特許 6571650 アミノ酸誘導体

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6571650

(24)【登録日】2019年8月16日

(45)【発行日】2019年9月4日

(54)【発明の名称】アミノ酸誘導体

(51)【国際特許分類】

   C07C 323/58 20060101AFI20190826BHJP

   C07C 323/60 20060101ALI20190826BHJP

   C07C 271/16 20060101ALI20190826BHJP

   C07C 275/14 20060101ALI20190826BHJP

   C07C 275/10 20060101ALI20190826BHJP

   C07C 271/12 20060101ALI20190826BHJP

   C07C 235/06 20060101ALI20190826BHJP

   C07C 247/04 20060101ALI20190826BHJP

   C07C 275/16 20060101ALI20190826BHJP

   C07C 247/12 20060101ALI20190826BHJP

   C07C 271/22 20060101ALI20190826BHJP

   C07C 237/06 20060101ALI20190826BHJP

   C07K 14/195 20060101ALI20190826BHJP

   C07K 16/12 20060101ALI20190826BHJP

   C07K 5/06 20060101ALI20190826BHJP

   A61K 47/18 20060101ALI20190826BHJP

   A61K 47/42 20170101ALN20190826BHJP

   A61K 47/20 20060101ALN20190826BHJP

   A61K 39/395 20060101ALN20190826BHJP

【ＦＩ】

   C07C323/58CSP

   C07C323/60ZNA

   C07C271/16

   C07C275/14

   C07C275/10

   C07C271/12

   C07C235/06

   C07C247/04

   C07C275/16

   C07C247/12

   C07C271/22

   C07C237/06

   C07K14/195

   C07K16/12

   C07K5/06

   A61K47/18

   !A61K47/42

   !A61K47/20

   !A61K39/395 M

   !A61K39/395 L

【請求項の数】9

【全頁数】68

(21)【出願番号】特願2016-532758(P2016-532758)

(86)(22)【出願日】2014年8月4日

(65)【公表番号】特表2016-534099(P2016-534099A)

(43)【公表日】2016年11月4日

(86)【国際出願番号】IB2014002505

(87)【国際公開番号】WO2015019192

(87)【国際公開日】20150212

【審査請求日】2017年8月2日

(31)【優先権主張番号】61/862,497

(32)【優先日】2013年8月5日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】506042265

【氏名又は名称】メディミューン リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100091096

【弁理士】

【氏名又は名称】平木 祐輔

(74)【代理人】

【識別番号】100118773

【弁理士】

【氏名又は名称】藤田 節

(74)【代理人】

【識別番号】100122389

【弁理士】

【氏名又は名称】新井 栄一

(74)【代理人】

【識別番号】100111741

【弁理士】

【氏名又は名称】田中 夏夫

(74)【代理人】

【識別番号】100169971

【弁理士】

【氏名又は名称】菊田 尚子

(74)【代理人】

【識別番号】100168893

【弁理士】

【氏名又は名称】岩崎 正路

(72)【発明者】

【氏名】マレッリ，マルチェッロ

(72)【発明者】

【氏名】ブルント，ミカエル，ヴァン

(72)【発明者】

【氏名】グラブスタイン，ケネス，エイチ．

【審査官】 ▲吉▼澤 英一

(56)【参考文献】

【文献】 米国特許第０４５１２９７９（ＵＳ，Ａ）

【文献】 JAMES K COWARD; WILLIAM D SWEET，ANALOGS OF S-ADENOSYLHOMOCYSTEINE AS POTENTIAL INHIBITORS OF BIOLOGICAL TRANSMETHYLATION. ，JOURNAL OF MEDICINAL CHEMISTRY，AMERICAN CHEMICAL SOCIETY，１９７２年 ４月，VOL:15, NR:4，PAGE(S):381 - 384，SYNTHESIS AND BIOLOGICAL ACTIVITY OF HOMOCYSTEINE DERIVATIVES BRIDGED TO ADENINE，ＵＲＬ，http://dx.doi.org/10.1021/jm00274a013

【文献】 KIMBONGUILA A M; MERZOUK A; GUIBE F; LOFFET A，ALLYLIC PROTECTION OF THIOLS AND CYSTEINE: I: THE ALLYLOXYCARBONYLAMINOMETHYL GROUP，TETRAHEDRON，NL，ELSEVIER SCIENCE PUBLISHERS，１９９９年 ５月２８日，VOL:55, NR:22，PAGE(S):6931 - 6944，ＵＲＬ，http://dx.doi.org/10.1016/S0040-4020(99)00322-1

【文献】 LINDLEY H，THE PREPARATION OF COMPOUNDS RELATED TO S-2-AMINOETHYL-L-CYSTEINE，AUSTRALIAN JOURNAL OF CHEMISTRY，AU，CSIRO PUBLISHING，１９５９年 ２月，VOL:12, NR:2，PAGE(S):296 - 298，ＵＲＬ，http://dx.doi.org/10.1071/CH9590296

【文献】 JERMYN M A，CARBOBENZOXY DERIVATIVES OF S-AMINOALKYL-L-CYSTEINES，AUSTRALIAN JOURNAL OF CHEMISTRY，AU，CSIRO PUBLISHING，１９６６年１０月，VOL:19, NR:10，PAGE(S):1999 - 2000，ＵＲＬ，http://dx.doi.org/10.1071/CH9661999

【文献】 STEPHEN G SPANTON; PRESTWICH GLENN D，CHEMICAL DEFENCE AND SELF-DEFENCE: BIOCHEMICAL TRANSFORMATIONS OF CONTACT INSECTICIDES，TETRAHEDRON，英国，PERGAMON PRESS，１９８２年 ６月，VOL:38, NR:13，PAGE(S):1921 - 1930，PRODUCED BY SOLDIER TERMITES，ＵＲＬ，http://dx.doi.org/10.1016/0040-4020(82)80041-0

【文献】 Xu, Jie-Cheng et al.,，Synthesis of MDP and its analogs，Huaxue Xuebao，１９９５年，(1995), 53(5), 509-15

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０７Ｃ

Ａ６１Ｋ

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

以下：

【化1】

【化2】

【化3】

【化4】

【化5】

【化6】

から選択される、ピロリシン類似体。

【請求項2】

非天然アミノ酸として、請求項１に記載の１つ又は複数のピロリシン類似体を含む突然変異体タンパク質。

【請求項3】

非天然アミノ酸として、請求項１に記載の１つのピロリシン類似体を含む、請求項２に記載の突然変異体タンパク質。

【請求項4】

１つ又は複数の非天然アミノ酸を介して、タンパク質、細胞傷害性薬剤、薬物及びポリマーから選択される１つ又は複数の部分に結合される、請求項２又は３に記載の突然変異体タンパク質。

【請求項5】

ＰＥＧ部分に結合される、請求項４に記載の突然変異体タンパク質。

【請求項6】

抗体部分に結合される、請求項４に記載の突然変異体タンパク質。

【請求項7】

細胞傷害性薬剤部分に結合される、請求項４に記載の突然変異体タンパク質。

【請求項8】

薬物部分に結合される、請求項４に記載の突然変異体タンパク質。

【請求項9】

１つ又は複数の非天然アミノ酸を含む突然変異体タンパク質の製造における、請求項１に記載のピロリシン類似体の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、生体共役反応（ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）方法に用いるためのアミノ酸誘導体に関する。

【背景技術】

【0002】

ピロシリンは、天然アミノ酸であり、アンバーコドンにより真正に指定される唯一のアミノ酸である。ピロシリンは、２１番目のアミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼ（ＰｙｌＲＳ）を利用するが、これは、自然に進化して、他の全てのアミノ酸及びｔＲＮＡに対して直交性になったものである。Ｂｌｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．，２００４は、ＰｙｌＲＳ及びその対応ｔＲＮＡ（ｔＲＮＡｐｙｌ）が、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のアンバーコドンにピロリシンを組み込むことができることを証明した。彼らはまた、ｗｔＰｙｌＲＳが、天然では乱交雑性であり、リシンの類似体を組み込み得ることも明らかにした。

【0003】

Ｙｏｋｏｙａｍａ ｅｔ ａｌ．（欧州特許第１９１１８４０号明細書）は、ＰｙｌＲＳ／ｔＲＮＡｐｙｌ系が、真核細胞において直交性であることを立証し、細菌細胞のアンバーコドンによってコード化された標的タンパク質への複数の非天然アミノ酸（ｎｎＡＡ）の組み込みを明らかにした。これらの著者は、アミノ酸結合ポケットを形成し、かつ、他の規定アミノ酸に対してピロリシンを選択する上で機能する、ｐｙｌＲＳの重要なアミノ酸も明らかにした。この部位での突然変異によって、ｔＲＮＡｐｙｌを認識し、ＡｚＺ−ｌｙｓでアミノアシル化することができる突然変異体が作製された（Ｙａｎａｇｉｓａｗａ ２００８）。

【0004】

この直交性は、細菌及び真核細胞にまで広がる。

【0005】

ＰｙｌＲＳは、自然に進化してリシンを排除した、天然に乱交雑性のシンテターゼであるが、アジド、アルキン及びアルケンなどのリシン類似体を突然変異なしで組み込み得る（Ｙａｎａｇｉｓａｗａ ｅｔ ａｌ．，２００８；Ｎｅｕｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．２００８；Ｍｕｋａｉ ｅｔ ａｌ．，２００８；Ｎｇｕｙｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００９）。この特異性の基準は、ｐｙｌＲＳ結合ポケットのアミノ酸残基と、シンテターゼの活性部位におけるアミノ酸を安定化し、かつ正しく配置するピロリシンのピロール環との疎水性相互作用に依存する（Ｋａｖｒａｎ ｅｔ ａｌ．，２００７）。このＲＳ／ｔＲＮＡペアは、細菌、酵母及び哺乳動物細胞中に、一過性トランスフェクションによって導入されており、標的タンパク質へのいくつかの非天然アミノ酸の組み込みに有効であることがわかっている。

【0006】

例えば、欧州特許第１９１１８４０号明細書は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞における標的タンパク質へのＮ−ε−ｂｏｃ−リシンの組み込みを立証している。

【0007】

ピロリシン類似体は、天然又は遺伝子的進化ＰｙｌＲＳのいずれかによって認識されて、アンバーコドン部位でタンパク質に組み込まれるアミノ酸誘導体として定義されるが、これらは、過去数年にわたって開示されており、例えば、Ｆｅｋｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｆｅｋｎｅｒ，Ｌｉ＆Ｃｈａｎ，２０１０）及びＬｉｕ ｅｔ ａｌ．により論述されている。ＰｙｌＲＳ−ｔＲＮＡｐｙｌ系を用いて、官能基又は翻訳後修飾を担持する類似体がタンパク質に部位特異的に組み込まれている。いくつかの研究（例えば、Ｙａｎａｇｉｓａｗａ ｅｔ ａｌ．を参照）は、Ｎ６置換基が、結合ポケットピロリシン内の芳香環である類似体を収容するために、ＰｙｌＲＳ酵素内の突然変異に注目した。他の者、例えば、Ｎｇｕｙｅｎ ｅｔ ａｌ．（また、国際公開第２０１０／１３９９４８号パンフレット）、及びＬｉ ｅｔ ａｌ．（また、国際公開第２０１１／０４４２５５号パンフレット）は、嵩高のＮ６置換基を担持しないピロリシン類似体の同定に的を絞り、より単純な類似体の取得を達成し、これは、簡単に合成して、天然ＰｙｌＲＳ／ｔＲＮＡｐｙｌペアと相互作用させることができるであろう。さらに、Ｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．は、銅触媒クリックケミストリー（ＣＵＡＡＣ）によるタンパク質標識に使用しやすい末端アルキン及びアジド基を有する２つの類似体を開発した。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

依然として、さらに別のピロリシン類似体を開発する必要がある。これまで作製されたピロリシン類似体は、リシン骨格から進化したものに限定されているが、本発明者らは、様々なアミノ酸構造から出発して、天然ＰｙｌＲＳ／ｔＲＮＡｐｙｌペアと一緒にタンパク質に好適に組み込まれたピロリシン類似体を作製した。

【課題を解決するための手段】

【0009】

本発明に従い、本明細書に記載する式Ｉ〜ＶＩＩＩのピロリシン類似体が提供される。

【0010】

また、非天然アミノ酸として、本明細書に記載する式Ｉ〜ＶＩＩＩの１つ又は複数（例えば、１つ）のピロリシン類似体も提供される。

【0011】

さらに、１つ又は複数（例えば、１つ）の非天然アミノ酸を介して、タンパク質、細胞傷害性物質、薬剤及びポリマーから選択される１つ又は複数（例えば、１つ）の部分と結合される、前述した突然変異タンパク質も提供される。

【0012】

さらには、１つ又は複数の非天然アミノ酸を含む突然変異体タンパク質の製造における、前述したピロリシン類似体の使用も提供される。

【0013】

本発明に記載するアミノ酸類似体は、新規かつ有用であり、しかも、タンパク質に容易に組み込まれる（典型的には、適切に使用されれば、生物活性の損失なしに）と共に、生体共役反応に有用な手段を提供する点で、調製するのが簡単であるという利点を有する。

【図面の簡単な説明】

【0014】

【図1】モノクローナル抗体を含むアジドのペグ化を示す。レーン１：重鎖に組み込まれ、ペグ化条件に付された式ＩＡ．１類似体を含む抗体；レーン２：重鎖に組み込まれ、ペグ化条件に付された式ＩＩＩ．１類似体を含む抗体。

【発明を実施するための形態】

【0015】

配列表の配列の簡単な説明：
配列番号１：ＰｙｌＲＳメタノサルシナ・マゼイ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｍａｚｅｉ）ＷＴヌクレオチド配列
配列番号２：ＰｙｌＲＳメタノサルシナ・マゼイ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｍａｚｅｉ）ＷＴアミノ酸配列
配列番号３：ＰｙｌＲＳメタノサルシナ・マゼイ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｍａｚｅｉ）、Ｙ３８４Ｆ突然変異体ヌクレオチド配列
配列番号４：ＰｙｌＲＳメタノサルシナ・マゼイ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｍａｚｅｉ）、Ｙ３８４Ｆ突然変異体アミノ酸配列
配列番号５：ｔＲＮＡｐｙｌメタノサルシナ・マゼイ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｍａｚｅｉ）Ｇｏ１
配列番号６：Ｕ６ｓｎＲＮＡプロモータ
配列番号７：Ｕ６−ｔＲＮＡｐｙｌ構築物
配列番号８：ＧＦＰヌクレオチド配列
配列番号９：ＧＦＰアミノ酸配列
配列番号１０：ＧＦＰＹ４０ヌクレオチド配列
配列番号１１：ＧＦＰＹ４０アミノ酸配列
配列番号１２：抗Ｈｅｒ２（４Ｄ５）γヌクレオチド配列
配列番号１３：抗Ｈｅｒ２（４Ｄ５）γアミノ酸配列
配列番号１４：抗Ｈｅｒ２（４Ｄ５）γ＿Ｋ２７４アンバーヌクレオチド配列
配列番号１５：抗Ｈｅｒ２（４Ｄ５）γ＿Ｋ２７４アンバーアミノ酸配列
配列番号１６：抗Ｈｅｒ２（４Ｄ５）κヌクレオチド配列
配列番号１７：抗Ｈｅｒ２（４Ｄ５）κアミノ酸配列

