特許 6573633 ナノ粒子薬物コンジュゲート

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6573633

(24)【登録日】2019年8月23日

(45)【発行日】2019年9月11日

(54)【発明の名称】ナノ粒子薬物コンジュゲート

(51)【国際特許分類】

   A61K 47/69 20170101AFI20190902BHJP

   A61K 47/65 20170101ALI20190902BHJP

   A61K 47/52 20170101ALI20190902BHJP

   A61K 31/5377 20060101ALI20190902BHJP

   A61K 31/506 20060101ALI20190902BHJP

   A61K 49/00 20060101ALI20190902BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20190902BHJP

【ＦＩ】

   A61K47/69

   A61K47/65

   A61K47/52

   A61K31/5377

   A61K31/506

   A61K49/00

   A61P35/00

【請求項の数】34

【全頁数】39

(21)【出願番号】特願2016-569722(P2016-569722)

(86)(22)【出願日】2015年5月27日

(65)【公表番号】特表2017-521371(P2017-521371A)

(43)【公表日】2017年8月3日

(86)【国際出願番号】US2015032565

(87)【国際公開番号】WO2015183882

(87)【国際公開日】20151203

【審査請求日】2018年5月2日

(31)【優先権主張番号】62/004,738

(32)【優先日】2014年5月29日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】62/094,923

(32)【優先日】2014年12月19日

(33)【優先権主張国】US

【早期審査対象出願】

(73)【特許権者】

【識別番号】500213834

【氏名又は名称】メモリアル スローン ケタリング キャンサー センター

(73)【特許権者】

【識別番号】508057896

【氏名又は名称】コーネル・ユニバーシティー

【氏名又は名称原語表記】ＣＯＲＮＥＬＬ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(72)【発明者】

【氏名】ブラッドベリー， ミシェル エス．

(72)【発明者】

【氏名】ヨー， バーニー

(72)【発明者】

【氏名】ウィースナー， ウルリッヒ

(72)【発明者】

【氏名】マ， カイ

【審査官】 山村 祥子

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２０１１／００３１０９（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表２０１３−５２３８９５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１３／１９２６０９（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 ACS NANO，２０１３年，VOL.7, NO.3，p.2078-2089

【文献】 INTERNATIONAL JOURNAL OF ONCOLOGY，２０１３年，VOL.42，p.373-383

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ４７／００

Ａ６１Ｋ ９／００

Ａ６１Ｋ ３１／５０６

Ａ６１Ｋ ３１／５３７７

Ａ６１Ｋ ４９／００

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ナノ粒子；
酵素感受性リンカー部分；および
薬物部分
を含むナノ粒子薬物コンジュゲート（ＮＤＣ）であって、
前記ナノ粒子が、シリカベースのコア、および前記コアの少なくとも一部を取り囲むシリカシェルを含み、
前記ＮＤＣは、１０ｎｍ未満の直径を有し、
前記ナノ粒子が、有機ポリマーでコーティングされており、
前記薬物部分および酵素感受性リンカー部分が切断可能なリンカー−薬物構築物を形成し、前記切断可能なリンカー−薬物構築物は、前記ナノ粒子と共有結合的に連結し、酵素触媒性の薬物放出を促進する、ナノ粒子薬物コンジュゲート（ＮＤＣ）。

【請求項2】

前記酵素感受性リンカー部分が、１つまたは複数のアミノ酸を含む、請求項１に記載のＮＤＣ。

【請求項3】

前記酵素感受性リンカー部分が、
（アミノ−（スペーサー）_ｘ）_ｙ−ペプチドまたは（スペーサー）_ｚ−ペプチドを含み、前記スペーサーが、２〜５０個の原子を有しており、
ｘが１〜５の整数であり、
ｙが１〜５の整数であり、
ｚが５〜１５の整数であり、
前記酵素感受性リンカー部分が、前記酵素感受性リンカー部分と前記薬物部分の間に分解可能な部分を含む、請求項１に記載のＮＤＣ。

【請求項4】

前記酵素感受性リンカー部分が、ペプチドと前記薬物部分の間にスペーサーを含む、請求項１に記載のＮＤＣ。

【請求項5】

蛍光化合物を含む、請求項４に記載のＮＤＣ。

【請求項6】

放射性標識をさらに含む、請求項１に記載のＮＤＣ。

【請求項7】

前記酵素感受性リンカー部分が、プロテアーゼ結合時にＣ末端での加水分解を受け、それによって前記ナノ粒子から前記薬物部分を放出させることができる、請求項１に記載のＮＤＣ。

【請求項8】

前記薬物部分が、受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）阻害剤を含む、請求項１に記載のＮＤＣ。

【請求項9】

１〜２０の標的化部分をさらに含み、前記標的化部分が腫瘍細胞上の受容体と結合する、請求項１に記載のＮＤＣ。

【請求項10】

セラノスティックである、請求項９に記載のＮＤＣ。

【請求項11】

前記蛍光化合物がＣｙ５．５である、請求項５に記載のＮＤＣ。

【請求項12】

前記薬物部分が前記放射性標識に付着している、請求項６に記載のＮＤＣ。

【請求項13】

前記１つまたは複数のアミノ酸が、ペプチドまたはポリペプチドを含み、かつ、１〜１０個のアミノ酸を含み、
前記（アミノ−（スペーサー）_ｘ）_ｙ−ペプチドまたは（スペーサー）_ｚ−ペプチドがジペプチドであり、前記ジペプチドがフェニルアラニン−アルギニン（Ｐｈｅ−Ａｒｇ）またはフェニルアラニン−リシン（Ｐｈｅ−Ｌｙｓ）のうちの１つであり、
前記スペーサーがＰＥＧであり、
前記分解可能な部分がアミド結合であり、前記分解可能な部分が、プロテアーゼの存在下での前記薬物部分の切断を可能にする、請求項３に記載のＮＤＣ。

【請求項14】

前記スペーサーが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ＰＥＧ_２、またはパラ−アミノベンジルオキシカルバメート（ＰＡＢＣ）からなる群から選択される要素を含み、
前記蛍光化合物が前記ナノ粒子と会合しているか、または前記ナノ粒子のコア内部にある、請求項５に記載のＮＤＣ。

【請求項15】

前記プロテアーゼが、トリプシンを含めたセリンプロテアーゼであるか、またはカテプシンＢを含めたシステインプロテアーゼである、請求項７に記載のＮＤＣ。

【請求項16】

前記受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）阻害剤が、前記薬物部分の活性結合部位の基本的な化学構造を乱すことなく、前記酵素感受性リンカー部分への付着をもたらすように修飾された、その類似体またはその薬学的および／または治療的均等物を含むダサチニブまたはゲフィチニブである、請求項８に記載のＮＤＣ。

【請求項17】

前記標的化部分が、環状アルギニルグリシルアスパラギン酸（ｃＲＧＤ）を含む、請求項９に記載のＮＤＣ。

【請求項18】

ナノ粒子；
酵素感受性リンカー部分；および
薬物部分
を含むナノ粒子薬物コンジュゲート（ＮＤＣ）であって、
前記ＮＤＣは、１０ｎｍ未満の直径を有し、
前記ナノ粒子が、有機ポリマーでコーティングされており、
前記薬物部分および酵素感受性リンカー部分が切断可能なリンカー−薬物構築物を形成し、前記切断可能なリンカー−薬物構築物は、前記ナノ粒子と共有結合的に連結し、酵素触媒性の薬物放出を促進し、そして、
（ｉ）前記薬物部分が、ダサチニブ、ゲフィチニブ、ダサチニブの類似体およびゲフィチニブの類似体からなる群から選択される要素を含み、（ｉｉ）前記有機ポリマーが、少なくとも１つのリンカー−薬物構築物に付着した少なくとも１つの二官能化マレイミドシリル−ポリエチレングリコール基を含み、（ｉｉｉ）プロテアーゼを介して切断可能なリンカー−薬物構築物が形成され、前記酵素切断可能リンカー−薬物構築物が、前記酵素感受性リンカー部分によって前記ナノ粒子と共有結合的に連結されており、（ｉｖ）平均の薬物部分とナノ粒子との比が１〜２０の範囲である、ナノ粒子薬物コンジュゲート（ＮＤＣ）。

【請求項19】

前記酵素感受性リンカー部分が、１つまたは複数のアミノ酸を含む、請求項１８に記載のＮＤＣ。

【請求項20】

前記酵素感受性リンカー部分が、
（アミノ−（スペーサー）_ｘ）_ｙ−ペプチドまたは（スペーサー）_ｚ−ペプチドを含み、前記スペーサーが、２〜５０個の原子を有しており、
ｘが１〜５の整数であり、
ｙが１〜５の整数であり、
ｚが５〜１５の整数であり、
前記酵素感受性リンカー部分が、前記酵素感受性リンカー部分と前記薬物部分の間に分解可能な部分を含む、請求項１８に記載のＮＤＣ。

【請求項21】

前記酵素感受性リンカー部分が、ペプチドと前記薬物部分の間にスペーサーを含む、請求項１８に記載のＮＤＣ。

【請求項22】

蛍光化合物を含む、請求項２１に記載のＮＤＣ。

【請求項23】

放射性標識をさらに含む、請求項１８に記載のＮＤＣ。

【請求項24】

前記酵素感受性リンカー部分が、プロテアーゼ結合時にＣ末端での加水分解を受け、それによって前記ナノ粒子から前記薬物部分を放出させることができる、請求項１８に記載のＮＤＣ。

【請求項25】

前記薬物部分が、受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）阻害剤を含む、請求項１８に記載のＮＤＣ。

【請求項26】

１〜２０の標的化部分をさらに含み、前記標的化部分が腫瘍細胞上の受容体と結合する、請求項１８に記載のＮＤＣ。

【請求項27】

セラノスティックである、請求項２６に記載のＮＤＣ。

【請求項28】

前記蛍光化合物がＣｙ５．５である、請求項２２に記載のＮＤＣ。

【請求項29】

前記薬物部分が前記放射性標識に付着している、請求項２３に記載のＮＤＣ。

【請求項30】

前記１つまたは複数のアミノ酸が、ペプチドまたはポリペプチドを含み、かつ、１〜１０個のアミノ酸を含み、
前記（アミノ−（スペーサー）_ｘ）_ｙ−ペプチドまたは（スペーサー）_ｚ−ペプチドがジペプチドであり、前記ジペプチドがフェニルアラニン−アルギニン（Ｐｈｅ−Ａｒｇ）またはフェニルアラニン−リシン（Ｐｈｅ−Ｌｙｓ）のうちの１つであり、
前記スペーサーがＰＥＧであり、
前記分解可能な部分がアミド結合であり、前記分解可能な部分が、プロテアーゼの存在下での前記薬物部分の切断を可能にする、請求項２０に記載のＮＤＣ。

【請求項31】

前記スペーサーが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ＰＥＧ_２、またはパラ−アミノベンジルオキシカルバメート（ＰＡＢＣ）からなる群から選択される要素を含み、
前記蛍光化合物が前記ナノ粒子と会合しているか、または前記ナノ粒子のコア内部にある、請求項２２に記載のＮＤＣ。

【請求項32】

前記プロテアーゼが、トリプシンを含めたセリンプロテアーゼであるか、またはカテプシンＢを含めたシステインプロテアーゼである、請求項２４に記載のＮＤＣ。

【請求項33】

前記受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）阻害剤が、前記薬物部分の活性結合部位の基本的な化学構造を乱すことなく、前記酵素感受性リンカー部分への付着をもたらすように修飾された、その類似体またはその薬学的および／または治療的均等物を含むダサチニブまたはゲフィチニブである、請求項２５に記載のＮＤＣ。

【請求項34】

前記標的化部分が、環状アルギニルグリシルアスパラギン酸（ｃＲＧＤ）を含む、請求項２６に記載のＮＤＣ。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願への相互参照
本出願は、それぞれ２０１４年５月２９日および２０１４年１２月１９日に出願された米国仮特許出願第６２／００４，７３８号および同第６２／０９４，９２３号の優先権および利益を主張し、それらの全体を本明細書において参考として援用する。

【0002】

技術分野
本発明は、一般に、がんおよび他の疾患の検出、防止および治療のための治療剤の送達（例えば、標的薬物放出）用のナノ粒子コンジュゲートに関する。

【背景技術】

【0003】

ナノ治療送達ビヒクルは、典型的には、１〜１，０００ｎｍのサイズ範囲のマクロまたはスプラ分子の多成分系であり、本来的に治療薬である（例えば、活性医薬成分なし）か、または治療的送達系として機能する。これまで、リポソームナノ粒子およびバイオロジックは、様々な種類のがんを治療するために使用されるＦＤＡに認可された製品、または臨床試験中の製品の数の大部分を構成しているが、多くのポリマーベースの粒子製剤は、現在、初期試験段階である。

【0004】

ナノ治療的送達系のための望ましい候補は、薬物の生物学的利用能および薬物動態を好都合に変更し、同時にオフターゲットの毒性を最少化することができる、制御された仕方での薬物化合物の取り込みおよび放出という共通の特徴を共有している。疾患部位での、それらの正確な位置特定および保持を評価するために、画像化ラベルをその中に組み込むのが理想的である。

【0005】

しかし、これらの系は異なる機序を使用して機能する。例えば、抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）は、主に、腫瘍細胞の能動的標的化および薬物分子の条件付き放出によって、より低い薬物毒性を達成する。細胞表面の抗原と結合すると、活性薬物放出が、細胞内部移行およびエンドソーム取り込みの後に起こる。他方、より大きいペイロード（Ｄｏｘｉｌでは約１０，０００の薬物分子）を受動的にロードされる一般にずっと大きい集合複合体（約２０〜１５０ｎｍの直径）であるリポソームおよびポリマーベースの薬物送達系は、通常、標的化能力が欠如している（ＢＩＮＤ−０１４は例外である）。したがって、これらの複合体は、ナノ製剤化薬物の首尾よい送達のためには、主に、周知の強化された透過性および保持（ＥＰＲ）効果に依存している。リポソームの侵入型透過（interstitial permeation）は、それらのサイズに起因して劣っている可能性があるが、遊離薬物は、十分には理解されていない様々な機序によって放出される。例えば、Ａｂｒａｘａｎｅ（約１４０ｎｍ）は、疎水性化合物の生物学的利用能を増進させるために、異なるアプローチに依存する。この場合、アルブミンと薬物（パクリタキセル）の特定の製剤は、初期複合体を形成し、これは、次いで、注入されると、より小さいタンパク質−薬物凝集体に分散すると推定される。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

したがって、十分な生体内安定性を提供し、所望の部位での生物活性化合物の制御放出を示す薬物送達のための独特のプラットホームの必要性がある。

【課題を解決するための手段】

【0007】

本明細書では、ナノ粒子薬物コンジュゲート（ＮＤＣ）、特に、共有結合的に付着した薬物分子を有するシリカベースのナノ粒子プラットホームの方法および組成物を提供する。ＮＤＣは、ナノ治療薬として実証されている。サイズ、分子組成および化学（例えば、薬物放出の方式）の組合せは、狭い治療指数、用量制限毒性および限られた臨床的有用性を含む従来の製剤化を妨害する主要な障害物を克服する目的での他のナノ治療製品において見られる有益な特性を利用し得る。

【0008】

一態様では、本発明は、ナノ粒子（例えば、１ｎｍ〜２５ｎｍの範囲内の直径を有する）；リンカー部分；および薬物部分（例えば、その任意の類似体を含むダサチニブまたはゲフィチニブ）を含むナノ粒子薬物コンジュゲート（ＮＤＣ）であって、ナノ粒子が、有機ポリマー（例えば、有機ポリマーは、少なくとも１つのリンカー−薬物構築物に付着した少なくとも１つの二官能化マレイミドシリル−ポリエチレングリコール基を含む）でコーティングされており、薬物部分およびリンカー部分が、ナノ粒子と共有結合的に連結する（例えば、リンカー部分によって）切断可能な（例えば、プロテアーゼによって）リンカー−薬物構築物を形成する（例えば、平均の薬物部分とナノ粒子との比は１〜２０の範囲である）、ナノ粒子薬物コンジュゲート（ＮＤＣ）を対象とする。

