特許 6568796 角層の保湿状態の評価方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6568796

(24)【登録日】2019年8月9日

(45)【発行日】2019年8月28日

(54)【発明の名称】角層の保湿状態の評価方法

(51)【国際特許分類】

   G01N 21/3563 20140101AFI20190819BHJP

【ＦＩ】

   G01N21/3563

【請求項の数】9

【全頁数】16

(21)【出願番号】特願2015-256619(P2015-256619)

(22)【出願日】2015年12月28日

(65)【公開番号】特開2016-224025(P2016-224025A)

(43)【公開日】2016年12月28日

【審査請求日】2018年9月20日

(31)【優先権主張番号】特願2015-106325(P2015-106325)

(32)【優先日】2015年5月26日

(33)【優先権主張国】JP

(73)【特許権者】

【識別番号】000000918

【氏名又は名称】花王株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】110000084

【氏名又は名称】特許業務法人アルガ特許事務所

(74)【代理人】

【識別番号】100077562

【弁理士】

【氏名又は名称】高野 登志雄

(74)【代理人】

【識別番号】100096736

【弁理士】

【氏名又は名称】中嶋 俊夫

(74)【代理人】

【識別番号】100117156

【弁理士】

【氏名又は名称】村田 正樹

(74)【代理人】

【識別番号】100111028

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 博人

(72)【発明者】

【氏名】蘇木 佳彦

(72)【発明者】

【氏名】内藤 智

【審査官】 中澤 真吾

(56)【参考文献】

【文献】 特開２０１０−２５６１０４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１４−４８２５３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表平１１−５０６６２４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 米国特許出願公開第２０１３／６２５２３（ＵＳ，Ａ１）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｇ０１Ｎ １／００−１／４４

２１／００−２１／０１

２１／１７−２１／６１

３３／４８−３３／９８

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＩＲスペクトルにより角層の保湿状態を評価する方法であって、（１）測定対象の角層のＩＲスペクトル（スペクトル１）を測定し、（２）前記角層を４０％以上７５％以下の重水湿度下で７分以上４０分以下処理し、（３）重水処理後の角層のＩＲスペクトル（スペクトル２）を測定し、（４）ＩＲスペクトル中のアミドＩの強度に対するアミドIIの強度について、スペクトル１とスペクトル２の比を指標として評価する方法。

【請求項2】

測定対象の角層が、１５００〜１７００ｃｍ^-1の光を９５％以上透過し、角層を粘着し得る樹脂フィルムを用いて、ヒト皮膚から採取した角層である請求項１記載の評価方法。

【請求項3】

スペクトル１及びスペクトル２の測定が、ＩＲ透過光を測定するものである請求項１又は２記載の評価方法。

【請求項4】

ＩＲスペクトルにより角層ケラチンの分散性を定量評価する方法であって、（１）測定対象の角層のＩＲスペクトル（スペクトル１）を測定し、（２）前記角層を４０％以上７５％以下の重水湿度下で７分以上４０分以下処理し、（３）重水処理後の角層のＩＲスペクトル（スペクトル２）を測定し、（４）ＩＲスペクトル中のアミドＩの強度に対するアミドIIの強度について、スペクトル１とスペクトル２の比を指標として評価する方法。

【請求項5】

測定対象の角層が、１５００〜１７００ｃｍ^-1の光を９５％以上透過し、角層を粘着し得る樹脂フィルムを用いて、ヒト皮膚から採取した角層である請求項４記載の評価方法。

【請求項6】

スペクトル１及びスペクトル２の測定が、ＩＲ透過光を測定するものである請求項４又は５記載の評価方法。

【請求項7】

ＩＲスペクトルにより角層に対する化粧料の保湿性能、ケラチン分散効果、皮膚の形状変化抑制性能又は皮膚のつっぱり感抑制性能を評価する方法であって、（１）測定対象の角層のＩＲスペクトル（スペクトル１）を測定し、（２）前記角層を４０％以上７５％以下の重水湿度下で７分以上４０分以下処理し、（３）重水処理後の角層のＩＲスペクトル（スペクトル２）を測定し、（４）ＩＲスペクトル中のアミドＩの強度に対するアミドIIの強度について、スペクトル１とスペクトル２の比を指標として評価する方法。

【請求項8】

測定対象の角層が、１５００〜１７００ｃｍ^-1の光を９５％以上透過し、角層を粘着し得る樹脂フィルムを用いて、ヒト皮膚から採取した角層である請求項７記載の評価方法。

【請求項9】

スペクトル１及びスペクトル２の測定が、ＩＲ透過光を測定するものである請求項７又は８記載の評価方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、角層の保湿状態、角層ケラチンの分散性、化粧料の保湿性能、ケラチン分散効果、皮膚の形状変化抑制性能又は皮膚の乾燥感・つっぱり感抑制性能を評価する方法に関する。

