特許 6573601 アンチエイジング用皮膚外用剤

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6573601

(24)【登録日】2019年8月23日

(45)【発行日】2019年9月11日

(54)【発明の名称】アンチエイジング用皮膚外用剤

(51)【国際特許分類】

   A61K 8/60 20060101AFI20190902BHJP

   A61K 8/67 20060101ALI20190902BHJP

   A61Q 19/08 20060101ALI20190902BHJP

   A61K 31/7076 20060101ALI20190902BHJP

   A61K 47/22 20060101ALI20190902BHJP

   A61K 47/18 20060101ALI20190902BHJP

【ＦＩ】

   A61K8/60

   A61K8/67

   A61Q19/08

   A61K31/7076

   A61K47/22

   A61K47/18

【請求項の数】5

【全頁数】28

(21)【出願番号】特願2016-513776(P2016-513776)

(86)(22)【出願日】2015年4月13日

(86)【国際出願番号】JP2015061373

(87)【国際公開番号】WO2015159854

(87)【国際公開日】20151022

【審査請求日】2018年3月26日

(31)【優先権主張番号】特願2014-82524(P2014-82524)

(32)【優先日】2014年4月14日

(33)【優先権主張国】JP

(73)【特許権者】

【識別番号】397077760

【氏名又は名称】株式会社林原

(74)【代理人】

【識別番号】100108486

【弁理士】

【氏名又は名称】須磨 光夫

(72)【発明者】

【氏名】河野 恵三

(72)【発明者】

【氏名】宮田 聡美

(72)【発明者】

【氏名】花谷 利春

(72)【発明者】

【氏名】福田 惠温

【審査官】 駒木 亮一

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２０１１／１５８９０４（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特開２００４−０６７５７６（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ８／００−８／９９

Ａ６１Ｑ １／００−９０／００

Ａ６１Ｋ３８／００−３８／５８

Ａ６１Ｐ１／００−４３／００

Ａ６１Ｋ３１／００−３１／３２７

Ａ６１Ｋ３１／３３−３３／４４

Ａ６１Ｋ ９／００−９／７２

Ａ６１Ｋ４７／００−４７／４８

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ

／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

Ｊａｐｉｏ−ＧＰＧ／ＦＸ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

有効成分として、アデノシンＮ１−オキシド５´−リン酸、その類縁体及びその塩から選ばれる１種又は２種以上と、エチレンジアミン四酢酸及び／又はエピガロカテキンガレートを含有する皮膚外用剤であって、該アデノシンＮ１−オキシド５´−リン酸の類縁体がアデノシンＮ１−オキシド、３´−α−グルコシルアデノシンＮ１−オキシド及び５´−α−グルコシルアデノシンＮ１−オキシドから選ばれる１種又は２種以上である、アンチエイジング用皮膚外用剤。

【請求項2】

アスコルビン酸２−グルコシドをさらに含有する請求項１記載の皮膚外用剤。

【請求項3】

皮膚バリア機能亢進剤としての請求項１又は２記載の皮膚外用剤。

【請求項4】

抗シワ剤としての請求項１又は２記載の皮膚外用剤。

【請求項5】

抗シミ剤としての請求項１又は２記載の皮膚外用剤。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、アンチエイジング用皮膚外用剤に関し、詳細には、有効成分として、アデノシンＮ１−オキシド５´−リン酸、その類縁体及びその塩から選ばれる１種又は２種以上を含有するアンチエイジング用皮膚外用剤に関する。

【背景技術】

【0002】

いつまでも若々しくありたいという思いは人類共通の普遍的な願いであるが、年齢を重ねるに連れてヒトの皮膚にシワ、小ジワ、弛み、シミなどの変化が現れるのは人類が長きにわたって経験してきたところであり、加齢にともない皮膚も老化し、皮膚にシワ、小ジワ、弛み、シミなどの外観上の変化が現れることは、いわば自然の摂理であって、不可避なことであると考えられていた。

【0003】

ところが、近年、ヒトの皮膚の構造やその新陳代謝のメカニズムなどに関する研究が進むにつれて、加齢にともないヒトの皮膚にシワ、小ジワ、弛み、シミなどの変化が現れる原因や機構が徐々に明らかになりつつある。すなわち、よく知られているとおり、皮膚は、外側の薄い表皮（上皮組織）とその下層の厚い真皮（結合組織）とから構成されており、表皮は、体の最外層として、外界から生体を保護するとともに内部の水分や栄養分が外界に漏出するのを防ぎ、一方、真皮は、主に線維芽細胞、膠原線維（コラーゲン）、弾性繊維（エラスチン）、プロテオグリカンなどが複合的に三次元状に広がった構造を持つ結合組織であって、皮膚に強度、伸展性及び弾力性をもたらす役割を担っているが、加齢とともに皮膚における皮脂や水分の量が減少すると、皮膚表面の角質層の保湿力が失われ、乾燥などによる小ジワや肌のかさつきが生じやすくなるといわれている。

【0004】

また、ヒトの表皮は、外側から「角質層（角層）」、「顆粒層」、「有棘層」、「基底層」により構成され、基底層で生まれた表皮細胞（ケラチノサイト）が順次外側へ移動して角質層となり、最終的に剥がれ落ちることとなる。より詳細には、ケラチノサイトが表皮の一番内側にある基底層で増殖し、分化し、上層に押し上げられ、最終的に表皮の一番外側に位置する角質層（角層）となり、垢となって脱落してゆく。このケラチノサイトの増殖、移動、分化、脱落の一連の過程をターンオーバーといい、ケラチノサイトが一定のサイクルで新しく生まれ変わっていくことにより、皮膚の恒常性が保たれているが、加齢に伴い肌のターンオーバー速度が遅くなり、その結果、シワや弛みや肌荒れが生じるといわれている。肌のターンオーバー速度は、ヒトの体の部位によって異なるものの、概ね、健康な１０代のヒトの肌のターンオーバーは約２０日といわれ、２０代で約２８日となり、３０代では約４０日、４０代で２０代の約２倍の約５５日となり、５０代では約７５日になるといわれている（非特許文献１）。

【0005】

上記のとおり、加齢に伴う肌のターンオーバー速度の遅れは、シワ、弛みや肌荒れをもたらすといわれていることから、これら肌症状が気になり始める３０歳前後から５０歳前の年齢層を含む、いわゆるプレエイジング世代の肌にあっては、そのターンオーバー速度を２０代の正常な肌のターンオーバー速度に戻すことは困難であるとしても、何らかの手段により、加齢に伴なうターンオーバー速度の遅れを取り戻すことができれば、シワや弛みや肌荒れを効果的に改善できることとなる（特許文献１）。この観点から、ケラチノサイトの増殖、移動、分化、脱落の一連の過程の少なくとも一過程を促進することによりターンオーバー速度を高めることができると考えられる。しかし、未だ、実用的な解決手段は提供されていない。

【0006】

角質層は、角質細胞が幾重にも重なって構成された層であり、角質細胞の最外層には、角質細胞の内部を守るコーニファイドエンベロープと呼ばれる、インボルクリンなどの様々の蛋白質から構成された強固な膜が存在する。前記コーニファイドエンベロープは、皮膚におけるバリア機能において重要な役割を果たしている。皮膚におけるバリア機能が低下すると、紫外線、特に真皮にまで到達する長波長の紫外線Ａ波により、真皮に存在するコラーゲン、エラスチン、ヒアルロン酸などがダメージを受ける。また、皮膚におけるバリア機能が低下すると、皮膚が乾燥して保湿力が低下したり、皮脂の過剰分泌が促されて大人ニキビを誘発したり、ターンオーバーの乱れをきたすことも知られている。加齢にともない、皮膚におけるバリア機能が低下し、これにより、皮膚のシワ、小ジワ、弛み、シミなどが惹起される（特許文献２及び３を参照）。

【0007】

皮膚におけるバリア機能とは、皮膚における、いわゆる１次バリアと言われる皮脂膜の機能と対比される、２次バリアと言われる角質層の機能、つまり、生体外から生体内への異物の侵入や、生体内から生体外への過剰な水分放出を防止する機能、及び、角質層に隣接する表皮顆粒層に存在するタイトジャンクションと呼ばれる細胞間接着構造体による、生体の内と外とを仕切る機能である。

【0008】

また、加齢によって真皮における線維芽細胞やヒアルロン酸が減少したり、コラーゲンの切断やエラスチンの変性が起こると、シワが形成されたり、皮膚の弾性が低下して弛みや肌荒れが起こるといわれている。コラーゲンの線維を支える役割を持つ線維であるエラスチンは、肌にハリや弾力を与える役割をしており、エラスチンの減少はしわや弛みの形成につながる（非特許文献２）。また、コラーゲンを分解するマトリックスメタロプロテアーゼ−１は、シワの原因であることが知られている（非特許文献３）。

【0009】

また、エンドセリン−１は、メラノサイトの活性化や増殖を促進する物質であり、シミの原因であることが知られている。さらに、メラノサイトから表皮細胞に排出されたメラニンが表皮細胞からスムーズに排出されないことが肌への色素沈着（シミ）や肌のくすみの原因となるとの知見もある（非特許文献４）。

【0010】

これらの研究成果や知見に基づき、現在では、加齢にともないヒトの皮膚にシワ、小ジワ、弛み、シミなどの変化が現れるのを科学的な見地から合理的に予防又は改善する、いわゆるアンチエイジング用の皮膚外用剤が多数提案（例えば、特許文献４乃至１０を参照）されるに至り、人類は、いつまでも若々しくありたいという思いの実現に一歩ずつ近づきつつある。しかしながら、現在提案されているアンチエイジング用の皮膚外用剤は多数の可能性の中のごく一部の可能性を追求し、実現しているに過ぎず、アンチエイジング効果が奏される別異のメカニズムや、使い勝手の良さ、さらには製造の容易性といった観点も含め、より多方面の角度から新たなアンチエイジング用の皮膚外用剤を提供することが依然として望まれているのが現状である。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0011】

【特許文献1】特開２０１２−０５６８５７号公報

【特許文献2】特開２００４−０９１３７６号公報

【特許文献3】特開２００８−００７４１１号公報

【特許文献4】再公表特許第ＷＯ２００７／０１１０６６号公報

【特許文献5】特開２００７−２９１１０２号公報

【特許文献6】特開２００８−１６９１９６号公報

【特許文献7】特開２００８−２５５０２０号公報

【特許文献8】特開２００８−２６０７２１号公報

【特許文献9】特開２００９−０４０６９０号公報

【特許文献10】特開２００９−２４９３０６号公報

【非特許文献】

【0012】

【非特許文献1】Ｆａｒａｇｅ等（編者）、『テキストブック・オブ・エイジング・スキン（Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ａｇｉｎｇ Ｓｋｉｎ）』、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ社発行、２０１０年

