特許 6563492 間葉系幹細胞を区別する方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6563492

(24)【登録日】2019年8月2日

(45)【発行日】2019年8月21日

(54)【発明の名称】間葉系幹細胞を区別する方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/0775 20100101AFI20190808BHJP

   G01N 33/48 20060101ALI20190808BHJP

   C12Q 1/04 20060101ALI20190808BHJP

   C12Q 1/68 20180101ALI20190808BHJP

【ＦＩ】

   C12N5/0775

   G01N33/48 M

   C12Q1/04

   C12Q1/68

【請求項の数】18

【全頁数】21

(21)【出願番号】特願2017-525390(P2017-525390)

(86)(22)【出願日】2014年12月5日

(65)【公表番号】特表2018-502556(P2018-502556A)

(43)【公表日】2018年2月1日

(86)【国際出願番号】CN2014093109

(87)【国際公開番号】WO2016086403

(87)【国際公開日】20160609

【審査請求日】2017年6月23日

(73)【特許権者】

【識別番号】517156610

【氏名又は名称】メリディジェン・バイオテック・カンパニー・リミテッド

【氏名又は名称原語表記】Ｍｅｒｉｄｉｇｅｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．

(74)【代理人】

【識別番号】100081422

【弁理士】

【氏名又は名称】田中 光雄

(74)【代理人】

【識別番号】100084146

【弁理士】

【氏名又は名称】山崎 宏

(74)【代理人】

【識別番号】100122301

【弁理士】

【氏名又は名称】冨田 憲史

(72)【発明者】

【氏名】シュアン・チャン−ヨウ

(72)【発明者】

【氏名】リウ・ウェイ−ティン

(72)【発明者】

【氏名】シェン・シー−ペイ

(72)【発明者】

【氏名】リン・ユン

(72)【発明者】

【氏名】リ・ユエン−ツン

(72)【発明者】

【氏名】チャン・チア−チー

【審査官】 小林 薫

(56)【参考文献】

【文献】 特開２００４−２９０１８９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００９−０６５８７９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１０−１８９３０２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００７−５２８７０２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２００８／１１１１６１（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１０／１３１３１５（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 Cytotechnology, 2012, Vol.64, p.511-521

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １／００− ７／０８

Ｃ１２Ｑ １／００− ３／００

Ｇ０１Ｎ ３３／４８−３３／９８

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＤＷＰＩ（Ｄｅｒｗｅｎｔ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

繊維芽細胞から間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を区別する方法であって、
繊維芽細胞からＭＳＣを区別するように、ＭＳＣ上で発現されるマーカーＥｐｈＡ２を使用して繊維芽細胞からＭＳＣを単離することを含み、
ＭＳＣおよび繊維芽細胞は胎盤関連組織に由来する細胞の初代培養からである、方法。

【請求項2】

胎盤関連組織が、羊膜、絨毛膜板(chorionic disk)、絨毛膜(chorionic membrane)および臍帯からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

単離する工程が、抗体ベースの、またはヌクレオチドベースの単離方法によって行われる、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

単離した胎盤関連組織からＭＳＣおよび繊維芽細胞を回収すること；
初代培養を調製するために培養培地においてＭＳＣおよび繊維芽細胞を培養すること
の予備段階をさらに含む、請求項１に記載の方法。

【請求項5】

抗体ベースの単離方法が抗体ベースの磁気細胞選別または抗体ベースのフローサイトメトリーである、請求項３に記載の方法。

【請求項6】

ヌクレオチドベースの単離方法がヌクレオチドベースのフローサイトメトリーである、請求項３に記載の方法。

【請求項7】

間葉系幹細胞（ＭＳＣ）集団の純度を増加させる方法であって、
ＭＳＣ上で発現されるマーカーＥｐｈＡ２を使用してＭＳＣを単離および回収すること、ここでＭＳＣは胎盤関連組織に由来する細胞の初代培養からであり；および
ＭＳＣを培養すること
を含む、方法。

【請求項8】

胎盤関連組織が、羊膜、絨毛膜板、絨毛膜および臍帯からなる群から選択される、請求項７に記載の方法。

【請求項9】

単離する工程が、抗体ベースの、またはヌクレオチドベースの単離方法によって行われる、請求項７に記載の方法。

【請求項10】

胎盤関連組織に由来する細胞がＭＳＣのための培養培地において培養される、請求項７に記載の方法。

【請求項11】

ＭＳＣ集団の純度が、単離工程後にＰ０で少なくとも９５％である、請求項７に記載の方法。

【請求項12】

抗体ベースの単離方法が抗体ベースの磁気細胞選別または抗体ベースのフローサイトメトリーである、請求項９に記載の方法。

【請求項13】

ヌクレオチドベースの単離方法がヌクレオチドベースのフローサイトメトリーである、請求項９に記載の方法。

【請求項14】

炎症環境においてより応答性である間葉系幹細胞（ＭＳＣ）集団を単離する方法であって、
ＭＳＣ上で発現されるマーカーＥｐｈＡ２を使用してＭＳＣを単離および回収することを含み、ＭＳＣは胎盤関連組織に由来する細胞の初代培養からであり、ＭＳＣの集団は炎症環境においてより応答性である、方法。

【請求項15】

単離する工程が、抗体ベースの、またはヌクレオチドベースの単離方法によって行われる、請求項１４に記載の方法。

【請求項16】

ＭＳＣ集団が、ＴＮＦ−αシグナル伝達またはＴＮＦ−α−依存性シグナル伝達に対してより応答性である、請求項１４に記載の方法。

【請求項17】

抗体ベースの単離方法が抗体ベースの磁気細胞選別または抗体ベースのフローサイトメトリーである、請求項１５に記載の方法。

【請求項18】

ヌクレオチドベースの単離方法がヌクレオチドベースのフローサイトメトリーである、請求項１５に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本願発明は、胎盤関連組織に由来する細胞の初代培養において間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を区別する方法に関する。本願発明はまた、胎盤関連組織に由来する細胞の初代培養においてＭＳＣ集団の純度を増加させる方法に関する。他の局面において、本願発明は、炎症環境においてより応答性であるＭＳＣ集団を単離する方法に関する。