【0016】

定義
用語「アミド」は、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−結合を指す。

【0017】

用語「カルバメート」は、−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−結合を指す。

【0018】

用語「エステル」は、−Ｃ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−Ｃ結合を指す。

【0019】

用語「アルキル」は、典型的に、１〜６個、例えば、１〜４個の炭素原子を含む脂肪族結合又は置換基を指し、直鎖又は分岐状のいずれでもよい。例としては、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル及びｔ−ブチルが挙げられる。

【0020】

用語「アルコキシ」は、基−Ｏ−アルキルを指す。

【0021】

用語「アルケニル」、「アルケン」又は「オレフィン」は、典型的に、２〜６個、例えば、２〜４個の炭素原子を含む脂肪族結合又は置換基を指し、直鎖又は分岐状のいずれでもよく、少なくとも１つのＣ＝Ｃ部分を含有するという点で、不飽和である。例としては、エテニル、プロペン−１−イル、プロペン−２−イル、及び２−メチル−プロペン−２−イルが挙げられる。アルケニル基は、任意選択で、例えば、ハロゲン（例：Ｃｌ）若しくはエーテル基（例：−Ｏ−Ｃ_1〜6アルキル）などの１つ又は複数（例えば、１つ）の置換基で置換されていてもよいが、好適には置換されていない。

【0022】

用語「アルキニル」又は「アルキン」は、典型的に、２〜６個、例えば、２〜４個の炭素原子を含む脂肪族結合又は置換基を指し、直鎖又は分岐状のいずれでもよく、少なくとも１つのＣ≡Ｃ部分を含有するという点で、不飽和である。例としては、−Ｃ≡ＣＨ及び−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ₃が挙げられる。アルキニル基は、任意選択で、例えば、ハロゲン（例：Ｃｌ）若しくはエーテル基（例：−Ｏ−Ｃ_1〜6アルキル）などの１つ又は複数（例えば、１つ）の置換基で置換されていてもよいが、好適には置換されていない。

【0023】

用語「シクロアルキル」は、典型的に、３〜８個の環状炭素原子を含む脂環式及び不飽和化合物を指す。炭素原子の総数は、典型的に、３〜１０である。例示的基としては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、３−メチル−シクロプロピル及びシクロヘキシルが挙げられる。

【0024】

用語「シクロアルケニル」は、典型的に、５〜８個の環状炭素原子を含み、かつ少なくとも１つのＣ≡Ｃ部分を含有する脂環式化合物を指す。シクロアルケニル基は、分岐を含んでもよい。

【0025】

炭素原子の総数は、典型的に、５〜１０である。例示的基としては、シクロペンテニル、３−メチル−シクロプロピペニル及びシクロヘキセニルが挙げられる。

【0026】

用語「ヘテロシクリル」は、環が、Ｏ、Ｎ及びＳから選択される１つ又は複数（例：１つ、２つ若しくは３つ、例えば、１つ若しくは２つ、特に１つ）のヘテロ原子を含む、シクロアルキル又はシクロアルケニル部分を指す。例としては、アゼチジン、ピロリジン、ピペリジン、ピペラジン、Ｎ−メチルピペラジン、モルホリン及びチオモルホリンが挙げられる。

【0027】

用語「アリール」は、結合の一部又は置換基の一部であり得る芳香環構造を指す。アリール部分は、１つの環（例えば、フェニル）又は２つの環（例えば、ナフチル）を含んでもよい。アリール基は、例えば、アルキル、アルケニル、アルキニル、フルオロアルキル、ハロゲン、アルコキシ、ニトロ及びシアノから選択される、１つ又は複数（例：１つ若しくは２つ、例えば、１つ）の置換基により、置換されていてもよい。例示的アリールは、フェニルである。

【0028】

用語「ヘテロアリール」は、結合の一部又は置換基の一部であり得るヘテロ芳香環構造を指す。ヘテロ芳香環は、Ｏ、Ｎ及びＳから選択される、１〜４（より一般的には１〜３、例えば、１又は２）個のヘテロ原子を含んでよい。ヘテロアリール部分は、１つの環又は２つの環を含んでよい。１つの６員環を含む基の例としては、ピリジン及びピリミジンが挙げられる。１つの５員環を含む基の例としては、ピロール、フラン、チオフェン、オキサゾール、チアゾール、ジアゾール、チアジアゾール、及びテトラゾールが挙げられる。２つの環を含むヘテロアリールは、１つ若しくは両方の環にヘテロ原子を含んでもよい。例としては、キノリン及びイソキノリンが挙げられる。ヘテロアリール基は、例えば、アルキル、アルケニル、アルキニル、フルオロアルキル、ハロゲン、アルコキシ、ニトロ及びシアノから選択される、１つ又は複数（例：１つ若しくは２つ、例えば、１つ）の置換基により、置換されていてもよい。

【0029】

用語「芳香族ハロゲン化物」は、フッ素、塩化物、臭化物若しくはヨウ素などの少なくとも１つ（例えば、１つ）のハロ基により置換された芳香環（典型的にはフェニル）を指す。前記芳香環は、さらなる置換基、例えば、アリールについて述べたものを含んでもよい。

【0030】

用語「アジド（ａｚｉｄｅ）」及び「アジド（ａｚｉｄｏ）」は、Ｎ＝Ｎ（＋）＝Ｎ（−）官能基を指す。

【0031】

用語「シクロアルキン」は、環構造に捕捉された炭素−炭素三重結合を含む、炭素原子（典型的には、６〜９員、特に８〜９員）の環状構成を指す。例としては、シクロオクチン及びシクロノニチンが挙げられる。別の例として、ベンジンがある。シクロアルキン基は、分岐を含んでもよい。炭素の総数は、典型的に、６〜１２、例えば、６〜１０である。

【0032】

用語「ケトン」は、Ｃ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｃ結合を指す。

【0033】

用語「ピロリシン類似体」は、天然又は遺伝的進化ＰｙｌＲＳのいずれかにより認識されて、タンパク質のアンバーコドン部位に組み込まれたアミノ酸誘導体を意味する。

【0034】

「２０の天然アミノ酸のうちの１つの側鎖」という表現は、その１文字コード：Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ及びＹで知られる２０の天然アミノ酸に関する式：ＨＯＯＣ−ＣＨＲ−ＮＨ₂における、基Ｒを指す。Ｌ又はＤ立体化学のいずれか（又はその混合物）が意図されるが、Ｌ立体化学が好ましい。

【0035】

本発明は、ピロリシン類似体を開示する。

【0036】

本発明の一部のピロリシン類似体は、式Ｉ：

【化1】

（式中、
Ｚ＝結合、ＣＨ₂、ＣＨ−ＮＨ₂、ＣＨ−ＯＨ、ＮＨ、Ｏ、Ｓ又はＣＨ−ＮＨ₂であり；
ａは、３〜７の整数であり；
ｂは、０又は１〜７の整数であり；
ＦＧ＝アジド、アルケン、アルキン、ケトン、エステル、アリール又はシクロアルキン）
の構造を有する。

【0037】

式（Ｉ）のいくつかの化合物が知られている。

【0038】

従って、ａが４、ＺがＯを表し、−（ＣＨ₂）_b−ＦＧが、−ＣＨ₂−Ｃ≡ＣＨ、−ＣＨ₂ＣＨ₂−Ｎ₃、−ＣＨ₂−ＣＨ＝ＣＨ₂及び−ＣＨ₂−Ｐｈを表す、式（Ｉ）の化合物が、国際公開第２０１２／０３２１８１号パンフレットに開示されている。さらに、ａが４、ＺがＯを表し、−（ＣＨ₂）_b−ＦＧが、−ＣＨ₂−ＣＨ₂ＣＨ₂−Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ₃及び−ＣＨ₂ＣＨ₂ＣＨ₂−ＣＨ＝ＣＨ₂を表す、式（Ｉ）の化合物が、国際公開第２０１０／１３９９４８号パンフレットに開示されている。

【0039】

ａが４、Ｚが結合、ｂが０を表し、−（ＣＨ₂）_b−ＦＧが、−Ｃ（＝Ｏ）Ｂｎ及び−Ｃ（＝Ｏ）Ｍｅを表す、式（Ｉ）の化合物が、国際公開第２０１２／０３２１８１号パンフレットに開示されている。さらに、ａが４、Ｚが結合を表し、−（ＣＨ₂）_b−ＦＧが、−ＣＨ₂ＣＨ₂−Ｃ≡ＣＨを表す、式（Ｉ）の化合物が、国際公開第２０１０／１３９９４８号パンフレットに開示されている。

【0040】

本発明の一実施形態では、式Ｉの化合物は、ａ＝４を有し、これにより、一般式ＩＡ：

【化2】

の化合物が得られる。

【0041】

本発明の一実施形態では、式Ｉの化合物は、ａ＝３を有し、これにより、一般式ＩＢ：

【化3】

の化合物が得られる。

【0042】

式Ｉ、ＩＡ及びＩＢの実施形態において、Ｚは結合であり、例えば、Ｚは結合、ｂは０であり、ＦＧは、Ｃ（＝Ｏ）−アリール又はＣ（＝Ｏ）−アルキルである。

【0043】

式Ｉ、ＩＡ及びＩＢの実施形態において、Ｚは、ＣＨ₂、ＣＨ−ＮＨ₂、ＣＨ−ＯＨ、ＮＨ、Ｏ、Ｓ又はＣＨ−ＮＨ₂である。例えば、Ｚは、Ｏであってもよい。あるいは、Ｚは、ＮＨであってもよい。あるいは、Ｚは、ＣＨ₂、ＣＨ−ＮＨ₂、ＣＨ−ＯＨ、Ｓ又はＣＨ−ＮＨ₂であってもよい。

【0044】

一実施形態では、ｂは、１〜４である。

【0045】

一実施形態では、ＦＧは、アジドである。

【0046】

一実施形態では、ＦＧは、アルキン（例えば、エチニル）又はシクロアルキンである。

【0047】

一実施形態では、ＦＧは、アルケン、例えば、エテニルである。

【0048】

式Ｉ、ＩＡ及びＩＢにおいて、ＦＧがアリールを表すとき、一例は、芳香族ハロゲン化物、例えば、４−ヨードフェニルなどの４−ハロフェニルである。

【0049】

式ＩＡの化合物例は、下記のものである。
（２Ｓ）−２−アミノ−６−｛［（２−アジドエトキシ）カルボニル］アミノ｝ヘキサン酸

【化4】

（２Ｓ）−２−アミノ−６−｛［（プロプ−２−イン−１−イルオキシ）カルボニル］アミノ｝ヘキサン酸

【化5】

（２Ｓ）−２−アミノ−６−｛［（プロプ−２−エン−１−イルオキシ）カルボニル］アミノ｝ヘキサン酸

【化6】

（２Ｓ）−２−アミノ−６−｛［（２−アジドエチル）カルバモイル］アミノ｝ヘキサン酸

【化7】

（２Ｓ）−２−アミノ−６−｛［（プロプ−２−エン−１−イル）カルバモイル］アミノ｝ヘキサン酸

【化8】

（２Ｓ）−２−アミノ−６−｛［（３−アジドプロポキシ）カルボニル］アミノ｝ヘキサン酸

【化9】

（２Ｓ）−２−アミノ−６−［（２Ｓ）−２−アミノ−４−アジドブタンアミド］ヘキサン酸

【化10】

（２Ｓ）−２−アミノ−６−（｛［（４−ヨードフェニル）メトキシ］カルボニル｝アミノ）ヘキサン酸

【化11】

（２Ｓ）−２−アミノ−６−（４−アジドブタンアミド）ヘキサン酸

【化12】

【0050】

下記の化合物は、式ＩＢの化合物の例である。
（２Ｓ）−２−アミノ−５−｛［（２−アジドエトキシ）カルボニル］アミノ｝ペンタン酸

【化13】

（２Ｓ）−２−アミノ−５−｛［（プロプ−２−イン−１−イルオキシ）カルボニル］アミノ｝ペンタン酸

【化14】

（２Ｓ）−２−アミノ−５−｛［（プロプ−２−エン−１−イルオキシ）カルボニル］アミノ｝ペンタン酸

【化15】

【0051】

本発明の別のピロリシン類似体は、式ＩＩ：

【化16】

（式中、
Ｚ＝ＣＨ₂、ＣＨ−ＮＨ₂、ＣＨ−ＯＨ、ＮＨ、Ｏ又はＳ；
ＦＧ＝アジド、アルケン、アルキン、ケトン、エステル、アリール又はシクロアルキン；
ａ＝３又は５〜７の整数；及び
ｂ＝１〜４の整数である）
の構造を有する。

【0052】

一実施形態では、ＦＧは、アジドである。一実施形態では、ＦＧは、アルキン（例えば、エチニル）又はシクロアルキンである。一実施形態では、ＦＧは、アルケン、例えば、エテニルである。一実施形態では、Ｚは、ＮＨを表す。一実施形態では、ｂは、１又は２を表す。一実施形態では、Ｚ（ＣＨ₂）_bＦＧは、ＮＨ（ＣＨ₂）₂Ｎ₃又はＮＨＣＨ₂Ｃ≡ＣＨを表す。

【0053】

式ＩＩにおいて、ＦＧがアリールを表すとき、一例は、芳香族ハロゲン化物、例えば、４−ヨードフェニルなどの４−ハロフェニルである。

【0054】

部分Ｚ（ＣＨ₂）_bＦＧは、例えば、ＣＯ−アリール、例えば、ＣＯ−フェニル又は−ＣＯアルキル、例えば、−ＣＯＭｅを表す。

【0055】

本発明のさらに別のピロシリン類似体は、式ＩＩＩ：

【化17】

（式中、
Ｙ＝ＣＨ₂、ＮＨ、Ｏ又はＳ；
Ｚ＝ＣＨ₂、ＣＨ−ＮＨ₂、ＣＨ−ＯＨ、ＮＨ、Ｏ又はＳ；
ＦＧ＝アジド、アルケン、アルキン、ケトン、エステル、アリール又はシクロアルキン；
ａ＝１〜７の整数；
ＺがＮＨ、Ｏ又はＳであるとき、ｂが２〜７の整数である以外は、ｂ＝１〜７の整数であり、ただし、ａ＋ｂは、２〜８の範囲であり；
ｄ＝１〜４の整数）
の構造を有する。

