特許 6563827 Ｔｉｅ２活性化剤

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6563827

(24)【登録日】2019年8月2日

(45)【発行日】2019年8月21日

(54)【発明の名称】Ｔｉｅ２活性化剤

(51)【国際特許分類】

   A61K 36/074 20060101AFI20190808BHJP

   A61P 9/14 20060101ALI20190808BHJP

   A61P 9/00 20060101ALI20190808BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20190808BHJP

【ＦＩ】

   A61K36/074

   A61P9/14

   A61P9/00

   A61P43/00 111

【請求項の数】3

【全頁数】9

(21)【出願番号】特願2016-11918(P2016-11918)

(22)【出願日】2016年1月25日

(65)【公開番号】特開2017-132698(P2017-132698A)

(43)【公開日】2017年8月3日

【審査請求日】2018年8月6日

(73)【特許権者】

【識別番号】517298378

【氏名又は名称】株式会社ナガセビューティケァ

(74)【代理人】

【識別番号】100077012

【弁理士】

【氏名又は名称】岩谷 龍

(72)【発明者】

【氏名】位上 健太郎

(72)【発明者】

【氏名】伊藤 久富

(72)【発明者】

【氏名】野渕 翠

(72)【発明者】

【氏名】下条 洋輔

【審査官】 鶴見 秀紀

(56)【参考文献】

【文献】 特開２００４−１９６７６１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１７−１２２０６５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Biochem.Biophys.Res.Commun.，２００５年，Vol.330，pp.46-52

【文献】 Journal of Ethnopharmacology，２００４年，Vol.90，pp.17-20

【文献】 Journal of Nuclear Agricultural Sciences，２０１５年，Vol.29,No.10，pp.1963-1969

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ３６／００−３６／９０６８

Ａ６１Ｐ ９／００

Ａ６１Ｐ ９／１４

Ａ６１Ｐ ４３／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

霊芝の発酵物の抽出物を含有するＴｉｅ２活性化剤。

【請求項2】

霊芝の発酵物の抽出物を含有し、血管新生抑制剤、血管の成熟化剤、血管の正常化剤及び血管の安定化剤からなる群から選択される少なくとも１以上の用途に使用するための剤。

【請求項3】

血管新生抑制剤である場合を除く請求項１又は２に記載の剤。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、霊芝及び／又は霊芝の発酵物から選択される霊芝成分の抽出物（又はエキス）を含有するＴｉｅ２活性化剤に関する。また、本発明は、霊芝及び／又は霊芝の発酵物から選択される霊芝成分の抽出物（又はエキス）を含有し、血管新生抑制剤、血管の成熟化剤、血管の正常化剤、血管の安定化剤などの用途に使用するための剤に関する。

【背景技術】

【0002】

血管は、血管内皮細胞と血管壁細胞とから構成されており、血液の循環を通して生体組織中に酸素や栄養分を運ぶ役割を果たしている。通常、血液中の水分や低分子物質は血管を介して血液と組織間を透過しているが、タンパク質等の巨大分子は透過しない。このような血管の透過性は血管内皮細胞によって制御されており、血管の安定な構造は、血管内皮細胞の接着に加え、周囲に血管壁細胞が接着することによって維持されている。

【0003】

生体組織中の酸素や栄養分が不足すると、血管内皮細胞同士の接着や、血管壁細胞及び血管内皮細胞間の接着は抑制され、血管透過性が亢進することにより、血液中の液性因子や巨大分子が組織に行きわたる。
一方で、血管透過性が過剰に亢進すると、生体組織の浮腫、炎症などが引き起こされ、生体組織が機能不全となる。これらの現象は、糖尿病性網膜症、腫瘍、炎症などの病態で観察されており、血管透過性の制御不全がこれらの病態を招いていると考えられている。このような血管透過性の過剰亢進は、さらなる血管構造の乱れを引き起こすため、血管の安定な構造を維持させることが上記の病態改善にとって重要である。