【非特許文献2】小倉等、『日本化粧品技術者会誌』、第４４巻第４号、２７８乃至２８４頁、２０１０年

【非特許文献3】Ｆｉｓｈｅｒ等、『アメリカン・ジャーナル・オブ・パソロジー（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ）』、第１７４巻第１号、１０１乃至１１４頁、２００９年

【非特許文献4】Ｇｉｌｃｈｒｅｓｔ等、『フォトケミストリー・アンド・フォトバイオロジー（Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌｏｇｙ）』、第６３巻第１号、１乃至１０頁、１９９６年

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0013】

本発明は、上記従来技術の現状に鑑みて成されたもので、加齢にともない現れるヒトの皮膚のシワ、小ジワ、弛み、シミなどの変化を予防又は改善するための、新規なアンチエイジング用皮膚外用剤を提供することを課題とするものである。

【課題を解決するための手段】

【0014】

本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究努力を重ねた結果、アデノシンＮ１−オキシド５´−リン酸、その類縁体及びその塩が、優れたアンチエイジング効果、すなわち、ターンオーバー改善、皮膚におけるバリア機能の維持又は亢進、皮膚におけるフィラグリン蛋白の発現増強、皮膚におけるエラスチンの産生促進、皮膚におけるマトリックスメタロプロテアーゼ−１の産生抑制、又は、皮膚におけるエンドセリン−１の産生抑制効果を奏することにより、加齢にともなう皮膚のシワ、小ジワ、弛み、シミなどを予防又は改善するアンチエイジング効果を発揮することを見出して、本発明を完成した。

【0015】

すなわち、本発明は、上記課題を、有効成分としてアデノシンＮ１−オキシド５´−リン酸、その類縁体及びその塩から選ばれる１種又は２種以上を含有するアンチエイジング用皮膚外用剤を提供することによって解決するものである。

【0016】

また、本発明者らは、アスコルビン酸２−グルコシド、エピガロカテキンガレート及び／又はエチレンジアミン四酢酸との併用により、アデノシンＮ１−オキシド５´−リン酸、その類縁体及びその塩の奏するアンチエイジング効果が有意に強化されることを見出した。

【発明の効果】

【0017】

本発明のアンチエイジング用皮膚外用剤によれば、皮膚のターンオーバーを改善し、皮膚におけるバリア機能を維持又は亢進し、皮膚におけるフィラグリン蛋白の発現を増強し、皮膚におけるエラスチンの産生を維持又は亢進し、皮膚におけるマトリックスメタロプロテアーゼ−１の産生を抑制し、又は、皮膚におけるエンドセリン−１の産生を抑制することができるので、加齢にともなう皮膚のシワ、小ジワ、弛み、シミなどを効果的に予防又は改善することができる。

【発明を実施するための形態】

【0018】

本発明の皮膚外用剤は、有効成分として、アデノシンＮ１−オキシド５´−リン酸、その類縁体及びその塩を含有してなる。斯かるアデノシンＮ１−オキシド５´−リン酸、その類縁体及びその塩は、その由来を問わず、天然物から精製したものでもよく、化学的に合成したものであってもよい。本発明でいうアデノシンＮ１−オキシド５´−リン酸の類縁体とは、例えば、アデノシンＮ１−オキシドや３´−α−グルコシルアデノシンＮ１−オキシド、５´−α−グルコシルアデノシンＮ１−オキシド、アデノシンＮ１−オキシド５´−二リン酸、アデノシンＮ１−オキシド５´−三リン酸などを挙げることができる。また、本発明でいうアデノシンＮ１−オキシド５´−リン酸の塩とは、例えば、アデノシンＮ１−オキシド５´−リン酸ナトリウムやアデノシンＮ１−オキシド５´−リン酸カリウムなどを挙げることができる。作用効果の点では、アデノシンＮ１−オキシド５´−リン酸、アデノシンＮ１−オキシド、３´−α−グルコシルアデノシンＮ１−オキシド及び５´−α−グルコシルアデノシンＮ１−オキシドが望ましく、アデノシンＮ１−オキシド５´−リン酸、アデノシンＮ１−オキシド及び３´−α−グルコシルアデノシンＮ１−オキシドがより望ましく、アデノシンＮ１−オキシド５´−リン酸及びアデノシンＮ１−オキシドが特に望ましい。また、光安定性や溶解度の点で、アデノシンＮ１−オキシドよりもアデノシンＮ１−オキシド５´−リン酸が望ましい。アデノシンＮ１−オキシド５´−リン酸の塩は、アデノシンＮ１−オキシド５´−リン酸として作用するので、アデノシンＮ１−オキシド５´−リン酸とその塩は同等の効果を奏するが、溶解度の点で、アデノシンＮ１−オキシド５´−リン酸よりもアデノシンＮ１−オキシド５´−リン酸の塩が望ましい。これらの化合物は、製造原料由来の成分や合成過程で生じる副生成物を含んでいてもよく、通常は、固形物換算で、純度９５質量％以上が望ましく、９８質量％以上がより望ましく、９９質量％以上が特に望ましい。（特に断らない限り、本明細書では質量％を単に「％」と表記する。）

【0019】

以下、本発明の皮膚外用剤について具体的に説明する。

【0020】

通常、本発明の皮膚外用剤の場合、アデノシンＮ１−オキシド５´−リン酸、その類縁体及びその塩から選ばれる１種又は２種以上の配合割合は、一般に、皮膚外用剤の総質量に対して、０．００１乃至１０．０％が望ましく、０．０１乃至１．０％がより望ましい。これらの配合量が皮膚外用剤の全質量に対して０．００１％未満では、上記有効成分による作用が十分に発揮されない場合がある。逆に、１０．０％を超えると、使用量に比例した効果が得られないので、好ましくない場合がある。

【0021】

本発明で用いるアデノシンＮ１−オキシド５´−リン酸、その類縁体及びその塩は、それ自体で、ターンオーバー改善作用、皮膚におけるバリア機能の維持又は亢進作用、皮膚におけるフィラグリン蛋白の発現の増強、皮膚におけるエラスチン産生の維持又は亢進、皮膚におけるマトリックスメタロプロテアーゼ−１の産生抑制、又は、皮膚におけるエンドセリン−１の産生抑制作用を発揮するので、それ単独で本発明の皮膚外用組成物の有効成分として有利に利用できる。また、他の成分との併用も随意である。

【0022】

アデノシンＮ１−オキシド５´−リン酸、その類縁体及びその塩の奏するアンチエイジング効果は、アスコルビン酸２−グルコシド、エピガロカテキンガレート及び／又はエチレンジアミン四酢酸との併用により有意に強化されるので、これらも本発明の皮膚外用組成物の成分として有利に利用できる。

【0023】

なお、本発明で言うターンオーバー改善とは、「角質層（角層）」、「顆粒層」、「有棘層」及び「基底層」から構成されるヒトの表皮の元となる表皮細胞（ケラチノサイト）の増殖、移動、分化、脱落の一連の過程（ターンオーバー）を健全な状態に保つことを意味する。より具体的には、加齢に伴い長くなる肌のターンオーバー周期を短くすることを意味する。

【0024】

本発明のアデノシンＮ１−オキシド５´−リン酸、その類縁体及びその塩を有効成分として含有してなる皮膚外用剤によれば、ケラチノサイトの分化を促進し、トランスグルタミナーゼ活性を増強することにより、コーニファイドエンベロープの産生を促進し、皮膚のターンオーバーが改善されるので、加齢にともなう皮膚のシワ、小ジワ、弛み、シミなどを効果的に予防又は改善することができる。また、斯かる皮膚外用剤は、皮膚のタイトジャンクション機能を強化し、皮膚バリア機能が維持又は亢進され、水分放出を抑制するので、加齢にともなう皮膚の小ジワ、弛みなどを効果的に予防又は改善することができる。さらに、本発明の皮膚外用剤は、肌にハリや弾力を与えるエラスチンの産生を促進し、シワの原因となるマトリックスメタロプロテアーゼ−１の産生を抑制することができるので、シワ、弛みなどを効果的に予防又は改善することができる。加えて、本発明の皮膚外用剤は、エンドセリン−１の産生を抑制することができるので、シミなどを効果的に予防又は改善することができる。

【0025】

また、本発明の皮膚外用剤には、その具体的な形態に応じて公知の成分を配合することができる。すなわち、皮膚外用剤の形態の場合には、通常、皮膚外用剤に用いられ得る成分の１種又は２種以上を、本発明の所期の効果を損なわない範囲で配合することができる。例えば、油成分、界面活性剤、防腐剤（抗菌剤）、香料、美白剤、保湿剤、増粘剤、抗酸化剤、キレート剤、紫外線吸収・散乱剤、ビタミン類、アミノ酸類、抗炎症剤、血行促進剤、海藻抽出物、収斂剤、抗シワ剤、細胞賦活剤、抗老化防止剤、育毛・発毛剤、経皮吸収促進剤、水、アルコール類、水溶性高分子、ｐＨ調整剤、発泡剤、粉体、医薬品・医薬部外品・化粧品・食品用の添加剤、医薬用・医薬部外品用の有効成分などを適宜配合して、常法により皮膚外用剤を製造すればよい。

【0026】

具体的には、油成分としては、マカデミアナッツ油、ヒマシ油、オリーブ油、カカオ油、椿油、ヤシ油、木ロウ、ホホバ油、グレープシード油、アボガド油などの植物油脂類、ミンク油、卵黄油などの動物油脂類、蜜ロウ、鯨ロウ、ラノリン、カルナウバロウ、キャンデリラロウなどのロウ類、流動パラフィン、スクワラン、マイクロクリスタリンワックス、セレシンワックス、パラフィンワックス、ワセリンなどの炭化水素類、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、ベヘニン酸、ラノリン脂肪酸、リノール酸、リノレン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、オレイン酸、イソステアリン酸などの天然及び合成脂肪酸類、セタノール、ステアリルアルコール、ヘキシルデカノール、オクチルドデカノール、ラウリルアルコール、カプリルアルコール、ミリスチルアルコール、セチルアルコール、コレステロール、フィトステロールなどの天然及び合成高級アルコール類、ミリスチン酸イソプロピル、パルミチン酸イソプロピル、ミリスチン酸オクチルドデシル、オレイン酸オクチルドデシル、コレステロールオレートなどのエステル類などを例示することができる。

