特許 6573762 誘電泳動法を用いた細胞の判別方法及び装置、並びに、細胞の評価方法及び装置

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6573762

(24)【登録日】2019年8月23日

(45)【発行日】2019年9月11日

(54)【発明の名称】誘電泳動法を用いた細胞の判別方法及び装置、並びに、細胞の評価方法及び装置

(51)【国際特許分類】

   G01N 27/00 20060101AFI20190902BHJP

   C12M 1/34 20060101ALI20190902BHJP

   G01N 33/48 20060101ALI20190902BHJP

   G01N 21/17 20060101ALI20190902BHJP

   G01N 27/447 20060101ALI20190902BHJP

【ＦＩ】

   G01N27/00 Z

   C12M1/34 B

   G01N33/48 M

   G01N21/17 A

   G01N27/447 331Z

【請求項の数】9

【全頁数】18

(21)【出願番号】特願2015-6170(P2015-6170)

(22)【出願日】2015年1月15日

(65)【公開番号】特開2016-133314(P2016-133314A)

(43)【公開日】2016年7月25日

【審査請求日】2018年1月10日

(73)【特許権者】

【識別番号】593006630

【氏名又は名称】学校法人立命館

(74)【代理人】

【識別番号】100111567

【弁理士】

【氏名又は名称】坂本 寛

(74)【代理人】

【識別番号】110000280

【氏名又は名称】特許業務法人サンクレスト国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】田口 耕造

(72)【発明者】

【氏名】有年 慶修

【審査官】 小澤 瞬

(56)【参考文献】

【文献】 特開２００９−２９１０９５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００５−２２４１７１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２００７／１０５５７８（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特開２０１０−０４８７７９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００３−０００２２４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 米国特許出願公開第２００４／００５３２１１（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 特開平０７−０３１４５５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 圓城寺隆治 et al.，誘電泳動インピーダンス計測法による細菌誘電特性と細胞膜活性状態及び流量依存性の相関検証，静電気学会誌，２０１１年，35, 3，PP. 139-144

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｍ １／００ − Ｃ１２Ｍ ３／１０

Ｇ０１Ｎ ２１／００ − Ｇ０１Ｎ ２１／０１

Ｇ０１Ｎ ２１／１７ − Ｇ０１Ｎ ２１／６１

Ｇ０１Ｎ ２７／００ − Ｇ０１Ｎ ２７／１０

Ｇ０１Ｎ ２７／１４ − Ｇ０１Ｎ ２７／２４

Ｇ０１Ｎ ３３／４８ − Ｇ０１Ｎ ３３／９８

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

所定の周波数の交流電圧を流路内に配置された第１の誘電泳動電極に印加するステップ、
前記第１の誘電泳動電極に交流電圧を印加したときの細胞の挙動を撮像した画像により検出される誘電泳動による生細胞の前記第１の誘電泳動電極への捕捉状態に基づいて、所定のダメージ度の生細胞を判別するステップ、
判別された前記所定のダメージ度の生細胞に対して、前記流路に接続された処理室に移動させるための操作を行うステップ、
前記操作の後に、周波数を変化させながら前記処理室内に配置された第２の誘電泳動電極に交流電圧を印加するステップ、
前記第２の誘電泳動電極に交流電圧を印加したときの細胞の挙動を撮像した画像に基づいて誘電泳動による生細胞の前記第２の誘電泳動電極への捕捉状態を検出するステップ、及び
生細胞が前記第２の誘電泳動電極へ捕捉された時点における周波数に基づいて生細胞のダメージ度を評価するステップ
を含む、誘電泳動法を用いた細胞の判別及び評価方法。

【請求項2】

前記第１の誘電泳動電極に交流電圧を印加するステップ及び前記第２の誘電泳動電極に交流電圧を印加するステップにおいて、周波数を徐々に高めながら交流電圧を印加する、請求項１に記載の誘電泳動法を用いた細胞の判別及び評価方法。

【請求項3】

前記検出するステップでは、前記操作の後、生細胞を用いた所定の処理中に、前記第２の誘電泳動電極に交流電圧を印加したときの細胞の挙動を撮像した画像に基づいて誘電泳動による生細胞の前記第２の誘電泳動電極への捕捉状態を検出する、請求項１又は２に記載の誘電泳動法を用いた細胞の判別及び評価方法。

【請求項4】

前記検出するステップでは、前記操作の後、生細胞を用いた所定の処理中に、複数回、前記第２の誘電泳動電極に交流電圧を印加したときの細胞の挙動を撮像した画像に基づいて誘電泳動による生細胞の前記第２の誘電泳動電極への捕捉状態を検出する、請求項１又は２に記載の誘電泳動法を用いた細胞の判別及び評価方法。

【請求項5】

前記検出するステップでは、前記操作の後であり、かつ、生細胞を用いた所定の処理後に、前記第２の誘電泳動電極に交流電圧を印加したときの細胞の挙動を撮像した画像に基づいて誘電泳動による生細胞の前記第２の誘電泳動電極への捕捉状態を検出する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の誘電泳動法を用いた細胞の判別及び評価方法。

【請求項6】

生細胞の前記第２の誘電泳動電極への捕捉状態が維持される周波数の時間的変化を観測するステップを含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の誘電泳動法を用いた細胞の判別及び評価方法。

