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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】6570448
(24)【登録日】2019年8月16日
(45)【発行日】2019年9月4日
(54)【発明の名称】インフルエンザウイルス阻害薬
(51)【国際特許分類】
A61K 38/46 20060101AFI20190826BHJP
A61K 35/76 20150101ALI20190826BHJP
A61P 31/16 20060101ALI20190826BHJP
C07K 14/11 20060101ALI20190826BHJP
C12N 15/44 20060101ALI20190826BHJP
【ＦＩ】
A61K38/46
A61K35/76
A61P31/16
C07K14/11ZNA
C12N15/44
【請求項の数】14
【全頁数】25
(21)【出願番号】特願2015-540528(P2015-540528)
(86)(22)【出願日】2014年10月1日
(86)【国際出願番号】JP2014076317
(87)【国際公開番号】WO2015050170
(87)【国際公開日】20150409
【審査請求日】2017年9月4日
(31)【優先権主張番号】特願2013-207471(P2013-207471)
(32)【優先日】2013年10月2日
(33)【優先権主張国】JP
(31)【優先権主張番号】特願2014-94681(P2014-94681)
(32)【優先日】2014年5月1日
(33)【優先権主張国】JP
(73)【特許権者】
【識別番号】599045903
【氏名又は名称】学校法人 久留米大学
(74)【代理人】
【識別番号】100081422
【弁理士】
【氏名又は名称】田中 光雄
(74)【代理人】
【識別番号】100084146
【弁理士】
【氏名又は名称】山崎 宏
(74)【代理人】
【識別番号】100122301
【弁理士】
【氏名又は名称】冨田 憲史
(74)【代理人】
【識別番号】100156111
【弁理士】
【氏名又は名称】山中 伸一郎
(72)【発明者】
【氏名】上村 勇作
(72)【発明者】
【氏名】柏木 孝仁
(72)【発明者】
【氏名】原 好勇
(72)【発明者】
【氏名】渡邊 浩
【審査官】
小林 薫
(56)【参考文献】
【文献】
特表２０１２−５１２６３３（ＪＰ，Ａ）
【文献】
J. Virol., 1996, Vol.70, No.3, p.1905-1911
【文献】
J. Virol., 2010, Vol.84, No.18, p.9096-9104
【文献】
Nature, 2009, Vol.458, p.914-918
【文献】
J. Virol., 2013.03, Vol.87, No.6, p.3108-3118
【文献】
PLoS ONE, 2010, Vol.5, Issue 12, e15140 (p.1-11)
【文献】
感染症学雑誌, 2013.05.07, Vol.87, Suppl., p.191 (O1-003)
【文献】
J. Virol., 2006, Vol.80, No.16, p.7789-7798
(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）
Ｃ０７Ｋ １／００−１９／００
Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０
Ｃ１２Ｎ １／００− ７／０８
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ
ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ
ＤＷＰＩ（Ｄｅｒｗｅｎｔ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
エンドヌクレアーゼ活性を保持しているインフルエンザウイルス由来ＰＡサブユニット断片を含むインフルエンザウイルス阻害薬。
【請求項2】
ＰＡサブユニット断片の由来するインフルエンザウイルスがＡ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／２００４（Ｈ５Ｎ１）株、Ａ／ＷＳＮ／３３株（ソ連型Ｈ１Ｎ１）、Ａ／ＮＴ／６０／６８株（香港型Ｈ３Ｎ２）、Ａ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／１５６／９７株（１９９７年トリ型Ｈ５Ｎ１）またはＡ／Ｋｕｒｕｍｅ／Ｋ０９１０／２００９株（２００９パンデミックＨ１Ｎ１）である、請求項１に記載のインフルエンザウイルス阻害薬。
【請求項3】
ＰＡサブユニット断片がＰＡサブユニットのＮ末端断片である、請求項１または２に記載のインフルエンザウイルス阻害薬。
【請求項4】
ＰＡサブユニット断片が、配列番号４のアミノ酸配列のＮ末端から２８番目のプロリン（Ｐ）、８６番目のメチオニン（Ｍ）、９１番目のバリン（Ｖ）および１００番目のバリン（Ｖ）よりなる群から選ばれた少なくとも１のアミノ酸を含むＰＡサブユニット断片である、請求項１ないし３のいずれかに記載のインフルエンザウイルス阻害薬。
【請求項5】
ＰＡサブユニット断片が、配列番号４のアミノ酸配列のＮ末端から２８番目のプロリン（Ｐ）、８６番目のメチオニン（Ｍ）、９１番目のバリン（Ｖ）および１００番目のバリン（Ｖ）を含むＰＡサブユニット断片である、請求項４に記載のインフルエンザウイルス阻害薬。
【請求項6】
ＰＡサブユニット断片が、配列番号４のアミノ酸配列のＮ末端から１８７番目のロイシン（Ｌ）および／または１８８番目のトリプトファン（Ｗ）を含むＰＡサブユニット断片である、請求項１ないし５のいずれかに記載のインフルエンザウイルス阻害薬。
【請求項7】
ＰＡサブユニット断片が配列番号３のヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を含む、請求項１ないし６のいずれかに記載のインフルエンザウイルス阻害薬。
【請求項8】
ＰＡサブユニット断片が配列番号４のアミノ酸配列を含む、請求項１ないし７のいずれかに記載のインフルエンザウイルス阻害薬。
【請求項9】
ＰＡサブユニット断片が、配列番号４のアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を含む、請求項１ないし８のいずれかに記載のインフルエンザウイルス阻害薬。
【請求項10】
ＰＡサブユニット断片が、配列番号４のアミノ酸配列のＮ末端から１８７番目までのアミノ酸配列（配列番号５）を含むＰＡサブユニット断片である、請求項１ないし５のいずれかに記載のインフルエンザウイルス阻害薬。
【請求項11】
ＰＡサブユニット断片が、配列番号４のアミノ酸配列のＮ末端から１８８番目までのアミノ酸配列（配列番号６）を含むＰＡサブユニット断片である、請求項１ないし６のいずれかに記載のインフルエンザウイルス阻害薬。
【請求項12】
ＰＡサブユニット断片が、配列番号４のアミノ酸配列のＮ末端から１９２番目までのアミノ酸配列（配列番号７）を含むＰＡサブユニット断片である、請求項１ないし６のいずれかに記載のインフルエンザウイルス阻害薬。
【請求項13】
インフルエンザウイルスの遺伝子複製を阻害することによってウイルス増殖を阻害する、請求項１ないし１２のいずれかに記載のインフルエンザウイルス阻害薬。
【請求項14】
Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／２００４（Ｈ５Ｎ１）株、Ａ／ＷＳＮ／３３株（ソ連型Ｈ１Ｎ１）、Ａ／ＮＴ／６０／６８株（香港型Ｈ３Ｎ２）、Ａ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／１５６／９７株（１９９７年トリ型Ｈ５Ｎ１）およびＡ／Ｋｕｒｕｍｅ／Ｋ０９１０／２００９株（２００９パンデミックＨ１Ｎ１）よりなる群から選ばれるいずれのインフルエンザウイルス株に対してもウイルス増殖を阻害する、請求項１ないし１３のいずれかに記載のインフルエンザウイルス阻害薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、インフルエンザウイルス由来ＰＡサブユニット断片、および該断片を含むインフルエンザウイルス阻害薬に関する。【背景技術】
【0002】
インフルエンザウイルスは、マイナス鎖ＲＮＡをゲノムとして持つＲＮＡウイルスである。インフルエンザウイルスの表現型またはゲノムの塩基配列は頻繁に変異し、場合により種の壁を超えて感染する。【0003】
インフルエンザウイルスは、ウイルス粒子を構成するタンパク質の抗原性の違いから、Ａ型、Ｂ型およびＣ型の３属に分類されるが、人に感染を引き起こし、毎年冬期に流行を繰り返すのは、主にＡ型とＢ型である。【0004】
大多数の現在のインフルエンザ薬は、ウイルス表面に存在するノイラミニダーゼ（ＮＡ）を標的とする。ビリオン表面に存在する抗原はヘマグルチニン（ＨＡ）とＮＡの２種類があり（非特許文献１）、１６種類のＨＡサブタイプおよび９種類の異なるＮＡサブタイプが同定されている（非特許文献２）。このサブタイプの組み合わせにより、インフルエンザウイルスの型（例えば、Ｈ１Ｎ１型、Ｈ３Ｎ２型、Ｈ５Ｎ１型など）が決定される。例えば、オセルタミビル（「タミフル」として市販）とザナミビル（リレンザ）はＮＡ阻害薬であり、ウイルス粒子が感染細胞から放出されることを防ぐ（非特許文献３〜６）。しかしながら、オセルタミビル耐性インフルエンザがすでに出現しており、またこの薬は因果関係が不明であるものの異常行動の報告があるため、１０歳上の未成年には投与を差し控える必要があり、小児においては対象児が投与後に一人にならないように配慮する必要がある。抗インフルエンザ薬のアマンタジンはＭ２タンパク質（ウイルスプロトンチャネル）を標的としており（非特許文献７）、また、別の薬剤が、インフルエンザ由来のＭ２タンパク質の立体構造に基づいて開発されている。しかしながら、Ｍ２タンパク質を標的とした薬物の場合、Ｍ２の単一の残基の変異によってウイルスが耐性を獲得できるため、多くの株に対して役に立たなくなる可能性がある。また、Ｂ型インフルエンザはＭ２を持たない。オセルタミビルとアマンダジンの両者は、単一の知られている機能とウイルス株の間で実質的な配列変異を獲得するタンパク質を標的とする。従って、ウイルスのライフサイクルにおける他のプロセスを破壊する新しいリード分子を開発する必要性がある。【0005】
インフルエンザウイルスのＲＮＡポリメラーゼは、人への感染後、ウイルス増殖に関わる重要な役割を果たしているため、抗インフルエンザ薬のターゲットとなり得る。しかしながら、ウイルスＲＮＡポリメラーゼを標的としている薬物療法は現在のところ唯一、Ｔ７０５（一般名：ファビピラビル：富山化学）がある（非特許文献８）。ウイルスＲＮＡポリメラーゼは、ウイルスが複製するための広範な役割を担っている（非特許文献９）。このポリメラーゼは、ヘテロ三量体の複合体からなり、全分子量がほぼ２５０ｋＤａであり、ＰＡ、ＰＢ１およびＰＢ２の３つのサブユニットから構成される（非特許文献１０）。これらの３つのサブユニットのすべてが、転写と複製の両方に必要である（非特許文献１１）。今までのところ、ＲＮＡポリメラーゼの構造に関する情報は、非常に限定されている（非特許文献１２〜１４）。【先行技術文献】
【非特許文献】
【0006】
【非特許文献1】Hsieh, H. P. & Hsu, J. T., Curr. Pharm. Des. 13, 3531-42 (2007)
【非特許文献2】World Health Organization., Bull. World Health Organ. 58, 585-591 (1980)
【非特許文献3】Kim, C. U. et al., J. Am. Chem. Soc. 119, 681-690 (1997)
【非特許文献4】von Itzstein, M. et al., Nature 363, 418-423 (1993)
【非特許文献5】Liu, Y., Zhang, J. & Xu, W., Curr. Med. Chem. 14, 2872-91 (2007)
【非特許文献6】Russel, R. J. et al., Nature 443, 45-49 (2006)
【非特許文献7】Wang, C. et al, J. Virol. 67, 5585-5594 (1993); and Stouffer, A. L. et al., Nature 451, 596-599 (2008)
【非特許文献8】Furuta Y. et al., Antimicrob Agents Chemother. 2002 Apr;46(4):977-81.
