特許 6563379 白血球の枯渇による循環腫瘍細胞の濃縮

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6563379

(24)【登録日】2019年8月2日

(45)【発行日】2019年8月21日

(54)【発明の名称】白血球の枯渇による循環腫瘍細胞の濃縮

(51)【国際特許分類】

   G01N 33/48 20060101AFI20190808BHJP

   C12Q 1/02 20060101ALI20190808BHJP

   G01N 33/53 20060101ALI20190808BHJP

   C07K 16/28 20060101ALN20190808BHJP

【ＦＩ】

   G01N33/48 B

   C12Q1/02

   G01N33/53 K

   G01N33/48 M

   !C07K16/28

【請求項の数】11

【全頁数】14

(21)【出願番号】特願2016-502523(P2016-502523)

(86)(22)【出願日】2014年3月14日

(65)【公表番号】特表2016-519286(P2016-519286A)

(43)【公表日】2016年6月30日

(86)【国際出願番号】US2014027701

(87)【国際公開番号】WO2014152758

(87)【国際公開日】20140925

【審査請求日】2017年3月8日

(31)【優先権主張番号】61/787,611

(32)【優先日】2013年3月15日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】505060347

【氏名又は名称】ジャンセン ダイアグノスティックス，エルエルシー

(74)【代理人】

【識別番号】100088605

【弁理士】

【氏名又は名称】加藤 公延

(74)【代理人】

【識別番号】100130384

【弁理士】

【氏名又は名称】大島 孝文

(72)【発明者】

【氏名】ラオ・ガーラ・チャンドラ

(72)【発明者】

【氏名】フォルク・ブラッド

(72)【発明者】

【氏名】スミルノフ・デニス

(72)【発明者】

【氏名】ニールセン・カール

【審査官】 草川 貴史

(56)【参考文献】

【文献】 特表平０５−５０１６１２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 LIYING Y、外７名，Optimization of an enrichment process for circulating tumor cells from the blood of head and neck cancer patients through depletion of normal cells.，Biotechnol Bioeng.，２００９年 ２月 １日，Vol.102,No.2，Page.521-534

【文献】 CHEN-LIN CHEN、外９名，Separation and detection of rare cells in a microfluidic disk via negative selection.，Lab Chip.，２０１１年 ２月 ７日，Vol.11,No.3，Page.474-483

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｇ０１Ｎ ３３／４８−３３／９８

Ｃ１２Ｑ １／０２

Ｃ０７Ｋ １６／２８

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

濃縮した希少細胞及び白血球を含むサンプルから白血球を除去する方法であって、
（ａ）ハプテンにコンジュゲートされた白血球マーカーで白血球を標識する条件下で、ハプテンにコンジュゲートされたかかる白血球マーカーを用いて、かかるサンプルを処置する工程であって、前記濃縮した希少細胞及び前記白血球は、ステップ（ａ）の前に、免疫磁性マーカーで標識されて、免疫磁性法により濃縮されている、工程と、
（ｂ）工程（ａ）の組成物を、かかる標識した白血球に接着する第２の媒体を用いて処置する工程と、工程（ｂ）の組成物から、前記第２の媒体及びその接着した標識された白血球を分離する工程と、を含み、
前記濃縮した希少細胞は、ＣＴＣ、ＣＥＣ、ＣＭＭＣ、及びＣＭＣからなる群から選択され、
ステップ（ｂ）は免疫磁性法を含まない、方法。

【請求項2】

前記濃縮した希少細胞が、ＣＴＣ及びＣＥＣからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記濃縮した希少細胞がＣＴＣである、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

前記白血球マーカーが、ＣＤ４５、ＣＤ１９、ＣＤ１５、グリコフォリンＡ、ＣＤ２、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＥ３８、及びＣＤ６６ｂに対する抗体からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。

【請求項5】

前記白血球マーカーが、抗ＣＤ４５である、請求項１に記載の方法。

【請求項6】

前記白血球マーカーが、ＣＤ４５のエピトープを含む抗体フラグメントである、請求項１に記載の方法。

【請求項7】

前記ハプテンが、フルオレセイン染料（「ＦＩＴＣ」）、フィコエリトリン（「ＰＥ」）、アロフィコシアニン（「ＡＰＣ」）、及びビオチンからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。

【請求項8】

前記ハプテンがＦＩＴＣである、請求項１に記載の方法。

【請求項9】

前記濃縮した希少細胞がＣＴＣであり、前記白血球マーカーが抗−ＣＤ４５であり、前記ハプテンがビオチンである、請求項１に記載の方法。

【請求項10】

請求項１に記載の方法における使用のためのキットであって、前記ハプテンにコンジュゲートされた白血球マーカーと、前記ハプテンにコンジュゲートされた白血球マーカー以外の第２のマーカーとを含み、前記第２のマーカーは、前記ハプテンに対する抗体を含む、キット。

