特許 6566970 マイクロカプセル化技術及びその生成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6566970

(24)【登録日】2019年8月9日

(45)【発行日】2019年8月28日

(54)【発明の名称】マイクロカプセル化技術及びその生成物

(51)【国際特許分類】

   A61K 9/16 20060101AFI20190819BHJP

   A61K 47/42 20170101ALI20190819BHJP

   A61K 47/36 20060101ALI20190819BHJP

   A61K 35/12 20150101ALI20190819BHJP

   A61K 35/39 20150101ALI20190819BHJP

   A61K 35/407 20150101ALI20190819BHJP

   A61K 35/545 20150101ALI20190819BHJP

【ＦＩ】

   A61K9/16

   A61K47/42

   A61K47/36

   A61K35/12

   A61K35/39

   A61K35/407

   A61K35/545

【請求項の数】19

【全頁数】17

(21)【出願番号】特願2016-571014(P2016-571014)

(86)(22)【出願日】2015年6月3日

(65)【公表番号】特表2017-518310(P2017-518310A)

(43)【公表日】2017年7月6日

(86)【国際出願番号】US2015034041

(87)【国際公開番号】WO2015187862

(87)【国際公開日】20151210

【審査請求日】2018年5月24日

(31)【優先権主張番号】62/007,717

(32)【優先日】2014年6月4日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】516358303

【氏名又は名称】リカルダ、リミテッド、ライアビリティ、カンパニー

【氏名又は名称原語表記】ＬＩＫＡＲＤＡ，ＬＬＣ

(74)【代理人】

【識別番号】100107342

【弁理士】

【氏名又は名称】横田 修孝

(74)【代理人】

【識別番号】100155631

【弁理士】

【氏名又は名称】榎 保孝

(74)【代理人】

【識別番号】100137497

【弁理士】

【氏名又は名称】大森 未知子

(72)【発明者】

【氏名】カールティック、ラマチャンドラン

(72)【発明者】

【氏名】スティーブン、マイケル、ハリントン

【審査官】 高橋 樹理

(56)【参考文献】

【文献】 特開昭６３−１４６７９２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開昭５０−０４６８２２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Nature Materials，２０１３年，Vol.12，p.584-590

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ９／００− ９／７２

Ａ６１Ｋ ４７／００−４７／６９

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

３次元ヒドロゲルマトリクス中に生物学的材料をカプセル化する方法であって、
ヒドロゲル前駆体溶液を提供すること（前記溶液は、溶媒系中に分散または溶解される、ヒドロゲル前駆体化合物と、前記生物学的材料と、カルシウム、バリウム、ストロンチウム、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される二価カチオンとを含む）と、
前記ヒドロゲル前駆体溶液をアルギン酸塩と組み合わせて、前記ヒドロゲル前駆体溶液の液滴の周囲において前記アルギン酸塩のゲル化を開始し、コア／シェル微粒子を得ること（各コア／シェル微粒子は、アルギン酸塩シェルと、前記ヒドロゲル前駆体溶液を含む液体コアとを含む）と、
前記液体コア中の前記ヒドロゲル前駆体化合物を架橋して、コア／シェル架橋微粒子を得ること（各コア／シェル架橋微粒子は、前記アルギン酸塩シェルと、３次元ヒドロゲルマトリクス及び前記生物学的材料を含むコアとを含み、前記生物学的材料は、前記ヒドロゲルマトリクス中に封入される）と、
前記アルギン酸塩シェルを除去して、自己支持型ヒドロゲルマイクロビーズを得ること（各ヒドロゲルマイクロビーズは、前記３次元ヒドロゲルマトリクスと、その中に封入される生物学的材料とを含む）と、を含む、前記方法。

【請求項2】

前記ヒドロゲル前駆体化合物は、非アルギン酸塩化合物である、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記ヒドロゲル前駆体化合物は、ヒアルロン酸である、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

前記ヒドロゲル前駆体溶液は、フィブロネクチン、ラミニン、コラーゲン、細胞外マトリクス成分、またはそれらの合成型をさらに含む、請求項１に記載の方法。

【請求項5】

前記生物学的材料は、細胞集団、細胞塊、組織、これらの組み合わせ、及びこれらの断片からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。

【請求項6】

前記生物学的材料は、膵島、肝細胞、幹細胞、内分泌細胞；膵島、肝細胞、幹細胞、内分泌細胞に関連する組織、及び膵島塊、肝細胞塊、幹細胞塊、甲状腺塊、副腎塊、下垂体塊、ならびにこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。

【請求項7】

前記ヒドロゲル前駆体溶液は、前記溶媒系中に分散または溶解される、前記ヒドロゲル前駆体化合物、二価カチオン、及び生物学的材料から本質的になる、請求項１に記載の方法。

【請求項8】

前記ヒドロゲル前駆体溶液は、任意のヒドロゲル架橋剤をさらに含む、請求項１に記載の方法。

【請求項9】

前記アルギン酸塩は、アルギン酸ナトリウムである、請求項１に記載の方法。

【請求項10】

前記組み合わせは、アルギン酸塩の溶液に前記ヒドロゲル前駆体溶液を滴下添加して、前記コア／シェル微粒子を得ることを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項11】

前記添加は、前記ヒドロゲル前駆体溶液の液滴を生成し、前記液滴をアルギン酸塩の前記溶液に滴下して、前記コア／シェル微粒子を得ることを含む、請求項１０に記載の方法。

【請求項12】

前記液滴は、約５ｍｍ未満の最大表面間寸法を有する、請求項１１に記載の方法。

【請求項13】

前記ヒドロゲル前駆体溶液の粘度対前記アルギン酸塩溶液の粘度の比は、室温で１よりも大きい、請求項１０に記載の方法。

【請求項14】

前記架橋は、前記コア／シェル微粒子をヒドロゲルマトリクス架橋剤と接触させることを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項15】

前記架橋は、前記コア／シェル微粒子を活性化放射線に曝露して、架橋を開始することを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項16】

前記除去は、前記コア／シェル架橋微粒子をキレート剤と接触させて、前記アルギン酸塩シェルを弱める、溶解する、または崩壊させることを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項17】

前記キレート剤は、クエン酸塩、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、リン酸塩、及びこれらの混合物からなる群から選択される、請求項１６に記載の方法。

【請求項18】

前記除去は、前記コア／シェル架橋微粒子を物理的に撹拌して、前記アルギン酸塩シェルを破壊することを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項19】

前記ヒドロゲルマイクロビーズは、約５ｍｍ未満の最大表面間寸法を有する、請求項１に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、「ＭＩＣＲＯＥＮＣＡＰＳＵＬＡＴＩＯＮ ＴＥＣＨＮＩＱＵＥ ＡＮＤ ＰＲＯＤＵＣＴＳ ＴＨＥＲＥＯＦ」と題する、２０１４年６月４日出願の米国仮特許出願第６２／００７，７１７号の優先権の利益を主張する。

【0002】

本発明は、非アルギン酸ヒドロゲルマイクロビーズを調製するための方法及び技術、ならびに得られるその生成物に関する。

【背景技術】

【0003】

ヒドロゲル微粒子中の細胞カプセル化は、２つの主要な理由で、再生医療における有望な技術である。第１に、ヒドロゲルマトリクスの構造は、カプセル化された細胞が、周囲環境と栄養素及び治療分子を交換することができる一方で、他の細胞型、すなわち、宿主免疫細胞が、移植されたときにカプセル化された細胞に、侵入し、その免疫拒絶を仲介することができないようなものである。第２に、ヒドロゲル微粒子は、カプセル化された細胞の移植によく適している。それらの小さい物理的サイズ及び球状は、侵襲的な外科治療よりもむしろ、注射器及び針を介した単純かつ容易な送達を可能にする。さらに、この小さい物理的サイズは、より大きい「バルク」ゲル構造物を比較して、カプセル化された細胞へ／からの分子拡散の最小抵抗をもたらす。

