6567083 抗ＤＫＫ−１−抗ＲＡＮＫＬ二重特異性抗体化合物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6567083

(24)【登録日】2019年8月9日

(45)【発行日】2019年8月28日

(54)【発明の名称】抗ＤＫＫ−１−抗ＲＡＮＫＬ二重特異性抗体化合物

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/46 20060101AFI20190819BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20190819BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20190819BHJP

   C12N 15/28 20060101ALI20190819BHJP

   C12N 15/62 20060101ALI20190819BHJP

   A61P 19/10 20060101ALI20190819BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20190819BHJP

   A61P 19/08 20060101ALI20190819BHJP

   A61K 47/68 20170101ALI20190819BHJP

   C07K 16/28 20060101ALN20190819BHJP

【ＦＩ】

   C07K16/46ZNA

   C12N5/10

   C12N15/13

   C12N15/28

   C12N15/62 Z

   A61P19/10

   A61K39/395 N

   A61P19/08

   A61K47/68

   !C07K16/28

【請求項の数】16

【全頁数】30

(21)【出願番号】特願2017-559048(P2017-559048)

(86)(22)【出願日】2016年5月12日

(65)【公表番号】特表2018-516896(P2018-516896A)

(43)【公表日】2018年6月28日

(86)【国際出願番号】US2016032108

(87)【国際公開番号】WO2016186957

(87)【国際公開日】20161124

【審査請求日】2017年11月10日

(31)【優先権主張番号】62/163,044

(32)【優先日】2015年5月18日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】594197872

【氏名又は名称】イーライ リリー アンド カンパニー

(74)【代理人】

【識別番号】100092783

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 浩

(74)【代理人】

【識別番号】100095360

【弁理士】

【氏名又は名称】片山 英二

(74)【代理人】

【識別番号】100120134

【弁理士】

【氏名又は名称】大森 規雄

(74)【代理人】

【識別番号】100176094

【弁理士】

【氏名又は名称】箱田 満

(74)【代理人】

【識別番号】100104282

【弁理士】

【氏名又は名称】鈴木 康仁

(72)【発明者】

【氏名】コリトコ，アンドリュー

(72)【発明者】

【氏名】オブング，ヴィクター エイチ

【審査官】 鈴木 優志

(56)【参考文献】

【文献】 特表２０１２−５２３４１７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００２−５０９４３０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１１−２１３６５４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１２−５２６５４２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１１−５２３８５３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 浅野ら，生化学，２０１４年，Vol.86, No.4，p.469-473

【文献】 中村ら，骨粗鬆症治療，２０１５年 ４月１０日，Vo.14, No.1，p.77-80

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／００〜１５／９０

Ｃ０７Ｋ １／００〜１９／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＤＷＰＩ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

２つの第１のポリペプチド鎖と、２つの第２のポリペプチド鎖とを含む二重特異性抗体化合物であって、それぞれ
ａ．）前記第１のポリペプチド鎖は、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）及びｍＡｂ ＩｇＧ重鎖（ＨＣ）を含み、前記ＨＣは重鎖ＣＤＲ（ＨＣＤＲ）１〜３を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ１）を有し、ＨＣＤＲ１のアミノ酸配列は配列番号９であり、ＨＣＤＲ２のアミノ酸配列は配列番号１０であり、ＨＣＤＲ３のアミノ酸配列は配列番号１１であり、前記ｓｃＦｖは重鎖可変領域（ＨＣＶＲ２）及び軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ２）を有し、ＨＣＶＲ２はＨＣＤＲ４〜６を含み、ＬＣＶＲ２はＬＣＤＲ４〜６を含み、ＨＣＤＲ４のアミノ酸配列は配列番号１２であり、ＨＣＤＲ５のアミノ酸配列は配列番号１３であり、ＨＣＤＲ６のアミノ酸配列は配列番号１４であり、ＬＣＤＲ４のアミノ酸配列は配列番号１８であり、ＬＣＤＲ５のアミノ酸配列は配列番号１９であり、ＬＣＤＲ６のアミノ酸配列は配列番号２０であり、
ｂ．）前記第２のポリペプチドは、軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ）１〜３を含むｍＡｂ軽鎖（ＬＣ）を含み、ＬＣＤＲ１のアミノ酸配列は配列番号１５であり、ＬＣＤＲ２のアミノ酸配列は配列番号１６であり、ＬＣＤＲ３のアミノ酸配列は配列番号１７であり、
各ｓｃＦｖは、独立して、ＨＣのＣ末端及びＨＣＶＲ２のＮ末端に共有結合しているポリペプチドリンカー（Ｌ１）を介して前記ＨＣに連結され、ＬＣＶＲ２は、ＬＣＶＲ２のＮ末端及びＨＣＶＲ２のＣ末端に共有結合している第２のポリペプチドリンカー（Ｌ２）を介して同じｓｃＦｖのＨＣＶＲ２に連結される、二重特異性抗体化合物。

【請求項2】

ＨＣＶＲ１のアミノ酸配列が配列番号５であり、ＬＣＶＲ１のアミノ酸配列が配列番号７であり、ＨＣＶＲ２のアミノ酸配列が配列番号６であり、ＬＣＶＲ２のアミノ酸配列が配列番号８である、請求項１に記載の二重特異性抗体化合物。

【請求項3】

Ｌ１のアミノ酸配列が配列番号２１であり、Ｌ２のアミノ酸配列が配列番号２２である、請求項１及び２のいずれかに記載の二重特異性抗体化合物。

【請求項4】

２つの第１のポリペプチド鎖及び２つの第２のポリペプチド鎖を含む二重特異性抗体化合物であって、前記第１のポリペプチドの各々のアミノ酸配列が配列番号１であり、前記第２のポリペプチドの各々のアミノ酸配列が配列番号２である、二重特異性抗体化合物。

【請求項5】

配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチド鎖をコードするポリヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子及び配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチド鎖をコードするポリヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子を含む哺乳動物細胞であって、前記細胞は、配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチド鎖及び配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチド鎖を発現することができる、哺乳動物細胞。

【請求項6】

配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチド鎖をコードするポリヌクレオチド配列を含み、かつ配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチド鎖をコードするポリヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子を含む哺乳動物細胞であって、前記細胞は、配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチド鎖及び配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチド鎖を発現することができる、哺乳動物細胞。

【請求項7】

骨障害を治療するための薬学的組成物であって、請求項１〜４のいずれかに記載の二重特異性抗体化合物を含む、薬学的組成物。

【請求項8】

脊椎固定の患者を治療するための薬学的組成物であって、請求項１〜４のいずれかに記載の二重特異性抗体化合物を含む、薬学的組成物。

【請求項9】

骨粗鬆症、骨減少症、腰椎変性すべり症、変性椎間板疾患、または骨形成不全症のうちの少なくとも１つを治療するための薬学的組成物であって、請求項１〜４のいずれかに記載の二重特異性抗体化合物を含む、薬学的組成物。

【請求項10】

治療に使用するための、請求項１〜４のいずれかに記載の二重特異性抗体化合物。

【請求項11】

脊椎固定療法に対する補助剤として使用するための、請求項１〜４のいずれかに記載の二重特異性抗体化合物。

【請求項12】

骨治癒において、または骨粗鬆症、骨減少症、腰椎変性すべり症、変性椎間板疾患、もしくは骨形成不全症のうちの少なくとも１つの治療において使用するための、請求項１〜４のいずれかに記載の二重特異性抗体化合物。

【請求項13】

請求項１〜４のいずれかに記載の二重特異性抗体化合物及び１種以上の薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤を含む、薬学的組成物。

【請求項14】

脊椎固定の患者の治療のための薬剤の製造における、請求項１〜４のいずれかに記載の二重特異性抗体化合物の使用。

【請求項15】

骨障害の治療のための薬剤の製造における、請求項１〜４のいずれかに記載の二重特異性抗体化合物の使用。

【請求項16】

骨粗鬆症、骨減少症、腰椎変性すべり症、変性椎間板疾患、または骨形成不全症のうちの少なくとも１つの治療のための薬剤の製造における、請求項１〜４のいずれかに記載の二重特異性抗体化合物の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、医学の分野にある。より具体的には、本発明は、Ｄｉｃｋｋｏｐｆ関連タンパク質１（Ｄｋｋ−１）及び核因子κＢリガンド活性化受容体（ＲＡＮＫＬ）に対して指向される二重特異性抗体化合物に関する。本発明の二重特異性抗体化合物は、骨治癒において、例えば、脊椎固定術に対する補助剤として、及び／または骨粗鬆症、骨減少症、腰椎変性すべり症、変性椎間板疾患、骨形成不全症、もしくは骨量減少障害の治療において、有用であることが予想される。

【0002】

骨障害は、何百万人もの個体を侵しており、苦痛を伴い、衰弱させる症状をしばしば引き起こす。骨粗鬆症、骨減少症、及び／または骨形成不全症等のいくつかの障害は、骨吸収を低減するかつ／または骨形成を増加させる薬剤等の治療的介入を必要とし得る。腰椎変性すべり症及び変性椎間板疾患等の他の障害は、脊椎固定術等の治療的介入を必要とし得る。脊椎固定は、椎骨が融合するように、移植物質（例えば、骨移植片）を隣接する椎骨間に挿入して、それにより、融合された椎骨間の関節空間における可動域を限定または排除する、外科的処置である。上記の骨障害に加えて、脊椎固定は、変性椎間板疾患（ＤＤＤ）、脊椎症、及び脊椎すべり症等の変性病態、後弯症及び側弯症を含む先天性変形、ならびにいくつかの椎骨骨折に関連する、疼痛及び病的状態に対処するために行われる。

【0003】

特定の種類の脊椎固定手技としては、腰椎後側方固定術（ＰＬＦ）及び椎体間固定術（例えば、脊椎の位置及び脊椎への接近角度によって様々である、腰椎前方椎体間固定術（ＡＬＩＦ）、腰椎後方椎体間固定術（ＰＬＩＦ）、及び腰椎経椎間椎体間固定術（ＴＬＩＦ））が含まれる。ＰＬＦは、脊椎の後方において隣接する腰椎椎骨の横突起間に移植物質を配置し、次いで、椎骨の両側に位置付けられた金属ロッドに椎骨を固定することを伴う。椎体間固定術は、椎間板を除去し、隣接する椎骨間の椎間腔の中に移植物質を配置することを伴い、それによって、移植片と隣接する椎骨の終板との間に融合が生じる。ＰＬＦの場合、椎体間固定手技は、椎骨を金属ロッド、プレート、スクリュー、またはワイヤーで固定することによって安定化され得る。

【0004】

新たな骨成長及び移植片と椎骨との間の融合を刺激するために、脊椎固定手技中、骨移植片代用材（ＢＧＳ）がまた、移植片に、及び移植片と隣接する椎骨との間の接合部において適用され得る。ＢＧＳはしばしば、成形性ゲル、パテ、ペースト、またはスポンジの形態をとり、骨形成（ｆｏｒｍｉｎｇ）タンパク質（例えば、骨形成（ｍｏｒｐｏｈｏｇｅｎｉｃ）タンパク質）及び他の成長因子（例えば、ＴＧＦ−ベータ、ＰＤＧＦ、ＦＧＦ）等の物質を含む。ＢＧＳは、新たな骨形成及び融合に必要な必要タンパク質を供給するための手段を提供するが、ＢＧＳの採取は課題を提示しており、ＢＧＳは、脊椎固定手技中にしか適用することができない。

【0005】

脊椎固定手技は、２０世紀初期から行われてきたが、かかる手技は著しい危険性を提示し続けている。一般的な危険性としては、椎骨融合の失敗（偽関節）及び再置換手術の必要性の危険性、術後の疼痛及び病的状態、ならびに感染の危険性が含まれ、これらは全て、潜在的に長期の回復時間及び患者にとっての増加する費用につながり得る。故に、患者にとってよりよい転帰をもたらし得る代替療法が依然として必要である。特に、脊椎固定手技に対する補助剤として使用され得る、全身投与される医薬品が依然として必要である。好ましくは、かかる全身投与される医薬品は、脊椎固定手技の前、最中及び／または後に投与することが可能である。それに加えて、かかる代替療法は、脊椎固定手技に関連する危険性及び／もしくは合併症を低減すること、ならびに／または骨粗鬆症、骨減少症、変性腰椎脊椎すべり症、変性椎間板疾患、もしくは骨形成不全症の治療において、有効性を実証することが可能であるのが好ましい。Ｄｋｋ−１及びＲＡＮＫＬに指向される、本発明の二重特異性抗体化合物は、上記の必要性のうちの少なくとも１つを満たすことが予想される代替療法を提供する。

【0006】

Ｄｋｋ−１は、低比重リポタンパク質受容体関連タンパク質５／６（ＬＲＰ５／６）に結合し、ＬＲＰ５／６の、Ｗｎｔファミリータンパク質複合体との会合を妨害する、タンパク質Ｄｉｃｋｋｏｐｆファミリーのメンバーである。研究によると、ＬＲＰ５／６の、Ｗｎｔファミリータンパク質への結合を妨害することによって、Ｄｋｋ−１がＷｎｔシグナル伝達経路を阻害し、それによって、骨芽細胞形成及び骨代謝が損なわれることが示されている。Ｗｎｔシグナル伝達経路の拮抗においてＤｋｋ−１が果たす役割は、Ｄｋｋ−１を骨形成及び修復療法のための有力な標的とする。