【背景技術】

【0002】

間葉系幹または間質細胞（ＭＳＣ）は、繊維芽細胞様形態を有する胚性中胚葉起源の多分化能細胞である。これらの細胞は、刺激および培養条件に依存して、他の細胞型の中で特に脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞、神経系細胞および筋細胞に分化することができる。ｈＭＳＣの可塑性および組織修復および再生におけるｈＭＳＣの役割が広範に研究されているが、最近興味を集めたのはｈＭＳＣの免疫学的栄養特性である［５０−５１］。ヒト間葉系幹細胞は種々の組織から単離されている。ＭＳＣの最も頻繁に使用される供給源は骨髄（ＢＭ）である。しかしながら、単離手順は極めて侵襲的である。侵襲的単離手順を回避するために、ヒト臍帯および胎盤のような組織は、通常は分娩後に廃棄されるため、良い候補物と考えられている。臍帯または胎盤からのｈＭＳＣの単離は、以前の研究によって効率的であることが証明されている［４９］。

【0003】

ＭＳＣは、間葉組織に含まれる間質細胞のより複雑な細胞組成の亜集団である。不均一な性質および間葉系幹細胞に特異的な既知のバイオマーカーの非存在によって、ＭＳＣ表現型および特性を定義することは困難な課題である［５２−５４］。ＭＳＣの機能に関与する分子成分、特に細胞膜上の分子成分は、ほとんど知られていないままである。加えて、特異的細胞表面マーカーの欠如は、逆に間葉組織に豊富に存在する他の細胞型、特に成熟間質細胞、例えば繊維芽細胞での潜在的な汚染リスクを細胞培養に与える［５２−５４］。胎盤由来組織からのＭＳＣの単離処理において、繊維芽細胞、胎盤由来上皮細胞および胎盤由来細網細胞を含む非ＭＳＣは、しばしばインビトロ培養中にＭＳＣと共存する。特に、繊維芽細胞は主な汚染源である。

【0004】

繊維芽細胞は、結合組織において特に豊富に存在する成熟間葉細胞であると考えられている。したがって、これらの細胞は、多くの細胞培養系に存在する最も頻繁な汚染細胞表現型である。培養物から繊維芽細胞を成功裏に除去する技術を適用することは困難であるだけでなく、同じ培養物中でＭＳＣと繊維芽細胞とを区別することも特に複雑である。繊維芽細胞およびＭＳＣは、非常に類似した形態学的外観を有する。これらは両方ともよく増殖し、多くの同一の細胞表面マーカーを共有する［５５、５６］。ＭＳＣは、現在、国際細胞治療学会（ＩＳＣＴ）によって、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５を発現し、造血マーカーＣＤ１４、ＣＤ３４およびＣＤ４５に対して陰性である、プラスチック接着性の多分化能繊維芽細胞様細胞として定義されている。しかしながら、これらの特性およびマーカーはまた、線維芽細胞によって共有される。したがって、ＩＳＣＴによって提案される現在の定義は、ＭＳＣを一般的な繊維芽細胞と区別することができない。現在まで、繊維芽細胞からＭＳＣを区別する最良の方法は、これらの２種類の細胞の機能特性の分析に基づいている。ＭＳＣは多分化能性幹細胞性および免疫調節能を保持しているが、繊維芽細胞はこれらの機能特性の両方においてより制限されているようである。

【0005】

ＭＳＣの同定におけるＦｒｉｅｄｅｎｓｔｅｉｎの先駆的研究以来［４８］、エキソビボで繊維芽細胞から培養拡張されたＭＳＣを一貫して明確に区別する培養由来の方法論、形態および遺伝子発現の特徴において明確な違いはない［５７−６０］。現在、繊維芽細胞からＭＳＣを分離するための許容される基準または単一の細胞表面マーカーは存在しない。繊維芽細胞が胎盤由来のときのＭＳＣ培養において一般的な汚染細胞集団であるという事実によって、繊維芽細胞からＭＳＣを区別するためのバイオマーカーとしての新規の表面タンパク質は、胎盤由来ＭＳＣの初代培養の均質性を保証するために重要である。

【0006】

ヒトエリスロポエチン産生肝細胞（Ｅｐｈ）受容体は、受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）の最大ファミリーを含む膜貫通タンパク質を含む。Ｅｐｈ受容体の最初の同定された機能は、軸索誘導における複雑で洗練されたメカニズムにおける役割であった［４］。Ｅｐｈ受容体は現在、胚発生中の細胞の位置決定および組織パターン形成に関与する広範囲の細胞間伝達事象および癌および血管合併症などの病理学的状態を制御することが知られている［１−５］。加えて、これらの受容体は、シナプス可塑性、インスリン分泌、骨再形成、上皮性ホメオスタシスならびに炎症および免疫応答における特殊な細胞機能の重要な調節因子である［１，２，６］。それらは、ニューロン、血管細胞、上皮細胞、炎症細胞、免疫細胞、および癌幹細胞を含む腫瘍細胞のような多種多様な細胞型によって発現される［７−１０］。

