特許第6566473号(P6566473)IP Force 特許公報掲載プロジェクト 2022.1.31 β版

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特許6566473環状エーテル構造を有する有機化合物の分解能を有する新規微生物とその使用
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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】6566473
(24)【登録日】2019年8月9日
(45)【発行日】2019年8月28日
(54)【発明の名称】環状エーテル構造を有する有機化合物の分解能を有する新規微生物とその使用
(51)【国際特許分類】
   C12N 1/20 20060101AFI20190819BHJP
   C02F 3/34 20060101ALI20190819BHJP
   C12R 1/01 20060101ALN20190819BHJP
【FI】
   C12N1/20 FZNA
   C12N1/20 BZAB
   C02F3/34 Z
   C12N1/20 A
   C12R1:01
【請求項の数】8
【全頁数】17
(21)【出願番号】特願2015-167177(P2015-167177)
(22)【出願日】2015年8月26日
(65)【公開番号】特開2017-42097(P2017-42097A)
(43)【公開日】2017年3月2日
【審査請求日】2018年8月3日
【新規性喪失の例外の表示】特許法第30条第2項適用 (1)発行者:公益社団法人日本農芸化学会、刊行物名:2015年度(平成27年度)日本農芸化学会講演要旨集(オンライン)、発行年月日:平成27年3月5日 (2)集会名:2015年度(平成27年度)日本農芸化学学会大会、開催場所:岡山大学津島キャンパス(岡山市北区津島中)一般講演会場、開催日:平成27年3月27日
【微生物の受託番号】NPMD  NITE P-02105
(73)【特許権者】
【識別番号】800000068
【氏名又は名称】学校法人東京電機大学
(74)【代理人】
【識別番号】100106909
【弁理士】
【氏名又は名称】棚井 澄雄
(74)【代理人】
【識別番号】100149548
【弁理士】
【氏名又は名称】松沼 泰史
(74)【代理人】
【識別番号】100154852
【弁理士】
【氏名又は名称】酒井 太一
(74)【代理人】
【識別番号】100171446
【弁理士】
【氏名又は名称】高田 尚幸
(72)【発明者】
【氏名】椎葉 究
(72)【発明者】
【氏名】安部 智子
(72)【発明者】
【氏名】松井 稜太郎
【審査官】 宮岡 真衣
(56)【参考文献】
【文献】 国際公開第2016/181802(WO,A1)
【文献】 山本哲史ら,1,4-ジオキサン汚染地下水の生物浄化に関する研究,大成建設技術センター報,2013年,第 46 号,53-1-4
【文献】 Sei K et al,Isolation and characterization of bacterial strains that have high ability to degrade 1,4-dioxane as a sole carbon and energy source,Biodegradation,2013年,24(5),665-674
【文献】 Mahendra S et al,Pseudonocardia dioxanivorans sp. nov., a novel actinomycete that grows on 1,4-dioxane,Int J Syst Evol Microbiol.,2005年,55(Pt 2),593-598
【文献】 Jian-Meng Chen et al,A newly isolated strain capable of effectively degrading tetrahydrofuran and its performance in a continuous flow system,Bioresource Technology,2010年,101(16),6461-6467
【文献】 Kohlweyer U et al,Tetrahydrofuran degradation by a newly isolated culture of Pseudonocardia sp. strain K1,FEMS Microbiol Lett.,2000年,186(2),301-306
【文献】 VAINBERG S. et al.,Applied and Environmental Microbiology,Vol.72, No.8 (2006),p.5218-5224
(58)【調査した分野】(Int.Cl.,DB名)
C12N 1/20
C02F 3/34
C12R 1/01
JSTPlus/JMEDPlus/JST7580(JDreamIII)
CiNii
CAplus/MEDLINE/EMBASE/BIOSIS/WPIDS(STN)