【請求項11】

請求項１に記載の方法における使用のためのキットであって、前記希少細胞及び白血球を免疫磁性法でマーキングするための試薬と、前記ハプテンにコンジュゲートされた白血球マーカーと、前記白血球マーカー以外の第２のマーカーとを含み、前記第２のマーカーは、前記ハプテンに対する抗体を含む、キット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

（関連出願の相互参照）
本願は、係属中の米国仮特許出願第６１／７８７６１１号（表題「Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｔｕｍｏｒ Ｃｅｌｌｓ」、２０１３年３月１５日出願）の優先権を主張する。

【背景技術】

【0002】

上皮由来の循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）は、非常に低い頻度（血液１ｍＬ中に１０個未満）で癌患者の血液中に存在する。循環中の腫瘍細胞の検出は、癌疾患管理にとって重要である可能性がある。低頻度の細胞の検出には、大量の血液の処理が必要である。大量の血液からＣＴＣを計数し、特性化するには、ＣＴＣの濃縮が必要である。

【0003】

サイズ、密度、抗原に基づく、ＣＴＣの濃縮のために利用可能ないくつかの方法がある。希少細胞の濃縮のための十分確立された市販製品は、Ｖｅｒｉｄｅｓ ＣｅｌｌＳｅａｒｃｈ ＣＴＣアッセイである。ＣｅｌｌＳｅａｒｃｈ ＣＴＣアッセイは抗上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）にコンジュゲートした磁性粒子を用いて、７．５ｍＬの血液からＣＴＣを捕らえる。濃縮したサンプルを核酸染料ＤＡＰＩで染色して有核細胞を識別し、上皮由来の細胞を識別するために、フィコエリトリンにコンジュゲートした抗サイトケラチン抗体を識別し、全ての白血球を識別するために、アロフィコシアニンにコンジュゲートした抗白血球抗体を識別する。サンプルは、ＣＴＣの計数のためにＣｅｌｌＴｒａｃｋｓ Ａｎａｌｙｚｅｒ ＩＩで解析する。

【0004】

濃縮後の最終サンプルはＣＴＣ及び少数の白血球（１０００〜５０００個）を含んでいる。この濃縮方法は９９％を超える白血球（ＷＢＣ）を除去する。希少細胞の計数中の白血球の存在は問題ではなく、プロセスに有害に影響しない。ＷＢＣを白血球マーカー（ＣＤ４５）で標識して、ＷＢＣをＣＴＣと区別することができる。しかしながら、そのようなＣＴＣの中に存在する核酸の増幅によってその遺伝子型を定義するために、計数したＣＴＣを分子的に特性化することが望まれる場合、白血球の存在はこの特性化に有害な影響を及ぼす。計数した分画中の白血球の比率はＣＴＣの数と比較して高く、そのような白血球の核酸は、ＣＴＣで増幅されるので、それらの核酸、すなわちＣＴＣ又は白血球のソースを判定することは困難である（困難であった）。したがって、白血球を除去するための濃縮サンプルの更なる精製（ＣＴＣに対する白血球の比率を下げること）は、信頼できる分子特性化ツールの開発のための大きな節目となるであろう。この需求は、以下の発明によって満たされる。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0005】

ＣＴＣの濃縮後に白血球を除去する利用可能な方法は存在していない。それにはＣＴＣの濃縮に用いられたのと同じ原理は用いられないので、ユニークな方法が必要である。例えば、濃縮方法が最初の工程で免疫磁性法を用いる場合、免疫磁性法以外の別の方法を用いる必要がある。

【図面の簡単な説明】

【0006】

【図1】ハプテンに基づく白血球除去の解説図。

【図2】抗ＦＩＴＣでのインキュベーションの前及び後の白血球の解析。

【図3】白血球除去率（％）。

【図4】枯渇サンプル及び非枯渇サンプルの分子測定。

【図5】ＣＤ４５枯渇後の検出。

【図6】白血球枯渇でスパイクインしたＶｃａｐ細胞と培養したＶｃａｐ細胞との相関関係。

【図7】ビーズ枯渇の作用。

【発明を実施するための形態】

【0007】

本明細書に記載の発明は、濃縮した希少細胞及び白血球を含むサンプルから白血球を除去する方法を含む、又は本質的に該方法からなる、又は該方法からなるものであって、かかる方法は、
（ａ）ハプテンにコンジュゲートされた白血球マーカーで白血球を標識する条件下で、ハプテンにコンジュゲートされたかかる白血球マーカーを用いて、かかるサンプルを処置する工程と、
（ｂ）工程（ａ）の組成物を、かかる標識した白血球に接着する第２の媒体を用いて処置する工程と、工程（ｂ）の組成物から、第２の媒体及びその接着した標識された白血球を分離する工程と、を含む。