【0004】

近年、血管を安定化することを目的として、受容体型チロシンキナーゼＴｉｅ（ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ ｗｉｔｈ Ｉｇ ａｎｄ ＥＧＦ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｄｏｍａｉｎ）２を活性化する因子の探索が行われている（特許文献１）。Ｔｉｅ２は、血管内皮細胞に発現しており、活性化（リン酸化）されることによって、血管内皮細胞と血管壁細胞の接着を誘導し、血管を安定化することが知られている。
また、Ｔｉｅ２の活性化によって、血管新生（例えば、既存の血管からの新たな血管ネットワークの形成）の抑制化や、血管の成熟化（例えば、血管内皮細胞同士が接着斑を形成することで血管透過性を制御し、血管内皮細胞が血管壁細胞の裏打ちを伴うことによる血管構造の安定化）、血管の正常化（例えば、血管透過性の破綻した血管や血管の無秩序な増生を招くような異常な血管を、血管内皮細胞同士の接着を高め、血管壁細胞の内血管皮細胞への裏打ちを促進することにより、血管を正常な状態にすること）をできることも知られている（特許文献１及び２）。
例えば、血管再生医療等では、Ｔｉｅ２の活性化によって血管内皮細胞及び血管壁細胞間の接着を誘導し、血管を成熟できることが知られている。
また、糖尿病性網膜症や腫瘍等の、血管壁細胞が血管内皮細胞に接着しないことに起因する疾患等では、Ｔｉｅ２の活性化によって血管壁細胞を血管内皮細胞に接着させ、血管を正常化できることが知られている。

【0005】

Ｔｉｅ２の活性化については、例えば、ケイ（Ｃｉｎｎａｍｏｍｕｍ ｃａｓｓｉａ Ｂｌｕｍｅ）の成分であるシリンガレシノールは、Ｔｉｅ２を活性化することにより、紫外線Ｂによって低下した血管構造を安定化することが報告されている（特許文献１）。また、ケイカ（Ｏｓｍａｎｔｈｕｓ ｆｒａｇｒａｎｓ ｖａｒ． ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ）、ボダイジュ（Ｔｉｌｉａ ｃｏｒｄａｔａ）、マロニエ（Ａｅｓｃｕｌｕｓ ｈｉｐｐｏｃａｓｔａｎｕｍ）の抽出物のＴｉｅ２活性化作用が報告されている（特許文献２）。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0006】

【特許文献1】特開２００９−２６３３５９号公報

【特許文献2】特開２０１５−１６８６５６号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

本発明は、新たなＴｉｅ２活性化剤を提供することを目的とする。
また、本発明は、Ｔｉｅ２の活性化とアンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）の阻害作用とを両立できる剤を提供することをも目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0008】

本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、霊芝及び／又はその発酵物から選択される霊芝成分の抽出物（又は抽出エキス）が、Ｔｉｅ２活性化作用を有することを見出した。本発明者らは、上記以外にもさらに鋭意検討を重ねて本発明を完成するに至った。

