特許 6559709 ＨＥＲ１のベータ−ヘアピンに結合するＨＥＲ１抗原結合タンパク質

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6559709

(24)【登録日】2019年7月26日

(45)【発行日】2019年8月14日

(54)【発明の名称】ＨＥＲ１のベータ−ヘアピンに結合するＨＥＲ１抗原結合タンパク質

(51)【国際特許分類】

   C12P 21/08 20060101AFI20190805BHJP

   G01N 33/53 20060101ALI20190805BHJP

   C07K 16/28 20060101ALI20190805BHJP

   C07K 16/46 20060101ALI20190805BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20190805BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20190805BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20190805BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20190805BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20190805BHJP

   C07K 7/08 20060101ALI20190805BHJP

   C07K 14/195 20060101ALI20190805BHJP

【ＦＩ】

   C12P21/08ZNA

   G01N33/53 S

   C07K16/28

   C07K16/46

   A61K39/395 L

   A61K39/395 T

   A61K39/395 N

   A61P35/00

   A61P43/00 111

   C12N15/13

   C07K19/00

   C07K7/08

   C07K14/195

【請求項の数】20

【全頁数】65

(21)【出願番号】特願2016-567668(P2016-567668)

(86)(22)【出願日】2015年5月12日

(65)【公表番号】特表2017-523391(P2017-523391A)

(43)【公表日】2017年8月17日

(86)【国際出願番号】EP2015060491

(87)【国際公開番号】WO2015173249

(87)【国際公開日】20151119

【審査請求日】2017年1月20日

(31)【優先権主張番号】14168320.1

(32)【優先日】2014年5月14日

(33)【優先権主張国】EP

【微生物の受託番号】DSMZ  DSM ACC3240

【微生物の受託番号】DSMZ  DSM ACC3241

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】306021192

【氏名又は名称】エフ・ホフマン−ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト

(74)【代理人】

【識別番号】110002077

【氏名又は名称】園田・小林特許業務法人

(72)【発明者】

【氏名】ボッセンマイアー， ビルギット

(72)【発明者】

【氏名】ゲルク， ミヒャエル

(72)【発明者】

【氏名】ニーダーフェルナー， ゲルハルト

(72)【発明者】

【氏名】シュレムル， ミヒャエル

(72)【発明者】

【氏名】ペース， カルメン

【審査官】 北村 悠美子

(56)【参考文献】

【文献】 特表２００９−５３２３９３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 ZHU, Lei et al.，B-cell epitope peptide vaccination targeting dimer interface of epidermal growth factor receptor(EGFR)，Immunology Letters，２０１３年，Vol.153，Pages 33-40

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０７Ｋ １６／００−１６／４６

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ヒトＨＥＲ１に結合する単離された抗体を選択する方法であって、該抗体はヒトＨＥＲ１のＰＰＬＭＬＹＮＰＴＴＹＱＭＤＶＮＰＥＧＫのアミノ酸配列（配列番号１）の中で結合し、
ここで、
ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含む
配列番号１２ ＴｔＳｌｙＤｃａｓ−ＨＥＲ１、
配列番号１３ ＴｔＳｌｙＤｃｙｓ−ＨＥＲ１、
配列番号１４ ＴｔＳｌｙＤ（ＧＳＧ）−ＨＥＲ１、
配列番号１５ ＴｔＳｌｙＤ（ＣＣ）−ＨＥＲ１、
配列番号１６ ＴｔＳｌｙＤ（ＳＳ）−ＨＥＲ１、及び
配列番号１８ ＴｇＳｌｙＤｃｙｓ−ＨＥＲ１、
からなる群から選択される少なくとも１つのポリペプチドが、ａ）の下の少なくとも１つのポリペプチドへの結合を示す抗体を選択するために用いられ、
それによって、ヒトＨＥＲ１のＰＰＬＭＬＹＮＰＴＴＹＱＭＤＶＮＰＥＧＫのアミノ酸配列（配列番号１）の中で結合する抗体を選択する方法。

【請求項2】

請求項１の選択方法によって得られる単離された抗体であって、
該抗体が、
ｉ）寄託された抗体ＭＡＫ＜ＨＥＲ１−ＤＩＢ＞Ｍ−５０．０９７．１４（ＤＳＭ ＡＣＣ３２４０）の（ａ）ＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）ＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）ＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）ＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）ＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）ＨＶＲ−Ｌ３；又は
ｉｉ）寄託された抗体ＭＡＫ＜ＨＥＲ１−ＤＩＢ＞Ｍ−５０．１１０．２３（ＤＳＭ ＡＣＣ３２４１）の（ａ）ＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）ＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）ＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）ＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）ＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）ＨＶＲ−Ｌ３；
を含み、
全てのＨＶＲはカバットに従って決定され、
該抗体がＨＥＲ２、ＨＥＲ３及び／又はＨＥＲ４と交差反応性を有さない、抗体。

【請求項3】

該抗体がＨＥＲ２、ＨＥＲ３及び／又はＨＥＲ４と交差反応性を有さない、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

ヒトＨＥＲ１に結合する単離された抗体であって、
該抗体が、
ｉ）寄託された抗体ＭＡＫ＜ＨＥＲ１−ＤＩＢ＞Ｍ−５０．０９７．１４（ＤＳＭ ＡＣＣ３２４０）の（ａ）ＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）ＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）ＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）ＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）ＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）ＨＶＲ−Ｌ３；又は
ｉｉ）寄託された抗体ＭＡＫ＜ＨＥＲ１−ＤＩＢ＞Ｍ−５０．１１０．２３（ＤＳＭ ＡＣＣ３２４１）の（ａ）ＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）ＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）ＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）ＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）ＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）ＨＶＲ−Ｌ３；
を含み、
全てのＨＶＲはカバットに従って決定され、
該抗体が、
配列番号１３ ＴｔＳｌｙＤｃｙｓ−Ｈｅｒ１
のポリペプチドに結合し、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３及び／又はＨＥＲ４と交差反応性を有さない、抗体。

【請求項5】

ヒトＨＥＲ１に結合する単離された抗体であって、
ＥＬＩＳＡアッセイで、
配列番号１３ ＴｔＳｌｙＤｃｙｓ−Ｈｅｒ１
のポリペプチドに、
配列番号１１ ＴｔＳｌｙＤｃａｓ
のポリペプチドへの結合と比較して少なくとも５０倍高いＥＬＩＳＡシグナルで結合し、ここで、ＴｔＳｌｙＤｃｙｓ−ＨＥＲ１及びＴｔＳｌｙＤｃａｓは０．５μｇ／ｍｌの濃度で固定化されており、
該抗体が、
ｉ）寄託された抗体ＭＡＫ＜ＨＥＲ１−ＤＩＢ＞Ｍ−５０．０９７．１４（ＤＳＭ ＡＣＣ３２４０）の（ａ）ＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）ＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）ＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）ＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）ＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）ＨＶＲ−Ｌ３；又は
ｉｉ）寄託された抗体ＭＡＫ＜ＨＥＲ１−ＤＩＢ＞Ｍ−５０．１１０．２３（ＤＳＭ ＡＣＣ３２４１）の（ａ）ＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）ＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）ＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）ＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）ＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）ＨＶＲ−Ｌ３；
を含み、
全てのＨＶＲはカバットに従って決定され、
該抗体がＨＥＲ２、ＨＥＲ３及び／又はＨＥＲ４と交差反応性を有さない、抗体。

【請求項6】

ヒトＨＥＲ１に結合する単離された抗体であって、配列番号１３のポリペプチド（ＴｔＳｌｙＤｃｙｓ−Ｈｅｒ１）に含まれるＰＰＬＭＬＹＮＰＴＴＹＱＭＤＶＮＰＥＧＫのアミノ酸配列（配列番号１）の中で結合し、
該抗体が、
ｉ）寄託された抗体ＭＡＫ＜ＨＥＲ１−ＤＩＢ＞Ｍ−５０．０９７．１４（ＤＳＭ ＡＣＣ３２４０）の（ａ）ＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）ＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）ＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）ＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）ＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）ＨＶＲ−Ｌ３；又は
ｉｉ）寄託された抗体ＭＡＫ＜ＨＥＲ１−ＤＩＢ＞Ｍ−５０．１１０．２３（ＤＳＭ ＡＣＣ３２４１）の（ａ）ＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）ＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）ＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）ＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）ＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）ＨＶＲ−Ｌ３；
を含み、
全てのＨＶＲはカバットに従って決定され、
該抗体がＨＥＲ２、ＨＥＲ３及び／又はＨＥＲ４と交差反応性を有さない、抗体。

【請求項7】

ＥＧＦの非存在下でＡ５４９がん細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−１８５）においてＨＥＲ１のリン酸化を誘導しない、請求項２及び４から６のいずれか一項に記載の抗体。

【請求項8】

ＨＥＲ１発現Ａ５４９細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−１８５）を用いるウェスタンブロットアッセイで抗体とのインキュベーションから２時間後にＥＧＦの存在下でＨＥＲ１の７０パーセントを超える内部移行を示し、ＨＥＲ１発現Ａ５４９細胞を用いるウェスタンブロットアッセイで抗体とのインキュベーションから２時間後にＥＧＦの非存在下でＨＥＲ１の５５パーセント未満の内部移行を示す、請求項２及び４から７のいずれか一項に記載の単離された抗体。

【請求項9】

ヒト化抗体又はキメラ抗体である、請求項７又は８に記載の抗体。

【請求項10】

完全長ＩｇＧ１抗体又はＩｇＧ４抗体である、請求項７から９のいずれか一項に記載の抗体。

【請求項11】

Ｆａｂ断片である、請求項７から９のいずれか一項に記載の抗体。

【請求項12】

請求項７から９のいずれか一項に記載の抗体及び細胞傷害剤を含む、イムノコンジュゲート。

【請求項13】

請求項７から９のいずれか一項に記載の抗体又は請求項１２に記載のイムノコンジュゲート、及び薬学的に許容される担体を含む、薬学的製剤。

【請求項14】

医薬としての使用のための、請求項７から９のいずれか一項に記載の抗体又は請求項１２に記載のイムノコンジュゲート。

【請求項15】

がんの治療における使用のための、請求項７から９のいずれか一項に記載の抗体又は請求項１２に記載のイムノコンジュゲート。

【請求項16】

ＨＥＲ１／ＨＥＲ２及び／又はＨＥＲ１／ＨＥＲ１二量体化の阻害における使用のための、請求項７から９のいずれか一項に記載の抗体。

【請求項17】

請求項７から９のいずれか一項に記載の抗体をコードする、単離された核酸。

【請求項18】

ｉ）配列番号１２ ＴｔＳｌｙＤｃａｓ−ＨＥＲ１、
ｉｉ）配列番号１３ ＴｔＳｌｙＤｃｙｓ−ＨＥＲ１、
ｉｉｉ）配列番号１４ ＴｔＳｌｙＤ（ＧＳＧ）−ＨＥＲ１、
ｉｖ）配列番号１５ ＴｔＳｌｙＤ（ＣＣ）−ＨＥＲ１、
ｖ）配列番号１６ ＴｔＳｌｙＤ（ＳＳ）−ＨＥＲ１、及び
ｖｉ）配列番号１８ ＴｇＳｌｙＤｃｙｓ−ＨＥＲ１、
からなる群から選択されるポリペプチドであって、配列番号１のアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。

【請求項19】

がんを治療するための医薬であって、請求項７から９のいずれか一項に記載の抗体又は請求項１２に記載のイムノコンジュゲートを含む、医薬。

【請求項20】

ＨＥＲ１／ＨＥＲ２及び／又はＨＥＲ１／ＨＥＲ１二量体化を阻害するための薬剤であって、請求項７から９のいずれか一項に記載の抗体又は請求項１２に記載のイムノコンジュゲートを含む、薬剤。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ＨＥＲ１のベータ−ヘアピンに結合する抗ＨＥＲ１抗原結合性タンパク質、例えば抗ＨＥＲ１抗体、これらの抗原結合性タンパク質を選択する方法、医薬としてのそれらの調製及び使用に関する。

【背景技術】

【0002】

ＨＥＲタンパク質ファミリーは、以下の４メンバーからなる：ＨＥＲ１、別名上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）又はＥｒｂＢ−１、ＨＥＲ２、別名ＥｒｂＢ−２、ＥｒｂＢ−３、別名ＨＥＲ３及びＥｒｂＢ−４、別名ＨＥＲ４。ＥｒｂＢファミリーのタンパク質は受容体チロシンキナーゼであり、細胞の増殖、分化及び生存の重要な媒介物を表す。ＨＥＲファミリーは、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、ニューレグリン（ＮＲＧ）ファミリー、アンフィレグリン及びトランスフォーミング増殖因子−α（ＴＧＦ−ａ）のような上皮増殖因子ファミリー（ＥＧＦ−ファミリー）の異なるリガンドの受容体タンパク質を表す。

【0003】

ＨＥＲ１及び抗ＨＥＲ１抗体
ヒトＨＥＲ１（別名上皮増殖因子受容体ＥＧＦＲ又はＥｒｂ−Ｂ１）は、ｃ−ｅｒｂＢがん原遺伝子によってコードされる１７０ｋＤａ膜貫通型受容体であり、固有のチロシンキナーゼ活性を示す（Modjtahedi, H.等、Br. J. Cancer 73 (1996) 228-235；Herbst, R.S.及びShin, D.M.、Cancer 94 (2002) 1593-1611）。ＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベースエントリー番号Ｐ００５３３は、ＨＥＲ１の配列を提供する（配列番号２）。限定されずにＳｗｉｓｓｐｒｏｔデータベースエントリー番号Ｐ００５３３−１、Ｐ００５３３−２、Ｐ００５３３−３及びＰ００５３３−４によって特定されるものを含む、ＨＥＲ１のアイソフォーム及び変異体（例えば、代替ＲＮＡ転写物、切除型、多型等）もある。ＨＥＲ１は、α）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子−α（ＴＧＦ）、アンフィレグリン、ヘパリン結合性ＥＧＦ（ｈｂ−ＥＧＦ）、ベータセルリン及びエピレグリンを含むリガンドに結合することが公知である（Herbst, R.S.及びShin, D.M.、Cancer 94 (2002) 1593-1611；Mendelsohn, J.及びBaselga, J.、Oncogene 19 (2000) 6550-6565）。ＨＥＲ１は、細胞の増殖、分化、細胞生存、アポトーシス、血管新生、有糸分裂及び転移をコントロールするシグナル伝達経路の活性化を限定されずに含む、チロシンキナーゼ媒介シグナル伝達経路を通して多数の細胞プロセスを調節する（Atalay, G.等、Ann. Oncology 14 (2003) 1346-1363；Tsao, A.S.及びHerbst, R.S.、Signal 4 (2003) 4-9；Herbst, R.S.及びShin, D.M.、Cancer 94 (2002) 1593-1611；Modjtahedi, H.等、Br. J. Cancer 73 (1996) 228-235）。

【0004】

非コンジュゲートモノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、米国食品医薬品局による、進行した乳がんの治療（Grillo-Lopez, A.J.等、Semin. Oncol. 26 (1999) 66-73；Goldenberg, M.M.、Clin. Ther. 21 (1999) 309-18）のためのトラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標）；Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ Ｉｎｃ）の認可、ＣＤ２０陽性Ｂ細胞の低悪性度又は濾胞性の非ホジキンリンパ腫の治療のためのリツキシマブ（Ｒｉｔｕｘａｎ（商標）；ＩＤＥＣ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ及びＧｅｎｅｎｔｅｃｈ Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）の認可、再発した急性の骨髄性白血病の治療のためのゲムツズマブ（Ｍｙｌｏｔａｒｇ（商標）、Ｃｅｌｌｔｅｃｈ／Ｗｙｅｔｈ−Ａｙｅｒｓｔ）の認可及びＢ細胞慢性リンパ球性白血病の治療のためのアレムツズマブ（ＣＡＭＰＡＴＨ（商標）、Ｍｉｌｌｅｎｉｕｍ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ／Ｓｃｈｅｒｉｎｇ ＡＧ）の認可によって実証される通り、がんの治療のための有益な医薬品である可能性がある。これらの製品の成功は、それらの有効性だけでなくそれらの顕著な安全性プロファイルにもよる（Grillo-Lopez, A.J.等、Semin. Oncol. 26 (1999) 66-73；Goldenberg, M.M.、Clin. Ther. 21 (1999) 309-18）。これらの薬物の達成にもかかわらず、非コンジュゲートｍＡｂ療法によって一般的に与えられるものより高い特異的抗体活性を得ることに大きな関心が現在ある。

【0005】

いくつかの研究の結果は、Ｆｃ受容体依存性機構が腫瘍に対する細胞傷害性抗体の作用にかなり寄与することを示唆し、腫瘍に対する最適な抗体は活性化Ｆｃ受容体に優先的に結合し、抑制性パートナーＦｃγＲＩＩＢへの結合は最小限であろうことを示す。（Clynes, R.A.等、Nature Medicine 6(4) (2000) 443-446；Kalergis, A.M.及びRavetch, J.V.、J. Exp. Med. 195(12) (2002) 1653-1659）。例えば、少なくとも１つの研究の結果は、特にＦｃγＲＩＩＩａ受容体の多型が、抗体療法の有効性に強く関連していることを示唆する。（Cartron, G.等、Blood 99 (3) (2002) 754-758）。その研究は、ＦｃγＲＩＩＩａについてホモ接合の患者がヘテロ接合の患者よりリツキシマブへのより優れた応答を示すことを示した。著者は、優れた応答がＦｃγＲＩＩＩａへの抗体のより優れたインビボ結合によると結論づけ、それはリンパ腫細胞に対してより優れたＡＤＣＣ活性をもたらした（Cartron, G.等、Blood 99(3) (2002) 754-758）。

【0006】

ＥＧＦＲを標的にしてＥＧＦＲシグナル伝達経路をブロックする、様々な戦略が報告されている。ゲフィチニブ、エルロチニブ及びＣＩ−１０３３のような小分子チロシンキナーゼ阻害剤は、細胞内チロシンキナーゼ領域でＥＧＦＲの自己リン酸化をブロックし、それによって下流のシグナル伝達事象を阻害する（Tsao, A.S.及びHerbst, R.S.、Signal 4 (2003) 4-9）。他方、モノクローナル抗体はＥＧＦＲの細胞外部分を標的にし、それはリガンド結合のブロッキングをもたらし、それによって細胞増殖などの下流事象を阻害する（Tsao, A.S.及びHerbst, R.S.、Signal 4 (2003) 4-9）。

【0007】

インビトロでそのようなブロックを達成し、マウス異種移植モデルで腫瘍増殖に影響するそれらの能力について評価された、いくつかのマウスモノクローナル抗体が生成されている（Masui, H.等、Cancer Res. 46 (1986) 5592-5598；Masui, H.等、Cancer Res. 44 (1984) 1002-1007；Goldstein, N.等、Clin. Cancer Res. 1 (1995) 1311-1318）。例えば、ＥＭＤ５５９００（ＥＭＤ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）は、ヒト類表皮癌細胞株Ａ４３１に対して作製され、喉頭又は下咽頭の進行した扁平上皮癌患者の臨床試験で試験されたマウス抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体である（Bier, H.等、Eur. Arch. Otohinolaryngol. 252 (1995) 433-9）。さらに、ＥＧＦＲの細胞外ドメインに結合するラットモノクローナル抗体ＩＣＲ１６、ＩＣＲ６２及びＩＣＲ８０は、ＥＧＦ及びＴＧＦ−αの受容体の結合の阻害で有効であることが示された。（Modjtahedi, H.等、Int. J. Cancer 75 (1998) 310-316）。マウスのモノクローナル抗体４２５は、ヒトＡ４３１カルシノーマ細胞株に対して作製され、ヒト上皮増殖因子受容体の外部ドメイン上のポリペプチドエピトープに結合することが見出された別のＭＡｂである。（Murthy, U.等、Arch. Biochem. Biophys. 252(2) (1987) 549-560）。治療的処置におけるマウス抗体の使用上の潜在的な問題は、非ヒトモノクローナル抗体が外来タンパク質としてヒト宿主によって認識される可能性があることであり、したがって、そのような外来抗体の反復注射は、有害な過敏性反応につながる免疫応答の誘導をもたらす可能性がある。マウスをベースとしたモノクローナル抗体の場合、これはヒト抗マウス抗体応答、又は「ＨＡＭＡ」応答、又はヒト抗ラット抗体、又は「ＨＡＲＡ」応答としばしば呼ばれる。さらに、これらの「外来」抗体は、それらの標的部位に到達する前にそれらが実質的に中和されるほど、宿主の免疫系によって攻撃される可能性がある。さらに、非ヒトモノクローナル抗体（例えば、マウスモノクローナル抗体）はヒトエフェクター機能を一般的に欠き、すなわち、それらは、特に、補体依存性溶解を媒介すること、又は抗体依存性細胞傷害性若しくはＦｃ受容体媒介食作用を通してヒト標的細胞を溶解させることができない。

【0008】

２つ以上の異なる種（例えば、マウス及びヒト）からの抗体の一部を含むキメラ抗体が、「コンジュゲート」抗体に代わるものとして開発された。例えば、米国特許第５８９１９９６号（Mateo de Acosta del Rio, C.M.等）はＥＧＦＲに対するマウス／ヒトキメラ抗体Ｒ３について考察し、米国特許第５５５８８６４号はマウス抗ＥＧＦＲ ＭＡｂ４２５のキメラの及びヒト化された形の生成について考察している。さらに、ＩＭＣ−Ｃ２２５（Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標）；ＩｍＣｌｏｎｅ）は、様々なヒト異種移植モデルで抗腫瘍有効性を実証することが報告されている、キメラのマウス／ヒト抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体（マウスＭ２２５モノクローナル抗体をベースにしている、ヒト臨床治験でＨＡＭＡ応答をもたらした）である。（Herbst, R.S.及びShin, D.M.、Cancer 94 (2002) 1593-1611）。ＩＭＣ−Ｃ２２５の有効性は、ＥＧＦＲシグナル伝達経路によって、及びおそらく増加した抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）活性によって調節される細胞事象の阻害を含む、いくつかの機構に帰されている（Herbst, R.S.及びShin, D.M.、Cancer 94 (2002) 1593-1611）。ＩＭＣ−Ｃ２２５は、放射線療法及び化学療法との併用を含む臨床治験でも用いられた（Herbst, R.S.及びShin, D.M.、Cancer 94 (2002) 1593-1611）。近年、Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．（Ｆｒｅｍｏｎｔ、ＣＡ）は、がん療法のためのＡＢＸ−ＥＧＦを開発した。ＡＢＸ−ＥＧＦは、完全にヒトの抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体である。（Yang, X.D.等、Crit. Rev. Oncol./Hematol. 38 (2001) 17-23）。

【0009】

これまでは、ＨＥＲ１のベータ−ヘアピンに特異的に結合する抗原結合性タンパク質、特に抗体を選択することができなかったが、その理由は、ＨＥＲ１のこのベータ−ヘアピンが、ＨＥＲ１の平衡状態でアクセス不可能である隠れたエピトープに相当するからである（図１及びLemmon, MA、Exp Cell Res. Feb 15、2009; 315(4): 638-648を参照）。

【発明の概要】

【0010】

本発明者らは、そのような抗体を得るために、ＳｌｙＤ足場の中に三次元配向で機能的に提示されるＨＥＲ１のベータ−ヘアピン（例えば、図２、並びに配列番号１２から１６及び１８のポリペプチドを参照）を用いる方法を今回見出した。

【0011】

本発明は、ヒトＨＥＲ１に結合する抗原結合性タンパク質、特に抗体を選択する方法であって、
抗原結合性タンパク質、特に抗体はヒトＨＥＲ１のＰＰＬＭＬＹＮＰＴＴＹＱＭＤＶＮＰＥＧＫのアミノ酸配列（配列番号１）の中で結合し；
ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含む
配列番号１２ ＴｔＳｌｙＤｃａｓ−ＨＥＲ１、
配列番号１３ ＴｔＳｌｙＤｃｙｓ−ＨＥＲ１、
配列番号１４ ＴｔＳｌｙＤ（ＧＳＧ）−ＨＥＲ１、
配列番号１５ ＴｔＳｌｙＤ（ＣＣ）−ＨＥＲ１、
配列番号１６ ＴｔＳｌｙＤ（ＳＳ）−ＨＥＲ１、及び
配列番号１８ ＴｇＳｌｙＤｃｙｓ−ＨＥＲ１、
からなる群から選択される少なくとも１つのポリペプチドが、ａ）の下の少なくとも１つのポリペプチドへの結合を示す抗原結合性タンパク質、特に抗体を選択するために用いられ、
それによって、ヒトＨＥＲ１のＰＰＬＭＬＹＮＰＴＴＹＱＭＤＶＮＰＥＧＫのアミノ酸配列（配列番号１）の中で結合する抗原結合性タンパク質、特に抗体を選択する方法を提供する。

【0012】

本発明は、そのような選択方法によって得られる抗原結合性タンパク質、特に抗体を提供する。

【0013】

本発明は、ヒトＨＥＲ１に結合する単離された抗原結合性タンパク質、特に抗体を提供し、抗原結合性タンパク質、特に抗体はヒトＨＥＲ１のＰＰＬＭＬＹＮＰＴＴＹＱＭＤＶＮＰＥＧＫのアミノ酸配列（配列番号１）の中で結合する。

【0014】

本発明は、ヒトＨＥＲ１に結合する単離された抗原結合性タンパク質をさらに提供し、抗原結合性タンパク質は、
配列番号１３ ＴｔＳｌｙＤｃｙｓ−ＨＥＲ１；又は
配列番号１８ ＴｇＳｌｙＤｃｙｓ−ＨＥＲ１
のポリペプチドに結合する。

【0015】

本発明は、ヒトＨＥＲ１に結合する単離された抗原結合性タンパク質をさらに提供し、抗原結合性タンパク質は、
配列番号１３ ＴｔＳｌｙＤｃｙｓ−ＨＥＲ１
のポリペプチドに結合する。

【0016】

本発明は、ヒトＨＥＲ１に結合する単離された抗原結合性タンパク質をさらに提供し、抗原結合性タンパク質は、
配列番号１８ ＴｇＳｌｙＤｃｙｓ−ＨＥＲ１
のポリペプチドに結合する。

【0017】

本発明は、ヒトＨＥＲ１に結合する単離された抗原結合性タンパク質をさらに提供し、
抗原結合性タンパク質は、
配列番号１３のＴｔＳｌｙＤｃｙｓ−ＨＥＲ１のポリペプチドに含まれるＰＰＬＭＬＹＮＰＴＴＹＱＭＤＶＮＰＥＧＫ
のアミノ酸配列（配列番号１）の中で結合する。

【0018】

本発明は、ヒトＨＥＲ１に結合する単離された抗原結合性タンパク質をさらに提供し、
抗原結合性タンパク質は、
配列番号１８のＴｇＳｌｙＤｃｙｓ−ＨＥＲ１のポリペプチドに含まれるＰＰＬＭＬＹＮＰＴＴＹＱＭＤＶＮＰＥＧＫ
のアミノ酸配列（配列番号１）の中で結合する。

【0019】

本発明は、ヒトＨＥＲ１に結合する単離された抗体をさらに提供し、抗体は、
配列番号１３ ＴｔＳｌｙＤｃｙｓ−ＨＥＲ１；又は
配列番号１８ ＴｇＳｌｙＤｃｙｓ−ＨＥＲ１
のポリペプチドに結合する。

【0020】

本発明は、ヒトＨＥＲ１に結合する単離された抗体をさらに提供し、抗体は、
配列番号１３ ＴｔＳｌｙＤｃｙｓ−ＨＥＲ１
のポリペプチドに結合する。

【0021】

本発明は、ヒトＨＥＲ１に結合する単離された抗体をさらに提供し、抗体は、
配列番号１８ ＴｇＳｌｙＤｃｙｓ−ＨＥＲ１
のポリペプチドに結合する。

【0022】

本発明は、ヒトＨＥＲ１に結合する単離された抗体をさらに提供し、抗体は、配列番号１３のＴｔＳｌｙＤｃｙｓ−ＨＥＲ１のポリペプチドに含まれるＰＰＬＭＬＹＮＰＴＴＹＱＭＤＶＮＰＥＧＫのアミノ酸配列（配列番号１）の中で結合する。

【0023】

本発明は、ヒトＨＥＲ１に結合する単離された抗体をさらに提供し、抗体は、配列番号１８のＴｇＳｌｙＤｃｙｓ−ＨＥＲ１のポリペプチドに含まれるＰＰＬＭＬＹＮＰＴＴＹＱＭＤＶＮＰＥＧＫのアミノ酸配列（配列番号１）の中で結合する。

【0024】

好ましい一実施態様では、単離された抗原結合性タンパク質又は抗体は、ＥＧＦの非存在下でＡ５４９がん細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−１８５）においてＨＥＲ１のリン酸化を誘導しない。

【0025】

好ましい一実施態様では、単離された抗原結合性タンパク質又は抗体は、ＥＧＦの非存在下でＡ５４９がん細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−１８５）においてＨＥＲ１のリン酸化に関して非アゴニストである。

【0026】

本発明は、ヒトＨＥＲ１に結合する単離された抗体を提供し、抗体は、活性化ＨＥＲ１のアミノ酸配列の配列番号１に結合する。

【0027】

本発明は、ヒトＨＥＲ１に結合する単離された抗体を提供し、抗体は、活性化ＨＥＲ１のアミノ酸配列の配列番号１に結合し、ＨＥＲ１ホモダイマーのホモ二量体化を阻害する。

【0028】

本発明は、ヒトＨＥＲ１に結合する単離された抗体を提供し、抗体は、活性化ＨＥＲ１のアミノ酸配列の配列番号１に結合し、ＨＥＲ１／ＨＥＲ２ヘテロダイマーのヘテロ二量体化を阻害する。

