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特許6559642ＦＶＩＩＩの特定部位の変更

書誌要約請求の範囲詳細な説明課題実施例実施するための形態図面の説明

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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6559642

(24)【登録日】2019年7月26日

(45)【発行日】2019年8月14日

(54)【発明の名称】ＦＶＩＩＩの特定部位の変更

(51)【国際特許分類】

A61K 38/37 20060101AFI20190805BHJP

A61P 7/04 20060101ALI20190805BHJP

A61K 47/60 20170101ALI20190805BHJP

C07K 19/00 20060101ALN20190805BHJP

C07K 14/755 20060101ALN20190805BHJP

C12N 15/12 20060101ALN20190805BHJP

【ＦＩ】

A61K38/37ZNA

A61P7/04

A61K47/60

!C07K19/00

!C07K14/755

!C12N15/12

【請求項の数】9

【全頁数】49

(21)【出願番号】特願2016-234757(P2016-234757)

(22)【出願日】2016年12月2日

(62)【分割の表示】特願2012-231926(P2012-231926)の分割

【原出願日】2005年11月14日

(65)【公開番号】特開2017-105773(P2017-105773A)

(43)【公開日】2017年6月15日

【審査請求日】2016年12月2日

(31)【優先権主張番号】60/627,277

(32)【優先日】2004年11月12日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】507021757

【氏名又は名称】バイエル・ヘルスケア・エルエルシー

【氏名又は名称原語表記】ＢａｙｅｒＨｅａｌｔｈＣａｒｅＬＬＣ

(74)【代理人】

【識別番号】100114188

【弁理士】

【氏名又は名称】小野誠

(74)【代理人】

【識別番号】100119253

【弁理士】

【氏名又は名称】金山賢教

(74)【代理人】

【識別番号】100124855

【弁理士】

【氏名又は名称】坪倉道明

(74)【代理人】

【識別番号】100129713

【弁理士】

【氏名又は名称】重森一輝

(74)【代理人】

【識別番号】100137213

【弁理士】

【氏名又は名称】安藤健司

(74)【代理人】

【識別番号】100143823

【弁理士】

【氏名又は名称】市川英彦

(74)【代理人】

【識別番号】100151448

【弁理士】

【氏名又は名称】青木孝博

(74)【代理人】

【識別番号】100196483

【弁理士】

【氏名又は名称】川嵜洋祐

(74)【代理人】

【識別番号】100185959

【弁理士】

【氏名又は名称】今藤敏和

(74)【代理人】

【識別番号】100203035

【弁理士】

【氏名又は名称】五味渕琢也

(74)【代理人】

【識別番号】100146318

【弁理士】

【氏名又は名称】岩瀬吉和

(74)【代理人】

【識別番号】100127812

【弁理士】

【氏名又は名称】城山康文

(72)【発明者】

【氏名】クラーク・キユー・パン

(72)【発明者】

【氏名】ジヨン・イー・マーフイー

(72)【発明者】

【氏名】ベイソング・メイ

(72)【発明者】

【氏名】ジヨナサン・エス・ストラウス

(72)【発明者】

【氏名】ヘンドリ・ツアンドラ

(72)【発明者】

【氏名】ジヤンミン・チエン

(72)【発明者】

【氏名】トーマス・バーネツト

(72)【発明者】

【氏名】リアング・タング

(72)【発明者】

【氏名】デキアン・ワング

【審査官】田中晴絵

(56)【参考文献】

【文献】特表平１１−５１３３７８（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２００６−５１９２３８（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開昭５９−１７２４２５（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２００４／０７５９２３（ＷＯ，Ａ１）

【文献】特表平１０−５０６６１０（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開平０１−２２１３９３（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２００３−５２６３５８（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ３８／３７

Ａ６１Ｋ４７／６０

Ｃ０７Ｋ１４／００−１９／００

Ｃ１２Ｎ１５／００−１５／９０

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

治療上有効量の１個もしくは２個の生物適合性ポリマーに共有結合している機能性因子ＶＩＩＩポリペプチドからなる複合体を含む、因子ＶＩＩＩ阻害性抗体を既に発現している患者における血友病の処置のための医薬組成物であって、前記生物適合性ポリマーが、前記因子ＶＩＩＩ阻害性抗体の結合部位か或いは前記因子ＶＩＩＩ阻害性抗体の結合部位から２０オングストローム以内の部位において、前記機能性因子ＶＩＩＩポリペプチドに共有結合しており、生物適合性ポリマーが、ポリエチレングリコールを含む医薬組成物であり、但し、該患者において該因子ＶＩＩＩ阻害性抗体を飽和させる量の該因子ＶＩＩＩを含む医薬組成物を除く、前記医薬組成物。

【請求項2】

ポリエチレングリコールがメトキシポリエチレングリコールを含む、請求項１に記載の医薬組成物。

【請求項3】

メトキシポリエチレングルコールが、３ｋＤから１００ｋＤのサイズ範囲を有する、請求項２に記載の医薬組成物。

【請求項4】

メトキシポリエチレングルコールが、５ｋＤから６４ｋＤのサイズ範囲を有する、請求項２に記載の医薬組成物。

【請求項5】

メトキシポリエチレングルコールが、５ｋＤから４３ｋＤのサイズ範囲を有する、請求項２に記載の医薬組成物。

【請求項6】

複合体への因子ＶＩＩＩ阻害性抗体の結合が、複合されない場合の該ポリペプチドへの該抗体の結合より少ない、請求項１から５のいずれか１に記載の医薬組成物。

【請求項7】

機能性因子ＶＩＩＩポリペプチドが、配列番号３または４のアミノ酸配列を含む、請求項１から５のいずれか１に記載の医薬組成物。

【請求項8】

機能性因子ＶＩＩＩポリペプチドが、配列番号４のアミノ酸配列又はその対立遺伝子変異体を含む、請求項１から５のいずれか１に記載の医薬組成物。

【請求項9】

前記阻害性抗体の結合部位が、配列番号４を参照して４８４−５０８位である、請求項１から５のいずれか１に記載の医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【関連出願へのクロスリファレンス】

【0001】

本出願は、２００４年１１月１２日に申請された米国特許出願第６０／６２７，２７７号明細書への優先権の利益を請求し、その出願は引用することによりその記載事項全体が本明細書の内容となる。

【技術分野】

【0002】

発明の分野
本発明は、規定される部位において１個もしくはそれより多い生物適合性ポリマー、例えばポリエチレングリコールへのカップリングを許す因子ＶＩＩＩ（ＦＶＩＩＩ）突然変異タンパク質に関する。さらに、治療目的のための関連する調製物、投薬物（ｄｏｓａｇｅｓ）及びその投与の方法を提供する。これらの変更されたＦＶＩＩＩ突然変異体ならびに関連する組成物及び方法は、血友病Ａに苦しむ患者のための注入頻度が低下し、且つ免疫原性反応が低下した処置の選択肢を与えるのに有用である。

【背景技術】

【0003】

発明の背景
血友病Ａは最も普通の遺伝性凝固障害であり、５０００人の男性当たり１人の発生率と見積もられる。それは、血液凝固の固有の経路の決定的な構成成分であるＦＶＩＩＩにおける欠失又は構造的欠陥により引き起こされる。血友病Ａのための現在の処置は、ヒトＦＶＩＩＩの静脈内注射を含む。ヒトＦＶＩＩＩは約３００ｋＤの一本鎖分子として組換え的に生産されてきた。それは構造ドメインＡ１−Ａ２−Ｂ−Ａ３−Ｃ１−Ｃ２から成る（非特許文献１）。前駆体生成物はゴルジ装置において２００ｋＤ（重）及び８０ｋＤ（軽）の２つのポリペプチド鎖にプロセシングされ、２つの鎖は金属イオンにより一緒に保持される（非特許文献２；非特許文献３）。

【0004】

ＦＶＩＩＩのＢ−ドメインはＢ−ドメイン欠失ＦＶＩＩＩ（ＢＤＤ，９０ｋＤＡ１−Ａ２重鎖プラス８０ｋＤ軽鎖）として省略可能であると思われ、血友病Ａのための置換療法として有効であることも示された。Ｂ−ドメイン欠失ＦＶＩＩＩ配列は、Ｂ−ドメインの１４個のアミノ酸以外のすべての欠失を含有する。

【0005】

血友病Ａ患者は現在、必要時の、又は１週に数回投与される予防的治療としてのＦＶＩＩＩの静脈内投与により処置される。予防的処置のために、体重のｋｇ当たり１５〜２５ＩＵの因子ＶＩＩＩが１週に３回投与される。患者においてそれは常に必要である。人間におけるＦＶＩＩＩの短い半減期の故に、それは頻繁に投与されねばならない。全長タンパク質の場合の３００ｋＤを超えるその大きなサイズにかかわらず、ＦＶＩＩＩは人間中でわずか約１１時間の半減期を有する。（非特許文献４）。頻繁な静脈内注射の必要性は、患者のコンプライアンスにとってものすごい障壁を作る。より長い半減期を有し、従って必要な投与がより頻繁でないＦＶＩＩＩ製品を開発できたら、それは患者にとってもっと簡便であろう。さらに、半減期が向上したら、その場合はより少ない用量が必要となり得るので、処置の経費を減少させることができる。

【0006】

現在の治療へのさらなる欠点は、患者の約２５〜３０％がＦＶＩＩＩ活性を阻害する抗体を発現することである（非特許文献５）。阻害性抗体の主なエピトープはＡ２ドメイン内で残基４８４−５０８に、Ａ３ドメイン内で残基１８１１−１８１８に、及びＣ２ドメイン内に位置する。抗体発現は置換療法としてのＦＶＩＩＩの使用を妨げ、この群の患者に高い用量の組換え因子ＶＩＩａを用いるさらにもっと高価な処置及び免疫寛容治療（ｉｍｍｕｎｅｔｏｌｅｒａｎｃｅｔｈｅｒａｐｙ）を追求することを強いる。

【0007】

以下の研究は、阻害性抗体のＦＶＩＩＩエピトープを同定した。２５個の阻害性血漿試料の研究において、１１個はトロンビン生成７３ｋＤ軽鎖フラグメントＡ３Ｃ１Ｃ２に、４個はＡ２ドメインに、そして１０個は両方に結合することが見出された（非特許文献６）。別の研究において、患者からの８個のＡ２ドメイン阻害物質（ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ）中の６個は組換えＡ２ポリペプチドにより中和された（非特許文献７）。患者からの９個の阻害物質中の６個に関するエピトープは、Ａ２残基３７９−５３８にマッピングされた（非特許文献８）。１８個の重−鎖阻害物質に関するエピトープは、Ａ２ドメインの同じＮ−末端１８．３ｋＤ領域中に位置決定された（非特許文献９）。

【0008】

ヒトＡ２ドメイン残基３８７−６０４を相同ブタ配列で置換することにより形成される活性な組換えハイブリッドヒト／ブタＦＶＩＩＩ分子は、患者のＡ２阻害物質に抵抗性であり（非特許文献１０）、Ａ２への結合に関して患者のＡ２阻害物質と競合するネズミモノクローナル抗体ｍＡＢ４１３ＩｇＧに抵抗性（非特許文献１１）であった。このＡ２ドメインエピトープはさらに、ｍＡＢ４１３ＩｇＧ及び４個の患者の阻害物質が、Ａ２ドメイン残基４８４−５０８がブタのそれで置換されたハイブリッドヒト／ブタＦＶＩＩＩを阻害しないことを実験が示した時に、Ａ２ドメイン残基４８４−５０８に位置決定された（非特許文献１２）。このハイブリッドＦＶＩＩＩは、スクリーニングされた２３個の患者の血漿の少なくとも半分により抵抗性でもあった（非特許文献１３）。アラニン走査突然変異誘発（ａｌａｎｉｎｅｓｃａｎｎｉｎｇｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）は、試験された５個のすべての患者の阻害物質への結合に関して残基４８７が決定的であるが、残基４８４、４８７、４８９及び４９２はすべてｍＡＢ４１３ＩｇＧとの相互作用に重要であることを同定した（非特許文献１４）。Ｒ４８４Ａ／Ｒ４８９Ａ／Ｐ４９２Ａ突然変異体を与えられるがＲ４８４Ａ／Ｒ４８９突然変異体を与えられないマウスにおける阻害性抗体力価は、標準ヒトＢＤＤＦＶＩＩＩを与えられるマウスにおけるより有意に低かった（非特許文献１５）。要するに、Ａ２ドメインの４８４−５０８領域はＦＶＩＩＩ活性の阻害物質のための結合部位であると思われる。

【0009】

ＦＶＩＩＩに対する免疫反応の出現に加え、通常の治療を用いる別の問題は、生体内におけるＦＶＩＩＩの短い半減期の故にそれが頻繁な投薬を必要とすることである。循環からのＦＶＩＩＩのクリアランスに関する機構が研究された。

【0010】

循環からのＦＶＩＩＩクリアランスは、部分的に低−密度リポタンパク質受容体−関連タンパク質（ＬＲＰ）、広いリガンド特性を有する肝臓クリアランス受容体への特異的な結合に帰せられた（非特許文献１６）。最近、低−密度リポタンパク質（ＬＤＬ）受容体も、例えばＦＶＩＩＩの血漿レベルの調節においてＬＲＰと協働することにより、ＦＶＩＩＩクリアランスにおいて役割を果たすことが示された（非特許文献１７）。両相互作用は、細胞−表面ヘパリン硫酸プロテオグリカン（ＨＳＰＧｓ）に結合することにより助長される。マウスにおける血漿半減期は、ＬＲＰが遮断されると３．３倍に延長され得るか、あるいはＬＲＰ及び細胞−表面ＨＳＰＧｓの両方が遮断されると５．５倍に延長され得る（非特許文献１８）。ＨＳＰＧｓはＦＶＩＩＩを細胞表面上に濃縮し、それをＬＲＰに与えると仮定される。ＦＶＩＩＩ上のＬＲＰ結合部位はＡ２残基４８４−５０９（非特許文献１９）、Ａ３残基１８１１−１８１８（非特許文献２０）及びＣ２ドメイン中のエピトープ（非特許文献２１）に位置決定された。

【0011】

ＦＶＩＩＩはプロテアーゼの作用によっても循環からクリアランスされる。この効果を理解するためには、ＦＶＩＩＩが血液凝固に含まれる機構を理解しなければならない。ＦＶＩＩＩはｖＷＦに結合した重鎖及び軽鎖のヘテロ二量体として循環する。ＶＷＦ結合はＦＶＩＩＩ残基１６４９−１６８９（非特許文献２２）ならびにＣ１（非特許文献２３）及びＣ２ドメイン（非特許文献２４）の一部を含む。ＦＶＩＩＩはトロンビンにより活性
化され、それは残基３７２、７４０及び１６８９の後でペプチド結合を切断し、Ａ１、Ａ２及びＡ３−Ｃ１−Ｃ２ドメインのヘテロ三量体を形成する（非特許文献２５）。ＦＶＩＩＩは、活性化されるとｖＷＦから解離し、リン脂質に結合することにより血小板の細胞表面に濃縮される。リン脂質結合はＦＶＩＩＩ残基２１９９、２２００、２２５１及び２２５２を含む（非特許文献２６）。そこでそれはＦＶＩＩＩ残基５５８−５６５（非特許文献２７）及び１８１１−１８１８（非特許文献２８）との相互作用を介してＦＩＸに、ならびにＦＶＩＩＩ残基３４９−３７２との相互作用を介してＦＸに（非特許文献２９）結合し、固有の凝固経路の必須の成分であるＦＸのＦＩＸ活性化のための補因子として働く。活性化されたＦＶＩＩＩ（ＦＶＩＩＩａ）は、プロテアーゼ活性化タンパク質Ｃ（ＡＰＣ）により、ＦＶＩＩＩ残基３３６及び５６２の後の切断を介して部分的に不活性化される（非特許文献３０）。しかしながら、不活性化の主な決定因子は、Ａ１及びＡ３−Ｃ１−Ｃ２からのＡ２ドメインの解離である（非特許文献３１）。

【0012】

タンパク質の生体内半減期を向上させることが示された１つの方法はＰＥＧ化である。ＰＥＧ化は、タンパク質又は他の分子への長−鎖ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子の共有結合である。ＰＥＧは直鎖状形態又は分枝鎖状形態にあり、種々の特徴を有する種々の分子を形成することができる。ペプチド又はタンパク質の半減期を向上させることの他に、ＰＥＧ化は抗体発現を減少させ、プロテアーゼ消化からタンパク質を保護し、且つ腎臓濾液（ｋｉｄｎｅｙｆｉｌｔｒａｔｅ）の外に材料を保持するために用いられてきた（非特許文献３２）。さらに、ＰＥＧ化はタンパク質の全体的な安定性及び溶解度も向上させることができる。最後に、ＰＥＧ化されたタンパク質の持続的な血漿濃度は、薬剤の谷からピークまでのレベル（ｔｈｅｔｒｏｕｇｈｔｏｐｅａｋｌｅｖｅｌ）を低下させることにより不利な副作用の程度を低下させ、かくして初期の時点にタンパク質の超−生理学的レベルを導入する必要を除去することができる。

【0013】

ＰＥＧ及びデキストランのような大きなポリマーを用いて第１級アミン（Ｎ−末端及びリシン）を標的とすることによるＦＶＩＩＩの無作為な変更は、種々の成功の程度を以って試みられてきた（特許文献１、特許文献２、特許文献３）。１９９４年の特許出願（特許文献１）において公開された最も劇的な進歩は、全−長ＦＶＩＩＩを５０−倍モル過剰のＰＥＧと反応させた後、４−倍の半減期の向上を示すが、２分の１への活性の損失（２−ｆｏｌｄａｃｔｉｖｉｔｙｌｏｓｓ）を犠牲にする。特許文献４は、無作為な変更を介して作られるＦＶＩＩＩとポリエチレングリコールの複合体を開示している。無作為にＰＥＧ化されたタンパク質、例えばインターフェロン−アルファ（非特許文献３３）は、過去に療薬として承認された。

