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特許6568797微生物による家畜敷料の殺菌方法

書誌要約請求の範囲詳細な説明課題実施例実施するための形態図面の説明

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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6568797

(24)【登録日】2019年8月9日

(45)【発行日】2019年8月28日

(54)【発明の名称】微生物による家畜敷料の殺菌方法

(51)【国際特許分類】

B09B 3/00 20060101AFI20190819BHJP

A01K 1/015 20060101ALI20190819BHJP

A61L 2/04 20060101ALI20190819BHJP

C12N 1/20 20060101ALI20190819BHJP

A01P 3/00 20060101ALI20190819BHJP

A01N 63/02 20060101ALI20190819BHJP

【ＦＩ】

B09B3/00 A

A01K1/015 BZAB

A61L2/04

C12N1/20 E

A01P3/00

A01N63/02 E

【請求項の数】23

【全頁数】15

(21)【出願番号】特願2015-536624(P2015-536624)

(86)(22)【出願日】2014年9月11日

(86)【国際出願番号】JP2014074067

(87)【国際公開番号】WO2015037661

(87)【国際公開日】20150319

【審査請求日】2017年8月15日

(31)【優先権主張番号】61/878,499

(32)【優先日】2013年9月16日

(33)【優先権主張国】US

【微生物の受託番号】NPMD NITE BP-01693

【微生物の受託番号】NPMD NITE BP-1692

【微生物の受託番号】IPOD FERM BP-1096

(73)【特許権者】

【識別番号】315019425

【氏名又は名称】アサヒカルピスウェルネス株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100091096

【弁理士】

【氏名又は名称】平木祐輔

(74)【代理人】

【識別番号】100118773

【弁理士】

【氏名又は名称】藤田節

(72)【発明者】

【氏名】上杉泰介

(72)【発明者】

【氏名】安田源太郎

【審査官】上坊寺宏枝

(56)【参考文献】

【文献】特開２００５−０７３６３９（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２００３−０９４０９５（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２００４−０５１３８０（ＪＰ，Ａ）

【文献】米国特許出願公開第２００６／０１８８９７８（ＵＳ，Ａ１）

【文献】特開２００４−０８２１１０（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２０１３−１７７２７１（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２０１３−０６０３７８（ＪＰ，Ａ）

【文献】ロシア国特許出願公開第０２４７９９７５（ＲＵ，Ａ）

【文献】ロシア国特許出願公開第０２３１７６７０（ＲＵ，Ａ）

【文献】特許第４５０３５３０（ＪＰ，Ｂ２）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｂ０９Ｂ３／００

Ａ０１Ｎ６３／００

Ａ０１Ｐ３／００

Ｃ０５Ｆ３／００、１１／００、１１／０８、１７／００

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

少なくとも1種のBacillus coagulans高温菌、或いは、該少なくとも1種のBacillus coagulans高温菌と、少なくとも1種のBacillus subtilis中温菌との組み合わせを、家畜敷料に添加し、敷料を発酵させる工程を含む、但し前記少なくとも1種のBacillus coagulans高温菌がBacillus coagulans CP3425株(国際寄託番号NITE BP-01693)又は同等の殺菌作用を有するその変異株を含むことを特徴とする、家畜敷料の殺菌方法。

【請求項2】

少なくとも1種のBacillus coagulans高温菌、或いは、該少なくとも1種のBacillus coagulans高温菌と、少なくとも1種のBacillus subtilis中温菌との組み合わせを、有機廃棄物又は家畜敷料に添加し、有機廃棄物又は敷料を発酵させる工程を含む、但し前記少なくとも1種のBacillus coagulans高温菌がBacillus coagulans CP3425株(国際寄託番号NITE BP-01693)又は同等の殺菌作用を有するその変異株を含むことを特徴とする、有機廃棄物又は家畜敷料の堆肥化促進方法。

【請求項3】

Bacillus coagulans高温菌が、少なくとも40〜60℃の温度で生育可能である請求項１又は２に記載の方法。

【請求項4】

Bacillus subtilis中温菌が、少なくとも30〜50℃の温度で生育可能である請求項１又は２に記載の方法。

【請求項5】

微生物の発酵熱のみを利用することを特徴とする請求項１〜４いずれか１項に記載の方法。

【請求項6】

Bacillus coagulans高温菌がさらに、Bacillus coagulans CP3424株(国際寄託番号NITE BP-01692)、又は同等の殺菌作用を有するその変異株を含む、請求項１〜３及び５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項7】

Bacillus subtilis中温菌が、Bacillus subtilis C-3102株(国際寄託番号FERM BP-1096)又はその変異株である、請求項１、２、４及び５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項8】

Bacillus coagulans高温菌がBacillus coagulans CP3425株(国際寄託番号NITE BP-01693)であり、及び、Bacillus subtilis中温菌がBacillus subtilis C-3102株(国際寄託番号FERM BP-1096)である、請求項１〜５及び７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項9】