【0029】

本発明は、ヒトＨＥＲ１に結合する単離された抗体を提供し、抗体は、以下の特性の１つ又は複数を有する：
ａ）配列番号１のアミノ酸配列に結合する；並びに／又は
ｂ）活性化ＨＥＲ１のアミノ酸配列の配列番号１に結合する；並びに／又は
ｃ）
配列番号１２ ＴｔＳｌｙＤｃａｓ−ＨＥＲ１、
配列番号１３ ＴｔＳｌｙＤｃｙｓ−ＨＥＲ１、
配列番号１４ ＴｔＳｌｙＤ（ＧＳＧ）−ＨＥＲ１、
配列番号１５ ＴｔＳｌｙＤ（ＣＣ）−ＨＥＲ１、
配列番号１６ ＴｔＳｌｙＤ（ＳＳ）−ＨＥＲ１、及び
配列番号１８ ＴｇＳｌｙＤｃｙｓ−ＨＥＲ１
からなる群から選択されるポリペプチドに含まれるＰＰＬＭＬＹＮＰＴＴＹＱＭＤＶＮＰＥＧＫのアミノ酸配列（配列番号１）の中で結合する、
並びに／又は
ｄ）ＨＥＲ１のβ−ヘアピン領域に結合する；並びに／又は
ｅ）ＨＥＲ１／ＨＥＲ２ヘテロダイマーのヘテロ二量体化を阻害する；並びに／又は
ｆ）ＨＥＲ２、ＨＥＲ３及び／若しくはＨＥＲ４と交差反応性を有さない；並びに／又は
ｇ）抗体はアミノ酸配列ＴＹＱＭＤＶＮＰＥＧ（配列番号１９）を含む１５アミノ酸の長さのポリペプチドに結合する；及び／又は
ｈ）ＴＹＱＭＤＶＮＰＥＧ（配列番号１９）からなるポリペプチドに結合する；並びに／又は
ｉ）抗体はアミノ酸配列ＭＬＹＮＰＴＴＹＱ（配列番号２０）を含む１５アミノ酸の長さのポリペプチドに結合する；及び／又は
ｊ）ＭＬＹＮＰＴＴＹＱ（配列番号２０）からなるポリペプチドに結合する；並びに／又は
ｋ）ＥＧＦの非存在下でＡ５４９がん細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−１８５）においてＨＥＲ１のリン酸化を誘導しない；並びに／又は
ｌ）ＥＧＦの非存在下でＨＥＲ１のリン酸化に関して非アゴニスト抗体である；並びに／又は
ｍ）ＨＥＲ１発現Ａ５４９細胞（ＡＴＣＣＣＣＬ−１８５）を用いるウェスタンブロットアッセイで抗体とのインキュベーションから２時間後にＥＧＦの存在下でＨＥＲ１の７０パーセントを超える内部移行を示し、ＨＥＲ１発現Ａ５４９細胞を用いるウェスタンブロットアッセイで抗体とのインキュベーションから２時間後にＥＧＦの非存在下でＨＥＲ１の５５パーセント未満の内部移行を示す。

【0030】

一実施態様では、そのような抗ＨＥＲ１抗体はモノクローナル抗体である。

【0031】

一実施態様では、そのような抗ＨＥＲ１抗体は、ヒトの、ヒト化された又はキメラの抗体である。

【0032】

一実施態様では、そのような抗ＨＥＲ１抗体は、ヒトＨＥＲ１に結合する抗体断片である。
ａ）寄託された抗体ＭＡＫ＜ＨＥＲ１−ＤＩＢ＞Ｍ−５０．０９７．１４（ＤＳＭ ＡＣＣ３２４０）の全ての３つの重鎖ＨＶＲ及び全ての３つの軽鎖ＨＶＲ；
ｂ）寄託された抗体ＭＡＫ＜ＨＥＲ１−ＤＩＢ＞Ｍ−５０．１１０．２３（ＤＳＭ ＡＣＣ３２４１）の全ての３つの重鎖ＨＶＲ及び全ての３つの軽鎖ＨＶＲ；
ｃ）寄託された抗体ＭＡＫ＜ＨＥＲ１−ＤＩＢ＞Ｍ−３７．０５８．０９（ＤＳＭ ＡＣＣ３２３８）の全ての３つの重鎖ＨＶＲ及び全ての３つの軽鎖ＨＶＲ；
ｄ）寄託された抗体ＭＡＫ＜ＨＥＲ１−ＤＩＢ＞Ｍ−３７．１８６．１５（ＤＳＭ ＡＣＣ３２３９）の全ての３つの重鎖ＨＶＲ及び全ての３つの軽鎖ＨＶＲ。

【0033】

本発明の一実施態様は、以下を含むヒト化抗ＨＥＲ１抗体である：
ａ）寄託された抗体ＭＡＫ＜ＨＥＲ１−ＤＩＢ＞Ｍ−５０．０９７．１４（ＤＳＭ ＡＣＣ３２４０）の全ての３つの重鎖ＨＶＲ及び全ての３つの軽鎖ＨＶＲ；
ｂ）寄託された抗体ＭＡＫ＜ＨＥＲ１−ＤＩＢ＞Ｍ−５０．１１０．２３（ＤＳＭ ＡＣＣ３２４１）の全ての３つの重鎖ＨＶＲ及び全ての３つの軽鎖ＨＶＲ；
ｃ）寄託された抗体ＭＡＫ＜ＨＥＲ１−ＤＩＢ＞Ｍ−３７．０５８．０９（ＤＳＭ ＡＣＣ３２３８）の全ての３つの重鎖ＨＶＲ及び全ての３つの軽鎖ＨＶＲ；
ｄ）寄託された抗体ＭＡＫ＜ＨＥＲ１−ＤＩＢ＞Ｍ−３７．１８６．１５（ＤＳＭ ＡＣＣ３２３９）の全ての３つの重鎖ＨＶＲ及び全ての３つの軽鎖ＨＶＲ。

【0034】

一実施態様では、そのような抗ＨＥＲ１抗体は、完全長のＩｇＧ１抗体又はＩｇＧ４抗体である。

【0035】

一実施態様では、そのような抗ＨＥＲ１抗体はＦａｂ断片である。

【0036】

本発明は、抗ＨＥＲ１抗体のような単離された核酸をさらに提供する。

【0037】

本発明は、そのような核酸を含む宿主細胞をさらに提供する。

【0038】

本発明は、抗体が生成されるようにそのような宿主細胞を培養することを含む、抗体の生成方法をさらに提供する。

【0039】

一実施態様では、そのような方法は、宿主細胞から抗体を回収することをさらに含む。

【0040】

本発明は、そのような抗ＨＥＲ１抗体及び細胞傷害性剤を含むイムノコンジュゲートをさらに提供する。

【0041】

本発明は、そのような抗ＨＥＲ１抗体及び薬学的に許容される担体を含む薬学的製剤をさらに提供する。

【0042】

本発明は、医薬として用いるための、本明細書に記載される抗ＨＥＲ１抗体をさらに提供する。本発明は、がん治療で使用するための、本明細書に記載される抗ＨＥＲ１抗体、又は抗ＨＥＲ１抗体及び細胞傷害性剤を含むイムノコンジュゲートをさらに提供する。本発明は、ＨＥＲファミリーの二量体化（ＨＥＲ１のホモ若しくはヘテロ二量体化、例えばＨＥＲ１ホモ二量体化又はＨＥＲ１／ＨＥＲ２ヘテロ二量体化）の阻止で使用するための、本明細書に記載される抗ＨＥＲ１抗体をさらに提供する。

【0043】

医薬の製造におけるそのような抗ＨＥＲ１抗体又は抗ＨＥＲ１抗体及び細胞傷害性剤を含むイムノコンジュゲートの使用。医薬ががんの治療のためであるそのような使用。医薬がＨＥＲ１ホモ又はヘテロ二量体化の阻止のためであるそのような使用。

【0044】

本発明は、がんを有する個体を治療する方法であって、本明細書に記載される抗ＨＥＲ１抗体、又は抗ＨＥＲ１抗体及び細胞傷害性剤を含むイムノコンジュゲートの有効量を個体に投与することを含む方法をさらに提供する。

【0045】

本発明は、がんを患っている個体でがん細胞のアポトーシスを誘導する方法であって、本明細書に記載される抗ＨＥＲ１抗体及び細胞傷害性剤を含むイムノコンジュゲートの有効量を個体に投与し、それによって個体でがん細胞のアポトーシスを誘導することを含む方法をさらに提供する。

【0046】

本発明の一実施態様は、
ｉ）配列番号１２ ＴｔＳｌｙＤｃａｓ−ＨＥＲ１、
ｉｉ）配列番号１３ ＴｔＳｌｙＤｃｙｓ−ＨＥＲ１、
ｉｉｉ）配列番号１４ ＴｔＳｌｙＤ（ＧＳＧ）−ＨＥＲ１、
ｉｖ）配列番号１５ ＴｔＳｌｙＤ（ＣＣ）−ＨＥＲ１、
ｖ）配列番号１６ ＴｔＳｌｙＤ（ＳＳ）−ＨＥＲ１、及び
ｖｉ）配列番号１８ ＴｇＳｌｙＤｃｙｓ−ＨＥＲ１、
からなる群から選択されるポリペプチドであり、このポリペプチドは配列番号１のアミノ酸配列を含む。

【0047】

本発明は、実験動物で配列番号１に対する免疫応答を導き出すための、
ｉ）配列番号１２ ＴｔＳｌｙＤｃａｓ−ＨＥＲ１、
ｉｉ）配列番号１３ ＴｔＳｌｙＤｃｙｓ−ＨＥＲ１、
ｉｉｉ）配列番号１４ ＴｔＳｌｙＤ（ＧＳＧ）−ＨＥＲ１、
ｉｖ）配列番号１５ ＴｔＳｌｙＤ（ＣＣ）−ＨＥＲ１、
ｖ）配列番号１６ ＴｔＳｌｙＤ（ＳＳ）−ＨＥＲ１、及び
ｖｉ）配列番号１８ ＴｇＳｌｙＤｃｙｓ−ＨＥＲ１、
からなる群から選択されるそのようなポリペプチドの１つの使用をさらに提供する。

【0048】

本発明は、以下の工程を含む、配列番号１のアミノ酸配列を有するＨＥＲ１のβ−ヘアピンに特異的に結合する抗体を生成するための方法をさらに提供する：
ａ）実験動物に、
ｉ）配列番号１２ ＴｔＳｌｙＤｃａｓ−ＨＥＲ１、
ｉｉ）配列番号１３ ＴｔＳｌｙＤｃｙｓ−ＨＥＲ１、
ｉｉｉ）配列番号１４ ＴｔＳｌｙＤ（ＧＳＧ）−ＨＥＲ１、
ｉｖ）配列番号１５ ＴｔＳｌｙＤ（ＣＣ）−ＨＥＲ１、
ｖ）配列番号１６ ＴｔＳｌｙＤ（ＳＳ）−ＨＥＲ１、及び
ｖｉ）配列番号１８ ＴｇＳｌｙＤｃｙｓ−ＨＥＲ１、
なる群から選択されるポリペプチドを少なくとも１回投与する工程であって、ポリペプチドは配列番号１のアミノ酸配列を有するＨＥＲ１のβ−ヘアピンを含む、工程、
ｂ）ポリペプチドの最後の投与の３日から１０日後に配列番号１のアミノ酸配列を有するＨＥＲ１のβ−ヘアピンに特異的に結合する抗体を生成するＢ細胞を実験動物から回収する工程、並びに
ｃ）配列番号１のアミノ酸配列を有するＨＥＲ１のβ−ヘアピンに特異的に結合する抗体をコードする核酸を含む細胞を培養し、細胞又は培地から抗体を回収し、それによって標的抗原に特異的に結合する抗体を生成する工程。

【0049】

本発明は、エピトープマッピングのための
ｉ）配列番号１２ ＴｔＳｌｙＤｃａｓ−ＨＥＲ１、
ｉｉ）配列番号１３ ＴｔＳｌｙＤｃｙｓ−ＨＥＲ１、
ｉｉｉ）配列番号１４ ＴｔＳｌｙＤ（ＧＳＧ）−ＨＥＲ１、
ｉｖ）配列番号１５ ＴｔＳｌｙＤ（ＣＣ）−ＨＥＲ１、
ｖ）配列番号１６ ＴｔＳｌｙＤ（ＳＳ）−ＨＥＲ１、及び
ｖｉ）配列番号１８ ＴｇＳｌｙＤｃｙｓ−ＨＥＲ１
からなる群から選択されるポリペプチドの使用をさらに提供し、ポリペプチドは配列番号１のアミノ酸配列を有するＨＥＲ１のβ−ヘアピンにエピトープを含む。

【0050】

ＳｌｙＤ足場の中に三次元配向で機能的に提示されるＨＥＲ１のベータ−ヘアピン（例えば、図２、並びに配列番号１２から１６及び１８のポリペプチドを参照）を用いることによって、このベータ−ヘアピンに結合する本明細書に記載の抗ＨＥＲ１抗原結合性タンパク質、特に抗体を選択することができた。本発明による抗原結合性タンパク質、特に抗体がＨＥＲ１の活性型への結合などの非常に価値ある特性を有し、したがって、ＥＧＦの非存在下でより存在下でそれらが明らかにより強力なＨＥＲ１内部移行を示すことが判明した。それらは、ＥＧＦの非存在下ではＨＥＲ１のリン酸化に関して非アゴニスト抗体である（それらはＨＥＲ１発現がん細胞でＨＥＲ１のリン酸化を誘導しない）（したがって、ＨＥＲ１抗体療法の間に、例えば皮膚の発疹のような副作用はより少ない可能性がある）。

【図面の簡単な説明】

【0051】

【図1】「閉鎖的」及び「開放的」なＨＥＲ１の立体配置並びに立体配置変化へのＥＧＦリガンドの影響の概略図である。

【図2】テルムス・テルモフィレス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ）のＳｌｙＤ足場の中に三次元配向で機能的に提示されるＨＥＲ１のベータ−ヘアピンの３Ｄ構造を示す図である。

【図3】ＴｔＳｌｙＤ−ｃａｓ−Ｈｅｒ１のＮｉ−ＮＴＡ精製のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す図である。Ｅは、精製された画分を示す。ＳＮ：精製前の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）溶解物上清。

【図4】テルムス・テルモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＴｔＳｌｙＤ−ｃａｓ−Ｈｅｒ１のＮｉ−ＮＴＡ精製画分のＳＥＣ溶出プロファイルを示す図である。

【図5】ヒトＨＥＲ１のβ−ヘアピンに結合する選択された抗体Ｍ−３１−２２、Ｍ−４７−１３、Ｍ−５０−１４（寄託されたＭＡＫ＜ＨＥＲ１−ＤＩＢ＞Ｍ−５０．０９７．１４）及びＭ−５０−２３（寄託されたＭＡＫ＜ＨＥＲ１−ＤＩＢ＞Ｍ−５０．１１０．２３）のＩＨＣでの特異性及び反応性の試験を示す図である。示すように、ＨＥＲ１の検出に特異的な全ての抗体はＨＥＲファミリーの他のメンバー（ＨＥＲ２、ＨＥＲ３及びＨＥＲ４）と交差反応性を示さない。

【図6】エピトープマッピング及びアラニンスキャン手法の戦略を示す図である。それらの構造的な埋め込み（構造的）を含むＨＥＲ１（ＥＧＦＲ）ＥＣＤ、Ｈｅｒ−２ ＥＣＤ、Ｈｅｒ−３ ＥＣＤ及びＨｅｒ−４ ＥＣＤのペプチドヘアピン配列（ペプチドヘアピン）を調査した。システインは、セリンと置き換えられた。

【図7】ＨＥＲ１抗体Ｍ−３１−２２、Ｍ−４７−１３、Ｍ−５０−１４（寄託されたＭＡＫ＜ＨＥＲ１−ＤＩＢ＞Ｍ−５０．０９７．１４）及びＭ−５０−２３（寄託されたＭＡＫ＜ＨＥＲ１−ＤＩＢ＞Ｍ−５０．１１０．２３）のエピトープのＣｅｌｌｕＳｐｏｔｓ（商標）合成及びエピトープマッピングを示す図である。Ｍ−４７−１３は、ＨＥＲ１ ＥＣＤ結合性エピトープＴＹＱＭＤＶＮＰＥＧ（配列番号１９）に結合する。Ｍ−５０−１４（寄託されたＭＡＫ＜ＨＥＲ１−ＤＩＢ＞Ｍ−５０．０９７．１４）及びＭ−５０−２３（寄託されたＭＡＫ＜ＨＥＲ１−ＤＩＢ＞Ｍ−５０．１１０．２３）はＨＥＲ１ ＥＣＤ結合性エピトープＭＬＹＮＰＴＴＹＱ（配列番号２０）に結合する−結合に最も寄与するアミノ酸は下線が引かれ／太字である。

【図8A】８Ａ（Ａ５４９細胞）を示す図である。左のレーンはＥＧＦの非存在下又は存在下でのＨＥＲ１の検出を示し、右のレーンはリン酸化されたＨＥＲ１の検出を示す。 このがん細胞株で、抗ＨＥＲ１β−ヘアピン抗体ＨＥＲ１ ｄｉｂ１＝Ｍ−５０−１４（＝寄託されたＭＡＫ＜ＨＥＲ１−ＤＩＢ＞Ｍ−５０．０９７．１４）、ＨＥＲ１ ｄｉｂ２＝Ｍ−５０−２３（＝寄託されたＭＡＫ＜ＨＥＲ１−ＤＩＢ＞Ｍ−５０．１１０．２３）及びＨＥＲ１ ｄｉｂ３＝Ｍ−４７−１５は、ＥＧＦの非存在下でＨＥＲ１のリン酸化に関して非アゴニスト抗体としての働きをし（ＨＥＲ１のリン酸化の誘導なし、−ＥＧＦレーン）、例えば国際公開第２００６／０８２５１５号に記載されるセツキシマブ、ＧＡ２０１、又はＡＢＴ８０６（ｍＡｂ８０６、例えば米国特許出願第２０１１／００７６２３２号に記載される）のような他のＨＥＲ１抗体は、リン酸化を強く誘導した（抗体のない培地と比較して）。

【図8B】８Ｂ（Ａ４３１細胞、わずかな構成的に活性化／リン酸化されたＨＥＲ１による強力なＨＥＲ１発現）を示す図である。左のレーンはＥＧＦの非存在下又は存在下でのＨＥＲ１の検出を示し、右のレーンはリン酸化されたＨＥＲ１の検出を示す。 このがん細胞株で、抗ＨＥＲ１β−ヘアピン抗体ＨＥＲ１ ｄｉｂ１＝Ｍ−５０−１４（＝寄託されたＭＡＫ＜ＨＥＲ１−ＤＩＢ＞Ｍ−５０．０９７．１４）、ＨＥＲ１ ｄｉｂ２＝Ｍ−５０−２３（＝寄託されたＭＡＫ＜ＨＥＲ１−ＤＩＢ＞Ｍ−５０．１１０．２３）及びＨＥＲ１ ｄｉｂ３＝Ｍ−４７−１５は、ＥＧＦの非存在下でＨＥＲ１のリン酸化に関して非アゴニスト抗体としての働きをし（ＨＥＲ１のリン酸化の誘導なし、−ＥＧＦレーン）、例えば国際公開第２００６／０８２５１５号に記載されるセツキシマブ、ＧＡ２０１、又はＡＢＴ８０６（ｍＡｂ８０６、例えば米国特許出願第２０１１／００７６２３２号に記載される）のような他のＨＥＲ１抗体は、リン酸化を強く誘導した（抗体のない培地と比較して）。

【図9】抗ＨＥＲ１β−ヘアピン抗体への抗ＨＥＲ１β−ヘアピン抗体の結合及びその内部移行を、ＨＥＲ１発現がん細胞株Ａ５４９を用いるウェスタンブロットで分析した図である。左側はＥＧＦの非存在下での時間依存性ＨＥＲ１検出を示し、右側はＥＧＦの存在下での時間依存性ＨＥＲ１検出を示す。抗体Ｍ−５０−１４は、ＥＧＦの非存在下でよりその存在下で明らかにより強力なＨＥＲ１内部移行を示す。（ＨＥＲ１発現Ａ５４９細胞を用いるウェスタンブロットアッセイで抗体とのインキュベーションから２時間後にＥＧＦの存在下でＨＥＲ１の７０パーセントを超える内部移行、及びＨＥＲ１発現Ａ５４９細胞を用いるウェスタンブロットアッセイで抗体とのインキュベーションから２時間後にＥＧＦの非存在下でＨＥＲ１の５５パーセント未満の内部移行）。

【図10】ＥＧＦの存在下でＨＥＲ１−ＥＣＤへの本発明の異なる抗体の結合を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0052】

Ｉ．定義
本明細書において、「アクセプターヒトフレームワーク」は、下に規定されるように、ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークに由来する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）フレームワーク又は重鎖可変ドメイン（ＶＨ）フレームワークのアミノ酸配列を含むフレームワークである。ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワーク「に由来する」アクセプターヒトフレームワークは、その同じアミノ酸配列を含むことができるか、又はそれはアミノ酸配列変化を含有することができる。一部の実施態様では、アミノ酸変化の数は、１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、３以下又は２以下である。一部の実施態様では、ＶＬアクセプターヒトフレームワークは、ＶＬヒト免疫グロブリンフレームワーク配列又はヒトコンセンサスフレームワーク配列と配列が同一である。

【0053】

「親和性成熟」抗体は、そのような改変を有さない親抗体と比較して、１つ又は複数の超可変領域（ＨＶＲ）に１つ又は複数の改変を有する抗体を指し、そのような改変は抗原への抗体の親和性の向上をもたらす。

【0054】

本明細書で用いる用語「抗原結合性タンパク質」は、本明細書に記載される抗体又は足場の抗原結合性タンパク質を指す。好ましい一実施態様では、抗原結合性タンパク質は、本明細書に記載される抗体である。足場の抗原結合性タンパク質は当該技術分野で公知であり、例えば、フィブロネクチン及び設計されたアンキリン反復配列タンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）が抗原結合性ドメインの代替の足場として用いられている、例えば、Ｇｅｂａｕｅｒ及びＳｋｅｒｒａ、Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｃａｆｆｏｌｄｓ ａｓ ｎｅｘｔ−ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ。Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ１３：２４５−２５５（２００９）及びＳｔｕｍｐｐ等、Ｄａｒｐｉｎｓ：Ａ ｎｅｗ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ。Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ Ｔｏｄａｙ １３：６９５−７０１（２００８）を参照、その両方は出典明示により完全に本明細書に援用される。Ｂ．本発明の抗原結合性タンパク質のための親可変ドメイン及び受容体の選択基準。一実施態様では、足場の抗原結合性タンパク質は、ＣＴＬＡ−４（エビボディ）；リポカリン；プロテインＡ由来の分子、例えばプロテインＡのＺ−ドメイン（アフィボディ、ＳｐＡ）、Ａ−ドメイン（アビマー／マキシボディ）；熱ショックタンパク質、例えばＧｒｏＥＩ及びＧｒｏＥＳ；トランスフェリン（トランス体）；アンキリン反復配列タンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）；ペプチドアプタマー；Ｃ型レクチンドメイン（テトラネクチン）；ヒト．ガンマ．−クリスタリン及びヒトユビキチン（アフィリン）；ＰＤＺドメイン；ヒトプロテアーゼ阻害剤のサソリ毒クニッツ型ドメイン；並びにフィブロネクチン（アドネクチン）；からなる群から選択され、これらは、天然リガンド以外のリガンドへの結合を得るために、タンパク質工学にかけられた。

【0055】

ＣＴＬＡ−４（細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４）は、主にＣＤ４＋Ｔ細胞で発現されるＣＤ２８ファミリーの受容体である。その細胞外ドメインは、可変ドメイン様のＩｇひだを有する。異なる結合特性を付与するために、抗体のＣＤＲに対応するループは異種配列で置換されてもよい。異なる結合特異性を有するように操作されたＣＴＬＡ−４分子は、エビボディとしても知られる。詳しくは、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ２４８（１−２）、３１−４５（２００１）を参照されたい。

【0056】

リポカリンは、ステロイド、ビリン、レチノイド及び脂質などの小さい疎水性分子を運搬する細胞外タンパク質のファミリーである。それらは、異なる標的抗原に結合するように操作することができる、円錐構造の開放端にいくつかのループを有する、強固なベータシート二次構造を有する。アンチカリンはサイズが１６０−１８０アミノ酸であり、リポカリンに由来する。詳しくは、Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １４８２：３３７−３５０（２０００）、米国特許第７２５０２９７Ｂ１号及び米国特許出願公開第２００７０２２４６３３号を参照されたい。

【0057】

アフィボディは、抗原に結合するように操作することができる、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）のプロテインＡに由来する足場である。このドメインは、概ね５８アミノ酸の３螺旋束からなる。表面残基のランダム化によって、ライブラリーが生成されている。詳しくは、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．Ｄｅｓ．ＳｅＩ．１７、４５５−４６２（２００４）及び欧州特許出願公開第１６４１８１８Ａ１号を参照されたい。アビマーは、Ａドメイン足場ファミリーに由来する多ドメインタンパク質である。概ね３５アミノ酸の天然ドメインは、規定のジスルフィド結合構造を採用する。多様性は、Ａドメインのファミリーが示す天然の変異のシャッフリングによって生成される。詳しくは、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ２３（１２）、１５５６−１５６１（２００５）及びＥｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｏｎ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎａｌ Ｄｒｕｇｓ１６（６）、９０９−９１７（Ｊｕｎｅ ２００７）を参照されたい。

【0058】

トランスフェリンは、モノマーの血清輸送糖タンパク質である。トランスフェリンは、許容表面ループ中のペプチド配列の挿入によって異なる標的抗原に結合するように操作することができる。操作されたトランスフェリン足場の例には、トランス体が含まれる。詳しくは、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ２７４、２４０６６−２４０７３（１９９９）を参照されたい。

【0059】

設計されたアンキリン反復配列タンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）は、細胞骨格への必要不可欠な膜タンパク質の結合を媒介するタンパク質のファミリーであるアンキリンに由来する。単一のアンキリン反復配列は、２つのアルファヘリックス及びベータターンからなる３３残基のモチーフである。それらは、各反復配列の第１のアルファヘリックス及びベータターンの残基をランダム化することによって異なる標的抗原に結合するように操作することができる。それらの結合界面は、モジュールの数を増加することによって増加することができる（親和性成熟の方法）。詳しくは、Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．３３２、４８９−５０３（２００３）、ＰＮＡＳ１００（４）、１７００−１７０５（２００３）及びＪ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．３６９、１０１５−１０２８（２００７）及び米国特許出願公開第２００４０１３２０２８Ａ１号を参照されたい。

【0060】

フィブロネクチンは、抗原に結合するように操作することができる足場である。アドネクチンは、ヒトフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）の１５反復単位の第１０ドメインの天然のアミノ酸配列の骨格からなる。ベータサンドイッチの一端の３つのループは、アドネクチンが目的の治療標的を特異的に認識することを可能にするように操作することができる。詳しくは、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．Ｄｅｓ．ＳｅＩ．１８、４３５−４４４（２００５）、米国特許出願公開第２００８０１３９７９１号、国際公開第２００５０５６７６４号及び米国特許第６８１８４１８Ｂ１号を参照されたい。

【0061】

ペプチドアプタマーは、定常足場タンパク質、一般的に活性部位に挿入される抑制された可変ペプチドループを含有するチオレドキシン（ＴｒｘＡ）からなるコンビナトリアル認識分子である。詳しくは、Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．５、７８３−７９７（２００５）を参照されたい。

【0062】

ミクロボディーは、３−４システイン架橋を含有する長さが２５−５０アミノ酸の天然に存在する微小タンパク質に由来する−微小タンパク質の例にはＫａｌａｔａＢＩ及びコノトキシン及びノッチンが含まれる。微小タンパク質は、微小タンパク質の全体のひだに影響することなく最高２５個のアミノ酸を含むように操作することができるループを有する。操作されたノッチンドメインの詳細については、国際公開第２００８０９８７９６号を参照されたい。

【0063】

他の抗原結合性タンパク質には、異なる標的抗原結合特性を操作するための足場として用いられているタンパク質、例えば、ヒトガンマ−クリスタリン及びヒトユビキチン（アフィリン）、ヒトプロテアーゼ阻害剤のクニッツ型のドメイン、Ｒａｓ結合性タンパク質ＡＦ−６のＰＤＺドメイン、サソリ毒（カリブドトキシン）、Ｃ型レクチンドメイン（テトラネクチン）が含まれ、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（２００７、Ｓｔｅｆａｎ Ｄｕｂｅｌ編）からのＣｈａｐｔｅｒ７−Ｎｏｎ−Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｓｃａｆｆｏｌｄｓ及びＰｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ１５：１４−２７（２００６）でレビューされている。本発明のエピトープ結合性ドメインは、これらの代替タンパク質ドメインのいずれに由来してもよい。