【0014】

しかしながらこの無作為法は、ヘテロ二量体性ＦＶＩＩＩにとってもっとずっと問題が多い。ＦＶＩＩＩは、１５８個のリシン、２個のＮ−末端及び多数のヒスチジン、セリン、トレオニン及びチロシンを含む何百のＰＥＧ化可能な部位を有し、それらのすべてはおそらく主に第１級アミンを標的とする試薬を用いてＰＥＧ化され得る。例えばＰＥＧ化されたインターフェロンアルファ−２ｂに関する主な位置異性体はヒスチジンであることが示された（非特許文献３４）。さらに、全長ＦＶＩＩＩの不均一なプロセシングは出発材料の混合物を生じ得、それはＰＥＧ化された生成物におけるさらなる複雑性に導く。ＰＥＧが決定的な活性部位もしくはその近辺で結合するべき場合、特に１個より多いＰＥＧ又は１個の大きなＰＥＧをＦＶＩＩＩに複合させる場合、ＦＶＩＩＩ上のＰＥＧ化の部位を制御しないさらなる欠点は活性の低下の可能性である。無作為なＰＥＧ化は必ず多量の多重にＰＥＧ化された生成物を生産するので、モノ−ＰＥＧ化生成物のみを得るための精製は全体的収率を非常に低下させるであろう。最後に、生成物分布におけるものすごい不均一性は、各ロットの一貫した合成及び特性化をほとんど不可能にするであろう。優れた製造は一貫した十分に特性化される生成物を必要とするので、生成物の不均一性は商品化への障壁である。これらの理由のすべてのために、ＦＶＩＩＩをＰＥＧ化するためのもっと
特異的な方法が望ましい。

【0015】

種々の特定部位のタンパク質ＰＥＧ化戦略が最近の総説にまとめられている（非特許文献３５）。１つの方法は、化学的合成又は組換え発現によるタンパク質中への不自然なアミノ酸の導入及びそれに続く不自然なアミノ酸と特異的に反応するであろうＰＥＧ誘導体の添加を含む。例えば不自然なアミノ酸は本来のタンパク質中に見出されないケト基を含有するものであることができる。しかしながらタンパク質の化学的合成は、ＦＶＩＩＩのような大きなタンパク質には実行できない。ペプチド合成の現在の限界は約５０個の残基である。数個のペプチドを連結させてもっと大きな１片のポリペプチドを作ることができるが、Ｂ−ドメイン欠失ＦＶＩＩＩを生産することさえ２０回より多い連結を必要とし、それは理想的な反応条件下でさえ１％より低い回収率を生ずる。不自然なアミノ酸を有するタンパク質の組換え発現はこれまで、主に非−哺乳類発現系に限られてきた。この方法は、哺乳類系で発現される必要があるＦＶＩＩＩのような大きく且つ複雑なタンパク質にとって問題が多いと思われる。

【0016】

タンパク質の部位−特異的ＰＥＧ化への他の方法は、ＰＥＧ−アルデヒドを用いてＮ−末端主鎖アミンを標的とすることによる。しかしながら、他のアミン基を超える特異性を達成するためにこの方法の下で必要な低いｐＨは、ＦＶＩＩＩの安定性のために必要な狭い近−中性ｐＨ範囲と適合しない（非特許文献３６）。さらに、ＦＶＩＩＩのＮ−末端ＰＥＧ化は、この領域が血漿クリアランスに含まれない場合、血漿半減期の向上を生ずることができない。事実、ＦＶＩＩＩ軽鎖のＮ−末端領域は、循環中のＦＶＩＩＩ生存のために決定的に重要である担体タンパク質であるフォンビルブラント因子（ｖＷＦ）への結合に関係があるとされてきた。因子ＶＩＩＩのＮ−末端変更により、決定的に重要なｖＷＦとの会合が崩壊するか、又は弱くなり得る。かくしてＦＶＩＩＩのＮ−末端ＰＥＧ化はＦＶＩＩＩの血漿半減期を低下させる反対の効果を有し得る。

【0017】

特許文献５は、システインを挿入するか、又は他のアミノ酸の代わりに置換し、次いでスルフヒドリル反応性基を有するリガンドを加えることによるヒトＩＬ−３、顆粒球コロニー刺激因子及びエリトロポエチンポリペプチドの部位−特異的変更を開示している。リガンドはシステイン残基に選択的にカップリングする。ＦＶＩＩＩ又はその変異体の変更は開示されていない。

【0018】

上記の理由のために、機能的活性を保持しながら生体内におけるより長い作用の持続時間及び低下した免疫原性を有する改良されたＦＶＩＩＩ変異体に対する要求がある。さらに、そのようなタンパク質が一貫したやり方で均一な生成物として生産されるのが望ましい。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0019】

【特許文献1】国際公開第９４／１５６２５号パンフレット

【特許文献2】米国特許第４９７０３００号明細書

【特許文献3】米国特許第６０４８７２０号明細書

【特許文献4】国際公開第２００４／０７５９２３号パンフレット

【特許文献5】国際公開第９０／１２８７４号パンフレット

【非特許文献】

【0020】

【非特許文献1】Ｔｈｏｍｐｓｏｎ著，Ｓｅｍｉｎ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２９，２００３年，１１−２２

【非特許文献2】Ｋａｕｆｍａｎｅｔａｌ．著，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３，１９８８年，ｐ．６３５２

【非特許文献3】Ａｎｄｅｒｓｓｏｎｅｔａｌ．著，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８３，１９８６年，ｐ．２９７９

【非特許文献4】Ｅｗｅｎｓｔｅｉｎｅｔａｌ．著，Ｓｅｍｉｎ，Ｈｅｍａｔｏｌ．４１，２００４年，ｐｐ．１−１６

【非特許文献5】Ｓａｅｎｋｏｅｔａｌ．著，Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉａ８，２００２年，ｐｐ．１−１１

【非特許文献6】Ｆｕｌｃｈｅｒ，Ｃ．ｅｔａｌ．著，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．２（２２），１９８５年，ｐｐ．７７２８−３２

【非特許文献7】Ｓｃａｎｄｅｌｌａ，Ｄ．ｅｔａｌ．著，Ｂｌｏｏｄ８２（６），１９９３年，ｐｐ．１７６７−７５

【非特許文献8】Ｓｃａｎｄｅｌｌａ，Ｄ．ｅｔａｌ．著，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５（１６），１９８８年，ｐｐ．６１５２−６

【非特許文献9】Ｓｃａｎｄｅｌｌａ，Ｄ．ｅｔａｌ．著，Ｂｌｏｏｄ７４（５），１９８９年，ｐｐ．１６１８−２６

【非特許文献10】Ｌｕｂｉｎ，Ｉ．ｅｔａｌ．著，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９（１２），１９９４年，ｐｐ．８６３９−４１

【非特許文献11】Ｓｃａｎｄｅｌｌａ，Ｄ．ｅｔａｌ．著，ＴｈｒｏｍｂＨａｅｍｏｓｔ．６７（６），１９９２年，ｐｐ．６６５−７１

【非特許文献12】Ｈｅａｌｅｙ，Ｊ．ｅｔａｌ．著，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０（２４），１９９５年，ｐｐ．１４５０５−９

【非特許文献13】Ｂａｒｒｏｗ，Ｒ．ｅｔａｌ．著，Ｂｌｏｏｄ９５（２），２０００年，ｐｐ．５６４−８

【非特許文献14】Ｌｕｂｉｎ，Ｉ．著，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（４８），ｐｐ．３０１９１−５

【非特許文献15】Ｐａｒｋｅｒ，Ｅ．ｅｔａｌ．著，Ｂｌｏｏｄ１０４（３），２００４年，ｐｐ．７０４−１０

【非特許文献16】Ｏｌｄｅｎｂｕｒｇｅｔａｌ．著，Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉａ１０Ｓｕｐｐｌ４，２００４年，ｐｐ．１３３−１３９

【非特許文献17】Ｂｏｖｅｎｓｃｈｅｎｅｔａｌ．著，Ｂｌｏｏｄ１０６，２００５年，ｐｐ．９０６−９１０

【非特許文献18】Ｓａｒａｆａｎｏｖｅｔａｌ．著，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６，２００１年，ｐｐ．１１９７０−１１９７９

【非特許文献19】Ｓａｅｎｋｏｅｔａｌ．著，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４，１９９９年，ｐｐ．３７６８５−３７６９２

【非特許文献20】Ｂｏｖｅｎｓｃｈｅｎｅｔａｌ．著，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８，２００３年，ｐｐ．９３７０−９３７７

【非特許文献21】Ｌｅｎｔｉｎｇｅｔａｌ．著，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４，１９９９年，ｐｐ．２３７３４−２３７３９

【非特許文献22】Ｆｏｓｔｅｒｅｔａｌ．著，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３，１９８８年，ｐｐ．５２３０−５２３４

【非特許文献23】Ｊａｃｑｕｅｍｉｎｅｔａｌ．著，Ｂｌｏｏｄ９６，２０００年，ｐｐ．９５８−９６５

【非特許文献24】Ｓｐｉｅｇｅｌ，Ｐ．ｅｔａｌ．著，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９（５１），２００４年，ｐｐ．５３６９１−８

【非特許文献25】Ｐｉｔｔｍａｎｅｔａｌ．著，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．２７６，２００１年，ｐｐ．１２４３４−１２４３９

【非特許文献26】Ｇｉｌｂｅｒｔｅｔａｌ．著，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７，２００２年，ｐｐ．６３７４−６３８１

【非特許文献27】Ｆａｙｅｔａｌ．著，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９，１９９４年，ｐｐ．２０５２２−２０５２７

【非特許文献28】Ｌｅｎｔｉｎｇｅｔａｌ．著，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１，１９９６年，ｐｐ．１９３５−１９４０

【非特許文献29】Ｎｏｇａｍｉｅｔａｌ．著，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９，２００４年，ｐｐ．１５７６３−１５７７１

【非特許文献30】Ｒｅｇａｎｅｔａｌ．著，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１，１９９６年，ｐｐ．３９８２−３９８７

【非特許文献31】Ｆａｙｅｔａｌ．著，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６，１９９１年，ｐｐ．８９５７−８９６２

【非特許文献32】Ｈａｒｒｉｓｅｔａｌ．著，ＣｌｉｎｉｃａｌＰｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ４０，２００１年，ｐｐ．５３９−５１

【非特許文献33】Ｋｏｚｌｏｗｓｋｉｅｔａｌ．著，Ｂｉｏｄｒｕｇｓ１５，２００１年，ｐｐ．４１９−４２９

【非特許文献34】Ｗａｎｇｅｔａｌ．著，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３９，２０００年，ｐｐ．１０６３４−１０６４０

【非特許文献35】Ｋｏｃｈｅｎｄｏｅｒｆｅｒ，Ｇ．著，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２００５，ｏｆＯｃｔ．１５，２００５，ｄｉｒｅｃｔｏｂｊｅｃｔｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｂｐａ．２００５．１０．００７としてオンラインで入手可能）

【非特許文献36】Ｗａｎｇｅｔａｌ．著，ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＪ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ２５９，２００３年，ｐｐ．１−１５

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0021】

本発明の目的は、向上した薬物動態学的特性及び治療的特性を有する生物適合性ポリマー−複合機能性ＦＶＩＩＩポリペプチドを提供することである。

【0022】

本発明の他の目的は、向上した薬物動態学的性質を有する生物適合性ポリマー−複合Ｂドメイン欠失ＦＶＩＩＩタンパク質を提供することである。

【0023】

本発明のさらに別の目的は、低−密度リポタンパク質受容体−関連タンパク質（ＬＲＰ）、低−密度リポタンパク質（ＬＤＬ）受容体、ヘパラン硫酸プロテオグリカン（ＨＳＰＧｓ）及び／又はＦＶＩＩＩに対する阻害性抗体への結合が減少した生物適合性ポリマー−複合機能性ＦＶＩＩＩポリペプチドを提供することである。

【0024】

本発明のさらに別の目的は、生体内におけるより長い作用の持続時間及び低下した免疫原性を有し、一貫したやり方で均一な生成物として生産され得る改良されたＦＶＩＩＩ変異体を提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0025】

本発明の１つの側面において、ポリペプチド上のあらかじめ規定される１個もしくはそれより多い部位において１個もしくはそれより多い生物適合性ポリマーに共有結合した機能性因子ＶＩＩＩポリペプチドを含んでなる因子ＶＩＩＩプロコアグラント活性を有する複合体であって、あらかじめ規定される部位がＮ−末端アミンではない複合体を提供する。本発明は、機能性因子ＶＩＩＩポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を突然変異させてあらかじめ規定される部位においてシステイン残基に関するコード配列に置換し；突然変異したヌクレオチド配列を発現させてシステイン増強突然変異タンパク質を生産し；突然変異タンパク質を精製し；実質的に導入されたシステイン残基のみにおいてポリペプチドと反応するように活性化された生物適合性ポリマーと突然変異タンパク質を反応させて複合体を形成し；そして複合体を精製することを含んでなる、この複合体の調製方法も含む。本発明は、複合体及び製薬学的に許容され得る添加剤を含んでなる製薬学的組成
物ならびに必要のある患者にこれらの製薬学的組成物の治療的に有効な量を投与することによる、血友病の処置方法も目的とする。

【0026】

本発明は、（ａ）特定部位の因子ＶＩＩＩ突然変異タンパク質を発現させ、ここで突然変異タンパク質は因子ＶＩＩＩ突然変異タンパク質の露出された表面上のアミノ酸残基に代わるシステイン置換を有し、且つそのシステインはキャッピングされており；（ｂ）システイン突然変異タンパク質を穏やかに還元し、且つキャップを放出する条件下でシステイン突然変異タンパク質を還元剤と接触させ；（ｃ）システイン突然変異タンパク質からキャップ及び還元剤を除去し；そして（ｄ）還元剤の除去から少なくとも約５分後に、ＰＥＧ化された因子ＶＩＩＩ突然変異タンパク質が生産されるような条件下で、スルフヒドリルカップリング部分を含んでなるＰＥＧでシステイン突然変異タンパク質を処理することを含んでなる、因子ＶＩＩＩ突然変異タンパク質の特定部位のＰＥＧ化のための方法にも関する。

【0027】

図面の簡単な記述
図１．ＰＥＧ突然変異タンパク質のためのベクターマップ及び突然変異誘発戦略。

【0028】

図２．モノクローナルＦＶＩＩＩ抗体クロマトグラフィーカラム上で精製されたＰＥＧ２タンパク質の場合の、時間に関する２８０ｎｍにおけるＵＶ吸光度分布。クロマトグラフィーは、ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅからのＡＫＴＡ^R Ｅｘｐｌｏｒｅｒ１００クロマトグラフィーシステムを用いて行なわれた。

【0029】

図３．３−段階特定部位ＰＥＧ化法。ＰＥＧはＰＥＧ−マレイミドのようなシステイン−反応性ＰＥＧを示す。閉じられた棒はジスルフィド形成を示し、開放された棒は還元されたシステインを示す。

【0030】

図４．ＰＥＧ２の特定部位のＰＥＧ化。

【0031】

図５．ＰＥＧ６の特定部位のＰＥＧ化。

【0032】

図６ａ．ＢＤＤ、ＰＥＧ２、４、５及び６の特定部位のＰＥＧ化。上のパネルは重（Ｈ）鎖抗体で染色され、下のパネルは軽（Ｌ）鎖抗体で染色された。“Ｕ”はＨ及びＬの両方を含有するプロセシングされない材料である。

【0033】

図６ｂ．ＰＥＧ２及びＰＥＧ６を標準として用いるＰＥＧ１５及びＰＥＧ７のＰＥＧ化。ＴＣＥＰを用いて開始精製ＰＥＧ突然変異タンパク質（“Ｓ”）を還元し、還元剤（“Ｒ”）の除去の後に１２ｋＤ（“１２”）又は２２ｋＤ（“２２”）ＰＥＧを用いてＰＥＧ化する。試料を６％Ｔｒｉｓ−グリシンＳＤＳＰＡＧＥ上で移動させ、左のパネル上で重鎖（“ＨＣ”）抗体又は右のパネル上で軽鎖（“ＬＣ”）抗体を用いて染色した。“Ｕ”はＨＣ及びＬＣの両方を含有するプロセシングされない材料である。ＰＥＧ化されたバンドを点により強調する。

【0034】

図６ｃ．ＰＥＧ２及びＰＥＧ６を標準として用いるＰＥＧ２＋６のＰＥＧ化。ＴＣＥＰを用いてＰＥＧ２、ＰＥＧ６又はＰＥＧ２＋６を還元し、還元剤（“Ｒ”）の除去の後に５ｋＤ（“５”）又は４３ｋＤ（“４３”）ＰＥＧを用いてＰＥＧ化する。１２、２２及び３３ｋＤＰＥＧｓを用いてもＰＥＧ２＋６をＰＥＧ化した。試料を６％Ｔｒｉｓ−グリシンＳＤＳＰＡＧＥ上で移動させ、左でタンパク質に関してクーマシーを用いて、あるいは重鎖（Ｈ）又は軽鎖（Ｌ）抗体を用いて染色した。“Ｕ”はＨ及びＬの両方を含有するプロセシングされない材料である。ＰＥＧ化されたバンドを点により強調する。

【0035】

図６ｄ．ＰＥＧ２を標準として用いる野生型全長ＦＶＩＩＩ（ＫＧ−２）のＰＥＧ化。左のゲルをタンパク質に関してクーマシー染色を用いて染色し、右のゲルをＰＥＧに関してヨウ素を用いて染色した。“ＢＤＤＵ”はＨ及びＬの両方を含有するプロセシングされないＢＤＤ材料である。ＰＥＧ化されたバンドを点により強調する。

【0036】

図７．ＰＥＧ化されたＰＥＧ２のトロンビン切断。Ａ２ドメインのＮ−末端半分を青く着色し、Ｃ−末端半分を緑に着色し、Ｒ８Ｂ１２抗体エピトープを暗緑色に強調した（右ＦＶＩＩＩモデル）。ＰＥＧ２（列１）及び２２ｋＤＰＥＧ化ＰＥＧ２（列２）をトロンビンで処理し（それぞれ列３及び４）、次いで７％Ｔｒｉｓ−アセテートゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上で移動させ、Ｒ８Ｂ１２抗体で染色した。各列は約５０ｎｇのＦＶＩＩＩを含有する。

【0037】

図８．ＰＥＧ化された野生型全長ＦＶＩＩＩ（ＫＧ−２）のトロンビン切断。“Ｓ”＝出発ＫＧ−２材料。“Ｒ”＝還元されたＫＧ−２及び除去された還元剤。“Ｐ”＝４３ｋＤＰＥＧを用いてＰＥＧ化された“Ｒ”。“Ｐｕｒｅ”＝過剰のＰＥＧから精製された“Ｐ”。“Ｌ”＝軽鎖。ＰＥＧ化されたバンドを点により強調する。