【0009】

ある特定の実施形態では、リンカー部分は、１個または複数のアミノ酸（例えば、ペプチドまたはポリペプチド）（例えば、１〜１０個のアミノ酸）を含む。ある特定の実施形態では、リンカー部分は、（アミノ−（スペーサー）_ｘ）_ｙ−ペプチドまたは（スペーサー）_ｚ−ペプチド［例えば、ジペプチド（例えば、フェニルアラニン−アルギニン（Ｐｈｅ−Ａｒｇ）またはフェニルアラニン−リシン（Ｐｈｅ−Ｌｙｓ））］を含み、ここで、スペーサーは２〜５０個の原子を有し（例えば、スペーサーはＰＥＧである）、ｘは１〜５の整数であり、ｙは１〜５の整数であり、ｚは５〜１５の整数であり、リンカー部分は、リンカー部分と薬物部分の間に分解可能な部分（例えば、アミド結合）を含む（例えば、プロテアーゼの存在下で薬物部分の切断を可能にする）。ある特定の実施形態では、リンカー部分は、ペプチドと薬物部分の間にスペーサー（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ））、ＰＥＧ_２、パラ−アミノベンジルオキシカルバメート（ＰＡＢＣ））を含む。ある特定の実施形態では、ＮＤＣは、蛍光化合物（例えば、ナノ粒子のコア内部で、例えばナノ粒子と会合している）をさらに含む。ある特定の実施形態では、ＮＤＣは、放射性標識をさらに含む。

【0010】

ある特定の実施形態では、リンカー部分は、プロテアーゼ（例えば、セリンプロテアーゼ（例えば、トリプシン）、システインプロテアーゼ（例えば、カテプシンＢ））結合時にＣ末端で加水分解を受け、それによって、ナノ粒子から薬物部分を放出することができる。

【0011】

ある特定の実施形態では、薬物部分は、受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）阻害剤（例えば、薬物部分の活性結合部位の基本的な化学構造を乱すことなく、リンカー部分への付着をもたらすように修飾された、その任意の類似体（例えば、その任意の薬学的および／または治療的均等物）を含むダサチニブまたはゲフィチニブ）を含む。

【0012】

ある特定の実施形態では、ＮＤＣは、１〜２０個の標的化部分（例えば、環状アルギニルグリシルアスパラギン酸（ｃＲＧＤ））をさらに含み、標的化部分は、腫瘍細胞上の受容体と結合する。

【0013】

ある特定の実施形態では、ＮＤＣは、セラノスティックである。

【0014】

ある特定の実施形態では、蛍光化合物はＣｙ５．５である。

【0015】

ある特定の実施形態では、薬物部分は、放射性標識に付着する。

【0016】

ある特定の実施形態では、ナノ粒子は、シリカベースのコア、およびコアの少なくとも一部を取り囲むシリカシェルをさらに含む。

【0017】

本発明の所与の態様に関して説明される実施形態の要素は、本発明の別の態様の種々の実施形態において使用され得る。例えば、１つの独立請求項に従属する従属請求項の特徴は、他の独立請求項のいずれかの装置および／または方法において使用することができることが企図されている。
例えば、本発明は以下の項目を提供する。
（項目１）
ナノ粒子（例えば、１ｎｍ〜２５ｎｍの範囲内の直径を有する）；
リンカー部分；および
薬物部分（例えば、その任意の類似体を含むダサチニブまたはゲフィチニブ）
を含むナノ粒子薬物コンジュゲート（ＮＤＣ）であって、
前記ナノ粒子が、有機ポリマー（例えば、前記有機ポリマーは、少なくとも１つのリンカー−薬物構築物に付着した少なくとも１つの二官能化マレイミドシリル−ポリエチレングリコール基を含む）でコーティングされており、
前記薬物部分およびリンカー部分が、前記ナノ粒子と共有結合的に連結する（例えば、前記リンカー部分によって）切断可能な（例えば、プロテアーゼによって）リンカー−薬物構築物を形成する（例えば、平均の薬物部分とナノ粒子との比は１〜２０の範囲である）、ナノ粒子薬物コンジュゲート（ＮＤＣ）。
（項目２）
前記リンカー部分が、１つまたは複数のアミノ酸（例えば、ペプチドまたはポリペプチド）（例えば、１〜１０個のアミノ酸）を含む、項目１に記載のＮＤＣ。
（項目３）
前記リンカー部分が、
（アミノ−（スペーサー）_ｘ）_ｙ−ペプチドまたは（スペーサー）_ｚ−ペプチド［例えば、ジペプチド（例えば、フェニルアラニン−アルギニン（Ｐｈｅ−Ａｒｇ）またはフェニルアラニン−リシン（Ｐｈｅ−Ｌｙｓ））］を含み、
前記スペーサーが、２〜５０個の原子を有しており（例えば、前記スペーサーはＰＥＧである）、
ｘが１〜５の整数であり、
ｙが１〜５の整数であり、
ｚが５〜１５の整数であり、
前記リンカー部分が、前記リンカー部分と前記薬物部分の間に分解可能な部分（例えば、アミド結合）を含む（例えば、プロテアーゼの存在下での前記薬物部分の切断を可能にする）、項目２に記載のＮＤＣ。
（項目４）
前記リンカー部分が、ペプチドと前記薬物部分の間にスペーサー（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ））、ＰＥＧ_２、パラ−アミノベンジルオキシカルバメート（ＰＡＢＣ））を含む、項目１〜３のいずれか一項に記載のＮＤＣ。
（項目５）
蛍光化合物（例えば前記ナノ粒子のコア内部で、例えば前記ナノ粒子と会合している）をさらに含む、前記項目のいずれかに記載のＮＤＣ。
（項目６）
放射性標識をさらに含む、前記項目のいずれかに記載のＮＤＣ。
（項目７）
前記リンカー部分が、プロテアーゼ（例えば、セリンプロテアーゼ（例えば、トリプシン）、システインプロテアーゼ（例えば、カテプシンＢ））結合時にＣ末端での加水分解を受け、それによって前記ナノ粒子から前記薬物部分を放出させることができる、前記項目のいずれか一項に記載のＮＤＣ。
（項目８）
前記薬物部分が、受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）阻害剤（例えば、前記薬物部分の活性結合部位の基本的な化学構造を乱すことなく、前記リンカー部分への付着をもたらすように修飾された、その任意の類似体（例えば、その任意の薬学的および／または治療的均等物）を含むダサチニブまたはゲフィチニブ）を含む、前記項目のいずれか一項に記載のＮＤＣ。
（項目９）
１〜２０の標的化部分（例えば、環状アルギニルグリシルアスパラギン酸（ｃＲＧＤ））をさらに含み、前記標的化部分が腫瘍細胞上の受容体と結合する、前記項目のいずれか一項に記載のＮＤＣ。
（項目１０）
セラノスティックである、項目８に記載のＮＤＣ。
（項目１１）
蛍光化合物がＣｙ５．５である、項目４に記載のＮＤＣ。
（項目１２）
前記薬物部分が放射性標識に付着している、項目５に記載のＮＤＣ。
（項目１３）
前記ナノ粒子が、シリカベースのコア、および前記コアの少なくとも一部を取り囲むシリカシェルをさらに含む、前記項目のいずれかに記載のＮＤＣ。

【図面の簡単な説明】

【0018】

【図1A】図１Ａは、ゲフィチニブおよび類似体（ＡＰｄＭＧ１およびｄＰＥＧ_２ＡＰｄＭＧ２）の化学構造を表す図である。

【0019】

【図1B】図１Ｂは、アミド結合を介して直接接続したリンカー−薬物の化学構造（Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ＡＰｄＭＧ３）を表す図である。

【0020】

【図1C】図１Ｃは、ｄＰＥＧ_２スペーサーを介して接続したリンカー−薬物の化学構造（Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ｄＰＥＧ_２ＡＰｄＭＧ４）を表す図である。

【0021】

【図1D】図１Ｄは、分解可能なＰＡＢＣスペーサーを介して接続したリンカー−薬物の化学構造（Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−ＰＡＢＣ−ＡＰｄＭＧ５）を表す図である。

【0022】

図２Ａ〜２Ｃは、リンカーの種類を示す図である。

【0023】

【図2A】図２Ａは、Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ＡＰｄＭＧが、薬物付着のためにアミド結合を利用することを表す図である。酵素はジペプチド配列（Ｐｈｅ−Ａｒｇ）を認識し、結合し、次いでジペプチドに対するアミド結合Ｃ末端を加水分解し、ＡＰｄＭＧ１を放出する。

【0024】

【図2B】図２Ｂは、Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ｄＰＥＧ_２ＡＰｄＭＧが、薬物放出を増進させるために薬物とジペプチドの間により長い１０個の原子ＰＥＧスペーサーを取り込むｄＰＥＧ_２ＡＰｄＭＧ２を使用することを示す図である。

【0025】

【図2C】図２Ｃは、Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−ＰＡＢＣ−ＡＰｄＭＧが、ジペプチド（Ｐｈｅ−Ｌｙｓ）とアミノプロピル−ｄＭＧの間にパラ−アミノベンジルオキシ（aminobenzoxy）−カルバメート（またはＰＡＢＣ）スペーサー基を利用することを示す図である。スペーサー−薬物の酵素触媒放出の後、スペーサーは自発的に薬物から分解する。

【0026】

図３Ａ〜３Ｃは、代表的な、リンカー−薬物構築物からの薬物の酵素（トリプシン）触媒放出を示すグラフである。データは、ＡＰｄＭＧおよびｄＰＥＧ_２ＡＰｄＭＧが構築物から放出されることを示す。保持時間は括弧内に示される。トリプシンアッセイは、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）中３７℃で実施した。

【0027】

【図3A】図３Ａは、６０分間でのＰｈｅ−Ａｒｇ−ＡＰｄＭＧ３（上部）およびＰｈｅ−Ａｒｇ−ＡＰｄＭＧ＋トリプシン（下部）のＬＣＭＳデータを示すグラフである。

【0028】

【図3B】図３Ｂは、１０分間でのＰｈｅ−Ａｒｇ−ｄＰＥＧ_２ＡＰｄＭＧ４（上部）およびＰｈｅ−Ａｒｇ−ｄＰＥＧ_２ＡＰｄＭＧ＋トリプシン（下部）のＬＣＭＳデータを示すグラフである。

【0029】

【図3C】図３Ｃは、１０分間でのＰｈｅ−Ａｒｇ−ＰＡＢＣ−ＡＰｄＭＧ５（上部）およびＰｈｅ−Ａｒｇ−ＰＡＢＣ−ＡＰｄＭＧ＋トリプシン（下部）のＬＣＭＳデータを示すグラフである。

【0030】

図４Ａおよび４Ｂは、ＨＰＬＣにより３４８ｎｍで経時的にモニターした、遊離リンカー−薬物構築物Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ＡＰｄＭＧ、Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ｄＰＥＧ_２ＡＰｄＭＧおよびＰｈｅ−Ｌｙｓ−ＰＡＢＣ−ＡＰｄＭＧについてのｉｎ ｖｉｔｒｏでの薬物放出アッセイを示すグラフである。遊離薬物％は、放出された薬物を、３４８ｎｍで決定されたリンカー−薬物構築物の初期薬物ロードで除したものである。

【0031】

【図4A】図４Ａは、トリプシンで処理された遊離リンカー−薬物構築物を表すグラフである。トリプシンアッセイは、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）中、３７℃で実施した。

【0032】

【図4B】図４Ｂは、カテプシンＢで処理された遊離リンカー−薬物構築物を表すグラフである。カテプシンＢアッセイは、２５ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）中で実施した。

【0033】

図５Ａおよび５Ｂは、トリプシンの存在下でのＮＤＣからのｉｎ ｖｉｔｒｏでの薬物放出の代表的なＨＰＬＣプロファイルを示すグラフである。ＮＤＣは、トリプシンで処理し、次いで５分および１２０分後にＨＰＬＣにより分析した。データは、化合物２または３がＣ’ドットから放出されることを示す。トリプシンアッセイは、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）中、３７℃で実施した。３４８ｎｍでのＨＰＬＣ分析。

【0034】

【図5A】図５Ａは、ＮＤＣ６のＨＰＬＣプロファイルを示すグラフである。

【0035】

【図5B】図５Ｂは、ＮＤＣ７のＨＰＬＣプロファイルを示すグラフである。

【0036】

図６Ａおよび６Ｂは、酵素の存在下、ＮＤＣからのｉｎ ｖｉｔｒｏでの薬物放出を表すグラフである。酵素反応を、ＨＰＬＣにより３４８ｎｍで経時的にモニターした。トリプシンアッセイは、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）中、３７℃で実施し；カテプシンＢアッセイは、２５ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）中、３７℃で実施した。

【0037】

【図6A】図６Ａは、トリプシンで処理されたＣ’ドット−（Ｃｙ５）−ＰＥＧ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ｄＰＥＧ_２ＡＰｄＭＧ６の薬物放出を示すグラフである。

【0038】

【図6B】図６Ｂは、カテプシンＢで処理されたＣ’ドット−（Ｃｙ５）−ＰＥＧ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−ＰＡＢＣ−ＡＰｄＭ７の薬物放出を示すグラフである。

【0039】

【図7】図７は、ゲフィチニブ、Ｃ’ドット−（Ｃｙ５）−ＰＥＧ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ｄＰＥＧ_２ＡＰｄＭＧ６およびＣ’ドット−（Ｃｙ５）−ＰＥＧ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−ＰＡＢＣ−ＡＰｄＭＧ７で処理されたＨ１６５０細胞のウエスタンブロット分析を示す図である。細胞を、ゲフィチニブまたは指定されたＮＤＣで、指示濃度で１８時間、続いてＥＧＦ（５０ｎｇ／ｍＬ）で５分間処理した（ｐＥＧＦＲ−リン酸化ＥＧＦＲ；ｔＥＧＦＲ−全ＥＧＦＲ）。

【0040】

【図8】図８は、Ｃ’ドット−（Ｃｙ５）−ＰＥＧ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ｄＰＥＧ_２−Ｇｌｙ−Ｄ−Ｔｙｒ（^１３１Ｉ）−ＡＰｄＭＧ８のラジオＧＰＣ（radioGPC）を示すグラフである。ピーク積分に基づいて＞９０％の放射化学的収率。より小さいピークは、残留遊離^１３１Ｉと推定される。

【0041】

【図9A】図９Ａおよび９Ｂは、放射性標識を付着するための薬物構成成分でＤ−チロシン残基を取り込むリンカー−薬物構築物、Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ｄＰＥＧ_２−Ｄ−Ｔｙｒ−アミノプロピル−ｄＭＧおよびＰｈｅ−Ｌｙｓ−ＰＡＢＣ−Ｄ−Ｔｙｒ−アミノプロピル−ｄＭＧ（化合物２３および２４）を示す図である。

【図9B】図９Ａおよび９Ｂは、放射性標識を付着するための薬物構成成分でＤ−チロシン残基を取り込むリンカー−薬物構築物、Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ｄＰＥＧ_２−Ｄ−Ｔｙｒ−アミノプロピル−ｄＭＧおよびＰｈｅ−Ｌｙｓ−ＰＡＢＣ−Ｄ−Ｔｙｒ−アミノプロピル−ｄＭＧ（化合物２３および２４）を示す図である。

【0042】

【図10】図１０は、ナノ粒子薬物コンジュゲート（ＮＤＣ）からの酵素媒介性薬物放出を例示するスキーム１を示す図である。

【0043】

【図11】図１１は、Ｃ’ドット−（Ｃｙ５）−ＰＥＧ−ｍａｌがリンカー−薬物構築物Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ｄＰＥＧ２ＡＰｄＭＧ４およびＰｈｅ−Ｌｙｓ−ＰＡＢＣ−ＡＰｄＭＧ５と反応して、ＮＤＣ Ｃ’ドット−（Ｃｙ５）−ＰＥＧ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ｄＰＥＧ_２ＡＰｄＭＧ６およびＣ’ドット−（Ｃｙ５）−ＰＥＧ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−ＰＡＢＣ−ＡＰｄＭＧ７を生じることを例示するスキーム２を示す図である。