Bacillus coagulans CP3424株(国際寄託番号NITE BP-01692)。

【請求項10】

Bacillus coagulans CP3425株(国際寄託番号NITE BP-01693)。

【請求項11】

少なくとも1種のBacillus coagulans高温菌、或いは、該少なくとも1種のBacillus coagulans高温菌と、少なくとも1種のBacillus subtilis中温菌との組み合わせを、有効成分として含む、但し前記少なくとも1種のBacillus coagulans高温菌がBacillus coagulans CP3425株(国際寄託番号NITE BP-01693)又は同等の殺菌作用を有するその変異株を含むことを特徴とする、家畜敷料の殺菌剤。

【請求項12】

Bacillus coagulans高温菌が、少なくとも40〜60℃の温度で生育可能である、請求項１１に記載の殺菌剤。

【請求項13】

Bacillus subtilis中温菌が、少なくとも30〜50℃の温度で生育可能である、請求項１１に記載の殺菌剤。

【請求項14】

Bacillus coagulans高温菌がさらに、Bacillus coagulans CP3424株(国際寄託番号NITE BP-01692)、又は同等の殺菌作用を有するその変異株を含む、請求項１１又は１２に記載の殺菌剤。

【請求項15】

Bacillus subtilis中温菌が、Bacillus subtilis C-3102株(国際寄託番号FERM BP-1096)又はその変異株である、請求項１１又は１３に記載の殺菌剤。

【請求項16】

Bacillus coagulans高温菌がBacillus coagulans CP3425株(国際寄託番号NITE BP-01693)であり、及び、Bacillus subtilis中温菌がBacillus subtilis C-3102株(国際寄託番号FERM BP-1096)である、請求項１１〜１３及び１５のいずれか１項に記載の殺菌剤。

【請求項17】

【請求項18】

Bacillus coagulans高温菌が、少なくとも40〜60℃の温度で生育可能である、請求項１７に記載の有機廃棄物又は家畜敷料の堆肥化促進剤。

【請求項19】

Bacillus subtilis中温菌が、少なくとも30〜50℃の温度で生育可能である、請求項１７に記載の有機廃棄物又は家畜敷料の堆肥化促進剤。

【請求項20】

Bacillus coagulans高温菌がさらに、Bacillus coagulans CP3424株(国際寄託番号NITE BP-01692)、又は同等の殺菌作用を有するその変異株を含む、請求項１７又は１８に記載の堆肥化促進剤。

【請求項21】

Bacillus subtilis中温菌が、Bacillus subtilis C-3102株(国際寄託番号FERM BP-1096)又はその変異株である、請求項１７又は１９に記載の堆肥化促進剤。

【請求項22】

Bacillus coagulans高温菌がBacillus coagulans CP3425株(国際寄託番号NITE BP-01693)であり、及び、Bacillus subtilis中温菌がBacillus subtilis C-3102株(国際寄託番号FERM BP-1096)である、請求項１７〜１９及び２１のいずれか１項に記載の堆肥化促進剤。

【請求項23】

Bacillus coagulans高温菌とBacillus subtilis中温菌からなる、但し前記Bacillus coagulans高温菌がBacillus coagulans CP3425株(国際寄託番号NITE BP-01693)又は同等の殺菌作用を有するその変異株であることを特徴とする、敷料殺菌または堆肥化促進用組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、特定のバチルス・コアギュランス（Bacillus coagulans）高温菌、或いは、この高温菌とバチルス・ズブチルス（Bacillus subtilis；「バチルス・ズブチリス」と呼称されることもある。）中温菌との組み合わせを使用することにより家畜敷料を殺菌する方法に関する。殺菌された敷料は、家畜用敷料として再利用されうる。

【0002】

本発明はまた、特定のBacillus coagulans 高温菌、或いは、この高温菌とBacillus subtilis中温菌との組み合わせを使用することにより有機廃棄物又は敷料の堆肥化を促進する方法に関する。

【背景技術】

【0003】

Bacillus属細菌は、有機廃棄物の堆肥化などの処理などに利用されうることは知られている。

【0004】

例えば、特許文献１には、生ごみなどの有機廃棄物又は敷料の堆肥化、あるいは敷料の再利用化における、有害菌、特に悪臭発生菌や病原菌の効率的な殺菌方法が記載されており、この方法では、Bacillus（バチルス）属、Geobacillus（ゲオバチルス）属及びAeribacillus（アエリバチルス）属からなる群から選択される少なくとも1種の微生物が使用されている。

【0005】

特許文献２には、有機廃棄物中に、15〜50℃で活性をもつ中温菌及び50〜70℃で活性をもつ高温菌を存在させることを特徴とする有機廃棄物処理方法が記載されており、中温菌がBacillus subtilis C-3102株(FERM BP-1096)であり、高温菌がBacillus pallidus TK6004株(FERM BP-08597)である。