【0038】

図９．ＰＥＧ化されたＰＥＧ２のヨウ素染色。２２又は４３ｋＤＰＥＧ化ＰＥＧ２を６％Ｔｒｉｓグリシンゲル上で移動させ、Ｒ８Ｂ１２ＦＶＩＩＩ抗体（列１及び２）又はヨウ素（列３及び４）を用いて染色した。２つの染色をそれらの分子量マーカーの列に従って整列させた。列１及び２はそれぞれ約３０ｎｇのＦＶＩＩＩを含有するが、列３及び４は約２μｇを含有する。

【0039】

図１０．ＰＥＧ化及び非ＰＥＧ化ＰＥＧ２のＭＡＬＤＩ質量分析。ＭＡＬＤＩ質量分析はＰＥＧ２（図１０ａ）又は２２ｋＤＰＥＧ化ＰＥＧ２（図１０ｂ）について行なわれた。ＰＥＧ化されると、ＰＥＧ２の重（Ｈ）鎖ピークは非常に減少し、１１１ｋＤ（２２ｋＤＰＥＧ＋８９ｋＤ重鎖）を中心とする新しいピーク（Ｈ＋ＰＥＧ）が現れる。１００ｋＤ（２２ｋＤＰＥＧ＋８３ｋＤ軽鎖）を中心とすることが予測されるＰＥＧ化された軽（Ｌ）鎖のピークは検出されない。

【0040】

図１１．トロンビン切断の後のＰＥＧ化及び非ＰＥＧ化ＰＥＧ２のＭＡＬＤＩ質量分析。

【0041】

図１２．トロンビン切断の前後のＰＥＧ化ＰＥＧ６のＭＡＬＤＩ質量分析。

【0042】

図１３．サイズ−排除カラム上で精製されたＰＥＧ化ＰＥＧ２の２８０ｎｍにおけるＵＶ吸収分布。

【0043】

図１４．カチオン交換カラム上で精製されたＰＥＧ化及び非ＰＥＧ化ＰＥＧ６の２８０ｎｍにおけるＵＶ吸収分布。

【0044】

図１５．サイズ−排除カラム上で精製されたＰＥＧ化及び非ＰＥＧ化ＰＥＧ６の２８０ｎｍにおけるＵＶ吸収分布。

【0045】

図１６．発色アッセイ及び凝固アッセイにより測定される場合のＰＥＧ化タンパク質の活性を非ＰＥＧ化タンパク質の活性と比較する。精製された全長ＦＶＩＩＩをＫＧ−２と示す。報告されるパーセント活性は、還元及び還元剤の除去後にＰＥＧで処理された試料の値を、ＰＥＧ化の収率を考慮しながら緩衝液標準で処理された試料の値で割ることにより決定された。

【0046】

図１７．ＰＥＧ２と比較されるＰＥＧ化ＰＥＧ２のウサギＰＫ研究。

【0047】

図１８．ＢＤＤ及びＰＥＧ２と比較されるＰＥＧ化ＰＥＧ２のウサギＰＫ研究。Ｐ−値はＰＥＧ化ＰＥＧとＢＤＤの間の比較である。

【0048】

図１９．ＢＤＤ及びＰＥＧ６と比較されるＰＥＧ化ＰＥＧ６のウサギＰＫ研究。

【0049】

図２０．非変更全長ＦＶＩＩＩと比較されるＰＥＧ化野生型全長（“ｆｌ”）ＦＶＩＩＩのウサギＰＫ研究。

【0050】

図２１．ＰＥＧ６及びＢＤＤと比較されるＰＥＧ化ＰＥＧ６の血友病マウスＰＫ研究。

【0051】

図２２．ＢＤＤと比較される２２及び４３ｋＤＰＥＧ化ＰＥＧ２の正常マウスＰＫ研究。

【0052】

図２３．時間経過中ずっと（ｆｕｌｌｔｉｍｅｃｏｕｒｓｅ）、ＢＤＤと比較される２２ｋＤＰＥＧ化ＰＥＧ２の正常マウスＰＫ研究。

【0053】

図２４．血友病マウスアッセイにおけるＢＤＤ因子ＶＩＩＩの２つの種の半減期の薬物動態学的（ＰＫ）評価を描く、血友病マウス（ＢＤＤ）因子ＶＩＩＩ回収率ヒストグラム。

【0054】

図２５．ＢＤＤと比較される２２ｋＤＰＥＧ化ＰＥＧ２の血友病マウス腎臓裂傷研究。ビヒクル処置されたマウスは体重のグラム当たり２５ｕＬの血液損失を有する。

【0055】

図２６．増加する量のＦＶＩＩＩ抗体の存在下におけるＰＥＧ化ＰＥＧ２及びＢＤＤの発色活性。抗体エピトープを括弧内に示す。

【0056】

図２７．増加する量のＦＶＩＩＩｍＡＢ４１３抗体の存在下におけるＰＥＧ化ＰＥＧの発色活性。

【0057】

図２８．ＦＶＩＩＩへの阻害物質を発現した患者に由来するヒト血漿の存在下におけるＢＤＤ、４３ｋＤＰＥＧ化ＰＥＧ２、３３ｋＤＰＥＧ化ＰＥＧ６及び３３ｋＤジＰＥＧ化ＰＥＧ２＋６の発色活性。阻害物質の力価及び血液収集の日付を上に記す。上の２つのパネルは、５−〜４０５−倍の患者血漿希釈において集められたデータを含む。下の左のパネルは、患者ＨＲＦ−８２８血漿に関する１：１５−倍希釈に焦点を当てている。下の右のパネルは、上の２つのパネルにおいて各ＦＶＩＩＩ試料のために用いられた０．０６４ＩＵ／ｍＬが飽和用量でなかったことを確証する。

【0058】

図２９．ＰＥＧ化スクリーニング法及び正当化。上のパネルは、一過的に発現されるＰＥＧ突然変異タンパク質のＰＥＧ化スクリーニングの略図を示す。下のパネルは、重鎖（“Ｈ”）−特異的抗体（左）又は軽−鎖（“Ｌ”）特異的抗体（右）を用いるＰＥＧ化生成物のウェスタン分析を示す。ＰＥＧ化されたバンドを点により強調する。“Ｕ”はＨ及びＬの両方を含有するプロセシングされない材料である。

【0059】

図３０．ＰＥＧ１５〜１７のＰＥＧ化スクリーニング。重鎖（“Ｈ”）−特異的抗体（Ｒ８Ｂ１２及び５８．１２）又は軽−鎖（“Ｌ”）特異的抗体（Ｃ７Ｆ７及びＧＭ）を用いるＰＥＧ化生成物のウェスタン分析。３つのすべての突然変異タンパク質は重鎖に関して選択的であり、ＰＥＧ１５−ＰＥＧ１６＞ＰＥＧ１７の相対的なＰＥＧ化効率を有する。ＰＥＧ化されたバンドを点により強調する。“Ｕ”はＨ及びＬの両方を含有するプロセ
シングされない材料である。

【0060】

図３１．還元剤濃度の関数としてＰＥＧ２＋１４のＰＥＧ化を示すゲル。ＰＥＧ２＋１４を４℃において３０分間、６７〜６７０ｕＭのＴＣＥＰを用いて処理した。スピン−カラム（ｓｐｉｎ−ｃｏｌｕｍｎ）により還元剤を除去し、続いて１２ｋＤＰＥＧを用いてＰＥＧ化した。ＦＶＩＩＩの重及び軽鎖をそれぞれ“Ｈ”及び“Ｌ”により強調する。２つの点はＰＥＧ化された重及び軽鎖を指し示す。

【0061】

図３２．６７〜６７０ｕＭのＴＣＥＰで処理され、続いて還元剤が除去されたＰＥＧ２＋１４のデコンボリューションされた質量スペクトル。

【発明を実施するための形態】

【0062】

発明の詳細な記述
本発明は、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをあらかじめ規定される部位において生物適合性ポリマーに共有結合させることができ、それはＮ−末端アミンにおいてではなく、且つそのようなポリペプチドは実質的にそれらの凝固剤活性を保持しているという発見に基づく。さらに、これらのポリペプチド複合体は増加した循環時間及び低下した抗原性を有する。本発明の複合体は、ＦＶＩＩＩへの無作為ポリマー結合又はＮ−末端における結合を有した先行技術の複合体を超えて有利である。特定部位の結合は、生物学的活性のために必要な領域を避ける変更を設計し、それにより実質的なＦＶＩＩＩ活性を保持することを可能にする。それは、ポリマーを結合させてＦＶＩＩＩクリアランスに含まれる部位において結合を遮断するように設計することも可能にする。特定部位の結合は、無作為なポリマーカップリングによる技術において生産される不均一な複合体ではなくて均一な生成物も可能にする。軽鎖のＮ−末端アミンにおける結合を避けることにより、本発明の複合体は、ＦＶＩＩＩポリペプチドの活性部位におけるリガンドの結合から可能な活性の損失を避ける。軽鎖のＮ−末端領域は、ｖＷＦ因子のＦＶＩＩＩへの会合に含まれると思われ、それは循環における安定化会合である。

【0063】

定義
生物適合性ポリマー。生物適合性ポリマーにはポリアルキレンオキシド、例えばこれらに限られないがポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、デキストラン、コロミン酸又は他の炭水化物に基づくポリマー、アミノ酸のポリマー、ビオチン誘導体、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリカルボキシレート、ポリビニルピロリドン、ポリエチレン−コ−無水マレイン酸、ポリスチレン−コ−無水リンゴ酸、ポリオキサゾリン、ポリアクリロイルモルホリン、ヘパリン、アルブミン、セルロース、キトサンの加水分解産物、デンプン、例えばヒドロキシエチル−デンプン及びヒドロキシプロピル−デンプン、グリコゲン、アガロース及びその誘導体、グアゴム、プルラン、イヌリン、キサンタンゴム、カラゲナン、ペクチン、アルギン酸加水分解産物、他の生体高分子ならびにそれらの同等物が含まれる。好ましいのはポリエチレングリコールであり、さらにもっと好ましくはメトキシポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）である。他の有用なポリアルキレングリコール化合物はポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）、ポリブチレングリコール（ＰＢＧ）、ＰＥＧ−グリシジルエーテル（Ｅｐｏｘ−ＰＥＧ）、ＰＥＧ−オキシカルボニルイミダゾール（ＣＤＩ−ＰＥＧ）、分枝鎖状ポリエチレングリコール、直鎖状ポリエチレングリコール、フォーク状ポリエチレングリコール（ｆｏｒｋｅｄｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌｓ）及び多−分枝もしくは「超分枝鎖状」ポリエチレングリコール（ｓｔａｒ−ＰＥＧ）である。

【0064】

ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）。本明細書で用いられる「ＰＥＧ」及び「ポリエチレングリコール」は互換性であり、いずれの水溶性ポリ（エチレンオキシド）も含む。典型的には、本発明に従う使用のためのＰＥＧｓは以下の構造、「−（ＯＣＨ₂ＣＨ₂）_n−
」を含み、ここで（ｎ）は２〜４０００である。本明細書で用いられる場合、ＰＥＧは、末端酸素が置き換えられているかもしくはいないかに依存して、「−ＣＨ₂ＣＨ₂−Ｏ（ＣＨ₂ＣＨ₂Ｏ）_n−ＣＨ₂ＣＨ₂−」及び「−（ＯＣＨ₂ＣＨ₂）_nＯ−」も含む。明細書及び請求項全体を通じて、「ＰＥＧ」という用語は種々の末端もしくは「末端キャッピング」基、例えば制限ではないがヒドロキシル又はＣ_1-20アルコキシ基を有する構造を含むことを思い出さねばならない。「ＰＥＧ」という用語は、大部分、すなわち５０％より多くの−ＯＣＨ₂ＣＨ₂−繰り返しサブユニットを含有するポリマーも意味する。特定の形態に関し、ＰＥＧは、多様な分子量ならびに構造又は形状、例えば分枝鎖状、直鎖状、フォーク状及び多官能基性のいくつを帯びることもできる。

【0065】

ＰＥＧ化。ＰＥＧ化は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）がタンパク質のような分子に共有結合する過程である。

【0066】

活性化もしくは活性官能基。生物適合性ポリマーのような官能基が活性化されたと記述される場合、官能基は他の分子上の求電子基（ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｉｌｅ）又は求核基（ｎｕｃｌｏｅｐｈｉｌｅ）と容易に反応する。

【0067】

Ｂドメイン欠失ＦＶＩＩＩ（ＢＤＤ）。本明細書で用いられる場合、ＢＤＤは、ＦＶＩＩＩのＢ−ドメインの１４個のアミノ酸以外のすべての欠失を含有するアミノ酸配列を有することを特徴とする。Ｂ−ドメインの最初の４個のアミノ酸（ＳＦＳＱ，配列番号：１）はＢ−ドメインの最後の１０個の残基（ＮＰＰＶＬＫＲＨＱＲ，配列番号：２）に連結している。（Ｌｉｎｄ，Ｐ．ｅｔａｌ．著，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２３２，１９９５年，ｐｐ．１９−２７）。本明細書で用いられるＢＤＤは配列番号：３のアミノ酸配列を有する。

【0068】

ＦＶＩＩＩ。血液凝固因子ＶＩＩＩ（ＦＶＩＩＩ）は、肝臓により合成されて血流中に放出される糖タンパク質である。循環血中で、それはフォンビルブラント因子（ｖＷＦ、因子ＶＩＩＩ−関連抗原としても既知）に結合して、安定な複合体を形成する。トロンビンにより活性化されると、それは複合体から解離し、凝固カスケードにおいて他の凝固因子と相互作用し、それは結局血栓の形成を生ずる。ヒト全長ＦＶＩＩＩは配列番号：４のアミノ酸配列を有するが、対立遺伝子変異体が可能である。

【0069】

機能性因子ＶＩＩＩポリペプチド。本明細書で用いられる場合、機能性因子ＶＩＩＩポリペプチドは、生体内もしくは試験管内で、例えば血友病Ａにより特徴付けられるヒト因子ＶＩＩＩ欠失を修正することができる機能性ポリペプチド又はポリペプチドの組み合わせを示す。因子ＶＩＩＩは自然の状態で複数の分解もしくはプロセシング形態を有する。これらは本明細書で示される通り、１個の鎖状タンパク質（ｏｎｅｃｈａｉｎｐｒｏｔｅｉｎ）である前駆体からタンパク質分解的に誘導される。機能性因子ＶＩＩＩポリペプチドはそのような１個の鎖状タンパク質を含み、且つヒト因子ＶＩＩＩ欠失を修正する生物学的活性を有するこれらの種々の分解産物も示す。対立遺伝子変異がおそらく存在する。機能性因子ＶＩＩＩポリペプチドは、因子ＶＩＩＩの誘導体を生ずるそのような対立遺伝子変異、グリコシル化形、変更及びフラグメントのすべてを、それらがヒト因子ＶＩＩＩの機能性セグメントを含有し、必須の特徴的なヒト因子ＶＩＩＩ機能的活性が本質的に留まっている限り含む。必要な機能的活性を保有する因子ＶＩＩＩの誘導体は、本明細書に記載される直接的な試験管内試験により容易に同定され得る。さらに、機能性因子ＶＩＩＩポリペプチドは、因子ＩＸａ、カルシウム及びリン脂質の存在下で因子ＸのＸａへの転換を触媒することができ、ならびに血友病Ａに冒された患者に由来する血漿における凝固欠陥を修正することができる。本明細書におけるヒト因子ＶＩＩＩアミノ酸配列及び機能性領域の配列の開示から、ＤＮＡの制限酵素切断を介して、あるいはヒト因子ＶＩＩＩタンパク質のタンパク質分解的もしくは他の分解を介して誘導され得るフラグメントは
、当該技術分野における熟練者に明らかになるであろう。

【0070】

ＦＩＸ。本明細書で用いられる場合、ＦＩＸは凝固因子ＩＸを意味し、それはヒト凝固因子ＩＸ又は血漿トロンボプラスチン成分としても既知である。

【0071】

ＦＸ。本明細書で用いられる場合、ＦＸは凝固因子Ｘを意味し、それはヒト凝固因子Ｘの名前及び名祖（ｅｐｏｎｙｍ）Ｓｔｕａｒｔ−Ｐｒｏｗｅｒ因子によっても既知である。

【0072】

薬物動態学。「薬物動態学」（「ＰＫ」）は、体内における薬剤の吸収、分布、代謝及び除去の性質を記述するために用いられる用語である。薬剤の薬物動態学の向上は、薬剤を生体内で治療薬としてより有効にする特性、特に体内におけるその有用な持続時間における向上を意味する。

【0073】

突然変異タンパク質。突然変異タンパク質は、タンパク質又はポリペプチドへの実験室誘導突然変異の結果として生ずる遺伝子操作されたタンパク質である。

【0074】

タンパク質。本明細書で用いられる場合、タンパク質とポリペプチドは同義語である。

【0075】

ＦＶＩＩＩクリアランス受容体。本明細書で用いられるＦＶＩＩＩクリアランス受容体は、１種もしくはそれより多い他の分子と結合又は会合して循環からのＦＶＩＩＩクリアランスを生ずる機能性ＦＶＩＩＩポリペプチド上の受容体領域を意味する。因子ＶＩＩＩクリアランス受容体には、制限ではないがＬＲＰ、ＬＤＬ受容体及び／又はＨＳＰＧに結合するＦＶＩＩＩ分子の領域が含まれる。

【0076】

議論
本発明の方法に従い、いずれの機能性因子ＶＩＩＩポリペプチドもあらかじめ決められた部位で突然変異させ、次いでその部位において生物適合性ポリマーに共有結合させることができると考えられる。有用なポリペプチドには、配列番号：４に示されるアミノ酸配列を有する全長因子ＶＩＩＩ及び配列番号：３に示されるアミノ酸配列を有するＢＤＤＦＶＩＩＩが含まれるが、これらに限られない。好ましいのはＢＤＤＦＶＩＩＩである。

【0077】

本発明の複合体において用いられる生物適合性ポリマーは、上記のポリマーのいずれであることもできる。生物適合性ポリマーは、薬物動態学における所望の向上を与えるように選ばれる。例えばポリマーの正体、サイズ及び構造は、活性における許容され得ない低下なしでＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドの循環半減期を向上させるように、あるいはポリペプチドの抗原性を低下させるように選ばれる。好ましくは、ポリマーはＰＥＧを含み、さらにもっと好ましくはその分子量の少なくとも５０％をＰＥＧとして有する。１つの態様において、ポリマーは末端−キャッピング部分、例えばヒドロキシル、アルコキシ、置換アルコキシ、アルケノキシ、置換アルケノキシ、アルキノキシ、置換アルキノキシ、アリールオキシ及び置換アリールオキシで末端がキャッピングされたポリエチレングリコールである。さらにもっと好ましいのは、メトキシポリエチレングリコールを含んでなるポリマーである。さらにもっと好ましいのは、３ｋＤ〜１００ｋＤ、そしてより好ましくは５ｋＤ〜６４ｋＤ又は５ｋＤ〜４３ｋＤのサイズ範囲を有するメトキシポリエチレングリコールを含んでなるポリマーである。

