特許 6573961 目の細胞を保護する薬品又は食品を調製するためのカンカニクジュヨウ抽出物の用途

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6573961

(24)【登録日】2019年8月23日

(45)【発行日】2019年9月11日

(54)【発明の名称】目の細胞を保護する薬品又は食品を調製するためのカンカニクジュヨウ抽出物の用途

(51)【国際特許分類】

   A61K 36/64 20060101AFI20190902BHJP

   A61K 31/7034 20060101ALI20190902BHJP

   A61K 9/08 20060101ALI20190902BHJP

   A61K 9/14 20060101ALI20190902BHJP

   A61K 9/20 20060101ALI20190902BHJP

   A61K 9/48 20060101ALI20190902BHJP

   A61P 27/02 20060101ALI20190902BHJP

   A61P 27/06 20060101ALI20190902BHJP

   A61P 9/10 20060101ALI20190902BHJP

【ＦＩ】

   A61K36/64

   A61K31/7034

   A61K9/08

   A61K9/14

   A61K9/20

   A61K9/48

   A61P27/02

   A61P27/06

   A61P9/10

【請求項の数】7

【全頁数】16

(21)【出願番号】特願2017-501159(P2017-501159)

(86)(22)【出願日】2015年7月3日

(65)【公表番号】特表2017-531614(P2017-531614A)

(43)【公表日】2017年10月26日

(86)【国際出願番号】CN2015083315

(87)【国際公開番号】WO2016000663

(87)【国際公開日】20160107

【審査請求日】2017年4月28日

(31)【優先権主張番号】62/020,409

(32)【優先日】2014年7月3日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】517004551

【氏名又は名称】シンファー ティアン−リー ファーマシューティカル カンパニー リミテッド（ハンツォウ）

【氏名又は名称原語表記】ＳＩＮＰＨＡＲ ＴＩＡＮ−ＬＩ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＣＯ．， ＬＴＤ． （ＨＡＮＧＺＨＯＵ）

(74)【代理人】

【識別番号】100102842

【弁理士】

【氏名又は名称】葛和 清司

(72)【発明者】

【氏名】リー，チー−ウェン

【審査官】 鈴木 理文

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２０１３／０８７０４２（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 中華眼底病雑誌，２０１３年，Vol.29 No.6，pp.593-599

【文献】 Chem. Pharm. Bull.，１９８９年，Vol.37，pp.3153-3154

【文献】 Chem. Pharm. Bull.，１９８９年，Vol.37 No.11，pp.3153-3154

【文献】 J. Ethnopharmacol.，２０１１年，Vol.138，pp.624-632

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ３６／６４

Ａ６１Ｋ ９／０８

Ａ６１Ｋ ９／１４

Ａ６１Ｋ ９／２０

Ａ６１Ｋ ９／４８

Ａ６１Ｋ ３１／７０３４

Ａ６１Ｐ ９／１０

Ａ６１Ｐ ２７／０２

Ａ６１Ｐ ２７／０６

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

網膜色素上皮細胞を保護するための組成物であって、活性成分としてカンカニクジュヨウ水抽出物を含み、
カンカニクジュヨウ水抽出物が、エキナコシド、アクテオシド、イソアクテオシド、およびツブロシドＡを含み、
カンカニクジュヨウ水抽出物が、網膜色素上皮細胞に対する酸化ストレスによる損傷または青色光による損傷を低減する、
前記組成物。

【請求項2】

組成物が、網膜色素上皮細胞に対する酸化ストレスによる損傷または青色光による損傷によって引き起こされる目の疾患を予防する、請求項１に記載の網膜色素上皮細胞を保護するための組成物。

【請求項3】

目の疾患が、黄斑部の退化、又は網膜症である、請求項２に記載の網膜色素上皮細胞を保護するための組成物。

【請求項4】

黄斑部の退化が、加齢黄斑変性である、請求項３に記載の網膜色素上皮細胞を保護するための組成物。

【請求項5】

加齢黄斑変性が、乾性黄斑変性又は滲出型黄斑変性である、請求項４に記載の網膜色素上皮細胞を保護するための組成物。

【請求項6】

網膜症が、糖尿病網膜症、網膜色素変性、網膜疾患、網膜動脈閉塞、網膜静脈閉塞、増殖性硝子体網膜症又は中心性漿液性脈絡膜網膜症である、請求項３に記載の網膜色素上皮細胞を保護するための組成物。

【請求項7】

組成物の形態が、カプセル、錠剤、粉剤又は液状である、請求項１に記載の網膜色素上皮細胞を保護するための組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、カンカニクジュヨウ抽出物の用途に関し、特に目の細胞を保護する薬剤又は食品を調製するための用途に関する。