【0044】

【図12】図１２は、ＡＰｄＭＧ１の合成プロセスを例示するスキーム３を示す図である。

【0045】

【図13】図１３は、ｄＰＥＧ_２ＡＰｄＭＧ２の合成プロセスを例示するスキーム４を示す図である。

【0046】

【図14】図１４は、Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ＡＰｄＭＧ３およびＰｈｅ−Ａｒｇ−ｄＰＥＧ_２ＡＰｄＭＧ４の合成プロセスを例示するスキーム５を示す図である。

【0047】

【図15】図１５は、Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−ＰＡＢＣ−ＡＰｄＭＧ（５）の合成プロセスを例示するスキーム６を示す図である。

【0048】

図１６Ａ〜１６Ｄは、ｍａｌ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットならびにＮＤＣ６および７の特徴付けを示す図である。

【0049】

【図16A】図１６Ａは、３４８ｎｍでの分析的Ｃ１８逆相ＨＰＬＣを示すグラフである。

【0050】

【図16B】図１６Ｂは、ＴＥＭ画像を示すグラフである。

【0051】

【図16C】図１６Ｃは、吸光度および発光スペクトルを示すグラフである。

【0052】

【図16D】図１６Ｄは、ＦＣＳ相関曲線を示すグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0053】

本開示の特徴および利点は、類似した参照文字が全体を通して対応する要素を同定する図面と併用すれば、以下に示す詳細な説明からより明らかになるであろう。図面において、類似した参照番号は一般に、同一の、機能的に類似した、かつ／または構造的に類似した要素を示す。
定義

【0054】

本開示がより容易に理解されるように、ある特定の用語をまず以下に定義する。本明細書を通して、以下の用語および他の用語のための追加的な定義が示される。

【0055】

本出願において、「または（or）」の使用は、別段の記述のない限り、「および／または（and/or）」を意味する。本出願で使用されるように、「含む（comprise）」という用語および用語の変形体、例えば「含むこと（comprising）」および「含む（comprises）」は、他の添加物、構成成分、整数またはステップを排除しないものとする。本出願で使用されるように、「約（about）」および「およそ（approximately）」という用語は均等語として使用される。約／およそを伴うかまたは伴わないで、本出願において使用される任意の数値は、当業者によって理解される任意の正常な変動をカバーするものとする。

【0056】

ある特定の実施形態では、「およそ」または「約」という用語は、別段の記述がない限り、または文脈から別段明らかでない限り（そうした数が可能な値の１００％を超える場合を除いて）、記述された参照値のいずれかの（それより大きいまたは小さい）方向に２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％またはそれ未満内に含まれる値の範囲を指す。

【0057】

「投与」という用語は、物質を対象中に導入することを指す。一般に、例えば、非経口（例えば、静脈内）、経口、局所、皮下、腹腔、動脈内、吸入、膣、直腸、鼻、脳脊髄液中への導入または身体区画（body compartments）への滴下注入を含む任意の投与経路を利用することができる。一部の実施形態では、投与は経口である。追加的にまたは代替的に、一部の実施形態では、投与は非経口である。一部の実施形態では、投与は静脈内である。

【0058】

「薬剤（agent）」という用語は、例えばポリペプチド、核酸、サッカリド、脂質、小分子、金属またはそれらの組合せを含む任意の化学的部類の化合物またはエンティティーを指す。文脈から明らかであるように、一部の実施形態では、薬剤は、細胞もしくは生物またはその画分、抽出物もしくは構成成分である、またはそれを含み得る。一部の実施形態では、薬剤は、それが自然界において見出されるかつ／またはそれから得られるという点で、天然産物であるまたはそれを含む。一部の実施形態では、薬剤は、人間の手の活動によって設計され、操作され、かつ／もしくは生産されるという点で人為的である、ならびに／または自然界では見出せない１つまたは複数のエンティティーであるまたはそれを含む。一部の実施形態では、薬剤は、単離された形態または純粋な形態で利用され得る。一部の実施形態では、薬剤は、粗製の形態で利用され得る。一部の実施形態では、潜在的な薬剤は、例えば、それらの中で活性薬剤を同定するまたは特徴付けるためにスクリーニングされ得るコレクションまたはライブラリーとして提供される。利用できる薬剤の一部の特定の実施形態には、小分子、抗体、抗体断片、アプタマー、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、ペプチド、ペプチド模倣物、ペプチド核酸、小分子等が含まれる。一部の実施形態では、薬剤は、ポリマーであるまたはそれを含む。一部の実施形態では、薬剤は、少なくとも１つのポリマー部分を含有する。一部の実施形態では、薬剤は、治療薬、診断薬および／または薬物を含む。

【0059】

「ペプチド」または「ポリペプチド」という用語は、ペプチド結合によって一緒に連結した少なくとも２個（例えば、少なくとも３個）のアミノ酸のストリングを指す。一部の実施形態では、ポリペプチドは天然由来のアミノ酸を含み；代替的にまたは追加的に、一部の実施形態では、ポリペプチドは、１個または複数の非天然アミノ酸（すなわち、自然界では生じないが、ポリペプチド鎖中に取り込むことができる化合物；例えば、機能性イオンチャネル中に首尾よく取り込まれた非天然アミノ酸の構造を示すhttp://www.cco.caltech.edu/~dadgrp/Unnatstruct.gifを参照されたい）を含み、かつ／または当技術分野で公知のようなアミノ酸類似体を代替的に用い得る）。一部の実施形態では、タンパク質中のアミノ酸の１個または複数は、例えば、炭水化物基、リン酸基、ファルネシル基、イソファルネシル基、脂肪酸基、コンジュゲーション、官能化または他の修飾のため等のリンカーなどの化学的エンティティーの付加によって修飾され得る。

【0060】

本明細書で使用される「会合した（associated）」という用語は、一般に、十分に安定しており、したがってエンティティーが、関連する条件、例えば生理学的条件下で、物理的に近接して留まった構造を形成するように、直接的または間接的に互いに物理的に近接する（例えば、連結剤としての役割を果たす１つまたは複数の追加のエンティティーによって）、２つまたはそれ超のエンティティーを指す。一部の実施形態では、会合した部分は互いに共有結合的に連結する。一部の実施形態では、会合したエンティティーは共有結合的に連結しい。一部の実施形態では、会合したエンティティーは、特異的な非共有結合相互作用によって互いに連結される（すなわち、それらの相互作用パートナーと使用の関連において存在する他のエンティティーを識別する相互作用リガンド間の相互作用、例えばストレプトアビジン／アビジン相互作用、抗体／抗原相互作用などによって）。代替的にまたは追加的に、十分な数の、より弱い非共有結合相互作用は、部分が会合したまま留まるのに十分な安定性を提供することができる。例示的な非共有結合相互作用には、これらに限定されないが、静電相互作用、水素結合、親和性、金属配位、物理吸着、ホスト−ゲスト相互作用、疎水性相互作用、パイスタッキング相互作用、ファンデルワールス相互作用、磁気相互作用、静電相互作用、双極子−双極子相互作用等が含まれる。

【0061】

本明細書で使用される「生分解性」材料は、細胞中に導入された場合、細胞に対する重大な毒性効果を伴うことなく、細胞機構（例えば、酵素分解）または加水分解によって、細胞が再使用または廃棄できる構成成分へ分解されるものである。ある特定の実施形態では、生分解性材料の分解によって生成した構成成分は、炎症および／またはｉｎ ｖｉｖｏでの他の有害効果を誘発しない。一部の実施形態では、生分解性材料は酵素的に分解される。代替的にまたは追加的に、一部の実施形態では、生分解性材料は、加水分解によって分解される。一部の実施形態では、生分解性ポリマー材料は、分解してそれらの構成成分ポリマーになる。一部の実施形態では、生分解性材料（例えば生分解性ポリマー材料を含む）の分解には、エステル結合の加水分解が含まれる。一部の実施形態では、材料（例えば生分解性ポリマー材料を含む）の分解には、ウレタン連結の切断が含まれる。

【0062】

本明細書で使用される「機能的（functional）」生体分子は、それによって特徴付けられる特性および／または活性を示す形態の生体分子である。生体分子は、２つの機能（すなわち、二機能性）または多くの機能（すなわち、多機能性）を有し得る。

【0063】

本明細書で使用される「ｉｎ ｖｉｔｒｏ」という用語は、多細胞生物内ではなく、むしろ、人工的環境、例えば試験管または反応容器中、細胞培養物中等において起こる事象を指す。

【0064】

本明細書で使用される「ｉｎ ｖｉｖｏ」は、ヒトおよび非ヒト動物などの多細胞生物内において起こる事象を指す。細胞ベースの系の関連では、用語は、生きた細胞内で起こる事象（例えばｉｎ ｖｉｔｒｏでの系とは対照的に）を指すために使用され得る。

【0065】

本明細書で使用される「画像化剤」という用語は、それと接合している薬剤（例えば、ポリサッカリドナノ粒子）の検出を容易にする、任意の元素、分子、官能基、化合物、それらの断片または部分を指す。画像化剤の例には、これらに限定されないが：種々のリガンド、放射性核種（例えば、^３Ｈ、^１４Ｃ、^１８Ｆ、^１９Ｆ、^３２Ｐ、^３５Ｓ、^１３５Ｉ、^１２５Ｉ、^１２３Ｉ、^６４Ｃｕ、^１８７Ｒｅ、^１１１Ｉｎ、^９０Ｙ、^９９ｍＴｃ、^１７７Ｌｕ、^８９Ｚｒ等）、蛍光色素（特定の例示的な蛍光色素については、以下を参照されたい）、化学発光剤（例えばアクリジニウムエステル（acridinum ester）、安定化されたジオキセタンなど）、生物発光剤、スペクトル的に分解可能な無機蛍光半導体ナノ結晶（すなわち、量子ドット）、金属ナノ粒子（例えば、金、銀、銅、白金等）ナノクラスター、常磁性金属イオン、酵素（酵素の具体的な例については、以下を参照されたい）、比色分析的標識（例えば、色素、コロイド金など）、ビオチン、ジゴキシゲニン（dioxigenin）、ハプテン、およびそのために抗血清またはモノクローナル抗体を利用できるタンパク質が含まれる。

【0066】

本明細書で使用される「ナノ粒子」という用語は、１０００ナノメートル（ｎｍ）未満の直径を有する粒子を指す。一部の実施形態では、ナノ粒子は、全米科学財団（National Science Foundation）によって定義されるように、３００ｎｍ未満の直径を有する。一部の実施形態では、ナノ粒子は、国立衛生研究所（National Institutes of Health）によってされるように、１００ｎｍ未満の直径を有する。一部の実施形態では、ナノ粒子は、それらが、一般に、空間またはコンパートメントを取り囲み封入する（例えば、内腔を規定するため）両親媒性エンティティーから構成されるミセル膜によってバルク溶液から分離された、封入されたコンパートメントを含むという点でミセルである。一部の実施形態では、ミセル膜は、例えば生体適合性および／または生分解性ポリマーなどの少なくとも１つのポリマーから構成される。

【0067】

本明細書で使用される「対象」という用語は、ヒトおよび哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ブタ、ネコ、イヌおよびウマ）を含む。多くの実施形態では、対象は、哺乳動物、具体的には霊長類、特にヒトである。一部の実施形態では、対象は、畜牛、ヒツジ、ヤギ、雌ウシ、ブタなどの家畜；ニワトリ、カモ、ガチョウ、シチメンチョウなどの家禽；ならびに家畜化された動物、特にイヌおよびネコなどのペットである。一部の実施形態では（例えば、特に研究関連において）、対象哺乳動物は、例えば齧歯動物（例えば、マウス、ラット、ハムスター）、ウサギ、霊長類または近交系ブタなどのブタなどである。

【0068】

本明細書で使用される「治療（treatment）」という用語は（「治療する（treat）」または「治療すること（treating）」も）、特定の疾患、障害および／または状態を、部分的にもしくは完全に緩和、改善、軽減（relive）、阻害する、その発症を遅延させる、その重症度を軽減させる、ならびに／または、特定の疾患、障害および／または状態の１つまたは複数の症状、特徴および／もしくは原因の発生を減少させる物質の任意の投与を指す。そうした治療は、関係する疾患、障害および／もしくは状態の兆候を示さない対象、ならびに／または疾患、障害および／もしくは状態の初期兆候だけしか示さない対象の治療であってよい。代替的にまたは追加的に、そうした治療は、関係する疾患、障害および／または状態の１つまたは複数の確立された兆候を示す対象の治療であってよい。一部の実施形態では、治療は、関係する疾患、障害および／または状態を患っていると診断されている対象の治療であってよい。一部の実施形態では、治療は、関係する疾患、障害および／または状態の発現のリスクの増大と統計的に相関のある１つまたは複数の易罹患性（susceptibility）因子を有していることが公知である患者の治療であってよい。
詳細な説明

【0069】

本明細書で、ある特定の実施形態では、非毒性でマルチモダリティーの、臨床的に証明されている、共有結合的に付着した薬物分子／部分を有するシリカベースのナノ粒子プラットホームを含むナノ粒子薬物コンジュゲート（ＮＤＣ）を説明する。ナノ粒子薬物コンジュゲート（ＮＤＣ）は、画像化能力、および腎臓を介して効率的にクリアにする標的化リガンドを実証する。さらに、コンジュゲートは、がん検出、防止および／または治療のための治療剤を包含する。例えば、特異的な受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）阻害剤を含有するＮＤＣが合成されており、それらは、制御されかつ予測可能な仕方で薬物化合物を放出することが実証されている。さらに、ウエスタンブロット分析は、細胞中での低減されたＲＴＫリン酸化レベルを示しており、これは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＮＤＣベースの薬物送達を示唆している。

【0070】

一部の実施形態では、シリカベースのナノ粒子プラットホームは、モジュラー機能（modular functionality）の範囲でのサブ１０ｎｍ範囲まで小さく制御可能な直径を有する蛍光性の有機シリカコアシェル粒子である極小ナノ粒子すなわち「Ｃドット」を含む。Ｃドットは、米国特許第８２９８６７７Ｂ２号「Fluorescent silica-based nanoparticles」、米国特許公開第２０１３／００３９８４８Ａ１号「Fluorescent silica-based nanoparticles」および米国特許公開第２０１４／０２４８２１０Ａ１号「Multimodal silica-based nanoparticles」に記載されている。これらの内容を、それらの全体において、参照により本明細書に組み込む。コアのシリカマトリックス中へ組み込まれるものは、区別できるその光学的特性を提供するＣｙ５．５などの近赤外色素分子である。コアを取り囲むものは、シリカの層またはシェルである。シリカ表面は、水性条件および生物学的に関連した条件での安定性を増進させるために、シリル−ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）基で共有結合的に修飾されている。これらの粒子は、ｉｎ ｖｉｖｏで評価され、主にそれらのサイズおよび不活性表面に起因して、優れたクリアランス特性を示す。Ｃドットに組み込まれる追加的な機能の中には、外科的用途およびがんにおける黒色腫検出のためのリンパ節の可視化におけるそれらの使用を可能にする、化学センシング、非光学的（ＰＥＴ）画像コントラストおよびｉｎ ｖｉｔｒｏ／ｉｎ ｖｉｖｏでの標的化能力がある。

【0071】

Ｃドットは、それらの物理的特性ならびに実証されているヒトのｉｎ ｖｉｖｏ特徴に起因して、薬物送達のための独特のプラットホームを提供する。これらの粒子は、極めて小さく、所望のクリアランスおよび薬物動態特性を維持しながら、腫瘍内微小環境におけるＥＰＲ効果により利益を受ける。この目的を達成するために、本明細書では、ある特定の実施形態では、薬物構築物がＣドット（または他のナノ粒子）に共有結合的に付着するナノ粒子薬物送達系が説明される。薬物送達のためのＣドットベースのＮＤＣは、良好な生体内安定性を提供し、時期尚早の薬物放出を最少化し、生物活性化合物の制御放出を示す。ある特定の実施形態では、ペプチドベースのリンカーは、ＮＤＣ用途に使用される。抗体およびポリマーの関連において、これらのリンカーは、ｉｎ ｖｉｔｒｏとｉｎ ｖｉｖｏの両方で安定であり、リソソームプロテアーゼによる酵素触媒加水分解に依存する、高度に予想可能な放出動力学を有している。例えば、リソソーム中での高度に発現したプロテアーゼであるカテプシンＢは、巨大分子からの薬物放出を容易にするために利用することができる。巨大分子の主鎖と薬物分子の間に短いプロテアーゼ感受性ペプチドを組み込むことによって、酵素の存在下での薬物の制御放出を得ることができる。