【請求項7】

生細胞を含む溶液を収容する収容部と、
前記収容部に接続された処理室と、
前記収容部内に配置された第１の誘電泳動電極と、
前記処理室内に配置された第２の誘電泳動電極と、
前記第１の誘電泳動電極に所定の周波数の交流電圧を印加する第１の電源部と、
周波数を変化させながら前記第２の誘電泳動電極に交流電圧を印加する第２の電源部と、
生細胞の挙動を撮像する撮像部と、
前記撮像部によって撮像した画像に基づいて生細胞の挙動を検出する検出部と、
前記検出部による検出結果に基づいて生細胞のダメージ度を取得する取得部と、を備え、
前記検出部は、前記第１の誘電泳動電極に交流電圧を印加したときの前記撮像部による前記画像から誘電泳動による生細胞の前記第１の誘電泳動電極への捕捉状態を検出し、前記捕捉状態に基づいて所定のダメージ度の生細胞を判別し、
前記取得部は、判別された前記所定のダメージ度の生細胞に対する、前記処理室に移動させるための操作の後に前記第２の誘電泳動電極に交流電圧を印加したときに前記撮像部によって撮像された画像により前記検出部によって検出された誘電泳動による生細胞の前記第２の誘電泳動電極への捕捉状態に基づいて、生細胞が前記第２の誘電泳動電極へ捕捉された時点における周波数に応じて生細胞のダメージ度を取得する、誘電泳動法を用いた細胞の判別及び評価装置。

【請求項8】

前記第１の電源部及び前記第２の電源部は、交流電圧の周波数をスイープさせる調整部を備えている、請求項７に記載の誘電泳動法を用いた細胞の判別及び評価装置。

【請求項9】

前記収容部内の溶液を加熱する加熱部をさらに備えており、
前記加熱部は、前記検出部により判別された生細胞のダメージ度に応じて加熱温度が制御される、請求項７又は８に記載の誘電泳動法を用いた細胞の判別及び評価装置。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、誘電泳動を用いて所定のダメージ度にある細胞を判別する方法及び装置、並びに、細胞のダメージ度を評価する方法及び装置に関する。

【背景技術】

【0002】

酵母菌等の細胞を用いて培養や融合等の処理を行う場合、生死判定を行うことによって細胞群の中から生きた細胞のみを抽出する作業が行われる。一般に、酵母菌の生死判定にはメチレンブルー染色法が用いられている。この方法は、メチレンブルーが細胞内に取り込まれた後、細胞内の酸化還元酵素の作用を受けて無色のロイコメチレンブルーになるという性質を利用したものであり、細胞を含む溶液中にメチレンブルー溶液を混入させると、生細胞は染色されず、死細胞のみが染色される。
しかし、この方法を長時間使用すると、メチレンブルーの毒素によって生細胞が死滅してしまい、その後の処理に失敗する可能性が生じる。

【0003】

生死判定を行う方法として、誘電泳動を用いたものも知られている。誘電泳動とは、不均一交流電界中において電界により分極した粒子が、電界の勾配によって強電界側又は弱電界側に泳動する現象である。下記の特許文献１には、複数の電極間に電界を発生させることにより、電極の間に負の誘電泳動によって粒子を集め、あるいは正の誘電泳動によって各電極に粒子を引きつける技術が開示されている。そして、生細胞及び死細胞の誘電特性等に応じた周波数の交流電圧を電極に印加することによって、例えば生細胞のみを電極に引きつけて死細胞から分離し、生細胞のみを抽出することが可能である。したがって、メチレンブルー染色法が有する上記の問題も解消することができる。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0004】

【特許文献1】特表２００６−５１００２０号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

上記のような生死判定を行うことによって生細胞として判定されたものであっても、外部から負荷を受けることによってダメージ（損傷等）を負ったものは、培養や融合等の処理に失敗する可能性が高くなるため、当該処理の対象としては適していない。
しかし、従来の誘電泳動を用いた生死判別では、このような細胞のダメージの度合（以下、「ダメージ度」ともいう）まで考慮して細胞を判別することはできない。したがって、培養等の処理に失敗したとき、細胞のダメージに原因があるのか他に原因があるのかを特定することもできない。

【0006】

本発明は、誘電泳動を利用して細胞のダメージ度を評価することができる評価方法及び装置、並びに、所定のダメージ度の細胞を判別する方法及び装置を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0007】

本発明に係る誘電泳動法を用いた細胞の判別方法は、
所定の周波数の交流電圧を誘電泳動電極に印加するステップ、及び
誘電泳動による生細胞の挙動に基づいて所定のダメージ度の生細胞を判別するステップを含むものである。

【0008】

本発明に係る誘電泳動法を用いた細胞の判別装置は、
生細胞を含む溶液を収容する収容部と、
前記収容部内に配置された誘電泳動電極と、
前記誘電泳動電極に所定の周波数の交流電圧を印加する電源部と、
誘電泳動による生細胞の挙動に基づいて所定のダメージ度の生細胞を判別する判別部と、を備えているものである。

【0009】

本発明に係る誘電泳動法を用いた細胞の評価方法は、
周波数を変化させながら誘電泳動電極に交流電圧を印加するステップ、
誘電泳動による生細胞の挙動を検出するステップ、及び
生細胞が所定の挙動を行う周波数に基づいて生細胞のダメージ度を評価するステップ、
を含むものである。

【0010】

本発明に係る誘電泳動法を用いた細胞の評価装置は、
生細胞を含む溶液を収容する収容部と、
前記収容部内に配置された誘電泳動電極と、
周波数を変化させながら前記誘電泳動電極に交流電圧を印加する電源部と、
生細胞が所定の挙動を行う周波数に基づいて生細胞のダメージ度を評価する評価部と、を備えているものである。