【0064】

用語「抗ＨＥＲ１抗原結合性タンパク質」、「（ヒト）ＨＥＲ１に結合する抗原結合性タンパク質」及び「ヒトＨＥＲ１に特異的に結合する抗原結合性タンパク質」は、抗原結合性タンパク質がＨＥＲ１を標的にすることにおいて診断薬及び／又は治療剤として有益であるように、十分な親和性でＨＥＲ１に結合することが可能である抗原結合性タンパク質を指す。一実施態様では、例えば表面プラズモン共鳴アッセイ（例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ）で測定したときの、無関係な非ＨＥＲ１タンパク質への抗ＨＥＲ１抗原結合性タンパク質の結合の程度は、ＨＥＲ１への抗原結合性タンパク質の結合の約１０％未満である。ある特定の実施態様では、ヒトＨＥＲ１に結合する抗原結合性タンパク質は、ヒトＨＥＲ１への結合に関して≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ又は≦０．００１ｎＭ（例えば、１０^−８Ｍ以下、例えば１０^−８Ｍから１０^−１３Ｍ、例えば１０^−９Ｍから１０^−１３Ｍ）の結合親和性のＫＤ値を有する。好ましい一実施態様では、結合親和性のそれぞれのＫＤ値は、ＨＥＲ１結合親和性のためのヒトＨＥＲ１（ＨＥＲ１−ＥＣＤ）の野生型細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を用いる表面プラズモン共鳴アッセイで判定される。

【0065】

用語「抗ＨＥＲ１抗体」、「（ヒト）ＨＥＲ１に結合する抗体」及び「ヒトＨＥＲ１に特異的に結合する抗体」は、抗体がＨＥＲ１を標的にすることにおいて診断薬及び／又は治療剤として有益であるように、十分な親和性でＨＥＲ１に結合することが可能である抗体を指す。一実施態様では、例えば表面プラズモン共鳴アッセイ（例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ）で測定したときの、無関係な非ＨＥＲ１タンパク質への抗ＨＥＲ１抗体の結合の程度は、ＨＥＲ１への抗体の結合の約１０％未満である。ある特定の実施態様では、ヒトＨＥＲ１に結合する抗体は、ヒトＨＥＲ１への結合に関して≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ又は≦０．００１ｎＭ（例えば、１０^−８Ｍ以下、例えば１０^−８Ｍから１０^−１３Ｍ、例えば１０^−９Ｍから１０^−１３Ｍ）の結合親和性のＫＤ値を有する。好ましい一実施態様では、結合親和性のそれぞれのＫＤ値は、ＨＥＲ１結合親和性のためのヒトＨＥＲ１（ＨＥＲ１−ＥＣＤ）の野生型細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を用いる表面プラズモン共鳴アッセイで判定される。

【0066】

本明細書で用いる用語「活性化ＨＥＲ１中のアミノ酸配列の配列番号１に結合する抗ＨＥＲ１抗原結合性タンパク質又は抗ＨＥＲ１抗体」は、ヒトＨＥＲ１−ＥＣＤに含まれるアミノ酸配列の配列番号１に結合する抗ＨＥＲ１抗原結合性タンパク質又は抗ＨＥＲ１抗体を指す。

【0067】

好ましい一実施態様では、本明細書で用いる用語「アミノ酸配列の配列番号１に結合する抗ＨＥＲ１抗原結合性タンパク質又は抗ＨＥＲ１抗体」は、配列番号１３のポリペプチド（ＴｔＳｌｙＤｃｙｓ−ＨＥＲ１）に含まれるアミノ酸配列の配列番号１に結合する抗ＨＥＲ１抗原結合性タンパク質又は抗ＨＥＲ１抗体を指す。

【0068】

一実施態様では、用語「活性化ＨＥＲ１中のアミノ酸配列の配列番号１に結合する抗ＨＥＲ１抗原結合性タンパク質又は抗ＨＥＲ１抗体」は、配列番号１３のポリペプチド（ＴｔＳｌｙＤｃｙｓ−ＨＥＲ１）に含まれるアミノ酸配列の配列番号１に結合する抗ＨＥＲ１抗原結合性タンパク質又は抗ＨＥＲ１抗体を指す。

【0069】

本明細書において、用語「抗体」は最も広い意味で用いられ、限定されずにモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、及び、それらが所望の抗原結合活性を示す限り抗体断片を含む、様々な抗体構造物を包含する。

【0070】

「抗体断片」は、インタクトな抗体が結合する抗原に結合するインタクトな抗体の一部を含む、インタクトな抗体以外の分子を指す。抗体断片の例には、限定されずに、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）_２；ダイアボディ；線状抗体；単鎖抗体分子（例えばｓｃＦｖ）；及び抗体断片から形成される多重特異性抗体が含まれる。

【0071】

参照抗体と「同じエピトープに結合する抗体」は、競合アッセイにおいてその抗原への参照抗体の結合を５０％以上ブロックする抗体を指し、反対に、参照抗体は競合アッセイにおいてその抗原へのその抗体の結合を５０％以上ブロックする。例示的な競合アッセイが、本明細書で提供される。

【0072】

用語「それがヒトＨＥＲ２、ＨＥＲ３及び／又はＨＥＲ４の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）と交差反応しないとき、すなわち、表面プラズモン共鳴アッセイで測定される結合性シグナル（相対単位（ＲＵ）の）がバックグラウンドシグナル（ノイズ）の３倍未満であるとき（例えば、抗原としてヒトＨＥＲ２、ＨＥＲ３及び／又はＨＥＲ４−ＥＣＤが可溶型被分析物［０］として注入される固定化（例えば捕捉された）抗体により２５℃で）、（ヒト）ＨＥＲ２、ＨＥＲ３及び／又はＨＥＲ４と交差反応性を有する／示す（又は代わりに交差反応する）抗体（又は抗原結合性タンパク質）。

【0073】

本明細書で用いる用語「がん」は、例えば、肺がん、非小細胞肺（ＮＳＣＬ）がん、細気管支肺胞上皮細胞肺がん、骨がん、膵臓がん、皮膚がん、頭頚部がん、皮膚若しくは眼内黒色腫、子宮がん、卵巣がん、直腸がん、肛門部のがん、腹部がん、胃がん、結腸がん、乳がん、子宮がん、卵管癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、膣癌、外陰癌、ホジキン病、食道がん、小腸がん、内分泌系のがん、甲状腺がん、副甲状腺がん、副腎がん、軟部組織の肉腫、尿道がん、陰茎がん、前立腺がん、膀胱がん、腎臓若しくは尿管がん、腎細胞癌、腎盂癌、中皮腫、肝細胞がん、胆道がん、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、脊髄腫瘍、脳幹神経膠腫、多形性神経膠芽腫、星状細胞腫、神経鞘腫、上衣細胞腫、髄芽腫、髄膜腫、扁平上皮癌、下垂体腺腫、リンパ腫、リンパ性白血病、並びに上記のがんのいずれかの難治性型のもの、又は上記のがんの１つ又は複数の組合せであってもよい。好ましい一実施態様では、そのようながんは、乳がん、卵巣がん、子宮頸がん、肺がん又は前立腺がんである。好ましい一実施態様では、そのようながんは、ＨＥＲ１の発現又は過剰発現でさらに特徴付けられる。さらなる一実施態様では、本発明は、原発腫瘍及び新規転移の同時治療で用いるための本発明の抗ＨＥＲ１抗体である。

【0074】

用語「キメラ」抗体は、重鎖及び／又は軽鎖の一部は特定の供給源又は種に由来するが、重鎖及び／又は軽鎖の残部は異なる供給源又は種に由来する抗体を指す。

【0075】

抗体の「クラス」は、その重鎖が保有する定常ドメイン又は定常領域の種類を指す。抗体の５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭがあり、これらのいくつかはサブクラス（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２、ＩｇＧ_３、ＩｇＧ_４、ＩｇＡ_１及びＩｇＡ_２にさらに分けることができる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、α、δ、ε、γ及びμとそれぞれ呼ばれている。

【0076】

本明細書で用いられる用語「細胞傷害性剤」は、細胞の機能を阻害若しくは阻止し、及び／又は細胞の死若しくは破壊を引き起こす物質を指す。細胞傷害性剤には、限定されずに、放射性同位体（例えば、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２及びＬｕの放射性同位体）；化学療法の剤又は薬物（例えば、メトトレキセート、アドリアマイシン、ビンカアルカロイド（ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド）、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロラムブシル、ダウノルビシン又は他の挿入剤）；成長阻害剤；核酸分解酵素などの酵素及びその断片；抗生物質；その断片及び／又は変異体を含む毒素、例えば小分子毒素又は細菌、真菌、植物若しくは動物起源の酵素活性毒素；並びに下で開示される様々な抗腫瘍又は抗がん剤が含まれる。好ましい一実施態様では、「細胞傷害性剤」はシュードモナス外毒素Ａ又はその変異体である。好ましい一実施態様では、「細胞傷害性剤」はアマトキシン又はその変異体である。

【0077】

本明細書で用いる用語「寄託された抗体」は、呼称及び寄託番号によって識別されるそれぞれの寄託されたハイブリドーマ細胞によって生成される抗体を指す。下の生体物質の寄託も参照されたい。

【0078】

「エフェクター機能」は、抗体アイソタイプによって異なる、抗体のＦｃ領域に帰せられる生物活性を指す。抗体のエフェクター機能の例には、以下のものが含まれる：Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）；Ｆｃ受容体結合；抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）；食作用；細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）の下方制御；及びＢ細胞活性化。

【0079】

薬剤、例えば薬学的製剤の「有効量」は、必要な投薬量及び期間で、所望の治療的又は予防的結果を達成するのに有効な量を指す。

【0080】

用語「エピトープ」には、抗体への特異的結合が可能である任意のポリペプチド決定因子が含まれる。ある特定の実施態様では、エピトープ決定因子は、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル又はスルホニルなどの分子の化学的活性表面基を含み、ある特定の実施態様では、特異的３次元構造特徴及び又は特異的荷電特徴を有することができる。エピトープは、抗体が結合する抗原の領域である。

【0081】

本明細書の用語「Ｆｃ領域」は、定常領域の少なくとも一部を含む、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を規定するために用いられる。この用語は、天然配列のＦｃ領域及び変異Ｆｃ領域を含む。一実施態様では、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、Ｃｙｓ２２６から、又はＰｒｏ２３０から重鎖のカルボキシル末端まで伸びている。しかし、Ｆｃ領域のＣ末端のリジン（Ｌｙｓ４４７）は、存在しても存在しなくてもよい。本明細書で特記されない限り、Ｆｃ領域又は定常領域のアミノ酸残基の番号付けは、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．等、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、５版、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ（１９９１）、ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ９１−３２４２に記載されるように、ＥＵインデックスとも呼ばれるＥＵ番号付け系による。

【0082】

「フレームワーク」又は「ＦＲ」は、超可変領域（ＨＶＲ）残基以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのＦＲは、４つのＦＲドメイン：ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４から一般になる。したがって、ＨＶＲ及びＦＲ配列は、ＶＨ（又はＶＬ）において以下の配列で一般に出現する：ＦＲ１−Ｈ１（Ｌ１）−ＦＲ２−Ｈ２（Ｌ２）−ＦＲ３−Ｈ３（Ｌ３）−ＦＲ４。

【0083】

本明細書において、用語「完全長抗体」、「インタクトな抗体」及び「全抗体」は互換的に使用されて、天然の抗体構造に実質的に類似した構造を有するか、又は本明細書に規定されるＦｃ領域を含有する重鎖を有する抗体を指す。

【0084】

用語「宿主細胞」、「宿主細胞株」及び「宿主細胞培養」は互換的に使用されて、そのような細胞の子孫を含む、外因性の核酸が導入された細胞を指す。宿主細胞には「形質転換体」及び「形質転換細胞」が含まれ、それらには、一次形質転換細胞及び継代数に関係なくそれに由来する子孫が含まれる。子孫は親細胞と核酸内容が完全に同一でなくてもよく、突然変異を含有することができる。当初形質転換された細胞でスクリーニング又は選択されたのと同じ機能又は生物活性を有する突然変異体子孫が、本明細書に含まれる。

【0085】

「ヒト抗体」は、ヒト若しくはヒト細胞によって生成される抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列、又はヒト抗体レパートリー、若しくは他のヒト抗体をコードする配列を利用する、ヒト以外の供給源に由来するアミノ酸配列を有する抗体である。ヒト抗体のこの定義は、ヒト以外の抗原結合残基を含むヒト化抗体を特異的に排除する。

【0086】

「ヒトコンセンサスフレームワーク」は、一連のヒト免疫グロブリンのＶＬ又はＶＨフレームワーク配列で最も一般的に見られるアミノ酸残基を表すフレームワークである。一般に、ヒト免疫グロブリンのＶＬ又はＶＨ配列の選択は、可変ドメイン配列のサブグループからである。一般に、配列のサブグループは、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．等、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、５版、Ｂｅｔｈｅｓｄａ ＭＤ（１９９１）、ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ９１−３２４２、１−３巻の中のサブグループである。一実施態様では、ＶＬについては、サブグループは、上記のカバット等におけるサブグループカッパＩである。一実施態様では、ＶＨについては、サブグループは、上記のカバット等におけるサブグループＩＩＩである。

【0087】

「ヒト化」抗体は、ヒト以外のＨＶＲからのアミノ酸残基及びヒトＦＲからのアミノ酸残基を含むキメラ抗体を指す。ある特定の実施態様では、ヒト化抗体は、少なくとも１つの、及び一般的に２つの可変ドメインの実質的に全てを含み、そこにおいて、ＨＶＲ（例えばＣＤＲ）の全て又は実質的に全てはヒト以外の抗体のそれらに対応し、ＦＲの全て又は実質的に全てはヒト抗体のそれらに対応する。ヒト化抗体は、ヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも一部を任意選択的に含むことができる。抗体、例えばヒト以外の抗体の「ヒト化変異体」は、ヒト化を経た抗体を指す。好ましい一実施態様では、「ヒト化抗体」を調製するために、マウスＨＶＲがヒト抗体のフレームワーク領域に接がれる。例えばＲｉｅｃｈｍａｎｎ，Ｌ．等、Ｎａｔｕｒｅ３３２（１９８８）３２３−３２７；及びＮｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｍ．Ｓ．等、Ｎａｔｕｒｅ３１４（１９８５）２６８−２７０を参照されたい。マウスの可変領域アミノ酸配列はヒト生殖系列抗体Ｖ遺伝子の集合と整列させられ、配列同一性及び相同性によって選別される。アクセプター配列は、高い全体的配列相同性、及び任意選択的にアクセプター配列中に正しい正規の残基が既に存在することにも基づいて選択される（Poul, M-A.及びLefranc, M-P., in "Ingenierie des anticorps banques combinatores"、Lefranc, M-P.及びLefranc, G.編、Les Editions INSERM、1997を参照されたい）。生殖系列Ｖ遺伝子は、重鎖についてはＨＶＲ３の始めまで、及び軽鎖のＨＶＲ３の中央までの領域だけをコードする。したがって、生殖系列Ｖ遺伝子の遺伝子は、全Ｖドメインにわたっては整列させられない。ヒト化コンストラクトは、軽鎖及び重鎖のために、ヒトフレームワーク１−３、マウスのＨＶＲ、並びにヒトＪＫ４及びＪＨ４配列に由来するヒトフレームワーク４配列をそれぞれ含む。１つの特定のアクセプター配列を選択する前に、ドナー抗体のいわゆる正規ループ構造を決定することができる（Morea, V.等、 Methods、20巻、3版(2000) 267-279を参照する）。これらの正規ループ構造は、いわゆる正規の位置に存在する残基のタイプによって決定される。これらの位置はＨＶＲ領域の外にあり（部分的に）、親の（ドナー）抗体のＨＶＲ立体配置を保持するために、最終コンストラクトにおいて機能的に同等に保たれるべきである。国際公開第２００４／００６９５５号では、非ヒト成熟抗体のＨＶＲの正規のＨＶＲ構造タイプを特定する工程；ヒト抗体可変領域のペプチド配列のライブラリーを得る工程；ライブラリー中の可変領域の正規のＨＶＲ構造タイプを決定する工程；及び非ヒト及びヒト可変領域の中の対応する位置で正規のＨＶＲ構造が非ヒト抗体の正規のＨＶＲ構造タイプと同じであるヒト配列を選択する工程を含む、抗体のヒト化方法が報告されている。要約すると、可能なアクセプター配列は、高い全体的相同性、及び任意選択的にさらにアクセプター配列中に正しい正規の残基が既に存在することに基づいて選択される。一部の場合には、単純なＨＶＲグラフティングは、非ヒト抗体の結合特異性の部分的保持をもたらすだけである。結合特異性を再構成するために少なくともいくつかの特異的非ヒトフレームワーク残基が必要とされ、ヒトフレームワークにも接がれなければならないこと、すなわち、非ヒトＨＶＲの導入に加えていわゆる「復帰突然変異」も実行しなければならないことが分かっている（例えば、Queen等、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 10、029-10、033；Co等、Nature 351 (1991) 501-502を参照されたい）。これらの特異的フレームワークアミノ酸残基はＦＲ−ＨＶＲ相互作用に加わり、ＨＶＲの立体配置（ループ）を安定させた（例えば、Kabat等、J. Immunol. 147 (1991) 1709を参照されたい）。一部の場合には、ヒト生殖系列配列をより緊密に採用するために正突然変異も導入される。したがって、「本発明による抗体のヒト化変異体」（それは、例えばマウス起源である）は、ＶＨ及びＶＬが上記の標準技術（ＨＶＲグラフティング、並びに任意選択的にフレームワーク領域及びＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２、ＨＶＲ−Ｌ１又はＨＶＲ−Ｌ２のある特定のアミノ酸の以降の突然変異誘発を含むが、ＨＶＲ−Ｈ３及びＨＶＲ−Ｌ３は未改変のままである）によってヒト化されるマウス抗体配列に基づく抗体を指す。

【0088】

本明細書で用いる用語「超可変領域」又は「ＨＶＲ」は、配列が超可変である（「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」）及び／又は構造的に規定されたループを形成する（「超可変ループ」）及び／又は抗原接触残基を含有する（「抗原接触部」）抗体可変ドメインの領域の各々を指す。一般に、抗体は６つのＨＶＲを含む：ＶＨに３つ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）及びＶＬに３つ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）。本明細書において、例示的なＨＶＲには、以下のものが含まれる：
（ａ）アミノ酸残基２６−３２（Ｌ１）、５０−５２（Ｌ２）、９１−９６（Ｌ３）、２６−３２（Ｈ１）、５３−５５（Ｈ２）及び９６−１０１（Ｈ３）で見られる超可変ループ（Chothia及びLesk、J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)）；
（ｂ）アミノ酸残基２４−３４（Ｌ１）、５０−５６（Ｌ２）、８９−９７（Ｌ３）、３１−３５ｂ（Ｈ１）、５０−６５（Ｈ２）及び９５−１０２（Ｈ３）で見られるＣＤＲ（Kabat等、Sequences of Proteins of Immunological Interest、5版、Public Health Service、National Institutes of Health、Bethesda、MD (1991)）；
（ｃ）アミノ酸残基２７ｃ−３６（Ｌ１）、４６−５５（Ｌ２）、８９−９６（Ｌ３）、３０−３５ｂ（Ｈ１）、４７−５８（Ｈ２）及び９３−１０１（Ｈ３）で見られる抗原接触部（MacCallum等、J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996)）；及び
（ｄ）ＨＶＲアミノ酸残基４６−５６（Ｌ２）、４７−５６（Ｌ２）、４８−５６（Ｌ２）、４９−５６（Ｌ２）、２６−３５（Ｈ１）、２６−３５ｂ（Ｈ１）、４９−６５（Ｈ２）、９３−１０２（Ｈ３）及び９４−１０２（Ｈ３）を含む（ａ）、（ｂ）及び／又は（ｃ）の組合せ。

【0089】

別途指示がない限り、本明細書において、可変ドメイン中のＨＶＲ残基及び他の残基（例えば、ＦＲ残基）は、上記のカバット等に従って番号付けされる。

【0090】

好ましくは、ＨＶＲはアミノ酸残基２４−３４（Ｌ１）、５０−５６（Ｌ２）、８９−９７（Ｌ３）、３１−３５ｂ（Ｈ１）、５０−６５（Ｈ２）及び９５−１０２（Ｈ３）（Kabat等、Sequences of Proteins of Immunological Interest、第5版、Public Health Service、National Institutes of Health、Bethesda、MD (1991)）に存在するＣＤＲを指す、すなわちＨＶＲはカバットに従って決定される。

【0091】

「イムノコンジュゲート」は、限定されずに細胞傷害性剤を含む１つ又は複数の異種分子にコンジュゲートされる抗体である。

【0092】

「個体」又は「対象」は、哺乳動物である。哺乳動物には、限定されずに、家畜（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ及びウマ）、霊長類（例えば、ヒト及びサルなどの非ヒト霊長類）、ウサギ及びげっ歯類（例えば、マウス及びラット）が含まれる。ある特定の実施態様では、個体又は対象はヒトである。

【0093】

「単離」抗体は、その天然の環境の構成要素から分離されたものである。一部の実施態様では、抗体は、例えば電気泳動（例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、毛細管電気泳動）又はクロマトグラフィー（例えば、イオン交換又は逆相ＨＰＬＣ）によって判定したときに、９５％又は９９％を超える純度まで精製される。抗体純度の調べるための方法の概説については、例えば、Ｆｌａｔｍａｎ，Ｓ．等、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ ８４８（２００７）７９−８７を参照されたい。

【0094】

「単離」核酸は、その天然の環境の構成要素から分離された核酸分子を指す。単離核酸には、その核酸分子を通常含有する細胞に含有される核酸分子が含まれるが、その核酸分子は染色体外に存在するか又はその天然の染色体位置と異なる染色体位置に存在する。

【0095】

「抗ＨＥＲ１抗体をコードする単離核酸」は、単一のベクター又は別個のベクター中のそのような核酸分子（複数可）を含む、抗体重鎖及び軽鎖（又はその断片）をコードする１つ又は複数の核酸分子を指し、そのような核酸分子（複数可）は宿主細胞の１つ又は複数の位置に存在する。

【0096】

本明細書で用いられる用語「モノクローナル抗体」は、可能な変異体抗体、例えば天然に存在する突然変異を含有するか又はモノクローナル抗体調製物の生成の間に生じる、一般に少量存在する変異体を除いて、実質的に均一な抗体の集団、すなわち集団を構成する個々の抗体が同一であり及び／又は同じエピトープに結合する集団から得られる抗体を指す。異なる決定因子（エピトープ）に対する異なる抗体を一般的に含むポリクローナル抗体調製物と対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定因子に対するものである。したがって、修飾語「モノクローナル」は、実質的に均一な抗体集団から得られるという抗体の性格を示し、いかなる特定の方法による抗体の生成を必要とするものと解釈するべきでない。例えば、本発明に従って用いられるモノクローナル抗体は、限定されずに、ハイブリドーマ方法、組換えＤＮＡ方法、ファージディスプレイ方法及びヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部又は一部を含有するトランスジェニック動物を利用する方法を含む様々な技術によって作製することができ、モノクローナル抗体を作製するためのそのような方法及び他の例示的な方法は本明細書に記載される。

【0097】

用語「Ｍａｂ」はモノクローナル抗体を指すが、用語「ｈＭａｂ」はそのようなモノクローナル抗体のヒト化変異体を指す。

【0098】

「ネイキッド抗体」は、異種部分（例えば、細胞傷害性部分）とコンジュゲートしていなく、放射標識されてもいない抗体を指す。ネイキッド抗体は、薬学的製剤中に存在していてよい（先行技術がイムノコンジュゲートを有する場合、含む）。

【0099】

「天然の抗体」は、様々な構造を有する天然に存在する免疫グロブリン分子を指す。例えば、天然のＩｇＧ抗体は、ジスルフィド結合している２つの同一の軽鎖及び２つの同一の重鎖で構成される、約１５０，０００ダルトンのヘテロテトラマー糖タンパク質である。Ｎ末端からＣ末端にかけて、各重鎖は、可変重鎖ドメイン又は重鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＨ）、続いて３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）を有する。同様に、Ｎ末端からＣ末端にかけて、各軽鎖は、可変軽鎖ドメイン又は軽鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＬ）、続いて定常軽鎖（ＣＬ）ドメインを有する。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）及びラムダ（λ）と呼ばれる２つのタイプの１つに割り当てることができる。

【0100】

用語「添付文書」は、適応症、使用法、投薬量、投与、併用療法、禁忌症及び／又はそのような治療製品の使用に関する警告に関する情報を含む、治療製品の市販パッケージに慣習的に含まれる説明書を指すために用いられる。

【0101】

参照ポリペプチド配列に関して「アミノ酸配列パーセント（％）同一性」は、いかなる保存的置換も配列同一性の一部とみなさずに、最大のパーセント配列同一性を達成するために配列を整列させ、必要に応じてギャップを導入した後の、参照ポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基の百分率と規定される。アミノ酸配列パーセント同一性を判定するためのアラインメントは、当該分野の技術の範囲内である様々な方法で、例えば公開されているコンピュータソフトウェア、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアを用いて達成することができる。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大のアラインメントを達成するのに必要な任意のアルゴリズムを含め、配列を整列させるための適切なパラメータを決定することができる。しかし、本明細書において、アミノ酸配列同一性％値は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ−２を用いて生成される。ＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータプログラムはＧｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．によって書かれ、ソースコードはＵ．Ｓ．Ｃｏｐｙｒｉｇｈｔ Ｏｆｆｉｃｅ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．、２０５５９の利用者文書に提出され、そこにおいてそれは米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７の下で登録されている。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．、Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａから公開されているか、又はソースコードからコンパイルすることができる。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、デジタルＵＮＩＸ Ｖ４．０Ｄを含む、ＵＮＩＸオペレーティングシステムで用いるためにコンパイルされるべきである。全ての配列比較パラメータはＡＬＩＧＮ−２プログラムによって設定され、変更されない。

【0102】

ＡＬＩＧＮ−２がアミノ酸配列比較のために用いられる状況では、所与のアミノ酸配列Ｂへの、それとの又はそれに対する所与のアミノ酸配列Ａのアミノ酸配列％同一性（それは、代わりに、所与のアミノ酸配列Ｂに、それと又はそれに対してある特定のアミノ酸配列％同一性を有するか含む所与のアミノ酸配列Ａと言い表すことができる）は、以下の通りに計算され：
分数Ｘ／Ｙ×１００
上式で、ＸはＡとＢのそのプログラムのアラインメントにおいて配列アラインメントプログラムＡＬＩＧＮ−２により同一の組合せとして評価されるアミノ酸残基の数であり、ＹはＢの中のアミノ酸残基の総数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さに等しくない場合は、ＡのＢとのアミノ酸配列％同一性は、ＢのＡとのアミノ酸配列％同一性と等しくない。特記されていない限り、本明細書で用いられる全てのアミノ酸配列同一性％値は、ＡＬＩＧＮ−２コンピュータプログラムを用いて直前の段落に記載の通りに得られる。

【0103】

用語「薬学的製剤」は、そこに含まれる有効成分の生物活性を有効にするような形であり、製剤が投与される対象に許容されないほど毒性である追加の成分を含有しない調製物を指す。

【0104】

「薬学的に許容される担体」は、薬学的製剤中の、有効成分以外の対象に無毒である成分を指す。薬学的に許容される担体には、限定されずに、バッファー、賦形剤、安定剤又は保存剤が含まれる。

【0105】

別途指示がない限り、本明細書で用いられる用語「ＨＥＲ１」は、霊長類などの哺乳動物（例えばヒト）及びげっ歯類（例えば、マウス及びラット）を含む任意の脊椎動物源からの任意の天然のＨＥＲ１を指す。本用語は、「完全長」の未処理のＨＥＲ１に加えて、細胞でのプロセシングからもたらされる任意の形のＨＥＲ１を包含する。本用語は、ＨＥＲ１の天然に存在する変異体、例えばスプライスバリアント又は対立遺伝子変異体も包含する。例示的なヒトＨＥＲ１のアミノ酸配列を、配列番号２に示す。「ヒトＨＥＲ１」（別名上皮増殖因子受容体ＥＧＦＲ又はＥｒｂ−Ｂ１）は、ｃ−ｅｒｂＢがん原遺伝子によってコードされる１７０ｋＤａ膜貫通型受容体であり、固有のチロシンキナーゼ活性を示す（Modjtahedi, H.等、Br. J. Cancer 73 (1996) 228-235；Herbst, R.S.及びShin, D.M.、Cancer 94 (2002) 1593-1611）。ＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベースエントリー番号Ｐ００５３３は、ＨＥＲ１の配列を提供する（配列番号２）。限定されずにＳｗｉｓｓｐｒｏｔデータベースエントリー番号Ｐ００５３３−１、Ｐ００５３３−２、Ｐ００５３３−３及びＰ００５３３−４によって特定されるものを含む、ＨＥＲ１のアイソフォーム及び変異体（例えば、代替ＲＮＡ転写物、切除型、多型等）もある。ＨＥＲ１は、α）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）（配列番号４）、トランスフォーミング増殖因子−α（ＴＧＦ）、アンフィレグリン、ヘパリン結合性ＥＧＦ（ｈｂ−ＥＧＦ）、ベータセルリン及びエピレグリンを含むリガンドに結合することが公知である（Herbst, R.S.及びShin, D.M.、Cancer 94 (2002) 1593-1611；Mendelsohn, J.及びBaselga, J.、Oncogene 19 (2000) 6550-6565）。ＨＥＲ１は、細胞の増殖、分化、細胞生存、アポトーシス、血管新生、有糸分裂及び転移をコントロールするシグナル伝達経路の活性化を限定されずに含む、チロシンキナーゼ媒介シグナル伝達経路を通して多数の細胞プロセスを調節する（Atalay, G.等、Ann. Oncology 14 (2003) 1346-1363；Tsao, A.S.及びHerbst, R.S.、Signal 4 (2003) 4-9；Herbst, R.S.及びShin, D.M.、Cancer 94 (2002) 1593-1611；Modjtahedi, H.等、Br. J. Cancer 73 (1996) 228-235）。本明細書で用いる用語「上皮増殖因子」（ＥＧＦ）は、ヒト上皮増殖因子（ＥＧＦ、ｈＥＧＦ）（配列番号４）を指す。