【0004】

細胞含有ヒドロゲルマイクロビーズを製造するために使用される現在の方法は、非常に限定される。これまで、マイクロビーズは、それらの特有かつ単純なゲル化機構のため、アルギン酸塩またはアガロースポリマーを使用してのみ製造され得る。残念ながら、これらの材料のいずれも、細胞の健康または機能に関して望ましくない。この点において、アルギン酸塩またはアガロースよりもはるかに優れた、多くの新規のヒドロゲル材料が入手可能である。しかしながら、それらの特定のゲル化機構により、それらは、生存細胞を含有する球状のマイクロビーズとして調製され得ない。本発明は、そのような構造物を生成するための方法を提供し、かつ幅広いヒドロゲル形成材料に適用できる。

【発明の概要】

【0005】

３次元ヒドロゲルマトリクス中に生物学的材料をカプセル化する方法が、本明細書に記載される。本方法は、概して、溶媒系中に分散または溶解される、ヒドロゲル前駆体化合物と、生物学的材料と、カルシウム、バリウム、ストロンチウム、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される二価カチオンとを含む、ヒドロゲル前駆体溶液を提供することを含む。ヒドロゲル前駆体溶液は、アルギン酸塩（アルギネート、alginate）と組み合わされて、コア／シェル微粒子を得る。コア／シェル微粒子のそれぞれは、アルギン酸塩シェルと、ヒドロゲル前駆体溶液を含む液体コアとを含む。液体コア中のヒドロゲル前駆体化合物は、架橋されて、コア／シェル架橋微粒子を得る。コア／シェル架橋微粒子のそれぞれは、アルギン酸塩シェルと、３次元ヒドロゲルマトリクス及び生物学的材料とを含むコアとを含む。有利に、生物学的材料は、懸濁され、ヒドロゲルマトリクス中にカプセル化、すなわち、封入される。次いで、一時的なアルギン酸塩シェルは、除去されて、自己支持型ヒドロゲルマイクロビーズを得る。ヒドロゲルマイクロビーズのそれぞれは、３次元ヒドロゲルマトリクスと、その中に封入される生物学的材料とを含む。

【0006】

本発明の技術に従って調製される３次元ヒドロゲルマイクロビーズもまた、本明細書に記載される。本マイクロビーズは、３次元ヒドロゲルマトリクスと、その中に封入される生物学的材料とを含む、自己支持体である。

【0007】

対象における移植のための組成物もまた、本明細書に記載される。本組成物は、本発明の技術に従って調製される複数の３次元ヒドロゲルマイクロビーズを含む。本マイクロビーズは、３次元ヒドロゲルマトリクスと、その中に封入される生物学的材料とを含む、自己支持体である。

【図面の簡単な説明】

【0008】

【図1】実施例１からの、アルギン酸塩シェルと、ヒドロゲル前駆体溶液を含む液体コアとを有する、コア／シェル微粒子の顕微鏡画像である。

【図2】実施例１からの、アルギン酸塩シェルと、ヒドロゲルコアとを有する、コア／シェル架橋微粒子の顕微鏡画像である。

【図3】実施例１からの、クエン酸塩中で２０分後のコア／シェル架橋微粒子の顕微鏡画像である。

【図4】実施例１からの、クエン酸塩中で４５分後のコア／シェル架橋微粒子の顕微鏡画像である。

【図5】シェル除去後のマイクロビーズの顕微鏡画像である。

【図6】最終クエン酸塩洗浄後のマイクロビーズの顕微鏡画像であり、実施例１から残っているヒドロゲルコアのみを示す。

【発明を実施するための形態】

【0009】

本発明は、ヒドロゲルマイクロカプセル（すなわち、マイクロビーズ）を生成するための、インサイドアウトゲル化方法に関する。より具体的には、マイクロビーズの３次元ヒドロゲルマトリクス中に生物学的材料にカプセル化する方法が、本明細書に記載される。本方法は、概して、ヒドロゲル前駆体化合物、任意の生物学的材料、及び二価カチオンの混合物の形成を含む。次いで、本混合物は、アルギン酸塩と組み合わされて、混合物の液滴の周囲にアルギン酸塩シェルを生成し、後に、ヒドロゲル前駆体コアのゲル化及びアルギン酸塩シェルの除去が続いて、自己支持型マイクロビーズを得る。

【0010】

一態様では、ヒドロゲル前駆体溶液が提供される。ヒドロゲル前駆体溶液は、他の成分との混合前に、溶媒系中にヒドロゲル前駆体化合物を分散して、溶液を形成することによって調製される。ヒドロゲル前駆体溶液のための好ましい溶媒系としては、水、緩衝剤（例えば、ヒスチジン、ＨＥＰＥＳ）、密度改変剤（例えば、イオジキサノール、フィコール）、粘度改変剤（例えば、ＰＥＧ、カルボキシメチルセルロース、キサンタンガム）、またはこれらの混合物が挙げられる。ヒドロゲル前駆体化合物は、溶液の全体積に基づき、約０．４％〜約４．０％重量／体積（４〜４０ｍｇ／ｍＬ）のレベルで溶液中に含まれる。

【0011】

好適なヒドロゲル前駆体化合物としては、ヒドロゲル形成ポリマー、オリゴマー、及び／またはモノマーが挙げられ、したがって、重合及び／または架橋を通じて、架橋またはネットワーク構造またはマトリクス（すなわち、「ヒドロゲル」）を形成することが可能であり、液体及び生物学的材料は、得られるゲル化構造またはマトリクスの間質空間または孔内に保持、懸濁、封入、及び／またはカプセル化されてもよい。本発明で使用するためのヒドロゲル前駆体化合物は、好ましくは、非アルギン酸ヒドロゲル前駆体化合物である。つまり、ヒドロゲル前駆体溶液は、好ましくは、アルギン酸塩化合物、すなわち、アルギン酸塩、アルギン酸、またはその塩もしくは誘導体に基づく化合物を実質的に含まない。本明細書で使用される場合、用語「実質的に含まない」は、成分が組成物に意図的に添加されないが、偶発的な不純物が生じ得ることを意味する。そのような実施形態では、ヒドロゲル前駆体溶液組成物は、１００重量％として見なされる乳剤の総重量に基づき、約０．０５重量％未満、好ましくは約０．０１％未満、及びより好ましくは約０重量％のそのような成分を含む。