【0056】

一実施形態では、ａ＋ｂは、３〜６、例えば、３〜４の範囲である。

【0057】

一実施形態では、ａは、１である。

【0058】

一実施形態では、ｂは、２である。別の実施形態では、ｂは、３である。

【0059】

一実施形態では、ＦＧは、アジドである。

【0060】

一実施形態では、ＦＧは、アルキン（例えば、エチニル）又はシクロアルキンである。

【0061】

一実施形態では、ＦＧは、アルケン、例えば、エテニルである。

【0062】

式ＩＩＩにおいて、ＦＧがアリールを表すとき、一例は、芳香族ハロゲン化物、例えば、４−ヨードフェニルなどの４−ハロフェニルである。

【0063】

式ＩＩＩの化合物例は、下記のものである。
（２Ｓ）−２−アミノ−３−［（２−｛［（２−アジドエトキシ）カルボニル］アミノ｝エチル）スルファニル］プロパン酸

【化18】

（２Ｓ）−２−アミノ−３−［（２−｛［（プロプ−２−イン−１−イルオキシ）カルボニル］アミノ｝エチル）スルファニル］プロパン酸

【化19】

（２Ｓ）−２−アミノ−３−［（２−｛［（プロプ−２−エン−１−イルオキシ）カルボニル］アミノ｝エチル）スルファニル］プロパン酸

【化20】

（２Ｓ）−２−アミノ−３−［（２−｛［（２−アジドエチル）カルバモイル］アミノ｝エチル）スルファニル］プロパン酸

【化21】

（２Ｓ）−２−アミノ−３−［（２−｛［（プロプ−２−イン−１−イル）カルバモイル］アミノ｝エチル）スルファニル］プロパン酸

【化22】

（２Ｓ）−２−アミノ−３−［（２−｛［（プロプ−２−エン−１−イル）カルバモイル］アミノ｝エチル）スルファニル］プロパン酸

【化23】

（２Ｓ）−２−アミノ−３−［（２−｛［（２−アジドエチル）カルバモイル］オキシ｝エチル）スルファニル］プロパン酸

【化24】

（２Ｓ）−２−アミノ−３−［（２−｛［（プロプ−２−イン−１−イル）カルバモイル］オキシ｝エチル）スルファニル］プロパン酸

【化25】

（２Ｓ）−２−アミノ−３−［（２−｛［（プロプ−２−エン−１−イル）カルバモイル］オキシ｝エチル）スルファニル］プロパン酸

【化26】

（２Ｓ）−２−アミノ−３−（｛３−［（２−アジドエチル）カルバモイル］プロピル｝スルファニル）プロパン酸

【化27】

（２Ｓ）−２−アミノ−３−（｛３−［（プロプ−２−イン−１−イル）カルバモイル］プロピル｝スルファニル）プロパン酸

【化28】

（２Ｓ）−２−アミノ−３−（｛３−［（プロプ−２−エン−１−イル）カルバモイル］プロピル｝スルファニル）プロパン酸

【化29】

（２Ｓ）−２−アミノ−３−（｛３−［（２−アジドエチル）カルバモイル］プロピル｝スルファニル）プロパン酸

【化30】

【0064】

さらにまた別のピロリシン類似体は、式ＩＶ：

【化31】

（式中、
Ｙ＝ＣＨ₂、ＮＨ、Ｏ又はＳ；
Ｚ＝ＣＨ₂、ＣＨ−ＮＨ₂、ＣＨ−ＯＨ、ＮＨ、Ｏ又はＳ；
ＦＧ＝アジド、アルケン、アルキン、ケトン、エステル、アリール又はシクロアルキン；
ａ＝１〜７の整数；
ＺがＮＨ、Ｏ又はＳであるとき、ｂが２〜７の整数である以外は、ｂ＝１〜７の整数であり、ただし、ａ＋ｂは、２〜８の範囲であり、
ｄ＝１〜４の整数）
の構造を有する。

【0065】

一実施形態では、ａ＋ｂは、３〜６、例えば、３〜４の範囲である。

【0066】

一実施形態では、ａは、１である。

【0067】

一実施形態では、ｂは、２である。別の実施形態では、ｂは、３である。

【0068】

一実施形態では、ＹはＮＨで、ＺはＯである。一実施形態では、ＹはＮＨで、ＺはＮＨである。一実施形態では、ＹはＯで、ＺはＯである。一実施形態では、ＹはＣＨ₂で、ＺはＮＨである。

【0069】

一実施形態では、ＦＧは、アジドである。

【0070】

一実施形態では、ＦＧは、アルキン（例えば、エチニル）又はシクロアルキンである。

【0071】

一実施形態では、ＦＧは、アルケン、例えば、エテニルである。

【0072】

式ＩＶにおいて、ＦＧがアリールを表すとき、一例は、芳香族ハロゲン化物、例えば、４−ヨードフェニルなどの４−ハロフェニルである。

【0073】

より一般的には、式ＩＩＩ及びＩＶの化合物は、式Ｘ：

【化32】

（式中、Ｘは、Ｏ又はＳを表し、他の全ての変数は、式ＩＩＩ又はＩＶの化合物について定義した通りである）
の化合物と呼ばれる。

【0074】

式ＩＶの化合物例は、下記のものである。
（２Ｓ）−２−アミノ−３−（２−｛［（２−アジドエトキシ）カルボニル］アミノ｝エトキシ）プロパン酸

【化33】

（２Ｓ）−２−アミノ−３−（２−｛［（プロプ−２−イン−１−イルオキシ）カルボニル］アミノ｝エトキシ）プロパン酸

【化34】

（２Ｓ）−２−アミノ−３−（２−｛［（プロプ−２−エン−１−イルオキシ）カルボニル］アミノ｝エトキシ）プロパン酸

【化35】

（２Ｓ）−２−アミノ−３−（２−｛［（２−アジドエチル）カルバモイル］アミノ｝エトキシ）プロパン酸

【化36】

（２Ｓ）−２−アミノ−３−（２−｛［（プロプ−２−イン−１−イル）カルバモイル］アミノ｝エトキシ）プロパン酸

【化37】

（２Ｓ）−２−アミノ−３−（２−｛［（プロプ−２−エン−１−イル）カルバモイル］アミノ｝エトキシ）プロパン酸

【化38】

（２Ｓ）−２−アミノ−３−（２−｛［（２−アジドエチル）カルバモイル］オキシ｝エトキシ）プロパン酸

【化39】

（２Ｓ）−２−アミノ−３−（２−｛［（プロプ−２−イン−１−イル）カルバモイル］オキシ｝エトキシ）プロパン酸

【化40】

（２Ｓ）−２−アミノ−３−（２−｛［（プロプ−２−エン−１−イル）カルバモイル］オキシ｝エトキシ）プロパン酸

【化41】

（２Ｓ）−２−アミノ−３−｛３−［（２−アジドエチル）カルバモイル］プロポキシ｝プロパン酸

【化42】

（２Ｓ）−２−アミノ−３−｛３−［（プロプ−２−イン−１−イル）カルバモイル］プロポキシ｝プロパン酸

【化43】

（２Ｓ）−２−アミノ−３−｛３−［（プロプ−２−エン−１−イル）カルバモイル］プロポキシ｝プロパン酸

【化44】

【0075】

別のピロリシン類似体は、式Ｖ：

【化45】

（式中、
Ｒ＝２０の天然アミノ酸のうちの１つの側鎖；
Ｚ＝ＣＨ₂、ＣＨ−ＮＨ₂、ＣＨ−ＯＨ、ＮＨ、Ｏ又はＳ；
ＦＧ＝アジド、アルケン、アルキン、ケトン、エステル、アリール又はシクロアルキン；
ａ＝１；及び
ｂ＝１〜４の整数）
の構造を有する。

【0076】

一実施形態では、ＺはＯである。

【0077】

一実施形態では、ＦＧは、アジドである。

【0078】

一実施形態では、ＦＧは、アルキン（例えば、エチニル）又はシクロアルキンである。

【0079】

一実施形態では、ＦＧは、アルケン、例えば、エテニルである。

【0080】

式Ｖにおいて、ＦＧがアリールを表すとき、一例は、芳香族ハロゲン化物、例えば、４−ヨードフェニルなどの４−ハロフェニルである。

【0081】

式Ｖの化合物例は、以下の通りである。
（２Ｓ）−２−アミノ−３−（２−｛［（２−アジドエトキシ）カルボニル］アミノ｝アセトアミド）プロパン酸

【化46】

（２Ｓ）−２−アミノ−３−（２−｛［（プロプ−２−イン−１−イルオキシ）カルボニル］アミノ｝アセトアミド）プロパン酸

【化47】

（２Ｓ）−２−アミノ−３−（２−｛［（プロプ−２−エン−１−イルオキシ）カルボニル］アミノ｝アセトアミド）プロパン酸

【化48】

【0082】

別のピロリシン類似体は、式ＶＩ：

【化49】

（式中、
Ｚ＝ＣＨ₂、ＣＨ−ＮＨ₂、ＣＨ−ＯＨ、ＮＨ、Ｏ又はＳ；
ＦＧ＝アジド、アルケン、アルキン、ケトン、エステル、アリール及びシクロアルキン；
ａ＝４又は５；及び
ｂ＝１〜４の整数）
の構造を有する。

【0083】

一実施形態では、Ｚは、ＮＨである。

【0084】

一実施形態では、ａは、５である。

【0085】

一実施形態では、ＦＧは、アジドである。

【0086】

一実施形態では、ＦＧは、アルキン（例えば、エチニル）又はシクロアルキンである。

【0087】

一実施形態では、ＦＧは、アルケン、例えば、エテニルである。

【0088】

式ＶＩにおいて、ＦＧがアリールを表すとき、一例は、芳香族ハロゲン化物、例えば、４−ヨードフェニルなどの４−ハロフェニルである。

【0089】

以下は、式ＶＩの化合物例である：
（２Ｓ）−２−アミノ−７−［（２−アジドエチル）カルバモイル］ヘプタン酸

【化50】

（２Ｓ）−２−アミノ−７−［（プロプ−２−イン−１−イル）カルバモイル］ヘプタン酸

【化51】

（２Ｓ）−２−アミノ−７−［（プロプ−２−エン−１−イル）カルバモイル］ヘプタン酸

【化52】

【0090】

代替的ピロリシン類似体は、式ＶＩＩ：

【化53】

（式中、
Ｒ＝アルキル、アルケニル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール又はヘテロシクリル；
ａ＝１〜７の整数；及び
ｂ＝１〜３の整数）
の構造を有する。

【0091】

一実施形態では、ａ＝４である。

【0092】

式ＶＩＩの好ましい化合物は、（２Ｓ）−２−アミノ−６−（２−アジドペンタンアミド）ヘキサン酸

【化54】

【0093】

代替的ピロリシン類似体は、式（ＶＩＩＩ）：

【化55】

（式中、
Ｚ＝ＣＨ₂、ＣＨ−ＮＨ₂、ＣＨ−ＯＨ、ＮＨ、Ｏ又はＳ；
Ｒ₁＝Ｈ、アルキル、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アリール、ヘテロアリール又はヘテロシクリル；
Ｒ₂＝アルキル、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アリール、ヘテロアリール又はヘテロシクリル；
Ｒ₃＝Ｈ、アルキル、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アリール、ヘテロアリール又はヘテロシクリル；及び
ａ＝１）
の構造を有する。

【0094】

好適には、Ｒ₁は、Ｈ又はアルキル、例えば、Ｈ又はメチル、特にＨを表す。

【0095】

好適には、Ｒ₃は、Ｈ又はアルキル、例えば、Ｈ又はメチル、特にＨを表す。

【0096】

好適には、Ｚは、Ｏを表す。

【0097】

Ｒ₂は、例えば、Ｃ_3〜4アルケニル、例えば、ＣＨ₂ＣＨ＝ＣＨ₂又はＣ_1〜4アルキル、例えば、ｎ−プロピル若しくはｔ−ブチルであってもよい。

【0098】

式ＶＩＩＩの化合物例は、以下の通りである。
（２Ｓ）−２−アミノ−３−（４−アジド−２−｛［（プロプ−２−エン−１−イルオキシ）カルボニル］アミノ｝ブタンアミド）プロパン酸

【化56】

（２Ｓ）−２−アミノ−３−｛４−アジド−２−［（プロポキシカルボニル）アミノ］ブタンアミド｝プロパン酸

【化57】

（２Ｓ）−２−アミノ−３−｛４−アジド−２−［（ｔ−ブトキシカルボニル）アミノ］ブタンアミド｝プロパン酸

【化58】

【0099】

式Ｉ〜ＶＩ及びＸの構造において、ＦＧがアルケンを表すとき、これは、好適には、−ＣＨ＝ＣＨ₂又は−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ₃、好ましくは−ＣＨ＝ＣＨ₂である。−（ＣＨ₂）_b−ＦＧ及び−（ＣＨ₂）_d−ＦＧの例は、−ＣＨ₂−ＣＨ＝ＣＨ₂及び−ＣＨ₂−ＣＨ₂−ＣＨ＝ＣＨ₂である。

【0100】

式Ｉ〜ＶＩ及びＸの構造において、ＦＧがアルキンを表すとき、これは、好適には、−Ｃ≡ＣＨ又は−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ₃、好ましくは−Ｃ≡ＣＨである。−（ＣＨ₂）_b−ＦＧ及び−（ＣＨ₂）_d−ＦＧの例は、−ＣＨ₂−Ｃ≡ＣＨである。

【0101】

式Ｉ〜ＶＩ及びＸの構造において、ＦＧがケトンを表すとき、これは、好適には、−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ₃又は−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ₂−ＣＨ₃、好ましくは−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ₃である。

【0102】

式Ｉ〜ＶＩ及びＸの構造において、ＦＧがエステルを表すとき、これは、好適には、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏアルキル、例えば、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏメチルである。