【0007】

ＥｐｈＡ２遺伝子は、タンパク質チロシンキナーゼファミリーのＥｐｈ受容体サブファミリーに属する。以前の研究は、特に神経系における発生事象の介在におけるＥｐｈＡ２の機能に関係している［４］。発生中、ＥｐｈＡ２は、パターン形成の特徴的な局面において、および後に、脈管形成、神経管発生、軸索中胚葉形成、早期後脳発生、ニューロン分化、細胞遊走の制御、破骨細胞形成および骨芽細胞形成の制御による骨再形成、乳腺上皮細胞増殖および乳腺発生中の分岐形態形成を含むいくつかの胎児組織の発生において機能する［１１］。特に、神経系の胚発生におけるＥｐｈＡ２の役割は、よく定義されており［１２］、ニューロンが正しい標的に到達するために軸索を送るプロセスを含む。

【0008】

Ｅｐｈ受容体の役割は、胚発生中および成体幹細胞ニッチ中の両方において、最近になってようやく幹細胞生物学に関与している。Ｅｐｈ受容体は、ほとんどの成体幹細胞ニッチにおいて発現されている。幹細胞は、特殊な組織位置内の幹細胞プールの自己複製および分化を調整する細胞および微小環境の決定因子の組合せとして定義される、特殊な微小環境であるニッチに位置している。胚形成および組織ホメオスタシス間のＥｐｈ受容体およびエフリンリガンドの発現は、発生中の幹細胞制御における、および成人組織ホメオスタシスにおける関与と一致する［１３、１５］。Ｅｐｈ／エフリン系が幹細胞休止、自己複製および分化間のバランスにおいて時空間調節機能を実行することが示唆されている［１４］。しかしながら、幹細胞ニッチ維持におけるＥｐｈのメカニズムおよび幹細胞の調節における役割は十分に理解されていない。ＥｐｈＡ２は、胚幹細胞において高度に発現される［１６］。それにもかかわらず、大多数の幹細胞におけるＥｐｈＡ２機能試験は、神経系に焦点を当てている。ＥｐｈＡ２は、ニューロンおよびグリア系統の前駆体を含むＣＮＳにおいて高度に発現される［１２、１５］。最近の試験は、エフリン−Ａ１がＥｐｈＡ２陽性心臓幹細胞の運動性を促進し、心筋梗塞後の再生および心機能の増強を引き起こす証拠を提供する［１７］。これらの知見に加えて、幹細胞科学におけるＥｐｈＡ２の発現プロフィールおよび機能はまだ十分に決定されていない。

【0009】

Ｅｐｈ受容体およびエフリンリガンドは、幹細胞／前駆細胞の自己複製および腫瘍進行の両方を調節する［１４］。未形質転換幹細胞／前駆細胞と癌細胞との間の高度の類似性も認められている。近年、癌細胞集団の２５％までを占める「癌幹細胞」区画を有する多数の癌の概念が記載されている［１４］。これらの細胞は、動物宿主で腫瘍を誘導し、自己複製し、腫瘍細胞量の増殖においてより分化した細胞を引き起こす能力について、腫瘍増殖細胞（ＴＰＣ）として定義されている［１４］。最近、Ｅｐｈ／エフリンシグナルは、癌細胞脱分化および幹様特性の制御に関連していた［９、１８、１９］。しかしながら、癌幹細胞は、関連分野において一般的に言及されるように、実際には（多分化能）「幹細胞」ではないことに留意されたい。

【0010】

特定のエフリンリガンドの下方制御と結びついたＥｐｈの過剰発現は、いくつかの癌で報告されており、腫瘍の攻撃性および高いグレードと関連している［１９−２２］。乳癌、卵巣癌および肺癌において、ならびに神経膠腫および黒色腫においてＥｐｈＡ２発現が上昇し、高レベルのＥｐｈＡ２は患者の生存率の低下と相関する、高レベルのＥｐｈＡ２は低い患者生存率と相関する［２０、２３−２９］。しかしながら、癌細胞におけるＥｐｈ受容体の役割および発現は完全に文脈依存である。逆の発現パターンも乳癌、結腸直腸癌および急性リンパ芽球性白血病を含むいくつかの腫瘍において観察され、エピジェネティックサイレンシングまたは突然変異による低いＥｐｈ受容体発現が予後不良と相関する［３０］。ヒト副腎皮質癌腫、腺腫および健常副腎皮質組織のアレイによる転写プロファイリングの研究において、ＥｐｈＡ２発現は健常副腎皮質組織と比較したとき、ヒト副腎皮質腫瘍組織において下方制御された［３１］。したがって、特定のＥｐｈおよびエフリンの発現パターンは多くの腫瘍形成症例において予後マーカーとして役割を果たすことができるが、相当量の研究報告における逆転現象もまた観察された。Ｅｐｈ／エフリンの発現は、非常に細胞／腫瘍−文脈特異的および文脈依存である。

【0011】

グリア芽腫（ＧＢＭ）に関する最近の研究は、ＴＰＣの大きな亜集団を有する腫瘍が、ＥｐｈＡ２およびＥｐｈＡ３の増加した発現を示すことを示した。ＥｐｈＡ２受容体は、ヒトグリア芽腫癌幹細胞（ＣＳＣ）において過剰発現され、ＥｐｈＡ２発現は、この特定のタイプの腫瘍におけるＣＳＣのサイズおよび腫瘍開始能力と正の相関がある［９］。これらのＥｐｈ受容体は中枢神経系の発生を調節するが、それらの脱調節された発現および体細胞突然変異は、神経系腫瘍の成長、進行および転移と関連する［３２−３６］。

