特許 6559898 スクアレンを含む両親媒性ポリアミノ酸高分子に基づくワクチンの免疫補助剤組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6559898

(24)【登録日】2019年7月26日

(45)【発行日】2019年8月14日

(54)【発明の名称】スクアレンを含む両親媒性ポリアミノ酸高分子に基づくワクチンの免疫補助剤組成物

(51)【国際特許分類】

   C08G 69/10 20060101AFI20190805BHJP

   C07K 2/00 20060101ALI20190805BHJP

   A61K 39/145 20060101ALI20190805BHJP

   A61K 39/215 20060101ALI20190805BHJP

   A61K 39/39 20060101ALI20190805BHJP

   A61K 47/34 20170101ALI20190805BHJP

   A61P 31/12 20060101ALI20190805BHJP

   A61P 37/04 20060101ALI20190805BHJP

【ＦＩ】

   C08G69/10

   C07K2/00

   A61K39/145

   A61K39/215

   A61K39/39

   A61K47/34

   A61P31/12

   A61P37/04

【請求項の数】12

【全頁数】27

(21)【出願番号】特願2018-531144(P2018-531144)

(86)(22)【出願日】2016年12月15日

(65)【公表番号】特表2018-537490(P2018-537490A)

(43)【公表日】2018年12月20日

(86)【国際出願番号】KR2016014714

(87)【国際公開番号】WO2017105103

(87)【国際公開日】20170622

【審査請求日】2018年6月14日

(31)【優先権主張番号】10-2015-0180413

(32)【優先日】2015年12月16日

(33)【優先権主張国】KR

(73)【特許権者】

【識別番号】517240942

【氏名又は名称】ヒュヴェット・バイオ・インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100108453

【弁理士】

【氏名又は名称】村山 靖彦

(74)【代理人】

【識別番号】100110364

【弁理士】

【氏名又は名称】実広 信哉

(74)【代理人】

【識別番号】100133400

【弁理士】

【氏名又は名称】阿部 達彦

(72)【発明者】

【氏名】スンジュ・ハム

(72)【発明者】

【氏名】ジョン・ウ・イム

(72)【発明者】

【氏名】ヒョン−ウク・キム

(72)【発明者】

【氏名】ジヘ・チェ

(72)【発明者】

【氏名】ダ・ヨン・ユン

(72)【発明者】

【氏名】ジヘ・キム

(72)【発明者】

【氏名】デソプ・ソン

(72)【発明者】

【氏名】ミン・ジュ・ヨム

(72)【発明者】

【氏名】ウン・ソン・ナ

【審査官】 中根 知大

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２００６／１１２４７７（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 Langmuir，２００７年，Vol.23，p.8308-8315

【文献】 Advanced Healthcare Materials，２０１４年，Vol.3，p.1107-1118

【文献】 Biomacromolecules，２００３年，Vol.4，p.249-258

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０８Ｇ ６９／００−６９／５０

Ａ６１Ｋ ３９／００−３９／４４，４７／３４

Ｃ０７Ｋ １／００−１９／００

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

下記化１で表されることを特徴ととする両親媒性ポリアミノ酸高分子。

【化1】

上記化１において、
Ｒ_１は、

【化2】

からなる群より選択された一つであり、
Ｒ_２は、

【化3】

であり、
ｘ、ｙ、ｚは、１より大きい整数である。

【請求項2】

前記両親媒性ポリアミノ酸高分子は、 Ｒ_１が

【化4】

であり、Ｒ_２が

【化5】

であることを特徴とする、請求項１に記載の両親媒性ポリアミノ酸高分子。

【請求項3】

スクアレンを担持し、請求項１に記載の両親媒性ポリアミノ酸高分子を含有する水中油型エマルジョン状態の両親媒性高分子粒子を含むことを特徴とする、免疫補助剤組成物。

【請求項4】

前記組成物でスクアレンは、０．５％（ｖ／ｖ）〜１０％（ｖ／ｖ）で含まれることを特徴とする、請求項３に記載の免疫補助剤組成物。

【請求項5】

前記スクアレンと両親媒性ポリアミノ酸高分子のモル量比は、１：０．００１〜１：０．９９９であることを特徴とする、請求項３に記載の免疫補助剤組成物。

【請求項6】

抗原；及びスクアレンを担持し、請求項１に記載の両親媒性ポリアミノ酸高分子を含有する水中油型エマルジョン状態の両親媒性高分子粒子を含むことを特徴とする、ワクチン組成物。

【請求項7】

前記抗原は、インフルエンザウイルス抗原または豚流行性下痢症ウイルス抗原であることを特徴とする、請求項６に記載のワクチン組成物。

【請求項8】

下記化２の化合物と下記化３の化合物を反応させて下記化１の両親媒性ポリアミノ酸高分子を製造するステップを含むことを特徴とする、両親媒性ポリアミノ酸高分子の製造方法。