GenBank/EMBL/DDBJ/GeneSeq
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
シュードノカルディア(Pseudonocardia)RM31株(NITE AP−02105)。
【請求項2】
請求項1に記載のシュードノカルディアRM31株を含むことを特徴とする環状エーテル構造を有する有機化合物分解剤。
【請求項3】
請求項2に記載の環状エーテル構造を有する有機化合物分解剤を用いることを特徴とする環状エーテル構造を有する有機化合物の分解方法。
【請求項4】
塩分の存在下で行う請求項3に記載の環状エーテル構造を有する有機化合物の分解方法。
【請求項5】
前記環状エーテル構造を有する有機化合物がジオキサン類である請求項3又は4に記載の環状エーテル構造を有する有機化合物の分解方法。
【請求項6】
請求項2に記載の環状エーテル構造を有する有機化合物分解剤を用いることを特徴とする廃水の処理方法。
【請求項7】
前記廃水が塩分を含む請求項6に記載の廃水の処理方法。
【請求項8】
請求項2に記載の環状エーテル構造を有する有機化合物分解剤を含む生物処理槽を備える廃水の処理装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、環状エーテル構造を有する有機化合物の分解能を有する新規微生物とその使用に関する。
【背景技術】
【0002】
1,4−ジオキサン等の環状エーテル構造を有する有機化合物は、各種工業において主に抽出、反応溶剤、塩素系溶剤の安定剤の製造に使用されている。しかしながら、水に対する高い親和性と揮発性の低さから、環境での残留性が高い。また、1,4−ジオキサンについては、人体への発ガン性が指摘されており、国内では平成21年に水質環境基準(0.05mg/L以下)が設けられている。
【0003】
この環状エーテル構造を有する有機化合物を含む廃水は、一般的な廃水微生物処理法では除去することが難しく、環状エーテル構造を有する有機化合物を分解可能な新規微生物の探索が進められている。
【0004】
特許文献1には、1,4−ジオキサン等のジオキサン環構造を有する化合物(以下、ジオキサン類と呼ぶ)を分解可能な新規微生物として、リノクラジエラ(Rhinocladiella)EP10株(FERM−AP−21771)が開示されている。この微生物は、10%以下の塩分存在下でも増殖可能であり、ジオキサン類を分解可能であることが記載されている。
【0005】
非特許文献1には、1,4−ジオキサンの分解可能な新規微生物として、シュードノカルディア・ジオキサニヴォランス(Pseudonocardia dioxanivorans)D17株が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0006】
【特許文献1】特開2010−252779号公報
【非特許文献】
【0007】
【非特許文献1】山本哲史他、「1,4−ジオキサン汚染地下水の生物浄化に関する研究」、大成建設技術センター報、第46号(2013)、53−1〜53−4.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
しかしながら、例えば、塩分が高濃度であるなど過酷な環境下において、より環状エーテル構造を有する有機化合物の分解能が高い微生物が求められている。
【0009】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、過酷な環境下において、環状エーテル構造を有する有機化合物の分解能を有する新規微生物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0010】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、シュードノカルディア(Pseudonocardia)属に属する放線菌が、環状エーテル構造を有する有機化合物を分解できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【0011】
本発明は、以下の態様を含む。
(1)シュードノカルディア(Pseudonocardia)RM31株(NITE AP−02105)。
(2)(1)に記載のシュードノカルディアRM31株を含むことを特徴とする環状エーテル構造を有する有機化合物分解剤。
(3)(2)に記載の環状エーテル構造を有する有機化合物分解剤を用いることを特徴とする環状エーテル構造を有する有機化合物の分解方法。
(4)塩分の存在下で行う(3)に記載の環状エーテル構造を有する有機化合物の分解方法。
(5)前記環状エーテル構造を有する有機化合物がジオキサン類である(3)又は(4)に記載の環状エーテル構造を有する有機化合物の分解方法。
(6)(2)に記載の環状エーテル構造を有する有機化合物分解剤を用いることを特徴とする廃水の処理方法。
(7)前記廃水が塩分を含む(6)に記載の廃水の処理方法。
(8)(2)に記載の環状エーテル構造を有する有機化合物分解剤を含む生物処理槽を備える廃水の処理装置。
【発明の効果】
【0012】