【0103】

式Ｉ〜ＶＩ及びＸの構造において、ＦＧがアリールを表すとき、これは、好適には、ハロゲン、特にヨウ素により置換されたフェニル（例えば、４−ヨード−フェニル）である。

【0104】

式Ｉ〜ＶＩ及びＸの構造において、ＦＧがシクロアルキンを表すとき、これは、好適には、シクロオクチン、例えば、シクロオクト−４，５−インである。

【0105】

式Ｉ〜ＶＩ及びＸの構造において、ＦＧがアジドを表すとき、−（ＣＨ₂）_b−ＦＧ又は−（ＣＨ₂）_d−ＦＧの例は、−（ＣＨ₂）₂−Ｎ₃である。

【0106】

式ＶＩＩ及びＶＩＩＩの構造において、Ｒ、Ｒ¹、Ｒ²及びＲ³が、アリールを表すとき、これは、好適には、フェニルである。

【0107】

本明細書に開示するピロリシン類似体は、様々な方法を用いて作製することができる。反応条件は、一般に、当業者が決定することができる。

【0108】

式Ｉ類似体は、活性化カルボニル基、例えば、クロロホルメート、活性化カルボン酸エステル、イソシアネート、活性化炭酸塩又はハロゲン化スルホニルを、１型の単保護ジアミノ基質（αアミノ基が、Ｂｏｃ、Ｃｂｚ、ＴＦＡ、アセチル若しくはＦｍｏｃ基などの保護基（「ＰＧ」）により保護されている）に添加することにより、容易に調製される（スキーム１を参照）。所望の官能性を設置するために、結合生成物３を、アジド求核基によるハロゲン化物の置換などのさらなる修飾に付してもよい。そうでなければ、中間物３を脱保護して、αアミノ酸マスク基を除去することにより、所望の式１類似体を取得する。

【0109】

【化59】

式ＶＩＩ類似体は、最初に、所望のαアジド前駆体を調製することにより、容易に作製される。これを達成するための１つの戦略は、ハロゲン化物（Ｃｌ、Ｂｒ、若しくはＩ）又はスルホン酸アルキル（トシレート、メシレート、トリフレート）などの脱離基（ＬＧ）をアジ化ナトリウムで置換することにより、αアジド酸６を得る。次に、これを、ＨＢＴＵ、ＤＣＣ及びＮＨＳ若しくはＣＤＩなどの基でカルボン酸を活性化することにより、７型の単保護ジアミノ基質とカップリングすることができる。αアミノ基をマスクする保護基を除去することにより、生成物８が得られる。保護基は、スキーム１に従って使用してよい。スキーム２を参照されたい。

【化60】

【0110】

ヒドロキシルアミノ酸９と、カルボン酸エステルなどの活性化カルボニル、イソシアネート、酸塩化物、活性化炭酸塩又はハロゲン化スルホニルを含む基質１０との結合により、式ＩＩ類似体を調製した。結合生成物１１は、ハロゲン化物又は活性化アルコールなどの脱離基の置換によるアジド官能基の設置のようなさらなる修飾に付すことができる。所望のアミノ酸類似体１２は、最終脱保護によってαアミノ酸マスク基を除去することにより、得られる。保護基は、スキーム１に従って使用してよい。スキーム３を参照されたい。

【化61】

【0111】

チオエーテル結合を含む式ＩＩＩ類似体は、基本的なＳ−アルキル化ステップにより容易に調製される。システインなどのチオアミノ酸１３を、所望の官能化アルキル化剤１４で処理することにより、Ｓ−アルキル化に影響を与える。次に、さらなる官能化を実施して、アミノ酸をその最終形態に固定する（例えば、アジド基の設置）。必要に応じた最終脱保護により、所望のアミノ酸１６が現れる。保護基は、スキーム１に従って使用してよい。
スキーム４を参照されたい。

【化62】

【0112】

式ＩＶ類似体は、エーテル結合がヒドロキシルアルキル化によって調製される、システイン類似体と類似の様式で調製することができる。セレンなどの保護ヒドロキシルアミノ酸１７をアルキル化剤１８で処理して、Ｏ−アルキル化に影響を与える。次に、さらなる官能化を実施して、アミノ酸をその最終形態に固定する（例えば、アジド基の設置）。必要に応じた最終脱保護により、所望のアミノ酸２０が現れる。保護基は、スキーム１に従って使用してよい。スキーム５を参照されたい。

【化63】

【0113】

式Ｖ類似体は、単保護ジアミノ誘導体２４との基本的なペプチドカップリングにより、簡単に調製される。この方法は、α又はβアミノ酸などの二官能性アミン２１と、カルボン酸エステルなどの活性化カルボニル、イソシアネート、酸塩化物、活性化炭酸塩又はハロゲン化スルホニルとのカップリングによって中間物２３を得ることにより、開始する。次に、２３のカルボン酸を、ＨＢＴＵ、ＤＣＣ及びＮＨＳ若しくはＣＤＩなどの試薬又はこれらの組み合わせで活性化した後、これを用いて、ジアミノプロピオン酸などの単保護ジアミン２４をアシル化することにより、ペプチド２５を得る。中間物２５を脱保護するか、又はさらに官能化（例えば、アジド化）した直後に脱保護するかのいずれかによって、所望のアミノ酸２６を得る。保護基は、スキーム１に従って使用してよい。スキーム６を参照されたい。

【化64】

【0114】

式ＶＩ類似体は、グリシン同等物のα中心のアルキル化により調製することができる。この配列では、アセトアミドマロン酸ジエチルなどの保護グリシン同等物２７をグリシン誘導体のα位置でアルキル化を実施するために、塩基性条件下で、２８のようなアルキル化剤で処理する。続いて、酸性又は塩基性条件下での脱保護により、所望のアミノ酸３０が得られる。

【化65】

【0115】

アジドホモアラニン誘導体を２４などの二官能性アミンの側鎖アミンとカップリングすることにより、式ＶＩＩＩ類似体を調製した。この工程は、中間物３３を得るための、アジドホモアラニン３１と、カルボン酸エステルなどの活性化カルボニル、イソシアネート、酸塩化物、活性化炭酸塩又はハロゲン化スルホニルとのカップリングによって開始する。次に、カルボン酸３３を、ＨＢＴＵ、ＤＣＣ及びＮＨＳ若しくはＣＤＩなどの試薬又はこれらの組み合わせで活性化した後、これを用いて、ジアミノプロピオン酸などの単保護ジアミン２４をアシル化することにより、ペプチド３４を得る。中間物３４を脱保護して、３５を得る。保護基は、スキーム１に従って使用してよい。スキーム８を参照されたい。

【化66】

【0116】

タンパク質への非天然アミノ酸の組み込み
本明細書に開示するピロリシン類似体は、組み換えタンパク質に組み込むことができる。特に、組み換えタンパク質への類似体の部位特異的組み込みは、アンバー抑制によって達成することができ、この場合、ナンセンス（アンバー）コドンを、組み換えタンパク質コード化ヌクレオチド配列内のピロリシン類似体を挿入しようとする部位に挿入する。突然変異したヌクレオチド配列を、ＰｙｌＲＳ及びｔＲＮＡｐｙｌをコード化する１つ又は複数のプラスミドと一緒に、無細胞発現系の細胞に挿入する。

【0117】

宿主細胞は、前述したようにＤＮＡ構築物を含むベクターで形質転換した真核細胞株であってもよい。

【0118】

あるいは、宿主細胞から得られる合成反応溶解物が、ポリペプチドの合成に必要な少なくとも１つの成分を含む、無細胞発現系が提供される。上記合成反応溶解物は、細菌又は真核細胞から得られる。

【0119】

好ましくは、合成反応溶解物は、真核細胞、より好ましくは、ウサギ網状赤血球細胞又は麦芽から得られる。

【0120】

好ましくは、無細胞発現系は、本発明のＷＴ ＰｙｌＲＳ及びｔＲＮＡｐｙｌを発現することができ、この場合、本発明のＤＮＡ構築物を含む合成反応溶解物を得るために用いられる細胞に、ｔＲＮＡｐｙｌを導入する。

【0121】

本発明で使用するのに好適な無細胞発現系は、例えば、国際公開第２０１００８１１０号パンフレット、同第２０１００８１１１１号パンフレット、同第２０１００８３１４８号パンフレットに記載されており、これらの文献は、その全体を参照により本明細書に組み込む。

【0122】

ピロリシン類似体を無細胞発現系に添加する場合、前記類似体を組み換えタンパク質内の指定位置に組み込む。ｎｎＡＡとｔＲＮＡｐｙｌをｐｙｌＲＳにより結合した後、ｔＲＮＡｐｙｌをｎｎＡＡでアミノアシル化する。アンバーアンチコドンを含有するこのｔＲＮＡｐｙｌが、細胞質ゾル中に放出されると、そこで、アンバー終止コドンに応答して、リボソームと相互作用することができ、ｎｎＡＡが放出されて、成長するポリペプチド鎖とのペプチド結合を形成する。

【0123】

本発明のピロリシン類似体を組み込むように修飾された組み換えタンパク質は、部位特異的翻訳後修飾を受けやすいあらゆる組み換えタンパク質、例えば、治療用タンパク質、例えば、サイトカイン、抗体及び抗体誘導体（Ｆａｂ断片、又は一本鎖抗体、例えば、一本鎖可変断片（ｓｃｆｖ）など）、ペプチド、酵素、融合タンパク質、デコイ受容体、タンパク質ワクチン、タンパク質ホルモン、例えば、インスリン、成長因子、（例えば、ヒト成長ホルモン、ｈＧＨ、ｈＧＣＳＦ、ｈＦＳＨ、ｈＨＣＧ）を含む。本発明のピロリシン類似体で修飾可能な別のタンパク質としては、診断標識、イメージング試薬がある。

【0124】

好適には、タンパク質を部位特異的に修飾して、本発明の１つ又は複数のｎｎＡＡ（ピロリシン類似体）を組み込むこともできる。例えば、抗体は、重鎖、若しくは軽鎖、又は軽鎖及び重鎖の両方に本発明のｎｎＡＡを組み込み得る。

【0125】

非天然アミノ酸とタンパク質の部位特異的結合
本発明のピロリシン類似体を組み込んだタンパク質を、官能化タンパク質コンジュゲートの調製に用いてもよい。非天然アミノ酸を組み込んだタンパク質と結合することができる分子としては、（ｉ）他のタンパク質、例えば、抗体、特にモノクローナル抗体；（ｉｉ）ポリマー、例えば、当該系に半減期延長をもたらし得るＰＥＧ基又は他の基；（ｉｖ）細胞傷害性薬剤、例えば、オーリスタチン（Ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ）Ｆ；並びに（ｖ）薬物部分、例えば、ドキソルビシン及び放射性同位体含有部分が挙げられる。さらに、これらの修飾タンパク質は、上記の効力のある化合物の標的化送達のために薬物又はヌクレオチドと結合することができる。

【0126】

特定の実施形態について、以下の抗体薬剤コンジュゲートの説明でさらに詳細に記述する。

【0127】

ピロリシン類似体は、好都合なことに、他のアミノ酸との副作用のリスクなしに、標的化された様式での結合を可能にするユニークな化学基を含有し得る。例えば、非天然アミノ酸は、アジド又はアルキン基を含有してもよく、これにより、ヒュスゲン１，３−双極子環状付加反応を用いて、対応するアルキン又はアジド基を含有する、結合させようとする分子との反応が可能になる。

【0128】

本発明の好ましい結合化学は、天然の２０のアミノ酸に対して直交性の反応を含む。こうした反応は、天然の２０のアミノ酸と相互作用しないか、又はこれらとの副反応を引き起こさず、反応に伴う官能基に特異的である。好適には、本発明のピロリシン類似体を用いて、必要な官能基を標的タンパク質に組み込む。

【0129】

さらに、タンパク質に対して破壊的でない、条件、例えば、タンパク質に対して許容可能で、かつその溶解度を維持するｐＨ範囲を有する水性溶媒、タンパク質に有害な作用をもたらさない温度で、前記反応を進行させる。

【0130】

タンパク質とリンカーとの結合部分の安定性を高めることも有利となりうる。従来の方法は、マレイミドとの反応によりシステインのチオール基と結合させて、チオールエーテルを形成する。チオールエーテルを逆反応に付して、抗体からリンカー薬物誘導体を放出させることもできる。本発明の一実施形態では、アジドとアルキンとの間で使用される結合化学によって、芳香族トリアゾールが形成されるが、これは、有意に安定しており、可逆性を被りにくい。

【0131】

さらに、反応の産物、タンパク質とペイロード同士の結合は、安定している、すなわち、従来の結合（アミド、チオールエーテル）に関連する安定性と等しいか、それより高くなければならない。結合に対する障害ではないが、結合反応を天然条件下で実施することができれば、余分な再生プロセシングステップが排除されることから、多くの場合、有利である。

【0132】

本発明のコンジュゲートの生成のための好ましい化学結合としては、以下のものが挙げられる：３＋２アルキン−アジド環状付加；３＋２双極子環状付加；ヒュスゲン３＋２環状付加；銅促進アジド−アルキン環状付加（ＣｕＡＡＣ）；ルテニウム促進アジドアルキン環状付加（ＲＡＡＣ）；金属促進アジドアルキン環状付加（ＭＡＡＣ）；歪促進アジドアルキン環状付加（ＳＰＡＡＣ）；パラジウムを用いたカップリング、例えば、ヘック（Ｈｅｃｋ）反応、薗頭（Ｓｏｎｏｇａｓｈｉｒａ）反応、鈴木（Ｓｕｚｕｋｉ）反応、スティル（Ｓｔｉｌｌｅ）カップリング、檜山／デンマーク（Ｈｉｙａｍａ／Ｄｅｎｍａｒｋ）反応、オレフィンメタセシス、ディールス・アルダー（Ｄｉｅｌｓ−ａｌｄｅｒ）反応、ヒドラジン、ヒドラジド、アルコキシアミン又はヒドロキシルアミンとのカルボニル縮合；ニトリル及びニトリルオキシドとの歪促進環状付加；電子促進環状付加；断片放出（ｆｒａｇｍｅｎｔ ｅｘｔｒｕｓｉｏｎ）環状付加；アルケン環状付加とこれに続くｂ−脱離反応。

【0133】

１つの好ましい実施形態によれば、組み込まれたアミノ酸は、アジド又はアルキン基を含有し、化学修飾の方法は、前記アジド又はアルキン基を、アルキン又はアジド基を含む試薬と反応させるステップを含む。考慮される反応は、トリアゾール結合の生成をもたらすヒュスゲン１，３−双極子環状付加反応である。アルキン又はアジド基を含む試薬は、タンパク質（例えば、抗体）、又は細胞傷害性薬剤、又は任意選択でリンカーを介してアルキン又はアジド基を担持し、半減期の延長に好適な薬物若しくは物質（例えば、ＰＥＧ基）であってよい。

