【図1A】本出願で使用される３個の第ＶＩＩ因子分子についてのヌクレオチド配列を示す図である。「Ｖ１」は配列番号１６の野生型ヒトアミノ酸配列に関して４個のアミノ酸変異：（Ｐ１０Ｑ、Ｋ３２Ｅ、Ｔ１０６ＮおよびＶ２５３Ｎ）を有するヒト第ＶＩＩ因子の変異体である。「Ｖ２」は配列番号１６の野生型ヒトアミノ酸配列に関して６個のアミノ酸変異：（Ｐ１０Ｑ、Ｋ３２Ｅ、Ａ３４Ｅ、Ｒ３６Ｅ、Ｔ１０６ＮおよびＶ２５３Ｎ）を有するヒト第ＶＩＩ因子の変異体である。図１はまた、実施例で使用される種々の構築物についてのヌクレオチド配列も示している。

【図1B】本出願で使用される３個の第ＶＩＩ因子分子についてのヌクレオチド配列を示す図である。「Ｖ１」は配列番号１６の野生型ヒトアミノ酸配列に関して４個のアミノ酸変異：（Ｐ１０Ｑ、Ｋ３２Ｅ、Ｔ１０６ＮおよびＶ２５３Ｎ）を有するヒト第ＶＩＩ因子の変異体である。「Ｖ２」は配列番号１６の野生型ヒトアミノ酸配列に関して６個のアミノ酸変異：（Ｐ１０Ｑ、Ｋ３２Ｅ、Ａ３４Ｅ、Ｒ３６Ｅ、Ｔ１０６ＮおよびＶ２５３Ｎ）を有するヒト第ＶＩＩ因子の変異体である。図１はまた、実施例で使用される種々の構築物についてのヌクレオチド配列も示している。

【図1C】本出願で使用される３個の第ＶＩＩ因子分子についてのヌクレオチド配列を示す図である。「Ｖ１」は配列番号１６の野生型ヒトアミノ酸配列に関して４個のアミノ酸変異：（Ｐ１０Ｑ、Ｋ３２Ｅ、Ｔ１０６ＮおよびＶ２５３Ｎ）を有するヒト第ＶＩＩ因子の変異体である。「Ｖ２」は配列番号１６の野生型ヒトアミノ酸配列に関して６個のアミノ酸変異：（Ｐ１０Ｑ、Ｋ３２Ｅ、Ａ３４Ｅ、Ｒ３６Ｅ、Ｔ１０６ＮおよびＶ２５３Ｎ）を有するヒト第ＶＩＩ因子の変異体である。図１はまた、実施例で使用される種々の構築物についてのヌクレオチド配列も示している。

【図1D】本出願で使用される３個の第ＶＩＩ因子分子についてのヌクレオチド配列を示す図である。「Ｖ１」は配列番号１６の野生型ヒトアミノ酸配列に関して４個のアミノ酸変異：（Ｐ１０Ｑ、Ｋ３２Ｅ、Ｔ１０６ＮおよびＶ２５３Ｎ）を有するヒト第ＶＩＩ因子の変異体である。「Ｖ２」は配列番号１６の野生型ヒトアミノ酸配列に関して６個のアミノ酸変異：（Ｐ１０Ｑ、Ｋ３２Ｅ、Ａ３４Ｅ、Ｒ３６Ｅ、Ｔ１０６ＮおよびＶ２５３Ｎ）を有するヒト第ＶＩＩ因子の変異体である。図１はまた、実施例で使用される種々の構築物についてのヌクレオチド配列も示している。

【図1E】本出願で使用される３個の第ＶＩＩ因子分子についてのヌクレオチド配列を示す図である。「Ｖ１」は配列番号１６の野生型ヒトアミノ酸配列に関して４個のアミノ酸変異：（Ｐ１０Ｑ、Ｋ３２Ｅ、Ｔ１０６ＮおよびＶ２５３Ｎ）を有するヒト第ＶＩＩ因子の変異体である。「Ｖ２」は配列番号１６の野生型ヒトアミノ酸配列に関して６個のアミノ酸変異：（Ｐ１０Ｑ、Ｋ３２Ｅ、Ａ３４Ｅ、Ｒ３６Ｅ、Ｔ１０６ＮおよびＶ２５３Ｎ）を有するヒト第ＶＩＩ因子の変異体である。図１はまた、実施例で使用される種々の構築物についてのヌクレオチド配列も示している。