【0106】

興味深いことに、その平衡状態において、ＨＥＲ１受容体はその「閉鎖的立体配置」で存在し、それは、二量体化ＨＥＲ１ベータ−ヘアピンモチーフが非共有結合的性相互作用を介してＨＥＲ１ ＥＣＤドメインＩＶに連結されることを意味する（図１及びLemmon, MA、"Ligand-induced ErbB receptor dimerization" Exp Cell Res. Feb 15、2009; 315(4): 638-648の全論文を参照されたい）。「閉鎖的」ＨＥＲ１立体配置は、特異的ＨＥＲ１ ＥＧＦ結合部位でのリガンドＥＧＦ（配列番号４）の結合を介して開放することができると想定されている。ＨＥＲ１ ＥＣＤのドメインＩ及びドメインＩＩＩによって形成されるＨＥＲ１界面で、これは起こる。この相互作用によって、ＨＥＲ１受容体が活性化されてその「開放的立体配置」に変えられると、考えられている（図１を参照されたい）。この開放的立体配置で、別のＨＥＲ１分子とのホモ二量体化又はＨＥＲファミリーの別のメンバーとのヘテロ二量体化、及びシグナル誘導（Lemmon, MA、Exp Cell Res. Feb 15、2009; 315(4): 638-648）。

【0107】

本明細書で用いるように、「治療」（及び「治療する」又は「治療すること」などの文法上のその変異体）は、治療する個体の自然経過を変化させる企てにおける臨床介入を指し、予防のために、又は臨床病理の過程で実施することができる。治療の望ましい効果には、限定されずに、疾患の発生又は再発を予防すること、症候の緩和、疾患の任意の直接的又は間接的な病理学的帰結の減少、転移の予防、疾患進行の速度を低下させること、病態の改善又は緩和、及び寛解又は予後の改善が含まれる。一部の実施態様では、本発明の抗体は、疾患の発達を遅延させるために、又は疾患の進行を遅くするために用いられる。

【0108】

用語「可変領域」又は「可変ドメイン」は、抗原への抗体の結合に関与する抗体の重鎖又は軽鎖のドメインを指す。天然の抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメイン（それぞれ、ＶＨ及びＶＬ）は類似の構造を一般に有し、各ドメインは４つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）及び３つの超可変領域（ＨＶＲ）を含む。（例えば、Kindt, T.J.等、Kuby Immunology、6版、W.H. Freeman and Co.、N.Y. (2007)、 p91を参照されたい）。抗原結合特異性を付与するのに、単一のＶＨ又はＶＬドメインで十分なことがある。さらに、相補的なＶＬ又はＶＨドメインのライブラリーをそれぞれスクリーニングするために、抗原に結合する抗体からのＶＨ又はＶＬドメインを用いて、特定の抗原に結合する抗体を単離することができる。例えば、Portolano, S.等、J. Immunol. 150 (1993) 880-887；Clackson, T.等、Nature 352 (1991) 624-628を参照されたい）。

【0109】

本明細書で用いるように、用語「ベクター」は、それが結合する別の核酸を増殖させることが可能な核酸分子を指す。本用語は、自己複製する核酸構造としてのベクター、並びにそれが導入されている宿主細胞のゲノムに組み込まれるベクターを含む。ある特定のベクターは、それらが作動可能に連結されている核酸の発現を導くことが可能である。そのようなベクターは、本明細書において「発現ベクター」と呼ばれる。

【0110】

ＩＩ．組成物及び方法
一態様では、本発明は、ＳｌｙＤ足場の中に三次元配向で機能的に提示されるＨＥＲ１のベータ−ヘアピン（例えば、図２、並びに配列番号１２から１６及び１８のポリペプチドを参照されたい）を用いることによって、ＨＥＲ１のベータ−ヘアピンに特異的である（及びＨＥＲ２、ＨＥＲ３及び／又はＨＥＲ４と交差反応しない）抗体を選択することが可能であったとの知見に一部基づく。

【0111】

ある特定の実施態様では、本発明はヒトＨＥＲ１に結合する抗体を提供し、抗体はヒトＨＥＲ１のＰＰＬＭＬＹＮＰＴＴＹＱＭＤＶＮＰＥＧＫのアミノ酸配列（配列番号１）の中で結合する。

【0112】

本発明の抗体は、例えば、がんの診断又は治療のために有益である。

【0113】

Ａ．例示的な抗ＨＥＲ１抗原結合性タンパク質及び抗体
本発明は、ヒトＨＥＲ１に結合する単離された抗原結合性タンパク質を提供し、抗原結合性タンパク質は以下からなる群から選択されるポリペプチドに結合する：
配列番号１２ ＴｔＳｌｙＤｃａｓ−ＨＥＲ１、
配列番号１３ ＴｔＳｌｙＤｃｙｓ−ＨＥＲ１、
配列番号１４ ＴｔＳｌｙＤ（ＧＳＧ）−ＨＥＲ１、
配列番号１５ ＴｔＳｌｙＤ（ＣＣ）−ＨＥＲ１、
配列番号１６ ＴｔＳｌｙＤ（ＳＳ）−ＨＥＲ１、及び
配列番号１８ ＴｇＳｌｙＤｃｙｓ−ＨＥＲ１。

【0114】

本発明は、ヒトＨＥＲ１に結合する単離された抗原結合性タンパク質をさらに提供し、抗原結合性タンパク質は、以下からなる群から選択されるポリペプチドに含まれるＰＰＬＭＬＹＮＰＴＴＹＱＭＤＶＮＰＥＧＫのアミノ酸配列（配列番号１）の中で結合する：
配列番号１２ ＴｔＳｌｙＤｃａｓ−ＨＥＲ１、
配列番号１３ ＴｔＳｌｙＤｃｙｓ−ＨＥＲ１、
配列番号１４ ＴｔＳｌｙＤ（ＧＳＧ）−ＨＥＲ１、
配列番号１５ ＴｔＳｌｙＤ（ＣＣ）−ＨＥＲ１、
配列番号１６ ＴｔＳｌｙＤ（ＳＳ）−ＨＥＲ１、及び
配列番号１８ ＴｇＳｌｙＤｃｙｓ−ＨＥＲ１。

【0115】

本発明は、ヒトＨＥＲ１に結合する単離された抗原結合性タンパク質をさらに提供し、
ａ）抗原結合性タンパク質は、
配列番号１３ ＴｔＳｌｙＤｃｙｓ−Ｈｅｒ１
のポリペプチドに結合する。

【0116】

本発明は、ヒトＨＥＲ１に結合する単離された抗原結合性タンパク質をさらに提供し、
抗原結合性タンパク質は、ＥＬＩＳＡアッセイで、
配列番号１３ ＴｔＳｌｙＤｃｙｓ−Ｈｅｒ１
のポリペプチドに、
配列番号１１ ＴｔＳｌｙＤｃａｓ
のポリペプチドへの結合と比較して少なくとも５０倍高いＥＬＩＳＡシグナル（好ましくは少なくとも１００倍高く、別の好ましい実施態様では少なくとも５００倍高い）で結合し、ここで、ＴｔＳｌｙＤｃｙｓ−ＨＥＲ１及びＴｔＳｌｙＤｃａｓは０．５μｇ／ｍｌの濃度で固定化されている。

【0117】

好ましくは、ＥＬＩＳＡシグナルは西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識Ｆ（ａｂ’）_２ヤギ抗マウスＦｃγで検出され、２，２’−アジノ−ジ−［３−エチルベンズチアゾリンスルホネート（６）］二アンモニウム塩（ＡＢＴＳ）がＨＲＰ基質として用いられた。

【0118】

本発明は、ヒトＨＥＲ１に結合する単離された抗原結合性タンパク質をさらに提供し、
ａ）抗原結合性タンパク質は、配列番号１３のポリペプチド（ＴｔＳｌｙＤｃｙｓ−Ｈｅｒ１）に含まれるＰＰＬＭＬＹＮＰＴＴＹＱＭＤＶＮＰＥＧＫのアミノ酸配列（配列番号１）の中で結合する。

【0119】

本発明は、ヒトＨＥＲ１に結合する単離された抗体を提供し、
ａ）抗体は以下からなる群から選択されるポリペプチドに結合する：
配列番号１２ ＴｔＳｌｙＤｃａｓ−ＨＥＲ１、
配列番号１３ ＴｔＳｌｙＤｃｙｓ−ＨＥＲ１、
配列番号１４ ＴｔＳｌｙＤ（ＧＳＧ）−ＨＥＲ１、
配列番号１５ ＴｔＳｌｙＤ（ＣＣ）−ＨＥＲ１、
配列番号１６ ＴｔＳｌｙＤ（ＳＳ）−ＨＥＲ１、及び
配列番号１８ ＴｇＳｌｙＤｃｙｓ−ＨＥＲ１。

【0120】

本発明は、ヒトＨＥＲ１に結合する単離された抗体をさらに提供し、
ａ）抗体は以下からなる群から選択されるポリペプチドに含まれるＰＰＬＭＬＹＮＰＴＴＹＱＭＤＶＮＰＥＧＫのアミノ酸配列（配列番号１）の中で結合する：
配列番号１２ ＴｔＳｌｙＤｃａｓ−ＨＥＲ１、
配列番号１３ ＴｔＳｌｙＤｃｙｓ−ＨＥＲ１、
配列番号１４ ＴｔＳｌｙＤ（ＧＳＧ）−ＨＥＲ１、
配列番号１５ ＴｔＳｌｙＤ（ＣＣ）−ＨＥＲ１、
配列番号１６ ＴｔＳｌｙＤ（ＳＳ）−ＨＥＲ１、及び
配列番号１８ ＴｇＳｌｙＤｃｙｓ−ＨＥＲ１。

【0121】

本発明は、ヒトＨＥＲ１に結合する単離された抗体をさらに提供し、
ａ）抗体は、
配列番号１３ ＴｔＳｌｙＤｃｙｓ−ＨＥＲ１
のポリペプチドに結合する。

【0122】

本発明は、ヒトＨＥＲ１に結合する単離された抗体をさらに提供し、
ａ）抗体は、配列番号１３のポリペプチド（ＴｔＳｌｙＤｃｙｓ−Ｈｅｒ１）に含まれるＰＰＬＭＬＹＮＰＴＴＹＱＭＤＶＮＰＥＧＫのアミノ酸配列（配列番号１）の中で結合する。

【0123】

一態様では、本発明はヒトＨＥＲ１に結合する単離された抗体を提供し、抗体はヒトＨＥＲ１のＰＰＬＭＬＹＮＰＴＴＹＱＭＤＶＮＰＥＧＫのアミノ酸配列（配列番号１）の中で結合する。

【0124】

ある特定の実施態様では、本発明はヒトＨＥＲ１に結合する単離された抗体を提供し、抗体は以下の特性（各単一の特性の各組合せも本明細書で企図される）の１つ又は複数を有する：
ａ）抗体は配列番号１のアミノ酸配列に結合する；並びに／又は
ｂ）抗体は活性化ＨＥＲ１のアミノ酸配列の配列番号１に結合する；並びに／又は
ｃ）抗体は、
配列番号１２ ＴｔＳｌｙＤｃａｓ−ＨＥＲ１、
配列番号１３ ＴｔＳｌｙＤｃｙｓ−ＨＥＲ１、
配列番号１４ ＴｔＳｌｙＤ（ＧＳＧ）−ＨＥＲ１、
配列番号１５ ＴｔＳｌｙＤ（ＣＣ）−ＨＥＲ１、
配列番号１６ ＴｔＳｌｙＤ（ＳＳ）−ＨＥＲ１、及び
配列番号１８ ＴｇＳｌｙＤｃｙｓ−ＨＥＲ１
からなる群から選択されるポリペプチドに含まれるＰＰＬＭＬＹＮＰＴＴＹＱＭＤＶＮＰＥＧＫのアミノ酸配列（配列番号１）の中で結合する、
並びに／又は
ｄ）ＨＥＲ１のβ−ヘアピン領域に結合する；並びに／又は
ｅ）ＨＥＲ１／ＨＥＲ２ヘテロダイマーのヘテロ二量体化を阻害する；並びに／又は
ｆ）ＨＥＲ２、ＨＥＲ３及び／若しくはＨＥＲ４と交差反応性を有さない；並びに／又は
ｇ）抗体はアミノ酸配列ＴＹＱＭＤＶＮＰＥＧ（配列番号１９）を含む１５アミノ酸の長さのポリペプチドに結合する；並びに／又は
ｈ）ＴＹＱＭＤＶＮＰＥＧ（配列番号１９）からなるポリペプチドに結合する；並びに／又は
ｉ）抗体はアミノ酸配列ＭＬＹＮＰＴＴＹＱ（配列番号２０）を含む１５アミノ酸の長さのポリペプチドに結合する；並びに／又は
ｊ）ＭＬＹＮＰＴＴＹＱ（配列番号２０）からなるポリペプチドに結合する；並びに／又は
ｋ）ＥＧＦの非存在下でＡ５４９がん細胞においてＨＥＲ１のリン酸化を誘導しない（実施例６を参照されたい）；並びに／又は
ｌ）ＥＧＦの非存在下でＨＥＲ１のリン酸化に関して非アゴニスト抗体である（実施例６を参照されたい）；並びに／又は
ｍ）ＨＥＲ１発現Ａ５４９細胞を用いるウェスタンブロットアッセイで抗体とのインキュベーションから２時間後にＥＧＦの存在下でＨＥＲ１の７０パーセントを超える内部移行を示し、ＨＥＲ１発現Ａ５４９細胞を用いるウェスタンブロットアッセイで抗体とのインキュベーションから２時間後にＥＧＦの非存在下でＨＥＲ１の５５パーセント未満の内部移行を示す（実施例５を参照されたい）。

【0125】

ある特定の実施態様では、本発明は、ヒトＨＥＲ１に結合する単離された抗体を提供し、抗体はアミノ酸配列ＭＬＹＮＰＴＴＹＱ（配列番号２０）を含む１５アミノ酸の長さのポリペプチドに結合する。

【0126】

ある特定の実施態様では、本発明は、ヒトＨＥＲ１に結合する単離された抗体を提供し、抗体はアミノ酸配列ＴＹＱＭＤＶＮＰＥＧ（配列番号１９）を含む１５アミノ酸の長さのポリペプチドに結合する。

【0127】

一態様では、本発明は、以下からなる群から選択される全部で６つのＨＶＲを含む抗ＨＥＲ１抗体を提供する：
ｉ）寄託された抗体ＭＡＫ＜ＨＥＲ１−ＤＩＢ＞Ｍ−５０．０９７．１４（ＤＳＭ ＡＣＣ３２４０）；
ｉｉ）寄託された抗体ＭＡＫ＜ＨＥＲ１−ＤＩＢ＞Ｍ−５０．１１０．２３（ＤＳＭ ＡＣＣ３２４１）；
ｉｉｉ）寄託された抗体ＭＡＫ＜ＨＥＲ１−ＤＩＢ＞Ｍ−３７．０５８．０９（ＤＳＭ ＡＣＣ３２３８）；及び
ｉｖ）寄託された抗体ＭＡＫ＜ＨＥＲ１−ＤＩＢ＞Ｍ−３７．１８６．１５（ＤＳＭ ＡＣＣ３２３９）。

【0128】

好ましくは、ＨＶＲはカバットに従って決定される。

【0129】

好ましい一実施態様では、本発明は、以下からなる群から選択される全部で６つのＨＶＲを含む抗ＨＥＲ１抗体を提供する：
ｉ）寄託された抗体ＭＡＫ＜ＨＥＲ１−ＤＩＢ＞Ｍ−５０．０９７．１４（ＤＳＭ ＡＣＣ３２４０）；及び
ｉｉ）寄託された抗体ＭＡＫ＜ＨＥＲ１−ＤＩＢ＞Ｍ−５０．１１０．２３（ＤＳＭ ＡＣＣ３２４１）。

【0130】

好ましくは、ＨＶＲはカバットに従って決定される。

【0131】

一態様では、本発明は、
ｉ）寄託された抗体ＭＡＫ＜ＨＥＲ１−ＤＩＢ＞Ｍ−５０．０９７．１４（ＤＳＭ ＡＣＣ３２４０）；
ｉｉ）寄託された抗体ＭＡＫ＜ＨＥＲ１−ＤＩＢ＞Ｍ−５０．１１０．２３（ＤＳＭ ＡＣＣ３２４１）；
ｉｉｉ）寄託された抗体ＭＡＫ＜ＨＥＲ１−ＤＩＢ＞Ｍ−３７．０５８．０９（ＤＳＭ ＡＣＣ３２３８）；及び
ｉｖ）寄託された抗体ＭＡＫ＜ＨＥＲ１−ＤＩＢ＞Ｍ−３７．１８６．１５（ＤＳＭ ＡＣＣ３２３９）
からなる群から選択される全部で６つのＨＶＲを含む抗ＨＥＲ１抗体を提供し、抗体は、以下の特性の１つ又は複数を有する：
ａ）抗体は配列番号１のアミノ酸配列に結合する；並びに／又は
ｂ）抗体は活性化ＨＥＲ１のアミノ酸配列の配列番号１に結合する；並びに／又は
ｃ）抗体は、
配列番号１２ ＴｔＳｌｙＤｃａｓ−ＨＥＲ１、
配列番号１３ ＴｔＳｌｙＤｃｙｓ−ＨＥＲ１、
配列番号１４ ＴｔＳｌｙＤ（ＧＳＧ）−ＨＥＲ１、
配列番号１５ ＴｔＳｌｙＤ（ＣＣ）−ＨＥＲ１、
配列番号１６ ＴｔＳｌｙＤ（ＳＳ）−ＨＥＲ１、及び
配列番号１８ ＴｇＳｌｙＤｃｙｓ−ＨＥＲ１、
からなる群から選択されるポリペプチドに含まれるＰＰＬＭＬＹＮＰＴＴＹＱＭＤＶＮＰＥＧＫのアミノ酸配列（配列番号１）の中で結合する、
並びに／又は
ｄ）ＨＥＲ１のβ−ヘアピン領域に結合する；並びに／又は
ｅ）ＨＥＲ１／ＨＥＲ２ヘテロダイマーのヘテロ二量体化を阻害する；並びに／又は
ｆ）ＨＥＲ２、ＨＥＲ３及び／又はＨＥＲ４と交差反応性を有さない；並びに／又は
ｇ）抗体はアミノ酸配列ＴＹＱＭＤＶＮＰＥＧ（配列番号１９）を含む１５アミノ酸の長さのポリペプチドに結合する；並びに／又は
ｈ）ＴＹＱＭＤＶＮＰＥＧ（配列番号１９）からなるポリペプチドに結合する；並びに／又は
ｉ）抗体はアミノ酸配列ＭＬＹＮＰＴＴＹＱ（配列番号２０）を含む１５アミノ酸の長さのポリペプチドに結合する；並びに／又は
ｊ）ＭＬＹＮＰＴＴＹＱ（配列番号２０）からなるポリペプチドに結合する；並びに／又は
ｋ）ＥＧＦの非存在下でＡ５４９がん細胞においてＨＥＲ１のリン酸化を誘導しない（実施例６を参照）；並びに／又は
ｌ）ＥＧＦの非存在下でＨＥＲ１のリン酸化に関して非アゴニスト抗体である（実施例６を参照されたい）；並びに／又は
ｍ）ＨＥＲ１発現Ａ５４９細胞を用いるウェスタンブロットアッセイで抗体とのインキュベーションから２時間後にＥＧＦの存在下でＨＥＲ１の７０パーセントを超える内部移行を示し、ＨＥＲ１発現Ａ５４９細胞を用いるウェスタンブロットアッセイで抗体とのインキュベーションから２時間後にＥＧＦの非存在下でＨＥＲ１の５５パーセント未満の内部移行を示す（実施例５を参照されたい）。

【0132】

好ましくは、ＨＶＲはカバットに従って決定される。

【0133】

さらなる態様では、本発明は、本明細書で提供される抗ＨＥＲ１抗体と同じエピトープに結合する抗体を提供する。例えば、ある特定の実施態様では、以下からなる群から選択される抗ＨＥＲ１抗体と同じエピトープに結合する抗体が提供される：
ｉ）寄託された抗体ＭＡＫ＜ＨＥＲ１−ＤＩＢ＞Ｍ−５０．０９７．１４（ＤＳＭ ＡＣＣ３２４０）；
ｉｉ）寄託された抗体ＭＡＫ＜ＨＥＲ１−ＤＩＢ＞Ｍ−５０．１１０．２３（ＤＳＭ ＡＣＣ３２４１）；
ｉｉｉ）寄託された抗体ＭＡＫ＜ＨＥＲ１−ＤＩＢ＞Ｍ−３７．０５８．０９（ＤＳＭ ＡＣＣ３２３８）；及び
ｉｖ）寄託された抗体ＭＡＫ＜ＨＥＲ１−ＤＩＢ＞Ｍ−３７．１８６．１５（ＤＳＭ ＡＣＣ３２３９）。

【0134】

好ましい一実施態様では、以下の抗ＨＥＲ１抗体と同じエピトープに結合する抗体が提供される：
ｉ）寄託された抗体ＭＡＫ＜ＨＥＲ１−ＤＩＢ＞Ｍ−５０．０９７．１４（ＤＳＭ ＡＣＣ３２４０）；又は
ｉｉ）寄託された抗体ＭＡＫ＜ＨＥＲ１−ＤＩＢ＞Ｍ−５０．１１０．２３（ＤＳＭ ＡＣＣ３２４１）。

【0135】

さらなる態様では、本発明は、ヒトＨＥＲ１への結合に関して本明細書で提供される抗ＨＥＲ１抗体と競合する抗体を提供する。例えば、ある特定の実施態様では、ヒトＨＥＲ１への結合に関して、以下からなる群から選択される抗ＨＥＲ１抗体と競合する抗体が提供される：
ｉ）寄託された抗体ＭＡＫ＜ＨＥＲ１−ＤＩＢ＞Ｍ−５０．０９７．１４（ＤＳＭ ＡＣＣ３２４０）；
ｉｉ）寄託された抗体ＭＡＫ＜ＨＥＲ１−ＤＩＢ＞Ｍ−５０．１１０．２３（ＤＳＭ ＡＣＣ３２４１）；
ｉｉｉ）寄託された抗体ＭＡＫ＜ＨＥＲ１−ＤＩＢ＞Ｍ−３７．０５８．０９（ＤＳＭ ＡＣＣ３２３８）；及び
ｉｖ）寄託された抗体ＭＡＫ＜ＨＥＲ１−ＤＩＢ＞Ｍ−３７．１８６．１５（ＤＳＭ ＡＣＣ３２３９）。

【0136】

好ましい一実施態様では、ヒトＨＥＲ１への結合に関して、以下の抗ＨＥＲ１抗体と競合する抗体が提供される：
ｉ）寄託された抗体ＭＡＫ＜ＨＥＲ１−ＤＩＢ＞Ｍ−５０．０９７．１４（ＤＳＭ ＡＣＣ３２４０）；及び
ｉｉ）寄託された抗体ＭＡＫ＜ＨＥＲ１−ＤＩＢ＞Ｍ−５０．１１０．２３（ＤＳＭ ＡＣＣ３２４１）。

【0137】

ある特定の実施態様では、アミノ酸ＭＬＹＮＰＴＴＹＱ（配列番号２０）からなるヒトＨＥＲ１の断片中のエピトープに結合する抗体が提供される。

【0138】

ある特定の実施態様では、アミノ酸ＴＹＱＭＤＶＮＰＥＧ（配列番号１９）からなるヒトＨＥＲ１の断片中のエピトープに結合する抗体が提供される。

【0139】

好ましい一実施態様では、抗体は、ＩｇＧ１又はＩｇＧ４アイソタイプのものである。好ましい一実施態様では、抗体はヒト起源の定常ドメイン（ヒト定常ドメイン）を含む。それぞれのヒト定常ドメインを含む本発明の意味の範囲内の一般的なヒト定常領域は、配列番号２１から配列番号２６のアミノ酸配列（それらは、アミノ酸置換を部分的に含む）を有する。

【0140】

１．抗体親和性
ある特定の実施態様では、本明細書で提供される抗体は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ又は≦０．００１ｎＭ（例えば、１０^−８Ｍ以下、例えば１０^−８Ｍから１０^−１３Ｍ、例えば１０^−９Ｍから１０^−１３Ｍ）の解離定数ＫＤを有する。

【0141】

好ましい一実施態様では、ＫＤは、〜１０応答単位（ＲＵ）で固定化抗原ＣＭ５チップと一緒に２５℃でＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）を用いる表面プラズモン共鳴アッセイを用いて測定される。簡潔には、供給業者の指示書に従って、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（ＣＭ５、ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．）を、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）で活性化する。結合タンパク質のおよそ１０反応単位（ＲＵ）を達成するために、５μｌ／分の流速で注入する前に、抗原を１０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．８で５μｇ／ｍｌ（〜０．２μＭ）に希釈する。抗原の注入の後、１Ｍのエタノールアミンを注入して未反応基をブロックする。反応速度論的測定のために、Ｆａｂの二倍段階希釈（０．７８ｎＭ−５００ｎＭ）を、２５℃の０．０５％ポリソルベート２０（ＴＷＥＥＮ−２０（商標））界面活性剤を有するＰＢＳ（ＰＢＳＴ）におよそ２５μｌ／分の流速で注入する。会合及び解離センサーグラムを同時に取り付け、簡単な１対１のＬａｎｇｍｕｉｒ結合モデル（ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアバージョン３．２）を用いることによって、会合速度（ｋ_ｏｎ又はｋａ）及び解離速度（ｋ_ｏｆｆ又はｋｄ）を計算する。平衡解離定数ＫＤは、比ｋｄ／ｋａ（ｋ_ｏｆｆ／ｋ_ｏｎ）として計算する。例えば、Ｃｈｅｎ，Ｙ．等、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９３（１９９９）８６５−８８１を参照されたい。上記の表面プラズモン共鳴アッセイによって会合速度が１０^６Ｍ^−１ｓ^−１を超えるならば、会合速度は、流動停止を備えた分光光度計（Ａｖｉｖ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）又は撹拌キュベットを備えた８０００シリーズＳＬＭ−ＡＭＩＮＣＯ（商標）分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＳｐｅｃｔｒｏｎｉｃ）などの分光計で測定されるような漸増濃度の抗原の存在下で、ＰＢＳ中の２０ｎＭ抗抗原抗体（Ｆａｂ形）、ｐＨ７．２の蛍光放出強度（励起＝２９５ｎｍ、放出＝３４０ｎｍ、１６ｎｍ帯域通過）の増加又は低下を２５℃で測定する蛍光消光技術を用いて判定することができる。

【0142】

２．抗体断片
ある特定の実施態様では、本明細書で提供される抗体は、抗体断片である。抗体断片には、限定されずに、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖ及びｓｃＦｖ断片、並びに下記の他の断片が含まれる。ある特定の抗体断片の概説については、Ｈｕｄｓｏｎ，Ｐ．Ｊ．等、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９（２００３）１２９−１３４を参照されたい。ｓｃＦｖ断片の概説については、例えば、Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、１１３巻、Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ及びＭｏｏｒｅ（編）、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９４）ｐ２６９−３１５中のＰｌｕｅｃｋｔｈｕｎ，Ａ．を参照；国際公開第９３／１６１８５号；並びに米国特許第５５７１８９４号及び５５８７４５８号も参照する。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含み、増加したインビボ半減期を有するＦａｂ及びＦ（ａｂ’）_２断片の考察については、米国特許第５８６９０４６号を参照されたい。

【0143】

ダイアボディは、二価又は二重特異性であってもよい、２つの抗原結合部位を有する抗体断片である。例えば、欧州特許第０４０４０９７号；国際公開第１９９３／０１１６１号；Ｈｕｄｓｏｎ，Ｐ．Ｊ．等、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９（２００３）１２９−１３４；及びＨｏｌｌｉｎｇｅｒ，Ｐ．等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０（１９９３）６４４４−６４４８を参照されたい。トリアボディ及びテトラボディも、Ｈｕｄｓｏｎ，Ｐ．Ｊ．等、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９（２００３）１２９−１３４に記載されている。

【0144】

単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全体若しくは一部又は軽鎖可変ドメインの全体若しくは一部を含む抗体断片である。ある特定の実施態様では、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体である（Ｄｏｍａｎｔｉｓ，Ｉｎｃ．、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ；例えば、米国特許第６２４８５１６Ｂ１号を参照されたい）。

【0145】

本明細書に記載されるように、抗体断片は、限定されずに、インタクトな抗体のタンパク質分解並びに組換え宿主細胞（例えば、大腸菌又はファージ）による生成を含む、様々な技術によって作製することができる。