本発明により、過酷な環境下において、環状エーテル構造を有する有機化合物の分解能が高い微生物を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【0013】
図1】シュードノカルディアRM31株の顕微鏡写真である。
図2】シュードノカルディアRM31株の16S rDNA遺伝子の塩基配列と近縁放線菌種の16S rDNA遺伝子の塩基配列とを比較し、作成したヒストグラムである。
図3】実施例1において、環状エーテル構造を有する有機化合物分解菌の集菌するために使用したパーコレーターと呼ばれる集菌装置の模式図である。
図4】実施例1において、パーコレーターを用いた160日間の還流集積による1,4−ジオキサンの分解推移を示したグラフである。
図5】実施例1において、成長の早い菌株No.12、17、24、31の4種について、1,4−ジオキサンの分解能の確認試験の結果を示したグラフである。
図6】試験例1において、RM31株による経時での1,4−ジオキサンの分解試験の結果を示したグラフである。
図7】試験例2において、RM31株による1,4−ジオキサン分解のpHによる影響の確認試験の結果を示したグラフである。
図8】試験例3において、RM31株による低濃度(150ppm)の1,4−ジオキサン分解試験の結果を示したグラフである。
図9】試験例4において、RM31株による1,4−ジオキサン分解のNaClによる影響の確認試験の結果を示したグラフである。
図10】試験例5において、RM31株による1,4−ジオキサン分解の温度による影響の確認試験の結果を示したグラフである。
図11】試験例6において、RM31株による1,4−ジオキサン分解の培地濃度の影響の確認試験の結果を示したグラフである。
図12】試験例7において、RM31株から抽出した粗酵素による1,4−ジオキサンの分解試験の結果を示したグラフである。
図13】試験例8において、RM31株によるテトラヒドロフラン(THF)の分解試験の結果を示したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【0014】
<シュードノカルディア(Pseudonocardia)RM31株>
一実施形態において、本発明は、シュードノカルディア(Pseudonocardia)RM31株(NITE AP−02105)を提供する。
【0015】
本実施形態の微生物は、シュードノカルディア(Pseudonocardia)属に属し、環状エーテル構造を有する有機化合物の分解能を有する。
シュードノカルディアは、放線菌門に属する真正細菌の一属である。
【0016】
シュードノカルディアRM31株の分離精製は、以下の手順により行った。
即ち、沖縄県眞栄田美咲の海岸で採取された海水試料から、パーコレーターと呼ばれる集積装置(例えば、国際公開第00/078923号参照)を用いて、154日間還流集積を行い、1,4−ジオキサンの分解能を持つ微生物を単離した。これを、下記表1に組成を示す1,4−ジオキサンを含むBSM(Basal salt medium)寒天培地を用いて、25℃で5日間培養し、菌株を確立した。形態観察その他からシュードノカルディア属の放線菌と同定し、RM31株と名付けた。
【0017】
【表1】
【0018】
シュードノカルディアRM31株の微生物学的性質は以下の通りである。走査型電気顕微鏡(SEM)を用いて撮影したシュードノカルディアRM31株の栄養型細胞(好適生育環境、豊富な栄養条件下で旺盛に増殖する状態の細胞)の顕微鏡写真を図1に示す。
【0019】
(科学的性質)
塩分存在下で環状エーテル構造を有する有機化合物の分解能を有する。
【0020】
(形態的性質)
(1)栄養型細胞は菌糸を形成して細長く増殖する。菌糸の太さは約1μmである。
(2)気菌糸上に胞子連鎖を形成する。
【0021】
(生殖様式)
(1)無性増殖、すなわち細胞分化の結果として無性胞子を形成する。
(2)菌糸の一部が断裂して均等な大きさの1列の細胞(分節胞子)の連鎖をつくり、やがて分離して、胞子の機能を持つ。
【0022】
(生理学・生化学性状)
(1)培養液:海水や汽水及び海水塩を含む培養液で生育できる。
(2)生育温度域:20℃以上30℃未満(至適温度25℃)。
(3)生育pH域:pH6.0〜7.0(至適pH7.0)。
(4)栄養源:炭素源として、環状エーテル構造を有する有機化合物だけではなく、グルコースなどの易分解性の単糖でも生育できる。また、窒素源として、硫酸や硝酸アンモニウムのような無機態窒素だけでなく、イーストエキスやペプトン、牛肉エキスのような有機態窒素でも利用できる。
【0023】
(分類学的性質)
シュードノカルディアRM31株の16S rDNA遺伝子の塩基配列を配列表の配列番号1に示す。図2は、シュードノカルディアRM31株の16S rDNA遺伝子の塩基配列と、近縁放線菌種の16S rDNA遺伝子の塩基配列とを比較し、作成したヒストグラムである。
この結果、シュードノカルディアRM31株は新規の放線菌株と判断した。
【0024】