【背景技術】

【0002】

目は魂の窓であり、目によって超高解像度で世界を見て、毎日の生活はいずれも目に依存する必要がある。現在、一般的な目の疾患は、加齢黄斑変性（Ａｇｅ−ｒｅｌａｔｅｄ ｍａｃｕｌａｒ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ；ＡＭＤと略称）、糖尿病網膜症（Ｄｉａｂｅｔｉｃ ｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ）及び増殖性硝子体網膜症（Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ ｖｉｔｒｅｏｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ；ＰＶＲと略称）等であり、そのうち、加齢黄斑変性は成人又は老人の失明に至る重要な目の疾患の１つであると認められる。

【0003】

世界保健機関（Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ；ＷＨＯ）は、加齢黄斑変性が既に白内障を超えて、視力不良を引き起こす最も一般的な原因（Ｊａｇｅｒ ｅｔ ａｌ ２００８）になると指摘し、２０１０年の報告には更に、加齢黄斑変性による視力低下及び失明となる人数が増加する傾向があると指摘した。米国国内の統計によると、八百万を超える人が加齢黄斑変性を罹患し、そのうち６５歳〜７４歳の人が１０％を超えて、７４歳以上の人は２５％を超えて、２０２０年まで、加齢黄斑変性を罹患する人は５０％を超えると予測された（Ｆｒｉｅｄｍａｎ ｅｔ ａｌ ２００４）。台湾地域では６５歳以上の老人の罹患率が約１０％であり、罹患率は欧州諸国よりも低いが、わが地域の人は黄斑変性に対する認知が限定的であり、且つ効果的な治療方法がないので、患者がこの疾患があると診断された後、医者も効果的な治療を与えることができない。このため、黄斑変性は我が地域の人の失明の主因の１つとなり、「視力のナンバーワンキラー」とも呼ばれ、このため、加齢黄斑変性に対しては、先に予防することが特に重要である。なお、台湾人口の高齢化、生活習慣の欧米化により、他の失明原因が制御される場合、加齢黄斑変性は日々一般的になって成人の主な目の病気となる。

【発明の概要】

【0004】

ラジカルによる細胞におけるＤＮＡ、タンパク質、脂類及び細胞内の高分子物質に対する酸化ストレスの損傷の累積は老化を引き起こすことがあり、中枢神経系の退化以外、一部の目の疾患（特に黄斑部の退化及び網膜症）も酸化ストレス損傷と高い相関性を有すると認められる。

【0005】

しかしながら、現在、効果的に目の疾患を予防し、遅延させるか又は治療する方法或いは目の細胞を保護する方法がまだないことは、本分野の解決するべき課題である。

【0006】

本発明は、目の細胞を保護する薬剤又は食品を調製するためのカンカニクジュヨウ抽出物の用途を提供する。

【0007】

本発明の一実施形態によれば、カンカニクジュヨウ抽出物は、エキナコシド、アクテオシド、イソアクテオシド、ツブロシドＡ又はそれらの組み合わせを含む。

【0008】

本発明の一実施形態によれば、薬剤又は食品は目の疾患を予防し、遅延させるか又は治療するためのものである。

【0009】

本発明の一実施形態によれば、目の疾患は黄斑部の退化、黄斑部円孔、網膜症又は緑内障である。

【0010】

本発明の一実施形態によれば、黄斑部の退化は加齢黄斑変性である。

【0011】

本発明の一実施形態によれば、加齢黄斑変性は乾性黄斑変性（ｄｒｙ−ＡＭＤ）又は滲出型黄斑変性（ｗｅｔ−ＡＭＤ）である。

【0012】

本発明の一実施形態によれば、網膜症は糖尿病網膜症、網膜色素変性（Ｒｅｔｉｎｉｔｉｓ ｐｉｇｍｅｎｔｏｓａ）、網膜疾患（Ｒｅｔｉｎａ ｄｉｓｅａｓｅ）、網膜動脈と静脈閉塞（Ｒｅｔｉｎａｌ ａｒｔｅｒｙ ａｎｄ ｖｅｉｎ ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ）、増殖性硝子体網膜症又は中心性漿液性脈絡膜網膜症（Ｃｅｎｔｒａｌ ｓｅｒｏｕｓ ｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ）である。