【0008】

本明細書で使用するとき、「白血球マーカー」は、白血球を標識するが希少細胞を標識しない物質を指す。白血球マーカーの例としては、ＣＤ４５、ＣＤ１９、ＣＤ１５、グリコフォリンＡ、ＣＤ２、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＥ３８、及びＣＤ６６ｂに対する抗体が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい白血球マーカーは抗ＣＤ４５である。ハプテンとしては、フルオレセイン色素（「ＦＩＴＣ」）、フィコエリトリン（「ＰＥ」）、アロフィコシアニン（「ＡＰＣ」）、及びビオチンが挙げられるが、これらに限定されない。好ましいハプテンはＦＩＴＣである。本明細書で使用するとき、用語「抗体」は、モノクローナル及びポリクローナルの両方の全抗体、特定のハプテンと結合する抗体フラグメント、特定のハプテンと結合する二重特異性抗体を含む。好ましい抗体はモノクローナル抗体である。

【0009】

本明細書で使用するとき、「第２の媒体」は、白血球マーカー以外の第２のマーカーを含む任意の表面を意味する。かかる第２のマーカーは、白血球マーカーにコンジュゲートされたハプテンに結合する。第２のマーカーの例としては、ＦＩＴＣ、ＰＥ、ＡＰＣに対する抗体が挙げられるがこれらに限定されず、好ましい第２のマーカーはＦＩＴＣに対する抗体である。使用できる表面の例としては、マイクロタイタープレートが挙げられる。

【0010】

本明細書で使用するとき、「希少細胞」は、血中で低頻度の細胞である。希少細胞の例としては、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）、循環内皮細胞（ＣＥＣ）、循環多発性骨髄腫細胞（ＣＭＭＣ）、及び循環黒色腫細胞（ＣＭＣ）が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい希少細胞はＣＴＣ及びＣＥＣであり、特に好ましい希少細胞はＣＴＣである。これらの希少細胞の濃縮分画は、既知の方法によって全血から生成し得る。かかる方法としては、非限定的に、米国特許第７，９０１，９５０号、同第６，３６５，３６２号、米国特許公開第２００９／０１３６９４６号、及び同第２０１３／０１８９６７５号、並びに同第２０１４／００１１６８５号の特許及び特許出願に開示されている方法並びに試薬が含まれ、これらの開示は参照することにより本明細書にその全体が組み込まれる。濃縮されたＣＴＣを得るための好ましい方法は、例えば、米国特許第６，３６５、３６２号などの参考文献に開示されている免疫磁性法、及びＣＥＬＬ ＳＥＡＲＣＨ製品ラインの方法である。

【0011】

ＣＴＣの濃縮分画からの白血球の枯渇の原理。図１に図示するように、ＣＴＣ及び白血球は抗ＥｐＣＡＭ磁性流体で標識し、白血球は白血球コンジュゲートハプテンで標識される。

【0012】

更に、本発明は、濃縮した希少細胞及び白血球を含むサンプルから白血球を除去するためのキットを含み、かかるキットは、ハプテンにコンジュゲートする白血球マーカーと、白血球マーカー以外の第２のマーカーとを含み、第２のマーカーは、かかるハプテンに対する抗体を含む。

【0013】

定義された用語の全ては、上記と同じ定義及び好ましい例を有する。

【0014】

また更に、本発明は、濃縮した希少細胞及び白血球を含むサンプルから白血球を除去するためのキットを含み、かかるキットは、希少細胞及び白血球を免疫磁性法でマーキングするための試薬と、ハプテンにコンジュゲートされる白血球マーカーと、白血球マーカー以外の第２のマーカーとを含み、第２のマーカーは、かかるハプテンに対する抗体を含む。

【0015】

定義された用語の全ては、上記と同じ定義及び好ましい例を有する。

【0016】

本発明を以下の実施例によって例示するが、それらによって本発明の範囲を限定することは意図されない。

【実施例】

【0017】

実施例１：マイクロタイタープレートにコーティングした抗ＣＤ４５を用いる白血球の枯渇
本実施例は、抗ＣＤ４５を用いた白血球の枯渇を示す。ＣＤ４５は白血球に存在する一般的な白血球マーカーであり、全ての白血球が抗ＣＤ４５に結合することが期待される。抗ＣＤ４５でコーティングした固相を用いて、白血球と結合させ、白血球とＣＴＣとの混合物からそれらを特異的に除去するために、抗ＣＤ４５を用いた。抗ＣＤ４５を次のように固相にコーティングした。