シュードノカルディアRM31株は、2015年8月20日付で独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター(NPMD)(千葉県木更津市かずさ鎌足2−5−8)にプタベスト条約の規定化で受領番号NITE AP−02105として国内寄託されている。
【0025】
(培地)
本実施形態において、シュードノカルディアRM31株を培養するにあたり、培地を用いることが好ましい。
用いられる培地は、シュードノカルディア属に属する放線菌が生育する条件であれば制限はないが、海水塩、海水、濃縮海水又は人工海水を含む培地が、環状エーテル構造を有する有機化合物の分解能を向上させることから、特に好ましい。
例えば、このような培地として、上記表1に示した組成のBSM培地を好ましく用いることができる。
その他用いることができる培地として、一般的な栄養培地であるNB(Nutrient Broth)培地(例えば、Difco社製の「Nutrient Broth, Bacto」(牛肉エキス3g/L、ペプトン5g/L含有)等)等を挙げることができるが、高効率で環状エーテル構造を有する有機化合物の分解することから、上記表1に示した組成のBSM培地が特に好ましい。
【0026】
(塩濃度)
本発明者らは、培地中に塩分を含むことにより、シュードノカルディアRM31株の環状エーテル構造を有する有機化合物の分解能が向上することを見出した。よって、培地に最適濃度の塩を添加することで、環状エーテル構造を有する有機化合物の分解能を向上させることができる。
本実施形態において、使用が可能な塩は、公知慣用の海水塩等を挙げることができる。海水塩としては、海水を蒸発乾固させて得られたものであっても、海水や海水の濃縮液を用いてもよいが、培地中に含まれる濃度を調節するためには、海水の固形分である海水塩を用いてもよい。
【0027】
また、人工海水を用いてもよい。人工海水とは、海水の組成を模して人工的に調製された粉末や濃縮液を意味し、海水を必要とする生物の飼育や培養において、入手性、再現性、廉価性などの理由から天然海水の代用となるものである。また、市販の人工海水を用いてもよい。市販の人工海水とは、塩化ナトリウムを主成分として、様々な無機塩類やpH調整剤などが含まれたものを意味し、用途により水道水や蒸留水で希釈することによって海水に近い成分となるものもある。
その他、上記の海水塩等でなくても、本発明の目的に適う培地として使用が可能な塩を調製して用いてもよい。
【0028】
培地中の塩濃度は、0.5%以上5%以下が好ましく、2%以上3.5%以下がより好ましく、3.5%が特に好ましい。シュードノカルディアRM31株は海洋圏で生育する微生物であり、海水の塩濃度が3.5%であることから、上記範囲内において、増殖させることができ、さらに、環状エーテル構造を有する有機化合物の分解能を向上させることができる。
【0029】
(培養方法)
本実施形態において、シュードノカルディアRM31株の培養方法は、公知慣用の方法で行うことができる。培養において、上記の培地を用いることができる。
本実施形態において、培養方法としては、例えば、静置培養法、振盪培養法、深部通気撹拌培養法等が挙げられる。
【0030】
培養におけるpHは、6.0〜7.0の中性付近で行うことができ、pH7.0であることが好ましい。
【0031】
培養温度としては、20℃以上30℃未満で行うことができ、25℃で行うことが好ましい。シュードノカルディアRM31株は海洋圏で生育する微生物であり、夏場でも水温が24〜28℃であることから、従来の放線菌よりも低温で培養することができ、さらに、環状エーテル構造を有する有機化合物を分解することができる。また、培養温度が上記範囲内である場合、培養温度を調節するためにエネルギーを必要とせず、また、特別な設備も必要としない。
【0032】
本実施形態の培養方法により、シュードノカルディアRM31株を培養すると、安定した増殖を示すばかりでなく、環状エーテル構造を有する有機化合物の分解能が向上したシュードノカルディアRM31株が得られる。
【0033】
<環状エーテル構造を有する有機化合物分解剤>
一実施形態において、本発明は、上述のシュードノカルディアRM31株を含む環状エーテル構造を有する有機化合物分解剤を提供する。
【0034】
本実施形態の分解剤によれば、塩類の存在下において、温和な条件で、高効率で環状エーテル構造を有する有機化合物を分解することができる。
【0035】
本実施形態において、シュードノカルディアRM31株の培養液をそのまま、又は水溶液に希釈して利用してもよい。また、培養液から、ろ過、遠心分離等の固液分離手段により回収し利用してもよい。さらに、凍結乾燥法等による乾燥状態で使用してもよい。
【0036】
シュードノカルディアRM31株は適宜製剤化して分解剤として利用してもよい。例えば、シュードノカルディアRM31株を、珪藻土、タルク、活性炭、ゼオライト、カオリナイト等の多孔質物質と混合し、表面へ付着又は多孔質に吸着させて分解剤として利用することが挙げられる。
