特許 6574821 カルボキシＸローダミン類似体

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6574821

(24)【登録日】2019年8月23日

(45)【発行日】2019年9月11日

(54)【発明の名称】カルボキシＸローダミン類似体

(51)【国際特許分類】

   C09B 11/28 20060101AFI20190902BHJP

   G01N 33/53 20060101ALI20190902BHJP

   G01N 33/533 20060101ALI20190902BHJP

   G01N 33/542 20060101ALI20190902BHJP

   G01N 33/566 20060101ALI20190902BHJP

【ＦＩ】

   C09B11/28 C

   C09B11/28 K

   G01N33/53 D

   G01N33/53 M

   G01N33/533

   G01N33/542 A

   G01N33/566

【請求項の数】17

【外国語出願】

【全頁数】100

(21)【出願番号】特願2017-183422(P2017-183422)

(22)【出願日】2017年9月25日

(62)【分割の表示】特願2014-543546(P2014-543546)の分割

【原出願日】2012年11月20日

(65)【公開番号】特開2018-35359(P2018-35359A)

(43)【公開日】2018年3月8日

【審査請求日】2017年10月24日

(31)【優先権主張番号】61/562,021

(32)【優先日】2011年11月21日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】593089149

【氏名又は名称】プロメガ コーポレイション

【氏名又は名称原語表記】Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ

(74)【代理人】

【識別番号】100094569

【弁理士】

【氏名又は名称】田中 伸一郎

(74)【代理人】

【識別番号】100088694

【弁理士】

【氏名又は名称】弟子丸 健

(74)【代理人】

【識別番号】100084663

【弁理士】

【氏名又は名称】箱田 篤

(74)【代理人】

【識別番号】100093300

【弁理士】

【氏名又は名称】浅井 賢治

(74)【代理人】

【識別番号】100119013

【弁理士】

【氏名又は名称】山崎 一夫

(74)【代理人】

【識別番号】100123777

【弁理士】

【氏名又は名称】市川 さつき

(74)【代理人】

【識別番号】100111796

【弁理士】

【氏名又は名称】服部 博信

(72)【発明者】

【氏名】カークランド トーマス エイ

(72)【発明者】

【氏名】マクドゥーガル マーク ジー

(72)【発明者】

【氏名】ドワイト スティーヴン

【審査官】 早乙女 智美

(56)【参考文献】

【文献】 特表２０１４−５３４２６１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表平０１−５０３４８８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００２−５４０２８０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００１−５２４４９３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００３−５０１５３９（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０７Ｄ

Ｃ０９Ｂ１１／２８

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

被標識物質が以下の式（Ｉａ）、式（Ｉｂ）、式（ＩＩＩａ）、式（ＩＩＩｂ）及び式（ＩＩＩｃ）から選ばれる化合物で標識されている、標識複合体：

（式（Ｉａ）及び式（Ｉｂ）中、
Ｒ¹およびＲ²は、互いに結合してトリメチレン基を形成しており、
Ｒ¹¹およびＲ¹²は、互いに結合してトリメチレン基を形成しており、
Ｒ⁵およびＲ¹⁵は、Ｈであり、
Ｒ²⁰、Ｒ²¹、Ｒ²²、Ｒ²⁴、Ｒ²⁵およびＲ²⁶は、Ｈであり、
Ｒ⁶およびＲ¹⁰のうちの一方は、ＣＯＯ^-、ＣＯＯＨ又はＨであり、
Ｒ⁶およびＲ¹⁰のうちの他方、ならびにＲ⁷〜Ｒ⁹は、独立して、Ｈ、Ｃｌ、Ｆ、ＣＯＯＨ、ＳＯ₃Ｈ、ＳＣＨ₂ＣＯＯＨ、

であり、および
各Ｘは、独立して、ＣＨ₂又はＣＨ（ＣＨ₃）である。）；

（式（ＩＩＩａ）、式（ＩＩＩｂ）及び式（ＩＩＩｃ）中、
Ｒ¹¹およびＲ¹²は、互いに結合してトリメチレン基を形成しており、
Ｒ²およびＲ¹⁶は、Ｈであることができ、
Ｒ³およびＲ⁴は、独立して、メチル又はエチルであることができ、
あるいは、Ｒ²およびＲ³は、互いに結合してトリメチレン基を形成し、ならびに、独立して、Ｒ⁴およびＲ¹⁶は、互いに結合してトリメチレン基又は−Ｃ（ＣＨ₃）₂−Ｃ＝Ｃ（ＣＨ₃）−を形成し、
Ｒ⁵、Ｒ¹³、Ｒ¹⁴およびＲ¹⁵は、Ｈであり、
Ｒ²⁰、Ｒ²¹およびＲ²²は、Ｈであり、
Ｒ⁶およびＲ¹⁰のうちの一方は、ＣＯＯ^-、ＣＯＯＨ又はＨであり、
Ｒ⁶およびＲ¹⁰のうちの他方、ならびにＲ⁷〜Ｒ⁹は、独立して、Ｈ、Ｃｌ、Ｆ、ＣＯＯＨ、ＳＯ₃Ｈ、ＳＣＨ₂ＣＯＯＨ、

であり、および
Ｘは、ＣＨ₂又はＣＨ（ＣＨ₃）である。）

【請求項2】

前記被標識物質が、ビーズ、固形支持体、樹脂粒子、アッセイプレート、タンパク質、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、リガンド、酵素基質、抗体、ナノボディ、ポリペプチド、ポリペプチドベースの毒素、アミノ酸、ペプチド、脂質、炭水化物、ハプテン、小分子、薬剤、薬剤化合物、イオン錯化剤、微粒子、合成ポリマー、天然ポリマー、細胞又はウイルスである、請求項１に記載の標識複合体。

【請求項3】

前記被標識物質が、前記式（Ｉａ）、式（Ｉｂ）、式（ＩＩＩａ）、式（ＩＩＩｂ）及び式（ＩＩＩｃ）から選ばれる化合物で、当該化合物中のＲ⁶、Ｒ⁷、Ｒ⁸、Ｒ⁹又はＲ¹⁰で表される基を介して標識されている、請求項１又は２に記載の標識複合体。

【請求項4】

前記被標識物質が、小分子、薬剤または薬剤化合物である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の標識複合体。

【請求項5】

前記被標識物質が、リガンドである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の標識複合体。

【請求項6】

前記リガンドが、クロロアルカンリガンドである、請求項５に記載の標識複合体。

【請求項7】

トレーサーである、請求項４に記載の標識複合体。

【請求項8】

被標識物質と対象のタンパク質の間の相互作用を検出する方法であって、前記対象のタンパク質を、請求項１〜７のいずれか１項に記載の標識複合体と接触させること、および前記相互作用を検出することを含む、方法。

【請求項9】

前記対象のタンパク質が、レポータータンパク質に融合されている、請求項８に記載の方法。

【請求項10】

前記レポータータンパク質が、ルシフェラーゼタンパク質である、請求項９に記載の方法。

【請求項11】

前記標識複合体がトレーサーである、請求項８に記載の方法。

【請求項12】

前記相互作用が、生物発光共鳴エネルギー転移により検出される、請求項８〜１１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項13】

前記対象のタンパク質が細胞で発現されている、請求項８〜１２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項14】

請求項１〜７のいずれか１項に記載の標識複合体、および使用説明書を含む、キット。

【請求項15】

対象のタンパク質を含む融合タンパク質を発現するためのベクター、または、対象のタンパク質を含む融合タンパク質を発現する細胞をさらに含む、請求項１４に記載のキット。

【請求項16】

前記対象のタンパク質が、レポータータンパク質に融合されている、請求項１５に記載のキット。

【請求項17】

前記レポータータンパク質が、ルシフェラーゼタンパク質である、請求項１６に記載のキット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、蛍光色素およびそれらの使用方法に関する。

【背景技術】

【0002】

蛍光色素は、生物学的研究および医療診断技術に広く用いられている。蛍光色素は、安価で、毒性も少なく、通常は十分な感度で検出できることから、従来技術よりも優れている傾向にある。識別可能な範囲の色を有する蛍光色素は多様であり、それによって、複数の生物学的な標的を同時に検出することができるマルチプレックスな分析をより実用的なものとしている。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0003】

新たな機器および生物学的用途の需要増加に対応するため、色素の特性をさらに改善することが求められている。特に、最大シグナル検出のための色素の波長の微調整を可能にし、追加の色を提供するための、さらなる戦略が求められている。

【課題を解決するための手段】

【0004】

一つの態様において、本発明は以下の式（Ｉａ）または式（Ｉｂ）：

【化1】

に記載の化合物を提供し、式中、
Ｒ¹およびＲ¹¹は、独立して、ＨまたはＣ_1-4アルキル、Ｌ−ＲもしくはＬ−Ｃ_Sであり、
Ｌは、１〜１６の非水素原子を有する、直鎖もしくは分枝状、環状もしくは複素環式の飽和または不飽和である共有結合であり、当該結合が、エステル、酸、アミン、アミド、アルコール、エーテル、チオエーテルもしくはハロゲン基のうちの組み合わせを含有するものであるか、または、一重、二重、三重もしくは芳香族の炭素−炭素結合であり、
Ｒは、反応基であり、
Ｃ_Sは、結合物質であり、
Ｒ²、Ｒ⁵、Ｒ¹²およびＲ¹⁵は、独立して、Ｈ、アルキル、アリール、ヘテロアリール、ＣＯ₂Ｈ、ＳＯ₃Ｈ、Ｌ−ＣＯ₂Ｈ、Ｌ−ＳＯ₃Ｈ、Ｌ−ＲまたはＬ−Ｃ_Sであり、
Ｒ²⁰、Ｒ²¹、Ｒ²²、Ｒ²³、Ｒ²⁴、Ｒ²⁵およびＲ²⁶は、独立して、ＨまたはＣ_1-6アルキルであるか、または、Ｒ²⁰およびＲ²¹、Ｒ²¹およびＲ²²、Ｒ²²およびＲ²³、Ｒ²⁴およびＲ²⁵、Ｒ²⁵およびＲ²⁶、ならびにＲ²⁶およびＲ²³の一つ以上が、アリール環、ヘテロアリール環、炭素環または複素環を共に形成し、
Ｒ¹およびＲ²、ならびに／または、Ｒ¹¹およびＲ¹²は、炭素環、複素環、アリール環、またはヘテロアリール環を共に形成してもよく、
Ｒ^6-10は、独立して、Ｈ、ハロ、ＯＨ、アルキル、アリール、ヘテロアリール、ＣＯ₂Ｈ、ＳＯ₃Ｈ、Ｌ−ＣＯ₂Ｈ、Ｌ−ＳＯ₃Ｈ、Ｌ−ＲまたはＬ−Ｃ_Sであり、
各Ｘは、独立して、ＣＨＲ²³、Ｏ、ＳまたはＮＲ³⁰であり、および、
Ｒ³⁰は、Ｈ、Ｃ_1-4アルキルまたは−Ｃ（Ｏ）Ｃ_1-4アルキルである。

【0005】

別の態様において、本発明は、式（ＩＩａ）または式（ＩＩｂ）：

【化2】

に記載の化合物を提供し、式中、
Ｒ¹およびＲ¹¹は、独立して、ＨまたはＣ_1-4アルキル、Ｌ−ＲもしくはＬ−Ｃ_Sであり、
Ｌは、１〜１６の非水素原子を有する、直鎖もしくは分枝状、環状もしくは複素環式の飽和または不飽和である共有結合であり、当該結合が、エステル、酸、アミン、アミド、アルコール、エーテル、チオエーテルもしくはハロゲン基のうちの組み合わせを含有するものであるか、または、一重、二重、三重もしくは芳香族の炭素−炭素結合であり、
Ｒは、反応基であり、
Ｃ_Sは、結合物質であり、
Ｒ²、Ｒ³、Ｒ⁴、Ｒ⁵、Ｒ¹²、Ｒ¹³、Ｒ¹⁴およびＲ¹⁵は、独立して、Ｈ、アルキル、アリール、ヘテロアリール、ＣＯ₂Ｈ、ＳＯ₃Ｈ、Ｌ−ＣＯ₂Ｈ、Ｌ−ＳＯ₃Ｈ、Ｌ−ＲまたはＬ−Ｃ_Sであり、
Ｒ²⁰、Ｒ²¹、Ｒ²²、Ｒ²³、Ｒ²⁴、Ｒ²⁵およびＲ²⁶は、独立して、ＨまたはＣ_1-6アルキルであるか、または、Ｒ²⁰およびＲ²¹、Ｒ²¹およびＲ²²、Ｒ²²およびＲ²³、Ｒ²⁴およびＲ²⁵、Ｒ²⁵およびＲ²⁶、ならびにＲ²⁶およびＲ²³の一つ以上が、アリール環、ヘテロアリール環、炭素環または複素環を共に形成し、
Ｒ¹およびＲ²、ならびに／または、Ｒ¹¹およびＲ¹²は、炭素環、複素環、アリール環、またはヘテロアリール環を共に形成してもよく、
Ｒ^6-10は、独立して、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＯＨ、アルキル、アリール、ヘテロアリール、ＣＯ₂Ｈ、ＳＯ₃Ｈ、Ｌ−ＣＯ₂Ｈ、Ｌ−ＳＯ₃Ｈ、Ｌ−ＲまたはＬ−Ｃ_Sであり、
各Ｘは、独立して、ＣＨＲ²³、Ｏ、ＳまたはＮＲ³⁰であり、および、
Ｒ³⁰は、Ｈ、Ｃ_1-4アルキルまたは、−Ｃ（Ｏ）Ｃ_1-4アルキルである。

【0006】

さらなる態様において、本発明は、式（ＩＩＩａ）、式（ＩＩＩｂ）または式（ＩＩＩｃ）：

【化3】

に記載の化合物を提供し、式中、
Ｒ¹¹は、独立して、ＨまたはＣ_1-4アルキル、Ｌ−ＲもしくはＬ−Ｃ_Sであり、
Ｌは、１〜１６の非水素原子を有する、直鎖もしくは分枝状、環状もしくは複素環式の飽和または不飽和である共有結合であり、当該結合が、エステル、酸、アミン、アミド、アルコール、エーテル、チオエーテルもしくはハロゲン基のうちの組み合わせを含有するものであるか、または、一重、二重、三重もしくは芳香族の炭素−炭素結合であり、
Ｒは、反応基であり、
Ｃ_Sは、結合物質であり、
Ｒ²およびＲ¹⁶は、独立して、Ｈ、アルキル、アリール、ヘテロアリール、ＣＯ₂Ｈ、ＳＯ₃Ｈ、Ｌ−ＣＯ₂Ｈ、Ｌ−ＳＯ₃Ｈ、Ｌ−ＲまたはＬ−Ｃ_Sであり、
Ｒ³およびＲ⁴は、Ｈ、アルキル、Ｌ−Ｒ、Ｌ−Ｃ_S、Ｌ−ＣＯ₂Ｈ、Ｌ−ＳＯ₃Ｈであるか、または、炭素環、アリール環、ヘテロアリール環もしくは複素環を共に形成し、 あるいは、Ｒ²およびＲ³、ならびに、独立して、Ｒ⁴およびＲ¹⁶は、炭素環、複素環、アリール環、またはヘテロアリール環を共に形成し、
Ｒ⁵、Ｒ¹²、Ｒ¹³、Ｒ¹⁴およびＲ¹⁵は、独立して、Ｈ、アルキル、アリール、ヘテロアリール、ＣＯ₂Ｈ、ＳＯ₃Ｈ、Ｌ−ＣＯ₂Ｈ、Ｌ−ＳＯ₃Ｈ、Ｌ−ＲまたはＬ−Ｃ_Sであり、
Ｒ²⁰、Ｒ²¹、Ｒ²²およびＲ²³は、独立して、ＨまたはＣ_1-6アルキルであるか、または、Ｒ²⁰およびＲ²¹、Ｒ²¹およびＲ²²、Ｒ²²およびＲ²³の一つ以上が、アリール環、ヘテロアリール環、炭素環または複素環を共に形成し、
Ｒ¹¹およびＲ¹²は炭素環、複素環、アリール環、またはヘテロアリール環を共に形成してもよく、
Ｒ^6-10は、独立して、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＯＨ、アルキル、アリール、ヘテロアリール、ＣＯ₂Ｈ、ＳＯ₃Ｈ、Ｌ−ＣＯ₂Ｈ、Ｌ−ＳＯ₃Ｈ、Ｌ−ＲまたはＬ−Ｃ_Sであり、
Ｘは、ＣＨＲ²³、Ｏ、ＳまたはＮＲ³⁰であり、および、
Ｒ³⁰は、Ｈ、Ｃ_1-4アルキルまたは、−Ｃ（Ｏ）Ｃ_1-4アルキルである。

【0007】

さらに別の態様において、本発明は、式（ＩＶ）：

【化4】

に記載の化合物を提供し、式中、
Ｒ²およびＲ¹⁶は、独立して、Ｈ、アルキル、アリール、ヘテロアリール、ＣＯ₂Ｈ、ＳＯ₃Ｈ、Ｌ−ＣＯ₂Ｈ、Ｌ−ＳＯ₃Ｈ、Ｌ−ＲまたはＬ−Ｃ_Sであってもよく、
Ｌは、１〜１６の非水素原子を有する、直鎖もしくは分枝状、環状もしくは複素環式の飽和または不飽和である共有結合であり、当該結合が、エステル、酸、アミン、アミド、アルコール、エーテル、チオエーテルもしくはハロゲン基のうちの組み合わせを含有するものであるか、または、一重、二重、三重もしくは芳香族の炭素−炭素結合であり、
Ｒは、反応基であり、
Ｃ_Sは、結合物質であり、
Ｒ³およびＲ⁴は、Ｈまたはアルキルであるか、または、炭素環、アリール環、ヘテロアリール環もしくは複素環を共に形成し、
あるいは、Ｒ²およびＲ³、ならびに、独立して、Ｒ⁴およびＲ¹⁶は、炭素環、複素環、アリール環、またはヘテロアリール環を共に形成し、
Ｒ⁵およびＲ¹⁵は、独立して、Ｈ、アルキル、アリール、ヘテロアリール、ＣＯ₂Ｈ、ＳＯ₃Ｈ、Ｌ−ＣＯ₂Ｈ、Ｌ−ＳＯ₃Ｈ、Ｌ−ＲまたはＬ−Ｃ_Sであり、
Ｒ²²およびＲ²³は、独立して、ＨまたはＣ_1-6アルキルであるか、または、アリール環、ヘテロアリール環、炭素環もしくは複素環を共に形成し、および、
Ｒ^6-10は、独立して、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＯＨ、アルキル、アリール、ヘテロアリール、ＣＯ₂Ｈ、ＳＯ₃Ｈ、Ｌ−ＣＯ₂Ｈ、Ｌ−ＳＯ₃Ｈ、Ｌ−ＲまたはＬ−Ｃ_Sである。

【0008】

さらなる態様において、本発明は、式（Ｖ）：

【化5】

に記載の化合物を提供し、式中、
Ｒ²およびＲ¹⁶は、独立して、Ｈ、アルキル、アリール、ヘテロアリール、ＣＯ₂Ｈ、ＳＯ₃Ｈ、Ｌ−ＣＯ₂Ｈ、Ｌ−ＳＯ₃Ｈ、Ｌ−ＲまたはＬ−Ｃ_Sであってもよく、
Ｌは、１〜１６の非水素原子を有する、直鎖もしくは分枝状、環状もしくは複素環式の飽和または不飽和である共有結合であり、当該結合が、エステル、酸、アミン、アミド、アルコール、エーテル、チオエーテルもしくはハロゲン基のうちの組み合わせを含有するものであるか、または、一重、二重、三重もしくは芳香族の炭素−炭素結合であり、
Ｒは、反応基であり、
Ｃ_Sは、結合物質であり、
Ｒ³およびＲ⁴は、Ｈまたはアルキルであるか、または、炭素環、複素環、アリール環もしくはヘテロアリール環を共に形成し、
あるいは、Ｒ²およびＲ³、ならびに、独立して、Ｒ⁴およびＲ¹⁶は、炭素環、複素環、アリール環、またはヘテロアリール環を共に形成してもよく、
Ｒ⁵およびＲ¹⁵は、独立して、Ｈ、アルキル、アリール、ヘテロアリール、ＣＯ₂Ｈ、ＳＯ₃Ｈ、Ｌ−ＣＯ₂Ｈ、Ｌ−ＳＯ₃Ｈ、Ｌ−ＲまたはＬ−Ｃ_Sであり、
Ｒ²⁰およびＲ²¹は、独立して、ＨまたはＣ_1-6アルキルであるか、または、アリール環、ヘテロアリール環、炭素環もしくは複素環を共に形成し、および、
Ｒ^6-10は、独立して、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＯＨ、アルキル、アリール、ヘテロアリール、ＣＯ₂Ｈ、ＳＯ₃Ｈ、Ｌ−ＣＯ₂Ｈ、Ｌ−ＳＯ₃Ｈ、Ｌ−ＲまたはＬ−Ｃ_Sである。