【0009】

すなわち、本発明のＴｉｅ２活性化剤（Ｔｉｅ２を活性化するための剤）は、霊芝及び／又は霊芝の発酵物から選択される霊芝成分の抽出物（又はエキス）を含有する。
このような剤は、Ｔｉｅ２活性化効果に起因して、種々の機能（例えば、血管新生抑制機能、血管成熟化機能、血管安定化機能など）を有している。
そのため、本発明には、このような機能に基づく種々の用途に使用するための剤も含まれる。このような剤は、例えば、霊芝及び／又は霊芝の発酵物から選択される霊芝成分の抽出物を含有し、血管新生抑制剤、血管の成熟化剤、血管の正常化剤及び血管の安定化剤からなる群から選択される少なくとも１以上の用途に使用するための剤であってもよい。
本発明の剤において、霊芝成分は、特に、霊芝の発酵物を含んでいてもよい。
また、本発明の剤において、抽出物は、水抽出物であってもよい。
本発明の剤は、前記のように、霊芝成分の抽出物を有効成分としているため、Ｔｉｅ２活性化機能のみならず、従来のＴｉｅ２活性化機能を有する成分にはない、他の機能も有している。そのため、本発明の剤は、さらに、このような他の機能を付与するための剤［例えば、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）を阻害するための剤］であってもよい。具体的には、本発明の剤は、さらに、血圧を降下させるための剤及び／又は血流改善をするための剤（血圧降下剤及び血流改善剤から選択された少なくとも１以上の用途に使用するための剤）であってもよい。また、本発明の剤は、さらに、体温調節機能を向上させるための剤（体温調整機能向上剤に使用するための剤）であってもよい。
本発明には、前記剤（Ｔｉｅ２活性化剤等）又は前記霊芝成分を含有する組成物（飲食品、医薬又は医薬組成物など）を含む。このような組成物は、霊芝成分を含んでおり、上記のように、例えば、Ｔｉｅ２活性化機能（さらにはＡＣＥ阻害機能）を有している。そのため、本発明の組成物は、例えば、Ｔｉｅ２を活性化（さらにはＡＣＥを阻害）するための組成物（Ｔｉｅ２活性化用組成物）であってもよい。本発明の組成物は、より具体的には、血管壁細胞が血管内皮細胞から脱離することに起因する疾患（例えば、腫瘍、慢性関節リウマチ、糖尿病網膜症、高脂血症、高血圧等）の予防、改善及び／又は治療のための組成物（医薬組成物）であってもよい。

【0010】

さらに、本発明には、前記剤（又は霊芝成分）又は前記組成物を、動物（ヒト、非ヒト動物）に投与し、Ｔｉｅ２を活性化する方法も含まれる。このような方法は、血管新生を抑制する方法、血管を成熟化する方法、及び血管を安定化する方法から選択された少なくとも１つの方法であってもよい。本発明の方法では、さらに、ＡＣＥを阻害してもよい。具体的には、本発明の方法では、血圧を降下させてもよく、血流を改善させてもよい。また、本発明の剤は、さらに、体温調節機能を向上させてもよい。

【発明の効果】

【0011】

本発明の剤又は組成物によれば、Ｔｉｅ２を効果的に活性化することができる。そのため、本発明では、Ｔｉｅ２の活性化に起因して、種々の症状や疾患の改善や予防のための剤（例えば、血管新生抑制剤、血管の成熟化剤、血管の正常化剤、血管の安定化剤など）を提供できる。より具体的な態様では、本発明の剤又は組成物は、血管内皮細胞及び血管壁細胞間の接着を誘導できるため、血管壁細胞が血管内皮細胞から脱離することに起因する疾患（例えば、腫瘍、慢性関節リウマチ、糖尿病網膜症、高脂血症、高血圧等）の予防、改善又は治療のために使用することができる。
また、本発明では、Ｔｉｅ２活性化機能に加えて、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）の阻害作用等の、従来のＴｉｅ２活性化成分に無い機能を実現できる。例えば、本発明の剤は、血圧降下効果、血流改善効果、体温調節機能向上効果なども有しているため、極めて有用性が高い。

【図面の簡単な説明】

【0012】

【図1】霊芝及び霊芝の発酵物のＴｉｅ２活性化評価結果を示す。

【図2】霊芝及び霊芝の発酵物のＴｉｅ２活性化評価結果を示す。

【発明を実施するための形態】

【0013】

以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の剤（Ｔｉｅ２活性化剤、血管新生抑制剤、血管の成熟化剤、血管の正常化剤、血管の安定化剤など）は、霊芝及び／又はその発酵物から選択される霊芝成分の抽出物（エキス又は抽出エキス）を含有することを特徴とする。
霊芝（Ｇａｎｏｄｅｒｕｍａ ｌｉｎｇｚｈｉ）は、ヒダナシタケ目マンネンタケ科マンネンタケ属に属するきのこである。
霊芝としては、特に限定されず、例えば、赤霊芝、青霊芝、黄霊芝、黒霊芝、白霊芝、紫霊芝、鹿角霊芝等が挙げられる。これらは、１種又は２種以上を使用することができる。また、霊芝は、天然品であっても、栽培品であってもよく、従来公知の取得方法により得られるものを使用することができる。

