特許 6573400 珪藻の新規形質転換ベクターおよびその含有する新規プロモーター配列

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6573400

(24)【登録日】2019年8月23日

(45)【発行日】2019年9月11日

(54)【発明の名称】珪藻の新規形質転換ベクターおよびその含有する新規プロモーター配列

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/80 20060101AFI20190902BHJP

   C12P 7/42 20060101ALI20190902BHJP

   C12N 1/13 20060101ALI20190902BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/80 Z

   C12P7/42ZNA

   C12N1/13

【請求項の数】8

【全頁数】44

(21)【出願番号】特願2016-547436(P2016-547436)

(86)(22)【出願日】2015年9月7日

(86)【国際出願番号】JP2015075372

(87)【国際公開番号】WO2016039300

(87)【国際公開日】20160317

【審査請求日】2018年9月6日

(31)【優先権主張番号】特願2014-182607(P2014-182607)

(32)【優先日】2014年9月8日

(33)【優先権主張国】JP

【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２３年度、独立行政法人科学技術振興機構、戦略的創造研究推進事業、先端的低炭素化技術開発、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願

(73)【特許権者】

【識別番号】513099603

【氏名又は名称】公立大学法人兵庫県立大学

(74)【代理人】

【識別番号】100101454

【弁理士】

【氏名又は名称】山田 卓二

(74)【代理人】

【識別番号】100062144

【弁理士】

【氏名又は名称】青山 葆

(74)【代理人】

【識別番号】100106518

【弁理士】

【氏名又は名称】松谷 道子

(72)【発明者】

【氏名】伊福 健太郎

(72)【発明者】

【氏名】菓子野 康浩

(72)【発明者】

【氏名】福澤 秀哉

(72)【発明者】

【氏名】梶川 昌孝

(72)【発明者】

【氏名】小川 順

【審査官】 田中 晴絵

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２０１４／０８８５６０（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特開平１１−４９６９５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開平１１−１１６４３１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１４−５１１１４０（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／８０

Ｃ１２Ｎ １／１３

Ｃ１２Ｐ ７／４２

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

配列番号１〜１０いずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチド。

【請求項2】

請求項１に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。

【請求項3】

請求項１に記載のポリヌクレオチドおよびターミネーター配列を含む第１発現カセット；および
請求項１に記載のポリヌクレオチド、薬剤耐性遺伝子、およびターミネーター配列を含む第２発現カセット；
を含む請求項２に記載のベクター。

【請求項4】

請求項２または３のベクターを宿主ツノケイソウ細胞へ導入することを特徴とする、ツノケイソウの形質転換方法。

【請求項5】

（１）配列番号１〜１０いずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（２）配列番号１〜１０いずれかの塩基配列に対して９０％以上の相同性を有し、かつ珪藻に目的遺伝子の発現をもたらすプロモーターとして機能するポリヌクレオチド；または
（３）配列番号１〜１０いずれかの塩基配列に対して１個以上５０個以下の塩基が付加、欠失および／または置換された塩基配列を有し、かつ珪藻に目的遺伝子の発現をもたらすプロモーターとして機能するポリヌクレオチド
から選択されるポリヌクレオチドおよび脂肪酸ヒドロキシラーゼ遺伝子を含むベクターを宿主珪藻細胞へ導入して形質転換体を得、当該形質転換体を培養することによってリシノール酸を得ることを特徴とする、リシノール酸の製造方法。

【請求項6】

該ポリヌクレオチドが配列番号１〜１０いずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチドである、請求項５に記載の方法。

【請求項7】

該宿主珪藻細胞が宿主ツノケイソウ細胞である、請求項５に記載の方法。

【請求項8】

該ポリヌクレオチドが配列番号１〜１０いずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチドであり、かつ、該宿主珪藻細胞が宿主ツノケイソウ細胞である、請求項５に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は藻類を形質転換するための、新規プロモーター、当該プロモーターを含むベクター、および当該ベクターを用いる藻類の形質転換方法に関するものである。

【背景技術】

【0002】

藻類の１つである海洋性珪藻は、いわゆる黄色植物と呼ばれるグループに属する単細胞真核生物である。珪藻は世界のＣＯ_２固定量の２０−４０％程度を担うとも見積もられており、一次生産者として地球環境に極めて重要な生物群である。珪藻類は、ＥＰＡ（エイコサペンタエン酸）に代表されるような、人間にとって有用な油脂などを合成する生物でもある。一般に、生物を工業的に利用するには、形質転換技術が用いられるが、藻類の形質転換効率は低いことが知られている。形質転換効率を上げるべく、種々の研究がなされているものの、依然としてその形質転換方法は限定的である。特に、海洋性中心目珪藻の１つであるツノケイソウについては、その遺伝子導入方法が研究されているがその形質転換効率は低い。Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ ｐｓｅｕｄｏｎａｎａ由来プロモーター含有Ｔｐｆｃｐ／ｎａｔプラスミドを用いたＣｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ ｓｐ．の形質転換では、形質転換効率は１．５〜６形質転換体／１０^８細胞と非常に低く、しかも導入遺伝子の発現は検出されなかった（非特許文献１）。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0003】

【非特許文献1】Miyagawa-Yamaguchi A, Okami T, Kira N, Yamaguchi H, Ohnishi K, and Adachi M (2011) Stable nuclear transformation of the diatom Chaetoceros sp., Phycol. Res. 59: 113-119

【非特許文献2】Miyahara M, Aoi M, Inoue-Kashino N, Kashino Y, Ifuku K (2013) Highly efficient transformation of the diatom Phaeodactylum tricornutum by multi-pulse electroporation, Biosci. Biotechnol. Biochem. 77: 874-876

【非特許文献3】Karasawa S, Araki T, Yamamoto-Hino M, Miyawaki A (2003) A green-emitting fluorescent protein from Galaxeidae coral and its monomeric version for use in fluorescent labeling, J. Biol. Chem. 278: 34167-34171

【非特許文献4】Poulsen N, Kroeger N (2005) A new molecular tool for transgenic diatoms, FEBS J. 272: 3413-3423

【非特許文献5】Poulsen N, Chesley PM, Kroeger N (2006) Molecular genetic manipulation of the diatom Thalassiosira pseudonana (Bacillariophyceae), J. Phycol. 42: 1059-1065

【非特許文献6】Guillard RR, Ryther JH (1962) Studies of marine planktonic diatoms. I. Cyclotella nana Hustedt, and Detonula confervacea (cleve) Gran. Can J Microbiol 8: 229-239

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0004】

本発明は、藻類（例えば、珪藻）を形質転換するための新規プロモーター、それを含有する新規形質転換ベクター、およびそのベクターを用いる藻類の形質転換方法を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0005】

本発明者らは、上記課題を解決すべく検討した結果、Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ ｇｒａｃｉｌｉｓで高発現している遺伝子のプロモーターが、藻類（例えば、珪藻）を極めて効率的に形質転換できることを見出し、本発明を完成した。