【0007】

ＲＡＮＫＬは、タンパク質ＴＮＦスーパーファミリーのメンバーであり、骨リモデリングにおいて必要不可欠な役割を果たす。ＲＡＮＫＬは、骨芽細胞によって発現され、破骨細胞及び破骨細胞の前駆体細胞の表面上にあるその同源の受容体ＲＡＮＫに結合する。ＲＡＮＫＬのＲＡＮＫへの結合は、成熟破骨細胞の形成、活性化、及び存続、ならびに細胞内シグナル伝達カスケードの刺激を誘導して、増加した骨吸収をもたらす。骨吸収におけるその役割を理由に、ＲＡＮＫＬの阻害は、患者における骨塩量を改善するための機構として認識される。

【0008】

Ｄｋｋ−１及びＲＡＮＫＬに対する中和抗体が、当該技術分野で知られている。例えば、米国特許第８，１４８，４９８号は、骨治癒及び癌の治療に使用するためのＤｋｋ−１抗体を開示している。同様に、米国特許第６，７４０，５２２号は、閉経後の女性及び骨折の危険性が高い男性における骨粗鬆症の治療に認可されているＤｅｎｏｓｕｍａｂ等の、ＲＡＮＫＬに指向される抗体を開示している。それに加えて、米国特許第８，３３８，５７６号は、骨量障害の治療のための、Ｄｋｋ−１抗体と、ＲＡＮＫＬ阻害剤をはじめとする種々の骨形成促進剤または骨吸収抑制剤のうちの１つとを含む、可能性のある併用療法について考察している。しかしながら、Ｄｋｋ−１及びＲＡＮＫＬの両方の活性を阻害するための認可された併用療法は何もない。故に、Ｄｋｋ−１阻害剤の骨形成特性をＲＡＮＫＬ阻害剤の骨吸収抑制特性と組み合わせ、脊椎固定の患者等の患者における骨治癒転帰を改善する、代替療法が依然として必要である。

【0009】

かかる代替療法に対する１つのアプローチは、２つの異なるバイオ製品（例えば、抗体）の同時投与を含み得る。同時投与には、２つの別個の製品の注射または２つの異なる抗体の合剤（ｃｏ−ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）の単回注射のいずれかが必要である。２回の注射は、投与量及びタイミングの柔軟性を許容するが、患者にとっては服薬順守及び疼痛の点から不都合である。さらに、合剤が投与量のいくらかの柔軟性を提供し得る一方で、２つの抗体の異なる分子特性に起因して、溶液中で（比較的高い濃度で）許容される粘度を有し、かつ、両方の抗体の化学的及び物理的安定性を許容する製剤条件を見出すことは、しばしばかなり難しいか、または不可能である。それに加えて、同時投与及び合剤は、２つの異なる薬物療法による付加的費用を伴い、これは患者及び／または支払者の費用を増加させ得る。したがって、骨障害の治療のための代替療法が依然として必要であり、好ましくは、かかる代替療法は二重特異性抗体を含む。しかしながら、上述の抗Ｄｋｋ−１及び抗ＲＡＮＫＬ抗体の開示にもかかわらず、Ｄｋｋ−１及びＲＡＮＫＬの両方に結合する単一の二重特異性中和抗体は、先行技術において開示されていなかった。

【0010】

本発明は、骨固定手技のための代替療法に対する必要性に取り組む。より具体的には、本発明は、Ｄｋｋ−１及びＲＡＮＫＬの両方の活性を阻害することが可能な二重特異性抗体化合物を提供する。本発明の二重特異性抗体化合物は、全身投与に好適で、かつ、脊椎固定手技の前、最中及び／または後に投与することが可能である、医薬品を提供する。さらに、本発明の二重特異性抗体化合物は、骨治癒のための薬剤として、例えば、脊椎固定手技に対する補助剤として、あるいは骨喪失もしくは変性に関連する病態の治療における薬剤として、有用である。

【0011】

本発明は、４つのポリペプチド鎖、すなわち、２つの第１のポリペプチド鎖及び２つの第２のポリペプチド鎖を有する二重特異性抗体化合物を提供し、各第１のポリペプチド鎖は、ポリペプチドリンカー（Ｌ１）を介してｍＡｂ ＩｇＧ重鎖（ＨＣ）のＣ末端で独立して連結された一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）を含み、各第２のポリペプチド鎖はｍＡｂ軽鎖（ＬＣ）を含む。本発明の二重特異性抗体化合物によれば、各ＨＣは、重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１〜３を有する重鎖可変領域（ＨＣＶＲ１）を含み、各ＬＣは、軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１〜３を有する軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ１）を含む。それに加えて、本発明の二重特異性抗体化合物によれば、各ｓｃＦｖは、ＬＣＤＲ４〜６を有する軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ２）及びＨＣＤＲ４〜６を有する重鎖可変領域（ＨＣＶＲ２）を含む。また、本発明の二重特異性抗体化合物によれば、ＨＣＶＲ２は、そのＮ末端でＬ１に連結され、そのＣ末端で、ＬＣＶＲ２のＮ末端に連結されたポリペプチドリンカー（Ｌ２）に連結される。本発明の二重特異性抗体化合物の特定の実施形態によれば、ＨＣＤＲ１のアミノ酸配列は配列番号９で与えられ、ＨＣＤＲ２のアミノ酸配列は配列番号１０で与えられ、ＨＣＤＲ３のアミノ酸配列は配列番号１１で与えられ、ＬＣＤＲ１のアミノ酸配列は配列番号１５で与えられ、ＬＣＤＲ２のアミノ酸配列は配列番号１６で与えられ、ＬＣＤＲ３のアミノ酸配列は配列番号１７で与えられ、ＨＣＤＲ４のアミノ酸配列は配列番号１２で与えられ、ＨＣＤＲ５のアミノ酸配列は配列番号１３で与えられ、ＨＣＤＲ６のアミノ酸配列は配列番号１４で与えられ、ＬＣＤＲ４のアミノ酸配列は配列番号１８で与えられ、ＬＣＤＲ５のアミノ酸配列は配列番号１９で与えられ、及びＬＣＤＲ６のアミノ酸配列は配列番号２０で与えられる。いくつかのより具体的な実施形態では、ＨＣは、ｍＡｂ ＩｇＧ４アイソタイプを含み、各ＬＣは、ｍＡｂ κ軽鎖を含む。

【0012】

いくつかの特定の実施形態では、本発明は、４つのポリペプチド鎖、すなわち、２つの第１のポリペプチド鎖及び２つの第２のポリペプチド鎖を有する二重特異性抗体化合物を提供し、各第１のポリペプチド鎖は、Ｌ１を介してＨＣのＣ末端で独立して連結されたｓｃＦｖを含み、第２のポリペプチド鎖の各々はＬＣを含む。かかる実施形態によれば、各ＨＣは、配列番号５で与えられるアミノ酸配列を有するＨＣＶＲ１を含み、各ＬＣは、配列番号７で与えられるアミノ酸配列を有するＬＣＶＲ１を含む。それに加えて、各ｓｃＦｖは、配列番号６で与えられるアミノ酸配列を有するＨＣＶＲ２、及び配列番号８で与えられるアミノ酸配列を有するＬＣＶＲ２を含む。また、本発明の二重特異性抗体化合物によれば、ＨＣＶＲ２は、そのＮ末端でＬ１に連結され、そのＣ末端で、ＬＣＶＲ２のＮ末端に連結されたＬ２に連結される。いくつかのさらにより具体的な実施形態では、Ｌ１のアミノ酸配列は配列番号２１で与えられ、Ｌ２のアミノ酸配列は配列番号２２で与えられる。

【0013】

さらに具体的な実施形態によれば、本発明は、４つのポリペプチド鎖、すなわち、２つの第１のポリペプチド鎖及び２つの第２のポリペプチド鎖を有する二重特異性抗体化合物を提供し、各第１のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、配列番号１で与えられ、各第２のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、配列番号２で与えられる。

【0014】

本発明はまた、本発明の二重特異性抗体化合物をコードする核酸分子及び発現ベクターに関する。ある実施形態では、本発明は、第１のポリペプチド鎖をコードするポリヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子を提供し、第１のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は配列番号１である。ある実施形態では、本発明はまた、第２のポリペプチド鎖をコードするポリヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子を提供し、第２のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は配列番号２である。さらなる実施形態では、本発明は、配列番号１のアミノ酸配列を有する第１のポリペプチド鎖をコードするポリヌクレオチド配列を含み、かつ配列番号２のアミノ酸配列を有する第２のポリペプチド鎖をコードするポリヌクレオチド配列を含む、ＤＮＡ分子を提供する。特定の実施形態では、配列番号１のアミノ酸配列を有する第１のポリペプチド鎖をコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号３で与えられ、配列番号２のアミノ酸配列を有する第２のポリペプチド鎖をコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号４で与えられる。

【0015】

本発明はまた、ＤＮＡ分子で形質転換された哺乳動物細胞を提供し、その細胞は、本発明の第１のポリペプチド鎖及び第２のポリペプチド鎖を含む二重特異性抗体化合物を発現することが可能である。また、本発明は、本発明の二重特異性抗体化合物が発現されるような条件下で哺乳動物細胞を培養することを含む、第１のポリペプチド鎖及び第２のポリペプチド鎖を含む二重特異性抗体化合物を産生するためのプロセスを提供する。本発明はまた、該プロセスによって産生される二重特異性抗体化合物を提供する。

【0016】

本発明はまた、本発明の二重特異性抗体化合物及び１種以上の薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤を含む、薬学的組成物を提供する。本発明の薬学的組成物は、脊椎固定の患者の治療に使用することができ、かかる治療は、脊椎固定の患者に、本発明の薬学的組成物を脊椎固定術の前、最中及び／または後に投与することを含む。いくつかの実施形態では、本発明の薬学的組成物は、骨障害の治療に使用することができる。いくつかの実施形態では、本発明の薬学的組成物は、骨粗鬆症、骨減少症、変性腰椎脊椎すべり症、変性椎間板疾患、及び／または骨形成不全症のうちの少なくとも１つに治療に使用することができ、かかる治療は、それを必要とする患者に本発明の薬学的組成物を投与することを含む。

【0017】

本発明はまた、脊椎固定の患者に治療有効量の本発明の二重特異性抗体化合物またはその薬学的組成物を投与することを含む、脊椎固定の患者を治療する方法を提供し、該二重特異性抗体化合物またはその薬学的組成物は、該脊椎固定の患者に、脊椎固定術の前、最中、及び／または後に投与される。それに加えて、本発明は、骨障害の治療を必要とする患者に、治療有効量の本発明の二重特異性抗体化合物を投与することを含む、骨障害を治療する方法を提供する。本発明のさらなる実施形態は、骨粗鬆症、骨減少症、変性腰椎脊椎すべり症、変性椎間板疾患、及び／または骨形成不全症のうちの少なくとも１つの治療を必要とする患者に、治療有効量の本発明の二重特異性抗体化合物またはその薬学的組成物を投与することを含む、骨粗鬆症、骨減少症、変性腰椎脊椎すべり症、変性椎間板疾患、及び／または骨形成不全症のうちの少なくとも１つを治療する方法を提供する。

【0018】

本発明はまた、療法に使用するための、本発明の二重特異性抗体化合物またはその薬学的組成物を提供する。より具体的には、本発明はまた、脊椎固定の患者の治療に使用するための、本発明の二重特異性抗体化合物またはその薬学的組成物を提供する。それに加えて、本発明は、骨障害の治療に使用するための、本発明の二重特異性抗体化合物またはその薬学的組成物を提供する。さらに、本発明は、骨粗鬆症、骨減少症、変性腰椎脊椎すべり症、変性椎間板疾患、及び／または骨形成不全症のうちの少なくとも１つの治療に使用するための、本発明の二重特異性抗体化合物またはその薬学的組成物を提供する。

【0019】

ある実施形態では、本発明はまた、脊椎固定の患者の治療のための薬剤の製造における、本発明の二重特異性抗体化合物またはその薬学的組成物の使用を提供する。それに加えて、本発明はまた、骨障害の治療のための薬剤の製造における、本発明の二重特異性抗体化合物またはその薬学的組成物を提供する。さらに、、本発明はまた、骨粗鬆症、骨減少症、変性腰椎脊椎すべり症、変性椎間板疾患、及び／または骨形成不全症のうちの少なくとも１つの治療のための薬剤の製造における、本発明の二重特異性抗体化合物またはその薬学的組成物を提供する。

【0020】

本明細書で言及されるとき、「二重特異性抗体化合物」という用語は、４つの抗原結合部位を含む設計されたポリペプチドを指す。４つの抗原結合部位のうちの２つはＤｋｋ−１に結合し、他の２つの抗原結合部位はＲＡＮＫＬに結合する。本発明の二重特異性抗体化合物は、単独でまたは同時にヒトＤｋｋ−１及びＲＡＮＫＬの両方と相互作用し、それらの活性を阻害することが可能である。Ｄｋｋ−１及びＲＡＮＫＬの阻害特性を単一の化合物へと組み合わせた際、本発明の二重特異性抗体化合物は、患者における骨形成及び／または骨吸収抑制効果を示すと考えられる。故に、本発明の二重特異性抗体化合物、またはその薬学的組成物は、例えば、脊椎固定術に対する補助剤として及び／または１つ以上の骨障害の治療において、有用であり得る。