【非特許文献9】Braam, J. et al., Cell 34, 609-618 (1983)
【非特許文献10】Horisberger, M. A. Virology 107, 302-305 (1980)
【非特許文献11】Huang, T. S. et al., J. Virol. 64, 5669-5673 (1990)
【非特許文献12】Area, E. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101, 308-313 (2004)
【非特許文献13】Torreira, E. et al., Nucleic Acids Res. 35, 3774-3783 (2007)
【非特許文献14】Tarendeau, F. et al., Nature Struct. Mol. Biol. 14, 299-233 (2007)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
このように、インフルエンザに対する対策として現在行われているのは、ワクチンによる予防と、ノイラミニダーゼ阻害薬（以下、ＮＡ阻害薬）による治療である。しかしながら、ワクチンによる予防は完全ではなく、特に型予想が外れた場合にはその効果は著しく低下する。また、現在使用可能なＮＡ阻害薬は全て作用機序が同じであり、耐性ウイルスが生じた場合には、全ての薬剤に耐性となる可能性が高い。すなわち、変異ウイルスの生じやすいインフルエンザウイルスに対する対策として不十分である。【課題を解決するための手段】
【0008】
本発明らは、前記課題を解決するために鋭意研究した結果、インフルエンザウイルス自身のタンパク質であるＰＡサブユニットの断片がインフルエンザウイルスの遺伝子複製を停止させ、インフルエンザウイルスの増殖そのものを抑制する作用を有することを見出し、本発明を完成させるに到った。【0009】
すなわち、本発明は、インフルエンザウイルス自身のタンパク質であるＰＡサブユニットを利用したインフルエンザウイルスの阻害薬であり、現存するＮＡ阻害薬とは作用機序が全く異なる。ＮＡ阻害薬の作用機序は、ウイルスの放出阻害であるため、インフルエンザウイルスの増殖は阻害できない。一方で、本発明による阻害薬ではインフルエンザウイルスの遺伝子複製を停止する作用があるため、インフルエンザウイルスの増殖そのものを止める作用がある。またワクチンが特定の株に対する対抗手段であるのに対して、本発明の阻害薬は多くの株に対して一律に有効である。【0010】
本発明は、以下を含む。［１］インフルエンザウイルス由来ＰＡサブユニット断片。
［２］インフルエンザウイルスがＡ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／２００４（Ｈ５Ｎ１）株、Ａ／ＷＳＮ／３３株（ソ連型Ｈ１Ｎ１）、Ａ／ＮＴ／６０／６８株（香港型Ｈ３Ｎ２）、Ａ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／１５６／９７株（１９９７年トリ型Ｈ５Ｎ１）またはＡ／Ｋｕｒｕｍｅ／Ｋ０９１０／２００９株（２００９パンデミックＨ１Ｎ１）である、［１］に記載のＰＡサブユニット断片。
［３］ＰＡサブユニットのＮ末端断片である、［１］または［２］に記載のＰＡサブユニット断片。
［４］ＰＡサブユニット断片がエンドヌクレアーゼ活性を保持している、［１］ないし［３］のいずれかに記載のＰＡサブユニット断片。
［５］ＰＡサブユニット断片が、天然のＰＡサブユニットのアミノ酸配列のＮ末端から２８番目のプロリン（Ｐ）、８６番目のメチオニン（Ｍ）、９１番目のバリン（Ｖ）および１００番目のバリン（Ｖ）よりなる群から選ばれた少なくとも１のアミノ酸を含むＰＡサブユニット断片である、［１］ないし［４］のいずれかに記載のＰＡサブユニット断片。
［６］ＰＡサブユニット断片が、天然のＰＡサブユニットのアミノ酸配列のＮ末端から２８番目のプロリン（Ｐ）、８６番目のメチオニン（Ｍ）、９１番目のバリン（Ｖ）および１００番目のバリン（Ｖ）を含むＰＡサブユニット断片である、［５］に記載のＰＡサブユニット断片。
［７］ＰＡサブユニット断片が、天然のＰＡサブユニットのアミノ酸配列のＮ末端から１８７番目のロイシン（Ｌ）および／または１８８番目のトリプトファン（Ｗ）を含むＰＡサブユニット断片である、［１］ないし［６］のいずれかに記載のＰＡサブユニット断片。
［８］配列番号３のヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を含む、［１］ないし［７］のいずれかに記載のＰＡサブユニット断片。
［９］配列番号４のアミノ酸配列を含む、［１］ないし［８］のいずれかに記載のＰＡサブユニット断片。
［１０］配列番号４のアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を含む、［１］ないし［９］のいずれかに記載のＰＡサブユニット断片。
［１１］ＰＡサブユニット断片が、天然のＰＡサブユニットのアミノ酸配列のＮ末端から１８７番目までのアミノ酸配列（配列番号５）を含むＰＡサブユニット断片である、［１］ないし［６］のいずれかに記載のＰＡサブユニット断片。
［１２］ＰＡサブユニット断片が、天然のＰＡサブユニットのアミノ酸配列のＮ末端から１８８番目までのアミノ酸配列（配列番号６）を含むＰＡサブユニット断片である、［１］ないし［７］のいずれかに記載のＰＡサブユニット断片。
［１３］ＰＡサブユニット断片が、天然のＰＡサブユニットのアミノ酸配列のＮ末端から１９２番目までのアミノ酸配列（配列番号７）を含むＰＡサブユニット断片である、［１］ないし［７］のいずれかに記載のＰＡサブユニット断片。
［１４］［１］ないし［１３］のいずれかに記載のＰＡサブユニット断片をコードする核酸。
［１５］［１４］に記載の核酸を含む組換えベクター。
［１６］［１５］に記載のベクターを含む形質転換細胞。
［１７］インフルエンザウイルス由来ＰＡサブユニット断片を含むインフルエンザウイルス阻害薬。
［１８］ＰＡサブユニット断片の由来するインフルエンザウイルスがＡ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／２００４（Ｈ５Ｎ１）株、Ａ／ＷＳＮ／３３株（ソ連型Ｈ１Ｎ１）、Ａ／ＮＴ／６０／６８株（香港型Ｈ３Ｎ２）、Ａ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／１５６／９７株（１９９７年トリ型Ｈ５Ｎ１）またはＡ／Ｋｕｒｕｍｅ／Ｋ０９１０／２００９株（２００９パンデミックＨ１Ｎ１）である、［１７］に記載のインフルエンザウイルス阻害薬。
［１９］ＰＡサブユニット断片がＰＡサブユニットのＮ末端断片である、［１７］または［１８］に記載のインフルエンザウイルス阻害薬。
［２０］ＰＡサブユニット断片がエンドヌクレアーゼ活性を保持している、［１７］ないし［１９］のいずれかに記載のインフルエンザウイルス阻害薬。
［２１］ＰＡサブユニット断片が、天然のＰＡサブユニットのアミノ酸配列のＮ末端から２８番目のプロリン（Ｐ）、８６番目のメチオニン（Ｍ）、９１番目のバリン（Ｖ）および１００番目のバリン（Ｖ）よりなる群から選ばれた少なくとも１のアミノ酸を含むＰＡサブユニット断片である、［１７］ないし［２０］のいずれかに記載のインフルエンザウイルス阻害薬。
［２２］ＰＡサブユニット断片が、天然のＰＡサブユニットのアミノ酸配列のＮ末端から２８番目のプロリン（Ｐ）、８６番目のメチオニン（Ｍ）、９１番目のバリン（Ｖ）および１００番目のバリン（Ｖ）を含むＰＡサブユニット断片である、［２１］に記載のインフルエンザウイルス阻害薬。
［２３］ＰＡサブユニット断片が、天然のＰＡサブユニットのアミノ酸配列のＮ末端から１８７番目のロイシン（Ｌ）および／または１８８番目のトリプトファン（Ｗ）を含むＰＡサブユニット断片である、［１７］ないし［２２］のいずれかに記載のインフルエンザウイルス阻害薬。
［２４］ＰＡサブユニット断片が配列番号３のヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を含む、［１７］ないし［２３］のいずれかに記載のインフルエンザウイルス阻害薬。
［２５］ＰＡサブユニット断片が配列番号４のアミノ酸配列を含む、［１７］ないし［２４］のいずれかに記載のインフルエンザウイルス阻害薬。
［２６］ＰＡサブユニット断片が、配列番号４のアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を含む、［１７］ないし［２５］のいずれかに記載のインフルエンザウイルス阻害薬。