【0146】

３．キメラ及びヒト化抗体
ある特定の実施態様では、本明細書で提供される抗体は、キメラ抗体である。ある特定のキメラ抗体は、例えば、米国特許第４８１６５６７号；及びＭｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８１（１９８４）６８５１−６８５５に記載されている。一例では、キメラ抗体は、非ヒト可変領域（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、又はサルなどの非ヒト霊長類に由来する可変領域）及びヒト定常領域を含む。さらなる例では、キメラ抗体は、クラス又はサブクラスが親抗体のものから変化している「クラススイッチ」された抗体である。キメラ抗体は、その抗原結合性断片を含む。

【0147】

ある特定の実施態様では、キメラ抗体は、ヒト化抗体である。一般的に、非ヒト抗体はヒトへの免疫原性を低減するためにヒト化されるが、親の非ヒト抗体の特異性及び親和性は保持される。一般に、ヒト化抗体は、ＨＶＲ、例えばＣＤＲ（又はその一部）が非ヒト抗体に由来し、ＦＲ（又はその一部）がヒト抗体配列に由来する、１つ又は複数の可変ドメインを含む。ヒト化抗体は、ヒト定常領域の少なくとも一部も任意選択的に含む。一部の実施態様では、例えば抗体の特異性又は親和性を回復又は改善するために、ヒト化抗体の一部のＦＲ残基は、非ヒト抗体（例えば、ＨＶＲ残基が由来する抗体）からの対応する残基で置換される。

【0148】

ヒト化抗体及びそれらを作製する方法は、例えば、Ａｌｍａｇｒｏ，Ｊ．Ｃ．及びＦｒａｎｓｓｏｎ，Ｊ．、Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１３（２００８）１６１９−１６３３で概説され、さらに、例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ，Ｉ．等、Ｎａｔｕｒｅ ３３２（１９８８）３２３−３２９；Ｑｕｅｅｎ，Ｃ．等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６（１９８９）１００２９−１００３３；米国特許第５８２１３３７号、７５２７７９１号、６９８２３２１号及び７０８７４０９号；Ｋａｓｈｍｉｒｉ，Ｓ．Ｖ．等、Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６（２００５）２５−３４（ＳＤＲ（ａ−ＣＤＲ）移植を記載する）；Ｐａｄｌａｎ，Ｅ．Ａ．、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８（１９９１）４８９−４９８（「リサーフェイシング」を記載する）；Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ，Ｗ．Ｆ．等、Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６（２００５）４３−６０（「ＦＲシャフリング」を記載する）；Ｏｓｂｏｕｒｎ，Ｊ等、Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６（２００５）６１−６８及びＫｌｉｍｋａ，Ａ．等、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，８３（２０００）２５２−２６０（ＦＲシャフリングの「誘導選択」手法を記載する）に記載されている。Ｍｏｒｅａ，Ｖ．等、Ｍｅｔｈｏｄｓ、ｌ２０巻、３版（２０００）２６７−２７９）及び国際公開第２００４／００６９５５号（正規の構造による手法）。

【0149】

４．ヒト抗体
ある特定の実施態様では、本明細書で提供される抗体は、ヒト抗体である。ヒト抗体は、当該技術分野で公知である様々な技術を用いて生成することができる。ヒト抗体は、ｖａｎ Ｄｉｊｋ，Ｍ．Ａ．及びｖａｎ ｄｅ Ｗｉｎｋｅｌ，Ｊ．Ｇ．、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５（２００１）３６８−３７４及びＬｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０（２００８）４５０−４５９に一般に記載されている。

【0150】

ヒト抗体は、抗原投与に応答してインタクトなヒト抗体又はヒト可変領域を有するインタクトな抗体を生成するように改変されているトランスジェニック動物に、免疫原を投与することによって調製することができる。そのような動物はヒト免疫グロブリン遺伝子座の全体又は一部を一般に含有し、それらは内因性免疫グロブリン遺伝子座を置き換えるか、又はそれらは染色体外に存在するか若しくは動物の染色体にランダムに組み込まれる。そのようなトランスジェニックマウスでは、内因性免疫グロブリン遺伝子座は、一般に不活性化されている。トランスジェニック動物からヒト抗体を得るための方法の概説については、Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２３（２００５）１１１７−１１２５を参照されたい。例えば、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（商標）技術を記載する米国特許第６０７５１８１号及び６１５０５８４号；ＨｕＭａｂ（登録商標）技術を記載する米国特許第５７７０４２９号；Ｋ−Ｍ ＭＯＵＳＥ（登録商標）技術を記載する米国特許第７０４１８７０号、及びＶｅｌｏｃｉＭｏｕｓｅ（登録商標）技術を記載する米国特許出願公開第２００７／００６１９００号も参照する。そのような動物によって生成されるインタクトな抗体からのヒト可変領域は、例えば異なるヒト定常領域と組み合わせることによってさらに改変することができる。

【0151】

ヒト抗体は、ハイブリドーマをベースとした方法によって作製することもできる。ヒトモノクローナル抗体の生成のための、ヒト骨髄腫及びマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞株が記載されている（例えば、Kozbor, D.、 J. Immunol.、133 (1984) 3001-3005；Brodeur, B.R.等、Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications、Marcel Dekker, Inc.、New York (1987)、p51-63；及びBoerner, P.等、J. Immunol.、147 (1991) 86-95を参照されたい）。ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術を通して生成されるヒト抗体も、Ｌｉ，Ｊ．等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０３（２００６）３５５７−３５６２に記載されている。追加の方法には、例えば、米国特許第７１８９８２６号（ハイブリドーマ細胞株からのモノクローナルヒトＩｇＭ抗体の生成を記載する）及びＮｉ，Ｊ．、Ｘｉａｎｄａｉ Ｍｉａｎｙｉｘｕｅ ２６（２００６）２６５−２６８（ヒト−ヒトハイブリドーマを記載する）に記載されるものが含まれる。ヒトハイブリドーマ技術（トリオーマ技術）も、Ｖｏｌｌｍｅｒｓ，Ｈ．Ｐ．及びＢｒａｎｄｌｅｉｎ，Ｓ．、Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ ２０（２００５）９２７−９３７及びＶｏｌｌｍｅｒｓ，Ｈ．Ｐ．及びＢｒａｎｄｌｅｉｎ，Ｓ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｆｉｎｄｉｎｇｓ ｉｎ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ２７（２００５）１８５−１９１に記載されている。

【0152】

ヒト抗体は、ヒト由来のファージディスプレイライブラリーから選択されるＦｖクローン可変ドメイン配列を単離することによって生成することもできる。そのような可変ドメイン配列は、所望のヒト定常ドメインと次に組み合わせることができる。抗体ライブラリーからヒト抗体を選択する技術は、下に記載される。

【0153】

５．ライブラリー由来の抗体
本発明の抗体は、所望の活性（複数可）を有する抗体についてコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることによって単離することができる。例えば、ファージディスプレイライブラリーを生成し、所望の結合特性を有する抗体についてそのようなライブラリーをスクリーニングするために、様々な方法が当該技術分野で公知である。そのような方法は、例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １７８（２００１）１−３７中のＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍ，Ｈ．Ｒ．等で概説され、さらに、例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ，Ｊ．等、Ｎａｔｕｒｅ ３４８（１９９０）５５２−５５４；Ｃｌａｃｋｓｏｎ，Ｔ．等、Ｎａｔｕｒｅ ３５２（１９９１）６２４−６２８；Ｍａｒｋｓ，Ｊ．Ｄ．等、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２（１９９２）５８１−５９７；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２４８（２００３）１６１−１７５中のＭａｒｋｓ，Ｊ．Ｄ．及びＢｒａｄｂｕｒｙ，Ａ．；Ｓｉｄｈｕ，Ｓ．Ｓ．等、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３８（２００４）２９９−３１０；Ｌｅｅ，Ｃ．Ｖ．等、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４０（２００４）１０７３−１０９３；Ｆｅｌｌｏｕｓｅ，Ｆ．Ａ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０１（２００４）１２４６７−１２４７２；及びＬｅｅ，Ｃ．Ｖ．等、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２８４（２００４）１１９−１３２に記載されている。

【0154】

ある特定のファージディスプレイ方法では、ＶＨ及びＶＬ遺伝子のレパートリーをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって別々にクローニングし、ファージライブラリーでランダムに組み換え、次に、それらをＷｉｎｔｅｒ，Ｇ．等、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１２（１９９４）４３３−４５５に記載されている通り、抗原結合性ファージについてスクリーニングすることができる。ファージは、抗体断片を一般的に単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片として又はＦａｂ断片として提示する。免疫化された供給源からのライブラリーは、ハイブリドーマを構築する必要なしに、免疫原へ高親和性抗体を提供する。あるいは、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，Ａ．Ｄ．等、ＥＭＢＯ Ｊ．１２（１９９３）７２５−７３４に記載される通り、いかなる免疫化なしに広範囲の非自己及び自己抗原へ抗体の単一供給源を提供するために、ナイーブレパートリーをクローニングする（例えば、ヒトから）ことができる。最後に、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ，Ｈ．Ｒ．及びＷｉｎｔｅｒ，Ｇ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． ２２７（１９９２）３８１−３８８に記載されている通り、幹細胞から、組換えを起こしていないＶ遺伝子セグメントをクローニングし、ランダム配列を含有するＰＣＲプライマーを用いて、高度可変ＣＤＲ３領域がコードされ、且つインビトロで組換えが起きるようにすることによって、ナイーブライブラリーを合成により作製することもできる。ヒト抗体ファージライブラリーを記載する特許公報には、例えば：米国特許第５７５０３７３号並びに米国特許出願公開第２００５／００７９５７４号、第２００５／０１１９４５５号、第２００５／０２６６０００号、第２００７／０１１７１２６号、第２００７／０１６０５９８号、第２００７／０２３７７６４号、第２００７／０２９２９３６号及び第２００９／０００２３６０号が含まれる。

【0155】

ヒト抗体ライブラリーから単離される抗体又は抗体断片は、本明細書においてヒト抗体又はヒト抗体断片とみなされる。

【0156】

６．多重特異性抗体
ある特定の実施態様では、本明細書で提供される抗体は、多重特異性抗体、例えば二重特異性抗体である。多重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる部位に結合特異性を有するモノクローナル抗体である。ある特定の実施態様では、結合特異性の１つはＨＥＲ１に対してであり、他は任意の他の抗原に対してである。ＨＥＲ１を発現する細胞に細胞傷害剤を局在化するために、二重特異性抗体を用いることもできる。二重特異性抗体は、完全長抗体又は抗体断片として調製することができる。

【0157】

多重特異性抗体の作製技術には、限定されずに、異なる特異性を有する２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対の組換え共発現（Milstein, C.及びCuello, A.C.、Nature 305 (1983) 537-540、国際公開第９３／０８８２９号、及びTraunecker, A.等、EMBO J. 10 (1991) 3655-3659を参照されたい）、及び「ノブ−イン−ホール」操作（例えば、米国特許第５７３１１６８号を参照されたい）が含まれる。多重特異的抗体は、抗体Ｆｃヘテロダイマー分子を作製するための静電ステアリング効果を操作すること（国際公開第２００９／０８９００４号）；２つ以上の抗体又は断片を架橋させること（例えば、米国特許第４６７６９８０号及びBrennan, M.等、Science 229 (1985) 81-83を参照されたい）；二重特異性抗体を生成するためにロイシンジッパーを用いること（例えば、Kostelny, S.A.等、J. Immunol. 148 (1992) 1547-1553を参照されたい）；二重特異性抗体断片を作製するための「ダイアボディ」技術を用いること（例えば、Hollinger, P.等、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 6444-6448を参照されたい）；及び単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）ダイマーを用いること（例えば、Gruber, M等、J. Immunol. 152 (1994) 5368-5374を参照されたい）；及び、例えばＴｕｔｔ，Ａ．等、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７（１９９１）６０−６９に記載されるような三重特異性抗体を調製することによって作製することもできる。

【0158】

「タコ抗体」を含む、３つ以上の機能的抗原結合部位を有する操作された抗体も、本明細書に含まれる（例えば、ＵＳ２００６／００２５５７６を参照されたい）。

【0159】

本明細書において、抗体又は断片は、ＨＥＲ１並びに別の異なる抗原に結合する抗原結合部位を含む「二重作用Ｆａｂ」又は「ＤＡＦ」も含む。（例えば、ＵＳ２００８／００６９８２０を参照されたい）。

【0160】

本明細書の抗体又は断片には、国際公開第２００９／０８０２５１号、国際公開第２００９／０８０２５２号、国際公開第２００９／０８０２５３号、国際公開第２００９／０８０２５４号、国際公開第２０１０／１１２１９３号、国際公開第２０１０／１１５５８９号、国際公開第２０１０／１３６１７２号、国際公開第２０１０／１４５７９２号及び国際公開第２０１０／１４５７９３号に記載される多重特異性抗体も含まれる。

【0161】

７．抗体変異体
ある特定の実施態様では、本明細書で提供される抗体のアミノ酸配列変異体が企図される。例えば、抗体の結合親和性及び／又は他の生物学的特性を向上させることが望ましいことがある。抗体のアミノ酸配列変異体は、抗体をコードするヌクレオチド配列に適切な改変を導入することによって、又はペプチド合成によって調製することができる。そのような改変には、例えば、抗体のアミノ酸配列中の残基からの欠失、及び／又はそれへの挿入及び／又はその置換が含まれる。その最終コンストラクトが所望の特徴、例えば抗原結合性を有する限り、最終コンストラクトに到達するために欠失、挿入及び置換の任意の組合せを作成することができる。

【0162】

ａ）置換、挿入及び欠失変異体
ある特定の実施態様では、１つ又は複数のアミノ酸置換を有する抗体変異体が提供される。置換型突然変異誘発のための目的の部位には、ＨＶＲ及びＦＲが含まれる。表１に「好ましい置換」の項目名の下に、保存的置換を示す。表１に「例示的な置換」の項目名の下に、及びアミノ酸側鎖クラスに関して下でさらに記載されるように、より実質的な変化が提供される。アミノ酸置換を目的の抗体に導入することができ、生成物を所望の活性、例えば、保持／改善された抗原結合性、低下した免疫原性又は改善されたＡＤＣＣ若しくはＣＤＣについてスクリーニングすることができる。

【0163】

アミノ酸は、共通する側鎖特性によって分類することができる：
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖配向に影響する残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。

【0164】

非保存的置換は、これらのクラスの１つのメンバーを別のクラスと交換することを伴う。

【0165】

置換型変異体の１つのタイプは、親抗体（例えばヒト化又はヒト抗体）の１つ又は複数の超可変領域の残基を置換することを含む。一般に、さらなる研究のために選択される生じた変異体（複数可）は、親抗体と比較してある特定の生物学的特性（例えば、増加した親和性、低減した免疫原性）の改変（例えば、改善）を有し、及び／又は実質的に保持された親抗体のある特定の生物学的特性を有する。例示的な置換型変異体は親和性成熟抗体であり、それは、例えば、本明細書に記載されるものなどのファージディスプレイをベースとした親和性成熟技術を用いて都合よく生成することができる。簡潔には、１つ又は複数のＨＶＲ残基を突然変異させ、変異体抗体をファージの上で提示し、特定の生物学的活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングする。

【0166】

例えば、抗体親和性を改善するために、ＨＶＲに変更（例えば、置換）を加えることができる。そのような変更はＨＶＲの「ホットスポット」で、すなわち、体細胞成熟過程において高頻度で突然変異を受けるコドンによってコードされる残基（例えば、Chowdhury, P.S.、Methods Mol. Biol. 207 (2008) 179-196を参照されたい）、及び／又はＳＤＲ（ａ−ＣＤＲ）で加えることができ、生じる変異体ＶＨ又はＶＬは結合親和性について試験される。二次ライブラリーから構築及び再選択することによる親和性成熟が、例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １７８（２００２）１−３７中のＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍ，Ｈ．Ｒ．等に記載されている。親和性成熟の一部の実施態様では、様々な方法（例えば、変異性ＰＣＲ、鎖シャッフリング又はオリゴヌクレオチド指定突然変異誘発）のいずれかによる成熟のために選択される可変遺伝子に、多様性が導入される。二次ライブラリーを次に作製する。所望の親和性を有する抗体変異体を特定するために、次にライブラリーをスクリーニングする。多様性を導入する別の方法は、ＨＶＲ指定手法を含み、この手法ではいくつかのＨＶＲ残基（例えば、一度に４−６残基）がランダム化される。抗原結合に関与するＨＶＲ残基は、例えば、アラニンスキャニング突然変異誘発又はモデル化を用いて、特異的に特定することができる。特に、ＣＤＲ−Ｈ３及びＣＤＲ−Ｌ３がしばしば標的にされる。

【0167】

ある特定の実施態様では、置換、挿入又は欠失は、そのような変更が抗原に結合する抗体の能力を実質的に低減しない限り、１つ又は複数のＨＶＲの中で起こることができる。例えば、結合親和性を実質的に低減しない保存的変更（例えば、本明細書で規定される保存的置換）を、ＨＶＲに加えることができる。そのような変更は、ＨＶＲの「ホットスポット」又はＳＤＲの外にあってもよい。上で提供される変異体ＶＨ及びＶＬ配列のある特定の実施態様では、各ＨＶＲは不変であるか、１つ以下、２つ又は３つのアミノ酸置換を含有する。

【0168】

突然変異誘発のために標的にすることができる抗体の特定の残基又は領域の特定のための有益な方法は、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ，Ｂ．Ｃ．及びＷｅｌｌｓ，Ｊ．Ａ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４（１９８９）１０８１−１０８５に記載のように「アラニンスキャニング突然変異誘発」と呼ばれる。この方法では、残基又は標的残基の群（例えば、ａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓ及びｇｌｕなどの荷電残基）が特定され、抗体と抗原の相互作用が影響を受けるかどうか判定するために中性又は負に荷電したアミノ酸（例えば、アラニン又はポリアラニン）によって置き換えられる。初期置換への機能的感受性を示しているアミノ酸位置に、さらなる置換を導入することができる。あるいは、又はさらに、抗体と抗原の間の接触点を特定するための、抗原抗体複合体の結晶構造。そのような接触残基及び隣接残基は、置換のための候補として標的にするか又は排除することができる。それらが所望の特性を有するかどうか判定するために、変異体をスクリーニングすることができる。

【0169】

アミノ酸配列の挿入には、１残基から１００以上の残基を含有するポリペプチドまでの長さのアミノ及び／又はカルボキシル末端融合、並びに単一又は複数のアミノ酸残基の配列内挿入が含まれる。末端挿入の例には、Ｎ末端メチオニル残基を有する抗体が含まれる。抗体分子の他の挿入型変異体には、抗体の血清中半減期を増加させる酵素（例えばＡＤＥＰＴ）又はポリペプチドに対する抗体のＮ又はＣ末端への融合が含まれる。

【0170】

ｂ）グリコシル化変異体
ある特定の実施態様では、本明細書で提供される抗体は、抗体がグリコシル化される程度を増加又は減少させるように変更される。抗体に対するグリコシル化部位の付加又は欠失は、１つ又は複数のグリコシル化部位が形成又は除去されるように、アミノ酸配列を変更することによって簡便に達成することができる。

【0171】

抗体がＦｃ領域を含む場合、それに結合する炭水化物を変更することができる。哺乳動物細胞によって生成される天然抗体は、Ｎ結合によってＦｃ領域のＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７に一般に結合する、分枝状の二分岐オリゴ糖を一般に含む。例えば、Ｗｒｉｇｈｔ，Ａ．及びＭｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．、ＴＩＢＴＥＣＨ １５（１９９７）２６−３２を参照されたい。オリゴ糖には、様々な炭水化物、例えば、マンノース、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧＩｃＮＡｃ）、ガラクトース及びシアル酸、並びに二分岐オリゴ糖構造の「ステム」のＧＩｃＮＡｃに結合したフコースを含めることができる。一部の実施態様では、ある特定の改善された特性を有する抗体変異体を作製するために、本発明の抗体のオリゴ糖の改変を加えることができる。

【0172】

一実施態様では、Ｆｃ領域に結合する（直接的又は間接的に）フコースを欠く炭水化物構造を有する抗体変異体が提供される。例えば、そのような抗体中のフコースの量は、１％から８０％、１％から６５％、５％から６５％又は２０％から４０％であってもよい。例えば国際公開第２００８／０７７５４６号に記載される通り、フコースの量は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析によって測定したときの、Ａｓｎ２９７に結合した全ての糖構造（例えば、複合体、ハイブリッド及び高マンノース構造）の合計と比較した、Ａｓｎ２９７の糖鎖中のフコースの平均量を計算することによって判定される。Ａｓｎ２９７は、Ｆｃ領域の２９７位（Ｆｃ領域残基のＥｕ番号付け）あたりに位置するアスパラギン残基を指す。しかし、抗体中の軽微な配列差異のために、Ａｓｎ２９７は、２９７位から約±３アミノ酸上流又は下流に、すなわち２９４位から３００位の間に位置することもできる。そのようなフコシル化変異体は、向上したＡＤＣＣ機能を有することができる。例えば、ＵＳ２００３／０１５７１０８；ＵＳ２００４／００９３６２１を参照されたい。「脱フコシル化」又は「フコース欠損」抗体変異体に関する刊行物の例には、以下のものが含まれる：ＵＳ２００３／０１５７１０８；国際公開第２０００／６１７３９号；国際公開第２００１／２９２４６号；ＵＳ２００３／０１１５６１４；ＵＳ２００２／０１６４３２８；ＵＳ２００４／００９３６２１；ＵＳ２００４／０１３２１４０；ＵＳ２００４／０１１０７０４；ＵＳ２００４／０１１０２８２；ＵＳ２００４／０１０９８６５；国際公開第２００３／０８５１１９号；国際公開第２００３／０８４５７０号；国際公開第２００５／０３５５８６号；国際公開第２００５／０３５７７８号；国際公開第２００５／０５３７４２号；国際公開第２００２／０３１１４０号；Ｏｋａｚａｋｉ，Ａ．等、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３６（２００４）１２３９−１２４９；Ｙａｍａｎｅ−Ｏｈｎｕｋｉ，Ｎ．等、Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．８７（２００４）６１４−６２２。脱フコシル化抗体の生成が可能な細胞株の例には、タンパク質フコシル化が欠損しているＬｅｃ１３ ＣＨＯ細胞（Ripka, J.等、Arch. Biochem. Biophys. 249 (1986) 533-545；ＵＳ２００３／０１５７１０８；及び国際公開第２００４／０５６３１２、特に実施例１１）、及びノックアウト細胞株、例えばアルファ−１，６−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子、ＦＵＴ８、ノックアウトＣＨＯ細胞（例えば、Yamane-Ohnuki, N.等、Biotech. Bioeng. 87 (2004) 614-622；Kanda, Y.等、Biotechnol. Bioeng. 94 (2006) 680-688；及び国際公開第２００３／０８５１０７号を参照されたい）が含まれる。

【0173】

二分されたオリゴ糖を有する、例えば抗体のＦｃ領域に結合する二分岐オリゴ糖がＧｌｃＮＡｃによって二分される抗体変異体がさらに提供される。そのような抗体変異体は、低減したフコシル化及び／又は向上したＡＤＣＣ機能を有することができる。そのような抗体変異体の例は、例えば、国際公開第２００３／０１１８７８号；米国特許第６６０２６８４号；及びＵＳ２００５／０１２３５４６に記載されている。Ｆｃ領域に結合するオリゴ糖に少なくとも１つのガラクトース残基を有する抗体変異体も、提供される。そのような抗体変異体は、向上したＣＤＣ機能を有することができる。そのような抗体変異体は、例えば、国際公開第１９９７／３００８７号；国際公開第１９９８／５８９６４号；及び国際公開第１９９９／２２７６４号に記載されている。

【0174】

ｃ）Ｆｃ領域変異体
ある特定の実施態様では、本明細書で提供される抗体のＦｃ領域に１つ又は複数のアミノ酸改変を導入し、それによってＦｃ領域変異体を生成することができる。Ｆｃ領域変異体は、１つ又は複数のアミノ酸位置にアミノ酸改変（例えば、置換）を含むヒトＦｃ領域配列（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４のＦｃ領域）を含むことができる。

【0175】

ある特定の実施態様では、本発明は、エフェクター機能の全てではなく一部を有する抗体変異体を企図し、このような抗体変異体であれば、抗体のインビボ半減期は重要であるが、ある特定のエフェクター機能（例えば、補体及びＡＤＣＣ）が不要又は有害である適用のための望ましい候補となる。ＣＤＣ及び／又はＡＤＣＣ活性の低減／消失を確認するために、インビトロ及び／又はインビボ細胞傷害性アッセイを実行することができる。例えば、抗体がＦｃγＲ結合を欠いている（したがって、ＡＤＣＣ活性を欠いている可能性がある）がＦｃＲｎ結合能力を保持することを確実にするために、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）結合アッセイを実行することができる。ＡＤＣＣを介在する一次細胞であるＮＫ細胞はＦｃガンマＲＩＩＩだけを発現するが、単球はＦｃガンマＲＩ、ＦｃガンマＲＩＩ及びＦｃガンマＲＩＩＩを発現する。造血細胞でのＦｃＲ発現は、Ｒａｖｅｔｃｈ，Ｊ．Ｖ．及びＫｉｎｅｔ，Ｊ．Ｐ．、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９（１９９１）４５７−４９２の４６４ページの表３で要約されている。目的の分子のＡＤＣＣ活性を調べるインビトロアッセイの非限定例は、米国特許第５５００３６２号（例えば、Hellstrom, I.等、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 (1986) 7059-7063;及びHellstrom, I.等、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 (1985) 1499-1502を参照されたい）；米国特許第５８２１３３７号（Bruggemann, M.等、J. Exp. Med. 166 (1987) 1351-1361を参照されたい）に記載されている。あるいは、非放射性アッセイ方法を採用することができる（例えば、フローサイトメトリーのためのＡＣＴＩ（商標）非放射性細胞傷害性アッセイ（ＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ；及びＣｙｔｏＴｏｘ ９６（登録商標）非放射性細胞傷害性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を参照されたい）。そのようなアッセイのための有益なエフェクター細胞には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が含まれる。あるいは、又はさらに、目的の分子のＡＤＣＣ活性は、例えばＣｌｙｎｅｓ，Ｒ．等、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５（１９９８）６５２−６５６に開示されているものなどの動物モデルにおいてインビボで評価してもよい。抗体がＣ１ｑに結合することができず、したがってＣＤＣ活性を欠くことを確認するために、Ｃ１ｑ結合アッセイを実行することもできる。例えば、国際公開第２００６／０２９８７９号及び国際公開第２００５／１００４０２号のＣ１ｑ及びＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照されたい。補体活性化を調べるために、ＣＤＣアッセイを実行することができる（例えば、Gazzano-Santoro, H.等、J. Immunol. Methods 202 (1996) 163-171；Cragg, M.S.等、Blood 101 (2003) 1045-1052；及びCragg, M.S.及びM.J. Glennie, Blood 103 (2004) 2738-2743を参照されたい）。当該技術分野で公知の方法を用いて、ＦｃＲｎ結合及びインビボでのクリアランス／半減期判定を実施することもできる（例えば、Petkova, S.B.等、Int. Immunol. 18(2006)1759-1769を参照されたい）。

【0176】

エフェクター機能の低減した抗体には、Ｆｃ領域残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７及び３２９の１つ又は複数の置換を有するものが含まれる（米国特許第６７３７０５６号）。そのようなＦｃ突然変異体には、残基２６５及び２９７のアラニンへの置換を有するいわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ突然変異体を含む、アミノ酸位置２６５、２６９、２７０、２９７及び３２７の２つ以上の置換を有するＦｃ突然変異体が含まれる（米国特許第７３３２５８１号）。

【0177】

ＦｃＲへの結合が向上又は減少したある特定の抗体変異体が記載される。（例えば、米国特許第６７３７０５６号；国際公開第２００４／０５６３１２号及びShields, R.L.等、J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604を参照されたい）。

【0178】

ある特定の実施態様では、抗体変異体は、ＡＤＣＣを向上させる１つ又は複数のアミノ酸置換、例えばＦｃ領域の２９８位、３３３位及び／又は３３４位（残基のＥＵ番号付け）の置換を有するＦｃ領域を含む。

【0179】

一部の実施態様では、例えば米国特許第６１９４５５１号、国際公開第９９／５１６４２号及びＩｄｕｓｏｇｉｅ，Ｅ．Ｅ．等、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４（２０００）４１７８−４１８４に記載されているように、変更された（すなわち、向上又は減少した）Ｃ１ｑ結合及び／又は補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）をもたらす変更がＦｃ領域に加えられる。

【0180】

半減期が増加した、及び胎児への母体ＩｇＧの移動を担う（Guyer, R.L.等、J. Immunol. 117 (1976) 587-593及びKim, J.K.等、J. Immunol. 24 (1994) 2429-2434）新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）への結合が向上した抗体が、ＵＳ２００５／００１４９３４に記載されている。それらの抗体は、ＦｃＲｎへのＦｃ領域の結合を向上させる１つ又は複数の置換をその中に有するＦｃ領域を含む。そのようなＦｃ変異体には、Ｆｃ領域残基２３８、２５６、２６５、２７２、２８６、３０３、３０５、３０７、３１１、３１２、３１７、３４０、３５６、３６０、３６２、３７６、３７８、３８０、３８２、４１３、４２４又は４３４の１つ又は複数の置換、例えばＦｃ領域残基４３４の置換を有するものが含まれる（米国特許第７３７１８２６号）。