【0012】

他方では、ＧＢＭ、結腸直腸癌、乳癌、前立腺癌および皮膚癌における腫瘍抑制効果を有するＥｐｈＡシグナル伝達のリガンド依存性活性化も報告された［２７、３８−４３］。実質的なＧＢＭ研究において、エフリンＡ１によるＥｐｈＡ２キナーゼの活性化は、恐らくＥｐｈＡ２およびＦＡＫ活性の下方制御を介して抗増殖効果を有することが報告された［２７、３８、４４］。ＥｐｈＡ２ノックアウトマウスは、腫瘍細胞増殖およびＥＲＫリン酸化の増加を示す［４５］。ＥｐｈＡ２のリガンド刺激はまた、ＥＧＦ介在ＥＲＫリン酸化を減弱させ、細胞増殖および遊走の減少と相関する［４６、４７］。概して、興味深いことに、これらの知見は、腫瘍増殖抑制および浸潤抑制ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１シグナル伝達を支持する。エフリン−Ｅｐｈ相互作用の結果は、異なる文脈において顕著に異なる。

【0013】

２０１２年のＶｅｓｃｏｖｉグループにより公開された論文［９］は、（１）ｈＧＢＭにおける幹様腫瘍増殖細胞（ＴＰＣ）がＥｐｈＡ２受容体を高度に発現すること、（２）高いＥｐｈＡ２発現がＴＰＣにおける未分化状態および自己複製を支えることを、（３）ＴＰＣ含有物および発癌性がＥｐｈＡ２^［低い］ｈＧＢＭ細胞よりもＥｐｈＡ２^［高い］ｈＧＢＭ細胞において高いことを証明する。上記の観察された事実にもかかわらず、ＥｐｈＡ２^［低い］ｈＧＢＭは依然として有意な腫瘍開始能力を有する。異なる腫瘍または異なるタイプの細胞はもちろんｈＧＢＭにおいてさえ、ＥｐｈＡ２が真のＴＰＣマーカーを示すかどうかは議論の余地がある。言い換えれば、当業者は、ＥｐｈＡ２がＴＰＣに対する特異的なユニバーサルマーカーであること、ましてや多分化能幹細胞に対する特異的なユニバーサルマーカーであることを認識していなかったであろう。同じグループはまた、幹細胞、好ましくは哺乳動物幹細胞、さらに好ましくはヒトまたはマウス幹細胞の同定および単離のための細胞表面マーカーとしてのＥｐｈＡ２の使用を主張する特許出願を出願した［３７、ＥＰ ２７３３２０６ Ａ１］。しかしながら、Ｖｅｓｃｏｖｉの研究が完全にヒトグリア芽腫（ｈＧＢＭ）に焦点を当てているだけであること、およびＥｐｈＡ２^［低い］ｈＧＢＭが依然として有意な腫瘍開始能力を有するという事実を考慮すると、当業者は、ＥｐｈＡ２が多分化能幹細胞を同定することにおいて適した特異的なマーカーであることを全く認識していなかったであろう。さらに、Ｖｅｓｃｏｖｉは、胎盤関連組織に由来する細胞の初代培養において多分化能幹細胞をどのように区別するかについて記載していない。

【発明の概要】

【0014】

特定の表面マーカーＥｐｈＡ２の発現レベルに基づいて、胎盤関連組織に由来する細胞の初代培養において、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を区別し得ることを本願発明において予想外に見出された。

【0015】

したがって、１つの局面において、本願発明は、胎盤関連組織に由来する細胞の初代培養においてＭＳＣを区別する方法であって、ＥｐｈＡ２の表面マーカーによって細胞を選別することを含む、方法を特徴とする。

【0016】

他の局面において、本願発明は、胎盤関連組織に由来する細胞の初代培養においてＭＳＣ集団の純度を増加させる方法であって、ＥｐｈＡ２の表面マーカーによって細胞を選別することを含む、方法を提供する。

【0017】

さらなる局面において、本願発明は、炎症環境においてより応答性であるＭＳＣ集団を単離する方法であって、ＥｐｈＡ２の表面マーカーによって細胞を選別することを含む、方法を提供する。

【0018】

本願発明の方法は、繊維芽細胞、胎盤由来上皮細胞、胎盤由来細網細胞、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される細胞集団からＭＳＣを区別するために使用され得る。

【0019】

本願発明の好ましい態様において、該方法は繊維芽細胞からＭＳＣを区別するために使用される。

【0020】

本願発明によると、胎盤関連組織は、羊膜、絨毛膜板(chorionic disk)、絨毛膜(chorionic membrane)および臍帯からなる群から選択され得る。

【0021】

本願発明によると、選別工程は、当分野で公知の技術または開発される技術、例えば、抗体ベースの、またはヌクレオチドベースの単離方法を使用して実施され得る。

【0022】

本願発明の１つの態様において、胎盤関連組織に由来する細胞はＭＳＣのための培養培地において培養される。

【0023】

特定の態様によると、単離されたＭＳＣ集団は、ＴＮＦ−αシグナル伝達またはＴＮＦ−α−依存性シグナル伝達に対してより応答性である。

【0024】

前述の概要および以下の詳細な説明の両方が例示的および説明的なものに過ぎず、本願発明を限定するものではないことを理解すべきである。

【0025】

前述の概要ならびに以下の発明の詳細な説明は、添付の図面と共に読むとき、さらによく理解される。本願発明を説明する目的のために、現在好ましい態様が図面に示されている。

【0026】

図面において

【図面の簡単な説明】

【0027】

【図1】図１はＥｐｈＡ２転写産物のリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応定量を示す。胎盤由来ＭＳＣにおけるＥｐｈＡ２の転写産物レベルを、繊維芽細胞におけるＥｐｈＡ２の発現と比較しての豊富倍数によって、すなわちＭＳＣにおけるＥｐｈＡ２ｍＲＮＡレベル 対 繊維芽細胞におけるＥｐｈＡ２レベルの比（ＭＳＣ／繊維芽細胞）によって評価した。ＭＳＣにおけるＥｐｈＡ２の転写産物レベルは、ドナー＃１２、＃１７、＃２１および＃２８からのサンプルによって証明された。結果は、ＥｐｈＡ２がインビトロで繊維芽細胞と比較してＭＳＣにおいて高度に豊富であったことを示した。Ｄ＝ドナー。ＡＭ＝羊膜；ＣＤ＝絨毛膜板；ＣＭ＝絨毛膜；およびＵＣ＝臍帯。ＢＳ＝ウシ胎児血清。Ｐ１＝継代１。Ｐ３＝継代３。