【0006】

特許文献３には、畜糞を主たる原料とし、同原料を撹拌しながら高温で加熱して殺菌処理し、その後有機物の分解発酵菌と家畜の病原菌を抑止する有用菌とを投入し、撹拌しながら畜糞の有機成分を分解発酵させるとともに、家畜の病原菌を抑止する有用菌を増殖させ、その後粉粒状に乾燥させて製造する家畜用敷料が開示されてる。殺菌は、バーナー等を使用して、90〜110℃で1〜2時間以上かけて実施するものであると記載されている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0007】

【特許文献1】特開2013-060378号公報

【特許文献2】日本国特許4503530号公報

【特許文献3】特開2006-238820号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

一度使用された家畜敷料には、敷料の他に家畜排せつ物（通常、糞尿）が混入している。これを再使用するためには、混入する有害菌を殺菌すること、水分を除去し乾燥状態とすること、アンモニアレベルを低減することが必要であり、効率的に短期間で処理されることが求められる。本発明者らが開発したある特定の好気性Bacillus属細菌が、敷料の殺菌や堆肥化に利用されうる。この方法は、発酵熱を利用して有害菌の殺菌や水分蒸散を行うものであり、敷料の堆積形成、切返し（酸素供給）、一面に広げるという操作を繰り返し実施することを含む。

【0009】

微生物を用いた殺菌は、熱源を不要とするためコスト的に有利であるし、多量の敷料を一度に処理することができるという利点がある。この手法で問題となるのは、有害菌を実質的に悪影響が生じないレベルにまで殺菌可能な微生物を使用することである。このような微生物は、発酵熱により、対象の有害菌の菌数を10万分の１以下にできることが目安と考えられる。そのような有用な微生物を見出すことができれば、敷料をさらに効果的に殺菌することが可能になる。しかし、敷料には、多くの場合、難分解性の植物性敷料や木質系敷料が使用されているため、菌の生育が思いのほか難しく効果的な殺菌処理ができないという問題がある。

【課題を解決するための手段】

【0010】

本発明者は、今回、家畜敷料を効果的に殺菌可能にするBacillus属細菌、或いはそれらの菌の組み合わせを見出したことにより、本発明を完成させた。

【0011】

本発明は、以下の特徴を包含する。

【0012】

(1) 少なくとも1種のBacillus coagulans 高温菌、或いは、該少なくとも1種のBacillus coagulans 高温菌と、少なくとも1種のBacillus subtilis 中温菌との組み合わせを、家畜敷料に添加し、敷料を発酵させる工程を含む、家畜敷料の殺菌方法。

【0013】

(2) 少なくとも1種のBacillus coagulans 高温菌、或いは、該少なくとも1種のBacillus coagulans 高温菌と、少なくとも1種のBacillus subtilis中温菌との組み合わせを、有機廃棄物又は家畜敷料に添加し、有機廃棄物又は敷料を発酵させる工程を含む、有機廃棄物又は家畜敷料の堆肥化促進方法。

【0014】

(3) Bacillus coagulans 高温菌が、少なくとも40〜60℃の温度で生育可能である、(1)又は(2)に記載の方法。

【0015】

(4) Bacillus subtilis中温菌が、少なくとも30〜50℃の温度で生育可能である、(1)又は(2)に記載の方法。

【0016】

(5) 微生物の発酵熱のみを利用することを特徴とする、(1)〜(4)のいずれかに記載の方法。

【0017】

(6) Bacillus coagulans 高温菌が、Bacillus coagulans CP3424株(国際寄託番号NITE BP-01692)、Bacillus coagulans CP3425株(国際寄託番号NITE BP-01693)、及びそれらの変異株からなる群から選択される、請求項(1)〜(3)及び(5)のいずれかに記載の方法。

【0018】

(7) Bacillus subtilis中温菌が、Bacillus subtilis C-3102株(国際寄託番号FERM BP-1096)又はその変異株である、(1)、(2)、(4)及び(5)のいずれかに記載の方法。

【0019】

(8) Bacillus coagulans 高温菌がBacillus coagulans CP3425株(国際寄託番号NITE BP-01693)又はその変異株であり、及び、Bacillus subtilis中温菌がBacillus subtilis C-3102株(国際寄託番号FERM BP-1096)又はその変異株である、(1)〜(7)のいずれかに記載の方法。

【0020】

(9) Bacillus coagulans CP3424株(国際寄託番号NITE BP-01692)又はその変異株。

【0021】

(10) Bacillus coagulans CP3425株(国際寄託番号NITE BP-01693)又はその変異株。

【0022】

(11) 少なくとも1種のBacillus coagulans高温菌、或いは、該少なくとも1種のBacillus coagulans高温菌と、少なくとも1種のBacillus subtilis中温菌との組み合わせを、有効成分として含む、家畜敷料の殺菌剤。

