特許 6563985 植物調節エレメントおよびその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6563985

(24)【登録日】2019年8月2日

(45)【発行日】2019年8月21日

(54)【発明の名称】植物調節エレメントおよびその使用

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/113 20100101AFI20190808BHJP

   C12N 5/04 20060101ALI20190808BHJP

   A01H 5/00 20180101ALI20190808BHJP

   C07K 2/00 20060101ALN20190808BHJP

   A01P 7/04 20060101ALN20190808BHJP

   A01P 13/00 20060101ALN20190808BHJP

   A01N 63/00 20060101ALN20190808BHJP

   C11C 3/00 20060101ALN20190808BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/113 ZZNA

   C12N5/04

   A01H5/00 A

   !C07K2/00

   !A01P7/04

   !A01P13/00

   !A01N63/00 C

   !C11C3/00

【請求項の数】15

【外国語出願】

【全頁数】85

(21)【出願番号】特願2017-157783(P2017-157783)

(22)【出願日】2017年8月18日

(62)【分割の表示】特願2016-86925(P2016-86925)の分割

【原出願日】2012年5月11日

(65)【公開番号】特開2018-23385(P2018-23385A)

(43)【公開日】2018年2月15日

【審査請求日】2017年9月15日

(31)【優先権主張番号】61/485,876

(32)【優先日】2011年5月13日

(33)【優先権主張国】US

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】501231613

【氏名又は名称】モンサント テクノロジー エルエルシー

(74)【代理人】

【識別番号】100106518

【弁理士】

【氏名又は名称】松谷 道子

(74)【代理人】

【識別番号】100122301

【弁理士】

【氏名又は名称】冨田 憲史

(74)【代理人】

【識別番号】100157956

【弁理士】

【氏名又は名称】稲井 史生

(72)【発明者】

【氏名】スタニスラフ・フラシンスキー

(72)【発明者】

【氏名】バレット・シー・フォート

(72)【発明者】

【氏名】モハメド・アウファトル

(72)【発明者】

【氏名】ランドール・ダブリュー・シュルツ

(72)【発明者】

【氏名】シャオピン・ウェイ

(72)【発明者】

【氏名】ウェイ・ウー

(72)【発明者】

【氏名】シャウピン・ヤン

【審査官】 松原 寛子

(56)【参考文献】

【文献】 特開２００１−３４６５８０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００３−５１６７５３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY，２００２年，Vol.277, No.13，p.11582-11590

【文献】 Mol Gen Genet，１９９７年，Vol.256，p.211-222

【文献】 EST11010374 CM-PEa library Cucumis melo cDNA clone PEa0004M05, mRNA sequence, GenBank: JG468661.1，２０１１年 ３月１５日，２０１７年３月９日検索 <https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucest/326210348?sat=1&satkey=73505460>

【文献】 Cm42_B23.f Cucumis melo BamHI-BAC library (BCM library) Cucumis melo subsp. melo genomic, genomic su，２０１０年，２０１７年３月９日検索 <https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucgss/312429024?sat=6&satkey=29141022>

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／１１３

Ａ０１Ｈ ５／００

Ｃ１２Ｎ ５／０４

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ａ）遺伝子調節活性を示す、配列番号３２の全長に対して少なくとも９０パーセントの配列同一性を有する配列、
ｂ）配列番号３２を含む配列、ならびに
ｃ）遺伝子調節活性を示す、配列番号１６９を含む配列番号３２の断片
からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列を含む、遺伝子調節機能活性を示すＤＮＡ分子であって、異種の転写可能なポリヌクレオチド分子に作動可能に連結されている、ＤＮＡ分子。

【請求項2】

前記ポリヌクレオチド配列が、配列番号３２において記載されているポリヌクレオチド配列に対して少なくとも９０パーセントの配列同一性を有する、請求項１に記載のＤＮＡ分子。

【請求項3】

前記ポリヌクレオチド配列が、配列番号３２において記載されているポリヌクレオチド配列に対して少なくとも９５パーセントの配列同一性を有する、請求項１に記載のＤＮＡ分子。

【請求項4】

異種の転写可能なポリヌクレオチド分子が、農学的に重要な遺伝子を含む、請求項１に記載のＤＮＡ分子。

【請求項5】

農学的に重要な遺伝子が、植物において除草剤耐性を与える、請求項４に記載のＤＮＡ分子。

【請求項6】

農学的に重要な遺伝子が、植物において病虫害抵抗性を与える、請求項４に記載のＤＮＡ分子。

【請求項7】

ａ）遺伝子調節活性を示す、配列番号３２の全長に対して少なくとも９０パーセントの配列同一性を有する配列、
ｂ）配列番号３２を含む配列、ならびに
ｃ）遺伝子調節活性を示す、配列番号１６９を含む配列番号３２の断片
からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列を含む、遺伝子調節機能活性を示す異種のＤＮＡ分子を含むトランスジェニック植物細胞であって、前記ＤＮＡ分子が、異種の転写可能なポリヌクレオチド分子に作動可能に連結されている、トランスジェニック植物細胞。

【請求項8】

前記トランスジェニック植物細胞が、単子葉植物細胞である、請求項７に記載のトランスジェニック植物細胞。

【請求項9】

前記トランスジェニック植物細胞が、双子葉植物細胞である、請求項７に記載のトランスジェニック植物細胞。

【請求項10】

ａ）遺伝子調節活性を示す、配列番号３２の全長に対して少なくとも９０パーセントの配列同一性を有する配列、
ｂ）配列番号３２を含む配列、ならびに
ｃ）遺伝子調節活性を示す、配列番号１６９を含む配列番号３２の断片
からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列を含む、遺伝子調節機能活性を示すＤＮＡ分子を含むトランスジェニック植物またはその一部分であって、前記ＤＮＡ分子が、異種の転写可能なポリヌクレオチド分子に作動可能に連結されている、トランスジェニック植物またはその一部分。

【請求項11】

遺伝子調節機能活性を示す前記ＤＮＡ分子を含む、請求項１０に記載のトランスジェニック植物の子孫植物またはその一部分。

【請求項12】

ａ）遺伝子調節活性を示す、配列番号３２の全長に対して少なくとも９０パーセントの配列同一性を有する配列、
ｂ）配列番号３２を含む配列、ならびに
ｃ）遺伝子調節活性を示す、配列番号１６９を含む配列番号３２の断片
からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列を含む、遺伝子調節機能活性を示すＤＮＡ分子を含むトランスジェニック種子であって、前記ＤＮＡ分子が、異種の転写可能なポリヌクレオチド分子に作動可能に連結されている、トランスジェニック種子。

【請求項13】

商品を製造する方法であって、
ａ）１）遺伝子調節活性を示す、配列番号３２の全長に対して少なくとも９０パーセントの配列同一性を有する配列、
２）配列番号３２を含む配列、ならびに
３）遺伝子調節活性を示す、配列番号１６９を含む配列番号３２の断片
からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列を含む、遺伝子調節機能活性を示すＤＮＡ分子を含むトランスジェニック植物またはその一部分であって、前記ＤＮＡ分子が、異種の転写可能なポリヌクレオチド分子に作動可能に連結されている、トランスジェニック植物またはその一部分を得ること、ならびに
ｂ）それらから商品を製造すること
を含む、方法。

【請求項14】

商品が、タンパク質濃縮物、タンパク質単離物、穀物、デンプン、種子、ミール、穀粉、バイオマス、または種子油である、請求項１３に記載の方法。

【請求項15】

転写可能なポリヌクレオチド分子を発現する方法であって、
ａ）１）遺伝子調節活性を示す、配列番号３２の全長に対して少なくとも９０パーセントの配列同一性を有する配列、
２）配列番号３２を含む配列、ならびに
３）遺伝子調節活性を示す、配列番号１６９を含む配列番号３２の断片
からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列を含む、遺伝子調節機能活性を示すＤＮＡ分子を含むトランスジェニック植物であって、前記ＤＮＡ分子が、異種の転写可能なポリヌクレオチド分子に作動可能に連結されている、トランスジェニック植物を得ること、ならびに
ｂ）前記転写可能なポリヌクレオチドが発現される、前記トランスジェニック植物を栽培すること
を含む、方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、その全体が参照によって本明細書において組み込まれる、２０１１年３月１３日に提出された米国仮特許出願第６１／４８５，８７６号の利益を主張する。

【0002】

配列表の組み込み
Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）において測定されるように、４６３キロバイトであり、２０１２年３月９日に作成された「ＭＯＮＳ３０４ＷＯ．ｔｘｔ」という名のファイル中に含有される配列表は、電子的な提出によって本明細書と共に提出され、参照によって本明細書において組み込まれる。

【0003】

本発明は、植物分子生物学および植物遺伝子工学の分野ならびに植物における遺伝子発現を調整するのに有用なＤＮＡ分子に関する。

【背景技術】

【0004】

調節エレメントは、作動可能に連結された、転写可能なポリヌクレオチド分子の転写を調整することによって、遺伝子活性を調節する遺伝因子である。そのようなエレメントは、プロモーター、リーダー、イントロン、および３’非翻訳領域を含み、植物分子生物学および植物遺伝子工学の分野において有用である。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0005】

本発明は、植物における使用のための、一般にマスクメロンと呼ばれる植物種であるメロン（Ｃｕｃｕｍｉｓ ｍｅｌｏ）に由来する、プロモーター、リーダー、およびイントロンなどの新規な遺伝子調節エレメントを提供する。本発明はまた、調節エレメントを含むＤＮＡコンストラクト、トランスジェニック植物細胞、植物、および種子をも提供する。本明細書において提供される調節配列に関して異種であってもよい、転写可能なポリヌクレオチド分子に作動可能に連結された配列が提供されてもよい。本発明はまた、調節エレメント、調節エレメントを含むＤＮＡコンストラクト、ならびに転写可能なポリヌクレオチド分子に作動可能に連結された調節エレメントを含むトランスジェニック植物細胞、植物、および種子を作製するならびに使用するための方法をも提供する。

【0006】

したがって、一態様において、本発明は、ａ）配列番号１〜１９９、２１１、および２１２のいずれかに対して少なくとも８５パーセントの配列同一性を有する配列；ｂ）配列番号１〜１９９、２１１、および２１２のいずれかを含む配列；ならびにｃ）遺伝子調節活性を示す、配列番号１〜１９９、２１１、および２１２のいずれかの断片からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列を含む、転写調節発現エレメント群またはプロモーターまたはリーダーまたはイントロンなどのＤＮＡ分子であって、異種の転写可能なポリヌクレオチド分子に作動可能に連結されている、ＤＮＡ分子を提供する。特定の実施形態において、転写調節発現エレメント群またはプロモーターまたはリーダーまたはイントロンが、配列番号１〜１９９、２１１、および２１２のいずれかと、少なくとも９０パーセント、少なくとも９５パーセント、少なくとも９８パーセント、または少なくとも９９パーセント同一である。特定の実施形態において、異種の転写可能なポリヌクレオチド分子が、農学的に重要な遺伝子、植物における除草剤抵抗性を提供することができる遺伝子、または植物における植物害虫抵抗性を提供することができる遺伝子を含む。

【0007】

本発明はまた、ａ）配列番号１〜１９９、２１１、および２１２のいずれかに対して少なくとも８５パーセントの配列同一性を有する配列；ｂ）配列番号１〜１９９、２１１、および２１２のいずれかを含む配列；ならびにｃ）遺伝子調節活性を示す、配列番号１〜１９９、２１１、および２１２のいずれかの断片からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列を含む、転写調節発現エレメント群またはプロモーターまたはリーダーまたはイントロンなどのＤＮＡ分子を含むトランスジェニック植物細胞であって、前記ＤＮＡ分子が、異種の転写可能なポリヌクレオチド分子に作動可能に連結されている、トランスジェニック植物細胞を提供する。さらに、転写調節発現エレメント群またはプロモーターまたはリーダーまたはイントロンは、遺伝子の発現を調節する。トランスジェニック植物細胞は、単子葉または双子葉植物細胞とすることができる。

【0008】

ａ）配列番号１〜１９９、２１１、および２１２のいずれかに対して少なくとも８５パーセントの配列同一性を有する配列；ｂ）配列番号１〜１９９、２１１、および２１２のいずれかを含む配列；ならびにｃ）遺伝子調節活性を示す、配列番号１〜１９９、２１１、および２１２のいずれかの断片からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列を含む、転写調節発現エレメント群またはプロモーターまたはリーダーまたはイントロンなどのＤＮＡ分子を含むトランスジェニック植物またはトランスジェニック植物の一部であって、前記ＤＮＡ分子が、異種の転写可能なポリヌクレオチド分子に作動可能に連結されている、トランスジェニック植物またはトランスジェニック植物の一部が、本発明によってさらに提供される。特定の実施形態において、トランスジェニック植物は、転写調節発現エレメント群またはプロモーターまたはリーダーまたはイントロンを含有する任意の世代の子孫植物であってもよい。

【0009】

ａ）配列番号１〜１９９、２１１、および２１２のいずれかに対して少なくとも８５パーセントの配列同一性を有する配列；ｂ）配列番号１〜１９９、２１１、および２１２のいずれかを含む配列；ならびにｃ）遺伝子調節活性を示す、配列番号１〜１９９、２１１、および２１２のいずれかの断片からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列を含む、転写調節発現エレメント群またはプロモーターまたはリーダーまたはイントロンなどのＤＮＡ分子を含むトランスジェニック種子であって、前記ＤＮＡ分子が、異種の転写可能なポリヌクレオチド分子に作動可能に連結されている、トランスジェニック種子が、さらに提供される。

【0010】

さらに他の態様において、本発明は、ａ）配列番号１〜１９９、２１１、および２１２のいずれかに対して少なくとも８５パーセントの配列同一性を有する配列；ｂ）配列番号１〜１９９、２１１、および２１２のいずれかを含む配列；ならびにｃ）遺伝子調節活性を示す、配列番号１〜１９９、２１１、および２１２のいずれかの断片からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列を含む、転写調節発現エレメント群またはプロモーターまたはリーダーまたはイントロンなどのＤＮＡ分子を含有する、トランスジェニック植物、トランスジェニック植物の一部、またはトランスジェニック種子から商品を製造する方法であって、前記ＤＮＡ分子が、異種の転写可能なポリヌクレオチド分子に作動可能に連結されている、方法を提供する。一実施形態において、商品は、タンパク質濃縮物、タンパク質単離物、穀物、デンプン、種子、ミール、穀粉、バイオマス、または種子油である。

【0011】

他の態様において、本発明は、ａ）配列番号１〜１９９、２１１、および２１２のいずれかに対して少なくとも８５パーセントの配列同一性を有する配列；ｂ）配列番号１〜１９９、２１１、および２１２のいずれかを含む配列；ならびにｃ）遺伝子調節活性を示す、配列番号１〜１９９、２１１、および２１２のいずれかの断片からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列を含む、転写調節発現エレメント群またはプロモーターまたはリーダーまたはイントロンなどのＤＮＡ分子を含む商品であって、前記ＤＮＡ分子が、異種の転写可能なポリヌクレオチド分子に作動可能に連結されている、商品を提供する。

【0012】

さらに他の態様において、本発明は、配列番号１〜１９９、２１１、および２１２のいずれかのＤＮＡ配列に対して少なくとも８５パーセント同一であるＤＮＡ配列を有する、配列番号１〜１９９、２１１、および２１２のいずれかを含有する、または配列番号１〜１９９、２１１、および２１２のいずれかの断片からなる、転写調節発現エレメント群またはプロモーターまたはリーダーまたはイントロンなどのＤＮＡ分子を使用して、トランスジェニック植物において、転写可能なポリヌクレオチド分子を発現させ、トランスジェニック植物を栽培する方法を提供する。

【0013】

配列の簡単な説明
配列番号１、５、７、９、１１、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５９、１６２、１６７、１６８、１７２、１７５、１７６、１７７、１７８、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２１１、および２１２は、リーダーエレメントに作動可能に連結されたプロモーターエレメント；またはリーダーエレメントおよびイントロンエレメントに作動可能に連結されたプロモーターエレメント、またはリーダーエレメントに作動可能に連結され、イントロンエレメントに作動可能に連結され、リーダーエレメントに作動可能に連結されたプロモーターエレメントから構成されるウリ属（Ｃｕｃｕｍｉｓ）転写調節発現エレメント群またはＥＸＰ配列である。

【0014】

配列番号２、６、８、１０、１２、１６３、および１６９は、プロモーターエレメントである。

【0015】

配列番号３、１６４、１６６、および１７０は、リーダー配列である。

【0016】

配列番号４、１６５、および１７１は、イントロン配列である。

【0017】

配列番号１５７、１６０、１７３、１７９、および１８６は、プロモーターが、リーダーエレメントに作動可能に連結されている配列である。

【0018】

配列番号１５８、１６１、１７４、１８０、および１８７は、イントロンが、リーダーエレメントに作動可能に連結されている配列である。

【図面の簡単な説明】

【0019】

【図1a】図１ａ〜１ｆは、メロンから単離されたプロモーターエレメントに対応するプロモーターバリアントセグメントのアライメントを示す。特に、図１ａ〜１ｆは、転写調節発現エレメント群ＥＸＰ−ＣＵＣｍｅ．Ｕｂｑ１：１：１（配列番号１）において見出される２０６８ｂｐプロモーター配列Ｐ−ＣＵＣｍｅ．Ｕｂｑ１−１：１：１５（配列番号２）対プロモーター、Ｐ−ＣＵＣｍｅ．Ｕｂｑ１−１：１：１５の５’欠失を介して誘導されるプロモーター配列のアライメントを示す。たとえばＰ−ＣＵＣｍｅ．Ｕｂｑ１−１：１：１５の５’末端の欠失は、プロモーター、ＥＸＰ−ＣＵＣｍｅ．Ｕｂｑ１：１：２（配列番号５）内に見出される１４５９ｂｐプロモーターであるＰ−ＣＵＣｍｅ．Ｕｂｑ１−１：１：１６（配列番号６）；ＥＸＰ−ＣＵＣｍｅ．Ｕｂｑ１：１：３（配列番号７）内に含まれる９６４ｂｐ配列であるＰ−ＣＵＣｍｅ．Ｕｂｑ１−１：１：１７（配列番号８）；ＥＸＰ−ＣＵＣｍｅ．Ｕｂｑ１：１：４（配列番号９）内に含まれる４７９ｂｐ配列であるＰ−ＣＵＣｍｅ．Ｕｂｑ１−１：１：１８（配列番号１０）；およびＥＸＰ−ＣＵＣｍｅ．Ｕｂｑ１：１：５（配列番号１１）内に含まれる１７３ｂｐ配列であるＰ−ＣＵＣｍｅ．Ｕｂｑ１−１：１：１９（配列番号１２）をもたらした。

【図1b】図１ａ〜１ｆは、メロンから単離されたプロモーターエレメントに対応するプロモーターバリアントセグメントのアライメントを示す。特に、図１ａ〜１ｆは、転写調節発現エレメント群ＥＸＰ−ＣＵＣｍｅ．Ｕｂｑ１：１：１（配列番号１）において見出される２０６８ｂｐプロモーター配列Ｐ−ＣＵＣｍｅ．Ｕｂｑ１−１：１：１５（配列番号２）対プロモーター、Ｐ−ＣＵＣｍｅ．Ｕｂｑ１−１：１：１５の５’欠失を介して誘導されるプロモーター配列のアライメントを示す。たとえばＰ−ＣＵＣｍｅ．Ｕｂｑ１−１：１：１５の５’末端の欠失は、プロモーター、ＥＸＰ−ＣＵＣｍｅ．Ｕｂｑ１：１：２（配列番号５）内に見出される１４５９ｂｐプロモーターであるＰ−ＣＵＣｍｅ．Ｕｂｑ１−１：１：１６（配列番号６）；ＥＸＰ−ＣＵＣｍｅ．Ｕｂｑ１：１：３（配列番号７）内に含まれる９６４ｂｐ配列であるＰ−ＣＵＣｍｅ．Ｕｂｑ１−１：１：１７（配列番号８）；ＥＸＰ−ＣＵＣｍｅ．Ｕｂｑ１：１：４（配列番号９）内に含まれる４７９ｂｐ配列であるＰ−ＣＵＣｍｅ．Ｕｂｑ１−１：１：１８（配列番号１０）；およびＥＸＰ−ＣＵＣｍｅ．Ｕｂｑ１：１：５（配列番号１１）内に含まれる１７３ｂｐ配列であるＰ−ＣＵＣｍｅ．Ｕｂｑ１−１：１：１９（配列番号１２）をもたらした。

【図1c】図１ａ〜１ｆは、メロンから単離されたプロモーターエレメントに対応するプロモーターバリアントセグメントのアライメントを示す。特に、図１ａ〜１ｆは、転写調節発現エレメント群ＥＸＰ−ＣＵＣｍｅ．Ｕｂｑ１：１：１（配列番号１）において見出される２０６８ｂｐプロモーター配列Ｐ−ＣＵＣｍｅ．Ｕｂｑ１−１：１：１５（配列番号２）対プロモーター、Ｐ−ＣＵＣｍｅ．Ｕｂｑ１−１：１：１５の５’欠失を介して誘導されるプロモーター配列のアライメントを示す。たとえばＰ−ＣＵＣｍｅ．Ｕｂｑ１−１：１：１５の５’末端の欠失は、プロモーター、ＥＸＰ−ＣＵＣｍｅ．Ｕｂｑ１：１：２（配列番号５）内に見出される１４５９ｂｐプロモーターであるＰ−ＣＵＣｍｅ．Ｕｂｑ１−１：１：１６（配列番号６）；ＥＸＰ−ＣＵＣｍｅ．Ｕｂｑ１：１：３（配列番号７）内に含まれる９６４ｂｐ配列であるＰ−ＣＵＣｍｅ．Ｕｂｑ１−１：１：１７（配列番号８）；ＥＸＰ−ＣＵＣｍｅ．Ｕｂｑ１：１：４（配列番号９）内に含まれる４７９ｂｐ配列であるＰ−ＣＵＣｍｅ．Ｕｂｑ１−１：１：１８（配列番号１０）；およびＥＸＰ−ＣＵＣｍｅ．Ｕｂｑ１：１：５（配列番号１１）内に含まれる１７３ｂｐ配列であるＰ−ＣＵＣｍｅ．Ｕｂｑ１−１：１：１９（配列番号１２）をもたらした。