シュードノカルディアRM31株は、担体に固定化して分解剤してもよい。担体への固定化方法としては、例えば担体結合法、包括法、吸着法等が挙げられる。担体の材質は、有機又は無機のいずれのものでも構わない。分解剤の製造方法としては、例えば、公知の放線菌培地にオートクレーブ処理等の殺菌処理を施した担体を添加し、通常の培養方法で行えばよい。固定化した微生物はそのまま使用してもよい。また、遠心分離により回収して使用してもよい。また、凍結乾燥、真空乾燥等の処理により乾燥状態にして使用してもよい。
【0037】
(環状エーテル構造を有する有機化合物)
シュードノカルディアRM31株が分解することが可能な環状エーテル構造を有する有機化合物は、特別な限定はなく、例えば、オキシラン、オキセタン、オキソラン(テトラヒドロフラン:THF)、オキサン(テトラヒドロピラン:THP)、ジオキサン又はオキセパン等の環状エーテル環構造を有する化合物等が挙げられる。これらの環状骨格を形成する炭素原子には少なくとも一つの置換基が結合した構造を有する化合物であってもよい。置換基としては、アルキル基、水酸基等が挙げられる。
中でも、環境負荷の観点から、ジオキサン類が好ましい。ジオキサン類の具体例としては、1,4−ジオキサン、1,3−ジオキサン、4−ジオキサン−2,3−ジオール、1,4−ジオキサンジメタノール等が挙げられる。
【0038】
<環状エーテル構造を有する有機化合物の分解方法>
一実施形態において、本発明は、上述の環状エーテル構造を有する有機化合物分解剤を用いた環状エーテル構造を有する有機化合物の分解方法を提供する。
【0039】
本実施形態の分解方法によれば、塩類の存在下において、温和な条件で、高効率で環状エーテル構造を有する有機化合物を分解することができる。これは、分解剤に含まれるシュードノカルディアRM31株が、上述の通り、塩分存在下において、環状エーテル構造を有する有機化合物の分解能が向上するためである。
【0040】
本実施形態の分解方法において、シュードノカルディアRM31株と環状エーテル構造を有する有機化合物を共存させることにより実施すればよい。共存とは、シュードノカルディアRM31株と化合物が接触することを意味する。例えば、分解対象化合物を含む水溶液中で好適な条件でシュードノカルディアRM31株を増殖させることにより実施する方法等が挙げられる。
【0041】
本実施形態の分解方法において、環状エーテル構造を有する有機化合物とは、上述のものが挙げられる。中でも、環境負荷の観点から、ジオキサン類に好ましく適用される。
【0042】
<廃水の処理方法>
一実施形態において、本発明は上述の環状エーテル構造を有する有機化合物分解剤を用いた廃水の処理方法を提供する。
【0043】
本実施形態の廃水の処理方法によれば、環状エーテル構造を有する有機化合物を含む廃水を、温和な条件下で効率的に処理することができる。また、廃水は塩分を含んでいてもよい。これは、分解剤に含まれるシュードノカルディアRM31株が、上述の通り、塩分存在下において、環状エーテル構造を有する有機化合物の分解能が向上するためである。
【0044】
また、廃水には、環状エーテル構造を有する有機化合物以外の有機化合物を含んでいてもよい。この場合、シュードノカルディアRM31株を含む分解剤による、環状エーテル構造を有する有機化合物の分解除去を行う前に、環状エーテル構造を有する有機化合物以外の有機化合物を除去する前処理を行えばよい。前処理方法としては、通常の生物処理方法や凝集処理方法等が挙げられ、これら複数の処理方法を組み合わせてもよい。また、前処理において、pHの調整を行ってもよい。分解剤に含まれるシュードノカルディアRM31株は、pHが中性付近で効率よく環状エーテル構造を有する有機化合物を分解するため、必要に応じてpHを調整してもよい。
【0045】
本実施形態において、廃水の処理方法は、上述のシュードノカルディアRM31株の培養方法と同様の条件で行えばよい。pHが中性付近であればよく、温度も20℃以上30℃であればよいため、温和な条件で廃水の処理を行うことができる。また、温度調節等が必要ないため、エネルギーの消費を抑えることができる。
【0046】
<廃水の処理装置>
一実施形態において、本発明は上述の環状エーテル構造を有する有機化合物分解剤を含む生物処理槽を備えた廃水の処理装置を提供する。
【0047】
本実施形態の廃水の処理装置によれば、環状エーテル構造を有する有機化合物を含む廃水を、温和な条件下で効率的に処理することができる。
【0048】
環状エーテル構造を有する有機化合物分解剤を含む生物処理槽は、特別な限定はなく、従来の廃水の処理装置で用いられる生物処理槽を用いればよい。また生物処理槽の数は1つに限らない。複数の槽で構成されていてもよい。
【0049】
さらに、廃水に含まれる環状エーテル構造を有する有機化合物以外の有機化合物を除去するための前処理槽を備えていてもよい。また、前処理槽には、廃水のpHを調節するために、酸(例えば、塩酸、硫酸等)及びアルカリ(例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等)のうち少なくともいずれかのpH調整剤を含む装置を備えていてもよい。その他、従来、廃水の処理を行うために必要とされる装置を備えていてもよい。
【実施例】
【0050】