【図1F】本出願で使用される３個の第ＶＩＩ因子分子についてのヌクレオチド配列を示す図である。「Ｖ１」は配列番号１６の野生型ヒトアミノ酸配列に関して４個のアミノ酸変異：（Ｐ１０Ｑ、Ｋ３２Ｅ、Ｔ１０６ＮおよびＶ２５３Ｎ）を有するヒト第ＶＩＩ因子の変異体である。「Ｖ２」は配列番号１６の野生型ヒトアミノ酸配列に関して６個のアミノ酸変異：（Ｐ１０Ｑ、Ｋ３２Ｅ、Ａ３４Ｅ、Ｒ３６Ｅ、Ｔ１０６ＮおよびＶ２５３Ｎ）を有するヒト第ＶＩＩ因子の変異体である。図１はまた、実施例で使用される種々の構築物についてのヌクレオチド配列も示している。

【図1G】本出願で使用される３個の第ＶＩＩ因子分子についてのヌクレオチド配列を示す図である。「Ｖ１」は配列番号１６の野生型ヒトアミノ酸配列に関して４個のアミノ酸変異：（Ｐ１０Ｑ、Ｋ３２Ｅ、Ｔ１０６ＮおよびＶ２５３Ｎ）を有するヒト第ＶＩＩ因子の変異体である。「Ｖ２」は配列番号１６の野生型ヒトアミノ酸配列に関して６個のアミノ酸変異：（Ｐ１０Ｑ、Ｋ３２Ｅ、Ａ３４Ｅ、Ｒ３６Ｅ、Ｔ１０６ＮおよびＶ２５３Ｎ）を有するヒト第ＶＩＩ因子の変異体である。図１はまた、実施例で使用される種々の構築物についてのヌクレオチド配列も示している。

【図1H】本出願で使用される３個の第ＶＩＩ因子分子についてのヌクレオチド配列を示す図である。「Ｖ１」は配列番号１６の野生型ヒトアミノ酸配列に関して４個のアミノ酸変異：（Ｐ１０Ｑ、Ｋ３２Ｅ、Ｔ１０６ＮおよびＶ２５３Ｎ）を有するヒト第ＶＩＩ因子の変異体である。「Ｖ２」は配列番号１６の野生型ヒトアミノ酸配列に関して６個のアミノ酸変異：（Ｐ１０Ｑ、Ｋ３２Ｅ、Ａ３４Ｅ、Ｒ３６Ｅ、Ｔ１０６ＮおよびＶ２５３Ｎ）を有するヒト第ＶＩＩ因子の変異体である。図１はまた、実施例で使用される種々の構築物についてのヌクレオチド配列も示している。

【図2】本出願で使用される３個の第ＶＩＩ因子分子についてのアミノ酸配列を示す図である。本明細書で使用される野生型ヒト第ＶＩＩ因子は配列番号１６のアミノ酸配列を有する。Ｖ１は配列番号１７のアミノ酸配列を有する。Ｖ２は配列番号１８のアミノ酸配列を有する。Ｖ１およびＶ２において、配列番号１６の野生型第ＶＩＩ因子からの変化を太字で示す。

【図3】本出願の実施例で使用される３個の第ＶＩＩ因子分子を示す模式図である。Ｎ−グリコシル化部位におけるグリカンの結合を示している。グリカンを描写するために、実線の箱はＮ−アセチルグルコサミンを表し、斜線のついた楕円形はマンノースを表し、あいた楕円形はガラクトースを表し、濃い菱形はシアル酸（Ｎ−アセチルノイラミン酸としても知られている）を表し、閉じた三角形はフコースを表す。グリカン構造はグリカンの１つの可能な変異体を用いた描写であるが、実際に測定されるグリカンを表していない。

【図4】Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒコンセンサス配列中のＡｓｎにおける結合を示すＮ結合型グリカンを示す概略図である。末端シアル酸を含む種々の単糖を有するＭａｎ_３（ＧｌｃＮＡｃ）_２コアを示している。