【0134】

組み込まれたｎｎＡＡと標的ペイロードとの部位特異的結合は、抗体、抗体断片、及びサイトカインなどの完全に折り畳まれたタンパク質を用いて実施することができる。あるいは、この結合は、ドデシル硫酸ナトリウム及び尿素などの変性剤の存在下で、変性タンパク質に対して実施してもよい。銅触媒アジドアルキン添加は、変性剤と、ジチオトレイトール及び２−メルカプトエタノールなどの還元剤の存在下で実施することができる。

【0135】

２つ以上のｎｎＡＡが、標的タンパク質（例えば、抗体）に組み込まれる場合、化学修飾は、同じでも異なっていてもよい。例えば、２つのｎｎＡＡが組み込まれる場合、一方を薬物部分に結合するように修飾し、他方をＰＥＧ部分に結合するように修飾してもよい。

【0136】

好都合なことには、異なるが相補的な反応基を担持する本発明の２つ以上のｎｎＡＡを組み込むと、前記ｎｎＡＡは、互いに反応して、分子内リンクを生成することができる。

【0137】

一実施形態では、抗体薬物コンジュゲートを調製するために、本発明の結合化学を用いる。また、抗体−タンパク質コンジュゲート、タンパク質タンパク質コンジュゲート、例えば、抗体断片から成る二重特異的コンジュゲートなどを構築するために、結合化学を用いてもよい。さらに、結合化学は、薬物動態学的特性を操作する目的で、ＰＥＧなどのポリマーをタンパク質と結合させるのに用いてもよい。

【0138】

ＰＥＧ部分
標的タンパク質をＰＥＧ部分に結合してもよい。ＰＥＧ部分を抗体薬物コンジュゲートに組み込んでもよい。ＰＥＧ部分は、典型的に、５ｋＤａ〜４０ｋＤａの分子量を有し得る。より好ましくは、ＰＥＧ部分は、約２０ｋＤａの分子量を有し得る。ＰＥＧ部分は直鎖でも、分岐していてもよい。

【0139】

抗体薬剤コンジュゲート（ＡＤＣ）
本発明のピロリシン類似体は、均質性である抗体薬物コンジュゲート（所与の薬物、典型的には、細胞傷害性薬物、あるいは、タンパク質若しくはＰＥＧ基に、合成リンカーにより共有結合された組換え抗体）の製造に特に有用であり、抗体当たりの薬物（又は他の結合された分子）の数及び抗体に対するこれら薬物の位置は明確に制御されており、これによって、組み込まれた非天然アミノ酸を含有するモノクローナル抗体が得られ、直交性化学により、薬物部分（又は他の結合された分子）を担持するリンカーに部位特異的に結合される。

【0140】

本発明のピロリシン類似体を用いて得られるＡＤＣは、下記の方法に従って製造することができ、この方法は、以下：
１．完全長抗体をコードするＤＮＡ配列を担持する１つ又は複数のプラスミドを安定した細胞株に導入することにより、終止コドンを上記配列内の特定の位置に導入するステップ、
２．所望の位置に設定されたピロリシン類似体（ｎｎＡＡ）を含む修飾抗体を精製するステップ、
３．抗体に設定されたｎｎＡＡに相補的な官能基を含むように修飾された細胞毒−リンカー誘導体を、直交性化学により、相補的反応基を含有する修飾抗体と反応させるステップ、
４．得られたＡＤＣを精製するステップ
を含む。

【0141】

従って、本発明は、抗体成分が、所望の位置にユニークな反応性官能基を担持する非天然アミノ酸を組み込むように修飾され、これにより、前記官能基が薬物部分（又はタンパク質若しくはＰＥＧ基）との結合を可能にするＡＤＣも提供する。

【0142】

一実施形態では、本発明は、タンパク質、薬物及びＰＥＧ部分から選択される１つ又は複数（例えば、１つ、２つ、３つ若しくは４つ、好ましくは１つ若しくは２つ、特に１つ）の部分と、トリアゾール部分を含むリンカーによって結合された抗Ｈｅｒ−２抗体を含む抗体コンジュゲートを提供する。

【0143】

特に、トリアゾール部分は、抗Ｈｅｒ−２抗体の配列に組み込まれた非天然アミノ酸の側鎖のアジド又はアルキン部分と、タンパク質、薬物若しくはＰＥＧ部分に結合したアルキン又はアジド部分との反応により形成することができる。

【0144】

一実施形態において、トリアゾール部分は、抗Ｈｅｒ−２抗体の配列に組み込まれた非天然アミノ酸の側鎖のアジド又はアルキン部分と、タンパク質、薬物若しくはＰＥＧ部分に結合したアルキン又はアジド部分との、銅（Ｉ）触媒作用の条件下での反応により形成される。

【0145】

一実施形態では、銅アジドアルキン環状付加を結合に用いる。好適には、この反応には、末端アルキンを担持するオーリスタチン、アマニチン、タキソール又はドキソルビシンなどの細胞傷害性薬剤を使用する。さらに、この反応では、硫酸銅、酢酸銅、ヨウ化銅若しくは臭化銅などの銅供給源；アスコルビン酸ナトリウム、ヒドラジン、ヒドロキシルアミン、亜硫酸水素ナトリウム、ジチオトレイトール、システイン、ｂ−メルカプトエタノールなどの還元剤；トリス［（１−ベンジル−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）メチル］アミン（ＴＢＴＡ）又はトリス（３−ヒドロキシプロピルトリアゾリルメチル）アミン（ＴＨＰＴＡ）などの銅キレートリガンドを使用する。好適には、上記反応は、４〜５０℃で実施する。好適には、反応時間は、０．５〜４８時間の範囲である。別の実施形態では、歪促進アジドアルキン環状付加を結合に用いる。好適には、この反応には、色素、ＰＥＧポリマー、又は細胞傷害性薬剤、例えば、シクロオクチン基を担持するオーリスタチンを使用する。好適には、反応は、室温で０．５〜４８時間にわたってインキュベートさせる。

【0146】

塩
本明細書に記載するピロリシン類似体は、任意選択で、塩の形態で使用してもよい。こうした塩のいずれも本発明の態様を形成する。カルボン酸の塩は、第１族金属及び第２族金属を用いて形成される塩、特にナトリウム及びカリウム塩などの可溶性塩を含み得る。アミンの塩は、ＨＣｌ、ＨＢｒ又は酢酸などの弱酸及び強酸で形成された塩を含み得る。

【0147】

本発明の実施形態
本発明の実施形態は、以下のように表される：
１．式Ｉ：

【化67】

（式中、
Ｚ＝結合、ＣＨ₂、ＣＨ−ＮＨ₂、ＣＨ−ＯＨ、ＮＨ、Ｏ、Ｓ又はＣＨ−ＮＨ₂；
ａは、３〜７の整数であり；
ｂは、０又は１〜７の整数であり；及び
ＦＧ＝アジド、アルケン、アルキン、ケトン、エステル、アリール又はシクロアルキン）
のピロリシン類似体。

【0148】

２．ａが３である、実施形態１に記載のピロリシン類似体。

【0149】

３．ａが４である、実施形態１に記載のピロリシン類似体。

【0150】

４．以下：

【化68】

から選択される、実施形態３に記載のピロリシン類似体。

【0151】

５．以下：

【化69】

から選択される、実施形態２に記載のピロリシン類似体。

【0152】

６．式ＩＩ：

【化70】

（式中、
Ｚ＝ＣＨ₂、ＣＨ−ＮＨ₂、ＣＨ−ＯＨ、ＮＨ、Ｏ又はＳ；
ＦＧ＝アジド、アルケン、アルキン、ケトン、エステル、アリール又はシクロアルキン；
ａ＝３又は５〜７の整数；及び
ｂ＝１〜４の整数）
のピロリシン類似体。

【0153】

７．式ＩＩＩ：

【化71】

（式中、
Ｙ＝ＣＨ₂、ＮＨ、Ｏ又はＳ；
Ｚ＝ＣＨ₂、ＣＨ−ＮＨ₂、ＣＨ−ＯＨ、ＮＨ、Ｏ又はＳ；
ＦＧ＝アジド、アルケン、アルキン、ケトン、エステル、アリール又はシクロアルキン；
ａ＝１〜７の整数；
ＺがＮＨ、Ｏ又はＳであるとき、ｂが２〜７の整数である以外は、ｂ＝１〜７の整数であり、ただし、ａ＋ｂは、２〜８の範囲であり、
及びｄ＝１〜４の整数）
のピロリシン類似体。

【0154】

８．以下：

【化72】

【化73】

【化74】

から選択される、実施形態７に記載のピロリシン類似体。

【0155】

９．式ＩＶ：

【化75】

（式中、
Ｙ＝ＣＨ₂、ＮＨ、Ｏ又はＳ；
Ｚ＝ＣＨ₂、ＣＨ−ＮＨ₂、ＣＨ−ＯＨ、ＮＨ、Ｏ又はＳ；
ＦＧ＝アジド、アルケン、アルキン、ケトン、エステル、アリール又はシクロアルキン；
ａ＝１〜７の整数；
ＺがＮＨ、Ｏ又はＳであるとき、ｂが２〜７の整数である以外は、ｂ＝１〜７の整数であり、ただし、ａ＋ｂは、２〜８の範囲であり、
及び
ｄ＝１〜４の整数）
のピロリシン類似体。

【0156】

１０．以下：

【化76】

【化77】

【化78】

から選択される、実施形態９に記載のピロリシン類似体。

【0157】

１１．式Ｖ：

【化79】

（式中、
Ｒ＝２０の天然アミノ酸のうちの１つの側鎖；
Ｚ＝ＣＨ₂、ＣＨ−ＮＨ₂、ＣＨ−ＯＨ、ＮＨ、Ｏ又はＳ；
ＦＧ＝アジド、アルケン、アルキン、ケトン、エステル、アリール又はシクロアルキン；
ａ＝１；及び
ｂ＝１〜４の整数）
のピロリシン類似体。

【0158】

１２．以下：

【化80】

から選択される、実施形態１１に記載のピロリシン類似体。

【0159】

１３．式ＶＩ：

【化81】

（式中、
Ｚ＝ＣＨ₂、ＣＨ−ＮＨ₂、ＣＨ−ＯＨ、ＮＨ、Ｏ又はＳ；
ＦＧ＝アジド、アルケン、アルキン、ケトン、エステル、アリール又はシクロアルキン；
ａ＝４又は５；及び
ｂ＝１〜４の整数）
のピロリシン類似体。

【0160】

１４．以下：
式ＶＩ．１

【化82】

から選択される、実施形態１３に記載のピロリシン類似体。

【0161】

１５．式ＶＩＩ：

【化83】

（式中、
Ｒ＝アルキル、アルケニル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール又はヘテロシクリル；
ａ＝１〜７の整数；及び
ｂ＝１〜３の整数）
のピロリシン類似体。

【0162】

１６．

【化84】

である、実施形態１５に記載のピロリシン類似体。

【0163】

１７．式ＶＩＩＩ：

【化85】

（式中、
Ｚ＝ＣＨ₂、ＣＨ−ＮＨ₂、ＣＨ−ＯＨ、ＮＨ、Ｏ又はＳ；
Ｒ₁＝Ｈ、アルキル、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アリール、ヘテロアリール又はヘテロシクリル；
Ｒ₂＝アルキル、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アリール、ヘテロアリール又はヘテロシクリル；
Ｒ₃＝Ｈ、アルキル、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アリール、ヘテロアリール又はヘテロシクリル；及び
ａ＝１）
のピロリシン類似体。

【0164】

１８．以下：

【化86】

から選択される、実施形態１７に記載のピロリシン類似体。

【0165】

１９．非天然アミノ酸として、実施形態１〜１８のいずれか１つに記載の１つ又は複数のピロリシン類似体を含む、突然変異体タンパク質。

【0166】

２０．非天然アミノ酸として、実施形態１〜１８のいずれか１つに記載の１つのピロリシン類似体を含む、実施形態１９に記載の突然変異体タンパク質。

【0167】

２１．非天然アミノ酸を介して、タンパク質、細胞傷害性薬剤、薬物及びポリマーから選択される１つ又は複数の部分と結合される、実施形態１９又は実施形態２０に記載の突然変異体タンパク質。

【0168】

２２．ＰＥＧ部分に結合される、実施形態２１に記載の突然変異体タンパク質。

【0169】

２３．抗体部分に結合される、実施形態２１に記載の突然変異体タンパク質。

【0170】

２４．細胞傷害性薬剤部分に結合される、実施形態２１に記載の突然変異体タンパク質。

【0171】

２５．薬物部分に結合される、実施形態２１に記載の突然変異体タンパク質。

【0172】

２６．１つ又は複数の非天然アミノ酸を含む突然変異体タンパク質の製造における、実施形態１〜１８のいずれか１つに記載の１つのピロリシン類似体の使用。

【実施例】

【0173】

実施例１．式Ｉ及びＩＢ類似体の製造
（２Ｓ）−２−アミノ−６−［（２Ｓ）−２−アミノ−４−アジドブタンアミド］ヘキサン酸（式ＩＡ．７）の調製。マグネチックスターラを備えた２０ｍＬバイアル中に、４ｍＬのＤＭＦ中のＮ−Ｂｏｃ−アジドホモアラニン（２００ｍｇ、１当量）及びＨＢＴＵ（３１１ｍｇ、１当量）を導入した。混合物を１５分間攪拌してから、ＤＭＦ（３ｍＬ）中の溶液Ｎ−Ｂｏｃ−リシン（２３５ｍｇ、１当量）、続いてトリエチルアミン（２２８ｕＬ）を添加した。バイアルにキャップをして、４時間攪拌した。混合物を２５０ｍＭクエン酸及び酢酸エチルの間で分配した。有機層を保持し、水層を酢酸エチルでさらに２回抽出した。有機層を合わせて、硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過し、濃縮した。質量分析により、所望の中間物の形成が判明した。シリカゲルクロマトグラフィーによって、さらなる精製を実施した。

【0174】

Ｂｏｃ保護中間物を２０ｍＬバイアルに導入し、アセトニトリル（４ｍＬ）に懸濁させた。これに、ジオキサン（４Ｎ、４ｍＬ）中の塩酸の溶液を添加した。溶液を２時間攪拌した後、減圧下で濃縮した。混合物を凍結乾燥した。イオン交換樹脂（Ｄｏｗｅｘ−５０）でさらに精製することにより、所望のアミノ酸が得られた。質量分析により、生成物を確認した。