【0072】

ある特定の実施形態では、ＮＤＣは、極めて小さく（例えば、約５ｎｍ〜約１０ｎｍ（例えば、約６ｎｍ）の平均直径を有する）、例えば薬物放出がプロテアーゼによって触媒される場合、酵素感受性リンカーを利用する。一例では、ゲフィチニブ、重要な表皮性増殖因子受容体変異体（ＥＧＦＲｍｔ＋）−チロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）がん薬は、修飾され、粒子上に取り込まれた。得られるＮＤＣは優れたｉｎ ｖｉｔｒｏでの安定性、溶解性を示し、ＥＧＦＲｍｔ＋−発現ＮＳＣＬＣ細胞において活性であることが証明されている。

【0073】

ある特定の実施形態では、ＮＤＣは、例えば特定の組織型（例えば、特定の腫瘍）を標的とする１つまたは複数の標的化部分を含む。標的部分を有するＮＤＣは、腫瘍細胞における薬物の内部移行を増進させる（例えば、標的化リガンドは腫瘍細胞上の受容体と結合し、かつ／または薬物を腫瘍細胞中に送達する（例えば、高い透過性によって））。例えば、追加的な標的化部分（例えば、ｃＲＧＤ）を有する粒子治療薬を作り出すために、シリカナノ粒子を、ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧコンジュゲートとマレイミド二官能化ＰＥＧの混合物に添加する。マレイミド二官能化ＰＥＧは、薬物−リンカーコンジュゲートの追加的な付着を支援してセラノスティック産物を作り出す。

【0074】

一部の実施形態では、極小粒子は、ＰＥＴ標識および／または光学的プローブと会合し得る。ナノ粒子は、標的部位での薬物蓄積を評価するために、ｉｎ ｖｉｖｏで観察することができる（例えば、ＰＥＴによって）。例えば、ＰＥＴ標識を有するナノ粒子（例えば、薬物物質なしで）を最初に投与し得る。次いで、ｉｎ ｖｉｖｏでのナノ粒子のＰＥＴ画像を分析することによって、腫瘍中の薬物（例えば、ナノ粒子とコンジュゲートされた）の濃度および蓄積速度を推定し得る。用量は、個人化された薬を提供するための得られた推定値（例えば、患者の体重よりむしろ腫瘍サイズ）に基づいて決定され得る。一部の実施形態では、放射性標識化された薬物を、ｉｎ ｖｉｖｏで追跡することができる。高度に濃縮された化学療法薬物は、それが標的化されていない場合、危険である可能性がある。一部の実施形態では、光学的プローブ（例えば、フルオロフォア）を有するナノ粒子を、腫瘍の手術中の画像化（例えば、組織／腫瘍の表面が曝露されている場合）および／またはバイオプシーのために使用し得る。

【0075】

治療剤およびナノ粒子を、別個に、放射性標識化するまたは光学的に標識化することができ、これは、治療剤およびナノ粒子の独立したモニタリングを可能にする。一実施形態では、放射性フッ素化された（すなわち、^１８Ｆ）ダサチニブを、ＮＨＳエステル連結によって、ナノ粒子に付着されたＰＥＧ−３４００部分とカップリングさせる。放射性フッ素は、放射性ヨウ素化Ｃ２４Ｉ）蛍光性（Ｃｙ５）ナノ粒子からの薬物の分布および放出の時間依存性の変化を独立にモニターできるようにするのに非常に重要である。この仕方で、プロドラッグ（ダサチニブ）およびナノ粒子をモニターすることができる。これは、二重標識化アプローチが使用されていない従来技術での方法と比較して、プロドラッグ設計の最適化を可能にする。別の実施形態では、放射線治療用ヨウ素分子（例えば、^１３１Ｉ）または他の治療用ガンマまたはアルファ放射体は、マレイミド官能基を介してＰＥＧとコンジュゲートされ、治療剤は、ｉｎ ｖｉｖｏでＰＥＧから解離し得ない。

【0076】

ＮＤＣは、分子リンカーを介して、Ｃドットナノ粒子（または他のナノ粒子）に共有結合的に付着する薬物化合物である。ある特定の実施形態では、リンカーは、細胞のリソソーム中で主に見出される酵素であるトリプシン（調節酵素）および／またはカテプシンＢに対して感受性のペプチド（例えば、ジペプチド）配列を組み込む。２つの部類のリンカー化学に関連する実験を、制御された薬物放出のために本明細書で説明する（１つはリンカーと薬物の間にアミド結合を取り込むことであり；もう１つはリンカーと薬物の間に分解可能な部分を利用することである）。一部の実施形態では、リンカーは、特定の条件下、例えばタンパク分解性加水分解でナノ粒子（例えば、Ｃドット）から薬物を放出するように設計される。

【0077】

使用できる薬物の例は、ダサチニブおよびゲフィチニブなどのＲＴＫ阻害剤を含み、これらは、ヒトまたはネズミ起源の原発性腫瘍細胞（例えば、ヒト患者の脳腫瘍外植片からの高悪性度の神経膠腫、ニューロスフェアの遺伝子操作されたマウスモデル）および／または非神経起源の腫瘍細胞株によって発現された、血小板由来の増殖因子受容体（ＰＤＧＦＲ）またはＥＧＦＲｍｔ＋を標的とすることができる。ダサチニブおよびゲフィチニブ類似体は、活性結合部位を規定する基本的な化学構造を乱すことなく、いくつかのリンカーへの共有結合的な付着を可能にするように合成することができる。

【0078】

合成アプローチが確認され、所望のリンカー−薬物構築物およびＮＤＣが得られた。ＮＤＣ特徴付けおよび酵素放出アッセイのためのＨＰＬＣ／ＬＣＭＳ法も開発された。ｉｎ ｖｉｔｒｏでの酵素薬物放出アッセイによって、ＮＤＣ設計における多くの重要な構造的要因が明らかになった。例えば、Ｃドットとリンカーの間の間隔を、異なるサイズのＰＥＧ鎖を使用して変化させると、酵素触媒薬物放出を可能にするために、Ｃドットとリンカーの間の十分な間隔が重要であることが明らかになった。同様に、リンカーと薬物の間の間隔が、酵素媒介性放出に重要であることも判明した。さらに、リンカーと薬物の間に分解可能な部分を利用するリンカー設計は、簡単なアミド結合を使用した場合より、大幅に速い放出動力学を示した。一部の実施形態では、分解可能な部分は、酵素的に切断かつ／または活性化することができる炭水化物および／または任意のリンカーであってよい。

【0079】

細胞ベースのアッセイも実施した。ダサチニブまたはゲフィチニブ類似体のいずれかを組み込んだリンカー−薬物構築物およびＮＤＣを、原発性脳腫瘍細胞（ニューロスフェア）および／または脳に転移している腫瘍細胞株（例えば、肺、扁平上皮がん）に対してテストした。ＥＧＦＲｍｔ＋のリン酸化レベルは、ＮＤＣならびに遊離リンカー−薬物構築物に曝露された細胞株において低下または消失し、ＮＤＣは、いくつかの場合、ネイティブな薬物（native drug）より強力な阻害活性を示した。

【0080】

一態様では、薬物部分がリンカー部分を介してナノ粒子に共有結合的に連結する、薬物部分、リンカー部分およびナノ粒子を含むナノ粒子薬物コンジュゲート（ＮＤＣ）を本明細書で説明する。ある特定の実施形態では、ＮＤＣは、リンカー部分と薬物部分の間にアミド結合および／または分解可能な部分を含む。ある特定の実施形態では、リンカー部分はペプチド（例えば、ジペプチド）を含む。ある特定の実施形態では、リンカー部分は、プロテアーゼが結合するとＣ末端での加水分解をもたらし、それによってナノ粒子から薬物部分を放出する。ある特定の実施形態では、薬物部分は、受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）阻害剤（例えば、薬物部分の活性結合部位の基本的な化学構造を乱すことなく、リンカー部分への付着をもたらすように修飾された、その任意の類似体、例えばその任意の薬学的および／または治療的均等物を含むダサチニブまたはゲフィチニブ）を含む。ある特定の実施形態では、ナノ粒子はより新しい世代のＣドットまたはＣ’ドットである。別の態様では、本発明は、本明細書で説明する実施形態のいずれかのＮＤＣの投与および／または検出を含む、疾患（例えば、がん）の検出、防止および／または治療の方法を対象とする。

【0081】

ナノサイズの薬物送達ビヒクルは、（１）体全体および細胞内のトラフィッキングを可能にする、それらの小さなサイズ；（２）カーゴ搭載および放出を可能にする、それらの高い表面積対体積比；ならびに（３）溶解性を増進させ、結合を制御し、生物学的に活性な機能を取り込む、それらの調節可能な表面化学に起因して、魅力的なものである。

【0082】

ｉｎ ｖｉｖｏでのナノ粒子薬物送達は、粒子の取り込み（オプソニン化）、排出（腎臓）または非特異的な損失（血管外漏出）を引き起こし、治療ペイロードが所望の細胞に到達するのを妨げる可能性がある、多くの生物物理学的および生化学的課題に満ちている。薬物送達構築物の主要パラメーターの１つはその物理的サイズであり、より小さい粒子（例えば、約５ｎｍ未満またはそれに等しい流体力学直径の粒子）は、非特異的に血管外遊出する（extravasate）ことができるが、ずっと大きい粒子または凝集体（例えば、約５００ｎｍ超もしくはそれに等しい直径の粒子または凝集体）は、それらの意図された標的へトラフィッキングされるのではなくむしろ微小血管系中に留まる可能性がある。非生分解性材料については、所望の薬物動態を可能にするために腎臓クリアランスの速度を制限しながら、粒子除去の手段としての腎臓濾過を可能にする、５ｎｍ〜１０ｎｍの範囲の好ましい直径が存在することが見出されている。さらに、このサイズレジームの粒子は、強化された透過性および保持（ＥＰＲ）効果、すなわち、漏れやすい脈管構造に起因した腫瘍内微小環境における巨大分子の受動的蓄積を利用することもできることが見出された。

【0083】

例えば、ある特定の実施形態では、極小（例えば、５ｎｍ〜１０ｎｍの範囲の直径を有する）のものを、その全体において、参照により本明細書に組み込まれる米国特許公開第２０１４／０２４８２１０Ａ１号に記載されているようにしてヒトにおいてテストした。この例では、５人の患者において有害事象は見られず、薬剤は、試験期間にわたって十分に許容されるものであった。組織１グラム当たりの注射用量のパーセンテージ（％ＩＤ／ｇ）対注射後の時間、および対応する平均臓器吸収用量で表された薬物動態挙動は、他の一般に使用される診断用放射性トレーサーで見出されるものに匹敵していた。この代表的な患者の一連のＰＥＴ画像化は、主要な臓器および組織からの推定される血液プール活性の漸進的な損失を示し、注射後（ｐ．ｉ．）７２時間で感知できるほどの活性は見られなかった。これらの患者における全身クリアランス半減時間は、１３〜２１時間の範囲であると推定された。興味深いことに、多くの疎水性分子、タンパク質およびより大きい粒子プラットホーム（１０ｎｍ超）とは対照的に、肝臓、脾臓、または骨髄における顕著な局在化は見られなかった。患者は、甲状腺組織取り込みをブロックするためにヨウ化カリウム（ＫＩ）で予備処置されたが、この患者では、他の組織と比べて、より高い平均吸収甲状腺用量が得られた。粒子は、やはり主に、腎臓と膀胱壁の両方で腎臓によって排出され（甲状腺および腫瘍の後、以下を参照されたい）、これは、７２時間ｐ．ｉ．までで最も高い％ＩＤ／ｇ値の１つを示している；腎臓で排出される放射性医薬品によくあるように、膀胱壁は、他の主要臓器および組織よりも高い平均吸収用量を受けた。これらの発見は、肝胆道よりむしろ、腎臓の排出が、体からのクリアランスの主な経路である事実を強調している。

【0084】

表皮性増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）が、標的療法のために使用される。構成的活性化をもたらすＥＧＦＲ変異は、転移性非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）の１０〜３５％において見出されており、ＥＧＦＲ阻害剤は全身性疾患に対しては効果的であるが、脳転移の制御は、薬物送達によって制限されたままである。ＥＧＦＲ変異は、原発性多形性膠芽腫（ＧＢＭ）（２つの高頻度に見られる形態の脳がん）の４０〜５０％においても見出される。ゲフィチニブなどのＥＧＦＲ−チロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）は、前臨床設定において有望さが示されているが、それらは、多分、不十分な組織または中枢神経系（ＣＮＳ）浸透および用量制限毒性のため、脳がん患者においてはほとんど効果のないことが実証されている。

【0085】

ゲフィチニブは、ＥＧＦＲのキナーゼドメイン活性部位と結合しそれを阻害する。ＮＤＣとの関連でゲフィチニブを利用するためには、キナーゼドメインとの薬物の結合をそれほど乱さない化学的に反応性基を取り込むことが重要である。Ｘ線結晶学的試験およびＳＡＲ試験によって、モルホリノ基をアミンで置き換えても、薬物活性をそれほど変えることはないが、修飾のための必要化学的機能（アミン）が提供され、結果として、ＣドットまたはＣ’ドットへの共有結合的な付着がもたらされることが明らかになった（図１Ａ）。

【実施例】

【0086】

１つの実施例は、ナノ粒子薬物コンジュゲート（例えば、共有結合的に付着した薬物分子を有するシリカベースのナノ粒子プラットホーム）の例示的な合成ならびにそれらの特徴付けおよび予備的な生物学的評価を実証する。

【0087】

商業的に入手可能なｄｅｓ−モルホリノ−ゲフィチニブ（ｄＭＧ）を用いて、所望のアミノプロピル−ｄＭＧ（ＡＰｄＭＧ）を、Ｂｏｃ保護されたアミノプロピルブロミドの求核置換（例えば、１ステップで）、続く酸脱保護によって得た（図１Ａ、図１０（スキーム１））。さらに、以下でさらに詳細に説明されるゲフィチニブ類似体２は、Ｆｍｏｃ−ｄＰＥＧ２−ＣＯＯＨをカップリングさせ、続く塩基脱保護ステップによって１から容易に得られた（図１Ａ、図１１（スキーム２））。ＡＰｄＭＧ１およびｄＰＥＧ_２ＡＰｄＭＧ２が、ＥＧＦＲに対する活性を保持していることを確認するために、Ｈ１６５０細胞を化合物で処理し、ウエスタンブロットにより分析してＥＧＦＲ中のホスホ−Ｔｙｒ１６８レベルを評価した。Ｈ１６５０細胞は、受容体の構成的活性をもたらす変異ＥＧＦＲ（Ｌ８５８ＲおよびΔＥ７４６−Ａ７５０）を含有する、モデルヒト腫瘍由来の非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）系統（気管支肺胞上皮癌）である。両方の化合物は、１および１０μＭの濃度でのホスホ−Ｔｙｒ^１６８の阻害で、ゲフィチニブと同様の効果を示したが、ｄＰＥＧ_２ＡＰｄＭＧ２は低減した活性を示した。

【0088】

３つのリンカータイプを、Ｃドットベースの薬物送達について検討した（図１Ｂ〜１Ｄ）。３つのリンカータイプは、薬物放出のためにプロテアーゼを利用するジペプチド配列を含む。プロテアーゼはジペプチドを認識してそれと結合し、Ｃ末端で加水分解をもたらし、リンカーから薬物構成成分を放出する。本明細書で説明するリンカー−薬物構築物を評価するために、２つのモデルプロテアーゼ、トリプシンおよびカテプシンＢを使用した。トリプシンは、代表的なセリンプロテアーゼとして選択した。これは、アルギニンおよびリシンなどの塩基性アミノ酸を含有するペプチドに対して高度に活性であり、これらの残基に対するＣ末端を切断する。カテプシンＢは、よりストリンジェントな基質特異性を有するシステインプロテアーゼである。今まで記載されている最小の基質コンセンサス配列は、疎水性および塩基性残基を含有するジペプチドモチーフである。トリプシンと同様に、カテプシンＢは、塩基性アミノ酸に対するＣ末端を切断する。ジペプチドのフェニルアラニン−アルギニン（Ｐｈｅ−Ａｒｇ）およびフェニルアラニン−リシン（Ｐｈｅ−Ｌｙｓ）は、トリプシンおよびカテプシンについてのトリプシン／カテプシンＢ認識モチーフであり、これらはリンカー−薬物構築物中に含まれる（図１Ｂ〜Ｄ）。