【0009】

別の態様において、本発明は、式（ＶＩ）：

【化6】

に記載の化合物を提供し、式中、
Ｒ⁵およびＲ¹⁵は、独立して、Ｈ、アルキル、アリール、ヘテロアリール、ＣＯ₂Ｈ、ＳＯ₃Ｈ、Ｌ−ＣＯ₂Ｈ、Ｌ−ＳＯ₃Ｈ、Ｌ−ＲまたはＬ−Ｃ_Sであり、
Ｌは、１〜１６の非水素原子を有する、直鎖もしくは分枝状、環状もしくは複素環式の飽和または不飽和である共有結合であり、当該結合が、エステル、酸、アミン、アミド、アルコール、エーテル、チオエーテルもしくはハロゲン基のうちの組み合わせを含有するものであるか、または、一重、二重、三重もしくは芳香族の炭素−炭素結合であり、
Ｒは、反応基であり、
Ｃ_Sは、結合物質であり、
Ｒ²²、Ｒ²³、Ｒ²⁶およびＲ²⁷は、独立して、ＨまたはＣ_1-6アルキルであるか、または、Ｒ²²およびＲ²³およびＲ²⁶およびＲ²⁷のうち一つ以上が、アリール環、ヘテロアリール環、炭素環、または複素環を共に形成し、および、
Ｒ^6-10は、独立して、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＯＨ、アルキル、アリール、ヘテロアリール、ＣＯ₂Ｈ、ＳＯ₃Ｈ、Ｌ−ＣＯ₂Ｈ、Ｌ−ＳＯ₃Ｈ、Ｌ−ＲまたはＬ−Ｃ_Sである。

【0010】

さらなる態様において、本発明は、式（ＶＩＩ）：

【化7】

に記載の化合物を提供し、式中、
Ｒ⁵およびＲ¹⁵は、独立して、Ｈ、アルキル、アリール、ヘテロアリール、ＣＯ₂Ｈ、ＳＯ₃Ｈ、Ｌ−ＣＯ₂Ｈ、Ｌ−ＳＯ₃Ｈ、Ｌ−ＲまたはＬ−Ｃ_Sであり、
Ｌは、１〜１６の非水素原子を有する、直鎖もしくは分枝状、環状もしくは複素環式の飽和または不飽和である共有結合であり、当該結合が、エステル、酸、アミン、アミド、アルコール、エーテル、チオエーテルもしくはハロゲン基のうちの組み合わせを含有するものであるか、または、一重、二重、三重もしくは芳香族の炭素−炭素結合であり、
Ｒは、反応基であり、
Ｃ_Sは、結合物質であり、
Ｒ²⁰、Ｒ²¹、Ｒ²⁴およびＲ²⁵は、独立して、ＨまたはＣ_1-6アルキルであるか、または、Ｒ²⁰およびＲ²¹およびＲ²⁴およびＲ²⁵のうち一つ以上が、アリール環、ヘテロアリール環、炭素環、または複素環を共に形成し、および、
Ｒ^6-10は、独立して、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＯＨ、アルキル、アリール、ヘテロアリール、ＣＯ₂Ｈ、ＳＯ₃Ｈ、Ｌ−ＣＯ₂Ｈ、Ｌ−ＳＯ₃Ｈ、Ｌ−ＲまたはＬ−Ｃ_Sである。

【0011】

さらなる態様において、本発明は、式（ＶＩＩＩａ）または式（ＶＩＩＩｂ）：

【化8】

に記載の化合物を提供し、式中、
Ｒ¹¹は、ＨまたはＣ_1-4アルキル、Ｌ−ＲもしくはＬ−Ｃ_Sであり、
Ｌは、１〜１６の非水素原子を有する、直鎖もしくは分枝状、環状もしくは複素環式の飽和または不飽和である共有結合であり、当該結合が、エステル、酸、アミン、アミド、アルコール、エーテル、チオエーテルもしくはハロゲン基のうちの組み合わせを含有するものであるか、または、一重、二重、三重もしくは芳香族の炭素−炭素結合であり、
Ｒは、反応基であり、
Ｃ_Sは、結合物質であり、
Ｒ¹²およびＲ¹⁵は、独立して、Ｈ、アルキル、アリール、ＣＯ₂Ｈ、ＳＯ₃Ｈ、Ｌ−ＣＯ₂Ｈ、Ｌ−ＳＯ₃Ｈ、Ｌ−ＲまたはＬ−Ｃ_Sであり、
Ｒ²⁰、Ｒ²¹、Ｒ²²およびＲ²³は、独立して、ＨまたはＣ_1-6アルキルであるか、または、Ｒ²⁰およびＲ²¹、Ｒ²¹およびＲ²²、ならびにＲ²²およびＲ²³のうち一つ以上が、縮合アリール環を共に形成し、
Ｒ¹¹およびＲ¹²は、任意選択的に置換された環において、共に連結されても良く、 Ｒ^6-10は、独立して、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＯＨ、アルキル、アリール、ＣＯ₂Ｈ、ＳＯ₃Ｈ、Ｌ−ＣＯ₂Ｈ、Ｌ−ＳＯ₃Ｈ、Ｌ−ＲまたはＬ−Ｃ_Sであり、
Ｘは、ＣＨＲ²³、Ｏ、ＳまたはＮＲ³⁰であり、および、
Ｒ³⁰は、Ｈ、Ｃ_1-4アルキルまたは−Ｃ（Ｏ）Ｃ_1-4アルキルである。

【0012】

一部の態様において、本発明は、標識された生体分子を提供する。一部の態様において、標識された生体分子は、小分子（たとえば、薬剤または薬剤化合物）である。他の態様において、標識された生体分子または標識された小分子は、標的（たとえば、薬剤標的）への結合をモニターするための蛍光トレーサーとして作用する。

【0013】

他の態様において、本発明は、試料中の選択分子を検出するための方法を提供し、当該方法には、ａ）選択分子を含有すると思われる試料を、本発明の化合物および選択分子に対するリガンドを含有する複合体を含む組成物と接触させ、混合物を得ること、ｂ）当該混合物中の当該化合物の存在または量を検出すること、が含まれる。

【0014】

一部の態様において、本発明は、試料中の核酸ポリマーの存在を検出する方法を提供し、当該方法には、核酸ポリマーを含有すると思われる試料を、本発明の化合物およびオリゴヌクレオチドを含有する複合体を含有する組成物と接触させること、および、当該試料中の当該化合物の存在または量を検出すること、が含まれる。

【0015】

一部の態様において、本発明は、対象の標的（たとえば、薬剤標的）への結合をモニターする方法を提供し、当該方法には、対象標的を含有する融合タンパク質を含有する試料を、本明細書に記述される色素を結合された小分子と接触させること、および、小分子複合体の対象標的への結合を検出すること、が含まれる。一部の態様において、融合タンパク質は、対象標的に融合されたルシフェラーゼタンパク質を含有する。他の態様において、融合タンパク質は、対象標的に融合された蛍光タンパク質を含有する。一部の態様において、融合タンパク質がルシフェラーゼタンパク質を含有する場合、結合は、生物発光共鳴エネルギー転移（ＢＲＥＴ）により検出される。一部の態様において、融合タンパク質が蛍光タンパク質を含有する場合、結合は、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）により検出される。一部の態様において、試料は、融合タンパク質を発現する細胞を含有する。

【0016】

一部の態様において、本発明は、タンパク質−タンパク質相互作用をモニターするための方法を提供し、当該方法には、第一融合タンパク質および第二融合タンパク質を含有する試料を、本明細書に記述される色素を結合されたリガンドと接触させること、ならびに、第一および第二融合タンパク質の間の相互作用を検出すること、が含まれる。一部の態様において、第一融合タンパク質は、第一結合パートナーに融合されたルシフェラーゼタンパク質を含有し、第二融合タンパク質は、第二結合パートナーに融合されたＨａｌｏＴａｇ（登録商標）タンパク質を含有し、リガンド複合体は、ＨａｌｏＴａｇ（登録商標）リガンドを含有する。

【0017】

一部の態様において、本発明は、タンパク質（複数含む）、ペプチド（複数含む）またはリガンド（複数含む）の標識に用いられ得る反応性色素を提供する。一部の態様において、本発明の反応性色素は、標的タンパク質またはペプチドに、反応性シアノベンゾチアゾールの標識作用を用いて付着させる。

【0018】

他の態様において、本発明は、本発明の化合物、または本発明による標識生体分子を含有するキットを提供する。一部の態様において、当該キットは、標識生体分子または標識小分子（たとえば、薬剤または薬剤化合物）を含有する。一部の態様において、当該キットはさらに、対象タンパク質または対象標的を含有する融合タンパク質を発現する細胞を含有する。他の態様において、当該キットはさらに、対象タンパク質または対象標的を含有する融合タンパク質を発現するためのベクターを含有する。

【図面の簡単な説明】

【0019】

【図1A】本発明の様々な化合物を示す。

【図1B】本発明の様々な化合物を示す。

【図1C】本発明の様々な化合物を示す。

【図1D】本発明の様々な化合物を示す。

【図1E】本発明の様々な化合物を示す。

【図2A】本発明の様々な化合物を示す。

【図2B】本発明の様々な化合物を示す。

【図2C】本発明の様々な化合物を示す。

【図2D】本発明の様々な化合物を示す。

【図2E】本発明の様々な化合物を示す。

【図3A】本発明の様々な化合物を示す。

【図3B】本発明の様々な化合物を示す。

【図3C】本発明の様々な化合物を示す。

【図3D】本発明の様々な化合物を示す。

【図3E】本発明の様々な化合物を示す。

【図4】ＦＡＭ、ＪＯＥ、ＥＴ ＴＭＲ、ＥＴ ＲＯＸおよびＥＴ４５１０で標識された遺伝子座のピークを示す電気泳動図を示す。男性のＤＮＡ（１．０ｎｇ）を、２１−ＳＴＲプライマー対混合物（表１）および追加の遺伝子座Ｄ２２Ｓ１０４５、Ｄ２Ｓ４４１およびＤＹＳ３９１を用いて増幅させた。増幅産物を、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３５００ ｘＬ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒで分析した。パネルＡ：ＦＡＭ標識遺伝子座（Ａｍｅｌｏｇｅｎｉｎ、Ｄ３Ｓ１３５８、Ｄ１Ｓ１６５６、Ｄ６Ｓ１０４３、Ｄ１３Ｓ３１７およびＰｅｎｔａ Ｅ）のピークを示す電気泳動図。パネルＢ：ＪＯＥ標識遺伝子座（Ｐｅｎｔａ Ｄ、Ｄ１６Ｓ５３９、Ｄ１８Ｓ５１、Ｄ２Ｓ１３３８およびＣＳＦ１ＰＯ）のピークを示す電気泳動図。パネルＣ：ＥＴ−ＴＭＲ標識遺伝子座（ＴＨ０１、ｖＷＡ、Ｄ２１Ｓ１１、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ５Ｓ８１８、およびＴＰＯＸ）のピークを示す電気泳動図。パネルＤ：ＥＴ ＲＯＸ標識遺伝子座（Ｄ８Ｓ１１７９、Ｄ１２Ｓ３９１、Ｄ１９Ｓ４３３およびＦＧＡ）を示す電気泳動図。パネルＥ：ＥＴ ４５１０標識遺伝子座（Ｄ２２Ｓ１０４５、Ｄ２Ｓ４４１およびＤＹＳ３９１）を示す電気泳動図。注記：ＰｅｎｔａＤが、ＪＯＥ標識遺伝子座セット中で最も大きい遺伝子座であり、ＥＴ ４５１０標識遺伝子座は、最も小さいものから最も大きいものまで示されている。他のセット中の遺伝子座は、最も大きいものから最も小さいものまで示されている。

【図5】４５１０で標識された（パネルＡ）、４５６３で標識された（パネルＢ）、または４５７４で標識された（パネルＣ）、ＤＹＳ３９１、Ｄ２Ｓ４４１およびＤ２２Ｓ１０４５遺伝子座のピークを示す電気泳動図を示す。男性ＤＮＡ（１．０ｎｇ）を、２１−ＳＴＲプライマー対混合物（表１）および追加の遺伝子座Ｄ２２Ｓ１０４５、Ｄ２Ｓ４４１およびＤＹＳ３９１を用いて増幅させた。増幅産物を、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３５００ ｘＬ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒで分析した。

【図6】４５１０で標識された（パネルＡ）、４５６３で標識された（パネルＢ）、または４５７４で標識された（パネルＣ）、ＤＹＳ３９１、Ｄ２Ｓ４４１およびＤ２２Ｓ１０４５遺伝子座のピークを示す電気泳動図を示す。および、ＪＯＥで標識された遺伝子座、Ｐｅｎｔａ Ｄ、Ｄ１６Ｓ５３９、Ｄ１８Ｓ５１、Ｄ２Ｓ１３３８およびＣＳＦ１ＰＯのピークを示す電気泳動図を示す。男性ＤＮＡ（１．０ｎｇ）を、２１−ＳＴＲプライマー対混合物（表１）および追加の遺伝子座Ｄ２２Ｓ１０４５、Ｄ２Ｓ４４１およびＤＹＳ３９１を用いて増幅させた。増幅産物を、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３５００ ｘＬ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒで分析した。

【図7】４５１０で標識された（パネルＡ）、４５６３で標識された（パネルＢ）、または４５７４で標識された（パネルＣ）、ＤＹＳ３９１、Ｄ２Ｓ４４１およびＤ２２Ｓ１０４５遺伝子座のピークを示す電気泳動図を示す。男性ＤＮＡ（０．５ｎｇ）を、２１−ＳＴＲプライマー対混合物（表１）および追加の遺伝子座Ｄ２２Ｓ１０４５、Ｄ２Ｓ４４１およびＤＹＳ３９１を用いて増幅させた。増幅産物を、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３５００ｘＬ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒで分析した。

【図8】４５１０で標識された（パネルＡ）、４５６３で標識された（パネルＢ）、または４５７４で標識された（パネルＣ）、ＤＹＳ３９１、Ｄ２Ｓ４４１およびＤ２２Ｓ１０４５遺伝子座のピークを示す電気泳動図を示す。および、ＪＯＥで標識された遺伝子座、Ｐｅｎｔａ Ｄ、Ｄ１６Ｓ５３９、Ｄ１８Ｓ５１、Ｄ２Ｓ１３３８およびＣＳＦ１ＰＯのピークを示す電気泳動図を示す。男性ＤＮＡ（０．５ｎｇ）を、２１−ＳＴＲプライマー対混合物（表１）および追加の遺伝子座Ｄ２２Ｓ１０４５、Ｄ２Ｓ４４１およびＤＹＳ３９１を用いて増幅させた。増幅産物を、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３５００ ｘＬ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒで分析した。

【図9】リガンド３７８０を用いた共焦点像を示す。（ａ）核局在配列（ＨＴ−ＮＬＳ）を含有するＨａｌｏＴａｇ（登録商標）を安定発現しているＵ２ＯＳ細胞を、無洗浄プロトコールで、１００ｎＭ リガンド３７８０で標識し、３％ λ６３３レーザー、ＰＭＴ７１５、ＣＡ８０μｍ、１００ｘを用いて撮像した。（ｂ）ＨＴ−ＮＬＳを安定発現しているＵ２ＯＳ細胞を、迅速標識プロトコールで、１μＭ リガンド３７８０で標識し、３％ λ６３３レーザー、ＰＭＴ６００、ＣＡ２００μｍ、１００ｘを用いて撮像した。（ｃ）融合タンパク質ｐ６５−ＨａｌｏＴａｇ（ｐ６５−ＨＴ）を安定発現しているＵ２ＯＳ細胞を、迅速標識プロトコールで、１μＭ リガンド３７８０で標識し、８％ λ６３３レーザー、ＰＭＴ７７５、ＣＡ８０μｍ、１００ｘを用いて撮像した。（ｄ）Ｕ２ＯＳ細胞を、迅速標識プロトコールで、１μＭ リガンド３７８０で標識し、８％ λ６３３レーザー、ＰＭＴ７７５、ＣＡ２００μｍ、２０ｘを用いて撮像した。各像の左のパネルは、蛍光チャンネルを示し、真ん中のパネルはＤＩＣを示し、右側のパネルは２つを重ね合わせたものを示す。

【図10】リガンド３７８１を用いた共焦点像を示す。（ａ）融合タンパク質ｐ６５−ＨＴを安定発現しているＵ２ＯＳ細胞、および、（ｂ）Ｕ２ＯＳ細胞を、迅速標識プロトコールで、１μＭ リガンド３７８１で標識した。細胞は、１０％ λ５４３レーザー、ＰＭＴ８３０、ＣＡ８０μｍ、８０ｘを用いて撮像した。各像の左のパネルは、蛍光チャンネルを示し、真ん中のパネルはＤＩＣを示し、右側のパネルは２つを重ね合わせたものを示す。

【図11】リガンド３７８２を用いた共焦点像を示す。（ａ）ＨＴ−ＮＬＳを安定発現しているＵ２ＯＳ細胞を、無洗浄プロトコールで、１００ｎＭ リガンド３７８２で標識し、３％ λ６３３レーザー、ＰＭＴ６１５、ＣＡ８０μｍ、１００ｘを用いて撮像した。（ｂ）ＨＴ−ＮＬＳを安定発現しているＵ２ＯＳ細胞を、迅速標識プロトコールで、１μＭ リガンド３７８２で標識し、３％ λ６３３レーザー、ＰＭＴ６００、ＣＡ２００μｍ、１００ｘを用いて撮像した。（ｃ）融合タンパク質ｐ６５−ＨＴを安定発現しているＵ２ＯＳ細胞を、迅速標識プロトコールで、１μＭ リガンド３７８２で標識し、８％ λ６３３レーザー、ＰＭＴ７７５、ＣＡ８０μｍ、１００ｘを用いて撮像した。（ｄ）Ｕ２ＯＳ細胞を、迅速標識プロトコールで、１μＭ リガンド３７８２で標識し、８％ λ６３３レーザー、ＰＭＴ７７５、ＣＡ２００μｍ、２０ｘを用いて撮像した。各像の左のパネルは、蛍光チャンネルを示し、真ん中のパネルはＤＩＣを示し、右側のパネルは２つを重ね合わせたものを示す。

【図12】リガンド３７８３を用いた共焦点像を示す。（ａ）ＨＴ−ＮＬＳを安定して発現しているＵ２ＯＳ細胞を、無洗浄プロトコールで、１００ｎＭ リガンド３７８３で標識し、３％ λ６３３レーザー、ＰＭＴ６１５、ＣＡ８０μｍ、１００ｘを用いて撮像した。（ｂ）ＨＴ−ＮＬＳを安定発現しているＵ２ＯＳ細胞を、迅速標識プロトコールで、１μＭ リガンド３７８３で標識し、３％ λ６３３レーザー、ＰＭＴ６００、ＣＡ２００μｍ、１００ｘを用いて撮像した。（ｃ）融合タンパク質ｐ６５−ＨＴを安定発現しているＵ２ＯＳ細胞を、迅速標識プロトコールで、１μＭ リガンド３７８３で標識し、８％ λ６３３レーザー、ＰＭＴ７５０、ＣＡ８０μｍ、１００ｘを用いて撮像した。（ｄ）Ｕ２ＯＳ細胞を、迅速標識プロトコールで、１μＭ リガンド３７８３で標識し、８％ λ６３３レーザー、ＰＭＴ７７５、ＣＡ２００μｍ、２０ｘを用いて撮像した。各像の左のパネルは、蛍光チャンネルを示し、真ん中のパネルはＤＩＣを示し、右側のパネルは２つを重ね合わせたものを示す。

【図13】リガンド３９０５を用いた共焦点像を示す。（ａ）ＨＴ−ＮＬＳを安定発現しているＵ２ＯＳ細胞を、迅速標識プロトコールで、１μＭ リガンド３９０５で標識し、３％ λ６３３レーザー、ＰＭＴ６００、ＣＡ２００μｍ、２０ｘを用いて撮像した。（ｂ）融合タンパク質ｐ６５−ＨＴを安定発現しているＵ２ＯＳ細胞、および、（ｃ）Ｕ２ＯＳ細胞を、迅速標識プロトコールで、１μＭ リガンド３９０５で標識し、１５％ λ６３３レーザー、ＰＭＴ８００、ＣＡ８０μｍ、２０ｘを用いて撮像した。各像の左のパネルは、蛍光チャンネルを示し、真ん中のパネルはＤＩＣを示し、右側のパネルは２つを重ね合わせたものを示す。

【図14】リガンド３９０６を用いた共焦点像を示す。（ａ）ＨＴ−ＮＬＳを安定発現しているＵ２ＯＳ細胞を、迅速標識プロトコールで、１μＭ リガンド３９０６で標識し、３％ λ６３３レーザー、ＰＭＴ６００、ＣＡ２００μｍ、２０ｘを用いて撮像した。（ｂ）融合タンパク質ｐ６５−ＨＴを安定発現しているＵ２ＯＳ細胞、および、（ｃ）Ｕ２ＯＳ細胞を、迅速標識プロトコールで、１μＭ リガンド３９０６で標識し、１０％ λ６３３レーザー、ＰＭＴ７２０、ＣＡ８０μｍ、２０ｘを用いて撮像した。各像の左のパネルは、蛍光チャンネルを示し、真ん中のパネルはＤＩＣを示し、右側のパネルは２つを重ね合わせたものを示す。