以下、実施例により、本発明を詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【0051】
[実施例1]環状エーテル構造を有する有機化合物分解菌の単離
(1)スクリーニング
沖縄県眞栄田美咲の海岸で採取された海水を試料とした。環状エーテル構造を有する有機化合物分解菌を単離するために、パーコレーターと呼ばれる集菌装置(分解菌迅速集積装置、藤原製作所製)を用いた(図3参照)。
パーコレーターの原理としては、多孔質の炭化資材に微生物を閉じ込め、そこに唯一の炭素源を添加した液体培地を還流し続けることで、培地中の炭素源の濃度は減少していく。炭化資材中の微生物が増殖すると炭素源の減少速度は速くなり、炭化資材を砕いて抽出した液を寒天培地に塗布することで単離することができる。
【0052】
まず、オートクレーブで滅菌処理したパーコレーター10に、上記沖縄県でサンプリングした海水に1日漬けた炭化資材A130(マングローブを炭にして直径2mm〜4mmに砕いたもの)1を10g入れ、下記表2に示した組成のBSM液体培地2を還流液として250mL入れ、エアレーションポンプ3を用いて、還流を開始した。
【0053】
【表2】
【0054】
表2において、Vitamin 5mixtureには、下記表3に示した成分が含まれる。また、Trace Elementsには、下記表4に示した成分が含まれる。
【0055】
【表3】
【0056】
【表4】
【0057】
還流液中の1,4−ジオキサンの減少傾向を簡易的に追うために、初期濃度を1,000ppmに調製し、100ppmを切ったことを確認したら、その日の内に装置内の還流液を全て交換し、還流を再開して1,4−ジオキサンの減少傾向を追った。この操作を160日間繰り返し行った。結果を図4に示す。海水サンプルにおいて、1,4−ジオキサンの分解速度が安定した154日目で集積培養を停止し、菌が存在している炭化資材A130を取り出した。
【0058】
炭化資材A130を砕き、リン酸バッファーで抽出した。次に、上記表2からVitamin 5mixtureとTrace Elementを除いたBSM培地をベースにした寒天培地を作製した。リン酸バッファーの抽出液を作製した寒天培地に平板塗抹した。寒天培地には、32個のコロニーが生えてきた。
【0059】
(2)1,4−ジオキサンの分解能の確認試験
続いて、32個のコロニーの内、特に成長の早い菌株No.12、17、24、31の4種について、1,4−ジオキサンの分解能の確認試験を行った。
分解確認試験は、10cm程度のふた付きガラス管に1,000ppmに調整したBSM液体培地を2ml入れた。続いて、それぞれ単離したコロニーを、白金耳を用いて入れ、4日間振とうした。その後1,4−ジオキサンの濃度をHPLCで測定した。測定条件は、親水性相互作用クロマトグラフィー(Hydrophilic Interaction Chromatography:HILIC)カラムを使用した。さらに、アセトニトリルと0.1%リン酸の比を、95:5、60:40、95:5と経時的に変え、濃度勾配を作り、15分間測定した。結果を図5に示す。図5において、Firstとは、菌体を入れてすぐの1,4−ジオキサン濃度を表す。また、コントロールとは、菌体を含まないBSM液体培地を用いて4日間振とうし、同様の試験を行った結果を表す。
【0060】
図5から、No.31の菌株について、1000ppm濃度の1,4−ジオキサンを約70%分解する能力があることが明らかとなった。No.31の菌株を1,4−ジオキサン分解菌RM31株と命名した。
続いて、RM31株について、様々な条件下でどのように分解に影響するか検討した。
また、RM31株から16S rRNAを分離増幅して、(株)テクノスルガ・ラボに同定を依頼したところ、その相同性からPseudonocardia属の一種であることが明らかとなった。
【0061】
[試験例1]RM31株による経時での1,4−ジオキサン分解試験
200mLの三角フラスコに1,4−ジオキサンの濃度を1,000ppmに調整したBSM液体培地を20mL入れ、菌体量を全体の5%になるように添加した。フラスコはゴム栓とパラフィルムをして、25℃、150rpmで振とうし、0、6、10.5、24、48、72、120時間ごとにサンプリングした。HPLC(実施例1の条件で実施。)を用いて、サンプル中の1,4−ジオキサンの濃度を測定した。結果を図6に示す。
【0062】
図6から、48時間で約400ppm程度の1,4−ジオキサンを分解したことが確かめられた。さらに、48時間後は、1,4−ジオキサン濃度がほぼ横ばいとなり、分解活性が低下することが確かめられた。48時間の内に、液体培地内の栄養をほとんど使い果たしたか、又は、酸素濃度の低下やpH等、実験装置内の環境要因の変化が分解活性に大きく影響している可能性が示唆された。
【0063】
[試験例2]RM31株による1,4−ジオキサン分解のpHによる影響の確認試験
まずBSM培地を調製した。BSM培地の初期pHは7.5で中性を示した。1%HClと1M NaOHを用いて、BSM培地のpHを3〜10まで段階的に調整し、その他の条件は試験例1と同様にして、25℃、150rpmで5日間振とう培養した。pH調整直後(First)、1日後、5日後の1,4−ジオキサン濃度を、HPLC(実施例1の条件で実施。)を用いて測定した。結果を図7に示す。