【0014】

霊芝の部位は、特に限定されず、どの部位でも使用することができる。霊芝の部位としては、例えば、傘、ヒダ、ツバ、柄、ツボ等が挙げられる。これらは１種又は２種以上を使用することができる。

【0015】

霊芝の発酵物としては、特に限定されるものではないが、代表的には、霊芝の自己消化物等である。
霊芝の自己消化物は、例えば、霊芝を所定の温度（例えば、３５〜４０℃程度）で発酵又は熟成させることにより、得ることができる。発酵時間は、特に限定されず、例えば１〜４８時間、好ましくは１〜３０時間である。尚、発酵は、霊芝の発酵に寄与する菌等の存在下で行ってもよい。

【0016】

発酵は、水の存在下で行ってもよい。水を存在させる態様としては、特に限定されず、噴霧、浸漬などが挙げられる。
なお、発酵後、必要に応じて、滅菌処理（例えば、加熱滅菌、高圧滅菌、濾過滅菌等）を行ってもよい。

【0017】

霊芝成分の抽出物としては、例えば、霊芝成分の溶媒抽出物等が挙げられる。
抽出溶媒としては、特に限定されないが、例えば、水（例えば、蒸留水、イオン交換水、生理食塩水等）、有機溶媒［例えば、低級アルコール（例えば、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、ｔ−ブタノール等）、多価アルコール（例えば、グリセリン、プロピレングリコール等）、ケトン類（例えば、アセトン等）、エステル類（例えば、酢酸エチルエステル等）、エーテル類（例えば、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン等）等］等が挙げられ、好ましくは、水、低級アルコール等であり、より好ましくは、水、エタノール等である。これらは１種単独で又は２種以上を組合せて使用することができる。

【0018】

霊芝成分の溶媒抽出物の製造方法は、特に限定されず、植物の溶媒抽出物の製造において使用される従来公知の方法に従ってよい。
霊芝成分の溶媒抽出物は、例えば、霊芝成分と抽出溶媒の混合物を、必要に応じて撹拌することにより得ることができる。
尚、溶媒抽出に供する霊芝成分としては、霊芝及び／又はその発酵物をそのまま使用してもよいし、霊芝及び／又はその発酵物を粉砕物、粉末、ペースト等として使用してもよい。

【0019】

霊芝成分の溶媒抽出物の製造において、霊芝成分と抽出溶媒の配合割合は、特に限定されないが、例えば、霊芝成分／抽出溶媒の重量比が、好ましくは１／２〜１／１００、より好ましくは１／２〜１／５０、さらに好ましくは１／５〜１／２０である。

【0020】

溶媒抽出の温度は、霊芝成分と抽出溶媒の混合物の重量等により適宜選択され得るが、例えば１５〜１５０℃である。
溶媒抽出の時間は、前記混合物の重量や処理温度等により適宜選択され得るが、例えば、０．１〜４８時間である。

【0021】

霊芝成分の溶媒抽出物の中でも、霊芝成分の水抽出物が好ましく、熱水抽出物（例えば、霊芝成分と水の混合物を９０〜１３０℃で加熱した物等）が好ましい。

【0022】

霊芝成分の抽出物は、必要に応じて、さらに、粗精製又は精製（例えば、ろ過、遠心分離等）、滅菌（例えば、加熱滅菌、高圧滅菌、濾過滅菌等）、希釈、濃縮、乾燥（凍結乾燥等）、結晶化、再結晶等の処理を行ったものであってもよい。これらの処理方法は、特に限定されず、常法に従ってよい。