【0027】

界面活性剤としては、モノラウリン酸ソルビタン、モノパルミチン酸ソルビタン、セスキオレイン酸ソルビタン、トリオレイン酸ソルビタン、モノラウリン酸ポリオキシエチレンソルビタン、モノステアリン酸ポリオキセチレンソルビタン、ポリエチレングリコールモノオレート、ポリエチレングリコールアルキレート、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリグリコールジエーテル、ラウロイルジエタノールアマイド、脂肪酸イソプロパノールアマイド、マルチトールヒドロキシ脂肪酸エーテル、アルキル化多糖、アルキルグルコシド、シュガーエステルなどの非イオン性界面活性剤、親油型グリセリンモノステアレート、自己乳化型グリセリンモノステアレート、ポリグリセリンモノステアレート、ポリグリセリンアルキレート、ソルビタンモノオレート、ポリエチレングリコールモノステアレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレート、ポリオキシエチレンセチルエーテル、ポリオキシエチレン化ステロール、ポリオキシエチレン化ラノリン、ポリオキシエチレン化蜜ロウ、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油などのノニオン界面活性剤、ステアリン酸ナトリウム、パルミチン酸カリウム、セチル硫酸ナトリウム、ラウリルリン酸ナトリウム、パルミチン酸トリエタノールアミン、ポリオキシエチレンラウリルリン酸ナトリウム、Ｎ−アシルグルタミン酸ナトリウム、パルミチン酸ナトリウム、ラウリン酸ナトリウム、ラウリル酸ナトリウム、ラウリル硫酸カリウム、アルキル硫酸トリエタノールアミンエーテル、ロート油、リニアドデシルベンゼン硫酸、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油マレイン酸、アシルメチルタウリンなどのアニオン界面活性剤、塩化ステアリルジメチルベンジルアンモニウム、塩化ステアリルトリメチルアンモニウム、ステアリルトリメチルアンモニウムクロライド、塩化ベンザルコニウム、ラウリルアミンオキサイドなどのカチオン界面活性剤、塩酸アルキルアミノエチルグリシン液、レシチンなどの両性界面活性剤などを例示することができる。

【0028】

防腐剤（抗菌剤）としては、安息香酸及びその塩類、サリチル酸及びその塩類、ソルビン酸及びその塩類、デヒドロ酢酸及びその塩類、パラオキシ安息香酸アルキルエステルをはじめとするパラオキシ安息香酸エステル、２，４，４´−トリクロロ−２´−ヒドロキシジフェニルエーテル、３，４，４´−トリクロロカルバニリド、ヘキサクロロフェン、塩化ベンザルコニウム、フェノキシエタノール、ヒノキチオール、レゾルシン、エタノール、１，３−ブチレングリコール、感光素２０１号などを例示することができる。

【0029】

香料としては、ベンズアルデヒド、ベンジルベンゾエート、フェニル酢酸、サンダロール、オイゲノール、リリアール、リラール、リナロール、２−メチル−３−（４−メチルフェニル）−プロパナール、ムスクケトン、シンナミックアルデヒド、ベルトフィックス、メチルイオノン、ゲラニルホーメート、イソＥスーパー、γ−ウンデカラクトン、ヘキシルサリシレート、シス−３−ヘキセニルサリシレート、メチルジヒドロジャスモネート、テトラヒドロフルフリル３−メルカプトプロピオネート、コバノール、バニリン、バニラール、ゼラニウムオイル、ペニロイヤルオイル、バーチオイル、アルモイゼオイルなどを例示することができる。

【0030】

美白剤としては、アスコルビン酸やその誘導体及びそれらの塩類、アルコキシサリチル酸類及びその塩類、ハイドロキノンやその配糖体などのハイドロキノンの誘導体、トラネキサム酸やその誘導体及びそれらの塩類、レゾルシンの誘導体、コウジ酸やその誘導体及びそれらの塩類、エラグ酸やリノール酸及びそれらの塩類、カミツレ抽出物、テトラヒドロクルクミノイド、藍草抽出物などを挙げることができる。

【0031】

保湿剤としては、エリスリトール、キシリトール、ソルビトール、マルチトール、グリセリン、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ポリグリセリン、ポリエチレングリコール、ジプロピレングリコール、１，２−ペンタンジオール、イソプレングリコールなどの多価アルコール類、グルコース、マルトース、トレハロース、トレハロースの糖質誘導体、デキストリン、サイクロデキストリン、国際公開ＷＯ ０２／１０３６１号明細書で開示したサイクロ｛→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→｝の構造を有する環状四糖、特開平２００５−９５１４８号公報に記載したサイクロ｛→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→｝の構造を有する環状四糖などの糖類、アミノ酸、乳酸ナトリウム、ピロリドンカルボン酸ナトリウムなどの天然保湿成分、グリコーゲン、ローカストビーンガム、キシログルカン、クインスシード、カラギーナン、ペクチン、マンナン、カードラン、サクシノグルカン、ガラクタン、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸、ムコイチン硫酸、ケラト硫酸、キチン、ヘパラン硫酸、ヒアルロン酸などのムコ多糖類やこれらムコ多糖類の加水分解物、シルクやコラーゲンなどの蛋白質・ペプチドやこれらの加水分解物などの水溶性高分子物質、これらの塩類、ジメチルポリシロキサン、メチルフェニルシロキサンなどのシリコン類、乳酸菌・ビフィズス菌などの培養上清などを例示することができる。

【0032】

増粘剤としては、アルギン酸ナトリウム、キサンタンガム、ケイ酸アルミニウム、マルメロ種子抽出物、アラビアガム、ヒドロキシエチルグアガム、カルボキシメチルグアガム、グアガム、デキストラン、トラガントガム、デンプン、プルラン、キチン、キトサン、寒天、セルロース、などの天然高分子物質、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、可溶性デンプン、カチオン化セルロース、カルボキシメチルキチンなどの半合成高分子物質、カルボキシビニルポリマー、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ビニルアルコール・酢酸ビニル共重合体などの合成高分子物質などを例示することができる。

【0033】

抗酸化剤としては、ジブチルヒドロキシトルエン、ブチルヒドロキシアニソール、没食子酸プロピル、アスコルビン酸、ビタミンＥ、カテキン類、フラボノイド類やこれらの誘導体などを例示することができる。

【0034】

キレート剤としては、エデト酸二ナトリウム、エチレンジアミン四酢酸塩、ピロリン酸塩、ヘキサメタリン酸塩、クエン酸、酒石酸、グルコン酸などを例示することができる。

【0035】

ｐＨ調整剤としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、トリエタノールアミン、ニトリロトリエタノール、クエン酸、クエン酸ナトリウム、ホウ酸、ホウ砂、リン酸水素カリウムなどを例示することができる。

【0036】

紫外線吸収・散乱剤としては、パラアミノ安息香酸系紫外線吸収剤、アントラニル酸系紫外線吸収剤、サリチル酸系紫外線吸収剤、ケイ皮酸系紫外線吸収剤、ベンゾフェノン系紫外線吸収剤、糖系紫外線吸収剤、３−（４´−メチルベンジリデン）−ｄ−カンファー、３−ベンジリデン−ｄ，１−カンファー、ウロカニン酸、ウロカニン酸エチルエステル、２−フェニル−５−メチルベンゾキサゾール、２，２´−ヒドロキシ−５−メチルフェニルベンゾトリアゾール、２−（２´−ヒドロキシ−５´−ｔ−オクチルフェニル）ベンゾトリアゾール、２−（２´−ヒドロキシ−５´−メチルフェニルベンゾトリアゾール、ジベンザラジン、ジアニソイルメタン、４−メトキシ−４´−ｔ−ブチルジベンゾイルメタン、５−（３，３−ジメチル−２−ノルボルニリデン）−３−ペンタン−２−オン、２−ヒドロキシ−４−メトキシベンゾフェノン、オクチルジメチルパラアミノベンゾエート、エチルヘキシルパラメトキシサイナメート、酸化チタン、カオリン、タルクなどを例示することができる。

【0037】

ビタミン類としては、ビタミンＡ及びその誘導体、ビタミンＢ１及びその誘導体、ビタミンＢ２及びその誘導体、ビタミンＢ６塩酸塩、ビタミンＢ６トリパルミテート、ビタミンＢ６ジオクタノエート、ビタミンＢ１２、ビタミンＢ１５及びその誘導体などのビタミンＢ類、アスコルビン酸及びその誘導体、α−トコフェロール、β−トコフェロール、γ−トコフェロール、ビタミンＥアセテートなどのビタミンＥ類、ビタミンＤ類、ビタミンＨ、パントテン酸、パンテチン、ビタミンＦ、ビタミンＫ、ビタミンＰ及びその誘導体、ビタミンＵ、フェルラ酸、γ−オリザノール、α−リポ酸、オロット酸、コエンザイムＱ１０などやそれらの誘導体などを例示することができ、それらの塩類であってもよい。

【0038】

アミノ酸類としては、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トレオニン、フェニルアラニン、チロシン、アスパラギン、グルタミン、タウリン、トリプトファン、シスチン、システイン、メチオニン、プロリン、ヒドロキシプロリン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニン、ヒスチジン、リジン、カルニチン、シトルリン及びそれらの誘導体などを例示することができ、それらの塩類であってもよい。

【0039】

本発明の皮膚外用剤を使用する場合の形態に特に限定はなく、例えば水溶液系、可溶化系、乳化系、粉末分散系、固形スティック系、水−油２層系、水−油−粉末３層系など、種々の形態で本発明の皮膚外用剤を適用することが可能である。また、その具体的な剤形にも特に限定はなく、医薬品、医薬部外品、化粧品などの薬事法上の区別に拘束されるものでもない。本発明の皮膚外用剤は、医薬品、医薬部外品又は化粧品として、皮膚、口唇や頭皮などの外皮及び口腔内に適用されるものをいい、具体的には、軟膏、クリーム、乳液、ローション、エッセンス、ゼリー、ジェル、パック、シャンプー、リンス、ヘアトリートメント、マスク、マスカラ、アイライナー、育毛剤、リップスティック（口紅）、リップグロス、ファンデーション、頬紅、アイシャドウ、パウダー、マニキュア、石鹸、ボディーソープ、浴用剤、粉歯磨、潤性歯磨、練歯磨、水歯磨、薬用歯磨、口中清涼剤、口中清涼フィルム、マウスウオッシュ、うがい薬などを例示することができる。