【0006】

本発明は、下記：
（１）配列番号１〜１０いずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（２）配列番号１〜１０いずれかの塩基配列に対して８０％以上の相同性を有し、かつ藻類に目的遺伝子の発現をもたらすプロモーターとして機能するポリヌクレオチド；
（３）配列番号１〜１０いずれかの塩基配列に対して１個または数個の塩基が付加、欠失および／または置換された塩基配列を有し、かつ藻類に目的遺伝子の発現をもたらすプロモーターとして機能するポリヌクレオチド；
を提供する。なお、本明細書において上記（１）〜（３）のポリヌクレオチドを、本発明にかかるプロモーター配列、または本発明のプロモーター配列と称する場合がある。

【0007】

本発明は、上記ポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。

【0008】

本発明は、
上記ポリヌクレオチドおよびターミネーター配列を含む第１発現カセット；または
上記ポリヌクレオチド、薬剤耐性遺伝子およびターミネーター配列を含む第２発現カセット；を含む、あるいは、これらの両方の発現カセット含むベクターを提供する。

【0009】

本発明は、上記ベクターを宿主藻類細胞へ導入することを特徴とする、藻類の形質転換方法を提供する。

【0010】

さらに本発明は、上記ポリヌクレオチドおよび脂肪酸ヒドロキシラーゼ遺伝子（例えば脂肪酸２−ヒドロキシラーゼ遺伝子、より具体的にはオレイン酸１２−ヒドロキシラーゼ遺伝子）を含むベクターを宿主藻類細胞へ導入して形質転換体を得、当該形質転換体を培養することによってリシノール酸を得ることを特徴とする、リシノール酸の製造方法を提供する。

【発明の効果】

【0011】

本発明にかかるプロモーター配列は、藻類（例えば、珪藻）を効率的に形質転換し得る。

【図面の簡単な説明】

【0012】

【図1】Ｃ．ｇｒａｃｉｌｉｓの増殖に対するノウルセオトリシン（ＮＴＣ）の影響 細胞を種々の濃度の抗生物質を含有するＩＭＫ培地でＯＤ７００＝０．０７にて継代培養し、連続的光照射（３０μｍｏｌ光子ｍ^−２ｓ^−１）下、２０℃で２８日増殖させた。

【図2】多重パルスエレクトロポレーションのパルス計画の説明 マルティプル高電圧ポアリングパルス（Ｐ．Ｐ．：９パルス、３００Ｖ、５ｍｓ継続、２５ｍｓインターバル、１０％減衰率）は、細胞膜に一時的な孔の形成を促進し、その後のマルティプル低電圧トランスファーパルス（Ｔ．Ｐ．：各極性について４０パルス、８Ｖ、５０ｍｓ継続、５０ｍｓインターバル、４０％減衰率）は細胞内部へのＤＮＡの導入を促進する。

【図3A】ノウルセオトリシン耐性遺伝子（ｎａｔ）発現を駆動する種々のプロモーターを含有するｐＵＣベクターを用いたＣ．ｇｒａｃｉｌｉｓ細胞の形質転換効率 ４００μｇ／ｍＬノウルセオトリシン含有ＩＭＫ寒天プレートで形質転換細胞を選択した。エラーバーは±ＳＥ（ｎ＝３〜７）を示す。従来のベクター（左端）に比べ、今回単離したプロモーターは、１００〜２００倍の形質転換効率を示した。

【図3B】選択培地上のノウルセオトリシン耐性形質転換体のコロニー

【図4A】制限酵素切断部位が記されたＣ．ｇｒａｃｉｌｉｓ形質転換ベクターのマップ−Ｌｈｃｒ５（ｆｃｐ遺伝子）のプロモーター−ノウルセオトリシン耐性遺伝子（ｎａｔ） Ｌｈｃｒ５（ｆｃｐ遺伝子）、Ｌｈｃｆ４（ｆｃｐ遺伝子）、硝酸レダクターゼ遺伝子（ＮＲ）、およびアセチル‐ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ遺伝子（ＡＣＡＴ）のプロモーターをそれぞれ、外来性遺伝子用クローニング部位の直前に設置した。ベクター中、構成的ＡＣＡＴプロモーターは、ノウルセオトリシン耐性遺伝子（ｎａｔ）の発現を駆動する。Ｌｈｃｒ１４遺伝子のターミネーターを両発現カセットの末端に設置した。ＨｉｎｄＩＩＩ部位またはＥｃｏＲＩ部位は形質転換のためにベクターを直鎖化するために使用することができる。 当該構築物はまた、アンピシリン耐性遺伝子（ＡｍｐＲ）およびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉの複製起点を含有する。

【図4B】制限酵素切断部位が記されたＣ．ｇｒａｃｉｌｉｓ形質転換ベクターのマップ−硝酸レダクターゼ遺伝子（ＮＲ）のプロモーター−ノウルセオトリシン耐性遺伝子（ｎａｔ）

【図4C】制限酵素切断部位が記されたＣ．ｇｒａｃｉｌｉｓ形質転換ベクターのマップ−Ｌｈｃｆ４（ｆｃｐ遺伝子）のプロモーター−ノウルセオトリシン耐性遺伝子（ｎａｔ）

【図4D】制限酵素切断部位が記されたＣ．ｇｒａｃｉｌｉｓ形質転換ベクターのマップ−アセチル‐ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ遺伝子（ＡＣＡＴ）のプロモーター−ノウルセオトリシン耐性遺伝子（ｎａｔ）

【図5】トランスジェニックＣ．ｇｒａｃｉｌｉｓ細胞における導入遺伝子の組込みおよびｍＲＮＡ発現（Ａ） ｐＣｇＬｈｃｒ５ｐ−ｌｕｃで形質転換されたトランスジェニックＣ．ｇｒａｃｉｌｉｓ株中のｎａｔ、ｌｕｃ、およびｐｓｂ３１遺伝子のＰＣＲ増幅 野生型（ＷＴ）および４つのノウルセオトリシン耐性クローンから単離したゲノムＤＮＡを鋳型ＤＮＡとして使用した。Ｍ：１００ｂｐサイズラダーマーカー（Ｂ）各遺伝子のｍＲＮＡ発現を示すＲＴ−ＰＣＲ分析（Ｃ）ゲノムサザンブロット分析 総ゲノムＤＮＡ（５μｇ）をＥｃｏＲＩ（左）またはＢａｍＨＩ（右）で切断し、１％アガロースゲルで分離して、ナイロン膜にブロットした。ルシフェラーゼコード領域用のジゴキシゲニン（ＤＩＧ）標識ＤＮＡプローブを用いて、導入遺伝子を含むＤＮＡフラグメントを検出した。

【図6】繰り返し継代培養を重ねた場合のルシフェラーゼ活性の安定性 トランスジェニックＬｈｃｒ５ｐ−ｌｕｃ細胞（株２）を、ノウルセオトリシンの存在下（黒）または非存在下（白）で、１週間サイクルで継代培養した。 ノウルセオトリシンの存在下での第１回目の継代培養の活性を１００％とした。

【図7】Ｌｈｃｒ５プロモーターの制御下で単量体アザミグリーンタンパク質（ｍＡＧ）を発現するトランスジェニックＣ．ｇｒａｃｉｌｉｓ細胞の光学顕微鏡写真（Ａ）および蛍光顕微鏡写真（Ｂ） ｍＡＧタンパク質の存在は、緑色蛍光により示された。 スケールバーは１０μｍである。