【0023】

(12) Bacillus coagulans 高温菌が、少なくとも40〜60℃の温度で生育可能である、(11)に記載の殺菌剤。

【0024】

(13) Bacillus subtilis中温菌が、少なくとも30〜50℃の温度で生育可能である、(11)に記載の殺菌剤。

【0025】

(14) Bacillus coagulans 高温菌が、Bacillus coagulans CP3424株(国際寄託番号NITE BP-01692)、Bacillus coagulans CP3425株(国際寄託番号NITE BP-01693)、及びそれらの変異株からなる群から選択される、(11)又は(12)に記載の殺菌剤。

【0026】

(15) Bacillus subtilis中温菌が、Bacillus subtilis C-3102株(国際寄託番号FERM BP-1096)又はその変異株である、(11)又は(13)に記載の殺菌剤。

【0027】

(16) Bacillus coagulans 高温菌がBacillus coagulans CP3425株(国際寄託番号NITE BP-01693)又はその変異株であり、及び、Bacillus subtilis中温菌がBacillus subtilis C-3102株(国際寄託番号FERM BP-1096)又はその変異株である、(11)〜(15)のいずれかに記載の殺菌剤。

【0028】

(17) 少なくとも1種のBacillus coagulans 高温菌、或いは、該少なくとも1種のBacillus coagulans高温菌と、少なくとも1種のBacillus subtilis中温菌との組み合わせを、有効成分として含む、有機廃棄物又は家畜敷料の堆肥化促進剤。

【0029】

(18) Bacillus coagulans 高温菌が、少なくとも40〜60℃の温度で生育可能である、(17)に記載の有機廃棄物又は家畜敷料の堆肥化促進剤。

【0030】

(19) Bacillus subtilis中温菌が、少なくとも30〜50℃の温度で生育可能である、(17)に記載の有機廃棄物又は家畜敷料の堆肥化促進剤。

【0031】

(20) Bacillus coagulans 高温菌が、Bacillus coagulans CP3424株(国際寄託番号NITE BP-01692)、Bacillus coagulans CP3425株(国際寄託番号NITE BP-01693)、及びそれらの変異株からなる群から選択される、(17)又は(18)に記載の堆肥化促進剤。

【0032】

(21) Bacillus subtilis中温菌が、Bacillus subtilis C-3102株(国際寄託番号FERM BP-1096)又はその変異株である、(17)又は(19)に記載の堆肥化促進剤。

【0033】

(22) Bacillus coagulans 高温菌がBacillus coagulans CP3425株(国際寄託番号NITE BP-01693)又はその変異株であり、及び、Bacillus subtilis中温菌がBacillus subtilis C-3102株(国際寄託番号FERM BP-1096)又はその変異株である、(17)〜(21)のいずれかに記載の堆肥化促進剤。

【0034】

(23) Bacillus coagulans 高温菌とBacillus subtilis中温菌からなる敷料殺菌または堆肥化促進用組成物。

【0035】

本発明によれば、特定のBacillus属細菌の組み合わせを使用することにより、家畜敷料を効果的に殺菌することができるという利点がある。

【0036】

本明細書は本願の優先権の基礎である米国仮特許出願US61/878,499号(出願日09/16/2013)の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。

【図面の簡単な説明】

【0037】

【図1】この図は、敷料の堆積物を示す。

【図2】この図は、敷料の堆積物の断面図で温度測定部位を示す。上部（Up）は堆積の天面から20cmの部位、下部（Down）は堆積の底面から10cmの部位、側部（Lateral）は側面から11.5cmの部位を測定した。

【0038】

図1及び図2は、実施の一形態であり、堆積物の大きさはその都度調整されうるものである。

【発明を実施するための形態】

【0039】

本発明をさらに詳細に説明する。

【0040】

１．家畜敷料の殺菌剤及び殺菌方法
本発明は、少なくとも1種のBacillus coagulans 高温菌、或いは、該少なくとも1種のBacillus coagulans 高温菌と、少なくとも1種のBacillus subtilis 中温菌との組み合わせを、家畜敷料に添加し、敷料を発酵させる工程を含む、家畜敷料の殺菌方法を提供する。

【0041】

本発明の実施形態により、Bacillus coagulans 高温菌が、少なくとも40〜60℃の温度で生育可能であり、敷料中の生育に伴い発酵熱を生じることで有害菌に対し殺菌作用を有する。

【0042】

本発明の別の実施形態により、Bacillus subtilis中温菌が、少なくとも30〜50℃の温度で生育可能であり、敷料中の生育に伴い発酵熱を生じることで有害菌に対し殺菌作用を有する。

【0043】

本発明の別の実施形態により、上記工程では、上記微生物の発酵熱のみを利用することを特徴とする。

【0044】

この方法は、家畜に対し有害な大腸菌群、Salmonella属細菌、Campylobacter属細菌などの、敷料に混入した細菌を殺菌することができる。本発明者が実施した試験によれば、敷料中の有害菌を効果的に減少又は殺菌するためには、54℃以上の温度が必要であるし、殺菌効果を得るためには、60℃以上の温度に維持することが好ましい。