【発明の効果】

【0011】

本発明によれば、誘電泳動を利用して細胞のダメージ度の評価、又は、所定のダメージ度の細胞の判別を好適に行うことができる。

【図面の簡単な説明】

【0012】

【図1】実施形態に係る細胞の判別装置の構成図である。

【図2】誘電泳動チップの斜視図である。

【図3】誘電泳動チップの平面図である。

【図4】図３におけるＡ−Ａ線矢視断面図である。

【図5】図３におけるＢ−Ｂ線矢視断面図である。

【図6】誘電泳動電極に電圧を印加したときの細胞の挙動を示す画像である。

【図7】実施例１において、誘電泳動電極で捕捉した細胞を培養した様子を示す画像である。

【図8】実施例２に用いる装置の構成図である。

【図9】（ａ）は、実施例２に用いる誘電泳動チップの平面図、（ｂ）は、同分解斜視図である。

【図10】実施例２において取得された結果を示すグラフである。

【図11】実施例３に用いる装置の構成図である。

【図12】実施例３において取得された結果を示すグラフである。

【図13】実施例３において取得された結果を示すグラフである。

【図14】実施例３において取得された結果を示すグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0013】

［実施形態の要旨］
最初に実施形態の要旨を列記して説明する。なお、以下に記載する実施形態の少なくとも一部を任意に組み合わせてもよい。

【0014】

（１）実施形態に係る誘電泳動法を用いた細胞の判別方法は、
所定の周波数の交流電圧を誘電泳動電極に印加するステップ、及び
誘電泳動による生細胞の挙動に基づいて所定のダメージ度の生細胞を判別するステップを含むものである。

【0015】

本出願の発明者は、負荷を与えた生細胞の誘電泳動による挙動を分析することによって、当該負荷による生細胞のダメージ度と、生細胞が所定の挙動を行う交流電圧の周波数との間に関連性があることを知得した。そして、この関連性を考慮することによって所定のダメージ度の細胞を判別可能であることを見出し、上記の判別方法を創作するに到った。
そして、上記の判別方法においては、所定の周波数の交流電圧を誘電泳動電極に印加することによって、所定のダメージ度の生細胞を判別することができ、培養や融合等の処理を行う場合には、ダメージ度の低い細胞を判別して用いることが可能となる。したがって、当該処理の確実性を高めることができる。

【0016】

なお、生細胞の挙動としては、誘電泳動電極への捕捉や、複数の誘電泳動電極間への捕捉等を挙げることができる。また、生細胞にダメージを与える負荷としては、熱、光（電磁波）、磁界、超音波、又は薬品等を挙げることができる。また、所定の周波数とは、１つの特定の値であってもよいし、ある程度の幅を有する範囲であってもよい。所定のダメージ度とは、数値等によって絶対的に特定できるダメージ度であってもよいし、他の生細胞との関係で相対的に特定できるダメージ度（例えば、細胞群の中で最も小さいダメージ度）であってもよい。

【0017】

（２）誘電泳動電極に交流電圧を印加するステップにおいては、周波数を徐々に高めながら交流電圧を印加することが好ましい。
ダメージ度の低い生細胞は、より低い周波数で所定の挙動を起こすため、低い値から徐々に周波数を高めながら交流電圧を印加することによって、よりダメージ度の低い生細胞を判別することが可能となる。

【0018】

（３）実施形態に係る誘電泳動法を用いた細胞の判別装置は、
生細胞を含む溶液を収容する収容部と、
前記収容部内に配置された誘電泳動電極と、
前記誘電泳動電極に所定の周波数の交流電圧を印加する電源部と、
誘電泳動による生細胞の挙動に基づいて所定のダメージ度の生細胞を判別する判別部と、を備えている。

【0019】

この判別装置によれば、所定の周波数の交流電圧を誘電泳動電極に印加することによって、所定のダメージ度の生細胞を判別することができる。したがって、培養や融合等の処理を行う場合には、ダメージ度の低い生細胞を判別して用いることができ、当該処理の確実性を高めることができる。

【0020】

（４）上記の判別装置において、前記電源部は、交流電圧の周波数をスイープさせる調整部を備えていることが好ましい。
これにより、周波数を低い値から徐々に高めながら交流電圧を誘電泳動電極に印加することができ、よりダメージ度の低い生細胞を判別することが可能となる。

【0021】

（５）前記判別部は、
生細胞の挙動を撮像する撮像部と、
前記撮像部によって撮像された画像により生細胞の挙動を検出する検出部と、
を備えていることが好ましい。
これにより、実際の生細胞の画像を用いて正確に挙動を検出し、所定のダメージ度の細胞を適切に判別することができる。

【0022】

（６）上記の判別装置は、前記収容部内の溶液を加熱する加熱部をさらに備えており、
前記加熱部は、前記判別部により判別された生細胞のダメージ度に応じて加熱温度が制御されることが好ましい。
例えば、培養等の所定の処理を行うときに溶液の温度を加熱する場合、その熱によって負荷が加わると生細胞のダメージ度が高まる可能性がある。そのため、この構成では、生細胞に対するダメージ度が高まらないように加熱温度を制御することができる。

【0023】

（７）実施形態に係る誘電泳動法を用いた細胞の評価方法は、
周波数を変化させながら誘電泳動電極に交流電圧を印加するステップ、
誘電泳動による生細胞の挙動を検出するステップ、及び
生細胞が所定の挙動を行う周波数に基づいて生細胞のダメージ度を評価するステップ、
を含む。

【0024】

前述したように、負荷による生細胞のダメージ度と、細胞が所定の挙動を行う周波数との間には関連性があるため、当該周波数に基づいて生細胞のダメージ度を評価することができる。そのため、ダメージ度が低いと評価された生細胞を用いて培養や融合等の処理を行うことが可能となり、当該処理の確実性を高めることができる。

