特許 6565900 ビタミンＤおよびサポニンを含む混合物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6565900

(24)【登録日】2019年8月9日

(45)【発行日】2019年8月28日

(54)【発明の名称】ビタミンＤおよびサポニンを含む混合物

(51)【国際特許分類】

   G01N 33/82 20060101AFI20190819BHJP

   G01N 33/53 20060101ALI20190819BHJP

【ＦＩ】

   G01N33/82

   G01N33/53 H

【請求項の数】10

【全頁数】14

(21)【出願番号】特願2016-510358(P2016-510358)

(86)(22)【出願日】2015年3月24日

(86)【国際出願番号】JP2015058809

(87)【国際公開番号】WO2015146937

(87)【国際公開日】20151001

【審査請求日】2017年12月22日

(31)【優先権主張番号】特願2014-62133(P2014-62133)

(32)【優先日】2014年3月25日

(33)【優先権主張国】JP

(73)【特許権者】

【識別番号】306008724

【氏名又は名称】富士レビオ株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100089118

【弁理士】

【氏名又は名称】酒井 宏明

(72)【発明者】

【氏名】堀池 麻里子

(72)【発明者】

【氏名】内田 好昭

【審査官】 西浦 昌哉

(56)【参考文献】

【文献】 特開昭６１−２１２３２２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１３−５２４２０８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特許第４１３０９５８（ＪＰ，Ｂ２）

【文献】 国際公開第２００９／００１７８６（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特開２００２−２３４８４４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００７−１９７３２８（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｇ０１Ｎ ３３／４８−３３／９８

Ｃ０７Ｋ １／００−１９／００

Ａ６１Ｋ ４７／００−４７／６９

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

水溶液中でビタミンＤをサポニンで安定化することを含む、ビタミンＤの水溶液中での保存方法。

【請求項2】

ビタミンＤおよびサポニンを含む水溶液を標品として用いてビタミンＤを検出することを含み、ビタミンＤの検出がイムノアッセイにより行われる、ビタミンＤの測定方法。

【請求項3】

水溶液中のビタミンＤの濃度が１〜２０００ｎｇ／ｍＬである、請求項１または２記載の方法。

【請求項4】

水溶液中のサポニンの濃度が０．１〜２０％（ｗ／ｖ）である、請求項１〜３のいずれか一項記載の方法。

【請求項5】

水溶液中のサポニンの濃度が０．５〜１０％（ｗ／ｖ）である、請求項４記載の方法。

【請求項6】

水溶液中のビタミンＤとサポニンとの重量比（ビタミンＤ：サポニン）が１：２０００００〜１：１０の範囲内である、請求項１〜５のいずれか一項記載の方法。

【請求項7】

ビタミンＤが水溶液中で０〜５０℃で保存される、請求項１〜６のいずれか一項記載の方法。

【請求項8】

ビタミンＤが水溶液中で５〜３５℃で保存される、請求項７記載の方法。

【請求項9】

ビタミンＤが水溶液中で３日以上保存される、請求項１〜８のいずれか一項記載の方法。

【請求項10】

ビタミンＤおよびサポニンを含む水溶液、ならびにビタミンＤの測定試薬を含む、ビタミンＤの測定用キット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ビタミンＤおよびサポニンを含む混合物およびその製造方法などに関する。

【背景技術】

【0002】

ビタミンＤの安定化剤としては、β−シクロデキストリンが知られている（特許文献１）。β−シクロデキストリンは７分子のグルコースがグルコシド結合によって結合した環状オリゴ糖の一種である。環状構造の内径は０．６〜０．８ｎｍ程度であり、環状構造の内部は疎水性であるため、疎水性の低分子化合物を包接することができる。β−シクロデキストリンは、水への溶解度が低いこと（１．８ｇ／１００ｍＬ）が知られている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0003】

【特許文献1】特許第４１３０９５８号

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0004】

本発明の目的は、ビタミンＤを安定化し得る代替手段を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0005】

本発明者らは、種々の成分がビタミンＤの安定化作用を有するか否か鋭意検討した結果、サポニンがビタミンＤを良好に安定化できることなどを見出し、本発明を完成するに至った。