【0013】

本発明の一実施形態によれば、薬剤の形態はカプセル、錠剤、粉剤又は液状であってよい。

【0014】

本発明は、カンカニクジュヨウ抽出物を薬剤又は食品の調製に利用して、目の細胞を保護する効果を有する。

【図面の簡単な説明】

【0015】

本発明の特徴、メリット及び実施例をより分かりやすくするために、添付図面の説明が以下の通り記載される。

【図1】本発明の実施例の細胞毒性試験結果図を示す。

【図2】本発明の実施例の細胞毒性試験結果図を示す。

【図3】本発明の実施例の細胞毒性試験結果図を示す。

【図4】本発明の実施例の細胞毒性試験結果図を示す。

【図5】本発明の実施例の細胞毒性試験結果図を示す。

【図6】本発明の実施例のＨ_２Ｏ_２により誘発された細胞毒性に対する保護作用の試験結果図を示す。

【図7】本発明の実施例のＨ_２Ｏ_２により誘発された細胞毒性に対する保護作用の試験結果図を示す。

【図8】本発明の実施例のＨ_２Ｏ_２により誘発された細胞毒性に対する保護作用の試験結果図を示す。

【図9】本発明の実施例のＨ_２Ｏ_２により誘発された細胞毒性に対する保護作用の試験結果図を示す。

【図10】本発明の実施例のＨ_２Ｏ_２により誘発された細胞毒性に対する保護作用の試験結果図を示す。

【図11】本発明の実施例のｔ−ＢＨＰにより誘発された細胞毒性に対する保護作用の試験結果図を示す。

【図12】本発明の実施例のｔ−ＢＨＰにより誘発された細胞毒性に対する保護作用の試験結果図を示す。

【図13】本発明の実施例のｔ−ＢＨＰにより誘発された細胞毒性に対する保護作用の試験結果図を示す。

【0016】

【図14】本発明の実施例のｔ−ＢＨＰにより誘発された細胞毒性に対する保護作用の試験結果図を示す。

【図15】本発明の実施例のｔ−ＢＨＰにより誘発された細胞毒性に対する保護作用の試験結果図を示す。

【図16】本発明の実施例のＮａＮ_３により誘発された細胞毒性に対する保護作用の試験結果図を示す。

【図17】本発明の実施例のＮａＮ_３により誘発された細胞毒性に対する保護作用の試験結果図を示す。

【図18】本発明の実施例のＮａＮ_３により誘発された細胞毒性に対する保護作用の試験結果図を示す。

【図19】本発明の実施例のＮａＮ_３により誘発された細胞毒性に対する保護作用の試験結果図を示す。

【図20】本発明の実施例のＮａＮ_３により誘発された細胞毒性に対する保護作用の試験結果図を示す。

【図21】本発明の実施例の青色光照射により誘発された細胞毒性に対する保護作用の試験結果図を示す。

【図22】本発明の実施例の青色光照射により誘発された細胞毒性に対する保護作用の試験結果図を示す。

【図23】本発明の実施例の青色光照射により誘発された細胞毒性に対する保護作用の試験結果図を示す。

【図24】本発明の実施例の青色光照射により誘発された細胞毒性に対する保護作用の試験結果図を示す。

【図25】本発明の実施例の青色光照射により誘発された細胞毒性に対する保護作用の試験結果図を示す。

【発明を実施するための形態】

【0017】

本発明の記述をより詳細化し充実させるために、以下、本発明の実施形態と具体的な実施例に対して説明的な記述を提出するが、これは、本発明の具体的な実施例を実施又は応用する唯一の形式ではない。有益な場合には、以下に開示された各実施例を互いに組み合わせるか又は取り替えてもよいし、一実施例に他の実施例を付加してもよく、さらなる記載又は説明を必要としない。以下の記述において、読者が以下の実施例を十分に理解するように複数の特定の細部を詳しく説明する。しかし、これらの特定な細部がない場合には本発明の実施例を実践することができる。

【0018】

本発明は、目の細胞を保護する薬剤又は食品を調製するためのカンカニクジュヨウ抽出物の用途を提供する。
「砂漠人参」とも呼ばれるカンカニクジュヨウ（Ｃｉｓｔａｎｃｈｅ ｔｕｂｕｌｏｓａ）は、ニクジュヨウの１種であり、従来から補腎壮陽薬として、勃起不全、不妊、脱力感、腰と膝の痛み及び便秘の治療に用いられ、２００５年から『中国薬典』に記載される。ニクジュヨウは、酸化防止、神経細胞保護作用（例えば神経細胞アポトーシス抑制）、神経成長因子分泌促進、脳内神経伝達物質調整作用、学習記憶力改善及び脳内アミロイドペプチド（Ａｍｙｌｏｉｄ）生成低減等の効果を有する。

【0019】

本発明の一実施形態によれば、カンカニクジュヨウ抽出物は、エキナコシド（Ｅｃｈｉｎａｃｏｓｉｄｅ）、アクテオシド（Ａｃｔｅｏｓｉｄｅ）、イソアクテオシド（Ｉｓｏａｃｔｅｏｓｉｄｅ）、ツブロシドＡ（Ｔｕｂｕｌｏｓｉｄｅ Ａ）又はそれらの組み合わせを少なくとも含む。エキナコシド、アクテオシド、イソアクテオシド及びツブロシドＡのいずれも、目の細胞に対して保護作用を有する。