【0175】

（２Ｓ）−２−アミノ−６−｛［（２−アジドエチル）カルバモイル］アミノ｝ヘキサン酸（式ＩＡ．４）の調製。マグネチックスターラを備えた４ｍＬバイアル中に、Ｂｏｃ−Ｎ−６−リシン（５０ｍｇ、１当量）及びＤＭＦ（１ｍＬ）を導入した。これに、２−クロロエチルイソシアネート（１７．３ｍｇ、１．０当量）及びピリジン（３２．３ｕＬ、２当量）を添加した。バイアルにキャップをして、４時間攪拌した。溶液を抽出漏斗に移し、酢酸エチル及び１００ｍＭクエン酸で抽出した。混合物を振盪させ、各層を分離した。水層を酢酸エチルでさらに２回抽出した。有機層を合わせて、５％塩化リチウムで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過し、濃縮した。質量分析により、生成物を同定し、次のステップに直接供した。

【0176】

マグネチックスターラを備えた４ｍＬバイアル中に、粗クロロ誘導体及びＤＭＳＯ（１ｍＬ）を導入した。アジ化ナトリウム（１３０ｍｇ、５当量）及びピリジン（３２．３ｕＬ、２当量）を混合物に添加し、バイアルにキャップをした。混合物を６０℃で一晩攪拌した。溶液を抽出漏斗に移してから、１００ｍＭクエン酸及び酢酸エチルで希釈した。混合物を振盪させ、各層を分離した。水層を酢酸エチルでさらに２回抽出した。有機層を合わせて、５％塩化リチウムで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過し、濃縮した。質量分析により、中間物を同定し、次のステップに移った。

【0177】

２０ｍＬバイアル中に、粗生成物とアセトニトリル（２ｍＬ）を導入した。これに、ジオキサン（４Ｎ、２ｍＬ）中の塩酸の溶液を添加した。溶液を２時間攪拌した後、減圧下で濃縮した。混合物を半固体まで凍結乾燥した後、翻訳試験に使用した。生成物を質量分析により確認した。

【0178】

（２Ｓ）−２−アミノ−６−｛［（プロプ−２−エン−１−イル）カルバモイル］アミノ｝ヘキサン酸（式ＩＡ．５）の調製。マグネチックスターラを備えた４ｍＬバイアル中に、Ｂｏｃ−Ｎ−６−ヒドロキシノルロイシン（５０ｍｇ、１当量）及びＤＭＦ（１．５ｍＬ）を導入した。これに、アリルイソシアネート（１８．０ｕＬ、１．０当量）及びピリジン（３２．３ｕＬ、２当量）を添加した。バイアルにキャップをして、４時間攪拌した。溶液を抽出漏斗に移し、酢酸エチル及び１００ｍＭクエン酸で抽出した。混合物を振盪させ、各層を分離した。水層を酢酸エチルでさらに２回抽出した。有機層を合わせて、５％塩化リチウムで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過し、濃縮した。質量分析により、生成物を同定し、次のステップに直接供した。

【0179】

２０ｍＬバイアル中に、アセトニトリル（２ｍＬ）中の粗ヒドロキシルロイシン−アリルカルバメート誘導体を導入した。これに、ジオキサン（４Ｎ、２．５ｍＬ）中の塩酸の溶液を添加した。溶液を２時間攪拌した後、減圧下で濃縮した。混合物を半固体まで凍結乾燥した後、翻訳試験に使用した。生成物を質量分析により確認した。さらなる精製は、イオン交換樹脂（Ｄｏｗｅｘ−５０）で実施することができた。

【0180】

（２Ｓ）−２−アミノ−５−｛［（２−アジドエトキシ）カルボニル］アミノ｝ペンタン酸（式ＩＢ．１）の調製。マグネチックスターラを備えた２０ｍＬバイアル中に、炭酸カリウム（１Ｍ、２．５ｍＬ）及びジオキサン（２．５ｍＬ）の溶液中のＮ−Ｂｏｃ−オルニチン（５００ｍｇ、１当量）を導入した。２−クロロエチルクロロホルメート（２２３ｕＬ、１当量）を添加し、バイアルにキャップをして、４時間攪拌した。１Ｍクエン酸で混合物をほぼｐＨ２まで酸性化した。溶液を抽出漏斗に移し、酢酸エチルで水層を抽出した（３×）。有機層を合わせて、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮した。ＬＣ／ＭＳにより、大部分の生成物が所望の質量であることを確認した。それ以上の精製はせずに、粗生成物を次のステップに供した。

【0181】

粗塩化物中間物を２０ｍＬバイアル中に導入し、ＤＭＳＯ（１５ｍＬ）に溶解させた。アジ化ナトリウム（６２５ｍｇ、４当量）及びピリジン（１５５ｕＬ）を添加し、バイアルにキャップをしてから、６０℃で一晩攪拌した。混合物を２５０ｍＭクエン酸と一緒に抽出漏斗に注ぎ込み、酢酸エチルで抽出した（３×）。有機層を合わせて、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮した。ＬＣ／ＭＳにより、生成物の形成を確認した。シリカゲルクロマトグラフィーにより、さらなる精製を実施した。

【0182】

２０ｍＬバイアル中に、Ｂｏｃ中間物を導入して、アセトニトリル（４ｍＬ）に懸濁させた。これに、ジオキサン（４Ｎ、４ｍＬ）中の塩酸の溶液を添加した。溶液を２時間攪拌した後、減圧下で濃縮した。濃縮物を水に溶解させてから、イオン交換樹脂（Ｄｏｗｅｘ−５０）に適用した。捕捉物質を水で洗浄してから、炭酸水素アンモニウムで溶出した。アミノ酸を含む濃縮画分をＴＬＣにより同定した後、プールして、凍結乾燥することにより、所望の生成物を得た。生成物を質量分析により確認した。

【0183】

（２Ｓ）−２−アミノ−５−｛［（プロプ−２−エン−１−イルオキシ）カルボニル］アミノ｝ペンタン酸（式ＩＢ．３）の調製。マグネチックスターラを備えた２０ｍＬバイアル中に、炭酸カリウム（１Ｍ、２ｍＬ）及びジオキサン（２ｍＬ）の溶液中のＮ−Ｂｏｃ−オルニチン（３００ｍｇ、１当量）を導入した。クロロギ酸アリル（１３７ｕＬ、１当量）を添加し、バイアルにキャップをして、４時間攪拌した。１Ｍクエン酸で混合物をほぼｐＨ２に酸性化した。溶液を抽出漏斗に移し、酢酸エチルで水層を抽出した（３×）。有機層を合わせて、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮した。ＬＣ／ＭＳにより、大部分の生成物が所望の質量であることを確認した。シリカゲルクロマトグラフィーにより、さらなる精製を実施した。

【0184】

２０ｍＬバイアル中に、Ｂｏｃ中間物を導入して、アセトニトリル（３ｍＬ）に懸濁させた。これに、ジオキサン中の塩酸の溶液（４Ｎ、３ｍＬ）を添加した。溶液を２時間攪拌した後、減圧下で濃縮した。濃縮物を水に溶解させてから、イオン交換樹脂（Ｄｏｗｅｘ−５０）に適用した。捕捉物質を水で洗浄してから、炭酸水素アンモニウムで溶出した。アミノ酸を含む濃縮画分をＴＬＣにより同定した後、プールして、凍結乾燥することにより、所望の生成物を得た。生成物を質量分析により確認した。

【0185】

実施例２．式ＩＩＩの化合物の調製
（２Ｓ）−２−アミノ−３−［（２−｛［（２−アジドエトキシ）カルボニル］アミノ｝エチル）スルファニル］プロパン酸（式ＩＩＩ．１）の調製。マグネチックスターラを備えた４ｍＬバイアル中に、システイン（７５ｍｇ、１当量）及び炭酸ナトリウムの溶液（２．８Ｍ、６２０ｕＬ）を導入した。これに、ＤＭＳＯ（６２０ｕＬ）中の２−クロロエチル−Ｎ−（２−ブロモエチル）カルバメート（９９ｍｇ、１．０当量）を添加した。バイアルにキャップをして、８時間攪拌した。質量分析により、所望のｓ−アルキル化中間物の形成が判明した。中間物質量の確認後、アジ化ナトリウム（１２０ｍｇ）及びＤＭＳＯ（１ｍＬ）を添加し、バイアルに再度キャップをしてから、混合物を６０℃に一晩加熱した。質量分析により、所望の質量の好適な形成が判明した。粗混合物のｐＨを２に調節してから、凍結乾燥して、ペーストを得た。材料を水に懸濁させ、イオン交換樹脂（Ｄｏｗｅｘ−５０）に捕捉させた後、水で洗浄してから、水酸化アンモニウムで溶出した。溶出した画分をプールして、凍結乾燥することにより、所望のアミノ酸を得た。生成物を質量分析により確認した。

【0186】

（２Ｓ）−２−アミノ−３−［（２−｛［（プロプ−２−イン−１−イルオキシ）カルボニル］アミノ｝エチル）スルファニル］プロパン酸（式ＩＩＩ．２）の調製。マグネチックスターラを備えた４ｍＬバイアル中に、システイン（７５ｍｇ、１当量）及び炭酸ナトリウムの溶液（２．８Ｍ、６２０ｕＬ）を導入した。これに、ジオキサン（６２０ｕＬ）中のプロプ−２−イン−１−イルＮ−（２−ブロモエチル）カルバメート（８６ｍｇ、１．０当量）を添加した。バイアルにキャップをして、一晩攪拌した。質量分析により、所望のＳ−アルキル化生成物の形成が判明した。粗混合物のｐＨを２に調節してから、ペースト状に凍結乾燥した。材料を水に懸濁させ、イオン交換樹脂（Ｄｏｗｅｘ−５０）に捕捉させた後、水で洗浄してから、水酸化アンモニウムで溶出した。濃縮画分をプールして、凍結乾燥することにより、所望のアミノ酸を得た。生成物を質量分析により確認した。

【0187】

（２Ｓ）−２−アミノ−３−［（２−｛［（プロプ−２−エン−１−イルオキシ）カルボニル］アミノ｝エチル）スルファニル］プロパン酸（式ＩＩＩ．３）の調製。マグネチックスターラを備えた４ｍＬバイアル中に、システイン（７５ｍｇ、１当量）及び炭酸ナトリウムの溶液（２．８Ｍ、６２０ｕＬ）を導入した。これに、ジオキサン（６２０ｕＬ）中のプロプ−２−エン−１−イルＮ−（２−ブロモエチル）カルバメート（８８ｍｇ、１．０当量）を添加した。バイアルにキャップをして、一晩攪拌した。質量分析により、所望のＳ−アルキル化生成物の形成が判明した。粗混合物のｐＨを２に調節してから、ペースト状に凍結乾燥した。材料を水に懸濁させ、イオン交換樹脂（Ｄｏｗｅｘ−５０）に捕捉させた後、水で洗浄してから、水酸化アンモニウムで溶出した。濃縮画分をプールして、凍結乾燥することにより、所望のアミノ酸を得た。生成物を質量分析により確認した。

【0188】

（２Ｓ）−２−アミノ−３−（｛３−［（２−アジドエチル）カルバモイル］プロピル｝スルファニル）プロパン酸（式ＩＩＩ．３）の調製。マグネチックスターラを備えた２０ｍＬバイアル中に、システイン（７５ｍｇ、１当量）及び炭酸ナトリウムの溶液（１Ｍ、１．７ｍＬ）を導入した。これに、ジオキサン（１．５ｍＬ）中のＮ−（２−アジドエチル）−４−ブロモブタンアミド（８６ｍｇ、１．０当量）を添加した。バイアルにキャップをして、８時間攪拌した。質量分析により、所望のＳ−アルキル化生成物の形成が判明した。粗混合物のｐＨを２に調節し、イオン交換樹脂（Ｄｏｗｅｘ−５０）に適用した後、水で洗浄してから、水酸化アンモニウムで溶出した。ＴＬＣにより同定したアミノ酸を含む画分をプールして、凍結乾燥することにより、所望のアミノ酸を得た。生成物を質量分析により確認した。

【0189】

（２Ｓ）−２−アミノ−３−（｛３−［（プロプ−２−エン−１−イル）カルバモイル］プロピル｝スルファニル）プロパン酸（式ＩＩＩ．１２）の調製。マグネチックスターラを備えた２０ｍＬバイアル中に、システイン（２８５ｍｇ、１当量）及び炭酸ナトリウムの溶液（２．８Ｍ、１．２ｍＬ）を導入した。これに、４−ブロモ−Ｎ−（プロプ−２−エン−１−イル）ブタンアミド（３３３ｍｇ、１．０当量）を添加した。バイアルにキャップをして、一晩攪拌した。質量分析により、所望のｓ−アルキル化生成物の形成が判明した。粗混合物のｐＨを２に調節してから、凍結乾燥して、ペーストを得た。材料を水に懸濁させ、イオン交換樹脂（Ｄｏｗｅｘ−５０）に適用した後、水で洗浄してから、水酸化アンモニウムで溶出した。濃縮画分をプールして、凍結乾燥することにより、所望のアミノ酸を得た。生成物を質量分析により確認した。

【0190】

実施例３．式Ｖの化合物の調製
（２Ｓ）−２−アミノ−３−（２−｛［（２−アジドエトキシ）カルボニル］アミノ｝アセトアミド）プロパン酸（式Ｖ．１）の調製。マグネチックスターラを備えた４ｍＬバイアル中に、１ｍＬのＤＭＦ中の２−｛［（２−クロロエトキシ）カルボニル］アミノ｝酢酸（５０ｍｇ、１当量）及びＨＢＴＵ（１０５ｍｇ、１当量）を導入した。混合物を１５分間攪拌した後、ＤＭＦ（１ｍＬ）中の（２Ｓ）−３−アミノ−２−｛［（ｔｅｒｔ−ブトキシ）カルボニル］アミノ｝プロパン酸（６６ｍｇ、１当量）の溶液、続いてトリエチルアミン（７７ｕＬ）を添加した。バイアルにキャップをして、４時間攪拌した。混合物を２５０ｍＭクエン酸及び酢酸エチルに注ぎ込み、振盪させた。層を分離させて、有機層を保持した。水層を酢酸エチルでさらに２回抽出した。有機層を合わせて、硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過及び濃縮した。質量分析により、所望の生成物の形成を確認した。それ以上の精製はせずに、粗生成物を次のステップに供した。

【0191】

塩化物中間物を２０ｍＬバイアル中に導入し、ＤＭＳＯ（５ｍＬ）に溶解させた。アジ化ナトリウム（７２ｍｇ、４当量）を添加し、バイアルにキャップをしてから、６０℃で一晩攪拌した。混合物を２５０ｍＭクエン酸及び酢酸エチルに注ぎ込み、振盪させた。層を分離させて、有機層を保持した。水層を酢酸エチルでさらに２回抽出した。有機層を合わせて、硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過及び濃縮した。質量分析により、所望の生成物の形成を確認した。シリカゲルクロマトグラフィーにより、さらなる精製を達成することができた。