【0045】

Bacillus coagulans 高温菌は、40〜60℃の温度で生育可能であるという性質の他に、家畜排せつ物（通常、糞尿）を含む敷料の温度を発酵熱により54℃以上に高める能力を有しており、このために、敷料中の有害菌の効果的な殺菌が可能となる。Bacillus coagulans 高温菌及び/又はBacillus subtilis中温菌は、例えば、家畜アンモニア耐性試験を行ったのち、敷料の発酵試験によって選抜することができる。

【0046】

Bacillus coagulans 高温菌の具体例は、Bacillus coagulans CP3424株(国際寄託番号NITE BP-01692)、Bacillus coagulans CP3425株(国際寄託番号NITE BP-01693)、及びそれらの変異株である。

【0047】

また、Bacillus subtilis中温菌の具体例は、Bacillus subtilis C-3102株(国際寄託番号FERM BP-1096)又はその変異株である。

【0048】

好ましい菌株の組み合わせとして、Bacillus coagulans 高温菌がBacillus coagulans CP3425株(国際寄託番号NITE BP-01693)又はその変異株であり、及び、Bacillus subtilis中温菌がBacillus subtilis C-3102株(国際寄託番号FERM BP-1096)又はその変異株である。

【0049】

Bacillus coagulans CP3424株(国際寄託番号NITE BP-01692)及びBacillus coagulans CP3425株(国際寄託番号NITE BP-01693)は、国際寄託機関である独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（〒292-0818日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8 122号室）に2013年8月13日に寄託され、上記の国際寄託番号が付与された。これらの菌株は、16S rDNA配列を公知の菌種と比較することによって、それらが、Bacillus coagulansに属するものであると同定された。

【0050】

本発明によれば、これらのBacillus coagulans高温菌のいずれか又は両方の菌株のみか、或いは、これらのBacillus coagulans菌株の少なくとも1つとBacillus subtilis中温菌との組み合わせによって、敷料を殺菌することができる。

【0051】

Bacillus subtilis中温菌は、敷料中に添加されたとき、発酵熱により敷料を40℃以上に昇温しうる細菌である。好ましい中温菌は、Bacillus subtilis C-3102株(国際寄託番号FERM BP-1096)又は、該C-3102株と実質的に同等の殺菌作用を有するその変異株である。C-3102株は、1985年12月25日に、日本国茨城県つくば市東1丁目1番地1(寄託時;日本国茨城県筑波郡谷田部町東1丁目1番地3)の独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（寄託時；通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所）に寄託番号微工研寄第8584号として原寄託し、1986年6月28日に、同機関にて寄託番号FERM BP-1096(移管時;微工研条寄第1096号)として国際寄託に移管された。この寄託菌株は、現在、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許生物寄託センター（郵便番号292-0818 日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8 120号室）で保管・管理されている。この菌株はまた、特開昭63-209580号公報、特開昭62-232343号公報などにも記載されている。

【0052】

本発明では、上記の3種の寄託菌株の変異株であってもよく、そのような変異株は、各親株と同等の殺菌作用を有するものである。変異株は、親株を、ニトロソグアニジン、ニトロソウレア、エタンスルホン酸メチル、それらの誘導体などの化学変異原の存在下に培養するか、培養親株に、紫外線、ガンマ線、X線などの高エネルギー線を照射するなどの方法によって得ることができる。

【0053】

また、本発明で使用される上記の3種の寄託菌株又はそれらの変異株は、芽胞の形態で添加してもよい。芽胞は、生存に適さない環境下で形成される、菌自身を保護するための構造体であり、適する環境になった際には、発芽し栄養型細菌となることができる。

【0054】

上記の菌株をCP3424株＋C-3102株、或いは、CP3425株＋C-3102株の各組み合せで敷料に添加したときそれぞれ、C-3102株の単独添加より高い殺菌効果を示す（後述の実施例参照）。

【0055】

このように、本発明によれば、Bacillus subtilis中温菌を、Bacillus coagulans CP3424株(国際寄託番号NITE BP-01692)、Bacillus coagulans CP3425株(国際寄託番号NITE BP-01693)、及びそれらの変異株からなる群から選択される少なくとも1種のBacillus coagulans高温菌と組み合わせることによって、敷料の殺菌を効果的に行うことができる。

【0056】

上記のBacillus coagulans高温菌を、或いは、Bacillus coagulans高温菌とBacillus subtilis中温菌の組み合わせを家畜敷料に添加する場合、各菌を、例えば適切な量で敷料に添加することができるが、敷料内で生育し、かつ、敷料中で殺菌に必要な発酵熱を得ることが可能であればこの範囲に制限されない。