【0020】

本発明のカンカニクジュヨウ抽出物を目の細胞を保護する薬剤又は食品に調製する方法は、カンカニクジュヨウ抽出物を提供し、目の細胞を保護する薬剤又は食品として調製することを含んでよい。例を挙げると、カンカニクジュヨウ抽出物を目の細胞を保護する薬剤又は食品に調製する方法は、まず、カンカニクジュヨウを抽出すること、次に、カンカニクジュヨウから抽出された成分（即ちカンカニクジュヨウ抽出物）に対して補助材料添加、加工等の工程を行った後、薬剤又は食品を調製することを含む。又は、前記カンカニクジュヨウ抽出物に含まれた成分を直接に取得し、補助材料添加、加工等の工程を行った後、薬剤又は食品を直接に調製することを含む。

【0021】

注意すべきなのは、本発明のカンカニクジュヨウ抽出物で調製されてなる薬剤又は食品は、前記４種の成分における少なくとも１種を含んでもよく、且つ選択的に薬剤又は食品における一般的な他の補助材料を含んでもよい。また、本発明のカンカニクジュヨウ抽出物で調製された薬剤又は食品は、任意の形態であってよく、例えば薬剤の形態がカプセル、錠剤、粉剤又は液状であってよい。

【0022】

本発明の一実施形態によれば、薬剤又は食品は目の疾患を予防し、遅延させるか又は治療するためのものである。

【0023】

本発明の一実施形態によれば、目の疾患は黄斑部の退化、黄斑部円孔、網膜症又は緑内障である。

【0024】

本発明の一実施形態によれば、黄斑部の退化は加齢黄斑変性である。臨床及び病理表現により、加齢黄斑変性は、乾性黄斑変性及び滲出型黄斑変性という２種のタイプに分けられることができる。

【0025】

本発明の一実施形態によれば、網膜症は、糖尿病網膜症、網膜色素変性、網膜疾患、網膜動脈と静脈閉塞、増殖性硝子体網膜症又は中心性漿液性脈絡膜網膜症である。

【0026】

本発明によれば、カンカニクジュヨウ抽出物を薬剤又は食品の調製に用い、ここでカンカニクジュヨウ抽出物に含まれた成分は、エキナコシド、アクテオシド、イソアクテオシド、ツブロシドＡ又はそれらの組み合わせであってよく、目の細胞に対する酸化ストレスによる損傷を低減することができ、それにより調製された該薬剤又は食品に目の細胞への保護効果を持たせる。将来、目の疾患の悪化を予防するか又は遅らせる薬剤として更に開発されることができ、特に網膜症疾患の治療に用いることができる。

【0027】

以下、複数の実施例を挙げて更に本発明の方法を詳しく説明し、しかしながら、それは例示して説明するためのものだけであり、本発明を限定するためのものではなく、本発明の保護範囲は請求の範囲で画定されたものを基準とする。

【0028】

実施例１
本発明の実施例１において、カンカニクジュヨウ抽出物の調製は以下の工程を含む。

【0029】

カンカニクジュヨウの肉質茎部分１０ｋｇを取り、スライスした後８倍の体積の水に１時間浸漬した後、２時間煎じ、濾過して濾過液を収集する。

【0030】

６倍の体積の水を入れて濾過後の煎じ薬のかすを２回煎じ、毎回１時間ずつ行い、且つ濾過して濾過液を収集する。

【0031】

三回の濾過液を併合して、且つ５０℃で１．１０の比重に減圧濃縮して、濃度６０％となるようにエタノールを添加し、１２時間冷蔵し、上澄液をデカントして、５０℃で減圧濃縮して且つ１．１０の比重となるようにエタノールを回収し、粗抽出物６ｋｇを取得する。

【0032】

１倍体積の水で工程３の粗抽出物を加熱溶解して、且つマクロポーラス吸着樹脂カラム内に注入する。次に、順次に４倍体積の水及び５倍体積の４０％エタノールで溶離し、更に水溶離液をマクロポーラス吸着樹脂カラムに注入し、先に３倍の体積の水で溶離し、水溶離液を捨ててから、４倍体積の４０％エタノールで溶離する。

【0033】

工程４の２回の４０％エタノール溶離液を収集し、濃縮乾燥した後、実施例１のカンカニクジュヨウ抽出物１１０７ｇを取得することができる。該カンカニクジュヨウ抽出物には、エキナコシド、アクテオシド、イソアクテオシド及びツブロシドＡを含む。