【0089】

Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ＡＰｄＭＧは、プロテアーゼ感受性リンカー−薬物構築物を得るためのアプローチの一例である（図２Ａおよび２Ｂ）。そうした設計では、ゲフィチニブ類似体１を、ジペプチド配列のＣ末端に直接付着させる。化合物３を、固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）法を使用して合成し、続く２でのＣ末端の修飾および最終脱保護ステップによって３を得た（図１１（スキーム３））。

【0090】

薬物構成成分のジペプチドモチーフへの近接近を考慮し、酵素が結合し、リンカー−薬物を加水分解するのを妨害する可能性がある、潜在的な立体的問題に対処した。ペプチドと薬物の間の距離を増大させるために、ＡＰｄＭＧ１を修飾してｄＰＥＧ_２ＡＰｄＭＧ２を得た（図１３（スキーム４））。ジペプチド構成成分とｄＰＥＧ_２ＡＰｄＭＧ２の間のカップリング反応、続く脱保護ステップによって、Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ｄＰＥＧ_２ＡＰｄＭＧ４（Ｐｈｅ−Ａｒｇとゲフィチニブ類似体の間の１０個の原子の短いＰＥＧスペーサーを含有するリンカー薬物構築物）を得た。

【0091】

ＡＰｄＭＧ１に対する構造的変化を導入することなく、ジペプチドと薬物構成成分の間の大きい間隔を保持するために、Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−ＰＡＢＣ−ＡＰｄＭＧ５を合成した。このリンカーは、ペプチドと薬物の間に自壊性（self-immolative）パラ−アミノベンジルオキシカルバメート（ＰＡＢＣ）基を取り込む（図１Ｄおよび２Ａ〜２Ｃ）。酵素的加水分解されると、この基は、さらに分解してパラ−アミノベンジルアルコールとＣＯ_２になり、それによって、ＡＰｄＭＧを放出する。化合物５の合成はＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｍｔｔ）−ＯＨで始まる（図１３（スキーム６））。保護されたアミノ酸は、パラ−アミノベンジルアルコールで修飾されてＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｍｔｔ）−ＰＡＢＡ１８をもたらす。Ｆｍｏｃ基が除去され、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨとカップリングすると、保護されたジペプチド、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（Ｍｔｔ）−ＰＡＢＡ１９が形成される。次いで、−ＰＡＢＡの遊離ヒドロキシル基は、パラ−ニトロフェノールカーボネートクロリドで活性化され、活性化されたカーボネート２０をもたらし、次いで、これはＡＰｄＭＧ１と反応し、化合物２１をもたらす。一連の脱保護およびカップリングの後、化合物２２が得られた。最終脱保護ステップは、酸性条件を必要とした。しかし、パラ−アミノベンジルオキシカルバメート基自体は、そうした条件下（例えば、酸性条件）で、分解の影響を受けやすい。十分に穏やかな条件（例えば、０．５％ＴＦＡ）により、リンカーを保持しながら、リシンからＭｔｔ基および末端チオールからＭｍｔ基が除去され、所望の生成物１６が得られることが分かった。リシン側鎖をマスキングするＭｔｔ基は、パラ−ニトロフェノールカーボネートクロリドの存在下で安定であるが、穏やかな酸性条件下での除去に対して不安定であるので、この全般的な合成アプローチに非常に適している。これは、パラ−ニトロフェノールカーボネートクロリドの存在下で容易に除去された、リシン側鎖保護のための、より一般的に使用される、非常に変化しやすい（hyper-labile）Ｍｍｔ基とは対照的である。

【0092】

３つのリンカー−薬物構築物を評価するために、化合物３〜５を酵素的加水分解にかけた（表１、図３Ａ〜３Ｃ、４Ａおよび４Ｂ）。薬物−リンカー構築物を、トリプシンまたはカテプシンＢのいずれかでインキュベートし、反応を、ＨＰＬＣまたはＬＣＭＳでモニターした。トリプシンは３つすべての構築物に対して活性であった：６０分までに、ＡＰｄＭＧ１をもたらすＰｈｅ−Ａｒｇ−ＡＰｄＭＧ３の完全な加水分解が観察され；完全な、Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ｄＰＥＧ_２ＡＰｄＭＧ４からのｄＰＥＧ_２ＡＰｄＭＧ２の放出、およびＰｈｅ−Ｌｙｓ−ＰＡＢＣ−ＡＰｄＭＧ５からのＡＰｄＭＧ１の放出のためには１０分間しかかからなかった。しかし、構築物をカテプシンＢで処理した場合、Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ＡＰｄＭＧ３については、加水分解は観察されなかったが、Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ｄＰＥＧ_２ＡＰｄＭＧ４は完全に加水分解されて、ｄＰＥＧ_２ＡＰｄＭＧ２の放出がもたらされた。

【0093】

以下の表１は、リンカー−薬物構築物についての薬物放出アッセイによって得られた半減期を例示する。

【表1】

【0094】

薬物放出プロファイルを得るために化合物３〜５についてｉｎ ｖｉｔｒｏでのアッセイを実施し、構築物の酵素媒介性加水分解を、異なる時間点にわたってモニターした（図４Ａおよび４Ｂ）。Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ＡＰｄＭＧ３については、薬物ＡＰｄＭＧ１の５０％は９分間で放出されたが、Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ｄＰＥＧ_２ＡＰｄＭＧ４は５０％薬物放出について、２分間以内で、著しく速かった。化合物５もやはり速く、５０％薬物放出のために１分未満しか必要としなかった。カテプシンＢの存在下で、薬物放出が観察されなかったので、Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ＡＰｄＭＧ３は不十分な基質であることが判明した。Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ｄＰＥＧ_２ＡＰｄＭＧ４については、薬物の５０％が１１０分間で放出された。Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−ＰＡＢＣ−ＡＰｄＭＧ５は５０％薬物のために＜１分間しか必要とせず、それが、酵素のための非常に効率的な基質であることを示唆している。

【0095】

トリプシンとカテプシンＢの両方について、３つのリンカー−薬物構築物についての薬物放出の速度は、同じ一般的傾向にしたがっている：Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−ＰＡＢＣ−ＡＰｄＭＧ５＞Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ｄＰＥＧ_２ＡＰｄＭＧ４＞Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ＡＰｄＭＧ３（最も速い方から最も遅い方へ）。Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ＡＰｄＭＧ３およびＰｈｅ−Ａｒｇ−ｄＰＥＧ_２ＡＰｄＭＧ４についての結果は、薬物のジペプチド単位への近接が、酵素活性および薬物放出に影響を及ぼすことを示唆している。薬物とジペプチドの間の間隔（距離）が、１０個の原子のＰＥＧ基の取り込みを介して増大した場合、加水分解（薬物放出）は増進する。この効果は、構築物３を加水分解することができない、カテプシンＢで最も顕著に観察される。しかし、薬物とジペプチド４の間に１０個の原子のＰＥＧスペーサーを取り込むことによって、加水分解および薬物放出が観察される。

【0096】

ＮＤＣを調製するために、マレイミド官能化Ｃ’ドット（Ｃ’ドット−（Ｃｙ５）−ＰＥＧ−ｍａｌ）を合成した。Ｃｙ５フルオロフォアで修飾されたシランを調製し、ＮＨ_４ＯＨの希釈溶液中へ、テトラメチルオルトシラン（ＴＭＯＳ）と一緒に、滴定し（モル比ＴＭＯＳ：Ｃｙ５：ＮＨ３：Ｈ２０は１：０．００１：０．４４：１２１５である）、２４時間混合した（Urata C、Aoyama Y、TonegawaA、Yamauchi Y、Kuroda K. Dialysisprocess for the removal of surfactants to form colloidal mesoporous silicananoparticles. Chem Commun (Camb). ２００９年；（３４巻）：５０９４〜６頁）（Yamada H、Urata C、AoyamaY、Osada S、Yamauchi Y、Kuroda K. Preparation of Colloidal Mesoporous Silica Nanoparticleswith Different Diameters and Their Unique Degradation Behavior in StaticAqueous Systems、Chem. Mater. ２０１２年；２４巻（８号）：１４６２〜７１頁）（Wang J、Sugawara-Narutaki A、Fukao M、Yokoi T、ShimojimaA、Okubo T. Two-phase synthesis of monodisperse silicananospheres with amines or ammonia catalyst and their controlled self-assembly.ACS Appl Mater Interfaces. ２０１１年；３巻（５号）：１５３８〜４４頁）。これは、Ｃｙ５カプセル化されたシリカ粒子をもたらし、その表面を、ＰＥＧ−シラン（５００ｇ／モル）（Suzuki K、Ikari K、ImaiH. Synthesis of silica nanoparticles having a well-ordered mesostructured usinga double surfactant system. J Am Chem Soc.２００４年；１２６巻（２号）：４６２〜３頁）およびマレイミド−ＰＥＧ−シラン（１：２．３：０．００６のモル比ＰＥＧ−シラン：ＴＭＯＳ：ｍａｌ−ＰＥＧ−シラン）での処理によって、さらに、マレイミド基でＰＥＧ化し、官能化した。４８時間後、反応混合物を透析し、濾過し、ゲル濾過により精製した。ナノ粒子を、それぞれ直径、形態および全体的純度について蛍光相関分光法（ＦＣＳ）、透過電子顕微鏡法（ＴＥＭ）および分析的ＨＰＬＣによって特徴付けした。得られたＣ’ドットは１０ｎｍ未満の直径であり、狭い粒径分布を有していた（図１６Ａ〜１６Ｄ）。

【0097】

リンカー−薬物４および５（例えば、Ｃ’ドット−（Ｃｙ５）−ＰＥＧ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ｄＰＥＧ_２ＡＰｄＭＧ（６）およびＣ’ドット−（Ｃｙ５）−ＰＥＧ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−ＰＡＢＣ−ＡＰｄＭＧ（７））を取り込んだＮＤＣを、Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ｄＰＥＧ_２ＡＰｄＭＧ（４）およびＰｈｅ−Ｌｙｓ−ＰＡＢＣ−ＡＰｄＭＧ（５）をＣ’ドット−（Ｃｙ５）−ＰＥＧ−ｍａｌに加えて、構築物上の末端チオールを粒子上のマレイミド基と反応させることによって得た（スキーム２）。ＮＤＣ生成物を単離した後、ゲル濾過により精製してＮＤＣ６および７を得、ＴＥＭおよびＨＬＰＣによって特徴付けした（図１６Ａおよび図１６Ｂ）。分析的ＨＰＬＣを、夾雑物の存在を評価し、また、粒子当たりの薬物分子の数または薬物と粒子の比（ＤＰＲ）を決定するために使用した（表２）。ゲフィチニブ類似体の濃度は、３４８ｎｍで容易に測定することができ、粒子濃度は、Ｃ’ドット内に包埋されたＣｙ５のため、６５０ｎｍで得ることができる。平均ＤＰＲは中程度であることが分かったが、ＮＤＣは、ＤＰＲ推定値が１未満から１５超の範囲にある測定可能な不均一性を示した。ゲフィチニブ類似体の不十分な溶解性のため予想されるように、ＮＤＣの沈殿は観察されなかった。ＦＣＳを、リンカー−薬物コンジュゲーションに起因した粒子サイズの変化を評価するために使用した。表２に示すように、ＮＤＣは、ベースのｍａｌ−Ｃ’ドットにわたって、最小の直径の増大を示した。

【0098】

以下の表２は、ナノ粒子特徴付けの概要を例示する。

【表2】

【0099】

経時的な酵素依存性薬物放出を、Ｃ’ドット−（Ｃｙ５）−ＰＥＧ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ｄＰＥＧ_２ＡＰｄＭＧおよびＣ’ドット−（Ｃｙ５）−ＰＥＧ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−ＰＡＢＣ−ＡＰｄＭＧについて測定して、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの薬物放出プロファイルを得た（図６Ａおよび６Ｂ）。トリプシンでの薬物放出を実証する代表的なＨＰＬＣデータを図５Ａおよび５Ｂに示す。ＮＤＣ６および７は、トリプシンのための優れた基質であり、５０％薬物放出を達成するのに、それぞれ４４分間および６分間を必要とした（図６Ａ、表１）。カテプシンＢの存在下で、放出動力学は、両方のＮＤＣについて著しく遅く：薬物放出の５０％は、ＮＤＣ６について５６０分間、ＮＤＣ７について５１０分間で達成された（図６Ｂ、表１）。一緒にすると、データは、薬物構成成分の制御放出をもたらす、粒子表面上のリンカー−薬物構築物の接近可能性（accessibility）を実証している。

【0100】

ＮＤＣの安定性を、水性条件において、酸性および中性のｐＨ（５．０および７．２）下、３７℃で評価した。ＮＤＣ６とＮＤＣ７はどちらも、ＨＰＬＣで測定して、４８時間で分解または薬物放出を示さなかった。ｉｎ ｖｉｖｏで起こり得る逆マイケル反応またはチオール交換反応の可能性に起因した抗体薬物コンジュゲートからのリンカー薬物構築物の損失が観察されたため、チオール−マレイミドベースのコンジュゲーションの精査を招くこととなった。過剰なチオールの存在下でのＮＤＣのｉｎ ｖｉｔｒｏでの安定性を評価するために、ＮＤＣ７を、３０ｍＭのグルタチオン（gluthathione）で、３７℃、ｐＨ７．２で４８時間インキュベートした。リンカー−薬物の５％未満が、４８時間後にＣドットから分離された（表４）。

【0101】

以下の表３は、リンカー−薬物構築物についての薬物放出アッセイによって得られた半減期を例示する。

【表3】

【0102】

以下の表４は、ＮＤＣ安定性データを例示する。

【表4】

【0103】

Ｃ’ドット−（Ｃｙ５）−ＰＥＧ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ｄＰＥＧ_２ＡＰｄＭＧおよびＣ’ドット−（Ｃｙ５）−ＰＥＧ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−ＰＡＢＣ−ＡＰｄＭＧの生物学的活性を、Ｈ１６５０細胞の処理、続く、ＥＧＦＲにおけるホスホ−Ｔｙｒ^１６８のウエスタンブロットによる検出によって評価し、ゲフィチニブと比較した。血清飢餓細胞を各化合物と１８時間にわたってインキュベートし、次いでＥＧＦ刺激にかけた。ゲフィチニブ対照は、ＥＧＦＲのＴｙｒ^１６８リン酸化の用量依存的減少を示し、１μＭで完全に消失した（図７）。ＮＤＣ６および７も用量依存的阻害を示し；ＮＤＣ６で処理された細胞は、１０μＭで検出可能なレベルのホスホ−Ｔｙｒ^１６８を示した。対照的に、ＮＤＣ７は良好な活性を示し、１００ｎＭでホスホ−Ｔｙｒ^１６８は大幅に減少しており、１μＭのＮＤＣ濃度で完全に消失している。時期尚早の薬物放出が起こり、ホスホ−Ｔｙｒ^１６８ＥＧＦＲの減少が観察され得る可能性があることを所与として、これらのアッセイで使用したＮＤＣの安定性をモニターした。Ｈ１６５０細胞を１８時間で処理するために使用したＮＤＣ６または７（１０μＭ）を含む一定分量の媒体をＨＰＬＣで分析した。媒体中に遊離薬物が検出されず、ＮＤＣは損なわれていなかったので、両方の粒子はこれらの条件下で安定であることが証明された（表３）。ＮＤＣ６および７に加えて、最終的なｉｎ ｖｉｖｏでの試験のための二次的画像化モダリティー（secondary imaging modality）の組み込みを検討した。Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ｄＰＥＧ_２−Ｄ−Ｔｙｒ−アミノプロピル−ｄＭＧを有するリンカー−薬物構築物を、放射性標識を付着させるために、薬物構成成分でＤ−チロシン残基を取り込んで合成した（化合物２３および２４）。ＮＤＣ Ｃ’ドット−（Ｃｙ５）−ＰＥＧ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ｄＰＥＧ_２−Ｄ−Ｔｙｒ−ＡＰｄＭＧを調製し、^１３１Ｉを用いて、＞９０％の放射化学的純度で首尾よく放射性ヨウ化した（図８）。
試薬：