【図15】リガンド３９５４の共焦点像を示す。（ａ）ＨＴ−ＮＬＳを安定発現しているＵ２ＯＳ細胞、および、（ｂ）Ｕ２ＯＳ細胞を、迅速標識プロトコールで、１μＭ リガンド３９５４で標識し、４％ λ６３３レーザー、ＰＭＴ８８０、ＣＡ８０μｍ、２０ｘを用いて撮像した。各像の左のパネルは、蛍光チャンネルを示し、真ん中のパネルはＤＩＣを示し、右側のパネルは２つを重ね合わせたものを示す。

【図16】リガンド４３５６および４３５７の共焦点像を示す。ＨＴ−ＮＬＳを安定発現しているＵ２ＯＳ細胞を、迅速標識プロトコールで、１μＭのリガンド（ａ）４３５６、または（ｂ）４３５７で標識し、１０％ λ６３３レーザー、ＰＭＴ８３０、ＣＡ８０μｍ、３０ｘを用いて撮像した。各像の左のパネルは、蛍光チャンネルを示し、真ん中のパネルはＤＩＣを示し、右側のパネルは２つを重ね合わせたものを示す。

【図17】ＨＴ−ＮＬＳを安定発現しているＵ２ＯＳ細胞でのリガンド３７８０、３７８２および３７８３の標識効率を示す。（ａ）直接的なリガンドシグナル（λ６３３）およびＴＭＲシグナル（λ５３２）を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥ後の蛍光スキャン。レーン１は、５μＭ ＴＭＲ迅速標識（追跡）と共に、洗浄無し標識（パルス）を用いた１００ｎＭリガンドを表し、レーン２は、５μＭ ＴＭＲ迅速標識（追跡）を伴う１μＭ迅速標識（パルス）を表し、レーン３は、５μＭ ＴＭＲ迅速標識（追跡）を伴う５μＭ迅速標識（パルス）を表し、「ＴＭＲ」は、ＴＭＲリガンドのみで標識された細胞を表す。（ｂ）ＴＭＲ単独バンドのパーセントとして、ＴＭＲゲルからのバンド（ＴＭＲシグナル）の定量化を示すグラフ。

【図18】リガンド３７８２存在下でのＵ２ＯＳ細胞およびＣＨＯ細胞の生存能力を示す。グラフは、リガンド３７８２またはＤＭＳＯ担体（対照）と２４時間インキュベーションした後の、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙの結果を示す。各バーは、ｎ＝６ウェル（±ＳＥＭ）を表す。

【図19】ＨａｌｏＴａｇ（登録商標）ＴＭＲリガンドの代替としての、ゲルベース分析における、リガンド３７８２の性能を示す。

【図20】不活性ｐ３８アルファキナーゼに結合するｐ３８アルファキナーゼ蛍光トレーサーＰＢＩ４８３８の略図を示す。

【図21A】ＢＲＥＴを用いてモニターされた、ＮａｎｏＬｕｃ−ｐ３８融合タンパク質発現細胞での、色素トレーサーＰＢＩ４８３８の滴定を示す。さらに、図は、トレーサーとＮａｎｏＬｕｃ−ｐ３８融合物の相互作用を、ＢＩＲＢ７９６で阻害することが出来ることを示す。結合は、溶解細胞中で、ＢＲＥＴを用いてモニターされた。

【図21B】ＢＲＥＴを用いてモニターされた、ＮａｎｏＬｕｃ−ｐ３８融合タンパク質発現細胞での、色素トレーサーＰＢＩ４８３８の滴定を示す。さらに、図は、トレーサーとＮａｎｏＬｕｃ−ｐ３８融合物の相互作用を、ＢＩＲＢ７９６で阻害することが出来ることを示す。結合は、生細胞中で、ＢＲＥＴを用いてモニターされた。

【図22A】蛍光色素トレーサーＰＢＩ４８３８を用いた、生細胞中の、既知の薬物（ＢＩＲＢ７９６）のキナーゼ標的ｐ３８への結合のモニタリングを示す。結合は、ＢＲＥＴならびに、ｐ３８に対して測定されたＥＣ５０値を用いてモニターされた。

【図22B】蛍光色素トレーサーＰＢＩ４８３８を用いた、生細胞中の、既知の薬物（ＢＩＲＢ７９６）のキナーゼ標的ｐ３８への結合のモニタリングを示す。結合は、ＢＲＥＴならびに、ＰＫＣａ（陰性対照）に対して測定されたＥＣ５０値を用いてモニターされた。

【図23】ＨａｌｏＴａｇ（登録商標）リガンドに結合された色素である、ＰＢＩ３７８１へ結合されたＨａｌｏＴａｇ−ＦＫＢＰ１２融合物と、ＮａｎｏＬｕｃ−Ｆｒｂ融合物（ドナー）の間に発生するＢＲＥＴの、ラパマイシン依存性の増加を示す（Ａ）。（Ｂ）は、ＮａｎｏＬｕｃルシフェラーゼおよびＰＢＩ３７８１の発光スペクトル、ならびに、ＰＢＩ３７８１の励起スペクトルを示す。

【図24】色素が結合されたＨａｌｏＴａｇ（登録商標）リガンド（ＰＢＩ３７８１）と、ＢＲＥＴを用いたＮａｎｏＬｕｃ−Ｆｒｂ融合物とＨａｌｏＴａｇ−ＦＫＰｆ１２融合物の間の、ラパマイシン介在相互作用のモニタリングを示す。

【発明を実施するための形態】

【0020】

定義
本明細書において、以下の用語および表現は、示された意味を有する。ラジカル、置換基、および範囲に対して以下に記載される具体的な値は解説の目的のためのみである。それらは他の定義された値、またはラジカルおよび置換基に対して定義された範囲内の他の値を除外しない。

【0021】

基または部分を置換することが出来る場合、「置換された」という用語は、もし、指示される原子の標準の原子価を上回らず、置換によって安定した化合物がもたらされるのであれば、「置換された」を用いた表現中で指示されている基の、一つ以上（たとえば、１、２、３、４、５または６；一部の実施形態においては、１、２または３；および他の実施形態においては、１または２）の水素が、列挙され、指定される基の選択物と置換することができる、または当業者に公知の適切な基（たとえば、以下に列挙される基の一つ以上）と置換することができることを示している。置換される基の適切な置換基としては、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、ハロ、ハロアルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、アリール、ヘテロアリール、複素環、シクロアルキル、アルカノイル、アルコキシカルボニル、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリフルオロメチルチオ、ジフルオロメチル、アセチルアミノ、ニトロ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、カルボキシ、カルボキシアルキル、ケト、チオキソ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アリールスルフィニル、アリールスルホニル、ヘテロアリールスルフィニル、ヘテロアリールスルホニル、ヘテロサイクルスルフィニル、ヘテロサイクルスルホニル、リン酸塩、硫酸塩、ヒドロキシルアミン、ヒドロキシル（アルキル）アミン、およびシアノを挙げることができる。さらに、適切な指定される基としては、たとえば、−Ｘ、−Ｒ、−Ｏ−、−ＯＲ、−ＳＲ、−Ｓ−、−ＮＲ₂、−ＮＲ₃、＝ＮＲ、−ＣＸ₃、−ＣＮ、−ＯＣＮ、−ＳＣＮ、−Ｎ＝Ｃ＝Ｏ、−ＮＣＳ、−ＮＯ、−ＮＯ₂、＝Ｎ₂、−Ｎ₃、ＮＣ（＝Ｏ）Ｒ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲＲ−Ｓ（＝Ｏ）₂Ｏ−、−Ｓ（＝Ｏ）₂ＯＨ、−Ｓ（＝Ｏ）₂Ｒ、−ＯＳ（＝Ｏ）₂ＯＲ、−Ｓ（＝Ｏ）₂ＮＲ、−Ｓ（＝Ｏ）Ｒ、−ＯＰ（＝Ｏ）Ｏ₂ＲＲ、−Ｐ（＝Ｏ）Ｏ₂ＲＲ、−Ｐ（＝Ｏ）（Ｏ−）₂、−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）₂、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｘ、−Ｃ（Ｓ）Ｒ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｓ）ＯＲ、−Ｃ（Ｏ）ＳＲ、−Ｃ（Ｓ）ＳＲ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲＲ、−Ｃ（Ｓ）ＮＲＲ、−Ｃ（ＮＲ）ＮＲＲが挙げられ、ここで、各Ｘは、独立して、ハロゲン（「ハロ」）：Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩであり、各Ｒは、独立して、Ｈ、アルキル、アリール、ヘテロアリール、複素環、保護基またはプロドラッグ部分である。当業者なら容易に理解できることであるが、置換基がケト（＝Ｏ）またはチオキソ（＝Ｓ）等である場合、置換された原子上の２つの水素原子が置き換えられる。

【0022】

本明細書において、「アルキル」という用語は、たとえば１〜２０の炭素原子、多くの場合は１〜１２、または１〜約６炭素原子を有する、分枝している炭化水素、分枝していない炭化水素、または、環状の炭化水素を指す。例としては、メチル、エチル、１−プロピル、２−プロピル、1−ブチル、２−メチル−１−プロピル、２−ブチル、２−メチル−２−プロピル（ｔ−ブチル）、１−ペンチル、２−ペンチル、３−ペンチル、２−メチル−２−ブチル、３−メチル−２−ブチル、３−メチル−１−ブチル、２−メチル−１−ブチル、１−ヘキシル、２−ヘキシル、３−ヘキシル、２−メチル−２−ペンチル、３−メチル−２−ペンチル、４−メチル−２−ペンチル、３−メチル−３−ペンチル、２−メチル−３−ペンチル、２，３−ジメチル−２−ブチル、３，３−ジメチル−２−ブチル、ヘキシル、オクチル、デシル、ドデシル等が挙げられるが、これらに限定されない。アルキルは、置換されても、置換されなくてもよい。たとえば、置換アルキル基は、以下に記述されるハロアルキル基であっても良い。アルキルはまた、任意選択的に、部分的に、または全体的に不飽和であってもよい。したがって、アルキル基の列記としては、アルケニル基およびアルキニル基の両方が挙げられる。アルキルは、前述および上に挙げた例のように、一価の炭化水素ラジカルであってもよく、または、その用途の状況に従い、二価の炭化水素ラジカル（たとえば、アルキレン）であってもよい。さらに、アルキル基は、中断された（ｉｎｔｅｒｒｕｐｔｅｄ）という用語について以下に記述するように、任意選択的に中断されてもよい。

【0023】

「アルケニル」という用語は、分枝している、または分枝していない、部分的に不飽和の一価ラジカルの炭化水素鎖を指す（すなわち、炭素−炭素、ｓｐ²二重結合）。一つの実施形態において、アルケニル基は、２〜１０炭素原子、または２〜６炭素原子を有しても良い。別の実施形態において、アルケニル基は、２〜４炭素原子を有する。例としては、エチレンまたはビニル、アリル、シクロペンテニル、５−ヘキセニル等が挙げられるが、これらに限定されない。アルケニルは、置換されていても、置換されていなくてもよい。

【0024】

「アルキニル」という用語は、完全な不飽和の点を有する、分枝している、または分枝していない一価ラジカルの炭化水素鎖を指す（すなわち、炭素−炭素、ｓｐ三重結合）。一つの実施形態において、アルキニル基は、２〜１０炭素原子、または２〜６炭素原子を有してもよい。別の実施形態において、アルキニル基は、２〜４炭素原子を有しても良い。この用語の典型的な例としては、たとえば、エチニル、１−プロピニル、２−プロピニル、１−ブチニル、２−ブチニル、３−ブチニル、１−ヘキシニル、２−ヘキシニル、３−ヘキシニル、１−オクチニル等の基がある。アルキニルは、置換されていても、置換されていなくてもよい。

【0025】

「シクロアルキル」または「カルボシル（ｃａｒｂｏｃｙｌｅ）」または「炭素環式化合物の」という用語は、単独の環または複数の縮合環を有する３〜約１０炭素原子の環式のアルキル基を指す。そのようなシクロアルキル基としては、例えば、単独の環構造としてシクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロオクチル等が挙げられ、複数の環構造としては、アダマンタニル等が挙げられる。シクロアルキルは、置換されていても、置換されていなくてもよい。シクロアルキル基は、一価であっても二価であっても良く、アルキル基についての上述のように、任意選択的に置換されていてもよい。シクロアルキル基は、任意選択的に、一つ以上の不飽和の部位を含んでいてもよく、たとえば、シクロアルキル基は、一つ以上の炭素−炭素二重結合（たとえば、シクロヘキセン、１，３−シクロヘキサジエン、１，４−シクロヘキサジエン等）を含んでも良い。シクロアルキル基は、単環として３〜８炭素原子を有する、二環として７〜１２炭素原子を有する、および、多環として約２０炭素原子までを有する、飽和または部分的に不飽和な環を意味する、炭素環であってもよい。単環炭素環は、通常は、３〜６環原子を有し、さらにより典型的には、５〜６環原子を有する。二環炭素環は、７〜１２環原子（たとえば、ビシクロ［４，５］、［５，５］、［５，６］、または［６，６］システムとして配置される）を有し、または、９〜１０環原子（［５，６］または［６，６］システムとして配置される）を有する。炭素環の例としては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、１−シクロペント−１−エニル、１−シクロペント−２−エニル、１−シクロペント−３−エニル、シクロヘキシル、１−シクロヘックス−１−エニル、１−シクロヘックス−２−エニル、または１−シクロヘックス−３−エニルが挙げられる。炭素環は、アルキル基についての上述のように、任意選択的に置換されていても良い。

【0026】

「アルコキシ」という用語は、アルキル−Ｏ−基を指し、ここで、アルキルは、本明細書に定義される。一つの実施形態において、アルコキシ基としては、たとえば、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、イソ−プロポキシ、ｎ−ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｎ−ペントキシ、ｎ−ヘキシルオキシ、１，２−ジメチルブトキシ等が挙げられる。アルコキシは、置換されていても、置換されていなくてもよい。

【0027】

「アリール」という用語は、元となる芳香族環系の単独の炭素原子から一つの水素原子を除去することにより得られる芳香族炭化水素基を指す。ラジカルは、元となる環系の、飽和炭素原子または不飽和炭素原子であってもよい。アリール基は、６〜１８炭素原子、６〜１４炭素原子、または６〜１０炭素原子を有しても良い。アリール基は、単環（たとえば、フェニル）または多縮合環（融合）環を有しても良く、ここで、少なくとも一つの環は芳香族（たとえば、ナフチル、ジヒドロフェナントレニル、フルオレニルまたはアンスリル）である。典型的なアリール基としては、ベンゼン、ナフタレン、アンスラセン、ビフェニル等から得られるラジカルが挙げられるが、これらに限定されない。アリールは、アルキル基についての上述のように、置換されていなくても、任意選択的に置換されていてもよい。たとえば、アリール基は、様々な置換アリール（たとえば、ペンタフルオロフェニルまたはパラ−トリフルオロメチルフェニル等）を提供するために、一つ以上の置換基（上述のもの）で置換されていてもよい。

【0028】

「ハロ」という用語は、フルオロ、クロロ、ブロモ、およびヨード基を指す。同様に、「ハロゲン」という用語は、フッ素、塩素、臭素、ヨードを指す。

【0029】

「ヘテロアリール」という用語は、本明細書において、１、２、または３つの芳香族環を含有し、および芳香族環中に少なくとも１つの窒素、酸素または硫黄原子を含有する単環、二環、または三環系として定義され、上記で「置換された」の定義で記述されるように、たとえば１つ以上、特に１〜３の置換基で置換されても、置換されなくとも良い。典型的なヘテロアリール基は、１つ以上のヘテロ原子に加えて、２〜１４の炭素原子を含有する。ヘテロアリール基の例としては、２Ｈ−ピロリル、３Ｈ−インドリル、４Ｈ−キノリジニル、アクリジニル、ベンゾ［ｂ］チエニル、ベンゾチアゾリル、β−カルボリニル、カルバゾリル、クロメニル、シノリニル、ジベンゾ［ｂ，ｄ］フラニル、フラザニル、フリル、イミダゾリル、イミジゾリル、インダゾリル、インドリシニル、インドリル、イソベンゾフラニル、イソインドリル、イソキノリル、イソチアゾリル、イソキサゾリル、ナフチリジニル、オキサゾリル、ピリミジニル、フェナントリジニル、フェナントロリニル、フェナルサジニル、フェナジニル、フェノチアジニル、フェノキサチイニル、フェノキサジニル、フタラジニル、プテリジニル、プリニル、ピラニル、ピラジニル、ピラゾリル、ピリダジニル、ピリジル、ピリミジニル、ピリミジニル、ピロリル、キナゾリニル、キノリル、キノキサリニル、チアジアゾリル、チアンスレニル、チアゾリル、チエニル、トリアゾリル、テトラゾリル、およびキサンテニルが挙げられるが、これらに限定されない。一つの実施形態において、「ヘテロアリール」という用語は、非過酸化酸素、硫黄およびＮ（Ｚ）（ここで、Ｚは、無いか、またはＨ、Ｏ、アルキル、アリールもしくは（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキルアリールである）から独立して選択されるヘテロ原子を１、２、３または４つ、ならびに炭素を含有する５〜６環原子を含有する単環芳香族環を意味する。別の実施形態においてヘテロアリールは、それらから由来する約８〜１０環原子のオルト−縮合二環複素環を意味し、特に、ベンズ−誘導体または、それらへプロピレン、トリメチレンもしくはテトラメチレンジラジカルを融合することにより誘導されるものを意味する。

【0030】

「複素環」という用語は、酸素、窒素および硫黄基から選択されるヘテロ原子を少なくとも１つ含有する、飽和または部分的に不飽和の環系を意味し、環のサイズは、３〜約１２原子、または合計で約７〜約１４の環原子を含む二環系であり、および、「置換された」という用語のもと、本明細書に定義される基の一つ以上で任意選択的に置換されている。複素環は、一つ以上のヘテロ原子を含有する単環、二環、または三環基であっても良い。複素環基はまた、環に付着するオキソ基（＝Ｏ）またはチオキソ（＝Ｓ）基を含んでも良い。複素環基の非限定的な例示としては、１，３−ジヒドロベンゾフラン、１，３−ジオキソラン、１，４−ジオキサン、１，４−ジチアン、２Ｈ−ピラン、２−ピラゾリン、４Ｈ−ピラン、クロマニル、イミダゾリジニル、イミダゾリニル、インドリニル、イソクロマニル、イソインドリニル、モルホリン、ピペラジニル、ピペリジン、ピペリジル、ピラゾリジン、ピラゾリジニル、ピラゾリニル、ピロリジン、ピロリン、キヌクリジン、およびチオモルホリンが挙げられる。

【0031】

「複素環」という用語は、例示を目的とし、非限定的に、Paquette, Leo A.; Principles of Modern Heterocyclic Chemistry (W.A. Benjamin, New York, 1968)の特に１、３、４、６、７および９章、The Chemistry of Heterocyclic Compounds, A Series of Monographs" (John Wiley & Sons, New York, 1950〜現在)の特に１３、１４、１６、１９および２８号、ならびに、J. Am. Chem. Soc. 1960, 82, 5566に記述される複素環のモノラジカルを挙げることができる。一つの実施形態において、「複素環」は、本明細書に定義される「炭素環」を含み、ここで、１つ以上（たとえば、１、２、３または４）の炭素原子は、ヘテロ原子（たとえば、Ｏ、ＮまたはＳ）と置換されている。

【0032】

複素環は、例示を目的とし、非限定的に、ジヒドロピリジル、テトラヒドロピリジル（ピペリジル）、チアゾリル、テトラヒドロチオフェニル、硫黄酸化テトラヒドロチオフェニル、ピリミジニル、フラニル、チエニル、ピロリル、ピラゾリル、ピペリジニル、４−ピペリドニル、ピロリジニル、２−ピロリドニル、ピロリニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロキノリニル、テトラヒドロイソキノリニル、デカヒドロキノリニル、オクタヒドロイソキノリニル、アゾシニル、トリアジニル、６Ｈ−１，２，５−チアジアジニル、２Ｈ，６Ｈ−１，５，２−ジチアジニル、チエニル、チアントレニル、ピラニル、イソベンゾフラニル、クロメニル、キサンテニル、フェノキサチニル、２Ｈ−ピロリル、イソチアゾリル、イソキサゾリル、ピラジニル、ピリダジニル、インドリジニル、イソインドリル、３Ｈ−インドリル、１Ｈ−インダゾリ、プリニル、４Ｈ−キノリジニル、フタラジニル、ナフチリジニル、キノキサリニル、キナゾリニル、シノリニル、プテリジニル、カルバゾリル、β−カルボリニル、フェナンチリジニル、アクリジニル、ピリミジニル、フェナントロリニル、フェナジニル、フェノチアジニル、フラザニル、フェノキサジニル、イソクロマニル、クロマニル、イミダゾリジニル、イミダゾリニル、ピラゾリジニル、ピラゾリニル、ピペラジニル、インドリニル、イソインドリニル、キヌクリジニル、モルホリニル、オキサゾリジニル、ベンゾトリアゾリル、ベンズイソキサゾリル、オキシンドリル、ベンゾキサゾリニル、イサチノイルおよびビス−テトラヒドロフラニルを含む。