【0034】

実施例２−５
本発明は、エキナコシド（ｅｃｈｉｎａｃｏｓｉｄｅ）を実施例２とし、アクテオシド（ａｃｔｅｏｓｉｄｅ）を実施例３とし、イソアクテオシド（ｉｓｏａｃｔｅｏｓｉｄｅ）を実施例４（以上、いずれも米国ＣｈｒｏｍａＤｅｘ会社から購入）とし、ツブロシドＡ（Ｔｕｂｕｌｏｓｉｄｅ Ａ）を実施例５（中国上海同田生物技術有限会社、略称Ｔａｕｔｏ Ｂｉｏｔｅｃｈから購入）とする。

【0035】

細胞培養
網膜色素上皮細胞（Ｒｅｔｉｎａｌ Ｐｉｇｍｅｎｔ Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ；ＲＰＥと略称）は、網膜神経上皮層と脈絡膜との間に位置し、多種の生理機能（例えば、網膜バリア、食作用、視サイクル代謝参与、酸化防止機能及び成長因子分泌等）を有する。ＲＰＥ細胞は、酸化ストレスの損傷により死亡しやすく、更に網膜症、視機能異常、ひいては視機能喪失を引き起こし、このため、常に目の相関疾患の細胞モードの研究に利用される。

【0036】

加齢黄斑変性を例として、加齢黄斑変性は、血管内皮成長因子（Ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ；ＶＥＧＦと略称）の酸化ストレス、リポフスチン沈着（Ｄｅｌｏｒｉ ＦＣ ｅｔ ａｌ、２００１）、慢性炎症及び補体系突然変異等と密接に関連し、このため、ＲＰＥ細胞を使用して研究する。加齢黄斑変性において、酸化ストレスによりＲＰＥ細胞又は脈絡膜毛細管（Ｃｈｏｒｉｏｃａｐｉｌｌａｒｉｓ）損傷（Ｂｏｌｔｚ Ａ ｅｔ ａｌ、 ２０１０）を引き起こす。ＲＰＥ細胞の損傷によりブルッフ膜（Ｂｒｕｃｈ ｍｅｍｂｒａｎｅ）及び脈絡膜の炎症反応を引き起こし、且つＲＰＥ細胞の機能障害及び誘発した炎症反応により細胞外基質（Ｅｘｔｒａ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｍａｔｒｉｘ；ＥＣＭと略称）の異常沈積を引き起こし、更にＲＰＥ細胞の生物機能に影響を与えて、且つ加齢黄斑変性の進行を悪化させる。

【0037】

以下の実験例は、ＲＰＥ細胞（アメリカ培養細胞系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ；略称ＡＴＣＣから購入））を採用して本発明の実施例１−５の目の細胞に対する保護効果を評価するものであり、細胞培養は以下の工程を含む。

【0038】

ＲＰＥ細胞株の不凍管を液体窒素から取り出し、急速に３７℃の水浴タンクに置いて１分間解凍した後、迅速に無菌作業台内へ移動する。細胞株を取り出し、１０ｍＬのＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ'ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ）培養液を含有する１０ｃｍの培養皿に入れて、この培養液に１０％の非活性化のウシ胎仔血清（ｈｅａｔ−ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ；ＦＢＳと略称）、２ｍＭのＬ‐グルタミン（Ｌ−ｇｌｕｔａｍｉｎｅ）、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン（ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ）及び１００ｇ／ｍＬのストレプトマイシン（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）を加える。

【0039】

該培養皿を３７℃のインキュベータに置いて、条件として９５％の空気及び５％の二酸化炭素の混合気体、湿度７０％の環境において培養し、三日おきに新鮮な培養液を切り替える。実験する前に培養液を血清を含まないＤＭＥＭに切り替える必要がある。
細胞は飽和に近い程度まで増殖する際、セルカウンタで細胞の数を測定する。細胞数が約２×１０^５−１×１０^６細胞／ｍＬに達する際、１：３の割合で希釈して細胞の継代培養を行う。ＲＰＥ細胞が付着型細胞であるため、切り替える場合、まず、細胞を含有する培養液を１５ｍＬの遠心分離管に吸い込み、室温で回転速度７２ｇで５分間遠心する必要がある。遠心を行った後、上澄液を吸い除いて更に新鮮な培養液を加えて培養する。