【0023】

また、本発明は、霊芝成分（又は、本発明の剤）を含む組成物も含有する。
このような組成物は、例えば、飲食品（食品組成物）、医薬組成物等であってよい。

【0024】

尚、飲食品には、健康食品、サプリメントなども含まれる。健康食品としては、例えば、保健、健康維持及び増進等を目的とした食品（例えば、認可された特定機能性食品、特定機能性食品の認可のないいわゆる健康食品等）、特定保健用食品等である。また、サプリメントとしては、例えば、栄養素等を補うための栄養補助食品、栄養機能食品、健康の保持、回復、増進等のために役立つ機能等を有する健康補助食品、健康機能食品等である。

【0025】

本発明の組成物は、添加剤を含んでいてもよい。添加剤（他の添加剤）としては、特に限定されず、通常の食品や医薬品に使用される添加剤（例えば、賦形剤、滑沢剤、崩壊剤、結合剤、溶解補助剤、甘味料、着色料、保存料、増粘剤、酸化防止剤、香料、酸味料、調味料、乳化剤、ｐＨ調整剤、ビタミン類、ミネラル類、アミノ酸類、色素等）を使用することができる。添加剤は、単独で又は２種以上組み合わせてもよい。

【0026】

本発明の剤又は組成物の投与形態は、特に限定されず、例えば、経口投与、非経口投与、外用等であるが、好ましくは、経口投与である。

【0027】

本発明の剤又は組成物の剤型は、特に限定されないが、経口投与の場合は、例えば、固形剤（例えば、錠剤、被覆錠剤、顆粒剤、散剤、丸剤、トローチ剤、カプセル剤等）、液剤（例えば、エリキシル、シロップ、懸濁液等）等が挙げられる。非経口投与の場合の剤型としては、特に限定されないが、例えば、注射剤、経皮剤、経腸剤、点滴剤、外用剤、坐剤等が挙げられる。

【0028】

本発明の剤又は組成物の投与量（又は摂取量）は、特に限定されないが、例えば、成人１日当たり、剤又は組成物に含有される霊芝成分の抽出物の乾燥重量に換算して、好ましくは約１〜１０００ｍｇ／ｋｇ（体重）であり、より好ましくは約１０〜１００ｍｇ／ｋｇ（体重）程度であってもよい。このような量で投与すると、Ｔｉｅ２活性化効果、血管新生抑制効果、血管の成熟化効果、血管の正常化効果、血管の安定化効果等を効果的に得られる点で好ましい。
また、Ｔｉｅ２活性化剤の投与回数（又は摂取回数）は、剤型、投与対象等に応じて適宜選択され、１回投与であってもよいし、ある間隔をおいて持続投与してもよい。持続投与の場合、投与間隔は１日１回から数ヶ月に１回でも良い。

【実施例】

【0029】

以下、実施例によって本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されず、本発明の技術的範囲を逸脱しない範囲において様々な変更や修正が可能である。

【0030】

＜実施例１〜３＞
［霊芝の溶媒抽出物］
霊芝（赤霊芝、子実体）を粉砕した霊芝粉末２５ｇに水５００ｍＬを加え、１２１℃で２時間加熱し、霊芝を水中に抽出した。抽出後の液を濾過した後、凍結させて粉末とし、霊芝の溶媒抽出物を得た。

【0031】

［細胞培養］
正常ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）は、組織培養用低血清培地Ｈｕｍｅｄｉａ−ＥＧ２（倉敷紡績株式会社製）で培養し、６ウェルプレートに０．５×１０^６細胞/２ｍＬ/ウェルで播種し、３７℃、５％ＣＯ_２環境下で１晩培養した。
培養したＨＵＶＥＣに、霊芝の溶媒抽出物を、最終濃度がそれぞれ１００、３００、１０００μｇ/ｍＬとなるよう培地に添加し、さらに３０分培養した。