【0078】

好ましくは、ポリマーは反応性部分を有する。例えば１つの態様において、ポリマーはスルフヒドリル反応性部分を有し、それは機能性因子ＶＩＩＩポリペプチド上の遊離のシステインと反応して共有結合を形成することができる。そのようなスルフヒドリル反応性
部分にはチオール、トリフレート、トレシレート、アジリジン、オキシラン、Ｓ−ピリジル又はマレイミド部分が含まれる。好ましいのはマレイミド部分である。１つの態様において、ポリマーは直鎖状であり、一方の末端にスルフヒドリルに対して強く反応性でない「キャップ」（例えばメトキシ）を、且つ他方の末端にスルフヒドリル反応性部分を有する。好ましい態様において、複合体はＰＥＧ−マレイミドを含み、５ｋＤ〜６４ｋＤのサイズ範囲を有する。

【0079】

有用な生物適合性ポリマーの選択のためのさらなる指針は、下記の実施例に示される。

【0080】

ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の特定部位の突然変異は、当該技術分野において既知のいずれの方法によっても起こり得る。好ましい方法は、ポリマーの共有結合のために選ばれる部位にシステインコドンを導入するための突然変異誘発を含む。これは、商業的に入手可能な特定部位の突然変異誘発キット、例えばＳｔｒａｔａｇｅｎｅｃＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ^TM ＩＩ特定部位の突然変異誘発キット、ＣｌｏｎｔｅｃｈＴｒａｎｓｆｏｒｍｅｒ特定部位の突然変異誘発キットｎｏ．Ｋ１６００−１、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＧｅｎＴａｙｌｏｒ特定部位の突然変異誘発システムｎｏ．１２３９７０１４、ＰｒｏｍｅｇａＡｌｔｅｒｅｄＳｉｔｅｓＩＩ試験管内突然変異誘発システムキットｎｏ．Ｑ６２１０又はＴａｋａｒａＭｉｒｕｓ
ＢｉｏＬＡＰＣＲ突然変異誘発キットｎｏ．ＴＡＫＲＲ０１６を用いて行なうことができる。

【0081】

最初に機能性ＦＶＩＩＩポリペプチドの表面上の１個もしくはそれより多いアミノ酸に関するコドンをシステインに関するコドンで置換して組換え発現系においてシステイン突然変異タンパク質を生産し、突然変異タンパク質をシステイン−特異的ポリマー試薬と反応させ、突然変異タンパク質を精製することにより、本発明の複合体を調製することができる。

【0082】

この系において、システイン部位におけるポリマーの付加は、ポリマー上のマレイミド活性官能基を介して行なうことができる。この方法の例を下記に示す。用いられるスルフヒドリル反応性ポリマーの量は、誘導体化されるべきシステインのモル量に少なくとも等モル量でなければならず、好ましくは過剰に存在する。好ましくは、少なくとも５−倍モル過剰のスルフヒドリル反応性ポリマーが用いられ、さらにもっと好ましくは、少なくとも１０−倍過剰のそのようなポリマーが用いられる。共有結合に有用な他の条件は、当該技術分野における者の熟練の範囲内である。

【0083】

下記の実施例において、突然変異タンパク質は当該技術分野において通常の方法で命名される。突然変異体の命名のための約定（ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ）は、配列番号：４に示される成熟全長因子ＶＩＩＩに関するアミノ酸配列に基づく。分泌タンパク質として、ＦＶＩＩＩは翻訳過程の間にタンパク質分解により切断されるシグナル配列を含有する。１９個のアミノ酸のシグナル配列の除去に続き、分泌されるＦＶＩＩＩ生成物の最初のアミノ酸はアラニンである。

【0084】

通常であり且つ本明細書で用いられる通り、ＢＤＤＦＶＩＩＩ中の突然変異アミノ酸に言及する場合、突然変異アミノ酸は全長ＦＶＩＩＩの配列中のその位置により称される。例えば下記で議論されるＰＥＧ６突然変異タンパク質はＫ１８０８Ｃと称され、それは、それが全長配列中の１８０８に類似の位置においてリシン（Ｋ）がシステイン（Ｃ）に変更されているからである。

【0085】

ポリマーの共有結合のためにあらかじめ規定される部位は、ＦＶＩＩＩ活性に含まれないか、又は生体内でＦＶＩＩＩを安定化する他の機構、例えばｖＷＦへの結合に含まれな
い、ポリペプチドの表面上に露出されている部位から最適に選ばれる。そのような部位は、ＦＶＩＩＩが不活性化されるか、又は循環からクリアランスされる機構に含まれることが知られている部位からも最適に選ばれる。これらの部位の選択は、下記で詳細に議論される。好ましい部位には、（ａ）低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質、（ｂ）ヘパリン硫酸プロテオグリカン、（ｃ）低密度リポタンパク質受容体及び／又は（ｄ）因子ＶＩＩＩ阻害性抗体に関する結合部位内もしくはそれらの近辺のアミノ酸残基が含まれる。「結合部位内もしくはそれらの近辺」により、結合部位に十分に近く、部位への生物適合性ポリマーの共有結合が結合部位の立体障害を生ずるであろう残基を意味する。そのような部位は、例えば結合部位の２０Å以内であると思われる。

【0086】

本発明の１つの態様において、生物適合性ポリマーは（ａ）上記で定義された因子ＶＩＩＩクリアランス受容体、（ｂ）因子ＶＩＩＩを分解することができるプロテアーゼのための結合部位及び／又は（ｃ）因子ＶＩＩＩ阻害性抗体のための結合部位内又はそれらの近辺のアミノ酸残基において機能性因子ＶＩＩＩポリペプチドに共有結合する。プロテアーゼは活性化タンパク質Ｃ（ＡＰＣ）であることができる。他の態様において、生物適合性ポリマーは機能性因子ＶＩＩＩポリペプチド上のあらかじめ規定される部位において共有結合し、ポリペプチドへの低−密度リポタンパク質受容体関連タンパク質の結合は、ポリペプチドが複合されない場合のそれへの結合より少なく、好ましくは２分の１より少ない。１つの態様において、生物適合性ポリマーは機能性因子ＶＩＩＩポリペプチド上のあらかじめ規定される部位において共有結合し、ヘパリン硫酸プロテオグリカンのポリペプチドへの結合は、ポリペプチドが複合されない場合のそれへの結合より少なく、好ましくは２分の１より少ない。さらに別の態様において、生物適合性ポリマーは機能性因子ＶＩＩＩポリペプチド上のあらかじめ規定される部位において共有結合し、因子ＶＩＩＩ阻害性抗体のポリペプチドへの結合は、ポリペプチドが複合されない場合のそれへの結合より少なく、好ましくはポリペプチドが複合されない場合のそれへの結合の２分の１より少ない。別の態様において、生物適合性ポリマーは機能性因子ＶＩＩＩポリペプチド上のあらかじめ規定される部位において共有結合し、低密度リポタンパク質受容体のポリペプチドへの結合は、ポリペプチドが複合されない場合のそれへの結合より少なく、好ましくは２分の１より少ない。別の態様において、生物適合性ポリマーは機能性因子ＶＩＩＩポリペプチド上のあらかじめ規定される部位において共有結合し、血漿プロテアーゼがポリペプチドを分解する程度は、ポリペプチドが複合されない場合より低い。さらに別の態様において、血漿プロテアーゼによるポリペプチドの分解は、同じ条件下で同じ時間に及んで測定される場合に、ポリペプチドが複合されない場合のその分解の２分の１より少ない。

【0087】

ＦＶＩＩＩに関するＬＲＰ、ＬＤＬ受容体又はＨＳＰＧ結合親和性は、表面プラスモン共鳴法（Ｂｉａｃｏｒｅ）を用いて決定することができる。例えばＦＶＩＩＩを直接又はＦＶＩＩＩ抗体を介して間接的にＢｌａｃｏｒｅ^TMチップにコーティングし、種々の濃度のＬＲＰをチップ上に通過させて相互作用の開始速度（ｏｎ−ｒａｔｅ）及び終了速度（ｏｆｆ−ｒａｔｅ）の両方を測定することができる（ＢｏｖｅｎｓｃｈｅｎＮ．ｅｔａｌ．著，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８（１１），２００３年，ｐｐ．９３７０−７）。２つの速度の比率は親和性の尺度を与える。ＰＥＧ化した場合の２分の１、好ましくは５分の１、より好ましくは１０分の１、そしてさらにもっと好ましくは３０分の１への親和性における低下が望ましい。

【0088】

プロテアーゼＡＰＣによるＦＶＩＩＩの分解は、当該技術分野における熟練者に既知のいずれの方法によっても測定することができる。

【0089】

１つの態様において、生物適合性ポリマーは因子ＶＩＩＩアミノ酸位置８１、１２９、３７７、３７８、４６８、４８７、４９１、５０４、５５６、５７０、７１１、１６４８、１７９５、１７９６、１８０３、１８０４、１８０８、１８１０、１８６４、１９０３
、１９１１、２０９１、２１１８及び２２８４の１個もしくはそれより多くにおいてポリペプチドに共有結合する。別の態様において、生物適合性ポリマーは因子ＶＩＩＩアミノ酸位置３７７、３７８、４６８、４９１、５０４、５５６、１７９５、１７９６、１８０３、１８０４、１８０８、１８１０、１８６４、１９０３、１９１１及び２２８４の１個もしくはそれより多くにおいてポリペプチドに共有結合し、且つ（１）低−密度リポタンパク質受容体関連タンパク質への複合体の結合は低−密度リポタンパク質受容体関連タンパク質への非複合ポリペプチドの結合より少ないか；（２）低−密度リポタンパク質受容体への複合体の結合は低−密度リポタンパク質受容体への非複合ポリペプチドの結合より少ないか；あるいは（３）低−密度リポタンパク質受容体関連タンパク質及び低−密度リポタンパク質受容体の両方への複合体の結合は低−密度リポタンパク質受容体関連タンパク質及び低−密度リポタンパク質受容体への非複合ポリペプチドの結合より少ない。

【0090】

さらに別の態様において、生物適合性ポリマーは因子ＶＩＩＩアミノ酸位置３７７、３７８、４６８、４９１、５０４、５５６及び７１１の１個もしくはそれより多くにおいてポリペプチドに共有結合し、且つヘパリン硫酸プロテオグリカンへの複合体の結合はヘパリン硫酸プロテオグリカンへの非複合ポリペプチドの結合より少ない。さらに別の態様において、生物適合性ポリマーは因子ＶＩＩＩアミノ酸位置８１、１２９、３７７、３７８、４６８、４８７、４９１、５０４、５５６、５７０、７１１、１６４８、１７９５、１７９６、１８０３、１８０４、１８０８、１８１０、１８６４、１９０３、１９１１、２０９１、２１１８及び２２８４の１個もしくはそれより多くにおいてポリペプチドに共有結合し、且つ複合体は非複合ポリペプチドより少ない因子ＶＩＩＩ阻害性抗体への結合を有する。さらに別の態様において、生物適合性ポリマーは因子ＶＩＩＩアミノ酸位置８１、１２９、３７７、３７８、４６８、４８７、４９１、５０４、５５６、５７０、７１１、１６４８、１７９５、１７９６、１８０３、１８０４、１８０８、１８１０、１８６４、１９０３、１９１１、２０９１、２１１８及び２２８４の１個もしくはそれより多くにおいて、そして好ましくは位置３７７、３７８、４６８、４９１、５０４、５５６及び７１１の１個もしくはそれより多くにおいてポリペプチドに共有結合し、且つ複合体は、非複合ポリペプチドが有するより少ない因子ＶＩＩＩを分解できる血漿プロテアーゼからの分解を有する。より好ましくは、血漿プロテアーゼは活性化タンパク質Ｃである。

【0091】

さらに別の態様において、生物適合性ポリマーはアミノ酸位置１２９、４９１、１８０４及び／又は１８０８において、より好ましくは４９１又は１８０８においてＢ−ドメイン欠失因子ＶＩＩＩに共有結合する。さらに別の態様において、生物適合性ポリマーは因子ＶＩＩＩアミノ酸位置１８０４においてポリペプチドに結合し、且つポリエチレングリコールを含む。好ましくは、生物適合性ポリマー結合のための１個もしくはそれより多いあらかじめ規定される部位は、部位特異的システイン突然変異により制御される。

【0092】

機能性因子ＶＩＩＩポリペプチド上の１個もしくはそれより多い部位、好ましくは１もしくは２個の部位がポリマー結合のためにあらかじめ規定される部位であることができる。特定の態様において、ポリペプチドはモノ−ＰＥＧ化又はジＰＥＧ化される。

【0093】

本発明は、機能性因子ＶＩＩＩポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を突然変異させてあらかじめ規定される部位においてシステイン残基に関するコード配列に置換し；突然変異したヌクレオチド配列を発現させてシステイン増強突然変異タンパク質を生産し；突然変異タンパク質を精製し；実質的に還元システイン残基のみにおいてポリペプチドと反応するように活性化された生物適合性ポリマーと突然変異タンパク質を反応させて複合体を形成し；そして複合体を精製することを含んでなる、複合体の調製方法にも関する。他の態様において、本発明は：（ａ）特定部位の因子ＶＩＩＩ突然変異タンパク質を発現させ、ここで突然変異タンパク質は因子ＶＩＩＩ突然変異タンパク質の露出された表面上のアミノ酸残基に代わるシステイン置換を有し、且つそのシステインはキャッピングさ
れており；（ｂ）システイン突然変異タンパク質を穏やかに還元し、且つキャップを放出する条件下でシステイン突然変異タンパク質を還元剤と接触させ；（ｃ）システイン突然変異タンパク質からキャップ及び還元剤を除去し；そして（ｄ）還元剤の除去から少なくとも約５分、そして好ましくは少なくとも１５分、さらにもっと好ましくは少なくとも３０分後に、ＰＥＧ化された因子ＶＩＩＩ突然変異タンパク質が生産されるような条件下で、スルフヒドリルカップリング部分を含んでなるＰＥＧでシステイン突然変異タンパク質を処理することを含んでなる、因子ＶＩＩＩ突然変異タンパク質の特定部位のＰＥＧ化のための方法を提供する。ＰＥＧのスルフヒドリルカップリング部分は、チオール、トリフレート、トレシレート、アジリジン、オキシラン、Ｓ−ピリジル及びマレイミド部分より成る群から選ばれ、好ましくはマレイミドである。

【0094】

本発明は、本発明の複合体の治療的に有効な量及び製薬学的に許容され得る添加剤を含んで成る非経口的投与のための製薬学的組成物にも関する。製薬学的に許容され得る添加剤は、調製物の調製を助けるか、又は安定化するために活性成分に加えることができ、且つ患者に有意な毒物学的悪影響を起こさない物質である。そのような添加剤の例は当該技術分野における熟練者に周知であり、水、糖類、例えばマルトースもしくはスクロース、アルブミン、塩類などが含まれる。他の添加剤は、例えばＥ．Ｗ．ＭａｒｔｉｎによるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓに記載されている。そのような組成物は本明細書の複合体の有効量を、宿主への有効な投与に適した製薬学的に許容され得る組成物を調製するために適した量のビヒクルと一緒に含有するであろう。例えば血友病Ａに苦しむ患者に、出血事例の重度とともに変わり得る投薬量で非経口的に複合体を投与することができる。静脈内に投与される平均投薬量は、術前適用のためにキログラム当たり４０単位、少ない出血のためにキログラム当たり１５〜２０単位及び保持投薬のためにキログラム当たり８−時間に及んで投与される２０〜４０単位の範囲内である。

【0095】

１つの態様において、本発明の方法は１個もしくはそれより多い表面ＢＤＤアミノ酸をシステインで置換し、哺乳類発現系においてシステイン突然変異タンパク質を生産し、生育培地からのシステインにより発現の間にキャッピングされたシステインを還元し、還元剤を除去してＢＤＤジスルフィドを再生させ、システイン−特異的な生物適合性ポリマー試薬、例えばＰＥＧ−マレイミドと反応させることを含む。そのような試薬の例は、ＮｅｋｔａｒＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓｏｆＳａｎＣａｒｉｏｓ，ＣＡからそれぞれＮｅｋｔａｒカタログ番号２Ｄ２Ｍ０Ｈ０１ｍＰＥＧ−ＭＡＬ分子量５，０００Ｄａ、２Ｄ２Ｍ０Ｐ０１ｍＰＥＧ−ＭＡＬ分子量２０ｋＤ、２Ｄ３Ｘ０Ｐ０１ｍＰＥＧ２−ＭＡＬ分子量４０ｋＤの下に入手可能な５、２２又は４３ｋＤあるいはＮＯＦＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｔｏｋｙｏ，ＪａｐａｎからそれぞれＮＯＦカタログ番号ＳｕｎｂｒｉｇｈｔＭＥ−１２０ＭＡ及びＳｕｎｂｒｉｇｈｔＭＥ−３００ＭＡの下に入手可能な１２又は３３ｋＤのようなＰＥＧサイズを有するＰＥＧ−マレイミドである。ＰＥＧ化生成物は、未反応ＰＥＧの除去のためにイオン−交換クロマトグラフィーを用いて、及び未反応ＢＤＤの除去のためにサイズ−排除クロマトグラフィーを用いて精製される。この方法を用いてＦＶＩＩＩとの望ましくない相互作用、例えば受容体−媒介クリアランス、阻害性抗体結合及びタンパク質分解酵素による分解を同定し、且つ選択的に遮蔽することができる。我々は、Ｎｅｋｔａｒ又はＮＯＦにより５ｋＤとして供給されるＰＥＧ試薬が我々の実験室で６ｋＤとして判断され（ｔｅｓｔｅｄ）、類似して我々の実験室では直鎖状２０ｋＤとして供給されるＰＥＧ試薬が２２ｋＤとして判断され、４０ｋＤとして供給されるものが４３ｋＤとして判断され、６０ｋＤとして供給されるものが６４ｋＤとして判断されたことに注意した。混乱を避けるために、我々は本明細書の議論において、５ｋＤ
ＰＥＧを除いて我々の実験室で判断された通りの分子量を用い、５ｋＤＰＥＧは製造者がそれを同定した通りに５ｋＤとして報告する。