【0040】

以下の実験例は上記工程で培養した後のＲＰＥ細胞により本発明の実施例１−５の効果を評価する。

【0041】

実験例１、実施例１−５のＲＰＥ細胞生存率及び成長に対する測定（ＭＴＴ ａｓｓａｙ）
実験前にまず、培養液を無血清の培養液に置換し、定量的なＲＰＥ細胞（２×１０^５細胞／ｍＬ）を分けて９６ウェル培養プレートに置いて、インキュベータ内に入れた後、異なる濃度の実施例１−５で細胞を処理した後２４時間培養する。次に、１．０ｍｇ／ｍＬのチアゾリルブルーテトラゾリウムブロミド（３−（４，５−Ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌ−２−ｙｌ）−２，５−ｄｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ；ＭＴＴと略称）を添加して、３７℃で１時間作用させる。そして、更に各ウェルに２００μＬのジメチルスルホキシド（ｄｉｍｅｔｈｙｌ ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ；ＤＭＳＯと略称）を添加し、やや混合した後、室温で光を避けて１０分間軽く振る。ウェル内に残留された細胞が完全に溶解された後、酵素免疫分析装置（ＭＲＸ ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ；ＵＳＡ）により５５０ｎｍの波長で各ウェルの吸光度を検出する。実施例により処理されない細胞が２４時間培養した後、対照群として用いられた。

【0042】

実験例１の目的は、実施例１−５がＲＰＥ細胞に対して細胞毒性を有するかどうか及びそのＲＰＥ細胞成長を促進する程度を測定することにある。生存細胞のミトコンドリア酵素を利用してＭＴＴ試薬をホルマザン（ｆｏｒｍａｚａｎ）である紫色の結晶に還元し、更にＤＭＳＯで結晶を溶解する。即ち細胞の代謝活性を細胞が生存するかどうかの依拠とすることにより、測定された溶解吸光度は相対的な細胞生存率に等しいので、生存細胞が多いほど、その吸光度が高くなる。細胞生存率百分率の計算方式は以下のとおりである。

【0043】

【数1】

【0044】

実験例１のデータ結果は、実験回数の平均値標準誤差（ｍｅａｎ±Ｓ．Ｅ．）で示される。学生t検定（Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ t−ｔｅｓｔ）又は一元配置分散分析（ｏｎｅ ｗａｙ ANOVA）に基づいて統計分析を行い、P＜０．０５となると、有意差があると示される。

【0045】

図１−５を参照して、それぞれ実施例１−５のそれぞれの細胞毒性試験結果図を示す。図１−５に示すように、実施例１−５のＩＣ_２５、ＩＣ_５０及びＩＣ_７５が知られ、且つ結果を以下の表１にまとめる。

【0046】

【表1】

【0047】

表１の結果より、実施例１−５のＩＣ_５０を大きさ順に並べ替える。（実施例５、実施例１）＞実施例２＞（実施例３、実施例４）とする。実験例１で得られた細胞毒性試験結果に従って、後続の実験例２に用いるテスト濃度を決定する。

【0048】

実験例２、実施例１−５の活性酸素種（ｒｅａｃｔｉｖｅ ｏｘｙｇｅｎ ｓｐｅｃｉｅｓ；ＲＯＳと略称）を共同処理した後のＲＰＥ細胞の生存率及び成長に対する測定（ＭＴＴ ａｓｓａｙ）
実験例２は実験例１で得られた細胞毒性試験結果により、実施例１−５からそれぞれ３つの濃度を取って、実験例２の酸化ストレス傷害保護作用のテスト濃度とする。実験例２において実施例１−５のＩＣ_５０を最高濃度として用い、その目的はＩＣ_５０で実施例１−５の毒性と薬学的性質との作用区間を再び確認することにある。

【0049】

実験する前に、まず、培養液を無血清の培養液に切り替え、定量的な細胞（２×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）を分けて９６ウェル培養プレートに置いて、インキュベータ内に入れた後、異なる濃度の実施例１−５で細胞を処理した後２４時間培養する。次に、異なる濃度の酸化ストレスインデューサ（Ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｓｔｒｅｓｓ ｉｎｄｕｃｅｒ）を添加して細胞を処理する。実験例２で用いられた酸化ストレスインデューサは、過酸化水素（ｈｙｄｒｏｇｅｎ ｐｅｒｏｘｉｄｅ；Ｈ_２Ｏ_２、濃度が０．０１−１０ｍＭである）、ｔｅｒｔ-ブチルヒドロペルオキシド（ｔｅｒｔ−ｂｕｔｙｌ ｈｙｄｒｏｘｙｐｅｒｏｘｉｄｅ；ｔ−ＢＨＰと略称し、濃度が０．０１−１０ｍＭである）、アジ化ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ａｚｉｄｅ；ＮａＮ_３、濃度が０．１−１００ｍＭである）及び青色光により誘発された損傷を含み、波長が４８０ｎｍであり、照度が３５０ルクス（ｌｕｘ）の青色発光ダイオード（ｌｉｇｈｔ−ｅｍｉｔｔｉｎｇ ｄｉｏｄｅ；ＬＥＤと略称）で細胞を照射する。次に、それぞれ処理時間が終わった後（青色光照射試験で連続的に７日観察し、他の酸化ストレスインデューサがいずれも２４時間である）、０．５ｍｇ／ｍＬのＭＴＴを添加し、３７℃で２時間作用させる。そして、更に２００μＬのＤＭＳＯを各ウェルに添加し、やや混合した後、室温で光を避けて１０分間軽く振って、ウェル内に残留された細胞が完全に溶解した後、酵素免疫分析装置により５５０ｎｍの波長で各ウェルの吸光値を検出する。酸化ストレスインデューサ及び実施例により処理されない細胞を２４時間培養した後対照群とし、且つ実験例１に記載された細胞生存率百分率の計算方式で対照群に対する細胞生存率を計算する。

