特許 6572198 皮膚弾性改善剤の評価又は選択方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6572198

(24)【登録日】2019年8月16日

(45)【発行日】2019年9月4日

(54)【発明の名称】皮膚弾性改善剤の評価又は選択方法

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/68 20180101AFI20190826BHJP

   G01N 33/68 20060101ALI20190826BHJP

【ＦＩ】

   C12Q1/68

   G01N33/68ZNA

【請求項の数】3

【全頁数】17

(21)【出願番号】特願2016-238137(P2016-238137)

(22)【出願日】2016年12月8日

(65)【公開番号】特開2018-93743(P2018-93743A)

(43)【公開日】2018年6月21日

【審査請求日】2018年3月22日

(73)【特許権者】

【識別番号】000000918

【氏名又は名称】花王株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】110000084

【氏名又は名称】特許業務法人アルガ特許事務所

(74)【代理人】

【識別番号】100077562

【弁理士】

【氏名又は名称】高野 登志雄

(74)【代理人】

【識別番号】100096736

【弁理士】

【氏名又は名称】中嶋 俊夫

(74)【代理人】

【識別番号】100117156

【弁理士】

【氏名又は名称】村田 正樹

(74)【代理人】

【識別番号】100111028

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 博人

(72)【発明者】

【氏名】笠松 慎也

【審査官】 田名部 拓也

(56)【参考文献】

【文献】 米国特許出願公開第２００８／０２０６７７０（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 特表２０１１−５２５４９５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Srinivas V. Saladi et al.，Pigment Cell Melanoma Res.，２０１３年，26，377-391

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｑ １／００ − １／７０

Ａ６１Ｑ １／００ − ９０／００

ＰｕｂＭｅｄ

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

光老化による皮膚弾性低下の改善剤の評価及び／又は選択方法であって：
ＢＲＧ−１を発現可能な組織又は細胞に、被験物質を適用すること；
該組織又は細胞における、ＢＲＧ−１の発現もしくは活性、又はＢＲＧ−１をコードする遺伝子の発現を測定すること；
該測定結果に基づいて、ＢＲＧ−１の発現もしくは活性、又はＢＲＧ−１をコードする遺伝子の発現を増強させる被験物質を、光老化による皮膚弾性低下の改善剤として評価及び／又は選択すること、
を含む、方法。

【請求項2】

光老化による皮膚のシワ又はたるみの予防又は改善剤の評価及び／又は選択方法であって：
ＢＲＧ−１を発現可能な組織又は細胞に、被験物質を適用すること；
該組織又は細胞における、ＢＲＧ−１の発現もしくは活性、又はＢＲＧ−１をコードする遺伝子の発現を測定すること；
該測定結果に基づいて、ＢＲＧ−１の発現もしくは活性、又はＢＲＧ−１をコードする遺伝子の発現を増強させる被験物質を、光老化による皮膚のシワ又はたるみの予防又は改善剤として評価及び／又は選択すること、
を含む、方法。

【請求項3】

光老化による皮膚のハリの低下の予防又は改善剤の評価及び／又は選択方法であって：
ＢＲＧ−１を発現可能な組織又は細胞に、被験物質を適用すること；
該組織又は細胞における、ＢＲＧ−１の発現もしくは活性、又はＢＲＧ−１をコードする遺伝子の発現を測定すること；
該測定結果に基づいて、ＢＲＧ−１の発現もしくは活性、又はＢＲＧ−１をコードする遺伝子の発現を増強させる被験物質を、光老化による皮膚のハリの低下の予防又は改善剤として評価及び／又は選択すること、
を含む、方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、皮膚弾性改善剤を評価及び／又は選択する方法に関する。

【背景技術】

【0002】

人間の皮膚は、加齢と共に老化して弾力を喪失し、ハリの低下や、シワ、たるみの発生を生じる。特に顔面や首筋、肩など太陽光のあたる部分の皮膚では、慢性的な紫外線の影響により、シワやたるみの形成、又はしみやそばかすの形成が、他の光のあたらない部分と比較し顕著となる。これら紫外線暴露部で起こる皮膚老化は光老化と呼ばれる。光老化とは、慢性的な日光照射、特に紫外線への曝露によって皮膚の内的な老化プロセスが加速されて起こる皮膚の変化である。

【0003】

真皮の弾性の維持には、細胞外マトリクス（ＥＣＭ）の構成成分である弾性線維やコラーゲン線維が重要な役割を担っている。弾性線維は、トロポエラスチン分子と、フィブリリン−１から主に構成されるミクロフィブリルとの凝集体が重合して構築されている。皮膚の光老化は、コラーゲン線維や弾性線維の減少や分解を伴う。

【0004】

真核細胞のＤＮＡは高度に折りたたまれたクロマチン構造にあるため、遺伝子が転写されその機能を発揮するためには、このクロマチン構造が解かれ、転写因子や転写活性化因子がＤＮＡにアクセス可能になることが重要である。クロマチン構造を解く機能を持ったタンパク質集団はクロマチンリモデリング複合体と呼ばれ、それらの１つがＳＷＩ／ＳＮＦ複合体である。ＢＲＧ−１（別名：ＳＭＡＲＣＡ４）は、ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体のコアサブユニットとして機能するタンパク質である（非特許文献１）。ＢＲＧ−１がＵＶ照射により傷ついたＤＮＡの修復に関与すると考えられること（非特許文献２、３）や、ＢＲＧ−１をノックダウンしたメラノーマの細胞増殖が低下したこと（非特許文献４）が報告されている。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0005】

【非特許文献1】Int J Biochem Cell Biol, 2009, 41(4):725-728

【非特許文献2】Cell Cycle, 2009, 8(23):3953-3959

【非特許文献3】J Biol Chem. 2009 284(44):30424-32

【非特許文献4】Biochem Biophys Res Commun, 2010, 392(3):454-9

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

本発明は、真皮細胞外マトリクス（ＥＣＭ）の形成を制御し、皮膚弾性を改善し、又は皮膚のシワ、たるみ、ハリの低下等を予防又は改善することができる素材を評価及び／又は選択する方法に関する。

【課題を解決するための手段】

【0007】

本発明者らは、ヒトの皮膚におけるＢＲＧ−１の発現量と皮膚弾性との間に関連性が見られること、及び線維芽細胞におけるＢＲＧ−１の発現低下によりＥＣＭの成分であるコラーゲンや弾性線維構成因子の発現量が低下することを見出した。これらの知見に基づいて、本発明者らは、ＢＲＧ−１の発現又は活性の制御作用を指標として、コラーゲン線維、弾性線維、ＥＣＭ等の形成を制御し、皮膚弾性を改善し、又は皮膚のシワ、たるみ、ハリの低下等を予防又は改善することができる素材を評価及び／又は選択することができることを見出した。