【0006】

すなわち、本発明は、以下のとおりである。
〔１〕ビタミンＤおよびサポニンを含む、混合物。
〔２〕混合物が水溶液である、上記の混合物。
〔３〕サポニンがトリテルペン系サポニンである、上記の混合物。
〔４〕トリテルペン系サポニンがキラヤサポニンである、上記の混合物。
〔５〕水溶液中のサポニンの濃度が０．５〜１０％（ｗ／ｖ）である、上記の混合物。
〔６〕ビタミンＤをサポニンと組み合わせることを含む、ビタミンＤおよびサポニンを含む混合物の製造方法。
〔７〕ビタミンＤをサポニンで安定化することを含む、ビタミンＤの保存方法。
〔８〕ビタミンＤおよびサポニンを含む水溶液を標品として用いてビタミンＤを検出することを含む、ビタミンＤの測定方法。
〔９〕ビタミンＤの検出がイムノアッセイにより行われる、上記の方法。
〔１０〕以下（１）〜（４）のいずれかを含む、キット：
（１）ビタミンＤ、およびサポニン；
（２）ビタミンＤの測定試薬、およびサポニン；
（３）ビタミンＤおよびサポニン、ならびにビタミンＤの測定試薬；または
（４）ビタミンＤおよびサポニンを含む水溶液、ならびにビタミンＤの測定試薬。

【発明の効果】

【0007】

本発明の混合物は、サポニンの作用によりビタミンＤを安定化できることから、標品等として用いられるビタミンＤの保存に有用である。
本発明はまた、ビタミンＤの安定化および/または保存に有用な一連の発明を提供する。

【発明を実施するための形態】

【0008】

本発明は、ビタミンＤおよびサポニンを含む混合物を提供する。

【0009】

本明細書中で用いられる場合、用語「ビタミンＤ」は、特に指定されないかぎり、１）ビタミンＤ２およびビタミンＤ３、２）ビタミンＤ２およびビタミンＤ３の代謝産物、３）ビタミンＤ２およびビタミンＤ３アナログ薬、ならびに４）それらの塩を包括的に含むものとする。ビタミンＤ２およびビタミンＤ３の代謝産物としては、例えば、ビタミンＤにヒドロキシル基が付加された化合物（例、２５ＯＨビタミンＤ２、２５ＯＨビタミンＤ３、１，２５（ＯＨ）_２ビタミンＤ２、１，２５（ＯＨ）_２ビタミンＤ３）が挙げられる。

【0010】

【化1】

【0011】

ビタミンＤ２およびビタミンＤ３アナログ薬としては、例えば、マキサカルシトール（ｍａｘａｃａｌｃｉｔｏｌ）、ファレカルシトリオール（ｆａｌｅｃａｌｃｉｔｒｉｏｌ）、パリカルシトール（ｐａｒｉｃａｌｃｉｔｏｌ）、ドキセルカルシフェロール（ｄｏｘｅｒｃａｌｃｉｆｅｒｏｌ）、カルシポトリオール（ｃａｌｃｉｐｏｔｒｉｏｌ）、セオカルシトール（ｓｅｏｃａｌｃｉｔｏｌ）が挙げられる。

【0012】

塩としては、例えば、金属塩、無機塩、有機塩、および酸付加塩が挙げられる。金属塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩等の一価の金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩等の二価の金属塩が挙げられる。無機塩としては、例えば、アンモニウム塩が挙げられる。有機塩としては、例えば、アルキル基で置換されたアンモニウム塩が挙げられる。アルキル基で置換されたアンモニウム塩としては、モノアルキルアンモニウム塩、ジアルキルアンモニウム塩、トリアルキルアンモニウム塩、テトラアルキルアンモニウム塩が挙げられる。アルキル基で置換されたアンモニウム塩におけるアルキル基は、特に限定されないが、炭素数１〜６のアルキル基であってもよい。炭素数１〜６のアルキル基は、直鎖または分岐鎖であり、例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ｓｅｃ−ペンチル、ｔｅｒｔ−ペンチル、ヘキシル、イソヘキシルが挙げられる。酸付加塩で用いられる酸としては、例えば、無機酸（例、硫酸、塩酸、臭化水素酸、硝酸、およびリン酸）、ならびに有機酸（例、酢酸、シュウ酸、乳酸、クエン酸、リンゴ酸、グルコン酸、酒石酸、フマル酸、マレイン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、およびｐ−トルエンスルホン酸）が挙げられる。

【0013】

ビタミンＤは、単一物質であっても、複数（例、２種、３種または４種）の混合物であってもよい。単一物質であることもまた好ましい。ビタミンＤは、例えば、標品、医薬、試薬、食品、飲料、および飼料等の成分として用いることができる。

【0014】

サポニンは、サポゲニン（非糖部分またはアグリコンとも呼ばれる）および糖部分から構成される配糖体である。サポニンは、親水基として作用し得る糖部分、および疎水基として作用し得るサポゲニンを有することにより界面活性作用を発揮し得る。サポニンは、単一物質であっても、複数（例、２〜５０種、２〜４０種、２〜３０種、２〜２０種、２〜１０種、または２〜５種）の混合物（例、抽出物）であってもよい。