【化6】

【化7】

【化8】

上記化１〜化３において、
Ｒ_１は、

【化9】

からなる群より選択された一つであり、
Ｒ_２は、

【化10】

であり、
ｘ、ｙ、ｚは、１より大きい整数である。

【請求項9】

上記化１のｘとｙに対して、前記ｘとｙは、１：０．１〜１：１０の割合で含まれることを特徴とする、請求項８に記載の両親媒性ポリアミノ酸高分子の製造方法。

【請求項10】

請求項１に記載の両親媒性ポリアミノ酸高分子を含む水溶液とスクアレンを含む溶液とを混合して、水中油型エマルジョン状態の両親媒性高分子粒子を製造するステップを含むことを特徴とする、免疫補助剤組成物の製造方法。

【請求項11】

抗原を含む溶液と、スクアレンを担持する請求項１に記載の両親媒性ポリアミノ酸高分子を含むエマルジョン溶液と、を混合するステップを含むことを特徴とする、ワクチン組成物の製造方法。

【請求項12】

前記抗原を含む溶液とエマルジョン溶液とを混合するステップは、抗原を含む溶液とエマルジョン溶液とを１：０．２〜１：５の体積比で混合することを含むことを特徴とする、請求項１１に記載のワクチン組成物の製造方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、両親媒性ポリアミノ酸高分子、前記高分子を含有するエマルジョン粒子を含む免疫補助剤組成物、抗原と前記高分子エマルジョン粒子とを含むワクチン組成物及びそれらの製造方法に関する。

【背景技術】

【0002】

免疫補助剤（ａｄｊｕｖａｎｔ）とは、抗原性を高めてワクチンの開発に用いられるか、または抗原に対する非特異的免疫反応を増強させて治療及び予防などに用いられる物質である。免疫補助剤は、抗原量が少ないとき、抗原に対する免疫反応を迅速で且つ強力に、そして長期間維持させる役割をするため、ワクチンを製造する際に使用され、特別な免疫補助剤を使用するか抗原の量を異にすることで、免疫反応を調節するか、または抗原に対する抗体の種類、亜型などを調節することができるようにする。免疫補助剤の使用により、ワクチンの効能を増大させることができ、広範囲なウイルス感染症から保護することができる。このような免疫補助剤の開発は、ワクチンの開発と共に加速化されており、免疫関連疾患に対する範囲が広くなるにつれ新しい免疫補強剤としての開発が非常に有望な分野として挙論されている。

【0003】

しかし、従来の免疫補助剤で用いられた界面活性剤は、生体適合性が多少低く、安定性が落ちる問題点があった。したがって、このような問題を解決するためには、より生体適合性を有し、安定した免疫補助剤の開発が必要である。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0004】

本発明の目的は、生体適合性を有し、高い抗体力価を示す免疫補助剤組成物、ワクチン組成物及びそれらの製造方法を提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0005】

上記目的を達成するために、本発明は、両親媒性ポリアミノ酸高分子を提供する。

【0006】

また、本発明は、前記両親媒性ポリアミノ酸高分子の製造方法を提供する。

【0007】

また、本発明は、スクアレンを担持し、前記両親媒性ポリアミノ酸高分子を含有する水中油型エマルジョン状態の両親媒性高分子粒子を含む免疫補助剤組成物を提供する。

【0008】

また、本発明は、前記両親媒性ポリアミノ酸高分子を含む水溶液と、スクアレンを含む溶液と、を混合するステップを含む免疫補助剤組成物の製造方法を提供する。

【0009】

また、本発明は、抗原と、スクアレンを担持し、前記両親媒性ポリアミノ酸高分子を含有する水中油型エマルジョン状態の両親媒性高分子粒子とを含むワクチン組成物を提供する。

【0010】

また、本発明は、抗原を含む溶液と、スクアレンを担持し、前記両親媒性ポリアミノ酸高分子を含むエマルジョン溶液とを混合するステップを含むワクチン組成物の製造方法を提供する。

【0011】

以下、本発明の構成を具体的に説明する。

【0012】

本発明は、下記化１で表される両親媒性ポリアミノ酸高分子を提供する：

【0013】

【化1】

【0014】

上記化１において、
Ｒ_１は、

【化2】

からなる群より選択された一つであり、

【0015】

Ｒ_２は、

【化3】

であり、

【0016】

ｘ、ｙ、ｚは、１より大きい整数である。

【0017】

一具体例において、前記両親媒性ポリアミノ酸高分子は、 Ｒ１が

【0018】

【化4】

であり、Ｒ２が

【0019】

【化5】

である両親媒性ポリアミノ酸高分子を含むことができる。

【0020】

また、本発明は、下記化２の化合物と下記化３の化合物とを反応させて下記化１の両親媒性ポリアミノ酸高分子を製造するステップを含む両親媒性ポリアミノ酸高分子の製造方法を提供する：

【0021】

【化6】

【0022】

【化7】

【0023】

【化8】

【0024】

上記化１〜化３において、
Ｒ_１は、

【化9】

からなる群より選択された一つであり、

【0025】

Ｒ_２は、

【化10】

であり、

【0026】

ｘ、ｙ、ｚは、１より大きい整数である。

【0027】

本発明において、上記化１のｘとｙは、１：０．１〜１：１０、例えば、１：０．５〜１：５、１：０．５〜１：２、好ましくは、１：１で含まれることができる。上記範囲に化２の化合物と化３の化合物のモル量比を調整することで、前記両親媒性ポリアミノ酸の両親媒性を維持することができる。