【背景技術】

【0002】

保湿成分又は保湿剤を含有する化粧料の評価方法のうち、実際の皮膚中の水分保持部位である角層を使用した評価方法としては、被評価物質を皮膚に塗布して、塗布前後の水分量を皮膚の電気的特性で測定する方法（特許文献１）、角層を重水処理した前後のＩＲスペクトルを対比してアミドＩの強度を基準として、スペクトル強度の変化量又は変化率により保湿レベルを評価する方法（特許文献２）が報告されている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0003】

【特許文献1】特開２００７−４５７７６号公報

【特許文献2】特開２０１０−２５６１０４号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0004】

しかしながら、特許文献１の方法では、角層構成成分と相互作用している水を評価しているのか、被評価物質と相互作用する水を評価しているのか判別できなかった。また、特許文献２の方法は、角層構成成分と相互作用する水の量を評価しており、角層の保湿状態の評価方法として正しい手段ではあるが、その正確性については課題があった。
また、近年の環境変化や食生活等の変化に伴い、皮膚の問題、特に、皮膚の乾燥感やつっぱり感が顕著に意識されるようになり、皮膚の乾燥感やつっぱり感を正しく評価或いは予測することが要望されるようになってきた。
従って、本発明の課題は、角層の保湿状態及び化粧料の保湿性能を適確に評価できる方法を提供することにある。加えて、化粧料の皮膚の形状変化抑制性能又は乾燥感・つっぱり感抑制性能を評価できる方法を提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0005】

特許文献２は、角層の保湿状態を評価するために、角層を重水処理した前と後のＩＲスペクトルを対比して、アミドＩの強度を基準として、スペクトル強度の変化量又は変化率により保湿レベルを評価している。
アミドIIのピークは、アミドＩとともにタンパク質を構成するアミノ酸由来のアミド基由来のピークであり、ケラチンに関する測定を正確に行うには、アミドIIのピークにより評価することが正確性の点から好ましい。特許文献２では、アミドIIのピークが例示されているものの、実施例のスペクトルではアミドIIは評価が困難となっている。本発明者は、その理由について種々検討したところ、特許文献２では角層の重水処理を十分に行う観点から、１００％重水環境（液相）で１時間処理している点に問題があることが判明した。
すなわち、角層構成成分と相互作用している水が多い場合、角層を重水処理すると重水で置換される水素が多くなり、アミドIIのピークは重水処理前に比べて低くなる。一方、角層構成成分と相互作用している水が少ない場合、角層を重水処理すると、重水で置換される水素が少なく、アミドIIのピークは重水処理前に比べてさほど変化しない。それにもかかわらず、１００％重水で１時間処理すると、角層構成成分と相互作用の多少にかかわらず、アミドIIのピークがほぼ観察されなくなってしまっていた。このような条件では、角層構成成分と相互作用している水分量を正確に測定できないことが判明した。

【0006】

そこで、角層試料を重水の気相中で処理を行い、処理する重水湿度及び時間を一定の範囲とすることにより角層構成成分と相互作用している水の存在の量に応じたアミドIIのピークの強度変化を観察することができ、アミドＩだけでなくアミドIIのピークの強度変化も明確に測定でき、アミドＩのピークとアミドIIのピークの強度比を測定することによって、実際に存在する状態の角層中の水分量が適確に評価できることを見出した。また、このように角層試料の重水処理条件を一定にすることにより、角層ケラチンの分散性を定量評価できることも見出し、本発明を完成した。

【0007】

すなわち、本発明は次の〔１〕〜〔３〕を提供するものである。
〔１〕ＩＲスペクトルにより角層の保湿状態を評価する方法であって、（１）測定対象の角層のＩＲスペクトル（スペクトル１）を測定し、（２）前記角層を４０％以上７５％以下の重水湿度で７分以上４０分以下処理し、（３）重水湿度下での処理後の角層のＩＲスペクトル（スペクトル２）を測定し、（４）ＩＲスペクトル中のアミドＩの強度に対するアミドIIの強度について、スペクトル１とスペクトル２の比を指標として評価する方法。

【0008】

〔２〕ＩＲスペクトルにより角層ケラチンの分散性を定量評価する方法であって、（１）測定対象の角層のＩＲスペクトル（スペクトル１）を測定し、（２）前記角層を４０％以上７５％以下の重水湿度で７分以上４０分以下処理し、（３）重水湿度下での処理後の角層のＩＲスペクトル（スペクトル２）を測定し、（４）ＩＲスペクトル中のアミドＩの強度に対するアミドIIの強度について、スペクトル１とスペクトル２の比を指標として評価する方法。
〔３〕ＩＲスペクトルにより角層に対する化粧料の保湿性能、ケラチン分散効果、皮膚の形状変化抑制性能又は皮膚の乾燥感・つっぱり感抑制性能を評価する方法であって、（１）測定対象の角層のＩＲスペクトル（スペクトル１）を測定し、（２）前記角層を４０％以上７５％以下の重水湿度で７分以上４０分以下処理し、（３）重水湿度下での処理後の角層のＩＲスペクトル（スペクトル２）を測定し、（４）ＩＲスペクトル中のアミドＩの強度に対するアミドIIの強度について、スペクトル１とスペクトル２の比を指標として評価する方法。

