特許 6571333 改変ミニヘプシジンペプチドおよびその使用方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6571333

(24)【登録日】2019年8月16日

(45)【発行日】2019年9月4日

(54)【発明の名称】改変ミニヘプシジンペプチドおよびその使用方法

(51)【国際特許分類】

   C07K 7/06 20060101AFI20190826BHJP

   A61K 38/08 20190101ALI20190826BHJP

   A61P 1/16 20060101ALI20190826BHJP

   A61P 3/00 20060101ALI20190826BHJP

   A61P 3/10 20060101ALI20190826BHJP

   A61P 7/06 20060101ALI20190826BHJP

   A61P 9/04 20060101ALI20190826BHJP

   A61P 19/08 20060101ALI20190826BHJP

【ＦＩ】

   C07K7/06ZNA

   A61K38/08

   A61P1/16

   A61P3/00

   A61P3/10

   A61P7/06

   A61P9/04

   A61P19/08

【請求項の数】26

【全頁数】52

(21)【出願番号】特願2014-546062(P2014-546062)

(86)(22)【出願日】2012年12月6日

(65)【公表番号】特表2015-504859(P2015-504859A)

(43)【公表日】2015年2月16日

(86)【国際出願番号】US2012068180

(87)【国際公開番号】WO2013086143

(87)【国際公開日】20130613

【審査請求日】2015年11月24日

【審判番号】不服2018-1198(P2018-1198/J1)

【審判請求日】2018年1月29日

(31)【優先権主張番号】61/568,724

(32)【優先日】2011年12月9日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】505088684

【氏名又は名称】ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア

(74)【代理人】

【識別番号】100079108

【弁理士】

【氏名又は名称】稲葉 良幸

(74)【代理人】

【識別番号】100109346

【弁理士】

【氏名又は名称】大貫 敏史

(74)【代理人】

【識別番号】100117189

【弁理士】

【氏名又は名称】江口 昭彦

(74)【代理人】

【識別番号】100134120

【弁理士】

【氏名又は名称】内藤 和彦

(72)【発明者】

【氏名】ガンツ，トーマス

(72)【発明者】

【氏名】ネメス，エリザベータ

(72)【発明者】

【氏名】ルチャラ，ピョートル

【合議体】

【審判長】 長井 啓子

【審判官】 天野 貴子

【審判官】 田村 聖子

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２０１０／０６５８１５号

【文献】 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ，２０１１年，１２１（１２），４８８０−４８８８， Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｌ ｄａｔａ

【文献】 特表２０１０−５１７５２９号公報

【文献】 米国特許出願公開第２０１１／０１８３３６２号明細書

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

ＣＡｐｌｕｓ（ＳＴＮ）

ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｄｐａ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ｄｐａ、
Ｎ−ＭｅＡｓｐ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｄｐａ−Ｏｉｃ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−ｂｈＰｈｅ−Ｒ１４、
Ｎ−ＭｅＡｓｐ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｄｐａ−ｂｈＰｒｏ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−ｂｈＰｈｅ−Ｒ１４、
Ｉｄａ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｄｐａ−ｂｈＰｒｏ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−ｂｈＰｈｅ−Ｒ１４、
Ｉｄａ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｄｐａ−ｂｈＰｒｏ−Ｎ−ＭｅＡｒｇ−Ｃｙｓ−Ｎ−ＭｅＡｒｇ−ｂｈＰｈｅ−Ｒ１４、
Ｉｄａ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｄｐａ−ｂｈＰｒｏ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−ｂｈＰｈｅ−Ｒｌ５、
Ｉｄａ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｄｐａ−ｂｈＰｒｏ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−ｂｈＰｈｅ、
Ｉｄａ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｄｐａ−ｂｈＰｒｏ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ（Ｓ−Ｓ−Ｐａｌ）−Ａｒｇ−ｂｈＰｈｅ、
Ｉｄａ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｄｐａ−ｂｈＰｒｏ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ（Ｓ−Ｓ−ｃｙｓｔｅａｍｉｎｅ−Ｐａｌ）−Ａｒｇ−ｂｈＰｈｅ、
Ｉｄａ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｄｐａ−ｂｈＰｒｏ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ（Ｓ−Ｓ−Ｃｙｓ−ＮＨＰａｌ）−Ａｒｇ−ｂｈＰｈｅ、
Ｉｄａ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｄｐａ−ｂｈＰｒｏ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ（Ｓ−Ｓ−Ｃｙｓ）−Ａｒｇ−ｂｈＰｈｅ−Ｒ１４、
Ｉｄａ（ＮＨＰａｌ）−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｄｐａ−ｂｈＰｒｏ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−ｂｈＰｈｅ、
Ｉｄａ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｄｐａ−ｂｈＰｒｏ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−ｂｈＰｈｅ−Ｉｄａ（ＮＨＰａｌ）、
Ｉｄａ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｄｐａ−ｂｈＰｒｏ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−ｂｈＰｈｅ−Ａｈｘ−Ｉｄａ（ＮＨＰａｌ）、
Ｉｄａ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｄｐａ−ｂｈＰｒｏ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−ｂｈＰｈｅ−Ａｈｘ−Ｉｄａ（ＮＢｚｌ２）、及び
Ｉｄａ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｄｐａ−ｂｈＰｒｏ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ａｈｘ−Ｉｄａ（ＮＨＰａｌ）
からなる群から選択されるペプチドであって、
Ａｈｘが、ペプチド残基９とＩｄａ残基との間のアミノヘキサン酸スペーサーであり、
Ｒ１４が、パルミトイル−ＰＥＧ−ミニＰＥＧ３−であり、
Ｒ１５が、パルミトイル−ＰＥＧ−であり、
ＰＥＧがポリエチレングリコールであり、
ミニＰＥＧ３が、１１−アミノ−３，６，９−トリオキサウンデカン酸である、
ペプチド。

【請求項2】

前記ペプチドがヘプシジン活性を示す、請求項１に記載のペプチド。

【請求項3】

前記ペプチドがフェロポルチンと結合する、請求項１に記載のペプチド。

【請求項4】

当該ペプチドがＩｄａ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｄｐａ−ｂｈＰｒｏ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ａｈｘ−Ｉｄａ（ＮＨＰａｌ）であり、Ａｈｘが、ペプチド残基９とＩｄａ残基との間のアミノヘキサン酸スペーサーである、請求項１〜３のいずれか１項に記載のペプチド。

【請求項5】

請求項１〜４のいずれか１項に記載の少なくとも１つのペプチドを含む組成物。

【請求項6】

医薬組成物である、請求項５に記載の組成物。

【請求項7】

フェロポルチンと接触させられ、前記フェロポルチンと結合し、フェロポルチン内在化および分解を誘発する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の少なくとも１つのペプチドまたは請求項５または６に記載の組成物。

【請求項8】

対象に投与され、前記対象の鉄代謝の疾患を治療するための、請求項１〜４のいずれか１項に記載の少なくとも１つのペプチドまたは請求項５または６に記載の組成物。

【請求項9】

前記鉄代謝の疾患が鉄過負荷疾患である、請求項８に記載のペプチドまたは組成物。

【請求項10】

試薬、デバイス、説明資料、またはそれらの組み合わせをともに梱包された、請求項１〜４のいずれか１項に記載の少なくとも１つのペプチドまたは請求項５または６に記載の組成物を含むキット。

【請求項11】

フェロポルチンと結合する請求項１〜４のいずれか１項に記載の少なくとも１つのペプチドと、前記ペプチドと結合する抗体と、を含む複合体。

【請求項12】

医薬品の製造のための請求項１〜４のいずれか１項に記載の少なくとも１つのペプチドまたは請求項５または６に記載の組成物の使用。

【請求項13】

ヘモクロマトーシス、ＨＦＥ変異ヘモクロマトーシス、フェロポルチン変異ヘモクロマトーシス、トランスフェリン受容体２変異ヘモクロマトーシス、ヘモジュベリン変異ヘモクロマトーシス、ヘプシジン変異ヘモクロマトーシス、若年性ヘモクロマトーシス、新生児ヘモクロマトーシス、ヘプシジン欠損症、輸血鉄過剰症、サラセミア、中間型サラセミア、α型サラセミア、鉄芽球性貧血、ポルフィリン症、晩発性皮膚ポルフィリン症、アフリカ鉄過剰症、高フェリチン血症、セルロプラスミン欠損症、無トランスフェリン血症、先天性赤血球異形成貧血、慢性疾患の貧血、炎症の貧血、感染の貧血、低色素性小球性貧血、鉄欠乏性貧血、鉄剤不応性鉄欠乏性貧血、慢性腎臓疾患の貧血、エリスロポエチン不応性、肥満の鉄欠乏症、貧血、フリードライヒ運動失調症、薄束症候群、ハレルフォルデン−スパッツ病、ウィルソン病、肺ヘモジデリン沈着症、肝細胞癌、肝炎、肝硬変、又は慢性腎不全を治療するための医薬品の製造のための請求項１〜４のいずれか１項に記載の少なくとも１つのペプチドまたは請求項５または６に記載の組成物の使用。

【請求項14】

治療を必要とする対象の鉄代謝の疾患を治療するための医薬品の製造のための請求項１〜４のいずれか１項に記載の１つ以上のペプチドまたは請求項５または６に記載の組成物の使用。

【請求項15】

前記鉄代謝の疾患が、鉄過負荷疾患、鉄欠乏障害、又は鉄生体内分布の障害である、請求項１４に記載の使用。

【請求項16】

前記鉄代謝の疾患が、ヘモクロマトーシスである、請求項１４に記載の使用。

【請求項17】

治療を必要とする対象の鉄量を低下させるための医薬品の製造のための請求項１〜４のいずれか１項に記載の１つ以上のペプチドまたは請求項５または６に記載の組成物の使用。

【請求項18】

治療を必要とする対象の鉄代謝の疾患の治療における使用のために使用される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の１つ以上のペプチドまたは請求項５または６に記載の組成物。

【請求項19】

前記鉄代謝の疾患が、鉄過負荷疾患、鉄欠乏障害、又は鉄生体内分布の障害である、請求項１８に記載の使用のために使用される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の１つ以上のペプチドまたは請求項５または６に記載の組成物。

【請求項20】

前記鉄代謝の疾患が、遺伝性ヘモクロマトーシスである、請求項１８に記載の使用のために使用される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の１つ以上のペプチドまたは請求項５または６に記載の組成物。

【請求項21】

前記鉄代謝の疾患が、ヘモクロマトーシスである、請求項１８に記載の使用のために使用される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の１つ以上のペプチドまたは請求項５または６に記載の組成物。

【請求項22】

治療を必要とする対象の鉄量を低下させるために使用される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の１つ以上のペプチドまたは請求項５または６に記載の組成物。

【請求項23】

請求項１２から１７のいずれか１項に記載の医薬品の製造のためであり、前記医薬品が単回の１日用量として、または分割の１日用量として有効１日用量にて投与されるよう調製される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の１つ以上のペプチドまたは請求項５または６に記載の組成物の使用。

【請求項24】

前記有効１日用量が、約１０〜５００μｇ／ｋｇ／日であり、前記医薬品が皮下注射用に配合される、請求項２３に記載の使用。

【請求項25】

前記有効１日用量が約１０〜１０００μｇ／ｋｇ／日であり、前記医薬品が、経口、経肺または粘膜投与用に配合される、請求項２３に記載の使用。

【請求項26】

Ｉｄａ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｄｐａ−ｂｈＰｒｏ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ａｈｘ−Ｉｄａ（ＮＨＰａｌ）であるペプチドであって、
Ａｈｘが、ペプチド残基９とＩｄａ残基との間のアミノヘキサン酸スペーサーであり、
それを必要としている対象の鉄代謝の疾患を治療することに、及び／又は鉄量を低下させることに使用される、ペプチド。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０１１年１２月９日に出願された米国特許出願第６１／５６８，７２４号の利益を主張し、その全体が本明細書において参照により組み込まれる。

【0002】

本出願は、２００９年１２月４日に出願された、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６７１１号の３７１条国内移行である、米国特許出願第１３／１３１，７９２号および２００８年１２月５日に出願された米国仮出願第６１／１２０，２７７号に関し、それらの全体が本明細書において参照により組み込まれる。

【0003】

政府支援の承認
本発明は、国立衛生研究所により授与された、助成金番号第ＮＩＨ／ＮＩＤＤＫ Ｒ０１ ＤＫ０９０５５４号において政府支援がなされた。政府は、本発明において一定の権利を有する。

【0004】

ＥＦＳ−ＷＥＢにより提出された配列表の参照
２．５３ｋｂサイズである「０３４０４４＿０９７ＷＯ１＿ＳＴ２５」と名付けられた配列表のＡＳＣＩＩテキストファイルの内容が２０１２年１１月１日に作製され、ＥＦＳ−Ｗebにより電子出願され、これにより本出願は、その全体が本明細書において参照により組み込まれる。

【背景技術】

【0005】

発明の背景
１．技術分野
本発明は概ね、ヘプシジン活性を示すペプチドに関する。

【0006】

２．関連技術の説明
ヘプシジンは肝臓により生成されるペプチドホルモンであり、ヒトおよび他の哺乳類動物の鉄ホメオスタシスの調節因子である。ヘプシジンはその受容体、鉄輸送チャンネルであるフェロポルチンに結合することにより作用し、その内在化および分解を生じる。ヒトヘプシジンは、２５アミノ酸ペプチド（Ｈｅｐ２５）である。Ｋｒａｕｓｅ ｅｔ ａｌ．（２０００）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ ４８０：１４７−１５０、およびＰａｒｋ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７６：７８０６−７８１０を参照のこと。ヘプシジンの生物活性２５アミノ酸形態の構造は、Ｊｏｒｄａｎ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８４：２４１５５−６７により記載されているように、４つのジスルフィド結合を形成する８個のシステインを含む単純なヘアピンである。Ｎ末端領域は鉄調節機能において必要であり、５個のＮ末端アミノ酸残基の欠失が鉄調節機能の消失を生じる。Ｎｅｍｅｔｈ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｂｌｏｏｄ １０７：３２８−３３を参照のこと。

【0007】

異常なヘプシジン活性は、遺伝性ヘモクロマトーシスおよび鉄負荷性貧血および骨髄異形成を含む鉄過負荷疾患と関連する。遺伝性ヘモクロマトーシス（ＨＨ）は、おもにヘプシジン欠乏により、または非常に稀にヘプシジン耐性により生じる遺伝的鉄過負荷疾患である。これが、食事からの鉄を過剰に吸収させ、鉄過負荷を発症させる。ＨＨの臨床徴候は、肝臓疾患（肝硬変、肝細胞癌）、糖尿病、および心不全を含み得る。現在、ＨＨの唯一の治療は定期的な瀉血であり、これは効果的であるが、患者にとって非常に厄介なものである。

【0008】

鉄負荷性貧血は、βサラセミアなどの赤血球生成不良を伴う遺伝性貧血であり、重度の鉄過負荷を伴う。鉄過負荷由来の合併症が、これらの患者における罹患率および死亡率の主な原因となる。ヘプシジン欠乏は、輸血していない患者では鉄過負荷の主な原因であり、輸血した患者では鉄過負荷の一因となる。これらの患者における鉄過負荷のための現在の治療は、非常に厄介であり、時には効果がなく、高頻度の副作用を伴う鉄キレート化である。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0009】