【0021】

また、本明細書で言及される二重特異性抗体化合物は、４つのポリペプチド鎖、すなわち、２つの第１のポリペプチド鎖及び２つの第２のポリペプチド鎖を含む。第１のポリペプチド鎖の各々は、ポリペプチドリンカー（Ｌ１）によってｍＡｂ重鎖（ＨＣ）のＣ末端に連結された一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）を含むように設計される。第２のポリペプチド鎖の各々は、モノクローナル抗体軽鎖（ＬＣ）を含み、第１のポリペプチド鎖の１つ、具体的には第１のポリペプチド鎖のＨＣ内に鎖間ジスルフィド結合を形成するように設計される。各第１のポリペプチド鎖は、第１のポリペプチド鎖の各々のＨＣ間に、他の第１のポリペプチド鎖との鎖間ジスルフィド結合を形成するように設計される。各第１のポリペプチド鎖は、具体的にはそれぞれの第１のポリペプチド鎖のｓｃＦｖ内で、鎖内ジスルフィド結合を形成するようにさらに設計される。

【0022】

本発明の二重特異性抗体化合物のポリペプチド鎖は、左から右へと読む場合のＮ末端からＣ末端までのそれらのアミノ酸配列によって描写され、このうち各アミノ酸は、１文字または３文字いずれかのアミノ酸略号によって表される。本明細書で別途定めのない限り、本発明のポリペプチドの調製に使用される全てのアミノ酸は、Ｌ−アミノ酸である。アミノ酸、またはポリペプチド鎖の「Ｎ末端」（またはアミノ末端）は、アミノ酸上の遊離アミン基、またはポリペプチド鎖の第１のアミノ酸残基上の遊離アミン基を指す。同様に、またはポリペプチド鎖の「Ｃ末端」（またはカルボキシ末端）は、アミノ酸上の遊離カルボキシ基、またはポリペプチド鎖の最後のアミノ酸残基上の遊離カルボキシ基を指す。

【0023】

本明細書で言及されるとき、第１のポリペプチド鎖の「一本鎖可変フラグメント」（ｓｃＦｖ）は、ポリペプチドリンカー（Ｌ２）を介して連結された重鎖可変領域（ＨＣＶＲ２）及び軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ２）を含むポリペプチド鎖を指す。それに加えて、本明細書において言及されるとき（及び以下の略図において表されるように）、各ｓｃＦｖのＨＣＶＲ２は、ａ．）そのＮ末端で、ポリペプチドリンカー（Ｌ１）によって（第１のポリペプチド鎖の）１つのＨＣのＣ末端に連結され、かつｂ．）そのＣ末端で、第２のポリペプチドリンカー（Ｌ２）を介して同じｓｃＦｖのＬＣＶＲ２のＮ末端に連結される。リンカーＬ１及びＬ２は、典型的には、１０〜２５アミノ酸長であり、グリシン、セリンまたはトレオニンアミノ酸のうちの１つ以上が豊富にある。

【化1】

【0024】

本発明の二重特異性抗体化合物によれば、各第１のポリペプチド鎖のＨＣは、アイソタイプ（例えばＩｇＧとして）を規定するγとして分類される。このアイソタイプは、さらにサブクラス（例えば、ＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２、ＩｇＧ_３、及びＩｇＧ_４）に分割され得る。特定の実施形態では、本発明の二重特異性抗体化合物は、ＩｇＧ４タイプのｍＡｂ重鎖を含む。各ＨＣは、Ｎ末端重鎖可変領域、続いて、３つのドメイン（Ｃ_Ｈ１、Ｃ_Ｈ２、及びＣ_Ｈ３）からなる定常領域（ＣＨ）、及びヒンジ領域からなる。

【0025】

それに加えて、本発明の二重特異性抗体化合物によれば、各ｍＡｂ軽鎖（ＬＣ）は、κまたはλとして分類され、当該技術分野で既知の特定の定常領域によって特徴付けられる。特定の実施形態では、本発明の二重特異性抗体化合物は、κ ＬＣを含む。各ＬＣは、Ｎ末端軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ１）、続いて軽鎖定常領域からなる。

【0026】

それぞれ各ＨＣ及びＬＣのＨＣＶＲ１及びＬＣＶＲ１、及び各ｓｃＦｖのＨＣＶＲ２及びＬＣＶＲ２は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変領域にさらに細分することができ、これには、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる、より保存された領域が介在している。好ましくは、本発明の二重特異性抗体化合物のフレームワーク領域は、ヒト由来であるか、または実質的にヒト由来である。本発明による二重特異性抗体化合物の各ＨＣＶＲ１、ＨＣＶＲ２、ＬＣＶＲ１、及びＬＣＶＲ２は、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順にアミノ末端からカルボキシ末端に配置された、３つのＣＤＲ及び４つのＦＲから構成される。本明細書で、各ＨＣＶＲ１の３つのＣＤＲは「ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３」と称され、各ＨＣＶＲ２の３つのＣＤＲは「ＨＣＤＲ４、ＨＣＤＲ５、及びＨＣＤＲ６」と称され、各ＬＣＶＲ１の３つのＣＤＲは「ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３」と称され、各ＬＣＶＲ２の３つのＣＤＲは、「ＬＣＤＲ４、ＬＣＤＲ５、及びＬＣＤＲ６」と称される。ＣＤＲは、抗原と特異的な相互作用を形成する残基の大部分を含む。特定の抗原に結合する本発明の二重特異性抗体化合物の機能的能力は、ＣＤＲによって大きく影響される。

【0027】

本明細書において交換可能に使用されるとき、「抗原結合部位」及び「抗原結合領域」は、抗原と相互作用するアミノ酸残基を含有し、それぞれの抗原に対する二重特異性抗体化合物の特異性及び親和性を付与する、本発明の二重特異性抗体化合物の部分を指す。本発明の二重特異性抗体化合物によれば、抗原結合部位はＨＣＶＲ１／ＬＣＶＲ１対（鎖間ジスルフィド結合によって結合されたＬＣ及びＨＣのもの）及びｓｃＦｖ ＨＣＶＲ２／ＬＣＶＲ２対によって形成される。それに加えて、本発明の二重特異性抗体化合物によれば、各ＨＣＶＲ１／ＬＣＶＲ１対によって形成される抗原結合部位は同じであり（例えば、同じ抗原に対する親和性を含む）、各ｓｃＦｖ ＨＣＶＲ２／ＬＣＶＲ２対によって形成される抗原結合部位は同じである（例えば、同じ抗原に対する親和性を含む）。しかしながら、本発明の二重特異性抗体化合物によれば、各ＨＣＶＲ１／ＬＣＶＲ１対によって形成される抗原結合部位は、各ｓｃＦｖ ＨＣＶＲ２／ＬＣＶＲ２対によって形成された抗原結合部位とは異なる（例えば異なる抗原に対する親和性を含む）。本発明の二重特異性抗体化合物によれば、ＨＣＶＲ１／ＬＣＶＲ１対によって形成される抗原結合部位は、Ｄｋｋ−１に対する親和性を付与し、一方で、ＨＣＶＲ２／ＬＣＶＲ２対によって形成される抗原結合部位は、ＲＡＮＫＬに対する親和性を付与する。

【0028】

「Ｋａｂａｔ番号付け」または「Ｋａｂａｔラベリング」という用語は、本明細書で交換可能に使用される。当該技術分野で認識されているこれらの用語は、抗体の重鎖及び軽鎖可変領域における他のアミノ酸残基よりもより可変性（すなわち超可変性）であるアミノ酸残基を番号付けするシステムを指す（Ｋａｂａｔ，ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．ＮＹ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１９０：３８２−９３（１９７１）、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１−３２４２（１９９１））。

【0029】

用語「Ｎｏｒｔｈ番号付け」または「Ｎｏｒｔｈラベリング」は、本明細書で交換可能に使用される。当該技術分野で認識されているこれらの用語は、抗体の重鎖及び軽鎖可変領域の他のアミノ酸残基よりもより可変性（すなわち超可変性）であるアミノ酸残基を番号付けするシステムを指し、（Ｎｏｒｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｙ ＣＤＲ Ｌｏｏｐ Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，４０６：２２８−２５６（２０１１）に記載されているように、少なくとも部分的に、多数の結晶構造を有する親和性伝播クラスタリングに基づく。

【0030】

二重特異性抗体設計
本発明の二重特異性抗体化合物を構築しようと試みた際に、重大な問題に遭遇した。遭遇した問題には、骨形成の増加と骨吸収の減少との両方に対する適合性及び／または最適な生物活性を有する単一薬剤を設計することが含まれる。例えば、ｍＡｂ部分またはｓｃＦｖ部分のうちの一方としてのＤｋｋ−１抗体、及びｍＡｂ部分またはｓｃＦｖ部分のうちの他方としての既知のＲＡＮＫＬ抗体（Ｄｅｎｏｓｕｍａｂ等）を含む、二重特異性抗体化合物（米国特許第８，１４８，４９８号に記載される）は、適合性及び／または許容される生物活性を有する薬剤を提供しない。実際、研究によると、（骨吸収を減少させるための）Ｄｅｎｏｓｕｍａｂの薬力学的作用プロファイルは、６か月であり、半減期はおよそ３５〜４２日であり、一方で、（骨形成を増加させるための）米国特許第８，１４８，４９８号に記載されるＤｋｋ−１抗体の薬力学的作用プロファイルは、１ヵ月であり、半減期はおよそ１６日にすぎないことが示されている。かかる本質的に異なる生物学的活性プロファイルは、とりわけ脊椎固定療法（本質的な骨治癒及び融合が術後最初の３か月で起こることが知られる）に対する補助剤としての治療的使用のための、投薬に対する問題を生じさせる。したがって、本発明の驚くべきかつ予想外の特性を有する二重特異性抗体化合物に到達するためには、薬理学的介入が必要とされる。

【0031】

本発明の二重特異性抗体化合物を設計することに関して上で詳述された重大な問題の結果として、脊椎固定術に対する補助剤として使用するのに許容される生物活性プロファイルを有する二重特異性抗体に到達するために、新規のＲＡＮＫＬ抗体が開発及び設計された。したがって、Ｄｋｋ−１ ｍＡｂ部分及びＲＡＮＫＬ ｓｃＦｖ部分を含む二重特異性抗体化合物（本明細書でさらに詳述される）が設計された。本発明の設計された二重特異性抗体化合物は、脊椎固定術に対する補助剤として使用するための、骨吸収（減少）及び骨形成（増加）について治療的に許容されかつ適合性の生物活性プロファイルを含む。それに加えてかつ驚くべきことに、設計された修飾は、治療的に許容される安定性、溶解度、光安定性、熱安定性、及び粘度もまた有する、二重特異性抗体をもたらした。本発明の二重特異性抗体化合物をもたらした修飾のうち、当該技術分野で示唆または教示される慣例または共通一般知識であるものは何もない。

【0032】

二重特異性抗体発現
作動可能に連結されている遺伝子の発現を導くことができる発現ベクターは、当該技術分野で周知である。発現ベクターは、宿主細胞からのポリペプチドの分泌を促進するシグナルペプチドをコードすることができる。シグナルペプチドは、免疫グロブリンシグナルペプチドまたは異種シグナルペプチドであり得る。第１のポリペプチド鎖及び第２のポリペプチド鎖の各々は、それらが１つのベクター中で作動可能に連結されている異なるプロモーターから独立して発現されてもよく、あるいは、第１及び第２のポリペプチド鎖は、２つのベクター（１つは第１のポリペプチド鎖を発現し、１つは第２のポリペプチド鎖を発現する）に作動可能に連結されている異なるプロモーターから独立して発現することができる。本発明の二重特異性抗体化合物の調製に使用するための例示の好適なベクターには、ｐＥＥ ６．４（例えば第１のポリヌクレオチド配列を発現させるため）及びｐＥＥ １２．４（例えば第２のポリヌクレオチド配列を発現させるため）等の、Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓから入手可能なベクターが含まれる。

【0033】

配列番号１のアミノ酸配列を有する、本発明の二重特異性抗体化合物の例示的な第１のポリペプチド鎖（フレキシブルなグリシンセリンリンカーを介してＨＣのＣ末端で連結されたｓｃＦｖを含む）をコードする特定のＤＮＡポリヌクレオチド配列は、配列番号３で提供される（配列番号３で提供されるＤＮＡ ポリヌクレオチド配列はまた、シグナルペプチドもコードする）。配列番号２のアミノ酸配列を有する、本発明の二重特異性抗体化合物の例示的な第２のポリペプチド鎖（ＬＣを含む）をコードする特定のＤＮＡポリヌクレオチド配列は、配列番号４で提供される（配列番号４で提供されるＤＮＡ ポリヌクレオチド配列はまた、シグナルペプチドもコードする）。