【0008】

したがって、一実施形態において、本発明は、皮膚弾性改善剤の評価及び／又は選択方法であって：
ＢＲＧ−１を発現可能な組織又は細胞に、被験物質を適用すること；
該組織又は細胞における、ＢＲＧ−１の発現もしくは活性、又はＢＲＧ−１をコードする遺伝子の発現を測定すること；
該測定結果に基づいて、ＢＲＧ−１の発現もしくは活性、又はＢＲＧ−１をコードする遺伝子の発現を増強させる被験物質を、皮膚弾性改善剤として評価及び／又は選択すること、
を含む方法を提供する。

【0009】

別の一実施形態において、本発明は、皮膚のシワ又はたるみ予防又は改善剤の評価及び／又は選択方法であって：
ＢＲＧ−１を発現可能な組織又は細胞に、被験物質を適用すること；
該組織又は細胞における、ＢＲＧ−１の発現もしくは活性、又はＢＲＧ−１をコードする遺伝子の発現を測定すること；
該測定結果に基づいて、ＢＲＧ−１の発現もしくは活性、又はＢＲＧ−１をコードする遺伝子の発現を増強させる被験物質を、皮膚のシワ又はたるみ予防又は改善剤として評価及び／又は選択すること、
を含む方法を提供する。

【0010】

別の一実施形態において、本発明は、皮膚のハリの低下予防又は改善剤の評価及び／又は選択方法であって：
ＢＲＧ−１を発現可能な組織又は細胞に、被験物質を適用すること；
該組織又は細胞における、ＢＲＧ−１の発現もしくは活性、又はＢＲＧ−１をコードする遺伝子の発現を測定すること；
該測定結果に基づいて、ＢＲＧ−１の発現もしくは活性、又はＢＲＧ−１をコードする遺伝子の発現を増強させる被験物質を、皮膚のハリの低下予防又は改善剤として評価及び／又は選択すること、
を含む方法を提供する。

【0011】

別の一実施形態において、本発明は、真皮細胞外マトリクス形成制御剤の評価及び／又は選択方法であって：
ＢＲＧ−１を発現可能な組織又は細胞に、被験物質を適用すること；
該組織又は細胞における、ＢＲＧ−１の発現もしくは活性、又はＢＲＧ−１をコードする遺伝子の発現を測定すること；
該測定結果に基づいて、ＢＲＧ−１の発現もしくは活性、又はＢＲＧ−１をコードする遺伝子の発現を変化させる被験物質を、真皮細胞外マトリクス形成制御剤として評価及び／又は選択すること、
を含む方法を提供する。

【0012】

別の一実施形態において、本発明は、弾性線維形成制御剤の評価及び／又は選択方法であって：
ＢＲＧ−１を発現可能な組織又は細胞に、被験物質を適用すること；
該組織又は細胞における、ＢＲＧ−１の発現もしくは活性、又はＢＲＧ−１をコードする遺伝子の発現を測定すること；
該測定結果に基づいて、ＢＲＧ−１の発現もしくは活性、又はＢＲＧ−１をコードする遺伝子の発現を変化させる被験物質を、弾性線維形成制御剤として評価及び／又は選択すること、
を含む方法を提供する。

【0013】

別の一実施形態において、本発明は、コラーゲン線維形成制御剤の評価及び／又は選択方法であって：
ＢＲＧ−１を発現可能な組織又は細胞に、被験物質を適用すること；
該組織又は細胞における、ＢＲＧ−１の発現もしくは活性、又はＢＲＧ−１をコードする遺伝子の発現を測定すること；
該測定結果に基づいて、ＢＲＧ−１の発現もしくは活性、又はＢＲＧ−１をコードする遺伝子の発現を変化させる被験物質を、コラーゲン線維形成制御剤として評価及び／又は選択すること、
を含む方法を提供する。

【発明の効果】

【0014】

本発明は、皮膚弾性やそれに関わる成分の発現を評価することができる新たなマーカー分子を提供する。本発明によれば、ＢＲＧ−１の発現又は活性を指標として、簡便かつ迅速に、コラーゲン線維、弾性線維もしくはＥＣＭの形成を制御し、皮膚弾性を改善し、又は皮膚のシワ、たるみ、ハリの低下等を予防又は改善することができる素材を探索することができる。

【図面の簡単な説明】

【0015】

【図1】ヒト皮膚におけるＢＲＧ−１遺伝子発現と弾性値（Ｕｒ／Ｕｆ）との関係。

【図2】ヒト上腕内側部（弱露光部）及び前腕外側部（露光部）の皮膚におけるＢＲＧ−１遺伝子発現量。

【図3】線維芽細胞のウェスタンブロッティング解析。ＢＲＧ−１ ｓｉＲＮＡ：ＢＲＧ−１特異的ｓｉＲＮＡ導入細胞、Ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｉＲＮＡ：非特異的配列ｓｉＲＮＡ導入細胞。

【図4】免疫染色線維芽細胞の蛍光顕微鏡画像。ＢＲＧ−１ ｓｉＲＮＡ：ＢＲＧ−１特異的ｓｉＲＮＡ導入細胞、Ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｉＲＮＡ：非特異的配列ｓｉＲＮＡ導入細胞。

【図5】免疫染色線維芽細胞の蛍光顕微鏡画像。ＢＲＧ−１ ｓｉＲＮＡ：ＢＲＧ−１特異的ｓｉＲＮＡ導入細胞、Ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｉＲＮＡ：非特異的配列ｓｉＲＮＡ導入細胞。

【発明を実施するための形態】

【0016】

本明細書において、アミノ酸配列及びヌクレオチド配列に関する「少なくとも９０％の同一性」とは、９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上の同一性をいう。

【0017】

本明細書において、ヌクレオチド配列及びアミノ酸配列の同一性は、リップマン−パーソン法（Ｌｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎ法；Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８５，２２７：１４３５−１４４１）によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアＧｅｎｅｔｙｘ−Ｗｉｎ（Ｖｅｒ．５．１．１；ソフトウェア開発）のホモロジー解析（Ｓｅａｒｃｈ ｈｏｍｏｌｏｇｙ）プログラムを用いて、Ｕｎｉｔ ｓｉｚｅ ｔｏ ｃｏｍｐａｒｅ（ｋｔｕｐ）を２として解析を行うことにより算出される。

【0018】

本明細書において「ＢＲＧ−１」は、別名ＳＭＡＲＣＡ４といい、ＡＡＩ３６６４５．１（ＧｅｎＢａｎｋ）で表されるヒトＢＲＧ−１タンパク質、又はそのホモログをいう。ＢＲＧ−１は、クロマチンリモデリング複合体の１つであるＳＷＩ／ＳＮＦ複合体のコアサブユニットとして機能するタンパク質である（非特許文献１）。好ましくは、本明細書における「ＢＲＧ−１」は、配列番号２で示されるアミノ酸配列、又は当該配列と少なくとも９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質である。