【0057】

各菌株は、Bacillus coagulans又はBacillus subtilisの培養のために通常使用されている培地、培養温度、培養時間などの培養条件にて好気的に培養し増殖することができる。

【0058】

培地は、炭素源、窒素源、微量元素などを含む、液体培地又は固体培地である。具体的には、培地には、ペプトン、ポリペプトン、肉エキス、酵母エキス、麦芽エキス、コーンスティープリカーなどの有機窒素源、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム等のアンモニウム塩、硝酸ナトリウム等の硝酸塩などの無機窒素源、グルコース、スクロース、マルトース、デンプン、ソルビトール、マルトオリゴ糖、デキストリンなどの炭素源、マグネシウム、カルシウム、ナトリウム、カリウム、鉄、亜鉛、銅などのリン酸塩、塩酸塩、硝酸塩、硫酸塩などの無機塩などを含有させることができる。

【0059】

培養温度は、30〜60℃、また、培地のpHは、6.0〜8.5としうる。

【0060】

培養時間は、10〜72時間としうる。

【0061】

培養後の菌株を遠心分離、膜分離等の分離法にて濃縮して得られた濃縮物、培養菌株を凍結乾燥などの乾燥法にて乾燥して得られた乾燥物などの形態として保存しうる。

【0062】

敷料の殺菌方法では、敷料に上記の菌株を添加して発酵を開始し、発酵熱（発酵温度は約55〜80℃）を利用して敷料を殺菌する。殺菌処理にかかる時間は、特に制限はないが、通常１〜2週間である。

【0063】

各菌の添加は、同時添加又は分離添加のいずれでもよい。分離添加の場合、好ましくは、Bacillus subtilis中温菌を先に添加し、敷料の発酵に伴う温度上昇を確認したのち、Bacillus coagulans高温菌を敷料に添加するのがよい。

【0064】

菌の添加は、万遍なく敷料に添加することができるのであれば特に制限はなく、例えば、用時調製した菌懸濁液を敷料に散布する、菌末を敷料に散布するなどの仕方で行うことができる。

【0065】

家畜敷料は、ニワトリ、ウシ、ブタ、ヤギ、七面鳥、ウズラなどの家畜の敷料であり、明細書中の「敷料」は、家畜の敷きわら又は寝わらを指し、通常、わら、もみ殻、牧草、木質系敷料（おがくず、等）などからなる。明細書中特に断らないかぎり、「敷料」は、使用済みのものであり、これには、家畜の排せつ物（通常、糞尿）が含まれており、有害菌が存在しているものをいう。有害菌には、上記のとおり、大腸菌群、Salmonella属細菌、Campylobacter属細菌などが含まれ、本発明の方法は、このような有害菌を殺菌し、敷料の再利用を可能にすることができる。好ましい敷料は、鶏糞敷料又は牛糞敷料である。

【0066】

本発明はさらに、Bacillus coagulans CP3424株(国際寄託番号NITE BP-01692)又はその変異株、並びに、Bacillus coagulans CP3425株(国際寄託番号NITE BP-01693) 又はその変異株を提供する。

【0067】

これらの菌株又は変異株については、上で説明したとおりである。いずれの変異株も、各親株と実質的に同等の敷料有害菌殺菌作用を有する。明細書中、「実質的に同等」という用語は、殺菌効果のレベル及び/又は有害菌の種類が、完全に同一でなくてもよいがほぼ同等であることを意味する。

【0068】

本発明はさらに、上記の殺菌方法で使用可能である、少なくとも1種のBacillus coagulans高温菌、或いは、該少なくとも1種のBacillus coagulans高温菌と、少なくとも1種のBacillus subtilis中温菌との組み合わせを、有効成分として含む、家畜敷料の殺菌剤を提供する。

【0069】

【0070】

【0071】

Bacillus coagulans高温菌及びBacillus subtilis中温菌は、上記の選抜手順を用いて家畜敷料中から選抜することができる。

【0072】

本発明の殺菌剤の具体例は、Bacillus coagulans 高温菌が、Bacillus coagulans CP3424株(国際寄託番号NITE BP-01692)、Bacillus coagulans CP3425株(国際寄託番号NITE BP-01693)、及びそれらの変異株からなる群から選択される菌株を含む殺菌剤である。

【0073】

本発明の殺菌剤の別の例は、Bacillus coagulans CP3424株(国際寄託番号NITE BP-01692)、Bacillus coagulans CP3425株(国際寄託番号NITE BP-01693)及びそれらの変異株からなる群から選択される少なくとも1種のBacillus coagulans 高温菌と、Bacillus subtilis C-3102株(国際寄託番号FERM BP-1096)又はその変異株であるBacillus subtilis中温菌とを有効成分として含む殺菌剤である。