【0181】

Ｆｃ領域変異体の他の例に関する、Ｄｕｎｃａｎ，Ａ．Ｒ．及びＷｉｎｔｅｒ，Ｇ．、Ｎａｔｕｒｅ ３２２（１９８８）７３８−７４０；ＵＳ５６４８２６０；ＵＳ５６２４８２１；及び国際公開第９４／２９３５１号も参照する。

【0182】

ｄ）システイン操作抗体変異体
ある特定の実施態様では、抗体の１つ又は複数の残基がシステイン残基で置換されるシステイン操作抗体、例えば「ｔｈｉｏＭＡｂ」を作製することが望ましいことがある。特定の実施態様では、置換される残基は、抗体のアクセス可能な部位に存在する。本明細書にさらに記載されるように、それらの残基をシステインで置換することによって、反応性チオール基が抗体のアクセス可能な部位に置かれ、抗体を他の部分、例えば薬物部分又はリンカー−薬物部分にコンジュゲートさせてイムノコンジュゲートを作製するために用いることができる。ある特定の実施態様では、以下の残基の任意の１つ又は複数をシステインで置換することができる：軽鎖のＶ２０５（カバット番号付け）；重鎖のＡ１１８（ＥＵ番号付け）；及び重鎖Ｆｃ領域のＳ４００（ＥＵ番号付け）。例えば米国特許第７５２１５４１号に記載されるように、システイン操作抗体を生成することができる。

【0183】

ｅ）抗体誘導体
ある特定の実施態様では、本明細書で提供される抗体は、当該技術分野で公知であって直ちに利用できるさらなる非タンパク質部分を含有するように、さらに改変することができる。抗体の誘導体化のために適する部分には、限定されずに水溶性ポリマーが含まれる。水溶性ポリマーの非限定例には、限定されずに、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールの共重合体、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸共重合体、ポリアミノ酸（ホモポリマー又はランダム共重合体）、及びデキストラン又はポリ（ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシド共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）、ポリビニルアルコール及びそれらの混合物が含まれる。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中でのその安定性のために製造上の利点を有することができる。ポリマーは任意の分子量であってもよく、分枝状であっても非分枝状であってもよい。抗体に付着するポリマーの数は異なってもよく、１を超える数のポリマーが付着する場合は、それらは同じか又は異なる分子であってもよい。一般に、誘導体化のために用いられるポリマーの数及び／又はタイプは、限定されずに、改善する抗体の特定の特性又は機能、抗体誘導体が規定条件下の療法で用いられるかどうか、などを含む考慮事項に基づいて決定することができる。

【0184】

別の実施態様では、抗体と、照射への曝露によって選択的に加熱することができる非タンパク質部分のコンジュゲートが提供される。一実施態様では、非タンパク質部分は、カーボンナノチューブである（Kam, N.W.等、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102 (2005) 11600-11605）。照射は任意の波長であってもよく、限定されずに、通常の細胞を害しないが、抗体−非タンパク質部分に隣接する細胞が死滅する温度まで非タンパク質部分を加熱する波長を含む。

【0185】

Ｂ．組換え方法及び組成物
抗体は、例えば米国特許第４８１６５６７号に記載されているように、組換え方法及び組成物を用いて生成することができる。一実施態様では、本明細書に記載される抗ＨＥＲ１抗体をコードする単離核酸が提供される。そのような核酸は、抗体のＶＬを含むアミノ酸配列及び／又はＶＨを含むアミノ酸配列（例えば、抗体の軽鎖及び／又は重鎖）をコードすることができる。さらなる実施態様では、そのような核酸を含む１つ又は複数のベクター（例えば、発現ベクター）が提供される。さらなる実施態様では、そのような核酸を含む宿主細胞が提供される。そのような実施態様では、宿主細胞は、以下のものを含む（例えば、以下のもので形質転換されている）：（１）抗体のＶＬを含むアミノ酸配列及び抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含むベクター、又は（２）抗体のＶＬを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第１のベクター及び抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第２のベクター。一実施態様では、宿主細胞は真核生物、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞又はリンパ系細胞（例えば、Ｙ０、ＮＳ０、Ｓｐ２０細胞）である。一実施態様では、抗ＨＥＲ１抗体を作製する方法であって、上で提供されるような抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を抗体の発現に適する条件下で培養すること、及び任意選択的に宿主細胞（又は宿主細胞培地）から抗体を回収することを含む方法が提供される。

【0186】

抗ＨＥＲ１抗体の組換え生成のために、例えば上記のような抗体をコードする核酸を単離して、さらなるクローニング及び／又は宿主細胞での発現のために１つ又は複数のベクターに挿入する。そのような核酸は、従来の手法を用いて（例えば、抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することが可能であるオリゴヌクレオチドプローブを用いて）、容易に単離し、配列決定を行うことができる。

【0187】

抗体をコードするベクターのクローニング又は発現のために適する宿主細胞には、本明細書に記載される原核生物又は真核生物の細胞が含まれる。例えば、特にグリコシル化及びＦｃエフェクター機能が不要なときは、抗体を細菌で生成することができる。細菌での抗体断片及びポリペプチドの発現については、例えばＵＳ５６４８２３７、ＵＳ５７８９１９９及びＵＳ５８４０５２３を参照されたい。（大腸菌での抗体断片の発現を記載する、Charlton, K.A., In:、Methods in Molecular Biology、248巻、Lo, B.K.C.(編)、Humana Press、Totowa、NJ (2003)、p245-254も参照する）。発現の後、抗体を可溶性分画中の細菌細胞ペーストから単離することができ、さらに精製することができる。

【0188】

原核生物に加えて、そのグリコシル化経路が「ヒト化され」、部分的又は完全にヒトのグリコシル化パターンを有する抗体の生成をもたらす真菌類及び酵母株を含む、糸状菌又は酵母などの真核生物の微生物が、抗体をコードするベクターのために適するクローニング又は発現宿主である。Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓ，Ｔ．Ｕ．、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２２（２００４）１４０９−１４１４及びＬｉ，Ｈ．等、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２４（２００６）２１０−２１５を参照されたい。

【0189】

グリコシル化抗体の発現のために適する宿主細胞は、多細胞生物（無脊椎動物及び脊椎動物）にも由来する。無脊椎動物細胞の例には、植物及び昆虫細胞が含まれる。特にヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞のトランスフェクションのために昆虫細胞と共に用いることができる、多数のバキュロウイルス株が同定された。

【0190】

植物細胞培養物を、宿主として利用することもできる。例えば、米国特許第５９５９１７７号、第６０４０４９８号、第６４２０５４８号、第７１２５９７８号及び第６４１７４２９号を参照されたい（トランスジェニック植物で抗体を生成するためのＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ（商標）技術を記載する）。

【0191】

脊椎動物細胞を、宿主として用いることもできる。例えば、懸濁液で成長するように適合させた哺乳動物細胞株が利用可能である。有益な哺乳動物宿主細胞株の他の例は、ＳＶ４０によって形質転換したサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ−７）；ヒト胚性腎臓株（例えば、Graham, F.L.等、J. Gen Virol. 36 (1977) 59-74に記載される、２９３又は２９３細胞）；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）；マウスセルトリ細胞（例えば、Mather, J.P.、Biol. Reprod. 23 (1980) 243-252に記載されるＴＭ４細胞）；サル腎臓細胞（ＣＶ１）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ；バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ３Ａ）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８）；ヒト肝細胞（ＨｅｐＧ２）；マウス乳房腫瘍（ＭＭＴ０６０５６２）；例えば、Mather, J.P.等、Annals N. Y. Acad. Sci. 383 (1982) 44-68に記載されるＴＲＩ細胞；ＭＲＣ ５細胞；及びＦＳ４細胞である。他の有益な哺乳動物の宿主細胞株には、ＤＨＦＲ⁻ＣＨＯ細胞を含むチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（Urlaub, G.等、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980) 4216-4220）；並びにＹ０、ＮＳ０及びＳｐ２／０などの骨髄腫細胞株が含まれる。抗体産生のために適するある特定の哺乳動物宿主細胞株の概説については、例えば、Ｙａｚａｋｉ，Ｐ．及びＷｕ，Ａ．Ｍ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、２４８巻、Ｌｏ，Ｂ．Ｋ．Ｃ（編）、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、ＮＪ（２００４）、ｐ２５５−２６８を参照されたい。

【0192】

Ｃ．アッセイ及び抗体（又は抗原結合性タンパク質）選択方法
本明細書で提供される抗ＨＥＲ１抗体は、当該技術分野で公知の様々なアッセイによってそれらの物理的／化学的特性及び／又は生物学的活性について特定するか、スクリーニングするか又は特徴付けることができる。

【0193】

本発明の一態様は、ヒトＨＥＲ１に結合する抗体（又は抗原結合性タンパク質）を選択する方法であって、抗体（又は抗原結合性タンパク質）はヒトＨＥＲ１のＰＰＬＭＬＹＮＰＴＴＹＱＭＤＶＮＰＥＧＫのアミノ酸配列（配列番号１）の中で結合し；
ここで、
ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含む
配列番号１２ ＴｔＳｌｙＤｃａｓ−ＨＥＲ１、
配列番号１３ ＴｔＳｌｙＤｃｙｓ−ＨＥＲ１、
配列番号１４ ＴｔＳｌｙＤ（ＧＳＧ）−ＨＥＲ１、
配列番号１５ ＴｔＳｌｙＤ（ＣＣ）−ＨＥＲ１、
配列番号１６ ＴｔＳｌｙＤ（ＳＳ）−ＨＥＲ１、及び
配列番号１８ ＴｇＳｌｙＤｃｙｓ−ＨＥＲ１、
からなる群から選択される少なくとも１つのポリペプチドが；
ａ）の下の少なくとも１つのポリペプチドへの結合を示す抗体（又は抗原結合性タンパク質）を（結合アッセイで）選択するために用いられ、
それによって、ヒトＨＥＲ１のＰＰＬＭＬＹＮＰＴＴＹＱＭＤＶＮＰＥＧＫのアミノ酸配列（配列番号１）の中で結合する抗原結合性タンパク質、特に抗体を選択する方法である。

【0194】

一実施態様では、そのような選択方法は、選択される抗体がＰＰＬＭＬＹＮＰＴＴＹＱＭＤＶＮＰＥＧＫのアミノ酸配列（配列番号１）を含まないポリペプチド足場に結合しないことを確認するために、選択される抗体が：
配列番号１１ ＴｔＳｌｙＤｃａｓ
配列番号１７ ＴｇＳｌｙＤΔＩＦ
からなる群から選択されるポリペプチドで逆スクリーニングされる（ポリペプチドへの結合について試験される）工程をさらに含む。

【0195】

本発明は、そのような選択方法によって得られる抗体（又は抗原結合性タンパク質）を提供する。

【0196】

ヒトＨＥＲ１に特異的に結合する抗体（又は抗原結合性タンパク質）を選択する方法であって、
ａ）配列番号１のアミノ酸配列を有するＨＥＲ１のβ−ヘアピンへの複数の抗体（又は抗原結合性タンパク質）の結合親和性を判定する工程であって、ＨＥＲ１のβ−ヘアピンは、配列番号１のアミノ酸配列を有するＨＥＲ１のβ−ヘアピンを含む：
ｉ）配列番号１２ ＴｔＳｌｙＤｃａｓ−ＨＥＲ１、
ｉｉ）配列番号１３ ＴｔＳｌｙＤｃｙｓ−ＨＥＲ１、
ｉｉｉ）配列番号１４ ＴｔＳｌｙＤ（ＧＳＧ）−ＨＥＲ１、
ｉｖ）配列番号１５ ＴｔＳｌｙＤ（ＣＣ）−ＨＥＲ１、
ｖ）配列番号１６ ＴｔＳｌｙＤ（ＳＳ）−ＨＥＲ１、及び
ｖｉ）配列番号１８ ＴｇＳｌｙＤｃｙｓ−ＨＥＲ１、
からなる群から選択されるポリペプチドとして提示される工程、
ｂ）所定の閾値レベルを上回る明らかな複合安定性を有する抗体（又は抗原結合性タンパク質）を選択する工程
を含む方法。

【0197】

１．結合アッセイ及び他のアッセイ
一態様では、本発明の抗体（又は抗原結合性タンパク質）は、例えば、表面プラズモン共鳴（ＢＩＡＣＯＲＥ）を含む、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロットなどの公知の方法によって、その抗原結合活性について試験される。

【0198】

別の態様では、ＨＥＲ１への結合について
ｉ）寄託された抗体ＭＡＫ＜ＨＥＲ１−ＤＩＢ＞Ｍ−５０．０９７．１４（ＤＳＭ ＡＣＣ３２４０）；
ｉｉ）寄託された抗体ＭＡＫ＜ＨＥＲ１−ＤＩＢ＞Ｍ−５０．１１０．２３（ＤＳＭ ＡＣＣ３２４１）；
ｉｉｉ）寄託された抗体ＭＡＫ＜ＨＥＲ１−ＤＩＢ＞Ｍ−３７．０５８．０９（ＤＳＭ ＡＣＣ３２３８）；又は
ｉｖ）寄託された抗体ＭＡＫ＜ＨＥＲ１−ＤＩＢ＞Ｍ−３７．１８６．１５（ＤＳＭ ＡＣＣ３２３９）；
と競合する抗体を特定するために、競合アッセイを用いることができる。

【0199】

ある特定の実施態様では、そのような競合抗体は、
ｉ）寄託された抗体ＭＡＫ＜ＨＥＲ１−ＤＩＢ＞Ｍ−５０．０９７．１４（ＤＳＭ ＡＣＣ３２４０）；
ｉｉ）寄託された抗体ＭＡＫ＜ＨＥＲ１−ＤＩＢ＞Ｍ−５０．１１０．２３（ＤＳＭ ＡＣＣ３２４１）；
ｉｉｉ）寄託された抗体ＭＡＫ＜ＨＥＲ１−ＤＩＢ＞Ｍ−３７．０５８．０９（ＤＳＭ ＡＣＣ３２３８）；又は
ｉｖ）寄託された抗体ＭＡＫ＜ＨＥＲ１−ＤＩＢ＞Ｍ−３７．１８６．１５（ＤＳＭ ＡＣＣ３２３９）
が結合するのと同じエピトープ（例えば、線状又は立体配置的エピトープ）に結合する。

【0200】

抗体が結合するエピトープをマッピングするための詳細な例示的方法は、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、６６巻、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、ＮＪ（１９６６）中のＭｏｒｒｉｓ，Ｇ．Ｅ．編、Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓで提供される。ＣｅｌｌｕＳｐｏｔ（商標）技術を用いるさらなる方法が、実施例４で詳述される。

【0201】

例示的な競合アッセイでは、固定化されたＨＥＲ１は、ＨＥＲ１にそれぞれ結合する第１の標識化抗体（例えば、寄託された抗体ＭＡＫ＜ＨＥＲ１−ＤＩＢ＞Ｍ−５０．０９７．１４（ＤＳＭ ＡＣＣ３２４０）；ＭＡＫ＜ＨＥＲ１−ＤＩＢ＞Ｍ−５０．１１０．２３（ＤＳＭ ＡＣＣ３２４１）；ＭＡＫ＜ＨＥＲ１−ＤＩＢ＞Ｍ−３７．０５８．０９（ＤＳＭ ＡＣＣ３２３８）；ＭＡＫ＜ＨＥＲ１−ＤＩＢ＞Ｍ−３７．１８６．１５（ＤＳＭ ＡＣＣ３２３９））及びＨＥＲ１への結合に関して第１の抗体と競合するその能力について試験される第２の非標識化抗体を含む溶液中でインキュベートされる。第２の抗体は、ハイブリドーマ上清中に存在してもよい。コントロールとして、固定化されたＨＥＲ１を、第１の標識化抗体を含んでいるが第２の非標識化抗体を含まない溶液中でインキュベートする。ＨＥＲ１への第１の抗体の結合を許容する条件下でのインキュベーションの後、過剰な未結合の抗体を除去し、固定化されたＨＥＲ１に結合している標識の量を測定する。固定化されたＨＥＲ１に結合している標識の量がコントロール試料に対して試験試料で実質的に低減されている場合は、そのことは、ＨＥＲ１への結合に関して第２の抗体が第１の抗体と競合していることを示す。Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ及びＬａｎｅ，Ｄ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｃｈａｐｔｅｒ．１４、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ（１９８８）を参照されたい。

【0202】

２．活性アッセイ
一態様では、生物活性を有する、その抗ＨＥＲ１抗体（又は抗原結合性タンパク質）を特定するためのアッセイが提供される。生物活性には、例えば、ＨＥＲ１リン酸化の阻害、ＥＧＦの非存在下でのＨＥＲ１リン酸化に関する非アゴニスト活性、ＨＥＲ１を発現又は過剰発現するがん細胞のがん細胞増殖の阻害、ＨＥＲ１／ＨＥＲ１ホモ二量体化の阻害、ＨＥＲ１／ＨＥＲ２ヘテロ二量体化の阻害、ウェスタンブロット又はＦＡＣＳアッセイによる（時間依存的）内部移行、異種移植ＨＥＲ１を発現又は過剰発現するがん細胞を有する異種移植動物（例えば、マウス又はラット）モデルでのインビボ腫瘍増殖阻害を含めることができる。そのような生物活性を有する抗体は、単独で、又はインビボ及び／又はインビトロで細胞傷害性剤とのイムノコンジュゲートとしても提供される。

【0203】

ある特定の実施態様では、本発明の抗体は、そのような生物活性について試験される。特定の生物活性のための例示的なビトロ又はインビボアッセイは、実施例２ｅ、及び実施例５、６及び８で記載される。

【0204】

Ｄ．イムノコンジュゲート
本発明は、１つ又は複数の細胞傷害性剤、例えば化学療法剤若しくは薬物、増殖阻害剤、毒素（例えば、細菌、真菌、植物又は動物起源のタンパク質毒素、酵素活性毒素、又はその断片）、又は放射性同位体にコンジュゲートされた本明細書に記載の抗ＨＥＲ１抗体（又は抗原結合性タンパク質）を含むイムノコンジュゲートも提供する。

【0205】

一実施態様では、イムノコンジュゲートは、抗体が１つ又は複数の薬物、例えば、限定されずに、メイタンシノイド（ＵＳ５２０８０２０、ＵＳ５４１６０６４及びＥＰ０４２５２３５Ｂ１を参照されたい）；モノメチルアウリスタチン薬物部分ＤＥ及びＤＦ（ＭＭＡＥ及びＭＭＡＦ）などのアウリスタチン（ＵＳ５６３５４８３及びＵＳ５７８０５８８及び米ＵＳ７４９８２９８を参照されたい）；ドラスタチン；カリケアマイシン又はその誘導体（ＵＳ５７１２３７４、ＵＳ５７１４５８６、ＵＳ５７３９１１６、ＵＳ５７６７２８５、ＵＳ５７７０７０１、ＵＳ５７７０７１０、ＵＳ５７７３００１及びＵＳ５８７７２９６；Hinman, L.M.等、Cancer Res. 53 (1993) 3336-3342及びLode, H.N.等、Cancer Res. 58 (1998) 2925-2928を参照されたい）；ダウノマイシン又はドキソルビシンなどのアントラサイクリン（Kratz, F.等、Curr. Med. Chem. 13 (2006) 477-523；Jeffrey, S.C.等、Bioorg. Med. Chem. Lett. 16 (2006) 358-362；Torgov, M.Y.等、Bioconjug. Chem. 16 (2005) 717-721；Nagy, A.等、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97(2000)829-834；Dubowchik, G.M.等、Bioorg. & Med. Chem. Letters 12 (2002) 1529-1532；King, H.D.等、J. Med. Chem. 45 (2002) 4336-4343；及び米国特許第６６３０５７９号を参照されたい）；メトトレキサート；ビンデシン；ドセタキセル、パクリタキセル、ラロタキセル、テセタキセル及びオルタタキセルなどのタキサン；トリコテセン；並びにＣＣ１０６５にコンジュゲートされる抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）である。

【0206】

別の実施態様では、イムノコンジュゲートは、限定されずに、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合性活性断片、外毒素Ａ鎖（緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）から）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデッシンＡ鎖、アルファ−サルシン、シナアブラギリ（Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ ｆｏｒｄｉｉ）タンパク質、ダイアンシンタンパク質、ヨウシュヤマゴボウ（Ｐｈｙｔｏｌａｃａ ａｍｅｒｉｃａｎａ）タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ及びＰＡＰ−Ｓ）、ツルレイシ（ｍｏｍｏｒｄｉｃａ ｃｈａｒａｎｔｉａ）阻害剤、クルシン、クロチン、サポンソウ（ｓａｐａｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）阻害剤、ゲロニン、マイトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン及びトリコテセンを含む、酵素活性毒素又はその断片にコンジュゲートされた本明細書に記載の抗体を含む。

【0207】

別の実施態様では、イムノコンジュゲートは、シュードモナス外毒素Ａ又はその変異体にコンジュゲートされた本明細書に記載の抗体を含む。シュードモナス外毒素Ａ又はその変異体は、例えば、国際公開第２０１１／３２０２２号、国際公開第２００９／３２９５４号、国際公開第２００７／０３１７４１号、国際公開第２００７／０１６１５０号、国際公開第２００５／０５２００６号及びＬｉｕ Ｗ等、ＰＮＡＳ１０９（２０１２）１１７８２−１１７８７に記載される。

【0208】

別の実施態様では、イムノコンジュゲートは、放射性原子にコンジュゲートされて放射性コンジュゲートを形成する、本明細書に記載の抗体を含む。放射性コンジュゲートの生成のために、様々な放射性同位体が利用できる。例には、Ａｔ^２１１、Ｉ^１３１、Ｉ^１２５、Ｙ^９０、Ｒｅ^１８６、Ｒｅ^１８８、Ｓｍ^１５３、Ｂｉ^２１２、Ｐ^３２、Ｐｂ^２１２及びＬｕの放射性同位体が含まれる。放射性コンジュゲートを検出のために用いる場合は、それは、シンチグラフィー研究のための放射性原子、例えばＴＣ^９９ｍ若しくはＩ^１２３、又は核磁気共鳴（ＮＭＲ）画像化（磁気共鳴画像化、ＭＲＩとしても知られる）のためのスピン標識、例えば、再度ヨウ素−１２３、ヨウ素−１３１、インジウム−１１１、フッ素−１９、炭素−１３、窒素−１５、酸素−１７、ガドリニウム、マンガン若しくは鉄を含むことができる。

【0209】

抗体及び細胞傷害性剤のコンジュゲートは、ａ）組換え発現技術（例えば、大腸菌でＦａｂ又はＦｖ抗体断片に融合しているアミノ酸配列ベースの毒素の発現のため）を用いて、ｂ）ポリペプチドカップリング技術（Ｆａｂ又はＦｖ抗体断片へのアミノ酸配列ベースの毒素のソルターゼ酵素ベースのカップリングなど）を用いて、又はｃ）様々な二官能基のタンパク質カップリング剤、例えば、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオナート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能基の誘導体（例えば、ジメチルアジピミダートＨＣｌ）、活性エステル（例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル）、アルデヒド（例えば、グルタルアルデヒド）、ビス−アジド化合物（例えば、ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス−ジアゾニウム誘導体（例えば、ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えば、トルエン２，６−ジイソシアネート）及びビス活性フッ素化合物（例えば、１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン）を用いて作製することができる。例えば、リシンイムノトキシンは、Ｖｉｔｅｔｔａ，Ｅ．Ｓ．等、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３８（１９８７）１０９８−１１０４に記載のように調製することができる。炭素１４標識１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、抗体への放射性ヌクレオチドのコンジュゲーションのための例示的なキレート剤である。国際公開第９４／１１０２６号を参照されたい。リンカーは、細胞内で細胞傷害薬の放出を促進する「開裂可能なリンカー」であってもよい。例えば、酸に対して不安定なリンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー、感光性リンカー、ジメチルリンカー又はジスルフィド含有リンカー（Chari, R.V.等、Cancer Res. 52 (1992) 127-131；米国特許第５２０８０２０号）を用いることができる。

【0210】

本明細書のイムノコンジュゲート又はＡＤＣは、限定されずに、市販されている（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ．、Ｕ．Ｓ．Ａから）架橋試薬、例えば、限定されずに、ＢＭＰＳ、ＥＭＣＳ、ＧＭＢＳ、ＨＢＶＳ、ＬＣ−ＳＭＣＣ、ＭＢＳ、ＭＰＢＨ、ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢ、ＳＭＣＣ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、スルホ−ＥＭＣＳ、スルホ−ＧＭＢＳ、スルホ−ＫＭＵＳ、スルホ−ＭＢＳ、スルホ−ＳＩＡＢ、スルホ−ＳＭＣＣ及びスルホ−ＳＭＰＢ及びＳＶＳＢ（スクシンイミジル−（４−ビニルスルホン）ベンゾエート）によって調製されるコンジュゲートを明示的に企図する。

【0211】

Ｅ．診断及び検出のための方法及び組成物
ある特定の実施態様では、本明細書で提供される抗ＨＥＲ１抗体（又は抗原結合性タンパク質）のいずれも、生物学的試料中のＨＥＲ１の存在をそれぞれ検出するのに有益である。本明細書で用いる用語「検出する」は、定量的又は定性的検出を包含する。ある特定の実施態様では、生物学的試料は、腫瘍組織などの細胞又は組織を含む。

【0212】

一実施態様では、診断又は検出の方法で用いるための抗ＨＥＲ１抗体が提供される。さらなる態様では、生物学的試料中のＨＥＲ１の存在をそれぞれ検出する方法が提供される。ある特定の実施態様では、この方法は、ＨＥＲ１への抗ＨＥＲ１抗体の結合を許容する条件下で生物学的試料を本明細書に記載される抗ＨＥＲ１抗体とそれぞれ接触させること、及び抗ＨＥＲ１抗体とＨＥＲ１の間でそれぞれ複合体が形成されるかどうか検出することを含む。そのような方法は、インビトロ又はインビボの方法であってもよい。一実施態様では、抗ＨＥＲ１抗体は、例えばＨＥＲ１がそれぞれ患者の選択のためのバイオマーカーである場合に、抗ＨＥＲ１抗体による療法に適格な対象を選択するために用いられる。

【0213】

本発明の抗体を用いて診断することができる例示的な障害には、がんが含まれる。

【0214】

ある特定の実施態様では、標識化抗ＨＥＲ１抗体が提供される。標識には、限定されずに、直接的に検出される標識又は部分（例えば、蛍光性、発色性、高電子密度、化学発光及び放射性の標識）、並びに、例えば酵素反応又は分子相互作用を通して間接的に検出される酵素又はリガンドなどの部分が含まれる。例示的な標識には、限定されずに、放射性同位体^３２Ｐ、^１４Ｃ、^１２５Ｉ、^３Ｈ及び^１３１Ｉ、フルオロフォア、例えば希土類キレート又はフルオレセイン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロン、ルシフェラーゼ、例えばホタルルシフェラーゼ及び細菌ルシフェラーゼ（米国特許第４７３７４５６号）、ルシフェリン、２，３−ジヒドロフタラジンジオン、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、糖類オキシダーゼ、例えばグルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、及びグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、ＨＲＰなどの色素前駆体を酸化するために過酸化水素を採用する酵素に結合した複素環式オキシダーゼ、例えばウリカーゼ及びキサンチンオキシダーゼ、ラクトペルオキシダーゼ又はミクロペルオキシダーゼ、ビオチン／アビジン、スピン標識、バクテリオファージ標識、安定したフリーラジカルなどが含まれる。

【0215】

Ｆ．薬学的製剤
本明細書に記載される抗ＨＥＲ１抗体（又は抗原結合性タンパク質）の薬学的製剤は、所望の純度を有するそのような抗体を、１つ又は複数の任意選択の薬学的に許容される担体（Remington's Pharmaceutical Sciences、16版、Osol, A.(編)(1980)）と、凍結乾燥製剤又は水溶液の形で混合することによって調製される。薬学的に許容される担体は、採用される投薬量及び濃度でレシピエントに一般に無毒であり、限定されずに以下のものが含まれる：バッファー、例えばリン酸、クエン酸及び他の有機酸；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤；保存剤（例えば、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；ヘキサメトニウムクロライド；ベンザルコニウムクロライド；ベンゼトニウムクロライド；フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；メチル又はプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レソルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；及びｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリン；ポリ（ビニルピロリドン）などの親水性ポリマー；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリジン；単糖類、二糖類及びグルコース、マンノース又はデキストリンを含む他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート化剤；スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトールなどの糖類；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えばＺｎ−タンパク質錯体）；及び／又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤。本明細書の例示的な薬学的に許容される担体には、間質性の薬物分散剤、例えば可溶型中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質（ｓＨＡＳＥＧＰ）、例えばヒト可溶型ＰＨ−２０ヒアルロニダーゼ糖タンパク質、例えばｒｈｕＰＨ２０（ＨＹＬＥＮＥＸ（登録商標）、Ｂａｘｔｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．）がさらに含まれる。ｒｈｕＰＨ２０を含む有用なある特定の例示的なｓＨＡＳＥＧＰ及び方法は、米国特許出願公開第２００５／０２６０１８６号及び第２００６／０１０４９６８号に記載されている。一態様では、ｓＨＡＳＥＧＰはコンドロイチン分解酵素などの１つ又は複数の追加のグリコサミノグリカナーゼと組み合わされる。

【0216】

例示的な凍結乾燥された抗体製剤は、米国特許第６２６７９５８号に記載されている。水性抗体製剤には、米国特許第６１７１５８６号及び国際公開第２００６／０４４９０８号に記載されるものが含まれ、後者製剤にはヒスチジン−酢酸バッファーが含まれる。