【0033】

例示を目的とし、非限定的に、炭素結合複素環は、ピリジンの２、３、４、５もしくは６位で結合されるか、ピリダジンの３、４、５もしくは６位で結合されるか、ピリミジンの２、４、５もしくは６位で結合されるか、ピラジンの２、３、５もしくは６位で結合されるか、フラン、テトラヒドロフラン、チオフラン、チオフェン、ピロールもしくはテトラヒドロピロールの２、３、４もしくは５位で結合されるか、オキサゾール、イミダゾールもしくはチアゾールの２、４もしくは５位で結合されるか、イソキサゾール、ピラゾールもしくはイソチアゾールの３、４もしくは５位で結合されるか、アジリジンの２もしくは３位で結合されるか、アゼチジンの２、３もしくは４位で結合されるか、キノリンの２、３、４、５、６、７もしくは８位で結合されるか、または、イソキノリンの１、３、４、５、６、７もしくは８位で結合される。炭素結合複素環としては、２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル、５−ピリジル、６−ピリジル、３−ピリダジニル、４−ピリダジニル、５−ピリダジニル、６−ピリダジニル、２−ピリミジニル、４−ピリミジニル、５−ピリミジニル、６−ピリミジニル、２−ピラジニル、３−ピラジニル、５−ピラジニル、６−ピラジニル、２−チアゾリル、４−チアゾリル、５−チアゾリル等が挙げられる。

【0034】

例示を目的として、非限定的に、窒素結合複素環は、アジリジン、アゼチジン、ピロール、ピロリジン、２−ピロリン、３−ピロリン、イミダゾール、イミダゾリジン、２−イミダゾリン、３−イミダゾリン、ピラゾール、ピラゾリン、２−ピラゾリン、３−ピラゾリン、ピペリジン、ピペラジン、インドール、インドリン、１Ｈ−インダゾールの１位に結合されるか、イソインドールもしくはイソインドリンの２位に結合されるか、モルホリンの４位に結合されるか、および、カルバゾールもしくはβ−カルボリンの９位に結合されてもよい。一つの実施形態において、窒素結合複素環としては、１−アジリジル、１−アゼテジル、１−ピロリル、１−イミダゾリル、１−ピラゾリルおよび１−ピペリジニルが挙げられる。

【0035】

「アミノ」という用語は、−ＮＨ₂を指す。アミノ基は、「置換された」という用語に対して本明細書に定義されるように、任意選択的に置換されても良く、たとえば、アミノ基は、−ＮＲ₂であっても良く、ここで、Ｒは、置換の定義で列記された基である。たとえば、−ＮＲ₂基は、「アルキルアミノ」を含むことが出来、ここで、少なくとも１つのＲは、アルキルであり、２番目のＲは、アルキルもしくは水素であり、および／または、「アシルアミノ」（−Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝Ｏ）Ｒ）を含み、ここで、各Ｒは、独立して、水素、アルキル、アルカリルまたはアリールである。

【0036】

「アルカリル」という用語は、少なくとも１つのアルキル基で置換されたアリール基を指し、それらは、アルキル基またはアリール基のいずれかのラジカルを介して、置換基を共に形成する。アルカリルのアルカリ基は、直鎖または分枝鎖いずれかの約１〜８炭素原子を含むことが出来る。典型的なアルカリル基としては、ベンジル、２−フェニルエチル、３−フェニルプロピル、４−フェニルブチ、５−フェニルペンチル、６−フェニルヘキシル、７−フェニルヘプチル、８−フェニルオクチル、それらの分枝アルキル鎖誘導体、およびそれらのナフタレン版が挙げられる。アルカリルは、アルキル基に対して上述されたように、任意選択的に置換されてもよい。

【0037】

「中断された（ｉｎｔｅｒｒｕｐｔｅｄ）」という用語は、示されている各原子の標準原子価を超えず、中断により、安定した化合物がもたらされる場合、別の基が、「中断された」という用語の表現で言及されている特定の炭素鎖の２つの隣接する炭素原子（およびそれらに付着される水素原子（たとえば、メチル（ＣＨ₃）、メチレン（ＣＨ₂）、またはメチン（ＣＨ）））の間に挿入されることを意味する。炭素鎖を中断することができる適切な基としては、たとえば、一つ以上の非過酸化オキシ（−Ｏ−）、チオ（−Ｓ−）、イミノ（−Ｎ（Ｈ）−）、メチレンジオキシ（−ＯＣＨ₂Ｏ−）、カルボニル（−Ｃ（＝Ｏ）−）、カルボキシ（−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−）、カルボニルジオキシ（−ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ−）、カルボキシラト（−ＯＣ（＝Ｏ）−）、イミン（Ｃ＝ＮＨ）、スルフィニル（ＳＯ）およびスルホニル（ＳＯ₂）が挙げられる。アルキル基は、前述の適切な基の一つ以上（たとえば、１、２、３、４、５または約６）で中断されることができる。中断部位はまた、アルキル基の炭素原子と当該アルキル基に付着される炭素原子の間であっても良い。

【0038】

一つ以上の置換基を含有する上述の任意の基に関して、もちろん、そのような基には、立体的に実現不可能な、および／または、合成不可能な任意の置換または置換パターンが含まれないことが理解される。さらに、本発明の化合物は、これらの化合物の置換により発生するすべての立体異性体を含有する。本発明の一部の化合物は、非対称の置換炭素原子を含有しても良く、および、光学的に活性で、またはラセミ体で単離されてもよいことが理解される。当分野において、たとえば、ラセミ体の分割または光学的に活性な開始材料から合成することにより、光学的に活性な形態を調製する方法が公知である。すべてのキラル体、ジアステレオマー体、ラセミ体、およびすべての構造幾何異性体は、本発明の一部である。加えて、本発明の一部の化合物は、回転異性体として存在しても良い。一部の例において、これらの回転異性体は、分離することができる。回転異性体およびそれらの混合物は両方とも、本発明により企図されるものである。

【0039】

一つの異性体が、別のと比較して優れた特性または活性を示し得る。必要であれば、キラルカラムを用いたＨＰＬＣによって、または、Tucker et al., J. Med. Chem., 37: 2437 (1994)に記載されるような樟脳塩化物等の分割剤を用いた分割により、ラセミ物質を分離させることができる。キラル化合物はまた、キラル触媒またはキラルリガンド（たとえば、Huffman et al., J. Org. Chem., 60: 1590 (1995)）を用いて直接合成しても良い。

【0040】

「有効量」とは、一般に、所望される効果を得る量を意味し、たとえば、反応をもたらすのに十分な量である。

【0041】

本明細書において、「接触すること」とは、触れること、接触すること、または接近もしくはごく近傍に近づく振る舞いを指し、分子レベルで、たとえば、化学的反応または物理的変化を、たとえば溶液中、細胞中または他の反応混合物中で、引き起こすことを含む。

【0042】

「反応基」という用語は、カルボン酸の活性化エステル、アミン、アルコール、ハロゲン化スルホニル、メルカプタン、ボロナート、ホスホルアミダイト、イソシアネート、ハロアセタミド、アルデヒド、アジド、アシルニトリル、光活性化基またはハロゲン化アルキルを指す。

【0043】

「結合物質」という用語は、たとえば、表面（たとえば、ビーズ、固形支持体、樹脂粒子またはアッセイプレート）、生物学的分子（たとえば、タンパク質、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド（ＤＮＡおよびＲＮＡを含む）、酵素基質、抗体、ナノボディ、ポリペプチド、ポリペプチドベースの毒素、アミノ酸、脂質、炭水化物、ハプテン、小分子、薬剤、薬剤化合物、イオン錯化剤（たとえば、金属キレート剤）、微粒子、合成ポリマーもしくは天然ポリマー、細胞、ウイルス、他の蛍光分子または表面）、または他の対象の部分（たとえば、クロロアルカンまたはシアノベンゾチアゾール）等の、共有結合性物質を指す。

【0044】

「トレーサー」は、本発明の色素が、上記で定義されるように生物学的分子に、おそらくはリンカーを介して結合されている、結合物質の一種である。

【0045】

「痕跡の無いリンカー（ｔｒａｃｅｌｅｓｓ ｌｉｎｋｅｒ）」または「自己犠牲リンカー（ｓｅｌｆ−ｉｍｍｏｌａｔｉｖｅ ｌｉｎｋｅｒ）」という用語は、リンカーから結合物質が切り離されると、非結合色素を放出するために、色素から当該リンカーが自発的に切り離される、リンカーを指す。痕跡の無いリンカーの例としては、以下が挙げられる：

【化9】

当業者には理解されることだが、リンカーの長さおよび置換のさらなる改変が可能である。

【0046】

色素
本発明は、以下の式（Ｉａ）および式（Ｉｂ）：

【化10】

の化合物を提供し、式中、
Ｒ¹およびＲ¹¹は、独立して、ＨまたはＣ_1-4アルキル、Ｌ−ＲもしくはＬ−Ｃ_Sであり、
Ｌは、１〜１６の非水素原子を有する、直鎖もしくは分枝状、環状もしくは複素環式の飽和または不飽和である共有結合であり、当該結合が、エステル、酸、アミン、アミド、アルコール、エーテル、チオエーテルもしくはハロゲン基のうちの組み合わせを含有するものであるか、または、一重、二重、三重もしくは芳香族の炭素−炭素結合であり、
Ｒは、反応基であり、
Ｃ_Sは、結合物質であり、
Ｒ²、Ｒ⁵、Ｒ¹²およびＲ¹⁵は、独立して、Ｈ、アルキル、アリール、ヘテロアリール、ＣＯ₂Ｈ、ＳＯ₃Ｈ、Ｌ−ＣＯ₂Ｈ、Ｌ−ＳＯ₃Ｈ、Ｌ−ＲまたはＬ−Ｃ_Sであり、
Ｒ²⁰、Ｒ²¹、Ｒ²²、Ｒ²³、Ｒ²⁴、Ｒ²⁵およびＲ²⁶は、独立して、ＨまたはＣ_1-6アルキルであるか、または、Ｒ²⁰およびＲ²¹、Ｒ²¹およびＲ²²、Ｒ²²およびＲ²³、Ｒ²⁴およびＲ²⁵、Ｒ²⁵およびＲ²⁶、ならびにＲ²⁶およびＲ²³の一つ以上が、共にアリール環、ヘテロアリール環、炭素環または複素環を形成し、
Ｒ¹およびＲ²、ならびに／または、Ｒ¹¹およびＲ¹²は共に炭素環、複素環、アリール環、またはヘテロアリール環を形成してもよく、
Ｒ^6-10は、独立して、Ｈ、ハロ、ＯＨ、アルキル、アリール、ヘテロアリール、ＣＯ₂Ｈ、ＳＯ₃Ｈ、Ｌ−ＣＯ₂Ｈ、Ｌ−ＳＯ₃Ｈ、Ｌ−ＲまたはＬ−Ｃ_Sであり、
各Ｘは、独立して、ＣＨＲ²³、Ｏ、ＳまたはＮＲ³⁰であり、および、
Ｒ³⁰は、Ｈ、Ｃ_1-4アルキルまたは−Ｃ（Ｏ）Ｃ_1-4アルキルである。

【0047】

一部の実施形態において、Ｒ¹およびＲ²、またはＲ¹¹およびＲ¹²により形成された環は、Ｃ、Ｎ、ＯおよびＳから選択される３〜１０の原子であってもよい。他の実施形態において、環は、５〜７原子を有する。ある実施形態において、環原子はすべて炭素である。これらの環は、さらに、不飽和の要素を含有しても良い。ある実施形態において、これらの環は、アリール環またはヘテロアリール環である。

【0048】

式（Ｉｂ）において、Ｒ²およびＲ⁵は、アリール環またはヘテロアリール環を共に形成しても良い。好適には、環は、フェニルまたはチオフェニルである。一部の実施形態において、環は置換されている。

【0049】

好適には、ＸはＣＨ₂である。Ｒ¹¹は、好適にはＣ_1-4アルキルである。一部の実施形態において、Ｒ¹¹は、メチルまたはエチルである。他の実施形態において、Ｒ¹¹およびＲ¹²は、５〜７員炭素環を形成する。好適には、環は非置換の６員環である。好適には、Ｒ²およびＲ¹²は、Ｈ、ＣｌまたはＯＭｅである。Ｒ⁵およびＲ¹⁵は、Ｈであっても良い。

【0050】

本発明はまた、以下の式（ＩＩａ）および式（ＩＩｂ）：

【化11】

（ＩＩａ） （ＩＩｂ）
の化合物を提供し、式中、
Ｒ¹およびＲ¹¹は、独立して、ＨまたはＣ_1-4アルキル、Ｌ−ＲもしくはＬ−Ｃ_Sであり、
Ｌは、１〜１６の非水素原子を有する、直鎖もしくは分枝状、環状もしくは複素環式の飽和または不飽和である共有結合であり、当該結合が、エステル、酸、アミン、アミド、アルコール、エーテル、チオエーテルもしくはハロゲン基のうちの組み合わせを含有するものであるか、または、一重、二重、三重もしくは芳香族の炭素−炭素結合であり、
Ｒは、反応基であり、
Ｃ_Sは、結合物質であり、
Ｒ²、Ｒ³、Ｒ⁴、Ｒ⁵、Ｒ¹²、Ｒ¹³、Ｒ¹⁴およびＲ¹⁵は、独立して、Ｈ、アルキル、アリール、ヘテロアリール、ＣＯ₂Ｈ、ＳＯ₃Ｈ、Ｌ−ＣＯ₂Ｈ、Ｌ−ＳＯ₃Ｈ、Ｌ−ＲまたはＬ−Ｃ_Sであり、
Ｒ²⁰、Ｒ²¹、Ｒ²²、Ｒ²³、Ｒ²⁴、Ｒ²⁵およびＲ²⁶は、独立して、ＨまたはＣ_1-6アルキルであるか、または、Ｒ²⁰およびＲ²¹、Ｒ²¹およびＲ²²、Ｒ²²およびＲ²³、Ｒ²⁴およびＲ²⁵、Ｒ²⁵およびＲ²⁶、ならびにＲ²⁶およびＲ²³の一つ以上が、アリール環、ヘテロアリール環、炭素環または複素環を共に形成し、
Ｒ¹およびＲ²、ならびに／または、Ｒ¹¹およびＲ¹²は、炭素環、複素環、アリール環、またはヘテロアリール環を共に形成してもよく、
Ｒ^6-10は、独立して、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＯＨ、アルキル、アリール、ヘテロアリール、ＣＯ₂Ｈ、ＳＯ₃Ｈ、Ｌ−ＣＯ₂Ｈ、Ｌ−ＳＯ₃Ｈ、Ｌ−ＲまたはＬ−Ｃ_Sであり、
各Ｘは、独立して、ＣＨＲ²³、Ｏ、ＳまたはＮＲ³⁰であり、および、
Ｒ³⁰は、Ｈ、Ｃ_1-4アルキルまたは、−Ｃ（Ｏ）Ｃ_1-4アルキルである。

【0051】

一部の実施形態において、Ｒ¹およびＲ²またはＲ¹¹およびＲ¹²により形成される環は、Ｃ、Ｎ、ＯおよびＳから選択される３〜１０原子であっても良い。他の実施形態において、環は５〜７原子を有する。ある実施形態において、環原子はすべて炭素である。
これらの環は、さらに、不飽和の要素を含有しても良い。ある実施形態において、環は、アリール環またはヘテロアリール環であってもよい。

【0052】

式（ＩＩａ）において、Ｒ²およびＲ³、Ｒ⁴およびＲ⁵、Ｒ¹²およびＲ¹³、またはＲ¹⁴およびＲ¹⁵のうち一つ以上がまた、アリール環またはヘテロアリール環と共に連結されていても良い。式（ＩＩｂ）において、Ｒ⁴およびＲ⁵または、Ｒ¹⁴およびＲ¹⁵のうちの一つまたは両方が、アリール環またはヘテロアリール環を共に形成しても良い。好適には、環は、フェニルまたはチオフェニルである。一部の実施形態において、環は置換されている。

【0053】

好適には、ＸはＣＨ₂である。Ｒ¹¹は、好適にはＣ_1-4アルキルである。一部の実施形態において、Ｒ¹¹は、メチルまたはエチルである。他の実施形態において、Ｒ¹¹およびＲ¹²は、共に５〜７員炭素環を形成する。好適には、環は非置換の６員環である。好適には、Ｒ²、Ｒ⁵、Ｒ¹²およびＲ¹⁵は、Ｈである。

【0054】

本発明はまた、以下の式（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）および（ＩＩＩｃ）：

【化12】

の化合物を提供し、式中、
Ｒ¹¹は、独立して、ＨまたはＣ_1-4アルキル、Ｌ−ＲもしくはＬ−Ｃ_Sであり、
Ｌは、１〜１６の非水素原子を有する、直鎖もしくは分枝状、環状もしくは複素環式の飽和または不飽和である共有結合であり、当該結合が、エステル、酸、アミン、アミド、アルコール、エーテル、チオエーテルもしくはハロゲン基のうちの組み合わせを含有するものであるか、または、一重、二重、三重もしくは芳香族の炭素−炭素結合であり、
Ｒは、反応基であり、
Ｃ_Sは、結合物質であり、
Ｒ²およびＲ¹⁶は、独立して、Ｈ、アルキル、アリール、ヘテロアリール、ＣＯ₂Ｈ、ＳＯ₃Ｈ、Ｌ−ＣＯ₂Ｈ、Ｌ−ＳＯ₃Ｈ、Ｌ−ＲまたはＬ−Ｃ_Sであり、
Ｒ³およびＲ⁴は、Ｈ、アルキル、Ｌ−Ｒ、Ｌ−Ｃ_S、Ｌ−ＣＯ₂Ｈ、Ｌ−ＳＯ₃Ｈであるか、または、炭素環、アリール環、ヘテロアリール環もしくは複素環を共に形成し、 あるいは、Ｒ²およびＲ³、ならびに、独立して、Ｒ⁴およびＲ¹⁶は、炭素環、複素環、アリール環、またはヘテロアリール環を共に形成し、
Ｒ⁵、Ｒ¹²、Ｒ¹³、Ｒ¹⁴およびＲ¹⁵は、独立して、Ｈ、アルキル、アリール、ヘテロアリール、ＣＯ₂Ｈ、ＳＯ₃Ｈ、Ｌ−ＣＯ₂Ｈ、Ｌ−ＳＯ₃Ｈ、Ｌ−ＲまたはＬ−Ｃ_Sであり、
Ｒ²⁰、Ｒ²¹、Ｒ²²およびＲ²³は、独立して、ＨまたはＣ_1-6アルキルであるか、または、Ｒ²⁰およびＲ²¹、Ｒ²¹およびＲ²²、Ｒ²²およびＲ²³の一つ以上が、アリール環、ヘテロアリール環、炭素環または複素環を共に形成し、
Ｒ¹¹およびＲ¹²は、炭素環、複素環、アリール環、またはヘテロアリール環を共に形成してもよく、
Ｒ^6-10は、独立して、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＯＨ、アルキル、アリール、ヘテロアリール、ＣＯ₂Ｈ、ＳＯ₃Ｈ、Ｌ−ＣＯ₂Ｈ、Ｌ−ＳＯ₃Ｈ、Ｌ−ＲまたはＬ−Ｃ_Sであり、
Ｘは、ＣＨＲ²³、Ｏ、ＳまたはＮＲ³⁰であり、および、
Ｒ³⁰は、Ｈ、Ｃ_1-4アルキルまたは、−Ｃ（Ｏ）Ｃ_1-4アルキルである。

【0055】

式（ＩＩＩａ）および（ＩＩＩｂ）において、Ｒ¹⁶およびＲ⁵は、炭素環、複素環、アリール環またはヘテロアリール環を共に形成しても良い。式（ＩＩＩｃ）において、Ｒ¹⁴およびＲ⁵、ならびに／または、Ｒ²およびＲ¹³は、炭素環、複素環、アリール環またはヘテロアリール環を共に形成しても良い。好適には、環は、フェニルまたはチオフェニルである。一部の実施形態において、環は、置換されている。

【0056】

一部の実施形態において、Ｒ¹¹およびＲ¹²で形成される環は、Ｃ、Ｎ、ＯおよびＳから選択される３〜１０原子であっても良い。他の実施形態において、環は、５〜７原子を有する。ある実施形態において、環原子はすべて炭素である。これらの環は、さらに、不飽和の要素を含有しても良い。ある実施形態において、環は、アリールまたはヘテロアリールである。