【図1d】図１ａ〜１ｆは、メロンから単離されたプロモーターエレメントに対応するプロモーターバリアントセグメントのアライメントを示す。特に、図１ａ〜１ｆは、転写調節発現エレメント群ＥＸＰ−ＣＵＣｍｅ．Ｕｂｑ１：１：１（配列番号１）において見出される２０６８ｂｐプロモーター配列Ｐ−ＣＵＣｍｅ．Ｕｂｑ１−１：１：１５（配列番号２）対プロモーター、Ｐ−ＣＵＣｍｅ．Ｕｂｑ１−１：１：１５の５’欠失を介して誘導されるプロモーター配列のアライメントを示す。たとえばＰ−ＣＵＣｍｅ．Ｕｂｑ１−１：１：１５の５’末端の欠失は、プロモーター、ＥＸＰ−ＣＵＣｍｅ．Ｕｂｑ１：１：２（配列番号５）内に見出される１４５９ｂｐプロモーターであるＰ−ＣＵＣｍｅ．Ｕｂｑ１−１：１：１６（配列番号６）；ＥＸＰ−ＣＵＣｍｅ．Ｕｂｑ１：１：３（配列番号７）内に含まれる９６４ｂｐ配列であるＰ−ＣＵＣｍｅ．Ｕｂｑ１−１：１：１７（配列番号８）；ＥＸＰ−ＣＵＣｍｅ．Ｕｂｑ１：１：４（配列番号９）内に含まれる４７９ｂｐ配列であるＰ−ＣＵＣｍｅ．Ｕｂｑ１−１：１：１８（配列番号１０）；およびＥＸＰ−ＣＵＣｍｅ．Ｕｂｑ１：１：５（配列番号１１）内に含まれる１７３ｂｐ配列であるＰ−ＣＵＣｍｅ．Ｕｂｑ１−１：１：１９（配列番号１２）をもたらした。

【図1e】図１ａ〜１ｆは、メロンから単離されたプロモーターエレメントに対応するプロモーターバリアントセグメントのアライメントを示す。特に、図１ａ〜１ｆは、転写調節発現エレメント群ＥＸＰ−ＣＵＣｍｅ．Ｕｂｑ１：１：１（配列番号１）において見出される２０６８ｂｐプロモーター配列Ｐ−ＣＵＣｍｅ．Ｕｂｑ１−１：１：１５（配列番号２）対プロモーター、Ｐ−ＣＵＣｍｅ．Ｕｂｑ１−１：１：１５の５’欠失を介して誘導されるプロモーター配列のアライメントを示す。たとえばＰ−ＣＵＣｍｅ．Ｕｂｑ１−１：１：１５の５’末端の欠失は、プロモーター、ＥＸＰ−ＣＵＣｍｅ．Ｕｂｑ１：１：２（配列番号５）内に見出される１４５９ｂｐプロモーターであるＰ−ＣＵＣｍｅ．Ｕｂｑ１−１：１：１６（配列番号６）；ＥＸＰ−ＣＵＣｍｅ．Ｕｂｑ１：１：３（配列番号７）内に含まれる９６４ｂｐ配列であるＰ−ＣＵＣｍｅ．Ｕｂｑ１−１：１：１７（配列番号８）；ＥＸＰ−ＣＵＣｍｅ．Ｕｂｑ１：１：４（配列番号９）内に含まれる４７９ｂｐ配列であるＰ−ＣＵＣｍｅ．Ｕｂｑ１−１：１：１８（配列番号１０）；およびＥＸＰ−ＣＵＣｍｅ．Ｕｂｑ１：１：５（配列番号１１）内に含まれる１７３ｂｐ配列であるＰ−ＣＵＣｍｅ．Ｕｂｑ１−１：１：１９（配列番号１２）をもたらした。

【図1f】図１ａ〜１ｆは、メロンから単離されたプロモーターエレメントに対応するプロモーターバリアントセグメントのアライメントを示す。特に、図１ａ〜１ｆは、転写調節発現エレメント群ＥＸＰ−ＣＵＣｍｅ．Ｕｂｑ１：１：１（配列番号１）において見出される２０６８ｂｐプロモーター配列Ｐ−ＣＵＣｍｅ．Ｕｂｑ１−１：１：１５（配列番号２）対プロモーター、Ｐ−ＣＵＣｍｅ．Ｕｂｑ１−１：１：１５の５’欠失を介して誘導されるプロモーター配列のアライメントを示す。たとえばＰ−ＣＵＣｍｅ．Ｕｂｑ１−１：１：１５の５’末端の欠失は、プロモーター、ＥＸＰ−ＣＵＣｍｅ．Ｕｂｑ１：１：２（配列番号５）内に見出される１４５９ｂｐプロモーターであるＰ−ＣＵＣｍｅ．Ｕｂｑ１−１：１：１６（配列番号６）；ＥＸＰ−ＣＵＣｍｅ．Ｕｂｑ１：１：３（配列番号７）内に含まれる９６４ｂｐ配列であるＰ−ＣＵＣｍｅ．Ｕｂｑ１−１：１：１７（配列番号８）；ＥＸＰ−ＣＵＣｍｅ．Ｕｂｑ１：１：４（配列番号９）内に含まれる４７９ｂｐ配列であるＰ−ＣＵＣｍｅ．Ｕｂｑ１−１：１：１８（配列番号１０）；およびＥＸＰ−ＣＵＣｍｅ．Ｕｂｑ１：１：５（配列番号１１）内に含まれる１７３ｂｐ配列であるＰ−ＣＵＣｍｅ．Ｕｂｑ１−１：１：１９（配列番号１２）をもたらした。

【発明を実施するための形態】

【0020】

発明の詳細な説明
本明細書において開示される本発明は、有益な遺伝子調節活性を有するメロンから得られたポリヌクレオチド分子を提供する。これらのポリヌクレオチド分子の設計、構築、および使用が記載される。これらのポリヌクレオチド分子のヌクレオチド配列は、配列番号１〜１９９、２１１、および２１２の中で提供される。これらのポリヌクレオチド分子は、たとえば、植物組織における、作動可能に連結された、転写可能なポリヌクレオチド分子の発現に影響を及ぼすことができ、そのため、トランスジェニック植物において、遺伝子発現またはコード遺伝子産物の活性を選択的に調節することができる。本発明はまた、ポリヌクレオチド分子を修飾する、生成する、および使用するための方法を提供する。本発明はまた、プロモーターおよび／または他の開示されるヌクレオチド配列を含有する組成物、形質転換宿主細胞、トランスジェニック植物、および種子ならびにそれらを調製し、使用する方法をも提供する。

【0021】

以下の定義および方法は、よりよく本発明を定義し、本発明の実施において当業者らをガイドするために提供される。特に断りのない限り、用語は、当業者らによって、従来の使用法に従って理解される。

【0022】

ＤＮＡ分子
本明細書において使用されるように、用語「ＤＮＡ」または「ＤＮＡ分子」は、５’（上流域）末端から３’（下流）末端に読まれる、ゲノムまたは合成起源の二本鎖ＤＮＡ分子、すなわちデオキシリボヌクレオチド塩基またはポリヌクレオチド分子のポリマーを指す。本明細書において使用されるように、用語「ＤＮＡ配列」は、ＤＮＡ分子のヌクレオチド配列を指す。

【0023】

本明細書において使用されるように、用語「単離ＤＮＡ分子」は、その天然または自然状態においてそれと通常関連する他の分子から、少なくとも部分的に分離されたＤＮＡ分子を指す。一実施形態において、用語「単離」が、その天然または自然状態においてＤＮＡ分子の側面に通常位置する核酸のいくつかから、少なくとも部分的に分離されたＤＮＡ分子を指す。したがって、たとえば組換え技術の結果として、ＤＮＡ分子が通常関連しない調節またはコード配列に融合されたＤＮＡ分子は、本明細書において、単離されていると考えられる。そのような分子は、それらが天然状態にないという点で、宿主細胞の染色体の中に統合されるまたは他のＤＮＡ分子と共に核酸溶液中に存在する場合、単離されていると考えられる。

【0024】

本発明において開示される、ＤＮＡ分子またはその断片を単離し、操作するための多くの方法が、知られている。たとえば、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）技術は、特定の出発ＤＮＡ分子を増幅するおよび／またはもとの分子のバリアントを生成するために使用することができる。ＤＮＡ分子またはその断片はまた、自動オリゴヌクレオチド合成装置を使用することによって一般に実施されるように、化学的な手段によって断片を直接合成することによってなど、他の技術によって得ることもできる。

【0025】

本明細書において使用されるように、用語「配列同一性」は、２つの最適にアライメントされたポリヌクレオチド配列または２つの最適にアライメントされたポリペプチド配列が同一である程度を指す。最適な配列アライメントは、適切な内部ヌクレオチド挿入、欠失、またはギャップにより、配列アライメント中のヌクレオチドのマッチの数を最大限にするように、２つの配列、たとえば参照配列および他の配列を手作業でアライメントすることによって作出される。本明細書において使用されるように、用語「参照配列」は、配列番号１〜１９９、２１１、および２１２のポリヌクレオチド配列として提供される配列を指す。

【0026】

本明細書において使用されるように、用語「パーセントの配列同一性」または「パーセントの同一性」または「％の同一性」は、同一性分率×１００である。参照配列と最適にアライメントされた配列についての「同一性分率」は、参照配列におけるヌクレオチドの総数、たとえば、完全長の全参照配列におけるヌクレオチドの総数によって割った、最適なアライメントにおけるヌクレオチドのマッチの数である。したがって、本発明の一実施形態は、配列番号１〜１９９、２１１、および２１２としての本明細書において提供される参照配列に対して最適にアライメントされた場合に、参照配列に対して、少なくとも約８５パーセントの同一性、少なくとも約９０パーセントの同一性、少なくとも約９５パーセントの同一性、少なくとも約９６パーセントの同一性、少なくとも約９７パーセントの同一性、少なくとも約９８パーセントの同一性、または少なくとも約９９パーセントの同一性を有する配列を含むＤＮＡ分子である。特定の実施形態において、そのような配列が、遺伝子調節活性を有するまたは細胞内に、作動可能に連結されたポリペプチドを局在化させるように機能するペプチドをコードするとして定義されてもよい。

【0027】

調節エレメント
調節エレメントは、遺伝子調節活性を有するＤＮＡ分子、すなわち、作動可能に連結された、転写可能なポリヌクレオチド分子の転写および／または翻訳に影響を及ぼす能力を有するＤＮＡ分子である。用語「遺伝子調節活性」は、したがって、その作動可能に連結された、転写可能なポリヌクレオチド分子の転写および／または翻訳に影響を及ぼすことによって、作動可能に連結された、転写可能なポリヌクレオチド分子の発現パターンに影響を及ぼす能力を指す。本明細書において使用されるように、転写調節発現エレメント群（ＥＸＰ）は、作動可能に連結された、エンハンサー、プロモーター、リーダー、およびイントロンなどの発現エレメントから構成されてもよい。したがって、転写調節発現エレメント群は、たとえば、リーダー配列の５’に作動可能に連結されたプロモーターから構成されてもよく、これは、順番に、イントロン配列の５’に作動可能に連結される。イントロン配列は、天然の配列の第１のイントロン／エクソンスプライスジャンクションのポイントから始まる配列から構成されてもよく、転写および結果として生じる転写物の適切なプロセシングを促進するために、適切なイントロン／エクソンプロセシングをもたらすように、第２のイントロン／エクソンスプライスジャンクションを含む小さなリーダー断片からさらに構成されてもよい。リーダーおよびイントロンは、作動可能に連結された、転写可能なポリヌクレオチド分子の転写および結果として生じる転写されたＲＮＡの翻訳に正に影響を及ぼしてもよい。あらかじめ処理されたＲＮＡ分子は、リーダーおよびイントロンを含み、これは、転写ＲＮＡの転写後プロセシングおよび／または細胞核から細胞質の中への転写ＲＮＡ分子の輸出に影響を及ぼしてもよい。転写ＲＮＡ分子の転写後プロセシングの後に、リーダー配列は、最終的なメッセンジャーＲＮＡの一部として保持されてもよく、メッセンジャーＲＮＡ分子の翻訳に正に影響を及ぼしてもよい。

【0028】

プロモーター、リーダー、イントロン、および転写終結領域などの調節エレメントは、生細胞において遺伝子調節活性を有し、遺伝子の全体的な発現において欠くことのできない役割を果たすＤＮＡ分子である。用語「調節エレメント」は、遺伝子調節活性を有するＤＮＡ分子、すなわち、作動可能に連結された、転写可能なポリヌクレオチド分子の転写および／または翻訳に影響を及ぼす能力を有するＤＮＡ分子を指す。植物において機能する、プロモーターおよびリーダーなどの単離された調節エレメントは、そのため、遺伝子工学の方法を通して植物表現型を修飾するのに有用である。

【0029】

調節エレメントは、それらの発現パターンの効果（定性的におよび／または定量的に）、たとえばそれらの時間的、空間的、発生的、組織、環境的、生理学的、病理学的、細胞周期、および／もしくは化学的に応答性の発現パターンならびにその任意の組み合わせによってならびに定量的または定質的指標によってなどのように、正のもしくは負の効果および／または構成的なもしくは他の効果によって特徴付けられてもよい。プロモーターは、作動可能に連結された、転写可能なポリヌクレオチド分子の発現を調整するための調節エレメントとして有用である。

【0030】

本明細書において使用されるように、「遺伝子発現パターン」は、作動可能に連結されたＤＮＡ分子の、転写ＲＮＡ分子への任意のパターンの転写である。転写ＲＮＡ分子は、タンパク質分子を生成するように翻訳されてもよいまたはｄｓＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、およびその他同種のものなどのアンチセンスまたは他の調節ＲＮＡ分子をもたらしてもよい。

【0031】

本明細書において使用されるように、用語「タンパク質発現」は、転写ＲＮＡ分子の、タンパク質分子への、任意のパターンの翻訳である。タンパク質発現は、その時間的、空間的、発生的、または形態的性質によっておよび定量的または定質的指標によって特徴付けられてもよい。

【0032】

本明細書において使用されるように、用語「プロモーター」は、一般に、転写を開始するために、ＲＮＡポリメラーゼＩＩおよび他のタンパク質（トランス作用性転写因子）の認識および結合に関与するＤＮＡ分子を指す。プロモーターは、遺伝子のゲノムコピーの５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）から最初に単離されてもよい。その代わりに、プロモーターは、合成的に生成されてもよいまたは操作されたＤＮＡ分子であってもよい。プロモーターはまた、キメラ、すなわち、２つ以上の異種ＤＮＡ分子の融合を通して生成されたプロモーターであってもよい。本発明を実施するのに有用なプロモーターは、配列番号２、６、８、１０、１２、１６３、および１６９のいずれかまたは配列番号１３〜１９９、２１１、および２１２のいずれかまたはその断片もしくはバリアント内に構成されるプロモーターエレメントを含む。本発明の特定の実施形態において、本明細書において記載されているそのような分子および任意のバリアントまたはその誘導体が、プロモーター活性を含むとしてさらに定義される、すなわち、トランスジェニック植物においてなどのように、宿主細胞においてプロモーターとして働くことができる。さらに特定の実施形態において、断片が、それが由来する出発プロモーター分子が持つプロモーター活性を示すとして定義されてもよいまたは断片が、基本レベルの転写をもたらし、転写の開始のためのＲＮＡポリメラーゼＩＩ複合体の認識および結合のためのＴＡＴＡボックスもしくは等価な配列から構成される「最小限のプロモーター」を含んでいてもよい。

【0033】

一実施形態において、プロモーター分子の断片が、提供される。プロモーター断片は、上記に記載されているように、プロモーター活性をもたらし、単独でまたはキメラプロモーターを構築する際などのように、他のプロモーターおよびプロモーター断片と組み合わせて有用であってもよい。特定の実施形態において、本明細書において開示されるプロモーター活性を有するポリヌクレオチド分子の少なくとも約５０、９５、１５０、２５０、５００、７５０、または少なくとも約１０００以上の連続ヌクレオチドを含むプロモーターの断片が提供される。

【0034】

配列番号２、６、８、１０、１２、１６３、および１６９として示されるプロモーターまたはたとえば内部欠失もしくは５’欠失などの、配列番号１３〜１９９、２１１、および２１２内に構成されるプロモーターエレメントのいずれかに由来する組成物は、発現に対して正の効果もしくは負の効果を有するエレメントを除去すること；発現に対して正の効果もしくは負の効果を有するエレメントを重複させること；および／または発現に対して、組織もしくは細胞特異的な効果を有するエレメントを重複させるもしくは除去することを含めて、発現を改善するまたは改変するために生成することができる。配列番号２、６、８、１０、１２、１６３、および１６９として示されるプロモーターまたはＴＡＴＡボックスエレメントまたはその等価な配列および下流の配列が除去されている３’欠失から構成される配列番号１３〜１９９、２１１、および２１２内に構成されるプロモーターエレメントのいずれかに由来する組成物は、たとえば、エンハンサーエレメントを作製するために使用することができる。さらなる欠失は、発現に対して正のもしくは負の；組織特異的な；細胞特異的な；またはタイミング特異的な（これに限定されないが概日リズムなど）効果を有する任意のエレメントを除去するように作製することができる。配列番号２、６、８、１０、１２、１６３、および１６９として示されるプロモーターまたは配列番号１３〜１９９、２１１、および２１２内に構成されるプロモーターエレメントならびにそれに由来する断片またはエンハンサーのいずれかは、他のエンハンサーならびにプロモーターに作動可能に連結された、配列番号２、６、８、１０、１２、１６３、および１６９として示されるプロモーターまたは配列番号１３〜１９９、２１１、および２１２内に構成されるプロモーターエレメントならびにそれに由来する断片またはエンハンサーのいずれかから構成されるキメラ転写調節エレメント組成物を作製するために使用することができる。特定の導入遺伝子の所望の発現の側面に対する、本明細書において記載されている修飾、重複、または欠失の有効性は、作製された変化および出発分子中の変化の目標に依存して変化し得る結果を検証するために、本明細書における効果的な実施例において記載されているものなどの、安定した一時的な植物アッセイにおいて実験的に試験されてもよい。

【0035】

本明細書において使用されるように、用語「リーダー」は、遺伝子のゲノムコピーの非翻訳５’領域（５’ＵＴＲ）から単離され、転写開始部位（ＴＳＳ）およびタンパク質コード配列開始部位の間のヌクレオチドセグメントとして一般に定義されるＤＮＡ分子を指す。その代わりに、リーダーは、合成的に生成されたまたは操作されたＤＮＡエレメントであってもよい。リーダーは、作動可能に連結された転写可能なポリヌクレオチド分子の発現を調整するための５’調節エレメントとして使用することができる。リーダー分子は、異種プロモーターまたはそれらの天然のプロモーターと共に使用されてもよい。本発明のプロモーター分子は、したがって、それらの天然のリーダーに作動可能に連結されてもよいまたは異種リーダーに作動可能に連結されてもよい。本発明を実施するのに有用なリーダーは、配列番号３、１６４、１６６、および１７０または配列番号１３〜１９９、２１１、および２１２内に構成されるリーダーエレメントまたはその断片もしくはバリアントを含む。特定の実施形態において、そのような配列が、たとえば、トランスジェニック植物細胞を含む宿主細胞においてリーダーとして作用することができるとして提供され、定義されてもよい。一実施形態において、そのような配列が、リーダー活性を含むと解読される。

【0036】

配列番号３、１６４、１６６、および１７０として示されるリーダー配列（５’ＵＴＲ）または配列番号１３〜１９９、２１１、および２１２のいずれかの内に構成されるリーダーエレメントは、調節エレメントから構成されてもよいまたは導入遺伝子の転写もしくは翻訳に対して効果を有する二次構造を採用してもよい。配列番号３、１６４、１６６、および１７０として示されるリーダー配列または配列番号１３〜１９９、２１１、および２１２内に構成されるリーダーエレメントは、導入遺伝子の転写または翻訳に影響を及ぼすキメラ調節エレメントを作製するために、本発明に従って使用することができる。さらに、配列番号３、１６４、１６６、および１７０として示されるリーダー配列または配列番号１３〜１９９、２１１、および２１２のいずれかの内に構成されるリーダーエレメントは、導入遺伝子の転写または翻訳に影響を及ぼすキメラリーダー配列を作製するために使用することができる。

【0037】

新しい植物宿主の中への外来遺伝子の導入は、必ずしも、入って来る遺伝子の高度な発現をもたらすとは限らない。さらに、複雑な形質を扱う場合、空間的にまたは時間的に異なる発現パターンを有するいくつかの遺伝子を調整することが時々必要である。イントロンは、主にそのような調整をもたらすことができる。しかしながら、１つのトランスジェニック植物における同じイントロンの複数の使用は、不利益を示すことが示された。それらの場合において、適切な組換えＤＮＡエレメントの構築のための基本的な制御エレメントの集合物を有することが必要である。発現を増強する特性を有する、当技術分野において知られているイントロンの利用可能な集合物が限られているので、他の選択肢が必要とされる。