【0217】

本明細書の製剤は、治療中の特定の適応症のために必要に応じて１を超える有効成分を含有することもできる。

【0218】

有効成分は、例えばコアセルベーション技術又は界面重合、例えばそれぞれヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン−マイクロカプセル及びポリ（メチルメタクリレート）マイクロカプセルによって調製されるマイクロカプセルに、コロイド状薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル）又はマクロエマルジョンの形で取り込むことができる。そのような技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１６版、Ｏｓｏｌ，Ａ．（編）（１９８０）に開示されている。

【0219】

徐放性調製物を調製することができる。徐放性調製物の適する例には、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスが含まれ、そのマトリックスは造形品、例えばフィルム又はマイクロカプセルの形である。

【0220】

インビボ投与のために用いられる製剤は、一般に無菌である。無菌状態は、例えば滅菌濾過膜を通す濾過によって容易に達成することができる。

【0221】

Ｇ．治療方法及び組成物
本明細書で提供される、抗ＨＥＲ１抗体（又は抗原結合性タンパク質）又は細胞傷害性剤にコンジュゲートされた抗ＨＥＲ１抗体（又は抗原結合性タンパク質）のイムノコンジュゲートのいずれも、治療方法で用いることができる。

【0222】

一態様では、医薬として用いるための抗ＨＥＲ１抗体又は細胞傷害性剤にコンジュゲートされた抗ＨＥＲ１抗体のイムノコンジュゲートが提供される。さらなる態様では、がん治療における使用のための抗ＨＥＲ１抗体又は細胞傷害性剤にコンジュゲートされた抗ＨＥＲ１抗体のイムノコンジュゲートが提供される。ある特定の実施態様では、治療方法で用いるための抗ＨＥＲ１抗体又は細胞傷害性剤にコンジュゲートされた抗ＨＥＲ１抗体のイムノコンジュゲートが提供される。ある特定の実施態様では、本発明は、がんを有する個体を治療する方法であって、抗ＨＥＲ１抗体又は細胞傷害性剤にコンジュゲートされた抗ＨＥＲ１抗体のイムノコンジュゲートの有効量を個体に投与することを含む方法で用いるための、抗ＨＥＲ１抗体又は細胞傷害性剤にコンジュゲートされた抗ＨＥＲ１抗体のイムノコンジュゲートを提供する。さらなる実施態様では、本発明は、がん細胞のアポトーシスを誘導するか／又はがん細胞増殖を阻害することに用いるための、抗ＨＥＲ１抗体又は細胞傷害性剤にコンジュゲートされた抗ＨＥＲ１抗体のイムノコンジュゲートを提供する。ある特定の実施態様では、本発明は、個体でがん細胞のアポトーシスを誘導するか／又はがん細胞増殖を阻害する方法であって、抗ＨＥＲ１抗体又は細胞傷害性剤にコンジュゲートされた抗ＨＥＲ１抗体のイムノコンジュゲートの有効量を個体に投与して、がん細胞のアポトーシスを誘導するか／又はがん細胞増殖を阻害することを含む方法で用いるための、抗ＨＥＲ１抗体又は細胞傷害性剤にコンジュゲートされた抗ＨＥＲ１抗体のイムノコンジュゲートを提供する。上記の実施態様のいずれかによる「個体」は、好ましくはヒトである。

【0223】

さらなる態様では、本発明は、医薬の製造又は調製における、抗ＨＥＲ１抗体又は細胞傷害性剤にコンジュゲートされた抗ＨＥＲ１抗体のイムノコンジュゲートの使用を提供する。一実施態様では、医薬はがんの治療のためである。さらなる実施態様では、医薬は、がんを有する個体に医薬の有効量を投与することを含むがんの治療方法で用いるためのものである。さらなる実施態様では、医薬は、がん細胞のアポトーシスを誘導するか／又はがん細胞増殖を阻害するためのものである。さらなる実施態様では、医薬は、がんを患っている個体でがん細胞のアポトーシスを誘導するか／又はがん細胞増殖を阻害する方法であって、がん細胞のアポトーシスを誘導するか／又はがん細胞増殖を阻害するのに有効な医薬の量を個体に投与することを含む方法で用いるためのものである。上記の実施態様のいずれかによる「個体」は、ヒトであってもよい。

【0224】

さらなる態様では、本発明は、がんを治療する方法を提供する。一実施態様では、この方法は、がんを有する個体に抗ＨＥＲ１抗体の有効量を投与することを含む。上記の実施態様のいずれかによる「個体」は、ヒトであってもよい。

【0225】

さらなる態様では、本発明は、がんを患っている個体でがん細胞のアポトーシスを誘導するか／又はがん細胞増殖を阻害する方法を提供する。一実施態様では、本方法は、抗ＨＥＲ１抗体又は細胞傷害性化合物にコンジュゲートされた抗ＨＥＲ１抗体のイムノコンジュゲートの有効量を個体に投与して、がんを患っている個体でがん細胞のアポトーシスを誘導するか／又はがん細胞増殖を阻害することを含む。一実施態様では、「個体」はヒトである。

【0226】

さらなる態様では、本発明は、例えば上記の治療方法のいずれかで用いるための、本明細書で提供される抗ＨＥＲ１抗体のいずれかを含む薬学的製剤を提供する。一実施態様では、薬学的製剤は、本明細書で提供される抗ＨＥＲ１抗体のいずれか及び薬学的に許容される担体を含む。

【0227】

本発明の抗体（及び任意の追加の治療剤）は、非経口、肺内及び鼻腔内、及び、局所治療のために所望の場合は病巣内投与を含む、任意の適する手段によって投与することができる。非経口注入には、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内又は皮下の投与が含まれる。投与は、一部、投与が短期であるか又は長期であるかによって、任意の適する経路、例えば注射、例えば静脈内又は皮下注射によることができる。限定されずに様々な時点での単一又は複数の投与、ボーラス投与及びパルス注入を含む、様々な投与スケジュールが本明細書で企図される。

【0228】

本発明の抗体は、医学行動規範と一致した様式で製剤化、投薬及び投与されるだろう。この関係において考慮すべき因子には、治療される特定の障害、治療される特定の哺乳動物、個々の患者の臨床状態、障害の原因、薬剤の送達部位、投与方法、投与計画及び医療施術者に公知である他の因子が含まれる。抗体は、その必要はないが、問題の障害を予防又は治療するために現在用いられている１つ又は複数の薬剤と一緒に任意選択的に製剤化される。そのような他の薬剤の有効量は、製剤中に存在する抗体の量、障害又は治療のタイプ及び上述の他の因子に依存する。これらは本明細書に記載されるのと同じ投薬量及び投与経路で、又は本明細書に記載される投薬量の約１から９９％で、又は適切であると経験的／臨床的に判定される任意の投薬量及び任意の経路によって一般に用いられる。

【0229】

疾患の予防又は治療のために、本発明の抗体の適切な投薬量（単独で用いられるか又は１つ若しくは複数の他の追加の治療剤と併用されるとき）は、治療する疾患のタイプ、抗体のタイプ、疾患の重症度及び経過、抗体が予防又は治療目的で投与されるのか、以前の療法、患者の病歴及び抗体への応答、並びに主治医の裁量に依存する。抗体は、好適には、単回で又は一連の治療にわたって患者に投与される。例えば、１回を超える別個の投与によるものであれ又は連続的注入によるものであれ、疾患のタイプ及び重症度によって、約１μｇ／ｋｇから１５ｍｇ／ｋｇ（例えば０．５ｍｇ／ｋｇ−１０ｍｇ／ｋｇ）の抗体が患者への投与のための初期候補投薬量であってもよい。１つの一般的な日投薬量は、上で指摘した因子によって、約１μｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇ以上の範囲内であってもよい。数日以上にわたる反復投与のためには、状態により、治療は病徴の所望の抑制が起こるまで一般に維持される。抗体の１つの例示的な投薬量は、約０．０５ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇの範囲内であろう。したがって、約０．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、４．０ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇ（又はその任意の組合せ）の単回又は複数回の用量を患者に投与することができる。そのような用量は、断続的に、例えば毎週又は３週毎に投与することができる（例えば、患者が約２から約２０用量、又は例えば約６用量の抗体を受けるように）。より高い初回負荷用量と、続く１回又は複数回のより低い用量を投与することができる。例示的な投薬レジメンは、約４ｍｇ／ｋｇの初回負荷用量の投与、続いて抗体の約２ｍｇ／ｋｇの毎週の維持量の投与を含む。しかし、他の投薬レジメンが利用可能なことがある。この療法の進行は、従来の技術及びアッセイにより容易に監視される。

【0230】

抗ＨＥＲ１抗体の代わりに又はそれに加えて本発明のイムノコンジュゲートを用いて、上記の製剤又は治療方法のいずれかを実行することができることが理解される。

【0231】

ＩＩＩ．製造品
本発明の別の態様では、上記の障害の治療、予防及び／又は診断のために有益な材料を含有する製造品が提供される。製造品は、容器、及び容器の上に又はそれに関連して表示又は添付文書を含む。適する容器には、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、ＩＶ溶液バッグなどが含まれる。容器はガラス又はプラスチックなどの様々な材料で形成することができる。容器は、それ自体が有効であるか、又は状態を治療、予防及び／若しくは診断するために有効な別の組成物と組み合わされた組成物を保持し、滅菌アクセスポートを有することができる（例えば、容器は、静脈内溶液バッグ又は皮下注射針で穿刺可能なストッパを有するバイアルであってもよい）。組成物中の少なくとも１つの活性剤は、本発明の抗体である。表示又は添付文書は、組成物が選択された状態を治療するために用いられることを示す。さらに、製造品は、（ａ）本発明の抗体を含む組成物を含有する第１の容器；及び（ｂ）さらなる細胞傷害性の、さもなければ治療用の薬剤を含む組成物を含有する第２の容器を含むことができる。本発明のこの実施態様で、製造品は、特定の状態を治療するために組成物を用いることができることを示す添付文書をさらに含むことができる。あるいは、又はさらに、製造品は、薬学的に許容されるバッファー、例えば静菌性注射用水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝食塩水、リンガー液及びデキストローズ溶液を含む第２の（又は第３の）容器をさらに含むことができる。それは、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針及びシリンジを含む、商業的及びユーザーの見地から望ましい他の材料をさらに含むことができる。

【0232】

上記の製造品のいずれかは、抗ＨＥＲ１抗体の代わりに又はそれに加えて、本発明のイムノコンジュゲートを含むことができることが理解される。

【0233】

アミノ酸配列の説明
配列番号１ ヒトＨＥＲ１のβ−ヘアピン
配列番号２ ヒトＨＥＲ１
配列番号３ ヒトＨＥＲ１細胞外ドメイン（ＥＣＤ）
配列番号４ ヒトＥＧＦ
配列番号５ ヒトＨＥＲ２
配列番号６ ヒトＨＥＲ２細胞外ドメイン（ＥＣＤ）
配列番号７ ヒトＨＥＲ３
配列番号８ ヒトＨＥＲ３細胞外ドメイン（ＥＣＤ）
配列番号９ ヒトＨＥＲ４
配列番号１０ ヒトＨＥＲ４細胞外ドメイン（ＥＣＤ）
配列番号１１ ＴｔＳｌｙＤｃａｓ
配列番号１２ ＴｔＳｌｙＤｃａｓ−ＨＥＲ１
配列番号１３ ＴｔＳｌｙＤｃｙｓ−ＨＥＲ１
配列番号１４ ＴｔＳｌｙＤ（ＧＳＧ）−ＨＥＲ１
配列番号１５ ＴｔＳｌｙＤ（ＣＣ）−ＨＥＲ１
配列番号１６ ＴｔＳｌｙＤ（ＳＳ）−ＨＥＲ１
配列番号１７ ＴｇＳｌｙＤΔＩＦ
配列番号１８ ＴｇＳｌｙＤｃｙｓ−ＨＥＲ１
配列番号１９ ＨＥＲ１抗体Ｍ−４７−１３のＨＥＲ１結合性エピトープ
配列番号２０ ＨＥＲ１抗体Ｍ−５０−１４（寄託されたＭＡＫ＜ＨＥＲ１−ＤＩＢ＞Ｍ−５０．０９７．１４）及びＭ−５０−２３（寄託されたＭＡＫ＜ＨＥＲ１−ＤＩＢ＞Ｍ−５０．１１０．２３）のＨＥＲ１結合性エピトープ
配列番号２１ ヒトカッパ軽鎖定常領域
配列番号２２ ヒトラムダ軽鎖定常領域
配列番号２３ ＩｇＧ１に由来するヒト重鎖定常領域
配列番号２４ Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ突然変異ＩｇＧ１に由来するヒト重鎖定常領域
配列番号２５ Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ突然変異ＩｇＧ１に由来するヒト重鎖定常領域
配列番号２６ ＩｇＧ４に由来するヒト重鎖定常領域

【0234】

以下の実施例及び図面は本発明の理解を助けるために提供され、その真の範囲は添付の特許請求の範囲に示される。本発明の精神を逸脱しない範囲で、示される手法に改変を加えることができるものと理解される。

【0235】

以下に、本発明のいくつかの実施態様が掲載される：
１．ヒトＨＥＲ１に結合する抗原結合性タンパク質を選択する方法であって、抗原結合性タンパク質はヒトＨＥＲ１のＰＰＬＭＬＹＮＰＴＴＹＱＭＤＶＮＰＥＧＫのアミノ酸配列（配列番号１）の中で結合し、
ここで、
ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含む
配列番号１２ ＴｔＳｌｙＤｃａｓ−ＨＥＲ１、
配列番号１３ ＴｔＳｌｙＤｃｙｓ−ＨＥＲ１、
配列番号１４ ＴｔＳｌｙＤ（ＧＳＧ）−ＨＥＲ１、
配列番号１５ ＴｔＳｌｙＤ（ＣＣ）−ＨＥＲ１、
配列番号１６ ＴｔＳｌｙＤ（ＳＳ）−ＨＥＲ１、及び
配列番号１８ ＴｇＳｌｙＤｃｙｓ−ＨＥＲ１、
からなる群から選択される少なくとも１つのポリペプチドが；ａ）の下の少なくとも１つのポリペプチドへの結合を示す抗原結合性タンパク質を選択するために用いられ、
それによって、ヒトＨＥＲ１のＰＰＬＭＬＹＮＰＴＴＹＱＭＤＶＮＰＥＧＫのアミノ酸配列（配列番号１）の中で結合する抗原結合性タンパク質を選択する方法。
２．実施態様１の選択方法によって得られる抗原結合性タンパク質。
３．抗原結合性タンパク質が抗体である、実施態様１の方法又は実施態様２の抗原結合性タンパク質。
４．ヒトＨＥＲ１に結合する単離された抗原結合性タンパク質であって、
ＥＬＩＳＡアッセイで、
配列番号１３ ＴｔＳｌｙＤｃｙｓ−Ｈｅｒ１、
のポリペプチドに、
配列番号１１ ＴｔＳｌｙＤｃａｓ
のポリペプチドへの結合と比較して少なくとも５０倍高いＥＬＩＳＡシグナルで結合し、ここで、ＴｔＳｌｙＤｃｙｓ−ＨＥＲ１及びＴｔＳｌｙＤｃａｓは０．５μｇ／ｍｌの濃度で固定化されている、抗原結合性タンパク質。
５．ヒトＨＥＲ１に結合する単離された抗原結合性タンパク質であって、配列番号１３のポリペプチド（ＴｔＳｌｙＤｃｙｓ−Ｈｅｒ１）に含まれるＰＰＬＭＬＹＮＰＴＴＹＱＭＤＶＮＰＥＧＫのアミノ酸配列（配列番号１）の中で結合する、抗原結合性タンパク質。
６．抗原結合性タンパク質が抗体である、実施態様４又は５の抗原結合性タンパク質。
７．抗体が、ＥＧＦの非存在下でＡ５４９がん細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−１８５）においてＨＥＲ１のリン酸化を誘導しない（ＥＧＦの非存在下でＡ５４９がん細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−１８５）においてＨＥＲ１のリン酸化に関して非アゴニスト抗体である）、実施態様１から６のいずれか１つの単離された抗原結合性タンパク質又は抗体。
８．ＨＥＲ１発現Ａ５４９細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−１８５）を用いるウェスタンブロットアッセイで抗体とのインキュベーションから２時間後にＥＧＦの存在下でＨＥＲ１の７０パーセントを超える内部移行を示し、ＨＥＲ１発現Ａ５４９細胞を用いるウェスタンブロットアッセイで抗体とのインキュベーションから２時間後にＥＧＦの非存在下でＨＥＲ１の５５パーセント未満の内部移行を示す、実施態様１から７のいずれか１つの単離された抗体。
９．ヒトＨＥＲ１に結合する単離された抗体であって、ＴＹＱＭＤＶＮＰＥＧのアミノ酸配列（配列番号１９）を含む、１５アミノ酸の長さのポリペプチドに結合する抗体。
１０．ヒトＨＥＲ１に結合する単離された抗体であって、ＭＬＹＮＰＴＴＹＱのアミノ酸配列（配列番号２０）を含む、１５アミノ酸の長さのポリペプチドに結合する抗体。
１１．ヒト、ヒト化された又はキメラの抗体である、実施態様６から１０の抗体。
１２．ヒトＨＥＲ１に結合する抗体断片である、実施態様６から１０の抗体。
１３．ヒトＨＥＲ１に結合する単離された抗体であって、
ｉ）寄託された抗体ＭＡＫ＜ＨＥＲ１−ＤＩＢ＞Ｍ−５０．０９７．１４（ＤＳＭ ＡＣＣ３２４０）の（ａ）ＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）ＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）ＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）ＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）ＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）ＨＶＲ−Ｌ３；
ｉｉ）寄託された抗体ＭＡＫ＜ＨＥＲ１−ＤＩＢ＞Ｍ−５０．１１０．２３（ＤＳＭ ＡＣＣ３２４１）の（ａ）ＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）ＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）ＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）ＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）ＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）ＨＶＲ−Ｌ３；
ｉｉｉ）寄託された抗体ＭＡＫ＜ＨＥＲ１−ＤＩＢ＞Ｍ−３７．０５８．０９（ＤＳＭ ＡＣＣ３２３８）の（ａ）ＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）ＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）ＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）ＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）ＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）ＨＶＲ−Ｌ３；
ｉｖ）寄託された抗体ＭＡＫ＜ＨＥＲ１−ＤＩＢ＞Ｍ−３７．１８６．１５（ＤＳＭ ＡＣＣ３２３９）の（ａ）ＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）ＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）ＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）ＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）ＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）ＨＶＲ−Ｌ３；
を含み、全てのＨＶＲはカバットに従って決定される抗体。
１４．完全長ＩｇＧ１抗体又はＩｇＧ４抗体である、実施態様６から１３のいずれか１つの抗体。
１５．Ｆａｂ断片である、実施態様６から１３のいずれか１つの抗体。
１６．実施態様６から１３のいずれか１つの抗体及び細胞傷害性剤を含むイムノコンジュゲート。
１７．実施態様６から１３のいずれか１つの抗体又は実施態様１６のイムノコンジュゲート、及び薬学的に許容される担体を含む薬学的製剤。
１８．医薬として用いるための、実施態様６から１３のいずれか１つの抗体又は実施態様１６のイムノコンジュゲート。
１９．がんの治療で用いるための実施態様６から１３のいずれか１つの抗体又は実施態様１６のイムノコンジュゲート。
２０．ＨＥＲ１／ＨＥＲ２及び／又はＨＥＲ１／ＨＥＲ１二量体化の阻害で用いるための実施態様６から１３のいずれか１つの抗体。
２１．医薬の製造での、実施態様６から１３のいずれか１つの抗体又は実施態様１６のイムノコンジュゲートの使用。
２２．医薬ががん治療のためである、実施態様２０の使用。
２３．ＨＥＲ１／ＨＥＲ２及び／又はＨＥＲ１／ＨＥＲ１二量体化の阻害のための医薬の製造における、実施態様６から１３のいずれか１つの抗体の使用。
２４．がんを有する個体を治療する方法であって、実施態様１から２３のいずれか１つの抗体又は実施態様１から２３のいずれか１つの抗体及び細胞傷害性剤を含むイムノコンジュゲートの有効量を個体に投与することを含む方法。
２５．がんを患っている個体でがん細胞のアポトーシスを誘導する方法であって、実施態様１から２４のいずれか１つの抗体及び細胞傷害性剤を含むイムノコンジュゲートの有効量を個体に投与し、それによって個体でがん細胞のアポトーシスを誘導することを含む方法。
２６．実施態様６から１１のいずれか１つの抗体をコードする、単離された核酸。
２７．実施態様２６の核酸を含む宿主細胞。
２８．抗体が生成されるように実施態様２７の宿主細胞を培養することを含む、抗体の生成方法。
２９．配列番号１のアミノ酸配列を含む
ｉ）配列番号１２ ＴｔＳｌｙＤｃａｓ−ＨＥＲ１、
ｉｉ）配列番号１３ ＴｔＳｌｙＤｃｙｓ−ＨＥＲ１、
ｉｉｉ）配列番号１４ ＴｔＳｌｙＤ（ＧＳＧ）−ＨＥＲ１、
ｉｖ）配列番号１５ ＴｔＳｌｙＤ（ＣＣ）−ＨＥＲ１、
ｖ）配列番号１６ ＴｔＳｌｙＤ（ＳＳ）−ＨＥＲ１、及び
ｖｉ） 配列番号１８ ＴｇＳｌｙＤｃｙｓ−ＨＥＲ１、
からなる群から選択されるポリペプチド。

【0236】

生体物質の寄託
Ｂｕｄａｐｅｓｔ条約に従って、以下の生体物質がＬｅｉｂｎｉｚ−Ｉｎｓｔｉｔｕｔ Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ（ＤＳＭＺ）、Ｉｎｈｏｆｆｅｎｓｔｒ．７Ｂ、３８１２４ Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、Ｇｅｒｍａｎｙに寄託されている。

【実施例】

【0237】

材料及び一般方法
組換えＤＮＡ技術
ＤＮＡを操作するために、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．等、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ； Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８９に記載の通りに標準方法を用いた。分子生物学的試薬は、製造業者の指示に従って用いた。

【0238】

遺伝子合成
化学的合成によって作製されたオリゴヌクレオチドから、所望の遺伝子セグメントを調製した。ＰＣＲ増幅を含むオリゴヌクレオチドのアニーリング及びライゲーションによって、単一の制限エンドヌクレアーゼ切断部位に連なる長さ４００−１６００ｂｐの遺伝子セグメントを組み立て、その後、指示された制限部位、例えばＥｃｏＲＩ／ＢｌｐＩ又はＢｓｍＩ／ＸｈｏＩを介して下記の発現ベクターにクローニングした。サブクローニングした遺伝子断片のＤＮＡ配列は、ＤＮＡ配列決定によって確認した。遺伝子合成断片は、Ｇｅｎｅａｒｔ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）において所与の仕様書により注文した。

【0239】

ＤＮＡ配列決定
Ｓｅｑｕｉｓｅｒｖｅ ＧｍｂＨ（Ｖａｔｅｒｓｔｅｔｔｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で実施された二本鎖配列決定によって、ＤＮＡ配列は決定された。

【0240】

ＤＮＡ及びタンパク質配列分析と配列データ管理
配列の形成、マッピング、分析、アノテーション及び図示のために、ＩｎｆｏｍａｘのＶｅｃｔｏｒ ＮＴ１ Ａｄｖａｎｃｅセットのバージョン１１．５．０を用いた。

【0241】

実施例１
抗原の調製及びタンパク質スクリーニング−ＨＥＲ１のβ−ヘアピンに結合する抗体を選択するための機能的β−ヘアピンＨＥＲ１コンストラクトの生成
機能的β−ヘアピンＨＥＲ１コンストラクトを生成するために、ＦＫＢＰドメインを含むＳｌｙＤポリペプチドフレームワークにＨＥＲ１β−ヘアピンＨＥＲ１のアミノ酸配列を接いだ。そのようなコンストラクトでは、ＨＥＲ１の天然の不活性化立体配置の隠れた構造と対照的に、接いだβ−ヘアピンは自由にアクセス可能である（例えばＥＧＦのようにリガンドの非存在下で）（ＨＥＲ１のβ−ヘアピンが隠れている、図１及び２を参照する）。

【0242】

全ての融合したＳｌｙＤポリペプチドは、ほとんど同一のプロトコールを用いることにより精製し、リフォールディングすることができる。選択的増殖のためのそれぞれの抗生物質を含有する（カナマイシン３０μｇ／ｍｌ又はアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ））ＬＢ培地で、特定の発現プラスミドで形質転換した大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を１．５のＯＤ６００まで３７℃で増殖させ、１ｍＭイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を加えることによってサイトゾル過剰発現を誘導した。誘導の３時間後に、遠心分離（５，０００ｇで２０分間）によって細胞を収集し、凍結させ、−２０℃で保存した。細胞溶解のために、７Ｍ ＧｄｍＣｌ及び５ｍＭイミダゾールを加えた冷却させた５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ８．０）に冷凍ペレットを再懸濁した。その後、細胞溶解を完成させるために、懸濁液を氷上で２−１０時間撹拌した。遠心分離（２５，０００ｇ、１時間）及び濾過（硝酸セルロース膜、８．０μｍ、１．２μｍ、０．２μｍ）の後、溶解バッファーで平衡させたＮｉ−ＮＴＡカラムに溶解物を加えた。以降の洗浄工程では、チオール部分を還元形に保ち、早発のジスルフィド架橋を阻止するために、イミダゾール濃度を１０ｍＭ（７Ｍ ＧｄｍＣｌを含む５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ８．０）中で）に上げ、５ｍＭ ＴＣＥＰを加えた。少なくとも１５から２０容積の還元性洗浄バッファーを加えた。その後、マトリックスに結合したＳｌｙＤ融合ポリペプチドの立体配置的リフォールディングを誘導するために、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾール及び５ｍＭ ＴＣＥＰを含む５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ８．０）でＧｄｍＣｌ溶液を置き換えた。同時精製プロテアーゼの再活性化を回避するために、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ（登録商標）ＥＤＴＡフリー、Ｒｏｃｈｅ）をリフォールディングバッファーに加えた。合計１５から２０カラム容積のリフォールディングバッファーを、夜通しの手順の中で加えた。その後、１００ｍＭ ＮａＣｌ及び１０ｍＭイミダゾールを含む、１０カラム容積の５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ８．０）で洗浄することによって、ＴＣＥＰとＣｏｍｐｌｅｔｅ（登録商標）ＥＤＴＡフリー阻害剤カクテルの両方を除去した。最後の洗浄工程では、頑固な汚染物質を除去するために、イミダゾール濃度を３０ｍＭ（１０カラム容積）に上げた。同じバッファー中の２５０ｍＭイミダゾールを加えることによって、リフォールディングさせたポリペプチドを次に溶出させた。トリシン−ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、タンパク質含有画分を純度について調査した（Schaegger, H.及びvon Jagow, G., Anal. Biochem. 166 (1987) 368-379）。その後、バッファー系（５０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）、１００ｍＭ ＫＣｌ、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ）としてリン酸カリウムを用いるサイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（商標）ＨｉＬｏａｄ、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に、タンパク質をかけた。最後に、タンパク質含有画分をプールし、Ａｍｉｃｏｎセル（ＹＭ１０）で〜５ｍｇ／ｍｌの濃度に濃縮した。ＴｔＳｌｙＤｃａｓ−ＨＥＲ１のＮｉ−ＮＴＡ精製の例示的なＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を図３に示し、テルムス・テルモフィルスＳｌｙＤｃａｓ−ＨＥＲ１のＮｉ−ＮＴＡ精製画分のＳＥＣ溶出プロファイルを図４に示す。ＴｔＳｌｙＤｃａｓ−ＨＥＲ１融合ポリペプチドは、そのモノマー形態の可溶型及び安定したポリペプチドとして精製することに成功した。最終収量は、画分１１及び１２からの３０ｍｇ精製タンパク質で数量化された。

【0243】

表２：開発したＳｌｙＤベースのエピトープ足場のアミノ酸配列の要約（それは挿入断片としてＨＥＲ１二量体化ドメイン断片ＨＥＲ１を有する。

【0244】

テルムス・テルモフィルスのＴｔＳｌｙＤｃａｓ−ＨＥＲ１、ＴｔＳｌｙＤｃｙｓ−ＨＥＲ１、ＴｔＳｌｙＤ（ＧＳＧ）−ＨＥＲ１、ＴｔＳｌｙＤ（ＣＣ）−ＨＥＲ１、ＴｔＳｌｙＤ（ＳＳ）−ＨＥＲ１、テルモコックス・ガンマトレランス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｇａｍｍａｔｏｌｅｒａｎｓ）のＴｇＳｌｙＤｃｙｓ−ＨＥＲ１は、挿入断片としてＨＥＲ１二量体化ドメイン断片（ＨＥＲ１のβ−ヘアピン）を有し、ＥＬＩＳＡスクリーニングで免疫原として、及びポジティブコントロールとして用いられた。

【0245】

ＴｔＳｌｙＤｃａｓ及びＴｇＳｌｙＤΔＩＦは、ＥＬＩＳＡスクリーニングでネガティブコントロールとして用いられた（ＨＥＲ１二量体化ドメイン断片（挿入断片としてＨＥＲ１のβ−ヘアピン）なしで）。