【0096】

ＢＤＤの位置４９１及び１８０８におけるシステイン突然変異（上記で開示された）の他に、位置４８７、４９６、５０４、４６８、１８１０、１８１２、１８１３、１８１５、１７９５、１７９６、１８０３及び１８０４をシステインに突然変異させ、ＰＥＧ化された時におそらくＬＲＰ結合の遮断を可能にした。位置３７７、３７８及び５５６もシステインに突然変異させ、ＰＥＧ化された時にＬＲＰ及びＨＳＰＧ結合の両方の遮断を可能にした。位置８１、１２９、４２２、５２３、５７０、１８６４、１９１１、２０９１及び２２８４はＢＤＤ上で等しく空間的に隔たるように選ばれ、これらの位置における大きなＰＥＧｓ（＞４０ｋＤ）を用いる特定部位のＰＥＧ化は本来のグリコシル化部位（４１、２３９及び２１１８）及びＬＲＰ結合部位におけるＰＥＧ化と一緒になってＢＤＤの表面を完全に覆い、ＢＤＤに関する新規なクリアランス機構を同定するはずである。

【0097】

１つの態様において、細胞培養培地はシステインを含有し、それはジスルフィド結合の形成により突然変異タンパク質のシステイン残基を「キャッピング」する。複合体の調製において、組換え系で生産されるシステイン突然変異タンパク質は培地からのシステインでキャッピングされ、このキャップはシステイン−特異的ポリマー試薬の添加の前に、キャップを放出する穏やかな還元により除去される。当該技術分野における熟練者に明らかな通り、ＦＶＩＩＩの部位−特異的突然変異のための当該技術において既知の他の方法も用いることができる。

【実施例】

【0098】

ＦＶＩＩＩの構造活性関連性分析。ＦＶＩＩＩ及びＢＤＤＦＶＩＩＩは、生物学的反応に含まれる多種の部位を有する非常に大きな複合（ｃｏｍｐｌｅｘ）分子である。薬物動態学的性質を向上させるためにそれらを共有結合により変更する以前の試みは、混同した結果を有した。分子を特異的に突然変異させ、次いで部位−特異的なやり方でポリマーを加えることができることは驚くべきことである。さらに、非特異的な付加及び活性の低下を引き起こす過去のポリマー複合体の場合の問題を考えると、向上した薬物動態学的性質及び保持される活性の結果も驚くべきことである。

【0099】

１つの態様において本発明は、ＰＥＧ−マレイミドのようなシステイン−特異的リガンドを用いる特定部位の突然変異誘発に関する。非−突然変異ＢＤＤはＰＥＧ−マレイミドと反応するために利用できるシステインを有しておらず、従って突然変異システイン位置のみがＰＥＧ化の部位となるであろう。さらに特定的に、ＢＤＤＦＶＩＩＩは１９個のシステインを有し、その中の１６個はジスルフィドを形成し、その中の他の３個は遊離のシステインである（ＭｃＭｕｌｌｅｎｅｔａｌ．著，ＰｒｏｔｅｉｎＳｃｉ．４，１９９５年，ｐｐ．７４０−７４６）。ＢＤＤの構造モデルは、３個の遊離のシステインのすべてが埋もれていることを示唆している（Ｓｔｏｌｉｏｖａ−ＭｃＰｈｉｅｅｔａｌ．著，Ｂｌｏｏｄ９９，２００２年，ｐｐ．１２１５−１２２３）。酸化されたシステインはＰＥＧ−マレイミドによりＰＥＧ化され得ないので、ＢＤＤ中でジスルフィドを形成する１６個のシステインは、最初に還元されずにはＰＥＧ化され得ない。ＢＤＤの構造モデルに基づき、ＢＤＤ中の３個の遊離のシステインは、最初にタンパク質を変性させ、これらのシステインをＰＥＧ試薬に露出せずにはＰＥＧ化され得ない。かくしてＢＤＤ構造を劇的に変えることなく、本来のシステイン残基におけるＰＥＧ化によりＢＤＤの特異的なＰＥＧ化を達成することは実行可能であると思われず、ＢＤＤの構造を劇的に変えることは、おそらくその機能を破壊するであろう。

【0100】

全長ＦＶＩＩＩのＢドメイン中の４個のシステインのレドックス状態は未知である。Ｂドメイン中の４個のシステインのＰＥＧ化は、それらがジスルフィドを形成しておらず、表面に露出されていれば可能であり得る。しかしながら、全長ＦＶＩＩＩ及びＢＤＤは類似の薬物動態学的（ＰＫ）側面及び生体内における類似の半減期を有するので（Ｇｒｕｐｐｏｅｔａｌ．著，Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉａ９，２００３年，ｐｐ．２５１−２６
０）、ＢドメインＰＥＧ化は、ＰＥＧが偶然非−Ｂドメイン領域をも保護しなければ、向上した血漿半減期を生ずるとは思われない。

【0101】

ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチド上のポリマー結合のためのあらかじめ規定される部位であって、因子ＶＩＩＩ活性を保持し、且つ薬物動態学を向上させる部位を決定するために、ＢＤＤＦＶＩＩＩに基づいて以下の指針を示す。変更はクリアランス、不活性化及び免疫原性機構、例えばＬＲＰ、ＨＳＰＧ、ＡＰＣならびに阻害性抗体結合部位を標的としなければならない。Ｓｔｏｉｌｏｖａ−ＭｃＰｈｉｅ，Ｓ．ｅｔａｌ．著，Ｂｌｏｏｄ９９（４），２００２年，ｐｐ．１２１５−２３はＢＤＤの構造を示している。例えば半減期を延長するために、１個のＰＥＧをＡ２残基４８４−５０９及びＡ３残基１８１１−１８１８中のＬＲＰ結合部位もしくはその近辺における特異的な部位に導入することができる。これらの部位における嵩高いＰＥＧの導入は、ＦＶＩＩＩがＬＲＰに結合する能力を崩壊させ、循環からのＦＶＩＩＩのクリアランスを減少させるはずである。活性に有意に影響せずに半減期を延長するために、ＰＥＧを残基１６４８において導入することができるとも思われ、それは全長分子中のＢドメインとＡ３ドメインの連結部分にあり、ＢＤＤではＡ２及びＡ３ドメインの間の１４−アミノ酸中にある（ｉｎｔｈｅ１４−ａｍｉｎｏａｃｉｄｌｉｋｅｒＩｔｈｅＢＤＤｂｅｔｗｅｅｎｔｈｅ
Ａ２ａｎｄＡ３ｄｏｍａｉｎｓ）。

【0102】

ＰＥＧ化の特異性は、組換えＤＮＡ突然変異誘発法を用いて１個のシステイン残基をＡ２又はＡ３ドメイン中に工作し（ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）、続いて導入されたシステインをＰＥＧ−マレイミドのようなシステイン−特異的ＰＥＧ試薬を用いて部位−特異的にＰＥＧ化することにより達成され得る。４８４−５０９及び１８１１−１８１８におけるＰＥＧ化の他の利点は、これらの２つのエピトープが患者における阻害性抗原部位の３つの主な種類の２つに相当することである。循環半減期の向上及び免疫原性反応の低下の最大の効果を達成するために、Ａ２及びＡ３ＬＲＰ結合部位の両方をＰＥＧ化し、ジＰＥＧ化生成物を与えることができる。１８１１−１８１８領域内におけるＰＥＧ化は、この領域がＦＩＸ結合にも含まれるために、活性の有意な損失を生じ得ることに注意しなければならない。５５８−５６５内における特定部位のＰＥＧ化はＨＳＰＧ結合を廃止するが、この領域はＦＩＸにも結合するので、活性も低下させ得る。

【0103】

ＦＶＩＩＩの新規なクリアランス機構を同定するために、さらに別の表面部位をＰＥＧ化することができる。Ａ２ドメインのＰＥＧ化は、活性化されるとＡ２ドメインがＦＶＩＩＩから解離し、おそらくそのより小さいサイズの故にＦＶＩＩＩ分子の残りの部分より速く循環から除去される点で追加の利点を与えることができる。他方、ＰＥＧ化されたＡ２は、腎臓クリアランスを逃れるのに十分に大きく、ＦＶＩＩＩの残りの部分と同等の血漿半減期を有することができ、かくして生体内で活性ＦＶＩＩＩを再構築することができる。

【0104】

Ａ２及びＡ３領域内のＰＥＧ化部位の同定。推定Ａ２ＬＲＰ結合領域もしくはその近辺における５個の位置（ＰＥＧ１−５位置に対応するＹ４８７、Ｌ４９１、Ｋ４９６、Ｌ５０４及びＱ４６８）を、高い表面露出及びそれらのＣαからＣβへの軌道（ｔｒａｊｅｃｔｏｒｙ）の外側への向きに基づき、特定部位のＰＥＧ化のための例として選んだ。さらに、これらの残基は分子の三−次元構造において互いから大体同じ距離にあり、それらは一緒になってこの領域全体を表す（ｒｅｐｒｅｓｅｎｔ）ことができる。推定Ａ３ＬＲＰ結合領域もしくはその近辺における８個の位置（ＰＥＧ６−１４に対応する１８０８、１８１０、１８１２、１８１３、１８１５、１７９５、１７９６、１８０３、１８０４）を特定部位のＰＥＧ化のための例として選んだ。ＰＥＧ６（Ｋ１８０８）は１８１１−１８１８及び１８１０における自然のＮ−結合グリコシル化部位に隣接している。位置１８１０（ＰＥＧ７）におけるＰＥＧ化は糖をＰＥＧで置換するであろう。ＰＥＧ８位置Ｔ
１８１２における突然変異もグリコシル化部位を廃止するであろう。ＰＥＧ９位置（Ｋ１８１３）は内側に向いていると予測されたが、構造モデルが正しくない場合にそれは選ばれた。ＰＥＧ１０（Ｙ１８１５）はＬＲＰ結合ループ内の嵩高い疎水性アミノ酸であり、疎水性アミノ酸は典型的にはタンパク質−タンパク質相互作用の中心に存在するので、決定的な相互作用残基であり得る。１８１１−１８１８領域はＬＲＰ及びＦＩＸ結合の両方に含まれると報告されているので、このループ内におけるＰＥＧ化はおそらく活性の低下を生ずると考えられた。かくしてＰＥＧ１１−ＰＥＧ１４（１７９５、１７９６、１８０３、１８０４）は１８１１−１８１８ループ近辺にあるがループ内にないように設計され、種々のＰＥＧサイズを用いてＬＲＰ及びＦＩＸ結合を解離させる（ｄｉｓｓｏｃｉａｔｅ）ことができるようにした。

【0105】

両ＬＲＰ結合部位を同時に遮断するために、例えばＰＥＧ２及びＰＥＧ６位置における二重ＰＥＧ化を発生させることができる。

【0106】

５５８−５６５領域はＨＳＰＧ及びＦＩＸの両方に結合することが示されているので、この領域内で部位は設計されなかった。代わりに、結合ＰＥＧが両方の相互作用を妨げ、且つそれらの間のあり得る相互作用を崩壊させることができるように、ＰＥＧ１５−ＰＥＧ１７（３７７、３７８及び５５６）がＡ２ＬＲＰ及びＨＳＰＧ結合領域の間に設計された。表面露出され且つ外側に向いているさらに別の部位をＬＲＰ及びＨＰＳＧ結合領域内もしくはその近辺で選ぶこともできた。新規なクリアランス機構を同定するために、ＦＶＩＩＩを系統的にＰＥＧ化することができる。ＰＥＧ１−１７の他に、３個の他の自然のグリコシル化部位、すなわちＰＥＧ１８−２０に対応するＮ４１、Ｎ２３９及びＮ２１１８をＰＥＧ化のための結合点（ｔｅｔｈｅｒｉｎｇｐｏｉｎｔｓ）として用いることができ、それはそれらが表面露出されているはずだからである。ＰＥＧ２、ＰＥＧ６及び４個のグリコシル化部位のＣβ原子から２０オングストローム半径内の表面領域は、ｖＷＦ、ＦＩＸ、ＦＸ、リン脂質及びトロンビンに関する機能的相互作用部位の他にＢＤＤモデル上にマッピングされた。

【0107】

Ｙ８１、Ｆ１２９、Ｋ４２２、Ｋ５２３、Ｋ５７０、Ｎ１８６４、Ｔ１９１１、Ｑ２０９１及びＱ２２８４に対応するＰＥＧ２１−２９は次いで、それらのＣβ原子のそれぞれからの２０オングストローム半径で残るＢＤＤ表面のほとんど全体を覆うそれらの能力に基づいて選択された。これらの位置は、それらが完全に露出されており、外側に向いており、且つ自然のシステインからずっと離れていて正しくないジスルフィド形成の可能性を最小にする故にも選択された。２０オングストローム半径は、６４ｋＤ分枝鎖状ＰＥＧのような大きなＰＥＧが約２０オングストローム半径を有する球を覆う可能性を有すると思われる故に選ばれる。ＰＥＧ２及びＰＥＧ６ならびにグリコシル化部位ＰＥＧ１８、１９及び２０と一緒のＰＥＧ２１−２９のＰＥＧ化は、ＦＶＩＩＩの非−機能性（ｎｏｎ−ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ）表面のほとんど全体を保護するようである。

【0108】

ＰＫ側面の向上、より高い安定性又は免疫原性の低下のような強化された性質に導くＰＥＧ化位置を組み合わせて、最大に強化された性質を有する多重−ＰＥＧ化生成物を形成することができる。ＰＥＧ３０及びＰＥＧ３１は、それぞれＡ２及びＡ３ドメイン中の露出されたジスルフィドを除去することにより設計された。ＰＥＧ３０又はＣ６３０Ａは、そのジスルフィドパートナーＣ７１１をＰＥＧ化のために遊離させるはずである。同様に、ＰＥＧ３１、Ｃ１８９９ＡはＣ１９０３がＰＥＧ化されるのを可能にするはずである。

【0109】

突然変異誘発。ＰＥＧ化のために選ばれる部位においてシステインコドンを導入することにより、ＦＶＩＩＩの特定部位のＰＥＧ化のための基質を形成することができる。ＰＥＧ突然変異体のすべての生産のためにＳｔｒａｔａｇｅｎｅｃＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ^TM ＩＩ特定部位の突然変異誘発キットを用いた（ＳｔｒａｔａｇｅｎｅＣｏｒｐｏｒ
ａｔｉｏｎ，ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡからのＳｔｒａｔａｇｅｎｅキット２００５２３）。ｃＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ^TM特定部位の突然変異誘発法は、ＰｆｕＴｕｒｂｏ^R ＤＮＡポリメラーゼ及び温度サイクラーを用いて行なわれる。所望の突然変異を含有する２個の相補的オリゴヌクレオチドプライマーを、ＰｆｕＴｕｒｂｏを用いて伸張させ、それはプライマーを置き換えないであろう。野生型ＦＶＩＩＩ遺伝子を含有するｄｓＤＮＡを鋳型として用いる。複数の伸張サイクルに続き、メチル化ＤＮＡに関して特異的なＤｐｎｌエンドヌクレアーゼを用いて生成物を消化する。突然変異を含有する新しく合成されたＤＮＡはメチル化されないが、親の野生型ＤＮＡはメチル化される。次いで消化されたＤＮＡを用いてＸＬ−１Ｂｌｕｅ超−感応細胞を形質転換する。

【0110】

突然変異誘発の効率はほとんど８０％である。突然変異誘発反応はｐＳＫ２０７＋ＢＤＤＣ２．６又はｐＳＫ２０７＋ＢＤＤにおいて行なわれた（図１）。ＤＮＡ配列決定により成功した突然変異誘発を確かめ、突然変異を含有する適したフラグメントを哺乳類発現ベクターｐＳＳ２０７＋ＢＤＤ中のＦＶＩＩＩ主鎖中に転移させた。転移の後、突然変異のすべてを再び配列−確認した。Ａ３突然変異タンパク質ＰＥＧ６、７、８、９及び１０の場合、ベクターｐＳＫ２０７＋ＢＤＤＣ２．６において突然変異誘発を行なった。配列決定により確かめた後、突然変異体フラグメント、Ｋｐｎｌ／ＰｍｅをｐＳＫ２０７＋ＢＤＤ中にサブクローニングした。次いでＢＤＤ突然変異タンパク質をｐＳＳ２０７＋ＢＤＤ発現ベクター中にサブクローニングした。Ａ３突然変異タンパク質ＰＥＧ１１、１２、１３、１４の場合、突然変異誘発をベクターｐＳＫ２０７＋ＢＤＤ中で直接行い、配列−確認突然変異体ＢＤＤを次いでｐＳＳ２０７＋ＢＤＤ中にサブクローニングした。Ａ２突然変異タンパク質ＰＥＧ１、２、３、４、５の場合、突然変異誘発をｐＳＫ２０７＋ＢＤＤＣ２．６ベクター中で行なった。配列が確認された突然変異体をｐＳＫ２０７＋ＢＤＤ中に、及び次いでｐＳＳ２０７＋ＢＤＤ中にサブクローニングした。