【0034】

宿主細胞は、本発明の第１のポリペプチド鎖、第２のポリペプチド鎖、または第１及び第２のポリペプチド鎖の両方を発現する１つまたは複数の発現ベクターで安定にまたは一時的にトランスフェクト、形質転換、形質導入、または感染された細胞を含む。本発明の二重特異性抗体化合物を産生する宿主細胞株の作出及び単離は、当該技術分野で既知の標準技術を用いて達成することができる。哺乳動物細胞は、二重特異性抗体の発現に好ましい宿主細胞である。特定の哺乳動物細胞は、ＣＨＯ、ＮＳ０、ＤＧ−４４及びＨＥＫ２９３である。好ましくは、二重特異性抗体化合物は、宿主細胞が培養される培地中に分泌され、そこから二重特異性抗体化合物が、従来技術により回収または精製され得る。例えば、培地は、従来の方法を用いて、プロテインＡまたはプロテインＧ親和性クロマトグラフィーカラム及びサイズ排除またはＣａｐｔｏマルチモーダルクロマトグラフィーに適用し、そこから溶離することができる。さらに、可溶性凝集体及び多量体は、サイズ排除、疎水性相互作用、イオン交換、またはヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを含む、一般的な技術によって有効に除去することができる。生成物は、例えば−７０℃で直ちに凍結させてもよく、または凍結乾燥させてもよい。

【0035】

抗体の哺乳類発現がグリコシル化をもたらすことは、当該技術分野において周知である。典型的には、高度に保存されたＮ−グリコシル化部位で抗体のＦｃ領域にグリコシル化が起こる。Ｎ−グリカンは、典型的にはアスパラギンに結合する。例として、表１に示される例示の二重特異性抗体の各ＨＣは、配列番号１のアスパラギン残基２９６でグリコシル化されている。

【0036】

治療的使用
本明細書で使用されるとき、「治療」及び／または「治療すること」」は、全てのプロセスを指すことを意図し、これには、本明細書に記載の障害の進行の遅延、中断、阻止、制御、または停止があり得るが、必ずしも全ての障害症状の完全な排除を示すわけではない。治療は、Ｄｋｋ−１及び／もしくはＲＡＮＫＬのレベルの低下、またはＤｋｋ−１及び／もしくはＲＡＮＫＬの生物活性の低下により利益を得るであろう患者における、疾患または病態の治療のための本発明の二重特異性抗体化合物、またはその薬学的組成物の投与を含み、（ａ）疾患のさらなる進行を阻害すること、すなわちその進行を阻止すること、及び（ｂ）疾患を緩和すること、すなわち、疾患もしくは障害の退行を引き起こすこと、またはその症状もしくは合併症を緩和することを含む。本発明の二重特異性抗体は、骨治癒において、例えば、脊椎固定術に対する補助剤として、及び／または骨粗鬆症、骨減少症、変性腰椎脊椎すべり症、変性椎間板疾患、もしくは骨形成不全症の治療において、有用であることが予想される。

【0037】

本明細書において交換可能に使用される「患者」、「対象」、及び「個体」という用語は、ヒトを指す。いくつかの実施形態では、患者は、脊椎固定手技の必要性があると診断された、脊椎固定手技を受けている、または脊椎固定手技を以前に受けたことがある、ヒトである。いくつかの実施形態では、患者は、骨治癒、例えば、骨造成、骨リモデリング、骨折修復、変性による骨喪失の予防を必要とする危険性があるもしくはそれを必要とする、及び／または骨粗鬆症、骨減少症、変性腰椎脊椎すべり症、変性椎間板疾患、もしくは骨形成不全症等の骨障害を発症する危険性があるもしくはその治療を必要とすることを特徴とする、ヒトである。

【0038】

薬学的組成物
本発明の二重特異性抗体化合物は、患者への投与に好適な薬学的組成物に組み込むことができる。本発明の二重特異性抗体化合物は、静脈内、筋肉内、皮下、または腹腔内を含む非経口投与を介した投与が意図される。それに加えて、本発明の二重特異性抗体化合物は、患者に単独で、または薬学的に許容される担体及び／もしくは希釈剤と共に単回用量または複数回用量で、投与することができる。かかる薬学的組成物は、選択された投与様式に適切であるように設計されており、薬学的に許容される希釈剤、担体及び／または分散剤のような賦形剤、緩衝剤、界面活性剤、保存剤、可溶化剤、等張剤、安定化剤などが適宜使用される。該組成物は、開業医には一般的に知られているような製剤化技術の概要を提供する、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ，Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，１９^ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ １９９５に開示されている従来の技術に従って設計することができる。薬学的組成物に好適な担体には、本発明の二重特異性抗体化合物と組み合わせた場合に、分子の活性を保持し、かつ患者の免疫系と非反応性である、任意の材料が含まれる。本発明の薬学的組成物は、二重特異性抗体化合物及び１種以上の薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤を含む。

【0039】

本発明の二重特異性抗体化合物の有効量とは、所望の治療結果を達成するのに必要な量（投薬量及び時間及び投薬手段で）を指す。二重特異性抗体化合物またはその薬学的組成物の有効量は、個体の疾患状態、年齢、性別、及び体重、ならびに個体において所望の応答を誘発する二重特異性抗体化合物またはその部分の能力等の要因に従って変化し得る。有効量はまた、二重特異性抗体化合物の毒性または有害な効果が治療上有益な効果よりも大きいものである。

【実施例】

【0040】

二重特異性抗体の発現及び精製
本発明の例示的な二重特異性抗体は、本質的に以下のように発現及び精製される。配列番号３（例示的な配列番号１の第１のポリペプチド鎖及び翻訳後に切断されるシグナルペプチドをコードする）及び配列番号４（例示的な配列番号２の第２のポリペプチド鎖及び翻訳後に切断されるシグナルペプチドをコードする）のＤＮＡを含むグルタミンシンセターゼ（ＧＳ）発現ベクターを用いて、チャイニーズハムスター細胞株（ＣＨＯ、ＧＳノックアウト）をエレクトロポレーションによりトランスフェクトする。発現ベクターは、ＳＶ Ｅａｒｌｙ（シミアンウイルス４０Ｅ）プロモーター及びＧＳ遺伝子をコードする。ＧＳの発現は、ＣＨＯ細胞によって必要とされるアミノ酸であるグルタミンの生化学的合成を可能にする。トランスフェクション後、細胞を５０μＭ Ｌ−メチオニンスルホキシミン（ＭＳＸ）でバルク選択にかける。ＭＳＸによるＧＳの阻害は、選択のストリンジェンシーを高めるために利用される。宿主細胞ゲノムの転写活性領域への発現ベクターｃＤＮＡの組み込みを有する細胞を、ＣＨＯ野生型細胞に対して選択することができる。トランスフェクトされたプールを、安定した発現細胞のクローン伸長に近づけるようにするために、低密度でプレートする。マスターウェル（ｍａｓｔｅｒｗｅｌｌ）を二重特異性抗体発現についてスクリーニングし、次いで無血清懸濁培養においてスケールアップして、産生に使用する。

【0041】

例示的な二重特異性抗体が分泌された清澄化された培地を、リン酸緩衝化生理食塩水（ｐＨ７．４）などの適合性緩衝液で平衡化されたプロテインＡアフィニティーカラムに適用する。カラムを洗浄して非特異的結合成分を除去する。結合された二重特異性抗体は、例えばｐＨ勾配によって溶出され、例えばトリス、ｐＨ８緩衝液で中和される。二重特異性抗体画分は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥまたは分析的サイズ排除などによって検出され、その後プールされる。可溶性凝集体及び多量体は、サイズ排除、疎水性相互作用、イオン交換、またはヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを含む、一般的な技術によって有効に除去することができる。二重特異性抗体は、一般的な技術を用いて濃縮及び／または滅菌濾過される。これらのクロマトグラフィー工程後の例示的な二重特異性抗体の純度は９８％より大きい（モノマー）。二重特異性抗体は、−７０℃で直ちに凍結するか、または４℃で数ヶ月貯蔵してもよい。

【0042】

本質的に上述の通りの手順に従って発現及び精製した、本発明の例示的な二重特異性抗体化合物を含む、種々の領域及びリンカーの関係が、表１に提示されている（アミノ酸の番号付けは直線的番号付けを適用し、アミノ酸の可変ドメインへの割り当ては、ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇで入手可能なＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）に基づき、アミノ酸のＣＤＲドメインへの割り当ては、周知のＫａｂａｔ及びＮｏｒｔｈ番号付け協定に基づき及び表１の最後に反映される通りである）。

【表1】

【0043】

表１に提示される例示的な二重特異性抗体化合物は、配列番号１のアミノ酸配列を有する２つの第１のポリペプチド鎖及び配列番号２のアミノ酸配列を有する２つの第２のポリペプチド鎖を含む。例示的な二重特異性抗体化合物によれば、第１のポリペプチド鎖の各々は、配列番号１のシステイン残基１３３と配列番号２のシステイン残基２１４との間の第２のポリペプチド鎖の各々との鎖間ジスルフィド結合；他方の第１のポリペプチド鎖との少なくとも２つの鎖間ジスルフィド結合、すなわち、第１のポリペプチド鎖のシステイン残基２２５（配列番号１のもの）と他方の第１のポリペプチド鎖のシステイン残基２２５（配列番号１のもの）との間に形成される第１の鎖間ジスルフィド結合、第１のポリペプチド鎖のシステイン残基２２８（配列番号１のもの）と他方の第１のポリペプチド鎖のシステイン残基２２８（配列番号１のもの）との間に形成される第２の鎖間ジスルフィド結合；各第１のポリペプチド鎖のシステイン残基５０４（配列番号１のもの）とシステイン残基７０６（配列番号１のもの）との間の各第１のポリペプチド鎖のｓｃＦｖ中に形成された鎖内ジスルフィド結合を形成する。さらに、表１に提示される例示的な二重特異性抗体化合物は、両方の第１のポリペプチドの配列番号１のアスパラギン残基２９６でグリコシル化されている。

【0044】

本明細書で別途注記される場合を除いて、実施例全体を通して言及される例示的な二重特異性抗体化合物は、表１に提示される本発明の例示的な二重特異性抗体化合物を指す。

【0045】

二重特異性抗体化合物溶解度及び安定性分析
例示的な二重特異性抗体化合物は、１０ｍＭクエン酸緩衝液ｐＨ５．５または１０ｍＭヒスチジン緩衝液ｐＨ５．５のうちの一方で製剤化する。それぞれの緩衝液に添加する１５０ｍＭ ＮａＣｌ及び０．０２％ Ｔｗｅｅｎ８０の影響もまた評価する。二重特異性抗体化合物は、Ａｍｉｃｏｎ Ｕ．Ｃ．フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ番号ＵＦＣ９０３０２４）を使用して１ｍｇ／ｍＬ及び５０ｍｇ／ｍＬに濃縮する。

【0046】

例示的な二重特異性抗体化合物の安定性を、２５℃で４週間のインキュベーションの後に分析する。パーセント高分子量（％ＨＭＷ）は、ＴＳＫｇｅｌ Ｓｕｐｅｒ ＳＷ３０００（Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ製品番号１８６７５）カラムを使用して、分析サイズ排除クロマトグラフィー（ａＳＥＣ）により評価する。５０ｍＭリン酸ナトリウム＋３５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．０を０．４ｍＬ／分で１５分間移動する移動相として使用する。濃縮した二重特異性抗体化合物の５μＬ（５μｇ）の体積をカラムに注入し、検出を２１４ｎｍで測定する。１μＬ（５０μｇ）の体積をカラムに注入し、２８０ｎｍで検出を測定する。ＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎを使用してクロマトグラムを分析し、全ＡＵＣに対する、モノマーピーク前に溶出したピークのＡＵＣの比を用いて％高分子量（ＨＭＷ）を算出する。これらの結果を表２に要約する（ＮａＣｌ及びＴｗｅｅｎの添加は、結果に対していかなる特記すべき影響も示さなかった）。

【表2】

【0047】

例示的な二重特異性抗体化合物の溶解度を、２５℃で１週間のインキュベーションの後に分析する。溶解度を、１５０ｍｇ／ｍＬに濃縮された二重特異性抗体で評価し（Ａｍｉｃｏｎ Ｕ．Ｃ．フィルター、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ番号ＵＦＣ９０３０２４を使用）、１５０ｍＭ ＮａＣｌを含むｐＨ５．５の１０ｍＭ クエン酸、または１５０ｍＭ ＮａＣｌを含むｐＨ５．５の１０ｍＭ ヒスチジンのいずれかの中に製剤化する。それぞれの緩衝液に添加する０．０２％ Ｔｗｅｅｎ８０の影響もまた評価する。例示的な二重特異性抗体は、少なくとも１４８ｍｇ／ｍＬの溶解度を示し、治療的二重特異性抗体の許容値内であった（Ｔｗｅｅｎの添加は、結果に対していかなる特記すべき影響も示さなかった）。例示的な二重特異性抗体化合物はまた、インキュベーション期間後に相分離がなかった。

【0048】

例示的な二重特異性抗体化合物の粘度を室温で分析する。粘度を、１００ｍｇ／ｍＬに濃縮された二重特異性抗体化合物で評価し（Ａｍｉｃｏｎ Ｕ．Ｃ．フィルター、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ番号ＵＦＣ９０３０２４を使用）、１５０ｍＭ ＮａＣｌを含むｐＨ５．５の１０ｍＭ クエン酸、または１５０ｍＭ ＮａＣｌを含むｐＨ５．５の１０ｍＭ ヒスチジンのいずれかの中に製剤化する。例示的な二重特異性抗体は、クエン酸中に製剤化されたときには３．１２ｃＰの粘度を示し、ヒスチジン中に製剤化されたときには４．８８ｃＰの粘度を示し、治療的二重特異性抗体の許容値内であった。