本発明は概ね、ヘプシジン活性を示すペプチドおよびその使用方法に関する。

【0010】

本発明は、以下の構造式ＩＡまたはＩＢを含み、本質的に以下の構造式ＩＡまたはＩＢからなり、または以下の構造式ＩＡまたはＩＢからなる、単離され、かつ／または精製され得るペプチドを提供する：
Ａ１−Ａ２−Ａ３−Ａ４−Ａ５−Ａ６−Ａ７−Ａ８−Ａ９−Ａ１０ ＩＡ
Ａ１０−Ａ９−Ａ８−Ａ７−Ａ６−Ａ５−Ａ４−Ａ３−Ａ２−Ａ１ ＩＢ
式中、
Ａ１は、Ａｓｐ、Ｄ−Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｄ−Ｇｌｕ、ピログルタミン酸、Ｄ−ピログルタミン酸、Ｇｌｎ、Ｄ−Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｄ−Ａｓｎ、またはその代用物として通常使用される非天然アミノ酸、例えば、ｂｈＡｓｐ、Ｉｄａ、Ｉｄａ（ＮＨＰａｌ）およびＮ−ＭｅＡｓｐ、好ましくはＩｄａおよびＮ−ＭｅＡｓｐであり、
Ａ２は、Ｔｈｒ、Ｄ−Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｄ−Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ｄ−Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｄ−Ｉｌｅ、Ａｌａ、Ｄ−Ａｌａまたはその代用物として通常使用される非天然アミノ酸、例えば、Ｔｌｅ、Ｉｎｐ、Ｃｈｇ、ｂｈＴｈｒ、およびＮ−ＭｅＴｈｒであり、
Ａ３は、Ｈｉｓ、Ｄ−Ｈｉｓ、Ａｓｎ、Ｄ−Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｄ−Ａｒｇ、またはその代用物として通常使用される非天然アミノ酸、例えば、Ｌ−Ｈｉｓ（π−Ｍｅ）、Ｄ−Ｈｉｓ（π−Ｍｅ）、Ｌ−Ｈｉｓ（τ−Ｍｅ）、またはＤ−Ｈｉｓ（τ−Ｍｅ）であり、
Ａ４は、Ｐｈｅ、Ｄ−Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ｄ−Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｄ−Ｉｌｅ、Ｔｒｐ、Ｄ−Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｄ−Ｔｙｒ、またはその代用物として通常使用される非天然アミノ酸、例えば、Ｐｈｇ、ｂｈＰｈｅ、Ｄｐａ、Ｂｉｐ、１Ｎａｌ、２Ｎａｌ、ｂｈＤｐａ、Ａｍｃ、ＰｈｅＦ５、ｈＰｈｅ、Ｉｇｌ、またはシクロヘキシルアラニン、好ましくはＤｐａであり、
Ａ５は、Ｐｒｏ、Ｄ−Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｄ−Ｓｅｒ、またはその代用物として通常使用される非天然アミノ酸、例えば、Ｏｉｃ、ｂｈＰｒｏ、ｔｒａｎｓ−４−ＰｈＰｒｏ、ｃｉｓ−４−ＰｈＰｒｏ、ｃｉｓ−５−ＰｈＰｒｏ、およびＩｄｃ、好ましくはｂｈＰｒｏであり、
Ａ６は、Ａｒｇ、Ｄ−Ａｒｇ、Ｉｌｅ、Ｄ−Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｄ−Ｌｅｕ、Ｔｈｒ、Ｄ−Ｔｈｒ、Ｌｙｓ、Ｄ−Ｌｙｓ、Ｖａｌ、Ｄ−Ｖａｌ、またはその代用物として通常使用される非天然アミノ酸、例えば、Ｄ−Ｎω、ω−ジメチル−アルギニン、Ｌ−Ｎω、ω−ジメチル−アルギニン、Ｄ−ホモアルギニン、Ｌ−ホモアルギニン、Ｄ−ノルアルギニン、Ｌ−ノルアルギニン、シトルリン、グアニジウム基が修飾または置換された修飾Ａｒｇ、ノルロイシン、ノルバリン、ｂｈＩｌｅ、Ａｃｈ、Ｎ−ＭｅＡｒｇ、およびＮ−ＭｅＩｌｅ、好ましくはＡｒｇであり、
Ａ７は、Ｃｙｓ、Ｄ−Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｄ−Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｄ−Ａｌａ、または非天然アミノ酸、例えば、Ｃｙｓ（Ｓ−ｔＢｕｔ）、ホモＣｙｓ、Ｐｅｎ、（Ｄ）Ｐｅｎ、好ましくはＳ−ターシャリーブチル−システイン、Ｃｙｓ（Ｓ−Ｓ−Ｐａｌ）、Ｃｙｓ（Ｓ−Ｓ−システアミン−Ｐａｌ）、Ｃｙｓ（Ｓ−Ｓ−Ｃｙｓ−ＮＨＰａｌ）、およびＣｙｓ（Ｓ−Ｓ−Ｃｙｓ）であり、
Ａ８は、Ａｒｇ、Ｄ−Ａｒｇ、Ｉｌｅ、Ｄ−Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｄ−Ｌｅｕ、Ｔｈｒ、Ｄ−Ｔｈｒ、Ｌｙｓ、Ｄ−Ｌｙｓ、Ｖａｌ、Ｄ−Ｖａｌ、またはその代用物として通常使用される非天然アミノ酸、例えば、Ｄ−Ｎω、ω−ジメチル−アルギニン、Ｌ−Ｎω、ω−ジメチル−アルギニン、Ｄ−ホモアルギニン、Ｌ−ホモアルギニン、Ｄ−ノルアルギニン、Ｌ−ノルアルギニン、シトルリン、グアニジウム基が修飾または置換された修飾Ａｒｇ、ノルロイシン、ノルバリン、ｂｈＩｌｅ、Ａｃｈ、Ｎ−ＭｅＡｒｇ、およびＮ−ＭｅＩｌｅ、好ましくはＡｒｇであり、
Ａ９は、Ｐｈｅ、Ｄ−Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ｄ−Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｄ−Ｉｌｅ、Ｔｙｒ、Ｄ−Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｄ−Ｔｒｐ、Ｐｈｅ−Ｒ^ａ、Ｄ−Ｐｈｅ−Ｒ^ａ、Ｄｐａ−Ｒ^ａ、Ｄ−Ｄｐａ−Ｒ^ａ、Ｔｒｐ−Ｒ^ａ、ｂｈＰｈｅ−Ｒ^ａ、またはその代用物として通常使用される非天然アミノ酸であって、結合するＲ^ａがあってもよく、またはなくてもよい、非天然アミノ酸、例えば、ＰｈｅＦ５、Ｎ−ＭｅＰｈｅ、ベンジルアミド、２−アミノインダン、ｂｈＰｈｅ、Ｄｐａ、Ｂｉｐ、１Ｎａｌ、２Ｎａｌ、ｂｈＤｐａ、およびシクロヘキシルアラニン、好ましくはｂｈＰｈｅおよびｂｈＰｈｅ−Ｒ^ａであり、Ｒ^ａがパルミトイル−ＰＥＧ−であり、ＰＥＧがＰＥＧ１１またはミニＰＥＧ３、パルミトイル−ＰＥＧ−ＰＥＧであり、ＰＥＧがＰＥＧ１１またはミニＰＥＧ３、ブタノイル（Ｃ４）−ＰＥＧ１１−、オクタノイル（Ｃ８、カプリル酸）−ＰＥＧ１１−、パルミトイル（Ｃ１６）−ＰＥＧ１１−、またはテトラコサノイル（Ｃ２４、リグノセリン酸）−ＰＥＧ１１−であり、
Ａ１０は、Ｃｙｓ、Ｄ−Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｄ−Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｄ−Ａｌａ、または非天然アミノ酸、例えば、Ｉｄａ、Ｉｄａ（ＮＨＰａｌ）Ａｈｘ、およびＩｄａ（ＮＢｚｌ２）Ａｈｘであり、
この場合、カルボキシ末端アミノ酸がアミドもしくはカルボキシ形態であり、少なくとも１個のスルフィドリルアミノ酸が配列内のアミノ酸の１つとして存在し、Ａ１、Ａ１〜Ａ２、Ａ１０、またはそれらの組み合わせが場合により存在せず、但し、そのペプチドが表１に記載のペプチドの１つではない。いくつかの実施形態において、本発明のペプチドは、以下の少なくとも１つを含有する：ａ）Ａ１＝Ｎ−ＭｅＡｓｐ、Ｉｄａ、またはＩｄａ（ＮＨＰａｌ）、ｂ）Ａ５＝ｂｈＰｒｏ、ｃ）Ａ６＝Ｄ−Ｖａｌ、Ｄ−Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｄ−Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｄ−Ａｒｇ、Ａｃｈ、ｂｈＡｒｇ、またはＮ−ＭｅＡｒｇ、ｄ）Ａ７＝Ｃｙｓ（Ｓ−Ｓ−Ｐａｌ）、Ｃｙｓ（Ｓ−Ｓ−システアミン−Ｐａｌ）、Ｃｙｓ（Ｓ−Ｓ−Ｃｙｓ−ＮＨＰａｌ）、またはＣｙｓ（Ｓ−Ｓ−Ｃｙｓ）、および／またはｅ）Ａ８＝Ｄ−Ｖａｌ、Ｄ−Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｄ−Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｄ−Ａｒｇ、Ａｃｈ、ｂｈＡｒｇ、またはＮ−ＭｅＡｒｇ。いくつかの実施形態において、ｉ）Ａ１がＩｄａであり、Ａ９がＰｈｅであるときに、Ａ１０はＡｈｘ−Ｉｄａ（ＮＨＰａｌ）ではなく、ｉｉ）Ａ１がＩｄａであり、Ａ９がｂｈＰｈｅ−Ｒ^ｂではないときに、Ｒ^ｂはＳ−（パルミチル）チオグリコール酸−ＰＥＧ−であり、ｉｉｉ）Ａ４がＤ−Ｐｈｅであり、Ａ７がＤ−Ｃｙｓ（Ｓ−Ｓ−ｔＢｕｔ）ではなく、Ａ９がＤ−Ｔｒｐ−Ｒ^ｃではないときに、Ｒ^ｃはブタノイル−ＰＥＧ１１−、オクタノイル−ＰＥＧ１１−、パルミトイル−ＰＥＧ１１−、またはテトラコサノイル−ＰＥＧ１１−であり、またはｉｖ）Ａ１がＩｄａであり、Ａ９がｂｈＰｈｅ−Ｒ^ｄであるときに、Ｒ^ｄはパルミトイル−ＰＥＧ−ミニＰＥＧ３−であり、Ａ６およびＡ８がともにＤ−ＡｒｇまたはともにｂｈＡｒｇでない。いくつかの実施形態において、Ａ１がＤ−Ａｓｐ、Ｎ−ＭｅＡｓｐ、Ｉｄａ、またはＩｄａ（ＮＨＰａｌ）であり、Ａ２がＴｈｒまたはＤ−Ｔｈｒであり、Ａ３がＨｉｓまたはＤ−Ｈｉｓであり、Ａ４がＤｐａまたはＤ−Ｄｐａであり、Ａ５がＰｒｏ、Ｄ−Ｐｒｏ、ｂｈＰｒｏ、またはＯｉｃであり、Ａ６がＩｌｅ、Ｄ−Ｉｌｅ、Ａｒｇ、Ｄ−Ｖａｌ、Ｄ−Ｌｅｕ、Ａｃｈ、またはＮ−ＭｅＡｒｇであり、Ａ７がＣｙｓ、Ｄ−Ｃｙｓ、Ｃｙｓ（Ｓ−Ｓ−Ｐａｌ）、Ｃｙｓ（Ｓ−Ｓ−システアミン−Ｐａｌ）、Ｃｙｓ（Ｓ−Ｓ−Ｃｙｓ−ＮＨＰａｌ）、またはＣｙｓ（Ｓ−Ｓ−Ｃｙｓ）であり、Ａ８がＩｌｅ、Ｄ−Ｉｌｅ、Ａｒｇ、Ｄ−Ｖａｌ、Ｄ−Ｌｅｕ、Ａｃｈ、またはＮ−ＭｅＡｒｇであり、Ａ９がＰｈｅ、Ｄ−Ｐｈｅ、Ｄｐａ、Ｄ−Ｄｐａ、Ｔｒｐ、Ｄ−Ｔｒｐ、ｂｈＰｈｅ、Ｐｈｅ−Ｒ^ａ、Ｄ−Ｐｈｅ−Ｒ^ａ、Ｄｐａ−Ｒ^ａ、Ｄ−Ｄｐａ−Ｒ^ａ、Ｔｒｐ−Ｒ^ａ、ｂｈＰｈｅ−Ｒ^ａであり、この場合、Ｒ^ａがパルミトイル−ＰＥＧ−であり、ＰＥＧがＰＥＧ１１またはミニＰＥＧ３、パルミトイル−ＰＥＧ−ＰＥＧであり、ＰＥＧがＰＥＧ１１またはミニＰＥＧ３、ブタノイル（Ｃ４）−ＰＥＧ１１−、オクタノイル（Ｃ８、カプリル酸）−ＰＥＧ１１−、パルミトイル（Ｃ１６）−ＰＥＧ１１−、またはテトラコサノイル（Ｃ２４、リグノセリン酸）−ＰＥＧ１１−であり、Ａ１０が、存在する場合、Ｉｄａ（ＮＨＰａｌ）ＡｈｘまたはＩｄａ（ＮＢｚｌ２）Ａｈｘである。いくつかの実施形態において、Ａ６および／またはＡ８がリジン誘導体、例えば、Ｎ−ε−ジニトロフェニル−リジン、Ｎ−ε−メチル−リジン、Ｎ，Ｎ−ε−ジメチル−リジン、およびＮ，Ｎ，Ｎ−ε−トリメチル−リジンである。いくつかの実施形態において、ペプチドが、ＰＲ４２’、ＰＲ４７、ＰＲ４８、ＰＲ４９、ＰＲ５０、ＰＲ５１、ＰＲ５２、ＰＲ５３、ＰＲ５６、ＰＲ５７、ＰＲ５８、ＰＲ５９、ＰＲ６０、ＰＲ６１、ＰＲ６３、ＰＲ６５、ＰＲ６６、ＰＲ６７、ＰＲ６８、ＰＲ６９、ＰＲ７０、ＰＲ７１、ＰＲ７２、ＰＲ７３、ＰＲ７４、およびＰＲ８２からなる群から選択される。

【0011】

いくつかの実施形態において、ペプチドは、ジスルフィド結合により環状構造を形成する。いくつかの実施形態において、ペプチドはヘプシジン活性を示す。いくつかの実施形態において、ペプチドはフェロポルチン、好ましくはヒトフェロポルチンと結合する。

【0012】

いくつかの実施形態において、本発明は、少なくとも１つのペプチドを含み、本明細書に記載の構造式ＩＡまたはＩＢを含み、本質的に該構造式ＩＡまたはＩＢからなり、または該構造式ＩＡまたはＩＢからなる、単離され、合成され、かつ／または精製され得る組成物および医薬品を提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、少なくとも１つのペプチドを含み、本明細書に記載の構造式ＩＡまたはＩＢを含み、本質的に該構造式ＩＡまたはＩＢからなり、または該構造式ＩＡまたはＩＢからなる、単離され、かつ／または精製され得る、鉄過負荷疾患などの鉄代謝の疾患の治療のための医薬品を製造する方法を提供する。また、本明細書に記載の構造式ＩＡまたはＩＢを含み、本質的に該構造式ＩＡまたはＩＢからなり、または該構造式ＩＡまたはＩＢからなる、単離され、かつ／または精製され得る少なくとも１つのペプチド、あるいは上記の少なくとも１つのペプチドを含む組成物を、対象に投与することを含む、対象の、例えば、哺乳類対象、好ましくはヒト対象の鉄代謝の疾患を治療する方法を提供する。いくつかの実施形態において、ペプチドを治療有効量で投与する。いくつかの実施形態において、治療有効量は、単回の１日用量または分割の１日用量として投与される有効１日用量である。本発明のペプチドも種々の用量にて投与することができる。

【0013】

いくつかの実施形態において、用量は、１週間の用量、例えば、１〜１０，０００μｇ／ｋｇ／用量として与えられる。いくつかの実施形態において、１日の用量は、約１〜１，０００、好ましくは約１０〜５００μｇ／ｋｇ／日である。投与量は、投与されるペプチジル薬の配合の種類ならびに投与経路に従い異なり得る。当業者であれば、投与される投与量が、本明細書に記載の好ましい投与量の範囲から得られるのと同様の薬物動態または生物学的プロファイルを生じるよう、投与経路または配合を変更することにより投与量を調節することができる。いくつかの実施形態において、投与される組成物は、経口、経肺または粘膜投与のために配合される。

【0014】

いくつかの実施形態は、血清鉄値を１０〜８０％減少させることにより、有効な薬物動態および薬力学プロファイルを生じる任意の投与経路を用いた任意の投与量を含む。いくつかの好ましい用量は、血清鉄の所望の減少を生じるものを含む。本発明のペプチジルまたはタンパク質配合物の投与は、自己投与を含む直接投与および薬物を処方する行為を含む間接投与の両方を含む。例えば、患者に薬物の自己投与を指示し、かつ／または患者に薬物の処方を提供する医師は、薬物を患者に投与すると考えられる。

【0015】

いくつかの実施形態において、本発明は、フェロポルチンを結合させ、またはフェロポルチンと、本明細書に開示の少なくとも１つのペプチドまたは組成物を接触させることを含むフェロポルチン内在化および分解を誘発する方法を提供する。

【0016】

いくつかの実施形態において、本発明は、試薬、デバイス、説明資料、またはそれらの組み合わせとともに梱包された本明細書に開示の少なくとも１つのペプチドまたは組成物を含むキットを提供する。

【0017】

いくつかの実施形態において、本発明は、フェロポルチン、好ましくはヒトフェロポルチンと結合する本明細書に開示の少なくとも１つのペプチド、または抗体、例えば、本明細書に開示のペプチドであるＨｅｐ２５に特異的に結合する抗体、またはそれらの組み合わせを含む複合体を提供する。

【0018】

いくつかの実施形態において、本発明は、本明細書に記載の構造式ＩＡまたはＩＢを含み、本質的に該構造式ＩＡまたはＩＢからなり、または該構造式ＩＡまたはＩＢからなる、単離され、かつ／または精製され得る少なくとも１つのペプチド、または治療を必要とする対象の鉄代謝の疾患を治療し、かつ／または鉄量を低下させるための医薬品の製造のための上記の少なくとも１つのペプチドを含み、本質的に該ペプチドからなり、または該ペプチドからなる組成物の使用を提供し、この場合、医薬品は、単回の１日用量として、または分割の１日用量として有効の１日用量にて投与されるよう調製される。いくつかの実施形態において、用量は約１〜１，０００、好ましくは約１０〜５００μｇ／ｋｇ／日である。いくつかの実施形態において、医薬品は、皮下注射または経口、経肺もしくは粘膜投与のために配合される。

【0019】

上述の一般的な説明および以下の詳細な説明はともに、例示および説明に過ぎず、特許請求された場合に本発明のさらなる説明を提供することを企図する。添付の図面は本発明のさらなる理解を提供することを含み、本明細書の一部に組み込まれ、かつそれを構成し、本発明のいくつかの実施形態を図示し、説明とともに本発明の原理を説明するのに役立つ。
本発明は、図面を参照してさらに理解される。

【図面の簡単な説明】

【0020】

【図1】Ｈｅｐ２５におけるアラニン置換の相対的ヘプシジン活性を示すグラフである。

【図2A】Ｈｅｐ２５におけるＦ４置換の相対的ヘプシジン活性を示すグラフである。

【図2B】Ｈｅｐ２５におけるＦ９置換の相対的ヘプシジン活性を示すグラフである。

【図3A】Ｈｅｐ２５に対するＨｅｐ１〜９およびＨｅｐ１〜１０Ｃ７Ａのヘプシジン活性を示すグラフである（Ａ）。

【図3B】Ｈｅｐ１〜９またはＨｅｐ２５に対するＨｅｐ１〜７およびＨｅｐ１〜８のヘプシジン活性を示すグラフである。

【図3C】Ｈｅｐ２５に対するＨｅｐ４〜７、Ｈｅｐ３〜７、Ｈｅｐ３〜８およびＨｅｐ３〜９のヘプシジン活性を示すグラフである。

【図4】Ｈｅｐ２５およびＨｅｐ１〜９に対するＣ７改変ペプチドのヘプシジン活性を示すグラフである。

【図5】Ｈｅｐ２５または対照（ＰＢＳ）と比較してミニヘプシジンＨｅｐ１〜９、ＰＲ６およびＰＲ１２のインビボ効果（マウスの血清鉄濃度により測定）を示すグラフである。ペプチドは、マウス当たり５０μｇのペプチドを腹腔内注射した。

【図6】腹腔内注射されたミニヘプシジンＰＲ２７（２０および２００ｎモル）のインビボ効果（マウスの血清鉄濃度により測定）を示すグラフである。Ｈｅｐ２５の注射量は２０ｎモルであった。

【図7】腹腔内注射されたミニヘプシジンｒｉＨｅｐ７ΔＤＴ（２０および２００ｎモル）のインビボ効果（マウスの血清鉄濃度により測定）を示すグラフである。Ｈｅｐ２５の注射量は２０ｎモルであった。

【図8】はじめにリポソームと混合し、腹腔内注射したミニヘプシジンＰＲ２７およびＰＲ２８（２０ｎモル）のインビボ効果（マウスの血清鉄濃度により測定）を示すグラフである。Ｈｅｐ２５の注射量は２０ｎモルであった。

【図9】強制による経口投与後のミニヘプシジンＰＲ２７（２００ｎモル）のインビボ効果（マウスの血清鉄濃度により測定）を示すグラフである。

【図10A】野生型マウスのミニヘプシジンＰＲ６５およびその活性を示す。ＰＲ６５の構造式を示す。Ｉｄａ＝イミノ二酢酸、Ｄｐａ＝ジフェニルアラニン、ｂｈＰｒｏ＝ベータ−ホモプロリン、ｂｈＰｈｅ＝ベータ−ホモフェニルアラニン。

【図10B】野生型マウスのミニヘプシジンＰＲ６５およびその活性を示す。溶剤、天然のヘプシジンまたはＰＲ６５の腹腔内注射４時間後の野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスの血清鉄を示す（各群ｎ＝４〜８）。^＊＊ｐ＝０．０１、^＊ｐ＝０．００５。バーは平均値および誤差バーは標準偏差を示す。

【図10C】野生型マウスのミニヘプシジンＰＲ６５およびその活性を示す。２０ｎモルのＰＲ６５の腹腔内または皮下注射４時間後の野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスの血清鉄を示す（各群ｎ＝４）。^＊ｐ＝０．００７、^＊＊ｐ＝０．０４。バーは平均値および誤差バーは標準偏差を示す。