［２７］ＰＡサブユニット断片が、天然のＰＡサブユニットのアミノ酸配列のＮ末端から１８７番目までのアミノ酸配列（配列番号５）を含むＰＡサブユニット断片である、［１７］ないし［２２］のいずれかに記載のＰＡサブユニット断片。
［２８］ＰＡサブユニット断片が、天然のＰＡサブユニットのアミノ酸配列のＮ末端から１８８番目までのアミノ酸配列（配列番号６）を含むＰＡサブユニット断片である、［１７］ないし［２３］のいずれかに記載のＰＡサブユニット断片。
［２９］ＰＡサブユニット断片が、天然のＰＡサブユニットのアミノ酸配列のＮ末端から１９２番目までのアミノ酸配列（配列番号７）を含むＰＡサブユニット断片である、［１７］ないし［２３］のいずれかに記載のＰＡサブユニット断片。
［３０］インフルエンザウイルスの遺伝子複製を阻害することによってウイルス増殖を阻害する、［１７］ないし［２９］のいずれかに記載のインフルエンザウイルス阻害薬。
［３１］Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／２００４（Ｈ５Ｎ１）株、Ａ／ＷＳＮ／３３株（ソ連型Ｈ１Ｎ１）、Ａ／ＮＴ／６０／６８株（香港型Ｈ３Ｎ２）、Ａ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／１５６／９７株（１９９７年トリ型Ｈ５Ｎ１）およびＡ／Ｋｕｒｕｍｅ／Ｋ０９１０／２００９株（２００９パンデミックＨ１Ｎ１）よりなる群から選ばれるいずれのインフルエンザウイルス株に対してもウイルス増殖を阻害する、［１７］ないし［３０］のいずれかに記載のインフルエンザウイルス阻害薬。
【発明の効果】
【0011】
本発明は、インフルエンザウイルス自身のタンパク質であるＰＡサブユニットを利用したインフルエンザウイルスの阻害薬であり、タミフル等のインフルエンザ阻害薬の作用とは全く異なり、インフルエンザウイルス自体の増殖を抑制する画期的な作用を有する。また、その阻害効果も、従来のタミフル等と比較して格段に優れた効果を示し、マイクログラムオーダーの投与で増殖が１／１０００以下に抑制される。さらに、従来のインフルエンザ薬のようにウイルス表面に存在するＨＡやＮＡを標的とせず、遺伝子複製酵素を含むインフルエンザウイルスのＲＮＰ（核酸タンパク質複合体）に作用するため、単一のインフルエンザウイルス株のみを対象とせず、Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／２００４（Ｈ５Ｎ１）株、Ａ／ＷＳＮ／３３株（ソ連型Ｈ１Ｎ１）、Ａ／ＮＴ／６０／６８株（香港型Ｈ３Ｎ２）、Ａ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／１５６／９７株（１９９７年トリ型Ｈ５Ｎ１）およびＡ／Ｋｕｒｕｍｅ／Ｋ０９１０／２００９株（２００９パンデミックＨ１Ｎ１）よりなる群から選ばれるいずれのインフルエンザウイルス株にも極端に優れた阻害作用があり、ウイルス株に依存しない幅広い適用が可能である。【図面の簡単な説明】
【0012】
【図5】図５は、ＶＮ ＰＡ Ｎ２１２以外の他の株由来のＰＡサブユニット断片も同様の阻害活性を有することを示す図である。図５の左のパネルはルシフェラーゼの活性測定によるもの、図５の右のパネルはPrimer Extension Assayにて測定したものを示す。ＷＳＮ：Ａ／ＷＳＮ／３３株（ソ連型Ｈ１Ｎ１）；ＮＴ：Ａ／ＮＴ／６０／６８株（香港型Ｈ３Ｎ２）；ＨＫ：Ａ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／１５６／９７株（１９９７年トリ型Ｈ５Ｎ１）；ＶＮ：Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／２００４（Ｈ５Ｎ１）株；ＳＷ：Ａ／Ｋｕｒｕｍｅ／Ｋ０９１０／２００９株（２００９パンデミックＨ１Ｎ１）
【発明を実施するための形態】
【0013】
本発明は、インフルエンザウイルス自身のタンパク質であるＰＡサブユニットを利用したインフルエンザウイルスの阻害薬であり、現存するＮＡ阻害薬とは作用機序が全く異なる。ＮＡ阻害薬の作用機序は、ウイルスの放出阻害であるため、インフルエンザウイルスの増殖は阻害できない。一方、本発明による阻害薬ではインフルエンザウイルスの遺伝子複製を停止する作用があるため、インフルエンザウイルスの増殖そのものを止める作用がある。またワクチンが特定の株に対する対抗手段であるのに対して、本発明の阻害薬は多くの株に対して一律に有効である。【0014】
以下、本発明を詳細に説明する。以下の実施の形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明をこの実施の形態のみに限定する趣旨ではない。本発明は、その要旨を逸脱しない限り、様々な形態で実施をすることができる。【0015】
本発明の原理は以下のとおりである。図１はインフルエンザウイルスのリバースジェネティクス法（ウイルスの人工合成法）を応用したインフルエンザウイルスのレプリコン構築を示す。細胞内に、インフルエンザウイルスのＲＮＰ（核酸・タンパク質複合体）を構成するＲＮＡポリメラーゼＰＢ１サブユニット（ＰＢ１）、ＲＮＡポリメラーゼＰＢ２サブユニット（ＰＢ２）、ＲＮＡポリメラーゼＰＡサブユニット（ＰＡ）およびＮＰタンパク質（核蛋白；ＮＰ）と、インフルエンザウイルスの遺伝子を改変（インフルエンザウイルスの遺伝子に代わってホタルルシフェラーゼ遺伝子を導入）したｖＬＵＣをＨＥＫ２９３Ｔ細胞にプラスミドを利用して導入する。それぞれのプラスミドから生じたＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡおよびＮＰはタンパク質として細胞内に発現し、ｖＬＵＣはウイルス様ＲＮＡとして細胞内に発現する。それぞれの構成成分は、２９３Ｔ細胞内で集合し、インフルエンザウイルスのＲＮＰ（ただし遺伝子はホタルルシフェラーゼ）を形成する。このＲＮＰは細胞内で自律的に遺伝子複製と転写を行える、つまり、インフルエンザウイルスの遺伝子複製と転写を人工的に細胞内に構築したレプリコンである。また、遺伝子をホタルルシフェラーゼに置換しているためこのレプリコンの転写産物から生じてくるタンパク質は、インフルエンザウイルスのタンパク質ではなくホタルルシフェラーゼである。このホタルルシフェラーゼの活性を測定することで、インフルエンザウイルスＲＮＰの細胞内活性を評価できる。本発明では、ＶＮ ＰＡ Ｎ２１２断片を発現するプラスミドを加えることで、遺伝子の複製・転写活性がどのように変化したかを測定している。【0016】
同様に、図２を参照しながら本発明におけるＲＮＰ活性測定の原理を説明する。細胞内（例えば、ＨＥＫ２９３Ｔ）に人工的にインフルエンザウイルスのＲＮＰを形成すると、このＲＮＰは自律的に遺伝子複製と転写を細胞内で行うことができる（インフルエンザウイルスのレプリコン）。複製・転写産物を細胞から抽出し、それぞれの核酸（ｍＲＮＡ（ウイルスのｍＲＮＡ）、ｖＲＮＡ（ウイルスの遺伝子；ウイルスのゲノムＲＮＡ）、ｃＲＮＡ（ウイルス遺伝 子の相補鎖））を特異的なプライマーを用いてＲＴ反応にて定量することで、インフルエンザウイルスの遺伝子複製と転写活性を定量することができる。その際、インフルエンザウイルスの遺伝子配列をルシフェラーゼに置き換えておくと、ＲＮＰの転写活性により、ルシフェラーゼが産生されるため、ルシフェラーゼの活性を測定することで、簡便にＲＮＰの活性を測定することができる。この方法は、ＲＮＰ活性のスクリーニングに特に利用されている。【0017】
本発明者らは、上記のＲＮＰ活性測定系に基づいてＶＮ株のＰＡサブユニットのＮ末側断片（ＰＡサブユニットのＮ末端から２１２位アミノ酸までの断片；以下、「ＶＮ ＰＡ Ｎ２１２」ともいう）をＷＳＮ株インフルエンザウイルスのＲＮＰに加えたところ、著しいＲＮＰ活性の低下が見られることを見出した（図３、図４参照）。一方、ＰＡサブユニットのＣ末側断片（ＰＡサブユニットからＶＮ ＰＡ Ｎ２１２を開裂した後の残りの断片；ＰＡサブユニットのＮ末端から２１３位〜Ｃ末端までの断片）では殆ど活性低下は認められなかった。【0018】
このように、本発明は、特定の株から単離されたＰＡサブユニットの一部断片に著しい遺伝子複製酵素阻害効果があるとの知見に基づくものである。すなわち、インフルエンザウイルスをもってインフルエンザウイルスを阻害できるという知見である。その作用機序には未だ不明な点が残されているが、遺伝子複製酵素を含むインフルエンザウイルスのＲＮＰ（核酸タンパク質複合体）に作用し、インフルエンザウイルスの遺伝子複製活性および転写活性を喪失させる作用が確認できている。また、その作用にはＰＡサブユニット断片に含まれるエンドヌクレアーゼ部位が関与しており、インフルエンザウイルスのＲＮＰに特異的に作用していることが推測されている。この断片は著しい阻害活性を有しており、また現存するＮＡ阻害薬とは全く作用機序が異なることから、次世代のインフルエンザウイルス阻害薬として有望であると考えられる。また、様々な株に対する阻害効果を確認したところ、Ａ／ＷＳＮ／３３株（ソ連型Ｈ１Ｎ１）、Ａ／ＮＴ／６０／６８株（香港型Ｈ３Ｎ２）、Ａ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／１５６／９７株（１９９７年トリ型Ｈ５Ｎ１）またはＡ／Ｋｕｒｕｍｅ／Ｋ０９１０／２００９株（２００９パンデミックＨ１Ｎ１）の何れに対しても効果が認められ、株に依存しない幅広い適応が可能であると考えられる。【0019】