【0049】

例示的な二重特異性抗体化合物の光安定性分析を、５０ｍｇ／ｍＬの濃縮された二重特異性抗体で評価し、１０ｍＭ ヒスチジン、ｐＨ５．５中に製剤化する。２４００００ルクス時間の可視光または４０ワット−ｈｒ／ｍ^２のＵＶ光に試料を曝露する。対照（「暗」）試料は光に曝露されない。試料を次いで、暗試料と比較した％ＨＭＷの変化についてａＳＥＣカラムで分析する。ＵＶ光に曝露された場合、％ＨＭＷの変化は何ら記録されず、可視光に曝露された場合には、１．６２％のＨＭＷ増加が記録された。それに加えて、ＣＤＲ酸化及び脱アミド化は、可視光曝露（２．８％）及びＵＶ曝露（０．８％）によって有意には増加しない。光安定性測定値は全て、治療的二重特異性抗体の許容値内である。

【0050】

本発明の例示的な二重特異性抗体化合物の凍結解凍分析を、表３に従って行った３回の凍結／解凍サイクルの後に評価する。

【表3】

【0051】

例示的な二重特異性抗体化合物の凍結／解凍分析を、１ｍｇ／ｍＬまたは５ｍｇ／ｍＬの濃縮された二重特異性抗体化合物で評価し、ａ．）０．０２％ Ｔｗｅｅｎ−８０を含む及び含まない１０ｍＭ クエン酸、ｐＨ５．５、またはｂ．）０．０２％ Ｔｗｅｅｎ−８０を含む及び含まない１０ｍＭ ヒスチジン、ｐＨ５．５、のいずれかの中に製剤化する。３回の凍結／解凍サイクル（表３に表す単一サイクル）を行い、各試料の粒子成長をＨＩＡＣ粒子計数器（Ｐａｃｉｆｉｃ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、品番９７０３）を用いて評価する。結果を表４に提供する。

【表4】

【0052】

表４に提供される結果は、本発明の例示的二重特異性抗体化合物が、低濃度及び高濃度の両方の条件下で、複数回の凍結／解凍サイクル後に安定であることを実証する。

【0053】

本明細書に提供される結果は、本明細書に記載されるように製剤化された本発明の例示的な二重特異性抗体化合物が、高タンパク質濃度の溶解度を達成し（１５０ｍｇ／ｍＬを超える）、０．５％未満のＨＭＷ分解を示し、治療的二重特異性抗体の許容値内の粘度及び光安定性を有することを実証する。

【0054】

Ｄｋｋ−１及びＲＡＮＫＬに対する二重特異性抗体結合親和性
ヒトＤｋｋ−１及びヒトＲＡＮＫＬに対する例示的な二重特異性抗体の結合親和性及び結合化学量論を、ＨＢＳ−ＥＰ＋（１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．４＋１５０ｍＭ ＮａＣｌ＋３ｍＭ ＥＤＴＡ＋０．０５％（ｗ／ｖ）界面活性剤Ｐ２０）泳動用緩衝液でプライミングしたＢｉａｃｏｒｅ ２０００計測器での表面プラズモン共鳴アッセイ、及び２５℃に設定した分析温度を用いて決定する。捕捉手法を用いるために、４つ全てのフローセル（Ｆｃ）上に固定化したプロテインＡ（標準的なＮＨＳ−ＥＤＣアミンカップリングを用いて生成）を含むＣＭ５チップ（Ｂｉａｃｏｒｅ、品番ＢＲ−１００５３０）を使用する。抗体試料は、泳動用緩衝液中に希釈することによって０．２〜１０μｇ／ｍＬに調製する。ヒトＤｋｋ−１ 試料は、泳動用緩衝液中に希釈することによって１００ｎＭ、５０ｎＭ、２５ｎＭ、１２．５ｎＭ、６．２５ｎＭ、３．１２５ｎＭ、１．５６２５ｎＭ、０．７８１２５ｎＭ、０．３９０６２５ｎＭ、０．１９５３１２５ｎＭ、及び０（ブランク）ｎＭの最終濃度に調製する。ヒトＲＡＮＫＬは、泳動用緩衝液中に希釈することによって１００ｎＭ、５０ｎＭ、２５ｎＭ、１２．５ｎＭ、６．２５ｎＭ、３．１２５ｎＭ、１．５６２５ｎＭ、０．７８１２５ｎＭ、０．３９０６２５ｎＭ、０．１９５３１２５ｎＭ、及び０（ブランク）ｎＭの最終濃度に調製する。

【0055】

各分析サイクルは、（１）抗体試料を別個のフローセル（Ｆｃ２及びＦｃ３）上に捕捉すること、（２）各ヒトＤｋｋ−１濃度を５０μＬ／分で３００秒間にわたって全てのＦｃ上へ注入、続いて緩衝液フローに１２００秒間にわたって戻して、解離相を監視すること、（３）各ヒトＲＡＮＫＬ濃度を１００μＬ／分で１５０秒間にわたって全てのＦｃ上へ注入、続いて緩衝液フローに１８００秒間にわたって戻して、解離相を監視すること、（４）１０ｍＭ グリシン、ｐＨ１．５を５μＬ／分で１２０秒間にわたって全てのセル上へ注入することによりチップ表面を再生すること、及び（５）１０μＬ（６０秒）のＨＢＳ−ＥＰ＋の注入によりチップ表面を平衡化すること、からなる。データを、標準的な二重参照を用いて処理し、Ｂｉａｃｏｒｅ ２０００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア、バージョン２．０．３を用いて１：１結合モデルに適合させて、会合速度（ｋ_ｏｎ、Ｍ^−１ｓ^−１単位）、解離速度（ｋ_ｏｆｆ、ｓ^−１単位）、及びＲ_ｍａｘ（ＲＵ単位）を決定する。平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）は、関係Ｋ_Ｄ＝ｋ_ｏｆｆ／ｋ_ｏｎから算出し、モル単位である。結果を表５に提供する。

【表5】

【0056】

表５に提供される結果は、本発明の例示的な二重特異性抗体が、２５℃において高い親和性でヒトＲＡＮＫＬ及びヒトＤｋｋ−１に結合することを実証する。

【0057】

インビトロでのルシフェラーゼ活性におけるＤｋｋ−１誘導型低減の中和
ＴＣＦ／ＬＥＦルシフェラーゼレポーターで安定に感染させたマウス前造骨性ＭＣ３Ｔ３Ｅ１／Ｔｏｐｆｌａｓｈ細胞を使用して、表１に提示される例示的な二重特異性抗体の、Ｄｋｋ−１活性を中和する能力を評価する。Ｗｎｔ３ａは、ＴＣＦ／ＬＥＦ調節型ルシフェラーゼ発光を誘導する。ヒトＤｋｋ−１は、Ｗｎｔ３ａ誘導型ＴＣＦ／ＬＥＦルシフェラーゼ発現を遮断する。例示的な二重特異性抗体によるＤｋｋ−１活性の中和を、ルシフェラーゼ発光の回復を定量することにより測定する。

【0058】

ＭＣ３Ｔ３Ｅ１細胞は、１０％ ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、品番１００８２−１４７）及び１倍ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｈｙｃｌｏｎｅ、品番ＳＶ３００１０）を含有するＭＥＭα培地（Ｇｉｂｃｏ、品番Ａ１０４９０−０１）中の１．２５μｇ／ｍｌピューロマイシンの選択的圧力の下で、慣例通りに培養する。ウェル当たり４０，０００個のＭＣ３Ｔ３Ｅ１細胞（１００μＬ中）を、９６ウェルの細胞培養プレートのウェルに添加する（Ｃｏｓｔａｒ、品番３９０３）。細胞を３７℃で一晩インキュベートする（５％ ＣＯ_２及び９５％湿度の下で）。

【0059】

増殖培地中、Ｗｎｔ３ａ（Ｒ＆Ｄ、品番５０３６−ＷＮ）は、０．３３ｕｇ／ｍＬに希釈し、組換えｈＤｋｋ−１は、１ｕｇ／ｍｌに希釈する。Ｗｎｔ３ａ及びｈＤｋｋ−１（それぞれの濃度で）を補充した増殖培地を使用して、ａ．）例示的な二重特異性抗体、ｂ．）Ｄｋｋ−１中和抗体（ＩｇＧ４骨格、及び例示的な二重特異性抗体のｍＡｂ部分と同じ重鎖及び軽鎖可変領域配列を有するＤｋｋ−１抗体）、及びｃ．）ＲＡＮＫＬ中和抗体（例示的な二重特異性抗体のｓｃＦｖ部分と同じＣＤＲ配列を有するＩｇＧ４ ＲＡＮＫＬ ｍＡｂ）に対して、３００ｎＭ〜１．２３ｎＭの用量範囲を調製する。増殖培地は、「培地のみ」及び「Ｗｎｔ３ａを含む培地」対照に使用される。

【0060】

一晩のインキュベーションの後、培地を除去し、細胞を、上述のそれぞれの抗体処理濃度または対照で処理する（二連で）。細胞を次いで、３７℃で３時間及び３０分間インキュベートし、続いて室温で３０分間インキュベートする。インキュベーションの後、処理剤を細胞から除去し、５０μＬのＧｌｏ溶解緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ、品番Ｅ２６６Ａ）を細胞に添加する。細胞を次いで、プレートシェーカーで５〜１０分間、穏やかに撹拌しながら溶解させる。細胞溶解の後、５０μＬのプレミックスＢｒｉｇｈｔ Ｇｌｏルシフェラーゼ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ、品番Ｅ６２０）を添加し、発光をＷａｌｌａｃ Ｖｉｃｔｏｒ １４２０マルチラベルプレートリーダーで測定する。全ての処理群についてのＥＣ_５０値及び信頼区間（ＣＩ）を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６による４パラメータロジスティック回帰モデルを用いて算出する。

【0061】

結果は、本発明の例示的な二重特異性抗体が、Ｗｎｔ３ａ誘導型ＴＣＦ／ＬＥＦルシフェラーゼ活性のヒトＤｋｋ−１による遮断を中和することを実証する。阻害は、陽性対照Ｄｋｋ−１抗体で観察されるものに匹敵する（平均ＥＣ_５０が、例示的な二重特異性抗体について５．３０ｎＭ（ＣＩ＝４．１２〜６．８２ｎＭ）ｎＭ、これに対比して陽性対照Ｄｋｋ−１抗体について６．６１（ＣＩ＝４．９２〜８．８６ｎＭ））。ＲＡＮＫＬ抗体及び培地対照は、試験したいずれの濃度でも、ＭＣ３Ｔ３Ｅ１細胞においてヒトＤｋｋ−１がＷｎｔ３ａ誘導型ＴＣＦ／ＬＥＦルシフェラーゼを遮断するのを中和しない。この結果は、本発明の例示的な二重特異性抗体がＤｋｋ−１を有効に中和することを実証する。

【0062】

インビトロでのＲＡＮＫＬ誘導型のＮＦ−ｋＢ主導型ルシフェラーゼ活性の中和
ヒトＲＡＮＫ及びＮＦ−ｋＢ主導型ルシフェラーゼレポーターを安定に共発現するＨＥＫ２９３細胞を使用して、表１に提示される例示的な二重特異性抗体の、ＲＡＮＫＬ活性を中和する能力を評価する。上述のＨＥＫ２９３細胞モデルにおいて、ＲＡＮＫは、ヒトＲＡＮＫＬが結合すると、ＮＦ−ｋＢシグナル伝達を誘導してルシフェラーゼ発光をもたらす。例示的な二重特異性抗体によるＲＡＮＫへのＲＡＮＫＬ結合の中和を、ルシフェラーゼ発光の低減によって測定する。

【0063】

ＨＥＫ２９３細胞は、７００μｇ／ｍＬ Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ（ＨｙＣｌｏｎｅ、品番ＳＶ３００６９．０１）の選択的圧力の下で、慣例通りに培養する。２５，０００細胞／ウェルを、アッセイ培地（５％ ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、品番１００８２−１４７）、２０ｎＭ Ｈｅｐｅｓ（ＨｙＣｌｏｎｅ、品番ＳＨ３０２３７．０１）、１倍ＧｌｕｔａＭａｘ（Ｇｉｂｃｏ、品番３５０５０−６１）及び１倍ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｈｙｃｌｏｎｅ、品番ＳＶ３００１０）を含有する、（５０μＬ ＤＭＥＭ／Ｆ１２（１：３）培地（Ｇｉｂｃｏ、品番９３０１５２ＤＫ））中、９６ウェルの組織培養プレートのウェルに添加する（Ｂｅｎｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、品番３５４６２０）。細胞を３７℃で（５％ ＣＯ_２及び９５％湿度で）一晩インキュベートする。

【0064】

１００ｎｇ／ｍＬのｈＲＡＮＫＬを含むアッセイ培地を使用して、ａ．）例示的な二重特異性抗体、及びｂ．）ＲＡＮＫＬ中和抗体（例示的な二重特異性抗体のｓｃＦｖ部分と同じＣＤＲ配列を有するＩｇＧ４ ＲＡＮＫＬ ｍＡｂ）の各々に対して、１００ｎＭ〜０．００５ｎＭ（１：３段階希釈を用いて）の用量範囲を調製する。アッセイ培地は、「培地のみ」及び「１００ｎｇ／ｍｌ ＲＡＮＫＬを含む培地」対照に使用される。全ての処理群を室温で３０分間インキュベートした後、細胞に添加する。