【図11A】鉄負荷したヘプシジンノックアウトマウスのＰＲ６５の低鉄血症の影響を示す。ＰＲ６５が皮下注射２４時間後の血清鉄における用量依存的低下を誘発したことを示す。平均値および標準偏差を示す。各点ｎ＝３〜５匹のマウス。＃ｐ＝０．００５、＆ｐ＝０．００４、^＊ｐ＜０．００１。

【図11B】鉄負荷したヘプシジンノックアウトマウスのＰＲ６５の低鉄血症の影響を示す。１００ｎモルのＰＲ６５の皮下注射により誘発された低鉄血症の時間経過を示す。平均値および標準偏差を示す。各点ｎ＝４〜６匹のマウス。＃ｐ＝０．００８、^＊ｐ＜０．００１。

【図12】ＰＲ６５処置したヘプシジンノックアウトマウスにおける鉄分布の変化を示す。組織鉄は、ＰＲ６５（１００ｎモル）の皮下注射０〜４８時間後にて増感ペルルス染色により視覚化された。代表的な画像を示す。水平バーは、４００μｍ（１０倍）および１００μｍ（４０倍）を示す。上部の列：脾臓鉄は乏しく、その分布は４８時間の間にはっきりと変化しなかった。中央の列：絨毛嚢胞の鉄は、溶剤処置および１〜４時間のＰＲ６５処置されたマウスにおいて明らかであり、腸細胞の基底側方膜からの鉄の活性フェロポルチン介在性流出を示した。１２〜２４時間に、鉄は、腸細胞に滞留し、（ミニ）ヘプシジン誘発性フェロポルチン分解と一致した。注射４８時間後では、鉄はもはや腸細胞に滞留していなかった。下部の列：予測した通り、肝臓は、ベースラインにて鉄負荷され、鉄染色のパターンの変化は、ＰＲ６５処置の４８時間内に認められなかった。

【図13A】ＰＲ６５が、鉄枯渇させたヘプシジンノックアウトマウスにおける鉄負荷を抑制したことを示す。全てのマウスは、５〜６週齢から１２週齢まで鉄欠乏飼料（４ｐｐｍ鉄）で飼育された。「ベースライン」群（ｎ＝７）は、１２週齢にて試験された（白色のバー）。残りのマウスに、さらに２週間、鉄負荷飼料（３００ｐｐｍ）を与える一方で、溶剤（灰色のバー、ｎ＝６）またはＰＲ６５を１日当たり２０、５０または１００ｎモルにて毎日皮下注射した（黒色のバー、各用量ｎ＝４）。マウスは、最後の注射２４時間後で分析された。溶剤と比較して、ＰＲ６５の注射は、脾臓の鉄滞留を生じた。グラフは、平均値および標準偏差を示す。スチューデントのｔ検定を使用し、各状態の平均値を溶剤処置のものに対して比較した（バーの上のｐ値）。

【図13B】ＰＲ６５が、鉄枯渇させたヘプシジンノックアウトマウスにおける鉄負荷を抑制したことを示す。全てのマウスは、５〜６週齢から１２週齢まで鉄欠乏飼料（４ｐｐｍ鉄）で飼育された。「ベースライン」群（ｎ＝７）は、１２週齢にて試験された（白色のバー）。残りのマウスに、さらに２週間、鉄負荷飼料（３００ｐｐｍ）を与える一方で、溶剤（灰色のバー、ｎ＝６）またはＰＲ６５を１日当たり２０、５０または１００ｎモルにて毎日皮下注射した（黒色のバー、各用量ｎ＝４）。マウスは、最後の注射２４時間後で分析された。溶剤と比較して、ＰＲ６５の注射は、血清鉄の用量依存的低下を生じた。グラフは、平均値および標準偏差を示す。スチューデントのｔ検定を使用し、各状態の平均値を溶剤処置のものに対して比較した（バーの上のｐ値）。

【図13C】ＰＲ６５が、鉄枯渇させたヘプシジンノックアウトマウスにおける鉄負荷を抑制したことを示す。全てのマウスは、５〜６週齢から１２週齢まで鉄欠乏飼料（４ｐｐｍ鉄）で飼育された。「ベースライン」群（ｎ＝７）は、１２週齢にて試験された（白色のバー）。残りのマウスに、さらに２週間、鉄負荷飼料（３００ｐｐｍ）を与える一方で、溶剤（灰色のバー、ｎ＝６）またはＰＲ６５を１日当たり２０、５０または１００ｎモルにて毎日皮下注射した（黒色のバー、各用量ｎ＝４）。マウスは、最後の注射２４時間後で分析された。溶剤と比較して、ＰＲ６５の注射は、Ｈｂ濃度における対応する用量依存的低下を生じた。グラフは、平均値および標準偏差を示す。スチューデントのｔ検定を使用し、各状態の平均値を溶剤処置のものに対して比較した（バーの上のｐ値）。

【図13D】ＰＲ６５が、鉄枯渇させたヘプシジンノックアウトマウスにおける鉄負荷を抑制したことを示す。全てのマウスは、５〜６週齢から１２週齢まで鉄欠乏飼料（４ｐｐｍ鉄）で飼育された。「ベースライン」群（ｎ＝７）は、１２週齢にて試験された（白色のバー）。残りのマウスに、さらに２週間、鉄負荷飼料（３００ｐｐｍ）を与える一方で、溶剤（灰色のバー、ｎ＝６）またはＰＲ６５を１日当たり２０、５０または１００ｎモルにて毎日皮下注射した（黒色のバー、各用量ｎ＝４）。マウスは、最後の注射２４時間後で分析された。溶剤と比較して、ＰＲ６５の注射は、高用量にて心臓鉄の低下を生じた。グラフは、平均値および標準偏差を示す。スチューデントのｔ検定を使用し、各状態の平均値を溶剤処置のものに対して比較した（バーの上のｐ値）。

【図13E】ＰＲ６５が、鉄枯渇させたヘプシジンノックアウトマウスにおける鉄負荷を抑制したことを示す。全てのマウスは、５〜６週齢から１２週齢まで鉄欠乏飼料（４ｐｐｍ鉄）で飼育された。「ベースライン」群（ｎ＝７）は、１２週齢にて試験された（白色のバー）。残りのマウスに、さらに２週間、鉄負荷飼料（３００ｐｐｍ）を与える一方で、溶剤（灰色のバー、ｎ＝６）またはＰＲ６５を１日当たり２０、５０または１００ｎモルにて毎日皮下注射した（黒色のバー、各用量ｎ＝４）。マウスは、最後の注射２４時間後で分析された。溶剤と比較して、ＰＲ６５の注射は、肝臓鉄の低下を生じた。ＰＲ６５を注射されたマウスの肝臓鉄含量は、マウスのベースライン群のものと顕著な違いはなく、２週間の処置の間の肝臓における新たな鉄はほとんどか全く吸収されず、または沈着されなかった。グラフは、平均値および標準偏差を示す。スチューデントのｔ検定を使用し、各状態の平均値を溶剤処置のものに対して比較した（バーの上のｐ値）。図１３Ｅにおいて、各状態の平均値をベースラインと比較した（バーの上の各線のｐ値）。

【図14】鉄の過負荷の抑制のためのＰＲ６５注射の２週間後の鉄の細胞分布を示す。代表的な画像を示す。水平のバーは、４００μｍ（１０倍）および１００μｍ（４０倍）を示す。鉄の蓄積は、ＰＲ６５処置したマウスの脾臓赤髄において認められたが、溶剤処置したマウスでは認められなかった。同様に、十二指腸細胞の鉄蓄積は、ＰＲ６５処置したマウスにおいてのみ認められた。溶剤注射したマウスの心臓鉄染色と比較して、５０および１００ｎモルのＰＲ６５を注射した動物の心臓の鉄蓄積は少なく、図４の定量方法と一致した。２０および５０ｎモルのＰＲ６５で処置したマウスの肝臓鉄負荷は、ベースライン群のものと類似し、溶剤処置した群の鉄負荷よりかなり少なかった。最高量のＰＲ６５にて、肝臓鉄は、ベースライン時よりも低く、マウスが、ミニヘプシジン活性が高いにも関わらず、肝臓鉄を動員することができたことを示した。

【図15A】鉄負荷したヘプシジンノックアウトマウスの２週間のＰＲ６５処置が少量の鉄の再分布を生じたことを示す。ヘプシジンノックアウトマウスは、生存期間全体にわたり３００ｐｐｍの鉄飼料で飼育された。１２週齢にて開始すると、マウスの１群には溶剤を皮下注射し（ｎ＝４）、他は２週間毎日、５０ｎモルのＰＲ６５を注射した（ｎ＝４）。鉄および血液学的パラメータを最後の注射２４時間後で測定した。溶剤処置したマウスと比較しＰＲ６５処置したマウスにおいて、脾臓鉄が１５倍以上増加し、ＰＲ６５活性を確認した。

【図15B】鉄負荷したヘプシジンノックアウトマウスの２週間のＰＲ６５処置が少量の鉄の再分布を生じたことを示す。ヘプシジンノックアウトマウスは、生存期間全体にわたり３００ｐｐｍの鉄飼料で飼育された。１２週齢にて開始すると、マウスの１群には溶剤を皮下注射し（ｎ＝４）、他は２週間毎日、５０ｎモルのＰＲ６５を注射した（ｎ＝４）。鉄および血液学的パラメータを最後の注射２４時間後で測定した。溶剤処置したマウスと比較しＰＲ６５処置したマウスにおいて、血清鉄濃度が最後の注射２４時間後で同様であった。

【図15C】鉄負荷したヘプシジンノックアウトマウスの２週間のＰＲ６５処置が少量の鉄の再分布を生じたことを示す。ヘプシジンノックアウトマウスは、生存期間全体にわたり３００ｐｐｍの鉄飼料で飼育された。１２週齢にて開始すると、マウスの１群には溶剤を皮下注射し（ｎ＝４）、他は２週間毎日、５０ｎモルのＰＲ６５を注射した（ｎ＝４）。鉄および血液学的パラメータを最後の注射２４時間後で測定した。溶剤処置したマウスと比較しＰＲ６５処置したマウスにおいて、ヘモグロビンが２ｇ／ｄＬ低下し、赤血球生成に対する鉄制限を示した。

【図15D】鉄負荷したヘプシジンノックアウトマウスの２週間のＰＲ６５処置が少量の鉄の再分布を生じたことを示す。ヘプシジンノックアウトマウスは、生存期間全体にわたり３００ｐｐｍの鉄飼料で飼育された。１２週齢にて開始すると、マウスの１群には溶剤を皮下注射し（ｎ＝４）、他は２週間毎日、５０ｎモルのＰＲ６５を注射した（ｎ＝４）。鉄および血液学的パラメータを最後の注射２４時間後で測定した。溶剤処置したマウスと比較しＰＲ６５処置したマウスにおいて、心臓鉄が低下する傾向であったが、その差は、処置したマウスの数において統計学的に有意ではなかった。

【図15E】鉄負荷したヘプシジンノックアウトマウスの２週間のＰＲ６５処置が少量の鉄の再分布を生じたことを示す。ヘプシジンノックアウトマウスは、生存期間全体にわたり３００ｐｐｍの鉄飼料で飼育された。１２週齢にて開始すると、マウスの１群には溶剤を皮下注射し（ｎ＝４）、他は２週間毎日、５０ｎモルのＰＲ６５を注射した（ｎ＝４）。鉄および血液学的パラメータを最後の注射２４時間後で測定した。溶剤処置したマウスと比較しＰＲ６５処置したマウスにおいて、肝臓鉄が約２０％低下した。

【図16】確立された鉄過負荷の治療のための２週間のＰＲ６５注射後の、鉄の細胞分布を示す。組織切片は、図１５Ａ〜１５Ｅで分析した動物に対応し、代表的な画像を示した。水平バーは、４００μｍ（１０倍）および１００μｍ（４０倍）を示す。増感ペルルス染色により、脾臓マクロファージおよび十二指腸細胞が溶剤処置したマウスではなく、ＰＲ６５処置したマウスにおいて鉄を滞留したことを確認した。溶剤処置した対照と比較し、鉄染色は、ＰＲ６５で処置したマウスの肝臓において強度が低いことが認められた。溶剤とＰＲ６５処置したマウスとの一貫した差は、心臓の切片において認められなかった（図示せず）。

【図17】表１、３および４に記載の分子の構造の一部を示す。

【発明を実施するための形態】

【0021】

本発明の詳細な説明
本発明は、鉄代謝の疾患の試験および治療に有用なペプチドを提供する。

【0022】

本明細書において使用される場合、「鉄代謝の疾患」は、異常な鉄代謝が直接疾患を引き起こし、もしくは血中鉄濃度が異常調節となり疾患を生じ、または鉄の異常調節が別の疾患の結果であり、あるいは疾患が鉄濃度を調節することにより処置することができるなどの疾患を含む。より詳細には、本開示における鉄代謝の疾患は、鉄過負荷疾患、鉄欠乏障害、鉄生体内分布の障害、鉄代謝の他の障害および鉄代謝に潜在的に関連する他の障害などを含む。鉄代謝の疾患は、ヘモクロマトーシス、ＨＦＥ変異ヘモクロマトーシス、フェロポルチン変異ヘモクロマトーシス、トランスフェリン受容体２変異ヘモクロマトーシス、ヘモジュベリン変異ヘモクロマトーシス、ヘプシジン変異ヘモクロマトーシス、若年性ヘモクロマトーシス、新生児ヘモクロマトーシス、ヘプシジン欠損症、輸血鉄過剰症、サラセミア、中間型サラセミア、α型サラセミア、鉄芽球性貧血、ポルフィリン症、晩発性皮膚ポルフィリン症、アフリカ鉄過剰症、高フェリチン血症、セルロプラスミン欠損症、無トランスフェリン血症、先天性赤血球異形成貧血、慢性疾患の貧血、炎症の貧血、感染の貧血、低色素性小球性貧血、鉄欠乏性貧血、鉄剤不応性鉄欠乏性貧血、慢性腎臓疾患の貧血、エリスロポエチン不応性、肥満の鉄欠乏症、他の貧血、ヘプシジンを過剰産生し、またはその過剰産生を誘発する良性または悪性腫瘍、ヘプシジン過剰を伴う状態、フリードライヒ運動失調症、薄束症候群、ハレルフォルデン−スパッツ病、ウィルソン病、肺ヘモジデリン沈着症、肝細胞癌、がん、肝炎、肝硬変、異食症、慢性腎不全、インスリン抵抗性、糖尿病、アテローム性動脈硬化症、神経変性障害、多発性硬化症、パーキンソン病、ハンチントン病、およびアルツハイマー病を含む。本明細書において使用される場合、「鉄過負荷疾患」および「鉄過負荷の疾患」は、治療しない場合、罹患対象の鉄の濃度が異常に高くなる、または高くなる可能性のある疾患および障害を指す。

【0023】

いくつかの場合において、「鉄代謝の疾患」の定義に含まれる疾患および障害は、鉄が関連していると必ずしも分類されるものではない。例えば、ヘプシジンは、マウス膵臓においてかなり発現し、糖尿病（Ｉ型またはＩＩ型）、インスリン耐性、耐糖能障害および他の障害が基礎鉄代謝障害を治療することにより改善され得ることが示唆される。本明細書において参照により組み込まれる、Ｉｌｙｉｎ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．（２００３）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．５４２ ２２−２６を参照のこと。それゆえ、これらの疾患は、広義の定義のもとに包含される。当業者であれば、所与の疾患が、本明細書において参照により組み込まれる、国際公開第２００４０９２４０５号のアッセイおよび、ヘプシジン、ヘモジュベリン、または鉄濃度および発現をモニタリングし、本明細書において参照により組み込まれる、米国特許第７，５３４，７６４号に記載のものなどの当技術分野において周知であるアッセイを含む当技術分野において周知の方法を使用して本発明における「鉄代謝の疾患」であるかどうかを容易に決定することができる。

【0024】

本発明の好ましい実施形態において、鉄代謝の疾患は、遺伝性ヘモクロマトーシス、鉄負荷性貧血、アルコール性肝疾患およびＣ型慢性肝炎を含む、鉄過負荷疾患である。

【0025】

本明細書において使用される場合、用語、「タンパク質」、「ポリペプチド」および「ペプチド」は、２個以上のアミノ酸がともに結合することを指す同じ意味で使用される。以下の表２に記載の一般的でない、または非天然のアミノ酸の略語を除き、当技術分野において使用される３文字および１文字の略語を、本明細書において使用し、アミノ酸残基を表す。「Ｄ−」が接頭につく場合を除き、アミノ酸はＬ−アミノ酸である。アミノ酸の略語の群または文字列を使用し、ペプチドを表す。詳細に示される場合を除き、ペプチドは、左にＮ末端を示し、配列はＮ末端からＣ末端に記載される。

【0026】

本発明のペプチドは、化学合成（固相、溶液相、またはそれらの組み合わせ）、生合成または組み換えＤＮＡ法を使用するインビトロ合成を含む当技術分野において周知の方法を使用して作製され得る。例えば、本明細書において参照により組み込まれる、Ｋｅｌｌｙ＆Ｗｉｎｋｌｅｒ（１９９０）Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ，ｖｏｌ．１２，Ｊ．Ｋ．Ｓｅｔｌｏｗ ｅｄ．，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，ｐｐ．１−１９；Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ（１９６４）Ｊ Ａｍｅｒ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ ８５：２１４９；Ｈｏｕｇｈｔｅｎ（１９８５）ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８２：５１３１−５１３５；およびＳｔｅｗａｒｔ＆Ｙｏｕｎｇ（１９８４）Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｅｄ．Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬを参照のこと。本発明のペプチドは、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、イオン交換または免疫アフィニティークロマトグラフィー、沈降法、濾過、サイズ排除、または電気泳動などの当技術分野において周知のタンパク質精製技法を使用して精製され得る。本明細書において参照により組み込まれる、Ｏｌｓｎｅｓ，Ｓ．ａｎｄ Ａ．Ｐｉｈｌ（１９７３）Ｂｉｏｃｈｅｍ．１２（１６）：３１２１−３１２６；およびＳｃｏｐｅｓ（１９８２）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，ＮＹを参照のこと。代替えとして、本発明のペプチドは、当技術分野において周知の組み換えＤＮＡ法により作製され得る。従って、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、本明細書において検討される。好ましい実施形態において、ポリヌクレオチドを単離する。本明細書において使用される場合、「単離されたポリヌクレオチド」は、ポリヌクレオチドが天然に生じるものと異なる環境にあるポリヌクレオチドを指す。

【0027】

いくつかの実施形態において、本発明のペプチドは実質的に精製される。本明細書において使用される場合、「実質的に精製された」化合物は、その天然の環境から取り出され、化合物が天然に関連する他の高分子構成物質を少なくとも約６０％、好ましくは約７５％および最も好ましくは約９０％含まない化合物、または２１４ｎｍでの検出のＨＰＬＣにより測定される他のペプチド構成物質を少なくとも約６０％、好ましくは約７５％および最も好ましくは約９０％含まない化合物を指す。