【0019】

本明細書において「ＢＲＧ−１をコードする遺伝子」（又は「ＢＲＧ−１遺伝子」）とは、ＢＣ１３６６４４．１（ＧｅｎＢａｎｋ）で表される遺伝子、又はそのホモログをいい、上記で定義したＢＲＧ−１をコードする。好ましくは、本明細書における「ＢＲＧ−１をコードする遺伝子」は、配列番号１で示されるヌクレオチド配列、又は当該配列と少なくとも９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつ上記で定義したＢＲＧ−１をコードするポリヌクレオチドである。

【0020】

後記実施例に例示するように、ヒトの皮膚におけるＢＲＧ−１の発現量は皮膚弾性と関連しており、ＢＲＧ−１の発現量が高いほど皮膚の弾性が高い傾向が見られた（図１）。また、ヒトの皮膚におけるＢＲＧ−１の発現は、露光部ではより低下していた（図２）。これらの結果は、光老化による皮膚弾性低下におけるＢＲＧ−１の関与を示唆する。さらに、線維芽細胞におけるＢＲＧ−１の発現阻害は、真皮細胞外マトリクス（ＥＣＭ）の成分であるコラーゲン線維や弾性線維構成因子の発現量を低下させ、かつコラーゲン線維又は弾性線維の形成や分解に関わる因子の発現にも影響した（図３〜５）。これらの結果は、ＢＲＧ−１が、コラーゲン線維又は弾性線維の形成と分解の制御を介して真皮ＥＣＭの形成や破壊に関与し、ひいては皮膚の弾性、又は光老化による皮膚の変化（例えば、シワ、たるみ、又はハリの低下）に寄与していることを示す。

【0021】

このように、ＢＲＧ−１は、真皮ＥＣＭの構造を制御し、結果として皮膚弾性を制御することができる皮膚弾性制御因子である。また、目尻のシワ程度の悪化と皮膚弾力性の低下が高く相関することが知られているように（Ｔａｋｅｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｓｏｃ． Ｃｏｓｍｅｔ．Ｃｈｅｍ．，４６，１６３−１７３，１９９５）、皮膚弾性は皮膚のシワ、たるみ又はハリの状態に影響する。したがって、ＢＲＧ−１の発現増加は、真皮ＥＣＭにおけるコラーゲン又は弾性線維を増加させ、それによって皮膚の弾性を向上させ、ひいては皮膚のシワもしくはたるみを予防もしくは改善し、又は皮膚のハリ低下を予防もしくは改善し得る。逆に、ＢＲＧ−１の発現低下は、真皮ＥＣＭにおけるコラーゲン又は弾性線維を減少させ、それによって皮膚の弾性を低下させ得る。

【0022】

したがって、ＢＲＧ−１の発現もしくは活性、又はＢＲＧ−１をコードする遺伝子の発現を指標として、コラーゲン線維もしくは弾性線維形成制御剤、真皮ＥＣＭ形成制御剤、皮膚弾性改善剤、皮膚のシワもしくはたるみ予防もしくは改善剤、又は皮膚のハリの低下予防もしくは改善剤を評価又は選択することができる。あるいは、ＢＲＧ−１の発現もしくは活性、又はＢＲＧ−１をコードする遺伝子の発現を制御することにより、コラーゲン線維、弾性線維もしくは真皮ＥＣＭの形成を制御することや、皮膚弾性を改善することや、皮膚のシワもしくはたるみを予防もしくは改善することや、又は皮膚のハリの低下を予防もしくは改善することが可能である。またあるいは、ＢＲＧ−１の発現もしくは活性、又はＢＲＧ−１をコードする遺伝子の発現を指標として、被験体の皮膚弾性を評価したり、被験体の皮膚のシワもしくはやたるみの生じやすさや、ハリの低下しやすさを評価したり、あるいは真皮におけるＥＣＭ、弾性線維もしくはコラーゲンの量を評価することが可能である。

【0023】

したがって、一実施形態において、本発明は、皮膚弾性改善剤の評価及び／又は選択方法を提供する。別の一実施形態において、本発明は、皮膚のシワ又はたるみ予防又は改善剤の評価及び／又は選択方法を提供する。別の一実施形態において、本発明は、皮膚のハリの低下予防又は改善剤の評価及び／又は選択方法を提供する。

【0024】

さらなる実施形態において、本発明は、真皮ＥＣＭ形成制御剤の評価及び／又は選択方法を提供する。さらなる実施形態において、本発明は、弾性線維形成制御剤の評価及び／又は選択方法を提供する。さらなる実施形態において、本発明は、コラーゲン線維形成制御剤の評価及び／又は選択方法を提供する。

【0025】

以下の本明細書において、上述した本発明の方法によって評価及び／又は選択される皮膚弾性改善剤、皮膚のシワ又はたるみ予防又は改善剤、皮膚のハリの低下予防又は改善剤、真皮ＥＣＭ形成制御剤、弾性線維形成制御剤、及びコラーゲン線維形成制御剤を、まとめて「本発明の剤」ということがある。

【0026】

上述した本発明の方法は、ＢＲＧ−１の発現もしくは活性、又はＢＲＧ−１をコードする遺伝子の発現を指標とする。上述した本発明の方法はｉｎ ｖｉｔｒｏで行われ得る。より詳細には、本発明の方法は、以下：
ＢＲＧ−１を発現可能な組織又は細胞に、被験物質を適用すること；及び
該組織又は細胞における、ＢＲＧ−１の発現もしくは活性、又はＢＲＧ−１をコードする遺伝子の発現を測定すること、
を含む。

【0027】

本発明の方法で使用される被験物質は、本発明の剤として使用することを所望する物質であれば、特に制限されない。被験物質は、天然に存在する物質であっても、化学的又は生物学的方法等で人工的に合成した物質であってもよく、また化合物であっても、組成物もしくは混合物であってもよい。

【0028】

本発明の方法の一実施形態において、被験物質を適用されるＢＲＧ−１を発現可能な組織又は細胞の例としては、ＢＲＧ−１又はその遺伝子を発現している、哺乳動物から単離された組織もしくは細胞、又はその培養物が挙げられる。より詳細な例としては、哺乳動物から採取された皮膚組織、真皮組織、真皮細胞、及びそれらの培養物；好ましくは、真皮線維芽細胞又はその培養物、などが挙げられる。

【0029】

本発明の方法で使用されるＢＲＧ−１を発現可能な組織又は細胞が由来する哺乳動物の例としては、例えば、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ブタ、サル等が挙げられ、好ましくはヒトであるが、これらに限定されない。