【0012】

任意の架橋可能なヒドロゲル前駆体化合物は、本発明で使用するのに好適であり、好ましい化合物は、生体適合性非アルギン酸塩コポリマー、特に、非アルギン酸塩ブロックコポリマー、ならびに他の種類の架橋可能なモノマー及び／またはオリゴマーである。例示的な前駆体化合物としては、非アルギン酸多糖類、変性ヒアルロン酸、コラーゲン／ゼラチン、ポリエチレングリコール、キトサン、アガロースなどが挙げられるがこれらに限定されない。特に好ましいヒドロゲル前駆体化合物は、ヒアルロン酸である。１つ以上の実施形態では、ヒドロゲルは、低速ゲル化ヒドロゲルである。生体適合性ヒドロゲルもまた、ヒドロゲルの指定された最終用途に応じて、特に好ましい。本明細書で使用される場合、「生体適合性」は、それが、過剰な毒性、刺激、またはアレルギーもしくは免疫原性応答なしで、対象に投与され得、かつ任意の望ましくない生物学的効果を引き起こさないか、またはそれが含有される組成物の他の成分のうちのいずれかと有害な様式で相互作用しないという点で、それが生存組織に有害ではない、より具体的には、それが生物学的または別様に望ましくないものではないことを意味する。生体適合性ヒドロゲルは、当業者に周知のように、生物学的材料のいかなる分解も最小限に抑えるように、かつ対象におけるいかなる有害な副作用も最小限に抑えるように選択される。ヒドロゲル前駆体と含まれ得るさらなる任意の成分としては、フィブロネクチン、ラミニン、コラーゲン、その合成型を含む細胞マトリクスの他の成分などが挙げられる。

【0013】

ヒドロゲル前駆体溶液は、二価カチオンをさらに含む。本発明で使用するための好適な二価カチオンは、アルギン酸塩との相互作用後にゲルを形成することができる任意のイオンを含む。より具体的には、二価カチオンは、好ましくは、生体適合性である。１つ以上の実施形態では、二価カチオンは、カルシウム、バリウム、ストロンチウム、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される。二価カチオンは、ヒドロゲル前駆体化合物と共に溶媒系中に分散または溶解される。二価カチオンは、１００％として見なされる溶液の全体積に基づき、約０．０２５モル／リットル〜約０．２５モル／リットルのレベルで溶液中に含まれるべきである。

【0014】

ヒドロゲル前駆体溶液は、生物学的材料をさらに含む。例示的な生物学的材料としては、細胞集団、細胞塊、組織、これらの組み合わせ、及びこれらの断片が挙げられる。生物学的材料は、天然由来であっても、もしくは自然に単離されてもよく、またはそれらは、操作もしくは遺伝子組み換えされた細胞、塊、組織などであってもよい。本発明で使用するための生物学的材料の非限定的な例としては、膵島、膵島塊、肝細胞、幹細胞、及び関連する細胞及び組織、ならびに内分泌細胞、幹細胞塊、甲状腺塊、副腎塊、下垂体塊、及び組織工学または細胞を用いた治療に対する他の３次元細胞塊が挙げられる。細胞型及び／または組織の組み合わせもまた、本発明で使用され得る。

【0015】

１つ以上の実施形態では、追加の添加剤、培地、栄養素、ｐＨ緩衝剤、密度改変剤、粘度改変剤などが、ヒドロゲル前駆体溶液中に含まれ得る。いくつかの実施形態では、ヒドロゲル前駆体溶液は、溶媒系中に分散または溶解されるヒドロゲル前駆体化合物、二価カチオン、及び生物学的材料から本質的になるか、またはそれらからなりさえもする。ヒドロゲル前駆体溶液は、以下に記載されるゲル化まで、液体形態のままであり、したがって、１つ以上の実施形態では、溶液は、好ましくは、ヒドロゲル架橋剤を本質的に含まない。１つ以上の実施形態では、ヒドロゲル前駆体溶液の密度は、生物学的材料の密度と「一致」されて、ヒドロゲル前駆体溶液全体にわたって（かつ、以下で考察されるように、得られる液滴全体にわたって）懸濁される生物学的材料を維持する能力を改善する。したがって、いくつかの実施形態では、以下でより詳細に考察されるように、ゲル化／架橋前に、液体コアの縁部への生物学的材料の移動または「沈降」を減速または防止するのに十分に、ヒドロゲル前駆体の粘度を増加させることが望ましくあり得る。

【0016】

次いで、ヒドロゲル前駆体溶液は、アルギン酸塩と組み合わされる。１つ以上の実施形態では、ヒドロゲル前駆体溶液は、アルギン酸塩の溶液に滴下添加されて、ヒドロゲル前駆体溶液の個々の液滴上にアルギン酸塩シェルを形成する。例えば、液体ヒドロゲル前駆体溶液は、液滴を形成するために好適な器具から押出または分注される。任意の好適な器具が使用され得、概して、ヒドロゲル前駆体溶液を保持するためのチャンバを備え、チャンバは、分注出口または先端で終端する流体通路と流体連通している。分注先端は、ヒドロゲル前駆体溶液が液滴として放出される開口部を有する。本技術は、注射器及び針などの単純な器具、ならびに液滴生成のために特に設計された機械を使用して実行され得る。液滴の所望のサイズは、開口部の断面寸法、ヒドロゲル前駆体溶液の粘度、及びアルギン酸塩溶液の相対粘度に基づき制御され得る。本発明は、約５ｍｍ未満、好ましくは約２ｍｍ未満、より好ましくは約１ｍｍ未満、及びさらにより好ましくは約５０μｍ〜約７５０μｍの範囲の最大表面間寸法（すなわち、球状の液滴の場合、その直径）を有する液滴に特に適している。

【0017】

概して、アルギン酸塩の溶液は、アルギン酸ナトリウム槽、好ましくは、溶媒系中に分散されるアルギン酸ナトリウムの混合または撹拌槽を含む。他のアルギン酸塩（アルギン酸カルシウム以外）が使用され得る。様々な種類のゲル形成であるが脱架橋可能なアルギン酸塩が、所望の特性に応じて本発明で使用され得る。概して、ラミナリアヒペルボレアから抽出されるものなど、低粘度／低分子量及び高Ｇアルギン酸塩が好ましい。ＦＭＣ ＢｉｏＰｏｌｙｍｅｒ（Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ）を含むアルギン酸塩が、様々な源からのそれらの異なる特性に従って市販されている。溶液中のアルギン酸塩の量は異なり得るが、１００％として見なされる溶液の全体積に基づき、約０．１％〜約２．０％に及ぶことができる。概して、アルギン酸塩溶液の粘度は、ヒドロゲル前駆体溶液の粘度未満であるべきである。アルギン酸塩溶液の粘度は、アルギン酸塩濃度及びアルギン酸塩ポリマーの平均分子量（すなわち、アルギン酸塩分子の長さまたは鎖中のモノマー単位の数）によって決まり、より長い鎖は、同様の濃度でより高い粘度をもたらす。１つ以上の実施形態では、アルギン酸塩溶液の粘度は、室温（約２０〜２５℃）で、約１〜約２０ｃＰ、及び好ましくは約１〜約４ｃＰに及ぶ。より具体的には、ヒドロゲル前駆体溶液の粘度対アルギン酸塩溶液の粘度の比は、室温で１よりも大きくあるべきである。１つ以上の実施形態では、ヒドロゲル前駆体溶液の粘度対アルギン酸塩溶液の粘度の比は、約１：１〜約１０００：１である。１つ以上の実施形態では、ヒドロゲル前駆体の粘度の比は、約２０：１である。１つ以上の実施形態では、ヒドロゲル前駆体溶液の粘度は、約１〜最大で約５００ｃＰであり、室温で約４０〜約１００ｃＰが特に好ましい。