【図8】硝酸レダクターゼ遺伝子（ＮＲ）のプロモーター制御下でのルシフェラーゼ（ｌｕｃ）活性の誘導 ｐＣｇＮＲｐ−ｌｕｃで形質転換したＣ．ｇｒａｃｉｌｉｓのトランスジェニック細胞株をアンモニウム培地で培養し、硝酸培地（ＮＯ_３⁻）または新しいアンモニウム培地（ＮＨ４^＋）に移した。ｘ軸は培地交換後の時間を示す。ａ．ｕ．：任意単位エラーバーは±ＳＥ（ｎ＝３）を示す。

【図9】ｐＣｇＬｈｃｒ５−ＣｐＦＡＨで形質転換したトランスジェニックＣ．ｇｒａｃｉｌｉｓの脂質分析

【図10A】ＣｐＦＡＨ−４株のＭＳプロファイル

【図10B】ＣｐＦＡＨ−４株のＭＳプロファイル

【図10C】ＣｐＦＡＨ−４株のＭＳプロファイル

【図10D】ＣｐＦＡＨ−４株のＭＳプロファイル

【図11】ＲＴ−ＰＣＲ結果

【図12】ＣｐＦＡＨ−３株およびＣｐＦＡＨ−４株のリシノール酸の量 リシノール酸は、乾燥細胞重量の０．２〜０．３％（ｗ／ｗ）にまで蓄積した。

【図13】Ｃ．ｇｒａｃｉｌｉｓのＬｈｃｒ５ｐ−ＣｐＦＡＨ株の主な脂肪酸組成 リシノール酸（１８：１−ＯＨ）：ＣｐＦＡＨ株中の総脂肪酸の４．８〜６．７％ １６：１−ＯＨ：ＣｐＦＡＨ株中の総脂肪酸の１．０％

【図14A】制限酵素切断部位が記されたＣ．ｇｒａｃｉｌｉｓ形質転換ベクターのマップ−Ｌｈｃｆ４（ｆｃｐ遺伝子）のプロモーター−ゼオシン耐性遺伝子（ｂｌｅ）

【図14B】制限酵素切断部位が記されたＣ．ｇｒａｃｉｌｉｓ形質転換ベクターのマップ−硝酸レダクターゼ遺伝子（ＮＲ）のプロモーター−ゼオシン耐性遺伝子（ｂｌｅ）

【発明を実施するための形態】

【0013】

本発明のプロモーター配列
本発明において、プロモーター配列とは、藻類細胞、例えば珪藻類、特にツノケイソウ類細胞において、その下流に配置された任意の目的遺伝子の発現を制御し得る配列を意味する。

【0014】

本発明のプロモーター配列は、Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ ｇｒａｃｉｌｉｓで高発現している遺伝子の上流に位置する非コード領域を構成するポリヌクレオチドを、当該技術分野に一般的な方法、例えば、ドラフト解析およびＲＮＡシークエンシング分析を行うことによって、探索することができる。

【0015】

Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ ｇｒａｃｉｌｉｓで高発現している遺伝子の上流に位置する非コード領域を構成するポリヌクレオチドには、例えば、下記の配列が挙げられる：
ＣｇLｈｃｒ１４ｐ （配列番号１）；
ＣｇＡＣＡＴｐ （配列番号２）；
ＣｇLｈｃｒ５ｐ （配列番号３）；
ＣｇＡＣＳＬｐ （配列番号４）；
ＣｇＮＲｐ （配列番号５）；
ＣｇｂＴｕｂｌｉｎｐ （配列番号６）；
ＣｇＡＴＰＳｐ （配列番号７）；
ＣｇＬｈｃｆ４ｐ （配列番号８）；
ＣｇＬｈｃｆ１ｐ＿Ａ （配列番号９）；
ＣｇＬｈｃｆ１ｐ＿Ｂ （配列番号１０）。

【0016】

本発明のプロモーター配列には、（１）配列番号１〜１０いずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチドが挙げられる

【0017】

本発明のプロモーター配列には、（２）配列番号１〜１０いずれかの塩基配列に対して８０％以上、９０％以上、９５％以上、９７％、または９９％以上の相同性を有し、かつ藻類に目的遺伝子の発現をもたらすプロモーターとして機能するポリヌクレオチドが挙げられる。

【0018】

本発明のプロモーター配列には、（３）配列番号１〜１０いずれかの塩基配列に対して１個または数個（１以上１００以下が好ましく、１以上５０以下がより好ましく、１以上３０以下がさらに好ましく、１以上１０以下がさらに好ましく、１以上５以下が特に好ましい）の塩基配列が付加、欠失および／または置換された塩基配列を有し、かつ藻類に目的遺伝子の発現をもたらすプロモーターとして機能するポリヌクレオチドが挙げられる。

【0019】

本発明のプロモーター配列は、当該技術分野に一般的な方法、例えば、Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ ｇｒａｃｉｌｉｓで高発現している遺伝子の上流から分離することにより入手することができ、ＰＣＲ法により増幅して使用することができる。あるいは化学的に合成しても良い。

【0020】

「目的遺伝子」は、生産の望まれるタンパク質をコードする遺伝子であって、特に限定されない。

【0021】

本発明のベクター
本発明は、上記プロモーター配列を含むベクターを提供する。
本発明のベクターは、本願発明に係るプロモーター配列を１またはそれ以上（例えば１〜５個、１〜３個、１または２個）含んでいてもよい。
ベクターの種類は、藻類細胞へ導入され得るものであれば特に限定されない。例えば、プラスミドベクター、ファージベクター、およびコスミドベクターなどのベクターが挙げられ、好ましくはプラスミドベクターが挙げられる。

【0022】

本発明のベクターは任意の目的遺伝子を導入するのに用いられる。目的遺伝子としては、例えばリシノール酸合成酵素などが挙げられる。

【0023】

本発明のベクターには、本発明のプロモーター配列によって発現が制御されうる任意の薬剤耐性遺伝子を含んでいてもよい。例えば、形質転換体を選択するための薬剤耐性遺伝子（例えば、ノウルセオトリシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、ゼオシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、エリスロマイシン耐性遺伝子）が挙げられる。複数の薬剤耐性を用いた選抜は、宿主細胞への遺伝子の多重導入に使用されうる。

【0024】

本発明のベクターは、一般的なベクターに含まれるその他の配列を含んでいてもよい。例えば、目的遺伝子の発現を調節するオペレーター、ターミネーター、エンハンサーなどのいわゆる調節配列を含んでいてもよい。さらに、本発明とは異なるプロモーターやそれに制御される遺伝子（例えば薬剤耐性遺伝子）などを含んでいてもよい。

【0025】

本発明のベクターは、当業者に周知の方法によって作成することができる。例えば、適切な制限酵素部位を設けたプライマーを用いて本発明のプロモーター配列を増幅し、制限酵素で切断したドナーベクターに挿入することによって得られる。あるいはＩｎ-Ｆｕｓｉｏｎ^（商標）反応を用いる方法によっても作成することができる。