【0065】

細胞の一晩のインキュベーションの後、存在する増殖培地を除去する。細胞を、５０μＬの、上記の濃度のうちの１つのそれぞれの抗体処理剤のうちの１つ（３連で）、または増殖培地対照に再懸濁させる。細胞を３７℃で１８時間インキュベートする（５％ ＣＯ２及び９５％湿度の下で）。インキュベーションの後、増殖培地を細胞から除去し、細胞を、１Ｌ １％ Ｔｒｉｔｉｏｎ Ｘ−１００溶解緩衝液（３０ｍＬ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（Ｆｉｓｈｅｒ、品番ＢＰ１５１−５００）、３ｍＬ ＭｇＣｌ（Ｓｉｇｍａ、品番Ｍ９２７２）、１０８．１５ｍＬ １Ｍ Ｔｒｉｚｍａ ＨＣＬ（Ｓｉｇｍａ、品番Ｔ−３２５３）、４１．８５ｍＬ １Ｍ Ｔｒｉｚｍａ Ｂａｓｅ（Ｓｉｇｍａ、品番Ｔ−１５０３）及び８１７ｍＬ Ｈ２Ｏ））中、５０μＬのＢｕｇＬｉｔｅ（２．２９６ｇ ＤＴＴ（Ｓｉｇｍａ、品番Ｄ０６３２）、１．１５２ｇ Ｃｏｅｎｚｙｍｅ Ａ（Ｓｉｇｍａ、品番Ｃ−３０１９）、０．２４８ｇ ＡＴＰ（Ｓｉｇｍａ、品番Ａ７６９９）に再懸濁させる。細胞を次いで、プレートシェーカーで５〜１０分間、穏やかに撹拌しながら溶解させる。細胞溶解の後、発光をＷａｌｌａｃ Ｖｉｃｔｏｒ １４２０マルチラベルプレートリーダーで測定する。全ての処理群についてのＩＣ_５０値を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６による３パラメータロジスティック回帰モデルを用いて算出する。

【0066】

結果は、本発明の例示的な二重特異性抗体が、ヒトＲＡＮＫＬ誘導型のＮＦ−ｋＢ主導型ルシフェラーゼ発光を中和したことを実証する。阻害は、陽性対照ＲＡＮＫＬ抗体で観察されるものに匹敵した（平均ＩＣ_５０が、例示的な二重特異性抗体について１．２０ｎＭ、これに対比して陽性対照ＲＡＮＫＬ抗体について１．３０ｎＭ）。培地対照は、試験したいずれの濃度でも、ＨＥＫ２９３細胞モデルにおいてヒトＲＡＮＫＬ誘導型のＮＦ−ｋＢ主導型ルシフェラーゼ発光を中和しなかった。これらの結果は、発明の例示的な二重特異性抗体がＲＡＮＫＬを有効に中和することを実証する。

【0067】

皮質欠損モデルにおけるインビボ有効性分析
インビボでの骨及び椎骨治癒に対する全身効果を、げっ歯類皮質欠損モデルを用いて評価する。１４週齢のオスの胸腺欠損ヌードラット（Ｈａｒｌａｎ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ））を、食物（０．５％Ｃａ及び０．４％Ｐを含むＴＤ ８９２２２、Ｔｅｋｌａｄ（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ））及び水を自由に与えながら、１２時間の光／暗サイクルにおいて２２℃で維持する。

【0068】

皮質欠損手術を、本質的にＫｏｍａｔｓｕら（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、１５０：１５７０−１５７９、２００９）に記載されるようにマウスに対して行う。簡潔に述べると、０日目、前皮質及び後皮質の両方を貫通する２ｍｍ直径の穴を、左大腿部及び右大腿部の骨幹を通して穿設する。術後１日目、マウスを７つの群に分割し、下記のうちの１つを単回腹腔内注射する：ａ．）１．４ｍｇ／ｋｇの例示的な二重特異性抗体（Ｎ＝９）、ｂ．）４．２ｍｇ／ｋｇの例示的な二重特異性抗体（Ｎ＝９）、ｃ．）１４ｍｇ／ｋｇの例示的な二重特異性抗体（Ｎ＝９）、ｄ．）４２ｍｇ／ｋｇの例示的な二重特異性抗体（Ｎ＝９）、ｅ．）３ｍｇ／ｋｇのＤｋｋ−１アッセイ対照抗体（例示的な二重特異性抗体のｍＡｂ部分と同じ重鎖及び軽鎖可変領域配列を有するＩｇＧ４ Ｄｋｋ−１ ｍＡｂ）（Ｎ＝９）、ｆ．）３ｍｇ／ｋｇのＲＡＮＫＬアッセイ対照抗体（例示的な二重特異性抗体のｓｃＦｖ部分と同じＣＤＲ配列を有するＩｇＧ４ ＲＡＮＫＬ ｍＡｂ）（Ｎ＝９）、及びｇ．）３ｍｇ／ｋｇ ヒトＩｇＧ４陰性対照抗体（Ｎ＝９）。３５日目、マウスを殺処理する。

【0069】

術後７、２１及び３５日時点で、ＧＥ Ｌｏｃｕｓ Ｕｌｔｒａ ＣＴ Ｓｃａｎｎｅｒ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ、Ｏｎｔａｒｉｏ、Ｃａｎａｄａ））を使用した定量的コンピューター断層撮影（ｑＣＴ）によって、全大腿骨の骨密度（ＢＭＤ）をインビボで長手方向に監視する。結果を表６に提供する。同様に、術後７、２１及び３５日時点で、ｑＣＴによって腰椎椎骨５（ＬＶ５）のＢＭＤを監視する。結果を表７に提供する（データは平均±標準誤差として提示、ＤｕｎｎｅｔｔのＴ検定）。

【表6】

【0070】

表６に提示される結果は、本発明の例示的な二重特異性抗体の（４．２ｍｇ／ｋｇ以上の）単回投与が、ＩｇＧ４対照抗体処置ラットと比較して、皮質欠損ＢＭＤを術後２１日目という早期に増加させることを実証する。

【表7】

【0071】

表７に提示される結果は、本発明の例示的な二重特異性抗体の単回投与が、ＩｇＧ４対照抗体処置ラットと比較して、ＬＶ５におけるＢＭＤを術後２１日目という早期に増加させることを実証する。

【0072】

殺処理後、大腿骨の生体力学的破壊時荷重（ｌｏａｄ−ｔｏ−ｆａｉｌｕｒｅ）分析、大腿骨頚部剛性、及び椎骨の破壊時荷重分析を行う。大腿骨の生体力学的破壊時荷重強度及び大腿骨頚部剛性を、大腿骨の近位半分を室温でチャックに垂直に取り付け、破壊するまで大腿骨骨頭に下向きの力をかけることによって分析する。椎骨（ＬＶ５）を、ＭＴＳモデル１／Ｓ材料試験デバイスを使用し、ＴｅｓｔＷｏｒｋｓ ４ソフトウェア（ＭＴＳ Ｃｏｒｐ．）で分析する圧縮試験において、破壊時荷重試験に供する。最終荷重を、椎骨によって支えられる最大力として測定する。結果を表８に提供する。

【表8】

【0073】

表８に提示される結果は、本発明の例示的な二重特異性抗体の単回投与が、ＩｇＧ４対照抗体処置ラットと比較して、大腿骨剛性及び大腿骨頚部強度ならびに椎骨強度を増加させることを実証する。

【0074】

インビボでのオッセオインテグレーション分析
オッセオインテグレーション及びインプラント固定、ならびに椎骨治癒に対する全身効果を、げっ歯類脛骨スクリューインプラントモデルを用いてインビボで評価する。２３週齢のオスＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｓ．，Ｉｎｔ’ｌ Ｉｎｃ．）に、両方の後肢脛骨における内側・外側へのチタンスクリュー（２×４ｍｍ）の外科移植を施す。術後１日目（１日目）、ラットを５つの群に分割し、下記のうちの１つを皮下注射する：ａ．）３ｍｇ／ｋｇのＩｇＧ４陰性対照抗体（Ｎ＝９）、ｂ．）３ｍｇ／ｋｇのＤｋｋ−１アッセイ対照抗体（例示的な二重特異性抗体のｍＡｂ部分と同じ重鎖及び軽鎖可変領域配列を有するＩｇＧ４ Ｄｋｋ−１ ｍＡｂ）（Ｎ＝９）、ｃ．）３ｍｇ／ｋｇのＲＡＮＫＬアッセイ対照抗体（例示的な二重特異性抗体のｓｃＦｖ部分と同じＣＤＲ配列を有するＩｇＧ４ ＲＡＮＫＬ ｍＡｂ）（Ｎ＝９）、ｄ．）４．２ｍｇ／ｋｇの例示的な二重特異性抗体（Ｎ＝９）、ｅ．）１４ｍｇ／ｋｇの例示的な二重特異性抗体（Ｎ＝９）、ならびにｆ．）１日時点及び８日時点の両方で４．２ｍｇ／ｋｇの例示的な二重特異性抗体（Ｎ＝９）。２１日目、ラットを殺処理する。

【0075】

殺処理後、両方の脛骨を各ラットから取り出し、清潔にし、５０／５０エタノール／生理食塩溶液中に固定する。生体力学的破壊時引張（ｐｕｌｌ−ｔｏ−ｆａｉｌｕｒｅ）力試験（１０ｍｍ／分の速度で）を、工業用デジタル式力計測器（Ｍａｒｋ−１０、モデルＭ３−５０、ＥＳＭ３０１、Ｉｎｄｉａｎａ）を使用して、エクスビボで各脛骨に対して行う。それに加えて、全身効果の評価のために、Ｌ５における骨塩含量（ＢＭＣ）変化もまたμＣＴでラットにおいて評価する。インプラントの破壊時引張力評価の結果を表９に提供する（データは平均±標準誤差として提示、ＤｕｎｎｅｔｔのＴ検定）。Ｌ５におけるＢＭＣ変化の結果は、表１０に提供する（データは平均±標準誤差として提示、ＤｕｎｎｅｔｔのＴ検定）。

【表9】

【0076】

表９に提示される結果は、表１に提示される例示的な二重特異性抗体の単回投与及び複数回投与が、ＩｇＧ４対照抗体処置ラットと比較して、インプラントの破壊時引張力を濃度（及び頻度）依存的様式で増加させることを実証する。このデータは、例示的な二重特異性抗体がオッセオインテグレーション及びインプラント固定を向上させるという知見を支持する。

【表10】

【0077】

表１０に提示される結果は、本発明の二重特異性抗体の単回投与が、ＩｇＧ４対照抗体処置ラットと比較して、脛骨インプラント後のＬ５のＢＭＣを改善する全身効果を実証することを実証する。

【0078】

腰椎後方融合モデルにおけるインビボ有効性分析
脊椎固定モデルにおけるインビボでの骨及び椎骨治癒に対する全身効果を、げっ歯類腰椎後方融合モデルを用いて評価する。４５０〜５３０ｇの質量を有する１４週齢のオスのＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｓ．，Ｉｎｔ’ｌ Ｉｎｃ．）に左腸骨稜手術を施して、０．５×０．５ｃｍの自家移植片を採取する。移植片を採取した同じラットにおいて、骨移植片を、皮質剥離した腰椎椎骨５及び６（Ｌ５及びＬ６）横突起に即座に移植する。第１の研究（研究１）において、総計４８匹のラットに移植手術を施し、第２の研究（研究２）においては、総計６０ラットに移植手術を施す。手術の当日（０日目）、デジタル放射線画像を撮影して、移植片の位置付けを確実にする。

【0079】

術後３日目、研究１の移植群ラットを４つの群に分割し、下記のうちの１つを単回皮下注射する：ａ．）５ｍｇ／ｋｇのＩｇＧ４陰性対照抗体（Ｎ＝１２）、ｂ．）５ｍｇ／ｋｇのＤｋｋ−１アッセイ対照抗体（例示的な二重特異性抗体のｍＡｂ部分と同じ重鎖及び軽鎖可変領域配列を有するＩｇＧ４ Ｄｋｋ−１ ｍＡｂ）（Ｎ＝１２）、ｃ．）５ｍｇ／ｋｇのＲＡＮＫＬアッセイ対照抗体（例示的な二重特異性抗体のｓｃＦｖ部分と同じＣＤＲ配列を有するＩｇＧ４ ＲＡＮＫＬ ｍＡｂ）（Ｎ＝１２）、及びｄ．）７．２ｍｇ／ｋｇのＤｋｋ−１／ＲＡＮＫＬ二重特異性抗体（Ｌ１、Ｌ２、ならびにＨＣＶＲ２及びＬＣＶＲ２についてのフレームワークアミノ酸配列において表１の例示的な二重特異性抗体から若干変化させた）（Ｎ＝１２）。２８日目、ラットを殺処理する。