【発明の効果】

【0009】

本発明の評価方法によれば、角層試料を４０％以上７５％以下の重水湿度で７分以上４０分以下処理することにより、過剰な重水置換が生じず、実際に存在する状態の角層ケラチンと水分との相互作用に関与しているＩＲスペクトルのアミドＩのピークだけでなく、アミドIIのピークも正確に測定できる。そして、当該アミドＩのピークとアミドIIのピークの強度比を測定することにより、角層中のケラチンの分散性、角層の保湿状態、角層に対する化粧料の保湿性能、ケラチン分散効果、皮膚の形状変化抑制性能及び皮膚の乾燥感・つっぱり感抑制性能を適確に評価することができる。

【図面の簡単な説明】

【0010】

【図1】試験に用いた粘着テープのＩＲスペクトルを示す。

【図2】重水湿度と重水素置換率（Ｄ化率）との関係を示す。

【図3】ケラチンの分散性と重水素置換率（Ｄ化率）との関係を示す。

【図4】重水処理時間と重水素置換率（Ｄ化率）との関係を示す。

【図5】角層を重水処理したとき、処理前後のＩＲスペクトルを示す。

【図6】化粧料を２週間連用した後の肌の水分量及び、重水素置換率（Ｄ化率）の変化量を示す。

【図7】化粧料を２週間連用した後の肌の水分量及び、重水素置換率（Ｄ化率）の値を示す。

【図8】試験例５において、乾燥感及びつっぱり感を評価する際に使用した、Visual Analogue Scale（VAS）法を示す。

【発明を実施するための形態】

【0011】

本発明の角層の保湿状態の評価方法、角層ケラチンの分散性の定量評価方法、角層に対する化粧料の保湿性能、ケラチン分散効果、皮膚の形状変化抑制性能又は皮膚の乾燥感・つっぱり感抑制性能の評価方法では、次の４工程を行う。
（１）測定対象の角層のＩＲスペクトル（スペクトル１）を測定する。
（２）前記角層を４０％以上７５％以下の重水湿度下で７分以上４０分以下処理する。
（３）重水処理後の角層のＩＲスペクトル（スペクトル２）を測定する。
（４）ＩＲスペクトル中のアミドＩの強度に対するアミドIIの強度について、スペクトル１とスペクトル２の比を求める。

【0012】

工程（１）における測定対象の角層は、ヒトを含む動物の角層であり、ヒト、ラット、マウス、ブタ等の皮膚から採取した角層である。皮膚から角層を採取するには、角層を粘着し得る樹脂フィルムを用いてテープストリッピングする手段、好ましくは樹脂フィルムの粘着面を皮膚に適用する手段が好適である。より好ましくは、１５００〜１７００ｃｍ^-1の光を９５％以上透過し、角層を粘着し得る樹脂を用いて、皮膚から採取した角層を用いる。ここで、１５００〜１７００ｃｍ^-1の光を９５％以上透過することは、アミド結合に相当する１５００〜１７００ｃｍ^-1にＩＲスペクトルの吸収ピークを実質的に示さないことを意味する。用いる樹脂フィルムは、このような波長の赤外線を９５％以上透過するのが、角層のＩＲスペクトル中のアミドＩ及びアミドIIのピークを検出する点で好ましい。１５００〜１７００ｃｍ^-1の光の透過率は９７％以上が好ましく、９８％以上がより好ましく、９９％以上がさらに好ましい。
また、樹脂フィルムとしては、ヒトの角層を粘着して採取する必要性から、角層を選択的に粘着し得る樹脂フィルムが好ましい。角層を粘着し得る樹脂フィルムの粘着力は、ＪＩＳＣ２１０７−１１（２０１１年）に基づき測定される粘着力が０．１〜１Ｎ／ｍｍの範囲にあるものが、ヒトの皮膚の角層を選択的に採取できる点で好ましい。
このような樹脂フィルムとしては、フッ素系ポリマーを８０質量％以上含有する粘着テープが好ましく、フッ素系ポリマーを８０〜１００質量％含有する粘着テープがより好ましい。このような粘着テープの市販品としては、ニトフロン（登録商標）テープ（日東電工製、粘着力：０．２１Ｎ/ｍｍ（＝３．９Ｎ/１９ｍｍ））、アズフロンテープ（アズワン製、粘着力：０．３２Ｎ/ｍｍ（＝８Ｎ／２５ｍｍ））が挙げられる。

【0013】

用いる樹脂フィルムの粘着力により、１回のテープストリッピングにより採取できる角層の層数がほぼ定まるので、複数回テープストリッピングしその樹脂フィルムを重ねて測定することにより、複数の層までの保湿状態や化粧料の浸透性を評価することができる。例えば１回のテープストリッピングで採取できる角層が１〜２層の樹脂フィルムを用いた場合は、３回テープストリッピングを行うことにより、３〜６層程度までの角層を評価することができる。