【0015】

サポニンを構成する糖部分としては、例えば、グルコース、ガラクトース、アラビノース、フコース、ラムノース、キシロース、アピオース等のペントースおよびヘキソースが挙げられる。

【0016】

サポニンを構成するサポゲニンとしては、例えば、トリテルペン系サポゲニン、およびステロイド系サポゲニンが挙げられる。

【0017】

サポニンは、それを構成するサポゲニンの種類に基づき、トリテルペン系サポニンおよびステロイド系サポニンに主に分類することができる。トリテルペン系サポニンとしては、例えば、キラヤサポニン、茶種子サポニン、キキョウサポニン、ダイズサポニン、イトヒメハギサポニン、ミシマサイコサポニン、カンゾウサポニン、ヒロハセネガサポニン、ナツメサポニン、オタネニンジンサポニン、セイヨウキズタサポニン、トチバニンジンサポニン、ヒナタイノコズチサポニン、アケビサポニン、ミツバアケビサポニン、エゴノキサポニン、モダマサポニンが挙げられる。ステロイド系サポニンとしては、例えば、サルササポニン、ジオスシン、アモロニン、カンモニン、ギトニン、ジギトニン、スミロニン、チゴニン、ノロニン、ユコニン、トリラリン、トリリンが挙げられる。これらのサポニンは、例えば、植物から抽出することにより、市販物を購入することにより、あるいは人工的に合成することにより、入手できる。好ましくは、サポニンは、トリテルペン系サポニンである。

【0018】

サポニンはまた、サポゲニンと糖部分の関係から、規定することができる。例えば、サポニン一分子中に存在する、一単位のサポゲニンに対する糖部分の単位数の観点から、サポニンを規定することができる。サポニン一分子中に存在する、一単位のサポゲニンに対する糖部分の単位数は、例えば１〜２０個であり、好ましくは２〜１５個であり、より好ましくは４〜１４個であり、さらにより好ましくは６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、または１２個である。また、サポゲニンに対する糖部分の鎖数（換言すれば、サポゲニンから伸びている糖鎖の数）の観点から、サポニンを規定することができる。このような鎖数は、例えば１個または複数個（例、２個または３個）であるが、好ましくは複数個であり、より好ましくは２個である。さらにより好ましくは、３位および２８位の炭素原子にそれぞれ結合した２個の糖鎖を有するトリテルペン系サポニンである。糖鎖は、直鎖であっても分岐鎖であってもよい。

【0019】

サポニンは、水への溶解度の観点から特定することもできる。サポニンは、一般に、水への溶解度が高い。したがって、水溶液では、サポニンを高濃度に調製し易い。本発明で用いられるサポニンについて、水への溶解度は、例えば２．０ｇ／１００ｍＬ以上、好ましくは３．０ｇ／１００ｍＬ以上、より好ましくは４．０ｇ／１００ｍＬ以上、さらにより好ましくは５．０ｇ／１００ｍＬ以上、特に好ましくは６．０ｇ／１００ｍＬ以上であってもよい。サポニンについて、水への溶解度はまた、例えば、２０．０ｇ／１００ｍＬ以下、１５．０ｇ／１００ｍＬ以下、１２．０ｇ／１００ｍＬ以下、または１０．０ｇ／１００ｍＬ以下であってもよい。高濃度のサポニンを含む水溶液を保存液として用いた場合であっても、ビタミンＤの検出反応が阻害されないことが実施例で確認されている。したがって、ビタミンＤおよびサポニンを含む水溶液は、標品としてのビタミンＤの保存に有用である。

【0020】

特に好ましくは、サポニンは、キラヤサポニンである。キラヤサポニンは、以下に示されるような構造を有する、サポゲニン（アグリコン）としてキラヤ酸を含むトリテルペン系サポニンである。キラヤサポニンは、例えば、バラ科キラヤ（Ｑｕｉｌｌａｊａ Ｓａｐｏｎａｒｉａ Ｍｏｌｉｎａ）の樹皮から抽出することにより、市販物を購入することにより、または人工的に合成することにより、入手することができる。