【0018】

有利に、ヒドロゲル前駆体溶液中の二価カチオンは、アルギン酸塩と反応して、アルギン酸塩シェルを含む各液滴及びヒドロゲル前駆体溶液を含む液体コアのためのコア／シェル微粒子を得る。コア／シェル微粒子は、アルギン酸塩シェルのさらなる硬化が望ましい場合、二価カチオンを含有する追加の溶液中に配置され得る。それにもかかわらず、このアプローチが、ヒドロゲル前駆体溶液を含有するための一時的（除去可能）な、多孔質の、かつ実質的に球状の型または封入材料を作るという点で、有意な利点を有することが理解される。理解されるように、「実質的に球状」は、コア／シェル微粒子がより「規則的な」形状を有する球状であってもよく、またはより不規則な形状（楕円形、長方形など）を有してもよいことを意味する。

【0019】

アルギン酸塩シェルによる良好なカプセル化のために、液滴「コア」が、分注された後にアルギン酸塩溶液の表面を貫通しなければならないことが理解される。つまり、液滴は、アルギン酸塩溶液の表面張力を破壊するのに十分な速度及び／または運動量を有しなければならない。当業者は、いくつかの変数が所望の結果を達成するように操作され得ることを認識するであろう。例えば、アルギン酸塩溶液は、溶液の表面張力を低減するために混合または撹拌され得る。同様に、液滴及びアルギン酸塩槽の相対粘度が、アルギン酸塩槽内への液滴侵入を促進するように調節され得ることが理解されるであろう。同様に、必要な液滴速度は、より大きいサイズの液滴に対して低減される（すなわち、より多くの質量を有し、したがってより低い速度で適切な運動量をもたらす液滴）。液滴が分注される高さもまた異なり得る。１つ以上の実施形態では、液滴は、約１５〜約２０ｃｍの高さ（アルギン酸塩溶液の表面から分注先端までで計算されるような）から分注される。１つ以上の実施形態では、液滴に対する目標速度は、約１．５ｍ／ｓ〜約５ｍ／ｓ、及び好ましくは約１．５ｍ／ｓ〜約４ｍ／ｓである。

【0020】

次いで、液体コア中のヒドロゲル前駆体化合物が架橋されて、コア／シェル架橋微粒子を得る。架橋は、特定のヒドロゲル前駆体化合物に応じて、様々な機構によって実施され得る。１つ以上の実施形態では、コア／シェル微粒子は、好ましくは溶液中で、ヒドロゲルマトリクス架橋剤と組み合わされる。架橋剤は、アルギン酸塩シェルを通してコア／シェル微粒子中に浸出し、ヒドロゲル前駆体化合物のゲル化（架橋）を得て、３次元ヒドロゲルマトリクスを形成する。架橋剤は、ヒドロゲル前駆体化合物に対応するが、得られる架橋マトリクス内の獲得した架橋の速度及びレベルを制御するように変更され得る。好適な架橋剤としては、光または熱開始架橋剤、ＰＥＧ系架橋剤（例えば、ＰＥＧＤＡ）などの化学架橋剤などが挙げられる。自己架橋型ヒドロゲル前駆体もまた使用され得る。

【0021】

ヒドロゲル架橋剤が、微粒子をヒドロゲル架橋のための別個の容器に移動させる必要なく、「１段階」でアルギン酸塩シェルのある程度の同時のヒドロゲルゲル化及び形成を促進するために、初期アルギン酸塩槽中で溶解され得ることもまた理解されるであろう。同様に、ヒドロゲル架橋剤は、実際に、ゲル化を効果的に停止するために、指定されたｐＨ（例えば、ｐＨ＜７）で初期ヒドロゲル前駆体溶液中に含まれ得る一方で、アルギン酸塩槽は、ｐＨ８で調製され得、それは、ヒドロゲル前駆体のゲル化時間を有意に低減する。同様に、光架橋可能なヒドロゲル系が使用され得、それは、コア／シェル微粒子を活性化放射線（例えば、紫外線）に曝露させて、液体コア中のヒドロゲル形成を開始することを伴う。

【0022】

ゲル化／架橋の速度を変化させるために、異なる架橋剤が使用され得ることも理解されるであろう。示されるデータは、大きい（例えば、３４００ダルトンのＰＥＧ）架橋剤でさえ、アルギン酸塩シェルを通じて拡散し、ヒドロゲル前駆体化合物と反応して、ゲル化を開始することが可能であることを示す。

【0023】

使用されるゲル化機構にかかわらず、各コア／シェル架橋微粒子は、異なるアルギン酸塩シェルと、ヒドロゲルマトリクス中に懸濁、封入、またはカプセル化された生物学的材料を有する３次元ヒドロゲルマトリクスを含む、ここで凝固または「ゲル化」したコアとを含む。このアプローチが、生理学的条件下で、多孔質の型内のヒドロゲル前駆体溶液のゲル化を可能にするという点で、有意な利点を有することが理解されるであろう。得られるヒドロゲルマトリクスは、液体及び気体に対して透過性である半剛性ネットワークであると特徴付けられるが、それは、流動を示さず、定常状態でその完全性を保持する。ヒドロゲルマトリクスは、３次元自己支持体である。用語「自己支持体」は、いったん形成されたヒドロゲルマトリクスが、外部支持構造なしでその形状を保持し、単にそれ自体の内力または重量による変形を起こしにくいことを意味する。自己支持体は、ゼリー、パテ、またはペーストのように柔軟、永久的に変形可能、または流動性ではないが、マトリクス体が力の下で一時的に凹むか、または変形し得るように弾性である。言い換えれば、自己支持体は、小さい圧縮及び／または屈曲後に反跳するか、または跳ね返って元の形状に戻り、ヒドロゲルマトリクスが、外部の圧力または力の十分な付与下でひびが入る、破壊する、または剪断することが理解される。

【0024】

次いで、アルギン酸塩シェルは、コア／シェル架橋微粒子から除去されて、自己支持型ヒドロゲルマイクロビーズを得る。１つ以上の実施形態では、コア／シェル架橋微粒子は、好ましくは溶液中で、かつアルギン酸塩シェルを弱める、溶解する、または別様に崩壊させる（かつそれにより除去する）のに十分な期間にわたって、適切なキレート剤と接触させられる。好ましくは、コア／シェル架橋微粒子は、混合または撹拌下で適切なキレート剤と接触させられる。例示的なキレート剤としては、クエン酸塩、ならびにＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）、ＥＧＴＡ（エチレングリコール四酢酸）、リン酸塩（例えば、オルトリン酸塩、リン酸塩など）など、二価カチオン（例えば、カルシウム、バリウム、またはストロンチウム）に対する他の既知のキレート剤などが挙げられる。加えて、アルギン酸塩シェルの形成で使用される二価カチオンは、例えば、非常に低いカルシウム濃度を含有する食塩水中で、経時的に変位され得る（非常にゆっくりではあるが）。アルギン酸塩シェルはまた、微粒子の機械的混合を使用して、破壊及び除去され得る。コア／シェル架橋微粒子はまた、アルギン酸塩シェルが除去されるまで、スクリーンまたはストレーナ上に回収され、所望に応じて追加のキレート剤溶液で洗浄され得る。