【0050】

実験例２のデータ結果は実験回数の平均値標準誤差（ｍｅａｎ±Ｓ．Ｅ．）で示される。学生t検定又はｏｎｅ ｗａｙ ＡＮＯＶＡに基づいて統計分析を行い、Ｐ＜０．０５となると、有意差があると示される。

【0051】

以下、実験例２で用いられた酸化ストレスインデューサ及びＲＰＥ細胞毒性物の作用メカニズムを以下の表２に総合的にまとめる。

【0052】

【表2】

【0053】

実験例２には、まず本発明の実施例１−５でＲＰＥ細胞をそれぞれ処理し、更にこれらの代表的な酸化ストレスインデューサでＲＰＥ細胞を処理し、ＲＰＥ細胞の生存率により、本発明の実施例１−５のＲＰＥ細胞に対する保護効果を評価する。

【0054】

図６−１０を参照すると、それらはそれぞれ実施例１−５のＨ_２Ｏ_２により誘発された細胞毒性に対する保護作用の試験結果図を示し、実施例１の濃度が５０、１００及び２００μｇ／ｍＬであり、実施例２の濃度が１８．７５、３７．５及び７５μｇ／ｍＬであり、実施例３の濃度が１５．６２５、３１．２５及び６２．５μｇ／ｍＬであり、実施例４の濃度が１５．６２５、３１．２５及び６２．５μｇ／ｍＬであり、実施例５の濃度が５０、１００及び２００μｇ／ｍＬである。試験結果に示すように、０．１ｍＭのＨ_２Ｏ_２を処理すると約５０％のＲＰＥ細胞死を引き起こし、即ち生存率が約５０％のみであることが分かる。この濃度による損傷には、実施例１、実施例２、実施例３及び実施例５がいずれも明らかに細胞保護作用を有し、そのうち実施例１の作用が最強で、その濃度が５０μｇ／ｍＬと１００μｇ／ｍＬである場合、５０％の細胞生存率を１００％まで向上させることができることが観察される。また、実施例１は、２００μｇ／ｍＬの濃度である場合、既にそのＩＣ_５０の濃度に達したので、合理的な細胞毒性反応を表現する。図６−１０の試験結果からも実施例１のＨ_２Ｏ_２に対する最も有効な作用濃度区間が５０μｇ／ｍＬと１００μｇ／ｍＬとの間にあることが再び確認される。

【0055】

図１１−１５を参照すると、それらはそれぞれ実施例１−５のｔ−ＢＨＰにより誘発された細胞毒性に対する保護作用の試験結果図を示す。実施例１の濃度が５０、１００及び２００μｇ／ｍＬであり、実施例２の濃度が１８．７５、３７．５及び７５μｇ／ｍＬであり、実施例３の濃度が１５．６２５、３１．２５及び６２．５μｇ／ｍＬであり、実施例４の濃度が１５．６２５、３１．２５及び６２．５μｇ／ｍＬであり、実施例５の濃度が５０、１００及び２００μｇ／ｍＬである。試験結果に示すように、０．３ｍＭのｔ−ＢＨＰを処理すると約８０％のＲＰＥ細胞死を引き起こすことができ、即ち生存率が約２０％のみであることが分かる。この濃度による損傷には、実施例１−実施例５がいずれも明らかに細胞保護作用を有し、そのうち実施例１、実施例２及び実施例３の作用が最強で、低濃度と中濃度でいずれも２０％の細胞生存率を８０％以上まで向上させることができることが観察される。また、各実施例１−５の高濃度が既にＩＣ_５０に達したので、合理的な細胞毒性反応を表現する。図１１−１５の試験結果からも実施例１、実施例２及び実施例３のｔ−ＢＨＰに対する最も有効な作用濃度区間が低濃度と中濃度との間にあることが再び確認される。