【0025】

（８）上記の評価方法は、生細胞に対する所定の操作後に、上記の各ステップが実行されることが好ましい。
生細胞に対して所定の操作を行った結果、細胞に負荷が与えられ、細胞がダメージを負ったり、逆に、当該操作によってダメージが回復したりすることもあり得る。この場合、生細胞に対する所定の操作後に、上記の各ステップを実行することによって、操作後の細胞のダメージ度を適切に評価することができる。したがって、操作後の生細胞を用いて所定の処理を行うべきか否かの判断を容易に行うことができる。なお、生細胞に対する操作としては、レーザーを用いた光トラップや電磁波の印加等が挙げられる。

【0026】

（９）また、上記の評価方法は、生細胞を用いた所定の処理中に、前記各ステップが実行されることが好ましい。
生細胞に対して培養や融合等の所定の処理を行っている最中に、当該細胞が負荷を受けることによってダメージ度が高まった場合、その処理に失敗する可能性が高くなる。したがって、生細胞を用いた所定の処理中に当該生細胞のダメージ度の評価を行うことで、そのまま処理を続けてよいか否かを容易に判断することができる。

【0027】

（１０）また、上記の評価方法は、生細胞を用いた所定の処理中に、前記各ステップが複数回実行されることが好ましい。
これにより、処理の確実性をより高めることができる。

【0028】

（１１）また、上記の評価方法は、生細胞を用いた所定の処理後に、前記各ステップが実行されることが好ましい。
これにより、処理後の細胞のダメージ度を把握することができる。

【0029】

（１２）上記の評価方法は、生細胞の所定の挙動が維持される周波数の時間的変化を観測するステップを含むことが好ましい。
これにより、時間の経過によって生細胞のダメージ度が変化する場合にも、逐次そのダメージ度を評価することができる。

【0030】

（１３）実施形態に係る誘電泳動法を用いた細胞の評価装置は、
生細胞を含む溶液を収容する収容部と、
前記収容部内に配置された誘電泳動電極と、
周波数を変化させながら前記誘電泳動電極に交流電圧を印加する電源部と、
生細胞が所定の挙動を行う周波数に基づいて生細胞のダメージ度を評価する評価部と、を備えている。

【0031】

この構成によれば、電源部が誘電泳動電極に印加した交流電圧の周波数によって生細胞のダメージ度を評価することができる。そのため、ダメージ度が低いと評価された生細胞を用いて培養や融合等の処理を行うことが可能となり、当該処理の確実性を高めることができる。

【0032】

（１４）前記評価部は、
生細胞の挙動を撮像する撮像部と、
前記撮像部によって撮像された画像により生細胞の挙動を検出する検出部と、
前記検出部の検出結果に基づいて生細胞のダメージ度を取得する取得部と、
を備えていることが好ましい。
これにより、実際の生細胞の画像を用いて正確に挙動を検出し、生細胞のダメージ度を適切に評価することができる。

【0033】

［本発明の実施形態の詳細］
以下、細胞の判別装置及び評価装置についてのより詳細な実施形態を説明する。
図１に示すように、細胞の判別装置１０は、所定のダメージ度の細胞を判別するためのものであり、誘電泳動チップ１１と、供給部１２と、排出部１３と、電源部１４，１５と、撮像部１６と、操作部１７と、加熱部１８と、制御部１９とを備えている。

【0034】

誘電泳動チップ１１は、溶液に含まれる細胞を電界の勾配によって泳動させるものであり、図２〜図５に示すように、基板２１と、基板２１に設けられた流路２２、供給ポート２３、排出ポート２４、及び処理室２５を備えている。

【0035】

基板２１は、長方形状のスライドガラスから成り、後述する撮像部１６の光源４１の光を透過することができる。
流路２２は、基板２１の上面に設けられた枠部材２７の内部に形成されている。この枠部材２７は、シリコーンゴム等により形成され、基板２１の上面の大部分を占める範囲で設けられている。流路２２は、枠部材２７の長手方向の一端部から他端部の範囲で枠部材２７を長方形状にくり抜くことによって形成されている。流路２２には、細胞を含む溶液が供給されるとともに、長手方向の一端側から他端側へ向けて溶液が流される。図２及び図３に溶液の流れ方向を矢印Ｘで示す。なお、流路２２は、細胞を含む溶液が収容される収容部をも構成する。

【0036】

流路２２の内部には、一対（２極）の誘電泳動電極３１（以下、「第１の電極」ともいう）が設けられている。この第１の電極３１は、溶液の流れ方向Ｘの下流側に配置されている。一対の第１の電極３１は、基板２１の上面に薄膜状に形成され、溶液の流れ方向Ｘに交差する方向に並べて配置されている。第１の電極３１は、例えばイオンコーターによって基板２１上に電極材料を蒸着することによって形成される。電極材料には、金又は銅等が用いられる。第１の電極３１は、第１の電源部１４（図３参照）に接続されている。

【0037】

図２及び図３に示すように、供給ポート２３は、溶液の流れ方向Ｘの上流側における枠部材２７の上面に設けられている。この供給ポート２３は、直方体のブロック形状に形成され、流路２２に連通する供給孔２３ａが上下方向に貫通して形成されている。供給ポート２３は、供給管３３を介して供給部１２（図１参照）に接続されている。