【0021】

【化2】

【0022】

【化3】

【0023】

サポニンは、抗酸化作用を有することが知られている（例、Ｇｒａｎｄｏｎら、Ｎａｔ Ｐｒｏｄ Ｃｏｍｍｕｎ．１２：１６９７−７００（２０１３）；Ｇｕａｊａｒｄｏ−Ｆｌｏｒｅｓら、Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．２：１４９７−５０３（２０１３）；Ｚｈａｏら、Ｅｖｉｄ Ｂａｓｅｄ Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ａｌｔｅｒｎａｔ Ｍｅｄ．２０１３：８２７２３０（２０１３）を参照）。サポニンが有する界面活性作用および抗酸化作用は、通常、別々に利用されている。例えば、サポニンを含む石鹸では、サポニンの界面活性作用が期待される。また、サポニンを含むサプリメントでは、サポニンの抗酸化作用が期待される。一方、本発明によれば、これらの両作用が同時に期待され得る。特にサポニンは水への溶解度が高いことから（例、キラヤサポニンの水への溶解度：１０ｇ／１００ｍＬ）、サポニンを増量することで抗酸化作用の増強が期待できる。

【0024】

混合物としては、例えば、粉末、および水溶液が挙げられる。例えば、本発明の混合物が水溶液である場合、サポニンの作用により水溶液中のビタミンＤを安定化できる。本発明の混合物がビタミンＤおよびサポニンの混合粉末である場合、本発明の混合物は、標品等として用いられる、ビタミンＤおよびサポニンを含む水溶液の簡便な調製（即ち、用時調製）に有用である。また、本発明の混合物がビタミンＤおよびサポニンの混合粉末である場合、本発明の混合物が吸湿したとしても、サポニンの作用によりビタミンＤが安定化され得る。混合粉末は、乾燥（例、凍結乾燥）または非乾燥の状態で提供されてもよい。水溶液は、凍結または液体の状態で提供されてもよい。好ましくは、本発明の混合物は、水溶液である。

【0025】

水溶液としては、例えば、水（例、蒸留水、滅菌水、滅菌蒸留水、純水）、および緩衝液が挙げられる。緩衝液としては、例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ＴＥ（Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ）緩衝液等のＴｒｉｓベースの緩衝液；塩酸−塩化カリウム緩衝液；グリシン‐塩酸緩衝液；クエン酸緩衝液；酢酸緩衝液；クエン酸−リン酸緩衝液；リン酸緩衝液；グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液；炭酸−重炭酸緩衝液；ホウ酸緩衝液；酒石酸緩衝液；ＭＥＳ（２−モルホリノエタンスルホン酸）緩衝液が挙げられる。緩衝液のｐＨは、ビタミンＤがサポニンにより安定化され得る限り特に限定されないが、例えばｐＨ５．０〜９．０である。ｐＨは、好ましくは５．５以上、より好ましくは６．０以上である。ｐＨはまた、好ましくは８．５以下、より好ましくは８．０以下である。水溶液は、少量の有機溶媒を含んでいてもよい。有機溶媒としては、例えば、アルコール（例、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール等の炭素原子数１〜６の低級アルコール）が挙げられる。水溶液中に含まれる有機溶媒量としては、例えば２０％（ｖ／ｖ）以下、好ましくは１５％（ｖ／ｖ）以下、より好ましくは１０％（ｖ／ｖ）以下、さらにより好ましくは５％（ｖ／ｖ）以下、特に好ましくは４％（ｖ／ｖ）以下、３％（ｖ／ｖ）以下、２％（ｖ／ｖ）以下、または１％（ｖ／ｖ）以下である。

【0026】

本発明の混合物中、ビタミンＤとサポニンとの重量比（ビタミンＤ：サポニン）は、サポニンによりビタミンＤを安定化できる限り特に限定されないが、例えば、１：２０００００〜１：１０の範囲内であってもよい。ビタミンＤとサポニンとの重量比の範囲における下限値は、好ましくは１：１０００００以上、より好ましくは１：２００００以上、さらにより好ましくは１：１００００以上、特に好ましくは１：２０００以上である。ビタミンＤとサポニンとの重量比の範囲における上限値は、好ましくは１：２０以下、より好ましくは１：５０以下、さらにより好ましくは１：１００以下、特に好ましくは１：１５０以下または１：２００以下である。

【0027】

本発明の混合物が水溶液である場合、水溶液中のビタミンＤの濃度は、特に限定されないが、例えば１ｎｇ／ｍＬ以上、好ましくは１０ｎｇ／ｍＬ以上、より好ましくは５０ｎｇ／ｍＬ以上、さらにより好ましくは１００ｎｇ／ｍＬ以上、特に好ましくは２００ｎｇ／ｍＬ以上であってもよい。水溶液中のビタミンＤの濃度はまた、例えば２０００ｎｇ／ｍＬ以下、１０００ｎｇ／ｍＬ以下、または５００ｎｇ／ｍＬ以下である。