【0014】

角層のＩＲスペクトルは、角層の透過光のＩＲスペクトルを測定することが好ましい。前記のように、１５００〜１７００ｃｍ^-1の光の透過度の高い樹脂フィルムを用いて採取した角層を試料として用いるため、透過光のＩＲスペクトルを測定することができる。このように透過光のＩＲスペクトルを測定するため、角層の表層だけでなく、角層全体の保湿状態等を評価することが可能となる。
ＩＲスペクトルの測定は、通常のＦＴ−ＩＲを用いることができる。

【0015】

工程（２）においては、前記角層を４０％以上７５％以下の重水湿度下で７分以上４０分以下処理する。工程（２）においては、前記重水湿度の気相で処理することができる。重水湿度は、十分に重水素置換させつつ過剰に重水素置換がされることを抑制してアミドIIを評価の対象とする観点から、重水湿度は、４０％以上であり、好ましくは４２％以上であり、より好ましくは４５％以上であり、そして７５％以下であり、好ましくは７３％以下であり、より好ましくは７０％以下であり、測定精度の向上の観点から、さらに好ましくは６５％以下であり、よりさらに好ましくは６０％以下である。また、同様の観点から重水湿度は４０〜７５％であり、４２〜７３％が好ましく、４５〜７０％がより好ましく、４５〜６５％がさらに好ましく、４５〜６０％がよりさらに好ましい。
また、重水による処理時間は、過剰な重水素置換を抑制しつつアミドIIによる評価を可能とする程度の重水素置換とする観点から、７分以上であり、好ましくは８分以上であり、より好ましくは９分以上であり、そして４０分以下であり、好ましくは３５分以下であり、より好ましくは３０分以下であり、測定精度の向上の観点から、さらに好ましくは２５分以下である。また、同様の観点から重水処理時間は、７分〜４０分であり、好ましくは８〜３５分であり、より好ましくは９〜３０分であり、さらに好ましくは９〜２５分である。

【0016】

ここで処理条件は、常温下で前記の重水湿度下中に角層試料を静置するのが好ましい。角層試料がテープストリッピングしたものである場合には、角層を含むテープをそのまま前記重水湿度下中に静置すればよい。即ち、テープ上の薄い角層試料であることから気相で重水処理を行うことができる。なお、常温とは、５℃〜３５℃であり、好ましくは１５℃〜３０℃である。

【0017】

工程（３）では、重水処理後の角層のＩＲスペクトル（スペクトル２）を測定する。工程（３）のＩＲスペクトル測定は、工程（１）と同様の条件で行うのが望ましい。ＩＲスペクトルの測定条件としては、温度２５℃、湿度４０〜６０％の環境で行い、角層を重水処理してから測定するまでの時間は、より正確な測定値を得る観点から、１０分以内が好ましく、５分以内が好ましく、３分以内がより好ましく、１分以内がよりさらに好ましい。

【0018】

前記条件の重水処理により、角層構成成分と相互作用している水が多い場合と、少ない場合とでは、重水で置換される水素の量が相違するため、アミド結合のＮ−Ｈに由来するアミドIIのピークは大きく変化する。従って、重水処理前後の主にアミドIIのピークの強度変化を測定することにより、角層構成成分と相互作用している水の量、すなわち角層中で保湿作用に関与している水分量を正確に測定できる。

【0019】

工程（４）では、ＩＲスペクトル中のアミドＩの強度に対するアミドIIの強度について、スペクトル１とスペクトル２の比を指標として角層の保湿状態、角層ケラチンの分散性、及び角層に対する化粧料の保湿性能を評価する。
すなわち、スペクトル１におけるアミドＩの強度に対するアミドIIの強度の比と、スペクトル２におけるアミドＩの強度に対するアミドIIの強度の比とを対比することにより、角層の保湿状態、角層ケラチンの分散性、角層に対する化粧料の保湿性能、ケラチン分散効果、皮膚の形状変化抑制性能又は皮膚の乾燥感・つっぱり感抑制性能を評価できる。

【0020】

ここで、角層の保湿状態、角層ケラチンの分散性を評価するには、予め多くのヒトの角層のデータを取得しておき、測定時の数値と対比することによって評価することができる。また、被測定者の過去のデータと比較することによっても評価できる。
また、角層に対する化粧料の保湿性能、ケラチン分散効果、皮膚の形状変化抑制性能、又は皮膚の乾燥感・つっぱり感抑制性能（以下、単に化粧料の保湿性能等という）は、被測定化粧料を塗布する前後のデータを対比すればよい。
化粧料の保湿性能等は、複数の被測定者について使用前或いは連用前を基準に使用後或いは連用後の数値を評価することが好ましい。具体的には、複数の被測定者についての使用前或いは連用前の数値の平均値或いは中間値を１００％とした場合の、使用後或いは連用後の数値の平均値或いは中間値の増加量又は増加率を評価することが好ましい。これにより、被測定者の個々の皮膚の違いがあっても、化粧料の使用前或いは連用前に比べて、使用後或いは連用後の相対的な変化をみることができる。また、化粧料の保湿性能等を評価する際には、化粧料が皮膚の上にあり、化粧料を含む皮膚の角層を採取することを防止する点から、皮膚を皮膚用の洗浄料で洗浄してから測定することが好ましい。