【0192】

単純な酸性化によりｂｏｃ基を取り出した。２０ｍＬバイアル中に、Ｂｏｃ−アジド中間物を導入して、アセトニトリル（２ｍＬ）に懸濁させた。これに、ジオキサン中の塩酸の溶液（４Ｎ、２ｍＬ）を添加した。溶液を２時間攪拌した後、減圧下で濃縮した。混合物を凍結乾燥して、ペーストを得た。イオン交換樹脂（Ｄｏｗｅｘ−５０）を用いたさらなる精製により、所望のアミノ酸を得た。生成物を質量分析により確認した。

【0193】

（２Ｓ）−２−アミノ−３−（２−｛［（プロプ−エン−１−イルオキシ）カルボニル］アミノ｝アセトアミド）プロパン酸（式Ｖ．３）の調製。マグネチックスターラを備えた４ｍＬバイアル中に、１ｍＬのＤＭＦ中の２−｛［（プロプ−２−エン−１−イルオキシ）カルボニル］アミノ｝酢酸（５０ｍｇ、１当量）及びＨＢＴＵ（１２０ｍｇ、１当量）を導入した。混合物を１５分間攪拌した後、ＤＭＦ（１ｍＬ）中の（２Ｓ）−３−アミノ−２−｛［（ｔｅｒｔ−ブトキシ）カルボニル］アミノ｝プロパン酸（７５ｍｇ、１当量）の溶液、続いてトリエチルアミン（８８ｕＬ）を添加した。バイアルにキャップをして、８時間攪拌した。混合物を２５０ｍＭクエン酸及び酢酸エチルの間で分配した。有機層を保持し、水層を酢酸エチルでさらに２回抽出した。有機層を合わせて、硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過及び濃縮した。質量分析により、所望の生成物の形成を確認した。シリカゲルクロマトグラフィーにより、さらなる精製を達成することができた。

【0194】

Ｂｏｃ保護中間物を２０ｍＬバイアル中に導入し、アセトニトリル（２ｍＬ）に懸濁させた。これに、ジオキサン（４Ｎ、２ｍＬ）中の塩酸の溶液を添加した。溶液を２時間攪拌した後、減圧下で濃縮した。混合物を凍結乾燥して、ペーストを得た。イオン交換樹脂（Ｄｏｗｅｘ−５０）を用いたさらなる精製により、所望のアミノ酸を得た。生成物を質量分析により確認した。

【0195】

（２Ｓ）−２−アミノ−３−（２−｛［（プロプ−２−イン−１−イルオキシ）カルボニル］アミノ｝アセトアミド）プロパン酸（式Ｖ．２）の調製。マグネチックスターラを備えた４ｍＬバイアル中に、１ｍＬのＤＭＦ中の２−｛［（プロプ−２−イン−１−イルオキシ）カルボニル］アミノ｝酢酸（５０ｍｇ、１当量）及びＨＢＴＵ（１２１ｍｇ、１当量）を導入した。混合物を１５分間攪拌した後、ＤＭＦ（１ｍＬ）中の（２Ｓ）−３−アミノ−２−｛［（ｔｅｒｔ−ブトキシ）カルボニル］アミノ｝プロパン酸（７６ｍｇ、１当量）の溶液、続いてトリエチルアミン（８９ｕＬ）を添加した。バイアルにキャップをして、８時間攪拌した。混合物を２５０ｍＭクエン酸及び酢酸エチルの間で分配した。有機層を保持し、水層を酢酸エチルでさらに２回抽出した。有機層を合わせて、硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過及び濃縮した。質量分析により、所望の生成物の形成を確認した。シリカゲルクロマトグラフィーにより、さらなる精製を達成することができた。

【0196】

Ｂｏｃ保護中間物、（２Ｓ）−２−｛［（ｔｅｒｔ−ブトキシ）カルボニル］アミノ｝−３−（２−｛［（プロプ−２−イン−１−イルオキシ）カルボニル］アミノ｝アセトアミド）プロパン酸を２０ｍＬバイアル中に導入し、アセトニトリル（２ｍＬ）に懸濁させた。これに、ジオキサン中の塩酸の溶液（４Ｎ、２ｍＬ）を添加した。溶液を２時間攪拌した後、減圧下で濃縮した。混合物を凍結乾燥して、ペーストを得た。イオン交換樹脂（Ｄｏｗｅｘ−５０）を用いたさらなる精製により、所望のアミノ酸を得た。生成物を質量分析により確認した。

【0197】

実施例４．式ＶＩＩ類似体の調製
（２Ｓ）−２−アミノ−６−（２−アジドペンタンアミド）ヘキサン酸（式ＶＩＩ．１）の調製。マグネチックスターラを備えた２０ｍＬバイアル中に、３ｍＬのＤＭＦ中の２−アジドペンタン酸（１００ｍｇ、１当量）及びＨＢＴＵ（２６６ｍｇ、１当量）を導入した。混合物を１５分間攪拌した後、ＤＭＦ（３ｍＬ）中のＮ−Ｂｏｃ−リシン（２００ｍｇ、１当量）の溶液、続いてトリエチルアミン（１９５ｕＬ）を添加した。バイアルにキャップをして、８時間攪拌した。混合物を２５０ｍＭクエン酸及び酢酸エチルの間で分配した。有機層を保持し、水層を酢酸エチルでさらに２回抽出した。有機層を合わせて、硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過及び濃縮した。質量分析により、所望の中間物の形成を確認した。シリカゲルクロマトグラフィーにより、さらなる精製を実施した。

【0198】

中間物を２０ｍＬバイアル中に導入し、アセトニトリル（２ｍＬ）に懸濁させた。これに、ジオキサン中の塩酸の溶液（４Ｎ、２ｍＬ）を添加した。溶液を２時間攪拌した後、減圧下で濃縮した。混合物を凍結乾燥した。イオン交換樹脂（Ｄｏｗｅｘ−５０）を用いたさらなる精製により、所望のアミノ酸を得た。生成物を質量分析により確認した。

【0199】

実施例５．式ＶＩＩＩ類似体の調製
（２Ｓ）−２−アミノ−３−（４−アジド−２−｛［（プロプ−２−エン−１−イルオキシ）カルボニル］アミノ｝ブタンアミド）プロパン酸（式ＶＩＩＩ．１）の調製。マグネチックスターラを備えた４ｍＬバイアル中に、１ｍＬのＤＭＦ中の（２Ｓ）−３−（４−アジド−２−｛［（プロプ−２−エン−１−イルオキシ）カルボニル］アミノ｝ブタンアミド）−２−｛［（ｔｅｒｔ−ブトキシ）カルボニル］アミノ｝プロパン酸（６５ｍｇ、１当量）及びＨＢＴＵ（１０８ｍｇ、１当量）を導入した。混合物を１５分間攪拌した後、ＤＭＦ（１ｍＬ）中の（２Ｓ）−３−アミノ−２−｛［（ｔｅｒｔ−ブトキシ）カルボニル］アミノ｝プロパン酸（６８ｍｇ、１当量）の溶液、続いてトリエチルアミン（７９ｕＬ）を添加した。バイアルにキャップをして、４時間攪拌した。混合物を２５０ｍＭクエン酸及び酢酸エチルに注ぎ込み、振盪させて、有機層を保持した。水層を酢酸エチルでさらに２回抽出した。有機層を合わせて、硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過及び濃縮した。質量分析により、所望の生成物の形成を確認した。シリカゲルクロマトグラフィーにより、さらなる精製を達成することができた。

【0200】

Ｂｏｃ保護中間物を２０ｍＬバイアル中に導入し、アセトニトリル（２ｍＬ）に懸濁させた。これに、ジオキサン中の塩酸の溶液（４Ｎ、２ｍＬ）を添加した。溶液を２時間攪拌した後、減圧下で濃縮した。混合物を凍結乾燥した。イオン交換樹脂（Ｄｏｗｅｘ−５０）を用いたさらなる精製により、所望のアミノ酸を得た。生成物を質量分析により確認した。

【0201】

実施例６．ＧＦＰアッセイによる翻訳試験
ｐｙｌＲＳ／ｔＲＮＡペアと本発明のピロリシン類似体（ｎｎＡＡ）との適合性及び標的タンパク質へのｎｎＡＡ組み込みの効率を評価するために、ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞アッセイを開発した。このために、ＰｙｌＲＳ（配列番号４）を安定に発現するＨＥＫ２９３細胞を、ｔＲＮＡｐｙｌ（配列番号７）の発現用のプラスミド及びＧＦＰＹ４０をコードするリポータ構築物（アミノ酸残基番号４０（ここで、１は、イニシエータメチオニン）のチロシンの代わりにアンバーコドンを含む）で一時的にトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を２ｍＭのｎｎＡＡと一緒に２〜３日の間インキュベートし、顕微鏡での視覚検査により、ＧＦＰ生成を定量的に分析した。Ａｃｃｕｒｉフローサイトメータを用いたフローサイトメトリーにより、ＧＦＰ蛍光を定量した後、蛍光細胞の幾何平均を決定した。

【0202】

細胞アッセイを用いて、様々なｎｎＡＡが、ｐｙｌＲＳの好適な基質であり、標的タンパク質へのその翻訳を可能にするかどうかを決定した。ＰｙｌＲＳ／ｔＲＮＡｐｙｌペアを発現すると共に、ＧＦＰＹ４０リポータ遺伝子をコードするベクターを含む細胞をｎｎＡＡの存在下でインキュベートした。ＰｙｌＲＳ／ｔＲＮＡｐｙｌペアにより容易に使用されるｎｎＡＡは、ＧＦＰのアンバー部位へのｎｎＡＡの翻訳を支持し、完全長ＧＦＰ（蛍光タンパク質）のリードスルーを可能にする。細胞の蛍光強度は、ｎｎＡＡ組み込みの効率に応じて変動する。従って、あまり使用されないｎｎＡＡは、弱い蛍光又は無蛍光細胞を生成する。顕微鏡観察によって、ｐｙｌＲＳにより使用可能なｎｎＡＡの数を明らかにした（表１、陽性ＧＦＰ）。さらに、各サンプル中の相対的発現を、ｐｙｌＲＳにより効率的に使用されることがわかっている物質により生成されたものと比較した。式１Ａ．１（ＭＦＩ＝９３１，２８９）、式１Ａ．２（ＭＦＩ＝１，６７６，２５０）及び式１Ａ．３（ＭＦＩ＝２，２５０，０００）（表１を参照）は、幾何平均と共に、高レベルのＧＦＰ発現を支持した。

【0203】

本発明者らにより、本発明の式ＩＡ．４、ＩＡ．５、ＩＩＩ．１、ＩＩＩ．２、ＩＩＩ．３、ＩＩＩ．１２、ＩＩＩ．１３、Ｖ．１、Ｖ．２、Ｖ．３、ＶＩＩ．１の類似体は、ＧＦＰリポータ遺伝子に組み込まれて、使用した実験条件下で緑色細胞をもたらすことがみいだされた。これらの中でも、類似体式ＩＩＩ．１（ＭＦＩ＝１，９８９，７５０）、式ＩＩＩ．２（ＭＦＩ＝１，８４７，２５０）及び式ＩＩＩ．３（ＭＦＩ＝２，１８７，０００）（表２を参照）は、高レベルのＧＦＰ発現を支持したことから、使用した実験条件下でｐｙｌＲＳ／ｔＲＮＡペアにより効率的に使用される類似体を表している。

【0204】

【表1】

【0205】

【表2】

【0206】

【表3】

【0207】

【表4】

【0208】

【表5】

【0209】

実施例７．抗体へのピロリシン類似体の部位特異的挿入並びにピロリシン類似体残基を含む抗Ｈｅｒ２抗体の結合構築及び発現
２つの非天然アミノ酸（各重鎖に１つ）を含む完全長抗Ｈｅｒ２抗体（４Ｄ５−２ＡＺ抗体）（配列番号１５）を哺乳動物細胞に発現させた。Ｋ２７４位でアンバー部位をコード化するＨｅｒ２抗体（配列番号１４）を安定に発現すると共に、ｐｙｌＲＳ／ｔＲＮＡペアを発現するＣＨＯ細胞を式ＩＩＩ．１及び式１Ａ．１のｎｎＡＡに暴露した。アジド部分を含有する式ＩＩＩ．１又は式１Ａ．１のｎｎＡＡを重鎖位置Ｋ２７４に組み込んだ後、プロテインＡ樹脂（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）又はＩｇＳｅｌｅｃｔ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，１７０９６９０１）のいずれかを用いたアフィニティクロマトグラフィーにより精製した。次に、精製した物質を濃縮し、結合反応に付した。

【0210】

マウス抗体４Ｄ５の重鎖及び軽鎖両方の可変領域を、ヒトＩｇＧをコードする遺伝子を含有するベクターにクローニングすることにより、Ｈｅｒ２／ｎｅｕの細胞外ドメインに向けられる抗体を作製した。オーバーラップオリゴマーを用いた遺伝子合成により、４Ｄ５の可変領域を作製して、ｐＦＵＳＥ−ＣＨＩｇ−ｈＧ１（ＩｇＧ１重鎖；γ）（配列番号１２及び１３）並びにｐＦＵＳＥ−ＣＨＬＩｇ−ｈｋ（軽鎖；κ；Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）（配列番号１６及び１７）によりコード化されるヒトＩｇＧ１フレームワークにクローニングして、マウス−ヒトハイブリッドを作製した。部位特異的突然変異により、アンバーコドンを重鎖（γ）のＫ２７４位に導入した（配列番号１４及び１５）。アンバーコドンを含むクローンをＤＮＡ配列決定により同定した。組み込み構築物を作製するために、重鎖のためのプロモータ及びＯＲＦをＰＣＲにより増幅し、制限酵素消化、及びｐＯｐｔｉｖｅｃ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）への連結によりクローニングした。軽鎖とｔＲＮＡの単コピーを、オーバーラップオリゴマーを用いて、２ステップＰＣＲ法により結合した後、重鎖を含むｐＯｐｔｉｖｅｃプラスミドの利用可能な部位にクローニングした。次に、この構築物をｐｙｌＲＳ／ｔＲＮＡペアを含むＣＨＯ−ＤＧ４４細胞株にトランスフェクトした後、ヒポキサチン及びチミジンを欠失した培地におけるその増殖により、トランスフェクタントを選択した。続いて、選択した細胞をクローニングし、アンバーコドンへのｎｎＡＡの効率的な導入が可能な高ＩｇＧ発現（完全長ＩｇＧの発現）を単離した。選択された細胞株を用いて、前述したｎｎＡＡを含むＩｇＧを作製した。Ｅｘｃｅｌ ＤＨＦＲ培地（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）において細胞を１〜２×１０⁶細胞／ｍＬの密度まで増殖させた後、式ＩＩＩ．１又は式ＩＡ．１のｎｎＡＡを１ｍＭの最終濃度まで培地に添加した。細胞を５日間インキュベートし、増殖培地からＩｇＧを精製した。上清を回収し、遠心分離にかけることにより、懸濁細胞及び他の残屑を回収した。次に、上清を０．２２ｕｍフィルターを通してろ過することにより、あらゆる粒子状物質を除去した後、クロマトグラフィーカラムに適用した。ろ過した上清を、ＡＫＴＡクロマトグラフィー系を用い、１〜５ｍＬ／分の流量で、１ｍＬ〜５ｍＬ充填ＨｉＴｒａｐプロテインＡ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅに適用した。結合した物質及び樹脂をＰＢＳで洗浄することにより、結合の緩いタンパク質を除去した後、結合物質を、１００ｍＭグリシン（ｐＨ３．０）を用い、１ｍＬ／分の流量で溶出した。標的タンパク質を含むピーク画分を０．１体積分率の１Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で中和した。全構築物をＰＢＳに対して４℃で１６時間最終リン酸バッファー中に透析した。両方の重鎖の２７４位に、ｎｎＡＡとして式ＩＩＩ．１が組み込まれた抗体は、「４Ｄ５−２ＡｚＡｂ−ＨＣ−２７４−（２Ｓ）−２−アミノ−３−［（２−｛［（２−アジドエトキシ）カルボニル］アミノ｝エチル）スルファニル］プロパン酸」と称した。