【0040】

以下、本発明につき実験により説明する。

【0041】

＜実験１：アデノシンＮ１−オキシド５´−リン酸及びその類縁体の正常ヒト表皮角化細胞のターンオーバーに及ぼす影響＞
ケラチノサイトの増殖、移動、分化、脱落の一連の過程をターンオーバーといい、ケラチノサイトが一定のサイクルで新しく生まれ変わっていくことにより、皮膚の恒常性が保たれているが、加齢に伴い肌のターンオーバー速度が遅くなり、その結果、シワや弛みや肌荒れが生じるといわれている。それ故、ケラチノサイトの分化を誘導すれば、ターンオーバー速度が速くなり、シワや弛みや肌荒れを改善することができると考えられる。このため、本実験では、アデノシンＮ１−オキシド５´−リン酸及びその類縁体のターンオーバー促進作用を、ケラチノサイトの分化誘導作用、コーニファイドエンベロープ産生促進作用及びトランスグルタミナーゼ活性増強作用を指標として評価した。なお、実験は、「Ｈａｓｅｇａｗａ等、『Ｌｉｐｉｄｓ』、第４６巻第６号、５２９乃至５３５頁、２０１１年」及び「Ｓｔｕｒｎｉｏｌｏ等、『Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ』、第２７８巻第４８号、４８０６６乃至４８０７３頁、２００３年」に準じて行った。

【0042】

＜実験１−１：ケラチノサイトの分化に対する影響＞
１２ウェルプレートに、増殖因子含有ケラチノサイト用培地（商品名「ＥｐｉＬｉｆｅ」，ライフテクノロジーズ社製）で２．５×１０^４個／ｍｌの濃度に調製した正常ヒト表皮角化細胞を１ｍｌ添加し、細胞がウェルの底面の半分程度を占める状態まで培養した。その後、培地を増殖因子不含ケラチノサイト用培地に交換して２日間培養し、さらに、培地を、表１に記載の被験物質を表１に示す各濃度で添加した増殖因子不含ケラチノサイト用培地にそれぞれ交換して３日間培養した。なお、被験物質を添加しない以外は同様にして培養したものを対照とした。顕微鏡下にて細胞形態の観察を行い、以下の基準に従いケラチノサイト分化誘導能を評価した。
スコア０：変化なし
スコア１：扁平形態を示す細胞数が全体の５０％以下
スコア２：扁平形態を示す細胞数が全体の５０％以上
スコア３：細胞のほぼ全てが不規則な形態をとり，一部光沢のある細胞も認められる
スコアが大きいほど、細胞の分化が促進されたことを意味する。実験は３回行い、その平均スコアを求めた。ケラチノサイトの分化誘導に対するアデノシンＮ１−オキシド５´−リン酸類縁体の作用を表１に示す。

【0043】

【表1】

【0044】

表１から明らかなように、被験物質を添加しない対照では正常ヒト表皮角化細胞の形態に変化がみられなかったのに対して、アデノシンＮ１−オキシド５´−リン酸ナトリウム及びアデノシンＮ１−オキシドでは、１０μＭの濃度において形態変化が認められ、２０〜４０μＭでは扁平な細胞がさらに脱核して小さくなり、細胞は不規則な形態をとるようになり、中には光沢のある細胞も認められ、分化が進行していた。３´−α−グルコシルアデノシンＮ１−オキシド及び５´−α−グルコシルアデノシンＮ１−オキシドでは、それぞれ４０〜８０μＭ及び２００〜４００μＭの濃度において形態変化が認められ、それぞれ１６０μＭ及び８００μＭでは扁平な細胞がさらに脱核して小さくなり、細胞は不規則な形態をとるようになり、中には光沢のある細胞も認められ、分化が進行していた。一方、アデノシンでは、４００μＭの濃度において、３´−α−グルコシルアデノシン及び５´−α−グルコシルアデノシンでは、８００μＭの濃度においても形態変化は認められなかった。

【0045】

試験した濃度範囲において、ケラチノサイトの分化促進は、アデノシンＮ１−オキシド５´−リン酸ナトリウム、アデノシンＮ１−オキシド、３´−α−グルコシルアデノシンＮ１−オキシド及び５´−α−グルコシルアデノシンＮ１−オキシドのいずれにおいても認められ、その効果は、アデノシンＮ１−オキシド５´−リン酸ナトリウム及びアデノシンＮ１−オキシドがより強いことが判明した。これらの結果は、アデノシンＮ１−オキシド５´−リン酸、その類縁体及びその塩が、ケラチノサイトの分化を促進することから、ターンオーバー改善剤として有用であることを物語っている。

【0046】

＜実験１−２：コーニファイドエンベロープの産生に及ぼす影響＞
コーニファイドエンベロープは、皮膚におけるバリア機能において重要な役割を果たしている。皮膚におけるバリア機能が低下すると、皮膚のシワ、小ジワ、弛み、シミなどが惹起される。このため、本実験では、アデノシンＮ１−オキシド５´−リン酸及びその類縁体のコーニファイドエンベロープの形成に及ぼす影響を調べた。なお、実験は、「Ｈａｓｅｇａｗａ等、『Ｌｉｐｉｄｓ』、第４６巻第６号、５２９乃至５３５頁、２０１１年」に準じて行った。

【0047】

表２に記載の被験物質を表２に示す各濃度で添加した以外は、実験１−１と同様に正常ヒト表皮角化細胞を培養した。培養した正常ヒト表皮角化細胞をリン酸緩衝生理食塩水で１回洗浄した後、リン酸緩衝生理食塩水を０．５ｍｌ加えてプレートに付着している細胞をかき取った。得られた細胞懸濁液に、１／４液量の１０％ラウリル硫酸ナトリウム溶液を加えて攪拌し、−８０℃で凍結した。解凍後、遠心分離（１２０００×ｇ，１５分）を行い、回収した細胞残渣を２％ラウリル硫酸ナトリウム含有リン酸緩衝生理食塩水で１回洗浄した後、さらに遠心分離（１２０００×ｇ，１５分）を行い、回収した細胞残渣を２％ラウリル硫酸ナトリウム及び２０ｍＭジチオトレイトール含有リン酸緩衝生理食塩水に懸濁した。この細胞残渣懸濁液を沸騰水浴中で１時間煮沸した後、３１０ｎｍの吸光度を測定してコーニファイドエンベロープ産生量とした。被験物質を添加しない以外は同様に処理したものを対照とし、その同じく３１０ｎｍの吸光度を１００％として、下記計算式に基づき、コーニファイドエンベロープ産生量を相対評価した。
計算式：コーニファイドエンベロープ産生量（相対値％）＝（被験物質添加サンプルの吸光度／対照の吸光度）×１００

【0048】

実験は３回行い、対照に対してダネットの多重比較検定を行なった。危険率ｐ＜０．０１を有意差ありとし、＊で示した。ケラチノサイトの分化に伴うコーニファイドエンベロープの産生に対するアデノシンＮ１−オキシド５´−リン酸類縁体の作用を表２に示す。

【0049】

【表2】

【0050】

表２から明らかなように、被験物質を添加しない対照と比較して、アデノシンＮ１−オキシド５´−リン酸ナトリウム及びアデノシンＮ１−オキシドでは、２５μＭの濃度においてコーニファイドエンベロープ産生量が約１８０％まで向上し、有意なコーニファイドエンベロープ産生促進作用が認められた。また、３´−α−グルコシルアデノシンＮ１−オキシドでは、２００μＭの濃度において有意なコーニファイドエンベロープ産生促進作用が認められた。５´−α−グルコシルアデノシンＮ１−オキシドでは、６００μＭの濃度において有意なコーニファイドエンベロープ産生促進作用が認められた。アデノシン５´−リン酸では、４００μＭの濃度においてコーニファイドエンベロープの産生を促進する傾向が認められた。一方、アデノシン及び３´−α−グルコシルアデノシンでは、それぞれ４００μＭ及び８００μＭの濃度においてもコーニファイドエンベロープ産生促進作用は認められなかった。

【0051】

試験した濃度において、コーニファイドエンベロープの産生促進は、アデノシンＮ１−オキシド５´−リン酸ナトリウム、アデノシンＮ１−オキシド、３´−α−グルコシルアデノシンＮ１−オキシド及び５´−α−グルコシルアデノシンＮ１−オキシドに認められ、その効果は、アデノシンＮ１−オキシド、アデノシンＮ１−オキシド５´−リン酸ナトリウム及び３´−α−グルコシルアデノシンＮ１−オキシドがより強く、アデノシンＮ１−オキシド及びアデノシンＮ１−オキシド５´−リン酸ナトリウムが最も強いことが判明した。これらの結果は、アデノシンＮ１−オキシド５´−リン酸、その類縁体及びその塩が、コーニファイドエンベロープの形成を促進するため、ターンオーバー改善剤として有用であることを物語っている。

【0052】

＜実験１−３：トランスグルタミナーゼ活性に及ぼす影響＞
トランスグルタミナーゼは蛋白質の架橋を触媒する酵素であり、コーニファイドエンベロープの形成に関与している。それ故、トランスグルタミナーゼ活性を増強することにより、コーニファイドエンベロープの形成が促進されるので、皮膚のシワ、小ジワ、弛み、シミなどを予防又は改善することができる。このため、本実験では、アデノシンＮ１−オキシド５´−リン酸及びその類縁体のトランスグルタミナーゼ活性に及ぼす影響を調べた。なお、実験は、「Ｓｔｕｒｎｉｏｌｏ等、『Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ』、第２７８巻第４８号、４８０６６乃至４８０７３頁、２００３年」に準じて行った。

【0053】

表３に記載の被験物質を表３に示す各濃度で添加した以外は、実験１−１と同様に正常ヒト表皮角化細胞を培養した。培養した正常ヒト表皮角化細胞に対して、１００μＭのフルオレセインカダベリンを添加して４時間静置した。その後、リン酸緩衝生理食塩水にて細胞を１回洗浄し、さらに、冷メタノールにて１０分間処理して細胞を固定した。冷メタノールで３回細胞を洗浄した後、リン酸緩衝生理食塩水を添加した。トランスグルタミナーゼにより細胞に取り込まれたフルオレセインカダベリンを、セルイメージングステーション（モレキュラープローブス社製）を用いて解析し、その蛍光強度をトランスグルタミナーゼ活性とした。被験物質を添加しない以外は同様に処理したものを対照とし、その蛍光強度を１００％として、下記計算式に基づき、トランスグルタミナーゼ活性を相対評価した。
計算式：トランスグルタミナーゼ活性（相対値％）＝（被験物質添加サンプルの蛍光強度／対照の蛍光強度）×１００

【0054】

実験は３回行い、対照に対してダネットの多重比較検定を行なった。危険率ｐ＜０．０１を有意差ありとし、＊で示した。コーニファイドエンベロープ産生に関与するトランスグルタミナーゼ活性に対するアデノシンＮ１−オキシド５´−リン酸類縁体の作用を表３に示す。