【0104】

商業的供給源から購入した溶媒および試薬は、さらに精製することなく使用した。アセトニトリル、ジエチルエーテル、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、酢酸エチル、ヘキサン、ヘキサフルオロイソプロパノール（ＨＦＩＰ）、メタノール、塩化メチレン（ＤＣＭ）およびトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）は、Ｆｉｓｈｅｒから得た。ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）、トリエチルアミン（ＴＥＡ）、炭酸カリウム、Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル）−アミノプロピルブロミド、（３−アミノプロピル）トリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）、（３−メルカプトプロピル）トリメトキシシラン（ＭＰＴＭＳ）、テトラメチルオルトケイ酸塩（ＴＭＯＳ）、ウシトリプシンは、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。Ｏ−Ｄｅｓ−モルホリノプロピルゲフィチニブは、Ｔｏｒｏｎｔｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（ＴＲＣ）から得た。２−（７−アザ−１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＴＵ）はＧｅｎｅｓｃｒｉｐｔから購入した。クロロトリチル樹脂および保護されたアミノ酸（Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｍｔｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ）は、ＥＭＤ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓから得た。Ｆｍｏｃ−Ｎ−ｄＰＥＧ_２ＯＨ、Ｍｍｔ−Ｓ−ｄＰＥＧ_８−ＯＨ、ｍａｌ−ｄＰＥＧ_１２−ＮＨＳは、Ｑｕａｎｔａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから購入した。Ｃｙ５マレイミドおよびＳｕｐｅｒｄｅｘ２００（分取グレード）はＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓから得た。ＤＭＳＯ−ｄおよびＣＤＣｌ_３は、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｉｓｏｔｏｐｅｓから購入した。固相合成は、Ｔｏｒｖｉｑからのポリプロピレンフリットシリンジ中で実施した。シリカ、ＴＬＣプレート、４ｇ、１２ｇ、２４ｇおよび４０ｇのＲｅｄｉＳｅｐ Ｒｆ順相カートリッジは、Ｔｅｌｅｄｙｎｅ ＩＳＣＯから得た。
フラッシュクロマトグラフィー：

【0105】

順相（シリカゲル）精製は、４ｇ、１２ｇ、２４ｇおよび４０ｇカートリッジを使用してＴｅｌｅｄｙｎｅ ＩＳＣＯ ＣｏｍｂｉＦｌａｓｈ Ｒｆで実施した。
分析的ＨＰＬＣ：

【0106】

試料は、５〜９５％アセトニトリル水溶液（０．５％ＴＦＡ）の直線勾配を使用して、１．２ｍＬ／分で１０分間、Ｃ４またはＣ１８のいずれか ４．６×５０ｍｍ逆相ＸＢｒｉｄｇｅ分析的カラム（Ｗａｔｅｒｓ）で、Ｗａｔｅｒｓ Ａｌｌｉａｎｃｅ ＨＰＬＣシステムまたはＡｕｔｏｐｕｒｅ ＬＣＭＳシステム（２７６７サンプルマネージャ、２９９６フォトダイオードアレイ検出器、２４２０ＥＬＳ検出器、Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ ＺＱ、２５２５バイナリーグラジエントモジュール、カラムフルイディクスオーガナイザー、５１５ＨＰＬＣポンプ、ポンプ制御モジュールＩＩ）で実行した。試料は、３４８ｎｍまたは６５０ｎｍのいずれかで分析した。
分取ＨＰＬＣ：

【0107】

試料は、５〜９５％アセトニトリル水溶液（０．５％ＴＦＡ）の直線勾配を使用して、２０ｍＬ／分で３０分間、Ｃ１８ １９×１５０ｍｍ逆相ＸＢｒｉｄｇｅ分取カラム（Ｗａｔｅｒｓ）で、Ｗａｔｅｒｓ分取システム（２９９６フォトダイオードアレイ検出器、２５４５バイナリーグラジエントモジュール）またはＡｕｔｏｐｕｒｅ ＬＣＭＳシステムのいずれかで精製した。試料は、２２０ｎｍまたは３４８ｎｍのいずれかで分析した。
核磁気共鳴（ＮＭＲ）；

【0108】

^１Ｈ−ＮＭＲおよび^１３Ｃ−ＮＭＲデータはＢｒｕｋｅｒ Ｕｌｔｒａｓｈｉｅｌｄ５００Ｐｌｕｓで得た。
トリプシンでの薬物放出アッセイ：

【0109】

アッセイは、２５μＭのＮＤＣ（例えば、６または７）または遊離リンカー−薬物（例えば３、４または５）および２００ｎＭトリプシンを用いて、２５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）中、３７℃で実施した。分析のため、７０μＬの分量を取り出し、指定された時間点（例えば、５、１５、３０、６０、１２０分間またはそれ超）で、酸（ＨＣｌ）でクエンチし、次いでＨＰＬＣ／ＬＣＭＳで実行した。ＮＤＣは水中、４℃で貯蔵した。トリプシンストック液は以下の通り調製した：１ｍｇのトリプシンを１ｍＬ水に溶解し、一定分量にし、次いで直ちに急速冷凍し、−８０℃で、最大で４週間貯蔵した。薬物放出アッセイの前に、酵素活性を、基質Ｚ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−パラ−ニトロ−アニリンを使用してテストした。遊離薬物％（図３およびＳ３）は、遊離薬物の量を、リンカー−薬物構築物またはＮＤＣのためにロードされた薬物の初期量で除したものである。遊離薬物の量は、３４８ｎｍでの放出された薬物に対応するＨＰＬＣピークの面積により決定される。ロードされた薬物の量は、酵素処理前のリンカー−薬物構築物またはＮＤＣについての３４８ｎｍでのＨＰＬＣピークの面積である。Ｃ’ドット−（Ｃｙ５）−ＰＥＧ−ｍａｌは３４８ｎｍでバックグラウンド吸光度を有するため、ＮＤＣについてのバックグラウンドサブトラクションが必要である。すべての緩衝液および溶液は、超純水（１８ＭΩ−ｃｍの抵抗率）を使用して調製した。
カテプシンＢでの薬物放出アッセイ：

【0110】

アッセイは、２５ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）中、３７℃で、２５μＭ ＮＤＣ（例えば、６または７）または遊離リンカー−薬物（例えば、３、４または５）および２００ｎＭカテプシンＢを用いて実施した。ＤＴＴは、このアッセイには使用しなかった。分析のために、７０μＬの分量を取り出し、指定された時間点（例えば、５、１５、３０、６０、１２０分間またはそれ超）で、酸（ＨＣｌ）でクエンチし、次いでＨＰＬＣ／ＬＣＭＳで実行した。ＮＤＣは水中、４℃で貯蔵した。カテプシンＢストック液は以下の通り調製した：１ｍｇのカテプシンＢを１ｍＬの５０ｍＭ酢酸ナトリウムおよび２．５ｍＭ ＥＤＴＡに溶解し、一定分量にし、次いで直ちに急速冷凍し、−８０℃で数週間貯蔵した。薬物放出アッセイの前に、酵素活性を、基質Ｚ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−パラ−ニトロ−アニリンを使用してテストした。遊離薬物％（図４Ａ、４Ｂ、６Ａおよび６Ｂ）は、上記段落で説明したように、遊離薬物の量を、リンカー−薬物構築物またはＮＤＣのためにロードされた薬物の初期量で除したものである。すべての緩衝液および溶液は、超純水（１８ＭΩ−ｃｍの抵抗率）を使用して調製した。
ＮＤＣ安定性アッセイ：

【0111】

アッセイは、２５ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）または５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）中、７．５μＭ ＮＤＣ（例えば、６または７）を用いて実施し、３７℃で最大で４８時間インキュベートした。リン酸緩衝液（ｐＨ７．２）中で１０ｍＭグルタチオン（還元型）も評価した。次いで２０μＬの一定分量をＨＰＬＣで分析した。１つの実験について、Ｈ１６５０細胞を、無血清ＤＥＭ中で、１０μＭ ＮＤＣで１８時間処理（以下のホスホＥＧＦＲアッセイを参照されたい）した後、媒体を回収し、ＨＰＬＣで分析した。
Ｈ１６５０細胞でのホスホＥＧＦＲアッセイ：

【0112】

Ｈ１６５０細胞を、２ｍｌの１０％ＦＢＳ ＤＥＭ培地を含む６ウェルプレート中で播種し（１５０万個の細胞）、２４時間成長させた。細胞を１ｍＬの無血清ＤＥＭ培地で洗浄し、次いでゲフィチニブまたはＮＤＣで、指示濃度で終夜（１８時間）インキュベートした。次いで、細胞を５０ｎｇ／ｍＬ ＥＧＦで５分間処理し、次いで１ｍＬのＰＢＳで洗浄した。トリプシン（０．５ｍｌ、０．２５％）を各ウェルに加え、細胞が脱離するまで（約５分間）インキュベートした。１ｍＬの１０％ＦＢＳ ＤＥＭ培地をウェルに加え、細胞を、１０ｍＬの１０％ＦＢＳ ＤＥＭ培地を含有した１５ｍＬ円錐管に移した。細胞を、４℃、３０００ｒｐｍで５分間遠心沈殿させた。細胞ペレットを１ｍＬの冷ＰＢＳで洗浄し、１．５ｍＬチューブに移し、遠心沈殿させた。ＰＢＳをデカントし、７０μＬのＲＩＰＡ（プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤を含有する）をペレットに加え、すり混ぜ（titurated）、氷上で１０分間インキュベートした。チューブを、４℃で、最高速度で１０分間回転させた。溶解物を新しい１．５ｍｌチューブに移し、−８０℃で貯蔵した。タンパク質濃度を、ブラッドフォードアッセイによって決定した。ウエスタンブロットを、Ｎｏｖｅｘ８％トリス−グリシンゲル（１．５ｍｍ×１５ウェル）、トリス−グリシンＳＤＳランニング緩衝液、ＮｕＰＡＧＥトランスファー緩衝液、１×ＴＢＳ洗浄緩衝液中の０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０、およびブロッキング緩衝液としての洗浄緩衝液中の５％乳汁を使用して、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ装置で実行した。一次抗体は以下のようにして適用した：抗リン酸化−ＥＧＦＲ（ｐＥＧＦＲ、Ｔｙｒ^１０６８）（１：１０００希釈；Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、抗ＥＧＦＲ（Ｄ３８Ｂ１）（１：５０００希釈；Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、モノクローナル抗β−アクチンクローンＡＣ−１５（１：５０００希釈；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）。適用された二次抗体は、ヤギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ（１：１００００希釈；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）およびヤギ抗ウサギＩｇＧ−ＨＲＰ（１：５０００希釈；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）であった。
Ｏ−ｄｅｓ−モルホリノ−ゲフィチニブ、ｄＭＧの調製（図１２（スキーム３）の８）：

【0113】

化合物は商業的に得た。

【0114】

¹H-NMR (500 MHz, DMSO-d6): δ 9.69 (s, 1H), 9.47 (s, 1H), 8.48 (s, 1H), 8.22 (dd, J = 6.9, 2.7Hz, 1H), 7.84 (ddd, J = 9.1, 4.4, 2.7 Hz, 1H), 7.78 (s, 1H), 7.41 (t, J = 9.1Hz, 1H), 7.22 (s, 1H), 3.98 (s, 3H). ¹³C-NMR (500 MHz, DMSO-d6): δ 155.83, 153.91, 151.89, 146.73, 146.20, 122.74, 121.69, 116.50,116.33, 109.51, 107.18, 105.25, 55.92.Ｃ_１５Ｈ_１１ＣｌＦＮ_３Ｏ_２（正確な質量３１９．１）についてのＥＳＩ−ＭＳ（ｍ／ｚ）：［Ｍ＋Ｈ］^＋計算値３２０．１、実測値３２０．２。
Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル）−アミノプロピル−ｄＭＧの合成（図１２（スキーム３）の９）：

【0115】

５００ｍｇの化合物８を、１００ｍＬの無水ＤＭＦに溶解した。Ｋ_２ＣＯ_３（ｍｇ、ｍｍｏｌ）を溶液に加えた。反応を６０℃で１６時間進行させ、ＴＬＣおよび／またはＨＰＬＣでチェックした。溶媒を真空中で除去し、褐色油状物を得、これを、ＤＣＭ〜ＤＣＭ中の２０％ＭｅＯＨの直線勾配を使用して、２４ｇのＲｅｄｉＳｅｐ Ｒｆ順相カートリッジでフラッシュ精製した。最終生成物を、白色固体（３１２ｍｇ、６２％収率）として単離した。

【0116】

¹H-NMR (500 MHz, DMSO-d6): δ 9.57 (s, 1H), 8.49 (s, 1H), 8.12 (dd, J = 6.8, 2.7 Hz, 1H), 7.81(m, 1H), 7.44 (t, J = 9.1 Hz, 1H), 7.20 (s, 1H), 6.92 (t, J = 5.7 Hz, 1H), 4.17(t, J = 6.0 Hz, 2H), 3.95 (s, 3H), 3.15 (q, J = 6.5 Hz, 2H), 1.95 (p, J = 6.5Hz, 2H), 1.38 (s, 9H). ¹³C-NMR (500 MHz, DMSO-d6): δ 156.01, 155.59, 154.39, 152.61, 146.92, 123.40, 122.29, 118.62,116.54, 116.37, 107.23, 102.59, 77.51, 66.69, 55.84, 37.22, 35.75, 28.95,28.22.Ｃ_２３Ｈ_２６ＣｌＦＮ_４Ｏ_４（正確な質量４７６．２）についてのＥＳＩ−ＭＳ（ｍ／ｚ）：［Ｍ＋Ｈ］^＋計算値４７７．２、実測値４７７．３。
アミノプロピル−Ｏ−ｄｅｓ−モルホリノ−ゲフィチニブ、ＡＰｄＭＧの調製（図１Ａおよび図１２（スキーム３）の１）：

【0117】

化合物９（１００ｍｇ、０．２１ｍｍｏｌ）を１ｍＬ ＴＦＡ：水（９：１）で３０分間処理した。ＴＦＡ：水を真空中で除去し、薄黄色油状物を得た。油状物をジエチルエーテルで洗浄し、次いで水：アセトニトリル（１：１）の溶液に溶解し、凍結させ、凍結乾燥した。黄褐色固体を得た（ＴＦＡ塩、９８ｍｇ、９５％収率）。

【0118】

¹H-NMR (500 MHz, DMSO-d6): δ 10.73 (s, 1H), 8.80 (s, 1H), 8.03 (s, 1H), 8.05 - 8.00 (m, 1H),7.88 (s, 3H), 7.72 (ddd, J = 9.0, 4.3, 2.6 Hz, 1H), 7.54 (t, J = 9.0 Hz, 1H),7.35 (s, 1H), 4.27 (t, J = 5.9 Hz, 2H), 4.00 (s, 3H), 3.04 (p, J = 6.7, 6.3 Hz,2H), 2.13 (dt, J = 12.2, 6.0 Hz, 2H). ¹³C-NMR (500 MHz, DMSO-d6): δ 158.02, 148.80, 116.96, 116.79, 107.60, 103.66, 66.17, 56.42,36.39, 26.59.Ｃ_１８Ｈ_１８ＣｌＦＮ_４Ｏ_２（正確な質量３７６．１）についてのＥＳＩ−ＭＳ（ｍ／ｚ）：［Ｍ＋Ｈ］^＋計算値３７７．１、実測値３７７．２。
９−フルオレニルメトキシカルボニル−Ｎ−アミド−ｄＰＥＧ_２−アミノプロピル−ｄＭＧ、Ｆｍｏｃ−ｄＰＥＧ_２ＡＰｄＭＧの調製（図１３（スキーム４）の１０）：