【0038】

排出ポート２４は、溶液の流れ方向Ｘの下流側における枠部材２７の上面に設けられている。この排出ポート２４は、供給ポート２３と同様に、直方体のブロック形状に形成され、流路２２に連通する排出孔２４ａが上下方向に貫通して形成されている。排出ポート２４は、図１に示すように、排出管３４を介して排出部１３に接続されている。

【0039】

処理室２５は、細胞に対して融合や培養等の所定の処理を行うための領域であり、流路２２に隣接して枠部材２７に形成されている。処理室２５は、枠部材２７を四角形状にくり抜くことにより形成され、流路２２における溶液の流れ方向Ｘの上流側に配置されている。また、処理室２５は、連通路２８を介して流路２２に接続されている。この連通路２８は、流れ方向Ｘに対して傾斜して形成され、処理室２５側の端部が流れ方向Ｘの上流側に、流路２２側の端部が流れ方向Ｘの下流側に配置されている。

【0040】

処理室２５の内部には、一対（２極）の誘電泳動電極３２（以下、「第２の電極」ともいう）が設けられている。一対の第２の電極３２は、基板２１の上面に薄膜状に形成され、流れ方向Ｘに沿う方向に並べて配置されている。第２の電極３２は、第１の電極３１と同様に、基板２１上に金や銅等の電極材料を蒸着することによって形成される。第２の電極３２は、第２の電源部１５に接続されている。

【0041】

図１に示すように、供給部１２は、細胞を含む溶液を供給管３３を介して供給するものである。供給部１２には、例えばシリンジポンプを用いることができる。
一方、排出部１３は、誘電泳動チップ１１において細胞の判別等が行われた後の溶液を排出管３４を介して排出するものである。この排出部１３にも、シリンジポンプを用いることができる。

【0042】

第１の電源部１４は、２極の第１の電極３１に対して交流電圧を印加する。第１の電源部１４は、第１の電極３１に印加する電圧や交流の周波数を調整する調整部３６を備えている。第１の電源部１４は、図３に示すように、２極の第１の電極３１の一方が正極となり、他方が負極となるように交流電圧を印加する。したがって、２極の第１の電極３１の間には電気力線が生じる。

【0043】

図１に示すように、第２の電源部１５は、２極の第２の電極３２に対して交流電圧を印加する。第２の電源部１５は、第２の電極３２に印加する電圧や交流の周波数を調整する調整部３７を備えている。第２の電源部１５は、図３に示すように、２極の第１の電極３１の一方が正極となり、他方が負極となるように交流電圧を印加する。したがって、２極の第２の電極３２の間には電気力線が生じる。

【0044】

図１に示すように、撮像部１６は、誘電泳動チップ１１に存在する細胞を撮像するものであり、光源４１と撮像器４２と光学系４３とを備えている。光学系４３は、対物レンズ４３ａ及びフィルタ４３ｂ等を含んでいる。撮像器４２は、ＣＭＯＳ又はＣＣＤ等のイメージセンサを備えたものを用いることができる。光源４１には、ハロゲン光源やＬＥＤ光源を用いることができる。撮像部１６によって撮像された画像情報は、制御部１９に入力され、制御部１９において各種の処理に用いられる。

【0045】

供給部１２から誘電泳動チップ１１の流路２２内に細胞を含む溶液を供給し、第１の電源部１４によって誘電泳動チップ１１の第１の電極３１に交流電圧を印加すると、その周波数に応じて誘電泳動が生じ、細胞を捕捉（トラップ）することができる。正の誘電泳動が生じると、細胞には第１の電極３１による引力が働き、細胞は第１の電極３１に張り付くことによってトラップされる。負の誘電泳動が生じると、細胞には第１の電極３１からの斥力が働き、第１の電極３１の間において、当該電極３１に非接触の状態で細胞が捕捉される。

【0046】

図６は、誘電泳動電極に交流電圧を印加したときの細胞の挙動を撮像部によって撮影した画像である。第１の電極３１に低周波数の交流電圧を印加したとき、図６（ａ）に示すように細胞Ｐは負の誘電泳動によって第１の電極３１間に捕捉され、第１の電極３１に高周波数の交流電圧を印加したとき、図６（ｂ）に示すように細胞Ｐは正の誘電泳動によって第１の電極３１に捕捉される。そして、このような細胞Ｐの挙動は、細胞の生死の状態によって異なる。

【0047】

したがって、溶液中に生細胞と死細胞とが含まれている場合、第１の電極３１に所定の周波数の交流電圧を印加することによって、生細胞を第１の電極３１に捕捉させ、かつ死細胞を第１の電極３１間に捕捉させることができ、これにより生細胞と死細胞とを判別することが可能となる。また、死細胞が、第１の電極３１又は第１の電極３１間にまったく捕捉されず、溶液中に浮遊したままである場合には、細胞を第１の電極３１に捕捉させ、かつ死細胞を溶液中に浮遊させることによって、生細胞と死細胞とを判別することが可能となる。

【0048】

また、ある周波数の交流電圧を印加したときの誘電泳動による生細胞の挙動は、生細胞のダメージ度によっても異なる。ダメージ度とは、例えば外部から負荷が与えられることによって細胞が受けたダメージの度合をいい、言い換えると細胞の健康（元気）の度合をいう。
したがって、第１の電極３１に所定の周波数の交流電圧を印加することによって、溶液に含まれる生細胞のうち所定のダメージ度の生細胞を第１の電極３１に捕捉させ、それ以外の生細胞を第１の電極３１間に捕捉させ（又は溶液中に浮遊させ）、所定のダメージ度の生細胞とそれ以外の生細胞とを判別することができる。また、生細胞は、ダメージ度が小さい程、より低い周波数の交流電圧の印加で第１の電極３１に捕捉される。したがって、第１の電源部１４において、交流電圧の周波数を低い値から徐々に上げる（スイープさせる）ことによって、よりダメージ度の小さい生細胞を判別することが可能となる。