【0026】

本発明のプロモーター配列はその下流にターミネーター配列が組み込まれた発現カセットとしてドナーベクターに導入してもよい。プロモーター配列とターミネーター配列の間に目的遺伝子が組み込まれていても良い。
目的遺伝子を挿入するために、プロモーター配列とターミネーター配列の間には、制限酵素の切断部位が複数存在する多重クローニング部位が存在することが望ましい。
本発明におけるターミネーター配列は藻類細胞で機能するものであれば特に限定されないが、例えばＣｇＬｈｃｒ１４のターミネーター配列：ＣｇＬｈｃｒ１４ｔｅｒ（配列番号１１）が挙げられる。

【0027】

本発明において、発現カセットとは：
プロモーター配列とターミネーター配列を少なくとも含む核酸構築物；
プロモーター配列と目的遺伝子を少なくとも含む核酸構築物；または
プロモーター配列、目的遺伝子、およびターミネーター配列を少なくとも含む核酸構築物；
を意味し、イントロン、スペーサー配列、エンハンサー配列等を含んでいてもよい。

【0028】

本発明のベクターは：
プロモーター配列およびターミネーター配列を含む第１発現カセット；または
プロモーター配列、薬剤耐性遺伝子およびターミネーター配列を含む第２発現カセット；を有していてもよく、あるいは、これらの両方を有していてもよい。
第１発現カセットは目的遺伝子を挿入するために使用され得る。あるいは、第１発現カセットには目的遺伝子が挿入されていてもよい。
第２発現カセットは形質転換体を選定するために使用され得る。

【0029】

本発明において、第１発現カセットとしては、本願発明に係るプロモーター配列（例えば、ＣｇLｈｃｒ１４ｐ；ＣｇＡＣＡＴｐ；ＣｇLｈｃｒ５ｐ；ＣｇＡＣＳＬｐ；ＣｇＮＲｐ；ＣｇｂＴｕｂｌｉｎｐ；ＣｇＡＴＰＳｐ；ＣｇＬｈｃｆ４ｐ；ＣｇＬｈｃｆ１ｐ＿Ａ；もしくはＣｇＬｈｃｆ１ｐ＿Ｂ、またはそれらと８０％以上の相同性を有するポリヌクレオチド）とその下流に組み込まれたターミネーター配列（例えばＣｇＬｈｃｒ１４ｔｅｒ）を含む発現カセットが挙げられる。

【0030】

本発明において、第２発現カセットとしては、本願発明に係るプロモーター配列（例えば、ＣｇLｈｃｒ１４ｐ；ＣｇＡＣＡＴｐ；ＣｇLｈｃｒ５ｐ；ＣｇＡＣＳＬｐ；ＣｇＮＲｐ；ＣｇｂＴｕｂｌｉｎｐ；ＣｇＡＴＰＳｐ；ＣｇＬｈｃｆ４ｐ；ＣｇＬｈｃｆ１ｐ＿Ａ；もしくはＣｇＬｈｃｆ１ｐ＿Ｂ、またはそれらと８０％以上の相同性を有するポリヌクレオチド）、その下流に組み込まれたターミネーター配列（例えばＣｇＬｈｃｒ１４ｔｅｒ）、およびプロモーター配列とターミネーター配列の間に組み込まれた薬剤耐性遺伝子（例えばｎａｔ、ｂｌｅ）を含む発現カセットが挙げられる。

【0031】

形質転換方法
本発明は、上記ベクターを宿主藻類細胞へ導入することを特徴とする、藻類の形質転換方法を提供する。

【0032】

宿主藻類細胞に本発明のベクターを導入するには、当業者に周知の方法を用いることができ、例えば、パーティクルガン法、ガラスビーズ攪拌法、マイクロインジェクション法、アグロバクテリウム法、酢酸リチウム法、リン酸カルシウム法、プロトプラスト法、多重パルスエレクトロポレーション法などの方法が挙げられる。

【0033】

本発明の方法に使用する宿主は、藻類細胞であれば特に限定されない。好ましい宿主藻類細胞の例は、珪藻類（例えば中心目珪藻または羽状目珪藻）およびその変異体が挙げられ、好ましくはツノケイソウおよびその変異体、より好ましくはＣｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ ｇｒａｃｉｌｉｓおよびその変異体が挙げられる。

【0034】

本発明の方法において、目的遺伝子が宿主細胞中の、染色体、プラスミド、プラスチドもしくはミトコンドリアＤＮＡに組み込まれた状態で宿主細胞に保持されることによって、宿主細胞を形質転換することができる。

【0035】

培養
形質転換体の培養条件は、宿主藻類細胞、プロモーター配列、目的遺伝子に基づいて適宜選択することができる。
形質転換体の培養は、振とう培養、連続培養等の通常の培養方法を用いて行うことができる。培養条件は、培養方法等により適宜選択すればよい。

【0036】

リシノール酸の製造方法
さらに本発明は、本発明にかかるプロモーター配列および脂肪酸ヒドロキシラーゼ遺伝子を含むベクターを宿主藻類細胞へ導入して形質転換体を得、当該形質転換体を培養することによってリシノール酸を得ることを特徴とする、リシノール酸の製造方法を提供する。
リシノール酸は炭素数１８のω−９脂肪酸の一価不飽和脂肪酸であり、Ｃ１２位にヒドロキシル基を持つ。リシノール酸は、脂肪酸ヒドロキシラーゼ（例えば脂肪酸２−ヒドロキシラーゼ、より具体的にはオレイン酸１２−ヒドロキシラーゼ）により、炭素数１８のω−９脂肪酸の一価不飽和脂肪酸であるオレイン酸の１２位にヒドロキシル基が付加されることによって、合成される。

【化1】

【0037】

脂肪酸ヒドロキシラーゼ遺伝子には、例えば、麦角菌（Ｃｌａｖｉｃｅｐｓ ｐｕｒｐｕｒｅａ）ＮＢＲＣ６２６３株由来の脂肪酸２−ヒドロキシラーゼ（オレイン酸１２−ヒドロキシラーゼ）遺伝子（ＣｐＦＡＨ（配列番号１２））が挙げられる。当該ＣｐＦＡＨと８０％以上、９０％以上、９５％以上、または９７％以上の相同性を有する塩基配列からなり、かつ脂肪酸ヒドロキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子も、本願発明の脂肪酸ヒドロキシラーゼ遺伝子に含まれる。
藻類は全般的にオレイン酸生合成能を有することが知られている。リシノール酸の製造において、藻類細胞であれば宿主は特に限定されない。好ましい宿主藻類細胞の例は、珪藻類（例えば中心目珪藻または羽状目珪藻）およびその変異体が挙げられ、好ましくはツノケイソウおよびその変異体、より好ましくはＣｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ ｇｒａｃｉｌｉｓおよびその変異体が挙げられる。
リシノール酸を合成するための培地としては、形質転換体を培養することによってリシノール酸が合成される培地であれば特に限定されない。
宿主細胞が珪藻である場合には、珪藻が生育可能な一般的な培地であればよい。
培養温度はリシノール酸が産生される温度であれば特に限定されない。例えば、宿主細胞が珪藻（例えばツノケイソウ）である場合には、１５〜３５℃が好ましく、１８〜２５℃がより好ましい。
宿主が海洋性珪藻類である場合、培地の例として、海塩および０．２ｍＭ Ｎａ_２ＳｉＯ_３を補充したダイゴＩＭＫ培養培地が挙げられる。
宿主が海洋性珪藻類である場合、培養条件として、５０μｍｏｌ光子ｍ^−２ｓ^−１下、振とう培養が挙げられる。