【0028】

【図2】図２はＭＳＣおよび繊維芽細胞の混合集団のフローサイトメトリー分析の結果を示す。ドナー＃２３からの臍帯（ＵＣ）由来のＭＳＣを異なる比率で繊維芽細胞と混合した。結果は、フローサイトメトリーにより検出したＥｐｈＡ２^＋集団のパーセントが増加した繊維芽細胞集団に応答して比例的に減少したことを証明した。ＦＢ＝繊維芽細胞。

【0029】

【図3】図３は、ｑＰＣＲによって評価されたＥｐｈＡ２ ＲＮＡレベルを示す。異なる個々の細胞集団における全ＲＮＡ発現レベルを、内因性ＧＡＰＤＨ発現レベルによって標準化した。「スクランブル」は、ｓｈＲＮＡノックダウン実験におけるスクランブルコントロールとして示した。正常な野生型ＵＣ由来のＭＳＣにおけるＥｐｈＡ２転写産物発現レベルと比較することによって、ｑＲＴ−ＰＣＲ結果はｓｈ−ＥｐｈＡ２ノックダウン効率を確認した。Ｄ＝ドナー。ＵＣ＝臍帯。

【0030】

【図4】図４Ａおよび図４Ｂは、トランズウェル遊走アッセイおよび細胞生存能力検出の結果を示す。図４Ａにおいて、生存可能である遊走細胞は、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）発光シグナル強度として示される。図４Ｂにおいて、生存可能である遊走細胞は、０．２％ ＦＢＳコントロールにおける野生型ＭＳＣと比較しての相対的な比率として示される。

【発明を実施するための形態】

【0031】

本願発明は、表面マーカーＥｐｈＡ２による細胞選別を介して、胎盤関連組織に由来する細胞の初代培養において間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を区別することができるという予期し得ない知見に基づく。

【0032】

１つの局面において、本願発明は、胎盤関連組織に由来する細胞の初代培養においてＭＳＣを区別する方法であって、ＥｐｈＡ２の表面マーカーによって細胞を選別することを含む、方法を提供する。

【0033】

他の局面において、本願発明は、胎盤関連組織に由来する細胞の初代培養においてＭＳＣ集団の純度を増加させる方法であって、ＥｐｈＡ２の表面マーカーによって細胞を選別することを含む、方法を特徴とする。

【0034】

ＥｐｈＡ２選別されたＭＳＣが選別されていないＭＳＣまたはＭＳＣのような細胞と比較して炎症環境において優れた応答性を示すことも証明される。したがって、さらなる局面において、本願発明は、炎症環境または微小環境においてより応答性であるＭＳＣ集団を単離する方法であって、ＥｐｈＡ２の表面マーカーによって細胞を選別することを含む、方法を提供する。本願発明の１つの態様において、単離されたＭＳＣ集団は、ＴＮＦ−αシグナル伝達またはＴＮＦ−α−依存性シグナル伝達に対してより応答性である。

【0035】

ＭＳＣは、種々のサイトカインによる活性化に続くＴ細胞応答およびＢ細胞応答を抑制することによって、免疫抑制機能を示す。サイトカインはまた、ＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γの作用による急性炎症環境の存在下で炎症誘発効果を発揮するように誘導され得る。リウマチ性関節炎のような炎症性関節疾患において、骨髄におけるＭＳＣはＴＮＦ−α−依存性メカニズムによって関節へ遊走し、疾患プロセスに部分的に関与し得る。ＭＳＣはまた、骨関節症の関節周囲組織において増加した数で示されており、これは関節修復または再生の試みを反映し得る［６］。炎症環境において放出されるＴＮＦ−αは、ＭＳＣのＴＮＦ−Ｒ１に結合しＭＳＣにおけるＮＦ−κＢ経路を活性化することによって、ＭＳＣに免疫抑制特性を与え、免疫調節における役割を果たすＭＳＣをもたらすことが提案されている［６２］。

【0036】

本願発明によると、細胞は、当分野で知られているプロトコール、例えばＦｕｋｕｃｈｉ ｅｔ ａｌのもの、にしたがって、胎盤関連組織から新たに由来、取得または回収される。特定の好ましい態様において、次に、胎盤関連組織に由来する細胞はＭＳＣのための培養培地において培養される。ＭＳＣのための標準培地は、最少必須培地イーグル(Minimum Essential Medium Eagle)（様々なタイプの修飾を有する）、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）および塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を含む［４９、６４−６８］。

【0037】

本願発明によると、方法は、繊維芽細胞、胎盤由来上皮細胞、胎盤由来細網細胞、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される細胞集団からＭＳＣを区別するために使用され得る。好ましくは、本願発明の方法は、胎盤関連組織に由来する細胞の初代培養において繊維芽細胞からＭＳＣを区別するために使用される。

【0038】

胎盤関連組織は、羊膜、絨毛膜板、絨毛膜および臍帯からなる群から選択され得る。

【0039】

本願発明の方法の実施において、胎盤関連組織に由来する細胞の初代培養の培養物は、ＥｐｈＡ２による細胞選別に付される。細胞選別は、当分野で公知の技術または開発される技術、例えば、抗体ベースの、またはヌクレオチドベースの単離方法によって行われ得る。好ましくは、細胞選別は、抗体ベースの磁気細胞選別により行われる。例えば、ＭＡＣＳ方法（ＭＡＣＳ^{（登録商標）} Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）。加えて、細胞選別は、フローサイトメトリー方法、例えば抗体ベースの、またはヌクレオチドベースのフローサイトメトリーを介して行われ得る。