【0080】

術後３日目、研究２の移植群ラットを５つの群に分割し、下記のうちの１つを単回皮下注射する：ａ．）１ｍｇ／ｋｇのＩｇＧ４陰性対照抗体（Ｎ＝１２）、ｂ．）１ｍｇ／ｋｇのＤｋｋ−１アッセイ対照抗体（例示的な二重特異性抗体のｍＡｂ部分と同じ重鎖及び軽鎖可変領域配列を有するＩｇＧ４ Ｄｋｋ−１ ｍＡｂ）（Ｎ＝１２）、ｃ．）１ｍｇ／ｋｇのＲＡＮＫＬアッセイ対照抗体（例示的な二重特異性抗体のｓｃＦｖ部分と同じＣＤＲ配列を有するＩｇＧ４ ＲＡＮＫＬ ｍＡｂ）（Ｎ＝１２）、ｄ．）１．４ｍｇ／ｋｇのＤｋｋ−１／ＲＡＮＫＬ二重特異性抗体（Ｌ１、Ｌ２、ならびにＨＣＶＲ２及びＬＣＶＲ２についてのフレームワークアミノ酸配列において表１の例示的な二重特異性抗体から若干変化させた）（Ｎ＝１２）、及びｅ．）７．２ｍｇ／ｋｇのＤｋｋ−１／ＲＡＮＫＬ二重特異性抗体（Ｌ１、Ｌ２、ならびにＨＣＶＲ２及びＬＣＶＲ２についてのフレームワークアミノ酸配列において表１の例示的な二重特異性抗体から若干変化させた）（Ｎ＝１２）。２８日目、ラットを殺処理する。

【0081】

殺処理後、全てのラットを脊椎融合率及び質について評価する。研究１の移植群ラットを、腰椎椎骨３（Ｌ３、非移植椎骨）におけるＢＭＤ変化についてμＣＴで評価して、全身の骨効果を評価する。脊椎融合率及び質を、ボクセル当たり３６μｍの解像度で、３ＤマイクロＣＴ画像（μＣＴ４０）を使用して評価する。得られた３Ｄ画像を使用して、次の採点システムを用いて骨組織融合を評価する：０＝融合なし、３＝部分的融合、及び５＝全体的融合。融合率は、各群における部分的融合スコア及び全体的融合スコアを合わせたパーセンテージである。脊椎融合率及び質（Ｌ５及びＬ６における）の結果を表１１に提供する（データは平均スコア±標準誤差として提示、Ｆｉｓｈｅｒの正確確率検定）。Ｌ３におけるＢＭＤ変化の結果（研究１の移植群における）を表１２に提供する（データは平均±標準誤差として提示、ＤｕｎｎｅｔｔのＴ検定）。

【表11】

【0082】

表１１に提示される結果は、本発明の二重特異性抗体の単回投与が、ＩｇＧ４対照抗体処置ラットと比較して、腰椎後方融合部位における融合率及び質を術後２８日目という早期に増加させることを実証する。

【表12】

【0083】

表１２に提示される結果は、本発明の二重特異性抗体の単回投与が、ＩｇＧ４対照抗体処置ラットと比較して、腰椎後方融合手技後の隣接する椎骨のＢＭＤを術後２８日目という早期に改善する全身効果を実証することを実証する。

配列

【0084】

配列番号１−（表１の例示的な二重特異性抗体化合物の）例示的な第１のポリペプチド
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＴＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＴＩＳＧＧＧＦＧＴＹＹＰＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＰＧＹＮＮＹＹＦＤＩＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＡＦＴＮＹＹＩＥＷＶＲＱＡＰＧＱＣＬＥＷＭＧＶＩＮＰＧＷＧＤＴＮＹＮＥＫＦＫＧＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＲＤＴＡＨＧＹＹＡＬＤＰＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＡＳＱＮＶＧＴＮＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＡＳＹＲＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＹＷＤＹＰＬＴＦＧＣＧＴＫＶＥＩＫ

【0085】

配列番号２−（表１の例示的な二重特異性抗体化合物の）例示的な第２のポリペプチド
ＥＩＶＬＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＨＡＳＤＳＩＳＮＳＬＨＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＹＡＲＱＳＩＱＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＳＥＳＷＰＬＨＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ

【0086】

配列番号３−例示的な第１のポリペプチド（配列番号１）及びシグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列
ａｔｇｇａｇａｃｇｇａｃａｃｔｃｔｃｃｔｃｃｔｇｔｇｇｇｔａｔｔｇｃｔｃｃｔｔｔｇｇｇｔｃｃｃｔｇｇｔｔｃｔａｃａｇｇｇｇａｇｇｔａｃａｇｃｔｇｇｔａｇａａａｇｃｇｇｔｇｇｇｇｇａｔｔｇｇｔａｃａａｃｃａｇｇｔｇｇａｔｃｔｃｔｃｃｇｇｔｔｇｔｃａｔｇｔｇｃａｇｃｔａｇｔｇｇｇｔｔｔａｃｃｔｔｃｔｃｃａｇｔｔａｔａｃｇａｔｇｔｃｔｔｇｇｇｔｇａｇａｃａａｇｃｇｃｃｃｇｇｔａａａｇｇａｔｔｇｇａｇｔｇｇｇｔｃｇｃａａｃｃａｔｃａｇｔｇｇａｇｇａｇｇｇｔｔｔｇｇａａｃａｔａｃｔａｃｃｃｔｇａｔａｇｃｇｔｔａａｇｇｇｇｃｇｇｔｔｔａｃｃａｔａａｇｃａｇａｇａｔａａｃｇｃｇａａｇａａｃｔｃｔｃｔｃｔａｃｃｔｔｃａａａｔｇａａｃｔｃｔｃｔｇｃｇｇｇｃｔｇａａｇａｔａｃａｇｃｔｇｔｇｔａｔｔａｔｔｇｃｇｃｃｃｇｃｃｃｔｇｇｇｔａｔａａｃａａｔｔａｃｔａｃｔｔｃｇａｔａｔｔｔｇｇｇｇｃｃａａｇｇｇａｃａａｃｃｇｔａａｃｃｇｔｇｔｃｔａｇｃｇｃｔｔｃａａｃｔａａｇｇｇｔｃｃａａｇｃｇｔｇｔｔｃｃｃｔｔｔｇｇｃａｃｃｃｔｇｃａｇｃａｇａａｇｃａｃｇｔｃｃｇａｇｔｃｔａｃｃｇｃｔｇｃｔｔｔｇｇｇｃｔｇｔｃｔｃｇｔｃａａｇｇａｃｔａｃｔｔｃｃｃｃｇａａｃｃａｇｔｔａｃｔｇｔｔｔｃｔｔｇｇａａｃｔｃｔｇｇｔｇｃａｃｔｃａｃａａｇｔｇｇｇｇｔｃｃａｔａｃｇｔｔｃｃｃｃｇｃｃｇｔｔｔｔｇｃａａｔｃｃａｇｃｇｇｇｔｔｇｔａｃｔｃｔｃｔｔｔｃａｔｃｃｇｔｇｇｔｃａｃｔｇｔｔｃｃｔａｇｃｔｃｃａｇｃｃｔｃｇｇｃａｃｔａａａａｃｔｔａｃａｃｔｔｇｔａａｔｇｔａｇａｃｃａｔａａｇｃｃｃａｇｃａａｃａｃｃａａｇｇｔｇｇａｔａａｇａｇａｇｔｃｇａｇｔｃｃａａｇｔａｃｇｇｃｃｃｔｃｃｔｔｇｔｃｃｔｃｃａｔｇｔｃｃｔｇｃｇｃｃｇｇａｇｇｃｃｇｃｃｇｇａｇｇａｃｃｔｔｃｔｇｔｇｔｔｃｃｔｔｔｔｔｃｃａｃｃａａａａｃｃｔａａａｇａｃａｃｃｃｔｔａｔｇａｔａｔｃｃｃｇａａｃｔｃｃｃｇａｇｇｔａａｃｇｔｇｃｇｔｇｇｔａｇｔｃｇａｔｇｔａａｇｃｃａｇｇａａｇａｔｃｃｃｇａａｇｔｃｃａｇｔｔｃａａｔｔｇｇｔａｃｇｔｔｇａｃｇｇｃｇｔｃｇａａｇｔｃｃａｃａａｔｇｃｔａａｇａｃａａａａｃｃｃａｇｇｇａａｇａｇｃａｇｔｔｃａａｃａｇｃａｃｃｔａｔｃｇｃｇｔａｇｔｇａｇｃｇｔａｃｔｇａｃｃｇｔｇｃｔｔｃａｃｃａａｇａｃｔｇｇｃｔｃａａｃｇｇｔａａｇｇａａｔａｔａａａｔｇｔａａｇｇｔｔｔｃｃａａｔａａａｇｇｃｃｔｇｃｃｃａｇｃｔｃａａｔｔｇａｇａａａａｃｃａｔａｔｃｃａａａｇｃｔａａｇｇｇｇｃａａｃｃｔｃｇａｇａａｃｃａｃａｇｇｔｔｔａｃａｃａｃｔｔｃｃｔｃｃａｔｃａｃａｇｇａｇｇａａａｔｇａｃｇａａａａａｔｃａｇｇｔｔａｇｃｃｔｇａｃｔｔｇｔｃｔｃｇｔｔａａａｇｇａｔｔｔｔａｔｃｃａｔｃｔｇａｔａｔｔｇｃｃｇｔａｇａａｔｇｇｇａｇａｇｔａａｔｇｇａｃａｇｃｃｔｇａｇａａｔａａｃｔａｔａａｇａｃｃａｃａｃｃａｃｃｃｇｔｃｃｔｃｇａｃｔｃｔｇａｃｇｇｃｔｃａｔｔｃｔｔｃｃｔｇｔａｔｔｃｔｃｇｃｔｔｇａｃｇｇｔｇｇａｃａａｇａｇｃａｇａｔｇｇｃａｇｇａａｇｇｇａａｃｇｔｇｔｔｔｔｃｔｔｇｃａｇｔｇｔｇａｔｇｃａｃｇａｇｇｃａｃｔｇｃａｔａａｔｃａｔｔａｃａｃａｃａｇａａｇｔｃｔｔｔｇｔｃｃｃｔｇｔｃａｃｔｇｇｇｔｇｇｃｇｇａｇｇａｇｇｔｔｃａｇｇａｇｇｔｇｇｇｇｇｃａｇｔｇｇｃｇｇｃｇｇａｇｇｃｔｃａｃａｇｇｔｃｃａｇｃｔｔｇｔｃｃａｇｔｃｔｇｇｇｇｃａｇａｇｇｔｇａａｇａａｇｃｃｃｇｇｇａｇｔａｇｔｇｔｇａａｇｇｔｃａｇｃｔｇｔａａｇｇｃｇｔｃａｇｇｇｔａｃｇｃｔｔｔｔａｃｔａａｔｔａｃｔａｃａｔｔｇａａｔｇｇｇｔｇａｇａｃａｇｇｃｔｃｃａｇｇｃｃａｇｔｇｔｃｔｔｇａｇｔｇｇａｔｇｇｇｃｇｔｇａｔｔａａｔｃｃａｇｇｃｔｇｇｇｇｔｇａｃａｃｔａａｔｔａｃａａｔｇａｇａａｇｔｔｃａａａｇｇｇｃｇｇｇｔｇａｃｔａｔｃａｃｇｇｃａｇａｔａａｇｔｃｔａｃｔｔｃｃａｃｔｇｃｔｔａｔａｔｇｇａｇｃｔｃｔｃｃｔｃｃｃｔｇａｇｇａｇｃｇａａｇａｃａｃｃｇｃｔｇｔｔｔａｔｔａｔｔｇｔｇｃｃｃｇｇｃｇａｇａｔａｃａｇｃｃｃａｔｇｇｇｔａｔｔａｔｇｃｃｃｔｃｇａｔｃｃａｔｇｇｇｇｃｃａｇｇｇｃａｃｇａｃａｇｔｔａｃｃｇｔｇａｇｃｔｃｃｇｇａｇｇａｇｇａｇｇｇａｇｃｇｇｇｇｇｃｇｇｇｇｇａｔｃｔｇｇａｇｇａｇｇａｇｇａａｇｔｇｇａｇｇｔｇｇａｇｇｇｔｃｔｇｇｇｇｇａｇｇｃｇｇａａｇｃｇａｔａｔｃｃａｇａｔｇａｃｔｃａａａｇｃｃｃｔａｇｔｔｃｃｔｔｇａｇｃｇｃｃｔｃｔｇｔｇｇｇｃｇａｃａｇａｇｔｇａｃａａｔａａｃｃｔｇｔａａａｇｃａｔｃａｃａａａａｃｇｔｇｇｇｃａｃｃａａｃｇｔｇｇｃｇｔｇｇｔａｔｃａａｃａａａａａｃｃｔｇｇｃａａｇｇｃｇｃｃｔａａｇｔｔｇｃｔｇａｔｔｔａｔａｇｔｇｃａｔｃｔｔａｃａｇｇｔａｔｔｃａｇｇｇｇｔｇｃｃｃｔｃｃａｇａｔｔｔａｇｔｇｇｃａｇｔｇｇｃａｇｃｇｇａａｃｃｇａｔｔｔｃａｃｔｃｔｃａｃａａｔａａｇｃｔｃｔｃｔｔｃａｇｃｃａｇａｇｇａｃｔｔｃｇｃｇａｃｇｔａｔｔａｔｔｇｃｃａａｃａｇｔａｔｔｇｇｇａｃｔａｔｃｃａｃｔｇａｃｔｔｔｃｇｇｔｔｇｔｇｇａａｃａａａｇｇｔｔｇａｇａｔｃａａｇ