【0018】

抗ＣＤ４５（Ｖｅｒｉｄｅｘ）を５０ｍＭの重炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ８．５）にて５０μｇ／ｍＬまで希釈した。次に、抗ＣＤ４５抗体溶液０．８ｍＬを６ウェルのマイクロタイタープレートに添加し、室温（ＲＴ）で３時間、次いで２〜８℃で一晩、インキュベートした。一晩のインキュベーション後、抗ＣＤ４５抗体を吸引し、１ｍＬのＰＢＳ／１％ ＢＳＡを用いてウェルを室温で４時間ブロックした。緩衝液を吸引し、２ｍＬのＰＢＳでウェルを２回リンスした。リンスの後、全緩衝液を吸引し、プレートを１時間乾燥した。プレートは、使用するまで密封されたビニール袋に入れて２〜８℃で乾燥保管した。

【0019】

本実施例では、白血球を非白血球から分離する原理を試験するために２つの実験を行った。１つの研究では、ＢＤ溶血試薬を用いて赤血球を溶血した後、純粋な白血球を全血から調製した。このサンプルは陽性対照として用いた。もう１つの研究では、ＣｅｌｌＳｅａｒｃｈ ＣＴＣ Ｐｒｏｆｉｌｅキットを用いてＣｅｌｌＴｒａｃｋｓ ＡｕｔｏＰｒｅｐシステムで７．５ｍＬの血液を処理した。このＣＴＣ Ｐｒｏｆｉｌｅキットは、循環腫瘍細胞の捕獲のための磁性流体磁性粒子にコンジュゲートされた抗上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）を含んでいる。標的細胞の濃縮後、試料を９００μＬのＰＢＳ／１％ＢＳＡ緩衝液に再懸濁した。濃縮サンプルは標的細胞と白血球とを含有することになる。サンプルをマイクロタイタープレートのウェルに添加する前に、プレートを室温にし（最低３０分間）、ウェルを２ｍＬのＰＢＳ／５％ＢＳＡで２回洗浄した。次に、ウェルから緩衝液を吸引し、その後、サンプルを添加した。９００μＬのＣＴＣアッセイサンプル及び全血からの純粋な白血球をプレートの２つの別々のウェルに添加した。１５分毎にやさしく攪拌して１時間インキュベートした後、３００μＬの上清を除去して白血球数を判定した。サンプル中に存在した白血球数は、閾として前方散乱を用いてＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（Beckton Dickinson）によって判定した。ウェル内の抗ＣＤ４５に白血球が結合すれば、上清中の白血球数はインキュベーション工程前のサンプルと比較して少なくなるはずである。上清中にあるのは、未結合の細胞でなくてはならない。結果を表１ａに示す。

【0020】

【表1】

【0021】

上記の結果は、抗ＣＤ４５でコーティングしたマイクロタイタープレートに純粋な白血球を加えることによって、それらの白血球を除去することができることを示している。しかしながら、ＣＴＣアッセイのサンプルの上清に白血球が見つかった。これは、ＣＴＣアッセイのサンプルからの白血球が、ウェルにコーティングされた抗ＣＤ４５に結合しなかったことを示唆している。それらの２つのサンプルの違いは、ＣＴＣアッセイのサンプルでは白血球が磁性流体磁性粒子で標識されていることである。白血球に存在する磁性流体磁性粒子が立体障害のためにプレート上での抗ＣＤ４５への結合を妨げている可能性がある。この問題を克服するために、ＣＴＣアッセイからのサンプルを、最初に、リンカーによってハプテンにコンジュゲートされた抗ＣＤ４５で標識した（実施例を参照）。次に、抗ＣＤ４５タグで予め標識した白血球を含有するサンプルを、抗ハプテンでコーティングしたマイクロタイタープレートに添加した。

【0022】

実施例２：抗フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）でのマイクロタイタープレートのコーティング
抗ＦＩＴＣはＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから購入し、５０ｍＭの重炭酸ナトリウム（ｐＨ ８．５）にて５０μｇ／ｍＬまで希釈した。抗ＦＩＴＣ８００μＬを６ウェルのマイクロタイタープレートに添加し、室温で３時間、次いで２〜８℃で一晩、インキュベートした。一晩のインキュベーション後、プレートを室温にした。上清を吸引し、次いで、プレートをＰＢＳで２回リンスした。次いで、１ｍＬのＰＢＳ／１％ ＢＳＡを用いて室温で４時間、ウェルをブロックした。緩衝液を吸引し、２ｍＬのＰＢＳでウェルを２回リンスした。リンスの後、全緩衝液を吸引し、プレートを１時間乾燥した。プレートは、使用するまで密封されたビニール袋に入れて２〜８℃で乾燥保管した。使用する日に、プレートを室温にした（最低３０分間）。２ｍＬのＰＢＳ／１％ ＢＳＡをウェルに加え、１５分間インキュベートした。吸引後、プレートを再び２ｍＬのＰＢＳ／１％ ＢＳＡでリンスした。サンプルをウェルに加える前に緩衝液を吸引した。