【0246】

エピトープ足場は大腸菌で発現されるので、Ｎ末端メチオニン残基は存在しても存在しなくてもよい。（Ｎｔ＝Ｎ末端；Ｃｔ＝Ｃ末端）

【0247】

実施例２
ａ）免疫化及びＨＥＲ１抗体の選択
ＨＥＲ１のβ−ヘアピンに対する抗体の生成のために、Ｂａｌｂ／Ｃ、ＮＭＲＩ又はＳＪＬマウスを異なる抗原で免疫化した。抗原として、以下のタンパク質を用いた：完全長ＨＥＲ１ ＥＣＤ、又はエピトープ足場タンパク質ＴｔＳｌｙＤｃａｓ−ＨＥＲ１、ＴｔＳｌｙＤｃｙｓ−ＨＥＲ１及びＴｔＳｌｙＤ（ＧＳＧ）−ＨＥＲ１。ＴｔＳｌｙＤｃａｓ−ＨＥＲ１変異体は、ＨＥＲ１二量体化ドメイン特異的抗体の生成のために用いられる、第一世代のエピトープ足場を表す。

【0248】

免疫化の実施開始後０、６及び１０週間の時点で、全てのマウスを３回の免疫化にかけた。各時点で、各マウスを１００μｌのＰＢＳに溶解した１００μｇの無エンドトキシン免疫原で免疫化した。最初の免疫化のために、免疫原を１００μｌのＣＦＡと混合した。２回目及び３回目の免疫化のために、免疫原をＩＦＡと混合した。１回目と３回目の免疫化は腹膜内経路を介して加え、２回目の免疫化は皮下に加えた。ハイブリドーマ技術を用いた抗体発達のための脾細胞の調製の２及び３日前に、アジュバントなしの１００μｌのＰＢＳ中の１２．５μｇの免疫原による静脈内ブースター免疫化に、マウスをかけた。

【0249】

力価分析
それぞれの免疫原及びスクリーニングタンパク質に対する血清力価の決定のために、免疫化の実施開始後１１週目に各マウスの血清の少量を収集した。ＥＬＩＳＡのために、免疫原又はスクリーニング足場タンパク質をプレート表面に固定化した。ＨＥＲ１ ＥＣＤを１μｇ／ｍｌの濃度で固定化し、足場タンパク質ＴｔＳｌｙＤｃａｓ−ＨＥＲ１、ＴｔＳｌｙＤｃｙｓ−ＨＥＲ１、ＴｔＳｌｙＤ（ＧＳＧ）−ＨＥＲ１、ＴｔＳｌｙＤｃａｓ、ＴｇＳｌｙＤΔＩＦ及びＴｇＳｌｙＤｃｙｓ−ＨＥＲ１は０．５μｇ／ｍｌの濃度で用いた。足場タンパク質ＴｔＳｌｙＤｃａｓ及びＴｇＳｌｙＤΔＩＦは、ネガティブコントロールとして用いた。各マウスからの血清を１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで希釈し、希釈溶液をプレートに加えた。血清は、１：３００、１：９００、１：２７００、１：８１００、１：２４３００、１：７２９００、１：２１８７００及び１：６５６１００の希釈で試験した。結合した抗体は、ＨＲＰ標識Ｆ（ａｂ’）_２ヤギ抗マウスＦｃγ（Ｄｉａｎｏｖａ）及び基質としてＡＢＴＳ（Ｒｏｃｈｅ）で検出した。

【0250】

血清滴定のレベルにおいてさえ、免疫化されたマウスがＨＥＲ１β−ヘアピンドメインに対する抗体を発達させることは既に明らかだった。ＨＥＲ１ ＥＣＤで免疫化したマウスでは、これは、二量体化β−ヘアピンループを含有する足場タンパク質の１つに対する滴定によって示すことができる。強く低減されたシグナルは、ＨＥＲ１ ＥＣＤによる免疫化より生じた抗体の大部分はＥＣＤの中の他の部分を標的にし、わずかな部分だけが二量体化β−ヘアピンドメインに結合するという事実によって説明することができる。ＨＥＲ１二量体化ループ含有足場で免疫化したマウスでは、ループを標的にする抗体の画分は、Ｈｅｒ１ ＥＣＤ（ポジティブコントロール）に対する滴定及びＨＥＲ１挿入なしのコントロール足場（ネガティブコントロール）に対する滴定によって示すことができる。

【0251】

ｂ）抗体発達及びＥＬＩＳＡスクリーニング／選択
ここに記載されるエピトープ足場技術の使用は、ＨＥＲ１二量体化ドメイン（ＨＥＲ１のβ−ヘアピン）を標的にする抗体の発達のための２つの戦略を主に提供する。１つの戦略は、完全長ＨＥＲ１ ＥＣＤで免疫化し、二量体化ドメイン特異的抗体についてスクリーニングするために足場を用いることである。他の戦略は、免疫化のための足場の直接使用、及び、ＨＥＲ１ ＥＣＤ、別の骨格を有する足場又は逆スクリーニングのために挿入なしの足場を用いることである。一次Ｂ細胞をＰ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３骨髄腫細胞と融合することによって、抗体をハイブリドーマ技術で生じさせた。最終ブースター免疫化の２日後に、免疫化マウスを屠殺し、脾細胞集団を調製した。ＰＥＧ融合技術を用いることにより、脾細胞をＰ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３と融合させた。融合からの細胞バッチ培養を、５％ＣＯ_２の下の３７℃で一晩インキュベートした。翌日、融合細胞を含有する細胞バッチを３００ｇで１０分間遠心分離した。その後、細胞を０．１×アザセリン−ヒポキサンチン（Ｓｉｇｍａ）加用ハイブリドーマ選択培地に懸濁し、９６ウェルプレートの１ウェルにつき細胞数２．５×１０^４の濃度で播種した。５％ＣＯ_２の下の３７℃で少なくとも１週間、プレートを培養した。ＥＬＩＳＡ分析の３日前に、選択培地を交換した。

【0252】

ＨＥＲ１ ＥＣＤ及び様々な足場タンパク質に対して、一次培養上清をＥＬＩＳＡで試験した。足場タンパク質に対する試験は、選択されたクローンが天然のＨＥＲ１ ＥＣＤの二量体化ドメインβ−ヘアピンに結合することを実証するために実行された。コントロール足場ＴｔＳｌｙＤｃａｓ及びＴｇＳｌｙＤΔＩＦに対する試験は、選択されたクローンが挿入されたＨＥＲ１由来の配列に結合し、足場骨格に結合しないことを示すために実行された。ＥＬＩＳＡスクリーニングのために、抗原ダウンフォーマットを用いた。ＨＥＲ１ ＥＣＤを１μｇ／ｍｌの濃度で固定化し、足場タンパク質ＴｔＳｌｙＤｃｙｓ−ＨＥＲ１、ＴｇＳｌｙＤｃｙｓ−Ｈｅｒ１及びＴｔＳｌｙＤｃａｓは０．５μｇ／ｍｌの濃度で固定化した。ハイブリドーマ上清をプレートに加え、室温で１時間インキュベートした。結合した抗体は西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識Ｆ（ａｂ’）_２ヤギ抗マウスＦｃγ（Ｄｉａｎｏｖａ）で検出し、２，２’−アジノ−ジ−［３−エチルベンズチアゾリンスルホネート（６）］二アンモニウム塩（ＡＢＴＳ）（Ｒｏｃｈｅ）をＨＲＰ基質として用いた。

【0253】

ＨＲＰ標識Ｆ（ａｂ’）_２ＡＢＴＳ（Ｒｏｃｈｅ）を、ＨＲＰ基質として用いた。

ｃ）免疫組織化学
選択したクローンを、反応性及び特異性についてＩＨＣで試験した。したがって、完全長ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３又はＨＥＲ４をそれぞれコードするプラスミドで、ＨＥＫ２９３細胞を一時的にトランスフェクトさせた。トランスフェクションの２日後に、今やＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３又はＨＥＲ４を発現する異なる細胞株を収集し、その後ＩＨＣコントロールの生成のためにホルマリンで固定し、アガロースに包埋した。ホルマリンでの夜通しの追加の固定の後、アガロースブロックをパラフィンに包埋した。トランスフェクトしていないＨＥＫ２９３細胞はネガティブコントロールとして用い、トランスフェクトした細胞の通りに処理した。パラフィン包埋の後、ミクロトームを用いて３μｍの薄切片を調製した。切片をガラス製顕微鏡スライドに載せ、２時間乾燥させた。免疫組織化学的染色手法の全てのさらなる工程を、Ｖｅｎｔａｎａ Ｂｅｎｃｈｍａｒｋ ＸＴを用いて実行した。１時間加熱してスライドからワックスを除去し、抗原の回収を実施した。抗原回収のために、ＶｅｎｔａｎａバッファーＣＣ１を用いた。抗体は、１μｇ／ｍｌの濃度で用いた。結合した抗体の検出のために、Ｖｅｎｔａｎａ ＵｌｔｒａＶｉｅｗ検出キットを用いた。結果は、図５に示す。全ての試験したクローンはＨＥＲ１への結合を示し、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３又はＨＥＲ４に対する交差反応性は検出されなかった。
ｄ）選択された抗Ｈｅｒ１ハイブリドーマのＤＮＡ配列決定
選択されたハイブリドーマクローンのＤＮＡ配列を得るために、５’Ｒａｃｅ ＰＣＲを実行した。ＲＴ−ＰＣＲのために、全ＲＮＡ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて５×１０^６個の細胞から全ＲＮＡを調製する。５’プライムＲＡＣＥ ＰＣＲキット（Ｒｏｃｈｅ）を用いて、逆転写及びＰＣＲを実行した。重鎖及び軽鎖から生じたＰＣＲ断片を、ゲル電気泳動及び以降のゲル精製によって精製する。ＴｏｐｏＺｅｒｏ−Ｂｌｕｎｔクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＰＣＲ断片をクローニングし、コンピテント細胞に形質転換させる。選択されたクローンのためのコンセンサス配列を得るために、各ハイブリドーマからのいくつかのクローン（例えば、クローンＭ−３１−２２、Ｍ−３７．０５８．０９（ＭＡＫ＜ＨＥＲ１−ＤＩＢ＞Ｍ−３７．０５８．０９（ＤＳＭ ＡＣＣ３２３８））、Ｍ−３７−１５（ＭＡＫ＜ＨＥＲ１−ＤＩＢ＞Ｍ−３７．１８６．１５（ＤＳＭ ＡＣＣ３２３９））、Ｍ−４７−０１、Ｍ−４７−０４、Ｍ−４７−０６、Ｍ−４７−０８、Ｍ−４７−０９、Ｍ−４７−１２、Ｍ−４７−１３、Ｍ−４６−１４、Ｍ−４７−１５、Ｍ−４７−１６、Ｍ−５０−１４（ＭＡＫ＜ＨＥＲ１−ＤＩＢ＞Ｍ−５０．０９７．１４（ＤＳＭ ＡＣＣ３２４０））、Ｍ−５０−２１、Ｍ−５０−２３（ＭＡＫ＜ＨＥＲ１−ＤＩＢ＞Ｍ−５０．１１０．２３（ＤＳＭ ＡＣＣ３２４１））、Ｍ−５０−２４、Ｍ−５０−３７、Ｍ−５０−３８及びＭ−５０−４０）が配列決定にかけられる。

【0254】

実施例３
抗ＨＥＲ１抗体（Ｍ−４７−１３）の例示的なエピトープマッピングペプチドベースの２Ｄエピトープマッピング
別の実施態様では、ＣｅｌｌｕＳｐｏｔｓ（商標）合成及びエピトープマッピング技術を用いて、ＨＥＲ１ ＥＣＤエピトープを特徴付けるために、ペプチドベースのエピトープマッピング実験を実行した。エピトープマッピングは、ヒトＨＥＲ１ ＥＣＤ、ＨＥＲ２ ＥＣＤ、ＨＥＲ３ ＥＣＤ及びＨＥＲ４ ＥＣＤペプチドヘアピンの配列に対応する、重複した固定化されたペプチド断片（長さ：１５アミノ酸）のライブラリーによって実行した。図６に、エピトープマッピングの戦略を示す。それらの構造的な埋め込み（構造的）を含む、ＨＥＲ１（ＥＧＦＲ）ＥＣＤ、ＨＥＲ２ ＥＣＤ、ＨＥＲ３ ＥＣＤ及びＨＥＲ４ ＥＣＤのペプチドヘアピン配列（β−ヘアピン）を調査した。システインは、セリンと置き換えた。合成した各ペプチドを１アミノ酸シフトさせた、すなわち、それは前及び後のペプチドとそれぞれ１４アミノ酸の重複部分を有していた。ペプチドアレイの調製のために、Ｉｎｔａｖｉｓ ＣｅｌｌｕＳｐｏｔｓ（商標）技術を採用した。この手法では、合成後溶解する修飾されたセルロースディスクの上で、ペプチドを自動合成装置（Ｉｎｔａｖｉｓ ＭｕｌｔｉＰｅｐ ＲＳ）で合成する。高分子セルロースに共有結合している個々のペプチドの溶液を、コーティングされた顕微鏡スライドの上へ次にスポットする。ＣｅｌｌｕＳｐｏｔｓ（商標）合成は、３８４ウェル合成プレートのアミノ修飾セルロースディスクの上で９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）化学を利用して段階的に実行した。各カップリングサイクルでは、対応するアミノ酸を、ＤＭＦ中のＤＩＣ／ＨＯＢｔの溶液で活性化した。カップリング工程の間で、反応していないアミノ基は、無水酢酸、ジイソプロピルエチルアミン及び１−ヒドロキシベンゾトリアゾールの混合物でキャップした。合成の終了後、セルロースディスクを９６ウェルプレートに移し、側鎖脱保護のためにトリフルオロ酢酸酸（ＴＦＡ）、ジクロロメタン、トリイソプロピルシラン（ＴＩＳ）及び水の混合物で処理した。切断溶液の除去の後、ＴＦＡ、ＴＦＭＳＡ、ＴＩＳ及び水の混合物でセルロース結合ペプチドを溶解し、ジイソプロピルエーテルで沈殿させ、ＤＭＳＯに再懸濁する。その後、Ｉｎｔａｖｉｓスライドスポッティングロボットを用いて、Ｉｎｔａｖｉｓ ＣｅｌｌｕＳｐｏｔｓ（商標）スライドの上へペプチド溶液をスポットした。

【0255】

エピトープ分析のために、前記の通りに調製したスライドをエタノールで、次にＴｒｉｓ緩衝食塩水（ＴＢＳ；５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ８）で洗浄し、その後、４℃で１６時間、５ｍＬの１０×ウェスタンブロッキング試薬（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ）、ＴＢＳ中の２．５ｇスクロース、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０によりブロックした。スライドをＴＢＳ及び０．１％Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄し、その後常温で２時間、ＴＢＳ中の対応するＩＧＦ１抗体の１μｇ／ｍＬ及び０．１％Ｔｗｅｅｎ２０とインキュベートし、その後ＴＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄した。検出のために、スライドを抗ウサギ／抗マウス二次ＨＲＰ抗体（ＴＢＳ−Ｔに１：２００００）とインキュベートし、続いて化学発光基質ルミノールとインキュベートし、ＬｕｍｉＩｍａｇｅｒ（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ）で可視化した。ＥＬＩＳＡポジティブＳＰＯＴを数量化し、対応するペプチド配列の帰属を通して、抗体結合性エピトープを特定した。

【0256】

図７に表すように、Ｍ−４７−１３は、ＨＥＲ２ ＥＣＤ、ＨＥＲ３ ＥＣＤ又はＨＥＲ４ ＥＣＤのヘアピンモチーフに対して検出可能なシグナルのないアミノ酸配列ＴＹＱＭＤＶＮＰＥＧ（配列番号１９）を有するＨＥＲ１ ＥＣＤエピトープを示す。Ｍ３１−２２は、わずかに異なるエピトープを示す。Ｍ−５０−１４（寄託されたＭＡＫ＜ＨＥＲ１−ＤＩＢ＞Ｍ−５０．０９７．１４（ＤＳＭ ＡＣＣ３２４０））及びＭ−５０−２３（寄託されたＭＡＫ＜ＨＥＲ１−ＤＩＢ＞Ｍ−５０．１１０．２３（ＤＳＭ ＡＣＣ３２４１））は、ＨＥＲ２ ＥＣＤ、ＨＥＲ３ ＥＣＤ又はＨＥＲ４ ＥＣＤのヘアピンモチーフに対して検出可能なシグナルのないアミノ酸配列ＭＬＹＮＰＴＴＹＱ（配列番号２０）を有するＨＥＲ１ ＥＣＤエピトープを示す。

【0257】

実施例４
抗ＨＥＲ１β−ヘアピン抗体の動態スクリーニング／結合特性
動態スクリーニングは、Ｂｉａｃｏｒｅ ＣＭ５センサーを載せたＢＩＡｃｏｒｅ ４０００機器で、Ｓｃｈｒａｅｍｌ等（Schraml, M.及びM. Biehl、Methods Mol Biol 901 (2012) 171-181）に従って実施する。全てのアッセイで、試験抗体が捕捉される。このシステムは、ソフトウェアバージョンＶ１．１の制御下にある。機器バッファーは、ＨＢＳ−ＥＰ（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５（ｗ／ｖ）％Ｐ２０）であった。システムは、２５℃で操作される。１０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ４．５）中の３０μｇ／ｍｌウサギポリクローナル抗体（ＲＡＭ ＩｇＧ、（Ｆｃガンマ特異性を有するウサギ抗マウスＩｇＧ）ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を、製造業者の使用説明書に従い、ＥＤＣ／ＮＨＳ化学を用いてフローセル１、２、３及び４のスポット１、２、４及び５の上に固定化する。センサーは、１Ｍエタノールアミンを用いて飽和する。各フローセルで、参照シグナルはスポット１−２及びスポット５−４を用いて計算され、スポット３はブランクコントロールの役目を果たす。抗原（ＨＥＲ１のβ−ヘアピンペプチド（配列番号１）を含む、ヒト組換えＨＥＲ１ ＥＣＤ、及び組換えテルムス・テルモフィルスＴｔＳｌｙＤｃａｓ−ＨＥＲ１、ＴｔＳｌｙＤｃｙｓ−ＨＥＲ１、ＴｔＳｌｙＤ−（ＧＳＧ）−ＨＥＲ１、ＴｔＳｌｙＤ−（ＣＣ）−ＨＥＲ１、ＴｔＳｌｙＤ−（ＳＳ）−ＨＥＲ１、テルモコックス・ガンマトレランスＴｇＳｌｙＤｃｙｓ−ＨＥＲ１の１つ）を、非特異的結合を抑制するために１ｍｇ／ｍｌのＣＭＤ（カルボキシメチルデキストラン、Ｓｉｇｍａ）を追加した機器バッファーで１５０ｎＭに希釈する。それらを加える前に、ハイブリドーマ培養上清を機器バッファーで１：５に希釈する。希釈した混合物を、３０μｌ／分の流速で２分間注入する。応答単位で表した抗体捕捉レベル（ＣＬ）を監視する。その直後、それぞれの抗原を３分の結合時間の間３０μｌ／分の流速で注入する。その後、抗体抗原複合体の解離シグナルを５分間記録する。１０ｍＭグリシンＨＣｌ溶液（ｐＨ１．７）を３０μｌ／分の流速で２分間注入することによって、センサーを再生する。抗原の注入の終了の直前に記録したシグナルは、応答単位において、遅い結合（ＢＬ）と表される。解離の記録の終了の直前に記録したシグナルは、応答単位において、遅い安定性（ＳＬ）と表される。解離速度定数を判定、計算する。分で表した抗体抗原複合体の安定性は、以下の式で計算される：ｌｎ（２）／６０＊ｋｄ。モル比は、以下の式で計算された：ＭＷ（抗体）／ＭＷ（抗原）＊ＢＬ（抗原）／ＣＬ（抗体）。

【0258】

遅い結合（ＢＬ）は、被分析物注入の終わりの応答単位を表す。センサー表面のリガンドとして捕捉される抗体の量は、応答単位において、捕捉レベル（ＣＬ）として測定される。試験した被分析物、溶液中の抗体及び被分析物の分子量の情報と一緒に、モル比を計算することができる。センサーが抗体リガンド捕捉レベルの適する量で構成される場合には、各抗体は少なくとも溶液中の１つの被分析物に機能的に結合することができるはずであり、それはＭＲ＝１．０のモル比で表される。次に、モル比は、被分析物結合の結合価モードのための指標でもある。最大結合価は２つの被分析物に結合する抗体ではＭＲ＝２であり得、各Ｆａｂ結合価は１である。立体的制約又は機能障害性被分析物結合の場合には、ＨＥＲ１ ＥＣＤが本発明の抗ＨＥＲ１β−ヘアピン抗体によってその「閉鎖的」立体配置で結合している場合のように（このβヘアピンは閉鎖的立体配置に隠れている）、モル比は化学量論よりも低い結合を示し得る。モル比の判定での最大アッセイ偏差は、ＭＲ＝０．２である。

【0259】

実施例５
ウェスタンブロットによる抗ＨＥＲ１β−ヘアピン抗体の時間依存的内部移行分析！
抗ＨＥＲ１β−ヘアピン抗体への抗ＨＥＲ１β−ヘアピン抗体の結合及びその内部移行を、ＨＥＲ１発現がん細胞株Ａ５４９を用いるウェスタンブロットで分析した。

【0260】

２４ウェルプレート（細胞数３×１０５／ウェル、１０％ＦＣＳ含有培地）に、ＨＥＲ１発現Ａ５４９（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ−１８５（商標）肺癌）細胞を播種した。翌日に、培地を絶食培地（０．５％ＦＣＳ）に置き換えた。４時間後に（細胞溶解の２４時間前に）、抗体Ｍ−５０−１４（＝寄託されたＭＡＫ＜ＨＥＲ１−ＤＩＢ＞Ｍ−５０．０９７．１４）を、１８５μｇ／ｍｌの最終濃度まで各細胞株の２つのウェルに加えた。翌日、抗体Ｍ−５０−１４（＝寄託されたＭＡＫ＜ＨＥＲ１−ＤＩＢ＞Ｍ−５０．０９７．１４）を以下の時点で再び加えた：細胞溶解の６時間、４時間、２時間、１時間前。細胞溶解の１０分前に、各時点の１つのウェルを、ｈＥＧＦ（最終濃度２００ｎｇ／ｍｌ）で刺激した。細胞を、４０μｌのＴｒｉｔｏｎ溶解バッファーで溶解した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施し、続いて半湿式ウェスタンブロッティングを実施した。膜は、ＨＥＲ１（Ｕｐｓｔａｔｅ＃０６−８４７）、ホスホＨＥＲ１（Ｅｐｉｔｏｍｉｃｓ＃１１３９−１）及びホスホチロシン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ＃１６−１０５）に対する抗体とインキュベートした。

【0261】

結果を、図９（Ａ５４９細胞）に示す。左側はＥＧＦの非存在下での時間依存性ＨＥＲ１検出を示し、右側はＥＧＦの存在下での時間依存性ＨＥＲ１検出を示す。抗体Ｍ−５０−１４は、ＥＧＦの非存在下でよりその存在下で明らかにより強力なＨＥＲ１内部移行を示す。（ＨＥＲ１発現Ａ５４９細胞を用いるウェスタンブロットアッセイで抗体とのインキュベーションから２時間後にＥＧＦの存在下でＨＥＲ１の７０パーセントを超える内部移行、及びＨＥＲ１発現Ａ５４９細胞を用いるウェスタンブロットアッセイで抗体とのインキュベーションから２時間後にＥＧＦの非存在下でＨＥＲ１の５５パーセント未満の内部移行）。

【0262】

実施例６
ＨＥＲ１発現Ａ５４９及びＡ４３１がん細胞での抗ＨＥＲ１抗体結合によるＨＥＲ１リン酸化の阻害（誘導なし）
２４ウェルプレート（細胞数３×１０５／ウェル、１０％ＦＣＳ含有培地）に、ＨＥＲ１発現Ａ５４９（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ−１８５（商標）肺癌）細胞及びＡ４３１（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−１５５５（商標）−皮膚がん／類表皮癌）細胞を播種した。翌日に、培地を絶食培地（０．５％ＦＣＳ）に置き換えた。４時間後に（細胞溶解の２４時間前に）、抗体を１８５μｇ／ｍｌの最終濃度まで各細胞株の２つのウェルに加えた。翌日、抗体を以下の時点で再び加えた：細胞溶解の６時間、４時間、２時間、１時間前。細胞溶解の１０分前に、各時点の１つのウェルを、ｈＥＧＦ（最終濃度２００ｎｇ／ｍｌ）で刺激した。細胞を、４０μｌのＴｒｉｔｏｎ溶解バッファーで溶解した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施し、続いて半湿式ウェスタンブロッティングを実施した。膜は、ＨＥＲ１（Ｕｐｓｔａｔｅ＃０６−８４７）、ホスホＨＥＲ１（Ｅｐｉｔｏｍｉｃｓ＃１１３９−１）及びホスホチロシン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ＃１６−１０５）に対する抗体とインキュベートした。

【0263】

結果を、図８Ａ（Ａ５４９細胞）及び８Ｂ（Ａ４３１細胞、わずかな構成的に活性化／リン酸化されたＨＥＲ１による強力なＨＥＲ１発現）に示す。左のレーンはＥＧＦの非存在下又は存在下でのＨＥＲ１の検出を示し、右のレーンはリン酸化されたＨＥＲ１の検出を示す。

【0264】

両方のがん細胞株で、抗ＨＥＲ１β−ヘアピン抗体ＨＥＲ１ ｄｉｂ１＝Ｍ−５０−１４（＝寄託されたＭＡＫ＜ＨＥＲ１−ＤＩＢ＞Ｍ−５０．０９７．１４（ＤＳＭ ＡＣＣ３２４０））、ＨＥＲ１ ｄｉｂ２＝Ｍ−５０−２３（＝寄託されたＭＡＫ＜ＨＥＲ１−ＤＩＢ＞Ｍ−５０．１１０．２３（ＤＳＭ ＡＣＣ３２４１））及びＨＥＲ１ ｄｉｂ３＝Ｍ−４７−１５は、ＨＥＲ１のリン酸化の誘導を示さず、非アゴニストＨＥＲ１抗体としての働きをし（ＥＧＦリガンドの非存在下、−レーン）、一方、セツキシマブ、ＧＡ２０１（イムガツズマブ、ＣＡＳ番号９５９９６３−４６−３、親のＩＣＲ６２ラット抗体のヒト化によって導かれた、ヒト化され、糖操作されたＩｇＧ１ ｍＡｂ、例えば国際公開第２００６／０８２５１５号に記載される）、又はＡＢＴ８０６（ｍＡｂ８０６、ＥＧＦＲ欠失変異体、ｄｅ２−７ ＥＧＦＲ並びに野生型を標的にする、例えば米国特許出願第２０１１／００７６２３２号に記載される）のような他のＨＥＲ１抗体は、強力なリン酸化を誘導した（ＥＧＦの非存在下で、抗体のない培地と、又は本発明の抗体と比較して）。

【0265】

実施例７
抗ＨＥＲ１β−ヘアピン抗体（ＥＬＩＳＡ）の存在下でのＨＥＲ１（ＥＧＦＲ）−ＥＣＤへのリガンドＥＧＦの結合
ストレプトアビジンをコーティングした９６ウェルプレートを、ＳＢＰ標識ＨＥＲ１−ＥＣＤを含有する細胞培養上清と４℃でインキュベートした。翌日に、洗浄バッファー（ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）でウェルを３回洗浄し、１％ＢＳＡを含有するＰＢＳで１時間ブロックした。洗浄バッファーによるさらなる３回の洗浄の後、所望の最終濃度（１０^−３から１０^３ｎＭ）の２×保存液として４０μｌの抗体溶液（Ｄｅｌｆｉａ結合バッファー中）を各ウェルに加えた。直ちに、１０ｎＭの最終濃度を達成するために４０μｌの２０ｎＭユウロピウム標識ＥＧＦを加えた。室温で２時間、プレートを振盪機の上でインキュベートした。Ｄｅｌｆｉａ洗浄バッファーによる３回の洗浄の後、Ｄｅｌｆｉａ強化溶液を加え、振盪機の上で１５分間インキュベートした（光保護）。最後に、時間分解蛍光測定プロトコールを用いてＴｅｃａｎ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｆ２００リーダーでプレートを測定した。ＨＥＲ１ｄｉｂ上清は、１：１から１：１０ｅ７の希釈で用いた。抗ＨＥＲ１抗体Ｍ−５０−１４（５０．０９７．１４＝ＭＡＫ＜ＨＥＲ１−ＤＩＢ＞Ｍ−５０．０９７．１４（ＤＳＭ ＡＣＣ３２４０．）；Ｍ−５０−２３（５０．１１０．２３＝ＭＡＫ＜ＨＥＲ１−ＤＩＢ＞Ｍ−５０．１１０．２３（ＤＳＭ ＡＣＣ３２４１．）；Ｍ−４７−１５（Ｍ−４７．２５９．１５）；Ｍ−３１−２２（Ｍ−３１．０２１．２２）；Ｍ−３７−０９（ＭＡＫ＜ＨＥＲ１−ＤＩＢ＞Ｍ−３７．０５８．０９（ＤＳＭ ＡＣＣ３２３８）；Ｍ−３７−１５（ＭＡＫ＜ＨＥＲ１−ＤＩＢ＞Ｍ−３７．１８６．１５（ＤＳＭ ＡＣＣ３２３９）の結果を図１０に示す。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8A】

【図8B】

【図9】

【図10】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]