本発明のＰＡサブユニット断片は、インフルエンザウイルスのいずれの株に由来するものであってもよい。好ましくは、Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／２００４（Ｈ５Ｎ１）株から本発明のＰＡサブユニット断片を得ることができる。他のインフルエンザウイルス株、例えば、Ａ／ＷＳＮ／３３株（ソ連型Ｈ１Ｎ１）、Ａ／ＮＴ／６０／６８株（香港型Ｈ３Ｎ２）、Ａ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／１５６／９７株（１９９７年トリ型Ｈ５Ｎ１）またはＡ／Ｋｕｒｕｍｅ／Ｋ０９１０／２００９株（２００９パンデミックＨ１Ｎ１）から本発明のＰＡサブユニット断片を得ることもできる。Ａ／ＷＳＮ／３３株（ソ連型Ｈ１Ｎ１）はインフルエンザの研究で用いられる一般的な株であり、過去に流行していた季節性のソ連型と同系列である。Ａ／ＮＴ／６０／６８株（香港型Ｈ３Ｎ２）もインフルエンザの研究で用いられる一般的な株であり、現在も流行している季節性の香港型と同系列である。Ａ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／１５６／９７株（１９９７年トリ型Ｈ５Ｎ１）は１９９７年にヒトに感染した高病原性トリインフルエンザである。Ａ／Ｋｕｒｕｍｅ／Ｋ０９１０／２００９株（２００９パンデミックＨ１Ｎ１）は２００９年に発生したパンデミック株（久留米大学医学部感染医学講座臨床感染医学部門分離）である。【0020】
本発明のＰＡサブユニット断片は、ＰＡサブユニットのＮ末端断片であることが好ましい。そのようなＮ末端断片としては、ＰＡサブユニットのＮ末から２１２アミノ酸までのアミノ酸配列を有する断片が挙げられる。具体的なアミノ酸配列は以下のとおりである。MetGluAspPheValArgGlnCysPheAsnProMetIleValGluLeuAlaGluLysAlaMetLysGluTyrGlyGluAspProLysIleGluThrAsnLysPheAlaAlaIleCysThrHisLeuGluValCysPheMetTyrSerAspPheHisPheIleAspGluArgSerGluSerIleIleValGluSerGlyAspProAsnAlaLeuLeuLysHisArgPheGluIleIleGluGlyArgAspArgThrMetAlaTrpThrValValAsnSerIleCysAsnThrThrGlyValGluLysProLysPheLeuProAspLeuTyrAspTyrLysGluAsnArgPheIleGluIleGlyValThrArgArgGluValHisThrTyrTyrLeuGluLysAlaAsnLysIleLysSerGluLysThrHisIleHisIlePheSerPheThrGlyGluGluMetAlaThrLysAlaAspTyrThrLeuAspGluGluSerArgAlaArgIleLysThrArgLeuPheThrIleArgGlnGluMetAlaSerArgGlyLeuTrpAspSerPheArgGlnSerGluArgGlyGluGluThrIleGluGluLysPheGluIleThrGlyThrMetArg（配列番号４）
【0021】
本発明の他の好ましいＰＡサブユニット断片は、ＰＡサブユニットのＮ末から少なくとも１８７アミノ酸までのアミノ酸配列を有する断片である（配列番号５）。本発明のさらに他の好ましいＰＡサブユニット断片は、ＰＡサブユニットのＮ末から少なくとも１８８アミノ酸までのアミノ酸配列を有する断片である（配列番号６）。本発明のさらに他の好ましいＰＡサブユニット断片は、ＰＡサブユニットのＮ末から少なくとも１９２アミノ酸までのアミノ酸配列を有する断片である（配列番号７）。【0022】
これまでに報告されたＰＡのＮ末端の機能には、エンドヌクレアーゼとプロテアーゼがある。エンドヌクレアーゼは細胞のｍＲＮＡをターゲットとしており、細胞由来のｍＲＮＡキャップを切り取る作用がある。またプロテアーゼの基質は未だ不明である。この何れの機能も活性中心が報告されているので（エンドヌクレアーゼの活性中心：Ｄ１０８位；プロテアーゼの活性中心：Ｔ１５７位）、本発明らは、それぞれの活性中心のアミノ酸を置換した変異体を作成し、阻害効果を確認した。【0023】
その結果、Ｎ２１２／Ｔ１５７Ａ（プロテアーゼ活性欠失体）では阻害効果が維持されたのに対して、Ｎ２１２／Ｄ１０８Ａ（エンドヌクレアーゼ活性欠失体）では阻害活性が失われた（実施例６、図９）。このことからエンドヌクレアーゼがＲＮＰの喪失（阻害）に関与していることが示唆された。なお、本明細書において「Ｔ１５７Ａ」や「Ｄ１０８Ａ」は特定のアミノ酸残基で別のアミノ酸残基に置換されていることを表し、例えば、「Ｔ１５７Ａ」は１５７位のＴがＡに置換されていることを表す。【0024】
それゆえ、本発明のＰＡサブユニット断片は、そのエンドヌクレアーゼ活性が保持されている限り、ＰＡサブユニットからのどのような断片であってもよい。例えば、本発明のＰＡサブユニット断片は、そのエンドヌクレアーゼ活性が保持されている限り、そのアミノ酸長に制限はなく、上記配列番号４で示されるアミノ酸配列からなる断片以外にも、Ｎ末端から１８０位、１９０位、２００位、２１０位、２２０位、または２３０位までのアミノ酸からなる断片であってよい。【0025】
ＰＡサブユニットの各種Ｎ末端断片についてエンドヌクレアーゼ活性をさらに詳細に検討したところ、ＰＡサブユニットのＮ末から２１２アミノ酸までのアミノ酸配列を有する断片のうち、Ｎ末から２〜１０までのアミノ酸、Ｎ末から２〜２２までのアミノ酸、Ｎ末から２〜４０までのアミノ酸、Ｎ末から２〜６０までのアミノ酸、Ｎ末から２〜８０までのアミノ酸、Ｎ末から２〜１００までのアミノ酸、およびＮ末から２〜１０７までのアミノ酸をそれぞれ欠失させると阻害活性が喪失することが見出された。このことから、ＰＡサブユニットのＮ末から２１２アミノ酸までのアミノ酸配列を有する断片のうちＮ末側のアミノ酸はエンドヌクレアーゼ活性にとって特に重要であることがわかった。【0026】
さらに、ＰＡサブユニットのＮ末から２１２アミノ酸までのアミノ酸配列を有する断片のうち、Ｎ末から７〜１０７までのアミノ酸、Ｎ末から２７〜１０７までのアミノ酸、Ｎ末から４７〜１０７までのアミノ酸、Ｎ末から６７〜１０７までのアミノ酸、Ｎ末から８７〜１０７までのアミノ酸、Ｎ末から１６〜２６までのアミノ酸、Ｎ末から２９〜８５までのアミノ酸、Ｎ末から５２〜７５までのアミノ酸、Ｎ末から５２〜８３までのアミノ酸、Ｎ末から１１０〜１３２までのアミノ酸、Ｎ末から１３７〜１６４までのアミノ酸およびＮ末から１３６〜１８６までのアミノ酸をそれぞれ欠失させると阻害活性が喪失することが見出され、上記断片のＮ末端付近、中央部、およびＣ末端付近のいずれの部位を中抜きしても阻害活性が喪失することが見出されたことから、エンドヌクレアーゼ活性にとって立体構造が重要であることがわかった。【0027】
一方、ＰＡサブユニットのＮ末から２１２アミノ酸までのアミノ酸配列を有する断片のうち、１３６からＣ末まで、１５３からＣ末まで、１７３からＣ末まで、１７７からＣ末まで、１８１からＣ末まで、１８５からＣ末まで、１８６からＣ末まで、および１８７からＣ末までのアミノ酸をそれぞれ欠失させると阻害活性が喪失するが、１８８からＣ末まで、１８９からＣ末まで、および１９３からＣ末までのアミノ酸をそれぞれ欠失させても阻害活性は喪失しないことが見出された。このことから、エンドヌクレアーゼ活性にはＮ末から少なくとも１８７アミノ酸までのアミノ酸配列が必須であることがわかった。さらに、１８９からＣ末まで、および１９３からＣ末までのアミノ酸を欠失させたものは、ＰＡサブユニットのＮ末から２１２アミノ酸までのアミノ酸配列を有する断片よりも阻害活性が強くなることもわかった。【0028】