【0032】

［Ｔｉｅ２活性化評価方法］
ＲＩＰＡバッファー（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）を用いて、上記で得られたＨＵＶＥＣを回収し、ＳＤＳサンプルバッファー［０．２５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、１０％ＳＤＳ、３０％グリセロール、０．５Ｍ ＤＤＴ、０．０３％ＢＰＢ］を加えて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを以下の条件で行った。
ゲル：１０％アクリルアミドゲル
泳動条件：２００ｍＡ、６０分
Ｔｉｅ２抗体：Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社製
Ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｔｉｅ２抗体：Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社製
次いで、ｉＢｌｏｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いてＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇを行い、ＰＶＤＦ（ポリフッ化ビニリデン）膜に転写した。５％スキムミルク/ＴＢＳＴによりブロッキングを１時間行い、その後、ＴＢＳＴで３回洗浄した後、Ｔｉｅ２抗体（ａ―Ｔｉｅ２）、又はＰｈｏｓｐｈｏ−Ｔｉｅ２抗体（ａ―ｐＴｉｅ２）を加えて１時間抗体反応させ、ＨＲＰ標識された二次抗体を加えて１時間反応させ、化学発光検出（ＥＣＬ）により、タンパク質のバンドを検出した。

【0033】

また、陽性対象として、アンジオポエチン（Ａｎｇ）１（Ｒ＆Ｄｓｙｓｔｅｍｓ社製）を、最終濃度が１００ｎｇ/ｍＬとなるように、培養したＨＵＶＥＣに添加した後、３７℃、５％ＣＯ_２環境下で３０分培養して得られた細胞を用いて、上記と同様にＴｉｅ２活性化評価を行った。尚、アンジオポエチン１は、Ｔｉｅ２を活性化（リン酸化）することが知られている。

【0034】

＜実施例４〜６＞
霊芝の溶媒抽出物の代わりに、霊芝粉末８００ｇに水１２Ｌを添加し、３７度で２４時間撹拌処理した後、１２１℃で１５分間加熱減菌し、フィルター濾過した後、得られたエキスを凍結乾燥させて粉末とし、霊芝の発酵物を得た。この霊芝の発酵物２５ｇに水５００ｍＬを加え、１２１℃で２時間加熱し、霊芝の発酵物を水中に抽出した。抽出後の液を濾過した後、凍結乾燥させて粉末とし、霊芝の発酵物の溶媒抽出物を得た。
これを、最終濃度が１００、３００、１０００μｇ/ｍＬとなるよう添加した以外は実施例１〜３と同様にして、Ｔｉｅ２活性化評価を行った。

【0035】

実施例１〜６のＴｉｅ２活性化評価結果を、図１及び図２、表１に示す。尚、図２及び表１において、ｐＴｉｅ２／Ｔｉｅ２とは、検出された、Ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｔｉｅ２抗体／Ｔｉｅ２抗体の濃度比を示す。
また、図１及び図２において、Ａｎｇ１は、陽性対象の結果を示す。また、図１及び２において、霊芝Ｅｘは霊芝の溶媒抽出物を、発酵霊芝Ｅｘは霊芝の発酵物の溶媒抽出物を示す。

【0036】

【表1】

【0037】

図１、図２及び表１に示すように、霊芝成分の抽出物は、Ｔｉｅ２をリン酸化することが確認され、Ｔｉｅ２活性化効果を有することが確認された。
特に、実施例５に示すように、コントロールと比較して１．９倍ものＴｉｅ２活性化効果を奏することは、極めて優れた効果である。

【産業上の利用可能性】

【0038】

本発明の剤は、効果的にＴｉｅ２を活性化することができる。また、本発明の剤は、血管新生抑制剤、血管の成熟化剤、血管の正常化剤又は血管の安定化剤等として使用することができる。

【図1】

【図2】