【0028】

一具体例において、前記両親媒性ポリアミノ酸高分子は、両親媒性の特性を通じて疎水性コアと親水性シェルを有する球状粒子形態のマイセル（ｍｉｃｅｌｌｅ）形態で存在してもよく、中が空いている親水性コアを疎水性シェルと親水性シェルが二重で取り囲んでいるポリマーソーム（ｐｏｌｙｍｅｒｓｏｍｅ）形態で存在してもよい。

【0029】

本発明の一実施例によれば、上記化１でのｘとｙを１：０．１〜１：１０になるように上記化２の化合物及び化３の化合物を有機溶媒に溶かした後、２４時間〜６０時間、例えば、４８時間の間、３０℃〜４０℃で重合反応を進行することができる。反応が終結した混合溶液は、沈澱法を通じて高分子を分離し、十分に透析した後に凍結乾燥して分岐構造（ｂｒａｎｃｈｅｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）の両親媒性ポリアミノ酸高分子を得ることができる。

【0030】

また、本発明は、スクアレンを担持し、前記両親媒性ポリアミノ酸高分子を含有する水中油型エマルジョン状態の両親媒性高分子粒子を含む免疫補助剤組成物を提供する。

【0031】

前記免疫補助剤組成物において、上述した両親媒性ポリアミノ酸高分子の全ての内容をそのまま適用または準用することができる。

【0032】

本発明において、前記水中油型エマルジョン状態の両親媒性高分子粒子は、両親媒性ポリアミノ酸高分子内にスクアレンを担持するものであってもよい。前記スクアレン（ｓｑｕａｌｅｎｅ）は、抗原補強剤または免疫補助剤（免疫増強剤）の役割を行い、ワクチンの効果を増幅させるために用いられる。

【0033】

本発明において、用語「免疫補助剤（ａｄｊｕｖａｎｔ）」は、免疫増強剤、抗原補強剤またはアジュバント（ａｄｊｕｖａｎｔ）と呼ばれる物質を意味し、より具体的に、ワクチンに対する反応を高めて免疫システムにより多量の抗体が生成されるように補助する物質を意味する。前記スクアレンは、通常、深海鮫の肝臓から抽出されるものであってもよく、その外に多くの経路を通じて生成されたものであってもよいが、これに制限されるものではない。

【0034】

一具体例において、前記両親媒性ポリアミノ酸高分子内に担持されたスクアレンの含量は、０．５％（ｖ／ｖ）〜１０％（ｖ／ｖ）、例えば、１％（ｖ／ｖ）〜８％（ｖ／ｖ）、３％（ｖ／ｖ）〜７％（ｖ／ｖ）、４％（ｖ／ｖ）〜６％（ｖ／ｖ）、好ましくは、５％（ｖ／ｖ）あってもよい。上記範囲にスクアレンの含量を調整することで、スクアレンが免疫補助剤としての機能を実行することができる。

【0035】

一具体例において、前記スクアレンと両親媒性ポリアミノ酸高分子のモル量比は、１：０．００１〜１：０．９９９、例えば、１：０．００１〜０．５、１：０．００１〜１：０．００５であってもよい。

【0036】

上記範囲に両親媒性ポリアミノ酸高分子とスクアレンのモル量比を調整することで、水中油型エマルジョン状態の両親媒性高分子粒径を調節することができる。

【0037】

本発明による両親媒性ポリアミノ酸高分子は、アミノ酸高分子を用いることで、生体適合性が高く免疫補助剤として使用することが適合である。

【0038】

また、前記水中油型エマルジョン状態の両親媒性高分子粒子は、平均粒径が１０ｎｍ〜１μｍ、例えば、１００ｎｍ〜５００ｎｍ、２００ｎｍ〜４００ｎｍであってもよい。

【0039】

本発明の組成物は、従来の免疫補助剤組成物で使われた界面活性剤の代わりに両親媒性ポリアミノ酸高分子を使用するものであって、前記両親媒性ポリアミノ酸高分子を使用することで、一層生体適合性を有し、高い抗体力価を有する免疫補助剤組成物を提供することができる。

【0040】

上記製造方法において、両親媒性ポリアミノ酸高分子、水中油型エマルジョン状態の両親媒性高分子粒子及び免疫補助剤は、上述した全ての内容をそのまま適用または準用することができる。

【0041】

また、本発明は、前記両親媒性ポリアミノ酸高分子を含む水溶液とスクアレンを含む溶液とを混合して、水中油型エマルジョン状態の両親媒性高分子粒子を製造するステップを含む免疫補助剤組成物の製造方法を提供する。

【0042】

上記製造方法において、両親媒性ポリアミノ酸高分子、水中油型エマルジョン状態の両親媒性高分子粒子、免疫補助剤及びスクアレンは、上述した全ての内容をそのまま適用または準用することができる。

【0043】

また、本発明は、抗原と、スクアレンを担持し、前記両親媒性ポリアミノ酸高分子を含有する水中油型エマルジョン状態の両親媒性高分子粒子とを含むワクチン組成物を提供する。