【0030】

あるいは、本発明の方法に用いられる、ＢＲＧ−１を発現可能な組織又は細胞の例としては、ＢＲＧ−１又はその遺伝子を発現するように遺伝的に改変された哺乳動物の組織もしくは細胞、又はその培養物が挙げられる。当該遺伝的に改変された哺乳動物の組織又は細胞、及びその培養物は、例えば、哺乳動物の任意の組織又は細胞にＢＲＧ−１をコードする遺伝子を導入して、該組織又は細胞がＢＲＧ−１を発現するように、あるいはＢＲＧ−１の発現が強化されるように形質転換することによって作製することができる。あるいは、ＢＲＧ−１遺伝子のプロモーター領域の下流にルシフェラーゼなどのレポーター遺伝子を融合させたコンストラクトが導入された細胞又はその培養物を用いることもできる。遺伝子やコンストラクトを細胞に導入する方法としては、エレクトロポレーションやリポフェクションなどによるベクター導入が挙げられるが、これらに限定されない。

【0031】

該ＢＲＧ−１を発現可能な組織又は細胞への被験物質の適用は、例えば、被験物質を所定の濃度になるように予め培地中に添加した後、当該組織又は細胞を該培地に播種すること、あるいは、当該組織又は細胞が播種された培地に、被験物質を所定の濃度になるように添加することにより行うことができる。被験物質適用後の組織又は細胞は、通常の条件、例えば真皮線維芽細胞の場合、約２５〜３７℃で８〜２４０時間程度、好ましくは２４〜１２０時間程度の条件で培養することが好ましい。

【0032】

培地に対する該組織又は細胞の播種時の濃度は、細胞が増殖可能な濃度であれば特に限定されない。また、被験物質の添加濃度は、０．００００１〜１０％（ｗ／ｖ）とするのが好ましく、０．０００１〜５％（ｗ／ｖ）とするのがより好ましいが、被験物質の種類によって適宜調節すればよく、特に限定されない。

【0033】

該組織又は細胞を培養する培地は、常用の培地を用いることができる。該培地としては、例えば１０％ＦＢＳ含有又は不含有Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）などが挙げられるが、これらに限定されない。細胞継代又は増殖時には、これらの培地に、血清、増殖因子、インスリン等の増殖添加剤や抗菌剤等を添加することが好ましい。

【0034】

次いで、該被験物質を適用した組織又は細胞を回収して、ＢＲＧ−１の発現もしくは活性、又はＢＲＧ−１をコードする遺伝子の発現を測定する。遺伝子の発現レベルの測定は、公知の方法に従って行うことができる。例えば、ｍＲＮＡレベルで検出する場合は、例えば細胞からｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出した後、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法、ＲＮＡ分解酵素プロテクションアッセイ法、ＤＮＡアレイ法、ノーザンブロット解析法などを用いて、ＢＲＧ−１遺伝子から転写されたｍＲＮＡを検出定量することができる。

【0035】

ＢＲＧ−１タンパク質の発現レベルの測定は、公知の方法に従って行うことができ、例えば、ＲＩＡ法、ＥＩＡ法、ＥＬＩＳＡ、バイオアッセイ法、ウェスタンブロットなどの通常の免疫測定法により行うことができる。ウェスタンブロットが安価かつ簡便で望ましい。ＢＲＧ−１タンパク質の活性レベルの測定は、公知の方法に従って行うことができ、例えば、ウェスタンブロッティングによるリン酸化の検出などにより行うことができる。

【0036】

次いで、本発明の方法においては、上記のとおり測定したＢＲＧ−１の発現もしくは活性レベル、又はＢＲＧ−１をコードする遺伝子の発現レベルに基づいて、皮膚弾性改善剤、皮膚のシワ又はたるみ予防又は改善剤、皮膚のハリの低下予防又は改善剤、真皮ＥＣＭ形成制御剤、弾性線維形成制御剤、又はコラーゲン線維形成制御剤として使用可能な被験物質を評価及び／又は選択する。

【0037】

本発明の方法の一実施形態においては、ＢＲＧ−１の発現もしくは活性レベルを増強させるか、又はＢＲＧ−１をコードする遺伝子の発現レベルを増強させる被験物質を評価及び／又は選択する。これら被験物質は、皮膚弾性改善剤、皮膚のシワ又はたるみ予防又は改善剤、又は皮膚のハリの低下予防又は改善剤として使用することができる。

【0038】

本発明の方法の別の実施形態においては、ＢＲＧ−１の発現もしくは活性レベルを増強させるか、又はＢＲＧ−１をコードする遺伝子の発現レベルを増強させる被験物質を評価及び／又は選択する。これら被験物質は、真皮ＥＣＭ形成促進剤、弾性線維形成促進剤、又はコラーゲン線維形成促進剤として使用することができる。

【0039】

本発明の方法のさらに別の実施形態においては、ＢＲＧ−１の発現もしくは活性レベルを低下させるか、又はＢＲＧ−１をコードする遺伝子の発現レベルを低下させる被験物質を評価及び／又は選択する。これら被験物質は、真皮ＥＣＭ形成抑制剤、弾性線維形成抑制剤、又はコラーゲン線維形成抑制剤として使用することができる。

【0040】

好ましくは、上述した被験物質の評価及び／又は選択においては、被験物質を適用したＢＲＧ−１を発現可能な組織又は細胞（試験群）におけるＢＲＧ−１又はその遺伝子の発現もしくは活性レベルを、対照群におけるＢＲＧ−１又はその遺伝子の発現もしくは活性レベルと比較し、当該比較結果に基づいて、本発明の剤として使用できる被験物質を選択する。

【0041】

対照群としては、試験群と同じＢＲＧ−１を発現可能な組織又は細胞であって、被験物質を適用されていないものや、被験物質の溶媒のみを適用したものなどが挙げられる。対照群におけるＢＲＧ−１又はその遺伝子の発現もしくは活性は、上記と同様の手順で測定することができる。

【0042】

試験群におけるＢＲＧ−１又はその遺伝子の発現又は活性レベルが対照群と比べて高い場合、該被験物質を、ＢＲＧ−１又はその遺伝子の発現又は活性レベルを増強させる物質として選択する。例えば、対照群における発現又は活性レベルに対して、試験群における発現又は活性レベルが統計学的に有意に増加した場合に、被験物質を、ＢＲＧ−１又はその遺伝子の発現又は活性レベルを増強させる物質として選択する。別の例では、対照群における発現又は活性レベルを１００％としたときに、試験群における発現又は活性レベルが１１０％以上、好ましくは１３０％以上、さらに好ましくは１５０％以上である場合に、被験物質を、ＢＲＧ−１又はその遺伝子の発現又は活性レベルを増強させる物質として選択する。選択された被験物質は、皮膚弾性改善剤、皮膚のシワ又はたるみ予防又は改善剤、皮膚のハリの低下予防又は改善剤、真皮ＥＣＭ形成促進剤、弾性線維形成促進剤、又はコラーゲン線維形成促進剤として、あるいはそれらの候補物質として選択され得る。