【0023】

実施例３：ＦＩＴＣにコンジュゲートされた抗ＣＤ４５で白血球を標識し、マイクロタイタープレートを抗ＦＩＴＣでコーティングした、ＣＴＣアッセイのサンプルからの白血球の除去
ＳＫＢＲ３細胞でスパイクした７．５ｍＬのＥＤＴＡ血液を、ＣｅｌｌＳｅａｒｃｈ ＣＴＣキットを用いてＡｕｔｏＰｒｅｐで処理した。このＣＴＣアッセイからの濃縮されたサンプルを２μｇ／ｍＬの最終濃度で抗ＣＤ４５−ＦＩＴＣで染色した。２ｍＬのＰＢＳ／１％ＢＳＡでサンプルを２回洗浄し、１５分間磁性分離することによって、過剰のＣＤ４５−ＦＩＴＣを除去した。最終的なサンプルを９００μＬのＰＢＳ／５％ＢＳＡに再懸濁し、次いで、抗ＦＩＴＣでコーティングしたウェルに加えた。１５分毎にやさしく攪拌して、サンプルを１時間インキュベートした。１時間後、３００μＬの上清をウェルから除去し、フローサイトメーターによって白血球及びＳＫＢＲ３細胞の数を判定した。フローサイトメトリーによってＳＫＢＲ３細胞を検出するために、アロフィコシアニン染料（ＡＰＣ）にコンジュゲートされた抗Ｈｅｒ２ｎｅｕで細胞を標識した。白血球は抗ＣＤ４５−ＦＩＴＣで標識されているので、ＦＩＴＣチャネルに検出された。図２には、枯渇の前及び後に検出された細胞が示されている。

【0024】

図２は、白血球の枯渇の前及び後の腫瘍細胞及び白血球の数を示す。白血球の数はそれぞれ、枯渇前は３５９４個、枯渇後は３５４個であり、このことは、白血球の約９０％がサンプルから枯渇したことを示している。一方、腫瘍細胞の数はそれぞれ、枯渇前は２０９４個、枯渇後は１９２４個であり、このことは、腫瘍細胞の全て（＞９０％）が上清に存在していることを示している。この実施例は、腫瘍細胞の濃縮後にＣＴＣアッセイサンプルに存在している白血球を本発明を用いて除去できることを示している。

【0025】

これを６つのサンプルで試験し、その結果を図３に示す。結果は、ＷＢＣの９０％超が最小限の腫瘍細胞（ＳＫＢＲ３）の損失（＜１５％）で除去され得ることを示している。

【0026】

実施例４：循環内皮細胞（ＣＥＣ）アッセイにおける白血球の枯渇
本実施例は、ＷＢＣ枯渇の原理を他の希少細胞アッセイにも適用できることを示す。ＣｅｌｌＳｅａｒｃｈ ＣＥＣアッセイは、ＣｅｌｌＳｅａｒｃｈ ＣＥＣキットを用いて血液由来のＣＥＣを濃縮する。このキットは、ＣＥＣの捕獲のための磁性流体磁性粒子にコンジュゲートされた抗ＣＤ１４６を含んでいる。このアッセイは、ＣＴＣアッセイと同様に、サンプルの調製のためにＣｅｌｌＴｒａｃｋｓ ＡｕｔｏＰｒｅｐシステムを用いる。ＣＥＣは健常な血液サンプルに低頻度で存在するが、癌、心血管障害、感染症などの様々な条件によって上昇する。

【0027】

このアッセイを用いて、低頻度で存在するＣＥＣ（１試験につき細胞１〜２０個）への枯渇原理の作用、及びＷＢＣの枯渇効率を試験した。

【0028】

ＣｅｌｌＳｅａｒｃｈ ＣＥＣアッセイを用いて、ＣｅｌｌＴｒａｃｋｓ ＡｕｔｏＰｒｅｐシステムで４ｍＬのＥＤＴＡ血液を処理した。濃縮された細胞は、全ての細胞の識別のために核酸染料（ＤＡＰＩ）で染色し、ＣＥＣの識別のためにフィコエリトリン染料（ＰＥ）にコンジュゲートされた抗ＣＤ１０５で染色した。本実施例では、白血球を標識するために抗ＣＤ４５−ＦＩＴＣを使用した。染色工程後、サンプルを３２０μＬの緩衝液に再懸濁し、ＣｅｌｌＴｒａｃｋｓ Ａｎａｌｙｚｅｒ ＩＩでの解析のためにＣｅｌｌＳｅａｒｃｈ解析カートリッジに移した。ＣｅｌｌＴｒａｃｋｓ Ａｎａｌｙｚｅｒ ＩＩは、４つの異なる色でスキャンする４色蛍光顕微鏡であり、画像を解析し、ＤＡＰＩ及びＣＤ１０５−ＰＥに陽性の画像を提示する。ＤＡＰＩ及びＣＤ１０５に陽性かつＣＤ４５に陰性の細胞はＣＥＣとして数えられる。サンプルに存在するＷＢＣの総数は、ＤＡＰＩ陽性に基づいて数えられる。