【0055】

【表3】

【0056】

表３から明らかなように、被験物質を添加しない対照と比較して、アデノシンＮ１−オキシド５´−リン酸ナトリウム及びアデノシンＮ１−オキシドでは、２０μＭの濃度においてトランスグルタミナーゼ活性がそれぞれ約５７０％及び約６３０％まで向上し、有意なトランスグルタミナーゼ活性増強作用が認められた。また、５´−α−グルコシルアデノシンＮ１−オキシドでは、４００μＭの濃度において有意なトランスグルタミナーゼ活性増強作用が認められた。３´−α−グルコシルアデノシンＮ１−オキシドでは、１００μＭの濃度においてトランスグルタミナーゼ活性増強作用は認められなかったが、５´−α−グルコシルアデノシンＮ１−オキシドでは、４００μＭの濃度で効果が認められたため、３´−α−グルコシルアデノシンＮ１−オキシドについても、より高濃度での使用では効果が認められると考えられる。アデノシン、アデノシン５´−リン酸、３´−α−グルコシルアデノシン及び５´−α−グルコシルアデノシンでは、４００μＭの濃度においてトランスグルタミナーゼ活性増強作用は認められなかった。

【0057】

試験した濃度において、トランスグルタミナーゼ活性の増強は、アデノシンＮ１−オキシド５´−リン酸ナトリウム、アデノシンＮ１−オキシド及び５´−α−グルコシルアデノシンＮ１−オキシドに認められ、その効果は、アデノシンＮ１−オキシド及びアデノシンＮ１−オキシド５´−リン酸ナトリウムがより強いことが判明した。これらの結果は、アデノシンＮ１−オキシド５´−リン酸、その類縁体及びその塩が、トランスグルタミナーゼ活性を増強する作用を有し、ターンオーバー改善剤として有用であることを物語っている。

【0058】

＜実験２：アデノシンＮ１−オキシド５´−リン酸及びその類縁体のヒト上皮様細胞癌由来細胞に対するタイトジャンクション機能強化作用に及ぼす影響＞
タイトジャンクションは、生体外から生体内への異物の侵入や生体内から生体外への過剰な水分放出を防止する機能を有する。それ故、タイトジャンクション機能が強化されることにより、皮膚バリア機能の亢進や保湿につながると考えられる。このため、本実験では、アデノシンＮ１−オキシド５´−リン酸及びその類縁体のタイトジャンクションに及ぼす影響を調べた。なお、実験は、「Ｓｕｚｕｋｉ及びＨａｒａ、『Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ』、第１３９巻第５号、９６５乃至９７４頁、２００９年」に準じて行った。

【0059】

表４に記載の被験物質を表４に示す各濃度で添加した培地で１×１０^５個／ｍｌの濃度に調製したヒト上皮様細胞癌由来Ａ−４３１細胞を、１２ウェルインサートカップにそれぞれ２ｍｌずつ添加し、細胞をウェルの底面全体を占める状態まで培養した。培養液量をインサートカップの内側と外側それぞれ２ｍＬに合わせ、水面の変化がないことを確認し、インサートカップの内側に透過物のモデルとして蛍光色素であるルシファーイエロー（ライフテクノロジーズ）を終濃度１００μＭになるよう添加した。その後、インサートカップの内側と外側それぞれの培養液中のルシファーイエローの蛍光強度を測定し、下記計算式により、インサートカップの内側と外側の蛍光強度の和に対する外側の蛍光強度の割合を求め、ルシファーイエローの透過率とした。
計算式：ルシファーイエローの透過率（％）＝｛インサートカップの外側の吸光度／（インサートカップの内側の吸光度＋インサートカップの外側の吸光度）｝×１００
被験物質を添加しない以外は同様に処理したものを対照とし、そのルシファーイエローの透過率を１００％として、下記計算式に基づき、タイトジャンクション機能の強化による透過率の減少を相対評価した。
計算式：ルシファーイエローの相対透過率（相対値％）＝（被験物質添加サンプルの透過率／対照の透過率）×１００

【0060】

実験は３回行い、対照に対してダネットの多重比較検定を行なった。危険率ｐ＜０．０１を有意差ありとし、＊で示した。ヒト上皮様細胞癌由来細胞のタイトジャンクション機能に対するアデノシンＮ１−オキシド５´−リン酸類縁体の作用を表４に示す。

【0061】

【表4】

【0062】

表４から明らかなように、被験物質を添加しない対照と比較して、アデノシンＮ１−オキシド５´−リン酸ナトリウムでは、２０μＭの濃度においてルシファーイエロー透過率が約６０％に減少し、有意なタイトジャンクション機能強化作用が認められた。また、アデノシンＮ１−オキシドでは、１０〜２０μＭの濃度において有意なタイトジャンクション機能強化作用が認められた。さらに、アデノシンでは、２００〜４００μＭの濃度において有意なタイトジャンクション機能強化作用が認められた。しかし、３´−α−グルコシルアデノシンＮ１−オキシド、５´−α−グルコシルアデノシンＮ１−オキシド、アデノシン５´−リン酸、３´−α−グルコシルアデノシン及び５´−α−グルコシルアデノシンでは、２００〜４００μＭの濃度においてタイトジャンクション機能強化作用は認められなかった。

【0063】

試験した濃度範囲において、タイトジャンクション機能強化作用は、効果の点から、アデノシンＮ１−オキシド５´−リン酸ナトリウム、アデノシンＮ１−オキシド及びアデノシンが望ましく、アデノシンＮ１−オキシド５´−リン酸ナトリウム及びアデノシンＮ１−オキシドがより望ましいといえる。これらの結果は、アデノシンＮ１−オキシド５´−リン酸ナトリウム及びアデノシンＮ１−オキシドが、タイトジャンクション機能の強化作用を有することから、皮膚バリア機能亢進剤及び保湿剤として有用であることを物語っている。

【0064】

＜実験３：アデノシンＮ１−オキシド５´−リン酸ナトリウムの正常ヒト表皮角化細胞におけるフィラグリン蛋白発現増強作用＞
皮膚におけるバリア機能の形成や、水分保持に重要な役割を果たしている蛋白質の１つにフィラグリンが知られている。フィラグリンは、プロフィラグリンとして表皮で産生され、これが分解されることでフィラグリンとなり、皮膚のバリア機能を担っている。またフィラグリンは、さらに分解を受けて天然の保湿因子としても作用する。さらには、近年、フィラグリンの発現低下とアトピー性皮膚炎との関連性が指摘されている（「Ｏｓａｗａ等『Ａｌｌｅｒｇｏｌｏｇｙ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ』、第６０巻第１号１乃至９頁、２０１１年」）。そこで本実験では、アデノシンＮ１−オキシド５´−リン酸ナトリウムの正常ヒト表皮角化細胞におけるフィラグリン蛋白発現増強作用を調べた。なお実験は、「Ｏｔｓｕｋａ等、『Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｌｌｅｒｇｙ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ』、第１３３巻第１号１３９乃至１４６頁、２０１４年」に準じて行った。

【0065】

６ウェルプレートにおいて、増殖因子含有ケラチノサイト用培地（商品名「ＥｐｉＬｉｆｅ」，ＫＵＲＡＢＯ社製）で５×１０^４個／ウェルの濃度に播種した正常ヒト表皮角化細胞を、３７℃で４日間培養した。４日目で細胞がウェルの８０％を占めるようになったところで、２μＭ、５μＭ、１０μＭになるようにアデノシンＮ１−オキシド５´−リン酸ナトリウムを添加したＥｐｉＬｉｆｅ培地と２日おきに培地交換しながら、さらに４日間培養することによりフィラグリンの発現を誘導した。アデノシンＮ１−オキシド５´−リン酸ナトリウムに代えて０．５ｍＭになるように塩化カルシウムを添加したＥｐｉｌｉｆｅ培地を用いた以外は同様にして正常ヒト表皮角化細胞を培養して陽性対照とした。４日間培養後に、細胞をダルベッコ−リン酸緩衝生理食塩水にて洗浄し、蛋白分解酵素阻害剤を含むＳＤＳサンプル緩衝液（６２．５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ６．８、２％ＳＤＳ、１０％グリセロール、５０ｍＭ ＤＴＴ）を０．１ｍＬ添加し、セルスクレーパーを用いて細胞を回収した。回収した細胞を、１０分間煮沸した後超音波破砕し、Ｐｉｅｒｃｅ ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）にて蛋白定量を行った。サンプルの一定量（１００μｇ/ｌａｎｅ）を定法によりＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動に供し、その後ＰＶＤＦ膜に転写した。

【0066】

ＰＶＤＦ転写膜をブロックエース（ＤＳ Ｐｈａｒｍａ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ社製）を用いてブロッキングした後、１次抗体としてマウス抗フィラグリン抗体（ＡＫＨ１，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ社製、２００倍希釈）あるいはマウス抗アクチン抗体（ＭＡＢ１５０１、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社製、２０，０００倍希釈）を反応させ、次いで２次抗体としてＨＲＰ標識抗マウスイムノグロブリン抗体（Ｐ０４４７、Ｄａｋo社製、２，０００倍希釈）を反応させた。反応後、ＥＣＬ Ｐｌｕｓ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用いて、化学発光用フィルムＨｙｐｅｒｆｉｌｍ ＥＣＬ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）上にバンドを検出した。検出されたバンドは、画像解析ソフト「Ｉｍａｇｅ Ｊ」により解析し数値化した。

【0067】

データは被験物質を添加しないものを対照とし、そのフィラグリン／アクチンのバンドの強度比を１００％として、フィラグリン／アクチンのバンドの強度比の上昇率でフィラグリン蛋白の発現量を相対評価した。正常ヒト表皮角化細胞におけるフィラグリン蛋白の発現に及ぼすアデノシンＮ１−オキシド５´−リン酸ナトリウムの作用を表５に示した。

【0068】

【表5】

【0069】

表５から明らかなように、被験物質を添加しない対照と比較して、アデノシンＮ１−オキシド５´−リン酸ナトリウムでは、添加濃度依存的にフィラグリン蛋白の発現量が上昇し、１０μＭでは３０８％と陽性対照の０．５ｍＭの塩化カルシウムと同等レベルの発現上昇作用が認められた。これらの結果は、アデノシンＮ１−オキシド５´−リン酸ナトリウムによるタイトジャンクション機能強化作用の一部はフィラグリン蛋白の発現増強作用を介したものであり、本物質が皮膚バリア機能亢進剤及び保湿剤として有用であることを物語っている。

【0070】

さらに、近年、皮膚バリア機能が低下することにより外来の異物が皮膚を介して侵入し、その結果として外来アレルゲンに対する感作が成立しやすくなることがアトピー性皮膚炎の発症に繋がっていることが指摘されている。この実験結果は、アデノシンＮ１−オキシド５´−リン酸ナトリウムがフィラグリン蛋白の発現増強作用を介して、アトピー性皮膚炎発症の防止にも繋がることを示すものである。