【0025】

その実施形態にかかわらず、アルギン酸塩シェルの除去は、３次元ヒドロゲルマトリクス内にカプセル化、封入、または懸濁される生物学的成分を含む、ヒドロゲルマイクロビーズを得る。このアプローチが、ヒドロゲルマトリクスの良好なゲル化後に、生理学的条件下で多孔質の球状の型の溶解及び除去を可能にするという点で、有意な利点を有することが理解されるであろう。得られるヒドロゲルマイクロビーズは、３次元（例えば、実質的に球状の）マトリクス型カプセルであり、それがコアシェル型カプセルにあるような異なるシェルを有するよりもむしろ、ビーズ全体にわたって充填材料を保持することを意味する。上記のように、ヒドロゲルマイクロビーズはまた、自己支持体である。得られるヒドロゲルマイクロビーズは、メッシュスクリーンまたは他の装置を使用して溶液から回収され得、かつ所望に応じて、培地または適切な栄養素中で洗浄または懸濁されてもよい。１つ以上の実施形態では、得られるマイクロビーズは、実質的に球状の形状である。有利に、粒径は、選択された液滴発生器の能力に応じて、高度にカスタマイズ可能である。１つ以上の実施形態では、得られるヒドロゲルマイクロビーズまたは微粒子は、約５ｍｍ未満、好ましくは約２ｍｍ未満、より好ましくは約５０μｍ〜約２ｍｍ、さらにより好ましくは約５０μｍ〜約７５０μｍの範囲、及び最も好ましくは約５０μｍ〜約５００μｍの平均（中間）最大表面間寸法（すなわち、球状のマイクロビーズの場合、その直径）を有する。

【0026】

上記の方法中に形成されるマイクロビーズまたは粒子は、その方法における様々なステップの間で濾過及び／または洗浄されて、次のステップに進む前に、形成溶液からマイクロビーズまたは粒子を単離し得ることが理解されるであろう。

【0027】

要約すると、本明細書に記載される方法は、生物学的に関連した条件下での非アルギン酸ヒドロゲルミクロスフェアの製造を可能にする。生存細胞または組織のマイクロカプセル化は、組織工学及び細胞を用いた療法において非常に幅広い魅力があり、それでもなお、マイクロカプセルとして調合されることが現在可能な材料は、アルギン酸塩、及び場合によっては、アガロースに本質的に限定され、それらのうちいずれも、細胞機能を支持または誘導するための重要な生物学的手掛かりを有しない。したがって、この方法の重要な特徴は、生物学的活性及び生体適合性を改善するための、非アルギン酸ヒドロゲル材料中の細胞または細胞塊のマイクロカプセル化に対する。加えて、代替材料の選択（例えば、共有結合架橋ヒドロゲル、可変の架橋剤サイズ、及び反応化学など）は、得られるマイクロカプセルの構造、機械、及び分解特性の制御のはるかに大きいレベルを潜在的に可能にし得る。有利に、一時的なアルギン酸塩シェルのため、マイクロカプセルは、低速ゲル化ヒドロゲル前駆体を使用したときでさえ作られ得る。

【0028】

別の主要な利点は、本方法が、有機溶媒を使用するか、または別様に生存組織に対して毒性である他のミクロスフェア製造方法とは対照的に、細胞に適合することである。記載される方法の追加の利点は、ヒドロゲルマイクロビーズが移植された生物学的材料の生体適合性を改善し、線維症を低減することを含む。加えて、マイクロビーズは、マイクロビーズにおける細胞及び組織機能の制御及び支持の強化を可能にし、そのようなマイクロビーズを使用して作られる任意のインプラントの生物活性を改善する。さらに、一時的なアルギン酸塩シェルの使用は、幅広いヒドロゲルがマイクロビーズを作るために使用されることを可能にし、それは、当業者に、得られるマイクロビーズの所望の機械的特性（例えば、弾性係数、靱性など）の制御を与える。さらに、この技術はまた、当業者に、いったん移植されたヒドロゲルの分解速度を制御することなど、他の所望の特徴に基づき、選択されたヒドロゲルを与える（例えば、長期免疫保護（細胞移植療法）または短期細胞支持（組織工学）に対する、共有架橋ゲル対イオン架橋ゲルの間で選択することが可能であることによって）。同様に、ある範囲のヒドロゲルの間で選択するが、それでもなおマイクロビーズを形成することが可能であることによって、当業者はまた、得られるマイクロビーズの細孔径及び拡散特性など、ヒドロゲルマトリクスの所望の微細構造のさらなる制御を有する。

【0029】

得られるヒドロゲルマイクロビーズは、概して、カプセル化された膵島または膵島細胞を介した糖尿病の好転、骨または軟骨修復のための改変細胞または幹細胞の送達、宿主免疫系からの移植された治療用細胞または細胞塊の保護を非限定的に含む、様々な用途を有する。

【0030】

本発明の様々な実施形態のさらなる利点は、本明細書の開示及び以下の実施例の考察によって当業者に明らかとなるであろう。本明細書に記載される様々な実施形態が、本明細書に別段の指示がない限り、必ずしも相互排他的ではないことが理解されるであろう。例えば、一実施形態に記載または図示される特徴はまた、他の実施形態にも含まれ得るが、必ずしも含まれない。したがって、本発明は、本明細書に記載される特定の実施形態の様々な組み合わせ及び／または統合を包含する。

【0031】

本明細書で使用される場合、２つ以上の項目のリストで使用される場合、句「及び／または」は、列挙された項目のうちのいずれか１つがそれ自体で採用され得るか、または列挙された項目のうちの２つ以上の任意の組み合わせが採用され得ることを意味する。例えば、組成物が構成成分Ａ、Ｂ、及び／またはＣを含有または除外するものと記載される場合、その組成物は、Ａを単独で、Ｂを単独で、Ｃを単独で、Ａ及びＢを組み合わせて、Ａ及びＣを組み合わせて、Ｂ及びＣを組み合わせて、またはＡ、Ｂ、及びＣを組み合わせて含有または除外し得る。