【0057】

本発明はまた、以下の式（ＩＶ）：

【化13】

（ＩＶ）
に記載の化合物を提供し、式中、
Ｒ²およびＲ¹⁶は、独立して、Ｈ、アルキル、アリール、ヘテロアリール、ＣＯ₂Ｈ、ＳＯ₃Ｈ、Ｌ−ＣＯ₂Ｈ、Ｌ−ＳＯ₃Ｈ、Ｌ−ＲまたはＬ−Ｃ_Sであってもよく、
Ｌは、１〜１６の非水素原子を有する、直鎖もしくは分枝状、環状もしくは複素環式の飽和または不飽和である共有結合であり、当該結合が、エステル、酸、アミン、アミド、アルコール、エーテル、チオエーテルもしくはハロゲン基のうちの組み合わせを含有するものであるか、または、一重、二重、三重もしくは芳香族の炭素−炭素結合であり、
Ｒは、反応基であり、
Ｃ_Sは、結合物質であり、
Ｒ³およびＲ⁴は、Ｈまたはアルキルであるか、または、炭素環、アリール環、ヘテロアリール環もしくは複素環を共に形成し、
あるいは、Ｒ²およびＲ³、ならびに、独立して、Ｒ⁴およびＲ¹⁶は、炭素環、複素環、アリール環、またはヘテロアリール環を共に形成し、
Ｒ⁵およびＲ¹⁵は、独立して、Ｈ、アルキル、アリール、ヘテロアリール、ＣＯ₂Ｈ、ＳＯ₃Ｈ、Ｌ−ＣＯ₂Ｈ、Ｌ−ＳＯ₃Ｈ、Ｌ−ＲまたはＬ−Ｃ_Sであり、
Ｒ²²およびＲ²³は、独立して、ＨまたはＣ_1-6アルキルであるか、または、アリール環、ヘテロアリール環、炭素環もしくは複素環を共に形成し、および、
Ｒ^6-10は、独立して、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＯＨ、アルキル、アリール、ヘテロアリール、ＣＯ₂Ｈ、ＳＯ₃Ｈ、Ｌ−ＣＯ₂Ｈ、Ｌ−ＳＯ₃Ｈ、Ｌ−ＲまたはＬ−Ｃ_Sである。

【0058】

本発明はさらに、以下の式（Ｖ）：

【化14】

（Ｖ）
に記載の化合物を提供し、式中、
Ｒ²およびＲ¹⁶は、独立して、Ｈ、アルキル、アリール、ヘテロアリール、ＣＯ₂Ｈ、ＳＯ₃Ｈ、Ｌ−ＣＯ₂Ｈ、Ｌ−ＳＯ₃Ｈ、Ｌ−ＲまたはＬ−Ｃ_Sであってもよく、
Ｌは、１〜１６の非水素原子を有する、直鎖もしくは分枝状、環状もしくは複素環式の飽和または不飽和である共有結合であり、当該結合が、エステル、酸、アミン、アミド、アルコール、エーテル、チオエーテルもしくはハロゲン基のうちの組み合わせを含有するものであるか、または、一重、二重、三重もしくは芳香族の炭素−炭素結合であり、
Ｒは、反応基であり、
Ｃ_Sは、結合物質であり、
Ｒ³およびＲ⁴は、Ｈまたはアルキルであるか、または、炭素環、複素環、アリール環もしくはヘテロアリール環を共に形成し、
あるいは、Ｒ²およびＲ³、ならびに、独立して、Ｒ⁴およびＲ¹⁶は、炭素環、複素環、アリール環、またはヘテロアリール環を共に形成してもよく、
Ｒ⁵およびＲ¹⁵は、独立して、Ｈ、アルキル、アリール、ヘテロアリール、ＣＯ₂Ｈ、ＳＯ₃Ｈ、Ｌ−ＣＯ₂Ｈ、Ｌ−ＳＯ₃Ｈ、Ｌ−ＲまたはＬ−Ｃ_Sであり、
Ｒ²⁰およびＲ²¹は、独立して、ＨまたはＣ_1-6アルキルであるか、または、アリール環、ヘテロアリール環、炭素環もしくは複素環を共に形成し、および、
Ｒ^6-10は、独立して、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＯＨ、アルキル、アリール、ヘテロアリール、ＣＯ₂Ｈ、ＳＯ₃Ｈ、Ｌ−ＣＯ₂Ｈ、Ｌ−ＳＯ₃Ｈ、Ｌ−ＲまたはＬ−Ｃ_Sである。

【0059】

本発明はさらに、以下の式（ＶＩ）：

【化15】

（ＶＩ）
に記載の化合物を提供し、式中、
Ｒ⁵およびＲ¹⁵は、独立して、Ｈ、アルキル、アリール、ヘテロアリール、ＣＯ₂Ｈ、ＳＯ₃Ｈ、Ｌ−ＣＯ₂Ｈ、Ｌ−ＳＯ₃Ｈ、Ｌ−ＲまたはＬ−Ｃ_Sであり、
Ｌは、１〜１６の非水素原子を有する、直鎖もしくは分枝状、環状もしくは複素環式の飽和または不飽和である共有結合であり、当該結合が、エステル、酸、アミン、アミド、アルコール、エーテル、チオエーテルもしくはハロゲン基のうちの組み合わせを含有するものであるか、または、一重、二重、三重もしくは芳香族の炭素−炭素結合であり、
Ｒは、反応基であり、
Ｃ_Sは、結合物質であり、
Ｒ²²、Ｒ²³、Ｒ²⁶およびＲ²⁷は、独立して、ＨまたはＣ_1-6アルキルであるか、または、Ｒ²²およびＲ²³およびＲ²⁶およびＲ²⁷のうち一つ以上が、アリール環、ヘテロアリール環、炭素環、または複素環を共に形成し、および、
Ｒ^6-10は、独立して、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＯＨ、アルキル、アリール、ヘテロアリール、ＣＯ₂Ｈ、ＳＯ₃Ｈ、Ｌ−ＣＯ₂Ｈ、Ｌ−ＳＯ₃Ｈ、Ｌ−ＲまたはＬ−Ｃ_Sである。

【0060】

本発明はさらに、以下の式（ＶＩＩ）：

【化16】

（ＶＩＩ）
に記載の化合物を提供し、式中、
Ｒ⁵およびＲ¹⁵は、独立して、Ｈ、アルキル、アリール、ヘテロアリール、ＣＯ₂Ｈ、ＳＯ₃Ｈ、Ｌ−ＣＯ₂Ｈ、Ｌ−ＳＯ₃Ｈ、Ｌ−ＲまたはＬ−Ｃ_Sであり、
Ｌは、１〜１６の非水素原子を有する、直鎖もしくは分枝状、環状もしくは複素環式の飽和または不飽和である共有結合であり、当該結合が、エステル、酸、アミン、アミド、アルコール、エーテル、チオエーテルもしくはハロゲン基のうちの組み合わせを含有するものであるか、または、一重、二重、三重もしくは芳香族の炭素−炭素結合であり、
Ｒは、反応基であり、
Ｃ_Sは、結合物質であり、
Ｒ²⁰、Ｒ²¹、Ｒ²⁴およびＲ²⁵は、独立して、ＨまたはＣ_1-6アルキルであるか、または、Ｒ²⁰およびＲ²¹およびＲ²⁴およびＲ²⁵のうち一つ以上が、アリール環、ヘテロアリール環、炭素環、または複素環を共に形成し、および、
Ｒ^6-10は、独立して、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＯＨ、アルキル、アリール、ヘテロアリール、ＣＯ₂Ｈ、ＳＯ₃Ｈ、Ｌ−ＣＯ₂Ｈ、Ｌ−ＳＯ₃Ｈ、Ｌ−ＲまたはＬ−Ｃ_Sである。

【0061】

以下の記載は、適切な場合には、式（Ｉ）〜（ＶＩＩ）に適用される。好適には、Ｒ²、Ｒ⁵およびＲ¹⁵は、Ｈである。Ｒ³およびＲ⁴は、好適にはＣ_1-4アルキルである。一部の実施形態において、Ｒ³およびＲ⁴は、メチルまたはエチルである。Ｒ³およびＲ⁴は、たとえばピペラジン等の複素環を共に形成しても良い。他の実施形態において、Ｒ²およびＲ³、ならびに／または、Ｒ⁴およびＲ¹⁶は、５〜７員炭素環を共に形成する。環は、好適には非置換の６員環である。

【0062】

Ｒ¹⁰は、好適にはＨ、Ｆ、Ｃｌ、ＣＯ₂ＨまたはＳＯ₃Ｈである。ある実施形態において、Ｒ¹⁰は、Ｈである。Ｒ⁶およびＲ⁹は、好適にはＨまたはハロである。ある実施形態において、Ｒ⁶およびＲ⁹は、ＣｌまたはＦのいずれかであっても良い。

【0063】

好適には、Ｒ⁷およびＲ⁸のうちの一つは、−Ｌ−Ｒ、−Ｌ−ＣＯ₂Ｈ、または−Ｌ−Ｃ_Sであり、他は、Ｈ、ＣｌまたはＦである。

【0064】

Ｌは、好適には、−ＣＯ−、ＳＣＨ₂ＣＯ−、または−ＳＯ₂−である。Ｌはまた、ＰＥＧ部分を含んでも良い。他の実施形態において、Ｌは、「痕跡の無い」または「自己犠牲」リンカーである。

【0065】

好適には、Ｒは、

【化17】

【化18】

または−Ｃｌであり、ＳＥが最も好ましい。

【0066】

Ｃ_Sは、好適には、式ＮＨＣＨ₂ＣＨ₂（ＯＣＨ₂ＣＨ₂）_n（ＣＨ₂）₆Ｃｌのクロロアルカン（ｎは、２〜６）、ヌクレオシド（たとえば、

【化19】

（アリルアミノｄＵ））、アリルアミノｄＵを介して好適に付着したオリゴヌクレオチド、またはシアノベンゾチアゾールである。好適には、シアノベンゾチアゾールは、

【化20】

であり、式中、Ｚは、ＯまたはＮＨである。

【0067】

好適な化合物としては、図１〜３に示されるものが挙げられる。当業者であれば、列１および行１の間にある任意の組み合わせが実現可能であることを理解するであろう。化合物番号を示してあるものは合成されている。

【0068】

他の固有な特性の中で、７員環を含有する本発明の化合物は、既存の本分野の化合物と比較して、色素の励起と発光において明らかな赤方偏移を示す。ある実施形態において、本発明の化合物は、最大で約６００ｎｍ〜約７３０ｎｍの発光を有する。ある実施形態において、本発明の化合物は、最大で約５７５ｎｍ〜約６７５ｎｍの励起を有する。

【0069】

文献中には本明細書に記述されている様式で縮合７員環を蛍光色素に組み込む記述は無いが、２つの公表文献（Zachariasse, et al., J. Photochem. Photobiol. A, 1997, 105, 373-383; Saha and Samanta, J. Phys. Chem. A 2002, 106, 4763-4771）において、６員炭素環および７員炭素環で色素蛍光に関連する窒素を含有することの比較が記述されている。これらの文献報告中に記載される色素では、環サイズが増加するにつれ、溶媒極性が増加しつつ量子収量が劇的に低下するが、本発明の色素についてはそのようなことは発生しない。

【0070】

また、ローザミン（ｒｏｓａｍｉｎｅ）誘導体において非縮合環サイズの影響に関する議論がある（Lu and Burgess, J. Org. Chem., 2008, 73, 8711-8718）。発光波長の偏移は、５員環から６員環へと環サイズが変化しても確認されなかった。極性溶媒中での高い量子収量を維持しながら、縮合７員環を含有する色素の、６員環のそれと比較した、発光の赤方偏移はまったく予期しないものであった。

【0071】

色素の合成
本明細書に記述される化合物は、様々な方法を用いて合成および結合されることが出来る。たとえば、Beija, et al., Chem. Soc. Rev., 2009, 38, 2410-2433を参照のこと。
例示的な合成を以下に要約する。
色素前駆体の合成

【化21】

【0072】

中間体３の合成は、テトラロン１のオキシムの形成、次いでＢｅｃｋｍａｎｎ転位により化合物２を得ることができる。次いで、Ｌａｃｔａｍ還元により化合物３を得る。

【化22】

【0073】

この環状アミン３のアルキル化、次いで脱メチル化により化合物４を得る。

【化23】

【0074】

ブロモクロロプロパンとの窒素のアルキル化、次いで熱誘導性環化により、三環アミンを得る。このアミンの脱メチル化により、化合物５を得る。５−メトキシテトラロンの使用により、異性体アミノフェノールを得る。
対称性色素（Ｓｙｍｍｅｔｒｉｃａｌ Ｄｙｅ）の合成

【化24】

【0075】

対称性ローダミンの合成は、化合物３、無水物６およびＺｎＣｌ₂を高熱で共に融合させる溶融処理により得られる。無水物６が不斉である場合、精製により両方の異性体色素が得られ、通常、それらは等量である。多くの場合、脱カルボキシル化ローザミンの一部はまた、化合物Ｉａの熱誘導性脱カルボキシル化から単離される。
非対称色素の合成

【化25】

【0076】

非対称ローダミン色素の合成は、２つの処理ステップで行うことができる。最初のステップでは、アミノフェノール３を、酸性触媒の非存在下で無水物６と反応させ、ケトン付加物７を得る。上述のように、もし６が比対称性である場合、７の２つの異性体は、この段階で分離することができる。

【化26】

【0077】

次いで、化合物７を別のアミノフェノール（またはアミノナフトール）と反応させ、式ＩＩＩａの色素を得る。この反応の典型的なやり方は、触媒トリメチルシリルポリホスフェートと、８０℃で、ＤＭＦで行われる。
ハロゲン化色素の結合

【化27】

【0078】

テトラハロゲン化ローダミン（フルオロまたはクロロのいずれか）を、ＤＭＦ中で、メルカプト酢酸で処理することにより官能基化した。このカルボン酸を、次いで、スクシジミジルエステル（ｓｕｃｃｉｄｉｍｉｄｙｌ ｅｓｔｅｒ）（ＳＥ）として活性化し、生体分子に結合させる。低級環上のカルボン酸を伴うローダミンを、ＳＥとして直接活性化し、生体分子に結合させた。

【0079】

当業者には理解できることだが、本明細書の化学式の化合物を合成する代替法が、当業者には明らかである。さらに、様々な合成ステップが、代替的な順序で実施されてもよく、または所望の化合物を得るために実施されてもよい。本明細書に記述される化合物の合成に有用な保護基の方法論（保護および脱保護）および合成化学変化が当分野に公知であり、たとえば、R. Larock, Comprehensive Organic Transformations, VCH Publishers (1989)； T.W. Greene and P.G.M. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 2d. Ed., John Wiley and Sons (1991)； L. Fieser and M. Fieser, Fieser and Fieser’s Reagents for Organic Synthesis, John Wiley and Sons (1994)；および、L. Paquette, ed., Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis, John Wiley and Sons (1995)、ならびにそれらの続版に記述されるものが挙げられる。

【0080】

中間体
本発明はさらに、式（ＶＩＩＩ）および（ＩＸ）：

【化28】

の化合物を提供し、式中、
Ｒ¹¹は、ＨまたはＣ_1-4アルキル、Ｌ−ＲもしくはＬ−Ｃ_Sであり、
Ｌは、１〜１６の非水素原子を有する、直鎖もしくは分枝状、環状もしくは複素環式の飽和または不飽和である共有結合であり、当該結合が、エステル、酸、アミン、アミド、アルコール、エーテル、チオエーテルもしくはハロゲン基のうちの組み合わせを含有するものであるか、または、一重、二重、三重もしくは芳香族の炭素−炭素結合であり、
Ｒは、反応基であり、
Ｃ_Sは、結合物質であり、
Ｒ¹²およびＲ¹⁵は、独立して、Ｈ、アルキル、アリール、ＣＯ₂Ｈ、ＳＯ₃Ｈ、Ｌ−ＣＯ₂Ｈ、Ｌ−ＳＯ₃Ｈ、Ｌ−ＲまたはＬ−Ｃ_Sであり、
Ｒ²⁰、Ｒ²¹、Ｒ²²およびＲ²³は、独立して、ＨまたはＣ_1-6アルキルであるか、または、Ｒ²⁰およびＲ²¹、Ｒ²¹およびＲ²²、ならびにＲ²²およびＲ²³のうち一つ以上が、縮合アリール環を共に形成し、
Ｒ¹¹およびＲ¹²は、任意選択的に置換された環において、共に連結されても良く、 Ｒ^6-10は、独立して、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＯＨ、アルキル、アリール、ＣＯ₂Ｈ、ＳＯ₃Ｈ、Ｌ−ＣＯ₂Ｈ、Ｌ−ＳＯ₃Ｈ、Ｌ−ＲまたはＬ−Ｃ_Sであり、
Ｘは、ＣＨＲ²³、Ｏ、ＳまたはＮＲ³⁰であり、および、
Ｒ³⁰は、Ｈ、Ｃ_1-4アルキルまたは−Ｃ（Ｏ）Ｃ_1-4アルキルである。

【0081】

一部の実施形態において、Ｒ¹¹およびＲ¹²により形成される環は、Ｃ、Ｎ、ＯおよびＳから選択される３〜１０原子であっても良い。これらの環は、さらに、不飽和の要素を含有しても良い。

【0082】

これらの化合物は、式（Ｉ）〜（ＶＩＩ）の化合物の合成に有用である。

【0083】

標識化生体分子
簡潔に述べると、本発明の色素は、物質組成の検出を可能にさせる標識剤として用いられても良い。本発明の色素は、限定されないが、生体分子（たとえば、ポリペプチド、ポリペプチドベースの毒素、アミノ酸、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド（ＤＮＡおよびＲＮＡを含む）、脂質、炭水化物および酵素基質）を含む広範囲の分子の標識に用いることができる。さらに、当該化合物は、ハプテン、小分子、薬剤、薬剤化合物、イオン錯化剤（たとえば金属キレート物質）、微粒子、合成ポリマーまたは天然ポリマー、細胞、ウイルス、他の蛍光物質または表面を標識するために用いられても良い。得られた標識分子は、複合体またはトレーサーと呼称されてもよい。

【0084】

一部の態様において、色素を、ヌクレオシド、ヌクレオチドまたはポリヌクレオチドと結合することができる。本発明の色素は、たとえばホスホルアミダイト（ｐｈｏｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ）、活性化エステルまたは反応性プラチナ錯体を介する等の当業者公知の任意の方法でヌクレオシド、ヌクレオチドまたはポリヌクレオチドと結合されてもよい。

【0085】

他の態様において、本発明の色素は、アミノ酸、アミノ酸類似体、またはポリペプチドと結合するために用いられることができる。他の態様において、本発明の色素は、小分子（たとえば、薬剤または薬剤化合物）と結合するために用いられることができる。一部の態様において、結合小分子は、蛍光トレーサーとして用いることができる。

【0086】

一部の実施形態において、標識生体分子は、プロ蛍光性化合物（ｐｒｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ）であってもよい。プロ蛍光性化合物は、関連色素と比較して減少された蛍光を有し、対象の酵素に対する基質を含有するものである。対象の酵素に作用されると、プロ蛍光性化合物由来の蛍光色素が放出され、それにより蛍光が発せられる。「痕跡の無い」または「自己犠牲」リンカーをまた、色素と酵素基質の間に含めることができる。

【0087】

例示的な標識生体分子として、式（ＸＩａ）、式（ＸＩｂ）および（ＸＩｃ）：

【化29】

の化合物が挙げられ、式中、
Ｒ¹¹は、ＨまたはＣ_1-6アルキルであり、
Ｗは、痕跡の無いリンカーまたは直接結合であり、
Ｒは、反応基であり、
Ｃ_Sは、酵素基質であり、
Ｒ²、Ｒ³、Ｒ⁴ Ｒ⁵、Ｒ¹¹、Ｒ１２、Ｒ¹³、Ｒ¹⁴、Ｒ¹⁵およびＲ¹⁶は、独立して、Ｈ、アルキル、アリール、ＣＯ₂Ｈ、ＳＯ₃Ｈ、Ｌ−Ｒ、Ｌ−Ｃ_S、Ｌ−ＣＯ₂Ｈ、またはＬ−ＳＯ₃Ｈであり、
Ｒ¹¹およびＲ¹²は、アリール環、ヘテロアリール環、炭素環または複素環に共に連結されても良く、
Ｒ^6-9は、独立して、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＯＨ、アルキル、アリール、ＣＯ₂Ｈ、ＳＯ₃Ｈ、Ｌ−ＣＯ₂Ｈ、またはＬ−ＳＯ₃Ｈであり、および、
Ｘは、ＣＨ₂、Ｏ、ＳまたはＮＨである。