【0038】

配列番号４、１６５、および１７１として示されるイントロンまたは配列番号１３〜１９９、２１１、および２１２内に構成されるイントロンエレメントのいずれかに由来する組成物は、シス調節エレメントの内部欠失もしくは重複の改変から構成することができるならびに／またはイントロン／エクソンスプライスジャンクションを含む５’および３’配列は、プロモーター＋リーダーまたはキメラプロモーター＋リーダーおよびコード配列に作動可能に連結された場合に、発現または発現の特異性を改善するために使用することができる。イントロン／エクソンスプライスジャンクションを含む５’および３’領域の改変はまた、メッセンジャーＲＮＡのプロセシングおよびスプライシングの後に結果として生じる転写物において生成される間違った開始および終止コドンの導入の可能性を低下させるために成すことができる。イントロンは、導入遺伝子の発現に対するイントロンの効果を決定するために、効果的な実施例において記載されているように、実験的に試験することができる。

【0039】

本発明に従って、プロモーターまたはプロモーターの断片は、既知のプロモーターエレメント、すなわち、ＴＡＴＡボックスおよび他の既知の転写因子結合部位モチーフなどのＤＮＡ配列特徴の存在について分析されてもよい。そのような知られているプロモーターエレメントの特徴は、もとのプロモーターと同様の発現パターンを有するバリアントを設計するために当業者によって使用されてもよい。

【0040】

本明細書において使用されるように、用語「エンハンサー」または「エンハンサーエレメント」は、全体的な発現パターンのある側面を与えるが、通常、作動可能に連結されたポリヌクレオチド配列の転写を駆動するのに単独では不十分であるシス作用性転写調節エレメント、別名、シスエレメントを指す。プロモーターと異なり、エンハンサーエレメントは、通常、転写開始部位（ＴＳＳ）もしくはＴＡＴＡボックスまたは等価な配列を含まない。プロモーターは、作動可能に連結されたポリヌクレオチド配列の転写に影響を及ぼす、１つまたは複数のエンハンサーエレメントを自然に含んでいてもよい。単離されたエンハンサーエレメントはまた、遺伝子発現の全体的な調整の側面を与えるキメラプロモーター．シスエレメントを生成するためにプロモーターに融合されてもよい。プロモーターまたはプロモーターの断片は、作動可能に連結された遺伝子の転写を達成する、１つまたは複数のエンハンサーエレメントを含んでいてもよい。多くのプロモーターエンハンサーエレメントは、ＤＮＡ結合タンパク質に結合しおよび／またはＤＮＡの形態に影響を及ぼし、ＤＮＡ鋳型へのＲＮＡポリメラーゼの接近を選択的に可能にするもしくは制限するまたは転写開始の部位での二重らせんの選択的な開口を促進する局所的な立体構造をもたらすと考えられる。エンハンサーエレメントは、転写を調節する転写因子に結合するように機能してもよい。いくつかのエンハンサーエレメントが、２つ以上の転写因子に結合し、転写因子は、２つ以上のエンハンサードメインと様々な親和性で相互作用してもよい。エンハンサーエレメントは、欠失分析、すなわちプロモーターの５’末端または内部から１つまたは複数のヌクレオチドを欠失させること；ＤＮアーゼＩフットプリント法を使用するＤＮＡ結合タンパク質分析、メチル化干渉、電気泳動移動度シフトアッセイ、ライゲーション媒介性のＰＣＲによるインビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）ゲノムフットプリント法、および他の従来のアッセイを含む、多くの技術によって；またはＢＬＡＳＴなどの従来のＤＮＡ配列比較法と共に、標的配列もしくは標的モチーフとして、既知のシスエレメントモチーフもしくはエンハンサーエレメントを使用するＤＮＡ配列類似性分析によって同定することができる。エンハンサードメインの微細構造は、１つまたは複数のヌクレオチドの突然変異誘発（もしくは置換）によってまたは他の従来の方法によってさらに研究することができる。エンハンサーエレメントは、化学合成によってまたはそのようなエレメントを含む調節エレメントからの単離によって得ることができ、それらは、続く操作を促進するのに有用な制限酵素部位を含有する、さらなる、側面に位置するヌクレオチドと共に合成することができる。したがって、作動可能に連結された転写可能なポリヌクレオチド分子の発現を調整するための、本明細書において開示される方法によるエンハンサーエレメントの設計、構築、および使用が、本発明によって包含される。

【0041】

植物において、遺伝子コンストラクトにおけるいくつかのイントロンの包含は、イントロンを欠くコンストラクトに比べて、ｍＲＮＡの増加およびタンパク質蓄積につながる。この効果は、遺伝子発現の「イントロン媒介性の増強」（ＩＭＥ）と称された［Ｍａｓｃａｒｅｎｈａｓ ｅｔ ａｌ．， （１９９０） Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １５：９１３−９２０］。植物における発現を刺激することが知られているイントロンは、とうもろこし遺伝子において［たとえばｔｕｂＡ１、Ａｄｈ１、Ｓｈ１、Ｕｂｉ１（Ｊｅｏｎ ｅｔ ａｌ． （２０００） Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． １２３：１００５−１０１４；Ｃａｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ． （１９８７） Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ． １：１１８３−１２００；Ｖａｓｉｌ ｅｔ ａｌ． （１９８９） Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． ９１：１５７５−１５７９；Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ． （１９９２） Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １８：６７５−６８９］およびイネ遺伝子において［たとえばｓａｌｔ、ｔｐｉ：ＭｃＥｌｒｏｙ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ２：１６３−１７１ （１９９０）；Ｘｕ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． １０６：４５９−４６７ （１９９４）］、同定された。同様に、ツクバネアサガオ（たとえばｒｂｃＳ）、ジャガイモ（たとえばｓｔ−ｌｓ１）由来のならびにシロイヌナズナ（たとえばｕｂｑ３およびｐａｔ１）由来のもののような双子葉植物遺伝子由来のイントロンは、遺伝子発現率を上昇させることが分かった［Ｄｅａｎ ｅｔ ａｌ． （１９８９） Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １：２０１−２０８；Ｌｅｏｎ ｅｔ ａｌ． （１９９１） Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． ９５：９６８−９７２；Ｎｏｒｒｉｓ ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２１：８９５−９０６；Ｒｏｓｅ ａｎｄ Ｌａｓｔ （１９９７） Ｐｌａｎｔ Ｊ．１１：４５５−４６４］。イントロンのスプライス部位内の欠失または突然変異が遺伝子発現を低下させることが示され、スプライシングがＩＭＥに必要とされるかもしれないことを示した［Ｍａｓｃａｒｅｎｈａｓ ｅｔ ａｌ． （１９９０） Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． １５：９１３−９２０；Ｃｌａｎｃｙ ａｎｄ Ｈａｎｎａｈ （２００２） Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． １３０：９１８−９２９］。しかしながら、スプライシングがそれ自体、双子葉植物におけるあるＩＭＥについて必要とされないことが、シロイヌナズナ由来のｐａｔ１遺伝子のスプライス部位内の点突然変異によって示された［Ｒｏｓｅ ａｎｄ Ｂｅｌｉａｋｏｆｆ （２０００） Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． １２２：５３５−５４２］。

【0042】

組換え発現カセットの中へのいくつかのイントロン挿入が、発現を増強しないので、イントロンによる遺伝子発現の増強は、一般的な現象ではない［たとえば、双子葉植物遺伝子（エンドウマメ由来のｒｂｃＳ遺伝子、マメ由来のファゼオリン遺伝子、およびジャガイモ由来のｓｔｌｓ−１遺伝子）由来のイントロンならびにとうもろこし遺伝子由来のイントロン （ａｄｈ１遺伝子、第９のイントロンおよびｈｓｐ８１遺伝子、第１のイントロン）］［Ｃｈｅｅ ｅｔ ａｌ． （１９８６） Ｇｅｎｅ ４１：４７−５７；Ｋｕｈｌｅｍｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９８８） Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ ２１２：４０５−４１１；Ｍａｓｃａｒｅｎｈａｓ ｅｔ ａｌ． （１９９０） Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １５：９１３−９２０；Ｓｉｎｉｂａｌｄｉ ａｎｄ Ｍｅｔｔｌｅｒ （１９９２） Ｉｎ ＷＥ Ｃｏｈｎ， Ｋ Ｍｏｌｄａｖｅ， ｅｄｓ， Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ ４２． Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ｐｐ ２２９−２５７；Ｖａｎｃａｎｎｅｙｔ ｅｔ ａｌ． １９９０ Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ． ２２０：２４５−２５０］。そのため、トランスジェニック植物における非内因性遺伝子または内因性遺伝子の遺伝子発現レベルを操作するためにそれぞれのイントロンを用いることができない。所定の遺伝子の発現率を増強するためにどの特徴または特異的配列の特徴がイントロン配列中に存在しなければならないかは、先行技術において知られておらず、そのため、先行技術から所定の植物イントロンが、異種で使用された場合に、ＩＭＥを引き起こすかどうかを予測することは可能ではない。

【0043】

本明細書において使用されるように、用語「キメラ」は、第１のＤＮＡ分子を第２のＤＮＡ分子に融合させることによって生成された単一のＤＮＡ分子を指し、第１のＤＮＡ分子も、第２のＤＮＡ分子も、通常、その立体配置で見出されないであろう、すなわち、他のものに融合されているであろう。キメラＤＮＡ分子は、したがって、自然界において他の場合に通常見出されない新しいＤＮＡ分子である。本明細書において使用されるように、用語「キメラプロモーター」は、ＤＮＡ分子のそのような操作を通して生成されたプロモーターを指す。キメラプロモーターは、２つ以上のＤＮＡ断片を組み合わせてもよい；例として、エンハンサーエレメントに対するプロモーターの融合があるであろう。したがって、作動可能に連結された転写可能なポリヌクレオチド分子の発現を調整するための、本明細書において開示される方法によるキメラプロモーターの設計、構築、および使用が、本発明によって包含される。

【0044】

本明細書において使用されるように、用語「バリアント」は、組成が同様であるが、第１のＤＮＡ分子と同一でない第２のＤＮＡ分子を指すが、第２のＤＮＡ分子はなお、第１のＤＮＡ分子の、一般的な機能性、すなわち同じまたは同様の発現パターンを維持する。バリアントは、異なる制限酵素部位ならびに／または内部欠失、置換、および／もしくは挿入を有するものなどの、第１のＤＮＡ分子のより短いもしくは切断型バージョンならびに／または第１のＤＮＡ分子の配列の改変バージョンであってもよい。「バリアント」はまた、参照配列の１つまたは複数のヌクレオチドの置換、欠失、および／または挿入を含むヌクレオチド配列を有する調節エレメントを包含することができ、誘導体調節エレメントが、対応する親調節分子よりも高いもしくは低いまたは等価な転写または翻訳活性を有する。調節エレメント「バリアント」はまた、細菌および植物細胞形質転換において天然に存在する突然変異から生じるバリアントを包含してもよい。本発明において、配列番号１〜１９９、２１１、および２１２として提供されるポリヌクレオチド配列は、なお一般的な機能性、すなわち、もとの調節エレメントと同じまたはそれと同様の発現パターンを維持しながら、組成が同様であるが、もとの調節エレメントのポリヌクレオチド配列と同一でないバリアントを作出するために使用されてもよい。本発明のそのようなバリアントの生成は、本開示に照らして当技術分野の通常の技術の範囲内に十分にあり、本発明の範囲内に包含される。キメラ調節エレメントの「バリアント」は、参照キメラ調節エレメント配列と同じ構成エレメントを含むが、キメラ調節エレメントを含む構成エレメントは、制限酵素消化およびライゲーション、ライゲーション非依存性クローニング、増幅の間のＰＣＲ産物のモジュールアセンブリー、またはキメラ調節エレメントの直接的な化学合成および当技術分野において知られている他の方法などの、当技術分野において知られている様々な方法によって適切に作用するように連結されてもよい。結果として生じる「バリアント」キメラ調節エレメントは、参照配列と同じ構成エレメントまたは同じ構成エレメントのバリアントから構成されるが、構成エレメントを作動可能に連結するために使用される配列（複数可）が異なる。本発明において、配列番号１〜１９９、２１１、および２１２として提供されるポリヌクレオチド配列は、それぞれ、参照配列を提供し、参照配列の構成エレメントが、当技術分野において知られている方法によってつながれてもよく、細菌および植物細胞形質転換において天然に存在する１つまたは複数のヌクレオチドの置換、欠失、および／もしくは挿入または突然変異からなってもよい。

【0045】

コンストラクト
本明細書において使用されるように、用語「コンストラクト」は、１つまたは複数のポリヌクレオチド分子が、機能的に適切に作用する方式で連結された、すなわち、作動可能に連結されたポリヌクレオチド分子を含む、ゲノム統合または自己複製が可能な、任意の供給源に由来する、プラスミド、コスミド、ウイルス、自己複製ポリヌクレオチド分子、ファージ、または線状もしくは環状一本鎖もしくは二本鎖ＤＮＡもしくはＲＮＡポリヌクレオチド分子などの、任意の組換えポリヌクレオチド分子を意味する。本明細書において使用されるように、用語「ベクター」は、形質転換、すなわち、宿主細胞の中への異種ＤＮＡの導入の目的で使用されてもよい、任意の組換えポリヌクレオチドコンストラクトを意味する。用語は、前述の分子のいずれかから単離された発現カセットを含む。

【0046】

本明細書において使用されるように、用語「作動可能に連結された」は、第２の分子につながれた第１の分子を指し、分子は、第１の分子が、第２の分子の機能に影響を及ぼすように配置される。２つの分子は、単一の連続分子の一部であってもよくまたはなくてもよく、隣接してもよいまたは隣接しなくてもよい。たとえば、プロモーターが細胞において興味のある、転写可能なポリヌクレオチド分子の転写を調整する場合、プロモーターは、転写可能なポリヌクレオチド分子に作動可能に連結されている。リーダーは、たとえば、それがコード配列によってコードされるポリペプチドについてのリーダーとして働くことができる場合、コード配列に作動可能に連結されている。

【0047】

本発明のコンストラクトは、一実施形態において、Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ細胞によって提供される移入分子と共に、植物細胞のゲノムの中へのＴ−ＤＮＡの統合を可能にするＴ−ＤＮＡを含む、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓから単離されたＴｉプラスミドの右側のボーダー（ＲｂまたはＡＧＲｔｕ．ＲＢ）および左側のボーダー（ＬＢまたはＡＧＲｔｕ．ＬＢ）領域を有する二重ＴｉプラスミドボーダーＤＮＡコンストラクトとして提供されてもよい（たとえば、米国特許第６，６０３，０６１号を参照されたい）。コンストラクトはまた、細菌細胞における複製機能および抗生物質選択をもたらすプラスミド骨格ＤＮＡセグメント、たとえば、ｏｒｉ３２２などのＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ複製開始点、ｏｒｉＶまたはｏｒｉＲｉなどの広宿主域複製開始点、およびスペクチノマイシンもしくはストレプトマイシンに対する抵抗性を付与するＴｎ７アミノグリコシドアデニルトランスフェラーゼ（ａａｄＡ）をコードする、Ｓｐｅｃ／Ｓｔｒｐなどの選択マーカーまたはゲンタミシン（Ｇｍ、Ｇｅｎｔ）選択マーカー遺伝子についてのコード領域を含有してもよい。植物形質転換のために、宿主細菌株は、多くの場合、Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ ＡＢＩ、Ｃ５８、またはＬＢＡ４４０４であるが、しかしながら、植物形質転換について当技術分野において知られている他の株が、本発明において機能することができる。

【0048】

方法は、転写可能なポリヌクレオチド分子がタンパク質産物として翻訳され、発現される機能的なｍＲＮＡ分子に転写されるように、コンストラクトをアセンブルし、細胞の中に導入するのに利用可能である。本発明の実施のために、たとえば、コンストラクトおよび宿主細胞を調製し、使用するための従来の組成物および方法は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ Ｖｏｌｕｍｅｓ １， ２， ａｎｄ ３ （２０００） Ｊ．Ｆ． Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｄ．Ｗ． Ｒｕｓｓｅｌｌ， ａｎｄ Ｎ． Ｉｒｗｉｎ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓにおいて見出すことができる。植物形質転換に特に適した組換えベクターを作製するための方法は、限定を伴うことなく、全体的に、米国特許第４，９７１，９０８号；第４，９４０，８３５号；第４，７６９，０６１号；および第４，７５７，０１１号において記載されているものを含む。これらのタイプのベクターはまた、科学文献においても概説されている［たとえばＲｏｄｒｉｇｕｅｚ， ｅｔ ａｌ．， Ｖｅｃｔｏｒｓ： Ａ Ｓｕｒｖｅｙ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｕｓｅｓ， Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ， Ｂｏｓｔｏｎ， （１９８８）およびＧｌｉｃｋ， ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ， ＦＬ． （１９９３）を参照されたい］。高等植物における核酸の発現に有用な典型的なベクターは、当技術分野においてよく知られており、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓの腫瘍誘発（Ｔｉ）プラスミドに由来するベクターを含む［Ｒｏｇｅｒｓ， ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １５３： ２５３−２７７ （１９８７）］。ｐＣａＭＶＣＮ移入制御ベクターを含む植物形質転換に有用な他の組換えベクターもまた、科学文献において記載されている［たとえばＦｒｏｍｍ， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８２： ５８２４−５８２８ （１９８５）を参照されたい］。

【0049】

様々な調節エレメントが、本明細書において提供されるもののいずれかを含むコンストラクトにおいて含まれていてもよい。任意のそのような調節エレメントは、他の調節エレメントと組み合わせて提供されてもよい。そのような組み合わせは、望ましい調節特徴をもたらすように、設計するまたは修飾することができる。一実施形態において、本発明のコンストラクトが、３’転写終結分子に作動可能に連結された、転写可能なポリヌクレオチド分子に作動可能に連結された、少なくとも１つの調節エレメントを含む。

【0050】

本発明のコンストラクトは、本明細書において提供されるまたは当技術分野において知られている任意のプロモーターまたはリーダーを含んでもよい。たとえば、本発明のプロモーターは、熱ショックタンパク質遺伝子に由来するものなどの、異種非翻訳５’リーダーに作動可能に連結されてもよい（たとえば米国特許第５，６５９，１２２号および第５，３６２，８６５号を参照されたい）。その代わりに、本発明のリーダーは、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ転写物プロモーターなどの異種プロモーターに作動可能に連結されてもよい（米国特許第５，３５２，６０５号を参照されたい）。異種エレメントのそのような作動可能な連結によって与えられる発現特性は、必ずしも、それぞれのプロモーターおよびリーダーの解明された特性が付加されたものではなく、むしろ、作動可能に連結された異種プロモーターおよびリーダーによって駆動される発現についての実験による分析を通して決定される。

【0051】

本明細書において使用されるように、用語「イントロン」は、遺伝子のゲノムコピーから単離されてもよくまたは同定されてもよく、翻訳前のｍＲＮＡプロセシングの間にスプライスされた領域として一般に定義されてもよいＤＮＡ分子を指す。その代わりに、イントロンは、合成的に生成されてもよいまたは操作されたＤＮＡエレメントであってもよい。イントロンは、作動可能に連結された遺伝子の転写をもたらすエンハンサーエレメントを含有してもよい。イントロンは、作動可能に連結された、転写可能なポリヌクレオチド分子の発現を調整するための調節エレメントとして使用されてもよい。ＤＮＡコンストラクトは、イントロンを含んでいてもよく、イントロンは、転写可能なポリヌクレオチド分子配列と比較して、異種ものであってもよいまたはなくてもよい。当技術分野におけるイントロンの例は、イネアクチンイントロン（米国特許第５，６４１，８７６号）およびトウモロコシＨＳＰ７０イントロン（米国特許第５，８５９，３４７号）を含む。本発明を実施するのに有用なイントロンは、配列番号４、１６５、および１７１または配列番号１３〜１９９、２１１、および２１２のいずれかの内に構成されるイントロンエレメントを含む。

【0052】

本明細書において使用されるように、用語「３’転写終結分子」または「３’ＵＴＲ」は、ｍＲＮＡ分子の３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）を生成するために転写の間に使用されるＤＮＡ分子を指す。ｍＲＮＡ分子の３’非翻訳領域は、特異的な切断および３’ポリアデニル化（別名、ｐｏｌｙＡテール）によって生成されてもよい。３’ＵＴＲは、転写可能なポリヌクレオチド分子に作動可能に連結されてもよく、その下流に位置してもよく、ポリアデニル化シグナルおよび転写、ｍＲＮＡプロセシング、または遺伝子発現に影響を及ぼすことができる他の調節シグナルを提供するポリヌクレオチドを含んでいてもよい。ｐｏｌｙＡテールは、ｍＲＮＡの安定性および翻訳の開始において機能すると考えられる。３’転写終結分子の例は、ノパリンシンターゼ３’領域［Ｆｒａｌｅｙ， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８０： ４８０３−４８０７ （１９８３）を参照されたい］；コムギｈｓｐ１７ ３’領域；エンドウマメｒｕｂｉｓｃｏ小サブユニット３’領域；ワタＥ６ ３’領域（米国特許第６，０９６，９５０号）；ＷＯ００１１２００Ａ２において開示される３’領域；およびｃｏｉｘｉｎ ３’ＵＴＲ（米国特許第６，６３５，８０６号）である。

【0053】

３’ＵＴＲは、典型的に、特異的な遺伝子の組換え発現に有益な使用を見出す。動物系において、３’ＵＴＲの機構は、十分に定義されている［たとえばＺｈａｏ ｅｔ ａｌ．， Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｒｅｖ ６３：４０５−４４５ （１９９９）；Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ， Ｎａｔｕｒｅ ３２２：５６２−５６５ （１９８６）；Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｐｒｏｇｒｅｓｓ １９：１６２０−１６２２ （２００３）；Ｙｏｎａｈａ ａｎｄ Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ， ＥＭＢＯ Ｊ． １９：３７７０−３７７７ （２０００）；Ｃｒａｍｅｒ ｅｔ ａｌ．， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ４９８：１７９−１８２ （２００１）；Ｋｕｅｒｓｔｅｍ ａｎｄ Ｇｏｏｄｗｉｎ， Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ４：６２６−６３７ （２００３）］。ＲＮＡ転写の有効な終結は、形質の性能に干渉し得る、形質に無関係な（下流）配列の望まれない転写を予防するために必要とされる。互いに局所的に近接して複数の遺伝子発現カセットを配置することは（たとえば１つのＴ−ＤＮＡ内で）、非依存性の挿入と比較して、前記コンストラクトにおける１つまたは複数の遺伝子の遺伝子発現の抑制をもたらし得る［Ｐａｄｉｄａｍ ａｎｄ Ｃａｏ， ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ３１：３２８−３３４ （２００１）。これは、たとえば、すべてのカセットからの強力な遺伝子発現が所望される場合に、適切なレベルの発現の達成に干渉し得る。