【0038】

下表に本発明のプロモーター配列の例：配列番号１〜１０を示す。

【0039】

【表1】

【0040】

【表2】

【0041】

【表3】

【0042】

【表4】

【0043】

【表5】

【0044】

【表6】

【0045】

【表7】

【0046】

【表8】

【0047】

【表9】

【0048】

【表10】

【0049】

下表にＣｇＬｈｃｒ１４のターミネーター配列：ＣｇＬｈｃｒ１４ｔｅｒ（配列番号１１）を示す。

【0050】

【表11】

【0051】

下表に麦角菌（Ｃｌａｖｉｃｅｐｓ ｐｕｒｐｕｒｅａ ＮＢＲＣ６２６３）由来の脂肪酸２−ヒドロキシラーゼ遺伝子（ＣｐＦＡＨ）（配列番号１２）を示す。

【0052】

【表12】

【実施例】

【0053】

以下、本発明を製造例によりさらに詳しく説明するが、本発明はこれらの例に限定されない。

【0054】

実施例１
材料および方法
＜珪藻培養＞
Ｃ．ｇｒａｃｉｌｉｓをthe University of Texas Culture Collectionから入手し、海塩（Ｓｉｇｍａ、セントルイス、ＭＯ、ＵＳＡ）および０．２ｍＭ Ｎａ_２ＳｉＯ_３を補充したダイゴＩＭＫ培養培地（日本製薬（株）、大阪、日本）で培養した。人工気象インキュベーター中、２０℃で増殖させた。白色蛍光灯で、連続光条件下、３０μｍｏｌ光子ｍ^−２ｓ^−１の放射照度を提供した。特に記載する場合には、当該珪藻細胞を、唯一の窒素源として０．８８ｍＭ ＮＨ_４Ｃｌ（アンモニウム培地）または０．８８ｍＭ ＮａＮＯ_３（硝酸培地）を含有するｆ／２培地（非特許文献６）で培養した。

【0055】

ノウルセオトリシン耐性プラスミドの構築
ノウルセオトリシン耐性遺伝子ｎａｔ（配列番号１３）をｐＹＬ１６プラスミド（ＷＥＲＮＥＲ ＢｉｏＡｇｅｎｔｓ、Ｊｅｎａ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から切除し、ｐＵＣ１１８（タカラバイオ）のＢａｍＨＩ−ＰｓｔＩ部位へサブクローンした。ついで、下記表Ａに記載されるプライマーを用いて、フコキサンチンクロロフィルａ／ｃ結合タンパク質（ｆｃｐ）遺伝子ＣｇＬｈｃｒ１４のターミネーター領域：ＣｇＬｈｃｒ１４ｔｅｒ（１１０ｂｐ、配列番号１１）をゲノムＰＣＲで増殖し、Ｉｎ-Ｆｕｓｉｏｎ^（商標）反応（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）によって下流のＨｉｎｄＩＩＩ部位に挿入した。最後に、Ｃ．ｇｒａｃｉｌｉｓのプロモーター領域をゲノムＰＣＲで増幅し、ｐＵＣ１１８の上流のＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ部位にサブクローンした。増幅したプロモーター配列の長さおよびＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪデータベースでの受託番号を下記表Ｂに示す。ゲノムＰＣＲで使用したプライマーセットは下記表Ａに示される。

【0056】

【表13】

【0057】

【表14-1】

【表14-2】

【0058】

【表15】

【0059】

＜ｐＣｇＬｈｃｒ５ｐベクター（登録番号AB981621）およびｐＣｇＮＲｐベクター（登録番号AB981622）の構築＞
（登録番号はDNA DATA BANK of JAPAN(DDBJ)の登録番号）
構成的遺伝子発現用プラスミドｐＣｇＬｈｃｒ５ｐをいくつかのステップで構築した。 下記の構築工程で使用したＰＣＲプライマーは上記表Ａに記載される。第１の発現カセットを作成するために、ｆｃｐ ＣｇＬｈｃｒ５のプロモーター領域（８１１ｂｐ）を、ＣｇＬｈｃｒ１４のターミネーター配列がＨｉｎｄＩＩＩ部位に挿入されたｐＵＣ１１８のＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ部位に挿入した。得られたプラスミドは、短いクローニング部位（ＢａｍＨＩ、ＸｂａＩ、ＳａｌＩ、ＰｓｔＩ）を有し、これにより所望の遺伝子を挿入することが可能である。
抗生物質選択用の第２の発現カセットを構築するために、アセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ（ＡＣＡＴ）遺伝子のプロモーター領域（６２６ｂｐ）およびＣｇＬｈｃｒ１４のターミネーター配列を含有するｐＵＣ１１８ベクターを同様に構築した。ついで、５’−末端および３’−末端にＢｇｌＩＩおよびＮｓｉＩ部位を有するｎａｔ遺伝子フラグメントをｐＹＬ１６からＰＣＲで増幅し、第２の発現カセットのＢａｍＨＩ−ＰｓｔＩ部位に挿入した。これにより第２の発現カセットにおけるＢａｍＨＩ−ＰｓｔＩ部位が破壊される（ＢａｍＨＩ／ＢｇｌＩＩおよびＰｓｔＩ／ＮｓｉＩペアは、共通の相補末端を生み出す）。最後に、２つの発現カセットを組み合わせて（第１の発現カセットの完全なプロモーター−ターミネータカセットをＰＣＲで増幅し、第２の発現カセットを含有するｐＵＣ１１８ベクターのＥｃｏＲＩ部位にＩｎ-Ｆｕｓｉｏｎ^（商標）反応によって挿入した）、ｐＣｇＬｈｃｒ５ｐベクターを得た。いずれかの発現カセットの置き換えを容易にするためにＭｆｅＩ部位を２つのカセットの間に導入した。
誘導的遺伝子発現用のｐＣｇＮＲｐベクターを構築するために、ｐＣｇＬｈｃｒ５ｐベクター中のＣｇＬｈｃｒ５のプロモーター領域をＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ消化で切除し、上記で構築したノウルセオトリシン耐性プラスミドから同様の制限酵素処理で切り出した硝酸レダクターゼＣｇＮＲ遺伝子のプロモーター領域（６３１ｂｐ）で置き換えた。
上記表Ａのプライマーを用いてルシフェラーゼ遺伝子（配列番号４４）およびアザミグリーン遺伝子（配列番号４５）をＰＣＲで増幅し、ｐＣｇＬｈｃｒ５ｐまたはｐＣｇＮＲｐのＢａｍＨＩ−ＰｓｔＩ部位に挿入した。