【0028】

本発明の混合物が水溶液である場合、水溶液中のサポニンの濃度は、ビタミンＤを安定化できる濃度である限り特に限定されないが、例えば０．１％（ｗ／ｖ）以上、好ましくは０．５％（ｗ／ｖ）以上、より好ましくは１．０％（ｗ／ｖ）以上、さらにより好ましくは１．５％（ｗ／ｖ）以上、特に好ましくは２．０％（ｗ／ｖ）以上であってもよい。水溶液中のサポニンの濃度はまた、サポニンの水への溶解度以下の濃度である限り特に限定されないが、例えば、２０％（ｗ／ｖ）以下、１５％（ｗ／ｖ）以下、１２％（ｗ／ｖ）以下、１０％（ｗ／ｖ）以下、９％（ｗ／ｖ）以下、８％（ｗ／ｖ）以下、７％（ｗ／ｖ）以下、６％（ｗ／ｖ）以下、または５％（ｗ／ｖ）以下である。

【0029】

本発明の混合物（例、水溶液）は、上述した成分に加えて、他の成分をさらに含有していてもよい。このような成分としては、例えば、アルブミン（例、ＢＳＡ）、カゼイン等のタンパク質；包接化合物（例、β−シクロデキストリン等のシクロデキストリン）；抗酸化剤；糖類（例、グルコース、スクロース、トレハロース）；有機酸（例、サリチル酸、コール酸、デオキシコール酸）；防腐剤（例、アジ化ナトリウム）；無機物（例、金属イオン）；塩（例、ＮａＣｌ、ＫＣｌ）；医薬、試薬、食品、飲料または飼料等の製品として許容され得る担体が挙げられる。

【0030】

本発明の混合物が水溶液である場合、水溶液の容量は、水溶液中に含まれるビタミンＤの用途に応じて適宜変動し得るが、例えば、０．１〜１０００．０ｍＬである。好ましくは、ビタミンＤは標品として用いられることから、本発明の水溶液の容量は、例えば０．１〜２０ｍＬであってもよい。本発明の水溶液の容量は、好ましくは０．２ｍＬ以上、より好ましくは０．５ｍＬ以上、さらにより好ましくは１．０ｍＬ以上であってもよい。本発明の水溶液の容量はまた、好ましくは１５ｍＬ以下、より好ましくは１０ｍＬ以下、さらにより好ましくは５．０ｍＬ以下、４．０ｍＬ以下または３．０ｍＬ以下であってもよい。

【0031】

本発明の混合物（例、水溶液）は、例えば、容器（例、チューブ、マルチウェルプレート、バイアル、もしくはボトル）または点眼ビン（例、ガラス、もしくはプラスチック）に収容された形態で提供されてもよい。特に、本発明の混合物は、ビタミンＤ標品として用いられる場合、標品用の容器または点眼ビンに収容された形態（好ましくは、水溶液の形態）で提供される。本発明の混合物がビタミンＤ標品として用いられ、かつマルチウェルプレートに収容された形態で提供される場合、複数のウェルは、ビタミンＤの定量に有用であるように、異なる用量のビタミンＤを含む水溶液を収容していてもよい。

【0032】

本発明はまた、ビタミンＤおよびサポニンを含む混合物の製造方法を提供する。本発明の製造方法は、ビタミンＤをサポニンと組み合わせることを含む。具体的には、ビタミンＤとサポニンとの組合せは、ビタミンＤ粉末または液体およびサポニン粉末または液体を混合することにより、行うことができる。ビタミンＤ、サポニン、混合物、ならびにビタミンＤおよびサポニンを含む混合物は、上述したとおりである。

【0033】

好ましくは、本発明の製造方法は、ビタミンＤおよびサポニンを含む水溶液の製造方法である。この場合、本発明の製造方法は、水溶液中においてビタミンＤをサポニンと組み合わせることを含む。具体的には、ビタミンＤおよびサポニンは、同時または別々に水溶液に添加することができる。ビタミンＤおよびサポニンが別々に水溶液に添加される場合、ビタミンＤを含む水溶液にサポニンが添加されてもよく、またはビタミンＤを含む水溶液にサポニンが添加されてもよい。このような操作により、上述したような濃度範囲内にあるビタミンＤおよびサポニンを含む水溶液を調製することができる。ビタミンＤ、サポニン、水溶液、ならびにビタミンＤおよびサポニンを含む水溶液は、上述したとおりである。