【0054】

植物において、明確に定義されたポリアデニル化シグナル配列は、知られていない。Ｈａｓｅｇａｗａ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｊ． ３３：１０６３−１０７２， （２００３）］は、ニコチアナ シルベストリスにおいてインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）およびインビボ系において保存ポリアデニル化シグナル配列を同定することができず、一次（非ポリアデニル化）転写物の実際の長さを決定することができなかった。弱い３’ＵＴＲは、リードスルーを生じさせる可能性を有し、これは、近隣の発現カセットに位置する遺伝子の発現に影響を及ぼし得る［Ｐａｄｉｄａｍ ａｎｄ Ｃａｏ， ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ３１：３２８−３３４ （２００１）］。転写終結の適切な制御は、下流に配置する配列（たとえば他の発現カセット）へのリードスルーを予防することができ、ＲＮＡポリメラーゼの効率的な再利用をさらに可能にし、遺伝子発現を改善することができる。転写の効率的な終結（ＤＮＡからのＲＮＡポリメラーゼＩＩの放出）は、転写の再開に必須であり、それによって、全体的な転写レベルに直接影響を及ぼす。転写終結に続いて、成熟ｍＲＮＡは、合成の部位および鋳型から細胞質に放出される。真核生物のｍＲＮＡは、ｐｏｌｙ（Ａ）形態としてインビボにおいて蓄積され、その結果、従来の方法によって転写終結部位を検出するのは困難となる。しかしながら、バイオインフォマティクスの方法による機能的で効率的な３’ＵＴＲの予測は、有効な３’ＵＴＲの容易な予測を可能にする保存配列がないという点で困難である。

【0055】

実際的見地から、導入遺伝子カセットにおいて使用される３’ＵＴＲが、以下の特徴を有することが典型的に有益である。３’ＵＴＲは、導入遺伝子の転写を効率的にかつ有効に終結することができ、かつ１つのＴ−ＤＮＡ中に存在する複数のカセットの場合のように他の導入遺伝子カセットから構成され得る任意の近隣ＤＮＡ配列またはＴ−ＤＮＡが挿入された近隣染色体ＤＮＡへの転写のリードスルーを予防するべきである。３’ＵＴＲは、導入遺伝子の発現を駆動するために使用されるプロモーター、リーダー、およびイントロンによって与えられる転写活性における低下を引き起こすべきでない。植物バイオテクノロジーにおいて、３’ＵＴＲは、多くの場合、形質転換植物から抽出された逆転写ＲＮＡの増幅反応の始動に使用され、また、（１）植物染色体の中に一度統合された導入遺伝子カセットの転写活性または発現を評価する；（２）植物ＤＮＡ内の挿入のコピー数を評価する；および（３）育種の後に結果として生じる種子の接合性を評価するのに使用される。３’ＵＴＲはまた、挿入されたカセットが完全であることを特徴付けるために形質転換植物から抽出されたＤＮＡの増幅反応において使用される。

【0056】

植物における導入遺伝子の発現を提供するのに有用な３’ＵＴＲは、アワ［セタリア イタリカ（Ｌ．） Ｂｅａｕｖ］に由来する種子、花、および他の組織から単離されたメッセンジャーＲＮＡから作製されたｃＤＮＡライブラリーにおいて発現配列タグ（ＥＳＴ）の発現に基づいて同定されてもよい。ｃＤＮＡのライブラリーは、花組織、種子、葉、および根を使用して、選択された植物種から単離された組織から作製される。結果として生じるｃＤＮＡは、様々な配列決定方法を使用して配列決定される。結果として生じるＥＳＴは、ｃｌｃ＿ｒｅｆ＿ａｓｓｅｍｂｌｅ＿ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０１．３７１３９（ＣＬＣ ｂｉｏ ＵＳＡ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ ０２１４２）などのバイオインフォマティクスソフトウェアを使用して、クラスターにアセンブルされる。それぞれのクラスターの転写物存在量は、それぞれのクラスターについてｃＤＮＡ読み取りの数を数えることによって決定される。同定された３’ＵＴＲは、ｃＤＮＡ配列に由来する配列およびゲノムＤＮＡに由来する配列から構成されてもよい。ｃＤＮＡ配列は、プライマーを設計するために使用され、これらは、その後、より長い終結配列をもたらすために、対応するゲノムＤＮＡ配列の３’領域をクローニングするためにメーカーのプロトコールに従って構築されたＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒ（商標）（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ）ライブラリーと共に使用される。それぞれの組織ライブラリーについての観察された配列読み取りの直接的なカウントまたは標準化されたカウントによる相対的な転写物存在量の分析は、発現のパターンについて特性を推測するために使用することができる。たとえば、いくつかの３’ＵＴＲは、葉に対立するものとして根組織においてより高度な存在量で見られた転写物において見出されてもよい。これは、転写物が、根において高度に発現され、根発現の特性が、プロモーター、リード、イントロン、または３’ＵＴＲの転写調節に起因し得ることを示唆する。特異的な器官、組織、または細胞型内の発現の特性によって同定される３’ＵＴＲの実験による試験は、それらの特異的な器官、組織、または細胞型における発現を増強する３’ＵＴＲの特徴をもたらすことができる。

【0057】

コンストラクトおよびベクターはまた、タンパク質産物を、特に葉緑体、白色体、もしくは他の色素体細胞小器官；ミトコンドリア；ペルオキシソーム；液胞；または細胞外の位置に向けるのに有用である、連結ペプチドを発現する輸送ペプチドコード配列を含んでいてもよい。葉緑体輸送ペプチドの使用の記載については、米国特許第５，１８８，６４２号および米国特許第５，７２８，９２５号を参照されたい。多くの葉緑体局在化タンパク質は、前駆体として、核内遺伝子から発現され、葉緑体輸送ペプチド（ＣＴＰ）によって葉緑体に向けられる。そのような単離緑葉タンパクの例は、リブロース−１，５，−ビスリン酸カルボキシラーゼの小サブユニット（ＳＳＵ）、フェレドキシン、フェレドキシンオキシドレダクターゼ、集光性複合体（ｌｉｇｈｔ ｈａｒｖｅｓｔｉｎｇ ｃｏｍｐｌｅｘ）タンパク質Ｉおよびタンパク質ＩＩ、チオレドキシンＦ、エノールピルビルシキミ酸リン酸シンターゼ（ＥＰＳＰ）、ならびに米国特許第７，１９３，１３３号において記載されている輸送ペプチドと関連するものを含むが、これらに限定されない。非緑葉タンパク質が、異種ＣＴＰとのタンパク質融合物の使用によって葉緑体に向けられるかもしれないことおよびＣＴＰが、葉緑体にタンパク質を向けるのに十分であることがインビボおよびインビトロにおいて実証された。シロイヌナズナＥＰＳＰ ＣＴＰ（ＣＴＰ２）［Ｋｌｅｅ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ． ２１０：４３７−４４２ （１９８７）を参照されたい］またはペチュニアＥＰＳＰ ＣＴＰ（ＣＴＰ４）［ｄｅｌｌａ−Ｃｉｏｐｐａ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８３：６８７３−６８７７ （１９８６）を参照されたい］などの適した葉緑体輸送ペプチドの組み込みは、トランスジェニック植物において葉緑体に異種ＥＰＳＰタンパク質配列を向けることが示された（米国特許第５，６２７，０６１号；第５，６３３，４３５号；および第５，３１２，９１０号ならびにＥＰ ０２１８５７１；ＥＰ １８９７０７；ＥＰ ５０８９０９；およびＥＰ ９２４２９９を参照されたい）。

【0058】

転写可能なポリヌクレオチド分子
本明細書において使用されるように、用語「転写可能なポリヌクレオチド分子」は、タンパク質コード配列を有するものおよび遺伝子抑制に有用な配列を有するＲＮＡ分子を生成するものを含むが、これらに限定されない、ＲＮＡ分子に転写可能な任意のＤＮＡ分子を指す。「導入遺伝子」は、少なくともゲノムにおけるその位置に関して宿主細胞に対して異種の転写可能なポリヌクレオチド分子および／または細胞の現世代もしくは任意の前の世代の宿主細胞のゲノムの中に人工的に組み込まれた転写可能なポリヌクレオチド分子を指す。

【0059】

本発明のプロモーターは、プロモーター分子に関して異種の転写可能なポリヌクレオチド分子に作動可能に連結されてもよい。本明細書において使用されるように、そのような組み合わせが通常自然界において見出されない場合、用語「異種の」は、２つ以上のポリヌクレオチド分子の組み合わせを指す。たとえば、２つの分子は、異なる種に由来してもよいおよび／または２つの分子は、異なる遺伝子、たとえば、同じ種由来の異なる遺伝子もしくは異なる種由来の同じ遺伝子に由来してもよい。プロモーターは、したがって、そのような組み合わせが通常自然界において見出されない場合、作動可能に連結された転写可能なポリヌクレオチド分子に関して、異種である、すなわち、その転写可能なポリヌクレオチド分子は、そのプロモーター分子と組み合わせて作動可能に連結されて天然に存在していない。

【0060】

転写可能なポリヌクレオチド分子は、一般に、ＲＮＡ転写物の発現が所望される任意のＤＮＡ分子であってもよい。ＲＮＡ転写物のそのような発現は、結果として生じるｍＲＮＡの分子、したがってタンパク質発現の翻訳をもたらしてもよい。その代わりに、たとえば、転写可能なポリヌクレオチド分子は、特異的な遺伝子またはタンパク質の発現の減少を最終的に引き起こすように設計されてもよい。一実施形態において、これは、アンチセンス方向に方向づけられた、転写可能なポリヌクレオチド分子を使用することによって達成されてもよい。手短に言えば、アンチセンスの転写可能なポリヌクレオチド分子が転写されると、ＲＮＡ産物は、細胞の内部で相補的ＲＮＡ分子にハイブリダイズし、捕捉する。この二重鎖ＲＮＡ分子は、細胞の翻訳機構によってタンパク質に翻訳することができず、細胞において分解される。任意の遺伝子が、このように負に調節されてもよい。

【0061】

したがって、本発明の一実施形態は、コンストラクトが植物細胞のゲノムに統合された場合に、所望のレベルでまたは所望のパターンで、転写可能なポリヌクレオチド分子の転写を調整するように、転写可能なポリヌクレオチド分子に作動可能に連結された、配列番号１〜１９９、２１１、および２１２として提供されるものなどの、本発明の調節エレメントである。一実施形態において、転写可能なポリヌクレオチド分子が、遺伝子のタンパク質コード領域を含み、プロモーターが、タンパク質産物として翻訳され、発現されるＲＮＡ分子の転写に影響を及ぼす。他の実施形態において、転写可能なポリヌクレオチド分子が、遺伝子のアンチセンス領域を含み、プロモーターが、標的宿主細胞において興味のある特異的なＲＮＡ分子の発現を阻害するように、アンチセンスＲＮＡ分子、二本鎖ＲＮＡ、または他の類似する阻害性のＲＮＡ分子の転写に影響を及ぼす。

【0062】

農学的に重要な遺伝子
転写可能なポリヌクレオチド分子は、農学的に重要な遺伝子であってもよい。本明細書において使用されるように、用語「農学的に重要な遺伝子」は、特定の植物組織、細胞、または細胞型において発現された場合に、植物形態、生理機能、成長、発生、収量、産物、栄養プロファイル、病気もしくは病虫害抵抗性、および／または環境的なもしくは化学的な耐性と関連するなどの望ましい特徴を与える、転写可能なポリヌクレオチド分子を指す。農学的に重要な遺伝子は、収量タンパク質、ストレス抵抗性タンパク質、発生制御タンパク質、組織分化タンパク質、分裂組織タンパク質、環境応答性タンパク質、老化タンパク質、ホルモン応答性タンパク質、脱離タンパク質、ソースタンパク質、シンクタンパク質、花制御タンパク質、種子タンパク質、除草剤抵抗性タンパク質、耐病性タンパク質、脂肪酸生合成酵素、トコフェロール生合成酵素、アミノ酸生合成酵素、殺虫性タンパク質、または抑制のための特定の遺伝子を標的にするアンチセンスもしくはＲＮＡｉ分子などの任意の他の作用物質をコードするものを含むが、これらに限定されない。農学的に重要な遺伝子の産物は、植物生理機能または代謝に対する効果を引き起こすように植物内で作用してもよいまたは植物をえさとする有害生物の食餌において殺虫剤として作用してもよい。

【0063】

本発明の一実施形態において、本発明のプロモーターが、プロモーターが農学的に重要な遺伝子である転写可能なポリヌクレオチド分子に作動可能に連結されるように、コンストラクトの中に組み込まれる。農学的に重要な遺伝子の発現は、農業経済学的に有益な形質を与えるのに望ましい。有益な農業形質は、たとえば、除草剤耐性、昆虫防除、改良された収量、菌類病抵抗性、ウイルス抵抗性、線虫抵抗性、細菌病抵抗性、植物成長および発生、デンプン産生、改良された油産生、高度な油産生、改良された脂肪酸含有量、高タンパク質産生、果実成熟、動物およびヒトに対する栄養の増強、生体高分子、環境ストレス抵抗性、医薬ペプチドおよび分泌性ペプチド、改善されたプロセシング形質、改善された消化率、酵素産生、風味、窒素固定、ハイブリッド種子産生、繊維産生、ならびにバイオ燃料産生であってもよいが、これらに限定されない。農学的に重要な遺伝子の例は、除草剤抵抗性（米国特許第第６，８０３，５０１号；第６，４４８，４７６号；第６，２４８，８７６号；第６，２２５，１１４号；第６，１０７，５４９号；第５，８６６，７７５号；第５，８０４，４２５号；第５，６３３，４３５号；および第５，４６３，１７５号）、収量の増加（米国特許第ＵＳＲＥ３８，４４６号；第６，７１６，４７４号；第６，６６３，９０６号；第６，４７６，２９５号；第６，４４１，２７７号；第６，４２３，８２８号；第６，３９９，３３０号；第６，３７２，２１１号；第６，２３５，９７１号；第６，２２２，０９８号；および第５，７１６，８３７号）、昆虫防除（米国特許第６，８０９，０７８号；第６，７１３，０６３号；第６，６８６，４５２号；第６，６５７，０４６号；第６，６４５，４９７号；第６，６４２，０３０号；第６，６３９，０５４号；第６，６２０，９８８号；第６，５９３，２９３号；第６，５５５，６５５号；第６，５３８，１０９号；第６，５３７，７５６号；第６，５２１，４４２号；第６，５０１，００９号；第６，４６８，５２３号；第６，３２６，３５１号；第６，３１３，３７８号；第６，２８４，９４９号；第６，２８１，０１６号；第６，２４８，５３６号；第６，２４２，２４１号；第６，２２１，６４９号；第６，１７７，６１５号；第６，１５６，５７３号；第６，１５３，８１４号；第６，１１０，４６４号；第６，０９３，６９５号；第６，０６３，７５６号；第６，０６３，５９７号；第６，０２３，０１３号；第５，９５９，０９１号；第５，９４２，６６４号；第５，９４２，６５８号、第５，８８０，２７５号；第５，７６３，２４５号；および５，７６３，２４１号）、菌類病抵抗性（米国特許第６，６５３，２８０号；第６，５７３，３６１号；第６，５０６，９６２号；第６，３１６，４０７号；第６，２１５，０４８号；第５，５１６，６７１号；第５，７７３，６９６号；第６，１２１，４３６号；第６，３１６，４０７号；および第６，５０６，９６２号）、ウイルス抵抗性（米国特許第６，６１７，４９６号；第６，６０８，２４１号；第６，０１５，９４０号；第６，０１３，８６４号；第５，８５０，０２３号；および第５，３０４，７３０号）、線虫抵抗性（米国特許第６，２２８，９９２号）、細菌病抵抗性（米国特許第５，５１６，６７１号）、植物成長および発生（米国特許第６，７２３，８９７号および第６，５１８，４８８号）、デンプン産生（米国特許第６，５３８，１８１号；第６，５３８，１７９号；第６，５３８，１７８号；第５，７５０，８７６号；第６，４７６，２９５号）、改良された油産生（米国特許第６，４４４，８７６号；第６，４２６，４４７号；第６，３８０，４６２号）、高度な油産生（米国特許第６，４９５，７３９号；第５，６０８，１４９号；第６，４８３，００８号；第６，４７６，２９５号）、改良された脂肪酸含有量（米国特許第６，８２８，４７５号；第６，８２２，１４１号；第６，７７０，４６５号；第６，７０６，９５０号；第６，６６０，８４９号；第６，５９６，５３８号；第６，５８９，７６７号；第６，５３７，７５０号；第６，４８９，４６１号；第６，４５９，０１８号）、高タンパク質産生（米国特許第６，３８０，４６６号）、果実成熟（米国特許第５，５１２，４６６号）、動物およびヒトに対する栄養の増強、（米国特許第６，７２３，８３７号；第６，６５３，５３０号；第６，５４１２，５９号；第５，９８５，６０５号；第６，１７１，６４０号）、生体高分子（米国特許第ＵＳＲＥ３７，５４３号；第６，２２８，６２３号；第５，９５８，７４５号、および第６，９４６，５８８号）、環境ストレス抵抗性（米国特許第６，０７２，１０３号）、医薬ペプチドおよび分泌性ペプチド（米国特許第６，８１２，３７９号；第６，７７４，２８３号；第６，１４０，０７５号；第６，０８０，５６０号）、改善されたプロセシング形質（米国特許第６，４７６，２９５号）、改善された消化率（米国特許第６，５３１，６４８号）、低度のラフィノース（米国特許第６，１６６，２９２号）、工業用酵素産生（米国特許第５，５４３，５７６号）、改善された風味（米国特許第６，０１１，１９９号）、窒素固定（米国特許第５，２２９，１１４号）、ハイブリッド種子産生（米国特許第５，６８９，０４１号）、繊維産生（米国特許第６，５７６，８１８号；第６，２７１，４４３号；第５，９８１，８３４号；第５，８６９，７２０号）、ならびにバイオ燃料産生（米国特許第５，９９８，７００号）についてのものを含む。

【0064】

その代わりに、農学的に重要な遺伝子は、たとえばアンチセンスを介して、内因性遺伝子の遺伝子発現の調整の標的を引き起こすＲＮＡ分子（たとえば米国特許第５，１０７，０６５号を参照されたい）；阻害性のＲＮＡ［たとえば、米国特許出願公開第２００６／０２００８７８号および第２００８／００６６２０６号ならびに米国特許出願第１１／９７４，４６９号において記載されているような、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、トランス作用性ｓｉＲＮＡ、およびフェーズドｓＲＮＡ（ｐｈａｓｅｄ ｓＲＮＡ）媒介性のメカニズムを介しての遺伝子発現の調整を含む「ＲＮＡｉ」］；または同時抑制媒介性のメカニズムをコードすることによって、上記に挙げられる植物の特徴または表現型に影響を及ぼすことができる。ＲＮＡはまた、所望の内因性ｍＲＮＡ産物を切断するように遺伝子操作された触媒ＲＮＡ分子（たとえばリボザイムまたはリボスイッチ；たとえばＵＳ ２００６／０２００８７８を参照されたい）とすることもできる。したがって、農業経済学的に重要な表現型または興味のある形態変化に影響を及ぼす転写ＲＮＡ分子をコードする、任意の転写可能なポリヌクレオチド分子は、本発明の実施に有用であってもよい。転写可能なポリヌクレオチド分子が遺伝子抑制を引き起こすことができる分子に転写されるように、細胞の中にコンストラクトを構築し、導入するための方法が、当技術分野において知られている。たとえば、植物細胞における遺伝子発現を調節するためにアンチセンス方向の転写可能なポリヌクレオチド分子を有するコンストラクトを使用する転写後遺伝子抑制は、米国特許第５，１０７，０６５号および第５，７５９，８２９号において開示され、植物において遺伝子発現を調節するためにセンス方向の転写可能なポリヌクレオチド分子を有するコンストラクトを使用する転写後遺伝子抑制は、米国特許第５，２８３，１８４号および第５，２３１，０２０号において開示される。植物細胞における転写可能なポリヌクレオチドの発現はまた、植物細胞をえさとする植物有害生物を抑制するために使用することができ、たとえば、鞘翅目の有害生物から単離された組成物（米国特許出願公開ＵＳ２００７０１２４８３６）および線虫有害生物から単離された組成物（米国特許出願公開ＵＳ２００７０２５０９４７）がある。有害生物は、節足動物有害生物、線虫有害生物、および真菌または微生物有害生物を含むが、これらに限定されない。本発明のコンストラクトの中への組み込みのための例示的な転写可能なポリヌクレオチド分子は、たとえば、標的種以外の種由来のＤＮＡ分子もしくは遺伝子または同じ種に由来するもしくは存在するが、古典的な生殖もしくは育種技術ではなく、遺伝子工学方法によってレシピエント細胞の中に組み込まれる遺伝子を含む。ポリヌクレオチド分子のタイプは、植物細胞中に既に存在するポリヌクレオチド分子、他の植物由来のポリヌクレオチド分子、異なる生物由来のポリヌクレオチド分子、または遺伝子のアンチセンスメッセージを含有するポリヌクレオチド分子などの、外部的に生成されたポリヌクレオチド分子、または導入遺伝子の人工、合成、もしくは他の場合には修飾バージョンをコードするポリヌクレオチド分子を含むが、これらに限定されない。

