間隔で３回投与後のヘモグロビン値が休薬期以前の水準に回復されることを確認した（図４ａ）。前記の結果により、当業者は、各用量に応じた変動幅を参考にして、患者のヘモグロビン値と状況に応じて適切な変化速度を有する用量及び用法を選ぶことができる。

【0083】

【表2】

【0084】

次に、３μｇ／ｋｇの濃度を４週間隔で２回投与した後のヘモグロビンの変化を最終的に分析した結果、平均０．６８ｇ／ｄｌヘモグロビン値の減少が観察され、５μｇ／ｋｇの濃度を４週間隔で投与した群では平均０．０１ｇ／ｄｌヘモグロビン値の減少が観察されており、８μｇ／ｋｇの濃度を４週間隔で投与した群では、平均０．７９ｇ／ｄｌ増加したことを確認した。特に、５μｇ／ｋｇ濃度の場合、ヘモグロビン値が９．２３ｇ／ｄｌで、投与前と同様に維持され、８μｇ／ｋｇ濃度の場合、ヘモグロビン値が１０．１７ｇ／ｄｌに増加したことを確認した。

【0085】

前記患者は、８週間の休薬期（Wash-out）を経て、ヘモグロビン値が着実に減少したが、ＥＰＯ−ｈｙＦｃ融合ポリペプチドを４週間隔で２回投与した場合には、用量に応じて減少パターンが維持パターン（５μｇ／ｋｇ）または上昇パターン（８μｇ／ｋｇ）に変わることを確認した（図４ｂ）。つまり、休薬期の間に現れた急激なヘモグロビン値の低下速度が緩和され、傾きが緩やかになったり反転されるパターンに変化した。

【0086】

これにより、慢性腎不全貧血患者に４週間で２回投与した場合（４週間隔、２回投与）にもＥＰＯ−ｈｙＦｃ融合ポリペプチド投与により濃度依存的にヘモグロビン値に影響を及ぼすことが分かった。また、すべての投与濃度でヘモグロビン値の増加が急激でなく、緩やかな上昇または維持されることを確認した。

【0087】

これらの結果は、ＥＰＯ−ｈｙＦｃ融合ポリペプチドの投与用量及び周期を調節することにより、目標ヘモグロビン値（例えば、１１ｇ／ｄｌ）未満の貧血患者でヘモグロビン値の矯正用法として使用したり、目標ヘモグロビン値に到達した貧血患者にヘモグロビン値の維持用法で利用できることを意味する。つまり、４週間隔の投与法の場合、用量選択によって矯正治療法（correction）または維持治療法（maintenance）のいずれも可能であることを意味する。

【0088】

実施例３．ＥＰＯ−ｈｙＦｃ反復投与による体内安全性確認
前記実施例１のようにＥＰＯ−ｈｙＦｃ融合ポリペプチドを各用法に合わせて反復投与した後、患者が訴える臨床的徴候及び症状などを介してＥＰＯ−ｈｙＦｃの反復投与の安全性を確認した。その結果、下記表３に示したように異常反応の発生頻度を確認した。

【0089】

【表3-1】

【0090】

【表3-2】

【0091】

【表3-3】

【0092】

【表3-4】

【0093】

すべての異常反応を医薬品副作用に関する分類体系であるＭｅｄＤＲＡのＰＴ（Preferred Term）ごとに評価した時、最も高い頻度で現れる異常反応は腹膜炎（６人、10.00％）、咳（４人、6.67％）、貧血（４人、6.67％）、鼻咽頭炎（４人、6.67％）、頭痛（４人、6.67％）の順であった。

【0094】

その他ＥＰＯ−ｈｙＦｃ投与と相関関係があると判断された異常薬物反応（ＡＤＲ）は一件も観察されなかった。また、投与量や投与間隔と相関関係があると推定される実験室検査項目だけでなく、理学的検査やバイタルサインには、臨床的に有意であると判断される所見は観察されなかった。

【0095】

慢性腎不全の患者は、一般的に健康状態が良好でない患者群であるという点と、ＥＰＯ-ｈｙＦｃ投与との相関関係が疑われる異常薬物反応（Adverse drug reation）が報告されなかったという点を考慮すると、ＥＰＯ−ｈｙＦｃ投与時の安全性上、特に留意すべき事項は認められなかった。また、異常反応や重大な異常反応の頻度と重症度、実験室的検査所見、理学的検査所見、バイタルサインを観察したとき、投与されたＥＰＯ−ｈｙＦｃの用量や投与間隔は、安全性上に影響を及ぼさないと判断された。

【0096】

これらの結果を総合して見ると、ＥＰＯ-ｈｙＦｃは従来の持続型ＥＰＯ製品Ｎｅｓｐより半減期が長く、異常反応が現れず安全を確認した。つまり、５μｇ／ｋｇ〜８μｇ／ｋｇのＥＰＯ−ｈｙＦｃ融合ポリペプチドを２週〜４週間隔で貧血患者に投与する場合には、従来の持続型ＥＰＯ製品に比べて、より安全でありながら、持続可能な治療剤として有用に使用できることが分かった。

【0097】

以上の説明から、本出願が属する技術分野の当業者は、本出願がその技術的思想や必須の特徴を変更せず、他の具体的な形で実施されることが理解できるだろう。これに関連し、以上で記述した実施例は、すべての面で例示的なものであり、限定的なものではないと理解しなければならない。本出願の範囲は、上記の詳細な説明ではなく、後述する特許請求の範囲の意味及び範囲、そしてその等価概念から導き出されるすべての変更または変形された形態が本出願の範囲に含まれるものと解釈されるべきである。

【図1a】

【図1b】

【図1c】

【図1d】

【図2a】

【図2b】

【図3】

【図4a】

【図4b】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]