【0034】

本発明の製造方法は、ビタミンＤおよびサポニンに加えて、上述したような他の成分（例、別の安定化剤）を組み合わせること（例、水溶液中に添加すること）を含んでいてもよい。他の成分は、ビタミンＤおよびサポニンと同様に、同時または別々に組み合わせること（例、水溶液中に添加すること）ができる。

【0035】

本発明はまた、ビタミンＤの保存方法を提供する。本発明の保存方法は、ビタミンＤをサポニンで安定化することを含む。好ましくは、本発明の保存方法は、ビタミンＤおよびサポニンを含む本発明の水溶液中で行われる。保存は、粉末または液体（凍結または非凍結）の状態、好ましくは液体の状態で行われ得る。したがって、本発明の保存方法は、好ましくは、ビタミンＤおよびサポニンを含む本発明の水溶液中において、ビタミンＤをサポニンで安定化することを含んでいてもよい。液体状態での保存は、例えば５０℃以下、より好ましくは４５℃以下、さらにより好ましくは４０℃以下、３５℃以下、３０℃以下、２５℃以下、または２０℃以下で行われてもよい。液体状態での保存はまた、０℃以上、１℃以上、２℃以上、３℃以上、または４℃以上で行われてもよい。

【0036】

液体状態での保存はまた、常温で行われてもよい。日本工業規格（ＪＩＳ）では、常温とは、２０℃±１５℃（５〜３５℃）の温度として定められている。一方、日本薬局方では、常温とは、１５〜２５℃の温度として定められている。本発明では、常温とは、５〜３５℃の温度範囲、好ましくは１５〜２５℃の温度範囲として定義される。これらの温度範囲は、実施例で保存効果が実証された温度４℃と３７℃との間にある。

【0037】

保存期間は、本発明の混合物中、好ましくは本発明の水溶液中において、ビタミンＤが測定可能な状態で残存し得る期間である限り特に限定されない。ビタミンＤの残存の程度は、保存期間によっても異なるため特に限定されないが、例えば、ビタミンＤは、本発明の混合物中において、初期量に対して、例えば３０％以上、好ましくは５０％以上、７０％以上、８０％以上または９０％以上の量において測定可能な状態で残存し得る。本発明の混合物中におけるビタミンＤの残存の程度は、後述する方法（例、イムノアッセイ）により決定することができる。保存期間としては、例えば、３日以上、１週間以上、２週間以上、３週間以上、１ヶ月以上、２ヶ月以上または３ヶ月以上の期間が挙げられる。また、保存期間は、特に限定されないが、例えば、３年以下、１年以下、６ヶ月以下または４ヶ月以下の期間であってもよい。

【0038】

本発明はまた、ビタミンＤの測定方法を提供する。本発明の測定方法は、ビタミンＤおよびサポニンを含む水溶液を標品として用いてビタミンＤを検出することを含む。本発明の測定方法では、当該水溶液（ビタミンＤ標品）は、例えば、ポジティブコントロールとして、および/または定量のための検量線の作成に用いることができる。

【0039】

本発明の測定方法が行われる場合、通常、ビタミンＤを含有する、または含有すると疑われるサンプルの測定が併せて行われる。このようなサンプルの由来は特に限定されず、生物由来の生物学的サンプルであってもよく、または環境サンプルなどであってもよい。生物学的サンプルが由来する生物としては、例えば、哺乳動物（例、ヒト、サル、マウス、ラット、ウサギ、ウシ、ブタ、ウマ、ヤギ、ヒツジ）、鳥類（例、ニワトリ）等の動物、昆虫、微生物、植物、菌類、魚類が挙げられるが、好ましくは哺乳動物、菌類、魚類であり、より好ましくは哺乳動物であり、さらにより好ましくはヒトである。生物学的サンプルはまた、血液自体または血液に由来するサンプルである血液関連サンプル（例、全血、血清、血漿）、唾液、尿、乳汁、組織または細胞抽出液、あるいはこれらの混合物であってもよいが、血液関連サンプルが好ましい。好ましいサンプルは、ヒトの血液関連サンプルである。環境サンプルとしては、土壌、海水、淡水由来のサンプルが挙げられる。サンプルは、遠心分離、抽出、ろ過、沈殿、加熱、凍結、冷蔵、および攪拌等の予備処理、ならびに界面活性剤等の成分を含む試薬（例、前処理液、希釈液、および/または反応液）による処理に付されてもよい。