【0065】

選択マーカー
本明細書において使用されたように、用語「マーカー」は、その発現またはその欠乏をいくつかの方法においてスクリーニングするまたはスコア化することができる任意の転写可能なポリヌクレオチド分子を指す。本発明の実施における使用のためのマーカー遺伝子は、β−グルクロニダーゼをコードする転写可能なポリヌクレオチド分子（米国特許第５，５９９，６７０号において記載されているＧＵＳ）、緑色蛍光タンパク質およびそのバリアント（米国特許第５，４９１，０８４号および第６，１４６，８２６号において記載されているＧＦＰ）、抗生物質抵抗性を与えるタンパク質、または除草剤耐性を与えるタンパク質を含むが、これらに限定されない。有用な抗生物質抵抗性マーカーは、カナマイシン（ｎｐｔＩＩ）、ヒグロマイシンＢ（ａｐｈ ＩＶ）、ストレプトマイシンまたはスペクチノマイシン（ａａｄ、ｓｐｅｃ／ｓｔｒｅｐ）、ならびにゲンタマイシン（ａａｃ３およびａａｃＣ４）に対する抵抗性を与えるタンパク質をコードするものを含む。トランスジェニック植物耐性が実証されており、本発明の方法を適用することができる除草剤は、アミノ−メチル−ホスホン酸、グリフォセート、グルホシネート、スルホニル尿素、イミダゾリノン、ブロモキシニル、デラポン（ｄｅｌａｐｏｎ）、ジカンバ、シクロヘキサンジオン、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ阻害剤、およびイソキサスフルトール（ｉｓｏｘａｓｆｌｕｔｏｌｅ）除草剤を含むが、これらに限定されない。除草剤耐性に関与するタンパク質をコードする転写可能なポリヌクレオチド分子は、５−エノイルピルビニルシキミ酸−３−リン酸シンターゼをコードする転写可能なポリヌクレオチド分子（米国特許第５，６２７，０６１号；第５，６３３，４３５号；第６，０４０，４９７号；および第５，０９４，９４５号において記載されているグリフォセート耐性についてのＥＰＳＰ）；グリフォセートオキシドレダクターゼおよびグリフォセート−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼをコードする転写可能なポリヌクレオチド分子（米国特許第５，４６３，１７５号において記載されているＧＯＸ；米国特許出願公開第２００３００８３４８０号において記載されているＧＡＴ、およびジカンバモノオキシゲナーゼ、米国特許出願公開第２００３０１３５８７９号）；ブロモキシニルニトリラーゼをコードする転写可能なポリヌクレオチド分子（米国特許第４，８１０，６４８号において記載されているブロモキシニル耐性についてのＢｘｎ）；ノルフルラゾン耐性についてＭｉｓａｗａ， ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ ４：８３３−８４０ （１９９３）およびＭｉｓａｗａ， ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ ６：４８１−４８９ （１９９４）において記載されているフィトエンデサチュラーゼ（ｃｒｔＩ）をコードする転写可能なポリヌクレオチド分子；スルホニル尿素除草剤に対する耐性についてＳａｔｈａｓｉｉｖａｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １８：２１８８−２１９３ （１９９０）において記載されているアセトヒドロキシ酸シンターゼ（ＡＨＡＳ、別名ＡＬＳ）をコードする転写可能なポリヌクレオチド分子；ならびにグルホシネートおよびビアラホス耐性についてＤｅＢｌｏｃｋ， ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ ６：２５１３−２５１９ （１９８７）において記載されているｂａｒ遺伝子を含むが、これらに限定されない。本発明のプロモーター分子は、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ、グリフォセート抵抗性ＥＰＳＰ、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ、ヒドロキシフェニルピルビン酸デヒドロゲナーゼ、ヒグロマイシンホスホトランスフェラーゼ、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ、ダラポンデハロゲナーゼ、ブロモキシニル抵抗性ニトリラーゼ、アントラニル酸シンターゼ、アリルオキシアルカノエートジオキシゲナーゼ、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ、グリフォセートオキシドレダクターゼ、およびグリフォセート−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼをコードする、連結された転写可能なポリヌクレオチド分子を発現することができる。

【0066】

分泌を、形質転換細胞を同定するまたは選択する手段として検出することができる分泌性マーカーをコードする遺伝子もまた、用語「選択マーカー」内に含まれる。例として、抗体相互作用によって同定することができる分泌性抗原またはさらに触媒作用的に検出することができる分泌性酵素をコードするマーカーを含む。選択可能な分泌マーカータンパク質は、多くのクラスに分類され、検出可能な（たとえばＥＬＩＳＡによって）小さな拡散性のタンパク質、細胞外溶液において検出可能な、小さな活性酵素（たとえばアルファ−アミラーゼ、ベータ−ラクタマーゼ、ホスフィノトリシントランスフェラーゼ）、または細胞壁中に挿入されるもしくは閉じ込められるタンパク質（伸長の発現単位において見出されるものなどのリーダー配列を含むタンパク質もしくはタバコＰＲ−Ｓとしても知られているタバコ病原性関連タンパク質など）を含む。他の可能な選択マーカー遺伝子は、当業者らに明らかであり、本発明によって包含される。

【0067】

細胞形質転換
本発明はまた、転写可能なポリヌクレオチド分子に作動可能に連結されたプロモーターを含む形質転換細胞および植物を生成する方法にも関する。

【0068】

用語「形質転換」は、レシピエント宿主の中への核酸の導入を指す。本明細書において使用されるように、用語「宿主」は、細菌、菌類、または植物を指し、細菌、菌類、または植物の任意の細胞、組織、器官、または子孫を含む。特定の興味のある植物の組織および細胞は、プロトプラスト、カルス、根、塊茎、種子、茎、葉、実生、胚、および花粉を含む。

【0069】

本明細書において使用されるように、用語「形質転換」は、コンストラクトなどの外来ポリヌクレオチド分子が導入された細胞、組織、器官、または生物を指す。導入されたポリヌクレオチド分子は、導入されたポリヌクレオチド分子が次の子孫に遺伝するように、レシピエント細胞、組織、器官、または生物のゲノムＤＮＡの中に統合されてもよい。「トランスジェニック」または「形質転換」細胞または生物はまた、細胞または生物の子孫および交雑において親としてそのようなトランスジェニック生物を用いる育種プログラムから生成され、外来ポリヌクレオチド分子の存在から結果として生じる、改変された表現型を示す子孫をも含む。用語「トランスジェニック」は、１つまたは複数の異種ポリ核酸分子を含有する細菌、菌類、または植物を指す。

【0070】

植物細胞の中にポリ核酸分子を導入するための多くの方法がある。方法は、一般に、適した宿主細胞を選択し、組換えベクターにより宿主細胞を形質転換し、形質転換宿主細胞を得る工程を含む。適した方法は、細菌感染（たとえばアグロバクテリウム）、バイナリーバクテリア人工染色体ベクター、ＤＮＡの直接的なデリバリー（たとえばＰＥＧ媒介性の形質転換、乾燥／阻害媒介性のＤＮＡ取込み、エレクトロポレーション、炭化ケイ素繊維による撹拌、およびＤＮＡコーティング粒子の加速などを介して［Ｐｏｔｒｙｋｕｓ， ｅｔ ａｌ．， Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４２： ２０５ （１９９１）において概説される］を含む。

【0071】

任意の形質転換方法は、本発明の１つまたは複数のプロモーターおよび／またはコンストラクトにより宿主細胞を形質転換するために利用されてもよい。宿主細胞は、植物細胞、藻類細胞、藻類、真菌細胞、菌類、細菌細胞、または昆虫細胞などの、任意の細胞または生物であってもよい。好ましい宿主および形質転換細胞は、植物、アスペルギルス、酵母、昆虫、細菌、および藻類由来の細胞を含む。

【0072】

再生されたトランスジェニック植物は、ホモ接合性のトランスジェニック植物をもたらすために自家受粉することができる。その代わりに、再生されたトランスジェニック植物から得られた花粉は、非トランスジェニック植物、好ましくは農業経済学的に重要な種の自殖系と交雑させてもよい。異なる形質および作物について一般に使用される育種方法の説明は、いくつかの参考図書のうちの１つにおいて見出すことができ、たとえばＡｌｌａｒｄ， Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， ＮＹ， Ｕ． ｏｆ ＣＡ， Ｄａｖｉｓ， ＣＡ， ５０−９８ （１９６０）；Ｓｉｍｍｏｎｄｓ， Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｃｒｏｐ ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ， Ｌｏｎｇｍａｎ， Ｉｎｃ．， ＮＹ， ３６９−３９９ （１９７９）；Ｓｎｅｅｐ ａｎｄ Ｈｅｎｄｒｉｋｓｅｎ， Ｐｌａｎｔ ｂｒｅｅｄｉｎｇ ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ， Ｗａｇｅｎｉｎｇｅｎ （ｅｄ）， Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｄｏｃｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ （１９７９）；Ｆｅｈｒ， Ｓｏｙｂｅａｎｓ： Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ， Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｕｓｅｓ， ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｍｏｎｏｇｒａｐｈ， １６：２４９ （１９８７）；Ｆｅｈｒ， Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｖａｒｉｅｔｙ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ， Ｔｈｅｏｒｙ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ， （Ｖｏｌ． １） ａｎｄ Ｃｒｏｐ Ｓｐｅｃｉｅｓ Ｓｏｙｂｅａｎ （Ｖｏｌ ２）， Ｉｏｗａ Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖ．， Ｍａｃｍｉｌｌａｎ Ｐｕｂ． Ｃｏ．， ＮＹ， ３６０−３７６ （１９８７）を参照されたい。逆に、非トランスジェニック植物由来の花粉は、再生されたトランスジェニック植物を受粉するために使用されてもよい。

【0073】

形質転換植物は、興味のある遺伝子の存在ならびに本発明の調節エレメントによって与えられた発現レベルおよび／またはプロファイルについて分析されてもよい。当業者らは、形質転換植物の分析に利用可能な多くの方法を知っている。たとえば、植物分析のための方法は、サザンブロットまたはノーザンブロット、ＰＣＲベースのアプローチ、生化学的分析、表現型スクリーニング法、フィールド評価、および免疫診断アッセイを含むが、これらに限定されない。転写可能なポリヌクレオチド分子の発現は、ＴａｑＭａｎ（登録商標）（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）試薬およびメーカーによって説明される方法およびＴａｑＭａｎ（登録商標） Ｔｅｓｔｉｎｇ Ｍａｔｒｉｘを使用して決定されるＰＣＲサイクルタイムを使用して測定することができる。その代わりに、Ｉｎｖａｄｅｒ（登録商標）（Ｔｈｉｒｄ Ｗａｖｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）試薬およびメーカーによって説明される方法を、導入遺伝子発現に使用することができる。

【0074】

本発明の植物の種子は、稔性トランスジェニック植物から収集することができ、本発明のコンストラクトを含み、農学的に重要な遺伝子を発現するハイブリッド植物系を含む、本発明の形質転換植物の子孫世代を成長させるために使用することができる。

【0075】

本発明はまた、本発明の植物の一部分を提供する。植物の一部分は、限定を伴うことなく、葉、茎、根、塊茎、種子、胚乳、胚珠、および花粉を含む。本発明はまた、本発明の核酸分子を含む形質転換植物細胞をも含み、提供する。

【0076】

トランスジェニック植物は、その子孫にトランスジェニックポリヌクレオチド分子を伝えてもよい。子孫は、祖先の植物に由来する導入遺伝子を含む、任意の再生可能な植物の一部分または種子を含む。トランスジェニック植物は、好ましくは、形質転換されたポリヌクレオチド分子についてホモ接合性であり、有性生殖の結果としてすべての子孫にその配列を伝える。子孫は、トランスジェニック植物によって産生された種子から成長させてもよい。その後、これらのさらなる植物は、植物の何世代にもわたって同じ特徴を示す系を生成するために自家受粉してもよい。これらの植物由来の子孫は、遺伝子発現について、とりわけ評価される。遺伝子発現は、ウエスタンブロッティング、ノーザンブロッティング、免疫沈降、およびＥＬＩＳＡなどのいくつかの一般的な方法によって検出されてもよい。

【0077】

これまでに本発明を全般的に記載したが、同じことが、例証を介して提供され、また、特に指定のない限り、本発明を限定するようには意図されない以下の実施例への参照を通してより容易に理解されるであろう。以下の実施例において開示される技術は、本発明の実施において十分に機能するように、発明者らによって発見された技術を示すことが、当業者らによって十分に理解されたい。しかしながら、当業者らは、本開示を考慮して、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、多くの変形が、開示される特定の実施形態において成され、同様のまたは類似する結果をなお得ることができ、そのため、添付の図面において記載され、示される内容はすべて、例証となるものとして解釈され、限定する意味で解釈されないことを十分に理解されたい。
実施例

【実施例1】

【0078】

調節エレメントの同定およびクローニング
新規な転写調節エレメントまたは転写調節発現エレメント群（ＥＸＰ）配列を同定し、双子葉植物種メロン（Ｃｕｃｕｍｉｓ ｍｅｌｏ）ＷＳＨ−３９−１０７０ＡＮのゲノムＤＮＡから単離した。

【0079】

転写調節エレメントは、大豆（ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ））およびシロイヌナズナ（Ａｌａｂｉｄｏｐｓｉｓ）において行われた転写プロファイリング実験に由来する私有のおよび公的なマイクロアレイデータ、ならびに、私有のメロン配列に対して、クエリーとして既知の双子葉植物配列を使用する、相同性ベースの検索に基づいて、選択した。

【0080】

同定した配列を使用して、生物情報学分析を、増幅したＤＮＡ内の調節エレメントを同定するために行い、続いて、配列中に存在する転写開始部位（ＴＳＳ）および任意の双方向性、イントロン、または上流コード配列の同定を行った。この分析の結果を使用して、調節エレメントをＤＮＡ配列内で決定し、調節エレメントを増幅するためにプライマーを設計した。それぞれの調節エレメントについて対応するＤＮＡ分子は、特有の制限酵素部位とメロンから単離したゲノムＤＮＡを含有するプライマーを用いて、標準的なポリメラーゼ連鎖反応条件を使用して増幅した。結果として生じるＤＮＡ断片は、適合する制限部位の標準的な制限酵素消化およびＤＮＡライゲーション方法を使用して、基本植物発現ベクターの中にライゲーションした。

【0081】

調節エレメントＴＳＳおよびイントロン／エクソンスプライスジャンクションの分析は、形質転換植物プロトプラストを使用して実行することができる。手短に言えば、プロトプラストを、異種転写可能ポリヌクレオチド分子に作動可能に連結された、クローニングＤＮＡ断片を含む植物発現ベクターを用いて形質転換し、５’ ＲＡＣＥ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｒａｐｉｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ Ｅｎｄｓ， Ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０（Ｉｎｖｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ９２００８）を、それによって産生されるｍＲＮＡ転写物の配列を分析することによって、調節エレメントＴＳＳおよびイントロン／エクソンスプライスジャンクションを確認するために使用する。

【0082】

ユビキチン１転写調節発現エレメント群（ＥＸＰ）をコードする配列は、上記に記載されているように分析し、それぞれの転写調節発現エレメント群（「ＥＸＰ」）はまた、それぞれの転写調節発現エレメント群を含む対応するプロモーター、リーダー、およびイントロンに分解した。同定されたユビキチン１転写調節発現エレメント群（「ＥＸＰ」）の配列は、配列番号１、５、７、９、および１１として本明細書において提供され、また、表１において下記に列挙される。対応するユビキチン１プロモーターは、配列番号２、６、８、１０、および１２として本明細書において提供される。ユビキチン１リーダーおよびイントロンは、それぞれ、配列番号３および４として本明細書において提供される。

【0083】

リーダーエレメントに作動可能に連結されたプロモーターエレメント；またはリーダーエレメントおよびイントロンエレメントに作動可能に連結されたプロモーターエレメント、またはリーダーエレメントに作動可能に連結され、イントロンエレメントに作動可能に連結され、リーダーエレメントに作動可能に連結されたプロモーターエレメントから構成される他のウリ属転写調節発現エレメント群またはＥＸＰ配列をコードする配列は、配列番号１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５９、１６２、１６７、１６８、１７２、１７５、１７６、１７７、１７８、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２１１、および２１２として提供され、また、下記の表１においても列挙される。さらなるプロモーターエレメントは、配列番号１６３および１６９として提供される。さらなるリーダーエレメントは、配列番号１６４、１６６、および１７０として提供される。さらなるイントロンエレメントは、配列番号１６５および１７１として提供される。プロモーターがリーダーエレメントに作動可能に連結されるエレメントは、配列番号１５７、１６０、１７３、１７９、および１８６として提供される。イントロンがリーダーエレメントに作動可能に連結されるエレメントは、配列番号１５８、１６１、１７４、１８０、および１８７として提供される。配列番号１３〜１９９、２１１、および２１２として提供される配列のサブセットに関して、これらの配列は、構成的発現、根発現、地上（ａｂｏｖｅ ｇｒｏｕｎｄ）発現、または種子発現などの望ましいパターンの発現を示す、異なる種の相同遺伝子由来のプロモーターによって駆動された転写プロファイリングまたは発現などの、実験の結果に基づいて選択し、クローニングした。ウリ属（Ｃｕｃｕｍｉｓ）配列によって与えられる実際の活性は、実験的に決定され、形質転換植物宿主細胞および完全なトランスジェニック植物において使用される場合、メロン以外の種由来の相同遺伝子に由来する調節エレメントと必ずしも同じではない。

【0084】

【表1-1】

【表1-2】

【表1-3】

【表1-4】

【表1-5】

【0085】

【表1-6】

【表1-7】

【表1-8】

【表1-9】

【表1-10】

【表1-11】

【表1-12】

【表1-13】

【表1-14】

【表1-15】

【表1-16】

【表1-17】

【0086】

表１において示されるように、たとえば、ＥＸＰ−ＣＵＣｍｅ．Ｕｂｑ１：１：１（配列番号１）と呼ばれる転写調節発現エレメント群（ＥＸＰ）は、メロンから単離された成分と共に、リーダーエレメント、Ｌ−ＣＵＣｍｅ．Ｕｂｑ１−１：１：１（配列番号３）の５’に作動可能に連結され、イントロンエレメント、Ｉ−ＣＵＣｍｅ．Ｕｂｑ１−１：１：１（配列番号４）の５’に作動可能に連結された、２０６８塩基対サイズ（ｂｐ）のプロモーターエレメント、Ｐ−ＣＵＣｍｅ．Ｕｂｑ１−１：１：１５（配列番号２）を含む。ＥＸＰ−ＣＵＣｍｅ．Ｕｂｑ１：１：２（配列番号５）と呼ばれる転写調節発現エレメント群（ＥＸＰ）は、メロンから単離された成分と共に、リーダーエレメント、Ｌ−ＣＵＣｍｅ．Ｕｂｑ１−１：１：１（配列番号３）の５’に作動可能に連結され、イントロンエレメント、Ｉ−ＣＵＣｍｅ．Ｕｂｑ１−１：１：１（配列番号４）の５’に作動可能に連結された、１４５９ｂｐプロモーターエレメント、Ｐ−ＣＵＣｍｅ．Ｕｂｑ１−１：１：１６（配列番号６）を含む。ＥＸＰ−ＣＵＣｍｅ．Ｕｂｑ１：１：３（配列番号７）と呼ばれる転写調節発現エレメント群（ＥＸＰ）は、メロンから単離された成分と共に、リーダーエレメント、Ｌ−ＣＵＣｍｅ．Ｕｂｑ１−１：１：１（配列番号３）の５’に作動可能に連結され、イントロンエレメント、Ｉ−ＣＵＣｍｅ．Ｕｂｑ１−１：１：１（配列番号４）の５’に作動可能に連結された、９６４ｂｐプロモーターエレメント、Ｐ−ＣＵＣｍｅ．Ｕｂｑ１−１：１：１７（配列番号８）を含む。ＥＸＰ−ＣＵＣｍｅ．Ｕｂｑ１：１：４（配列番号９）と呼ばれる転写調節発現エレメント群（ＥＸＰ）は、メロンから単離された成分と共に、リーダーエレメント、Ｌ−ＣＵＣｍｅ．Ｕｂｑ１−１：１：１（配列番号３）の５’に作動可能に連結され、イントロンエレメント、Ｉ−ＣＵＣｍｅ．Ｕｂｑ１−１：１：１（配列番号４）の５’に作動可能に連結された、４７９ｂｐプロモーターエレメント、Ｐ−ＣＵＣｍｅ．Ｕｂｑ１−１：１：１８（配列番号１０）を含む。ＥＸＰ−ＣＵＣｍｅ．Ｕｂｑ１：１：５（配列番号１１）と呼ばれる転写調節発現エレメント群（ＥＸＰ）は、メロンから単離された成分と共に、リーダーエレメント、Ｌ−ＣＵＣｍｅ．Ｕｂｑ１−１：１：１（配列番号３）の５’に作動可能に連結され、イントロンエレメント、Ｉ−ＣＵＣｍｅ．Ｕｂｑ１−１：１：１（配列番号４）の５’に作動可能に連結された、１７３ｂｐプロモーターエレメント、Ｐ−ＣＵＣｍｅ．Ｕｂｑ１−１：１：１９（配列番号１２）を含む。

【0087】

ユビキチン１プロモーター配列のアライメントは、図１ａ〜１ｆにおいて提供される。プロモーターエレメント、Ｐ−ＣＵＣｍｅ．Ｕｂｑ１−１：１：１６（配列番号６）、Ｐ−ＣＵＣｍｅ．Ｕｂｑ１−１：１：１７（配列番号８）、Ｐ−ＣＵＣｍｅ．Ｕｂｑ１−１：１：１８（配列番号１０）、およびＰ−ＣＵＣｍｅ．Ｕｂｑ１−１：１：１９（配列番号１２）は、プロモーター、Ｐ−ＣＵＣｍｅ．Ｕｂｑ１−１：１：１５（配列番号２）の５’末端から様々な長さの欠失を導入することによって構築した。