【0064】
図7から、pHが低下するごとにRM31株の分解活性が低下していくことが明らかとなった。また、BSM培地は白色に濁っている培地であるが、pHが低下していくごとに無色透明に近づくことが明らかとなった。培養試験を行っている中で、RM31株を添加した液体培地の濁度が、一度低下した後に再び増殖するという現象が確認された。これは、RM31株が1,4−ジオキサンを分解することで二酸化炭素が実験装置内に増加し、それが液体培地に溶け込むことでpHが酸性に近づいたためと推察される。また、それに伴い、分解活性も低下し、48時間以降の分解率の低下に繋がったと推察される。
【0065】
[試験例3]RM31株による低濃度(150ppm)の1,4−ジオキサン分解試験
発見されている1,4−ジオキサン分解菌の中には、低濃度では活性が働かないものも存在する。RM31株について、低濃度の条件で1,4−ジオキサンの分解能が作用されるかを確認するための試験を実施した。
1,4−ジオキサンの初期濃度を150ppmと低めに設定し、その他の条件は試験例1と同様の条件にして、1日間振とう培養した。試験終了後の1,4−ジオキサン濃度を、HPLC(実施例1の条件で実施。)を用いて測定した。結果を図8に示す。コントロールとして、RM31株を含まないBSM液体培地についても同様の試験を実施した。また、N.Dとは、検出限界以下であることを意味する。
【0066】
図8から、1,4−ジオキサンが低濃度の条件下でも、高濃度の時と比較して分解能を維持し、1,4−ジオキサンを分解することが確かめられた。また、コントロールでは、ほとんど1,4−ジオキサンが減少していないため、揮発による影響はないものと推察される。
【0067】
[試験例4]RM31株による1,4−ジオキサン分解のNaClによる影響の確認試験
BSM培地は海水を模した培地であるため、塩分濃度が3%になるようにNaClが添加されている。1,4−ジオキサンは主に陸圏の地下水を中心に汚染している物質であるため、真水に近い状態での分解能を検討する必要がある。上記表2の組成からNaClを除外した培地を作製し、その他の条件は試験例1と同様の条件にして、25℃、150rpmで2日間振とう培養した。培地調製直後、1日後、2日後の培地中の1,4−ジオキサン濃度を、HPLC(実施例1の条件で実施。)を用いて測定した。結果を図9に示す。コントロールとして、3%NaClを含むBSM培地についても同様の試験を実施した。
【0068】
図9から、3%NaClが添加されているものと同様に、48時間後で最も多く1,4−ジオキサンを分解した。NaClを添加していないものでは、200ppm程度(全体の25%程度)の1,4−ジオキサンを分解していることから、3%NaClが添加されているものと比較して、活性がやや低下するが、十分に1,4−ジオキサンの分解能を有することが確かめられた。
【0069】
[試験例5]RM31株による1,4−ジオキサン分解の温度による影響の確認試験
環境要因として温度が分解能にどのように影響するかを調べるために、恒温槽の温度を20℃と30℃にそれぞれ設定し、その他の条件は試験例1と同様の条件にして、5日間振とう培養を行った。培地調製直後、1日後、2日後、5日後の培地中の1,4−ジオキサン濃度を、HPLC(実施例1の条件で実施。)を用いて測定した。結果を図10に示す。20℃での試験結果が(A)であり、30℃での試験結果が(B)である。コントロールとして、RM31株を添加していないBSM培地についても同様の試験を実施した。
【0070】
図10(A)及び(B)から、20℃の方が30℃よりも高効率で1,4−ジオキサンを分解することが確かめられた。
これは、採取した環境の水温が、夏の時期でも24〜28℃しかないため、30℃では、1,4−ジオキサンの分解活性が失活してしまったものと推察される。20℃でも十分に1,4−ジオキサンの分解をしているが、試験例1と比較すると、25℃のほうが1,4−ジオキサンをより分解している。よって、RM31株にとって、25℃が最適な温度であると推察される。
また、コントロールにおいて、1,4−ジオキサンの量が減少しているのは、経時的に揮発したためであると推察される。
【0071】
[試験例6]RM31株による1,4−ジオキサン分解の培地濃度の影響の確認試験
表2の培地成分について、NaClと1,4−ジオキサン以外の全ての試薬について、2倍の量を添加し、培地を調製した。その他の条件は試験例1と同様の条件にして、5日間振とう培養を行った。培地調製直後、1日後、2日後、5日後の培地中の1,4−ジオキサン濃度を、HPLC(実施例1の条件で実施。)を用いて測定した。結果を図11に示す。コントロールとして、RM31株を添加していないBSM培地についても同様の試験を実施した。
【0072】
図11から、NaCl及び1,4−ジオキサン以外の窒素源を始めとする無機塩類の添加量を2倍にしても、1,4−ジオキサンを十分に分解できることが確かめられた。このことから、窒素源の量は1,4−ジオキサンの分解にあまり影響していないことが明らかとなった。よって、試験例1において分解速度が減少したのは、培地の栄養不足が原因ではなく、pHの低下等、他の環境要因によるものであると推察される。