【0044】

一具体例において、抗原は、インフルエンザウイルス抗原または豚流行性下痢症ウイルス抗原であってもよいが、これらに制限されるものではない。前記ウイルス抗原は、免疫補助剤としてスクアレンがワクチンと共に投与される場合、免疫増強の効果を示すことができるウイルス抗原であれば、特に制限されるものではない。

【0045】

本発明のワクチン組成物は、薬学的に許容可能な担体を含むことができる。本発明で用語「薬学的に許容可能な担体」とは、生物体を刺激せず投与成分の生物学的活性及び特性を阻害しない担体または希釈剤を意味する。本発明における薬学的に許容可能な担体は、食塩水、滅菌水、リンガー液、緩衝食塩水、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エタノール及びこれら成分のうち１つの成分または１つの成分以上を混合して使用することができ、必要に応じて、抗酸化剤、緩衝液及び静菌剤など他の通常の添加剤を添加し、組職または臓器に注入するに適合な注射剤の形態に剤形化することができる。また、等張性滅菌溶液、または場合によって、滅菌水や生理食塩水を添加して注射可能な溶液になることができる乾燥製剤（特に凍結乾燥製剤）に剤形化してもよい。また、標的器官に特異的に作用するように標的器官特異的抗体またはその他リガンドを前記担体と結合させて使用することができる。

【0046】

また、好ましくは、本発明の組成物は、充填剤、賦形剤、崩壊剤、結合剤及び滑沢剤などを追加で含むことができる。また、本発明の組成物は、哺乳動物に投与された後、活性成分の迅速、持続または遅延された放出を提供するように当業界に公知の方法を利用して剤形化することができる。

【0047】

本発明で用語「投与」は、適切な方法で患者に本発明の組成物を導入することを意味し、本発明の組成物の投与経路は、目的とする組職に到逹することができる限り、経口または非経口の多様な経路を通じて投与することができる。腹腔内投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、経口投与、局所投与、鼻内投与、肺内投与、直腸内投与を行うことができるが、これらに制限されない。

【0048】

本明細書で「有効量」は、目的とする治療すべき特定疾患の発症または進行を遅延するか全面的に中止させるに必要な量を意味する。本発明で組成物は、薬学的有効量で投与することができる。適合な１日当たりの総使用量は、正しい医学的判断範囲内で処方医師によって決まることは当業者にとって自明である。

【0049】

本発明の目的上、特定の患者に対する具体的な治療的有効量は、達成しようとする反応の種類と程度、場合によって、他の製剤の使用有無、及び具体的組成物、患者の年齢、体重、一般健康状態、性別及び食餌、投与時間、投与経路、及び組成物の分泌率、治療期間、具体的組成物と共に用いられるか同時に用いられる薬物を含めた多様な因子と、医薬分野によく知られている類似因子によって異ならせて適用することが好ましい。

【0050】

また、本発明は、抗原を含む溶液と、スクアレンを担持する両親媒性ポリアミノ酸高分子を含むエマルジョン溶液と、を混合するステップを含むワクチン組成物の製造方法を提供する。

【0051】

前記ワクチン組成物は、抗原を含む溶液と前記エマルジョン溶液とを１：０．２〜１：５、例えば、１：１の体積比で混合して製造することができる。

【発明の効果】

【0052】

本発明の免疫補助剤組成物は、両親媒性ポリアミノ酸高分子を用いることにより、一層生体適合性を有し、且つ高い抗体力価を有するワクチン免疫補助剤組成物を提供することができる。

【図面の簡単な説明】

【0053】

【図1】両親媒性ポリアミノ酸高分子（ＰＬＬ−ｂ−Ｐｈｅ）の合成過程を示した図である。

【図2】水中油型エマルジョンのＴＥＭ観察写真を示した図である。

【図3】水中油型エマルジョンを図式化して示した図である。

【図4】水中油型エマルジョンの製造方法を図式化して示した図である。

【図5】ポリリジン（ＰＬＬ）の重合結果をＮＭＲ分析を通じて確認した結果を示した図である。

【図6】両親媒性ポリアミノ酸高分子（ＰＬＬ−ｂ−Ｐｈｅ）の重合結果をＮＭＲ分析を通じて確認した結果を示した図である。

【図7】両親媒性ポリアミノ酸高分子（ＰＬＬ−ｂ−Ｐｈｅ）の重合結果を図式化して示した図である。

【図8】両親媒性ポリアミノ酸高分子（ＰＬＬ−ｂ−Ｐｈｅ）に担持するスクアレンの量（１％／２００μｌ）によるエマルジョンのサイズ変化をＤＬＳ法を通じて確認した結果を示した図である。

【図9】両親媒性ポリアミノ酸高分子（ＰＬＬ−ｂ−Ｐｈｅ）に担持するスクアレンの量（５％／１ｍｌ）によるエマルジョンのサイズ変化をＤＬＳ法を通じて確認した結果を示した図である。

【図10】両親媒性ポリアミノ酸高分子（ＰＬＬ−ｂ−Ｐｈｅ）に担持するスクアレンの量（１０％／２ｍｌ）によるエマルジョンのサイズ変化をＤＬＳ法を通じて確認した結果を示した図である。