【0040】

本願明細書において使用される「より応答性」なる用語は、ＴＮＦ−αシグナル伝達またはＴＮＦ−α−依存性シグナル伝達を含むが、これらに限定されない炎症関連シグナル伝達経路に応答するＭＳＣの細胞挙動（例えば移動）を指す。

【0041】

本願発明は、限定よりはむしろ証明の目的のために提供される以下の実施例によってさらに説明される。

【0042】

実施例

【実施例1】

【0043】

実施例１：胎盤由来間葉系幹細胞（ＭＳＣ）および繊維芽細胞の免疫表現型の特性化

【0044】

ドナーから書面によるインフォームドコンセントを得た後、満期胎盤（ｎ＝８）を回収した。ＭＳＣは、羊膜（ＡＭ）、絨毛膜板（ＣＤ）、絨毛膜（ＣＭ）および臍帯（ＵＣ）由来であった。胎盤由来細胞をＦＢＳおよび塩基性ＦＧＦを有するα−ＭＥＭ中、３７℃、飽和湿度および５％ ＣＯ_２で培養し、増殖し、維持し、細胞が８０％コンフルエンスに達したとき継代培養し、後にフローサイトメトリーにより表現型で特徴付けた。フローサイトメトリーの対象を免疫染色する過程において、製造業者の指示にしたがって細胞を抗体とインキュベートした。対応するクラスの非特異的ＩｇＧは陰性コントロールとして働いた。細胞懸濁液を、Ｆｌｏｗｊｏ ７．６．１ ソフトウェアにてフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＦＡＣＳＣａｎｔｏ ＩＩ）で分析した。

【0045】

本願発明者らは、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１９、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＨＬＡ−ＤＲおよびＥｐｈＡ２の発現を評価した。胎盤の種々の位置から単離された全てのＭＳＣのフローサイトメトリー分析は、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＥｐｈＡ２について陽性であり、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１９、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＨＬＡ−ＤＲについて陰性であった。繊維芽細胞（Ｈｕｍａｎ Ｆｏｒｅｓｋｉｎ Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ、ｎｅｏｎａｔａｌ、ＰＣ５０１Ａ−ＨＦＦ、ＳＢＩ）のフローサイトメトリー分析は、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５について陽性であり、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１９、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＨＬＡ−ＤＲについて陰性であり、ＥｐｈＡ２について陰性または低かった。胎盤由来ＭＳＣおよび繊維芽細胞間で別個のパターンは、ＥｐｈＡ２について注目された。ＭＳＣはＥｐｈＡ２陽性細胞の高いパーセントを示したが、繊維芽細胞は反対を示した。結果は以下の表１に示される。

【0046】

表１：胎盤由来間葉系幹細胞および繊維芽細胞の免疫表現型（フローサイトメトリーにおける陽性細胞のパーセント）

【表1】

ＡＭ＝羊膜；ＣＤ＝絨毛膜板；ＣＭ＝絨毛膜；およびＵＣ＝臍帯。陰性カクテルは、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１９、ＣＤ３４、ＣＤ４５およびＨＬＡ−ＤＲに対する抗体を含む（Human MSC Analysis Kit, BD Stemflow^ＴＭ, catalog number 562245）。胎盤由来間葉系幹細胞の免疫表現型は、Ｐ０でドナー＃１２およびドナー＃１７からのサンプルによって証明された。フローサイトメトリー分析は、ＭＳＣ集団がＰ０で９９．３〜９９．７％ ＣＤ７３陽性、７７．８〜９９．８％ ＣＤ９０陽性、７５．９〜９８．０％ ＣＤ１０５陽性および４５．０〜８０．７％ ＥｐｈＡ２であったことを示した。対照的に、造血細胞系−特異的マーカー、例えばＣＤ１１ｂ、ＣＤ１９、ＣＤ３４、ＣＤ４５およびＨＬＡ−ＤＲは、ＭＳＣにおいて発現されなかった。繊維芽細胞のフローサイトメトリー分析は、集団が９９．３％ ＣＤ７３陽性、９７．７％ ＣＤ９０陽性、７５．６％ ＣＤ１０５陽性および１８．６％ ＥｐｈＡ２陽性であったことを示した。造血細胞系特異的マーカー、例えばＣＤ１１ｂ、ＣＤ１９、ＣＤ３４、ＣＤ４５およびＨＬＡ−ＤＲは、繊維芽細胞において発現されなかった。

【実施例2】

【0047】

実施例２：ＥｐｈＡ２選別された胎盤由来間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の免疫表現型の特性化

【0048】

ａ．磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）によって選別されるＥｐｈＡ２豊富ＭＳＣのフローサイトメトリー分析

【0049】

ＭＡＣＳ方法（MACS^{(登録商標)} Technology, Miltenyi Biotec）は、ＥｐｈＡ２表面抗原に対する抗体でコーティングした磁気ナノ粒子とインキュベートすることにより細胞を分離させる。胎盤に由来するＭＳＣの初代培養物を、ＥｐｈＡ２に対する蛍光コンジュゲート抗ヒト抗体とインキュベートし、製造業者の指示にしたがってＲ−フィコエリトリン（ＰＥ）磁性粒子により選別した。Ｐ０でＭＡＣＳ選別ＭＳＣのフローサイトメトリー分析は、継代０のため、細胞集団が１００％ ＣＤ７３陽性、９７．２〜９９．５％ ＣＤ９０陽性、９６．０〜９９．９％ ＣＤ１０５陽性および９６．６〜１００％ ＥｐｈＡ２陽性発現において均質となり得ることを示し（以下の表２参照）、抗体コンジュゲート電磁ビーズを介するＥｐｈＡ２選別は、Ｐ０からＭＳＣ純度を劇的に改善することができることを証明した。豊富なＥｐｈＡ２陽性ＭＳＣ集団は、後の継代までインビトロでの拡張において十分に維持された（以下の表３参照）。