【0021】

ケラチンの分散に関しては、ケラチンが凝集しているとケラチン間の距離が狭まり、−ＮＨ基の水素が水素結合あるいは他の分子間結合（疎水結合等）に関与しているものが多くなり（水素重水素交換反応におけるアミドIIのピークの変化量が小さい）、ケラチンが分散しているとそうした分子間結合に関与している−ＮＨ基が少なくなる（水素重水素交換反応におけるアミドIIのピークの変化量が大きい）と考えられる。従って、重水素処理によるアミドIIのピーク変化の度合いが、ケラチンの分散性の指標になる。

【実施例】

【0022】

次に実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明する。

【0023】

参考例１
粘着性テープであるアズフロンテープ（アズワン製、ＴＦ１５−０２、粘着力：０．３２Ｎ／ｍｍ（＝８Ｎ／２５ｍｍ）、厚さ０．０８ｍｍ）の赤外線吸収スペクトルを測定した。その結果を図１に示す。図１に示すように、用いた粘着性テープには、１５００〜１７００ｃｍ^-1に吸収ピークを有さないことを確認した。なお、粘着性テープの粘着力はＪＩＳＣ２１０７−１１（２０１１年）に基づいて測定された数値である。

【0024】

試験例１
豚皮をアセトン：エーテル＝１：１の混合溶媒に２０分浸漬した後、混合溶媒を除去し、次いで、水に２０分浸漬させた（「アセトン／エーテル＋水処理」）。その後、水を除去し、この豚皮に粘着性のテープ（アズワン製、ＴＦ１５−０２、粘着力：０．３２Ｎ／ｍｍ（＝８Ｎ／２５ｍｍ）、厚さ０．０８ｍｍ）を貼り付け、テープの粘着面に角層を採取した。その後、テープ上に付着した角層を窒素気流雰囲気下に３分間静置し、乾燥させ、その後、角層のＩＲスペクトルを測定した（スペクトル１）。次いで、その角層を重水湿度５０％（気相中）のデシケーター内に１０分間静置して重水処理を実施した。その後、角層をデシケーター内からとりだし、再度ＩＲスペクトルを測定した（スペクトル２）。取得したスペクトル１、２を、アミドＩを標準ピークとして補正し補正スペクトル１、２を得た。次に解析対象ピークとしてアミドII（ケラチン由来）に検出されるピークを用い、補正スペクトル１、２における吸収強度を読み取った。［｛（重水置換後の吸光強度−重水置換前の吸光強度）／重水置換前の吸光強度｝×１００］を計算し、解析対象ピークの吸光強度変化率を求めた。求めた吸光強度変化率の値を、角層を重水処理したときの角層構成成分への重水素置換率（Ｄ化率）の目安として比較した。
また、上記の方法において、スペクトル１測定後の重水湿度を３０〜１００％とし、デシケーター内に載置する重水処理時間を５〜６０分とした場合についても測定した。その結果を表１に示す。

【0025】

【表1】

【0026】

そして、重水湿度５０％処理時間１０分と１００％処理時間１０分について、角層を未処
理、「アセトン／エーテル＋水処理」した場合の重水素置換率（Ｄ化率）を図２に示した。
この図２からわかるように、角層は「アセトン／エーテル＋水処理」されて乾燥状態にあるにもかからず、重水湿度１００％で処理した場合には重水素置換前後に差が見られないのに対して、重水湿度が５０％で処理した場合には、重水素置換率（Ｄ化率）の差を明確に確認することができる。

【0027】

ケラチンの分散に関しては、ケラチンが凝集しているとケラチン間の距離が狭まり、−ＮＨ基の水素が水素結合あるいは他の分子間結合（疎水結合等）に関与しているものが多くなり（水素重水素交換反応におけるアミドIIのピークの変化量が小さい）、ケラチンが分散しているとそうした分子間結合に関与している−ＮＨ基が少なくなる（水素重水素交換反応におけるアミドIIのピークの変化量が大きい）と考えられる。従って、アミドIIのピークの変化量がケラチン間の距離に関与していると考えられており、重水処理によるアミドIIのピークの変化の度合いを評価することが、ケラチンの分散性の指標として正確であると考える。この関係を図３に示す。

【0028】

５０％重水湿度での処理時間と重水素置換率（Ｄ化率）との関係を図４に示す。図４より、５０％重水湿度下での処理時間が７分以上４０分以下の場合に、水分を保持したケラチンと水分を保持しないケラチンとの間における、アミドII／アミドＩのピーク強度比を明確に判定できることがわかる。