【図11】本発明のワクチン組成物の抗体力価を測定するためにマウスの赤血球凝集抑制実験を５種の条件（ｉ）ＰＢＳ（ｎｏｎ−ｖａｃ）、ｉｉ）インフルエンザ免疫ワクチン抗原（Ａｇ−ｏｎｌｙ）、ｉｉｉ）インフルエンザ免疫ワクチン抗原と市販の研究用免疫補助剤のａｄｄａｖａｘとの組み合わせ（Ａｄｄａｖａｘ）、ｉｖ）インフルエンザ免疫ワクチン抗原とＰＬＬ−ｂ−Ｐｈｅとの組み合わせ（Ａｍｉｎｏ−Ｓｑ）、ｖ）インフルエンザ免疫ワクチン抗原と実験室で製造したａｄｄａｖａｘとの組み合わせ（Ｔ８０−Ｓｑ））、を通じて測定したＨＩ ｔｉｔｅｒ値を示した図である。

【図12】水中油型エマルジョン状態の両親媒性アミノ酸高分子粒子の保管温度及び保管期間による粒子安定性を確認した結果を示した図である。

【図13】本発明のワクチン組成物の免疫活性の測定のためにマウスモデルから採血した血清のＩｇＧをＥＬＩＳＡを通じて確認した結果を示した図である。

【図14】本発明のワクチン組成物の免疫活性測定のためにマウスモデルから採血した血清のＩｇＧ１をＥＬＩＳＡを通じて確認した結果を示した図である。

【図15】本発明のワクチン組成物の免疫活性測定のためにマウスモデルから採血した血清のＩｇＧ２ａをＥＬＩＳＡを通じて確認した結果を示した図である。

【図16】マウスモデルにインフルエンザウイルス（Ｈ１Ｎ１）を攻撃接種して本発明によるワクチン組成物の感染抑制能力をマウスモデルの体重を測定して確認した結果を示した図である。

【図17】インフルエンザウイルスの感染５日目及び７日目にマウスモデルの肺を摘出してウイルスの抗体力価を測定した結果を示した図である。

【図18】本発明によるワクチン組成物の免疫活性の測定のためにモルモットモデルから採血した血清のＩｇＧをＥＬＩＳＡを通じて確認した結果を示した図である。

【発明を実施するための形態】

【0054】

以下、本出願を実施例を通じて詳細に説明する。下記の実施例は本出願の内容を例示するものに過ぎず、本出願の範囲が下記実施例によって限定されるものではない。

【0055】

＜実施例１＞スクアレンを担持する両親媒性ポリアミノ酸高分子（ＰＬＬ−ｂ−Ｐｈｅ）を含むエマルジョンの製造
１）両親媒性ポリアミノ酸高分子（ＰＬＬ−ｂ−Ｐｈｅ）の合成
陽イオン性ポリアミノ酸高分子であるポリリジン（Ｐｏｌｙ−Ｌｙｓ）と疎水性アミノ酸の無水物であるフェニルアラニン−ＮＣＡ（Ｐｈｅ−ＮＣＡ）の分岐型両親媒性ポリアミノ酸高分子（ＰＬＬ−ｂ−Ｐｈｅ）の重合のために、ポリリジン（Ｐｏｌｙ−Ｌｙｓ）の重合度（ｎ）を求め、ポリリジン（Ｐｏｌｙ−Ｌｙｓ）のアミン基（−ＮＨ_２）とフェニルアラニン−ＮＣＡ（Ｐｈｅ−ＮＣＡ）のモル量比が１：０．９〜０．１になるように質量を準備した。準備された試料を２５ｍＬのＤＭＦ（ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍａｍｉｄｅ）に溶かして混合溶液を製造した後、４８時間の間３５℃で重合反応を進行した。反応が終結した混合溶液を沈澱法によりエチルエーテル（ｅｔｈｙｌ ｅｔｈｅｒ）を用いて高分子を分離し、十分に透析（ｄｉａｌｙｓｉｓ）して余分の溶媒と試料を除去した後、凍結乾燥を通じてＰｏｌｙ−ＬｙｓとＰｈｅ−ＮＣＡが分岐型に重合された両親媒性ポリアミノ酸高分子（ＰＬＬ−ｂ−Ｐｈｅ）を得た。ＰＬＬ−ｂ−Ｐｈｅの合成過程を図１に示した。

【0056】

２）水中油型エマルジョン（Ｏｉｌ ｉｎ ｗａｔｅｒ ｅｍｕｌｓｉｏｎ）の製造
１）で得た両親媒性ポリアミノ酸高分子（ＰＬＬ−ｂ−Ｐｈｅ）４０ｍｇを蒸留水（ＤＷ）２０ｍＬに溶かして水溶液を製造した。該水溶液を超音波処理（ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｓｓ）して８００ｒｐｍで撹拌した。このように撹拌が進行されている混合溶液に、少量のＴＨＦ（ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｆｕｒａｎ）に溶解されたスクアレン混合溶液を一度に添加した。スクアレンを添加した混合溶液は、３０分間超音波で処理し、５時間以上３００ｒｐｍ〜４００ｒｐｍで撹拌させてＴＨＦ溶媒を除去した後、スクアレンを担持した水中油型のＰＬＬ−ｂ−Ｐｈｅエマルジョンを製造した。製造されたエマルジョンをＴＥＭ顕微鏡で観察した写真を図２に示し、水中油型のエマルジョン及びエマルジョンの製造方法を図３及び図４に図式化した。