【0028】

本明細書において使用される場合、「単離された」化合物は、天然の環境から単離された化合物を指す。例えば、単離されたペプチドは、その天然のアミノ酸をもたないものであり、完全長のポリペプチド、隣接するＮ末端、Ｃ末端、または両方に対応する。例えば、単離されたＨｅｐ１−９は、Ｈｅｐ２５のアミノ酸残基１〜９を含む単離されたペプチドを指し、これは、そのＮ末端、Ｃ末端、または両方にて非天然のアミノ酸を有し得るが、Ｃ末端にてその９番目のアミノ酸残基に続くシステインアミノ酸残基をもたない。本明細書において記載されるように、アミノ酸の位置の言及は、Ｈｅｐ２５のアミノ酸残基に対応する。例えば、アミノ酸９位の言及は、Ｈｅｐ２５の９番目のアミノ酸残基に対応する。

【0029】

本発明のペプチドは、フェロポルチン、好ましくはヒトフェロポルチンと結合する。本発明の好ましいペプチドは、ヒトフェロポルチンと特異的に結合する。本明細書において使用される場合、「特異的に結合する」は、サンプル内の他の物質よりも所与のリガンドと、特異的な結合剤の好ましい相互作用を指す。例えば、所与のリガンドと特異的に結合する特異的な結合剤は、サンプル内の他の構成物質との任意の非特異的な相互作用の結合よりも観察可能な量または程度で、適切な条件において所与のリガンドと結合する。適切な条件は、所与の特異的な結合剤と所与のリガンドとの相互作用を可能にするものである。これらの条件は、ｐＨ、温度、濃度、溶剤、インキュベーションの時間などを含み、所与の特異的な結合剤およびリガンドの組み合わせで異なり得るが、当業者により容易に決定され得る。

【0030】

Ｈｅｐ２５のヘプシジン活性を模倣する本発明のペプチド、つまり、生物活性ヒト２５アミノ酸形態は、本明細書において「ミニヘプシジン」と称される。本明細書において使用される場合、「ヘプシジン活性」を有する化合物は、対象（例えば、マウスまたはヒト）にその化合物が用量依存的および時間依存的に投与（例えば、非経口注射または経口投与）されるときに、その血漿鉄濃度を低下させる能力を有することを意味する。例えば、Ｒｉｖｅｒａ ｅｔ ａｌ．（２００５），Ｂｌｏｏｄ １０６：２１９６−９に例証されているものを参照のこと。

【0031】

いくつかの実施形態において、本発明のペプチドは、Ｎｅｍｅｔｈ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｂｌｏｏｄ １０７：３２８−３３に教示されるように、フェロポルチン発現細胞株のフェロポルチンの内在化および分解を引き起こす能力によりアッセイされるインビトロ活性を有する。インビトロ活性は、Ｎｅｍｅｔｈ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｂｌｏｏｄ １０７：３２８−３３にあるように緑色蛍光タンパク質に融合したフェロポルチンを表示するよう操作された細胞の蛍光の用量依存的消失により測定され得る。少量の細胞をＨｅｐ２５またはミニヘプシジンの参照調製物の段階的な濃度を用いて２４時間インキュベーションする。本明細書において提供されるように、ＥＣ_５０値は、参照Ｈｅｐ２５調製物により生成された蛍光の最大消失の５０％を誘起する所与の化合物（例えば、ペプチド）の濃度として提供される。本アッセイのＨｅｐ２５調製物のＥＣ_５０は、５〜１５ｎＭの範囲であり、好ましいミニヘプシジンは、インビトロ活性アッセイにおいて約１，０００ｎＭ以下のＥＣ_５０値を有する。

【0032】

本発明によるヘプシジン活性およびペプチドのインビトロ活性を算出する当技術分野において周知の他の方法を使用することができる。例えば、化合物のインビトロ活性は、化合物が細胞フェロポルチンを内在化する能力により測定することができ、これはフェロポルチンの細胞外エピトープを認識する抗体を使用して、免疫組織化学またはフローサイトメトリーにより決定される。代替えとして、化合物のインビトロ活性は、Ｎｅｍｅｔｈ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｂｌｏｏｄ １０７：３２８−３３にあるように、鉄の放射性同位体または安定した同位体を予め負荷したフェロポルチン発現細胞から鉄の流出を阻害する化合物の用量依存的能力により測定することができる。

【0033】

ミニヘプシジンの設計

【0034】

これまでの研究は、Ｈｅｐ２５のＮ末端セグメントが、そのヘプシジン活性に重要であり、フェロポルチンと接触面を形成する可能性があることを示している。しかし、ヘプシジン活性に対する各Ｎ末端アミノ酸の重要性は知られていなかった。それゆえ、アラニンスキャンニング突然変異法をＨｅｐ２５の残基１〜６に行い、ヘプシジン活性に対する各Ｎ末端アミノ酸の寄与を決定した。図１に示されるように、Ｔ２Ａ置換は、実質的にヘプシジン活性に影響を与えなかった。フェニルアラニン置換（Ｆ４ＡまたはＦ９Ａ）は、ヘプシジン活性において最も大きな低下、つまり約７０％超を生じた。残りのアラニン置換では、Ｆ４ＡまたはＦ９Ａ置換ほど顕著でないヘプシジン活性の検出可能な低下があった。

【0035】

高度に保存され、明らかに構造的に重要なＦ４フェニルアラニンがヘプシジン活性に重要であるかどうかを決定するため、Ｈｅｐ２５のＦ４アミノ酸を、他のアミノ酸と体系立てて置換した。図２Ａに示されるように、側鎖をより極性（Ｆ４Ｙ）にすることは、Ｄ−フェニルアラニン（ｆ）または荷電アミノ酸（Ｄ、ＫおよびＹ）と置換した際のように、ヘプシジン活性の実質的な消失を導いた。しかし、ヘプシジン活性は、Ｆ４残基が非芳香族シクロヘキシルアラニンと置換されたときに維持され、それにより嵩高い疎水性残基が活性には十分であることが示された。

【0036】

高度に保存され、明らかに構造的に重要なＦ９フェニルアラニンがヘプシジン活性に重要であるかどうかを決定するため、Ｈｅｐ２５のＦ９アミノ酸を他のアミノ酸と置換した。図２Ｂに示されるように、ヘプシジン活性は、Ｆ９がアラニンと置換されたときだけでなく、非芳香族シクロヘキシルアラニンと置換したときにも低下し、それにより芳香族残基が活性に重要であり得ることが示された。

【0037】

変異試験は、ヒトフェロポルチンの３２６位のシステイン残基であるＣ３２６が、ヘプシジンの結合に関与する重要な残基であることを示す。従って、チオールを含有するＨｅｐ２５の種々のＮ末端フラグメント、すなわち、Ｈｅｐ４−７、Ｈｅｐ３−７、Ｈｅｐ３−８、Ｈｅｐ３−９、Ｈｅｐ１−７、Ｈｅｐ１−８、Ｈｅｐ１−９およびＨｅｐ１−１０ Ｃ７Ａが化学的に合成され、リフォールドされ、Ｈｅｐ２５に対する活性が、フェロポルチン−ＧＦＰ分解のフローサイトメトリーによる定量、細胞フェリチンの測定に基づく鉄流出推定、および放射性同位体鉄流出試験を使用してアッセイされた。これらのＮ末端フラグメントの配列およびＥＣ_５０を、表１に示す。

【0038】

図３に示されるように、注目すべきことに、かつ予想外に、Ｈｅｐ１−９およびＨｅｐ１−１０ Ｃ７Ａがフェロポルチン−ＧＦＰ内在化のフローサイトメトリーアッセイにおいてかなり活性であることが見つかった。Ｈｅｐ２５に比べ、Ｈｅｐ１−９およびＨｅｐ１−１０ Ｃ７Ａは、質量基準では約４倍のみおよび分子基準では約１０倍作用が弱いものであった。従って、Ｈｅｐ１−９およびＨｅｐ１−１０ Ｃ７Ａは、ヘプシジン活性を有する他のペプチドを構築する基剤として使用された。

【0039】

Ｈｅｐ１−９のヘプシジン活性におけるシステインチオールの重要性を決定するために、Ｈｅｐ１−９のＣ７残基が、Ｈｅｐ９−Ｃ７Ｓ（セリン置換）とＨｅｐ９Ｃ７−ｔＢｕｔ（ｔ−ブチル−ブロック化システイン）を得るために同様の形状を有するがジスルフィド結合を形成することができないアミノ酸と、またはＨｅｐ９Ｃ７−ＳＳｔＢｕｔを得るために脱離基としてＨＳ−ｔ−ブチルとのジスフィルド交換に関与し得るジスフィルド結合したターシャリーブチルにより修飾されたシステインと置換した。図４に示されるように、ジスルフィド形成または交換における可能性を除去したアミノ酸置換は、ヘプシジン活性の完全な消失を生じ、それによりジスルフィド形成が活性に必要であることが示された。他のＣ７アミノ酸置換および得られたヘプシジン活性を表１に示す。

【0040】

Ｈｅｐ１−９およびＨｅｐ１−１０ Ｃ７Ａに基づく他のペプチドは、ジスルフィド環状化され、非天然のアミノ酸置換を有し、レトロインバートされ、修飾されたＦ４およびＦ９残基を有し、または正の電荷を有するよう構築された。Ｃ末端のアミノ酸は、アミド化された形態であった。改変および得られたヘプシジン活性を表１に示す。

【0041】

表１に示されるように、ＰＲ４０およびＰＲ４１を除いて、約１０００ｎＭ以下のＥＣ_５０を示すミニヘプシジンは、Ｈｅｐ２５の残基３〜８（Ｈｅｐ３−８を参照）に対応する少なくとも６個の連続するアミノ酸残基を含有する。従って、いくつかの実施形態において、好ましいミニヘプシジンは、Ｈｅｐ１−９の６個の連続するアミノ酸残基に対応する少なくとも６個の連続するアミノ酸残基、好ましくは残基３〜８を有する。アミノ酸残基は、非天然または一般的でないアミノ酸、Ｌ−もしくはＤ−アミノ酸残基、修飾された残基、またはそれらの組み合わせであってよい。

【0042】

いくつかの実施形態において、本発明のミニヘプシジンは、少なくとも１つのアミノ酸置換、修飾、または付加を有する。アミノ酸置換の例として、Ｌ−アミノ酸残基とその対応するＤ−アミノ酸残基を置換すること、ＣｙｓとホモＣｙｓ、Ｐｅｎ、（Ｄ）Ｐｅｎ、Ｉｎｐなどを置換すること、ＰｈｅとｂｈＰｈｅ、Ｄｐａ、ｂｈＤｐａ、Ｂｉｐ、１Ｎａｌなどと置換することがある。置換する残基の名称および構造を表２に例示する。他の適切な置換を表１に例示する。修飾の例として、ペプチドが環状構造を形成する、つまりレトロインバートされるような１個以上のアミノ酸残基を修飾すること、およびジスルフィド結合を形成することができるよう残基を修飾することがある。付加の例として、表１に例示されるような、少なくとも１個のアミノ酸残基または少なくとも１個の化合物をＮ末端、Ｃ末端のいずれか、または両方に付加することを含む。

【0043】

表１に示されるように、約１００ｎＭ以下のＥＣ_５０を示す大部分のミニヘプシジンは、少なくとも１個のＤｐａまたはｂｈＤｐａアミノ酸置換を含有する。従って、いくつかの実施形態において、本発明のミニヘプシジンは、少なくとも１個のＤｐａまたはｂｈＤｐａアミノ酸置換を有する。

【0044】

図１のアラニン置換データに照らして、いくつかの実施形態において、本発明のミニヘプシジンは、アミノ酸７位にジスルフィド結合を形成するために利用可能なチオールがある限り、アミノ酸４位および９位以外のアミノ酸位にＡｌａを有することができる。表１のＨｅｐ９Ｆ４ＡおよびＨｅｐ９Ｃ−ＳＳｔＢｕｔを参照のこと。

【0045】

図２および表１の４位のアミノ酸置換に照らして、本発明のミニヘプシジンは、Ｈｅｐ２５、Ｈｅｐ１−９またはＨｅｐ１−１０ Ｃ７Ａの電荷または極性と比較し、その電荷または極性の実質的な変化が得られない４位のアミノ酸置換を有することができる。Ｈｅｐ１−９またはＨｅｐ１−１０ Ｃ７Ａの４位の好ましいアミノ酸置換は、Ｐｈｅ、Ｄ−Ｐｈｅ、ｂｈＰｈｅ、Ｄｐａ、ｂｈＤｐａ、Ｂｉｐ、１Ｎａｌなどを含む。

【0046】

本明細書において参照される元のミニヘプシジンは、以下の構造式Ｉであって、
Ａ１−Ａ２−Ａ３−Ａ４−Ａ５−Ａ６−Ａ７−Ａ８−Ａ９−Ａ１０ Ｉ
式中、
Ａ１は、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、ピログルタミン酸、Ｇｌｎ、Ａｓｎまたはその代用物として通常使用される非天然アミノ酸であり、
Ａ２は、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ａｌａまたはその代用物として通常使用される非天然アミノ酸であり、
Ａ３は、Ｈｉｓ、Ａｓｎ、Ａｒｇまたはその代用物として通常使用される非天然アミノ酸であり、
Ａ４は、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒまたはシクロヘキシルアラニンを含むその代用物として通常使用される非天然アミノ酸であり、
Ａ５は、Ｐｒｏ、Ｓｅｒまたはその代用物として通常使用される非天然アミノ酸であり、
Ａ６は、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌまたはその代用物として通常使用される非天然アミノ酸であり、
Ａ７は、Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、ＡｌａまたはＳ−ターシャリーブチル−システインを含むその代用物として通常使用される非天然アミノ酸であり、
Ａ８は、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ａｒｇまたはその代用物として通常使用される非天然アミノ酸であり、
Ａ９は、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｙｒまたはシクロヘキシルアラニンを含むその代用物として通常使用される非天然アミノ酸であり、
Ａ１０は、Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ａｌａまたはその代用物として通常使用される非天然アミノ酸であり、
カルボキシ末端アミノ酸は、アミドまたはカルボキシ形態であり、
Ｃｙｓまたは別のスルフィドリルアミノ酸は、配列中のアミノ酸の１つとして存在し、
Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ１〜Ａ２、Ａ１〜Ａ３、Ａ１０、Ａ９〜Ａ１０、Ａ８〜Ａ１０、またはそれらの組み合わせは、場合により存在しない、
構造式Ｉを有する。

【0047】

いくつかの実施形態において、Ａ１はＡｓｐであり、Ａ２はＴｈｒであり、Ａ３はＨｉｓであり、Ａ４はＰｈｅであり、Ａ５はＰｒｏであり、Ａ６はＩｌｅであり、Ａ７はＡｌａであり、Ａ８はＩｌｅであり、Ａ９はＰｈｅであり、Ａ１０はアミド形態のＣｙｓであり、Ａ１またはＡ１〜Ａ２は場合により存在しない。

【0048】

いくつかの実施形態において、Ａ１はＡｓｐであり、Ａ２はＴｈｒであり、Ａ３はＨｉｓであり、Ａ４はＰｈｅであり、Ａ５はＰｒｏであり、Ａ６はＩｌｅであり、Ａ７はＣｙｓまたは非天然チオールアミノ酸であり、Ａ８はＩｌｅであり、Ａ９はアミド形態のＰｈｅであり、Ａ１０は存在しない。

【0049】

いくつかの実施形態において、Ａ１およびＡ２は存在せず、Ａ３はＨｉｓであり、Ａ４はＰｈｅであり、Ａ５はＰｒｏであり、Ａ６はＩｌｅであり、Ａ７はＣｙｓまたは非天然チオールアミノ酸であり、Ａ８はアミド形態のＩｌｅであり、Ａ９およびＡ１０は存在しない。

【0050】

いくつかの実施形態において、Ａ１およびＡ２は存在せず、Ａ３はＨｉｓであり、Ａ４はＰｈｅであり、Ａ５はＰｒｏであり、Ａ６はＩｌｅであり、Ａ７はＣｙｓまたはアミド形態の非天然チオールアミノ酸であり、Ａ８〜Ａ１０は存在しない。

【0051】

いくつかの実施形態において、Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４、Ａ５、Ａ６、Ａ７、Ａ８、Ａ９、Ａ１０の非天然アミノ酸またはそれらの組み合わせは、対応するＤアミノ酸である。例えば、Ａ１において、非天然アミノ酸は、Ｄ−Ａｓｐ、Ｄ−Ｇｌｕ、Ｄ−Ｇｌｎ、Ｄ−Ａｓｎなどであってよい。

【0052】

いくつかの実施形態において、以下の非天然アミノ酸：
Ａ１は、Ｄ−Ａｓｐ、Ｄ−Ｇｌｕ、Ｄ−ピログルタミン酸、Ｄ−Ｇｌｎ、Ｄ−Ａｓｎ、ｂｈＡｓｐ、Ｉｄａ、またはＮ−ＭｅＡｓｐであり、
Ａ２は、Ｄ−Ｔｈｒ、Ｄ−Ｓｅｒ、Ｄ−Ｖａｌ、Ｔｌｅ、Ｉｎｐ、Ｃｈｇ、ｂｈＴｈｒ、またはＮ−ＭｅＴｈｒであり、
Ａ３は、Ｄ−Ｈｉｓ、Ｄ−Ａｓｎ、Ｄ−Ａｒｇ、Ｄｐａ、（Ｄ）Ｄｐａ、または２−アミノインダンであり、
Ａ４は、Ｄ−Ｐｈｅ、Ｄ−Ｌｅｕ、Ｄ−Ｉｌｅ、Ｄ−Ｔｒｐ、Ｐｈｇ、ｂｈＰｈｅ、Ｄｐａ、Ｂｉｐ、１Ｎａｌ、ｂｈＤｐａ、Ａｍｃ、ＰｈｅＦ５、ｈＰｈｅ、Ｉｇｌ、またはシクロヘキシルアラニンであり、
Ａ５は、Ｄ−Ｐｒｏ、Ｄ−Ｓｅｒ、Ｏｉｃ、ｂｈＰｒｏ、ｔｒａｎｓ−４−ＰｈＰｒｏ、ｃｉｓ−４−ＰｈＰｒｏ、ｃｉｓ−５−ＰｈＰｒｏ、Ｉｄｃであり、
Ａ６は、Ｄ−Ｉｌｅ、Ｄ−Ｌｅｕ、Ｐｈｇ、Ｃｈｇ、Ａｍｃ、ｂｈＩｌｅ、Ａｃｈ、およびＮ−ＭｅＩｌｅであり、
Ａ７は、Ｄ−Ｃｙｓ、Ｄ−Ｓｅｒ、Ｄ−Ａｌａ、Ｃｙｓ（Ｓ−ｔＢｕｔ）、ホモＣｙｓ、Ｐｅｎ、（Ｄ）Ｐｅｎ、Ｄａｐ（ＡｃＢｒ）、およびＩｎｐであり、
Ａ８は、Ｄ−Ｉｌｅ、Ｄ−Ｌｅｕ、Ｄ−Ｔｈｒ、Ｄ−Ｖａｌ、Ｄ−Ａｒｇ、Ｃｈｇ、Ｄｐａ、ｂｈＩｌｅ、Ａｃｈ、またはＮ−ＭｅＩｌｅであり、
Ａ９は、Ｄ−Ｐｈｅ、Ｄ−Ｌｅｕ、Ｄ−Ｉｌｅ、ＰｈｅＦ５、Ｎ−ＭｅＰｈｅ、ベンジルアミド、ｂｈＰｈｅ、Ｄｐａ、Ｂｉｐ、１Ｎａｌ、ｂｈＤｐａ、シクロヘキシルアラニンであり、
Ａ１０は、Ｄ−Ｃｙｓ、Ｄ−Ｓｅｒ、Ｄ−Ａｌａである。