【0111】

突然変異誘発に用いられるプライマー（センス鎖（ｓｅｎｓｅｓｔａｎｄ）のみ）を各反応に関して挙げる：
ＰＥＧ１，Ｙ４８７Ｃ：ＧＡＴＧＴＣＣＧＴＣＣＴＴＴＧＴＧＣＴＣＡＡＧＧＡＧＡＴＴＡＣＣＡ（配列番号：５）
ＰＥＧ２，Ｌ４９１Ｃ：ＴＴＧＴＡＴＴＣＡＡＧＧＡＧＡＴＧＣＣＣＡＡＡＡＧＧＴＧＴＡＡＡＡＣ（配列番号：６）
ＰＥＧ３，Ｋ４９６Ｃ：ＴＴＡＣＣＡＡＡＡＧＧＴＧＴＡＴＧＣＣＡＴＴＴＧＡＡＧＧＡＴＴＴＴＣ（配列番号：７）
ＰＥＧ４，Ｌ５０４Ｃ：ＡＡＧＧＡＴＴＴＴＣＣＡＡＴＴＴＧＣＣＣＡＧＧＡＧＡＡＡＴＡＴＴＣ（配列番号：８）
ＰＥＧ５，Ｑ４６８Ｃ：ＧＡＴＴＡＴＡＴＴＴＡＡＧＡＡＴＴＧＣＧＣＡＡＧＣＡＧＡＣＣＡＴＡＴ（配列番号：９）
ＰＥＧ６，Ｋ１８０８Ｃ：ＴＡＧＡＡＡＡＡＡＣＴＴＴＧＴＣＴＧＣＣＣＴＡＡＴＧＡＡＡＣＣＡＡＡＡＣ（配列番号：１０）
ＰＥＧ７，Ｎ１８１０Ｃ：ＡＡＣＴＴＴＧＴＣＡＡＧＣＣＴＴＧＣＧＡＡＡＣＣＡＡＡＡＣＴＴＡＣ（配列番号：１１）
ＰＥＧ８，Ｔ１８１２Ｃ：ＧＴＣＡＡＧＣＣＴＡＡＴＧＡＡＴＧＣＡＡＡＡＣＴＴＡＣＴＴＴＴＧＧＡ（配列番号：１２）
ＰＥＧ９，Ｋ１８１３Ｃ：ＣＡＡＧＣＣＴＡＡＴＧＡＡＡＣＣＴＧＣＡＣＴＴＡＣＴＴＴＴＧＧＡＡＡＧ（配列番号：１３）
ＰＥＧ１０，Ｙ１８１５Ｃ：ＣＴＡＡＴＧＡＡＡＣＣＡＡＡＡＣＴＴＧＣＴＴＴＴＧＧＡＡＡＧＴＧＣＡＡＣ（配列番号：１４）
ＰＥＧ１１，Ｄ１７９５Ｃ：ＡＴＴＴＣＴＴＡＴＧＡＧＧＡＡＴＧＣＣＡＧＡＧＧＣＡＡＧＧＡＧＣＡ（配列番号：１５）
ＰＥＧ１２，Ｑ１７９６Ｃ：ＴＣＴＴＡＴＧＡＧＧＡＡＧＡＴＴＧＣＡＧＧＣＡＡＧＧＡ
ＧＣＡＧＧＡ（配列番号：１６）
ＰＥＧ１３，Ｒ１８０３Ｃ：ＣＡＡＧＧＡＧＣＡＧＡＡＣＣＴＴＧＣＡＡＡＡＡＣＴＴＴＧＴＣＡＡＧＣＣＴ（配列番号：１７）
ＰＥＧ１４，Ｋ１８０４Ｃ：ＧＧＡＧＧＡＧＡＡＣＣＴＡＧＡＴＧＣＡＡＣＴＴＴＧＴＣＡＡＧＣＣＴ（配列番号：１８）
ＰＥＧ１５，Ｋ３７７Ｃ：ＣＧＣＴＣＡＧＴＴＧＣＣＡＡＧＴＧＴＣＡＴＣＣＴＡＡＡＡＣＴＴＧＧ（配列番号：１９）
ＰＥＧ１６，Ｈ３７８Ｃ：ＴＣＡＧＴＴＧＣＣＡＡＧＡＡＧＴＧＴＣＣＴＡＡＡＡＣＴＴＧＧＧＴＡ（配列番号：２０）
ＰＥＧ１７，Ｋ５５６Ｃ：ＣＴＣＣＴＣＡＴＣＴＧＣＴＡＣＴＧＣＧＡＡＴＣＴＧＴＡＧＡＴＣＡＡ（配列番号：２１）
ＰＥＧ１８，Ｎ４１Ｃ：ＣＡＡＡＡＴＣＴＴＴＴＣＣＡＴＴＣＴＧＣＡＣＣＴＣＡＧＴＣＧＴＧＴＡＣ（配列番号：２２）
ＰＥＨ１９，Ｎ２３９Ｃ：ＧＴＣＡＡＴＧＧＴＴＡＴＧＴＡＴＧＣＡＧＧＴＣＴＣＴＧＣＣＡＧＧＴ（配列番号：２３）
ＰＥＧ２０，Ｎ２１１８Ｃ：ＣＡＧＡＣＴＴＡＴＧＣＡＧＧＡＴＧＴＴＣＣＡＣＴＧＧＡＡＣＣＴＴＡ（配列番号：２４）
ＰＥＧ２１，Ｙ８１Ｃ：ＡＴＣＣＡＧＧＣＴＧＡＧＧＴＴＴＧＴＧＡＴＡＣＡＧＴＧＧＴＣＡＴＴ（配列番号：２５）
ＰＥＧ２２，Ｆ１２９Ｃ：ＧＡＡＧＡＴＧＡＴＡＡＡＧＴＣＴＧＴＣＣＴＧＧＴＧＧＡＡＧＣＣＡＴ（配列番号：２６）
ＰＥＧ２３，Ｋ４２２Ｃ：ＣＡＧＣＧＧＡＴＴＧＧＴＡＧＧＴＧＴＴＡＣＡＡＡＡＡＡＧＴＣＣＧＡ（配列番号：２７）
ＰＥＧ２４，Ｋ５２３Ｃ：ＧＡＡＧＡＴＧＧＧＣＣＡＡＣＴＴＧＣＴＣＡＧＡＴＣＣＴＣＧＧＴＧＣ（配列番号：２８）
ＰＥＧ２５，Ｋ５７０Ｃ：ＣＡＧＡＴＡＡＴＧＴＣＡＧＡＣＴＧＣＡＧＧＡＡＴＧＴＣＡＴＣＣＴＧ（配列番号：２９）
ＰＥＧ２６，Ｎ１８６４Ｃ：ＣＡＣＡＣＴＡＡＣＡＣＡＣＴＧＴＧＴＣＣＴＧＣＴＣＡＴＧＧＧＡＧＡ（配列番号：３０）
ＰＥＧ２７，Ｔ１９１１Ｃ：ＣＡＧＡＴＧＧＡＡＧＡＴＣＣＣＴＧＣＴＴＴＡＡＡＧＡＧＡＡＴＴＡＴ（配列番号：３１）
ＰＥＧ２８，Ｑ２０９１Ｃ：ＡＣＣＣＡＧＧＧＴＧＣＣＣＧＴＴＧＣＡＡＧＴＴＣＴＣＣＡＧＣＣＴＣ（配列番号：３２）
ＰＥＧ２９，Ｑ２２８４Ｃ：ＡＡＡＧＴＡＡＡＧＧＴＴＴＴＴＴＧＣＧＧＡＡＡＴＣＡＡＧＡＣＴＣＣ（配列番号：３３）
ＰＥＧ３０，Ｃ６３０Ａ：ＴＴＧＣＡＧＴＴＧＴＣＡＧＴＴＧＣＴＴＴＧＣＡＴＧＡＧＧＴＧＧＣＡ（配列番号：３４）
ＰＥＧ３１，Ｃ１８９９Ａ：ＡＡＴＡＴＧＧＡＡＡＧＡＡＡＣＧＣＴＡＧＧＧＣＴＣＣＣＴＧＣＡＡＴ（配列番号：３５）

【0112】

突然変異タンパク質発現。ハイグロマイシンＢに対する耐性を与えるベクターにおける挿入の後、ＰＥＧ突然変異タンパク質を、製造者の指示に従って２９３フェクチントランスフェクション試薬（ＦｅｃｔｉｎＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎＲｅａｇｅｎｔ）（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＣｏｒｐ．Ｃａｔ＃１２３４７−０１９）と複合させたＨＫＢ１１細胞中にトランスフェクションした（米国特許第６，１３６，５９９号明細書）。トランスフェクションから３日後におけるＦＶＩＩＩ発現をＣｏａｔｅｓｔ発色アッセイにより評価した（ＣｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘＣｏｒｐ．Ｃａｔ＃８２１０３３，実施例１２発色アッセイを参照されたい）（表１）。トランスフェクションされた細胞を次いで、５％ＦＢＳが補足された生育培地中で、５０□ｇ／ｍｌのＨｙｇＢを用いる選択圧下に置いた。ＨｙｇＢ−耐性コロニーが現れたら、それらを手で採集し、Ｃｏａｔｅｓｔ発色ア
ッセイによりＦＶＩＩＩ発現に関してスクリーニングした。ＦＶＩＩＩ発現安定細胞を次いでＨＰＰＳ補足物質を含有する培地に適応させた。細胞を拡大し、新しい培地を有する振盪フラスコ中にｍｌ当たり１Ｘ１０６個の細胞において播種した。３日後に収穫される組織培養液（ＴＣＦ）をＦＶＩＩＩＢＤＤ突然変異タンパク質の精製のために用いた。ＴＣＦのＦＶＩＩＩ活性をＣｏａｔｅｓｔにより検定した（表１）。

【0113】

【表1】

【0114】

突然変異タンパク質精製。分泌される突然変異タンパク質ＦＶＩＩＩタンパク質を含有する細胞培養上澄み液を集めたら、０．２ミクロンの膜フィルターを介して上澄み液を濾過し、残る細胞を除去する。次いで限外濾過又はアニオン交換により上澄み液を濃縮する。次いでそれを免疫親和性カラム（ｉｍｍｕｎｏａｆｆｉｎｉｔｙｃｏｌｕｍｎ）に適用し、そこで細胞培養培地成分及び宿主細胞タンパク質不純物の大部分を除去する。免疫親和性カラム溶出液を次いでスクロースを含有する調製緩衝液中へのダイアフィルトレーションにより緩衝液交換し、凍結する。発色アッセイにより、モノクローナルＦＶＩＩＩ抗体カラムを通過する（ａｃｒｏｓｓ）タンパク質の収率及び回収率を評価した。クロマトグラフィーランの負荷物、通過流（ｆｌｏｗｔｈｒｏｕｇｈ）、種々の溶出液画分、ストリップ及びダイアフィルトレーションされた溶出液の試料をＦＶＩＩＩ活性に関して検定した（表２）。表２はモノクローナル抗体カラムからのＰＥＧ２突然変異タンパク質の回収率を示す。抗体はＣ７Ｆ７抗体である。表２におけるパーセント回収率は発色アッセイにより決定される。最終的な収率は７３％であった。図２に示されるのは、モノクロ
ーナルＦＶＩＩＩ抗体クロマトグラフィーカラム上で精製されたＰＥＧ２タンパク質の場合の、時間に関する２８０ｎｍにおけるＵＶ吸光度のプロットである。クロマトグラフィーは、ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅからのＡＫＴＡ^R Ｅｘｐｌｏｒｅｒ１００クロマトグラフィーシステムを用いて行なわれた。この機器は多重−波長ＵＶ−可視モニター及び２ｍｍのフローセルを用いる。ＰＥＧ２突然変異タンパク質は高濃度の塩（ｈｉｇｈｓａｌｔ）の存在下でカラムから溶出し、溶出ピークは２８０ｎｍにおける吸光度及びＦＶＩＩＩ活性アッセイの両方により示される。

【0115】

【表2】

【0116】

ＰＥＧ化。１００倍を超える過剰のＰＥＧ：タンパク質比において、本来の全長ＦＶＩＩＩ又はＢＤＤを還元及び変性なしでシステイン−特異的ＰＥＧによりＰＥＧ化することはできず（データは示されていない）、すべての本来のシステインがジスルフィドを形成しているか、又はＦＶＩＩＩ内に埋もれているというＢＤＤ構造モデルに基づく仮説を確証している。上記で挙げた標準的な案を用いて発現し且つ精製されたＦＶＩＩＩシステイン突然変異タンパク質をシステイン−特異的ＰＥＧマレイミド試薬を用いてＰＥＧ化することはできず、おそらくそれは導入されたＦＶＩＩＩシステインが細胞生育培地中に存在するシステイン及びβ−メルカプトエタノールのようなスルフヒドリル基との反応により「キャッピングされている」からである。この問題はおそらく培地からシステイン及びβ−メルカプトエタノールを除去することにより解決され得るが、これはより低いＦＶＩＩＩ生産を生じ得、細胞により放出されるスルフヒドリルが導入されたＦＶＩＩＩシステインを遮断するのを妨げないであろう。

【0117】

本発明の他の側面において、ＦＶＩＩＩの部位−特異的ＰＥＧ化を可能にする３−段階法を開発した（図３）。段階１において、約１μＭにおける精製されたＦＶＩＩＩシステイン突然変異タンパク質を約０．７ｍＭトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）又は０．０７ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）のような還元剤を用い、４℃において３０分間穏やかに還元し、「キャップ」を放出させる。段階２に、回転カラム（ＢｉｏＲａｄ^R）を介して試料を移動させるようなサイズ−排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）法により「キャップ」と一緒に還元剤を除去し、導入されたシステインを遊離且つ還元された状態にしながらＦＶＩＩＩジスルフィドの再形成を可能にする。段階３において、還元剤の除去から少なくとも３０分後に、遊離されたＦＶＩＩＩシステイン突然変異タンパク質を５〜６４ｋＤの範囲のサイズを有する少なくとも１０−倍モル過剰のＰＥＧ−マレイミド（ＮｅｋｔａｒＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ及びＮ．Ｏ．Ｆ．Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用い、４℃で少なくとも１時間処理する。この方法は、異なる個人により繰り返される数十回の反応に関し、再現性の良いデータを有する高度に一貫した生成物分布を与える。

【0118】

ＴＣＥＰの除去のための回転カラム法は計ることができないので、ゲル濾過脱塩クロマトグラフィーが選ばれた。しかしながら、ＴＣＥＰのスパイクサンプル（ｓｐｉｋｅｓａｍｐｌｅ）を用いてこの方法を調べると、ＴＣＥＰがカラム空隙において測定可能なレベルで溶出し、その低い分子量を有する分子から予測される塩画分中のみで溶出するので
はないことが示された。ウェスタンブロットアッセイは、おそらくＴＣＥＰの不完全な除去の故の有意なバックグラウンドＰＥＧ化を示した。そうしている間に別の実験は、塩勾配と組み合わされたアニオン交換クロマトグラフィー媒体を用いて、Ｃ７Ｆ７精製材料を他のタンパク質不純物からさらに有意に精製できることを示した。そこで上記のＴＣＥＰを用いてＣ７Ｆ７材料を還元し、次いでアニオン交換カラム上で材料を処理する（ｐｒｏｃｅｓｓ）ことが決定された。電荷の相違のために、ＦＶＩＩＩタンパク質は保持されるが、ＴＣＥＰはカラムを通過して流れ、保持されない。同時に勾配塩溶出の間に、ＦＶＩＩＩタンパク質は残るタンパク質不純物の大部分から精製された。これは、後に起こるＰＥＧ化が、より純粋な出発材料を用いて理論的により均一であろうことを意味した。しかしながら、ＴＣＥＰのスパイクサンプルを用いて調べると、勾配中でＦＶＩＩＩと一緒に溶出する測定可能なレベルのＴＣＥＰが見出されることが示された。従って、アニオン交換クロマトグラフィーの後にゲル濾過脱塩クロマトグラフィーを行なうことが決定され、これらの２つの段階は順番に用いられると、ＴＣＥＰの完全な除去及び非−特異的ＰＥＧ化の除去を生じた。

【0119】

ＳＤＳＰＡＧＥ及びウェスタンブロットによるＰＥＧ化分析。還元性６％ＴｒｉｓＧｌｙｃｉｎｅＳＤＳポリアクリルアミドゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上の電気泳動により、ＰＥＧ化された生成物を分析することができる。電気泳動に続き、クーマシーブルーを用いてゲルを染色してすべてのタンパク質を同定するか、あるいは標準的なウェスタンブロット案に供してＦＶＩＩＩの種々の領域上のＰＥＧ化パターンを同定することができる。それぞれＦＶＩＩＩ重鎖のＣ−末端領域又はＶＩＩＩ軽鎖のＮ−末端領域に対して構成される（ｒａｉｓｅｄ）マウスモノクローナルＲ８Ｂ１２又はＣ７Ｆ７抗体を用いるブロットの染色は、それぞれの鎖のＰＥＧ化を同定するはずである。ＦＶＩＩＩの４８４−５０９領域に対する４１３抗体を用いる染色は、ＰＥＧ１−４のような突然変異タンパク質に関してＰＥＧ化が実際に部位−特異的であるか否かを決定するであろう。同様に、ＦＶＩＩＩの１８０１−１８２３領域を認識するＣＬＢ−ＣＡｇＡ抗体を用いる染色は、ＰＥＧ６−１０のような突然変異タンパク質に関してＰＥＧ化が部位−特異的であるか否かを決定するであろう。

【0120】

ＰＥＧ２（Ｌ４９１Ｃ）ＰＥＧ化は、軽鎖より重鎖に関して選択的であり、特に４８４−５０９領域に関して選択的であることが示されたが（図４）、ＰＥＧ６（Ｋ１８０８Ｃ）は重鎖より軽鎖に関して選択的であることが示された（図５）。

【0121】

図４に描かれる研究のために、ＴＣＥＰを用いてＰＥＧ２突然変異タンパク質（列１及び８）を還元し、続いてＴＣＥＰを除去し（列２及び９）、５、１２、２２、３３又は４３ｋＤＰＥＧ−マレイミドで処理する（列３−７及び１０−１４）。非ＰＥＧ化ＦＶＩＩＩは非プロセシング（Ｈ＋Ｌ）ならびにプロセシング重（Ｈ）及び軽（Ｌ）鎖バンドとして移動する。３つのすべてのバンドはクーマシーブルー染色されたゲル上で検出可能であるが（下の右）、鎖特異的抗体を用いるウェスタン染色はプロセシングされない対応する鎖のみを明らかにする。Ｒ８Ｂ１２染色（上の左）を用いると、ＰＥＧ２をＰＥＧ−マレイミドで処理する場合の重鎖（Ｈ）バンドは強度が劇的に低下し、新しいバンドが形成され、それはＰＥＧのサイズに比例して親Ｈバンドより高く移動する。Ｃ７Ｆ７染色（下の左）を用いると、軽鎖（Ｌ）バンド（不均一なグリコシル化の故に多重バンド）は強度を変えない。両染色に関する非プロセシングＨ＋Ｌバンドは、Ｈ鎖が非プロセシングＦＶＩＩＩの一部であるために移動する。クーマシー染色も軽鎖よりずっと多い重鎖のＰＥＧ化、すなわちＨバンド強度の低下を確証する。最後にＰＥＧ化バンドは、おそらく４８４−５０９への４１３抗体の結合を遮断する４９１の部位−特異的ＰＥＧ化の故に、ＰＥＧサイズ−依存的やり方で、Ｒ８Ｂ１２染色より４１３抗体染色上（上の右）で相対的により強度を失う。列当たりに負荷されるＦＶＩＩＩの量は２つの左のゲルの場合に約３０ｎｇであり、上の右のゲルの場合に約１０００ｎｇであり、下の右のゲルの場合に約２００
０ｎｇである。