【0057】

３）ワクチン組成物の製造
２）で製造した水中油型のエマルジョン２５μｌとＨＡ ｔｉｔｅｒ値が約１２８になるようにインフルエンザウイルス抗原を含んだＰＢＳ溶液２５μｌを混合し、体積が約１：１になるようにワクチン組成物を製造した。

【0058】

＜実験例１＞ＮＭＲ分析
両親媒性ポリアミノ酸高分子（ＰＬＬ−ｂ−Ｐｈｅ）の重合結果を核磁気共鳴（Ｎｕｃｌｅａｒ Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ；ＮＭＲ）分析を通じて確認して図５及び図６に示し、図７を通じてＰＬＬ−ｂ−Ｐｈｅの重合過程を図式化した。まず、Ｈ−Ｌｙｓ（Ｚ）−ＯＨをトリホスゲン（Ｔｒｉｐｈｏｓｇｅｎｅ）と反応させてＬｙｓ（ｚ）−ＮＣＡリシン無水物を合成し、ＮＭＲ分析を通じてＮＣＡとＣｂｚのピークを確認して適切に合成されたことを確認した。合成されたＬｙｓ（ｚ）−ＮＣＡリシン無水物は、ヘキシルアミン（Ｈｅｘｙｌａｍｉｎｅ）を用いて重合して陽イオン性ポリアミノ酸高分子（ＰＬＬ（ｚ）、Ｐｏｌｙ−ｌ−ｌｙｓｉｎｅ（ｚ））を合成した。これは、ＮＭＲデータでＮＣＡピークが消えたことを通じて重合の成功を確認した。その後、ＨＢｒ／ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ溶液を用いてアミン基を保護しているＣｂｚ保護グループを脱保護グループ化し、ＮＭＲ分析データでＣｂｚピークが弱くなり、消えたことを通じて陽イオン性アミノ酸高分子であるポリリジン（Ｐｏｌｙ−ｌ−ｌｙｓｉｎｅ）の合成を確認した。また、疎水性アミノ酸無水物（Ｐｈｅ−ＮＣＡ）をポリリジンと反応させてポリリジンにフェニルアラニン無水物が分岐型に重合されるようにした。その結果として、ＮＭＲ分析データでＮＣＡピークが消え、フェニルアラニンのベンゼン環のピークが生じたことを通じて重合されたことを確認した。

【0059】

＜実験例２＞ＤＬＳ法による水中油型エマルジョン状態の両親媒性高分子粒径分布度の測定
両親媒性ポリアミノ酸高分子（ＰＬＬ−ｂ−Ｐｈｅ）の量は固定し、スクアレンの量を調節して水中油型エマルジョン状態の両親媒性高分子粒径分布度を測定した。実施例１の２）エマルジョン製造方法を用いてスクアレンを高分子内に担持した。スクアレンの量による粒径の変化をＤＬＳ（ｄｙｎａｍｉｃ ｌｉｇｈｔ ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ）法を通じて確認した。その結果を図８〜図１０及び下記表１に示した。

【0060】

【表1】

【0061】

図８〜図１０及び上記表１を通じて、スクアレンの含量が増加するほど、水中油型エマルジョン状態の両親媒性高分子粒径はますます増加することを確認した。また、ＤＬＳ分析を通じて粒子が均一に単純分散（ｍｏｎｏｄｉｓｐｅｒｓｅ）されていることが確認できた。

【0062】

＜実験例３＞抗体力価の測定
筋肉注射接種対象としてマウスを２週間おきに注射接種を実施し、最初接種から４週間後に赤血球凝集抑制実験を進行して抗体力価を確認した。マウスの抗体力価の測定は、ＨＩ（Ｈｅｍａｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）テスト法で測定した。５種の条件（ｉ）ＰＢＳ（図１１のｎｏｎ−ｖａｃ）、ｉｉ）インフルエンザ免疫ワクチン抗原（図１１のＡｇ−ｏｎｌｙ）、ｉｉｉ）インフルエンザ免疫ワクチン抗原と市販の研究用免疫補助剤のＡｄｄａｖａｘとの組み合わせ（図１１のＡｄｄａｖａｘ）、ｉｖ）インフルエンザ免疫ワクチン抗原とＰＬＬ−ｂ−Ｐｈｅとの組み合わせ（図１１のＡｍｉｎｏ−Ｓｑ）、ｖ）インフルエンザ免疫ワクチン抗原と実験室で製造したＡｄｄａｖａｘとの組み合わせ（図１１のＴ８０−Ｓｑ））で実験を進行した。各条件当たり５匹のマウスを対象として実験し、免疫ワクチン抗原は、ＣＡ０４（Ｈ１Ｎ１）ウイルスを使用した。その結果を図１１に示した。