【0071】

＜実験４：アデノシンＮ１−オキシド５´−リン酸類縁体の正常ヒト皮膚線維芽細胞に対するエラスチン産生促進作用に及ぼす影響＞
コラーゲンの線維を支える役割を持つ線維であるエラスチンは、肌にハリや弾力を与える役割をしており、エラスチンの変性が起こると、皮膚の弾性が低下してシワや弛みの形成につながる。それ故、エラスチンの産生を促進することにより、シワや弛みを予防又は改善することができる。このため、本実験では、アデノシンＮ１−オキシド５´−リン酸及びその類縁体のエラスチン産生に及ぼす影響を調べた。なお、実験は、「Ｓｙｅｄａｉｎ及びＴｒａｎｑｕｉｌｌｏ、『Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｍｅｃｈａｎｉｃｓ』、第４４巻第５号、８４８乃至８５５頁、２０１１年」に準じて行った。

【0072】

１０％ウシ胎児血清含有ダルベッコ変法イーグル培地を用いて３×１０^５個／ｍｌの濃度に調製した正常ヒト皮膚線維芽細胞を、２４ウェルプレートにそれぞれ０．５ｍＬ添加し、１日培養した。細胞をダルベッコ−リン酸緩衝生理食塩水で洗浄後、表５に記載の被験物質を表５に示す各濃度で添加したダルベッコ変法イーグル培地でさらに２日間培養することによりエラスチン合成を誘導した。その後、培養上清は回収し、細胞を１ｍＬのダルベッコ−リン酸緩衝生理食塩水で洗浄後、０．１ｍＬの０．２５％トリプシン及びエチレンジアミン四酢酸を添加し３７℃で２分間処理して細胞をプレートから剥離した。プレートに０．５ｍＬのダルベッコ−リン酸緩衝生理食塩水を加え、得られた細胞懸濁液を１．５ｍＬチューブに回収し、遠心分離（３，０００×ｇ，５分）して剥離した細胞を回収した。エラスチンの定量は、エラスチン比色定量キット（バイオカラー社製）を用いて行った。先に回収した培養上清を用いて細胞を懸濁し、０．１６ｍＬの１Ｍ シュウ酸（キット試薬）を添加し１００℃で１時間反応させてエラスチンを可溶化した。０．６６ｍＬのエラスチン沈殿剤（キット試薬）を添加して１５分間転倒混和し、遠心分離（１０，０００×ｇ，１０分）して蛋白質を沈殿させた。沈殿に０．５ｍＬの染色剤（キット試薬）を添加して９０分間転倒混和し、遠心分離（１０，０００×ｇ，１０分）して色素が結合した沈殿を回収した。その後、０．２５ｍＬの色素分離剤（キット試薬）を添加して１時間転倒混和し、４９０ｎｍの吸光度を測定してウェル当たりのエラスチン量を算出した。検量線はキット付属品を用いて作成した。被験物質を添加しない以外は同様に処理したものを対照とし、その同じく４９０ｎｍの吸光度を１００％として、下記計算式に基づき、エラスチン産生量を相対評価した。
計算式：エラスチン産生量（相対値％）＝（被験物質添加サンプルの吸光度／対照の吸光度）×１００

【0073】

また、同条件での細胞増殖を確認するため、１０％ウシ胎児血清含有ダルベッコ変法イーグル培地を用いて２．５×１０^５個／ｍｌの濃度に調製した正常ヒト皮膚線維芽細胞を、９６ウェルマイクロプレートにそれぞれ０．１ｍＬ添加し、１日培養した。ダルベッコ−リン酸緩衝生理食塩水で洗浄後、表５に記載の被験物質を表５に示す各濃度で添加したダルベッコ変法イーグル培地培地で２日間培養した。上清除去後、培地で１０倍希釈したアラマーブルーを０．２ｍＬ添加し、３７℃で２時間反応させて、蛍光強度（励起波長５４４ｎｍ，蛍光波長５９０ｎｍ）を測定し、被験物質を添加しない以外は同様に処理した対照の蛍光強度を１００％として被験物質添加時の細胞数の変化率を求めた。

【0074】

実験は３回行い、対照に対してダネットの多重比較検定を行なった。危険率ｐ＜０．０１を有意差ありとし、＊で示した。正常ヒト皮膚線維芽細胞のエラスチン産生に対するアデノシンＮ１−オキシド５´−リン酸類縁体の作用を表６に示す。

【0075】

【表6】

【0076】

表６から明らかなように、被験物質を添加しない対照と比較して、アデノシンＮ１−オキシド５´−リン酸ナトリウム及びアデノシンＮ１−オキシドでは、１０μＭの濃度においてエラスチン産生量が約１２０％に向上し、有意なエラスチン産生増強作用が認められた。また、アデノシン５´−リン酸では、１０〜４０μＭの濃度においてエラスチン産生を増強する傾向があり、１００μＭの濃度においては、有意なエラスチン産生増強作用が認められた。なお、本実験系では細胞増殖に影響はみられなかった。

【0077】

試験した濃度範囲において、エラスチン産生促進作用は、効果の点から、アデノシンＮ１−オキシド５´−リン酸ナトリウム、アデノシンＮ１−オキシド及びアデノシン５´−リン酸が望ましく、アデノシンＮ１−オキシド５´−リン酸ナトリウム及びアデノシンＮ１−オキシドがより望ましいといえる。これらの結果は、アデノシンＮ１−オキシド５´−リン酸ナトリウム及びその類縁体であるアデノシンＮ１−オキシドが、エラスチン産生を促進する作用を有することから、抗シワ剤として有用であることを物語っている。

【0078】

＜実験５：アデノシンＮ１−オキシド５´−リン酸及びその類縁体の正常ヒト皮膚線維芽細胞に対するマトリックスメタロプロテアーゼ−１産生抑制作用に及ぼす影響＞
コラーゲンはマトリックスメタロプロテアーゼ−１によって分解され、コラーゲンが分解されると、シワが形成されたり、皮膚の弾性が低下して弛みが起こるといわれている。それ故、マトリックスメタロプロテアーゼ−１の産生を抑制することにより、シワや弛みを予防又は改善することができる。本実験では、アデノシンＮ１−オキシド５´−リン酸及びその類縁体のマトリックスメタロプロテアーゼ−１産生に及ぼす影響を調べた。なお、実験は、「Ｆｕｌｌｅｒ等、『Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｓｍｅｔｉｃ Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ』、第５巻第１号、３０乃至３８頁、２００６年」に準じて行った。

【0079】

１０％ウシ胎児血清含有ダルベッコ変法イーグル培地を用いて２．５×１０^５個／ｍｌの濃度に調製した正常ヒト皮膚線維芽細胞を、９６ウェルマイクロプレートにそれぞれ０．１ｍＬ添加し、ウェルの底面全体を占める状態まで培養した。次いで、培地を無血清培地に交換して２４時間培養し、表６に記載の被験物質を表６に示す各濃度で添加してさらに２４時間培養した。その後、ヒトＩＬ−１βを終濃度１ｎｇ／ｍｌとなるように添加し、さらに２４時間培養した。そして、培養上清中のマトリックスメタロプロテアーゼ−１を特異的ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄシステムス社製）を用いて検出し、テトラメチルベンジジンで発色させた後、４５０ｎｍの吸光度を測定した。被験物質を添加しない以外は同様に処理したものを対照とし、対照における培養上清中のマトリックスメタロプロテアーゼ−１を１００％として、下記計算式により、マトリックスメタロプロテアーゼ−１産生量を相対評価した。
計算式：マトリックスメタロプロテアーゼ−１産生量（相対値％）＝（被験物質添加サンプルの吸光度／対照の吸光度）×１００
また、細胞数は細胞数測定キット（染色法）にて測定し、対照を１００％として被験物質添加時の細胞数の変化率を求めた。

【0080】

実験は３回行い、対照に対してダネットの多重比較検定を行なった。危険率ｐ＜０．０１を有意差ありとし、＊で示した。正常ヒト皮膚線維芽細胞のマトリックスメタロプロテアーゼ−１産生量に対するアデノシンＮ１−オキシド５´−リン酸類縁体の作用を表７に示す。

【0081】

【表7】

【0082】

表７から明らかなように、被験物質を添加しない対照と比較して、アデノシンＮ１−オキシド５´−リン酸ナトリウムでは、１０〜２０μＭの濃度においてマトリックスメタロプロテアーゼ−１産生量が約８０〜３０％に減少し、濃度依存的且つ有意な産生抑制作用が認められた。アデノシンＮ１−オキシドでは、５〜２０μＭの濃度において同様の産生抑制作用が認められた。また、３´−α−グルコシルアデノシンＮ１−オキシド及び５´−α−グルコシルアデノシンＮ１−オキシドでは、２００〜８００μＭの濃度において、濃度依存的且つ有意な産生抑制作用が認められ、その効果は５´−α−グルコシルアデノシンＮ１−オキシドよりも３´−α−グルコシルアデノシンＮ１−オキシドの方が強かった。アデノシン、アデノシン５´−リン酸、３´−α−グルコシルアデノシン及び５´−α−グルコシルアデノシンでは、有意なマトリックスメタロプロテアーゼ−１産生抑制作用は認められなかった。

【0083】

試験した濃度範囲において、マトリックスメタロプロテアーゼ−１産生抑制作用は、効果の点から、アデノシンＮ１−オキシド５´−リン酸ナトリウム、アデノシンＮ１−オキシド、３´−α−グルコシルアデノシンＮ１−オキシド及び５´−α−グルコシルアデノシンＮ１−オキシドが望ましく、アデノシンＮ１−オキシド５´−リン酸ナトリウム及びアデノシンＮ１−オキシドがより望ましいといえる。これらの結果は、アデノシンＮ１−オキシド５´−リン酸、その類縁体及びその塩が、マトリックスメタロプロテアーゼ−１の産生を抑制する作用を有しており、抗シワ剤として有用であることを物語っている。

【0084】

＜実験６：アデノシンＮ１−オキシド５´−リン酸及びその類縁体の正常ヒト表皮角化細胞に対するエンドセリン−１産生抑制作用に及ぼす影響＞
エンドセリン−１は、メラノサイトの活性化や増殖を促進する物質であり、シミの原因であることが知られている。さらに、メラノサイトから表皮細胞に排出されたメラニンが表皮細胞からスムーズに排出されないことが肌への色素沈着（シミ）や肌のくすみの原因となるとの知見もある。それ故、エンドセリン−１産生を抑制することにより、肌への色素沈着（シミ）や肌のくすみを予防又は改善することができる。このため、本実験では、アデノシンＮ１−オキシド５´−リン酸及びその類縁体のエンドセリン−１産生に及ぼす影響を調べた。なお、実験は、「Ｉｓｈｉｄａ及びＳａｋａｇｕｃｈｉ、『Ｂｉｏｌｏｇ
ｉｃａｌ ＆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ』、第３０巻第５号、９２８乃至９３４頁、２００７年」に準じて行った。