【0053】

いくつかの実施形態において、以下のアミノ酸置換（および必要であれば付加）：
Ａ１は、Ａｌａ、Ｄ−Ａｌａ、Ｃｙｓ、Ｄ−Ｃｙｓ、Ｐｈｅ、Ｄ−Ｐｈｅ、ＣｙｓもしくはＤ−Ｃｙｓに結合したＡｓｐもしくはＤ−Ａｓｐ、またはケノデオキシコール酸、ウロソデオキシコール酸、もしくはパルミトイルに結合したＰＥＧ分子に結合したＰｈｅもしくはＤ−Ｐｈｅ、あるいはパルミトイルに結合したＤｐａもしくは（Ｄ）Ｄｐａであり、
Ａ２は、Ａｌａ、Ｄ−Ａｌａ、Ｃｙｓ、Ｄ−Ｃｙｓ、Ｐｒｏ、Ｄ−Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、またはＤ−Ｇｌｙであり、
Ａ３は、Ａｌａ、Ｄ−Ａｌａ、Ｃｙｓ、Ｄ−Ｃｙｓ、Ｄｐａ、Ｄｐａもしくは（Ｄ）Ｄｐａに結合したＡｓｐまたはＤ−Ａｓｐであり、
Ａ４は、Ａｌａ、Ｄ−Ａｌａ、Ｐｒｏ、またはＤ−Ｐｒｏであり、
Ａ５は、Ａｌａ、Ｄ−Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｄ−Ｐｒｏ、Ａｒｇ、Ｄ−Ａｒｇであり、
Ａ６は、Ａｌａ、Ｄ−Ａｌａ、Ｐｈｅ、Ｄ−Ｐｈｅ、Ａｒｇ、Ｄ−Ａｒｇ、Ｃｙｓ、Ｄ−Ｃｙｓであり、
Ａ７は、Ｈｉｓ、またはＤ−Ｈｉｓであり、
Ａ８は、Ｃｙｓ、またはＤ−Ｃｙｓであり、
Ａ９は、ＲＡに結合したＰｈｅもしくはＤ−Ｐｈｅ、Ａｓｐ、Ｄ−Ａｓｐ、ＲＢに結合したＡｓｐもしくはＤ−Ａｓｐ、ＲＣに結合したｂｈＰｈｅ、またはシステアミドであり、ＲＡは−ＣＯＮＨ_２−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｓ、Ｐｒｏ−ＬｙｓもしくはＰｒｏ−Ａｒｇに結合した−Ｄ−Ｐｒｏ、Ｐｒｏ−ＬｙｓもしくはＰｒｏ−Ａｒｇに結合したＰｒｏに結合した−ｂｈＰｒｏ、ｂｈＰｒｏ−ＬｙｓもしくはｂｈＰｒｏ−Ａｒｇに結合した−Ｄ−Ｐｒｏであり、ＲＢは−ＰＥＧ１１−ＧＹＩＰＥＡＰＲＤＧＱＡＹＶＲＫＤＧＥＷＶＬＬＳＴＦＬ、−（ＰＥＧ１１）−（ＧＰＨｙｐ）１０であり、ＲＣはＰｒｏ−ＬｙｓもしくはＰｒｏ−Ａｒｇに結合した−Ｄ−Ｐｒｏ、ｂｈＰｒｏ−ＬｙｓもしくはｂｈＰｒｏ−Ａｒｇに結合した−Ｄ−Ｐｒｏである。

【0054】

いくつかの実施形態において、ミニヘプシジンは、Ａ７がＡｌａであり、Ａ１０がＣｙｓである、１０−ｍｅｒ配列である。

【0055】

いくつかの実施形態において、ミニヘプシジンは、ジスルフィド結合により環状構造を形成する。

【0056】

いくつかの実施形態において、ミニヘプシジンは、Ａ１がＣ末端であり、Ａ１０がＮ末端であり、アミノ酸残基がＤ−アミノ酸であるようなレトロインバートされたペプチドである。いくつかの実施形態において、レトロインバートされたペプチドは、Ｎ末端、Ｃ末端、または両方で少なくとも１つの付加を有する。いくつかの実施形態において、レトロインバートされたペプチドは少なくとも１つのＬ−アミノ酸を含有する。

【0057】

いくつかの実施形態において、ミニヘプシジンは、４位、９位または両方にアミノ酸置換を有する。いくつかの実施形態において、アミノ酸置換基はＰｈｇ、Ｐｈｅ、Ｄ−Ｐｈｅ、ｂｈＰｈｅ、Ｄｐａ、Ｂｉｐ、１Ｎａｌ、Ｄｐａ、ｂｈＤｐａ、Ａｍｃ、またはシステアミドである。

【0058】

いくつかの実施形態において、ミニヘプシジンは、７位にアミノ酸置換を有する。いくつかの実施形態において、アミノ酸置換基は、Ｃｙｓ（Ｓ−ｔＢｕｔ）、Ａｌａ、Ｄ−Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｄ−Ｓｅｒ、ホモＣｙｓ、Ｐｅｎ、（Ｄ）Ｐｅｎ、Ｈｉｓ、Ｄ−Ｈｉｓ、またはＩｎｐである。

【0059】

いくつかの元のミニヘプシジンの例を表１に記載する。

【表1-1】

【表1-2】

【表1-3】

【表1-4】

【表2-1】

【表2-2】

【表2-3】

【表2-4】

【0060】

ペプチド合成

【0061】

Ｈｅｐ２５は、固相９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（ｆｍｏｃ）化学を使用して、ＵＣＬＡペプチド合成コア施設にて合成された。具体的に、ペプチドは、ｆｍｏｃアミノ酸であるＷａｎｇ樹脂（ＡｎａＳｐｅｃ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）および全ての残基においてダブルカップリングを使用してＡＢＩ４３１Ａペプチド合成装置（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）で合成された。切断後、３０ｍｇの粗製ペプチドを０．５Ｍ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８．２）、６Ｍグアニジン塩酸および２０ｍＭ ＥＤＴＡ中１０００倍モルの過剰量のジチオスレイトール（ＤＴＴ）を用いて、５２℃、２時間還元した。新鮮なＤＴＴ（５００モルの過剰量）を添加し、５２℃にてさらに１時間インキュベーションした。還元させたペプチドを、０．１％ＴＦＡで平衡させた１０ｇＣ１８ ＳＥＰ−ＰＡＫカートリッジ（Ｗａｔｅｒｓ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）で精製し、５０％アセトニトリルで溶出させた。溶出液を凍結乾燥させ、０．１％酢酸に再懸濁させた。還元させたペプチドをさらに、０．１％トリフルオロ酢酸で平衡させたＶＹＤＡＣ Ｃ１８カラム（２１８ＴＰ５１０；Ｗａｔｅｒｓ）の逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）により精製し、アセトニトリル勾配を用いて溶出させた。溶出液を凍結乾燥させ、０．１％酢酸、２０％ＤＭＳＯに溶解させ、およそ０．１ｍｇ／ｍｌ（ｐＨ８）の濃度にし、室温にて１８時間撹拌することにより空気酸化させた。リフォールディングさせたペプチドも１０ｇＣ１８ ＳＥＰ−ＰＡＫカートリッジおよびアセトニトリル勾配を使用してＲＰ−ＨＰＬＣ ＶＹＤＡＣ Ｃ１８カラムで連続して精製した。溶出液を凍結乾燥させ、０．０１６％ＨＣｌに再懸濁させた。リフォールディングさせた合成ヘプシジン誘導体の立体構造が、１２．５％酸−尿素ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）の電気泳動により検証され、ペプチド質量がマトリックス支援レーザー脱離／イオン化−飛行時間型質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ；ＵＣＬＡ質量分析施設、Ｌｏｓ Ａｎｇｅｌｅｓ，ＣＡ）により測定された。

【0062】

表１に記載の他のペプチドを、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）化学（Ｆｉｅｌｄｓ＆Ｎｏｂｌｅ（１９９０）Ｉｎｔ Ｊ Ｐｅｐｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ ３５：１６１−２１４）および市販のアミノ酸誘導体および試薬（ＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡおよびＣｈｅｍ−Ｉｍｐｅｘ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．，Ｗｏｏｄ Ｄａｌｅ，ＩＬ）を適用し、Ｓｙｍｐｈｏｎｙ（登録商標）自動化ペプチド合成装置（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ）またはＣＥＭ Ｌｉｂｅｒｔｙ自動化マイクロ波ペプチド合成装置（ＣＥＭ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ Ｉｎｃ．，Ｍａｔｔｈｅｗｓ，ＮＣ）のいずれかを使用して固相法により合成した。ペプチドを、修飾試薬Ｋ（ＴＦＡ９４％（ｖ／ｖ）；フェノール、２％（ｗ／ｖ）；水、２％（ｖ／ｖ）；ＴＩＳ、２％（ｖ／ｖ）；２時間）を使用して樹脂から切断し、氷冷ジエチルエーテルを添加することにより析出させた。続いて、ペプチドを、９５％より大きい均質性に分取逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）により精製し、それらの純度を、マトリックス支援レーザー脱離イオン化分析法（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ、ＵＣＬＡ質量分析施設、Ｌｏｓ Ａｎｇｅｌｅｓ，ＣＡ）ならびに２２０ｎｍおよび２８０ｎｍに波長設定したＰｒｏＳｔａｒ３２５Ｄｕａｌ Ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ ＵＶ−Ｖｉｓ検出器を備えたＶａｒｉａｎ ＰｒｏＳｔａｒ２１０ＨＰＬＣシステム（Ｖａｒｉａｎ Ｉｎｃ．，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）を使用する分析ＲＰ−ＨＰＬＣにより評価した。移動相は、溶剤Ａ、０．１％ＴＦＡ水溶液および溶剤Ｂ、アセトニトリル中の０．１％ＴＦＡから構成された。ペプチドの分析は、１００分間にわたり０〜１００％の溶剤Ｂの線形勾配（流速：１ｍｌ／分）を適用する逆相Ｃ１８カラム（Ｖｙｄａｃ ２１８ＴＰ５４，４．６×２５０ｍｍ，Ｇｒａｃｅ，Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ，ＩＬ）を用いて行われた。

【0063】

当技術分野において周知の他の方法を、本発明によるペプチドを合成または得るために使用することができる。全てのペプチドを、負に荷電した−ＣＯＯＨ末端よりペプチド結合にさらに類似した電荷中性の末端を作製するカルボキシアミド（−ＣＯＮＨ_２）として合成された。それにも関わらず、負に荷電した−ＣＯＯＨ末端を有するペプチドについて、本明細書で検討する。

【0064】

活性アッセイ

【0065】

フローサイトメトリー。本発明のペプチドの活性は、前述の通りフローサイトメトリーにより測定された。本明細書において参照により組み込まれる、Ｎｅｍｅｔｈ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｂｌｏｏｄ １０７：３２８−３３３を参照のこと。ＥＣＲ２９３／Ｆｐｎ−ＧＦＰ、つまり緑色蛍光タンパク質を用いてＣ末端にタグ付けされたポナステロン誘発性フェロポルチン構築物を用いて安定して導入された細胞株を使用した。本明細書において参照により組み込まれる、Ｎｅｍｅｔｈ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０６：２０９０−２０９３を参照のこと。つまり、細胞を、１０μＭ ポナステロンを用いて、または用いずに２０μＭ ＦＡＣの存在下においてポリ−Ｄ−リジン被覆されたプレートに載せた。２４時間後、ポナステロンを洗い流し、細胞をペプチドで２４時間処理した。次いで、細胞をトリプシン処理し、１×１０^６個の細胞／ｍｌに再懸濁し、緑色蛍光強度を、フローサイトメトリーにより分析した。フローサイトメトリーは、ＣＥＬＬＱＵＥＳＴバージョン３．３ソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いたＦＡＣＳＣＡＮ（蛍光活性化された細胞のスキャナー）分析フローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）において行われた。Ｆｐｎ−ＧＦＰを発現するポナステロンで誘発されなかった細胞を使用し、バックグランド蛍光を除外するためのゲートを確立した。ポナステロンで誘発されたが、いずれかのペプチドで処理されなかった細胞を、ポジティブコントロールとして使用した。各ペプチドを、各濃度（０、０．０１、０．０３、０．１、０．３、１、３および１０μＭ）の範囲にわたり試験した。各ペプチド処理は、個々に３〜６回繰り返された。ペプチドの各濃度において、結果を、Ｆがゲート化された緑色蛍光の平均値であり、ｘがペプチドである式１（（Ｆ_ｘ−Ｆ_{Ｈｅｐ２５}）／（Ｆ_未処理−Ｆ_{Ｈｅｐ２５}））に従い、Ｈｅｐ２５の最大活性（Ｆ_{Ｈｅｐ２５}）（用量範囲０．０１〜１０μＭ）の割合として表した。ＩＥＣ_５０濃度を表１に記載する。

【0066】

フェリチンアッセイ。ヘプシジン活性を有するペプチドで処理された細胞は鉄を保有し、高量のフェリチンを含有する。従って、以下のフェリチンアッセイを使用し、本発明によるミニヘプシジンを同定することができる。つまり、ＨＥＫ２９３−Ｆｐｎ細胞を、１０μＭポナステロンを用いて、または用いずに２０μＭ ＦＡＣとインキュベーションする。２４時間後、ポナステロンを洗い流し、ヘプシジン誘導体を、２０μＭ ＦＡＣの存在下において２４時間添加する。細胞タンパク質を、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００およびプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を用いて抽出する。フェリチン濃度を、製造者の説明書に従い、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）法（Ｒａｍｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｓｔａｆｆｏｒｄ，ＴＸ，またはＢｉｏｔｅｃｈ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ，Ｌａｇｕｎａ Ｎｉｇｕｅｌ，ＣＡ）により決定し、ビシンコニン酸（ＢＣＡ）法（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）により決定されるように、各サンプルの総タンパク質濃度に正規化する。

【0067】

インビボアッセイ。血清鉄アッセイ。ペプチド投与後の血清鉄の低下は、ヘプシジン活性の主な尺度になる。従って、本明細書において記載されるように、本発明の選択されたペプチドのヘプシジン活性を、試験対象の血清鉄を測定することによりインビボでアッセイした。つまり、Ｃ５７／Ｂｌ６Ｊマウスを、ＮＩＨ３１げっ歯類飼料で飼育した（３３３パーツパーミリオン（ｐｐｍ）鉄；Ｈａｒｌａｎ Ｔｅｋｌａｄ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）。実験２週間前に、マウスは、内因性ヘプシジンを抑制するために、約２〜４ｐｐｍ鉄を含有する飼料（Ｈａｒｌａｎ Ｔｅｋｌａｄ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）に切り替えられた。ペプチドストックを、滅菌リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）または次に記載される他の希釈剤において所望の濃度に希釈した。マウスに、以下の処理が行われた：（ａ）１００μｌ ＰＢＳ（対照）または１００μｌ ＰＢＳ中の５０μｇペプチドのいずれかを腹腔内に注射し、（ｂ）５００μｇの空のリポソームＣＯＡＴＳＯＭＥ ＥＬシリーズ（ＮＯＦ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を混合した１００μｌのペプチド（またはＰＢＳ）（製造者の推奨通りに調製）を注射し、（ｃ）ＳＬ２２０可溶化剤（ＮＯＦ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）で可溶化させた１００μｌのペプチド（またはＰＢＳ）を注射し、（ｄ）１倍の溶剤（Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬ（Ｓｉｇｍａ）／エタノール／ＰＢＳ；（１２．５：１２．５：７５））中の２５０μｌのペプチド（またはＰＢＳ）を強制投与した。マウスを、４時間後に屠殺し、血液を心臓穿刺により採取し、血清をＭＩＣＲＯＴＡＩＮＥＲチューブ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）を使用して分離した。血清鉄を、１０μｌの血清が測定当たりに使用されるようにマイクロプレートフォーマット用に変更した比色分析法（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，ＣＴ）を使用することにより決定した。結果を、ＰＢＳ処置したマウスの血清鉄濃度の平均値と比較したときの血清鉄の低下の百分率として表した。

【0068】

図５に示されるように、ＰＢＳ中、マウス当たり５０μｇのＰＲ１２のの腹腔内（ｉ．ｐ．）投与により、ＰＢＳのｉ．ｐ．投与と比較しときに、４時間後の血清鉄の顕著な低下を生じた。血清鉄の低下は、５０μｇのＨｅｐ２５のｉ．ｐ．注射により生じたものと同様であった。Ｈｅｐ９の注射（ｉ．ｐ．）は、血清鉄の低下を生じなかった。ＰＲ１２は、Ｈｅｐ９のレトロインバートされた形態であり、レトロインバートされた構造のためタンパク質分解に耐性がある。実験は、タンパク質分解の耐性の増加がミニヘプシジンの活性を改良することを示す。

【0069】

図６に示されるように、ＰＢＳ中２００ｎモルのｒｉＨｅｐ７ΔＤＴのｉ．ｐ．投与は、ＰＢＳの注射後に得られたものより顕著に低い血清鉄濃度を生じ、また、２０ｎモルのＨｅｐ２５のｉ．ｐ．注射よりも低いものであった。２０ｎモルのｒｉＨｅｐ７ΔＤＴの投与は、顕著ではないがわずかに血清鉄濃度を減少させた。実験は、ｉ．ｐ．注射後に、アミノ酸７個ほどの小さいペプチドがＨｅｐ２５に相当する活性を示すことができることを示す。

【0070】

図７に示されるように、ＰＢＳ中２０ｎモルのＰＲ２７のｉ．ｐ．投与は、２０ｎモルのＨｅｐ２５のｉ．ｐ．投与により生じたものに相当する血清鉄の低下を生じた。これは、ミニヘプシジンがインビボでＨｅｐ２５に対する同様な有効性を得ることができることを示した。高濃度のＰＲ２７（２００ｎモル）は、血清鉄濃度のさらに大きな低下を生じた。

【0071】

図８に示されるように、リポソーム溶液中２０ｎモルのＰＲ２７のｉ．ｐ．投与も、２０ｎモルのＨｅｐ２５のｉ．ｐ．投与により生じたものに類似する血清鉄低下を生じた。リポソーム溶液の投与自体は、血清鉄の濃度に影響しなかった。リポソーム溶液は、１００μｌのＰＢＳと５００μｇの空のリポソームＣＯＡＴＳＯＭＥ ＥＬシリーズ（ＮＯＦ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を混合することにより調製された（製造者の推奨通りに調製）。しかし、リポソーム溶液に溶解させたミニヘプシジンＰＲ２８は、ＰＲ２７より血清鉄を低下させる能力が低いことを示した。実験は、リポソームのペプチド懸濁液がそれらの活性に影響を与えないことを示す。従って、リポソームは、本発明によるペプチドの経口投与に有用であり得る。