【0088】

一部の実施形態において、酵素基質は、Ｚ−ＤＥＶＤである。別の実施形態において、酵素基質はＺ−ＡＡＦ−ベンジルである。

【0089】

式（ＸＩａ）によるプロ蛍光化合物としては、以下：

【化30】

および、

【化31】

が挙げられる。

【0090】

他の実施形態において、本発明は、他のプロ蛍光性生体分子を提供する。一部の実施形態において、本発明の色素は、生体分子を介してクエンチャーに付着される。色素の発光スペクトルで吸収する任意のクエンチャーを用いることができる。当業者であれば、そのようなクエンチャーを特定することができるであろう。適切なクエンチャーとしては、Ｂｌａｃｋ Ｈｏｌｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒｓ（商標）およびＱＸＬ（商標）クエンチャー（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓより入手可能）が挙げられる。

【0091】

クエンチャーを含有する例示的なプロ蛍光性化合物としては、以下が挙げられる：ＭＭＰ−３基質として、クエンチャー−ＧＡＢＡ−Ｐｒｏ−Ｃｈａ−Ａｂｕ−Ｓｍｃ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｄａｂ（色素）−Ａｌａ−Ｌｙｓ−ＮＨ２（アミノ酸鎖の切断により、クエンチャーが色素から分離され、蛍光が発せられる）。一つの実施形態において、色素は、低級環のカルボン酸を介してアミノ酸鎖に結合されることができる。色素はまた、他の位置でアミノ酸鎖に付着されることもできる。

【0092】

使用法
本発明の色素は、広範囲のアプリケーションを目的とする共有結合標識生体分子に有用なツールを提供する。標識により、たとえばタンパク質、糖タンパク質、核酸および脂質等の生体分子ならびに小分子（たとえば、薬剤もしくは薬剤物質、無機化学薬品またはそれらの任意の組み合わせ等）に関与する相互作用の研究が可能となる。相互作用は、セルなしの生物系、細胞系、またはｉｎ ｖｉｖｏで研究されてもよい。様々な相互作用の分析は多くの場合、科学研究および開発、薬物デザイン、スクリーニングおよび最適化、系統発生分類、個人、親および法鑑定の遺伝子型決定、環境研究、疾患状態の診断、予後診断および／または治療の重要な部分を担う。

【0093】

本発明の一部の態様において、本発明の複合体は、試料を標識し、当該試料を同定または定量できるようにするために用いられる。たとえば、そのような複合体は、標的生物検体に対するアッセイの一部として添加されてもよく、または、生物学的液体もしくは非生物学的液体中の検出可能なトレーサー要素として添加されても良い。

【0094】

試料は、生物学的材料（たとえば、固形材料（有機または無機）からの洗浄液、細胞培養が為された培地、細胞溶解物、評価のために細胞が播種された緩衝液、または生理学的源（たとえば、血液、血漿、血清、尿等））から直接採取されても良い。試料が細胞を含有する場合、当該細胞は、任意選択的に、単一細胞（微生物を含む）、または２次元もしくは３次元で他の細胞に関連した多細胞（多細胞生物、胚、組織、生検、線維、バイオフィルム等を含む）である。試料が細胞を含有する場合、当該細胞は、溶解されていてもよく（たとえば、細胞溶解物）、または細胞全体であっても良い。

【0095】

あるいは、試料は固形であり、任意選択的に、スメア、またはスクレープ、またはろ過により液体または蒸気から除去された残余物である。本発明の一つの態様において、試料は、生理学的液体（たとえば尿、脳脊髄液、血液、リンパ液、組織ホモジネート、間質液、細胞抽出物、粘液、唾液、痰、糞便、生理学的な分泌物または他の同様の液体等）の分離物または未濾過物を含む、生物学的液体から得られる。あるいは、試料は、たとえば土壌、水、または空気等の環境的源から、またはたとえば廃棄物流、水源、供給ラインもしくは製造ロットから取り出された等の工業的源から得られる。

【0096】

他の実施形態において、試料は、固形状もしくは半固形状基質の上または内に存在する。本発明の一つの態様において、基質は膜である。他の態様において、基質は、たとえば核酸またはタンパク質を分離および特徴付けるために用いられる電気泳動ゲル、または電気泳動ゲルから膜へとトランスファーすることにより調製されるブロットである。他の態様において、基質はシリコンチップまたはガラススライドであり、対象の検体はアレイ中で、そのチップ上またはスライド上に固定されている（たとえば、試料は、マイクロアレイ中でタンパク質または核酸ポリマーを含有している）。さらに他の態様において、基質はマイクロウェルプレートまたはマイクロ流体チップであり、試料は、自動化された方法、典型的には、たとえば薬剤スクリーニング等のハイスループットスクリーニングの様々な方法により、分析される。

【0097】

色素複合体は通常、検出可能な光学的反応を生じさせるために選択された条件下で、上述の複合体と対象の試料とを結合させることによって利用される。次いで、試料は、光学的反応を引き起こすために選択された波長で照らされる。典型的には、試料の具体的な特性は、光学的反応と、標準反応または予期される反応との比較により測定される。

【0098】

検出可能な光学的反応とは、観察または機器を使用してのいずれかで検出することができる光学的なシグナルの発生または変化を意味する。通常、検出可能な反応は、蛍光の強度、励起波長もしくは発光波長分布、蛍光の存続期間、蛍光偏光またはそれらの組み合わせの変化等の、蛍光の変化である。標準または予測される反応と比較した標識の程度および／または位置は、試料が所与の特性を有しているかどうか、およびそれがどの程度であるかを示唆している。本発明の一部の色素は、ほとんど蛍光発光を示さないが、発色団色素としてまだ有用である。そのような発色団は、ＦＲＥＴ応用においてエネルギーアクセプターとして有用であり、または単純に、試料もしくは試料の一部に所望の色を与えるのに有用である。

【0099】

生物学的応用を目的として、色素複合体は通常、当分野に良く知られている方法に従い調製される水性溶液、ほぼ水性の溶液、または水性混和性の溶液において用いられる。色素化合物の正確な濃度は、実験条件および所望される結果に依存するが、典型的には、約１ナノモル〜１ミリモルかそれ以上の範囲である。最適濃度は、最小のバックグラウンドの蛍光で、満足な結果が得られるまで、体系的に変化させることにより決定されてもよい。

【0100】

色素複合体は、生物学的成分を含有する試料を標識するために用いられても良い。試料は、成分（生細胞、細胞抽出物、細胞溶解物、細菌、ウイルス、細胞小器官およびそれらの混合物を含む）の異種混合物、または単一成分または同種成分集団（たとえば、天然アミノ酸もしくは合成アミノ酸、核酸もしくは炭水化物ポリマー、または脂質膜複合物）を含有しても良い。色素は多くの場合、使用濃度範囲内で、生細胞および他の生物学的成分に対して非毒性である。

【0101】

色素複合体は、色素複合体と対象の試料成分の間の接触を促進するように、試料と混合されてもよい。典型的には、色素複合体または色素複合体を含有する溶液は、単純に、試料に添加される。本発明のある色素（たとえば、１つ以上のスルホン酸部分で置換されているもの）は、生物細胞の膜にあまり浸透しないが、いったん生細胞の中に入ると、多くの場合、その中に良く留まることが出来る。細胞膜の透過性処置（たとえば、エレクトロポレーション、ショック処置または高濃度細胞外ＡＴＰ）を用いて、選択された色素複合体を細胞内に導入してもよい。あるいは、選択された色素複合体を、たとえば加圧マイクロインジェクション、スクレープローディング（ｓｃｒａｐｅ ｌｏａｄｉｎｇ）、パッチクランプ法、またはファゴサイトーシス等により、物理的に細胞内に挿入することもできる。

【0102】

脂肪族アミンまたはヒドラジン残基を包含する色素は、細胞内にマイクロインジェクションされてもよく、たとえばホルムアルデヒドまたはグルタルアルデヒド等のアルデヒド固定剤により細胞内でそれらの位置を固定することができる。この性質により、たとえばニューロントレース等の細胞内用途にそれら色素を活用することができる。

【0103】

脂溶性の置換基（たとえば、リン脂質）を有する色素は、たとえば、膜構造に対するプローブとしての利用のために、またはリポソーム、リポタンパク質、フィルム、プラスチック、脂溶性ミクロスフィアまたは類似の材料への組み込みのために、またはトレースのために、非共有結合的に脂質アセンブリへと組み込まれても良い。脂溶性色素は、膜構造の蛍光プローブとして有用である。

【0104】

化学反応性色素化合物は、上述の色素複合体を形成するために、様々な材料上対応する官能基に、共有結合的に付着してもよい。細胞表面上、細胞膜内、たとえば細胞小器官等の細胞内分画、または細胞質内の反応部位を標識するために色素化合物を用いて、それらの存在、量、近接性、活性または試料内のそれらの空間的および時間的分布を測定することができる。同様に光反応性の色素を用いて、生物細胞の外膜の成分を光標識しても良く、または細胞に対する光固定性極性トレーサーとして用いても良い

【0105】

一部の実施形態において、クロロアルカン標識色素を、ＨａｌｏＴａｇ（登録商標）と共に用いて、対象のタンパク質とＨａｌｏＴａｇ（登録商標）タンパク質の間に融合タンパク質を生成させることにより、対象タンパク質を検出してもよい。一般的に、これらの融合タンパク質は、ＨａｌｏＴａｇ（登録商標）融合構築物から細胞により発現され、融合タンパク質は、クロロアルカン標識色素を用いることにより検出される。このことにより、タンパク質発現を検出でき、またはタンパク質発現の経時的変化、タンパク質の局在と移動を測定することができる。さらに、蛍光ラベルを用いて、これらのタンパク質をゲル中で検出することができる。当該色素はまた、たとえばクチナーゼ、ジヒドロ葉酸還元酵素／トリメトプリムＳＮＡＰタグ、ＣｌｉｐＴａｇ、アルキルシトシントランスフェラーゼ（米国特許出願第２０１２／０２３７９６１号（本明細書に参照により援用される）を参照のこと）、およびアシル担体タンパク質（米国特許出願第２０１０／０１７３３８４号（本明細書に参照により援用される）を参照のこと）等の他のオルトゴナルな標識系で用いても良い。さらに、ＨａｌｏＴａｇはまた、たとえばＨｓｕｉｎｇｅｎ環化（クリック化学）、ヒドラゾンおよびオキシム形成ならびにシュタウディンガーライゲーション等の他の標識作用に対してオルトゴナルである。

【0106】

任意選択的に、試料は、残余分、過剰分もしくは結合しなかった分の色素化合物または色素複合体を除去するために、標識の後に洗浄される。試料は任意選択的に、標識の過程で一つ以上の他の溶液（洗浄溶液、透過および／または固定溶液、ならびに追加の検出試薬を含有する溶液を含む）と混合される。追加の検出試薬とは、一般的に、特定の細胞成分、細胞内基質または細胞状態の存在によって、当分野に一般に知られている方法に従い、検出可能な反応を生み出すものである。追加の検出試薬が、本発明の色素化合物のスペクトル特性とは異なる産物を有する、またはそのような産物を生成するものであった場合、マルチカラーの応用が可能となる。このことは、追加の検出試薬が、標識色素スペクトル特性と検出可能な程度にはっきりと異なるスペクトル特性を有する色素または色素複合体である場合に、とりわけ有益である。

【0107】

色素複合体は、たとえば、顕微鏡検査法および免疫蛍光アッセイにおける抗体複合体の使用、または核酸ハイブリダイゼーションアッセイのためのヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチド複合体の使用、核酸増幅反応、および核酸配列解析（たとえば、米国特許第５，３３２，６６６号、第５，１７１，５３４号および第４，９９７，９２８号ならびに国際公開第９４／０５６８８号を参照のこと）等の当分野に公知の方法に従い用いられる。本発明の複合的な独立系色素の色素複合体は、マルチカラー用途の実用性を備えている。

【0108】

標識の後、または標識している間の任意のときに、検出可能な光学的反応を生み出すために選択された光の波長で試料を照射し、光学的反応を検出する方法を用いて観察する。本発明の色素化合物の照射に有用な機器としては、限定されないが、携帯紫外線ランプ、水銀アークランプ、キセノンランプ、レーザーおよびレーザーダイオードが挙げられる。これらの照射源は、任意選択的にレーザースキャナー、蛍光マイクロプレートリーダー、標準もしくはミニ蛍光光度計、またはクロマトグラフィー検出器に統合される。

【0109】

光学的反応は、任意選択的に、目視検査または以下の任意のデバイスを用いて検出される：ＣＣＤカメラ、ビデオカメラ、写真用フィルム、レーザースキャニングデバイス、蛍光光度計、フォトダイオード、量子カウンター、落斜蛍光顕微鏡、走査型顕微鏡、フローサイトメーター、蛍光マイクロプレートリーダー、またはたとえば光電子増倍管等のシグナル増幅装置。試料がフローサイトメーターを用いて検査される場合、試料の検査には、蛍光反応に従い、任意選択的に試料の一部をソーティングすることが含まれる。

【0110】

使用法の例示
ｉ．核酸ポリマーの検出
一つの実施形態において、本発明の色素オリゴヌクレオチド複合体は、核酸ポリマーを含有する、または含有すると考えられる試料と混合され、色素オリゴヌクレオチド複合体（たとえば、プローブまたはプライマー）と試料の混合物を、複合体中のオリゴヌクレオチドと試料中の核酸ポリマーとが十分に混合される時間、インキュベートし、核酸ハイブリッド（複合物）（すなわち、プローブ）を形成させ、または核酸合成（すなわち、プライマー）を開始させ、それを検出することが出来る。標識分子の特徴（存在、位置、強度、励起スペクトルおよび発光スペクトル、蛍光極性、蛍光発光期間、ならびに他の蛍光シグナルの物理的特性）を用いて、試料の性状または部分の検出、識別、ソート、定量、配列解析および／または分析を行うことができる。本発明の色素複合体は、任意選択的に、異なるスペクトル特性を有する同一クラスの色素を含む、一つ以上の追加の試薬（たとえば、検出可能な程度に異なる蛍光試薬）と併せて用いられる。

【0111】

一般に、色素複合体は、試料および使用目的と合う水溶液または水性混和溶液中での色素複合体の溶解により、使用の調製がなされる。生物学的試料に対しては、細胞形態または細胞生理機能を乱すことは最小限にすることが望ましく、溶液はそれに基づいて選択される。

【0112】

標識溶液は、色素複合体を水性溶媒（たとえば、水、緩衝液（たとえば、緩衝生理食塩水。好ましくは一部の生存識別用途のために、リン酸塩が含まれていないもの）、トリス（ヒドロキシメチル）−アミノメタン（ＴＲＩＳ）緩衝液（好ましくはＥＤＴＡを含有する）、または水混和性有機溶媒（たとえばジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）等）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、または低級アルコール（たとえば、メタノールまたはエタノール））に直接、溶解することにより作製される。色素複合体は、通常、標識溶液に用いられるものよりも約１００倍高い濃度で、前もって有機溶媒（たとえば、１００％ＤＭＳＯ）に溶解されており、次いで、色素複合体が有効量で存在するように、水または緩衝液等の水性溶液で、１倍以上に希釈される。

【0113】

細胞性試料のための標識溶液は一般的に、０．１ｎＭ超、５０μＭ未満の色素濃度であり、より典型的には、１ｎＭ超、１０μＭ未満（たとえば、０．５〜５μＭ等）である。電気泳動ゲルに対する標識溶液は、一般的に、０．１μＭ超、１０μＭ未満の色素濃度であり、より典型的には約０．５〜２μＭである。同様のことが、核酸と混合される前のゲルへの色素添加にも当てはまる。溶液中の遊離核酸の検出および定量に対する標識溶液は、一般的に、０．１μＭ〜２μＭの濃度を有している。標識溶液の最適濃度および組成は、試料の性状（物理的、生物学的、生化学的および生理学的特性を含む）、色素−試料相互作用の性状（核酸部位への色素の移転率を含む）、および実施される分析の性状によって決定され、ならびに、標準法に従い、決定することができる。

【0114】

試料中の核酸は、ＤＮＡもしくはＲＮＡ、またはそれらの混合物もしくはハイブリッドであっても良い。いずれのＤＮＡも任意選択的に一重、二重、三重または四重らせんＤＮＡであり、いずれのＲＮＡも任意選択的に一重（ｓｓ）または二重（ｄｓ）らせんである。核酸は、天然ポリマー（起源が生物学的なもの）または合成ポリマー（人工的に改変または調製されたもの）であっても良い。核酸ポリマー（たとえば、少なくとも８塩基または塩基対を含有するもの）は、核酸断片、オリゴヌクレオチドまたは、２次元もしくは３次元構造を伴うより大きな核酸ポリマーとして存在しても良い。核酸は、任意選択的に、たとえば染色体等のように、凝縮された状態で存在する。核酸ポリマーは、任意選択的に一つ以上の改変塩基を含有し、または非共有結合的にもしくは共有結合的に付着されている標識に結合し、または非共有結合的にもしくは共有結合的に付着されている標識を含有する。たとえば、改変塩基は、自然発生の改変塩基（たとえば、ｔＲＮＡのΨ（プソイドウリジン）、５−メチルシトシン、６−メチルアミノプリン、６−ジメチルアミノプリン、１−メチルグアニン、２−メチルアミノ−６−ヒドロキシプリン、２−ジメチルアミノ−６−ヒドロキシプリン、５−アミノ−ＤＵ、イソＣ、イソＧ、または他の公知の微量塩基（たとえば、Davidson, The Biochemistry Of The Nucleic Acids (1976)を参照のこと））であってもよく、またはたとえばモルホリン誘導体化リン酸塩（ＡｎｔｉＶｉｒａｌｓ， Ｉｎｃ．， Ｃｏｒｖａｌｌｉｓ， Ｏｒｅｇｏｎ）等の独特のリンカー、またはたとえばＮ−（２−アミノエチル）グリシン単位（Wittung et al., Nature, 368:561 (1994)）等のペプチド核酸を含有するために合成的に改変されているか、または、脂肪族アミン、カルボン酸、アルコール、チオールまたはヒドラジンである単一反応性官能基（１０炭素未満）を含有するために合成的に改変されているか、または、蛍光標識もしくは他のハプテン（たとえば、イノシン、ブロモデオキシウリジン、ヨードデオキシウリジン、ビオチン、ジゴキシゲニン、２，４−ジニトロフェニル等（当該標識は元々ヌクレオチドに付着されている（たとえば、ＣＨＲＯＭＡＴＩＤＥ（商標）標識ヌクレオチド、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ， Ｅｕｇｅｎｅ， Ｏｒｅｇｏｎ）か、核酸に非共有結合的に付着しているリガンド、または核酸ポリマーの３´末端もしくは５´末端に位置している）を含有するために合成的に改変されている。主に改変塩基および結合を含有している核酸ポリマーに対する色素の感度は、結合状態との干渉により減少し得る。一部の実施形態において、色素は、ある色素：塩基対比で、非特異的ヌクレアーゼ活性を阻害するが、制限エンドヌクレアーゼ活性は阻害しない可能性がある。

【0115】

核酸を含有する試料は、任意選択的に、生物学的構造（すなわち、生物体または生物体の個別の単位）、または溶液（生物学的構造を含有する溶液を含む）、または固形もしくは半固形物質である。結果的として、核酸は任意選択的に、溶液中に遊離し、固形もしくは半固形物質中または固形もしくは半固形物質上で固定され、生物学的構造から抽出され（たとえば、溶解細胞、組織もしくは細胞小器官から）、または、生物学的構造内に内包されたままである。核酸を色素に結合させるためには、たとえ核酸が生物学的構造内に内包されていなくとも、核酸を水溶性環境におき、色素に接触させる必要性がある。

【0116】

核酸を含有する生物学的構造は、任意選択的に、たとえば、原核微生物もしくは真核微生物、またはウイルス、ウイロイド、染色体もしくは細胞小器官のように、核酸が細胞内または間質腔に存在する、細胞または組織である。あるいは、生物学的構造は、組織または細胞内に包含されていなくともよく、ウイルスまたは微生物もしくは他の細胞として存在しており、またはその元の細胞から除去された細胞内構成要素（たとえば、プラスミドもしくは染色体、またはミトコンドリアもしくは核もしくは他の細胞内小器官）として存在している。典型的には、生物学的構造は、任意選択的に真核細胞内に含有される細胞内小器官、染色体または細胞である。真核細胞の内側に存在する細胞は、一般に、寄生生物または、たとえばウイルス、細菌、原虫、マイコプラズマもしくはマイクバクテリウム等の他の感染性病原体である。核酸が、生物学的構造（細胞である）の中に含まれている場合、その細胞は生きた細胞または死んだ細胞またはそれらの混合物である。すなわち、細胞膜の完全性は、任意選択的に、保たれているか、または自然に破壊（自己溶解）、機械的もしくは化学的手段で破壊、またはたとえば温度や圧力の変化等の環境的手段により破壊されている。あるいは、細胞は、ブレブを形成しているか、またはアポトーシスを起こしているか、または増殖サイクルにあるか、または細胞分裂の状態にある。