【0049】

なお、本発明者は、生細胞に負荷（熱及びレーザー光）を加えることによってダメージを与え、そのダメージ度によって誘電泳動電極に捕捉される周波数が異なること、及び、ダメージ度の小さい生細胞ほど低い周波数の交流電圧の印加で誘電泳動電極に捕捉されることを、後述する実施例２及び３において実証した。

【0050】

第２の電極３２に低周波数の交流電圧を印加した場合も、図６（ａ）（ｂ）に示すように、細胞Ｐを電極３２又は電極３２間に捕捉することができる。したがって、処理室２５内においても細胞の生死の状態や生細胞のダメージ度を判別することが可能となる。
また、処理室２５内では、細胞を第２の電極３２又は第２の電極３２間に捕捉した状態で、所定の処理が行われる。例えば、処理室２５内では細胞の培養や融合が行われる。

【0051】

操作部１７は、集光したレーザー光により細胞をその焦点位置の近傍に捕捉し、移動させることができるものである。操作部１７は、レーザー発振器４５と、光ピンセット４６と、マニピュレータ４７とを備える。レーザー発振器４５によって発生したレーザー光は、光ピンセット４６から発射され、光ピンセット４６の先端部で細胞を捕捉する。マニピュレータ４７は、光ピンセット４６を前後、左右、及び上下等に移動させることができる。なお、操作部１７の構成としては、図１に示すものに限られるものではなく、例えば、誘電泳動チップ１１の下方からレーザー光を照射して細胞を捕捉し、その状態で誘電泳動チップを移動させる構成であってもよい。

【0052】

操作部１７は、上記のように第１の電極３１において捕捉された生細胞を、光ピンセット４６によって捕捉し、処理室２５に移動するために用いられる。このとき、操作部１７は、流路２２における流れに逆らって処理室２５まで生細胞を移動することになる。そして、処理室２５に移動した生細胞は、第２の電極３２によって捕捉され、捕捉された状態のまま所定の処理が行われる。なお、第２の電極３２で細胞を捕捉したまま培養等の処理が可能であることは、後述する実施例１において実証した。

【0053】

加熱部１８は、処理室２５内の溶液を加熱するためのものである。加熱部１８は、基板２１の裏面に取り付けられたペルチェ素子５１と、ペルチェ素子５１を駆動する熱源駆動部５２とを有している。処理室２５内で細胞に対して培養や融合等の処理を行うときに、加熱部１８は、当該処理に最適な温度条件を満たすように溶液の温度を調整する。また、加熱部１８における熱源駆動部５２の動作は、制御部１９によって制御される。

【0054】

制御部１９は、パーソナルコンピュータ等によって構成され、撮像部１６によって撮像された画像に基づいて生細胞の挙動、すなわち電極３１，３２又は電極３１，３２間における生細胞の挙動（捕捉状態）を検出する検出部５４としての機能と、その検出部５４による検出結果に基づいて生細胞のダメージ度を取得する取得部５５としての機能とを有している。

【0055】

検出部５４は、撮像部１６によって撮像した画像を解析処理することによって、生細胞が電極３１，３２に捕捉されているか否か、あるいは電極３１，３２間に捕捉されているか否か等の、生細胞の挙動を検出する。
生細胞の画像を撮像する撮像部１６や、当該画像から生細胞の挙動を検出する検出部５４は、所定のダメージ度の細胞を判別する判別部を構成している。また、撮像部１６、検出部５４、及び取得部５５は、生細胞のダメージ度を評価する評価部を構成している。

【0056】

また、制御部１９は、取得部５５によって取得されたダメージ度に基づいて、生細胞が第１及び第２の電極３２に捕捉された状態を維持するように、第１及び第２の電源部１４，１５の調整部３６，３７を制御する電源制御部５６としての機能を有する。
さらに、制御部１９は、加熱部１８による熱で生細胞がダメージを受け、第２の電極３２から離れてしまわないように、加熱部１８における熱源駆動部５２の動作を制御することによって処理室２５内の溶液の温度を調整する温度制御部５７としての機能を有している。

【0057】

生細胞に対して培養や融合等の所定の処理を行う場合、よりダメージ度の小さい生細胞を用いることによって、当該処理の確実性を高めることができる。そのため、本実施形態においては、流路２２内で第１の電極３１を用いることによってダメージ度の小さい生細胞を判別・抽出し、その生細胞を処理室２５に移動させて所定の処理を行うことができる。

【0058】

第１の電源部１４は、第１の電極３１に印加する交流電圧の周波数を調整する調整部３６を備えているので、周波数を低い値から徐々に上げていき、より早期に第１の電極３１に捕捉された生細胞、すなわちダメージ度の小さい生細胞を判別・抽出し、所定の処理に用いることができる。

【0059】

また、第１の電極３１において抽出された生細胞を処理室２５に移動させる過程において、操作部１７の光ピンセット４６（レーザー光）によって生細胞がダメージを受けた場合、あるいは、処理室２５内において所定の処理中に生細胞が加熱部１８の熱によってダメージを受けた場合、第２の電極３２に対する生細胞の捕捉状態が変化する。