【0072】

図９に示されるように、クレモホール（ｃｒｅｍｏｐｈｏｒｅ）ＥＬ溶液中２００ｎモルのＰＲ２７のの強制による経口投与は、ＰＢＳの同じ配合物の経口投与と比較してマウスの血清鉄の低下を生じた。Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬは、化学物質の溶解性を増大させ、かつ頻繁に薬物に使用される賦形剤または添加剤である。Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬ溶液を、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬ（Ｓｉｇｍａ）、エタノールおよびＰＢＳを１２．５：１２．５：７５の比で混合することにより調製した。２５０μｌのその溶液をマウスに強制投与した。

【0073】

従って、本発明を使用し、対象の血清鉄を低下させることができる。本発明による好ましいミニヘプシジンは、そのＮ末端アミノ酸に結合した、ＰＥＧ１１などのＰＥＧ分子を含むレトロインバートされたペプチドである。いくつかの実施形態において、ＰＥＧ分子は、パルミトイル基に結合し、または１つ以上のパルミトイル基に結合したジアミノプロピオン酸である。

【0074】

血清鉄含量の影響をアッセイすることに加え、当技術分野において周知の他のインビボアッセイを行い、本発明によるミニヘプシジンを同定し、かつ／または本発明による所与のペプチドまたはミニヘプシジンの治療有効量を決定することができる。このようなアッセイの例として、以下がある：

【0075】

組織鉄アッセイ。上記の血清鉄アッセイに加え、またはその代わりに、組織鉄分布を、処置されたマウスから得られた肝臓および脾臓切片の増感ペルルス染色により決定することができる。つまり、組織切片を、４％パラホルムアルデヒド／ＰＢＳに固定し、ペルルス溶液（１：１、２％ＨＣｌおよび２％フェロシアン化カリウム）および０．０１５％過酸化水素のジアミノベンジジン中でインキュベーションさせる。組織の非ヘム鉄を、Ｒｅｂｏｕｃｈｅ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｍｅｔｈｏｄｓ．５８（３）：２３９−５１；Ｐａｋ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｂｌｏｏｄ １０８（１２）：３７３０−５の微量法を使用して定量化することができる。肝臓および脾臓の１００ｍｇ片をホモジナイズし、酸を添加し、フェロジンを使用する比色法により検出される非ヘム結合鉄を放出させ、対照と比較する。ミニヘプシジンの処置は、他の組織化から脾臓への鉄の再分布を生じることが予想されるであろう。数週間から数カ月間にわたるミニヘプシジンの投与は、食事からの鉄の吸収が消失するため全ての組織の組織鉄含量を低下させることが予想されるであろう。

【0076】

血液学的アッセイ。血液学的アッセイを使用し、本発明によるミニヘプシジンを同定し、かつ／または本発明による所与のペプチドまたはミニヘプシジンの治療有効量を決定することができる。つまり、処置された対象からの血液をヘパリン含有チューブに採取する。ヘモグロビン、ＲＢＣ、ＭＣＶ、ＥＰＯ、白血球パラメータ、網状赤血球数、および網赤血球Ｈｇｂ含量を、当技術分野において周知の方法を使用して決定し、対照と比較する。ミニヘプシジンの処置は、ＭＣＶの低下を生じ、網状赤血球のＨｇｂ含量を消失させることが予想されるであろう。過剰量のミニヘプシジンの投与は、Ｈｇｂを低下させることが予想されるであろう。

【0077】

鉄輸送アッセイ。初代培養肝細胞およびマクロファージを使用する当技術分野において周知の鉄（^５５Ｆｅ）輸送アッセイを使用し、本発明によるミニヘプシジンを同定し、かつ／または本発明による所与のペプチドまたはミニヘプシジンの治療有効量を決定することができる。ヘプシジン活性を有するペプチドは、細胞からの^５５Ｆｅの放出を消失させ、または低下させるとであろう。つまり、細胞を、^５５Ｆｅ−ＮＴＡまたは^５５Ｆｅ−Ｔｆと３６時間インキュベーションする。組み込まれなかった^５５Ｆｅを洗い流した後、細胞を、所与のペプチドまたは対照で処理する。フェロポルチン変異体の場合において、形質導入を、^５５Ｆｅを添加する前に行い、発現を３６時間の鉄負荷期間の間に進ませることができた。少量の媒体を１、４、８、２４、３６、４８および７２時間後に採取し、放射性活性をシンチレーション計数器により決定する。細胞に関連した放射性活性は、シリコーンオイルを介した細胞を遠心分離し、当技術分野において周知の方法を使用して放射標識された鉄と細胞の非特異的結合を低下させることにより測定することができる。

【0078】

所与のペプチドが内因性フェロポルチンの内在化および分解を改変するかどうかを決定するために、ペプチドで処理された肝細胞およびマクロファージのタンパク質濃度およびフェロポルチンの細胞分布を、ウェスタンブロット法、免疫組織化学および当技術分野において周知のフェロポルチン抗体を使用してアッセイすることができる。

【0079】

改変ミニヘプシジン

【0080】

本発明による追加のミニヘプシジンを以下のように表３および表４に示す：

【表3】

【表4-1】

【表4-2】

【0081】

表３および４において、ＰＲ４７、ＰＲ４８、ＰＲ４９、ＰＲ５０、ＰＲ５１、ＰＲ５２、ＰＲ７６、ＰＲ７７、ＰＲ７８、およびＰＲ７９はレトロインバートされたミニヘプシジンであり、アミノ酸残基間のアラインメントとＨｅｐ２５の残基１〜１０のものを例示するために、左から右、Ｃ末端からＮ末端に示される。従って、Ｎ末端からＣ末端へのこれらのレトロインバートされたミニヘプシジンの従来の列挙は以下の通りである（Ｄアミノ酸は下線が引かれている）。
ＰＲ４７：Ｒ４−Ｆ−Ｉ−Ｃ−Ｉ−Ｐ−Ｄｐａ−Ｈ−Ｔ−Ｄ
ＰＲ４８：Ｒ４−Ｄｐａ−Ｉ−Ｃ−Ｉ−Ｐ−Ｄｐａ−Ｈ−Ｔ−Ｄ
ＰＲ４９：Ｒ４−Ｆ−Ｉ−Ｃ−Ｉ−Ｐ−Ｄｐａ−Ｈ
ＰＲ５０：Ｒ４−Ｄｐａ−Ｉ−Ｃ−Ｉ−Ｐ−Ｄｐａ−Ｈ
ＰＲ５１：Ｒ４−Ｆ−Ｖ−Ｃ−Ｖ−Ｐ−Ｄｐａ−Ｈ−Ｔ−Ｄ
ＰＲ５２：Ｒ４−Ｆ−Ｌ−Ｃ−Ｌ−Ｐ−Ｄｐａ−Ｈ−Ｔ−Ｄ
ＰＲ７６：Ｒ１７−Ｗ−Ｒ−Ｃｙｓ（Ｓ−Ｓ−ｔＢｕｔ）−Ｒ−Ｐ−Ｆ−Ｈ−Ｔ−Ｄ
ＰＲ７７：Ｒ１８−Ｗ−Ｒ−Ｃｙｓ（Ｓ−Ｓ−ｔＢｕｔ）−Ｒ−Ｐ−Ｆ−Ｈ−Ｔ−Ｄ
ＰＲ７８：Ｒ１９−Ｗ−Ｒ−Ｃｙｓ（Ｓ−Ｓ−ｔＢｕｔ）−Ｒ−Ｐ−Ｆ−Ｈ−Ｔ−Ｄ
ＰＲ７９：Ｒ２０−Ｗ−Ｒ−Ｃｙｓ（Ｓ−Ｓ−ｔＢｕｔ）−Ｒ−Ｐ−Ｆ−Ｈ−Ｔ−Ｄ

【0082】

表４に示されるように、投与経路は、所与のミニヘプシジンの活性に関与し得る（例えば、ＰＲ６５およびＰＲ６６を比較）。従って、表３および４のミニヘプシジンの一部の活性がないことの表示は、所与のミニヘプシジンが任意の投与経路および／または投与量にて任意の活性を欠失していることを示すとして解釈されるべきではない。実際に、表３に示されるように、相当数のかかるミニヘプシジンがよりかなり低い投与量にて、元のミニヘプシジンのように顕著なインビトロ活性を示す。

【0083】

これらのさらなるミニヘプシジンは、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６６７１１号（以下、「元のミニヘプシジン」と称し、構造式Ｉを有する）に記載のミニヘプシジンの改変物である。本明細書において使用される場合、元のミニヘプシジンの改変物であるミニヘプシジンは、本明細書において、「改変ミニヘプシジン」と称する。本明細書において使用される場合、「ミニヘプシジン」は、元のミニヘプシジンおよび改変ミニヘプシジンの両方を指す。本発明による改変ミニヘプシジンは以下の構造式ＩＡまたはＩＢを有する：
Ａ１−Ａ２−Ａ３−Ａ４−Ａ５−Ａ６−Ａ７−Ａ８−Ａ９−Ａ１０ ＩＡ
Ａ１０−Ａ９−Ａ８−Ａ７−Ａ６−Ａ５−Ａ４−Ａ３−Ａ２−Ａ１ ＩＢ
Ａ１は、Ａｓｐ、Ｄ−Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｄ−Ｇｌｕ、ピログルタミン酸、Ｄ−ピログルタミン酸、Ｇｌｎ、Ｄ−Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｄ−Ａｓｎ、またはその代用物として通常使用される非天然アミノ酸、例えば、ｂｈＡｓｐ、Ｉｄａ、Ｉｄａ（ＮＨＰａｌ）、およびＮ−ＭｅＡｓｐ、好ましくはＩｄａおよびＮ−ＭｅＡｓｐであり、
Ａ２は、Ｔｈｒ、Ｄ−Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｄ−Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ｄ−Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｄ−Ｉｌｅ、Ａｌａ、Ｄ−Ａｌａまたはその代用物として通常使用される非天然アミノ酸、例えば、Ｔｌｅ、Ｉｎｐ、Ｃｈｇ、ｂｈＴｈｒ、およびＮ−ＭｅＴｈｒであり、
Ａ３は、Ｈｉｓ、Ｄ−Ｈｉｓ、Ａｓｎ、Ｄ−Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｄ−Ａｒｇ、またはその代用物として通常使用される非天然アミノ酸、例えば、Ｌ−Ｈｉｓ（π−Ｍｅ）、Ｄ−Ｈｉｓ（π−Ｍｅ）、Ｌ−Ｈｉｓ（τ−Ｍｅ）、またはＤ−Ｈｉｓ（τ−Ｍｅ）であり、
Ａ４は、Ｐｈｅ、Ｄ−Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ｄ−Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｄ−Ｉｌｅ、Ｔｒｐ、Ｄ−Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｄ−Ｔｙｒ、またはその代用物として通常使用される非天然アミノ酸、例えば、Ｐｈｇ、ｂｈＰｈｅ、Ｄｐａ、Ｂｉｐ、１Ｎａｌ、２Ｎａｌ、ｂｈＤｐａ、Ａｍｃ、ＰｈｅＦ５、ｈＰｈｅ、Ｉｇｌ、またはシクロヘキシルアラニン、好ましくはＤｐａであり、
Ａ５は、Ｐｒｏ、Ｄ−Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｄ−Ｓｅｒ、またはその代用物として通常使用される非天然アミノ酸、例えば、Ｏｉｃ、ｂｈＰｒｏ、ｔｒａｎｓ−４−ＰｈＰｒｏ、ｃｉｓ−４−ＰｈＰｒｏ、ｃｉｓ−５−ＰｈＰｒｏ、およびＩｄｃ、好ましくはｂｈＰｒｏであり、
Ａ６は、Ａｒｇ、Ｄ−Ａｒｇ、Ｉｌｅ、Ｄ−Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｄ−Ｌｅｕ、Ｔｈｒ、Ｄ−Ｔｈｒ、Ｌｙｓ、Ｄ−Ｌｙｓ、Ｖａｌ、Ｄ−Ｖａｌ、またはその代用物として通常使用される非天然アミノ酸、例えば、Ｄ−Ｎω、ω−ジメチル−アルギニン、Ｌ−Ｎω、ω−ジメチル−アルギニン、Ｄ−ホモアルギニン、Ｌ−ホモアルギニン、Ｄ−ノルアルギニン、Ｌ−ノルアルギニン、シトルリン、グアニジウム基が修飾または置換された修飾Ａｒｇ、ノルロイシン、ノルバリン、ｂｈＩｌｅ、Ａｃｈ、Ｎ−ＭｅＡｒｇ、およびＮ−ＭｅＩｌｅ、好ましくはＡｒｇであり、
Ａ７は、Ｃｙｓ、Ｄ−Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｄ−Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｄ−Ａｌａ、またはその代用物として通常使用される非天然アミノ酸、例えば、Ｃｙｓ（Ｓ−ｔＢｕｔ）、ホモＣｙｓ、Ｐｅｎ、（Ｄ）Ｐｅｎ、好ましくはＳ−ターシャリーブチル−システイン、Ｃｙｓ（Ｓ−Ｓ−Ｐａｌ）、Ｃｙｓ（Ｓ−Ｓ−システアミン−Ｐａｌ）、Ｃｙｓ（Ｓ−Ｓ−Ｃｙｓ−ＮＨＰａｌ）、およびＣｙｓ（Ｓ−Ｓ−Ｃｙｓ）、または交換可能なシステインを有する任意のアミノ酸誘導体であり、
Ａ８は、Ａｒｇ、Ｄ−Ａｒｇ、Ｉｌｅ、Ｄ−Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｄ−Ｌｅｕ、Ｔｈｒ、Ｄ−Ｔｈｒ、Ｌｙｓ、Ｄ−Ｌｙｓ、Ｖａｌ、Ｄ−Ｖａｌ、またはその代用物として通常使用される非天然アミノ酸、例えば、Ｄ−Ｎω、ω−ジメチル−アルギニン、Ｌ−Ｎω、ω−ジメチル−アルギニン、Ｄ−ホモアルギニン、Ｌ−ホモアルギニン、Ｄ−ノルアルギニン、Ｌ−ノルアルギニン、シトルリン、グアニジウム基が修飾または置換された修飾Ａｒｇ、ノルロイシン、ノルバリン、ｂｈＩｌｅ、Ａｃｈ、Ｎ−ＭｅＡｒｇ、およびＮ−ＭｅＩｌｅ、好ましくはＡｒｇであり、
Ａ９は、Ｐｈｅ、Ｄ−Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ｄ−Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｄ−Ｉｌｅ、Ｔｙｒ、Ｄ−Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｄ−Ｔｒｐ、Ｐｈｅ−Ｒ^ａ、Ｄ−Ｐｈｅ−Ｒ^ａ、Ｄｐａ−Ｒ^ａ、Ｄ−Ｄｐａ−Ｒ^ａ、Ｔｒｐ−Ｒ^ａ、ｂｈＰｈｅ−Ｒ^ａ、またはその代用物として通常使用される非天然アミノ酸であって、結合するＲ^ａがあってもよく、またはなくてもよい、非天然アミノ酸、例えば、ＰｈｅＦ５、Ｎ−ＭｅＰｈｅ、ベンジルアミド、２−アミノインダン、ｂｈＰｈｅ、Ｄｐａ、Ｂｉｐ、１Ｎａｌ、２Ｎａｌ、ｂｈＤｐａ、およびシクロヘキシルアラニン、好ましくはｂｈＰｈｅおよびｂｈＰｈｅ−Ｒ^ａであり、Ｒ^ａがパルミトイル−ＰＥＧ−であり、ＰＥＧがＰＥＧ１１またはミニＰＥＧ３、パルミトイル−ＰＥＧ−ＰＥＧであり、ＰＥＧがＰＥＧ１１またはミニＰＥＧ３、ブタノイル（Ｃ４）−ＰＥＧ１１−、オクタノイル（Ｃ８、カプリル酸）−ＰＥＧ１１−、パルミトイル（Ｃ１６）−ＰＥＧ１１−、またはテトラコサノイル（Ｃ２４、リグノセリン酸）−ＰＥＧ１１−であり、
Ａ１０は、Ｃｙｓ、Ｄ−Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｄ−Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｄ−Ａｌａ、または非天然アミノ酸、例えば、Ｉｄａ、Ｉｄａ（ＮＨＰａｌ）Ａｈｘ、およびＩｄａ（ＮＢｚｌ２）Ａｈｘであり、
カルボキシ末端アミノ酸がアミドもしくはカルボキシ形態であり、
少なくとも１個のスルフィドリルアミノ酸が配列内のアミノ酸の１つとして存在し（および好ましくは、スルフィドリル基が交換可能であり）、
Ａ１、Ａ１〜Ａ２、Ａ１０、またはそれらの組み合わせが場合により存在せず、但し、そのペプチドが表１に記載のペプチドの１つではない。いくつかの実施形態において、改変ミニヘプシジンは、ジスルフィド結合により環状構造を形成する。いくつかの実施形態において、Ｎ末端アミノ酸は遊離アミンである。いくつかの実施形態において、Ｎ末端アミノ酸は、例えば、アセチル基でブロックされたアミンである。いくつかの実施形態において、Ａ６および／またはＡ８はリジン誘導体、例えば、Ｎ−ε−ジニトロフェニル−リジン、Ｎ−ε−メチル−リジン、Ｎ，Ｎ−ε−ジメチル−リジン、およびＮ，Ｎ，Ｎ−ε−トリメチル−リジンである。

【0084】

表４の改変ミニヘプシジンの５つは、濃度の測定を容易にするためにトリプトファンを含有する。従って、いくつかの実施形態において、本発明の改変ミニヘプシジンは、トリプトファンを含有する。いくつかの実施形態において、トリプトファン残基（複数可）は削除され、または別のアミノ酸と置換される。他の改変ミニヘプシジンは、システインに隣接する２個のイソロイシンをアルギニンまたはアルギニン誘導体と置換することにより元のミニヘプシジンを改変することにより作製された。予期せぬことに、これらのイソロイシンをアルギニンと置換することにより、ミニヘプシジンの活性の増加が生じたことがわかった。予期せぬ優れた活性は、６番目のアミノ酸位および／または８番目のアミノ酸位のアルギニンの存在の結果であると思われる。従って、いくつかの実施形態において、構造式ＩのＡ６位および／またはＡ８位のアミノ酸残基は、アルギニンである。かかるミニヘプシジンのさらなる改変も予期せぬ高い活性を生じた。本発明による改変ミニヘプシジンは、米国特許出願第１３／１３１，７９２号に例示された改変ミニヘプシジンと比較し優れた活性を予期せず示している。さらに、改変ミニヘプシジンの多くが、皮下投与されたときにそれらの活性を保有することがわかった。

【0085】

いくつかの実施形態において、Ｎ末端アミノ酸は遊離アミンを有する。いくつかの実施形態において、Ｎ末端アミンは、その電荷を除去する基、好ましくはアセチルまたはホルマル基で遮断される。いくつかの実施形態において、Ｎ末端アミンを、アシル鎖がＮ末端上にあるように、アシル鎖であって、好ましい実施形態では、脂肪酸、例えば、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、またはステアリン酸を含む、アシル鎖と結合させるよう改変する。アシル鎖はまた、当技術分野において周知のリンカー、例えば、ポリエチレングリコールリンカー、好ましくはＰＥＧ３を介して結合され得る。