また、ＰＡサブユニット断片の阻害活性についてさらに詳細に検討したところ、ＰＡサブユニット断片の阻害活性には、天然のＰＡサブユニットのアミノ酸配列のＮ末端から数えて２８番目のプロリン（Ｐ）、８６番目のメチオニン（Ｍ）、９１番目のバリン（Ｖ）および１００番目のバリン（Ｖ）よりなる群から選ばれた少なくとも１のアミノ酸を含むことが必須であることがわかった。すなわち、これら４つのアミノ酸残基は、ＰＡのエンドヌクレアーゼ活性に影響を及ぼす必須のアミノ酸といえる。従って、本発明のＰＡサブユニット断片は、そのエンドヌクレアーゼ活性を保持するためには、上記４つのアミノ酸残基の少なくとも１のアミノ酸を含んでいることが必要である。【0029】
さらに、上記のようにＰＡサブユニット断片の阻害活性には天然のＰＡサブユニットのアミノ酸配列のＮ末から少なくとも１８７アミノ酸までのアミノ酸配列が必須であることから、Ｎ末端から数えて１８７番目ロイシン（Ｌ）および１８８番目のトリプトファン（Ｗ）がエンドヌクレアーゼ活性にとって重要なアミノ酸であることが推測される。そのため、これらアミノ酸残基を置換して阻害活性に影響が出ないか調べたところ、これらアミノ酸残基のアラニン置換体は阻害活性がかなり低減することが認められた（実施例１１）。それゆえ、１８７番目ロイシン（Ｌ）および１８８番目のトリプトファン（Ｗ）がエンドヌクレアーゼ活性を保持するために必須であることがわかった。【0030】
本発明のＰＡサブユニット断片はまた、配列番号４のアミノ酸配列において、または上記各種ＰＡサブユニット断片において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を含むものであってよい。ここで、欠失、置換または付加されるアミノ酸の総数および位置は、得られるＰＡサブユニット断片がエンドヌクレアーゼ活性を保持している限り、特に限定されるものではない。欠失、置換または付加されるアミノ酸の総数は１または複数個、好ましくは１または数個であり、その具体的な範囲は、欠失に関しては通常１〜１０個、好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜２個であり、置換に関しては通常１〜２０個、好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜３個であり、付加に関しては通常１〜１０個、好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜２個である。【0031】
上記の変異型ＰＡを調製するためにポリヌクレオチドに変異を導入するには、Kunkel法やGapped duplex法等の部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット、例えばQuikChangeTM Site-Directed Mutagenesis Kit（ストラタジーン社製）、GeneTailorTM Site-Directed Mutagenesis System（インビトロジェン社製）、TaKaRa Site-Directed Mutagenesis System（Mutan-K、Mutan-Super Express Km等：タカラバイオ社製）等を用いて行うことができる。【0032】
ＰＡを製造する方法としては、ＰＡをコードする遺伝子を、そのタンパク質が発現するのに適した形態で適宜発現用ベクター内に組み込んだベクターを作製し、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、あるいは酵母や大腸菌等の微生物のいずれかに導入した形質転換体を作製して、その形質転換体を培養する方法が挙げられる。また、無細胞系タンパク質合成による製造方法を採用することも可能である。無細胞系タンパク質合成は、市販のキットを用いて行うことができ、そのようなキットとしては、例えば試薬キットPROTEIOSTM（東洋紡）、TNTTMSystem（プロメガ）、合成装置のPG-MateTM（東洋紡）、RTS（ロシュ・ダイアグノスティクス）などが挙げられる。【0033】
このような形質転換体または無細胞系タンパク質合成により生産されたＰＡは、所望によりその物理学的性質、化学的性質等を利用した各種の分離操作により分離、精製することができる。精製方法としては、例えば通常の塩析法、遠心分離、超音波破砕、限外ろ過、ゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等の各種液体クロマトグラフィー、透析法、これらの組合せを例示できる。【0034】
また、ＰＡを調製するその他の方法として、ＰＡがアフィニティータグを融合した形になるように形質転換体または無細胞系タンパク質合成で産生させ、ＰＡを分離、精製する方法を例示することができる。【0035】
本発明はまた、上記ＰＡサブユニット断片をコードする核酸をも提供する。斯かる核酸としては、ＰＡサブユニットのＮ末から２１２アミノ酸までのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を有する核酸が挙げられる。具体的なヌクレオチド配列は以下のとおりである。atggaagactttgtgcgacaatgcttcaatccaatgattgtcgagcttgcggaaaaggcaatgaaagaatatggggaagatccgaaaatcgaaacgaacaagtttgctgcaatatgcacacacttggaggtctgtttcatgtattcggattttcactttattgatgaacggagtgaatcaataattgtagaatctggagatccgaatgcattattgaaacaccgatttgaaataattgaaggaagagaccgaacgatggcctggactgtggtgaatagtatctgcaacaccacaggagttgagaaacctaaatttctcccagatttgtatgactacaaagagaaccgattcatcgaaattggagtgacacggagggaagttcatacatactatctggagaaagccaacaagataaaatccgagaagacacatattcacatattctcattcacaggggaggaaatggccaccaaagcggactacacccttgatgaagagagcagggcaagaattaaaaccaggctgttcaccataaggcaggaaatggccagtaggggtctatgggattcctttcgtcaatccgagagaggcgaagagacaattgaagaaaaatttgaaatcactggaaccatgcgctag（配列番号３）
【0036】
本発明はまた、上記核酸を含む組換えベクターをも提供する。組換えベクターを作製するには、目的とするポリペプチドのコード領域を含む適切な長さのＤＮＡ断片を調製する。目的とするポリペプチドのコード領域のヌクレオチド配列において、宿主細胞における発現に最適なコドンとなるように、ヌクレオチドを置換してもよい。次いで、このＤＮＡ断片を適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入して、組換えベクターを作製することができる（例えば、Molecular Cloning2nd Edition, J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989を参照）。【0037】
発現ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＵＣ１２，ｐＵＣ１３など）、枯草菌由来のプラスミド（ｐＵＢ１１０，ｐＴＰ５，ｐＣ１９４など）、酵母由来プラスミド（ｐＳＨ１９，ｐＳＨ１５など）、λファージなどのバクテリオファージ、レトロウイルス，ワクシニアウイルスなどの動物ウイルス、バキュロウイルスなどの昆虫病原ウイルスなどを用いることができる。【0038】
発現ベクターには、プロモーター、エンハンサー、リボソーム結合サイト、種々のシグナル配列（スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナルなど）、クローニングサイト、翻訳・転写ターミネーター、選択マーカー、ＳＶ４０複製オリジンなどを付加してもよい。このようなベクターの例としては、ｐＧＥＸシリーズ（アマシャムファルマシアバイオテク社）、pET Expression Syetem（Novagen社）などを例示することができる。【0039】
本発明はまた、上記ベクターを含む形質転換細胞をも提供する。組換えベクターを宿主細胞に導入するには、Molecular Cloning 2nd Edition, J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989に記載の方法（例えば、リン酸カルシウム法、DEAE-デキストラン法、トランスベクション法、マイクロインジェクション法、リポフェクション法、エレクロトポレーション法、形質導入法、スクレープローディング法、ショットガン法など）または感染により行うことができる。【0040】