【0063】

図１１から分かるように、抗体力価をＨＩ ｔｉｔｅｒ平均値で確認したとき、インフルエンザ免疫ワクチン抗原とＰＬＬ−ｂ−Ｐｈｅとの組み合わせの結果がインフルエンザ免疫ワクチン抗原とａｄｄａｖａｘとの組み合わせの結果に比べて１．５倍程度高い抗体力価を有することが確認できた。

【0064】

＜実験例４＞粒子安定性の確認
上記実施例１の２）で製造したスクアレンを担持する両親媒性ポリアミノ酸高分子（ＰＬＬ−ｂ−Ｐｈｅ）を含むエマルジョンは、ＤＬＳ機器を用いて保管温度による粒径を測定して粒子の安定性を確認した。粒子は、４℃での冷蔵保管と常温（ｒｏｏｍ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ；ＲＴ、２５℃）での常温保管を行い保管期間による粒子安定性を確認した。

【0065】

図１２から分かるように、保管期間が長くなっても粒子は初期の粒径を維持することを確認することができ、これを通じて、本発明による両親媒性アミノ酸高分子粒子を長期間保管しても均一によく分散していることが分かった。

【0066】

＜実験例５＞ウイルスに感染したモデルにおける免疫活性の測定
１）インフルエンザウイルス（Ｈ１Ｎ１）に感染したマウスモデルにおける免疫活性の測定
筋肉注射接種対象としてマウスを２週間おきに２回の注射接種を実施し、最後接種から２週間後に採血して抗原特異的抗体に基づく免疫反応（ｈｕｍｏｒａｌ ｉｍｍｕｎｉｔｙ）を確認するためにＥＬＩＳＡを通じて免疫活性測定実験を進行した。マウスの免疫活性の測定は、採血した血清を１：５０に希釈し、ＩｇＧとそのｉｓｏｔｙｐｅ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ）の量をＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ）を通じて確認し、それぞれ図１３〜図１５に示した。６種の条件（ｉ）無処理群（Ｎ．Ｃ．：ＰＢＳ ５０μｌ投与）、ｉｉ）インフルエンザ免疫ワクチン抗原（Ａｇ：抗原（不活性化免疫抗原、抗原力価３２）２５μｌ＋ＰＢＳ ２５μｌ投与）、ｉｉｉ）インフルエンザ免疫ワクチン抗原と市販の免疫補助剤のＡｌｕｍ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｉｍｊｅｃｔ^ＴＭ、アメリカ）との組み合わせ（Ａｇ／Ａｌｕｍ：抗原（不活性化免疫抗原、抗原力価３２）２５μｌ＋Ａｌｕｍ ２５μｌ投与）、ｉｖ）インフルエンザ免疫ワクチン抗原と市販の免疫補助剤のＡｄｄａｖａｘ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、アメリカ）との組み合わせ（Ａｇ／Ａｄｄａｖａｘ：抗原（不活性化免疫抗原、抗原力価３２）２５μｌ＋Ａｄｄａｖａｘ ２５μｌ投与）、ｖ）インフルエンザ免疫ワクチン抗原とスクアレン（０％）を担持したＰＬＬ−ｂ−Ｐｈｅとの組み合わせ（Ａｇ／ＣＡＳｑ（０％）：抗原（不活性化免疫抗原、抗原力価３２）２５μｌ＋ＣＡＳｑ（０％） ２５μｌ投与）、ｖｉ）インフルエンザ免疫ワクチン抗原とスクアレン（５％）を担持したＰＬＬ−ｂ−Ｐｈｅとの組み合わせ（Ａｇ／ＣＡＳｑ（５％）：抗原（不活性化免疫抗原、抗原力価３２）２５μｌ＋ＣＡＳｑ（０％） ２５μｌ投与）で実験を進行し、抗原と免疫補助剤は、１：１の割合でワクチン製剤を製造して実験を実行した。このとき、各条件当たり３匹のマウスを対象として実験し、免疫ワクチン抗原は、ＣＡ０４（インフルエンザウイルスＨ１Ｎ１）ウイルスを使用した。その結果を図１３〜図１５に示した。

【0067】

図１３〜図１５から分かるように、ＥＬＩＳＡ実験を進行して吸光度（４５０ｎｍ）でＩｇＧの量を間接的に確認した結果、吸光度の強度差からＣＡＳｑ（５％）がＡｄｄａｖａｘ、Ａｌｕｍに比べてより多量のＩｇＧを発現させたことを確認することができた。また、Ｔｈ１免疫反応と関連するＩｇＧ２ａ、Ｔｈ２免疫反応と関連するＩｇＧ１の結果でもＣＡＳｑ（５％）が有意なレベルであることを確認した。