【図5】Ｖ２に関して例示される、第ＶＩＩ因子変異体の半減期を減少させるために本開示で使用される２つのアプローチを示す概略図である。

【図6】ヒポグリコシル化（ｈｙｐｏｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ）第ＶＩＩ因子分子の表である。

【図7】実験の条件による脱シアリル化後のＶ２の重鎖上に残っているシアル酸を同定するためのＬＣ−ＭＳ法の結果を示す図である。

【図8】シアル酸含量についての脱シアリル化Ｖ２の分析を示す図である。

【図9】リン脂質ＦＸ活性化アッセイの結果を示す図である。

【図10】脱シアリル化タンパク質に対するＰＬ−ＴＧＡアッセイの結果を示す図である。

【図11】ヒポグリコシル化第ＶＩＩ因子変異体の発現を示す図である。

【図12】トランスフェクション上清を用いたヒポグリコシル化ＦＶＩＩ変異体の「特異的活性」の測定を示す表である。

【図13】精製したヒポグリコシル化変異体ｐＭＢ１２１に対するＰＬ−ＴＧＡアッセイの結果を示す図である。

【図14】野生型第ＶＩＩ因子と比較した脱シアリル化Ｖ２のインビトロ肝細胞クリアランスを示す図である。

【図15】第ＶＩＩ因子変異体によるインビトロ肝細胞クリアランスの結果を示す図である。ヒポグリコシル化変異体は、このモデルでクリアランスの増加を示さなかった。この結果は、これらの分子についての脱シアリル化Ｖ２によって利用されるクリアランス機構とは異なるクリアランス機構を示唆している。

【図16】ラットにおける薬物動態試験結果を示す図である。脱シアリル化Ｖ２およびＶ１の半減期は、第ＶＩＩ因子ＥＬＩＳＡによって測定されるようにスプラーグドーリーラットにおいてその未修飾親分子よりも有意に短かった。

【図17】ＨｅｍＡマウスにおける薬物動態試験結果を示す図である。

【図18】ＨｅｍＡマウスにおける脱シアリル化Ｖ２有効性試験を示す図である。

【図19】ＴＶＴ ＨｅｍＡモデルにおける脱シアリル化Ｖ２有効性試験を示す図である。

【図20】第ＶＩＩ因子と比較した脱シアリル化Ｖ２を有するＨｅｍＡマウスにおけるトロンビン−抗トロンビン（「ＴＡＴ」）産生の結果を示す図である。

【図21】凝固能力のあるマウスにおける脱シアリル化Ｖ２有効性試験を示す図である。

【図22】シアル酸の正常な抱合を有する野生型第ＶＩＩ因子と比較した脱シアリル化野生型第ＶＩＩ因子（ｄＷＴ ＶＩＩａ）のインビトロ肝細胞クリアランスを示す図である。

【図23】野生型第ＶＩＩ因子と比較したｄＷＴ ＶＩＩａについてのヒト組織因子ノックイン（ＴＦＫＩ）マウスの尾切断試験結果を示す図である。脱シアリル化第ＶＩＩ因子は、野生型第ＶＩＩ因子よりも有意に効果的であることが分かった。

【図24】ｄＷＴ ＶＩＩａまたは野生型第ＶＩＩ因子のいずれかの投与後のトロンビン抗トロンビン（ＴＡＴ）複合体のＥＬＩＳＡ分析の結果を示す図である。

【図25】ＦｅＣｌ_３血栓症モデルにおける血栓形成の分析の結果を示す図である。所与の用量のｄＷＴ ＶＩＩａは、野生型第ＶＩＩ因子と比較して大いに減少した血栓形成をもたらした。

【図26】蛍光原基質によって測定される可溶性組織因子に対するｄＷＴ ＶＩＩａおよび野生型第ＶＩＩ因子の見かけの結合親和性を示す図である。

【図27】可溶性組織因子と、ｄＷＴ ＶＩＩａまたは野生型第ＶＩＩ因子のいずれかの複合体による第Ｘ因子の第Ｘａ因子への変換を示す図である。