【0086】

いくつかの実施形態において、アミノ酸Ａ１の側鎖を、Ｎ末端アミンにおいて示されたように修飾することができる。例えば、アミノ酸Ａ１の遊離カルボニル基を、修飾、例えば、パルミトイルなどのアシル基により遮断することができる（ＰＲ７１を参照のこと）。

【0087】

いくつかの実施形態において、Ａ４は、嵩高い疎水性アミノ酸、例えば、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｌｅｕ、またはＩｌｅ、またはその側鎖に４個以上の炭素を含有するその代用物として通常使用される非天然のアミノ酸、好ましくは環状構造、例えば、Ｐｈｇ、Ｂｉｐ、１Ｎａｌ、２Ｎａｌ、Ａｍｃ、ＰｈｅＦ５、Ｉｇｌ（Ｌ−２−インダニルグリシン）もしくはＣｈａ（Ｌ−シクロヘキシルアラニン）、好ましくはＤｐａである。いくつかの実施形態において、Ａ４は、上記の嵩高い疎水性アミノ酸のベータホモ形態、例えば、ｂｈＰｈｅ、またはｂｈＤｐａを含有する。側鎖への他の修飾は、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ５８：３１０１−３１１０およびＷａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ５８：７３６５−７３７４に開示されるものなどの芳香族置換基を含む。いくつかの実施形態において、Ａ４残基はＤ−アミノ酸である。

【0088】

いくつかの実施形態において、Ａ９位のアミノ酸は、嵩高い疎水性アミノ酸、例えば、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｌｅｕ、もしくはＩｌｅまたはその側鎖に４個以上の炭素を含有するその代用物として通常使用される任意の非天然アミノ酸、好ましくは環状構造、例えば、Ｐｈｇ、Ｄｐａ、Ｂｉｐ、１Ｎａｌ、２Ｎａｌ、Ａｍｃ、ＰｈｅＦ５、ＩｇｌもしくはＣｈａ、例えば、１個以上の環もしくは芳香族置換基を含有する環状もしくは芳香族基である。いくつかの実施形態において、Ａ９残基はＤｐａまたはＴｒｐである。

【0089】

いくつかの実施形態において、本発明のミニヘプシジンは、そのインビボバイオアベイラビリティを維持し、かつ／または増大させるために改変または配合される。例えば、いくつかの実施形態において、ペプチド鎖はアシル鎖と結合する。いくつかの実施形態において、アシル鎖は、Ｎ末端もしくはＣ末端アミノ酸またはシステイン残基に結合し得る。いくつかの実施形態において、アシル鎖はＡ７残基と結合する。アシル鎖は、脂肪酸、例えば、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、またはステアリン酸を含み得る。アシル鎖はまた、スペーサー、例えば、ポリエチレングリコールスペーサーを含有し得る。いくつかの実施形態において、スペーサーは、ポリエチレングリコールスペーサー（１〜１１ＰＥＧ）、好ましくはＰＥＧ３またはＰＥＧ１１である。いくつかの実施形態において、スペーサーは、アミノ基とカルボン酸基との間の炭素数が、約２〜８個の炭素により分離されるアミノ酸のもの、例えば、６−アミノヘキサン酸を含む（例えば、ＰＲ７３を参照のこと）。他の適切なスペーサーは、環および／または芳香族の特徴を有する疎水性構造を含む（例えば、ＰＲ７４を参照のこと）。

【0090】

改変ミニヘプシジンは、改変ミニヘプシジンの、例えば、ＰＲ６５の毎日の投与が鉄過負荷を抑制する、マウスヘモクロマトーシスモデルにおいて例証された。それゆえ、本発明による改変ミニヘプシジンは、単独または１つ以上の元のミニヘプシジンと組み合わせて、治療、例えば、ヒトなどの対象の鉄過負荷を阻害し、かつ／または減少させるために、対象に投与され得る。それゆえ、本発明による改変および元のミニヘプシジンは、対象の鉄過負荷を阻害し、かつ／または減少させることにより鉄過負荷障害、例えば、ベータサラセミアおよび遺伝性ヘモクロマトーシスを治療するために、医薬品および治療に使用され得る。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの改変ミニヘプシジンおよび／または少なくとも１つの元のミニヘプシジンを、鉄過負荷の症状が認められ、かつ／または鉄過負荷障害を有するとして診断される前、その間、その後またはそれらを組み合わせて、対象に投与する。

【0091】

従って、いくつかの実施形態において、１つ以上の改変ミニヘプシジンは、単独または１つ以上の元のミニヘプシジンと組み合わせて、その企図される目的に適した担体を含む組成物の形態で提供される。組成物はまた、その企図される目的に適した１つ以上の追加の成分を含み得る。例えば、アッセイにおいて、組成物は、リポソーム、ニクロサミド、ＳＬ２２０可溶化剤（ＮＯＦ，Ｊａｐａｎ）、クレモホール（ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ）ＥＬ（Ｓｉｇｍａ）、エタノール、およびＤＭＳＯを含み得る。鉄過負荷疾患の治療において、組成物は、異なる吸収増強剤およびプロテアーゼ阻害剤、ペプチド封入化のための固体マイクロ粒子またはナノ粒子（例えば、キトサンおよびハイドロゲル）、高分子結合、脂質付加および他の化学修飾を含み得る。

【0092】

本発明はまた、単独または１つ以上の元のミニヘプシジンと組み合わせた、１つ以上の改変ミニヘプシジン、および／または試薬とともに梱包された本発明の組成物、デバイス、説明資料、またはそれらの組み合わせを含むキットを提供する。例えば、キットは、アッセイを行うために使用される試薬、鉄代謝の障害を診断、治療またはモニタリングするための薬物および組成物、アッセイされるサンプルを得るためのデバイス、試薬を混合し、アッセイを行うためのデバイスなどを含み得る。

【0093】

本発明のペプチドがヘプシジン活性を示し、すなわち、フェロポルチン分解のアゴニストとして作用する場合、単独または１つ以上の元のミニヘプシジンを組み合わせた、１つ以上の改変ミニヘプシジンを使用し、鉄過負荷疾患を治療することができる。例えば、単独または１つ以上の元のミニヘプシジンと組み合わせた１つ以上の改変ミニヘプシジンを対象に投与し、瀉血が禁忌であり、鉄キレート化剤が治療の中心になるが多くの場合、忍容性が不良である鉄負荷性貧血（特にβサラセミア）の鉄過負荷に関連する症状および／または病因を改善することができる。単独または１つ以上の元のミニヘプシジンと組み合わせた１つ以上の改変ミニヘプシジンを使用し、特に、維持瀉血に忍容性がない対象の遺伝性ヘモクロマトーシスを治療することができる。単独または１つ以上の元のミニヘプシジンと組み合わせた１つ以上の改変ミニヘプシジンを使用し、急性鉄毒性を治療することができる。いくつかの実施形態において、単独または１つ以上の元のミニヘプシジンと組み合わせた１つ以上の改変ミニヘプシジンの治療は、瀉血またはキレート化と組み合わせることができる。

【0094】

従って、単独または１つ以上の元のミニヘプシジンと組み合わせた１つ以上の改変ミニヘプシジンを、対象、好ましくはヒトなどの哺乳類動物に投与することができる。いくつかの実施形態において、対象への投与は、対象が鉄濃度の増加および／または異常に高い鉄濃度を示す前、示す時、および／または示した後である。いくつかの実施形態において、治療される対象は、高い鉄濃度を有する危険があり、かつ／または鉄過負荷疾患を有する遺伝的傾向を有する者である。いくつかの実施形態において、ペプチドを医薬組成物の形態で投与する。いくつかの実施形態において、ペプチドを治療有効量で投与する。本明細書において使用される場合、「治療有効量」は、プラセボなどの対照と比較して、鉄代謝の所与の疾患の症状および／または病因を改善する量である。

【0095】

治療有効量は、当技術分野において周知の標準的な方法により容易に決定され得る。投与される投与量は、疾患の臨床的重症度、対象の年齢および体重、または対象の鉄への曝露に応じて当業者により決定されることができる。ミニヘプシジンの好ましい有効量は、非経口配合物に当たり、約０．０１〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０１〜約３ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０１〜約２ｍｇ／ｋｇ、約０．０１〜約１ｍｇ／ｋｇ、または約０．０１〜約０．５ｍｇ／ｋｇ体重の範囲となる。経口投与のための有効量は、最大約１０倍高値であり得る。さらに、本発明のペプチドまたは組成物を用いた対象の治療は、単回治療を含むことができ、または好ましくは一連の治療を含むことができる。実際の投与量は、具体的なペプチドまたは組成物、具体的な配合物、投与様式、および治療される具体的な部位、宿主および疾患に従い異なるだろうということが考えられる。また、治療に使用される有効投与量が具体的な治療経過にわたり増加または低下し得ることが考えられる。所与の条件の組に対して最適な投与量を、所与のペプチドまたは組成物における実験的データに照らして、従来の投与用量決定試験を使用して当業者により確定することができる。投与量の変更は、当技術分野において周知の標準的な診断アッセイにより得られ、かつ明らかとなり得る。いくつかの状態において、慢性投与が必要とされ得る。

【0096】

本発明の医薬組成物を、所望の投与形態に適切な単位剤形で調製することができる。本発明の組成物を、経口、経腸、経鼻、局所（頬内および舌下を含む）、経膣および非経口（皮下、筋肉内、静脈内および皮内）を含む任意の適切な経路により治療のために投与することができる。経口、局所、経真皮、経鼻、経肺、経皮（皮膚が機械的またはエネルギー手段のいずれかにより破損する）、経腸、頬内、経膣、移植されたリザーバーを介して、または非経口を含む種々の投与経路を、本発明に従い使用することができる。非経口は、皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内、関節内、滑液嚢内、胸骨内、髄腔内、肝内、病変内および頭蓋内注射または注入法ならびに局所治療のための注射可能な材料（ポリマーを含む）を含む。いくつかの実施形態において、投与経路は皮下である。いくつかの実施形態において、組成物は密封され滅菌されたガラスバイアル内にある。いくつかの実施形態において、組成物は防腐剤を含有する。医薬組成物は、原末、錠剤、液体、ゲル、凍結乾燥物などとして配合されてよく、投与のためにさらに加工され得る。例えば、本明細書において参照により組み込まれる、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ：ＴＨＥ ＳＣＩＥＮＣＥ ＡＮＤ ＰＲＡＣＴＩＣＥ ＯＦ ＰＨＡＲＭＡＣＹ．２０^ｔｈ ｅｄ．（２０００）Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ．Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤを参照のこと。

【0097】

好ましい経路は、レシピエントの状態および年齢、治療される状態の性質および選択されたペプチドおよび組成物とともに異なり得ることが考えられる。

【0098】

本発明の医薬組成物は、治療有効量の少なくとも１つの本明細書において開示されたペプチド、および不活性であり得る、薬学的に許容可能な担体または希釈剤を含む。本明細書において使用される場合、用語「薬学的に許容可能な担体」は、製剤投与に適合し、当技術分野において周知の任意および全ての溶剤、分散媒体、増量剤、被覆剤、抗菌剤および抗真菌剤、防腐剤、等張性および吸収遅延剤などを含むことが企図される。任意の従来の媒体または薬剤が活性化合物と相溶性がない場合を除いて、組成物におけるその使用が検討される。

【0099】

補充化合物も組成物に組み込まれることができる。補充化合物は、ニクロサミド、リポソーム、ＳＬ２２０可溶化剤（ＮＯＦ，Ｊａｐａｎ）、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬ（Ｓｉｇｍａ）、エタノール、およびＤＭＳＯを含む。

【0100】

本発明のペプチドおよび組成物の毒性および治療有効性を、例えば、ＬＤ_５０（集団の５０％が致死となる用量）およびＥＤ_５０（集団の５０％に治療的効果がある用量）を決定するために、細胞培養物または実験動物における標準的な薬学的手法により決定することができる。毒性と治療効果との間の用量比が治療指数であり、ＬＤ_５０／ＥＤ_５０の比として表すことができる。大きな治療指数を示すペプチドが好ましい。毒性副作用を示すペプチドが使用され得る場合、感染していない細胞への潜在的な損傷を最小限にし、副作用を減少させるために、罹患組織の部位に、かかるペプチドを標的とする送達系を設計することに注意するべきである。

【0101】

細胞培養アッセイおよび動物試験から得られたデータを、ヒトに使用するための投与量の範囲を配合するときに使用することができる。本発明のペプチドの投与量は、好ましくは、ほとんどまたは全く毒性がないＥＤ_５０を含む血中濃度の範囲内にある。投与量は、使用される投与量形態および利用される投与経路に応じてこの範囲内で異なり得る。本発明の方法に使用される任意のペプチドにおいて、治療有効用量を、はじめに細胞培養アッセイから推定することができる。用量を、細胞培養において決定されるように、ＩＣ_５０（すなわち、症状の最大半量の阻害を得る試験化合物の濃度）を含む血中血漿濃度範囲を得るよう動物モデルにおいて配合することができる。かかる情報を使用し、より正確にヒトに有用な用量を決定することができる。血漿中の濃度を、例えば、高速液体クロマトグラフィーにより、または質量分析により測定することができる。

【0102】

改変ミニヘプシジン、ＰＲ６５

【0103】

ペプチド合成。本発明の改変ミニヘプシジンは、標準的な固相ｆｍｏｃ化学を使用して合成され、逆相ＨＰＬＣにより精製された。構造式ＩＡのＡ１〜Ａ９（すなわち、Ｎ〜Ｃ末端）の、ＰＲ６５において、主要な配列は、以下のように全てＬ−アミノ酸であった：イミノ二酢酸、トレオニン、ヒスチジン、ジフェニルアラニン、ベータ−ホモプロリン、アルギニン、システイン、アルギニンおよびベータ−ホモフェニルアラニン。Ｃ末端カルボキシアミドは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）リンカーおよびパルミチン酸基（図１０Ａ）を用いて誘導体化された。ヒトヘプシジンを、Ｐｅｐｔｉｄｅｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ，ＫＹ）から購入した。

【0104】

動物試験。全ての試験は、ＵＣＬＡの動物研究監視事務局により承認された。６週齢の雄野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスを使用し、天然のヘプシジンおよびＰＲ６５の活性と比較し、かつ腹腔内対皮下経路の投与後のＰＲ６５の効果を試験した。ヘプシジンおよびＰＲ６５を、ＰＥＧ−リン脂質系可溶化剤である、１００μｌのＳＬ２２０（ＮＯＦ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｊａｐａｎ）（Ｐｒｅｚａ ＧＣ，ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｊ Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１２１（１２）：４８８０−４８８８）において投与し、鉄パラメータを４時間後に測定した。この溶剤は、マウスの血清鉄濃度を顕著に変化させない（５μＭより小さい変化、図示せず）。

【0105】

ＰＲ６５の治療効果は、ヘプシジン−１ノックアウトマウス（Ｈａｍｐ１^−／−）において試験され（Ｌｅｓｂｏｒｄｅｓ−Ｂｒｉｏｎ ＪＣ，ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｂｌｏｏｄ １０８（４）：１４０２−１４０５）、マーカー利用した加速性戻し交配を使用してＣ５７ＢＬ／６バックグランド（Ｎ４．９９％遺伝子マーカー同一性）に戻し交配させた（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）。ＰＲ６５を、１００μｌのＳＬ２２０可溶化剤において皮下投与した。短期間の試験は、単回注射の有効性を確立するために最大４８時間行われた。長期間の試験（「抑制」および「治療」）は、毎日の注射を使用して２週間行われ、鉄および血液学的パラメータは、最後の注射の２４時間後に測定された。

【0106】

鉄負荷を抑制し、阻害し、または減少させるＰＲ６５の能力を試験するため（「抑制」試験）、雄Ｈａｍｐ１^−／−マウスを５〜６週齢で開始し２カ月間、低鉄飼料（４ｐｐｍ鉄）で飼育することにより鉄枯渇させた。方法は、野生型Ｃ５７Ｂ６マウスの肝臓鉄含量、約２〜３μモル／ｇ肝臓湿重量に一致するよう開発された（Ｒａｍｏｓ Ｅ，ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ５３（４）：１３３３−１３４１）。マウスの１群を、鉄枯渇直後に分析し（ベースライン群）、残りの動物は、鉄負荷飼料（標準的な飼料、約３００ｐｐｍのＦｅ）に切り替えられ、２週間、溶剤またはＰＲ６５（２０、５０または１００ｎモル）を毎日皮下注射された。全てのマウス飼料は、Ｈａｒｌａｎ−Ｔｅｋｌａｄ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）から得られた。

【0107】

鉄負荷されたＨａｍｐ１^−／−マウスのＰＲ６５の効果を試験するため（「治療」試験）、雄マウスは、生存期間全体において標準的な飼料で飼育された。１２〜１４週齢に開始すると、５０ｎモルのＰＲ６５または溶剤を、２週間皮下経路により毎日注射した。

【0108】

鉄および血液学的パラメータの測定。血清鉄および非ヘム鉄濃度を、これまでに記載されているように（Ｒａｍｏｓ Ｅ，ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ５３（４）：１３３３−１３４１）、酸処理の後に鉄定量化のための比色分析法（Ｇｅｎｚｙｍｅ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）を使用して決定した。脱パラフィン化された切片を、非ヘム鉄用にペルルスプルシアンブルー染色で染色し、ＳＧペルオキシダーゼ基質キット（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）を用いて増感させ、ヌクレアファストレッドを用いて対比染色した。完全な血球数がＨｅｍａＶｅｔ血液分析器（Ｄｒｅｗ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｏｘｆｏｒｄ，ＣＴ）を用いて得られた。

【0109】

統計学的分析。群の平均値との間の統計学的有意差を、スチューデントＴ検定およびＳｉｇｍａｐｌｏｔ１１．０パッケージ（Ｓｙｓｔａｔ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を使用して評価した。

【0110】

ミニヘプシジン治療方法

【0111】

ＰＲ６５（図１０Ａ）を、野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスのパイロット試験に基づき、ヘプシジンヌルマウスにおける抑制および治療試験に選択した。ＰＲ６５は、腹腔内注射後の最も強力なミニヘプシジンおよびその分子生物活性のうちの１つが陰性ヘプシジンに相当したことがわかった（図１０Ｂ）。さらに、ＰＲ６５は、腹腔内投与（図１０Ｃ）と比較した場合、皮下注射を用いて完全な活性を保有し、その合成費用は、他のミニヘプシジンと比較して好ましいものであった。８０個超のミニヘプシジンの定量的評価に基づき、ヒトヘプシジンの９Ｎ末端アミノ酸を含有する原型的なペプチド（配列番号９）と比較してＰＲ６５の高い生物活性は、芳香族性、可溶性、タンパク質分解耐性の増加、ならびにパルミトイル基により介在された血漿タンパク質結合の増大による腎クリアランスの低下による可能性がある。