【0074】

好ましい殺菌剤の例は、Bacillus coagulans CP3425株(国際寄託番号NITE BP-01693)又はその変異株であるBacillus coagulans 高温菌と、Bacillus subtilis C-3102株(国際寄託番号FERM BP-1096)又はその変異株であるBacillus subtilis中温菌を有効成分として含む殺菌剤である。

【0075】

本発明の殺菌剤は、上記菌株の混合物の形態であってもよいし、或いは、各菌株を分離した状態でパッケージングしてなる、所謂キットのような形態であってもよい。菌株は、使用時に増殖可能であるかぎり、粉末、顆粒、懸濁、濃縮、担体固定化などの任意の形態をなし、また、固体、液体、半固体、ゲルなどのいずれの状態もとりうるものとする。

【0076】

本発明の殺菌剤は、組成物の形態であってもよく、すなわち、上記定義のBacillus coagulans 高温菌と上記定義のBacillus subtilis中温菌からなる敷料殺菌用組成物でありうる。

【0077】

２．有機廃棄物又は家畜敷料の堆肥化促進剤及び堆肥化促進方法
本発明はまた、少なくとも1種のBacillus coagulans 高温菌、或いは、該少なくとも1種のBacillus coagulans高温菌と、少なくとも1種のBacillus subtilis中温菌との組み合わせを、有機廃棄物又は家畜敷料に添加し、有機廃棄物又は敷料を発酵させる工程を含む、有機廃棄物又は敷料の堆肥化促進方法を提供する。

【0078】

本発明の実施形態により、Bacillus coagulans 高温菌が、少なくとも40〜60℃の温度で生育可能であり、有機廃棄物又は家畜敷料の堆肥化促進作用を有する。

【0079】

本発明の別の実施形態により、Bacillus subtilis中温菌が、少なくとも30〜50℃の温度で生育可能であり、有機廃棄物又は家畜敷料の堆肥化促進作用を有する。

【0080】

本発明の別の実施形態により、上記工程では、上記微生物の発酵熱のみを利用することを特徴とする。

【0081】

Bacillus coagulans 高温菌及びBacillus subtilis中温菌は、上記の選抜手順により、例えば家畜敷料から選抜することができる。

【0082】

Bacillus coagulans 高温菌の具体例は、Bacillus coagulans CP3424株(国際寄託番号NITE BP-01692)、Bacillus coagulans CP3425株(国際寄託番号NITE BP-01693)、及びそれらの変異株からなる群から選択される。

【0083】

Bacillus subtilis中温菌の具体例は、Bacillus subtilis C-3102株(国際寄託番号FERM BP-1096)又はその変異株である。

【0084】

好適な菌の組み合わせとして、Bacillus coagulans 高温菌がBacillus coagulans CP3425株(国際寄託番号NITE BP-01693)又はその変異株であり、及び、Bacillus subtilis中温菌がBacillus subtilis C-3102株(国際寄託番号FERM BP-1096)又はその変異株である。

【0085】

各菌株及び剤、敷料等については、上記第１節で説明したとおりであり、この第２節でも同様に参照されるべきである。

【0086】

上で説明した敷料の殺菌方法はまた、不要になった又は廃棄される予定の敷料や、生産現場、調理現場、家庭内から廃棄される生ごみなどの有機廃棄物の堆肥化のために使用することができる。すなわち、このような敷料や有機廃棄物に、上記菌株の組み合わせを添加することによって、敷料又は有機廃棄物を発酵させ、発酵熱を利用することにより有機廃棄物又は敷料の堆肥化を促進する。発酵温度は、約55〜80℃となるため、発酵の促進とともに、水分の蒸散及び有害菌の殺菌が行われる。堆肥化時には、好ましくは、敷料や有機廃棄物を、時々又は常時、撹拌して又は混ぜ合わせて空気の取り込みをすることにより、効果的な発酵と堆肥化が可能となる。

【0087】

この方法で添加される菌株の添加時の量は、菌株が増殖し堆肥化を促進する量とする。また、堆肥化処理にかかる時間は、特に制限はないが、通常2〜3ヶ月である。

【0088】

上記の方法により得られた堆肥は、植物の栽培など農業分野で使用することができる。

【0089】

本発明はまた、上記の堆肥化促進方法で使用可能である、少なくとも1種のBacillus coagulans 高温菌、或いは、該少なくとも1種のBacillus coagulans高温菌と、少なくとも1種のBacillus subtilis中温菌との組み合わせを、有効成分として含む、有機廃棄物又は家畜敷料の堆肥化促進剤を提供する。

【0090】

【0091】

【0092】

上記剤の形態等については、上記殺菌剤で説明したものと同じであり、具体的には上記１節の説明を参照するべきである。

【0093】

Bacillus coagulans高温菌及びBacillus subtilis中温菌は、上記の選抜手順を用いて家畜敷料中から選抜することができる。

【0094】

本発明の堆肥化促進剤の具体例は、Bacillus coagulans 高温菌が、Bacillus coagulans CP3424株(国際寄託番号NITE BP-01692)、Bacillus coagulans CP3425株(国際寄託番号NITE BP-01693)、及びそれらの変異株からなる群から選択される菌株を含む堆肥化促進剤である。