【0056】

図１６−２０を参照すると、それらはそれぞれ実施例１−５のＮａＮ_３により誘発された細胞毒性に対する保護作用の試験結果図を示し、実施例１の濃度が７５、１００及び１２５μｇ／ｍＬであり、実施例２の濃度が２５、３７．５及び５０μｇ／ｍＬであり、実施例３の濃度が１５．６２５、３１．２５及び６２．５μｇ／ｍＬであり、実施例４の濃度が１５．６２５、３１．２５及び６２．５μｇ／ｍＬであり、実施例５の濃度が７５、１００及び１２５μｇ／ｍＬである。試験結果に示すように、１０ｍＭのＮａＮ_３を処理すると約５０％のＲＰＥ細胞死を引き起こすことができ、即ち生存率が約５０％のみであることが分かる。この濃度による損傷から、実施例１−実施例５はいずれも明らかに細胞保護作用を有し、そのうち実施例１、実施例４及び実施例５の保護作用が最強で、中濃度と高濃度でほぼ細胞生存率を１００％まで回復させることができ、次に実施例２と実施例３で５０％の細胞生存率を８０％以上まで向上させることができることが観察される。また、各実施例１−５の高濃度がこのＮａＮ_３の損傷で、重大な毒性反応を示さず、このＩＣ_５０も薬効果区間にあるが、まだ用量相関を表現しない。図１６−２０の試験結果により実施例１−実施例５のＮａＮ_３に対する最も有効な作用濃度区間が低濃度と中濃度との間にあることが確認される。

【0057】

図２１−２５を参照すると、それらはそれぞれ実施例１−５の青色光照射により誘発された細胞毒性に対する保護作用の試験結果図を示し、実施例１の濃度が５０、１００及び２００μｇ／ｍＬであり、実施例２の濃度が１８．７５、３７．５及び７５μｇ／ｍＬであり、実施例３の濃度が１５．６２５、３１．２５及び６２．５μｇ／ｍＬであり、実施例４の濃度が１５．６２５、３１．２５及び６２．５μｇ／ｍＬであり、実施例５の濃度が５０、１００及び２００μｇ／ｍＬである。試験結果に示すように、青色光（４８０ｎｍ、３０ｌｕｘ）で照射処理されたＲＰＥ細胞は、約第５日に照射された後４０％のＲＰＥ細胞死を引き起こし、即ち生存率が約６０％のみであることが観察される。この濃度による損傷には、実施例１−５がいずれも明らかに細胞保護作用を有し、そのうち実施例３と実施例４の作用が最強で、中濃度でいずれも６０％の細胞生存率を９０％−１００％以上まで向上させることができることが観察される。また、各実施例１−５の高濃度が既にＩＣ_５０に達したので、合理的に細胞毒性反応を表現する。図２１−２５の試験結果からも実施例３と実施例４の青色光照射の最も有効な作用に対する濃度区間が低濃度と中濃度との間にあることが確認される。

【0058】

本発明において、実験例１及び実験例２の試験結果を分析することにより、実施例１−５の抗酸化ストレスインデューサに対して損傷を引き起こす過程中に、実施例１−５と酸化ストレスインデューサとの間に化学反応が発生し、構造を改変し、更に質的変化を引き起こし、それにより実施例１−５の性質を還元剤から酸化剤へ変換し、酸化ストレスインデューサの性質を酸化剤から還元剤へ変換し、このため、同時に実施例１−５の抗酸化ストレスインデューサに対する効果及び酸化ストレスインデューサによる細胞損傷の程度を低減して、且つこの状況は実施例１−５及び酸化ストレスインデューサの濃度の増加に従ってより明確であることが発見される。

【0059】

以下、実験例２のすべての酸化ストレスインデューサの試験結果を以下の表３にまとめる。

【0060】

【表3】

【0061】

以上の表３の総合的な結果から分かるように、実施例１−５はｔ−ＢＨＰ、ＮａＮ_３及び青色光によるＲＰＥ細胞損傷に対していずれも明らかな保護作用を有し、そのうち実施例１及び実施例４が強い保護作用を有する。

【0062】

要するに、本発明は、目の細胞を保護する薬剤又は食品を調製するためのカンカニクジュヨウ抽出物の用途を提供する。カンカニクジュヨウ抽出物は、酸化ストレスによる目の細胞に対する損傷を低減することができ、それによりそれで調製された薬剤又は食品に目細胞への良好な保護効果を持たせ、将来、更に目の疾患を予防するか又は目の疾患の悪化を遅らせる薬剤又は食品として開発することができる。

【0063】

本発明は、実施形態として上記の通り開示したが、これは本発明を限定するものではない。当業者は、本発明の精神と範囲から逸脱しない限り、各種の変更や修正を加えることができる。従って、本発明の保護範囲は、添付する特許請求の範囲に定義されるものを基準とする。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】