宿主細胞としては、細菌細胞（例えば、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、枯草菌など）、真菌細胞（例えば、酵母、アスペルギルスなど）、昆虫細胞（例えば、Ｓ２細胞、Ｓｆ細胞など）、動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｃ１２７細胞、３Ｔ３細胞、ＢＨＫ細胞、ＨＥＫ２９３細胞など）、植物細胞などを例示することができる。本発明の実施例ではＨＥＫ２９３Ｔ細胞を用いた。【0041】
本発明はまた、本発明のインフルエンザウイルス由来ＰＡサブユニット断片を含むインフルエンザウイルス阻害薬をも提供する。上記インフルエンザウイルス阻害薬は、本発明のインフルエンザウイルス由来ＰＡサブユニット断片を有効成分として少なくとも１種以上含んでおり、必要に応じて薬学的に許容される添加物を含んでいてもよい。【0042】
本発明のインフルエンザウイルス阻害薬は、経口、非経口または局所的な経路のいずれかにより投与することができる。投与量は、治療対象動物（哺乳類、特にはヒト）の種およびその薬剤に対する個体の応答性、並びに選択される製剤の剤形および投与時間や間隔などに依存して変化するが、一般には、前記インフルエンザウイルス由来ＰＡサブユニット断片約１０ｍｇから約２００ｍｇ／日、好ましくは約１５ｍｇから約１５０ｍｇ／日、さらに好ましくは約２０ｍｇから約１００ｍｇ／日の範囲の用量で投与することができる。本発明のインフルエンザウイルス阻害薬は、前記のインフルエンザウイルス由来ＰＡサブユニット断片以外に、場合により医薬的に許容することのできる公知の担体若しくは希釈剤との組合せで、経口、非経口または局所的な経路のいずれかにより、単回または複数回で投与することができる。本発明のインフルエンザウイルス阻害薬は、種々の異なる剤形、例えば、錠剤、カプセル剤、ロゼンジ剤、トローチ剤、ハードキャンディー、粉末剤、スプレー剤、クリーム剤、軟膏剤、坐剤、ゼリー剤、ゲル剤、ペースト剤、ローション剤、軟膏剤、水性懸濁剤、注射用溶液剤、エリキシル剤、またはシロップ剤などにすることができる。【0043】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。【実施例1】
【0044】
インフルエンザウイルス由来ＰＡサブユニット断片によるインフルエンザウイルスの増殖抑制Ｅ−ＭＥＭ（１０％ＦＢＳ）（日水）培地を用いて、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（Human Embryonic Kidney Cell）を７５ｃｍ２フラスコにて８０％コンフルエントまで３７℃、５％ＣＯ２存在下で培養した。２９３Ｔ細胞の培地を丁寧に取り除き、１ｍｌの０.２５％トリプシン（１ｍＭ ＥＤＴＡ含む）（Nakarai）で処理し、３０ｍｌのＥ−ＭＥＭ（１０％ＦＢＳ含む）を加え縣濁した。懸濁細胞液を６穴プレートに各２ｍｌ撒いた。
【0045】
インフルエンザウイルスのＲＮＰ構築用のプラスミドをそれぞれ０.２μｇ／μｌにて調製した。ＲＮＰ構成タンパク質は、Ａ／ＷＳＮ／３３（Ｈ１Ｎ１）由来のＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、ＮＰの４種類であった。鋳型用ＲＮＡとしては、Ａ／ＷＳＮ／３３（Ｈ１Ｎ１）由来のＮＡ遺伝子、またはＮＡ遺伝子をルシフェラーゼ遺伝子に置換したものを用いた。各構成タンパク質をコードする核酸はｐｃＤＮＡ３.１（＋）（Invitrogen）に挿入したものを用いた。鋳型用ＲＮＡはｐＰＯＬＩ（Fodor E, et al. J Virol 76: 8989-9001. 2002）に挿入したものを用いた。【0046】
阻害薬として利用するＰＡ断片の発現用プラスミドも同様に０.２μｇ／μｌに調製した。この発現用プラスミドは、阻害効果のある目的部位株（Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／２００４（Ｈ５Ｎ１））由来ＰＡのＮ末端２１２アミノ酸（「ＶＮ ＰＡ Ｎ２１２」）をｐｃＤＮＡ３.１（＋）（Invitrogen）に挿入したものであった。また、阻害効果の比較対象として、ＰＡのＣ末端５０５アミノ酸（ＰＡ Ｃ７１６）を用いた。【0047】
１.５ｍｌテューブにＯｐｔｉ−ＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ）５０μｌを入れ、上記ＲＮＰ構築用プラスミドを各１μｌずつ加えた。同じテューブに、上記ＰＡ断片の発現用プラスミドを１μｌ加えた。新しい１.５ｍｌテューブにＯｐｔｉ−ＭＥＭ２５０μｌを入れ、Lipofectamine2000（Invitrogen）を２４μｌ加え、軽く縣濁した。これに上記プラスミド溶液を加え、軽く縣濁の後、室温で２０分間インキュベートした。この懸濁液３００μｌ（全量）をプレート上の懸濁細胞液に接種した。細胞を３０時間、３７℃、５％ＣＯ２存在下で培養した。培養液を取り除き、細胞を細胞懸濁液（Cell lysis buffer, Promega）に縣濁したものをルシフェラーゼの活性測定（Luciferase活性測定用キット、Promega）に用いた。活性測定は、Promegaの添付マニュアルに準じて行った（測定機器：EG&G BERTHOLD, Lumat LB 9507）。またはトータルＲＮＡを抽出しＲＮＰ活性をPrimer Extension Assay（T. Kashiwagi, et al. PLoS ONE 4(5): e5473. 2009）にて測定した。【0048】
結果を図４に示す。ＶＮ ＰＡ Ｎ２１２は著しい阻害活性を示しており、低濃度の段階からＷＳＮ ＲＮＰの活性が顕著な低下を示すことがわかった。【実施例2】
【0049】
他のインフルエンザウイルス株由来ＰＡサブユニット断片によるインフルエンザウイルスの増殖抑制実施例１と同様の手順により、Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／２００４（Ｈ５Ｎ１）株以外の他のインフルエンザウイルス株由来のＰＡサブユニット断片についてインフルエンザウイルスの増殖抑制効果を調べた。他のインフルエンザウイルス株としては、Ａ／ＷＳＮ／３３株（ソ連型Ｈ１Ｎ１）、Ａ／ＮＴ／６０／６８株（香港型Ｈ３Ｎ２）、Ａ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／１５６／９７株（１９９７年トリ型Ｈ５Ｎ１）およびＡ／Ｋｕｒｕｍｅ／Ｋ０９１０／２００９株（２００９パンデミックＨ１Ｎ１）を用いた。ルシフェラーゼによるレポーターアッセイによる確認だけでなく、インフルエンザウイルスの遺伝子複製と転写活性を特異的に検出できる実験系（Primer Extension Assay）でも確認を行った。
【0050】
結果を図５に示す。図５左パネルに示す結果から明らかなように、上記のいずれのインフルエンザウイルス株由来のＰＡサブユニット断片も阻害活性を示したが、Ａ／Ｋｕｒｕｍｅ／Ｋ０９１０／２００９株（２００９パンデミックＨ１Ｎ１）由来のＰＡサブユニット断片にＡ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／２００４（Ｈ５Ｎ１）と同程度の著しい阻害活性が認められた。Primer Extension Assayによる測定でも同様の結果が得られた（図５右パネル）。また、インターナルコントロールである５Ｓ ｒＲＮＡには変化がないことから、インフルエンザウイルスの遺伝子複製に特異的に作用していることが示唆された。Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／２００４（Ｈ５Ｎ１）とＡ／Ｋｕｒｕｍｅ／Ｋ０９１０／２００９株（２００９パンデミックＨ１Ｎ１）のＰＡサブユニットは分子系統上近縁であり、この２つの株に特有のアミノ酸配列が阻害に関与していることが示唆された。【実施例3】
【0051】
ウミシイタケルシフェラーゼを用いた阻害活性の測定特異性をさらに検証するため、ウミシイタケルシフェラーゼをコントロールとして用いた測定を行った。実施例１に記載のプラスミドに加えて、ウミシイタケルシフェラーゼを発現するプラスミドとしてpRL-TKを用いた以外は実施例１と同様の手順に従った。