【0060】

例えば、第１の電極３１においては、所定の周波数で捕捉されていた生細胞が、第２の電極３２に移動した後、当該周波数では捕捉されない場合は、移動中に生細胞がレーザー光によってダメージを負ったと考えられる。このようにダメージを負った生細胞は、培養等の処理の対象として適していない。そのため、判別装置１０は、操作部１７による操作を行った後、所定の処理を行う前に第２の電極３２おける生細胞の挙動を検出することによって、生細胞のダメージ度を評価し、当該処理に対する生細胞の適正を判断することができる。

【0061】

また、所定の処理を行っている最中にも、外部からの負荷によって生細胞がダメージを負うこともある。そのため、判別装置１０は、所定の処理の最中にも第２の電極３２における生細胞の挙動を検出することによって生細胞のダメージ度を評価する。したがって、本実施形態の判別装置１０は、所定のダメージ度の生細胞を判別するという側面だけでなく、生細胞のダメージ度を評価（測定）する評価装置（ダメージセンサ）としての側面も有している。

【0062】

加熱部１８は、処理室２５の下面を加熱するものであるため、基板２１の上面に設けられたに捕捉される細胞は、溶液の温度よりも高い温度で加熱される可能性があり、生細胞が受ける負荷も大きくなると考えられる。そのため、溶液の実際の温度ではなく、第２の電極３２に対する生細胞の挙動に基づいて加熱部１８を制御することで、生細胞に対する熱によるダメージを最小限に抑えることができる。

【0063】

具体的には、培養等の所定の処理中に第２の電極３２から生細胞が離れたことが検出部５４によって検出されると、制御部１９の温度制御部５７がペルチェ素子５１の出力を下げるように熱源駆動部５２を制御する。これにより、第２の電極３２に印加する交流電圧の周波数を上げなくても生細胞を再び第２の電極３２に捕捉させることができる。

【0064】

以上に説明した実施形態に係る判別装置１０は、所定のダメージ度の生細胞を判別し、判別された生細胞を用いて所定の処理を行うことができる。したがって、培養等の処理に対して適正のある所定のダメージ度の生細胞を用いて当該処理を行うことができる。
また、実施形態に係る判別装置１０は、第２の電極３２に印加する交流電圧の周波数を変化させ、誘電泳動による生細胞の挙動を検出部５４において検出し、その検出結果に基づいて、各生細胞のダメージ度を取得することができる。

【0065】

ダメージ度は、例えば、生細胞が捕捉された時点における周波数として取得することもできるし、その周波数に基づいた別の指標のかたちで取得することもできる。取得されたダメージ度は、例えば、制御部１９を構成するパーソナルコンピュータの表示部に表示することができる。また、取得されたダメージ度によって生細胞のダメージ度を評価することができ、その評価の結果に基づいて第２の電源部１５における調整部３７や、加熱部１８の制御を行うことができる。

【0066】

＜実施例＞
（実施例１）
実施例１においては、一対の誘電泳動電極に細胞を捕捉した状態で、培養が可能か否かを確認した。具体的には、エッペンを使用してＹＰＤ養液と水とを配合して１０倍希釈した酵母菌を長時間誘電泳動電極で捕捉し、捕捉した状態で培養できるかを確認した。誘電泳動チップ内の溶液の温度はペルチェ素子によって２８℃に制御した。そして、周波数８ＭＨｚの交流電圧１Ｖｐ−ｐを誘電泳動電極に印加し、酵母菌の生死判別を行い、生細胞を選別した。その後、同様の交流電圧及び周波数で細胞を誘電泳動電極に捕捉し続けた。その結果、約１時間２０分後に、培養が確認された。図７に培養に到るまでの細胞の状態を示す。図７において、観察対象となる細胞が丸で囲って示されている。また、図７（ａ）は、培養前の細胞を示し、図７（ｂ）は培養中の細胞を示し、図７（ｃ）は、培養後の細胞を示している。

【0067】

（実施例２）
実施例２においては、生細胞のダメージ度によって誘電泳動電極で捕捉することができる交流電圧の周波数に変化があることを確認する実験を行った。具体的には、酵母菌に熱を加えることによってダメージを与えたときの酵母菌の挙動を観察した。
実施例２では、図９に示す誘電泳動チップ１１１を有する図８の装置を用いた。図９に示すように、誘電泳動チップ１１１は、基板１２１上に矩形状のプール（収容部）１２２を形成し、このプール１２２内における基板１２１の上面に一対の誘電泳動電極１３１を設け、電源部１１４によって交流電圧を印加した。細胞としての酵母菌を含む溶液（水）をプール１２２に収容した。熱源として、基板１２１の下面にペルチェ素子１５１ａを設け、プール１２２の上面にＩＴＯ透明電極１５１ｂを設け、それぞれ熱源駆動部１５２ａ、１５２ｂにより駆動した。このように２つの熱源を設けることで素早く水温を上昇させるようにした。また、プール１２２の上面をＩＴＯ透明電極１５１ｂを取り付けたカバーガラス１５８で覆うことで溶液の蒸発を防いだ。プール１２２内の溶液の温度測定は、ＮＴＣサーミスタ１５９を用い、テスター（三和電気計器株式会社製、SANWA DIGITALA MULTIMETER CD721）により測定した。図８中の符号１１７は誘電泳動チップ１１１を移動させるマニピュレータ（操作部）１１７であり、符号１４１、１４２、及び１４３は、ぞれぞれ光源、撮像器、及び対物レンズである。

【0068】

プール１２２内の溶液の温度を３０℃、４０℃、５０℃、６０℃、７０℃に固定し、酵母菌を捕捉することができる交流電圧の周波数の変化を観察した。具体的には、酵母菌が誘電泳動電極１３１に捕捉された状態から、熱の影響によって誘電泳動電極１３１から離れたところで周波数を上昇させ、再び誘電泳動電極１３１に捕捉される周波数を測定した。また、熱による酵母菌の死滅を確認するため、溶液の温度が５０℃、６０℃、７０℃の場合にメチレンブルー溶液を混入した。