【0060】

【表16】

【0061】

【表17】

【0062】

ｐＣｇＬｈｃｒ５ｐベクター（登録番号AB981621）の配列（配列番号５３）

【0063】

ｐＣｇＮＲｐベクター（登録番号AB981622）の配列（配列番号５５）

【0064】

＜エレクトロポレーションによるＣ．ｇｒａｃｉｌｉｓの形質転換＞
非特許文献２に記載されるように、かつ若干修正を加えて、ＮＥＰＡ２１装置（ＮＥＰＡＧＥＮＥ、千葉、日本）を用いて多重パルスエレクトロポレーション行った。対数増殖期（ＯＤ_７００＝０．２〜０．４）の珪藻細胞を遠心分離（７００×ｇ、４分間）により収集し、洗浄し、１０％（ｖ／ｖ）ＩＭＫ培地を含む０．７７Ｍマンニトールで再懸濁した。５．９×１０^６細胞を含有する懸濁液（０．１５ｍＬ）をＨｉｎｄＩＩＩによって直鎖化されたプラスミド（５μｇ）と混合し、ついで０．２ｃｍ幅のエレクトロポレーションキュベットに移した。３００Ｖの矩形ポアリングパルス（パルス継続時間、５ｍｓ；９パルス；インターバル５０ｍｓ；１０％減衰率）を印加し、続いて８Ｖのトランスファーパルス（パルス継続時間、５０ｍｓ；各極性について４０パルス；インターバル５０ｍｓ；４０％減衰率）を行った。エレクトロポレーションの後、細胞を４ｍＬのＩＭＫ培地に移し、ついで非選択的培地で回復させるために、２０℃、１６〜２０時間、３０μｍｏｌ光子ｍ^−２ｓ^−１の光強度下でインキュベートした。遠心分離（７００×ｇ、４分間以上）で細胞を収集し、ＩＭＫ培地（０．２ｍＬ）に再懸濁した。形質転換した細胞を１％寒天およびノウルセオトリシン（ｃｌｏｎＮａｔ、ＷＥＲＮＥＲ ＢｉｏＡｇｅｎｔｓ）（４００μｇ／ｍＬ）を含有するＩＭＫ寒天プレートで選択した。

【0065】

＜導入ＤＮＡのゲノムへの挿入の分析＞
ＤＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、フェンロ、オランダ）を用いて、選択培地上で２〜３回継代培養した野生型および形質転換した細胞からゲノムＤＮＡを単離した。単離したゲノムＤＮＡにおける統合遺伝子のＰＣＲ検出のために、上記表Ａに記載のプライマーペアをこの分析にも使用した。サザンブロッティングのために、単離したゲノムＤＮＡをＥｃｏＲＩまたはＢａｍＨＩで消化し、１％アガロースゲル上で分離し、およびキャピラリートランスファー法によってＨｙｂｏｎｄ ＮＸ膜（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ピスカタウェイ、ＮＪ、ＵＳＡ）上に移した。Ｈｙｂｏｎｄ ＮＸ膜上に移されたＤＮＡのＵＶ架橋結合はＵＶＰ ＣＬ−１０００クロスリンカー（ＵＶＰ Ｉｎｃ．、アップランド、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて行った。ｎａｔおよびｌｕｃＤＮＡプローブのジゴキシゲニン標識、該プローブと膜結合ＤＮＡとのハイブリダイゼーション、およびハイブリダイゼーションの検出は、ＤＩＧ ＤＮＡ Ｌａｂｅｌｉｎｇ ａｎｄ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ、インディアナポリス、ＩＮ、ＵＳＡ）を用い使用説明書に従って行った。

【0066】

＜形質転換した細胞における、導入ＤＮＡの発現の分析＞
ＲＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、野生型および形質転換した細胞から総ＲＮＡを単離した。ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ^（商標）ＲＴ ｒｅａｇｅｎｔ ｗｉｔｈ ｇＤＮＡ Ｅｒａｓｅｒ（タカラバイオ、大津、日本）で、ゲノムＰＣＲ分析で使用した同一プライマーを用いて、逆転写（ＲＴ）−ＰＣＲを行った。形質転換した珪藻細胞中の単量体アザミグリーンタンパク質（ｍＡＧ）の緑色蛍光を、ＢＺ−９０００蛍光顕微鏡（キーエンス、大阪、日本）で分析した。細胞が含まれる範囲を４８０ｎｍで活性化し、蛍光放射を５１０ｎｍで検出した。ルシフェラーゼアッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ、マディソン、ＷＩ、ＵＳＡ）とＬｕｍａｔ ＬＢ ９５０７照度計（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ、オークリッジ、ＴＮ、ＵＳＡ）を用いてルシフェラーゼアッセイを行った。ルシフェラーゼ活性は、Ｒｃ−Ｄｃタンパク質アッセイキットとウシ血清アルブミン標準品（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、ハーキュリーズ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて定量した細胞抽出物のタンパク質濃度により標準化した。

【0067】

結果
＜形質転換体の選択 ノウルセオトリシンの濃度決定＞
ノウルセオトリシン耐性を獲得した形質転換Ｃ．ｇｒａｃｉｌｉｓをスクリーニングするために、Ｃ．ｇｒａｃｉｌｉｓの成長を阻害するのに必要とされるノウルセオトリシンの濃度について試験した。図１に示すとおり、２８日の培養期間中、４００μｇｍＬ^−１ノウルセオトリシン（液体ＩＭＫ培地中）はＣ．ｇｒａｃｉｌｉｓの増殖を完全に阻害した。細胞の増殖は３００μｇｍＬ^−１ノウルセオトリシンで抑制されたが、接種後７日で回復を始めた。細胞密度の違いにかかわらずＩＭＫ寒天プレートでも同じような結果が得られた。それ故、Ｃ．ｇｒａｃｉｌｉｓ形質転換体の選択およびそれに続く維持培養のために、４００μｇｍＬ^−１ノウルセオトリシンを含有するＩＭＫ培地を使用した。

【0068】

＜種々のプロモーターを含有するノウルセオトリシン耐性プラスミドを用いたＣ．ｇｒａｃｉｌｉｓの形質転換＞
下流の遺伝子が高発現（ＲＮＡシークエンシング分析によって見積もられた）している、１０個のプロモーターを選定した。それぞれ上記表Ａのプライマーを用いて単離した。それぞれの配列は表１〜１０に示す。当該単離されたプロモーターの下流の遺伝子は、以下のタンパク質をコードしていた（上記表Ｂ）；４つのＦＣＰタンパク質（Ｌｈｃｒ５、Ｌｈｃｒ１４、Ｌｈｃｆ１（ＣｇＬｈｃｆ１ｐ＿ＡとＣｇＬｈｃｆ１ｐ＿Ｂの遺伝子産物）、およびＬｈｃｆ４）、アセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ（ＡＣＡＴ）、長鎖アセチル−ＣｏＡシンテターゼ（ＡＣＳＬ）、β−チューブリン（ｂＴｕｂｌｉｎ）、ＡＴＰシンターゼ（ＡＴＰＳ）、および硝酸レダクターゼ（ＮＲ）。ｐＵＣ１１８中、ｎａｔ遺伝子の上流に５’−ＵＴＲを含む単離したプロモーターを挿入した。ｎａｔ遺伝子の後には転写ターミネータとしてＬｈｃｒ１４遺伝子の３’−ＵＴＲ配列が挿入された。当該ベクターは制限酵素消化によって直鎖化され、形質転換反応に使用された。
ノウルセオトリシン耐性プラスミドのＣ．ｇｒａｃｉｌｉｓ細胞への導入は多重パルスエレクトロポレーション（非特許文献２）によって行った。短時間の多重高電圧パルス（ポアリングパルス）は、細胞膜に一時的な穴の形成を促進し、続く長時間の多重低電圧パルス（トランスファーパルス）は、細胞内へのＤＮＡの送達を促進する。