【0087】

配列番号４−例示的な第２のポリペプチド（配列番号２）及びシグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列
ａｔｇｇａｇａｃａｇａｃａｃａｃｔｃｃｔｇｃｔａｔｇｇｇｔａｃｔｇｃｔｇｃｔｃｔｇｇｇｔｔｃｃａｇｇａｔｃｃａｃｔｇｇｔｇａａａｔｔｇｔｇｔｔｇａｃａｃａｇｔｃｔｃｃａｇｃｃａｃｃｃｔｇｔｃｔｔｔｇｔｃｔｃｃａｇｇｇｇａａａｇａｇｃｃａｃｃｃｔｃｔｃｃｔｇｃｃａｃｇｃｃａｇｃｇａｃａｇｔａｔｔａｇｃａａｃａｇｃｃｔａｃａｃｔｇｇｔａｃｃａａｃａｇａａａｃｃｔｇｇｃｃａｇｇｃｔｃｃｃａｇｇｃｔｃｃｔｃａｔｃｔａｔｔａｔｇｃｔａｇａｃａｇｔｃｃａｔｃｃａｇｇｇｃａｔｃｃｃａｇｃｃａｇｇｔｔｃａｇｔｇｇｃａｇｔｇｇｇｔｃｔｇｇｇａｃａｇａｃｔｔｃａｃｔｃｔｃａｃｃａｔｃａｇｃａｇｃｃｔａｇａｇｃｃｔｇａａｇａｔｔｔｔｇｃａｇｔｔｔａｔｔａｃｔｇｔｃａａｃａｇａｇｔｇａｇａｇｃｔｇｇｃｃｇｃｔｃｃａｃｔｔｃｇｇｃｇｇａｇｇｇａｃｃａａｇｇｔｇｇａｇａｔｃａａａｃｇａａｃｔｇｔｇｇｃｔｇｃａｃｃａｔｃｔｇｔｃｔｔｃａｔｃｔｔｃｃｃｇｃｃａｔｃｔｇａｔｇａｇｃａｇｔｔｇａａａｔｃｔｇｇａａｃｔｇｃｃｔｃｔｇｔｔｇｔｇｔｇｃｃｔｇｃｔｇａａｔａａｃｔｔｃｔａｔｃｃｃａｇａｇａｇｇｃｃａａａｇｔａｃａｇｔｇｇａａｇｇｔｇｇａｔａａｃｇｃｃｃｔｃｃａａｔｃｇｇｇｔａａｃｔｃｃｃａｇｇａｇａｇｔｇｔｃａｃａｇａｇｃａｇｇａｃａｇｃａａｇｇａｃａｇｃａｃｃｔａｃａｇｃｃｔｃａｇｃａｇｃａｃｃｃｔｇａｃｇｃｔｇａｇｃａａａｇｃａｇａｃｔａｃｇａｇａａａｃａｃａａａｇｔｃｔａｃｇｃｃｔｇｃｇａａｇｔｃａｃｃｃａｔｃａｇｇｇｃｃｔｇａｇｃｔｃｇｃｃｃｇｔｃａｃａａａｇａｇｃｔｔｃａａｃａｇｇｇｇａｇａｇｔｇｃ

【0088】

配列番号５−（表１の例示的な二重特異性抗体化合物の）例示的なＨＣＶＲ１
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＴＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＴＩＳＧＧＧＦＧＴＹＹＰＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＰＧＹＮＮＹＹＦＤＩＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ

【0089】

配列番号６−（表１の例示的な二重特異性抗体化合物の）例示的なＨＣＶＲ２
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＡＦＴＮＹＹＩＥＷＶＲＱＡＰＧＱＣＬＥＷＭＧＶＩＮＰＧＷＧＤＴＮＹＮＥＫＦＫＧＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＲＤＴＡＨＧＹＹＡＬＤＰＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ

【0090】

配列番号７−（表１の例示的な二重特異性抗体化合物の）例示的なＬＣＶＲ１
ＥＩＶＬＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＨＡＳＤＳＩＳＮＳＬＨＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＹＡＲＱＳＩＱＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＳＥＳＷＰＬＨＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ

【0091】

配列番号８−（表１の例示的な二重特異性抗体化合物の）例示的なＬＣＶＲ２
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＡＳＱＮＶＧＴＮＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＡＳＹＲＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＹＷＤＹＰＬＴＦＧＣＧＴＫＶＥＩＫ

【0092】

配列番号９−（表１の例示的な二重特異性抗体化合物の）例示的なＨＣＤＲ１
ＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＴＭＳ

【0093】

配列番号１０−（表１の例示的な二重特異性抗体化合物の）例示的なＨＣＤＲ２
ＴＩＳＧＧＧＦＧＴＹＹＰＤＳＶＫＧ

【0094】

配列番号１１−（表１の例示的な二重特異性抗体化合物の）例示的なＨＣＤＲ３
ＡＲＰＧＹＮＮＹＹＦＤＩ

【0095】

配列番号１２−（表１の例示的な二重特異性抗体化合物の）例示的なＨＣＤＲ４
ＫＡＳＧＹＡＦＴＮＹＹＩＥ

【0096】

配列番号１３−（表１の例示的な二重特異性抗体化合物の）例示的なＨＣＤＲ５
ＶＩＮＰＧＷＧＤＴＮＹＮＥＫＦＫＧ

【0097】

配列番号１４−（表１の例示的な二重特異性抗体化合物の）例示的なＨＣＤＲ６
ＡＲＲＤＴＡＨＧＹＹＡＬＤＰ

【0098】

配列番号１５−（表１の例示的な二重特異性抗体化合物の）例示的なＬＣＤＲ１
ＨＡＳＤＳＩＳＮＳＬＨ

【0099】

配列番号１６−（表１の例示的な二重特異性抗体化合物の）例示的なＬＣＤＲ２
ＹＹＡＲＱＳＩＱ

【0100】

配列番号１７−（表１の例示的な二重特異性抗体化合物の）例示的なＬＣＤＲ３
ＱＱＳＥＳＷＰＬＨ

【0101】

配列番号１８−（表１の例示的な二重特異性抗体化合物の）例示的なＬＣＤＲ４
ＫＡＳＱＮＶＧＴＮＶＡ

【0102】

配列番号１９−（表１の例示的な二重特異性抗体化合物の）例示的なＬＣＤＲ５
ＹＳＡＳＹＲＹＳ

【0103】

配列番号２０−（表１の例示的な二重特異性抗体化合物の）例示的なＬＣＤＲ６
ＱＱＹＷＤＹＰＬＴ

【0104】

配列番号２１−（表１の例示的な二重特異性抗体化合物の）例示的なＬ１
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ

【0105】

配列番号２２−（表１の例示的な二重特異性抗体化合物の）例示的なＬ２
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ

本発明は、以下の態様を含む。
［１］
２つの第１のポリペプチド鎖と、２つの第２のポリペプチド鎖とを含む二重特異性抗体化合物であって、それぞれ
ａ．）前記第１のポリペプチド鎖は、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）及びｍＡｂ ＩｇＧ重鎖（ＨＣ）を含み、前記ＨＣは重鎖ＣＤＲ（ＨＣＤＲ）１〜３を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ１）を有し、ＨＣＤＲ１のアミノ酸配列は配列番号９であり、ＨＣＤＲ２のアミノ酸配列は配列番号１０であり、ＨＣＤＲ３のアミノ酸配列は配列番号１１であり、前記ｓｃＦｖは重鎖可変領域（ＨＣＶＲ２）及び軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ２）を有し、ＨＣＶＲ２はＨＣＤＲ４〜６を含み、ＬＣＶＲ２はＬＣＤＲ４〜６を含み、ＨＣＤＲ４のアミノ酸配列は配列番号１２であり、ＨＣＤＲ５のアミノ酸配列は配列番号１３であり、ＨＣＤＲ６のアミノ酸配列は配列番号１４であり、ＬＣＤＲ４のアミノ酸配列は配列番号１８であり、ＬＣＤＲ５のアミノ酸配列は配列番号１９であり、ＬＣＤＲ６のアミノ酸配列は配列番号２０であり、
ｂ．）前記第２のポリペプチドは、軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ）１〜３を含むｍＡｂ軽鎖（ＬＣ）を含み、ＬＣＤＲ１のアミノ酸配列は配列番号１５であり、ＬＣＤＲ２のアミノ酸配列は配列番号１６であり、ＬＣＤＲ３のアミノ酸配列は配列番号１７であり、
各ｓｃＦｖは、独立して、ＨＣのＮ末端及びＬＣＶＲ２のＣ末端に共有結合しているポリペプチドリンカー（Ｌ１）を介して前記ＨＣに連結され、ＬＣＶＲ２は、ＬＣＶＲ２のＣ末端及びＨＣＶＲ２のＮ末端に共有結合している第２のポリペプチドリンカー（Ｌ２）を介して同じｓｃＦｖのＨＣＶＲ２に連結される、二重特異性抗体化合物。
［２］
ＨＣＶＲ１のアミノ酸配列が配列番号５であり、ＬＣＶＲ１のアミノ酸配列が配列番号７であり、ＨＣＶＲ２のアミノ酸配列が配列番号６であり、ＬＣＶＲ２のアミノ酸配列が配列番号８である、［１］に記載の二重特異性抗体化合物。
［３］
Ｌ１のアミノ酸配列が配列番号２１であり、Ｌ２のアミノ酸配列が配列番号２２である、［１］及び［２］のいずれかに記載の二重特異性抗体化合物。
［４］
２つの第１のポリペプチド鎖及び２つの第２のポリペプチド鎖を含む二重特異性抗体化合物であって、前記第１のポリペプチドの各々のアミノ酸配列が配列番号１であり、前記第２のポリペプチドの各々のアミノ酸配列が配列番号２である、二重特異性抗体化合物。
［５］
配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチド鎖をコードするポリヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子。
［６］
配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチド鎖をコードするポリヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子。
［７］
配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチド鎖をコードするポリヌクレオチド配列を含み、かつ配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチド鎖をコードするポリヌクレオチド配列を含む、ＤＮＡ分子。
［８］
［５］に記載のＤＮＡ分子及び［６］に記載のＤＮＡ分子を含む哺乳動物細胞であって、前記細胞は、配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチド鎖及び配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチド鎖を発現することができる、哺乳動物細胞。
［９］
前記哺乳動物細胞がＣＨＯである、［８］に記載の哺乳動物細胞。
［１０］
［７］に記載のＤＮＡ分子を含む哺乳動物細胞であって、前記細胞は、配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチド鎖及び配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチド鎖を発現することができる、哺乳動物細胞。
［１１］
前記哺乳動物細胞がＣＨＯである、［１０］に記載の哺乳動物細胞。
［１２］
アミノ酸配列が配列番号１であるポリペプチド及びアミノ酸配列が配列番号２であるポリペプチドを含む二重特異性抗体化合物を産生するためのプロセスであって、前記二重特異性抗体化合物が発現されるような条件下で［８］または［１０］に記載の哺乳動物細胞を培養することと、前記発現された二重特異性抗体化合物を回収することとを含む、プロセス。
［１３］
［１２］に記載のプロセスによって産生される二重特異性抗体化合物。
［１４］
骨障害を治療する方法であって、それを必要とする患者に、治療有効量の、［１］〜［４］及び［１３］のいずれかに記載の二重特異性抗体化合物を投与することを含む、方法。
［１５］
脊椎固定の患者を治療する方法であって、前記患者に、治療有効量の、［１］〜［４］及び［１３］のいずれかに記載の二重特異性抗体化合物を投与することを含む、方法。
［１６］
骨粗鬆症、骨減少症、腰椎変性すべり症、変性椎間板疾患、または骨形成不全症のうちの少なくとも１つを治療する方法であって、それを必要とする患者に、治療有効量の、［１］〜［４］及び［１３］のいずれかに記載の二重特異性抗体化合物を投与することを含む、方法。
［１７］
治療に使用するための、［１］〜［４］及び［１３］のいずれかに記載の二重特異性抗体化合物。
［１８］
脊椎固定療法に対する補助剤として使用するための、［１］〜［４］及び［１３］のいずれかに記載の二重特異性抗体化合物。
［１９］
骨治癒において、または骨粗鬆症、骨減少症、腰椎変性すべり症、変性椎間板疾患、もしくは骨形成不全症のうちの少なくとも１つの治療において使用するための、［１］〜［４］及び［１３］のいずれかに記載の二重特異性抗体化合物。
［２０］
［１］〜［４］及び［１３］のいずれかに記載の二重特異性抗体化合物及び１種以上の薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤を含む、薬学的組成物。
［２１］
脊椎固定の患者の治療のための薬剤の製造における、［１］〜［４］及び［１３］のいずれかに記載の二重特異性抗体化合物の使用。
［２２］
骨障害の治療のための薬剤の製造における、［１］〜［４］及び［１３］のいずれかに記載の二重特異性抗体化合物の使用。
［２３］
骨粗鬆症、骨減少症、腰椎変性すべり症、変性椎間板疾患、または骨形成不全症のうちの少なくとも１つの治療のための薬剤の製造における、［１］〜［４］及び［１３］のいずれかに記載の二重特異性抗体化合物の使用。

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]