【0069】

溶液の温度が３０℃及び４０℃の場合、１ＭＨｚの周波数の交流電圧を一定時間（３０分）印加しても酵母菌の挙動に変化はなく、誘電泳動電極１３１に捕捉された状態が維持された。
溶液の温度が５０℃の場合、１ＭＨｚの周波数の交流電圧を一定時間（３０分）印加すると、１８分後にメチレンブルーによって酵母菌が染色されたが、その後も酵母菌は誘電泳動電極１３１に捕捉された状態が維持された。

【0070】

溶液の温度が６０℃及び７０℃の場合、１ＭＨｚの周波数の交流電圧を印加すると、４分後、酵母菌が誘電泳動電極１３１から離れた。その後、周波数を２．３ＭＨｚに上昇させることで再び酵母菌を誘電泳動電極１３１に捕捉させた。６分後、酵母菌はメチレンブルーにより染色され、７分後に誘電泳動電極１３１に捕捉できなくなった。

【0071】

以上より、溶液の温度が３０℃、４０℃のときは、酵母菌を捕捉できる周波数に大きな変化はなく、熱が酵母菌に与えるダメージは少ないと考えられるが、５０℃以上では当該周波数に変化があり、細胞が熱によるダメージを負ったと考えられる。特に、溶液の温度が６０℃及び７０℃のときには酵母菌を捕捉できる周波数が大きく上昇している。したがって、熱による酵母菌のダメージが大きいほど、誘電泳動電極１３１によって捕捉することができる交流電圧の周波数が大きくなることが実証された。

【0072】

また、以上の実験に加えて、溶液の温度を初期温度から８０℃まで上昇させ、酵母菌の挙動を観察した。その結果、図１０に示すように溶液の温度と周波数の関係が得られた。酵母菌を捕捉することができる周波数は、溶液の温度上昇に伴って上昇した。溶液の温度が８０℃に達すると、酵母菌は、電源部１１４の上限である１５ＭＨｚの周波数でも捕捉することができなかった。したがって、温度が高くなるほど、熱が酵母菌に与えるダメージは大きくなり、酵母菌を捕捉できる周波数も上昇した。また、一般に酵母菌が死滅すると考えられる８０℃では、酵母菌は誘電泳動電極に捕捉されることはなくなった。

【0073】

（実施例３）
実施例３においては、実施例２と同様に、生細胞のダメージ度によって誘電泳動電極で捕捉することができる交流電圧の周波数に変化があることを確認した。具体的には、細胞をレーザー光で光トラップすることによってダメージを与えたときの酵母菌の挙動を観察した。

【0074】

実施例３では、図１１に示す装置を用いた。誘電泳動チップ２１１は、基板２２１上に一対の誘電泳動電極２３１を設けたものを使用した。Ａｒ（アルゴン）レーザ発振器２５７（レクセルレーザー社製、モデル９５イオンレーザー）によって照射されたレーザー光で酵母菌を光トラップし、マニピュレータ（操作部）２１７により誘電泳動チップ２１１を操作することで、酵母菌を一対の誘電泳動電極２３１間に移動させ、電源部２１４によって誘電泳動電極２３１に交流電圧を印加した。Ａｒレーザーには油浸対物レンズ２４３（オリンパス株式会社製、PlanApo 100x/1.40 Oil ∞/0.17）を用い、光源２４１には、ハロゲン光源（モリテックス株式会社製、MHF-D100LR）を用い、酵母菌の挙動を撮像器２４２により撮像した。

【0075】

レーザー光の照射パワーは、３０ｍＷ、５０ｍＷ、７０ｍＷとした。Ａｒレーザの周波数は５１４．５ｎｍとした。また、レーザー光の照射時間（光トラップする時間）を５分毎に設定した。そして、各照射時間毎に、誘電泳動電極２３１に酵母菌を捕捉することができる交流電圧の周波数を測定した。その結果を、図１２〜図１４に示す。これらの図において、周波数は、酵母菌を捕捉することができた周波数の平均値を示している。

【0076】

図１２〜図１４に示すように、いずれの照射パワーにおいても、照射時間が長くなるほど、酵母菌を捕捉することができる交流電圧の周波数は高くなることが分かった。したがって、レーザーによる光トラップで酵母菌がダメージを受け、誘電泳動電極２３１によって捕捉することができる交流電圧の周波数も上昇することが実証された。

【0077】

本発明は、上記の実施形態に限定されるものではなく、特許請求の範囲に記載された発明の範囲内において変更することができる。
上記実施形態では、２極の電極を用いたが、それ以上の多極の電極を用いることが可能である。

【0078】

細胞の捕捉のために誘電泳動電極に印加した交流電圧や周波数の具体的数値はあくまで一例であり、捕捉の対象となる細胞の特性や溶液の種類等に応じて適宜変更されるものである。

【符号の説明】

【0079】

１０ ：判別装置（評価装置）
１１ ：誘電泳動チップ
１４ ：第１の電源部
１５ ：第２の電源部
１６ ：撮像部
１７ ：操作部
１８ ：加熱部
１９ ：制御部
２２ ：流路（収容部）
２５ ：処理室（収容部）
３１ ：第１の電極（誘電泳動電極）
３２ ：第２の電極（誘電泳動電極）
３６ ：調整部
３７ ：調整部
５４ ：検出部
５５ ：取得部

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】