【0029】

試験例２
各種化粧料による、豚皮のケラチン分散状態の評価と、実際に人で使用した保湿感の評価。
［１：各化粧料による豚皮のケラチンの分散状態の測定試験］
「アセトン/エーテル＋水処理」を行った豚皮に粘着性のテープ（アズフロンテープ）を張り付け、テープの粘着面に角層を採取し、表２記載の化粧料に２０分浸漬させた。浸漬後、化粧料をティッシュで押さえて吸収させ、テープ上に採取した角層を窒素気流雰囲気下に３分間静置することにより、乾燥させた。その後、乾燥させた角層のＩＲスペクトルを測定した（スペクトル１）。次いで、その角層を５０％重水湿度下に１０分間静置し（５０％重水湿度のデシケーター内に静置し）、重水処理を実施した。重水処理後、再度ＩＲスペクトルを測定した（スペクトル２）（例として、水に浸漬した場合の重水処理前と後におけるＩＲスペクトルを、図５に示す。図５に示すように、重水処理の影響を受けにくいアミドＩの吸収ピークは重水処理の前後でほとんど変化しないのに対し、アミドII付近の吸収ピークは、重水処理の前後で強度が変化していることがわかる）。取得したスペクトル１、２を、アミドＩを標準ピークとして補正し補正スペクトル１、２を得た。次に解析対象ピークとしてアミドII（ケラチン由来）に検出されるピークを用い、補正スペクトル１、２における吸収強度を読み取った。［｛（重水置換後の吸光強度−重水置換前の吸光強度）／重水置換前の吸光強度｝×１００］を計算し、解析対象ピークの吸光強度変化率を求めた。求めた吸光強度変化率の値を、角層を重水処理したときの角層構成成分への重水素置換率（Ｄ化率）の目安として、各種化粧料間で比較した。その結果を表２に示す。

【0030】

［２：各化粧料による人で使用したときの保湿感の評価］
専門パネラー５名により、洗浄後の前腕屈側部に各化粧料０．０５〜０．１ｇを適用し、人差し指の指先で１秒間に１回転、約直径４cmの円を描くように２０秒間マッサージし、その直後の肌を触り、以下の基準で、しっとり感を評価した。結果を５名の合計点で示す。その結果を表２に示す。
４：非常にしっとりする。
３：しっとりする。
２：あまりしっとりしない。
１：しっとりしない。

【0031】

【表2】

【0032】

表２より、保湿性能の高い化粧料を用いた場合は、重水素置換率（Ｄ化率）が高く、本発明方法により角層の保湿状態、化粧料の保湿能が評価できることがわかる。

【0033】

試験例３
健常女性２０〜５０代の８名を２群に分け（各４名）、表３記載の実施例４と比較例３の化粧水を２週間連用し、連用前に対する連用後の皮膚の重水素交換率（Ｄ化率）の変化量と水分量の変化量について試験した。なお、試験は、試験前に顔を洗顔料にて洗顔後、２０℃／湿度１０％の環境下で１０分間馴化してから行った。

【0034】

【表3】

【0035】

［１：人の角層に対する各化粧料の保湿性の測定試験（Ｄ化率）］
人の右頬部に粘着性のテープ（アズフロンテープ）を張り付け、テープの粘着面に角層を採取し、テープごとＩＲスペクトルを測定した（スペクトル１）。その後、その角層とテープを５０％重水湿度下に１０分間静置し、重水処理を実施した。重水処理後、再度ＩＲスペクトルを測定した（スペクトル２）。取得したスペクトル１、２を、アミドＩを標準ピークとして補正し補正スペクトル１、２を得た。次に解析対象ピークとしてアミドII（ケラチン由来）に検出されるピークを用い、補正スペクトル１、２における吸収強度を読み取った。［｛（重水置換後の吸光強度−重水置換前の吸光強度）／重水置換前の吸光強度｝×１００］を計算し、解析対象ピークの吸光強度変化率を求めた。求めた吸光強度変化率の値を、角層を重水処理したときの角層構成成分への重水素置換率（Ｄ化率）の目安として、各種化粧料間で比較した。

【0036】

［２：人の角層に対する各化粧料の保湿性の測定試験（水分量）］
コルネオメーター（Courage+Khazaka社製）にて右頬部の水分量を測定した。

【0037】

なお、Ｄ化率、水分量は、化粧料の連用前を１００％とし、連用後の数値は連用前の数値に対する比率（％）で表す。また、２週間後のＤ化率、水分量の値も示した。なお、数値は４名の被験者の平均値である。結果を表３及び図６、７に示す。
図６、７より、水分量を高める化粧料を用いた場合、重水素置換率（Ｄ化率）が高くなり、本発明方法により人の角層の保湿状態を評価できることがわかる。