【0122】

還元及びそれに続く還元剤の除去は、ＦＶＩＩＩの移動を変えない（列１対２及び８対９）。ＰＥＧ２への２２ｋＤＰＥＧの付加は４１３抗体の結合を遮断し、４９１位置における特異的なＰＥＧ化と一致する（図４の上の右のゲル）。これはＰＥＧ化されたＰＥＧ２が人間においてより低い免疫原性を有するであろうことも示唆しており、それは、４１３抗体がヒトＡ２阻害性抗体と同じエピトープを共有することが示されているからである（Ｓｃａｎｄｅｌｌａｅｔａｌ．著，Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．６７，１９９２年，ｐｐ．６６５−７１）。

【0123】

図５に描かれる研究のために、ＴＣＥＰを用いてＰＥＧ６突然変異タンパク質を還元し、続いてＴＣＥＰを除去し（列１及び６）、５、１２、２２又は３３ｋＤＰＥＧ−マレイミドで処理する（列２−５及び７−１０）。非ＰＥＧ化ＦＶＩＩＩは非プロセシング（Ｈ＋Ｌ）ならびにプロセシング重（Ｈ）及び軽（Ｌ）鎖バンドとして移動する。ＰＥＧ６（Ｋ１８０８）突然変異は軽鎖上にあるので、ＰＥＧ化は軽鎖上のみで検出され、重鎖上では検出されなかった。列当たりに負荷されるＦＶＩＩＩの量は左のゲルの場合に約１００ｎｇであり、右のゲルの場合に約３０ｎｇである。

【0124】

標準として移動させたＢＤＤは、上記の還元及び還元剤除去法の後でさえ、１００−倍を超えるモル過剰のＰＥＧ−マレイミドを用いて処理した時に有意なＰＥＧ化を示さなかった（図６ａ）。同じ方法をＰＥＧ４及びＰＥＧ５にも適用した（図６ａ）。ＰＥＧ２と比較して、これらの突然変異タンパク質は有効にＰＥＧ化されなかったが、それらはＰＥＧ２（Ｌ４９１Ｃ）に類似して重鎖に関して選択的であった。ＰＥＧ６（Ｋ１０８０Ｃ）のＰＥＧ化効率は比較的低く、それはおそらくそれがＮ１８１０におけるＮ−結合グリコシル化部位に非常に近接しており、それが位置１８０８におけるＰＥＧ化を遮断し得るからである。かくして我々は、１８１０における本来のグリコシル化部位を除去するためにＰＥＧ７（Ｎ１８１０Ｃ）を設計した。頭−頭比較（ｈｅａｄ−ｔｏ−ｈｅａｄｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ）においてＰＥＧ７はＰＥＧ６と比較して向上したＰＥＧ化効率を示す（図６ｂ）。類似して、ＰＥＧ１５はＰＥＧ２よりわずかに良いＰＥＧ化効率を示す。ＢＤＤの二重突然変異体であるＰＥＧ２＋６は、ＰＥＧ２が重鎖システイン突然変異であり、ＰＥＧ６が軽鎖突然変異であるために、重鎖及び軽鎖の両方の上でＰＥＧ化され得る（図６ｃ）。この方法を野生型全長ＦＶＩＩＩにも適用した（図６ｄ）。ＰＥＧ化は、Ａ１、Ａ２及びＢドメインのほとんどを含む重鎖の最大のフラグメントに関して検出された。ＰＥＧ化パターンはモノＰＥＧ化を示唆し、１個のＰＥＧ化されたシステインのみがあることを示唆した。

【0125】

トロンビン切断及びウェスタンブロットによるＰＥＧ化分析。ＰＥＧ化された生成物を３７℃において３０分間トロンビン（ＦＶＩＩＩのｕｇ当たり４０ＩＵ）で処理することができる。用いられるトロンビンは汚染物としてＡＰＣも含有する。トロンビン切断は重鎖から５０ｋＤＡ１及び４３ｋＤＡ２ドメインを形成するが、ＡＰＣ切断はＡ２ドメインをさらに２１及び２２ｋＤのフラグメントに割るであろう（図７）。重鎖のＣ−末端を認識するＲ８Ｂ１２抗体を用いる染色は、無損傷のＡ２ドメイン及び２１ｋＤＣ−末端フラグメントのみを同定するであろう（ＦＶＩＩＩ５６２−７４０）。かくしてＰＥＧ２のＰＥＧ化が位置４９１に関して特異的であったら、４３ｋＤＡ２ドメインはＰＥＧ化されるが２１ｋＤＣ−末端フラグメントはＰＥＧ化されないはずである。これは実際に、図７に示される２２ｋＤＰＥＧ化ＰＥＧ２に関するウェスタンブロットにより確証された。かくして除去により、ＰＥＧ２のＰＥＧ化は、Ａ２ドメインのＮ−末端２２ｋＤフラグメント（ＦＶＩＩＩ３７３−５６１）に位置決定された。ＰＥＧ−マレイミドはｐＨ６．８においてシステインに関して完全に選択的であり、３７３−５６１内の唯一の本来のＦＶＩＩＩシステインは５２８−５５４の間の埋もれたジスルフィドに由来するので
、ＰＥＧ２は位置４９１における導入されたシステイン上でＰＥＧ化されるのが非常にありそうなことである。ＦＶＩＩＩ重鎖Ｎ−末端抗体を用いるトロンビン−処理されたＰＥＧ化ＰＥＧ２のウェスタン染色は、Ａ１ドメインのＰＥＧ化を示さなかった（データは示されない）。トロンビン切断法を用いるＰＥＧ２の選択的ＰＥＧ化は、５、１２、３３及び４３ｋＤのＰＥＧｓに関しても確証された（データは示されない）。ＰＥＧ化された野生型全長ＦＶＩＩＩのトロンビン切断は、ＢドメインのみがＰＥＧ化されることを示す（図８）。

【0126】

ヨウ素染色によるＰＥＧ化分析。クーマシーブルー及びウェスタン染色の際に新しく作られるバンドが実際にＰＥＧ化されたバンドであることを確証するために、ＰＥＧに関して特異的であるバリウム−ヨウ素染色を用いた（図９）。ＰＥＧ化されたＰＥＧ２を６％ＴｒｉｓＧｌｙｃｉｎｅゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上で移動させ、Ｒ８Ｂ１２重鎖抗体又はバリウム−ヨウ素溶液で染色した（Ｌｅｅｅｔａｌ．著，ＰｈａｒｍＤｅｖ
Ｔｅｃｈｎｏｌ．４：１９９９年，２６９−２７５）。ＰＥＧ化されたバンドは、それらを整列させるための分子量マーカーを用いて２つの染色の間で一致し、かくしてＦＶＩＩＩ重鎖ＰＥＧ化を確証した。

【0127】

ＭＡＬＤＩ−質量分析によるＰＥＧ化分析。重鎖中のＡ２ドメインのＰＥＧ化を確証するために、ＰＥＧ化の前後のｒＦＶＩＩＩ試料をマトリックス−補助レーザー脱着／イオン化（ＭＡＬＤＩ）質量分析により分析した。３０％アセトニトリル，０．１％ＴＦＡ中のシナピン酸マトリックスを有するＭＡＬＤＩ標的プレート（ｔａｒｇｅｔｐｌａｔｅ）上で試料を混合し、結晶化させた。次いでそれらをＶｏｙａｇｅｒＤＥ−ＰＲＯ分光計において、正の線状モードで分析した。図１０に示される結果は、８３ｋＤを中心とするＰＥＧ２の軽鎖及び８９ｋＤにおける重鎖（ＨＣ）を示した。ＰＥＧ化試料に関して取得されたスペクトルは、ＨＣピークの低下及び１１１ｋＤを中心とする新しいピークの形成を示した。これは、重鎖のＰＥＧ化を確証する。ＰＥＧ化された軽鎖（１０５ｋＤにおける）は、検出限界より上で観察されなかった。

【0128】

次いで試料を両方とも、ＦＶＩＩＩのｍｇ当たり２０単位のトロンビンにおいて３７℃で３０分間、トロンビン消化に供し、続いてアミノ酸分析によりＦＶＩＩＩ濃度を決定した（ＣｏｍｍｏｎｗｅａｌｔｈＢｉｏｔｈｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ）。重鎖は４６ｋＤ（Ａ１）Ｎ−末端画分及び４３ｋＤ（Ａ２）画分に切断された。ＰＥＧ化試料に関して取得されたＭＡＬＤＩスペクトル（図１１）は、４３ｋＤピークの喪失及びＰＥＧ化されたＡ２ドメインの故の新しい６５ｋＤピークの出現を示す。ＬＣのＰＥＧ化はやはり検出限界より上で観察されない。これらの結果は再び、ＦＶＩＩＩのＡ２ドメインのＰＥＧ化を確証している。同じ分析をＰＥＧ化されたＰＥＧ６に適用し、軽鎖Ａ３Ｃ１Ｃ２フラグメントのＰＥＧ化を確証した（図１２）。

【0129】

活性測定
凝固アッセイ。凝固ＦＶＩＩＩ：Ｃ試験法は、活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）に基づく１−段階アッセイである。ＦＶＩＩＩは因子ＩＸａ、カルシウム及びリン脂質の存在下で、因子ＸからＸａへの酵素的転換において補因子として働く。このアッセイでは、希釈された試験試料をＦＶＩＩＩ欠失血漿基質及びａＰＴＴ試薬の混合物と一緒に３７℃でインキュベーションする。インキュベーションされた混合物に塩化カルシウムを加え、凝固を開始させる。血餅が形成されるのに要する時間（秒）とＦＶＩＩＩ：Ｃの濃度の対数の間には逆比例関係（ｉｎｖｅｒｓｅｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ）が存在する。種々の希釈度の試験材料の凝固時間を、一系列の希釈度の既知の活性の標準材料から構築される曲線と比較することにより、未知の試料に関する活性レベルを内挿し、ｍＬ当たりの国際単位（ＩＵ／ｍＬ）において報告する。

【0130】

発色アッセイ。発色アッセイ法は２つの連続的段階から成り、その方法では色の強度がＦＶＩＩＩ活性に比例する。第１段階において、因子Ｘが最適量のカルシウムイオン及びリン脂質の存在下でＦＩＸａにより、その補因子ＦＶＩＩＩａを用いてＦＸａに活性化される。因子Ｘの活性化の速度がＦＶＩＩＩの量のみに依存するように、過剰量の因子Ｘが存在する。第２段階において、因子Ｘａは発色基質を加水分解し、発色団を与え、色の強度を４０５ｎｍにおいて測光的に読み取る。未知試料の力価を計算し、傾斜比統計法（ｓｌｏｐｅ−ｒａｔｉｏｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌｍｅｔｈｏｄ）を用いてアッセイの正当性を調べる。活性をｍＬ当たりの国際単位（ＩＵ／ｍＬ）において報告する。

【0131】

１８１１−１８１８ループはＦＩＸへの結合に含まれるが、このループ内の個々の位置の重要性は決定されていない。ＰＥＧ７−１０突然変異タンパク質は、本来のＦＶＩＩＩに関してほとんど同じ比発色活性を示す（表３）。表３は、ＢＤＤに関するＰＥＧ突然変異タンパク質及びＰＥＧ化されたＰＥＧ２又はＰＥＧ６のパーセント比活性（Ｓ．Ａ．）を示す。Ｓ．Ａ．は、発色、凝固又はｖＷＦ結合活性を全抗原ＥＬＩＳＡ（ＴＡＥ）値で割ることにより決定された。次いでＰＥＧ化突然変異タンパク質のＳ．Ａ．をＢＤＤのＳ．Ａ．（８ＩＵ／ｕｇ発色、５ＩＵ／ｕｇ凝固及び１ｖＷＦ／ＴＡＥ）で割り、１００を掛けて、表３中に発色、凝固及びｖＷＦ／ＴＡＥの見出しの下に挙げられるパーセントＳ．Ａ．を得る。

【0132】

【表3】

【0133】

表３中で用いられる場合、「ＰＥＧ２ｒｅｄ」は、還元剤で処理され、続いて還元剤が除去されたＰＥＧ２突然変異タンパク質である。この還元法はＦＶＩＩＩの３つの機能的活性を有意に変えなかった。５ｋＤ（ＰＥＧ２−５ｋＤ）〜４３ｋＤ（ＰＥＧ２−４３ｋＤ）の範囲のＰＥＧｓに複合したＰＥＧ２突然変異タンパク質は、有意な量の発色活性を失わなかったが、ＰＥＧサイズが５ｋＤを超えて大きくなるとともに凝固活性を非常に低下させた。比較的大きいサイズのＰＥＧ化ＰＥＧ２に関してｖＷＦ結合における中程度の減少もあり得る。

【0134】

全抗原ＥＬＩＳＡ（ＴＡＥ）。ポリクローナルＦＶＩＩＩ抗体がコーティングされたミクロタイタープレート上にＦＶＩＩＩを捕獲する。ビオチニル化ポリクローナルｒＦＶＩＩＩ抗体及びストレプタビジンホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）複合体を用いてＦＶＩＩＩ結合を検出する。ペルオキシダーゼ−ストレプタビジン複合体は、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質を加えると発色反応を生ずる。４パラメーターフィットモデルを用いて標準曲線から試料濃度を内挿する。ＦＶＩＩＩの結果をμｇ／ｍＬにおいて報告する。

【0135】

ｖＷＦ結合ＥＬＩＳＡ。ＦＶＩＩＩを溶液中で重症血友病血漿（ＳｅｖｅｒｅＨｅｍｏｐｈｉｌｉｃＰｌａｓｍａ）中のｖＷｆに結合させる。次いでｖＷｆ−特異的モノクローナル抗体がコーティングされたミクロタイタープレート上でＦＶＩＩＩ−ｖＷｆ複合体を捕獲する。ＦＶＩＩＩポリクローナル抗体及びホースラディッシュペルオキシダーゼ−抗−ウサギ複合体を用いてｖＷｆに結合したＦＶＩＩＩを検出する。ペルオキシダーゼ−複合抗体複合体は、基質を添加すると発色反応を生ずる。４パラメーターフィットモデルを用いて標準曲線から試料濃度を内挿する。ＦＶＩＩＩ結合の結果をμｇ／ｍＬにおいて報告する。ＰＥＧ化された場合に活性のいずれにも有意な影響はなく、それはＢドメインにおけるＰＥＧ化と一致した。

【0136】

【表4】

【0137】

イオン−交換クロマトグラフィーによるＰＥＧ化ＦＶＩＩＩの精製。ＰＥＧ化されたＦＶＩＩＩをアニオン交換カラム又はカチオン交換カラムに適用し、ここでタンパク質はカラムに結合するが、過剰の遊離のＰＥＧ試薬は結合せず、通過流中で除去される。次いで塩化ナトリウム勾配を用いてＰＥＧ突然変異タンパク質をカラムから溶出させる。負荷物、通過流及び勾配画分のバリウム−ヨウ素染色された４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲルを用い、カラム溶出画分がＰＥＧ化突然変異タンパク質を有することを確証した。

【0138】

サイズ−排除クロマトグラフィーによるＰＥＧ化ＦＶＩＩＩの精製。ＰＥＧ２突然変異タンパク質の大部分を含有するアニオン交換画分をプールし、限外濾過により濃縮し、次いでサイズ排除カラムに適用する。次いで調製緩衝液を用いてカラムを溶出させる。ＰＥＧがタンパク質に結合しているかどうかに依存するタンパク質のサイズ及び形における相
違の故に、このカラムはＰＥＧ化ＰＥＧ２突然変異タンパク質をＰＥＧ化されていない残るＰＥＧ２のそれから分離する。ＰＥＧ化された突然変異タンパク質ＦＶＩＩＩ画分を、ほとんどのＦＶＩＩＩ活性を有することに基づいてプールし、次いでその後の動物研究及び分子特性化のために凍結する。図１３は、４３ｋＤＰＥＧ化ＰＥＧ２突然変異タンパク質の溶出に対して非−ＰＥＧ化ＰＥＧ２突然変異タンパク質の溶出を比較する。ＰＥＧ化ＰＥＧ２は有意により初期に溶出し、それは共有結合したＰＥＧからのそのサイズにおける増加及び形を示す。

【0139】

より低い、すなわち５０％未満のＰＥＧ化の効率を示すＰＥＧ６のような突然変異タンパク質の場合、高度に純粋なモノ−ＰＥＧ化生成物を与えるための最も有効な精製案は、カチオン交換クロマトグラフィーとそれに続くサイズ排除クロマトグラフィーの組み合わせを使用することである。例えばＰＥＧ６の場合、カチオン交換クロマトグラフィーはＰＥＧ化されたＰＥＧ６（より初期の溶出画分、図１４）を非−ＰＥＧ化ＰＥＧ６の大部分（より後期の溶出画分、図１５）から精製する。次いでサイズ排除クロマトグラフィーはＰＥＧ化されたタンパク質（より初期の溶出画分、図１５）を非−ＰＥＧ化タンパク質（より後期の溶出画分、図１５）の残りから分離して仕上げを施す（ｐｏｌｉｓｈｅｓ）。

【0140】

活性へのＰＥＧサイズの影響。ＰＥＧサイズがＰＥＧ化された時のＦＶＩＩＩの凝固及び発色活性の両方に影響を有するかどうかを調べるために、精製された全長ＦＶＩＩＩ、ＰＥＧ２、ＰＥＧ６及びＰＥＧ１４をＴＣＥＰにより還元し、続いて還元剤を除去し、緩衝液標準又は６ｋＤ〜６４ｋＤの範囲のＰＥＧｓと反応させた。得られるＰＥＧ化ＦＶＩＩＩを過剰のＰＥＧ又は非ＰＥＧ化ＦＶＩＩＩの除去なしで直接検定した。標準実験は、過剰のＰＥＧがＦＶＩＩＩ活性に影響を有していないことを示した。