【0050】

表２：Ｐ０でＥｐｈＡ２選別された胎盤由来ＭＳＣの免疫表現型の特性化（フローサイトメトリーにおける陽性細胞のパーセント）

【表2】

ＥｐｈＡ２選別されたＭＳＣの免疫表現型の特性化は、Ｐ０でドナー＃１７からの絨毛膜板（ＣＤ）に由来するＭＳＣによって証明された。結果は、ＥｐｈＡ２陽性細胞はまたＣＤ７３陽性、ＣＤ９０陽性およびＣＤ１０５陽性であったことを示した。Ｄ＝ドナー。Ｐ＝継代。

【0051】

表３：インビトロでの拡張中のＥｐｈＡ２−ＭＡＣＳ豊富集団の免疫表現型の特性化（フローサイトメトリーにおける陽性細胞のパーセント）

【表3】

後の拡張におけるＥｐｈＡ２選別されたＭＳＣの免疫表現型の特性化。免疫表現型は、ドナー＃１７からの絨毛膜板（ＣＤ）に由来するＭＳＣによって証明された。ＭＳＣは、Ｐ０でＥｐｈＡ２−抗体−コンジュゲートされた電磁ビーズによって選別され、インビトロでの拡張中の後の継代での最適化されたＭＳＣ培養条件下で維持された。結果は、細胞表面マーカーＥｐｈＡ２の発現が、最適化されたＭＳＣ培養条件下で後の継代において十分に維持され得ることを示した。

【0052】

ｂ．フローサイトメトリー細胞選別機（ＦＣＣＳ）によって選別されるＥｐｈＡ２豊富ＭＳＣのフローサイトメトリー分析

【0053】

胎盤に由来する細胞を収集し、Ｐ０でＪＡＺＺ細胞選別機（ＢＤ、ＵＳＡ）を介して抗ＥｐｈＡ２抗体によって選別された。ＥｐｈＡ２選別されたＭＳＣのフローサイトメトリー分析は、継代２〜６において９９．５〜１００％ ＣＤ７３＆ＣＤ９０二重陽性、９９．６〜１００％ ＣＤ１０５＆ＣＤ９０二重陽性、９９．５〜１００％ ＥｐｈＡ２＆ＣＤ９０二重陽性、９９．８〜１００％ ＣＤ７３＆ＥｐｈＡ２二重陽性、９９．５〜１００％ ＣＤ１０５＆ＥｐｈＡ２二重陽性および９９．７〜１００％ ＣＤ７３＆ＣＤ１０５二重陽性集団があったことを示した（以下の表４参照）。データは、ＥｐｈＡ２タンパク質が後の継代でＭＳＣ培養物において連続的に発現され、維持され得ることを示した。

【0054】

表４：インビトロでの拡張中のＥｐｈＡ２−ＦＣＣＳ豊富集団の免疫表現型の特性化

【表4】

後の拡張におけるＥｐｈＡ２豊富ＭＳＣの免疫表現型の特性化。免疫表現型は、ドナー＃７からの臍帯（ＵＣ）に由来するＭＳＣによって証明された。ＭＳＣは、Ｐ０で細胞選別機を介して抗ＥｐｈＡ２抗体によって選別され、インビトロでの拡張中の後の継代での最適化されたＭＳＣ培養条件下で維持された。細胞表面マーカーＥｐｈＡ２の発現は、後の継代において良く保存され得る。

【実施例3】

【0055】

実施例３：胎盤由来間葉系幹細胞（ＭＳＣ）および繊維芽細胞におけるＥｐｈＡ２転写産物の定量リアルタイムＰＣＲ評価

【0056】

胎盤由来細胞（ｎ＝８、胎盤の４つの異なる部分ＡＭ、ＣＤ、ＣＭ、ＵＣから、継代１および継代３を含む）およびＨｕｍａｎ Ｆｏｒｅｓｋｉｎ Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ（neonatal, PC501A-HFF, SBI）の６４集団からの全ＲＮＡを、Ｄｉｒｅｃｔ−ｚｏｌ ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Zymo Research Corporation, CA, USA）を使用して単離した。相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｒ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Roche, Basel, Switzerland）で合成した。次に、定量ＲＴ−ＰＣＲを、製造業者の指示にしたがってＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０ ＩＩ（Roche, Basel, Switzerland)を用いるＲｏｃｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰｒｏｂｅＬｉｂｒａｒｙ Ｓｙｓｔｅｍを使用して行った。

【0057】

本願発明者らは、胎盤由来多分化能ＭＳＣおよび繊維芽細胞を比較するために、定量リアルタイムＰＣＲによってＥｐｈＡ２の発現を評価した。遺伝子発現は、様々な細胞集団において、内因性遺伝子のグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ発現に対して標準化した。ＭＳＣにおけるＥｐｈＡ２転写産物の発現は、繊維芽細胞におけるＥｐｈＡ２の発現と比較しての豊富倍数により計算された。結果は、ＥｐｈＡ２が繊維芽細胞と比較してＭＳＣにおいて高度に発現されたことを示した（図１）。