【0038】

試験例４
［各化粧料による豚皮のケラチンの分散状態の測定試験］
表４に示す組成の皮膚化粧料を製造し、ケラチン分散状態を評価した。結果を表４に併せて示す。なお、表４の各化粧料は以下のように製造した。

【0039】

（製造方法）
（１）化粧料２−１a〜２−３a、２−１b〜２−３b：
２５℃にて、全成分を混合し、２０分間撹拌して、化粧料を得た。
（２）実施例２−４a〜２−８a、２−４b、２−５b：
非イオン性界面活性剤以外の全成分を混合し、撹拌しながら８０℃まで加熱し、８０℃で加熱溶解した非イオン性界面活性剤を加え、２０分間撹拌し、その後、２５℃まで冷却して、化粧料を得た。

【0040】

（測定方法）
豚皮をアセトン：エーテル＝１：１の混合溶媒に２０分浸漬した後、混合溶媒を除去し、次いで、水に２０分浸漬させた（「アセトン／エーテル＋水処理」）。その後、水を除去し、この豚皮に粘着性のテープ（アズフロンテープ；アズワン社製、ＴＦ１５−０２、粘着力：０．３２Ｎ／ｍｍ（＝８Ｎ／２５ｍｍ）、厚さ０．０８ｍｍ）を貼り付け、テープの粘着面に角層を採取し、表１記載の化粧料に２０分浸漬させた。浸漬後、化粧料をティッシュで押さえて吸収させ、テープ上に採取した角層を窒素気流雰囲気下に３分間静置することにより、乾燥させた。その後、乾燥させた角層のＩＲスペクトルを測定した（スペクトル１）。次いで、その角層を５０％重水湿度下に１０分間静置し（５０％重水湿度のデシケーター内に静置し）、重水処理を実施した。重水処理後、再度ＩＲスペクトルを測定した（スペクトル２）。
取得したスペクトル１、２を、アミドＩを標準ピークとして補正して、補正スペクトル１、２を得た。次に、解析対象ピークとしてアミドII（ケラチン由来）に検出されるピークを用い、補正スペクトル１、２における吸収強度を読み取った。［｛（重水置換後の吸光強度−重水置換前の吸光強度）／重水置換前の吸光強度｝×１００］を計算し、解析対象ピークの吸光強度変化率を求めた。求めた吸光強度変化率の値を、角層を重水処理したときの角層構成成分への重水素置換率（Ｄ化率）の目安として、各種化粧料間で比較した。

【0041】

【表4】

【0042】

試験例５
［各化粧料による人角層におけるケラチンの分散状態、皮膚形状変化抑制の測定試験］
表５に示す組成の皮膚化粧料を製造し、人の角層のケラチンの分散状態、皮膚形状変化を評価した。結果を表５に併せて示す。なお、表５の各化粧料は以下のように製造した。

【0043】

（製造方法）
（１）２−９a：
水にキサンタンガムを添加し、８０℃にて撹拌し、キサンタンガム含有水溶液１を調製した。さらに、水に、ポリエチレングリコール（分子量１５４０）及びポリオキシエチレン（２０）イソセチルエーテルを添加し、８０℃にて撹拌し、ポリエチレングリコール（分子量１５４０）及びポリオキシエチレン（２０）イソセチルエーテル含有水溶液２を調製した。また、水にエクトインを添加し、２５℃にて撹拌し、エクトイン含有水溶液３を調製した。水溶液１、２、３、及びオキシエチレン・メチルポリシロキサン共重合体を除く残りの全成分を２５℃にて撹拌後、８０℃に加熱した水溶液１、２及び水溶液３、ポリオキシエチレン・メチルポリシロキサン共重合体を混合し２０分撹拌して、化粧料を得た。
（２）２−６ｂ：
エクトインを配合しない以外は、２−９aと同様にして、化粧料を製造した。

【0044】

（評価方法）
（１）ケラチンの分散状態の測定試験：
健常女性２０〜５０代の８名を２群に分け（各４名）、化粧料２−９a又は２−６ｂを２週間連用（１日に朝、夜１回使用。０．８ｇ／回使用）し、連用前に対する連用後の皮膚の重水素交換率（Ｄ化率）の変化量を評価した。なお、テープストリップによる角層採取は、洗顔料にて洗顔後、２０℃／湿度１０％の環境下で１０分間馴化した後に行った。
人の右頬部に粘着性のテープ（アズフロンテープ）を張り付け、テープの粘着面に角層を採取し、テープごとＩＲスペクトルを測定した（スペクトル１）。その後、その角層とテープを５０％重水湿度下に１０分間静置し、重水処理を実施した。重水処理後、再度ＩＲスペクトルを測定した（スペクトル２）。取得したスペクトル１、２を、アミドＩを標準ピークとして補正して補正スペクトル１、２を得た。次に解析対象ピークとしてアミドII（ケラチン由来）に検出されるピークを用い、補正スペクトル１、２における吸収強度を読み取った。［｛（重水置換後の吸光強度−重水置換前の吸光強度）／重水置換前の吸光強度｝×１００］を計算し、解析対象ピークの吸光強度変化率を求めた。求めた吸光強度変化率の値を、角層を重水処理したときの角層構成成分への重水素置換率（Ｄ化率）の目安として、各化粧料間で比較した。
なお、Ｄ化率は、化粧料の連用前を１００％とし、連用後の数値は連用前の数値に対する比率（％）で示す。なお、数値は４名の被験者の平均値である。