【0095】

本発明の堆肥化促進剤の別の例は、Bacillus coagulans CP3424株(国際寄託番号NITE BP-01692)、Bacillus coagulans CP3425株(国際寄託番号NITE BP-01693)及びそれらの変異株からなる群から選択される少なくとも1種のBacillus coagulans 高温菌と、Bacillus subtilis C-3102株(国際寄託番号FERM BP-1096)又はその変異株であるBacillus subtilis中温菌とを有効成分として含む堆肥化促進剤である。

【0096】

好ましい堆肥化促進剤の例は、Bacillus coagulans CP3425株(国際寄託番号NITE BP-01693)又はその変異株であるBacillus coagulans 高温菌と、Bacillus subtilis C-3102株(国際寄託番号FERM BP-1096)又はその変異株であるBacillus subtilis中温菌を有効成分として含む堆肥化促進剤である。

【0097】

本発明の堆肥化促進剤は、組成物の形態であってもよく、すなわち、上記定義のBacillus coagulans 高温菌と上記定義のBacillus subtilis中温菌からなる敷料堆肥化促進用組成物でありうる。

【実施例】

【0098】

以下の実施例を参照しながら本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の技術的範囲は、それらの実施例によって制限されないものとする。

【0099】

[実施例１]
１．微生物の分離及び同定
日本で採取した敷料を、滅菌水で懸濁して希釈し、標準寒天培地あるいはCYC寒天培地（ATCC medium 2591）に塗抹して、50℃あるいは60℃にて培養し、コロニーを形成させた。単離したコロニーを純化し、16S rRNA遺伝子配列の相同性に基づき同定した。

【0100】

２．アンモニア耐性によるスクリーニング
分離・同定した菌株の培養菌体を滅菌水で懸濁して希釈し、アンモニウム塩を添加したTS培地および高アンモニウム塩培地に滴下した。50℃、約12時間培養し、アンモニア塩を含むTS培地および高アンモニウム塩培地でのコロニーの大きさを基準にして微生物を選択した。このアンモニア耐性を有する微生物を選択する手法により、Bacillus licheniformis 群およびBacillus coagulans 群を選択した。

【0101】

３．発酵温度によるスクリーニング
Bacillus subtilis C-3102株（FERM BP-1096）を1 x 10⁵ cfu/g含む鶏の飼育に使用した敷料600 kgに分離したBacillus licheniformis群およびBacillus coagulans群を添加し、混合した。4-5日後に切返し、さらに4日間発酵させ、Bacillus licheniformis 群、もしくはBacillus coagulans 群の添加により発酵時の熱量が向上するかどうか観察した。熱量は敷料堆積物(図1)の3箇所(図2)の温度を測定し、式１にて算出した(表１)。
［式１］

【表1-1】

【表1-2】

【0102】

表中、上部（Up）、下部（Down）及び側部（Lateral）は、図2に示す位置を表す。

【0103】

その結果、Bacillus coagulans 群を加えた場合、Bacillus licheniformis 群と比較して熱量の向上が観察された。
次に、Bacillus coagulans群を構成する各菌株が実際に敷料の温度上昇に寄与するかどうか検討した。Bacillus subtilis C-3102株（FERM BP-1096）を1x 10⁵ cfu/g含む鶏の飼育に使用した敷料500 kgに、Bacillus coagulans 群の構成菌株であるBacillus coagulans CP3424株およびCP3425株を添加し、混合した。4日後に切返し、さらに4日間発酵させ、熱量が向上するかどうか観察した。熱量は敷料堆積物(図1)の3箇所(図2)の温度を測定し、式１にて算出した(表2)。

【表2】

【0104】

その結果、Bacillus subtilis C-3102株（FERM BP-1096）単独と比較して、Bacillus coagulans CP3424株およびBacillus coagulans CP3425株を添加した際に熱量が高くなることが明らかとなった。特に、Bacillus coagulans CP3425株のUpではBacillus subtilis C-3102株の約10倍の熱量を得ていた。これらのことから、Bacillus coagulans CP3424株およびCP3425株の添加により、敷料の温度上昇を促進させ、熱量を高めることにより、効果的に敷料を殺菌することができるといえる。

【0105】

[実施例２]
１．脱脂大豆を用いた発酵温度の確認
Bacillus subtilis C-3102株（FERM BP-1096）とBacillus coagulans CP3425株について、それぞれの芽胞化した菌体を水に懸濁した液体を脱脂大豆500gと混合した。この混合物を発泡スチロール容器に充填して培養し、その中心部の温度変化を3日間測定した。熱量は発泡スチロール容器の中心部の温度を測定して、式１にて算出した(表3)。

【表3】