【0069】

図３Ａは、異なるプロモーターを含有するｐＵＣベクターを用いて得られた、抗生物質耐性コロニー数／１０^８形質転換された細胞を示す。多重パルスエレクトロポレーションを使用したがこれまでの報告（非特許文献１）に一致して、ｐＴｐｆｃｐ／ｎａｔベクターはわずかにしか抗生物質耐性コロニーを産生しなかった。プロモーターを含有する残りのベクターは、１００〜４００個の抗生物質耐性コロニー／１０^８形質転換細胞を提供した。

【0070】

プロモーターによる形質転換効率の差は、選択培地による選択の間のプロモーターの活性の違いを反映し得る。この実験において、窒素源としてＮａＮＯ_３を含有するＩＭＫ培地を使用したので、当該培地では誘導性ＮＲプロモーターはアクティブになり、相当数の抗生物質耐性コロニーを生み出し得る。
図３Ｂに示すとおり形質転換後１４日にクリアなコロニーが認められ、ＰＣＲ分析により全ての抗生物質耐性コロニーでｎａｔ遺伝子の存在が確認された。

【0071】

＜発現プラスミドｐＣｇＬｈｃｒ５ｐおよびｐＣｇＮＲｐの構築＞
ベクターｐＣｇＬｈｃｒ５ｐ／ＣｇＡＣＡＴｐ−ｎａｔは、フコキサンチンクロロフィルａ／ｃ結合タンパク質（ｆｃｐ）遺伝子の構成的プロモーターを含有し、ベクターｐＣｇＮＲｐ／ＣｇＡＣＡＴｐ−ｎａｔは導入遺伝子の発現を駆動するために硝酸レダクターゼ（ＮＲ）遺伝子の誘導性プロモーターを含有した（図４）。両ベクターは、第２の発現カセットを有し、第２の発現カセット中のアセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ（ＡＣＡＴ）プロモーターは抗生物質選択のためのｎａｔ遺伝子発現を駆動した。簡単にするために、我々はこれらのベクターをｐＣｇＬｈｃｒ５ｐおよびｐＣｇＮＲｐと呼ぶ。ＢａｍＨＩ、ＸｂａＩ、ＳａｌＩ、およびＰｓｔＩ部位は外来性遺伝子を挿入するために利用することができ、ＥｃｏＲＩまたはＨｉｎｄＩＩＩ部位は形質転換反応のためにベクターを直鎖化するのに使用することができる。

【0072】

＜形質転換したＣ．ｇｒａｃｉｌｉｓ細胞における導入遺伝子の構成的発現＞
Ｃ．ｇｒａｃｉｌｉｓにおける外来性遺伝子の発現を試験するために、ホタルルシフェラーゼ遺伝子（ｌｕｃ）をｐＣｇＬｈｃｒ５ｐおよびｐＣｇＮＲｐに挿入し、ｐＣｇＬｈｃｒ５ｐ−ｌｕｃおよびｐＣｇＮＲｐ−ｌｕｃを得た。これらのベクターを用いてＣ．ｇｒａｃｉｌｉｓ細胞を形質転換し、その形質転換効率は＞１００形質転換体／１０^８細胞であった。平均して、抗生物質耐性株の約５０％が、ｎａｔおよびｌｕｃ遺伝子の両方を含んだ。図５（Ａ）および図５（Ｂ）は、４つのＬｈｃｒ５ｐ−ｌｕｃ形質転換体（株１〜４）のゲノムＰＣＲおよび逆転写（ＲＴ）ＰＣＲ分析の結果を示すが、この中で、導入遺伝子（ｎａｔおよびｌｕｃ）のゲノム挿入およびｍＲＮＡ発現の両方が確認された。ｐｓｂ３１遺伝子（これは光化学系ＩＩの膜表在性サブユニットをコードする）をコントロールとして分析した。ゲノムＰＣＲ（７６５ｂｐ、イントロンを含む）およびＲＴ−ＰＣＲ（成熟ｍＲＮＡにおいて５６６ｂｐ）においてｐｓｂ３１のフラグメントサイズが異なるので、ＲＴ−ＰＣＲ分析におけるゲノムＤＮＡコンタミネイションが無視できるものであることを示唆し、ｌｕｃ遺伝子ｍＲＮＡおよびｎａｔ遺伝子ｍＲＮＡがこれらの株で確かに発現したことを確認するものであった。トランスジェニックゲノムにおける導入遺伝子のコピー数を、ｌｕｃ遺伝子をプローブとして用いてサザンブロット分析で分析した。ゲノムＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩまたはＢａｍＨＩで消化した。これらは直鎖化されたｐＣｇＬｈｃｒ５ｐ−ｌｕｃベクター中にそれぞれ、ゼロおよび１つの認識部位を有する。結果は、導入した外来性ＤＮＡは、多くても１つまたは２つのコピーしか染色体ＤＮＡに組み入れられておらず（図５（Ｃ））、これは望ましくない挿入変異のリスクを減らすのに役立つであろうことを示唆した。

【0073】

異種発現した遺伝子の安定性を試験するために、株２のＬｈｃｒ５ｐ−ｌｕｃ（これは高いｌｕｃ活性を示した）を、ノウルセオトリシンの存在下または非存在下で繰り返し継代培養し、各継代培養の期間の終わりにルシフェラーゼ活性を評価した。図６に示されるとおり、抗生物質の存在・非存在に関わりなく４回の繰り返し継代培養の間に違いはなく、これにより、抗生物質選択圧の非存在下にあっても導入遺伝子は安定に継承され、発現することが示された。

【0074】

発現を可視化するためにｐＣｇＬｈｃｒ５ｐベクターおよびｐＣｇＮＲｐベクターを用い、細胞内のタンパク質生成物を標的とする蛍光性タンパク質（緑色蛍光タンパク質、イシサンゴＧａｌａｘｅｉｄａｅ由来アザミグリーン（ＡＧ）（非特許文献３））の発現を実験した。ＡＧは高い消光係数、蛍光量子収率、および酸安定性を有し、ＨｅＬａ細胞中でｅＧＦＰよりもさらに明るい緑色蛍光を産生する。改変型ＡＧの単量体バージョン（ｍＡＧ）は融合タンパク質の細胞内局在の可視化に十分に向いている。図７に示すとおり、導入遺伝子を持つ形質転換体の約５０％がｍＡＧの緑色蛍光を示した。