【実施例4】

【0058】

実施例４：ＭＳＣおよび繊維芽細胞の混合集団のフローサイトメトリー分析

【0059】

ＥｐｈＡ２が胎盤由来ＭＳＣを繊維芽細胞から分離するためのバイオマーカーとして役割を果たすことができることを証明するために、ドナー＃２３からの臍帯（ＵＣ）に由来するＭＳＣを、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆチューブ中に繊維芽細胞と以下の比率によって混合した（細胞数において、ＭＳＣ：繊維芽細胞）：２ｘ１０^５：０、２ｘ１０^５：２ｘ１０^４、２ｘ１０^５：４ｘ１０^４、２ｘ１０^５：２ｘ１０^５、２ｘ１０^５：１ｘ１０^６、２ｘ１０^５：２ｘ１０^６および０：２ｘ１０^５。次に、各Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆチューブ中のＥｐｈＡ２^＋集団をフローサイトメトリーにより分析した。図２に示される結果は、フローサイトメトリーを介して抗ＥｐｈＡ２抗体により検出されたＥｐｈＡ２^＋集団のパーセントは、繊維芽細胞集団の増加に応じて比例的に減少されたことを証明した。

【実施例5】

【0060】

実施例５：レンチウイルスの形質導入によるＥｐｈＡ２ノックダウン

【0061】

単離されたＭＳＣ集団においてＥｐｈＡ２の機能を評価するために、レンチウイルスの形質導入によるｓｈＲＮＡ（ｓｈＥｐｈＡ２）ノックダウン実験を行った。各構築物は、形質導入効率をモニタリングするためにＥＧＦＰレポーターを有する。４つの異なるｓｈＲＮＡ配列をそれぞれ３つの異なる感染多重度（ＭＯＩ）（２、５、１０）で試験し、各実験条件をトリプリケートで行った。ノックダウン効率はｑＲＴ−ＰＣＲによって評価された。結果は図３に示される。５０％ノックダウンの最も良いノックダウン効率をなし遂げることができた。

【実施例6】

【0062】

実施例６：

【0063】

この試験において、本願発明者らは、インビトロで、ＴＮＦ−αシグナルのような、炎症性刺激に応答してのＭＳＣにおけるＥｐｈＡ２の役割を調べた。本願発明者らは、炎症中のＭＳＣ遊走に関与するＥｐｈＡ２の効果に焦点を当てた［５１、６３］。基礎培養条件下またはＴＮＦ−α炎症性刺激の存在下でのＥｐｈＡ２^高いＭＳＣおよびＥｐｈＡ２^低いＭＳＣの遊走を調べた。

【0064】

ａ．ＥｐｈＡ２ノックダウンＭＳＣのトランズウェル遊走分析

【0065】

野生型ｓｈ−スクランブルおよびｓｈ−ＥｐｈＡ２標的ＭＳＣを、８μｍトランズウェル中、３０，０００細胞の条件で培養した。０．２％ＦＢＳおよびＴＮＦ−αを、ＭＳＣ遊走を活性化するために、より少ない(lower)チャンバーにおいて加えた。６時間後、生存可能である遊走細胞を、製造業者の指示にしたがってＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）発光試薬を介して分析した。結果は図４Ａおよび４Ｂに示される。データは、ｓｈ−ＥｐｈＡ２ ＭＳＣのＴＮＦ−αシグナルに応答する能力および遊走がＥｐｈＡ２ノックダウンによって支障を来たしたことを示した。

【0066】

ｂ．ＥｐｈＡ２高い ＭＳＣのトランズウェル遊走分析

【0067】

胎盤に由来する細胞の初代培養物を、ＥｐｈＡ２に対する抗ヒト抗体によってコンジュゲートされた電磁ビーズとインキュベートし、次に製造業者の指示にしたがって陽性選択によって選別した。フローサイトメトリー分析は、ＭＡＣＳ選別後にＥｐｈＡ２^＋ ＭＳＣおよびＥｐｈＡ２⁻細胞集団を確認した。細胞を、８μｍトランズウェル中、３０，０００細胞の条件で培養した。０．２％ＦＢＳおよびＴＮＦ−αを、ＭＳＣ遊走を活性化するために、より少ないチャンバーにおいて加えた。６時間後、生存可能である遊走細胞を、製造業者のマニュアルにしたがってＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）発光試薬を介して分析した。データは、ＭＳＣのＴＮＦ−αシグナルに応答する能力および遊走がＥｐｈＡ２飽和集団において増強されたことを示した。

【0068】

図４Ａおよび４Ｂに示されるとおり、ＭＳＣの遊走は、基礎培地へのＴＮＦ−αの添加によって有意に影響を受けた。ＴＮＦ−αでのＭＳＣの刺激後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）発光試薬を介して検出されたＭＳＣの遊走は、ＴＮＦ−α用量依存的において増加された（図４Ａ参照）。対照的に、細胞の移動は、ＥｐｈＡ２−ノックダウンＭＳＣ集団において、または選別によるＥｐｈＡ２⁻細胞において破壊された。ＴＮＦ−αシグナルに応答してのＭＳＣの遊走におけるＥｐｈＡ２分子の効果は、発光シグナルが、倍率変化における０．２％ＦＢＳコントロールにおいて遊走した野生型ＭＳＣと比較して遊走細胞集団に変換されたとき、より明らかである（図４Ｂ参照）。

【0069】

本願発明の広い概念から逸脱することなく、変更が上記態様に加えることができることが当業者に理解されよう。したがって、本願発明は記載された特定の態様に限定されず、特許請求の範囲により定義される本願発明の精神および範囲内の修飾を包含することが意図されることが理解される。

【0070】

文献：

【表5】

【表6】

【表7】

【表8】

【表9】

【表10】

【図1】

【図2】

【図3】

【図4A】

【図4B】