ホタルルシフェラーゼは、細胞内の人工インフルエンザウイルスＲＮＰから生成されるのに対し、ウミシイタケルシフェラーゼは、インフルエンザウイルスＲＮＰとは完全に独立して細胞内に発現した（インターナルコントロール）。この２つのルシフェラーゼは発色基質が異なり、PromegaのDual luciferase測定キットを用いることで、２つのルシフェラーゼの活性を区別して測定できた。測定方法はPromegaの添付マニュアルに準じて行った。
【0052】
結果を図６に示す。図６に示す結果から明らかなように、ＶＮ ＰＡ Ｎ２１２を加えた場合には、ホタルルシフェラーゼ（インフルエンザウイルスの遺伝子複製酵素によって産生）は顕著に喪失したのに対して、ウミシイタケルシフェラーゼ（細胞によって産生）は約半分程度の低下に留まった（ＲＮＰ＋ｐＲＬ＋Ｎ２１２）。コントロールとしてC末側のＶＮ ＰＡを加えた場合には、これらの変化は見られなかった（ＲＮＰ＋ｐＲＬ＋Ｃ７１６）。この結果から、ＶＮ ＰＡ Ｎ２１２はインフルエンザウイルスのＲＮＰに特異的に作用していることが確認された。【実施例4】
【0053】
様々なインフルエンザウイルス株に対する阻害活性の測定他のインフルエンザウイルス株へのＶＮ ＰＡ Ｎ２１２の作用を確認した。実施例１で用いたＡ／ＷＳＮ／３３（Ｈ１Ｎ１）に代えて、Ａ／ＮＴ／６０／６８株（香港型Ｈ３Ｎ２）、Ａ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／１５６／９７株（１９９７年トリ型Ｈ５Ｎ１）、Ａ／ＷＳＮ／３３株（ソ連型Ｈ１Ｎ１）およびＡ／Ｋｕｒｕｍｅ／Ｋ０９１０／２００９株（２００９パンデミックＨ１Ｎ１）を用いた以外は実施例１と同様の手順に従った。
【0054】
結果を図７に示す。図７に示す結果から明らかなように、ＶＮ ＰＡ Ｎ２１２はＡ／ＮＴ／６０／６８株（香港型Ｈ３Ｎ２）、Ａ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／１５６／９７株（１９９７年トリ型Ｈ５Ｎ１）、Ａ／ＷＳＮ／３３株（ソ連型Ｈ１Ｎ１）およびＡ／Ｋｕｒｕｍｅ／Ｋ０９１０／２００９株（２００９パンデミックＨ１Ｎ１）のいずれに対してもＡ／ＷＳＮ／３３（Ｈ１Ｎ１）に対すると同様の著しい阻害活性を示した。このことから、ＶＮ ＰＡ Ｎ２１２はヒトに主に影響を及ぼすであろう何れの株に対しても高い阻害効果を有することがわかった。【実施例5】
【0055】
各ＲＮＰ構成サブユニットに対する阻害活性の測定阻害メカニズムを探るために、インフルエンザウイルスのＲＮＰを構成するそれぞれのサブユニットの細胞内発現を確認した。
実施例４で用いた細胞抽出液の中のタンパク質量をＳＤＳ−ＰＡＧＥ法（１２％ゲル化剤）およびウエスタンブロット法（２０％メタノール、１００Ｖ、１時間、Millipore製ＰＶＤＦ膜）を用いて測定した。ＰＡ、ＰＢ１、ＮＰの検出には、それぞれを認識するウサギ由来のＩｇＧを用いた。インターナルコントロールとして細胞内に恒常的に発現しているベータアクチンを測定した。ベータアクチンの検出用抗体はマウス由来のＩｇＧであった。
【0056】
結果を図８に示す。図８に示す結果から明らかなように、何れのサブユニット（ＰＢ１、ＰＡ、ＮＰ）も発現が抑制されていることがわかった（パネルＰＡ（上段）、ＰＢ１およびＮＰの矢印）。また、ＶＮ ＰＡ Ｎ２１２自体の発現は正常に検出された（パネルＰＡ（下段）の矢印）。インターナルコントロールとしてのベータアクチンの発現は正常であった（パネルβ-Actinの矢印）。以上から、ＶＮ ＰＡ Ｎ２１２を加えることで、インフルエンザウイルスのＲＮＰ自体が細胞内から喪失していることがわかった。ベータアクチンの発現量は顕著な低下を示していないことから、インフルエンザウイルスのＲＮＰに特異的に作用していることが示唆された。【実施例6】
【0057】
ＰＡサブユニット断片変異体による阻害活性の測定（１）ＰＡサブユニット断片による阻害メカニズムを調べるため、ＰＡサブユニット断片に変異を導入して阻害活性を測定した。
これまでに報告されたＰＡのＮ末端の機能に、エンドヌクレアーゼとプロテアーゼがある。エンドヌクレアーゼは細胞のｍＲＮＡをターゲットとしており、細胞由来のｍＲＮＡキャップを切り取る作用がある。またプロテアーゼの基質は未だ不明である。この何れの機能も活性中心が報告されているのでそれぞれの変異体を作成し、阻害効果を確認した。
【0058】
ＶＮ ＰＡ Ｎ２１２に代えてＶＮ ＰＡ Ｎ２１２変異体を用いた以外は実施例１と同様の手順に従った。ＶＮ ＰＡ Ｎ２１２変異体の作成にはsite-directed mutagenesis法（DpnI処理法）により、QuikChangeTM Site-Directed Mutagenesis Kit（ストラタジーン社製）を用いた。【0059】
結果を図９に示す。図９に示す結果から明らかなように、Ｎ２１２／Ｔ１５７Ａ（プロテアーゼ活性欠失体）では阻害効果が維持されているのに対して、Ｎ２１２／Ｄ１０８Ａ（エンドヌクレアーゼ活性欠失体）では阻害活性が失われた。このことからＶＮ ＰＡ Ｎ２１２のエンドヌクレアーゼ活性がＲＮＰの喪失（阻害）に関与していることが示唆された。【実施例7】
【0060】
ＰＡサブユニット断片変異体による阻害活性の測定（２）エンドヌクレアーゼの活性中心はＤ１０８だけでなく、Ｋ１３４にも報告がある。そこでさらに深く検証するために、実施例６と同様の手順に従って、１０８位だけでなく１３４位の変異体も作成し確認を行った。
【0061】
結果を図１０に示す。図１０に示す結果から明らかなように、Ｎ２１２／Ｋ１３４ＡでもＮ２１２／Ｄ１０８Ａと同様に阻害活性が失われた。このことからＶＮ ＰＡ Ｎ２１２のエンドヌクレアーゼ活性がＲＮＰの喪失（阻害）に関与していることがさらに確認された。【実施例8】
【0062】
ＰＡサブユニット断片変異体を用いたＲＮＰの発現ＶＮ ＰＡ Ｎ２１２変異体を用いてＲＮＰの発現を確認した。実施例７で用いた細胞抽出液の中のタンパク質量をＳＤＳ−ＰＡＧＥ法（１２％ゲル化剤）およびウエスタンブロット法（２０％メタノール、１００Ｖ、１時間、Millipore製ＰＶＤＦ膜）を用いて測定した以外は実施例５と同様の手順に従った。
【0063】
結果を図１１に示す。図１１に示す結果から明らかなように、エンドヌクレアーゼを欠損したＶＮ ＰＡ Ｎ２１２ではＲＮＰの発現が確認された。このことからも、ＶＮ ＰＡ Ｎ２１２のエンドヌクレアーゼ活性がＲＮＰの喪失に関与していることが確認された。以上のことから、ＶＮ ＰＡ Ｎ２１２には、インフルエンザウイルスのＲＮＰ活性を著しく低下させる作用があり、それはＲＮＰ自体の喪失によって起こっていることがわかった。またそのメカニズムとしてＶＮ ＰＡ Ｎ２１２のエンドヌクレアーゼが関与していることが示唆された。【実施例9】
【0064】
ＰＡサブユニット断片変異体による阻害活性の測定（３）ＰＡサブユニット断片による阻害メカニズムをさらに詳細に調べるため、ＰＡサブユニット断片に欠失を導入した各種断片を調製した。具体的には、ＶＮ ＰＡ Ｎ２１２において、以下のアミノ酸をそれぞれ欠失させた断片を調製した（図１２）。
【表1】
【0065】
これら断片の調製は、ＶＮ ＰＡ Ｎ２１２に代えてＶＮ ＰＡ Ｎ２１２欠失変異体を用いた以外は実施例１と同様の手順に従った。ＶＮ ＰＡ Ｎ２１２変異体の作成にはsite-directed mutagenesis法（DpnI処理法）により、QuikChangeTM Site-Directed Mutagenesis Kit（ストラタジーン社製）を用いた。【0066】
結果を図１２に示す。図１２に示す結果から明らかなように、ＶＮ ＰＡ Ｎ２１２において、Ｎ末から２〜１０までのアミノ酸（ｄ２−１０）、Ｎ末から２〜２２までのアミノ酸（ｄ２−２２）、Ｎ末から２〜４０までのアミノ酸（ｄ２−４０）、Ｎ末から２〜６０までのアミノ酸（ｄ２−６０）、Ｎ末から２〜８０までのアミノ酸（ｄ２−８０）、Ｎ末から２〜１００までのアミノ酸（ｄ２−１００）およびＮ末から２〜１０７までのアミノ酸（ｄ２−１０７）をそれぞれ欠失させると阻害活性が喪失することが認められた。このことから、ＰＡサブユニットのＮ末から２１２アミノ酸までのアミノ酸配列を有する断片のうちＮ末側のアミノ酸はエンドヌクレアーゼ活性にとって特に重要であることがわかった。【0067】
また、ＶＮ ＰＡ Ｎ２１２において、Ｎ末から７〜１０７までのアミノ酸（ｄ２−１０７）、Ｎ末から２７〜１０７までのアミノ酸（ｄ２７−１０７）、Ｎ末から４７〜１０７までのアミノ酸（ｄ４７−１０７）、Ｎ末から６７〜１０７までのアミノ酸（ｄ６７−１０７）、Ｎ末から８７〜１０７までのアミノ酸（ｄ８７−１０７）、Ｎ末から１６〜２６までのアミノ酸（ｄ１６−２６）、Ｎ末から２９〜８５までのアミノ酸（ｄ２９−８５）、Ｎ末から５２〜７５までのアミノ酸（ｄ５２−７５）、Ｎ末から５２〜８３までのアミノ酸（ｄ５２−８３）、Ｎ末から１１０〜１３２までのアミノ酸（ｄ１１０−１３２）、Ｎ末から１３７〜１６４までのアミノ酸（ｄ１３７−１６４）、およびＮ末から１３６〜１８６までのアミノ酸（ｄ１３６−１８６）をそれぞれ欠失させると阻害活性が喪失することが認められた。このように、ＶＮ ＰＡ Ｎ２１２のＮ末端付近、中央部、およびＣ末端付近のいずれの部位を中抜きしても阻害活性が喪失することから、エンドヌクレアーゼ活性にとって立体構造が重要であることがわかった。【実施例10】