【0043】

試験群におけるＢＲＧ−１又はその遺伝子の発現又は活性レベルが対照群と比べて低い場合、該被験物質を、ＢＲＧ−１又はその遺伝子の発現又は活性レベルを低下させる物質として選択する。例えば、対照群における発現又は活性レベルに対して、試験群における発現又は活性レベルが統計学的に有意に低下した場合に、被験物質を、ＢＲＧ−１又はその遺伝子の発現又は活性レベルを低下させる物質として選択する。別の例では、対照群における発現又は活性レベルを１００％としたときに、試験群における発現又は活性レベルが９０％以下、好ましくは７０％以下、さらに好ましくは５０％以下である場合に、被験物質を、ＢＲＧ−１又はその遺伝子の発現又は活性レベルを低下させる物質として選択する。選択された被験物質は、真皮ＥＣＭ形成抑制剤、弾性線維形成抑制剤、又はコラーゲン線維形成抑制剤として、あるいはそれらの候補物質として選択され得る。

【0044】

本発明の方法においては、必要に応じて、上記手順で選択された物質をさらなるスクリーニングにかけてもよい。例えば、まず上記手順でＢＲＧ−１又はその遺伝子の発現又は活性レベルを増強又は低下させる物質として選択された試験物質を、本発明の剤の候補物質として取得する。次いで、これら候補物質を、皮膚組織、真皮組織、真皮線維芽細胞、もしくはそれらの培養物、又は３次元培養皮膚などの皮膚モデルに投与した後、真皮のＥＣＭ、弾性線維もしくはコラーゲンの量を測定するか、又は皮膚弾性、皮膚のシワ、たるみもしくはハリを測定し、さらに必要に応じて対照群の測定値と比較することにより、より効果的な被験物質を選別することができる。該対照群としては、例えば、被験物質を投与されていない又は被験物質の溶媒のみを投与した皮膚組織、真皮組織、真皮線維芽細胞、もしくはそれらの培養物、又は３次元培養皮膚などが挙げられる。

【0045】

例えば、被験物質投与群における真皮ＥＣＭ成分、例えば弾性線維構成因子もしくはコラーゲンの発現レベルが、対照群と比べて統計学的に有意に向上した場合、あるいは、対照群に対して１１０％以上、好ましくは１３０％以上、さらに好ましくは１５０％以上である場合に、該被験物質は、真皮ＥＣＭ形成促進剤、弾性線維形成促進剤、又はコラーゲン線維形成促進剤として選択され得る。弾性線維もしくはコラーゲンの発現レベルは、ＲＴ−ＰＣＲ、マイクロアレイ、免疫測定法、ウェスタンブロッティングなどの公知の方法によって測定することができる。

【0046】

あるいは、被験物質投与群における真皮ＥＣＭ成分、例えば弾性線維構成因子もしくはコラーゲンの発現レベルが、対照群と比べて統計学的に有意に減少した場合、あるいは、対照群に対して９０％以下、好ましくは７０％以下、さらに好ましくは５０％以下である場合に、該被験物質は、真皮ＥＣＭ形成抑制剤、弾性線維形成抑制剤、又はコラーゲン線維形成抑制剤として選択され得る。

【0047】

また例えば、被験物質投与群における皮膚弾性が、対照群と比べて統計学的に有意に向上した場合、あるいは、対照群に対して１１０％以上、好ましくは１３０％以上、さらに好ましくは１５０％以上である場合に、該被験物質は、皮膚弾性改善剤、皮膚のたるみ予防又は改善剤、又は皮膚のハリの低下予防又は改善剤として選択され得る。皮膚弾性は、通常の方法、例えばキュートメーターやレオメーターを用いることなどによって測定することができる。

【0048】

また例えば、被験物質投与群における皮膚のシワが、対照群と比べて統計学的に有意に減少した場合、あるいは、対照群に対して９５％以下、好ましくは９０％以下である場合に、該被験物質は、皮膚のシワの予防又は改善剤として選択され得る。皮膚のシワは、通常の方法、例えばレプリカ法や、取得した画像を用いた３次元解析法などによって測定することができる。

【0049】

本発明の例示的実施形態として、さらに以下の物質、製造方法、用途、方法等を本明細書に開示する。ただし、本発明はこれらの実施形態に限定されない。

【0050】

〔１〕皮膚弾性改善剤の評価及び／又は選択方法であって：
ＢＲＧ−１を発現可能な組織又は細胞に、被験物質を適用すること；
該組織又は細胞における、ＢＲＧ−１の発現もしくは活性、又はＢＲＧ−１をコードする遺伝子の発現を測定すること；
該測定結果に基づいて、ＢＲＧ−１の発現もしくは活性、又はＢＲＧ−１をコードする遺伝子の発現を増強させる被験物質を、皮膚弾性改善剤として評価及び／又は選択すること、
を含む、方法。

【0051】

〔２〕皮膚のシワ又はたるみ予防又は改善剤の評価及び／又は選択方法であって：
ＢＲＧ−１を発現可能な組織又は細胞に、被験物質を適用すること；
該組織又は細胞における、ＢＲＧ−１の発現もしくは活性、又はＢＲＧ−１をコードする遺伝子の発現を測定すること；
該測定結果に基づいて、ＢＲＧ−１の発現もしくは活性、又はＢＲＧ−１をコードする遺伝子の発現を増強させる被験物質を、皮膚のシワ又はたるみ予防又は改善剤として評価及び／又は選択すること、
を含む、方法。

【0052】

〔３〕皮膚のハリの低下予防又は改善剤の評価及び／又は選択方法であって：
ＢＲＧ−１を発現可能な組織又は細胞に、被験物質を適用すること；
該組織又は細胞における、ＢＲＧ−１の発現もしくは活性、又はＢＲＧ−１をコードする遺伝子の発現を測定すること；
該測定結果に基づいて、ＢＲＧ−１の発現もしくは活性、又はＢＲＧ−１をコードする遺伝子の発現を増強させる被験物質を、皮膚のハリの低下予防又は改善剤として評価及び／又は選択すること、
を含む、方法。

【0053】

〔４〕好ましくは、前記皮膚弾性改善が、光老化によって生じた皮膚弾性低下の改善であり、また好ましくは、前記皮膚のシワ、たるみ、又はハリの低下が、光老化によって生じた皮膚のシワ、たるみ、又はハリの低下である、〔１〕〜〔３〕のいずれか１項記載の方法。

【0054】

〔５〕真皮細胞外マトリクス形成制御剤の評価及び／又は選択方法であって：
ＢＲＧ−１を発現可能な組織又は細胞に、被験物質を適用すること；
該組織又は細胞における、ＢＲＧ−１の発現もしくは活性、又はＢＲＧ−１をコードする遺伝子の発現を測定すること；
該測定結果に基づいて、ＢＲＧ−１の発現もしくは活性、又はＢＲＧ−１をコードする遺伝子の発現を変化させる被験物質を、真皮細胞外マトリクス形成制御剤として評価及び／又は選択すること、
を含む、方法。