【0117】

核酸が溶液中に存在する場合、試料溶液は、精製核酸または合成核酸（たとえばオリゴヌクレオチド等）からそのままの混合物（たとえば細胞抽出物もしくはホモジネートもしくは他の生物学的液体等）まで、または生物学的、工業的もしくは環境的原料由来の希釈溶液のうちの一つを含むように、様々であり得る。一部の例においては、色素と混合する前に、溶液中の生体分子または液体の混合物から核酸を分離することが望ましい。一般的に、他のタンパク質または他の生物学的分子を有する粗混合物から核酸を分離および精製するための技術は非常に多く存在する。様々な支持体または溶液を用いた、または流体中での、クロマトグラフィー技術および電気泳動技術等が挙げられる。あるいは、核酸ポリマーがヌクレアーゼの存在下で分解されないように、核酸混合物は、ＲＮａｓｅまたはＤＮａｓｅで処理し、本発明の色素を用いて、分解産物から識別することができる。

【0118】

本発明の色素は生命体に対する毒性が比較的低いため、多くの場合、生きている試料中の核酸を、色素それ自身により引き起こされるダメージを極力少なく、または無し、検証することができる。一部の細胞は、他の細胞に対しては非透過性であると示されている色素を、細胞膜を超えての受動核酸とは異なる手段（たとえば、ファゴサイトーシスまたは他の摂取手段）により容易に取り込むことができるが、損なわれていない細胞またはゲル中の試料に用いるために、より浸透性のある色素を用いてもよい。これらの色素は、標準的なゲルベースのアプリケーションに用いることができる。色素の光安定性、毒性、結合アフィニティ、量子収量、および蛍光増強は、当分野に公知の標準的な方法に従い、測定される。

【0119】

一つの実施形態において、色素オリゴヌクレオチド複合体（たとえば、プローブまたはプライマー）は、生理学的試料中の対立遺伝子の同定のための方法およびキット中で用いられる。一つの実施形態において、遺伝子座、プライマーおよび増幅プロトコールの適切なセットが、複合的な共増幅遺伝子座から増幅対立遺伝子を生成するために選択され、一つの実施形態においては、当該複合的な共増幅遺伝子座は、サイズが重複しない、または、サイズが重複する異なる遺伝子座を対立遺伝子間で識別することができるような方法で標識される。さらに、この方法より、単一増幅プロトコールの使用に適した短いタンデムリピート（ＳＴＲ）遺伝子座の選別も予期させる。上手くいく組み合わせは、遺伝子座の組み合わせのトライアンドエラー、プライマー対配列の選択、およびすべての含有遺伝子座が増幅されうる平衡を特定するためのプライマー濃度の調整により創り出すことができる。マルチプレックスな増幅反応ステップで増幅されうる遺伝子座の数は、その反応が特定することができる増幅対立遺伝子を生み出す限り、２〜５０、または２〜５０の間の任意の整数値（たとえば、１６、１７、１８、２１、２３または２６）であってもよい。一つの実施形態において、増幅された断片は、５００ｂｐ未満の長さである。

【0120】

本発明の方法で用いられるプライマーの合成は、当業者公知の任意の標準的なオリゴヌクレオチド合成法を用いて実施することができる。各遺伝子座に対するプライマーの少なくとも１つに、異なる色素標識が共有結合的に付着する。

【0121】

本発明の方法に用いるためのゲノムＤＮＡ試料の調製は、ＤＮＡ増幅と相性の良い任意のＤＮＡ調製法を用いて行うことができる。多くのそのような方法が当業者に公知である。分析されるＤＮＡ試料の少なくとも１つがヒトゲノムＤＮＡである場合、そのＤＮＡは、組織、血液、精液、膣細胞、毛髪、唾液、尿、骨、口腔試料、胎盤細胞または胎児細胞を含有する羊膜液、絨毛膜絨毛、および上述の試料の任意の混合物からなる群から選択される試料から調製されても良い。

【0122】

ゲノムＤＮＡ試料が調製された時点で、標的遺伝子座を、マルチプレックス増幅ステップで共増幅することができる。多くの異なる増幅法（限定されないが、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）、転写ベース増幅、およびストランド置換増幅（ＳＤＡ）を含む）の任意の一つを用いて、遺伝子座を増幅することができる。一つの実施形態において、ＤＮＡ試料は、セット中の各遺伝子座に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ増幅に供される。

【0123】

各遺伝子座に対するプライマーの少なくとも１つは、色素標識に共有結合的に付着することができ、そのうちの一つは本発明の色素を含有する。プライマーおよびそれらに付着した色素は、ある色で標識された各遺伝子座に対するプライマーを用いて増幅された対立遺伝子が、同じ色で標識されたプライマーを用いてそれらで共増幅されたセット中の他の遺伝子座の対立遺伝子と、対立遺伝子が分離されたとき（たとえば、ゲル電気泳動またはキャピラリー電気泳動等）に重複しないように、マルチプレックスな増幅反応での使用に対して選択される。本発明での使用のためのプライマーへの付着に適した蛍光標識は、市販されている。たとえば、ＰＥ ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓおよびＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓから販売されている蛍光およびカルボキシ−テトラメチルローダミン標識およびそれらの化学的誘導体を参照のこと。一つの実施形態において、少なくとも３つの異なる標識を用いて、マルチプレックス増幅反応で用いられる異なるプライマーを標識する。サイズマーカーがマルチプレックス反応の評価に含まれる場合、サイズマーカーを調製するために用いられるプライマーは、その反応における対象遺伝子座を増幅するために用いられたプライマーとは異なる標識で標識されてもよい。

【0124】

マルチプレックス増幅ステップから、増幅対立遺伝子のセットが生成された時点で、増幅対立遺伝子が評価される。本方法の評価ステップは、多くの異なる手段のうちの任意の一つを用いて行うことができる。電気泳動（たとえば、キャピラリー電気泳動または変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動）を用いて、マルチプレックス増幅反応の産物を分離してもよい。ゲル分離および電気泳動法、ならびに評価ステップでの使用に適した条件は、当分野で公知である。変性ポリアクリルアミドゲルおよびキャピラリー電気泳動でのＤＮＡ断片の分離は、主に断片のサイズに基づき発生する。

【0125】

増幅対立遺伝子が分離された時点で、その対立遺伝子およびゲルまたはキャピラリー中の他の任意のＤＮＡ（たとえば、ＤＮＡサイズマーカーまたは対立遺伝子ラダー）を、次いで、可視化し、分析することができる。一つの実施形態において、多くの遺伝子座を含有する複合物の検出法は、蛍光であり、マルチプレックス反応における各遺伝子座に対するプライマーは、蛍光検出器を使用した標識産物の検出により観察される。

【0126】

ｉｉ．細胞撮像
蛍光標識生体分子は、培養細胞および全ての動物の両方における遺伝子発現研究のレポーターとして極めて有用であることが証明されている。たとえば、生きている細胞において、蛍光標識タンパク質は、タンパク質、細胞内小器官および他の細胞構成成分の局在および動力学の追跡に、ならびに、細胞内タンパク質輸送のトレーサーとしてもっともよく利用されている。本発明による標識生体分子の定量的撮像は、様々な技術（広視野、共焦点および多光子顕微鏡を含む）を用いて容易に実行され、細胞構造及び機能の複雑さを顕在化させるための固有な手段を提供する。とりわけ、本発明の色素を用いて細胞内のタンパク質転移を画像化し、タンパク質−タンパク質およびタンパク質−ＤＮＡ複合体を検出し、タンパク質発現、転移および活性状態を測定することができる。

【0127】

一つの実施形態において、細胞は本発明に従う標識生体分子と接触し、蛍光が検出される。たとえば、タンパク質は本発明の色素で標識することができ、細胞表面受容体への結合に用いることができる。この例において、細胞表面受容体の位置を検出することができる。

【0128】

または、本発明の蛍光色素は、たとえばＨａｌｏＴａｇ（登録商標）タンパク質（Ｐｒｏｍｅｇａ， Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）等のモジュール式タンパク質識別システムに用いることができる。このタイプのシステムにおいては、タンパク質のタグは、本発明の蛍光色素に付着したクロロアルカンリンカーを有する合成リガンドに共有結合的に結合するよう設計された改変ハロアルカンデハロゲナーゼである。

【0129】

ｉｉｉ．酵素アッセイ
本発明の色素はまた、酵素基質に結合させることができ、試料中の酵素の存在および／または活性を検出するために用いることができる。ゆえに本発明により、試料中の酵素を検出する方法が提供される。一つの実施形態においては、酵素を含有すると思われる試料を、本発明の色素のプロ蛍光形態である標識生体分子および酵素の基質と接触させ、蛍光を検出する。

【0130】

ｉｖ．他の用途
本発明の蛍光色素を、当分野に公知の他の技術に用いることもできる。たとえば、当該色素は、細胞構造（細胞骨格タンパク質、細胞内小器官、脂質、および膜を含み、細胞形態および流体の蛍光トレーサーとして）の精査、および細胞機能（細胞活性、細胞増殖、エンドサイトーシス、受容体、イオンチャンネル、シグナル伝達、ＲＯＳ、様々な陽イオンおよび膜電位を含む）の精査を目的として、抗体染色、生細胞での有機金属触媒の研究、生物医学撮像、ならびに、小分子、チオール反応性プローブ、ビオチンおよびハプテン誘導体のｉｎ ｖｉｖｏ検出、核酸およびタンパク質分析に用いられても良い。また、当該色素を用いて、ＦＲＥＴまたはＢＲＥＴを用いた生物学的現象を検出してもよい。たとえば、本発明の色素の様々な用途に関する記述として、「Ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ（登録商標）Ｈａｎｄｂｏｏｋ」（ｗｗｗ．ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ．ｃｏｍ）を参照のこと。

【0131】

また、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）または生物発光共鳴エネルギー転移（ＢＲＥＴ）を用いた生物学的現象の検出に当該色素を用いても良い。たとえば、本発明の色素の様々な用途に関する記述として、「Ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ（登録商標）Ｈａｎｄｂｏｏｋ」（ｗｗｗ．ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ．ｃｏｍ）を参照のこと。一部の実施形態において、本明細書に開示される色素は、ＢＲＥＴアクセプターとして使用することができる。本明細書に記述される色素を、ルシフェラーゼのエネルギー転移半径（たとえば、典型的には、１０ｎｍ未満）以内に近づかせ、正しい方向に置いた場合、無放射性のエネルギー転移が発生し、色素はその標準的な発光で光を発する。色素をルシフェラーゼに近づけさせるための多くの方法が公知であり、たとえば、小分子または量子ドット（Xia, Z and Rao, J. 2009. Curr. Opin. Biotech 20: 37-44）があり、これらの方法により、対象の生物学システムに関して何かしらを知ることができる。

【0132】

一部の実施形態において、本明細書に開示される色素は、たとえばクロロアルカン（米国特許第７，８６７，７２６号を参照のこと）等のタグに結合させてもよい。もし対象タンパク質がＨａｌｏＴａｇ（登録商標）融合物として発現されていた場合、この結合により、細胞内または細胞溶解物中の別の対象タンパク質により強く色素を結び付けることができる。対象タンパク質とＨａｌｏＴａｇタンパク質とのそのような融合物は、色素複合体と共有結合的に標識される。本明細書に開示される色素と特定のタンパク質とを結び付ける多くの他の方法があり、たとえば、色素を特定の抗体に結合させる方法がある。細胞または細胞溶解物中の他の対象タンパク質を、次いで、たとえば蛍ルシフェラーゼまたはＯｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼ（たとえば、Ｐｒｏｍｅｇａ社から入手できるＮａｎｏＬｕｃ（商標）ルシフェラーゼ（米国特許出願第２０１００２８１５５２号および米国特許出願第１３／２８７，９８６号を参照のこと））等のルシフェラーゼと融合させることができる。もし対象の第一タンパク質および第二タンパク質が規定の距離（たとえば、典型的には１０ｎｍ未満）で相互作用した場合、ルシフェリン基質の添加により、ＢＲＥＴが観察される。そのようなシステムにより、様々な条件下（たとえば、生きた細胞の内側）での２つの特定のタンパク質の相互作用を研究することができる。

【0133】

一部の実施形態において、本明細書に開示される色素をＦＲＥＴまたはＢＲＥＴで使用することにより、任意の２つの対象物質（たとえば、核酸、脂質、多糖、抗体、小分子（たとえば、薬剤または薬剤化合物等））の生物学的な相互作用を究明することができる。一部の実施形態において、タンパク質と小分子の相互作用は生きた細胞の内側で発生する。一部の実施形態において、本明細書に開示される色素は、小分子（たとえば、分子／タンパク質相互作用がその色素結合により阻害されないような方法で対象タンパク質と結合するトレーサー等）に結合されてもよい。もし対象タンパク質が上述のルシフェラーゼ融合物として発現される場合、生きた細胞の内側の小分子とタンパク質の相互作用を測定することができる。また、そのようなアッセイを用いて、小分子と、たった一つのタンパク質との結合を研究してもよい（たとえその特定の小分子が多くの他のタンパク質と結合し得るとしても）。

【0134】

一部の実施形態において、本発明の反応性色素を用いて、ｉｎ ｓｉｔｕでのタンパク質相互作用を定量化するために、タンパク質（複数含む）またはペプチド（複数含む）を標識してもよい。一部の態様において、色素標識は、反応性シアノベンゾチアゾール（ＣＢＴ）標識構造（米国特許出願第２００９／０２６３８４３号（本明細書に参照により援用される）を参照のこと）を用いて標的タンパク質または対象ペプチドに付着されうる。ＣＢＴ標識構造には、標的タンパク質またはペプチド上に、遊離のＮ末端システイン残基が必要となるが、たとえば、部位特異的なタンパク質分解性の開裂（たとえばＣ末端標的タンパク質またはペプチド由来のＨａｒｏＴａｇ等のＮ末端レポーターの開裂等）により、ｉｎ ｓｉｔｕまたは生化学的な方法で生成することができる。タンパク質分解が発生し、Ｎ末端システイン残基が生成された時点で、反応性ＣＢＴ標識法を用いて、標的タンパク質または対象ペプチド上の単一色素標識を作製することができる。この方法はまた、受容体リガンド（たとえば、サイトカインまたはペプチドリガンド）の部位特異的標識にも用いられうる。色素標識リガンドが適切なエネルギードナー（たとえば、生物発光共鳴エネルギー転移（ＢＲＥＴ）のルシフェラーゼ、またはＦｏｒｓｔｅｒ共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）の短波長蛍光）で標識された細胞表面受容体にごく近接して結合した場合、励起状態のドナーと蛍光色素アクセプターの間にエネルギー転移が発生し、結合色素からの発光が増加する。次いで、エネルギー転移を用いて、ＣＢＴ色素で標識されたタンパク質／ペプチドと対象のドナー標識された対象の受容体との相互作用を定量化してもよい。この標識法は、たとえば精製タンパク質または精製ペプチド等の精製成分と相性が良く、または全細胞もしくは細胞溶解物を含むより複雑な試料中の精製成分と相性が良い。さらに、この標識法は、ＢＲＥＴシグナルを産生するリガンド−受容体複合体の競争的置換により、対象の受容体に対する未標識タンパク質／ペプチドのアフィニティの検証にも有用である。

【0135】

キット
本発明の一つの態様において、上述の本発明の任意の色素を用いた様々なアッセイの実施を促進するキットの形成が提供される。本発明のキットは、通常、色素複合体の調製に有用な化学反応性標識物として、または色素複合体としてのいずれかである、本発明の着色された、または本発明の蛍光色素を含有し、ここで、その結合物質は、特定の結合対メンバーであるか、または、たとえばヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ペプチド、タンパク質または小分子（薬剤または薬剤化合物）である。当該キットは、任意選択的に、通常は水溶液である、緩衝剤を１つ以上含有する。本発明のキットは任意選択的にさらに、追加の検出試薬、得られた標識物質を精製するための精製媒体、発光標準物質、酵素、酵素阻害剤、有機溶媒、融合タンパク質発現のための構築物（たとえば、ルシフェラーゼを含有する融合タンパク質、またはタンパク質もしくは対象標的に融合されたＨａｌｏＴａｇ（登録商標）タンパク質）、融合タンパク質、または本発明のアッセイ実行のための説明書を含有する。

【0136】

一部の実施形態において、本発明のキットは、遺伝子座特異的プライマーを１つ以上、含有する。任意で使用説明書が含まれていても良い。他の任意のキット構成要素としては、特定の遺伝子座のそれぞれに指向する対立遺伝子ラダー、十分量の増幅酵素、増幅を促進する増幅緩衝液、電気泳動のための増幅物質調製のためのローディング溶液、鋳型対照としてのゲノムＤＮＡ、分離媒体中で見込まれる物質移動を確証するためのサイズマーカー、およびユーザーを教育し、誤使用を少なくするためのプロトコールおよびマニュアルが挙げられる。また、キット中の様々な試薬の量は、たとえばそのプロセスの最適感度等の多くの要因によって変化させることができる。応用マニュアルでの使用のためのテストキット、または自動検出器もしくは自動分析器との使用のためのテストキットを提供することも、本発明の範囲内にある。

【0137】

他の実施形態において、当該キットはまた、遺伝子改変された細胞または遺伝子融合（たとえば、タンパク質もしくは対象標的に融合されたルシフェラーゼまたはＨａｌｏＴａｇ（登録商標）タンパク質を含有する融合等）のためのベクターを含む。使用説明書を任意選択的に含んでも良い。

【0138】

以下の実施例は上述の発明を解説するためのものであり、本発明の範囲を狭めるものとはみなされない。当業者であれば、本発明を実施することができる他の方法を実施例から容易に類推されることが認識できるであろう。本発明の範囲内にありながら、様々な改変および変更が可能であることが、理解されるはずである。

【実施例】

【0139】

〔実施例１〕
７−メトキシテトラロンオキシム

【化32】

ＭｅＯＨ（１７５ｍＬ）に溶解した７−メトキシテトラロン（１５ｇ）の溶液に、ＮＨ₂ＯＨ（Ｈ₂Ｏに溶解した５０％、１５．７ｍＬ）およびＡｃＯＨ（４ｍＬ）を添加した。１時間攪拌した後、溶液を、固形物が現れ始めるまで濃縮した。反応物を希釈ＮａＨＣＯ₃水溶液（５００ｍＬ）へと注ぎ、得られた固形物をろ過して、標題の化合物（１７．８ｇ）を得た。1H NMR (DMSO-d6) δ 11.08 (s, 1H), 7.35 (s, 1H), 7.08 (d, 1H), 6.84 (d, 1H), 3.71 (s, 3H), 2.62-2.49 (m, 4H), 1.77-1.64 (m, 2H)。

【0140】

〔実施例２〕
８−メトキシ−４，５−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｂ］アゼピン−２（３Ｈ）−オン

【化33】

ピリジン（４００ｍＬ）に溶解した７−メトキシテトラロンオキシム（１７．８ｇ）の溶液に、ｐ−トルエンスルホニル塩化物（２６．６ｇ）を段階的に添加した。１８時間攪拌した後、反応物をＨＣｌ（３Ｍ、１Ｌ）へと注ぎ、得られた固形物をろ過して、粗トシレート（３２．４ｇ）を得た。このオレンジ色の固形物に、ＥｔＯＨ（７５０ｍＬ）およびＮａＯＡｃ（７５０ｍＬのＨ₂Ｏに溶解した７７．０ｇ）を添加し、得られた懸濁液を加熱灌流した。１６時間の灌流の後、加熱を停止し、固形物が現れ始めるまで溶液を濃縮した。冷却の後、得られた白色固形物をろ過し、標題の化合物（１１．２ｇ）を得た：1H NMR (DMSO-d6) δ 9.43 (s, 1H); 7.12 (d, 1H), 6.64 (dd, 1H), 6.52 (d, 1H), 3.69 (s, 3H), 2.56 (t, 2H), 2.12 (t, 2H), 2.07-1.98 (m, 2H)。

【0141】

〔実施例３〕
８−メトキシ−２，３，４，５−テトラヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｂ］アゼピン

【化34】

ＴＨＦ（１００ｍＬ）に溶解した８−メトキシ−４，５−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｂ］アゼピン−２（３Ｈ）−オン（２ｇ）の溶液に、水素化アルミニウムリチウム（０．７９ｇ）を添加し、反応物を加熱灌流した。１時間の攪拌の後、加熱を停止した。水（６ｍＬ）を加え、次いで、ＮａＯＨ（１０％、１５ｍＬ）を加え、凝集した固形物をろ過で除去し、溶離液を濃縮して、薄茶色の油として標題の化合物（１．９ｇ）を得た：1H NMR (DMSO-d6) δ 6.88 (d, 1H); 6.37 (d, 1H), 6.22 (dd, 1H), 5.14 (s, 1H), 3.62 (s, 3H), 2.90-2.85 (m, 2H), 2.57-2.53 (m, 2H), 1.67-1.59 (m, 2H), 1.52-1.45 (m, 2H)。