【実施例2】

【0088】

大豆子葉プロトプラストにおいてＧＵＳを駆動する調節エレメントの分析
大豆子葉プロトプラストを、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）導入遺伝子の発現を駆動する試験転写調節発現エレメント群を含有する植物発現ベクターを用いて形質転換し、ＧＵＳの発現が既知の構成的プロモーターによって駆動される、葉プロトプラストにおけるＧＵＳ発現と比較した。

【0089】

ＥＸＰ−ＣＵＣｍｅ．Ｕｂｑ１：１：１（配列番号１）、ＥＸＰ−ＣＵＣｍｅ．Ｕｂｑ１：１：２（配列番号５）、ＥＸＰ−ＣＵＣｍｅ．Ｕｂｑ１：１：３（配列番号７）、ＥＸＰ−ＣＵＣｍｅ．Ｕｂｑ１：１：４（配列番号９）、およびＥＸＰ−ＣＵＣｍｅ．Ｕｂｑ１：１：５（配列番号１１）によって駆動される導入遺伝子の発現を、既知の構成的プロモーターからの発現と比較した。植物発現ベクターはそれぞれ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ由来の右側のボーダー領域、ジャガイモ光誘発性組織特異的ＳＴ−ＬＳ１遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ受託：Ｘ０４７５３）に由来する、プロセシング可能なイントロンを含有するβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ、配列番号２０６）についてのコード配列の５’に作動可能に連結され、海鳥綿（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｂａｒｂａｄｅｎｓｅ）Ｅ６遺伝子（Ｔ−Ｇｂ．Ｅ６−３ｂ：１：１、配列番号２０４）由来の３’終結領域、エンドウマメＲｂｃＳ２−Ｅ９遺伝子、（Ｔ−Ｐｓ．ＲｂｃＳ２−Ｅ９−１：１：６、配列番号２０３）、または海鳥綿ＦｂＬａｔｅ−２遺伝子（Ｔ−Ｇｂ．ＦｂＬ２−１：１：１、配列番号２０５）の５’に作動可能に連結された、ＥＸＰ配列または既知の構成的プロモーターから構成される第１の導入遺伝子カセット；除草剤グリフォセート（シロイヌナズナアクチン７プロモーターによって駆動される）または抗生物質、カナマイシンに対する抵抗性を与える形質転換植物細胞の選択に使用される第２の導入遺伝子選択カセット、およびＡ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ由来の左側のボーダー領域から構成された。プロモーターがない対照植物発現ベクター（ｐＭＯＮ１２４９１２）は、発現についての陰性対照として働いた。前述の試験および構成的発現エレメント群は、下記の表２において示されるように、植物発現ベクターの中にクローニングした。

【0090】

【表2】

【0091】

同時形質転換およびデータの標準化における使用のための２つのプラスミドもまた、構築した。一方の形質転換対照プラスミドは、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓノパリンシンターゼ遺伝子（Ｔ−ＡＧＲｔｕ．ｎｏｓ−１：１：１３、配列番号２０９）由来の３’終結領域の５’に作動可能に連結されたホタル（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓ）ルシフェラーゼコード配列（ＦＬｕｃ、配列番号２０７）の発現を駆動する構成的プロモーターから構成された。他方の形質転換対照プラスミドは、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓノパリンシンターゼ遺伝子由来の３’終結領域の５’に作動可能に連結されたウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ルシフェラーゼコード配列（ＲＬｕｃ、配列番号２０８）の発現を駆動する構成的プロモーターから構成された。

【0092】

植物発現ベクター、ｐＭＯＮ８０５８５、ｐＭＯＮ１０９５８４、ｐＭＯＮ１１８７５６、ｐＭＯＮ１２４９１２、ｐＭＯＮ１３８７７６、ｐＭＯＮ１３８７７７、ｐＭＯＮ１３８７７８、ｐＭＯＮ１３８７７９、およびｐＭＯＮ１３８７８０は、ＰＥＧ形質転換方法を使用して、大豆子葉プロトプラスト細胞を形質転換するために使用した。プロトプラスト細胞を、２つの形質転換対照プラスミドのそれぞれおよび試験植物発現ベクターの等モル量を用いて形質転換した。ＧＵＳおよびルシフェラーゼの活性をアッセイした。ＧＵＳおよびルシフェラーゼの両方の測定は、２つの異なる小さなウェルトレーの中に、上記のように形質転換した細胞の溶解調製物の一定分量を配置することによって行った。一方のトレーは、ＧＵＳ測定に使用し、第２のトレーは、デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイ系を使用して、デュアルルシフェラーゼアッセイを実行するために使用した（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ；たとえば、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｎｏｔｅｓ Ｍａｇａｚｉｎｅ， Ｎｏ： ５７， １９９６， ｐ．０２を参照されたい）。サンプル測定は、形質転換当たり３回または４回の反復実験を使用して行った。平均ＧＵＳおよびルシフェラーゼ値を、下記の表３に示す。

【0093】

【表3】

【0094】

大豆子葉プロトプラストにおけるそれぞれのプロモーターの相対的な活性を比較するために、ＧＵＳ値を、ルシフェラーゼ活性に対するＧＵＳの比として表現し、構成的発現エレメント群、ＥＸＰ−Ａｔ．Ａｃｔ７：１：１１およびＥＸＰ−ＣａＭＶ．３５Ｓ−ｅｎｈ＋Ｐｈ．ＤｎａＫ：１：３について観察された発現レベルに関して標準化した。下記の表４は、ＥＸＰ−Ａｔ．Ａｃｔ７：１：１１およびＥＸＰ−ＣａＭＶ．３５Ｓ−ｅｎｈ＋Ｐｈ．ＤｎａＫ：１：３に関して標準化したホタルルシフェラーゼ（ＦＬｕｃ）に対するＧＵＳの比を示す。下記の表５は、ＥＸＰ−Ａｔ．Ａｃｔ７：１：１１およびＥＸＰ−ＣａＭＶ．３５Ｓ−ｅｎｈ＋Ｐｈ．ＤｎａＫ：１：３に関して標準化したレニラ（ｒｅｎｉｌｌａ）ルシフェラーゼ（ＲＬｕｃ）に対するＧＵＳの比を示す。

【0095】

【表4】

【0096】

【表5】

【0097】

上記表４および５に見られるように、発現エレメント群、ＥＸＰ−ＣＵＣｍｅ．Ｕｂｑ１：１：１（配列番号１）、ＥＸＰ−ＣＵＣｍｅ．Ｕｂｑ１：１：２（配列番号５）、ＥＸＰ−ＣＵＣｍｅ．Ｕｂｑ１：１：３（配列番号７）、ＥＸＰ−ＣＵＣｍｅ．Ｕｂｑ１：１：４（配列番号９）、およびＥＸＰ−ＣＵＣｍｅ．Ｕｂｑ１：１：５（配列番号１１）はそれぞれ、大豆子葉プロトプラストにおいて導入遺伝子発現を駆動する能力を実証した。発現レベルは、ＥＸＰ−Ａｔ．Ａｃｔ７：１：１１よりも大きく、このアッセイにおいてＥＸＰ−Ａｔ．Ａｃｔ７：１：１１よりも２．９〜５．８（ＦＬｕｃ）または３〜７（ＲＬｕｃ）倍高度であった。発現は、ＥＸＰ−ＣａＭＶ．３５Ｓ−ｅｎｈ＋Ｐｈ．ＤｎａＫ：１：３について観察された発現と等価、またはそれよりも高度であった。発現レベルは、ＥＸＰ−ＣａＭＶ．３５Ｓ−ｅｎｈ＋Ｐｈ．ＤｎａＫ：１：３について観察された発現よりも０．８〜１．７（ＦＬｕｃ）または１〜２．４（ＲＬｕｃ）倍高度であった。

【実施例3】

【0098】

撃ち込まれた（ｂｏｍｂａｒｄｅｄ）大豆葉および根においてＧＵＳを駆動する調節エレメントの分析
大豆葉および根を、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）導入遺伝子の発現を駆動する試験転写調節発現エレメント群を含有する植物発現ベクターを用いて形質転換し、ＧＵＳの発現が既知の構成的プロモーターによって駆動される、葉および根におけるＧＵＳ発現と比較した。

【0099】

粒子を撃ち込まれた大豆葉および根において、ＥＸＰ−ＣＵＣｍｅ．Ｕｂｑ１：１：１（配列番号１）、ＥＸＰ−ＣＵＣｍｅ．Ｕｂｑ１：１：２（配列番号５）、ＥＸＰ−ＣＵＣｍｅ．Ｕｂｑ１：１：３（配列番号７）、ＥＸＰ−ＣＵＣｍｅ．Ｕｂｑ１：１：４（配列番号９）、およびＥＸＰ−ＣＵＣｍｅ．Ｕｂｑ１：１：５（配列番号１１）によって駆動される導入遺伝子の発現を、既知の構成的プロモーターからの発現と比較した。葉および根の形質転換に使用した植物発現ベクターは、上記の実施例２の表２において示すものと同じものとした。

【0100】

植物発現ベクター、ｐＭＯＮ８０５８５、ｐＭＯＮ１０９５８４、ｐＭＯＮ１１８７５６、ｐＭＯＮ１２４９１２、ｐＭＯＮ１３８７７６、ｐＭＯＮ１３８７７７、ｐＭＯＮ１３８７７８、ｐＭＯＮ１３８７７９、およびｐＭＯＮ１３８７８０を、パーティクルガン（ｐａｒｔｉｃｌｅ ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）形質転換法を使用して大豆葉および根を形質転換するために使用した。

【0101】

手短に言えば、Ａ３２４４大豆種子は表面殺菌され、１６時間明および８時間暗の光周期によりトレーにおいて発芽させた。およそ１３日後に、葉および根の組織は、実生から無菌条件下で収集し、撃ち込みに使用した。組織試料は、植物培地を含有するペトリ皿上に無作為に配置した。１０マイクログラムのプラスミドＤＮＡを、撃ち込み用の０．６ミクロンの金粒子（カタログ＃１６５−２２６２ Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）をコーティングするために使用した。マクロキャリアに、ＤＮＡコーティング金粒子（カタログ＃１６５−２３３５ Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ ＣＡ）をロードした。ＰＤＳ １０００／Ｈｅ微粒子銃を、形質転換（カタログ＃１６５−２２５７ Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ ＣＡ）に使用した。撃ち込まれた根および葉組織は、摂氏２６度で２４時間、暗中でインキュベートした。この一晩のインキュベーション後に、組織を、摂氏３７度でＧＵＳ発現について溶液中で一晩染色した。一晩の染色の後に、クロロフィルを除去し、かつＧＵＳ染色を明らかにするために、組織を、７０％エタノール中に一晩浸漬した。その後、組織を撮影し、ＧＵＳ発現のレベルを反映する「０」、「＋」〜「＋＋＋＋＋＋」の評定尺度を、それぞれのコンストラクトに割り当てた（それぞれ０−発現なし、＋〜＋＋＋＋＋＋−低度〜高度）。

【0102】

それぞれの組織において実証されたＧＵＳ導入遺伝子の発現は、安定して形質転換されたトウモロコシ植物において導入遺伝子発現を駆動するそれぞれのエレメントの能力の相対的な可能性のあるレベルおよび特異性を推測するために使用した。平均ＧＵＳ発現評定を、下記の表６に提供する。

【0103】

【表6】

【0104】

上記表６において見られるように、発現エレメント群、ＥＸＰ−ＣＵＣｍｅ．Ｕｂｑ１：１：１（配列番号１）， ＥＸＰ−ＣＵＣｍｅ．Ｕｂｑ１：１：２（配列番号５）， ＥＸＰ−ＣＵＣｍｅ．Ｕｂｑ１：１：３（配列番号７）， ＥＸＰ−ＣＵＣｍｅ．Ｕｂｑ１：１：４（配列番号９）、およびＥＸＰ−ＣＵＣｍｅ．Ｕｂｑ１：１：５（配列番号１１）はそれぞれ、粒子を撃ち込まれた、形質転換された葉および根組織において導入遺伝子発現を駆動する能力を実証した。

【実施例4】

【0105】

大豆子葉プロトプラストにおいてＧＵＳを駆動する調節エレメントの分析
大豆子葉プロトプラストを、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）導入遺伝子の発現を駆動する試験転写調節発現エレメント群を含有する植物発現ベクターを用いて形質転換し、ＧＵＳの発現が既知の構成的プロモーターによって駆動される、葉プロトプラストにおけるＧＵＳ発現と比較した。

【0106】

Ｐ−ＣＵＣｍｅ．１−１：１：１ｒｃ（配列番号１５５）、Ｐ−ＣＵＣｍｅ．２−１：１：１（配列番号１４）、Ｐ−ＣＵＣｍｅ．３−１：１：３（配列番号１５）、ＥＸＰ−ＣＵＣｍｅ．４：１：１（配列番号１５６）、ＥＸＰ−ＣＵＣｍｅ．５：１：１（配列番号１５９）、Ｐ−ＣＵＣｍｅ．６−１：１：１（配列番号１８）、Ｐ−ＣＵＣｍｅ．８−１：１：２（配列番号１９）、Ｐ−ＣＵＣｍｅ．９−１：１：２（配列番号２０）、Ｐ−ＣＵＣｍｅ．１０−１：１：１（配列番号２１）、ＥＸＰ−ＣＵＣｍｅ．ｅＥＦ１ａ：１：１（配列番号１６２）、Ｐ−ＣＵＣｍｅ．１５−１：１：２（配列番号２３）、Ｐ−ＣＵＣｍｅ．１６ａ−１：１：２（配列番号２４）、Ｐ−ＣＵＣｍｅ．１７−１：１：２（配列番号２６）、Ｐ−ＣＵＣｍｅ．１８−１：１：２（配列番号２７）、Ｐ−ＣＵＣｍｅ．１９−１：１：３（配列番号１６７）、Ｐ−ＣＵＣｍｅ．２０−１：３（配列番号２１１）、Ｐ−ＣＵＣｍｅ．２１−１：１：１（配列番号３０）、Ｐ−ＣＵＣｍｅ．２２−１：１：３（配列番号３１）、ＥＸＰ−ＣＵＣｍｅ．ＳＡＭＳ２：１：１（配列番号１６８）、Ｐ−ＣＵＣｍｅ．２６−１：１：２（配列番号３３）、Ｐ−ＣＵＣｍｅ．２８−１：１：２（配列番号３４）、およびＥＸＰ−ＣＵＣｍｅ．２９：１：２（配列番号２１２）によって駆動された導入遺伝子の発現を、既知の構成的発現エレメント群からの発現と比較した。植物発現ベクターはそれぞれ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ由来の右側のボーダー領域、ジャガイモ光誘発性組織特異的ＳＴ−ＬＳ１遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ受託：Ｘ０４７５３）に由来する、プロセシング可能なイントロンを含有するβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ、配列番号２０６）についてのコード配列の５’に作動可能に連結され、海鳥綿（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｂａｒｂａｄｅｎｓｅ）Ｅ６遺伝子（Ｔ−Ｇｂ．Ｅ６−３ｂ：１：１、配列番号２０４）由来の３’終結領域、エンドウマメＲｂｃＳ２−Ｅ９遺伝子、（Ｔ−Ｐｓ．ＲｂｃＳ２−Ｅ９１：１：６、配列番号２０３）、または海鳥綿ＦｂＬａｔｅ−２遺伝子（Ｔ−Ｇｂ．ＦｂＬ２−１：１：１、配列番号２０５）の５’に作動可能に連結された、試験プロモーターまたは既知の構成的プロモーターから構成される第１の導入遺伝子カセット；除草剤グリフォセート（シロイヌナズナアクチン７プロモーターによって駆動される）または抗生物質、カナマイシンに対する抵抗性を与える形質転換植物細胞の選択に使用される第２の導入遺伝子選択カセット、およびＡ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ由来の左側のボーダー領域から構成された。プロモーターがない対照植物発現ベクター（ｐＭＯＮ１２４９１２）は、発現についての陰性対照として働いた。前述の試験および構成的発現エレメント群は、下記の表７において示されるように、植物発現ベクターの中にクローニングした。

【0107】

【表7】

【0108】

同時形質転換およびデータの標準化における使用のための２つのプラスミドもまた、構築した。一方の形質転換対照プラスミドは、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓノパリンシンターゼ遺伝子（Ｔ−ＡＧＲｔｕ．ｎｏｓ−１：１：１３、配列番号２０９）由来の３’終結領域の５’に作動可能に連結されたホタル（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓ）ルシフェラーゼコード配列（ＦＬｕｃ、配列番号２０７）の発現を駆動する構成的プロモーターから構成された。他方の形質転換対照プラスミドは、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓノパリンシンターゼ遺伝子由来の３’終結領域の５’に作動可能に連結されたウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ルシフェラーゼコード配列（ＲＬｕｃ、配列番号２０８）の発現を駆動する構成的プロモーターから構成された。

【0109】

植物発現ベクター、ｐＭＯＮ８０５８５、ｐＭＯＮ１０９５８４、ｐＭＯＮ１１８７５６、ｐＭＯＮ１２４９１２、ｐＭＯＮ１４０８１８、ｐＭＯＮ１４０８１９、ｐＭＯＮ１４０８２０、ｐＭＯＮ１４０８２１、ｐＭＯＮ１４０８２２、ｐＭＯＮ１４０８２３、ｐＭＯＮ１４０８２４、ｐＭＯＮ１４０８２５、ｐＭＯＮ１４０８２６、ｐＭＯＮ１４０８２７、ｐＭＯＮ１４０８２８、ｐＭＯＮ１４０８２９、ｐＭＯＮ１４０８３０、ｐＭＯＮ１４０８３１、ｐＭＯＮ１４０８３２、ｐＭＯＮ１４０８３３、ｐＭＯＮ１４０８３４、ｐＭＯＮ１４０８３５、ｐＭＯＮ１４０８３６、ｐＭＯＮ１４０８３７、ｐＭＯＮ１４０８３８、およびｐＭＯＮ１４０８３９は、ＰＥＧ形質転換方法を使用して大豆子葉プロトプラスト細胞を形質転換するために使用した。プロトプラスト細胞を、２つの形質転換対照プラスミドのそれぞれおよび試験植物発現ベクターの等モル量を用いて形質転換した。ＧＵＳおよびルシフェラーゼの活性をアッセイした。ＧＵＳおよびルシフェラーゼの両方の測定は、２つの異なる小さなウェルトレーの中に、上記のように形質転換した細胞の溶解調製物の一定分量を配置することによって行った。一方のトレーは、ＧＵＳ測定に使用し、第２のトレーは、デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイ系を使用して、デュアルルシフェラーゼアッセイを実行するために使用した（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ；たとえば、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｎｏｔｅｓ Ｍａｇａｚｉｎｅ， Ｎｏ： ５７， １９９６， ｐ．０２を参照されたい）。サンプル測定は、形質転換当たり３回または４回の反復実験を使用して行った。平均ＧＵＳおよびルシフェラーゼ値を、下記の表８に示す。

【0110】

【表8】

【0111】

大豆子葉プロトプラストにおけるそれぞれのプロモーターの相対的な活性を比較するために、ＧＵＳ値を、ルシフェラーゼ活性に対するＧＵＳの比として表現し、構成的発現エレメント群、ＥＸＰ−Ａｔ．Ａｃｔ７：１：１１およびＥＸＰ−ＣａＭＶ．３５Ｓ−ｅｎｈ＋Ｐｈ．ＤｎａＫ：１：３について観察された発現レベルに関して標準化した。下記の表９は、ＥＸＰ−Ａｔ．Ａｃｔ７：１：１１およびＥＸＰ−ＣａＭＶ．３５Ｓ−ｅｎｈ＋Ｐｈ．ＤｎａＫ：１：３に関して標準化したホタルルシフェラーゼ（ＦＬｕｃ）に対するＧＵＳの比を示す。下記の表１０は、ＥＸＰ−Ａｔ．Ａｃｔ７：１：１１およびＥＸＰ−ＣａＭＶ．３５Ｓ−ｅｎｈ＋Ｐｈ．ＤｎａＫ：１：３に関して標準化したレニラ（ｒｅｎｉｌｌａ）ルシフェラーゼ（ＲＬｕｃ）に対するＧＵＳの比を示す。

【0112】

【表9】

【0113】

【表10】

【0114】

表９および１０において見られるように、試験したほとんどの発現エレメント群は、大豆子葉プロトプラスト細胞において導入遺伝子発現を駆動する能力を実証した。ある発現エレメント群、ＥＸＰ−ＣＵＣｍｅ．４：１：１（配列番号１５６）は、このアッセイにおいて、ＥＸＰ−Ａｔ．Ａｃｔ７：１：１１よりも高度な導入遺伝子発現のレベルを実証した。

【実施例5】

【0115】

撃ち込まれた大豆葉および根においてＧＵＳを駆動する調節エレメントの分析
大豆葉および根は、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）導入遺伝子の発現を駆動する試験転写調節発現エレメント群を含有する植物発現ベクターを用いて形質転換し、ＧＵＳの発現が知られている構成的プロモーターによって駆動される根および葉におけるＧＵＳ発現と比較した。