【0055】

〔６〕弾性線維形成制御剤の評価及び／又は選択方法であって：
ＢＲＧ−１を発現可能な組織又は細胞に、被験物質を適用すること；
該組織又は細胞における、ＢＲＧ−１の発現もしくは活性、又はＢＲＧ−１をコードする遺伝子の発現を測定すること；
該測定結果に基づいて、ＢＲＧ−１の発現もしくは活性、又はＢＲＧ−１をコードする遺伝子の発現を変化させる被験物質を、弾性線維形成制御剤として評価及び／又は選択すること、
を含む、方法。

【0056】

〔７〕コラーゲン線維形成制御剤の評価及び／又は選択方法であって：
ＢＲＧ−１を発現可能な組織又は細胞に、被験物質を適用すること；
該組織又は細胞における、ＢＲＧ−１の発現もしくは活性、又はＢＲＧ−１をコードする遺伝子の発現を測定すること；
該測定結果に基づいて、ＢＲＧ−１の発現もしくは活性、又はＢＲＧ−１をコードする遺伝子の発現を変化させる被験物質を、コラーゲン線維形成制御剤として評価及び／又は選択すること、
を含む、方法。

【0057】

〔８〕前記ＢＲＧ−１の発現もしくは活性、又はＢＲＧ−１をコードする遺伝子の発現を増強させる被験物質を、真皮細胞外マトリクス形成促進剤として評価及び／又は選択することを含む、〔５〕記載の方法。

【0058】

〔９〕前記ＢＲＧ−１の発現もしくは活性、又はＢＲＧ−１をコードする遺伝子の発現を低下させる被験物質を、真皮細胞外マトリクス形成抑制剤として評価及び／又は選択することを含む、〔５〕記載の方法。

【0059】

〔１０〕前記ＢＲＧ−１の発現もしくは活性、又はＢＲＧ−１をコードする遺伝子の発現を増強させる被験物質を、弾性線維形成促進剤として評価及び／又は選択することを含む、〔６〕記載の方法。

【0060】

〔１１〕前記ＢＲＧ−１の発現もしくは活性、又はＢＲＧ−１をコードする遺伝子の発現を低下させる被験物質を、弾性線維形成抑制剤として評価及び／又は選択することを含む、〔６〕記載の方法。

【0061】

〔１２〕前記ＢＲＧ−１の発現もしくは活性、又はＢＲＧ−１をコードする遺伝子の発現を増強させる被験物質を、コラーゲン線維形成促進剤として評価及び／又は選択することを含む、〔７〕記載の方法。

【0062】

〔１３〕前記ＢＲＧ−１の発現もしくは活性、又はＢＲＧ−１をコードする遺伝子の発現を低下させる被験物質を、コラーゲン線維形成抑制剤として評価及び／又は選択することを含む、〔７〕記載の方法。

【0063】

〔１４〕前記ＢＲＧ−１を発現可能な組織又は細胞が、
好ましくは、哺乳動物から採取された皮膚組織、真皮組織、真皮細胞、及びそれらの培養物であり、
より好ましくは、哺乳動物から採取された真皮線維芽細胞又はその培養物である、
〔１〕〜〔１３〕のいずれか１項記載の方法。

【0064】

〔１５〕前記ＢＲＧ−１を発現可能な組織又は細胞が、好ましくは、ＢＲＧ−１又はその遺伝子を発現するように遺伝的に改変された哺乳動物の組織もしくは細胞、又はその培養物である、〔１〕〜〔１３〕のいずれか１項記載の方法。

【0065】

〔１６〕好ましくは、対照群におけるＢＲＧ−１の発現もしくは活性、又はＢＲＧ−１をコードする遺伝子の発現を測定することをさらに含み、該対照群が、ＢＲＧ−１を発現可能な組織又は細胞であって、被験物質を適用されていないものである、〔１〕〜〔１５〕のいずれか１項記載の方法。

【0066】

〔１７〕好ましくは、前記被験物質を適用した組織又は細胞におけるＢＲＧ−１の発現もしくは活性レベル、又はＢＲＧ−１をコードする遺伝子の発現レベルが、前記対照群におけるＢＲＧ−１の発現もしくは活性レベル、又はＢＲＧ−１をコードする遺伝子の発現レベルと比べて統計学的に有意に増加した場合に、該被験物質を、ＢＲＧ−１の発現もしくは活性、又はＢＲＧ−１をコードする遺伝子の発現を増強させる被験物質として選択することを含む、〔１６〕記載の方法。

【0067】

〔１８〕好ましくは、前記被験物質を適用した組織又は細胞におけるＢＲＧ−１の発現もしくは活性レベル、又はＢＲＧ−１をコードする遺伝子の発現レベルが、前記対照群におけるＢＲＧ−１の発現もしくは活性レベル、又はＢＲＧ−１をコードする遺伝子の発現レベルに対して１１０％以上、好ましくは１３０％以上、さらに好ましくは１５０％以上である場合に、該被験物質を、ＢＲＧ−１の発現もしくは活性、又はＢＲＧ−１をコードする遺伝子の発現を増強させる被験物質として選択することを含む、〔１６〕記載の方法。

【0068】

〔１９〕好ましくは、前記被験物質を適用した組織又は細胞におけるＢＲＧ−１の発現もしくは活性レベル、又はＢＲＧ−１をコードする遺伝子の発現レベルが、前記対照群におけるＢＲＧ−１の発現もしくは活性レベル、又はＢＲＧ−１をコードする遺伝子の発現レベルと比べて統計学的に有意に低下した場合に、該被験物質を、ＢＲＧ−１の発現もしくは活性、又はＢＲＧ−１をコードする遺伝子の発現を低下させる被験物質として選択することを含む、〔１６〕記載の方法。

【0069】

〔２０〕好ましくは、前記被験物質を適用した組織又は細胞におけるＢＲＧ−１の発現もしくは活性レベル、又はＢＲＧ−１をコードする遺伝子の発現レベルが、前記対照群におけるＢＲＧ−１の発現もしくは活性レベル、又はＢＲＧ−１をコードする遺伝子の発現レベルに対して９０％以下、好ましくは７０％以下、さらに好ましくは５０％以下である場合に、該被験物質を、ＢＲＧ−１の発現もしくは活性、又はＢＲＧ−１をコードする遺伝子の発現を低下させる被験物質として選択することを含む、〔１６〕記載の方法。