【0029】

枯渇工程のために、濃縮及び染色の後、サンプルを９００μＬのＰＢＳ／１％ ＢＳＡに再懸濁した。次いで、サンプルを、実施例４に記載したように抗ＦＩＴＣでコーティングしたマイクロタイタープレートに加えた。１時間後、サンプルを吸引し、磁性分離器を用いて３２０μＬに濃縮した。次に、ＣｅｌｌＴｒａｃｋｓ Ａｎａｌｙｚｅｒ ＩＩで解析するためにサンプル（３２０μＬ）をカートリッジに移した。上述のようにＣＥＣ及びＷＢＣの数を判定した。ＷＢＣの枯渇の前及び後のＣＥＣ及びＷＢＣの数を比較した。この研究の結果を表４ａに示す。

【0030】

【表2】

【0031】

結果は、ＣＥＣアッセイにおいて濃縮後のＣＥＣからもＷＢＣを除去できる（＞７５％）ことを明らかに示している。更に、枯渇の前と後のＣＥＣ数に差はなかった（８．６対８）。このデータは、非常に低頻度（＜２０細胞）で存在しているときでさえも標的細胞が除去されないことを示している。

【0032】

実施例５：ＣｅｌｌＳｅａｒｃｈ Ｐｒｏｆｉｌｅキット濃縮サンプルにおけるＷＢＣ枯渇の分子測定
６人の健常ドナーからの複製したＥＤＴＡ血液７．５ｍＬを、調整したＣｅｌｌＳｅａｒｃｈ ＣＴＣ Ｐｒｏｆｉｌｅキットを用いてＡｕｔｏＰｒｅｐで処理した。ＷＢＣの標識がＡｕｔｏＰｒｅｐで行われるように、ＰｒｏｆｉｌｅキットのＰＢＳ／ビオチン試薬に、２μｇ／ｍＬの最終的な試薬濃度で抗ＣＤ４５−ＦＩＴＣを補充した。ＡｕｔｏＰｒｅｐで濃縮後、各ドナーからのチューブ１つを、サンプルからＷＢＣを除去した「枯渇」プロトコル、又は枯渇処理なしのサンプルにおけるＷＢＣ汚染を測定するための対照として用いられる「非枯渇」プロトコルのいずれかに供した。

【0033】

非枯渇プロトコル
ＡｕｔｏＰｒｅｐからサンプルを取り出し、マグネットに１５分間置いた。緩衝液を吸引し、細胞をＲＬＴ緩衝液（Ｑｉａｇｅｎ）に溶解した。

【0034】

枯渇プロトコル
ＡｕｔｏＰｒｅｐで濃縮後、２ｍＬのＰＢＳ／１％ＢＳＡでサンプルを２回洗浄し、１５分間磁性分離することによって、過剰のＣＤ４５−ＦＩＴＣを除去した。最終的なサンプルを９００μＬのＰＢＳ／５％ＢＳＡに再懸濁し、次いで、抗ＦＩＴＣでコーティングしたウェルに加えた。１５分毎にやさしく攪拌して、サンプルを１時間インキュベートした。１時間後、３００μＬの上清をウェルから取り出し、細胞をマグネットに１５分間置いた。緩衝液を除去し、細胞をＲＬＴ緩衝液（Ｑｉａｇｅｎ）に溶解した。

【0035】

枯渇サンプル及び非枯渇サンプルの両方に関して、ＲＮＡをＱｉａｇｅｎ ＡｌｌＰｒｅｐキットを用いて精製し、Ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔｓキット（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて逆転写した。表５ａのリストの遺伝子について、ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＰｒｅＡｍｐ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及びプライマーセットを用いて、相補ＤＮＡを増幅した。白血球において発現することが知られている２つの遺伝子（ＣＤ４５（別称ＰＴＰＲＣ）及びＢＳＴ１）の増幅サンプル並びに発現したハウスキーピング遺伝子（Ｂアクチン）について定量的ＰＣＲを実行した。非枯渇サンプルとの相関における枯渇サンプルのＷＢＣの損失及びハウスキーピング特異性遺伝子シグナルによって、ＷＢＣの枯渇の有効性を測定した。

【0036】

図４において、それぞれ、丸は非枯渇（on depleted）サンプル、四角は枯渇サンプルの個々の測定を示す。線は各サンプルタイプの平均測定値を示す。Ｐ値は、測定した各遺伝子の枯渇サンプルと非枯渇サンプルとの間で行ったスチューデントＴ試験の結果を表す。枯渇サンプルと非枯渇サンプルとの間のＴ試験は、ＣＤ４５の枯渇の結果としてのＷＢＣ特異性遺伝子及びハウスキーピング遺伝子の有意な損失を示した。＞２サイクルの平均デルタＣｔ測定は、ＣＤ４５枯渇サンプルにおけるＷＢＣシグナルの＞７５％の低減を示している。