【0116】

粒子を撃ち込まれた大豆葉および根において、Ｐ−ＣＵＣｍｅ．１−１：１：１ｒｃ（配列番号１５５）、Ｐ−ＣＵＣｍｅ．２−１：１：１（配列番号１４）、Ｐ−ＣＵＣｍｅ．３−１：１：３（配列番号１５）、ＥＸＰ−ＣＵＣｍｅ．４：１：１（配列番号１５６）、ＥＸＰ−ＣＵＣｍｅ．５：１：１（配列番号１５９）、Ｐ−ＣＵＣｍｅ．６−１：１：１（配列番号１８）、Ｐ−ＣＵＣｍｅ．８−１：１：２（配列番号１９）、Ｐ−ＣＵＣｍｅ．９−１：１：２（配列番号２０）、Ｐ−ＣＵＣｍｅ．１０−１：１：１（配列番号２１）、ＥＸＰ−ＣＵＣｍｅ．ｅＥＦ１ａ：１：１（配列番号１６２）、Ｐ−ＣＵＣｍｅ．１５−１：１：２（配列番号２３）、Ｐ−ＣＵＣｍｅ．１６ａ−１：１：２（配列番号２４）、Ｐ−ＣＵＣｍｅ．１７−１：１：２（配列番号２６）、Ｐ−ＣＵＣｍｅ．１８−１：１：２（配列番号２７）、Ｐ−ＣＵＣｍｅ．１９−１：１：３（配列番号１６７）、Ｐ−ＣＵＣｍｅ．２０−１：３（配列番号２１１）、Ｐ−ＣＵＣｍｅ．２１−１：１：１（配列番号３０）、Ｐ−ＣＵＣｍｅ．２２−１：１：３（配列番号３１）、ＥＸＰ−ＣＵＣｍｅ．ＳＡＭＳ２：１：１（配列番号１６８）、Ｐ−ＣＵＣｍｅ．２６−１：１：２（配列番号３３）、Ｐ−ＣＵＣｍｅ．２８−１：１：２（配列番号３４）、およびＥＸＰ−ＣＵＣｍｅ．２９：１：２（配列番号２１２）によって駆動された導入遺伝子の発現を、既知の構成的発現エレメント群からの発現と比較した。葉および根の形質転換に使用した植物発現ベクターは、上記の実施例４の表７において示すものと同じものとした。

【0117】

植物発現ベクター、ｐＭＯＮ８０５８５、ｐＭＯＮ１０９５８４、ｐＭＯＮ１１８７５６、ｐＭＯＮ１２４９１２、ｐＭＯＮ１４０８１８、ｐＭＯＮ１４０８１９、ｐＭＯＮ１４０８２０、ｐＭＯＮ１４０８２１、ｐＭＯＮ１４０８２２、ｐＭＯＮ１４０８２３、ｐＭＯＮ１４０８２４、ｐＭＯＮ１４０８２５、ｐＭＯＮ１４０８２６、ｐＭＯＮ１４０８２７、ｐＭＯＮ１４０８２８、ｐＭＯＮ１４０８２９、ｐＭＯＮ１４０８３０、ｐＭＯＮ１４０８３１、ｐＭＯＮ１４０８３２、ｐＭＯＮ１４０８３３、ｐＭＯＮ１４０８３４、ｐＭＯＮ１４０８３５、ｐＭＯＮ１４０８３６、ｐＭＯＮ１４０８３７、ｐＭＯＮ１４０８３８、およびｐＭＯＮ１４０８３９を、パーティクルガン形質転換法を使用して大豆葉および根を形質転換するために使用した。

【0118】

手短に言えば、Ａ３２４４大豆種子は表面殺菌され、１６時間明および８時間暗の光周期によりトレーにおいて発芽させた。およそ１３日後に、葉および根の組織は、実生から無菌条件下で収集し、撃ち込みに使用した。組織試料は、植物培地を含有するペトリ皿上に無作為に配置した。１０マイクログラムのプラスミドＤＮＡを、撃ち込み用の０．６ミクロンの金粒子（カタログ＃１６５−２２６２ Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）をコーティングするために使用した。マクロキャリアに、ＤＮＡコーティング金粒子（カタログ＃１６５−２３３５ Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ ＣＡ）をロードした。ＰＤＳ １０００／Ｈｅ微粒子銃を、形質転換（カタログ＃１６５−２２５７ Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ ＣＡ）に使用した。撃ち込まれた根および葉組織は、摂氏２６度で２４時間、暗中でインキュベートした。この一晩のインキュベーション後に、組織を、摂氏３７度でＧＵＳ発現について溶液中で一晩染色した。一晩の染色の後に、クロロフィルを除去し、かつＧＵＳ染色を明らかにするために、組織を、７０％エタノール中に一晩浸漬した。その後、組織を撮影し、ＧＵＳ発現のレベルを反映する「０」、「＋」〜「＋＋＋＋＋＋」の評定尺度を、それぞれのコンストラクトに割り当てた（それぞれ０−発現なし、＋〜＋＋＋＋＋＋−低度〜高度）。

【0119】

それぞれの組織において実証されたＧＵＳ導入遺伝子の発現は、安定して形質転換されたトウモロコシ植物において導入遺伝子発現を駆動するそれぞれのエレメントの能力の相対的な可能性のあるレベルおよび特異性を推測するために使用した。平均ＧＵＳ発現評定を、下記の表１１に提供する。

【0120】

【表11】

【0121】

上記表１１において見られるように、発現エレメント群のうちの１つ以外すべては、粒子を撃ち込まれた大豆葉および根組織において導入遺伝子発現を駆動する能力を実証した。２つの発現エレメント群、Ｐ−ＣＵＣｍｅ．２８−１：１：２（配列番号３４）およびＥＸＰ−ＣＵＣｍｅ．４：１：１（配列番号１５６）は、このアッセイにおいて、ＥＸＰ−ＣａＭＶ．３５Ｓ−ｅｎｈ＋Ｐｈ．ＤｎａＫ：１：３によって駆動された発現と同様のまたはそれに比べて高度なレベルの発現を実証した。

【実施例6】

【0122】

導入遺伝子カセットアンプリコンを使用して、大豆子葉プロトプラストにおいてＧＵＳを駆動する調節エレメントの分析
大豆子葉プロトプラストを、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）導入遺伝子の発現を駆動する転写調節発現エレメント群を含有する導入遺伝子カセットアンプリコンを用いて形質転換し、ＧＵＳの発現が既知の構成的プロモーターによって駆動される、葉プロトプラストにおけるＧＵＳ発現と比較した。導入遺伝子カセットアンプリコンは、ＧＵＳコード配列（ＧＵＳ、配列番号２０６）に作動可能に連結され、３’ＵＴＲ（Ｔ−Ｇｂ．ＦｂＬ２−１：１：１、配列番号２０５）に作動可能に連結されたＥＸＰ配列から構成された。平均ＧＵＳ発現は、対照ＥＸＰエレメント、Ｐ−ＣａＭＶ．３５Ｓ−ｅｎｈ−１：１：１０２／Ｌ−ＣａＭＶ．３５Ｓ−１：１：２（配列番号２１０）およびＥＸＰ−Ａｔ．Ａｔｎｔｔ１：１：２（配列番号２００）と比較した。

【0123】

同時形質転換およびデータの標準化における使用のためのプラスミドもまた、実施例２において上記に記載されているものと同様の方法で使用した。一方の形質転換対照プラスミドは、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓノパリンシンターゼ遺伝子（Ｔ−ＡＧＲｔｕ．ｎｏｓ−１：１：１３、配列番号２０９）由来の３’終結領域の５’に作動可能に連結されたホタル（フォチナス・フィラリス）ルシフェラーゼコード配列（ＦＬｕｃ、配列番号２０５）の発現を駆動する構成的プロモーターから構成された。

【0124】

下記の表１２は、それぞれの導入遺伝子アンプリコンによって与えられた平均ＧＵＳ発現値を示す。下記の表１３は、ＥＸＰ−Ａｔ．Ａｔｎｔｔ１：１：２およびＰ−ＣａＭＶ．３５Ｓ−ｅｎｈ−１：１：１０２／Ｌ−ＣａＭＶ．３５Ｓ−１：１：２に関して標準化したホタルルシフェラーゼ（ＦＬｕｃ）に対するＧＵＳの比を示す。

【0125】

【表12-1】

【表12-2】

【0126】

【表13-1】

【表13-2】

【0127】

上記表１２において見られるように、すべてのＥＸＰ配列が、プロモーターなしの対照と比較した場合に、導入遺伝子発現を駆動する能力を実証したわけではなかった。しかしながら、ＥＸＰ配列、ＣｕｍＭｅ＿ＷＳＭ＿ＳＦ１６４２９．Ｇ５６７０（配列番号４０）、Ｐ−ＣＵＣｍｅ．ＣｕｍＭｅ＿ＷＳＭ＿ＳＦ１６４４４．Ｇ５１４０−１：１：１（配列番号１７５）、Ｐ−ＣＵＣｍｅ．ＣｕｍＭｅ＿ＷＳＭ＿ＳＦ１６５６３．Ｇ５５６０−１：１：１（配列番号１７６）、ＣｕｍＭｅ＿ＷＳＭ＿ＳＦ１７０５１．Ｇ５４７０（配列番号４８）、Ｐ−ＣＵＣｍｅ．ＣｕｍＭｅ＿ＷＳＭ＿ＳＦ１７１１１．Ｇ５７９０−１：１：１（配列番号１７７）、Ｐ−ＣＵＣｍｅ．ＷＳＭ＿ＳＦ１７２５２．Ｇ７３３０−１：１：１（配列番号１７９）、ＣｕｍＭｅ＿ＷＳＭ＿ＳＦ１７８６６．Ｇ６０５０（配列番号６２）、Ｐ−ＣＵＣｍｅ．ＣｕｍＭｅ＿ＷＳＭ＿ＳＦ１８４８８．Ｇ５３４０−１：１：１（配列番号１８１）、Ｐ−ＣＵＣｍｅ．ＣｕｍＭｅ＿ＷＳＭ＿ＳＦ１８５３６．Ｇ６４８０−１：１：１（配列番号１８２）、ＣｕｍＭｅ＿ＷＳＭ＿ＳＦ１８５７５．Ｇ６４１０（配列番号７１）、Ｐ−ＣＵＣｍｅ．ＣｕｍＭｅ＿ＷＳＭ＿ＳＦ１８６３４．Ｇ５１９０−１：１：１（配列番号１８３）、ＣｕｍＭｅ＿ＷＳＭ＿ＳＦ１８９８６．Ｇ６１１０（配列番号７９）、ＥＸＰ−ＣＵＣｍｅ．ＷＳＭ＿ＳＦ１９０６４．Ｇ５６９０：１：１（配列番号１８５）、Ｐ−ＣＵＣｍｅ．ＣｕｍＭｅ＿ＷＳＭ＿ＳＦ１９６４７．Ｇ５７６０−１：１：１（配列番号１８８）、Ｐ−ＣＵＣｍｅ．ＣｕｍＭｅ＿ＷＳＭ＿ＳＦ１９８３９．Ｇ５０９０−１：１：１（配列番号１８９）、ＣｕｍＭｅ＿ＷＳＭ＿ＳＦ１９９０２．Ｇ５２６０（配列番号８７）、Ｐ−ＣＵＣｍｅ．ＣｕｍＭｅ＿ＷＳＭ＿ＳＦ２０１３２．Ｇ５５６０−１：１：１（配列番号１９０）、ＣｕｍＭｅ＿ＷＳＭ＿ＳＦ２０３５９．Ｇ５８７０（配列番号９２）、ＣｕｍＭｅ＿ＷＳＭ＿ＳＦ２０６４５８．Ｇ５９７０（配列番号９８）、ＣｕｍＭｅ＿ＷＳＭ＿ＳＦ２０６５３４．Ｇ５２００（配列番号９９）、ＣｕｍＭｅ＿ＷＳＭ＿ＳＦ２２００８．Ｇ５６７０（配列番号１０８）、ＣｕｍＭｅ＿ＷＳＭ＿ＳＦ２２３５５．Ｇ５３１０（配列番号１１３）、Ｐ−ＣＵＣｍｅ．ＣｕｍＭｅ＿ＷＳＭ＿ＳＦ２２５３１．Ｇ５１２０−１：１：１（配列番号１９２）、ＥＸＰ−ＣＵＣｍｅ．ＷＳＭ＿ＳＦ１９０６４．Ｇ５６９０：１：１（配列番号１９３）、Ｐ−ＣＵＣｍｅ．ＣｕｍＭｅ＿ＷＳＭ＿ＳＦ２３９０６．Ｇ６１８０−１：１：１（配列番号１９４）、ＣｕｍＭｅ＿ＷＳＭ＿ＳＦ２４０４５．Ｇ５４００（配列番号１２３）、Ｐ−ＣＵＣｍｅ．ＣｕｍＭｅ＿ＷＳＭ＿ＳＦ２５１４１．Ｇ５１６０−１：１：２（配列番号１９５）、Ｐ−ＣＵＣｍｅ．ＣｕｍＭｅ＿ＷＳＭ＿ＳＦ２５９３６．Ｇ５４５０−１：１：１（配列番号１９７）、ＣｕｍＭｅ＿ＷＳＭ＿ＳＦ２８７２９．Ｇ５３４０（配列番号１３４）、ＣｕｍＭｅ＿ＷＳＭ＿ＳＦ３１２６４．Ｇ５３８０（配列番号１３６）、およびＰ−ＣＵＣｍｅ．ＣｕｍＭｅ＿ＷＳＭ＿ＳＦ３５８５６．Ｇ５１５０−１：１：１（配列番号１９８）は、ＥＸＰ−Ａｔ．Ａｔｎｔｔ１：１：２と同様のまたはそれよりも大きなレベルで、大豆子葉プロトプラストにおいて導入遺伝子発現を駆動する能力を実証した。上記の表１３において示されるように、ＥＸＰ配列Ｐ−ＣＵＣｍｅ．ＣｕｍＭｅ＿ＷＳＭ＿ＳＦ１９６４７．Ｇ５７６０−１：１：１（配列番号１８８）は、ＥＸＰ−Ａｔ．Ａｔｎｔｔ１：１：２よりも大きなレベルで、このアッセイにおいて導入遺伝子発現を駆動する能力を実証した。

【実施例7】

【0128】

ワタ葉プロトプラストにおいてＧＵＳを駆動する調節エレメントの分析
ワタ子葉プロトプラストを、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）導入遺伝子の発現を駆動する試験転写調節発現エレメント群を含有する植物発現ベクターを用いて形質転換し、ＧＵＳの発現が既知の構成的プロモーターによって駆動される、葉プロトプラストにおけるＧＵＳ発現と比較した。

【0129】

Ｐ−ＣＵＣｍｅ．１−１：１：１ｒｃ（配列番号１５５）、Ｐ−ＣＵＣｍｅ．２−１：１：１（配列番号１４）、Ｐ−ＣＵＣｍｅ．３−１：１：３（配列番号１５）、ＥＸＰ−ＣＵＣｍｅ．４：１：１（配列番号１５６）、Ｐ−ＣＵＣｍｅ．６−１：１：１（配列番号１８）、Ｐ−ＣＵＣｍｅ．８−１：１：２（配列番号１９）、Ｐ−ＣＵＣｍｅ．９−１：１：２（配列番号２０）、Ｐ−ＣＵＣｍｅ．１０−１：１：１（配列番号２１）、ＥＸＰ−ＣＵＣｍｅ．ｅＥＦ１ａ：１：１（配列番号１６２）、Ｐ−ＣＵＣｍｅ．１５−１：１：２（配列番号２３）、Ｐ−ＣＵＣｍｅ．１６ａ−１：１：２（配列番号２４）、Ｐ−ＣＵＣｍｅ．１７−１：１：２（配列番号２６）、Ｐ−ＣＵＣｍｅ．１８−１：１：２（配列番号２７）、Ｐ−ＣＵＣｍｅ．１９−１：１：３（配列番号１６７）、Ｐ−ＣＵＣｍｅ．２０−１：３（配列番号２１１）、Ｐ−ＣＵＣｍｅ．２１−１：１：１（配列番号３０）、Ｐ−ＣＵＣｍｅ．２２−１：１：３（配列番号３１）、ＥＸＰ−ＣＵＣｍｅ．ＳＡＭＳ２：１：１（配列番号１６８）、Ｐ−ＣＵＣｍｅ．２６−１：１：２（配列番号３３）、Ｐ−ＣＵＣｍｅ．２８−１：１：２（配列番号３４）、およびＥＸＰ−ＣＵＣｍｅ．２９：１：２（配列番号２１２）によって駆動された導入遺伝子の発現を、既知の構成的発現エレメント群からの発現と比較した。植物発現ベクターはそれぞれ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ由来の右側のボーダー領域、ジャガイモ光誘発性組織特異的ＳＴ−ＬＳ１遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ受託：Ｘ０４７５３）に由来する、プロセシング可能なイントロンを含有するβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ、配列番号２０６）についてのコード配列の５’に作動可能に連結され、海鳥綿（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｂａｒｂａｄｅｎｓｅ）Ｅ６遺伝子（Ｔ−Ｇｂ．Ｅ６−３ｂ：１：１、配列番号２０４）由来の３’終結領域、エンドウマメＲｂｃＳ２−Ｅ９遺伝子、（Ｔ−Ｐｓ．ＲｂｃＳ２−Ｅ９１：１：６、配列番号２０３）、または海鳥綿ＦｂＬａｔｅ−２遺伝子（Ｔ−Ｇｂ．ＦｂＬ２−１：１：１、配列番号２０５）の５’に作動可能に連結された、試験プロモーターまたは既知の構成的プロモーターから構成される第１の導入遺伝子カセット；除草剤グリフォセート（シロイヌナズナアクチン７プロモーターによって駆動される）または抗生物質、カナマイシンに対する抵抗性を与える形質転換植物細胞の選択に使用される第２の導入遺伝子選択カセット、およびＡ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ由来の左側のボーダー領域から構成された。プロモーターがない対照植物発現ベクター（ｐＭＯＮ１２４９１２）は、発現についての陰性対照として働いた。前述の試験および構成的発現エレメント群は、下記の表１４において示されるように、植物発現ベクターの中にクローニングした。

【0130】

【表14】

【0131】

同時形質転換およびデータの標準化における使用のための２つのプラスミドもまた、構築した。一方の形質転換対照プラスミドは、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓノパリンシンターゼ遺伝子（Ｔ−ＡＧＲｔｕ．ｎｏｓ−１：１：１３、配列番号２０９）由来の３’終結領域の５’に作動可能に連結されたホタル（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓ）ルシフェラーゼコード配列（ＦＬｕｃ、配列番号２０５）の発現を駆動する構成的プロモーターから構成された。他方の形質転換対照プラスミドは、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓノパリンシンターゼ遺伝子由来の３’終結領域の５’に作動可能に連結されたウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ルシフェラーゼコード配列（ＲＬｕｃ、配列番号２０６）の発現を駆動する構成的プロモーターから構成された。

【0132】

植物発現ベクター、ｐＭＯＮ８０５８５、ｐＭＯＮ１０９５８４、ｐＭＯＮ１１８７５６、ｐＭＯＮ１２４９１２、ｐＭＯＮ１４０８１８、ｐＭＯＮ１４０８１９、ｐＭＯＮ１４０８２０、ｐＭＯＮ１４０８２１、ｐＭＯＮ１４０８２３、ｐＭＯＮ１４０８２４、ｐＭＯＮ１４０８２５、ｐＭＯＮ１４０８２６、ｐＭＯＮ１４０８２７、ｐＭＯＮ１４０８２８、ｐＭＯＮ１４０８２９、ｐＭＯＮ１４０８３０、ｐＭＯＮ１４０８３１、ｐＭＯＮ１４０８３２、ｐＭＯＮ１４０８３３、ｐＭＯＮ１４０８３４、ｐＭＯＮ１４０８３５、ｐＭＯＮ１４０８３６、ｐＭＯＮ１４０８３７、ｐＭＯＮ１４０８３８、およびｐＭＯＮ１４０８３９は、ＰＥＧ形質転換方法を使用してワタ葉プロトプラスト細胞を形質転換するために使用した。プロトプラスト細胞を、２つの形質転換対照プラスミドのそれぞれおよび試験植物発現ベクターの等モル量を用いて形質転換した。ＧＵＳおよびルシフェラーゼの活性をアッセイした。ＧＵＳおよびルシフェラーゼの両方の測定は、２つの異なる小さなウェルトレーの中に、上記のように形質転換した細胞の溶解調製物の一定分量を配置することによって行った。一方のトレーは、ＧＵＳ測定に使用し、第２のトレーは、デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイ系を使用して、デュアルルシフェラーゼアッセイを実行するために使用した（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ；たとえば、Promega Notes Magazine, No: 57, 1996, p.02を参照されたい）。サンプル測定は、形質転換当たり４回の反復実験を使用して行った。平均ＧＵＳおよびルシフェラーゼ値を、下記の表１５に示す。

【0133】

【表15】

【0134】

ワタ葉プロトプラストにおけるそれぞれのプロモーターの相対的な活性を比較するために、ＧＵＳ値を、ルシフェラーゼ活性に対するＧＵＳの比として表現し、構成的発現エレメント群、ＥＸＰ−Ａｔ．Ａｃｔ７：１：１１およびＥＸＰ−ＣａＭＶ．３５Ｓ−ｅｎｈ＋Ｐｈ．ＤｎａＫ：１：３について観察された発現レベルに関して標準化した。下記の表１６は、ＥＸＰ−Ａｔ．Ａｃｔ７：１：１１およびＥＸＰ−ＣａＭＶ．３５Ｓ−ｅｎｈ＋Ｐｈ．ＤｎａＫ：１：３に関して標準化したホタルルシフェラーゼ（ＦＬｕｃ）に対するＧＵＳの比を示す。下記の表１７は、ＥＸＰ−Ａｔ．Ａｃｔ７：１：１１およびＥＸＰ−ＣａＭＶ．３５Ｓ−ｅｎｈ＋Ｐｈ．ＤｎａＫ：１：３に関して標準化したレニラ（ｒｅｎｉｌｌａ）ルシフェラーゼ（ＲＬｕｃ）に対するＧＵＳの比を示す。

【0135】

【表16】

【0136】

【表17】

【0137】

表１６および１７において見られるように、試験したほとんどの発現エレメント群は、ワタ葉プロトプラスト細胞において導入遺伝子発現を駆動する能力を実証した。ある発現エレメント群、ＥＸＰ−ＣＵＣｍｅ．４：１：１（配列番号１５６）は、このアッセイにおいて、ＥＸＰ−Ａｔ．Ａｃｔ７：１：１１よりも高度な導入遺伝子発現のレベルを実証した。