【0040】

ビタミンＤの検出は、定性的または定量的に行われる。ビタミンＤの検出は、自体公知の任意の方法により行うことができ、例えば、ビタミンＤに対する親和性物質（例、抗体）を用いて行うことができる（例、国際公開第２０１３／０４２４２６号）。ビタミンＤの検出はまた、イムノアッセイにより行なわれてもよい。このようなイムノアッセイとしては、例えば、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）（例、直接競合ＥＬＩＳＡ、間接競合ＥＬＩＳＡ、サンドイッチＥＬＩＳＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、磁性粒子法、免疫クロマト法、ルミネッセンス免疫測定法、スピン免疫測定法、ラテックス凝集法が挙げられる。ビタミンＤの検出を可能とする上記以外の方法としては、例えば、ＬＣ−ＭＳが挙げられる。

【0041】

ビタミンＤに対する親和性物質として抗体が用いられる場合、２次抗体がさらに用いられてもよい。２次抗体としては、ビタミンＤに対する抗体（１次抗体）の１次抗体部分に対する抗体であってもよく、ビタミンＤおよび１次抗体の複合体に対する抗体であってもよい。２次抗体等の抗体は、検出用物質に連結されていてもよい。検出用物質としては、例えば、酵素（例、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ）、親和性物質（例、ストレプトアビジン、ビオチン）、蛍光物質（例、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン）、発光物質（例、ルシフェリン、エクオリン）、放射性物質（例、^３Ｈ、^１４Ｃ、^３２Ｐ、^３５Ｓ、^１２５Ｉ）が挙げられる。２次抗体等の抗体は、抗体は、支持体に固定されていてもよい。支持体としては、例えば、粒子（例、磁性粒子）、メンブレン（例、ニトロセルロース膜）、ガラス、プラスチック、金属、プレート（例、マルチウェルプレート）、デバイスが挙げられる。抗体はまた、濾紙等の媒体に含浸された形態で提供されてもよい。

【0042】

本発明はまた、キットを提供する。ビタミンＤとサポニンとの間の関連性（サポニンによるビタミンＤの安定化）を見出した本発明者らの知見によれば、ビタミンＤまたはその測定試薬とサポニンとを組み合わせる動機付けが生まれるが、このような知見なしにはこれらを組み合わせる動機付けは存在しない。本発明のキットは、ビタミンＤまたはその測定試薬とサポニンとの組合せにより特徴付けられる。

【0043】

具体的には、本発明のキットは、以下（１）〜（４）のいずれかを含む。
（１）ビタミンＤ、およびサポニン；
（２）ビタミンＤの測定試薬、およびサポニン；
（３）ビタミンＤおよびサポニン、ならびにビタミンＤの測定試薬；または
（４）ビタミンＤおよびサポニンを含む水溶液、ならびにビタミンＤの測定試薬。

【0044】

本発明のキットに含まれる上述の構成成分の詳細（例、ビタミンＤ、サポニン、水溶液、ならびにビタミンＤおよびサポニンを含む水溶液、それらの濃度、好ましい例）は、本発明において上述したとおりであるが、上記（１）、（２）および（３）の場合、ビタミンＤおよびサポニンは、粉末の状態であることも好ましい。ビタミンＤの測定試薬は、例えば、ビタミンＤに対する親和性物質（例、抗体）を含む。ビタミンＤの測定試薬はまた、ビタミンＤのイムノアッセイに必要な成分を含んでいてもよい。これらのキットは、サンプルの処理試薬（例、前処理液、希釈液、および／または反応液）をさらに含んでいてもよい。本発明のキットでは、各構成成分が、それぞれ異なる容器に収容された形態で提供されてもよい。本発明のキットは、例えば、ビタミンＤ標品を含むビタミンＤの測定用キット、または試薬（例、診断試薬、実験試薬）用キットとして有用である。

【実施例】

【0045】

以下、本発明の実施例を記載するが、これらの実施例により本発明が限定されるものではない。

【0046】

実施例１：ビタミンＤの安定化に対する種々の界面活性剤の効果の検討
ビタミンＤを溶液中で安定化させることが難しい理由は二つある。先ず、ビタミンＤは、脂溶性であることから、容器の壁に容易に吸着し易い性質を有する。次に、ビタミンＤは、酸化により破壊され易い性質を有する。これらの事項を考慮し、種々の界面活性剤が２５ＯＨ ＶＤ３（２５ヒドロキシビタミンＤ３）の安定化作用を有するか否かについて、以下のとおり検討した。