【0032】

本発明は以下の通りである。
［１］３次元ヒドロゲルマトリクス中に生物学的材料をカプセル化する方法であって、
ヒドロゲル前駆体溶液を提供すること（前記溶液は、溶媒系中に分散または溶解される、ヒドロゲル前駆体化合物と、前記生物学的材料と、カルシウム、バリウム、ストロンチウム、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される二価カチオンとを含む）と、
前記ヒドロゲル前駆体溶液をアルギン酸塩と組み合わせて、コア／シェル微粒子を得ること（各コア／シェル微粒子は、アルギン酸塩シェルと、前記ヒドロゲル前駆体溶液を含む液体コアとを含む）と、
前記液体コア中の前記ヒドロゲル前駆体化合物を架橋して、コア／シェル架橋微粒子を得ること（各コア／シェル架橋微粒子は、前記アルギン酸塩シェルと、３次元ヒドロゲルマトリクス及び前記生物学的材料を含むコアとを含み、前記生物学的材料は、前記ヒドロゲルマトリクス中に封入される）と、
前記アルギン酸塩シェルを除去して、自己支持型ヒドロゲルマイクロビーズを得ること（各ヒドロゲルマイクロビーズは、前記３次元ヒドロゲルマトリクスと、その中に封入される生物学的材料とを含む）と、を含む、前記方法。
［２］前記ヒドロゲル前駆体化合物は、非アルギン酸塩化合物である、上記［１］に記載の方法。
［３］前記ヒドロゲル前駆体化合物は、ヒアルロン酸である、上記［１］に記載の方法。
［４］前記ヒドロゲル前駆体溶液は、フィブロネクチン、ラミニン、コラーゲン、細胞外マトリクス成分、またはそれらの合成型をさらに含む、上記［１］に記載の方法。
［５］前記生物学的材料は、細胞集団、細胞塊、組織、これらの組み合わせ、及びこれらの断片からなる群から選択される、上記［１］に記載の方法。
［６］前記生物学的材料は、膵島、肝細胞、幹細胞、内分泌細胞；膵島、肝細胞、幹細胞、内分泌細胞に関連する組織、及び膵島塊、肝細胞塊、幹細胞塊、甲状腺塊、副腎塊、下垂体塊、ならびにこれらの組み合わせからなる群から選択される、上記［１］に記載の方法。
［７］前記ヒドロゲル前駆体溶液は、前記溶媒系中に分散または溶解される、前記ヒドロゲル前駆体化合物、二価カチオン、及び生物学的材料から本質的になる、上記［１］に記載の方法。
［８］前記ヒドロゲル前駆体溶液は、任意のヒドロゲル架橋剤をさらに含む、上記［１］に記載の方法。
［９］前記アルギン酸塩は、アルギン酸ナトリウムである、上記［１］に記載の方法。
［１０］前記組み合わせは、アルギン酸塩の溶液に前記ヒドロゲル前駆体溶液を滴下添加して、前記コア／シェル微粒子を得ることを含む、上記［１］に記載の方法。
［１１］前記添加は、前記ヒドロゲル前駆体溶液の液滴を生成し、前記液滴をアルギン酸塩の前記溶液に滴下して、前記コア／シェル微粒子を得ることを含む、上記［１０］に記載の方法。
［１２］前記液滴は、約５ｍｍ未満の最大表面間寸法を有する、上記［１１］に記載の方法。
［１３］前記ヒドロゲル前駆体溶液の粘度対前記アルギン酸塩溶液の粘度の比は、室温で１よりも大きい、上記［１０］に記載の方法。
［１４］前記架橋は、前記コア／シェル微粒子をヒドロゲルマトリクス架橋剤と接触させることを含む、上記［１］に記載の方法。
［１５］前記架橋は、前記コア／シェル微粒子を活性化放射線に曝露して、架橋を開始することを含む、上記［１］に記載の方法。
［１６］前記除去は、前記コア／シェル架橋微粒子をキレート剤と接触させて、前記アルギン酸塩シェルを弱める、溶解する、または崩壊させることを含む、上記［１］に記載の方法。
［１７］前記キレート剤は、クエン酸塩、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、リン酸塩、及びこれらの混合物からなる群から選択される、上記［１６］に記載の方法。
［１８］前記除去は、前記コア／シェル架橋微粒子を物理的に撹拌して、前記アルギン酸塩シェルを破壊することを含む、上記［１］に記載の方法。
［１９］前記ヒドロゲルマイクロビーズは、約５ｍｍ未満の最大表面間寸法を有する、上記［１］に記載の方法。
［２０］上記［１］に記載の方法に従って調製される３次元ヒドロゲルマイクロビーズであって、３次元ヒドロゲルマトリクスと、その中に封入される生物学的材料とを含む、前記マイクロビーズ。
［２１］前記マイクロビーズは、約５０μｍ〜約２ｍｍの平均最大表面間寸法を有する、上記［２０］に記載のマイクロビーズ。
［２２］上記［１］に記載の方法に従って調製される複数の３次元ヒドロゲルマイクロビーズを含む、対象における移植のための組成物であって、前記マイクロビーズのそれぞれは、３次元ヒドロゲルマトリクスと、その中に封入される生物学的材料とを含む、前記組成物。
本記載はまた、本発明の様々な実施形態に関するある特定のパラメータを定量化するために数値範囲を使用する。数値範囲が提供される場合、そのような範囲は、その範囲のより低い値のみを記述する請求項の制限、ならびにその範囲のより高い値のみを記述する請求項の制限に対する文字通りの支持を提供するものと解釈されるものとすることが理解されるべきである。例えば、約１０〜約１００の開示された数値範囲は、「約１０よりも大きい」（上限なし）を記述する請求項、及び「約１００未満」（下限なし）を記述する請求項に対する文字通りの支持を提供する。

【実施例】

【0033】

以下の実施例は、本発明に従った方法を記載する。しかしながら、これらの実施例は、例示目的で提供され、その中の何も本発明の全体的な範囲の制限と見なされるべきではないことが理解されるものとする。

【0034】

実施例１
液体コアアルギン酸塩カプセルを評価するために、予備研究を実施した。簡潔に、４０％グルコース及び２５または５０ｍＭの塩化カルシウムの溶液を、様々な濃度での低粘度アルギン酸ナトリウム中に滴下した。グルコースを使用して、液体コア溶液の粘度及び密度を増加させ、それは、球状の構造物を形成するために必要であるように思われる。カルシウムを液体コア溶液中に溶解して、いったん液滴がインサイドアウトゲル化機構においてアルギン酸塩槽に入ると、アルギン酸塩の迅速なゲル化を開始した。グルコース実験の結果は、液体コア及びアルギン酸塩シェルの明確で円滑な接触面を示した。しかしながら、観察された構造物は、概して円形である一方で、尾に似た特徴を有した。これは、非最適なレオロジー特性による可能性が最も高い。次いで、液体コア構造物を５０ｍＭクエン酸ナトリウムに曝露し、軽く混合して、アルギン酸塩シェルが生理学的に関連する濃度のクエン酸塩を使用して溶解され得るかどうかを評価した。実際に、アルギン酸塩シェルは、最終的に溶解し、観察できる微量のゲル化構造物を残さなかった（液体グルコースコアは、単純にバルク溶液中に溶解して戻った）。

【0035】

許容できる試薬濃度及び一般的な技術を識別した後、市販のＨＡヒドロゲル（ＨｙＳｔｅｍ）を液体コア溶液として使用した。そのより大きい粘度によって（正確な計量は不明）、ヒアルロン酸成分、グリコシルのみを使用して、この実験における成功の可能性を高めた。ＧＭＰグレードのグリコシルを１×（２ｍＬ）でＨＴＫ溶液中に溶解し、次いで、塩化カルシウムを含むバイアルに添加して、１×グリコシル及び２５ｍＭ塩化カルシウムの最終液体コア溶液を得た（溶媒としてＨＴＫ溶液）。これを、２７Ｇの先端が丸い針を通じて、１〜２ｃｍの高さから、撹拌０．２５％アルギン酸ナトリウム槽（Ｐｒｏｔａｎａｌ ＬＦ １０／６０、低粘度、高Ｇ含有量）に滴下添加した。概して、球状の二層構造物が、アルギン酸塩槽内に形成される。図１を参照されたい。大部分は、グルコース実験で観察されたものと同様の小さい尾に似た特徴を有するように見えた。しかしながら、わずかな割合の構造物は、何の眼に見える尾もなく、有意に球状であるように見え、それは、この特定の配合物のレオロジー特性が、完全ではないがほぼ適切にこの技術のために調整されることを示し得る。

【0036】

液体コア−シェル構造物を５分間撹拌した状態にし、次いで、２５０μＭナイロンメッシュスクリーンで回収し、約１０ｍＭ塩化カルシウムを含有するＰＢＳに移して、コア硬化中の構造物の完全性を保護するために、アルギン酸塩シェルを強化した。