【0070】

〔２１〕好ましくは、前記被験物質を適用した組織又は細胞におけるＢＲＧ−１の発現もしくは活性レベル、又はＢＲＧ−１をコードする遺伝子の発現レベルが、前記対照群におけるＢＲＧ−１の発現もしくは活性レベル、又はＢＲＧ−１をコードする遺伝子の発現レベルと比べて統計学的に有意に増加した場合に、該被験物質を、皮膚弾性改善剤、皮膚のシワ又はたるみ予防又は改善剤、皮膚のハリの低下予防又は改善剤、真皮細胞外マトリクス形成促進剤、弾性線維形成促進剤、又はコラーゲン線維形成促進剤として、あるいはそれらの候補物質として選択することを含む、〔１６〕記載の方法。

【0071】

〔２２〕好ましくは、前記被験物質を適用した組織又は細胞におけるＢＲＧ−１の発現もしくは活性レベル、又はＢＲＧ−１をコードする遺伝子の発現レベルが、前記対照群におけるＢＲＧ−１の発現もしくは活性レベル、又はＢＲＧ−１をコードする遺伝子の発現レベルに対して１１０％以上、好ましくは１３０％以上、さらに好ましくは１５０％以上である場合に、該被験物質を、皮膚弾性改善剤、皮膚のシワ又はたるみ予防又は改善剤、皮膚のハリの低下予防又は改善剤、真皮細胞外マトリクス形成促進剤、弾性線維形成促進剤、又はコラーゲン線維形成促進剤として、あるいはそれらの候補物質として選択することを含む、〔１６〕記載の方法。

【0072】

〔２３〕好ましくは、前記被験物質を適用した組織又は細胞におけるＢＲＧ−１の発現もしくは活性レベル、又はＢＲＧ−１をコードする遺伝子の発現レベルが、前記対照群におけるＢＲＧ−１の発現もしくは活性レベル、又はＢＲＧ−１をコードする遺伝子の発現レベルと比べて統計学的に有意に低下した場合に、該被験物質を、真皮細胞外マトリクス形成抑制剤、弾性線維形成抑制剤、又はコラーゲン線維形成抑制剤として、あるいはそれらの候補物質として選択することを含む、〔１６〕記載の方法。

【0073】

〔２４〕好ましくは、前記被験物質を適用した組織又は細胞におけるＢＲＧ−１の発現もしくは活性レベル、又はＢＲＧ−１をコードする遺伝子の発現レベルが、前記対照群におけるＢＲＧ−１の発現もしくは活性レベル、又はＢＲＧ−１をコードする遺伝子の発現レベルに対して９０％以下、好ましくは７０％以下、さらに好ましくは５０％以下である場合に、該被験物質を、真皮細胞外マトリクス形成抑制剤、弾性線維形成抑制剤、又はコラーゲン線維形成抑制剤として、あるいはそれらの候補物質として選択することを含む、〔１６〕記載の方法。

【0074】

〔２５〕好ましくは、前記ＢＲＧ−１の発現もしくは活性、又はＢＲＧ−１をコードする遺伝子の発現を増強又は低下させる被験物質として選択された被験物質を、皮膚モデルに投与することをさらに含む、〔１〕〜〔２４〕のいずれか１項記載の方法。

【0075】

〔２６〕ＢＲＧ−１又はそれをコードする遺伝子を含む、皮膚弾性評価用マーカー。

【0076】

〔２７〕真皮におけるＢＲＧ−１の発現もしくは活性、又はＢＲＧ−１をコードする遺伝子の発現を測定することを含む、皮膚弾性評価方法。

【0077】

〔２８〕ＢＲＧ−１又はそれをコードする遺伝子を含む、真皮における細胞外マトリクス、弾性線維又はコラーゲン量の評価用マーカー。

【0078】

〔２９〕真皮におけるＢＲＧ−１の発現もしくは活性、又はＢＲＧ−１をコードする遺伝子の発現を測定することを含む、真皮における細胞外マトリクス、弾性線維又はコラーゲン量の評価方法。

【0079】

〔３０〕ＢＲＧ−１又はそれをコードする遺伝子を含む、皮膚のシワ、たるみ又はハリの低下の評価用マーカー。

【0080】

〔３１〕好ましくは、前記皮膚のシワ、たるみ、又はハリの低下が、光老化によって生じた皮膚のシワ、たるみ、又はハリの低下である、〔３０〕記載のマーカー。

【0081】

〔３２〕真皮におけるＢＲＧ−１の発現もしくは活性、又はＢＲＧ−１をコードする遺伝子の発現を測定することを含む、皮膚のシワ、たるみ、又はハリの低下の評価方法。

【0082】

〔３３〕好ましくは、前記皮膚のシワ、たるみ、又はハリの低下が、光老化によって生じた皮膚のシワ、たるみ、又はハリの低下である、〔３２〕記載の評価方法。

【実施例】

【0083】

以下、実施例を示し、本発明をより具体的に説明する。

【0084】

実施例１ ヒト皮膚におけるＢＲＧ−１発現
米国テキサス州ダラス近郊在住の６０歳代の健康な女性１５名（Ｃａｕｃａｓｉａｎ、Ａｓｉａｎ、Ｈｉｓｐａｎｉｃ及びＡｆｒｉｃａｎ Ａｍｅｒｉｃａｎを含む）を被験者とした。各被験者の上腕内側部及び前腕外側部の皮膚の弾性（Ｕｒ／Ｕｆ）を、キュートメーター（ＳＥＭ ５７５；Ｃｏｕｒａｇｅ ａｎｄ Ｋｈａｚａｋａ）を用いて計測した。

【0085】

続いて、皮膚科医が直径４ｍｍのパンチバイオプシーを用いて、各被験者の上腕内側部及び前腕外側部から皮膚組織を採取した。採取した皮膚組織は、即座にＲＮＡ ｌａｔｅｒ溶液（ＱＩＡＧＥＮ）に浸漬して保存した。保存した皮膚組織から、ＲＮｅａｓｙ ｍｉｃｒｏ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用い、添付のプロトコールに従ってトータルＲＮＡを回収した。得られたトータルＲＮＡより、Ｈｉｇｈ ｃａｐａｃｉｔｙ ＲＮＡ ｔｏ ｃＤＮＡ ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、添付のプロトコールに従ってｃＤＮＡを調製した。調製したｃＤＮＡを鋳型として、ＴａｑＭａｎ（登録商標）ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｓｓａｙｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、ＢＲＧ−１（Ｂｒａｈｍａ−ｒｅｌａｔｅｄ ｇｅｎｅ−１）遺伝子発現量を測定した。測定した値は、ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（ＧＡＰＤＨ）の遺伝子発現量で補正した。

【0086】

図１は、各被験者における上腕内側部または前腕外側部皮膚におけるＢＲＧ−１遺伝子発現量と皮膚弾性値（Ｕｒ／Ｕｆ）をプロットした図である。ＢＲＧ−１遺伝子の発現量が高いほど皮膚の弾性が高い傾向があり、ＢＲＧ−１発現と皮膚弾性値との間に統計学的に有意な関連性があることが示された。