【0085】

９６ウェルマイクロプレートにおいて、増殖因子含有ケラチノサイト用培地（商品名「ＥｐｉＬｉｆｅ」，ライフテクノロジーズ社製）を用いて、正常ヒト表皮角化細胞をウェルの底面全体を占める状態まで増殖させた後、培地を増殖因子不含ケラチノサイト用培地に交換してさらに２日間培養した。その後、アデノシンＮ１−オキシド５´−リン酸ナトリウムを１０、２０又は５０μＭになるよう添加し、６時間静置した。ハンクス緩衝液で洗浄後、紫外線Ｂ波を４０ｍＪ／ｃｍ^２の強度で細胞に照射し、増殖因子含有ケラチノサイト用培地を加えてさらに２４時間培養した。そして、培養上清中のエンドセリン−１を特異的ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄシステムス社製）を用いて検出し、テトラメチルベンジジンで発色させた後、４５０ｎｍの吸光度を測定した。アデノシンＮ１−オキシド５´−リン酸ナトリウムを添加しない以外は同様に処理したものを対照とし、対照における培養上清中のエンドセリン−１産生量を１００％として、下記計算式により、エンドセリン−１産生量を相対評価した。
計算式：エンドセリン−１産生量（相対値％）＝（被験物質添加サンプルの吸光度／対照の吸光度）×１００
また、細胞の増殖はメチレンブルーにて測定し、対照を１００％として被験物質添加時の細胞数の変化率を求めた。

【0086】

実験は３回行い、対照に対してダネットの多重比較検定を行なった。危険率ｐ＜０．０１を有意差ありとし、＊で示した。正常ヒト表皮角化細胞のエンドセリン−１産生に対するアデノシンＮ１−オキシド５´−リン酸ナトリウムの作用を表８に示す。

【0087】

【表8】

【0088】

表８から明らかなように、被験物質を添加しない対照と比較して、アデノシンＮ１−オキシド５´−リン酸ナトリウムは、２０μＭの濃度においてエンドセリン−１の産生を抑制する傾向があり、５０μＭの濃度においてエンドセリン−１の産生量が約５０％に減少し、有意なエンドセリン−１産生抑制作用が認められた。なお、本実験系では細胞増殖に影響はみられなかった。

【0089】

この結果は、アデノシンＮ１−オキシド５´−リン酸が、エンドセリン−１産生抑制作用を有していることから、抗シミ剤として有用であることを物語っている。

【0090】

＜実験７：エピガロカテキンガレートとアデノシンＮ１−オキシド５´−リン酸の併用がケラチノサイト分化誘導に及ぼす影響＞
実験は、それぞれ表８及び表９に記載の被験物質を表８及び表９に示す各濃度で添加した以外は、それぞれ実験１−２及び実験１−３記載の方法に準じて行い、化粧品に抗酸化剤として使用されるエピガロカテキンガレートとの併用によるアデノシンＮ１−オキシド５´−リン酸ナトリウムのコーニファイドエンベロープ産生促進作用及びトランスグルタミナーゼ活性増強作用への影響を調べた。被験物質を添加しない以外は同様に処理したものを対照とし、それぞれ下記計算式に基づき、対照に対するコーニファイドエンベロープ産生量増加率及びトランスグルタミナーゼ活性増加率を求めた。
計算式：コーニファイドエンベロープ産生量増加率（％）＝｛（被験物質添加サンプルの吸光度／対照の吸光度）×１００｝−１００
計算式：トランスグルタミナーゼ活性増加率（％）＝｛（被験物質添加サンプルの蛍光強度／対照の蛍光強度）×１００｝−１００
それぞれの結果を表９及び表１０に示す（効果が認められた組み合わせの増加率を＊で示した。）。

【0091】

【表9】

【0092】

【表10】

【0093】

表９及び表１０から明らかなように、１５μＭのアデノシンＮ１−オキシド５´−リン酸ナトリウムと１．６〜６．５μＭのエピガロカテキンガレートとを併用した場合、コーニファイドエンベロープ産生量増加率及びトランスグルタミナーゼ活性増加率のいずれもが、アデノシンＮ１−オキシド５´−リン酸ナトリウム及びエピガロカテキンガレートをそれぞれ単独で添加した場合の増加率の単なる和よりも顕著に増加していた。このことから、アデノシンＮ１−オキシド５´−リン酸ナトリウムとエピガロカテキンガレートの併用には、コーニファイドエンベロープ産生促進作用及びトランスグルタミナーゼ活性増強作用に対する相乗効果があると判断された。また、アデノシンＮ１−オキシド５´−リン酸ナトリウムとエピガロカテキンガレートのモル比は、１５μＭ：６．５μＭ〜１５μＭ：１．６μＭの範囲、すなわち、２．３：１〜９．４：１が望ましいといえる。この結果は、アデノシンＮ１−オキシド５´−リン酸、その類縁体及びその塩にエピガロカテキンガレートを配合した組成物が、相乗的にコーニファイドエンベロープの産生及びトランスグルタミナーゼ活性を促進或いは増強することから、抗シミ剤として有用であることを物語っている。

【0094】

＜実験８：アデノシンＮ１−オキシド５´−リン酸とエチレンジアミン四酢酸の併用がタイトジャンクション機能に及ぼす影響＞
実験は、表１１に記載の被験物質を表１１に示す各濃度で添加した以外は、実験２記載の方法に準じて行い、化粧品に保存料として使用されるエチレンジアミン四酢酸との併用によるアデノシンＮ１−オキシド５´−リン酸ナトリウム塩のタイトジャンクション機能強化作用への影響を調べた。被験物質を添加しない以外は同様に処理したものを対照とし、下記計算式に基づき、対照に対するルシファーイエローの相対透過率の減少率を求めた。
計算式：ルシファーイエローの相対透過率の減少率（％）＝１００−｛（被験物質添加サンプルの透過率／対照の透過率）×１００｝
結果を表１１に示す（効果が認められた組み合わせの減少率を＊で示した）。

【0095】

【表11】

【0096】

表１１から明らかなように、保存料として化粧品に使用されるエチレンジアミン四酢酸は、それ自体ではタイトジャンクション機能を弱める作用を示したものの、アデノシンＮ１−オキシド５´−リン酸ナトリウムとエチレンジアミン四酢酸を併用すると、エチレンジアミン四酢酸のタイトジャンクション機能を弱める作用が大幅に緩和されることが認められた。また、上記の結果は、アデノシンＮ１−オキシド５´−リン酸とエチレンジアミン四酢酸のモル比が、少なくとも１０μＭ：３ｍＭ以上、すなわち、少なくとも１：３００以上であれば、エチレンジアミン四酢酸が存在する場合でも、アデノシンＮ１−オキシド５´−リン酸ナトリウムを使用することによって、十分なタイトジャンクション機能の強化を図ることができるといえる。この結果は、アデノシンＮ１−オキシド５´−リン酸、その類縁体及びその塩にエチレンジアミン四酢酸を配合した組成物が、タイトジャンクション機能強化作用において有意な効果を示すことから、皮膚バリア機能亢進剤及び保湿剤として有用であることを物語っている。

【0097】

＜実験９：アスコルビン酸２−グルコシドとアデノシンＮ１−オキシド５´−リン酸又はその類縁体との併用がマトリックスメタロプロテアーゼ−１産生に及ぼす影響＞
実験は、表１２に記載の被験物質を表１２に示す各濃度で添加した以外は、実験５記載の方法に準じて行い、化粧品に美白剤として使用されるアスコルビン酸２−グルコシドとの併用によるアデノシンＮ１−オキシド５´−リン酸類縁体の抗シワ作用への影響を調べた。被験物質を添加しない以外は同様に処理したものを対照とし、下記計算式に基づき、対照に対するマトリックスメタロプロテアーゼ−１産生量減少率を求めた。
計算式：マトリックスメタロプロテアーゼ−１産生量減少率（％）＝１００−｛（被験物質添加サンプルの吸光度／対照の吸光度）×１００｝
結果を表１２に示す（効果が認められた組み合わせの減少率を＊で示した）。

【0098】

【表12】

【0099】

表１２から明らかなように、５〜１０μＭのアデノシンＮ１−オキシド５´−リン酸ナトリウム又はその類縁体のアデノシンＮ１−オキシドと２００μＭのアスコルビン酸２−グルコシドを併用した場合、マトリックスメタロプロテアーゼ−１産生量減少率が、アデノシンＮ１−オキシド５´−リン酸ナトリウム、アデノシンＮ１−オキシド及びアスコルビン酸２−グルコシドをそれぞれ単独で使用した場合の減少率の単なる和よりも顕著に増加していた。このことから、アデノシンＮ１−オキシド５´−リン酸ナトリウム又はアデノシンＮ１−オキシドとアスコルビン酸２−グルコシドの併用には、マトリックスメタロプロテアーゼ−１産生抑制作用に対する相乗効果があると判断された。また、アデノシンＮ１−オキシド５´−リン酸又はアデノシンＮ１−オキシドとアスコルビン酸２−グルコシドのモル比は、５μＭ：２００μＭ〜１０μＭ：２００μＭ、すなわち、１：４０〜１：２０が望ましいといえる。この結果は、アデノシンＮ１−オキシド５´−リン酸、その類縁体又はその塩とアスコルビン酸２−グルコシドを配合した組成物が、相乗的にマトリックスメタロプロテアーゼ−１の産生を抑制することから、抗シワ剤として有用であることを物語っている。

【0100】

＜実験１０：アデノシンＮ１−オキシド５´−リン酸及びその類縁体に光が及ぼす影響＞
皮膚外用剤は、その使用にあたり光に曝されることが想定されることから、それに含まれる有効成分は、光毒性を示さないことは勿論、光に対して安定であることが望ましい。光毒性とは、化学物質やその混合物の投与後、光に当たった場合に、投与した物質が反応して皮膚の細胞に障害が現れる現象である。本実験では、アデノシンＮ１−オキシド５´−リン酸と、その類縁体としてのアデノシンＮ１−オキシド及び５´−グルコシルアデノシンＮ１−オキシドの光に対する安定性を測定し比較した。