【0211】

４Ｄ５−２ＡｚＡｂ−ＨＣ−２７４−（２Ｓ）−２−アミノ−３−［（２−｛［（２−アジドエトキシ）カルボニル］アミノ｝エチル）スルファニル］プロパン酸のペグ化
２００ｕＬ ＰＣＲチューブ中に、４Ｄ５−２ＡｚＡｂ−ＨＣ２７４−（２Ｓ）−２−アミノ−３−［（２−｛［（２−アジドエトキシ）カルボニル］アミノ｝エチル）スルファニル］プロパン酸（式ＩＩＩ．１）の溶液（１００ｕＬ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、続いて、２０ＫＰＥＧシクロオクチンの溶液（３３．３、６０ｍｇ／ｍＬ）を導入した。溶液をボルテックスミキサーで激しく混合した後、一晩インキュベートした。混合物を２００ｕＬまで希釈してから、プロテインＡ磁気ビーズに適用した。混合物をボルテックスし、回転させることにより、ビーズを９０分間混合した。ビーズを固定化し、通過物質を廃棄した。ビーズをＰＢＳで洗浄し（２Ｘ）、還元ゲルバッファー中に懸濁させた。ボルテックスしてから、９５℃に３分加熱した。懸濁液をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に直接ロードした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのクーマシー染色は、重鎖の選択的ペグ化を示した（図１、レーン２）。

【0212】

参考文献
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Ｎｇｕｙｅｎ，Ｄ．Ｐ．，Ｌｕｓｉｃ，Ｈ．，Ｎｅｕｍａｎｎ，Ｈ．Ｋ．，Ｄｅｉｔｅｒｓ，Ａ．，＆Ｃｈｉｎ，Ｊ．Ｗ．（２００９）．Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｃｏｄｉｎｇ ａｎｄ Ｌａｂｅｌｉｎｇ ｏｆ Ａｌｉｐｈａｔｉｃ Ａｚｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｌｋｙｎｅｓ ｉｎ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｖｉａ ａ Ｐｙｒｒｏｌｙｓｙｌ−ｔＲＮＡ
Ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ／ｔＲＮＡｃｕａ Ｐａｉｒ ａｎｄ Ｃｌｉｃｋ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ，８７２０−８７２１．Ｙａｎａｇｉｓａｗａ，Ｔ．，Ｉｓｈｉｉ，Ｒ．，Ｆｕｋｕｎａｇａ，Ｒ．，Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，Ｔ．，Ｓａｋａｍｏｔｏ，Ｋ．，＆Ｙｏｋｏｙａｍａ，Ｓ．（２００８）．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃ Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｃｔｉｖｅ−ｓｉｔｅ ｌｏｏｐｓ ｉｎ Ｐｙｒｒｏｌｙｓｙｌ−ｔＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，３７８，６３４−６５２．
Ｙａｎａｇｉｓａｗａ，Ｔ．，Ｉｓｈｉｉ，Ｒ．，Ｆｕｋｕｎａｇａ，Ｒ．，Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，Ｔ．，Ｓａｋａｍｏｔｏ，Ｋ．，＆Ｙｏｋｏｙａｍａ，Ｓ．（２００８）．Ｍｕｌｔｉｓｔｅｐ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ Ｐｙｒｒｏｌｙｓｙｌ−ｔＲＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ ｔｏ Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ Ｅｎｃｏｄｅ Ｎｅ−（ｏ−Ａｚｉｄｏｂｅｎｚｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）ｌｙｓｉｎｅ ｆｏｒ Ｓｉｔｅ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ．Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１５，１１８７−１１９７．
Ｙａｎａｇｉｓａｗａ，Ｔ．，Ｓｕｍｉｄａ，Ｔ．，Ｉｓｈｉｉ，Ｒ．，＆Ｙｏｋｏｙａｍａ，Ｓ．（２０１３）．Ａ ｎｏｖｅｌ ｃｒｙｓｔａｌ ｆｏｍ ｏｆ ｐｙｒｒｏｌｙｓｙｌ−ｔＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ ｒｅｖｅａｌｓ ｔｈｅ ｐｒｅ− ａｎｄ ｐｏｓｔ−ａｍｉｎｏａｃｙｌ−ｔＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ ｓｔａｔｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ａｄｅｎｙｌａｔｅ ａｎｄ ａｍｉｎｏａｃｙｌ ｍｏｉｅｔｉｅｓ ａｎｄ ａｎ ａｓｐａｒａｇｉｎｅ ｒｅｓｉｄｕｅ ｉｎ ｔｈｅ ｃａｔａｌｙｔｉｃ ｓｉｔｅ．Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃａ Ｓｅｃｔｉｏｎ Ｄ，Ｄ６９，５−１５．

【0213】

本発明、並びに以下に記載する特許請求の範囲全体を通して、文脈から別の意味に解釈すべき場合を除き、「含む」という用語、並びに「含む」及び「含んでいる」などの変形は、記載された整数、ステップ、整数の群又はステップの群の包含を意味するが、いずれか他の整数、ステップ、整数の群又はステップ群の除外を意味するわけではないことは理解されよう。

【0214】

本明細書で言及する全ての特許及び特許出願は、その全体を参照により本明細書に組み込むものとする。
本発明は、以下の実施形態を包含する。
（実施形態１）
式Ｘ：

【化87】

（式中、
Ｘ＝Ｏ又はＳ；
Ｙ＝ＣＨ₂、ＮＨ、Ｏ又はＳ；
Ｚ＝ＣＨ₂、ＣＨ−ＮＨ₂、ＣＨ−ＯＨ、ＮＨ、Ｏ又はＳ；
ＦＧ＝アジド、アルケン、アルキン、ケトン、エステル、アリール又はシクロアルキン；ａ＝１〜７の整数；
ＺがＮＨ、Ｏ又はＳであるとき、ｂが２〜７の整数である以外は、ｂ＝１〜７の整数であり、ただし、ａ＋ｂは、２〜８の範囲であり；
ｄ＝１〜４の整数）
のピロリシン類似体。
（実施形態２）
式ＩＩＩ：

【化88】

（式中、
ａ、ｂ、Ｙ、Ｚ、ｄ及びＦＧは、請求項１に定義した通りである）
のピロリシン類似体である、実施形態１に記載のピロリシン類似体。
（実施形態３）
以下：

【化89】

【化90】

【化91】

から選択される、実施形態２に記載のピロリシン類似体。
（実施形態４）
式ＩＶ：

【化92】

（式中、
ａ、ｂ、Ｙ、Ｚ、ｄ及びＦＧは、実施形態１に定義した通りである）
のピロリシン類似体である、実施形態１に記載のピロリシン類似体。
（実施形態５）
以下：

【化93】

【化94】

【化95】

から選択される、実施形態４に記載のピロリシン類似体。
（実施形態６）
式Ｉ：

【化96】

（式中、
Ｚ＝結合、ＣＨ₂、ＣＨ−ＮＨ₂、ＣＨ−ＯＨ、ＮＨ、Ｏ、Ｓ又はＣＨ−ＮＨ₂であり；
ａは、３〜７の整数であり；
ｂは、０又は１〜７の整数であり；
ＦＧ＝アジド、アルケン、アルキン、ケトン、エステル、アリール又はシクロアルキンであるが；
以下：
ａが４、ＺがＯを表すとき、−（ＣＨ₂）_b−ＦＧは、−ＣＨ₂−Ｃ≡ＣＨ、−ＣＨ₂ＣＨ₂−Ｎ₃、−ＣＨ₂−ＣＨ＝ＣＨ₂又は−ＣＨ₂−Ｐｈではなく；
ａが４、ＺがＯを表すとき、−（ＣＨ₂）_b−ＦＧは、−ＣＨ₂ＣＨ₂ＣＨ₂−Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ₃又は−ＣＨ₂ＣＨ₂ＣＨ₂−ＣＨ＝ＣＨ₂ではなく；
ａが４、Ｚが結合、ｂが０を表すとき、−（ＣＨ₂）_b−ＦＧは、−Ｃ（＝Ｏ）Ｂｎ又は−Ｃ（＝Ｏ）Ｍｅではなく；かつ
ａが４、Ｚが結合を表すとき、−（ＣＨ₂）_b−ＦＧは、−ＣＨ₂ＣＨ₂−Ｃ≡ＣＨではないことを条件とする）
のピロリシン類似体。
（実施形態７）
ａが３である、実施形態６に記載のピロリシン類似体。
（実施形態８）
ａが４である、実施形態６に記載のピロリシン類似体。
（実施形態９）
ＺがＯである、実施形態６〜８のいずれか一項に記載のピロリシン類似体。
（実施形態１０）
ＺがＮである、実施形態６〜８のいずれか一項に記載のピロリシン類似体。
（実施形態１１）
Ｚが結合である、実施形態６〜８のいずれか一項に記載のピロリシン類似体。
（実施形態１２）
以下：

【化97】

から選択される、実施形態８に記載のピロリシン類似体。
（実施形態１３）
以下：

【化98】

から選択される、実施形態７に記載のピロリシン類似体。
（実施形態１４）
式ＩＩ：

【化99】

（式中、
Ｚ＝ＣＨ₂、ＣＨ−ＮＨ₂、ＣＨ−ＯＨ、ＮＨ、Ｏ又はＳ；
ＦＧ＝アジド、アルケン、アルキン、ケトン、エステル、アリール又はシクロアルキン；ａ＝３又は５〜７の整数；及び
ｂ＝１〜４の整数である）
のピロリシン類似体。
（実施形態１５）
式Ｖ：

【化100】

（式中、
Ｒ＝２０の天然アミノ酸のうちの１つの側鎖；
Ｚ＝ＣＨ₂、ＣＨ−ＮＨ₂、ＣＨ−ＯＨ、ＮＨ、Ｏ又はＳ；
ＦＧ＝アジド、アルケン、アルキン、ケトン、エステル、アリール又はシクロアルキン；ａ＝１；及び
ｂ＝１〜４の整数）
のピロリシン類似体。
（実施形態１６）
以下：

【化101】

から選択される、実施形態１５に記載のピロリシン類似体。
（実施形態１７）
式ＶＩ：

【化102】

（式中、
Ｚ＝ＣＨ₂、ＣＨ−ＮＨ₂、ＣＨ−ＯＨ、ＮＨ、Ｏ又はＳ；
ＦＧ＝アジド、アルケン、アルキン、ケトン、エステル、アリール又はシクロアルキン；ａ＝４又は５；及び
ｂ＝１〜４の整数）
のピロリシン類似体。
（実施形態１８）
以下：

【化103】

から選択される、実施形態１７に記載のピロリシン類似体。
（実施形態１９）
式ＶＩＩ：

【化104】

（式中、
Ｒ＝アルキル、アルケニル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール又はヘテロシクリル；
ａ＝１〜７の整数；及び
ｂ＝１〜３の整数）
のピロリシン類似体。
（実施形態２０）
以下：

【化105】

である、実施形態１９に記載のピロリシン類似体。
（実施形態２１）
式ＶＩＩＩ：

【化106】

（式中、
Ｚ＝ＣＨ₂、ＣＨ−ＮＨ₂、ＣＨ−ＯＨ、ＮＨ、Ｏ又はＳ；
Ｒ₁＝Ｈ、アルキル、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アリール、ヘテロアリール又はヘテロシクリル；
Ｒ₂＝アルキル、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アリール、ヘテロアリール又はヘテロシクリル；
Ｒ₃＝Ｈ、アルキル、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アリール、ヘテロアリール又はヘテロシクリル；及び
ａ＝１）
のピロリシン類似体。
（実施形態２２）
以下：

【化107】

から選択される、実施形態２１に記載のピロリシン類似体。
（実施形態２３）
非天然アミノ酸として、実施形態１〜２２のいずれか一項に記載の１つ又は複数のピロリシン類似体を含む突然変異体タンパク質。
（実施形態２４）
非天然アミノ酸として、実施形態１〜２２のいずれか一項に記載の１つのピロリシン類似体を含む、実施形態２３に記載の突然変異体タンパク質。
（実施形態２５）
１つ又は複数の非天然アミノ酸を介して、タンパク質、細胞傷害性薬剤、薬物及びポリマーから選択される１つ又は複数の部分に結合される、実施形態２３又は２４に記載の突然変異体タンパク質。
（実施形態２６）
ＰＥＧ部分に結合される、実施形態２５に記載の突然変異体タンパク質。
（実施形態２７）
抗体部分に結合される、実施形態２５に記載の突然変異体タンパク質。
（実施形態２８）
細胞傷害性薬剤に結合される、実施形態２５に記載の突然変異体タンパク質。
（実施形態２９）
薬物部分に結合される、実施形態２５に記載の突然変異体タンパク質。
（実施形態３０）
１つ又は複数の非天然アミノ酸を含む突然変異体タンパク質の製造における、実施形態１〜２２のいずれか一項に記載のピロリシン類似体の使用。

【図1】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]