【実施例8】

【0138】

導入遺伝子カセットアンプリコンを使用して、ワタ葉プロトプラストにおいてＧＵＳを駆動する調節エレメントの分析
ワタ葉プロトプラストを、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）導入遺伝子の発現を駆動する転写調節発現エレメント群を含有する導入遺伝子カセットアンプリコンを用いて形質転換し、ＧＵＳの発現が既知の構成的プロモーターによって駆動される、葉プロトプラストにおけるＧＵＳ発現と比較した。導入遺伝子カセットアンプリコンは、ＧＵＳコード配列（ＧＵＳ、配列番号２０６）に作動可能に連結され、３’ＵＴＲ（Ｔ−Ｇｂ．ＦｂＬ２−１：１：１、配列番号２０５）に作動可能に連結されたＥＸＰ配列から構成された。平均ＧＵＳ発現は、対照ＥＸＰエレメント、Ｐ−ＣａＭＶ．３５Ｓ−ｅｎｈ−１：１：１０２／Ｌ−ＣａＭＶ．３５Ｓ−１：１：２（配列番号２１０）およびＥＸＰ−Ａｔ．Ａｔｎｔｔ１：１：２（配列番号２００）と比較した。

【0139】

同時形質転換およびデータの標準化における使用のためのプラスミドもまた、実施例２において上記に記載されているものと同様の方法で使用した。形質転換対照プラスミドは、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓノパリンシンターゼ遺伝子（Ｔ−ＡＧＲｔｕ．ｎｏｓ−１：１：１３、配列番号２０９）由来の３’終結領域の５’に作動可能に連結されたホタル（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓ）ルシフェラーゼコード配列（ＦＬｕｃ、配列番号２０５）の発現を駆動する構成的プロモーターから構成された。

【0140】

下記の表１８は、それぞれの導入遺伝子アンプリコンによって与えられた平均ＧＵＳ発現値を示す。下記の表１９は、ＥＸＰ−Ａｔ．Ａｔｎｔｔ１：１：２およびＰ−ＣａＭＶ．３５Ｓ−ｅｎｈ−１：１：１０２／Ｌ−ＣａＭＶ．３５Ｓ−１：１：２に関して標準化したホタルルシフェラーゼ（ＦＬｕｃ）に対するＧＵＳの比を示す。

【0141】

【表18-1】

【表18-2】

【0142】

【表19-1】

【表19-2】

【0143】

上記表１８において見られるように、すべてのＥＸＰ配列が、プロモーターなしの対照と比較した場合に、導入遺伝子発現を駆動する能力を実証したわけではなかった。しかしながらＥＸＰ配列、Ｐ−ＣＵＣｍｅ．ＣｕｍＭｅ＿ＷＳＭ＿ＳＦ１６４４４．Ｇ５１４０−１：１：１（配列番号１７５）およびＰ−ＣＵＣｍｅ．ＣｕｍＭｅ＿ＷＳＭ＿ＳＦ１９８３９．Ｇ５０９０−１：１：１（配列番号１８９）は、ＥＸＰ−Ａｔ．Ａｔｎｔｔ１：１：２と同様のまたはそれよりも大きなレベルで、大豆子葉プロトプラストにおいて導入遺伝子発現を駆動する能力を実証した。上記の表１９において示されるように、ＥＸＰ配列、Ｐ−ＣＵＣｍｅ．ＣｕｍＭｅ＿ＷＳＭ＿ＳＦ１９８３９．Ｇ５０９０−１：１：１（配列番号１８９）は、ＥＸＰ−Ａｔ．Ａｔｎｔｔ１：１：２よりも大きなレベルで、このアッセイにおいて導入遺伝子発現を駆動する能力を実証した。

【実施例9】

【0144】

安定して形質転換された大豆においてＧＵＳを駆動する調節エレメントの分析
大豆植物を、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）導入遺伝子の発現を駆動するＥＸＰ配列を含有する植物発現ベクターを用いて形質転換した。

【0145】

ＥＸＰ−ＣＵＣｍｅ．Ｕｂｑ１：１：１（配列番号１）、ＥＸＰ−ＣＵＣｍｅ．Ｕｂｑ１：１：３（配列番号７）、Ｐ−ＣＵＣｍｅ．１−１：１：１ｒｃ（配列番号１５５）、Ｐ−ＣＵＣｍｅ．２−１：１：１（配列番号１４）、Ｐ−ＣＵＣｍｅ．３−１：１：３（配列番号１５）、ＥＸＰ−ＣＵＣｍｅ．４：１：１（配列番号１５６）、ＥＸＰ−ＣＵＣｍｅ．５：１：１（配列番号１５９）、Ｐ−ＣＵＣｍｅ．６−１：１：１（配列番号１８）、Ｐ−ＣＵＣｍｅ．８−１：１：２（配列番号１９）、Ｐ−ＣＵＣｍｅ．９−１：１：２（配列番号２０）、Ｐ−ＣＵＣｍｅ．１０−１：１：１（配列番号２１）、ＥＸＰ−ＣＵＣｍｅ．ｅＥＦ１ａ：１：１（配列番号１６２）、Ｐ−ＣＵＣｍｅ．１５−１：１：２（配列番号２３）、Ｐ−ＣＵＣｍｅ．１７−１：１：２（配列番号２６）、Ｐ−ＣＵＣｍｅ．１８−１：１：２（配列番号２７）、Ｐ−ＣＵＣｍｅ．１９−１：１：３（配列番号１６７）、Ｐ−ＣＵＣｍｅ．２０−１：３（配列番号２１１）、Ｐ−ＣＵＣｍｅ．２１−１：１：１（配列番号３０）、ＥＸＰ−ＣＵＣｍｅ．ＳＡＭＳ２：１：１（配列番号１６８）、Ｐ−ＣＵＣｍｅ．２６−１：１：２（配列番号３３）、ＥＸＰ−ＣＵＣｍｅ．２９：１：２（配列番号２１２）、Ｐ−ＣＵＣｍｅ．ＣｕｍＭｅ＿ＷＳＭ＿ＳＦ２５３５５．Ｇ５０００−１：１：１（配列番号１９６）、Ｐ−ＣＵＣｍｅ．ＣｕｍＭｅ＿ＷＳＭ＿ＳＦ１７１１１．Ｇ５７９０−１：１：１（配列番号１７７）、Ｐ−ＣＵＣｍｅ．ＣｕｍＭｅ＿ＷＳＭ＿ＳＦ２２５３１．Ｇ５１２０−１：１：１（配列番号１９２）、Ｐ−ＣＵＣｍｅ．ＣｕｍＭｅ＿ＷＳＭ＿ＳＦ１８４８８．Ｇ５３４０−１：１：１（配列番号１８１）、Ｐ−ＣＵＣｍｅ．ＣｕｍＭｅ＿ＷＳＭ＿ＳＦ２３７６０．Ｇ５２００−１：１：１（配列番号１９３）、ＥＸＰ−ＣＵＣｍｅ．ＷＳＭ＿ＳＦ１９０６４．Ｇ５６９０：１：１（配列番号１８５）、Ｐ−ＣＵＣｍｅ．ＷＳＭ＿ＳＦ１７２５２．Ｇ７３３０−１：１：１（配列番号１７９）、Ｐ−ＣＵＣｍｅ．ＣｕｍＭｅ＿ＷＳＭ＿ＳＦ１８６３４．Ｇ５１９０−１：１：１（配列番号１８３）、Ｐ−ＣＵＣｍｅ．ＣｕｍＭｅ＿ＷＳＭ＿ＳＦ１９６４７．Ｇ５７６０−１：１：１（配列番号１８８）、Ｐ−ＣＵＣｍｅ．ＣｕｍＭｅ＿ＷＳＭ＿ＳＦ２５９３６．Ｇ５４５０−１：１：１（配列番号１９７）、Ｐ−ＣＵＣｍｅ．ＣｕｍＭｅ＿ＷＳＭ＿ＳＦ１９８３９．Ｇ５０９０−１：１：１（配列番号１８９）、ＣｕｍＭｅ＿ＷＳＭ＿ＳＦ２０６４５８．Ｇ５９７０（配列番号９８）、およびＰ−ＣＵＣｍｅ．ＣｕｍＭｅ＿ＷＳＭ＿ＳＦ１８７１６．Ｇ５８６０−１：１：１（配列番号１８４）によって駆動されたＧＵＳ導入遺伝子の発現は、染色組織切片の検査を通して、定性的にもおよび定量的にもアッセイした。植物発現ベクターはそれぞれ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ由来の右側のボーダー領域、海鳥綿ＦｂＬａｔｅ−２遺伝子（Ｔ−Ｇｂ．ＦｂＬ２−１：１：１、配列番号２０５）由来の３’終結領域の５’に作動可能に連結された、ジャガイモ光誘発性組織特異的ＳＴ−ＬＳ１遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ受託：Ｘ０４７５３）に由来する、プロセシング可能なイントロンを含有するβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ、配列番号２０６）についてのコード配列の５’に作動可能に連結されたＥＸＰ配列から構成される第１の導入遺伝子カセット；除草剤グリフォセート（シロイヌナズナアクチン７プロモーターによって駆動される）に対する抵抗性を与えた形質転換植物細胞の選択に使用される第２の導入遺伝子選択カセット、およびＡ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ由来の左側のボーダー領域から構成された。

【0146】

前述のＥＸＰ配列は、下記の表２０〜２３において示されるような植物発現コンストラクトの中にクローニングし、ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介性の形質転換方法を使用して、大豆植物を形質転換するために使用した。ＧＵＳの発現は、選択した組織の組織学的切片を使用して、定性的におよび定量的にアッセイした。

【0147】

組織化学的ＧＵＳ分析は、形質転換植物の定質的発現分析に使用した。全組織切片を、適切な時間、ＧＵＳ染色溶液Ｘ−Ｇｌｕｃ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−ｂ−グルクロニド）（１ミリグラム／ミリリッター）と共にインキュベートし、すすぎ、青色の変色について視覚的に検査した。ＧＵＳ活性は、選択した植物器官および組織を使用して、直接的な目視検査または顕微鏡下での検査によって定性的に決定した。Ｒ_０世代植物は、Ｖｎ５根、Ｒ１根、Ｖｎ５シンク葉、Ｖｎ５ソース葉、Ｒ１ソース葉、Ｒ１葉柄、黄色鞘胚、黄色鞘子葉、Ｒ３未成熟種子、Ｒ３鞘、Ｒ５子葉、およびＲ１花において発現について検査した。

【0148】

定量的分析については、総タンパク質を、形質転換トウモロコシ植物の選択した組織から抽出した。総タンパク質のうちの１マイクログラムを、５０マイクロリットルの総反応容量で、蛍光発生基質４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−グルクロニド（ＭＵＧ）と共に使用した。反応生成物、４−メチルウンベリフェロン（４−ＭＵ）は、高ｐＨで最大に蛍光性であり、ヒドロキシル基はイオン化されている。炭酸ナトリウムの塩基性溶液の追加は、同時に、アッセイを停止し、蛍光性産物を定量化するためにｐＨを調整する。蛍光は、Ｍｉｃｒｏｍａｘ Ｒｅａｄｅｒと共に、Ｆｌｕｏｒｏｍａｘ−３（Ｈｏｒｉｂａ；Ｋｙｏｔｏ、Ｊａｐａｎ）を使用して、３６５ｎｍでの励起および４４５ｎｍでの放射を用いて測定し、スリット幅は、励起２ｎｍおよび放射３ｎｍで設定した。

【0149】

下記の表２０および２１は、Ｒ_０世代植物組織において測定した平均定量的発現レベルを示す。アッセイしなかった組織は、両方の表においてブランクのセルとして示す。

【0150】

【表20-1】

【表20-2】

【表20-3】

【0151】

【表21-1】

【表21-2】

【表21-3】

【0152】

表２０および２１において見られるように、ＥＸＰ配列、ＥＸＰ−ＣＵＣｍｅ．Ｕｂｑ１：１：１（配列番号１）、ＥＸＰ−ＣＵＣｍｅ．Ｕｂｑ１：１：３（配列番号７）、Ｐ−ＣＵＣｍｅ．１−１：１：１ｒｃ（配列番号１５５）、Ｐ−ＣＵＣｍｅ．２−１：１：１（配列番号１４）、ＥＸＰ−ＣＵＣｍｅ．４：１：１（配列番号１５６）、ＥＸＰ−ＣＵＣｍｅ．５：１：１（配列番号１５９）、Ｐ−ＣＵＣｍｅ．６−１：１：１（配列番号１８）、Ｐ−ＣＵＣｍｅ．８−１：１：２（配列番号１９）、Ｐ−ＣＵＣｍｅ．９−１：１：２（配列番号２０）、Ｐ−ＣＵＣｍｅ．１０−１：１：１（配列番号２１）、ＥＸＰ−ＣＵＣｍｅ．ｅＥＦ１ａ：１：１（配列番号１６２）、Ｐ−ＣＵＣｍｅ．１５−１：１：２（配列番号２３）、Ｐ−ＣＵＣｍｅ．１７−１：１：２（配列番号２６）、Ｐ−ＣＵＣｍｅ．１８−１：１：２（配列番号２７）、Ｐ−ＣＵＣｍｅ．１９−１：１：３（配列番号１６７）、Ｐ−ＣＵＣｍｅ．２０−１：３（配列番号２１１）、Ｐ−ＣＵＣｍｅ．２１−１：１：１（配列番号３０）、ＥＸＰ−ＣＵＣｍｅ．ＳＡＭＳ２：１：１（配列番号１６８）、Ｐ−ＣＵＣｍｅ．２６−１：１：２（配列番号３３）、ＥＸＰ−ＣＵＣｍｅ．２９：１：２（配列番号２１２）、Ｐ−ＣＵＣｍｅ．ＣｕｍＭｅ＿ＷＳＭ＿ＳＦ２５３５５．Ｇ５０００−１：１：１（配列番号１９６）、Ｐ−ＣＵＣｍｅ．ＣｕｍＭｅ＿ＷＳＭ＿ＳＦ１７１１１．Ｇ５７９０−１：１：１（配列番号１７７）、Ｐ−ＣＵＣｍｅ．ＣｕｍＭｅ＿ＷＳＭ＿ＳＦ２２５３１．Ｇ５１２０−１：１：１（配列番号１９２）、Ｐ−ＣＵＣｍｅ．ＣｕｍＭｅ＿ＷＳＭ＿ＳＦ１８４８８．Ｇ５３４０−１：１：１（配列番号１８１）、Ｐ−ＣＵＣｍｅ．ＣｕｍＭｅ＿ＷＳＭ＿ＳＦ２３７６０．Ｇ５２００−１：１：１（配列番号１９３）、ＥＸＰ−ＣＵＣｍｅ．ＷＳＭ＿ＳＦ１９０６４．Ｇ５６９０：１：１（配列番号１８５）、Ｐ−ＣＵＣｍｅ．ＷＳＭ＿ＳＦ１７２５２．Ｇ７３３０−１：１：１（配列番号１７９）、Ｐ−ＣＵＣｍｅ．ＣｕｍＭｅ＿ＷＳＭ＿ＳＦ１８６３４．Ｇ５１９０−１：１：１（配列番号１８３）、Ｐ−ＣＵＣｍｅ．ＣｕｍＭｅ＿ＷＳＭ＿ＳＦ１９６４７．Ｇ５７６０−１：１：１（配列番号１８８）、Ｐ−ＣＵＣｍｅ．ＣｕｍＭｅ＿ＷＳＭ＿ＳＦ２５９３６．Ｇ５４５０−１：１：１（配列番号１９７）、Ｐ−ＣＵＣｍｅ．ＣｕｍＭｅ＿ＷＳＭ＿ＳＦ１９８３９．Ｇ５０９０−１：１：１（配列番号１８９）、ＣｕｍＭｅ＿ＷＳＭ＿ＳＦ２０６４５８．Ｇ５９７０（配列番号９８）、およびＰ−ＣＵＣｍｅ．ＣｕｍＭｅ＿ＷＳＭ＿ＳＦ１８７１６．Ｇ５８６０−１：１：１（配列番号１８４）は、発現を駆動するために使用したＥＸＰ配列に依存して、アッセイしたいくつかのまたはすべての組織において導入遺伝子発現を駆動する能力を定量的に実証した。

【0153】

選択した組織切片の組織学的分析は、ＥＸＰ配列の多くについて発現のさらなる証拠を提供した。ＥＸＰ−ＣＵＣｍｅ．Ｕｂｑ１：１：１（配列番号１）およびＥＸＰ−ＣＵＣｍｅ．Ｕｂｑ１：１：３（配列番号７）は、定量的分析がかなり低度のレベルの発現を示したが、すべての組織において観察された染色により構成的発現パターンを実証した。このタイプの発現パターンは、低レベルの構成的発現を必要とする導入遺伝子の発現の駆動に対して非常に偶発的な（ａｄｖｅｎｔｉｔｉｏｕｓ）ものとすることができる。Ｐ−ＣＵＣｍｅ．１−１：１：１ｒｃ（配列番号１５５）によって駆動された発現は、シンクおよびソース葉の維管束および木部におけるならびに根外皮、師部、木部、内皮、中心柱、および先端における発現を実証した。ＥＸＰ−ＣＵＣｍｅ．４：１：１（配列番号１５６）によって駆動された発現は、すべての組織において観察され、植物の生殖相において観察された発現が最も高度であった。Ｐ−ＣＵＣｍｅ．１０−１：１：１（配列番号：２１）によって駆動された発現は、Ｖ５シンク葉およびＲ１花葯においてのみ観察された。ＥＸＰ−ＣＵＣｍｅ．ｅＥＦ１ａ：１：１（配列番号１６２）によって駆動された発現は、構成的発現パターンを実証し、最も高度な発現は、黄色鞘胚および子葉において観察された。黄色鞘胚活性は、Ｒ_０世代よりもＲ_１世代において５倍高度であった（下記表２３を参照されたい）。Ｐ−ＣＵＣｍｅ．１５−１：１：２（配列番号２３）、Ｐ−ＣＵＣｍｅ．１７−１：１：２（配列番号２６）、およびＰ−ＣＵＣｍｅ．１８−１：１：２（配列番号２７）によって駆動された発現は、構成的レベルの発現を組織学的に実証した。Ｐ−ＣＵＣｍｅ．１９−１：１：３（配列番号１６７）によって駆動された発現は、Ｖ５根およびＲ１葉柄を例外として構成的パターンの発現を組織学的に実証した。Ｒ３鞘は、最も高度な発現を示した。

【0154】

Ｐ−ＣＵＣｍｅ．２０−１：３（配列番号２１１）によって駆動された発現は、Ｖ５根における発現を例外として構成的発現パターンを組織学的に実証した。発現は、Ｒ８ステージ子葉において最も高度であった。ＥＸＰ−ＣＵＣｍｅ．ＳＡＭＳ２：１：１（配列番号１６８）によって駆動された発現は、すべての組織において組織学的に観察された発現により構成的パターンの発現を実証した。ＧＵＳ発現は、Ｒ_１世代において増加することが観察された（下記表２２および２３を参照されたい）。Ｒ１ステージ花および葉柄は、大豆において最も高レベルの発現を実証した。Ｐ−ＣＵＣｍｅ．ＣｕｍＭｅ＿ＷＳＭ＿ＳＦ２２５３１．Ｇ５１２０−１：１：１（配列番号１９２）によって駆動された発現は、構成的パターンの発現を組織学的に実証し、Ｒ８ステージ子葉および胚における発現が最も高度であった。Ｐ−ＣＵＣｍｅ．ＣｕｍＭｅ＿ＷＳＭ＿ＳＦ１８４８８．Ｇ５３４０−１：１：１（配列番号１８１）によって駆動された発現は、構成的レベルの発現を実証したが、定量的に高度な発現は、黄色鞘胚において観察された。

【0155】

ＥＸＰ−ＣＵＣｍｅ．ｅＥＦ１ａ：１：１（配列番号１６２）およびＥＸＰ−ＣＵＣｍｅ．ＳＡＭＳ２：１：１（配列番号１６８）を含むプラスミドコンストラクトを用いて形質転換したＲ_０世代植物の種子をまき、Ｒ_１世代植物をＧＵＳ発現について分析した。Ｒ_１世代植物は、Ｖｎ５根、Ｖｎ５シンク葉、Ｖｎ５ソース葉、Ｒ１ソース葉、Ｒ１葉柄 黄色鞘胚、黄色鞘子葉、Ｒ３未成熟種子、Ｒ３鞘、Ｒ５子葉、およびＲ１花において発現について検査した。表２２および２３は、Ｒ_１世代形質転換植物のそれぞれの組織において測定した平均ＧＵＳ発現を示す。

【0156】

【表22】

【0157】

【表23】

【0158】

上記表２２および２３において見られるように、ＥＸＰ−ＣＵＣｍｅ．ｅＥＦ１ａ：１：１（配列番号１６２）およびＥＸＰ−ＣＵＣｍｅ．ＳＡＭＳ２：１：１（配列番号１６８）によってＲ_１世代において駆動された発現は、構成的レベルの発現を示し、発現における増加は、Ｒ_０世代に比べてＲ_１世代で多くの組織において観察された。

【0159】

本発明の原理について例証し、記載したが、そのような原理から逸脱することなく、構成および細部において本発明を変更することができることは当業者らに明らかであるはずである。請求項の精神および範囲内にある変更はすべて、本発明の範囲内に含められることが意図される。本明細書において引用される刊行物および公開特許文書は、それぞれの個々の刊行物または特許出願が、参照によって組み込まれるように明確にかつ個々に示されるのと同じ程度まで、参照によってこれによって組み込まれる。

【図1a】

【図1b】

【図1c】

【図1d】

【図1e】

【図1f】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]