【0087】

図２は、各被験者の上腕内側部（弱露光部）及び前腕外側部（露光部）皮膚でのＢＲＧ−１遺伝子発現量を示す。ＢＲＧ−１の発現は、弱露光部皮膚と比べて露光部皮膚では統計学的に有意に低下していた。図１及び図２に示した結果から、光老化による皮膚弾性低下にＢＲＧ−１が関与していること、及びＢＲＧ−１の発現量が皮膚弾性を反映していることが示された。

【0088】

実施例２ 線維芽細胞におけるＢＲＧ−１発現阻害が細胞外マトリクス（ＥＣＭ）形成に及ぼす影響
２４ウェルプレートに、正常ヒト真皮線維芽細胞（クラボウ）を１×１０⁵ｃｅｌｌｓ／ウェルの細胞密度で播種した。２４時間後、Ｌｉｐｏｆｅｃｔ Ａｍｉｎｅ ２０００試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、定法に従ってＣｏｎｔｒｏｌ ｓｉＲＮＡ（非特異的配列）、又はＢＲＧ−１特異的配列ｓｉＲＮＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を細胞に導入した。２４時間後、５００μＬのＤＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に交換して細胞を培養し、５日後、培養上清及び細胞を回収した。細胞をＣｅｌｌ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）で回収した後、超音波破砕を行い、細胞溶解液を得、ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてタンパク定量を行った。
得られた細胞溶解液については、タンパク定量値を基にタンパク量を揃え、常法に従って抗ヒトＢＲＧ−１抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）によるウェスタンブロッティング解析を行い、ＢＲＧ−１発現を調べた。また、培養上清については、細胞溶解液のタンパク定量値を参照して、細胞に由来するタンパク量が等しくなるように希釈し、常法に従って抗ヒトＣｏｌｌａｇｅｎ Ｉ抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、抗ヒトＭＭＰ−１抗体（ＡｂＤ Ｓｅｒｏｔｅｃ）、抗ヒトＴＩＭＰ−１抗体（Ｇｅｎｅ−Ｔｅｘ Ｉｎｃ．）、及び抗ヒトＭＦＡＰ−４抗体（ＡｄｉｐｏＧｅｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）によるウェスタンブロッティング解析を行い、Ｃｏｌｌａｇｅｎ Ｉ、ＭＭＰ−１（Ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−１；Ｃｏｌｌａｇｅｎ分解酵素）、ＴＩＭＰ−１（Ｔｉｓｓｕｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ Ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−１；生体内におけるＭＭＰインヒビター）、及びＭＦＡＰ−４（ｍｉｃｒｏｆｉｂｒｉｌｌａｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ４；エラスチン形成の必須因子）の発現を調べた。

【0089】

ウェスタンブロッティングの結果を図３に示す。ＢＲＧ−１特異的配列ｓｉＲＮＡを導入した細胞（ＢＲＧ−１ ｓｉＲＮＡ）では、ＢＲＧ−１発現が阻害され、かつＣｏｌｌａｇｅｎ Ｉ、ＴＩＭＰ−１及びＭＦＡＰ−４の発現レベルが減少した一方、ＭＭＰ−１の発現は増加した。したがって、ＢＲＧ−１発現の阻害により、コラーゲンや弾性線維の形成が低下し、またコラーゲンの分解が亢進した。この結果は、ＢＲＧ−１が真皮におけるコラーゲン及び弾性線維の形成や分解に関与していること、ＢＲＧ−１発現レベルの増強は、コラーゲン及び弾性線維の量を増加させ、ＥＣＭ形成を促進する一方で、ＢＲＧ−１発現レベルの低下は、コラーゲン及び弾性線維の量を減少させ、ＥＣＭ形成を抑制することを示している。

【0090】

実施例３ 線維芽細胞におけるＢＲＧ−１発現阻害が弾性線維形成に及ぼす影響
２４ウェルプレートの各ウェルにカバーガラスを設置し、その上に１×１０⁵ｃｅｌｌｓ／ウェルの細胞密度で線維芽細胞を播種した。２４時間後、実施例２と同様の手順でＣｏｎｔｒｏｌ ｓｉＲＮＡ、又はＢＲＧ−１特異的配列ｓｉＲＮＡを細胞に導入した。２４時間後に、５００μＬの１０％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）に交換し、細胞を培養した。７日後、細胞を氷冷メタノールで固定化した後、ＢＲＧ−１と弾性線維の免疫染色を下記手順で行った。
・ＢＲＧ−１
ウサギ抗ヒトＢＲＧ−１抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）とＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏ ４８８標識抗ウサギＩｇＧ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて細胞の免疫染色を行った。カバーガラスに接着した細胞をＰｒｏＬｏｎｇ Ｇｏｌｄ ａｎｔｉｆａｄｅ ｒｅａｇｅｎｔ ｗｉｔｈ ＤＡＰＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてスライドガラス上にマウントし、蛍光顕微鏡を用いてＢＲＧ−１発現（励起波長：４８８ｎｍ、観察波長：５２５ｎｍ）及び核（励起波長：３５０ｎｍ、観察波長：４７０ｎｍ）を観察した。
・弾性線維
マウス抗ヒトＦｉｂｒｉｌｌｉｎ−１抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）及びウサギ抗Ｅｌａｓｔｉｎ抗体（Ｅｌａｓｔｉｎ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｃｏｍｐａｎｙ）と、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏ ５４６標識抗マウスＩｇＧ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏ ４８８標識抗ウサギＩｇＧ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて細胞の免疫染色を行った。カバーガラスに接着した細胞をＰｒｏＬｏｎｇ Ｇｏｌｄ ａｎｔｉｆａｄｅ ｒｅａｇｅｎｔ ｗｉｔｈ ＤＡＰＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてスライドガラス上にマウントし、蛍光顕微鏡を用いて弾性線維の構成分子であるフィブリリン−１（励起波長：５４６ｎｍ、観察波長：５７３ｎｍ）、エラスチン（励起波長：４８８ｎｍ、観察波長：５２５ｎｍ）及び核（励起波長：３５０ｎｍ、観察波長：４７０ｎｍ）を観察した。

【0091】

免疫染色細胞の蛍光顕微鏡画像を図４及び５に示す。ＢＲＧ−１特異的配列ｓｉＲＮＡを導入した細胞（ＢＲＧ−１ ｓｉＲＮＡ）では、ＢＲＧ−１発現が低下し（図４Ａ）、かつ弾性線維の構成分子であるフィブリリン−１及びエラスチンが減少した（図５Ａ〜Ｂ）。一方で、ＢＲＧ−１発現阻害は、核の数に変化が認められないことから、細胞の生存率には影響しなかった（図４Ｂ及び図５Ｃ）。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]