【0037】

【表3】

【0038】

実施例６：白血球枯渇後のＣＴＣ検出の改善
ＣＤ４５枯渇法の潜在的利点の１つは、白血球が寄与するバックグラウンド遺伝子発現がある程度存在するときにＣＴＣを検出する能力又はＣＴＣ遺伝子発現を特定化する能力が改善されていることである。白血球数の低下はバックグラウンド遺伝子発現を低下させ、より少数のＣＴＣにおいて転写物を検出する能力を改善するはずである。

【0039】

この原理を実証するために、６人のドナーのそれぞれについて４つのサンプルを用意し、２つのサンプルを１０個のＶＣａＰ細胞でスパイクし、２つのサンプルはスパイクしなかった。スパイクしたサンプルの１つ及びスパイクしていないサンプルの１つを、実施例５に記載した「枯渇」及び「非枯渇」プロトコルの両方で用意した。ＲＮＡ抽出、逆転写、及びプレ増幅キットは、実施例５と同様に実行した。公開データベースを検索して、ＷＢＣ枯渇法の有用性の測定に有用であり得る、可能性のあるＣＴＣマーカーのパネルを特定した。ＶＣａＰ細胞において中〜高発現であり、ＷＢＣにおいて一定範囲の発現を有する遺伝子を選択した。可能性のあるＣＴＣマーカーＳ１００Ａ１３及びＡＫＲ１Ｃ３のＲＴ−ＰＣＲの結果。ＷＢＣの枯渇なし（非枯渇サンプル）では、どちらの遺伝子も、スパイクしなかったサンプルのセットと１０個の細胞でスパイクしたサンプルのセットとの間の発現の有意差を示していない。枯渇セットでは、ＷＢＣが寄与したバックグラウンドが低下し、スパイクしなかったサンプルのセットと１０個の細胞でスパイクしたサンプルのセットとの間に有意差が存在する。

【0040】

実施例７：白血球の枯渇後のＣＴＣの分子特性化のためのＷＢＣの枯渇の適用
ＣＤ４５枯渇法の主な利点は、ＣＴＣの分子特性化の改善を可能にし、白血球が寄与するバックグラウンド遺伝子発現を最小限にすることである。

【0041】

この適用を実証するために、８人のドナーから８つのサンプルを調製し、それぞれ２つのサンプルを１００個、５０個、２５個、１０個のＶＣａＰ細胞でスパイクした。更に、ＶＣａＰ細胞（例えば１００個、５０個、２５個、１０個の細胞）のみを含有する４つのサンプルを陽性対照として用いた。ＲＮＡ抽出、逆転写、及びプレ増幅キットは、実施例６と同様に実行した。アンドロゲン受容体（ＡＲ）遺伝子、２つのＡＲスプライスバリアント（ＡＲＶ１及びＡＲＶ３／７）、ＴＭＰＲＳＳ２並びにＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧのスプライスバリアントを、ＶＣａＰ細胞のための試験遺伝子として選択した。ＷＢＣの枯渇後、純粋培養ＶＣａＰ細胞と、ＶＣａｐ細胞でスパイクした血液との間に、ＶＣａｐ細胞におけるこれらの候補遺伝子の発現の検出において良好な相関が存在し、相関係数（ｒ２）は＞０．９であった。結果を図６に示す。

【0042】

実施例８：ビーズに基づく濾過を用いた白血球の枯渇
本実施例は、ＣｅｌｌＳｅａｒｃｈ Ｐｒｏｆｉｌｅ Ｋｉｔを用いて濃縮したサンプルに存在する夾雑白血球の数を減少させるための代替方法を説明する。ＥｐＣＡＭに基づいた免疫磁性濃縮の後、夾雑ＣＤ４５＋ＷＢＣをプラスチックビーズで標識する。ビーズと結合したＣＤ４５＋細胞を保持し未結合のＣＴＣを通過させるフィルタで混合物を濾過して、ＷＢＣをＣＴＣから分離する。こうして、より少ない数の夾雑ＷＢＣを用いる分子解析又は細胞解析にＣＴＣが利用可能になる。