【0047】

１）材料の調製
・希釈液１を使用して、表１に示されるように、各界面活性剤をそれぞれの濃度に希釈した。
・ＥｔＯＨを使用して２５ＯＨ ＶＤ３を４μｇ／ｍＬに希釈した。
・カルボキシル化磁性粒子に抗２５ＯＨ ＶＤ抗体を感作させ、抗２５ＯＨ ＶＤ抗体結合磁性粒子を調製した。
・希釈液２を使用して抗２５ＯＨ ＶＤ抗体結合粒子を２５０μｇ／ｍＬに希釈し、粒子液を調製した。
・希釈液３を使用して、抗２５ＯＨ ＶＤ抗体と結合した２５ＯＨ ＶＤ３を認識する、ＡＬＰ（アルカリホスファターゼ）標識抗体を２００ｎｇ／ｍｌに希釈し、標識抗体液を調製した。

【0048】

希釈液１〜３の組成は、以下のとおりである。
希釈液１：ｐＨ７．５ １００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，５０ｍＭ ＮａＣｌ，０．１％（ｗ／ｖ） ＮａＮ_３
希釈液２：ｐＨ７．２ ５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，０．１％（ｗ／ｖ） ＮａＮ_３，０．１％（ｗ／ｖ） ＢＳＡ，１ｍＭ ＥＤＴＡ
希釈液３：ｐＨ６．８ ５０ｍＭ ＭＥＳ，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，０．１％（ｗ／ｖ） ＮａＮ_３，０．１％（ｗ／ｖ） ＢＳＡ，１０μｇ／ｍＬ

【0049】

２）測定手順
測定は、以下のとおり行った。
・界面活性剤溶液３００μＬに２５ＯＨ ＶＤ３溶液５μＬを加えた。
・撹拌した後、混合溶液を７０μＬずつに分け、４℃または３７℃で３日または６日間保存した。
・上記希釈液１で１５ｍｇ／ｍＬに希釈したデオキシコール酸ナトリウム溶液４０μＬを、混合溶液１０μＬに加えた。
・得られた溶液を撹拌した後、常温で１０分間反応させた。
・溶液に希釈液４ １５０μＬを加えた。
・上記溶液７５μＬに粒子液７５μＬを加えた。
・得られた溶液を撹拌した後、３７℃で１０分間反応させた。
・集磁して上清を除き、洗浄液２５０μＬを加えて粒子を洗浄した。
・洗浄操作を合計３回繰り返した。
・標識抗体溶液１２５μＬを加えた。
・得られた溶液を撹拌した後、３７℃で１０分間反応させた。
・集磁して上清を除き、洗浄液２５０μＬを加えて粒子を洗浄した。
・洗浄操作を合計３回繰り返した。
・ＡＬＰの発光基質溶液１１０μＬを加えた。
・得られた溶液を撹拌した後、３７℃で４分間反応させた。
・発光量を測定した。

【0050】

希釈液４の組成は、以下のとおりである。
希釈液４：ｐＨ７．５ １００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，５０ｍＭ ＮａＣｌ，０．１％（ｗ／ｖ） ＮａＮ_３，０．１％（ｗ／ｖ） ＢＳＡ

【0051】

【表1】

【0052】

番号（１）〜（１２）について「３ｄａｙｓ ４℃」の条件下で測定された発光量を１００％とした場合の各発光量の相対値（％）を表２に示す。その結果、キラヤサポニンを用いて測定された発光量は、２つの温度条件下で、経時的に減少しなかった。このことは、サポニンが２５ＯＨ ＶＤ３の安定化に優れることを示す。

【0053】

【表2】

【0054】

実施例２：ビタミンＤの安定化に対するサポニンの濃度の効果の検討
低濃度および高濃度のサポニンによるビタミンＤの安定化作用について、以下のとおり検討した。

【0055】

１）材料の調製
・希釈液１を使用して、表３に示されるように、各界面活性剤をそれぞれの濃度に希釈した。
・以降の操作は、実施例１−１）と同様に行った。

【0056】

２）測定手順
測定は、実施例１と同様に行った。

【0057】

番号（１）〜（３）について「４ｄａｙｓ ４℃」の条件下で測定された発光量を１００％とした場合の各発光量の相対値（％）を表３に示す。その結果、２％（ｗ／ｖ）および１０％（ｗ／ｖ）のキラヤサポニンを用いて測定された発光量は、２つの温度条件下で、経時的に減少しなかった。したがって、サポニンは、低濃度および高濃度の双方においてビタミンＤを安定化できることが示された。また、水溶液中に含まれていた高濃度のキラヤサポニンは、ビタミンＤの検出反応を阻害しなかった。したがって、サポニンは、ビタミンＤの標品（水溶液）の保存に適切であることが示された。

【0058】

【表3】

【産業上の利用可能性】

【0059】

本発明は、例えば、ビタミンＤの安定化に有用である。