【0119】

ＤＭＦ（５００μＬ）中にｄＰＥＧ_２ＡＰｄＭＧ２（２５ｍｇ、０．０５ｍｍｏｌ、ＴＦＡ塩）およびＦｍｏｃ−Ｎ−アミド−ｄＰＥＧ_２−ＣＯＯＨ（２０ｍｇ、０．０５ｍｍｏｌ）を含有する溶液を調製した。ＤＩＥＡ（１９ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ、２６μＬ）、続いて、ＤＭＦ（１００μＬ）中のＨＡＴＵ（１９ｍｇ、０．０５ｍｍｏｌ）の溶液を加えた。反応を室温で３０分間進行させ、完了をＬＣＭＳで決定した。真空中で体積を減少させ、酢酸エチルおよび酢酸エチル中の１０％メタノールの勾配を使用してシリカゲルクロマトグラフィーによって精製した。画分を集め、プールし、溶媒を真空中で除去した。単離された生成物は白色固体（８４％収率）であった。

【0120】

¹H-NMR (500 MHz, DMSO-d6): δ 9.55 (d, J = 10.7 Hz, 1H), 8.51 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 8.18 - 8.07(m, 1H), 7.96 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 7.87 (d, J = 7.6 Hz, 2H), 7.83 - 7.76 (m,2H), 7.67 (d, J = 7.5 Hz, 2H), 7.49 - 7.36 (m, 3H), 7.31 (td, J = 7.5, 1.2 Hz,3H), 7.21 (s, 1H), 4.28 (d, J = 6.9 Hz, 2H), 4.24 - 4.10 (m, 3H), 3.94 (s, 3H),3.60 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 3.46 (s, 4H), 3.36 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 3.27 (q, J =6.6 Hz, 2H), 3.10 (q, J = 5.9 Hz, 2H), 2.32 (t, J = 6.5 Hz, 2H), 1.97 (p, J =6.5 Hz, 2H). ¹³C-NMR (500 MHz, CDCl₃): δ 170.08, 143.85, 127.54, 126.98, 125.10, 120.05, 102.60, 69.42,69.04, 66.78, 66.58, 55.87, 46.69, 40.01, 39.94, 39.85, 39.77, 39.68, 39.60,39.51, 39.43, 39.35, 39.25, 39.18, 39.07, 39.01, 36.16, 35.69, 28.67, 0.08.Ｃ_４０Ｈ_４１ＣｌＦＮ_５Ｏ_７（正確な質量７５７．２７）についてのＥＳＩ−ＭＳ（ｍ／ｚ）：［Ｍ＋Ｈ］^＋計算値７５８．３、実測値７５８．４。
アミノ−ｄＰＥＧ_２−アミノプロピル−ｄＭＧ、ｄＰＥＧ_２ＡＰｄＭＧの調製（図１Ａおよび図１３（スキーム４）の２）：

【0121】

化合物１０（１０ｍｇ、０．０１３ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ（１ｍＬ）中の３０％ピペリジンに溶解し、室温で１５分間反応させた。溶媒を真空中で除去し、水／アセトニトリルに溶解し、逆相（Ｃ１８）ＨＰＬＣで精製した。生成物を白色粉末（７ｍｇ、８０％収率）として回収した。

【0122】

¹H-NMR (500 MHz, DMSO-d6): δ 10.66 (s, 1H), 8.78 (s, 1H), 8.05 - 7.97 (m, 3H), 7.80 (s, 3H),7.72 (ddd, J = 9.0, 4.3, 2.6 Hz, 1H), 7.54 (t, J = 9.1 Hz, 1H), 7.32 (s, 1H),4.20 (t, J = 6.1 Hz, 2H), 4.00 (s, 3H), 3.65 - 3.48 (m, 7H), 3.27 (q, J = 6.6Hz, 2H), 2.96 (q, J = 5.5 Hz, 2H), 2.34 (t, J = 6.5 Hz, 2H), 1.98 (t, J = 6.5Hz, 2H). ¹³C-NMR (500 MHz, DMSO-d6): δ116.96, 69.55, 69.29, 66.73, 66.61, 56.38, 38.57, 36.03, 35.63, 28.58.Ｃ_２５Ｈ_３１ＣｌＦＮ_５Ｏ_５（正確な質量５３５．２０）についてのＥＳＩ−ＭＳ（ｍ／ｚ）：［Ｍ＋Ｈ］^＋計算値５３６．２、実測値５３６．３。
Ｂｏｃ−Ｎ−アミノ−（ｄＰＥＧ_２）_３−Ｐｈｅ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨの調製（図１４（スキーム５）の１１）：

【0123】

クロロトリチル樹脂（１００ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ、１ｍｍｏｌ／ｇ）をフリットシリンジ反応容器に移し、２ｍＬ無水ＤＣＭ中に１０分間懸濁させた。溶媒を分注し、無水ＤＣＭ中のＤＩＥＡの溶液、続いて無水ＤＣＭ中のＦｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ（９７．５ｍｇ、１．５当量）の溶液をシリンジ中に抜き取り；４０分間撹拌した。溶液を分注し、樹脂を２分間、ＤＣＭで２×、次いでＤＭＦで２×洗浄した。標準的な固相ペプチド合成手順を実施して最終ペプチドを得た。手短に言えば、Ｆｍｏｃ脱保護を、３０％ピペリジン／ＤＭＦ（１ｍＬ）を使用して樹脂を、２×、１０分間洗浄して遂行した。これに、４×、それぞれ２分間のＤＭＦ（１ｍＬ）洗浄が続いた。カップリング反応を、次の順番でシリンジに加えられた、３当量過剰の保護されたアミノ酸（２ｍＬ ＤＭＦ中）、９当量過剰のＤＩＥＡ（１２０ｍｇ、０．９ｍｍｏｌ、１６０μＬ、１ｍＬ ＤＭＦ中）、３当量過剰のＨＡＴＵ（ｍｍｏｌ、ｍｇ、μＬ、２ｍＬ ＤＭＦ中）を使用して室温で実施し、１時間振とうさせた。これに、４×、それぞれ２分間のＤＭＦ（１ｍＬ）洗浄が続いた。Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ（１１６ｍｇ）、続いてＦｍｏｃ−Ｎ−ｄＰＥＧ_２−ＯＨの３つの残基（１２０ｍｇ）を加えた。配列、最終Ｆｍｏｃ脱保護および洗浄が完了した後、２ｍＬのＤＭＦ中のＢＯＣ無水物（ｍｍｏｌ、ｍｇ）およびＤＩＥＡ（ｍｍｏｌ、ｍｇ、μＬ）を使用してＮ末端アミンをキャップした。ペプチド−樹脂をＤＭＦ（１ｍＬ、２分間、２×）、次いでＤＣＭ（１ｍＬ、２分間、４×）で洗浄した。次いで、ＤＣＭ（２ｍＬ）中の５０％ＨＦＩＰをシリンジに加え、室温で１時間振とうさせることによって、保護されたペプチド生成物を樹脂から切り離した。次いで粗製ペプチドを逆相ＨＰＬＣで精製した。Ｃ_５４Ｈ_８６Ｎ_８Ｏ_１７Ｓ（正確な質量１１５０．５６）についてのＥＳＩ−ＭＳ（ｍ／ｚ）：［Ｍ＋Ｈ］^＋計算値１１５１．６、実測値１１５１．７。
Ｂｏｃ−Ｎ−アミド−（ｄＰＥＧ_２）_３−Ｐｈｅ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＡＰｄＭＧの調製（図１４（スキーム５）の１２）：

【0124】

ＤＭＦ（１ｍＬ）中に化合物１１（２３ｍｇ、０．０２ｍｍｏｌ、１当量）およびＡＰｄＭＧ１（９ｍｇ、０．０２４ｍｍｏｌ、１．２当量）を含有する溶液を調製した。続いて、このＤＩＥＡ（１０ｍｇ、０．０８ｍｍｏｌ、１４μＬ、４当量）にＨＡＴＵ（９ｍｇ、０．０２４ｍｍｏｌ、１．２当量）を加えた。反応をＨＰＬＣでモニターし、３０分間以内で完了した。溶媒を真空中で除去し、次いでＤＣＭ中に再懸濁させた。ＤＣＭ溶液を水４×で洗浄し、次いで蒸発させて黄褐色油状物を得た。Ｃ_７２Ｈ_１０２ＣｌＦＮ_１２Ｏ_１８Ｓ（正確な質量１５０８．６８）についてのＥＳＩ−ＭＳ（ｍ／ｚ）：［Ｍ＋Ｈ］^＋計算値１５０９．７、実測値１５０９．７；［Ｍ＋２Ｈ］^２＋計算値７５５．４、実測値７５５．０。
Ｂｏｃ−Ｎ−アミド−（ｄＰＥＧ_２）_３−Ｐｈｅ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ｄＰＥＧ_２ＡＰｄＭＧの調製（図１４（スキーム５）の１３）：

【0125】

ＤＭＦ（１ｍＬ）中に化合物１１（３０ｍｇ、０．０２６ｍｍｏｌ、１当量）およびｄＰＥＧ_２ＡＰｄＭＧ２（１８ｍｇ、０．０３４ｍｍｏｌ、１．３当量）を含有する溶液を調製した。続いて、このＤＩＥＡ（１４ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ、１８μＬ、４当量）に、ＨＡＴＵ（１３ｍｇ、０．０３４ｍｍｏｌ、１．３当量）を加えた。反応をＨＰＬＣでモニターし、３０分間以内で完了した。溶媒を真空中で除去し、次いでＤＣＭ中に再懸濁させた。ＤＣＭ溶液を水４×で洗浄し、次いで蒸発させて黄褐色油状物を得た。Ｃ_７９Ｈ_１１５ＣｌＦＮ_１３Ｏ_２１Ｓ（正確な質量１６６７．７７）についてのＥＳＩ−ＭＳ（ｍ／ｚ）：［Ｍ＋２Ｈ］^２＋計算値８３４．９、実測値８３４．７。
Ｈ_２Ｎ−（ｄＰＥＧ_２）_３−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ＡＰｄＭＧの調製（スキーム６の１４）：

【0126】

ＴＦＡ／水（９：１、１ｍＬ）を化合物１２（前のステップから約０．０２ｍｍｏｌ）に加え、室温で１時間放置した。反応物を蒸発させ、次いでＡＣＮ／水に溶解し、凍結させ、凍結乾燥して黄褐色固体を得た。粗製物を逆相ＨＰＬＣで精製した。最終生成物を白色固体（１４ｍｇ）として得た。Ｃ_５４Ｈ_７８ＣｌＦＮ_１２Ｏ_１３（正確な質量１１５６．５５）についてのＥＳＩ−ＭＳ（ｍ／ｚ）：［Ｍ＋Ｈ］^＋計算値１１５７．６、実測値１１５７．８；［Ｍ＋２Ｈ］^２＋計算値５７９．３、実測値５７９．１。
Ｈ_２Ｎ−（ｄＰＥＧ_２）_３−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−（ｄＰＥＧ_２）−ＡＰｄＭＧの調製（図１４（スキーム５）の１５）：

【0127】

ＴＦＡ／水（９：１、１ｍＬ）を化合物１３（前のステップから約０．０２６ｍｍｏｌ）に加え、室温で１時間放置した。反応物を蒸発させ、次いでＡＣＮ／水に溶解し、凍結させ、凍結乾燥して黄褐色固体を得た。粗製物を逆相ＨＰＬＣで精製した。最終生成物を白色固体（２４ｍｇ）として得た。Ｃ_６１Ｈ_９１ＣｌＦＮ_１３Ｏ_１６（正確な質量１３１５．６４）についてのＥＳＩ−ＭＳ（ｍ／ｚ）：［Ｍ＋Ｈ］^＋計算値１３１６．７、実測値１３１６．５；［Ｍ＋２Ｈ］^２＋計算値６５８．６、実測値６５８．５。
Ｓ−アセチル−メルカプトアセトアミド−（ｄＰＥＧ_２）_３−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ＡＰｄＭＧの調製（図１４（スキーム５）の１６）：

【0128】

ＤＭＦ（２００μＬ）中に化合物１４（５ｍｇ、０．００４ｍｍｏｌ、１当量）およびＤＩＥＡ（１．５ｍｇ、０．０１２ｍｍｏｌ、２μＬ、３当量）を含有する溶液を調製した。次いで、ＤＭＦ（１００μＬ）中のＳＡＭＡ−ＯＰｆｐ（２ｍｇ、０．００６ｍｍｏｌ、１．５当量）を溶液に加え、１時間反応させた。溶媒を真空中で除去し、次いで逆相ＨＰＬＣで精製した。３ｍｇの白色固体を回収した。Ｃ_６１Ｈ_９１ＣｌＦＮ_１３Ｏ_１６（正確な質量１３１５．６４）についてのＥＳＩ−ＭＳ（ｍ／ｚ）：［Ｍ＋Ｈ］^＋計算値１３１６．７、実測値１３１６．５；［Ｍ＋２Ｈ］^２＋計算値６５８．６、実測値６５８．５。
Ｓ−アセチル−メルカプトアセトアミド−（ｄＰＥＧ_２）_３−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ｄＰＥＧ_２ＡＰｄＭＧの調製（図１４（スキーム５）の１７）：

【0129】

ＤＭＦ（２００μＬ）中に化合物１５（５ｍｇ、０．００４ｍｍｏｌ、１当量）およびＤＩＥＡ（１．５ｍｇ、０．０１２ｍｍｏｌ、２μＬ、３当量）を含有する溶液を調製した。次いで、ＤＭＦ（１００μＬ）中のＳＡＭＡ−ＯＰｆｐ（２ｍｇ、０．００６ｍｍｏｌ、１．５当量）を溶液に加え、１時間反応させた。溶媒を真空中で除去し、次いで逆相ＨＰＬＣで精製した。３ｍｇの白色固体を回収した。Ｃ_６５Ｈ_９５ＣｌＦＮ_１３Ｏ_１８Ｓ（正確な質量１４３１．６３）についてのＥＳＩ−ＭＳ（ｍ／ｚ）：［Ｍ＋２Ｈ］^２＋計算値７１６．８、実測値７１６．７。
メルカプトアセトアミド−（ｄＰＥＧ_２）_３−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ＡＰｄＭＧ、Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ＡＰｄＭＧの調製（図１Ｂおよび図１４（スキーム５）の３）：

【0130】

このステップを、使用する直前に実施した。１ｍｇの化合物１６を、１００μＬの水／ＭｅＯＨ（１：１）に溶解し、それに、２μＬの１Ｎ ＮａＯＨを加えた。１５分後、２ｕＬの１Ｍ ＨＣｌを加えて中和した。溶液を直接使用した。Ｃ_５６Ｈ_８０ＣｌＦＮ_１２Ｏ_１４Ｓ（正確な質量１２３０．５３）についてのＥＳＩ−ＭＳ（ｍ／ｚ）：［Ｍ＋Ｈ］^＋計算値１２３１．５、実測値１２３１．４；［Ｍ＋２Ｈ］^２＋計算値６１６．３、実測値６１６．３。
メルカプトアセトアミド−（ｄＰＥＧ_２）_３−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ｄＰＥＧ_２ＡＰｄＭＧ、Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ｄＰＥＧ_２ＡＰｄＭＧの調製（図１Ｃおよび図１４（スキーム５）の４）：

【0131】

このステップを、使用する直前に実施した。１ｍｇの化合物１７を、１００μＬの水／ＭｅＯＨ（１：１）に溶解し、それに、２μＬの１Ｎ ＮａＯＨを加えた。１５分後、２ｕＬの１Ｍ ＨＣｌを加えて中和した。溶液を直接使用した。Ｃ_６３Ｈ_９３ＣｌＦＮ_１３Ｏ_１７Ｓ（正確な質量１３８９．６２）についてのＥＳＩ−ＭＳ（ｍ／ｚ）：［Ｍ＋Ｈ］^＋計算値１３９０．６、実測値１３９０．５；［Ｍ＋２Ｈ］^２＋計算値６９５．８、実測値６９５．７。
Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｍｔｔ）−ＰＡＢＯＨの調製（図１５（スキーム６）の１８）：