【0043】

この方法を実証するために、１０，０００個のＶＣＡＰ細胞を健常ドナーの血液の６つのチューブにスパイクし、ＣｅｌｌＳｅａｒｃｈ Ｐｒｏｆｉｌｅキットを用いて濃縮した。３つのサンプルは直ちにＱｉａｇｅｎ ＲＬＴ緩衝液に溶解し（非枯渇サンプル）、残りの３つのサンプルは、以下に記載したビーズに基づく方法を用いて枯渇させた。ＣＴＣ及び夾雑白血球を含有する濃縮分画を、ＣＤ４５分子に特異性の抗体でコーティングした３０ミクロンのプラスチックビーズと混合した（ｐｌｕｒｉＢｅａｄ、ｐｌｕｒｉＳｅｌｅｃｔ）。ビーズ／細胞混合物を８〜１０ＲＰＭで１時間室温でロックした。孔径２７ミクロンのフィルタでサンプルを濾過した（ｐｌｕｒｉＳｔｒａｉｎｅｒ、ｐｌｕｒｉＳｅｌｅｃｔ）。フィルタを２回洗浄し、その濾過によって収集した細胞を、白血球特異性マーカーであるＰＴＰＲＣ（別称ＣＤ４５）及び腫瘍細胞特異性マーカーであるアンドロゲン受容体（ＡＲ）に関して、ＲＴ−ＰＣＲによって解析した。非枯渇サンプルの発現レベルから枯渇サンプルの発現レベルを減算することによって（４０−Ｃｔ値）、デルタＣｔ値を算出した。白血球マーカーＰＴＰＲＣに関しての３．１サイクルというデルタＣｔは、非枯渇サンプルと比べて、ビーズ枯渇プロトコルによって白血球のレベルが有意に低下したことを示している。腫瘍細胞特異性マーカーＡＲに関してのわずか０．４サイクルというデルタＣＴは、ビーズ枯渇プロトコルが腫瘍特異性マーカーのレベルにほとんど影響しなかったことを示している。図７に示す結果は、ビーズ枯渇手順に供したサンプルと、供していないサンプルにおける、白血球及び腫瘍細胞マーカーに関するＲＴ−ＰＣＲの結果を示している。ＡＲ＝アンドロゲン受容体、ＰＴＰＲＣ＝タンパク質チロシンホスファターゼ、受容体タイプ、Ｃ。

【0044】

〔実施の態様〕
（１） 濃縮した希少細胞及び白血球を含むサンプルから白血球を除去する方法であって、
（ａ）ハプテンにコンジュゲートされた白血球マーカーで白血球を標識する条件下で、ハプテンにコンジュゲートされたかかる白血球マーカーを用いて、かかるサンプルを処置する工程と、
（ｂ）工程（ａ）の組成物を、かかる標識した白血球に接着する第２の媒体を用いて処置する工程と、工程（ｂ）の組成物から、前記第２の媒体及びその接着した標識された白血球を分離する工程と、を含む、方法。
（２） 前記濃縮した希少細胞が、ＣＴＣ、ＣＥＣ、ＣＭＭＣ、及びＣＭＣからなる群から選択される、実施態様１に記載の方法。
（３） 前記濃縮した希少細胞が、ＣＴＣ及びＣＥＣからなる群から選択される、実施態様１に記載の方法。
（４） 前記濃縮した希少細胞がＣＴＣである、実施態様１に記載の方法。
（５） かかる濃縮した希少細胞を免疫磁性マーカーで標識する、実施態様１に記載の方法。

【0045】

（６） 前記濃縮した希少細胞がＣＴＣである、実施態様５に記載の方法。
（７） 前記白血球マーカーが、ＣＤ４５、ＣＤ１９、ＣＤ１５、グリコフォリンＡ、ＣＤ２、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＥ３８、及びＣＤ６６ｂに対する抗体からなる群から選択される、実施態様１に記載の方法。
（８） 前記白血球マーカーが、抗−ＣＤ４５である、実施態様１に記載の方法。
（９） 前記白血球マーカーが、ＣＤ４５のエピトープを含む抗体フラグメントである、実施態様１に記載の方法。
（１０） 前記ハプチンが、フルオレセイン染料（「ＦＩＴＣ」）、フィコエリトリン（「ＰＥ」）、アロフィコシアニン（「ＡＰＣ」）、及びビオチンからなる群から選択される、実施態様１に記載の方法。

【0046】

（１１） 前記ハプテンがＦＩＴＣである、実施態様１に記載の方法。
（１２） 前記濃縮した希少細胞がＣＴＣであり、前記白血球マーカーが抗−ＣＤ４５であり、前記ハプチンがビオチンである、実施態様１に記載の方法。
（１３） 濃縮した希少細胞及び白血球を含むサンプルから白血球を除去するためのキットであって、ハプテンにコンジュゲートされる白血球マーカーと、前記白血球マーカー以外の第２のマーカーとを含み、前記第２のマーカーは、かかるハプテンに対する抗体を含む、キット。
（１４） 濃縮した希少細胞及び白血球を含むサンプルから白血球を除去するためのキットであって、前記希少細胞及び白血球を免疫磁性法でマーキングするための試薬と、ハプテンにコンジュゲートされる白血球マーカーと、前記白血球マーカー以外の第２のマーカーとを含み、前記第２のマーカーは、かかるハプテンに対する抗体を含む、キット。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】