【0073】
[試験例7]RM31株から抽出した粗酵素による1,4−ジオキサンの分解試験
遠沈管にRM31株の入ったBSM培地を入れて遠心した。次に、上清を捨て、0.1M リン酸バッファーを用いて3回程度洗浄した。続いて、海砂を添加してRM31株の菌体を破砕した。さらにそれを遠心し、上清を粗酵素液として回収した。1,4−ジオキサンの濃度を1,000ppmに調整したBSM培地に上記回収した粗酵素液が1%(体積比)になるように添加し、25℃、150rpmで30分振とうした。培地中の1,4−ジオキサン濃度を、HPLC(実施例1の条件で実施。)を用いて測定した。結果を図12に示す。コントロールとして、0.1M リン酸バッファーのみを添加したものについても同様の試験を実施した。
【0074】
図12から、試験例1等の菌体を用いた試験と比較して、短時間で1,4−ジオキサンの分解を確かめられた。実験装置は短時間での揮発の影響を受けにくいことから、RM31株がこの酵素を内包している可能性が示唆された。
【0075】
[試験例8]RM31株によるテトラヒドロフラン(THF)の分解試験
テトラヒドロフラン(THF)は1,4−ジオキサンに構造が良く似ており、また、汚水等の水質汚染地域でもよく同時に検出されている有機物質である。テトラヒドロフラン又は1,4−ジオキサンを含むBSM培地で5日間生育させたRM31株を用いて、テトラヒドロフランの分解能を確認した。
まず、下記表3で示した組成のテトラヒドロフランの濃度を1,000ppmになるようにBSM液体培地を調製した。
【0076】
【表5】
【0077】
続いて、その他の条件は、試験例1と同様の条件にして、テトラヒドロフランを含むBSM培地で生育させたRM31株(以下、THF−RM31株と呼ぶ。)と、1,4−ジオキサンを含むBSM培地で生育させたRM31株(以下、1,4−ジオキサン−RM31株と呼ぶ。)を添加し、5日間振とう培養を行った。培地調製直後、1日後、2日後、5日後の培地中のテトラヒドロフランを、HPLC(実施例1の条件で実施。)を用いて測定した。結果を図13に示す。コントロールとして、いずれのRM31株も添加していないテトラヒドロフランを1,000ppm含むBSM培地を用いて、同様の試験を実施した。
【0078】
図13から、THF−RM31株及び1,4−ジオキサン−RM31株共にテトラヒドロフランの分解能を有することが確かめられた。このことから、テトラヒドロフランの分解において、1,4−ジオキサンを分解する酵素と同じ分解酵素(monooxygenase)を用いた可能性が示唆された。また、両者を比較すると、THF−RM31株の方が10%以上テトラヒドロフランの分解能が高いことが明らかとなった。これは予めテトラヒドロフランを含む環境で生育したことで、テトラヒドロフランのエネルギー源への変換が効率よく行われたためであると推察される。
【0079】
[試験例9]RM31株とその他の1,4−ジオキサン分解菌との1,4−ジオキサン分解能の比較試験
シュードノカルディア・ジオキサニウォラン(Pseudonocardia dioxanivorans)D17株を用いて、100ppmの1,4−ジオキサンを含む下記表4に示した組成の無機塩培地に菌体量を全体の5%になるように添加した。続いて、28℃、120rpmで1日間振とう培養を行った。
【0080】
【表6】
【0081】
HPLC(実施例1の条件で実施。)を用いて、培地調製直後、5、10、15、20、24時間後にサンプル中の1,4−ジオキサンの濃度を測定した。
【0082】
その結果、20時間で全ての1,4−ジオキサンを分解したことが確かめられた。よって、D17株の1,4−ジオキサン分解速度は、5.0mgL−1/hであることが明らかとなった。
【0083】
一方、試験例1において、RM31株は、48時間で400ppmの1,4−ジオキサンを分解したことが確かめられており、RM31株の1,4−ジオキサン分解速度は、31.6mgL−1/hであった。また、試験例4において、NaClを含まない環境でも、48時間で200ppmの1,4−ジオキサンを分解したことが確かめられており、RM31株の1,4−ジオキサン分解速度は、15.8mgL−1/hであった。
よって、RM31株は、D17株と比較して、1,4−ジオキサン分解速度が3倍以上であることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【0084】
本発明によれば、過酷な環境下において、環状エーテル構造を有する有機化合物の分解能が高い微生物を提供することができる。
【符号の説明】
【0085】
1…炭化資材A130、2…BSM液体培地、3…エアレーションポンプ、10…パーコレーター。
図1
図2
図3
図4
図5
図6
図7
図8
図9
図10
図11
図12
図13
【配列表】
[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]