【0141】

図１６はこの研究の結果を示す。精製された全長ＦＶＩＩＩは図１６中でＫＧ−２として示される。図１６中で報告されるパーセント活性は、還元及び還元剤の除去の後にＰＥＧで処理された試料の値を、ＰＥＧ化の収率を考慮しながら、緩衝液標準で処理された試料の値で割ることにより決定された。ＰＥＧ化の収率は、いずれの与えられるＦＶＩＩＩ構築物の場合にも、すべてのＰＥＧｓにわたり（ａｃｒｏｓｓ）同等であった。それらはＫＧ−２、ＰＥＧ２及びＰＥＧ１４の場合に約８０％であり、ＰＥＧ６の場合に約４０％である。例えば１２ｋＤＰＥＧ化ＰＥＧ１４試料の場合の３．２ＩＵ／ｍＬに対して、緩衝液標準処理されたＰＥＧ１４は６．８ＩＵ／ｍＬの凝固活性を有する。しかしながら、ＰＥＧ化の効率は約８０％であり、３．２ＩＵ／ｍＬが約８０％のＰＥＧ化及び約２０％の非ＰＥＧ化の凝集体活性を示すことを意味する。非ＰＥＧ化試料が緩衝液標準で処理されたＰＥＧ１４と同じ活性を有すると仮定すると、ＰＥＧ化ＰＥＧ１４の場合の非ＰＥＧ化ＰＥＧ１４に対するパーセント活性は３４％＝（３．２−６．８ｘ２０％）／（６．８ｘ８０％）であると算定される。

【0142】

ＢＤＤのＰＥＧ２、ＰＥＧ６又はＰＥＧ１４位置におけるＡ２又はＡ３ドメイン内のＰＥＧ化は、ＰＥＧサイズが６ｋＤを超えて増加すると凝固活性の劇的な喪失を生ずる。しかしながら、全長ＦＶＩＩＩのＢドメイン内の本来のＢ−ドメインシステインにおけるＰＥＧ化は凝固活性に影響を有していなかった。興味深いことに、発色活性はすべてのＰＥＧ化構築物の場合に影響されなかった。これはアッセイの相違の故であり得る。小さい発色性ペプチド基質は、凝固活性で用いられるもっと大きなタンパク質基質よりＰＥＧ化ＦＶＩＩＩ／ＦＩＸ／ＦＸ複合体に容易に近づけることがあり得る。あるいはまた、ＰＥＧは突然変異タンパク質の活性化に影響し得る。これは２−段階発色アッセイより１−段階凝固アッセイによって容易に検出されるであろう。

【0143】

ＰＥＧ２、６及び１４の凝固活性へのＰＥＧの影響の観察を確証するために、いくつかのＰＥＧ化構築物を過剰のＰＥＧ及び非ＰＥＧ化タンパク質（ｕｎＰＥＧｙｌａｔｅｄ）
から精製した。ＰＥＧは発色活性に影響を有していないので、発色活性対凝固活性の比率は凝固活性へのＰＥＧの相対的影響についての良い評価となる（表５）。ＰＥＧ２のような与えられる位置におけるより大きなＰＥＧｓ及びＰＥＧ２＋６構築物の場合におけるようなより多数のＰＥＧｓは、より多くの凝固活性の喪失を引き起こす。

【0144】

【表5】

【0145】

うさぎＰＫ研究。ＦＶＩＩＩの薬物動態学（ＰＫ）へのＰＥＧ化の影響を理解するために、複数の種においてＰＫ研究を行なった。研究のためにＮＺＷＳＰＦウサギを用いた：１０匹の雌，グループあたり５匹のウサギ、２つのグループ（ＰＥＧ２ＦＶＩＩＩ及び２２ｋＤＰＥＧ化ＰＥＧ２）。試料を１００ＩＵ／ｍＬ（発色単位）の最終的濃度を以って無菌のＰＢＳ中に希釈した。各ウサギに耳縁静脈（ｍａｒｇｉｎａｌｅａｒｖｅｉｎ）を介して１ｍｌ／ｋｇ（１００ＩＵ／ｋｇ）の用量の希釈された試験物質又は標準物質を与えた。注入から種々の時間の後に、投薬から後の規定された時点に耳中心動脈（ｃｅｎｔｒａｌｅａｒａｒｔｅｒｙ）から血液試料（１ｍＬ）を１ｍＬシリンジ中に採取した（１００μＬの３．８％Ｎａ−クエン酸塩を装入）。血漿試料を、９６−ウェルプレート上にコーティングされたＲ８Ｂ１２重鎖抗体と一緒にインキュベーションし、投薬されたヒトＦＶＩＩＩを特異的に捕獲した。捕獲されたＦＶＩＩＩの活性を発色アッセイにより決定した（図１７）。ＰＥＧ化ＰＥＧ２及びＰＥＧ化ＰＥＧ６をＢＤＤと比較もし（図１８及び１９）、ＰＥＧ化された突然変異タンパク質はＢＤＤと比較して血漿回収率における向上を示した。ＰＥＧ化された野生型全長ＦＶＩＩＩは多くの向上を示すようではなかった（図２０）。

【0146】

マウスＰＫ研究。第２の種として、ＩＣＲ正常もしくは血友病、ＦＶＩＩＩ欠失マウス（Ｔａｃｏｎｉｃ，Ｈｕｄｓｏｎ，ＮＹ）をＰＫ研究に用いた。１時点につきグループ当たり５匹のマウスで、正常なマウスを研究に用いた。試験材料を調製緩衝液中に、２５ＩＵ／ｍＬの公称最終濃度まで希釈した。各マウスに尾静脈を介して４ｍＬ／ｋｇ（約０．１ｍＬの合計体積）の希釈された（ｄｉｌｕｔｅ）試験材料を投与することができる。指示される時点に下大静脈から、血液試料（正常もしくは血友病マウス研究のためにそれぞれ０．４５もしくは０．３ｍＬ）を１ｍＬのシリンジ（正常もしくは血友病マウス研究のためにそれぞれ５０もしくは３０μＬの３．８％Ｎａ−クエン酸塩が装入された）中に採取する（試料当たり１匹の動物）。上記の発色アッセイ法を用いて血漿試料をＦＶＩＩＩ濃度に関して検定する。ＰＥＧ化ＰＥＧ６は、ＢＤＤ又はＰＥＧ６と比較してより高い血漿回収率を示す（図２１）。ＰＥＧ化ＰＥＧ２は、ＢＤＤと比較してより高い血漿回収率を示す（図２２及び２３）。

【0147】

【表6】

【0148】

【表7】

【0149】

血友病マウス（ＢＤＤ）因子ＶＩＩＩ回収率。図２４に示される血友病マウス（ＢＤＤ）因子ＶＩＩＩ回収率ヒストグラムは、血友病マウスアッセイにおけるＢＤＤ因子ＶＩＩＩの２つの種の半減期の薬物動態学的（ＰＫ）評価を描く。このアッセイは、マウスモデルにおいて静脈内投与から後の３つの時点に、ＢＤＤ因子ＶＩＩＩ（図２４中で「ｗｔ」又は野生型ＢＤＤ因子ＶＩＩＩと呼ばれる）及びＢＤＤ因子ＶＩＩＩのＰＥＧ２＋６二重ＰＥＧ化変異体（そして本明細書の他の箇所でＢＤＤ因子ＶＩＩＩのＬ４９１Ｃ，Ｋ１８０８Ｃ二重変異体と同定される）の両方の血漿濃度を測定するように設計された。０．８及び４時間の両時点におけるＰＫ評価は同等であったが、１６時間の評価は特に注目する価値がある。１６時間において、非−ＰＥＧ化分子と比較する場合に約４倍（４００％）もの多くの二重にＰＥＧ化されたＢＤＤ因子ＶＩＩＩ変異体（ＰＥＧ２＋６）が投与から１６時間後のマウス血漿中に留まった。

【0150】

腎臓裂傷モデル。ＰＥＧ化ＦＶＩＩＩ突然変異タンパク質が血友病マウスにおいて出血を止めるのに有効であるかどうかを決定するために、腎臓裂傷モデルを用いた。血友病マウス（破壊されたＦＶＩＩＩ遺伝子を有するＣ５７／ＢＬ６）をイソフルオラン（ｉｓｏｆｌｕｏｒａｎｅ）下で麻酔し、秤量した。下大静脈を露出し、３１ゲージの針を用いて
１００ｕｌの食塩水又はＦＶＩＩＩを注入した。針を注意深く取り出し、出血を妨げるために注入の部位で３０〜４５秒間圧力を加えた。２分後、右腎臓を露出し、垂直軸に沿って鉗子間に保った。＃１５メスを用い、腎臓を３ｍｍの深さまで水平に切断した。傷の均一な深さを保証するために、腎臓を中心で軽く持って鉗子の両側上の等しい組織を露出した。露出された腎臓の表面は鉗子の深さまで切断された。上記の通りに血液損失を定量した。マウスについて種々の用量のＦＶＩＩＩを調べ、腎臓出血へのＦＶＩＩＩの用量反応関係を特性化した。ＰＥＧ化ＰＥＧ２は、マウス腎臓傷害後の血液損失の減少においてＢＤＤと同等の力価を示した（図２５）。かくしてＰＥＧ化ＰＥＧ２の凝固活性はＢＤＤのそれより低いが、この腎臓裂傷モデルは、ＰＥＧ化ＰＥＧ２の生体内有効性がＢＤＤと比較して測定可能なほど低下しないことを示し、発色アッセイデータと一致した。

【0151】

抗体阻害アッセイ。特異的に位置４９１（すなわちＰＥＧ２）においてポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のような高分子量ポリマーを付加することは、ｍＡＢ４１３へ、及び拡大により患者の大きな割合の阻害性抗体への結合及び感度を低下させるはずであり、それは、多くの患者が同じｍＡＢ４１３エピトープに対する阻害性抗体（ｉｎｈｉｂｉｔｏｒａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）を発現するからである。これを調べるために、増加する量のｍＡＢ４１３を非−飽和量（０．００３ＩＵ／ｍＬ）のＢＤＤ又は４３ｋＤＰＥＧ化ＰＥＧ２と一緒にインキュベーションし、発色アッセイにおいて機能的活性を調べた（図２６）。非−阻害性抗体であるＲ８Ｂ１２及びＣ２ドメインを標的とする阻害性抗体であるＥＳＨ４を標準として用いた。ＰＥＧ化ＰＥＧ２は実際にＢＤＤよりｍＡＢ４１３阻害に対して抵抗性であり、４９１位置近辺で結合しない標準抗体の存在下で類似の阻害パターンを示す。さらに、ｍＡＢ４１３阻害に対するＰＥＧの保護効果はＰＥＧサイズに依存し、より大きなＰＥＧｓがより強い効果を有する（図２７）。ＰＥＧ化ＦＶＩＩＩが患者からの阻害性抗体により抵抗性であるかどうかを調べるために、ＦＶＩＩＩへの阻害物質を発現した血友病Ａ患者に由来する１パネルの血漿の存在下で、発色活性を測定した。調べられた８人の患者の血漿の中で４人の患者の血漿試料において、４３ｋＤＰＥＧ化ＰＥＧ２はＢＤＤより患者の血漿阻害に抵抗性であった。例えばＰＥＧ化されたＰＥＧ２、ＰＥＧ６又はＰＥＧ２＋６は、１人の患者の血漿においてＢＤＤより高い残留活性を示したが、他の血漿においては示さなかった（図２８）。ジＰＥＧ化ＰＥＧ２＋６は、モノＰＥＧ化ＰＥＧ２又はＰＥＧ６より抵抗性であると思われる。これらの結果は、ＰＥＧ化ＰＥＧ突然変異タンパク質がＦＶＩＩＩへの阻害物質を発現する患者の処置においてより有効である得ることを示唆している。

【0152】

高処理量ＰＥＧ化スクリーニング。特定のＰＥＧ突然変異タンパク質のＰＥＧ化効率は予測不可能であり、それは特にＢＤＤの直接の構造的情報がないからである。例えばＢＤＤの構造モデルに基づき、ＰＥＧ４及びＰＥＧ５のＰＥＧ化効率がＰＥＧ２及びＰＥＧ１５のそれに類似して非常に高いはずと予測され、それは構造に従って３個のすべての位置が表面露出され且つ外側に向いているからである。かくして系統的なＰＥＧ化を介して新規なクリアランス機構を探索するためにＰＥＧを用いることは、多数の突然変異タンパク質をスクリーニングすることを必要とする。

【0153】

多数のＰＥＧ突然変異タンパク質を迅速にスクリーニングするために、新規な高処理量法が開発され、それは一過的にトランスフェクションされた突然変異タンパク質からのＰＥＧ化生成物のＰＥＧ化効率及び機能的活性を調べることができる。０．１〜０．２ＩＵ／ｍＬもの低いＦＶＩＩＩ発色値を有する５〜１０ｍＬもの少量の一過的に発現されたＰＥＧ突然変異タンパク質を、Ａｍｉｃｏｎ−ｃｅｎｔｒａＵｌｔｒａｄｅｖｉｃｅＭＷＣＯ３０Ｋを用いて約５０−倍濃縮し、ＦＶＩＩＩの濃度はＦＶＩＩＩへの抗体の相互作用の親和性範囲に近い１ｎＭより高くに達する。濃縮されたＰＥＧ突然変異タンパク質（〜３００ｕＬ）を〜３０ｕＬのＣ７Ｆ７ＦＶＩＩＩ抗体樹脂と一緒に４℃で終夜インキュベーションし、洗浄し、溶出させ、透析し、還元する。還元剤を除去し、還元さ
れたＰＥＧ突然変異タンパク質をＰＥＧ化し、上記のようなウェスタン分析上で移動させる（図２９及び３０）。一過的に発現されたＰＥＧ突然変異タンパク質の相対的なＰＥＧ化効率は、精製されたＰＥＧ突然変異タンパク質のそれと正確に一致する。

【0154】

この方法により、１〜２ヶ月内に数十個のＰＥＧ突然変異タンパク質をスクリーニングすることができる。例えばＰＥＧ１４（Ｋ１８０４ＣＢＤＤ）は、１２ｋＤＰＥＧを用いて少なくとも約８０％の軽鎖のＰＥＧ化を有し、重鎖のＰＥＧ化はなく（データは示されない）、軽鎖上に位置決定されるＫ１８０４Ｃ突然変異と一致した。Ｋ１８０４とＫ１８０８（ＰＥＧ６位置）の間のＣ□からＣ□への距離は、ＢＤＤ構造に従うとわずか８．４オングストロームであり、この位置における４３ｋＤＰＥＧの導入が、よりずっと高いＰＥＧ化収率の利点を以って、３３ｋＤＰＥＧ化ＰＥＧ６と類似のＰＫにおける向上を有するであろうことを示唆している。調べられたすべてのＰＥＧ突然変異タンパク質に関する相対的なＰＥＧ化収率を表８にまとめる。重鎖中にシステインを有するすべての突然変異タンパク質は重鎖上のみでＰＥＧ化されるが、軽鎖中にシステインを有するすべての突然変異タンパク質は軽鎖上でＰＥＧ化される点で、ＰＥＧ化はシステイン突然変異が導入される特定のＦＶＩＩＩ鎖に関して高度に選択的であった。突然変異タンパク質番号２〜３１は、挙げられる位置における本来のアミノ酸がシステインで置換されるＢＤＤのシステイン突然変異を示す。ＰＥＧ２＋６は、位置４９１及び１８０８がシステインで置換されたＢＤＤの二重突然変異タンパク質である。Ａ１及びＡ２（ならびに全長ＦＶＩＩＩであるＫＧ−２の場合にはＢドメイン）は重鎖に属するが、Ａ３、Ｃ１及びＣ２は軽鎖に属する。ＰＥＧ化効率は、ＰＥＧ化生成物をＳＤＳＰＡＧＥ上で移動させ、ＰＥＧ化バンドの強度を非ＰＥＧ化バンドと比較することから見積もられた：＋＋＋＞約８０％ＰＥＧ化収率，＋＋約３０〜７０％収率，＋約１０〜３０％収率及び− ＜約１０％収率。

【0155】

【表8】

【0156】

還元されたＰＥＧ突然変異タンパク質の質量分析。ＰＥＧ突然変異タンパク質又は全長
ＦＶＩＩＩの直接のＰＥＧ化を妨げる「キャップ」の正体を決定するために、ＰＥＧ２＋１４を６７ｕＭ〜６７０ｕＭの範囲の濃度におけるＴＣＥＰで還元した。ＰＥＧ化収率はＴＣＥＰの増加する量に比例して向上した（図３１）。同じ試料をＰＥＧ化の前に質量分析によっても分析した（図３２）。直接研究できるタンパク質ドメインを得るために、ＦＶＩＩＩのｍｇ当たり２０単位の比率におけるトロンビンを用い、試料を３７℃で３０分間消化した。トロンビン切断は残基３７２−７４０を含み、占有されたグリコシル化部位を含まないＡ２フラグメントを生ずる。消化された試料をＣ４逆相液体クロマトグラフィーシステム上に注入し、カラムからの溶出物を、電子スプレーインターフェース（ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙｉｎｔｅｒｆａｃｅ）を介して４極飛行時間質量分析計（ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅｔｉｍｅ−ｏｆ −ｆｌｉｇｈｔｍａｓｓｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ）中に直接導入した。Ａ２ドメインに相当するクロマトグラフィーピーク下からの質量スペクトルをデコンボリューションし、タンパク質の無損傷の質量値を与えた。還元の前に、ＰＥＧ２＋１４のＡ２ドメインは、理論的に予測されるより１１８ダルトン大きい質量を与える。ＴＣＥＰ濃度が向上すると、Ａ２ドメインの正確な予測質量を有する新しいピークが現れる。この新しいピークの割合は、ＴＣＥＰ濃度が向上するとともに増加する。１１８ダルトンの差は、システイン（１１９Ｄａ）とのジスルフィド形成を介する残基Ｃｙｓ４９１におけるシステイン化及び機器の精度により説明され得る。かくしてこれは、ＰＥＧ突然変異タンパク質がシステインによりキャッピングされ、それが直接のＰＥＧ化を妨げることを示す。

【0157】

本明細書で開示されるすべての引用文献は、引用することによりそれらの記載事項全体が本明細書の内容となる。

【図面の簡単な説明】

【0158】

【図1a】ＰＥＧ突然変異タンパク質のためのベクターマップ及び突然変異誘発戦略。

【図1b】ＰＥＧ突然変異タンパク質のためのベクターマップ及び突然変異誘発戦略。

【図2】モノクローナルＦＶＩＩＩ抗体クロマトグラフィーカラム上で精製されたＰＥＧ２タンパク質の場合の、時間に関する２８０ｎｍにおけるＵＶ吸光度分布。

【図3】３−段階特定部位ＰＥＧ化法。

【図4】ＰＥＧ２の特定部位のＰＥＧ化。

【図5】ＰＥＧ６の特定部位のＰＥＧ化。

【図6a】ＢＤＤ、ＰＥＧ２、４、５及び６の特定部位のＰＥＧ化。

【図6b】ＰＥＧ２及びＰＥＧ６を標準として用いるＰＥＧ１５及びＰＥＧ７のＰＥＧ化。