【0045】

（２）皮膚形状変化抑制の測定試験：
健常女性２０〜５０代の８名を２群に分け（各４名）、実施例９又は比較例５の化粧料を２週間連用（１日に朝、夜１回使用。０．８ｇ／回使用）し、連用前に対する連用後の皮膚形状変化抑制能を評価した。
人の左頬部の形を、レプリカ（シリコーン系印象材、ジーシー社製）にて転写し、レプリカの表面形状粗さＳａを、レーザー顕微鏡（型番VK-X250、キーエンス社製）を用いて計測した。
・洗顔後、３０℃／７０％ＲＨ室内に入室し、３分後にレプリカを転写した。
・その後、２０℃／１０％ＲＨ室内に移行し、入室から３分後にレプリカを転写した。
・３０℃／７０％ＲＨにおける表面形状粗さ［Ｓａ（３０℃／７０％ＲＨ）］。
・２０℃／１０％ＲＨにおける表面形状粗さ［Ｓａ（２０℃／１０％ＲＨ）］。
・それらの差分（ΔＳａ＝｜［Ｓａ（３０℃／７０％ＲＨ）］−［Ｓａ（２０℃／１０％ＲＨ）］｜）を、外部環境変化により生じた表面粗さの大きさとした。
・この評価の化粧料の使用前と２週間使用後の値をそれぞれ、ΔＳａ（使用前）、ΔＳａ（２週間使用後）とし、それらの差の値である表面形状粗さの変化率
ΔＳａ（２週間使用後−使用前）＝｛［ΔＳａ（２週間使用後）］−［ΔＳａ（使用前）］｝
を計算することにより、２週間連用の皮膚形状変化抑制の目安とした。
・ΔＳａ（２週間使用後−使用前）の数値が小さいほど皮膚形状の変化が小さいことを示す。

【0046】

（３）各化粧料による乾燥感及びつっぱり感の評価試験：
化粧料２−９a、２−６ｂについて、Visual Analogue Scale（VAS）法を用いて、乾燥感及びつっぱり感を評価した。
長さ１０cmの横軸直線（右端が「乾燥感を感じない」、左端が「乾燥を感じる（最大）」）を紙面上に提示し、現在の乾燥感がどの程度かを直線上に垂直な線を引いてもらい評価を行った（図８）。
・洗顔後、３０℃／７０％ＲＨ室内に入室し、３分後に評価を行った。その後、２０℃／１０％ＲＨ室内に移行し、同様に入室から３分後に評価を行った。
・３０℃／７０％ＲＨにおけるＶＡＳ値（ＶＡＳ（３０℃／７０％ＲＨ），ｍｍ）
・２０℃／１０％ＲＨにおけるＶＡＳ値（ＶＡＳ（２０℃／１０％ＲＨ），ｍｍ）
・その差分（ΔＶＡＳ＝｜｛ＶＡＳ（３０℃／７０％ＲＨ）−ＶＡＳ（２０℃／１０％ＲＨ）｝｜）を、外部環境変化により生じた乾燥感の大きさとした。
・この評価の使用前と２週間使用後の値をそれぞれ、ΔＶＡＳ（使用前）、ΔＶＡＳ（２週間使用後）とし、それらの差の値
ΔＶＡＳ（２週間使用後−使用前）＝｛［ΔＶＡＳ（２週間使用後）］−［ΔＶＡＳ（使用前）］｝
を計算することにより、乾燥感を評価した。
・ΔＶＡＳ（２週間使用後−使用前）の数値が、小さいほど乾燥感を感じなくなったことを示す。
つっぱり感に関しても同様に評価した。

【0047】

【表5】

【0048】

表５より、本発明により、ケラチン分散効果が高い化粧料を用いた場合、角層の重水素置換率（Ｄ化率）が高くなり、皮膚の形状変化抑制性能や乾燥感・つっぱり感の抑制性能が向上することが評価できる。
乾燥等によるつっぱり感は、角質細胞内の水分量が少なる結果、ケラチンが凝集し、それにより皮膚形状が収縮変化することで生じるものと考えられる。また、このケラチンの凝集は、電荷反発の減少によるものと考えられる。ケラチン分散効果が高い化粧料は、重水素置換率（Ｄ化率）が高くなっていることから、電荷反発効果を高め、ケラチンを分散させ、乾燥などの外的環境の変化においても、ケラチンを分散した状態に維持することができるために、皮膚の形状変化が抑制され、乾燥感・つっぱり感も改善されていると考えられる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】