【0068】
ＰＡサブユニット断片変異体による阻害活性の測定（４）ＰＡサブユニット断片による阻害メカニズムをさらに詳細に調べるため、ＰＡサブユニット断片に欠失を導入した各種断片を調製した。具体的には、ＶＮ ＰＡ Ｎ２１２において、以下のアミノ酸をそれぞれ欠失させた断片を調製した（図１３）。
【表2】
【0069】
これら断片の調製は、ＶＮ ＰＡ Ｎ２１２に代えてＶＮ ＰＡ Ｎ２１２欠失変異体を用いた以外は実施例１と同様の手順に従った。ＶＮ ＰＡ Ｎ２１２変異体の作成にはsite-directed mutagenesis法（DpnI処理法）により、QuikChangeTM Site-Directed Mutagenesis Kit（ストラタジーン社製）を用いた。【0070】
結果を図１３に示す。図１３に示す結果から明らかなように、ＶＮ ＰＡ Ｎ２１２において、１３６からＣ末までのアミノ酸（Ｎ１３５）、１５３からＣ末までのアミノ酸（Ｎ１５２）、１７３からＣ末までのアミノ酸（Ｎ１７２）、１７７からＣ末までのアミノ酸（Ｎ１７６）、１８１からＣ末までのアミノ酸（Ｎ１８０）、１８５からＣ末までのアミノ酸（Ｎ１８４）、１８６からＣ末までのアミノ酸（Ｎ１８５）、１８７からＣ末までのアミノ酸（Ｎ１８６）をそれぞれ欠失させると阻害活性が喪失するが、１８８からＣ末までのアミノ酸（Ｎ１８７）、１８９からＣ末までのアミノ酸（Ｎ１８８）、および１９３からＣ末までのアミノ酸（Ｎ１９２）を欠失させても阻害活性は喪失しないことが認められた。特に、Ｎ１８８およびＮ１９２に関しては、ＶＮ ＰＡ Ｎ２１２よりも強い阻害活性が認められた。このことから、エンドヌクレアーゼ活性にはＮ末から少なくとも１８７アミノ酸までのアミノ酸配列が必須であることがわかった。【実施例11】
【0071】
ＰＡサブユニット断片変異体による阻害活性の測定（５）実施例１０の結果は、ＰＡサブユニット断片の阻害活性には天然のＰＡサブユニットのアミノ酸配列のＮ末から少なくとも１８７アミノ酸までのアミノ酸配列が必須であることを示した。このことから、Ｎ末端から数えて１８７番目ロイシン（Ｌ）および１８８番目のトリプトファン（Ｗ）がエンドヌクレアーゼ活性にとって重要なアミノ酸であることが推測された。そこで、これらアミノ酸残基を置換して阻害活性に影響が出ないか調べた。具体的には、これらアミノ酸残基をアラニンに置換した断片を調製して阻害活性を調べた（Ｎ２１２／Ｌ１８７ＡおよびＮ２１２／Ｗ１８８Ａ；図１４）。
【0072】
これら断片の調製は、ＶＮ ＰＡ Ｎ２１２に代えてＶＮ ＰＡ Ｎ２１２変異体を用いた以外は実施例１と同様の手順に従った。ＶＮ ＰＡ Ｎ２１２変異体の作成にはsite-directed mutagenesis法（DpnI処理法）により、QuikChangeTM Site-Directed Mutagenesis Kit（ストラタジーン社製）を用いた。【0073】
結果を図１４に示す。図１４に示す結果から明らかなように、これらアミノ酸残基のアラニン置換体は阻害活性が完全に喪失するわけではないが、かなり低減することが認められた。それゆえ、１８７番目のロイシン（Ｌ）および１８８番目のトリプトファン（Ｗ）がエンドヌクレアーゼ活性を保持するために必須であることが証明された。【実施例12】
【0074】
インフルエンザウイルス由来ＰＡサブユニット断片によるインフルエンザウイルスの増殖抑制（２）本発明ではＰＡサブユニット断片を発現させるのに発現ベクターとしてプラスミドを用いているので、本発明の阻害活性がＰＡサブユニット断片によるのでなくプラスミドそのもの、あるいはプラスミドを導入するという行為によるのではないかとの疑念が残る。そこで、斯かる疑念を除くため、以下の実験を行った。
ＰＡ断片の発現用プラスミドとしては、ＶＮ ＰＡ Ｎ２１２をｐｃＤＮＡ３.１（＋）に挿入したもの、および阻害効果の比較対象として、ＰＡのＣ末端５０４アミノ酸（ＶＮ／ＰＡ／Ｃ５０４）をｐｃＤＮＡ３.１（＋）に挿入したものおよびプラスミド単独のｐｃＤＮＡ３.１（＋）を用いた他は、実施例１と同様に行った。
【0075】
結果を図１５に示す。ＶＮ ＰＡ Ｎ２１２をｐｃＤＮＡ３.１（＋）に挿入したもののみが著しい阻害活性を示しており、プラスミドそのもの、あるいはプラスミドを導入するという行為が阻害効果を示しているのでないことが確認された。このことから、プラスミドから合成されるＰＡサブユニット断片が阻害効果の本体であると推測された。【実施例13】
【0076】
各ＲＮＰ構成サブユニットに対する阻害活性の測定（２）、ＰＡサブユニット断片変異体による阻害活性の測定（６）およびＰＡサブユニット断片変異体を用いたＲＮＰの発現（２）本発明のＰＡサブユニット断片が本当に細胞内に発現して作用しているのかという懸念を解消するため、以下の実験を行った。
【0077】
実施例５に示すように、本発明のＰＡサブユニット断片を作用させると、インフルエンザウイルスのＲＮＰの構成成分（ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、ＮＰ）が細胞内から喪失する（図８参照）。実施例５と同様にして、ＶＮ ＰＡ Ｎ２１２およびＶＮ／ＰＡ／Ｃ５０４について、インフルエンザウイルスのＲＮＰを構成するそれぞれのサブユニットの細胞内発現を確認した。２種の濃度について試験した。
結果を図１６に示す（図１６Ａ）。ＶＮ ＰＡ Ｎ２１２の発現が確認され、また、その濃度に応じて、ＲＮＰの構成成分が全て喪失していた（図１６Ａ）。この結果と上記実施例１２の結果（プラスミド単独の結果）とから、プラスミドから発現したＰＡサブユニット断片が阻害効果を発揮していると確認できた。また、ベータアクチンの発現量は顕著な低下を示していないことから、インフルエンザウイルスのＲＮＰに特異的に作用していることが示唆された。
つぎに、阻害効果には１０８番目と１３４番目のエンドヌクレアーゼの活性中心が必要なことは、実施例６および７に示したとおりである。そこで、Ｎ２１２／Ｄ１０８Ａ、Ｎ２１２／Ｋ１３４ＡおよびＮ２１２／Ｔ１５７Ａについて、実施例５と同様にして発現させた。また、これら変異体について、実施例６と同様にして阻害活性を調べた。その結果を図１６に示す（図１６ＢおよびＣ）。
Ｎ２１２／Ｔ１５７Ａ、Ｎ２１２／Ｋ１３４Ａ、Ｎ２１２／Ｄ１０８Ａの全ての変異体において発現が確認された。ここで、エンドヌクレアーゼに関与している部位を変異した断片（Ｎ２１２／Ｋ１３４ＡとＮ２１２／Ｄ１０８Ａ）では、ＰＡサブユニット断片が発現されているにも拘わらず、阻害作用は認められなかった（すなわち、ＲＮＰの発現が抑えられなかった）。一方、エンドヌクレアーゼに関わらない部位を変異した断片（Ｎ２１２／Ｔ１５７Ａ）では阻害効果が認められた。これらのことから、エンドヌクレーゼの関与が再度確認され、さらにＰＡサブユニット断片が発現し、ＲＮＰの消失に作用していることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【0078】
本発明のＰＡサブユニット断片はインフルエンザウイルスのＲＮＰ（核酸タンパク質複合体）に作用し、インフルエンザウイルスの遺伝子複製活性および転写活性を喪失させる作用が確認できている。また、その作用にはＰＡサブユニット断片に含まれるエンドヌクレアーゼ部位が関与しており、インフルエンザウイルスのＲＮＰに特異的に作用している。本発明のＰＡサブユニット断片は著しいインフルエンザウイルス増殖阻害活性を有しており、また現存するＮＡ阻害薬とは全く作用機序が異なることから、次世代のインフルエンザウイルス阻害薬として極めて有望である。また、様々な株に対する阻害効果を確認したところ、ＶＮ ＰＡ Ｎ２１２はＡ／ＮＴ／６０／６８株（香港型Ｈ３Ｎ２）、Ａ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／１５６／９７株（１９９７年トリ型Ｈ５Ｎ１）、Ａ／ＷＳＮ／３３株（ソ連型Ｈ１Ｎ１）およびＡ／Ｋｕｒｕｍｅ／Ｋ０９１０／２００９株（２００９パンデミックＨ１Ｎ１）のいずれに対してもＡ／ＷＳＮ／３３（Ｈ１Ｎ１）に対すると同様の著しい阻害活性が認められ、株に依存しない幅広い適応が可能であると考えられる。【配列表】
[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]