【0132】

ＤＭＦ（５ｍＬ）中のＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｍｔｔ）−ＯＨ（７４８ｍｇ、１．２ｍｍｏｌ、１当量）およびパラ−アミノベンジルアルコール（３００ｍｇ、２．４ｍｍｏｌ、２当量）の溶液を調製した。ＤＩＥＡ（４６５ｍｇ、３．６ｍｍｏｌ、６３０μＬ、３当量）、続いてＤＭＦ（２ｍＬ）中のＨＡＴＵ（５０２ｍｇ、１．３ｍｍｏｌ、１．１当量）の溶液を加えた。ＨＰＬＣ／ＬＣＭＳで決定して、反応は３０分以内に完了した。溶媒を真空中で部分的に除去し、酢酸エチル／水で抽出した。酢酸エチル層を水で４×洗浄し、次いで蒸発させてオレンジ色固体を得た。粗製物を、ヘキサンおよび酢酸エチルの直線勾配を使用して、４０ｇのＲｅｄｉＳｅｐ Ｒｆ順相カートリッジで精製した。最終生成物を、白色固体（８５０ｍｇ、９７％収率）として単離した。

【0133】

¹H-NMR (500 MHz, CDCl₃): δ 7.96 (s, 1H), 7.73 (d, J = 7.9 Hz, 2H), 7.54 (d, J = 7.5 Hz, 2H),7.47 - 7.41 (m, 6H), 7.39 - 7.20 (m, 12H), 7.18 - 7.11 (m, 2H), 7.05 (d, J =7.9 Hz, 2H), 5.29 (s, 1H), 4.63 (s, 1H), 4.44 (d, J = 6.4 Hz, 2H), 2.28 (s,3H), 2.11 (t, J = 6.9 Hz, 2H), 1.88 (s, 1H), 1.58 (s, 5H), 1.51 (s, 1H), 1.38(s, 2H). ¹³C-NMR (500 MHz, CDCl₃): δ 146.36, 143.22, 141.32, 135.70, 128.57, 128.52, 128.49, 127.79,127.74, 127.12, 126.14, 124.92, 120.16, 120.02, 77.27, 77.02, 76.76, 70.62,64.92, 60.41, 47.16, 43.30, 30.57, 23.43, 21.07, 20.93, 14.21, 0.01.Ｃ_４８Ｈ_４７Ｎ_３Ｏ_４（正確な質量７２９．３６）についてのＥＳＩ−ＭＳ（ｍ／ｚ）：［Ｍ＋Ｈ］^＋計算値７３０．４、実測値７３０．２。
Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（Ｍｔｔ）−ＰＡＢＯＨの調製（図１５（スキーム６）の１９）：

【0134】

Ｆｍｏｃ基を、９ｍＬのＤＭＦ中の３０％ピペリジンを使用して１０分間、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｍｔｔ）−ＰＡＢＯＨ１８（４２５ｍｇ、０．６ｍｍｏｌ、１当量）から除去した。溶媒を真空中で除去し、得られた油状物を１０ｍＬのＤＭＦに再懸濁させた。ＤＭＦ（５ｍＬ）中のＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｍｔｔ）−ＯＨ（７４８ｍｇ、１．２ｍｍｏｌ、１当量）およびパラ−アミノベンジルアルコール（３００ｍｇ、２．４ｍｍｏｌ、２当量）の溶液を調製した。ＤＩＥＡ（４６５ｍｇ、３．６ｍｍｏｌ、６３０μＬ、３当量）、続いてＤＭＦ（２ｍＬ）中のＨＡＴＵ（５０２ｍｇ、１．３ｍｍｏｌ、１．１当量）の溶液を加えた。ＨＰＬＣ／ＬＣＭＳで決定して、反応は３０分以内に完了した。溶媒を真空中で部分的に除去し、酢酸エチル／水で抽出した。酢酸エチル層を水で４×洗浄し、次いで蒸発させてオレンジ色固体を得た。粗製物を、ヘキサンおよび酢酸エチルの直線勾配を使用して、４０ｇのＲｅｄｉＳｅｐ Ｒｆ順相カートリッジで精製した。最終生成物を、白色固体（８５０ｍｇ、９７％収率）として単離した。

【0135】

¹H-NMR (500 MHz, CDCl₃) δ 8.20 (s, 1H), 7.73 (d, J = 7.6 Hz, 2H), 7.50 (s, 2H), 7.48 - 7.34(m, 8H), 7.34 - 7.20 (m, 11H), 7.20 - 7.07 (m, 7H), 7.04 (d, J = 8.1 Hz, 2H),6.28 (s, 1H), 5.22 (s, 1H), 4.62 (s, 2H), 4.43 (dd, J = 10.7, 6.7 Hz, 1H), 4.32(d, J = 11.5 Hz, 1H), 3.05 (s, 2H), 2.27 (s, 3H), 2.11 - 2.02 (m, 2H), 1.89 (s,1H), 1.46 (d, J = 6.3 Hz, 1H), 1.26 (s, 2H). ¹³C-NMR (500 MHz, CDCl₃)δ 146.35, 141.31, 136.97, 135.70, 129.10, 128.93,128.57, 128.50, 127.82, 127.74, 127.71, 127.39, 127.12, 126.14, 124.91, 124.84,120.10, 120.04, 77.28, 77.23, 77.02, 76.77, 70.60, 67.15, 64.96, 54.06, 47.08,43.35, 31.30, 30.60, 23.52, 20.93.Ｃ_５７Ｈ_５６Ｎ_４Ｏ_５（正確な質量８７６．４３）についてのＥＳＩ−ＭＳ（ｍ／ｚ）：［Ｍ＋Ｈ］^＋計算値８７７．４、実測値８７７．３。
Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（Ｍｔｔ）−ＰＡＢＣ−ＡＰｄＭＧの調製（図１５（スキーム６）の２１）：

【0136】

化合物１９（４２０ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ、１当量）を、無水ＤＣＭ（２０ｍＬ）に溶解した。ピリジン（２１６ｍｇ、２．７ｍｍｏｌ、５．４当量）、続いて無水ＤＣＭ中の４−ニトロフェニルクロロホルメート（１８０ｍｇ、０．９ｍｍｏｌ、１．８当量）の溶液を加えた。反応を室温で２時間進行させ、次いでＨＰＬＣおよびＴＬＣでチェックした。溶媒を真空中で除去し、次いで、ヘキサンおよび酢酸エチルの直線勾配を使用して２４ｇのＲｅｄｉＳｅｐ Ｒｆ順相カートリッジで精製した。生成物Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（Ｍｔｔ）−ＰＡＢＣ−ｐＮＰ（２０）を、黄色固体（３６０ｍｇ、７０％収率）として単離した。Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（Ｍｔｔ）−ＰＡＢＣ−ｐＮＰ（５０ｍｇ、０．０５ｍｍｏｌ、１当量）を、無水ＤＣＭ（３ｍＬ）に溶解した。次いで、無水ＤＣＭ中のＡＰｄＭＧ１（２５ｍｇ、０．０５ｍｍｏｌ、ＴＦＡ塩、１当量）のＤＩＥＡ（６５ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ、９０μＬ、１０当量）との溶液をＦｍｏｃ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（Ｍｔｔ）−ＰＡＢＣ−ｐＮＰに加えた。反応を室温で４時間進行させ、次いでＨＰＬＣおよびＴＬＣでチェックした。溶媒を真空中で除去し、粗製物を、ヘキサンおよび酢酸エチルの直線勾配を用いて、４ｇのＲｅｄｉＳｅｐ Ｒｆ順相カートリッジで精製した。最終生成物を、黄色固体（３８ｍｇ、６０％収率）として単離した。Ｃ_７６Ｈ_７２ＣｌＦＮ_８Ｏ_８（正確な質量１２７８．５１）についてのＥＳＩ−ＭＳ（ｍ／ｚ）：［Ｍ＋Ｈ］^＋計算値１２７９．５、実測値１２７９．４；［Ｍ＋２Ｈ］^２＋計算値６４０．３、実測値６４０．３。
Ｍｍｔ−Ｓ−ｄＰＥＧ_８−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（Ｍｔｔ）−ｐＡＢＣ−ｄＭＧの調製（図１５（スキーム６）の２２）：

【0137】

１８ｍｇの化合物２１（０．０１４ｍｍｏｌ、１当量）を、２ｍＬのＤＭＦ中の３０％ピペリジンで脱保護した。５分後、ＨＰＬＣ／ＬＣＭＳにより、反応が完了していることを確認し、溶媒を真空中で除去した。得られた油状物を、ＤＭＦ（０．５ｍＬ）に溶解し、それに、Ｍｍｔ−Ｓ−ｄＰＥＧ_８−ＣＯＯＨ（１３ｍｇ、０．０１７ｍｍｏｌ、１．２当量）およびＤＩＥＡ（９ｍｇ、０．０７０ｍｍｏｌ、１３μＬ、５当量）を加えた。ＤＭＦ（２００μＬ）中のＨＡＴＵ（６ｍｇ、０．０１４ｍｍｏｌ、１．２当量）の溶液を調製し、反応物に加えた。１時間後、ＨＰＬＣ／ＬＣＭＳにより、反応は完了していると見なされ、溶媒を真空中で除去した。残留した油状物を、ＤＣＭ〜ＤＣＭ中の１０％ＭｅＯＨの直線勾配を使用して、４ｇのＲｅｄｉＳｅｐ Ｒｆ順相カートリッジでフラッシュ精製した。最終生成物を、白色固体（２３ｍｇ、９２％収率）として単離した。Ｃ_１００Ｈ_１１４ＣｌＦＮ_８Ｏ_１６Ｓ（正確な質量１７６８．７７）についてのＥＳＩ−ＭＳ（ｍ／ｚ）：［Ｍ＋２Ｈ］^２＋計算値８８５．９、実測値８８６．０。
ＨＳ−ｄＰＥＧ_８−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−ＰＡＢＣ−アミノプロピル−ｄＭＧの調製（図１５（スキーム６）の５）：

【0138】

１０ｍｇの化合物２２（５．６μｍｏｌ）を、２ｍＬのＤＣＭ中の０．５％ＴＦＡ／５％ＴＩＳで２時間処理し、次いでＨＰＬＣ／ＬＣＭＳでチェックして、脱保護の完了を確認した。溶液を真空中で除去し、次いで冷エーテルで３×洗浄した。白色固体を、水／アセトニトリル（１：１）に溶解し、凍結させ、凍結乾燥した。得られた白色固体を、さらに精製することなく使用した（６ｍｇ、８６％収率）。Ｃ_６０Ｈ_８２ＣｌＦＮ_８Ｏ_１５Ｓ（正確な質量１２４０．５３）についてのＥＳＩ−ＭＳ（ｍ／ｚ）：［Ｍ＋Ｈ］^＋計算値１２４１．５、実測値１２４１．６；［Ｍ＋２Ｈ］^２＋計算値６２１．３、実測値６２１．３。
Ｃ’ドット−（Ｃｙ５）−ＰＥＧ−マレイミドの調製：

【0139】

マレイミドおよびＮＨＳエステル官能化ポリエチレングリコール（ｍａｌ−ｄＰＥＧ_１２−ＮＨＳ）を、ＤＭＳＯ中、アミノシラン（ＡＰＴＥＳ）でコンジュゲートした（モル比ｍａｌ−ＰＥＧ−ＮＨＳ：ＡＰＴＥＳ：ＤＭＳＯ １：０．９：６０）。反応混合物を、窒素下、室温で４８時間放置してシラン官能化されたｍａｌ−ｄＰＥＧ（ｍａｌ−ｄＰＥＧ−ＡＰＴＥＳ）を生成した。マレイミド官能化Ｃｙ５（ｍａｌ−Ｃｙ５）を、ＤＭＳＯ中で、チオール−シラン（ＭＰＴＭＳ）と反応させた（モル比Ｃｙ５：ＭＰＴＭＳ：ＤＭＯＳ １：２５：１１５０）。反応物を、窒素下、室温で２４時間放置してシラン官能化Ｃｙ５（Ｃｙ５−ＭＰＴＭＳ）を生成した。次いで、ＴＭＯＳおよびＣｙ５−ＭＰＴＭＳを、水酸化アンモニウム（ammonia hydroxide）溶液（約ｐＨ８）に滴定した（モル比ＴＭＯＳ：Ｃｙ５：ＮＨ３：Ｈ２Ｏ １：０．００１：０．４４：１２１５）。溶液を、６００ｒｐｍで、室温で２４時間撹拌して、均一なＣｙ５カプセル化されたシリカナノ粒子を形成させた。次いで、ｍａｌ−ｄＰＥＧ−ＡＰＴＥＳおよびシラン官能化ポリエチレングリコール（ＰＥＧ−シラン、ＭＷおよそ５００、Ｇｅｌｅｓｔ）を合成溶液に加えて、粒子をペグ化し、表面官能化させた（ＰＥＧ−シラン：ＴＭＯＳ：ｍａｌ−ＰＥＧ−ＡＰＴＥＳ １：２．３：０．００６）。溶液を６００ｒｐｍ、室温で２４時間撹拌し、次いで、撹拌なしで、８０℃でさらに２４時間インキュベートした。溶液を、２０００ｍＬの脱イオン水中で２日間透析し（１０ｋ ＭＷＣＯ）、２００ｎｍシリンジフィルターで濾過し、最後にクロマトグラフィーで精製（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００）して、所望のｍａｌ−Ｃ’ドットを得た。
Ｃ’ドット−（Ｃｙ５）−ＰＥＧ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ｄＰＥＧ_２−Ｇｌｙ−Ｄ−Ｔｙｒ−ＡＰｄＭＧの調製：

【0140】

化合物６を得るために使用したのと同じ全般的合成戦略を使用した。リンカー−薬物構築物Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ｄＰＥＧ_２−Ｇｌｙ−Ｄ−Ｔｙｒ−ＡＰｄＭＧ（２３）を合成した。（Ｃ_７４Ｈ_１０５ＣｌＦＮ_１５Ｏ_２０Ｓ（正確な質量１６０９．７１）についてのＥＳＩ−ＭＳ（ｍ／ｚ）：［Ｍ＋２Ｈ］^２＋計算値８０５．９、実測値８０５．６）。この構築物を、ＮＤＣ６および７について説明したように、Ｃ’ドット−（Ｃｙ５）−ＰＥＧ−ｍａｌに付着させた。
Ｃ’ドット−（Ｃｙ５）−ＰＥＧ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−ＰＡＢＣ−Ｇｌｙ−Ｄ−Ｔｙｒ−ＡＰｄＭＧの調製：

【0141】

化合物７を得るために使用したのと同じ全般的合成戦略を使用した。リンカー−薬物構築物Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−ＰＡＢＣ−Ｇｌｙ−Ｄ−Ｔｙｒ−ＡＰｄＭＧ（２４）を合成した。（Ｃ_７１Ｈ_９４ＣｌＦＮ_１０Ｏ_１８Ｓ（正確な質量１４６０．６１）についてのＥＳＩ−ＭＳ（ｍ／ｚ）：［Ｍ＋Ｈ］^＋計算値１４６１．６、実測値１４６１．３；［Ｍ＋２Ｈ］^２＋計算値７３１．３、実測値７３１．５）。この構築物を、ＮＤＣ６および７について説明したように、Ｃ’ドット−（Ｃｙ５）−ＰＥＧ−ｍａｌに付着させた。
Ｃ’ドット−（Ｃｙ５）−ＰＥＧ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ｄＰＥＧ_２−Ｇｌｙ−Ｄ−Ｔｙｒ−アミノプロピル−ＡＰｄＭＧの放射性ヨウ素化物の調製：

【0142】

放射性ヨウ素化を、Ｉｏｄｏｇｅｎプロトコールを使用して、Ｃ’ドット−（Ｃｙ５）−ＰＥＧ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ｄＰＥＧ_２−Ｇｌｙ−Ｄ−Ｔｙｒ−ＡＰｄＭＧで実施した。ヨウ素化反応物をＰＤ１０カラムで精製し、次いでＧＰＣ（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ）で分析した。

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図1D】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図4A】

【図4B】

【図5A】

【図5B】

【図6A】

【図6B】

【図7】

【図8】

【図9A】

【図9B】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16A】

【図16B】

【図16C】

【図16D】