【0037】

後に、構造物を、１×濃度で、ＨｙＳｔｅｍ架橋剤、ＰＥＧＤＡを含有するバイアルに移して（すなわち、２．５ｍＬの全体積中１つの１つのバイアル）、通常の架橋剤濃度を再生した。ＰＥＧＤＡ（３４００ダルトン）は、アルギン酸塩シェル及びＨｙＳｔｅｍコアの両方に浸透し、架橋剤が最終的に構造物全体にわたって拡散することを可能にする。総ＰＥＧＤＡ対ＨｙＳｔｅｍ構成成分の比が、ゲルがバルクで作製される場合よりもはるかに高かったため、このパラメータは、明らかに変化する場合がある。この場合、通常の２．０ｍＬのグリコシル＋Ｇｅｌｉｎ−Ｓよりもむしろ、数百マイクロリットルのグリコシルのみが容器内にあった。それにもかかわらず、これは、開始点として単純に選択され、かつ修正され得る。

【0038】

週末にわたる室温でのインキュベーション後、構造物を、光学顕微鏡法を介して観察した。得られる構造物は、図２に示される。興味深いことに、元々直接接触していた２つの層間に隙間があったため、コアが収縮したか、またはシェルが膨張したかのいずれかが起こったように見えた。構造物を、ＰＢＳ中１０ｍＬの５０ｍＭクエン酸ナトリウムを含有するペトリ皿に移し、低いｒｐｍのオービタルシェーカー上に配置して、軽い混合及び流動をもたらした。構造物を４５分間観察し、その間、アルギン酸塩シェルは、有意に崩壊し、場合によっては、完全に消え、ＨｙＳｔｅｍコアは、変わらないままであり、それらの元の球状の形状のままである。図３を参照されたい。４５分後、構造物（図４を参照されたい）を２５０ｕＭナイロンメッシュスクリーン中で回収し、ペトリ皿に戻し、新鮮な１０ｍＬのアリコートの５０ｍＭクエン酸ナトリウムで洗い流した。図５を参照されたい。このステップから間もなく（ほんの数分）、実質的に全ての構造物がいかなる目に見えるシェルも有さず、硬化したＨｙＳｔｅｍコアのみが残った。図６を参照されたい。
次いで、さらなる観察のために、ＨｙＳｔｅｍミクロスフェアを滅菌ＰＢＳに移した。

【0039】

実施例２
Ａ．アルギン酸塩型を使用して、ヒドロゲルミクロスフェアを生成するための一般的なプロトコル
１．２５ｍＭカルシウムイオンを含有するように調節された、所望の最終構成成分濃度における液体ヒドロゲルポリマー溶液を調製する。カチオン濃度は、異なる液滴サイズに対して調節されるべきである。例えば、最大で２００ｍＭカルシウムイオン及び／または２００ｍＭバリウムイオンが、約４００〜６００ミクロンの平均サイズ範囲を有する液滴のために使用されている。
２．液滴発生器（例えば、注射器／針、または微粒子／マイクロカプセル化装置）中に溶液を充填し、液滴形成を開始し、所望の液滴サイズを達成するように機器の設定を調節する。
３．室温で、カルシウム不含緩衝液または培地（例えば、ＰＢＳ）中の０．２５％低粘度アルギン酸ナトリウム（ｗ／ｖ）の溶液を含む撹拌槽内に液滴を回収する。アルギン酸塩濃度は、調節され得る。例えば、０．１２５％ ｗ／ｖアルギン酸ナトリウムは、より小さい液滴のために使用されている。ヒドロゲルポリマー（コア）溶液の粘度及び密度は、最終的に、真に球状の構造物がアルギン酸塩槽との接触後に形成され得るかどうかを示す。これを超えて、液滴の高さ、すなわち、液滴発生出口から槽の表面までの距離は、得られる構造物の形態に関与する。これらのパラメータの特定の値はまた、液滴のサイズ、材料の種類、アルギン酸塩溶液の濃度及び粘度などに応じて異なる。これらの要因は考慮されなければならず、最終的に、目標ヒドロゲルポリマー溶液の組成物に制約を加える。
４．槽内の全ての液滴の回収後、約５分間撹拌し続けて、アルギン酸塩シェルが完全に形成されることを可能にし、液体コア−シェル構造物の凝集を低減または防止する。元の液滴のサイズ（体積）に応じて、このステップは任意であってもよい。より大きい球体（１〜３ｍｍ）に対して、これを行うことは、構造物の凝集を制限するように見えた。撹拌の長さは、液滴中で使用される二価カチオン濃度に反比例する。加えて、過剰な撹拌によって液滴変形が生じ得ることがわかっている。約１〜２分の撹拌時間がより小さい液滴に対して十分であることがわかっている。
５．適切なサイズのストレーナまたはスクリーンを使用して、アルギン酸塩溶液から構造物を分離する。
６．使用される特定のヒドロゲル溶液の特定の要件に従って、コアヒドロゲルポリマー溶液を架橋／ゲル化する。このステップは、使用されるヒドロゲル前駆体溶液の種類に応じて異なる。場合によっては、それは、液体コア−シェル構造物を、ヒドロゲル架橋剤を含むコアゲル化槽または器に移すことを伴う。それにもかかわらず、このステップは、各材料と関連する製造業者推奨のゲル化プロトコルとよく似る可能性が高く、アルギン酸塩シェル及び構造物形状を説明するわずかな変化のみを有する。いずれにせよ、本明細書で使用される培地は、硬化中にアルギン酸塩シェルの完全性を維持するために、少なくともある程度の量のカルシウムイオンを含有するべきである。
７．任意のさらなる所望の硬化（ｈａｒｄｅｎｉｎｇ）、硬化（ｃｕｒｉｎｇ）、またはインキュベーションは、この時点で行われ得る（例えば、丁重な取り扱いを必要とする生存細胞をカプセル化する場合）。そうでなければ、すぐにステップ８に進む。
８．次いで、一時的なアルギン酸塩シェルを除去する。例えば、次いで、コア／シェル構造物を槽に移し、かつ／または適切なキレート剤で洗浄して、アルギン酸塩シェルを除去する。今は固体のコア−シェル構造物を、ＰＢＳ（または他のカルシウム不含緩衝液）中の２５〜５０ｍＭクエン酸ナトリウムの溶液に移し、２４℃〜３７℃で２０〜４０分間軽く混合すると同時に、シェル分解の進行を視覚的に監視する。ミクロスフェア対クエン酸塩溶液の特定の体積比は、識別されていない。クエン酸塩の非常に低いコストを考慮すると、このステップは、アルギン酸塩シェルの完全除去を確実にするために、かなり大過剰なクエン酸塩溶液を使用して単純に行われるべきである。
９．追加のクエン酸塩溶液を用いて、適切なサイズのストレーナまたはスクリーンを使用して、構造物を洗い流し、シェルが目視検査によって完全に溶解するまで、新鮮なクエン酸塩溶液中の混合を繰り返す。洗浄中の流体の機械的剪断が、「新鮮な」クエン酸塩溶液よりもむしろ、このステップが残りのアルギン酸塩シェル材料の除去において効果的であった理由である可能性が高い。したがって、この洗浄ステップをより早く実施することは、このプロセスを潜在的に短縮し得る。
１０．ミクロスフェア（マイクロビーズ）がここで使用される準備ができている。使用するために、所望の培地または緩衝剤に移す。