【0101】

表１３に記載の被験物質２５ｍｇに対し、各ｐＨに調整したＭｃＩｌｖａｉｎ緩衝液をそれぞれに加えて５０ｍｌとし、試験本数分の透明ガラススクリュー管瓶（５ｍｌ）にそれぞれ２．０ｍｌずつ分注した。蛍光灯下（約４０００Ｌｕｘ，温度２８℃）において、各被験物質を分注した透明ガラススクリュー管瓶を寝かせた状態で設置した。アデノシンＮ１−オキシド５´−リン酸ナトリウムについては、実験開始時とその８週間後に、アデノシンＮ１−オキシド及び５´−グルコシルアデノシンＮ１−オキシドについては、実験開始時とそれから８週間後までの２週間ごとに、被験物質を分注した透明ガラススクリュー管瓶を１本取り出し、ＨＰＬＣを用いて分析を行った。実験は３回行い、各被験物質の平均残存率を実験開始時のＨＰＬＣクロマトグラムにおける被験物質のピーク面積に対する面積比から、下記計算式に基づいて算出した。表１３にアデノシンＮ１−オキシド５´−リン酸及びその類縁体の光に対する安定性を示す。
計算式：被験物質の残存率（％）＝（被験物質の各ｐＨにおける一定時間経過後の平均ピーク面積／被験物質の各ｐＨにおける実験開始時の平均ピーク面積）×１００

【0102】

【表13】

【0103】

表１３から明らかなように、アデノシンＮ１−オキシド５´−リン酸ナトリウムでは、実験開始８週間後において、ｐＨ４〜９の条件下で残存率が約８９〜９７％であり、光に対して非常に安定であった。一方、アデノシンＮ１−オキシドでは、実験開始８週間後において、ｐＨ６〜９の条件下で、残存率が約６３〜６６％であり、ｐＨ４〜５の条件下で、残存率が約２５％であり、光に対して不安定であった。また、５´−グルコシルアデノシンＮ１−オキシドでは、実験開始８週間後において、ｐＨ６〜９の条件下で、残存率が約２４〜３４％であり、ｐＨ４〜５の条件下で、残存率が約１０％であり、光に対して非常に不安定であった。

【0104】

太陽光照射下では、蛍光灯照射下と比較してより早く分解することが予測されるため、アデノシンＮ１−オキシド５´−リン酸ナトリウムが、種々のｐＨ条件下において、その類縁体と比較して光に対してより安定であることを示す上記結果は、アデノシンＮ１−オキシド５´−リン酸が皮膚外用剤の有効成分として、より有用であることを示している。

【0105】

なお、化学物質やその混合物の安全性を評価するための国際的に合意された試験方法であるＯＥＣＤテストガイドラインの「ＴＧ４３２：Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ３Ｔ３ ＮＲＵ光毒性試験」に準じて試験を行った結果、アデノシンＮ１−オキシド５´−リン酸ナトリウム、アデノシンＮ１−オキシド、３´−α−グルコシルアデノシンＮ１−オキシド及び５´−α−グルコシルアデノシンＮ１−オキシドに光毒性は認められなかった。このことから、アデノシンＮ１−オキシド５´−リン酸、その類縁体及びその塩を含有する皮膚外用剤は安全であるといえる。

【0106】

以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明の技術範囲は、これらの実施例により何ら限定的に解釈されるべきものではない。

【実施例1】

【0107】

＜化粧水＞
（配合処方）
配合成分 （質量％）
（１）グリセリン ４．０
（２）プロピレングリコール ３．０
（３）１，２−ペンタンジオール ０．１
（４）アデノシンＮ１−オキシド５´−リン酸ナトリウム １．０
（５）ポリオキシエチレン（２０モル）オレインアルコール ０．５
（６）ユキノシタエキス ２．０
（７）エタノール ５．０
（８）香料 適量
（９）精製水 残量

【0108】

上記配合処方の成分（１）乃至（４）を精製水（９）に溶解後、成分（５）乃至（８）を混合したものを徐々に添加し混和することにより、化粧水を調製した。本品は、アデノシンＮ１−オキシド５´−リン酸ナトリウムを配合していることから、皮膚のターンオーバーを促進する優れた化粧水であり、皮膚におけるバリア機能の維持又は亢進作用、エラスチン産生の維持又は亢進作用、抗シワ作用、抗小ジワ作用、抗弛み作用、抗シミ作用にも優れたアンチエイジング用化粧水として有用である。また、１，２−ペンタンジオールを配合しているので、防腐効果及び保湿性に優れた化粧水である。

【実施例2】

【0109】

＜乳液＞
（配合処方）
配合成分 （質量％）
（１）１，２−へキサンジオール ５．０
（２）オクチルドデカノール ４．０
（３）アデノシンＮ１−オキシド５´−リン酸ナトリウム ０．１
（４）アスコルビン酸２−グルコシド（株式会社林原販売、
商品名「ＡＡ２Ｇ」） ２．０
（５）ポリオキシエチレンオレイルエーテル（２０Ｅ．Ｏ．） １．０
（６）ステアリン酸 ０．５
（７）シアバター ２．０
（８）ミツロウ ４．０
（９）パラオキシ安息香酸エステル ０．２
（１０）マルメロ種子エキス ５．０
（１１）キサンタンガム ０．１
（１２）フィチン酸 ０．０２
（１３）ビタミンＥ ０．０１
（１４）精製水 残量

【0110】

上記の成分（１）、（３）、（１０）、（１１）及び精製水（１４）を混合し水相とした。次いで、成分（２）、（５）〜（９）、（１２）及び（１３）を加熱、混合し油相とした。油相に水相を添加し、均一に混合した後、冷却し、成分（４）を加えて均質に混合して乳液を得た。本品は、アデノシンＮ１−オキシド５´−リン酸ナトリウム及びアスコルビン酸２−グルコシドを配合していることから、皮膚のターンオーバーを促進する優れた乳液であり、皮膚におけるバリア機能の維持又は亢進作用、エラスチン産生の維持又は亢進作用、抗シワ作用、抗小ジワ作用、抗弛み作用、抗シミ作用にも優れたアンチエイジング用乳液として有用である。

【実施例3】

【0111】

＜化粧用乳液＞
（配合処方）
配合成分 （質量％）
（１）ステアリン酸 ２．５
（２）セタノール １．５
（３）ワセリン ５．０
（４）流動パラフィン １０．０
（５）ポリオキシエチレンオレート ２．０
（６）酢酸トコフェロール ０．５
（７）グリチルリチン酸ジカリウム ０．２
（８）ポリエチレングリコール（１５００） ３．０
（９）アデノシンＮ１−オキシド５´−リン酸ナトリウム ０．１
（１０）エピガロカテキンガレート ０．５
（１１）１，２−ヘキサンジオール ０．１
（１２）精製水 残量

【0112】

上記処方に従い、配合成分を常法により混合した後、更に、適量の香料を加えて乳液を製造した。本品は、アデノシンＮ１−オキシド５´−リン酸ナトリウム及びエピガロカテキンガレートを配合していることから、皮膚のターンオーバーを促進する優れた乳液であり、皮膚におけるバリア機能の維持又は亢進作用、エラスチン産生の維持又は亢進作用、抗シワ作用、抗小ジワ作用、抗弛み作用、抗シミ作用にも優れたアンチエイジング用乳液として有用である。

【実施例4】

【0113】

＜化粧用クリーム＞
（配合処方）
配合成分 （質量％）
（１）ステアリン酸 ５．０
（２）セチルアルコール ５．０
（３）スクワラン ８．０
（４）ワセリン ３．０
（５）グリセロールトリ２−エチルヘキサン酸エステル ７．０
（６）ジプロピレングリコール ６．０
（７）グリセリン ４．０
（８）アデノシンＮ１−オキシド５´−リン酸ナトリウム ０．１
（９）エデト酸二ナトリウム ０．０１
（１０）プロピレングリコールモノステアリン酸エステル ３．０
（１１）ポリオキシエチレン（２０）セチルアルコールエーテル ３．０
（１２）１，２−ヘキサンジオール ０．２
（１３）香料 適量
（１４）精製水 残量

【0114】

精製水（１４）に成分（６）乃至（９）を加え、６０℃に加温し、水相を調製した。別途、成分（１）乃至（５）、（１０）乃至（１３）を混合し、７０℃に加温して油相を調製し、先に調製した水相に添加した。これを常法により乳化してクリームを製造した。本品は、アデノシンＮ１−オキシド５´−リン酸ナトリウムを配合していることから皮膚のターンオーバーを促進する優れたクリームであり、エデト酸二ナトリウム（エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム）を配合していることから、安定である。皮膚におけるバリア機能の維持又は亢進作用、エラスチン産生の維持又は亢進作用、抗シワ作用、抗小ジワ作用、抗弛み作用、抗シミ作用にも優れた、べたつきがなく使用感も良好なアンチエイジング用化粧クリームとして有用である。

【実施例5】

【0115】

＜美容液＞
（配合処方）
配合成分 （質量％）
（１）マルチトール ７．５
（２）アスコルビン酸２−グルコシド（株式会社林原販売、
商品名「ＡＡ２Ｇ」） ２．０
（３）１，２−アルカンジオール ５．０
（４）ポリエチレングリコール１５００ １．０
（５）エタノール ５．０
（６）カルボキシビニルポリマー ０．４
（７）ポリアクリル酸ナトリウム ０．１
（８）ポリオキシエチレンオレイルエーテル（２０Ｅ．Ｏ．） １．５
（９）オリーブ油 ０．２
（１０）アデノシンＮ１−オキシド５´−リン酸ナトリウム ０．１
（１１）水酸化カリウム 適量
（１２）香料 適量
（１３）精製水 残量

【0116】

上記処方に従い、配合成分を常法により混合し、美容液を調製した。アデノシンＮ１−オキシド５´−リン酸ナトリウムを配合していることから、本品は、皮膚のターンオーバーを促進する優れた美容液であり、皮膚におけるバリア機能の維持又は亢進作用、エラスチン産生の維持又は亢進作用、抗シワ作用、抗小ジワ作用、抗弛み作用、抗シミ作用にも優れた、皮膚に塗布してもベタ付き感のない、使用感に優れたアンチエイジング用美容液として有用である。

【産業上の利用可能性】

【0117】

以上説明したとおり、本発明のアンチエイジング用皮膚外用剤によれば、皮膚のターンオーバーを改善し、皮膚におけるバリア機能を維持又は亢進し、皮膚におけるフィラグリン蛋白の発現を増強し、皮膚におけるエラスチンの産生を維持又は亢進し、皮膚におけるマトリックスメタロプロテアーゼ−１の産生を抑制し、又は、皮膚におけるエンドセリン−１の産生を抑制することができるので、加齢にともなう皮膚のシワ、小ジワ、弛み、シミなどを効果的に予防又は改善することができる。本発明は、斯界に多大の貢献をする誠に意義のある発明である。