【0075】

＜ＮＲプロモーターによるルシフェラーゼ遺伝子の誘導的発現＞
培地における窒素源を単に変えることによって、硝酸レダクターゼ遺伝子のプロモーターがＣｙｌｉｎｄｒｏｔｈｅｃａ ｆｕｓｉｆｏｒｍｉｓおよびＴ．ｐｓｅｕｄｏｎａｎａで導入遺伝子の発現を制御するのに使用できることが示されている（非特許文献４、非特許文献５）。Ｃ．ｇｒａｃｉｌｉｓ ＮＲ遺伝子（ＣｇＮＲ）の発現は、同一のメカニズム：アンモニウム培地では誘導はオフになり、硝酸培地で増殖するときには誘導される；によって制御される可能性がある。
Ｃ．ｇｒａｃｉｌｉｓにおける導入遺伝子の誘導的発現のためのｐＣｇＮＲｐベクターの有効性を試験するために、ｌｕｃ遺伝子を多重クローニング部位に組み込み、ｐＣｇＮＲｐ−ｌｕｃを得た。ノウルセオトリシンでの選択の後、抗生物質耐性コロニーの約５０％（１４／２９）がｌｕｃ遺伝子を保有し、およびｌｕｃ遺伝子を保有している形質転換体の約６０％（９／１４）が窒素源として硝酸塩のみを含有するＩＭＫ培地でルシフェラーゼ活性を示した。

【0076】

ＣｇＮＲプロモーターによって駆動される誘導的ｌｕｃ発現の反応速度を分析するために、ＣｇＮＲｐ−ｌｕｃ形質転換体株の１つを単一窒素源としてＮＨ_４Ｃｌを含有するｆ／２培地で増殖し、ついでＮａＮＯ_３を含有するｆ／２培地に移した（図８）。ｌｕｃ活性は６０分後に発現誘導され、８時間内には誘導前の値の２０倍以上に増加した。

【0077】

実施例２
リシノール酸の合成
ｐＣｇＬｈｃｒ５ｐベクターの多重クローニング部位に、麦角菌（Ｃｌａｖｉｃｅｐｓ ｐｕｒｐｕｒｅａ ＮＢＲＣ６２６３）由来の脂肪酸２−ヒドロキシラーゼ（ＣｐＦＡＨ）遺伝子を組み込んでｐＣｇＬｈｃｒ５ｐ−ＣｐＦＡＨを得、これを多重パルスエレクトロポレーションによりＣ．ｇｒａｃｉｌｉｓに導入した。得られた形質転換体ＣｐＦＡＨ−３株およびＣｐＦＡＨ−４株を、海塩（Ｓｉｇｍａ、セントルイス、ＭＯ、ＵＳＡ）および０．２ｍＭ Ｎａ_２ＳｉＯ_３を補充したダイゴＩＭＫ培養培地（日本製薬（株）、大阪、日本）（５０ｍＬ）中、２０℃、５０μｍｏｌ光子ｍ^−２ｓ^−１下、８日間振とう培養（１００ｒｐｍ）した。

【0078】

図９はｐＣｇＬｈｃｒ５−ＣｐＦＡＨで形質転換したトランスジェニックＣ．ｇｒａｃｉｌｉｓの脂質分析結果を示す。ＣｐＦＡＨ−４株中リシノール酸は４番目に大きいピークとして検出された。
図１０にＣｐＦＡＨ−４株のＭＳプロファイルを示す。

【0079】

図１１にＲＴ−ＰＣＲ結果を示す。
ＰＣＲ条件

【0080】

【表18】

【0081】

【表19】

【0082】

ＰＣＲ酵素、ＫＯＤ ＦＸ ＮＥＯ （ＴＯＹＯＢＯ ＪＡＰＡＮ）
２５サイクル（１０秒、９８℃；３０秒、５５℃；２０秒、６８℃）
予想生成物長；１５２ｂｐ（ＣｐＦＡＨ）および１６８ｂｐ（α−チューブリン）
サイズマーカー：１ｋｂ＋ラダー(Life Technologies Carlsbad, CA, USA)

【0083】

図１２にＣｐＦＡＨ−３株およびＣｐＦＡＨ−４株のリシノール酸の量を示す。リシノール酸は、乾燥細胞重量の０．２〜０．３％（ｗ／ｗ）にまで蓄積した。
図１３はＣｐＦＡＨ−３株およびＣｐＦＡＨ−４株の主な脂肪酸組成を示す。
リシノール酸（１８：１−ＯＨ）は両ＣｐＦＡＨ株中の総脂肪酸の４．８〜６．７％であった。１６：１−ＯＨはＣｐＦＡＨ株中の総脂肪酸の１．０％であった。

【0084】

実施例３
上記＜ｐＣｇＬｈｃｒ５ｐベクター（登録番号AB981621）およびｐＣｇＮＲｐベクター（登録番号AB981622）の構築＞に記載された方法と同様の方法で、ゼオシン耐性を付与する発現ベクターの構築を行った。
具体的には、ゼオシン選択用の第２発現カセットを構築するために、ｐＰｈａ−Ｔ１ベクター（GenBank: AF219942.1）から５’−末端および３’−末端にＢｇｌＩＩおよびＮｓｉＩ部位を有するｂｌｅ遺伝子（ゼオシン耐性を付与する遺伝子）フラグメントをＰＣＲで増幅した。このフラグメントを、アセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ（ＡＣＡＴ）遺伝子のプロモーター領域（６２６ｂｐ）およびＣｇＬｈｃｒ１４のターミネーター配列を含有するｐＵＣ１１８ベクターのＢａｍＨＩ−ＰｓｔＩ部位に挿入して第２の発現カセットを作製した。この挿入により、第２の発現カセットにおけるＢａｍＨＩ−ＰｓｔＩ部位が破壊される（ＢａｍＨＩ／ＢｇｌＩＩおよびＰｓｔＩ／ＮｓｉＩペアは、共通の相補末端を生み出す）。次に、この第２発現カセットをＳａｃIとＨｉｎｄＩＩＩで切り出し、同じ制限酵素で切断したノウルセオトリシン耐性プラスミド （ｐＣｇLｈｃｆ４ｐおよびｐＣｇＮＲｐ）に挿入することで、ゼオシン選択用の第２発現カセットに置換した。
このようにして構築したゼオシン耐性プラスミド（ｐＣｇLｈｃｆ４ｐ−ｂｌｅ、および、ｐＣｇＮＲｐ−ｂｌｅ）を用いて実施例１と同様にＣ．ｇｒａｃｉｌｉｓの形質転換を行ったところ、ノウルセオトリシン耐性プラスミドと同等の形質転換効率（＞１００形質転換体／１０^８細胞）であった。
制限酵素切断部位が記されたゼオシン耐性プラスミド（Ｃ．ｇｒａｃｉｌｉｓ形質転換ベクター）のマップを図１４に示す。

【0085】

【0086】

ｐＣｇLｈｃｆ４ｐ−ｂｌｅの配列（配列番号５７）

【0087】

ｐＣｇＮＲｐ−ｂｌｅの配列（配列番号６０）

【図1】

【図2】

【図3A】

【図3B】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図4D】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10A】

【図10B】

【図10C】

【図10D】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14A】

【図14B】

【配列表】

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