【0112】

長期間のミニヘプシジン治療法のための最適な投与パラメータを確立するため、鉄負荷されたヘプシジンノックアウトマウスである、Ｈａｍｐ１−／−マウスにおける用量応答（図１１Ａ）および経時（図１１Ｂ）実験が行われた。２４時間後、２０および５０ｎモルのＰＲ６５の皮下注射は、１５％および１０％（ｐ＝０．００５、ｐ＝０．００４）の血清鉄の低下を生じたが、１００および２００ｎモルの用量では、８５％および９５％の減少（ともにｐ＜０．００１）を生じた。１００ｎモルのＰＲ６５が最大に近い低鉄血症を生じるため、この用量を、経時実験用に選択し、そのピークの効果のタイミングおよび期間を決定した。血清Ｆｅの最大低下（８８％）は、皮下注射１２時間後で生じ（ｐ＜．００１）、血清Ｆｅは、２４時間でかなり抑制されたままであった（８２％）が、注射４８時間後で溶剤対照濃度に戻った。

【0113】

ＰＲ６５（１００ｎモル）の活性も組織鉄滞留においてその効果を介して４８時間にわたり評価された。興味深いことに、脾臓の鉄蓄積は、ＰＲ６５注射４８時間後の間に認められなかった（図１２）。これは、ヘプシジンノックアウトマウスの脾臓が完全に鉄を枯渇し、増感ペルルス染色により最終的に検出可能になるのに十分な鉄を蓄積するために２日超の日数がかかるためである。肝臓鉄含量は、これらのマウスでは既に高値であったが、実験の過程において視覚的に変化しなかった。注射１〜４時間後で、十二指腸切片が絨毛毛細管ネットワークの周囲を染色する個別の鉄を示し、連続する高いフェロポルチン活性および制御されていない血漿への鉄移動を示した。ＰＲ６５注射１２〜２４時間後に、腸細胞内に蓄積された鉄が、予測されたフェロポルチンのミニヘプシジン誘発性消失および血漿への鉄移動の消失と一致する。ミニヘプシジンの効果は注射４８時間後に消失し、鉄は腸細胞にもはや滞留されていなかった。

【0114】

従って、いくつかの実施形態において、対象を、所与の用量、例えば、毎日約１００μｇ／ｋｇのミニヘプシジンで治療し、約１週間後、用量を対象の血清鉄濃度が約１０μＭより下になる場合半量にし、または血清鉄が約３０μＭより上になる場合倍量にする。おおよそ三週目の治療開始時に、用量を、約１０〜３０μＭの血清鉄濃度を維持するために、約２５〜５０％を増加または低下することができる。いくつかの実施形態において、１つ以上のミニヘプシジンの約１週間の投与後、対象の鉄濃度、および／またはフェロポルチン、および／またはミニヘプシジン濃度を、当技術分野において周知の方法を使用して、または本明細書において開示されるように、モニタリングすることができ、次いで、その濃度に基づき、対象をそれに応じて治療することができ、例えば、初回用量より多いまたは少なくなり得る１つ以上のミニヘプシジンの１つ以上の続く用量を投与することができる。ミニヘプシジンの続く用量は、第１の用量のミニヘプシジンと同じまたは異なっていてよい。

【0115】

ミニヘプシジンの慢性投与がヘプシジン欠損対象における鉄負荷を抑制する

【0116】

対象のヘプシジンにおいて鉄負荷を抑制するＰＲ６５の能力を、マウスをモデルとして使用して試験した。ヘプシジンＫＯマウスは、鉄貯蔵を野生型マウスのものに相当する濃度に低下されるよう８週間の鉄欠乏飼料で飼育された。鉄枯渇後、マウスの１群を、ベースラインの鉄および血液学的パラメータを確立するため分析し、残りのマウスを、２週間の鉄負荷飼料（３００ｐｐｍのＦｅ）で飼育すると同時に、溶解した溶剤のみ（対照）またはＰＲ６５（２０、５０または１００ｎモル）の毎日の皮下注射を投与した。溶剤治療と比較し、ＰＲ６５が脾臓において鉄滞留が生じ、血清鉄を低下させ、肝臓鉄負荷を抑制することが仮定された。心臓鉄過負荷は、鉄負荷された患者の不良な予後のマーカーであるため、心臓鉄も測定された。ヘモグロビン濃度が、赤血球生成における過剰なヘプシジンの潜在的鉄抑制効果を検出するためにモニタリングされた。

【0117】

ミニヘプシジンのヘプシジンアゴニスト活性を、全ての処置群において、マクロファージの鉄滞留の増大が、脾臓鉄含量が増加するにつれて現れたことを確認した。溶剤注射された対照脾臓のほとんど検出不能な非ヘム鉄含量と比較して、３つ全てのミニヘプシジン用量は、脾臓鉄含量の１５〜３０倍の増加を生じた（全てｐ＝０．０１）（図１３Ａ）。血清鉄は、毎日２０ｎモルのＰＲ６５を投与されたマウスにおいて変化しなかった（ｐ＝０．２６）が、１日当たり５０および１００ｎモルを投与されたマウスにおいて６９％および８３％低下した（ともにｐ＝０．０１）（図１３Ｂ）。血中鉄濃度の低下も、５０および１００ｎモル群それぞれのヘモグロビン濃度の用量依存した３および５ｇ／ｄＬの減少として反映された（ともにｐ＜．００１）が、ヘモグロビン濃度は２０ｎモルにおいて有意に変化しなかった（ｐ＝０．１３）（図１３Ｃ）。心臓鉄濃度は、２０、５０および１００ｎモルそれぞれのＰＲ６５で処置されたマウスにおいて３３％、６０％および４７％低下した（ｐ＝０．０８、０．００７、０．０５）（図１３Ｄ）。さらに、３つのＰＲ６５用量で処置されたマウスは、溶剤処置された対照より肝臓鉄が７６％、５３％および６８％少なく（ｐ＝０．００１、０．０６、０．０１）、鉄枯渇されたベースライン群由来のマウスと比較して肝臓鉄の統計学的有意な増加はなかった。血清鉄およびヘモグロビンを除き、一貫した用量応答関係の欠如が、相対的に低用量で最大効果に到達し、その結果、その差が統計学的変動（肝臓および心臓鉄）を反映し、またはＰＲ６５の２つ以上の効果が複雑な様式において相互作用する（脾臓鉄は、全てがＰＲ６５の予測された効果である、脾臓からの鉄輸送の低下、十二指腸の鉄吸収の低下および腸細胞数の低下を組み合わせた効果を反映し得る）ことを示し得る。

【0118】

鉄枯渇されたベースラインのマウスと比較してミニヘプシジン処置されたマウス由来の組織切片のペルルス染色は、肝臓の鉄貯蔵が２０および５０ｎモル群においてベースラインから増加せず、１００ｎモル用量ではベースラインよりさらに低値であったことを示した（図１４）。対照的に、溶剤注射されたマウスの肝臓切片は、非常に高い鉄濃度を示した。溶剤とＰＲ６５群との間の差の同様なパターンが心臓において認められ、ペプチド１００ｎモルを投与されたマウスの心臓において完全な鉄染色の欠乏がある。脾臓の赤髄の鉄の顕著な蓄積が、全てのミニヘプシジン群において認められたが、溶剤を投与されたマウスまたはベースラインの鉄枯渇されたマウスにおいては認められなかった。ベースラインの十二指腸切片は、鉄染色を示さなかったが、ＰＲ６５処置されたマウスは、十二指腸細胞において鉄滞留を示し、再度、ＰＲ６５が腸細胞からの鉄流出を遮断したことを確認した。

【0119】

従って、いくつかの実施形態において、本発明は、本発明による１つ以上のミニヘプシジンの慢性的投与を含む、異常に低い濃度または全くないヘプシジンを有する対象において鉄負荷を抑制する方法を提供する。

【0120】

鉄過負荷されたヘプシジンノックアウトマウスにおけるミニヘプシジン効果

【0121】

対象の鉄過負荷のための独立した治療としてのミニヘプシジンの可能性を評価するため、１２週齢の鉄過負荷されたヘプシジンノックアウトマウスに、１４日間、毎日、５０ｎモルのＰＲ６５を注射した。この用量は、これまでの実験の１００ｎモルを投与されたマウスがやや貧血性であったため、最大忍容用量として選択された。ペプチド活性は、脾臓鉄含量において１５倍の増加が確認された（ｐ＜０．００１）（図１５Ａ）。ＰＲ６５投与前の鉄枯渇されたマウスと対照的に、確立された鉄過負荷された血清鉄濃度のマウスにおいて、溶剤処置されたマウスと比較して最後の投与２４時間後に低下しなかった（ｐ＝０．６８２）（図１５Ｂ）。しかし、ヘモグロビンの２ｇ／ｄＬの低下（ｐ＝０．０１２）（図１５Ｃ）は、血清鉄が処置の間一過性に低下していたことを示唆した。２４時間未満の期間の各５０ｎモル用量の低鉄血の影響は、この週齢のヘプシジンノックアウトマウスの重度の鉄過負荷によるものであったかもしれない。蓄積した肝細胞鉄は、フェロポルチンｍＲＮＡの５’鉄調節要素（５’ＩＲＥ）と相互作用する鉄調節タンパク質（ＩＲＰ）によりフェロポルチン翻訳の阻害を緩和することにより、および恐らく他のメカニズムにより、フェロポルチン合成および肝細胞から血漿への鉄流出を刺激することができる。対照群と比較して、ＰＲ６５で処置された鉄負荷されたマウスは、心臓鉄濃度の低下傾向（２４％低下、ｐ＝０．０８５）を示し（図１５Ｄ）、肝臓鉄濃度は、野生型マウスの総肝細胞鉄含量に等しい量である、約２０％（ｐ＝０．００９）または約２００μｇ／ｇ（図１５Ｅ）低下した。

【0122】

増感ペルルス染色は、ＰＲ６５で処置したマウスの脾臓および十二指腸の鉄滞留および肝臓の鉄分布パターンの変化を例証した（図１６）。溶剤およびＰＲ６５処置したマウスにおける心臓および膵臓の統計学的有意差は顕著ではなかった。凝集体において、染色および定量的分析は、２週間のミニヘプシジンのみの処置が食事からの鉄吸収を阻害するだけでなく、少量の鉄を肝臓から脾臓に再分布させることができたことを示す。

【0123】

従って、いくつかの実施形態において、鉄過負荷疾患のため治療されるヒト対象を、治療が肝臓の鉄蓄積を抑制したことを利用可能な画像技法（例えば、ＦｅｒｒｉＳｃａｎ）に検出するのに必要な少なくとも最短の期間、例えば、約３カ月間、１つ以上のミニヘプシジンで治療する。対象の中には、治療を何年も、または対象の生存期間継続する可能性がある。

【0124】

図１３において示されるように、ＰＲ６５は、おもに鉄吸収を減少させることにより作用したが、予防的に投与されるときに、鉄を脾臓マクロファージに再分布させた。従って、いくつかの実施形態において、１つ以上のミニヘプシジンを、対象の鉄過負荷に対する予防的治療として対象に投与することができる。例えば、正常範囲内であるが、鉄過負荷疾患の素因を有し（例えば、遺伝的に過剰鉄吸収を生じやすい）、または異常に高値の鉄濃度を発症する危険がある場合、対象は、対象が鉄過負荷疾患および／または異常に高値の鉄濃度を発症する可能性を抑制し、かつ／または減少させるために１つ以上のミニヘプシジンを投与することができる。

【0125】

図１３に従い、鉄分布を以下の推定および式に基づき算出した：平均体重２５ｇ、血液量（５．５％）＝１．４ｍｌ、肝臓質量（５％）＝１．３ｇ、脾臓質量（０．３％）＝０．０８ｇ、Ｈｂの分子質量＝６４，０００ダルトンおよび総原子質量＝２２４ダルトンの４個の鉄原子に基づいたＨｂ中の％Ｆｅ＝０．３４％、Ｈｂの鉄総量＝（Ｈｂ濃度）×（血液量）×（Ｈｂの％Ｆｅ）、および器官内の鉄総量＝鉄モル濃度×器官質量×５６ｇ／モルに基づいて器官質量を推定した。溶剤群およびＰＲ６５群の各量を以下に示す：

【表5】

【0126】

血漿鉄の得られた低下も、非トランスフェリン結合鉄（ＮＴＢＩ）の濃度を減少させ、鉄過剰量を忍容しない心臓および内分泌器官からの鉄の動員を促進することができる。従って、いくつかの実施形態において、１つ以上のミニヘプシジンを、ＮＴＢＩの濃度を減少させ、かつ／または心臓および内分泌器官から他の器官および組織への鉄の動員を促進させるために、対象に投与することができる。

【0127】

瀉血またはキレート化と異なり、ミニヘプシジンは、体内からの鉄消失を目に見えて増加させることは予期していなかった。ＨＦＥヌルマウスの鉄過負荷の相対的に軽度のモデルにおいて（Ｖｉａｔｔｅ Ｌ，ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｂｌｏｏｄ １０７（７）：２９５２−２９５８）、トランスジェニックのヘプシジン発現が、鉄の蓄積が相対的に非毒性である位置の肝臓マクロファージへの鉄の顕著な再分布が生じることが報告された。より過負荷されるＨａｍｐ１^−／−マウスにおいて、ミニヘプシジン処置されたマウスの赤髄マクロファージは、鉄を保有したが、肝臓および心臓鉄貯蔵のわずかに得られた低下は、ミニヘプシジンのみが肝臓鉄負荷が高くなると、少しの治療的利点を与えることを示唆する。この重度の鉄過負荷モデルにおける、ミニヘプシジン用量のトランスフェリン飽和の２４時間以内の効果は、ＮＴＢＩが、実質器官に連続して鉄を送達し、マクロファージの鉄再分布および鉄吸収の低下を弱めることを暗示し得る。

【0128】

それゆえ、ヒト対象で確立された鉄過負荷において、１つ以上のミニヘプシジンを用いた効率的な治療には、１日当たり１回以上の投与、肝臓鉄の有益な効果が検出され得る前の長期の治療期間を含むことができ、または瀉血もしくはキレート化による鉄の除去と組み合わせることができる。

【0129】

投与量

【0130】

ＰＲ６５のＬ−アミノ酸の独占的な使用により、ペプチド生成費用を顕著に減少させることがわかった。さらに、ＰＲ６５の非天然および高芳香族残基が、マウスの最小有効量を２０ｎモル／ｄまたは１．３ｍｇ／ｋｇ／ｄに実質的減少させることが予期せず見つかった。

【0131】

米国食品医薬品局の投与量調節ガイドラインに従い、マウスとヒトとの代謝速度の差により体表面積に対する投与量を正規化するＫｍ因子に基づいた変換を必要とする（Ｒｅａｇａｎ−Ｓｈａｗ Ｓ，ｅｔ ａｌ．（２００８）ＦＡＳＥＢ Ｊ ２２（３）：６５９−６６１）。ヒト相当量（ＨＥＤ）を、ＨＥＤ＝動物用量（ｍｇ／ｋｇ）×（動物Ｋｍ／ヒトＫｍ）により推定することができ、この場合、マウスおよび成人ヒトのＫｍはそれぞれ３および３７である。従って、本発明において、ヒトのミニヘプシジンの皮下用量は、最大約５０〜１００μｇ／ｋｇ／日、約７５〜１２５μｇ／ｋｇ／日、または約９０〜１１０μｇ／ｋｇ／日、好ましくは約１００μｇ／ｋｇ／日であり得る（この用量は、最も広く使用されるペプチド薬である、皮下注射インスリンの基本用量の中央値、つまり２型糖尿病において０．７５Ｕ／ｋｇ／日または３３μｇ／ｋｇ／日で通常使用される約３倍のペプチド量が容易に投与可能である（Ｒｏｓｅｎｓｔｏｃｋ Ｊ，ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｃａｒｅ ２４（４）：６３１−６３６））。当然ながら、低投与量ならびに高投与量を、具体的なミニヘプシジン、投与形態、配合、対象および鉄過負荷の程度に応じて、対象に投与することができる。

【0132】

ヒトのミニヘプシジン、例えばＰＲ６５の効果を変更することができるマウスとヒトとの鉄代謝の重要な違いには、ヒト赤血球のやや長い寿命（１２０日対４０日）および鉄欠乏食における鉄貯蔵のゆっくりした枯渇から推定した場合（男性において、３００〜６００日対１５〜２０日）のヒトにおけるかなり低い割合の鉄消失率（全体重の鉄と比較した１日の鉄消失）を含む。これらの違いの正味の影響は、ヒトにおける１日の鉄流出に対する腸の鉄吸収の寄与がかなり低いことがある（マウスでの５０％超と比較して４〜８％）（Ｒａｍｏｓ Ｅ，ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ５３（４）：１３３３−１３４１）。ヘプシジンおよびその類似体が、赤血球上よりマクロファージ上でより強い効果を発揮する場合（Ｒｅａｇａｎ−Ｓｈａｗ Ｓ，ｅｔ ａｌ．（２００８）ＦＡＳＥＢ Ｊ２２（３）：６５９−６６１）、これはさらに、ヒトにおける同様の低鉄血作用に必要なミニヘプシジンの相対的用量を低下させ得る。従って、いくつかの実施形態において、１つ以上のミニヘプシジンの治療有効量を、約１０〜５００μｇ／ｋｇ／日の範囲となる。繰り返すが、低用量ならびに高用量は、具体的なミニヘプシジン、投与形態、配合、対象および鉄過負荷の程度に応じて、対象に投与することができる。

【0133】

本明細書において提供される場合、本発明によるミニヘプシジンを使用し、遺伝的欠陥により危険のある対象、または既に鉄枯渇しているがキレート化療法または静脈切開療法ではもはや忍容しない対象の鉄過負荷を阻害し、減少させ、または治療することができる。本発明によるミニヘプシジンを使用し、βサラセミア重症型の対象および／またはヘプシジン濃度が正常より高いが、鉄過負荷の程度において適切な濃度より低い対象および具体的な対象を治療することができる。例えば、本発明による１つ以上のミニヘプシジンを使用し、食事からの鉄の過吸収に苦しむが、鉄濃度が正常である対象を、対象の鉄量を低下させ、過吸収を相殺させるために治療することができる。本発明の１つ以上のミニヘプシジンを使用して不十分な赤血球生成を治療し、対象の貧血を改良することができる。

【0134】

本発明のミニヘプシジンが相対的に小さい大きさであるため、ミニヘプシジンを、適切に配合し、経口投与およびインスリン投与（Ｒｏａｃｈ Ｐ．（２００８）Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ ４７（９）：５９５−６１０）、例えば、吸収もしくは経皮送達、または鼻粘膜もしくは頬粘膜送達に使用されるものなどの他の非侵襲的手段による投与に最適化させることができる。

【0135】

本発明の開示を理解または完成するために必要な範囲において、本明細書に挙げた全ての刊行物、特許および特許出願は、それぞれが個々に組み込まれるのと同じ程度に、本明細書において明示的に参照により組み込まれる。

【0136】

このように本発明の例示的実施形態を記載したことにより、当業者により、開示内のものは例示に過ぎず、種々の他の変更、適応、および改変が本発明の範囲内でなされ得ることを留意するものとする。それに従い、本発明は、本明細書に図示された特定の実施形態に限定されないが、以下の特許請求の範囲においてのみ限定される。

【図1】

【図2A】

【図2B】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10A】

【図10B】

【図10C】

【図11A】

【図11B】

【図12】

【図13A】

【図13B】

【図13C】

【図13D】

【図13E】

【図14】

【図15A】

【図15B】

【図15C】

【図15D】

【図15E】

【図16】

【図17-1】

【図17-2】

【図17-3】

【図17-4】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]