【0040】

Ｂ．アルギン酸塩型方法を使用して、「ＨｙＳｔｅｍ」ミクロスフェアを生成するために使用される例示的な手順
１．ＧＭＰグレードのグリコシル（ＨｙＳｔｅｍ−Ｃヒドロゲルのチオール化ヒアルロン酸ポリマー構成成分）を、緩衝臓器保存溶液を使用して、１０ｍｇ／ｍＬで再構成した。溶液は、ＨＴＫ保存溶液である。
２．塩化カルシウム粉末をグリコシル溶液に添加して、約２５ｍＭのカルシウムイオン濃度を得た。
３．次いで、Ｃａ２＋／グリコシルヒドロゲルポリマー溶液を、１〜２ｃｍの高さから、注射器及び２７Ｇの先端が丸い針を使用して、撹拌０．２５％（ｗ／ｖ）アルギン酸塩槽（Ｐｒｏｔａｎａｌ ＬＦ １０／６０）に滴下添加した。時々、液滴サイズを減少させるために、注射器を軽くたたくことによって、液滴を機械的に阻害した。
４．球状の液体グリコシルコア−アルギン酸塩シェル構造物は、液滴の槽との接触後すぐに形成され、さらに５分間撹拌して、シェルが完全に形成されることを可能にし、凝集を低減した。概して球状である一方で、構造物は、尾に似た特徴を有し、いくつかは他よりも大きかった。これらは、グリコシル溶液の粘度、例えば、濃度の調節、または他の粘度改変剤の添加によって、容易に排除されるはずである。
５．２５０ミクロンナイロンメッシュスクリーンを用いて、構造物を回収し、後の処理のために、ＰＢＳ中の１０ｍＭ Ｃａ２＋中で保管した（シェル除去）。このステップは、場合によっては任意であってもよい。
６．構造物を、１×の最終濃度で、Ｅｘｔｒａｌｉｎｋ（３４００ｇ／ｍｏｌのＰＥＧジアクリレート）を含有する管に移し（すなわち、ステップ１で使用された該緩衝液中の２．５ｍＬのＧＭＰグレードのＥｘｔｒａｌｉｎｋの１つのバイアル）、室温で２日間インキュベートした。より短いインキュベーション時間が、ある特定の実施形態で使用されてもよい。
７．次いで、構造物を、ＰＢＳ中の５０ｍＭクエン酸ナトリウムの溶液に移し、約４５分間オービタルシェーカー上で軽く混合した。光学顕微鏡法を介して、アルギン酸塩シェル分解を監視した。２０〜４５分の間、変化はあまり見られなかった。一般的なプロトコル解釈書で示唆されるように、洗浄ステップは、シェル除去プロセスを促進するように思われた。
８．次いで、構造物を、新鮮なクエン酸塩溶液を用いて、２５０ミクロンナイロンメッシュスクリーンで洗い流し、次いで、アルギン酸塩シェルの視覚的な証拠が残らなくなるまで、クエン酸ナトリウム中でさらに混合し、固体の球状のグリコシルコアのみを残した。アルギン酸塩が、洗浄ステップ単独によって完全に除去された可能性がある。しかしながら、これは、クエン酸塩溶液に戻され、数分間混合される前に、顕微鏡法を介して検証されていない。
９．グリコシル球体を室温において、ＰＢＳ中で保存した。

【0041】

Ｃ．ヒドロゲル前駆体中で架橋剤を用いて、アルギン酸塩型方法を使用して、「ＨｙＳｔｅｍ」ミクロスフェアを生成するために使用される例示的な手順
１．ヒドロゲル前駆体溶液を以下の通り調製した。１％ ｗ／ｖグリコシル（チオール化ＨＡ、ＭＷ約２５０ｋＤａ）、２００ｍＭ塩化カルシウム、１００ｍＭヒスチジン、及び０．２５％ ＰＥＧＤＡ３４００（ｐＨ６．５、粘度、約５０ｃＰ）。
２．直径が約６００ミクロンのヒドロゲル前駆体の液滴を、室温において、約１．５ｍ／ｓの初期速度で、１７ｃｍの高さから、０．１２５％ Ｐｒｏｔａｎａｌ ＬＦ １０／６０低粘度アルギン酸塩（粘度、約２．５ｃＰ）の撹拌層内に滴下して、コア／シェル微粒子を形成した。
３．コアシェル微粒子をアルギン酸塩槽内で２分間撹拌し、次いで、２５０ミクロンスクリーンを使用して回収した。
４．コア／シェル微粒子をＰＢＳ（ｐＨ７．４）に移し、ヒドロゲルの架橋（グリコシル及びＰＥＧＤＡ）を可能にするために一晩インキュベートした。
５．一晩のインキュベーション後、アルギン酸塩シェルが完全に溶解するまで、コア／シェル微粒子を、５０ｍＭクエン酸ナトリウムを含有する０．８５％塩化ナトリウム（またはカルシウム不含ＰＢＳ）の撹拌層に移した。

【0042】

実施例３
Ａ．アルギン酸塩型方法を使用して、ＵＶ架橋「ＨｙＳｔｅｍ−Ｃ」ミクロスフェアを生成するために使用される例示的な手順
１．以下の組成及び物理的特性を用いて、ヒドロゲル前駆体溶液を調製した。
・１．０％（ｗ／ｖ）グリコシル（ヒドロゲル前駆体ポリマー）
・０．５％（ｗ／ｖ）Ｇｅｌｉｎ−Ｓ（生物活性剤）
・１．０％（ｗ／ｖ）４側鎖ポリエチレングリコールノルボルネン（ヒドロキシルラジカル触媒チオール反応性架橋剤、ＭＷ：１０ｋＤａ、ＪｅｎＫｅｍ ＵＳＡ）
・１２％（ｖ／ｖ）イオジキサノール（密度改変剤）
・２００ｍＭ ＣａＣｌ_２
・１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ
・ｐＨ 室温で約７
・密度＝室温で１．０８ｇ／ｍＬ
・粘度 室温で約６０ｃＰ
２．以下の組成及び物理的特性を用いて、アルギン酸塩槽を調製した。
・０．１２％（ｗ／ｖ）Ｐｒｏｔａｎａｌ ＬＦ １０／６０低粘度アルギン酸塩
・０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０（界面活性剤）
・０．１％ Ｉｒｇａｃｕｒｅ ２９５９（光開始剤、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）
・１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ
・ｐＨ 室温で約７
・密度 室温で約１．０ｇ／ｍＬ
・粘度 室温で約２．５ｃＰ
３．ヒドロゲル前駆体溶液の液滴を、液滴発生器を使用して、約２０ｃｍの高さから、撹拌アルギン酸塩槽内に導入して、約１ｍｍのコア直径のコア／シェル微粒子を生成した。
４．コア／シェル粒子形成の直後に、撹拌槽を、光開始剤（Ｉｒｇａｃｕｒｅ ２９５９）を用いて、粒子及びアルギン酸塩溶液を含有するガラス容器の側壁を通じて、長波紫外線ランプ（Ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、ＬＬＣ、Ｍｏｄｅｌ ＵＶＬ−５６、６ワット、３６５ｎｍ）で照射した。撹拌を５分間続けた。
５．５分間の初期撹拌後、アルギン酸塩槽を、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳを含有する生理食塩水で１：１に希釈して、凝集及びアルギン酸塩シェルの異常増殖を防止した。ＵＶ照射及び撹拌をさらに２５分間続けた。
６．最後に、１．０Ｍクエン酸ナトリウムを、２５ｍＭクエン酸塩イオンの最終濃度まで、槽に添加した。アルギン酸塩シェルは、約５分後に完全に溶解して、架橋ＨｙＳｔｅｍヒドロゲルマイクロビーズを明らかにした。次いで、２５０ミクロンスクリーンを使用して、ＨｙＳｔｅｍビーズを回収した。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】