【0068】

２）インフルエンザウイルス（Ｈ１Ｎ１）に感染したマウスモデルにおける感染抑制能力の測定
筋肉注射接種対象としてマウスを２週間おきに注射接種を実施した後、インフルエンザウイルス（Ｈ１Ｎ１）を２０＊ＬＤ_５０含量で３０ｍｌずつ鼻腔に攻撃接種し、本発明によるワクチンの感染抑制能力を確認して図１６に示した。感染抑制能力の確認実験は、ウイルス感染後１１日間動物の体重を測定して確認した。このとき、各条件当たり１０匹のマウスを対象として６種の条件（ｉ）無処理群（図１６のＮ．Ｃ．）、ｉｉ）ＰＢＳ処理群（図１６のＰＢＳ：ＰＢＳ ５０μｌ投与後攻撃接種）、ｉｉｉ）インフルエンザ免疫ワクチン抗原（図１６のＡｇ：抗原（不活性化免疫抗原、抗原力価３２）２５μｌ＋ＰＢＳ ２５μｌ投与後攻撃接種）、ｉｖ）インフルエンザ免疫ワクチン抗原と市販の免疫補助剤のＡｌｕｍ ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｉｍｊｅｃｔ^ＴＭ、アメリカ）との組み合わせ（図１６のＡｇ／Ａｌｕｍ：抗原（不活性化免疫抗原、抗原力価３２）２５μｌ＋Ａｌｕｍ ２５μｌ投与後攻撃接種）、ｖ）インフルエンザ免疫ワクチン抗原と市販の免疫補助剤のＡｄｄａｖａｘ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、アメリカ）との組み合わせ（図１６のＡｇ/Ａｄｄａｖａｘ：抗原（不活性化免疫抗原、抗原力価３２）２５μｌ＋Ａｄｄａｖａｘ ２５μｌ投与後攻撃接種）、ｖｉ）インフルエンザ免疫ワクチン抗原とスクアレン（５％）を担持したＰＬＬ−ｂ−Ｐｈｅとの組み合わせ（図１６のＡｇ／ＣＡＳｑ（５％）：抗原（不活性化免疫抗原、抗原力価３２）２５μｌ＋ＣＡＳｑ（５％） ２５μｌ投与後攻撃接種））で実験を進行し、抗原と免疫補助剤は、１：１の割合でワクチン製剤を製造して実験を実行した。

【0069】

また、感染５日目と７日目にマウスの肺を摘出してウイルスのｔｉｔｅｒ値を測定することで肺に残っているウイルスの力価を測定した。このとき、各条件当たり３匹のマウスを対象として確認し、その結果を図１７に示した。

【0070】

図１７から分かるように、本発明の免疫補助剤を用いた実験群（Ａｇ／ＣＡＳｑ（５％））で動物の体重変化が無処理対照群に最も近いレベルであって、市販の免疫補助剤を用いた場合よりも優れた感染抑制能を有することが確認できた。また、感染５日目と７日目のウイルス力価を確認した結果、本発明の免疫補助剤を用いたときにウイルス力価が最も低いことが分かった。

【0071】

３）豚流行性下痢症ウイルス（ＰＥＤ）に感染したモルモットモデルにおける免疫活性の測定
筋肉注射接種対象としてモルモットを２週間おきに３回の注射接種を実施し、２次及び３次接種から各々２週後に採血し、抗原特異的抗体に基づく免疫反応（ｈｕｍｏｒａｌ ｉｍｍｕｎｉｔｙ）を確認するためにＥＬＩＳＡを通じる免疫活性測定実験を進行した。モルモットの免疫活性測定は、採血した血清を１：５０に希釈し、ＩｇＧの量をＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ）を通じて確認した。５種の条件（ｉ)無処理群（図１８のＮ．Ｃ．：ＰＢＳ ５０μｌ投与）、ｉｉ）ＰＥＤ免疫ワクチン抗原（図１８のＡｇ ｏｎｌｙ：抗原２５μｌ＋ＰＢＳ ２５μｌ投与）、ｉｉｉ）ＰＥＤＫ（筋肉接種用ＰＥＤウイルス免疫抗原）と市販の免疫補助剤のＡｄｄａｖａｘ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、アメリカ）との組み合わせ（図１８のＡｇ／Ａｄｄａｖａｘ：抗原２５μｌ＋Ａｄｄａｖａｘ ２５μｌ投与）、ｉｖ）ＰＥＤＫ（筋肉接種用ＰＥＤウイルス免疫抗原）と市販の免疫補助剤のＩＭＳ１３１３（ｓｅｐｐｉｃ社、フランス）との組み合わせ（図１８のＡｇ／ＩＭＳ１３１３：抗原２５μｌ＋ＩＭＳ１３１３ ２５μｌ投与）、ｖ）ＰＥＤＫ（筋肉接種用ＰＥＤウイルス免疫抗原）とスクアレン（５％）を担持したＰＬＬ−ｂ−Ｐｈｅとの組み合わせ（図１８のＡｇ／ＣＡＳｑ（５％）：抗原２５μｌ＋ＣＡＳｑ（５％） ２５μｌ投与）で実験を進行し、抗原と免疫補助剤は、１：１の割合でワクチン製剤を製造して実験を実行した。このとき、各条件当たり２匹のマウスを対象として実験し、その結果を図１８に示した。

【0072】

図１８から分かるように、従来の豚流行性下痢症（ＰＥＤ）ウイルスのワクチン製品に用いられる免疫補助剤を用いた場合と比較して、本発明による免疫補助剤を用いた場合に著しいＩｇＧ値を有することが確認できた。本発明による免疫補助剤のＰＥＤウイルスに対する免疫活性を通じて、ＰＥＤウイルスに対する免疫補助剤として優れた効果を示すことを確認した。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】