【0142】

〔実施例４〕
８−メトキシ−２，３，４，５−テトラヒドロ−１−エチルベンゾ［ｂ］アゼピン

【化35】

アセトニトリル（２５ｍＬ）に溶解した８−メトキシ−２，３，４，５−テトラヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｂ］アゼピン（０．５ｇ）の溶液に、ヨードエタン（０．４５ｍＬ）およびＫ₂ＣＯ₃（１．２ｇ）を添加し、反応物を加熱還流した。１８時間の攪拌の後、過熱を停止し、反応物を濃縮した。得られた残渣を、水（３０ｍＬ）とＥｔＯＡｃ（２５ｍＬ）の間で分割し、層を分離させ、有機層をブラインで洗浄し、乾燥させ（Ｎａ₂ＳＯ₄）、濃縮して、透明な油として標題の化合物（０．５４ｇ）を得た：1H NMR (DMSO-d6) δ 6.93 (d, 1H); 6.39 (d, 1H), 6.33 (dd, 1H), 3.67 (s, 3H), 3.07 (q, 2H), 2.85-2.82 (m, 2H), 2.62-2.58 (m, 2H), 1.66-1.59 (m, 2H), 1.51-1.43 (m, 2H), 1.10 (t, 3H)。

【0143】

〔実施例５〕
８−ヒドロキシ−２，３，４，５−テトラヒドロ−１−エチルベンゾ［ｂ］アゼピン

【化36】

−７８℃まで冷却したＣＨ₂Ｃｌ₂（２５ｍＬ）に溶解した８−メトキシ−２，３，４，５−テトラヒドロ−１−エチルベンゾ［ｂ］アゼピン（０．５４ｇ）の溶液に、ＢＢｒ₃（１．２４ｍＬ）を添加し、反応物を徐々に−２０℃まで温めた。３時間の攪拌の後、反応物をＭｅＯＨでクエンチし、室温にまで温めさせ、次いで、濃縮した。残渣をＨＣｌ（１Ｍ、４０ｍＬ）に溶解し、１時間攪拌した。この溶液を、Ｋ₂ＣＯ₃（飽和、水溶液）でｐＨ１２まで上げ、ＥｔＯＡｃ（４０ｍＬ）で抽出した。有機層をブラインで洗浄し、乾燥させ（Ｎａ₂ＳＯ₄）、濃縮した。粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィー（ヘプタンに溶解したＥｔＯＡｃの勾配）で精製し、透明な油として標題の化合物（０．３７ｇ）を得た：1H NMR (DMSO-d6) δ 8.88 (s, 1H), 6.79 (d, 1H); 6.29 (d, 1H), 6.16 (dd, 1H), 3.02 (q, 2H), 2.82-2.79 (m, 2H), 2.57-2.53 (m, 2H), 1.65-1.57 (m, 2H), 1.48-1.42 (m, 2H), 1.09 (t, 3H)；ＭＳは１９２（Ｃ₁₂Ｈ₁₈ＮＯ、Ｍ＋１）を予期し、実測値は１９２。

【0144】

〔実施例６〕
ビス（エチルアゼピノ）テトラクロロローダミン（ＰＢＩ３７３７）

【化37】

８−ヒドロキシ−２，３，４，５−テトラヒドロ−１−エチルベンゾ［ｂ］アゼピン（５０ｍｇ）、テトラクロロフタル酸無水物（５２ｍｇ）およびＺｎＣｌ₂（３６ｍｇ）の混合物を約２５０℃まで２分間加熱した。残渣をＣＨ₂Ｃｌ₂／ＭｅＯＨ（１／１、２０ｍＬ）に懸濁し、ろ過し、濃縮した。粗色素を、分取ＨＰＬＣ（Ｈ₂Ｏに溶解した０．１％ＴＦＡ中のＡＣＮの勾配）で精製し、青い固形物として標題の化合物（１ｍｇ）を得た。ＭＳは６３２（Ｃ₃₂Ｈ₃₀Ｃｌ₄Ｎ₂Ｏ₃⁺、Ｍ⁺）を予期し、実測値は６３２：λｍａｘＡｂｓ＝５９５ｎｍ（ＭｅＯＨ）、λｍａｘＥｍ＝６１９ｎｍ（ＭｅＯＨ）。

【0145】

〔実施例７〕
追加化合物の合成
適切なフェノールおよび無水フタル酸を使用して、ＰＢＩ３７３７と同様の方法で、以下の化合物を合成した。一部の例において、ローダミンの脱カルボキシル化から得られたローザミンも単離した。

【表1】

【0146】

〔実施例８〕
１１−メトキシ−２，３，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−１Ｈ−アゼピノ［３，２，１−ｉｊ］キノリン

【化38】

ブロモクロロプロパン（２ｍＬ）に溶解した８−メトキシ−２，３，４，５−テトラヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｂ］アゼピン（０．２５ｇ）の溶液に、Ｎａ₂ＣＯ₃（０．６ｇ）を添加し、反応物を加熱灌流した。１８時間の攪拌の後、加熱を停止し、反応物を水（３０ｍＬ）とエーテル（２５ｍＬ）の間で分割し、層を分離させ、有機層をブラインで洗浄し、乾燥させ（Ｎａ₂ＳＯ₄）、濃縮した。粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィー（ヘプタンに溶解したＥｔＯＡｃの勾配）で精製し、透明な油として標題の化合物（０．２７ｇ）を得た：1H NMR (DMSO-d6) δ 6.82 (d, 1H); 6.36 (d, 1H), 3.68 (s, 3H), 3.04-3.00 (m, 2H), 2.89-2.85 (m, 2H), 2.60-2.57 (m, 2H), 2.53-2.49 (m, 2H), 1.70-1.61 (m, 4H), 1.48-1.40 (m, 2H)；ＭＳは２１８（Ｃ₁₄Ｈ₂₀ＮＯ、Ｍ＋１）を予期し、実測値は２１８。

【0147】

〔実施例９〕
１１−ヒドロキシ−２，３，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−１Ｈ−アゼピノ［３，２，１−ｉｊ］キノリン

【化39】

標題の化合物を、１１−メトキシ−２，３，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−１Ｈ−アゼピノ［３，２，１−ｉｊ］キノリンから、８−ヒドロキシ−２，３，４，５−テトラヒドロ−１−エチルベンゾ［ｂ］アゼピンと同様の方法で合成した：1H NMR (DMSO-d6) δ 8.82 (s, 1H), 6.64 (d, 1H); 6.22 (d, 1H), 3.03-2.99 (m, 2H), 2.87-2.83 (m, 2H), 2.55-2.50 (m, 2H), 2.53-2.49 (m, 2H), 1.68-1.61 (m, 4H), 1.45-1.37 (m, 2H)；ＭＳは２０４（Ｃ₁₃Ｈ₁₈ＮＯ、Ｍ＋１）を予期し、実測値は２０４。

【0148】

〔実施例１０〕
８−メトキシ−５−メチル−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｂ］アゼピン

【化40】

開始材料として８−メトキシ−５−メチル−１Ｈ−ベンゾ［ｂ］アゼピン−２（３Ｈ）−オン（Aust. J. Chem. 1978, 31, 2031-2037）を使用した８−メトキシ−２，３，４，５−テトラヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｂ］アゼピンの合成に対する方法に従い、標題の化合物を合成した：1H NMR (DMSO-d6) δ 7.28 (d, 1H), 6.46 (dd, 1H); 6.28 (d, 1H), 5.89 (t, 1H), 5.30 (s, 1H), 3.77 (s, 3H), 3.40 (t, 2H), 2.41 (q, 2H), 2.14 (d, 3H)；ＭＳは１９０（Ｃ₁₂Ｈ₁₆ＮＯ， Ｍ＋１）を予期し、実測値は１９０。

【0149】

〔実施例１１〕
８−ヒドロキシ−５−メチル−２，３−ジヒドロ−１−エチルベンゾ［ｂ］アゼピン

【化41】

８−メトキシ−２，３，４，５−テトラヒドロ−１−エチルベンゾ［ｂ］アゼピンに対するアルカリ化手順に従い、８−メトキシ−５−メチル−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｂ］アゼピンから標題の化合物を合成し、８−ヒドロキシ−２，３，４，５−テトラヒドロ−１−エチルベンゾ［ｂ］アゼピンの合成のために用いられた脱メチル化手順を行った：1H NMR (DMSO-d6) δ 9.15 (s, 1H), 7.05 (d, 1H), 6.31-6.25 (m, 2H), 5.80 (t, 1H), 5.30 (s, 1H), 3.12-3.03 (m, 4H), 2.17 (q, 2H), 1.97 (s, 3H), 1.09 (t, 3H)；ＭＳは２０３（Ｃ₁₃Ｈ₁₈ＮＯ、Ｍ＋１）を予期し、実測値は２０３。

【0150】

〔実施例１２〕
８−ヒドロキシ−５−メチル−２，３，４，５−テトラヒドロ−１−エチルベンゾ［ｂ］アゼピン

【化42】

ＭｅＯＨ（１０ｍＬ）に溶解した８−ヒドロキシ−５−メチル−２，３−ジヒドロ−１−エチルベンゾ［ｂ］アゼピン（０．１４ｇ）とＰｄ／Ｃ（１０ｍｇ）の懸濁液を、Ｈ₂でパージし、次いで、１ａｔｍのＨ₂下で３時間攪拌した。次いで、反応物をＣｅｌｉｔｅでろ過し、溶離液を濃縮し、粗反応物をシリカゲル（ヘプタンに溶解したＥｔＯＡｃの勾配）で精製し、透明な油として標題の化合物（０．０９ｇ）を得た：1H NMR (CDCl3) δ 7.26 (s, 1H), 6.97 (d, 1H), 6.46-6.33 (m, 2H), 3.23-3.02 (m, 4H), 2.79-2.67 (m, 2H), 1.81-1.53 (m, 3H), 1.29 (d, 3H), 1.19 (t, 3H)；ＭＳは２０６（Ｃ₁₃Ｈ₂₀ＮＯ、Ｍ＋１）を予期し、実測値は２０６。

【0151】

〔実施例１３〕
９−ヒドロキシ−２，３，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−１Ｈ−アゼピノ［３，２，１−ｉｊ］キノリン

【化43】

５−メトキシテトラロンから合成開始する１１−ヒドロキシ−２，３，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−１Ｈ−アゼピノ［３，２，１−ｉｊ］キノリンと同様の方法で、標題の化合物を合成した：1H NMR (DMSO-d6) δ 8.69 (s, 1H), 6.55 (d, 1H); 6.27 (d, 1H), 3.05-3.02 (m, 2H), 2.92-2.89 (m, 2H), 2.68-2.64 (m, 2H), 2.54 (t, 2H), 1.69-1.60 (m, 4H), 1.45-1.37 (m, 2H)；ＭＳは２０４（Ｃ₁₃Ｈ₁₈ＮＯ、Ｍ＋１）を予期し、実測値は２０４。

【0152】

〔実施例１４〕
２，３，４，５−テトラクロロ−６−（９−ヒドロキシ−２，３，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−１Ｈ−アゼピノ［３，２，１−ｉｊ］キノリン−１０−カルボニル）安息香酸

【化44】

ジクロロベンゼン（１ｍＬ）に溶解した９−ヒドロキシ−２，３，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−１Ｈ−アゼピノ［３，２，１−ｉｊ］キノリン（３０ｍｇ）の溶液に、テトラクロロフタル酸無水物（０．１３ｍＬ）を添加した。２時間、還流で攪拌した後、溶媒を除去し、得られた粗生成物を分取ＨＰＬＣ（Ｈ₂Ｏに溶解した０．１％ＴＦＡ中のＡＣＮの勾配）で精製し、緑色の固形物として標題の化合物（２０ｍｇ）を得た：ＭＳは４９０（Ｃ₂₁Ｈ₁₈Ｃｌ₄ＮＯ₄⁺、Ｍ＋）を予期し、実測値は４９０。

【0153】

〔実施例１５〕
追加の化合物の合成
適切なフェノールおよび無水フタル酸を使用して、２，３，４，５−テトラクロロ−６−（９−ヒドロキシ−２，３，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−１Ｈ−アゼピノ［３，２，１−ｉｊ］キノリン−１０−カルボニル）安息香酸と同様の方法で、以下の化合物を合成した。

【表2】

【0154】

〔実施例１６〕
ビス（アゼピノピペリジノ）−テトラクロロローダミン（ＰＢＩ３８６１）

【化45】

ＤＭＦ（１ｍＬ）に溶解した２，３，４，５−テトラクロロ−６−（９−ヒドロキシ−２，３，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−１Ｈ−アゼピノ［３，２，１−ｉｊ］キノリン−１０−カルボニル）安息香酸（２０ｍｇ）と９−ヒドロキシ−２，３，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−１Ｈ−アゼピノ［３，２，１−ｉｊ］キノリン（１４ｍｇ）の溶液に、トリメチルシリルポリホスフェート（０．２５ｍＬ）を添加した。１時間、８０℃で攪拌した後、水（１ｍＬ）を添加し、得られた溶液を分取ＨＰＬＣ（Ｈ₂Ｏに溶解した０．１％ＴＦＡ中のＡＣＮの勾配）で精製し、青色固形物として標題の化合物（１０ｍｇ）を得た：ＭＳは６５６（Ｃ₃₄Ｈ₃₀Ｃｌ₄Ｎ₂Ｏ₃⁺、Ｍ＋）を予期し、実測値は６５６；λｍａｘＡｂｓ＝６０５ｎｍ（ＭｅＯＨ）、λｍａｘＥｍ＝６２０ｎｍ（ＭｅＯＨ）。

【0155】

〔実施例１７〕
追加の化合物の合成
実施例１４または１５の適切なフェノールおよびケトフェノールを用いて、ビス（アゼピノピペリジノ）−テトラクロロローダミンと同様の方法で以下の化合物を合成した。

【表3】

【0156】

〔実施例１８〕
ビス（ピペリジンアゼピノ）−トリクロロローダミンメルカプト酢酸（ＰＢＩ３７６９）

【化46】

ＤＭＦ（１０ｍＬ）に溶解したビス（ピペリジンアゼピノ）−テトラクロロローダミン（ＰＢＩ３７３８、０．６０ｇ）とジイソプロピルエチルアミン（０．３２ｍＬ）の溶液に、メルカプト酢酸（０．１３ｍＬ）を添加した。２時間攪拌した後、得られた産物を分取ＨＰＬＣ（Ｈ₂Ｏに溶解した０．１％ＴＦＡ中のＡＣＮの勾配）で精製し、青色固形物として標題の化合物（０．３５ｇ）を得た：ＭＳは７１２（Ｃ₃₆Ｈ₃₃Ｃｌ₃Ｎ₂Ｏ₅Ｓ⁺、Ｍ＋）を予期し、実測値は７１２；λｍａｘＡｂｓ＝６０６ｎｍ（ＭｅＯＨ）、λｍａｘＥｍ＝６２７ｎｍ（ＭｅＯＨ）。

【0157】

〔実施例１９〕
追加の化合物の合成
適切なハロローダミンを用いて、ＰＢＩ３７６９と同様の方法で以下の化合物を合成した。

【表4】

【0158】

〔実施例２０〕
ビス（ピペリジノアゼピノ）−ペンタフルオロローザミン（ＰＢＩ３８６０）

【化47】

Ｈ₂ＳＯ₄（６０％水溶液、２ｍＬ）に溶解したペンタフルオロベンズアルデヒド（４０ｍｇ）と１１−ヒドロキシ−２，３，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−１Ｈ−アゼピノ［３，２，１−ｉｊ］キノロン（５０ｍｇ）の溶液を、１５０℃で１０分間、攪拌した。得られた溶液を分取ＨＰＬＣ（Ｈ₂Ｏに溶解した０．１％ＴＦＡ中のＡＣＮの勾配）で精製し、青色固形物として標題の化合物（２０ｍｇ）を得た：ＭＳは５６５（Ｃ₃₃Ｈ₃₀Ｆ₅Ｎ₂Ｏ⁺、Ｍ＋）を予期し、実測値は５６５；λ_maxＡｂｓ＝６２０ｎｍ（ＭｅＯＨ）、λ_maxＥｍ＝６４２ｎｍ（ＭｅＯＨ）。

【0159】

〔実施例２１〕
ビス（ピペリジンアゼピノ）−６−（（２−（２−（（６−クロロヘキシル）オキシ）エトキシ）エチル）−カルバモイル）ローダミン（ＰＢＩ３７８１）

【化48】

ＤＭＦ（１ｍＬ）に溶解したビス（ピペリジンアゼピノ）−６−カルボキシローダミン（１０ｍｇ）とジイソプロピルエチルアミン（０．０２ｍＬ）の溶液に、ＴＳＴＵ（８ｍｇ）を添加した。１５分間、攪拌した後、２−（２−（（６−クロロヘキシル）オキシ）エトキシ）エチルアミンＨＣｌ（７ｍｇ）（H. Benink, M. McDougall, D. Klaubert, G. Los, BioTechniques 2009, 47, 769-774（参照により本明細書に援用される）に記述される手順に従い合成された）を添加した。さらに３０分攪拌した後、反応混合物を分取ＨＰＬＣ（Ｈ₂Ｏに溶解した０．１％ＴＦＡ中のＡＣＮの勾配）で精製し、青色固形物として標題の化合物（１ｍｇ）を得た：ＭＳは７６９（Ｃ₄₅Ｈ₅₅ＣｌＮ₃Ｏ₆⁺、Ｍ＋）を予期し、実測値は７６９。

【0160】

〔実施例２２〕
追加の化合物の合成
適切な色素カルボン酸およびアミンを用いて、ＰＢＩ３７８１と同様の方法で以下の化合物を合成した。

【表5】

【0161】

〔実施例２３〕
ビス（ピペリジンアゼピノ）トリクロロローダミンアセトアリルアミノｄＵ５´−ＤＭＴ３´−ホスホルアミダイト（ＰＢＩ３８８５）

【化49】

固形物ビス（ピペリジンアゼピノ）トリクロロローダミンアセトアリルアミノｄＵ５´−ＤＭＴ（１．０ｇ）を、Ｎ₂で洗い流し、乾燥ＣＨ₂Ｃｌ₂（１０ｍＬ）に溶解した。この溶液に、５−エチルチオテトラゾール（３０ｍｇ）、次いで２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ´，Ｎ´−テトライソプロピルホスホルジアミダイト（０．３１ｍＬ）を添加した。９０分間攪拌した後、反応混合物をヘプタンに滴下して加えた。スラリーを５分間攪拌
し、ろ過して、青色固形物として標題の化合物（１．０ｇ）を得た：ＭＳは１４８０（Ｃ₇₈Ｈ₈₄Ｃｌ₃Ｎ₇Ｏ₁₂ＰＳ＋、Ｍ＋）を予期し、実測値は１４８０。

【0162】

〔実施例２４〕
ビス（ピペリジンアゼピノ）−トリクロロローダミンメルカプト酢酸ＳＥ（ＰＢＩ４５７４）

【化50】

ＣＨ₂Ｃｌ₂（０．５ｍＬ）に溶解したビス（ピペリジンアゼピノ）−トリクロロローダミンメルカプト酢酸（１０ｍｇ）とジイソプロピルエチルアミン（０．０２ｍＬ）の溶液に、２−スクシミド−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムテトラフルオロホウ酸塩（ＴＳＴＵ）（８ｍｇ）を添加した。１時間攪拌した後、反応混合物をクエン酸一ナトリウム（２５０ｍＭ、１５ｍＬ）へと注ぎ、ＣＨ₂Ｃｌ₂（１０ｍＬ）で３回抽出し、混合有機層を乾燥させ（Ｎａ₂ＳＯ₄）、濃縮し、青色固形物として標題の化合物（５ｍｇ）を得た：ＭＳは８０９（Ｃ₄₀Ｈ₃₆Ｃｌ₃Ｎ₃Ｏ₇Ｓ⁺、Ｍ＋）を予期し、実測値は８０９。

【0163】

〔実施例２５〕
ビス（ピペリジンアゼピノ）−３，５−ビススルホローダミン（ＰＢＩ３９０４）

【化51】

１ｍＬの濃硫酸に溶解した１１−ヒドロキシ−２，３，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−１Ｈ−アゼピノ［３，２，１−ｉｊ］キノリン（５０ｍｇ）と４−ホルミルベンゼン−１，３−ジスルホン酸二ナトリウム塩水和物（３８ｍｇ）の混合物を、５時間、油槽を用いて１００℃まで解放容器中で攪拌しながら加熱した。この後、反応物を油槽から取り出し、液化するまで攪拌しながらゆっくりと氷を加えた。次いで、酸性化された水を、油分の多い残渣から移し、この残渣をさらに水で２回以上洗浄した。次いで、残渣をメタノールに溶解し、溶媒を蒸発させ、残渣をセライト上に沈着させた。粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィー（ＣＨ₂Ｃｌ₂に溶解したＭｅＯＨの勾配）で精製し、赤色固形物として標題の化合物（７８ｍｇ）を得た：ＭＳは６３５（Ｃ₃₃Ｈ₃₅Ｎ₂Ｏ₇Ｓ₂、Ｍ＋）を予期し、実測値は６３５；λｍａｘＡｂｓ＝５９０ｎｍ（ＭｅＯＨ）、λｍａｘＥｍ＝６１３ｎｍ（ＭｅＯＨ）。

【0164】

〔実施例２６〕
ビス（ピペリジンアゼピノ）−５−塩化スルホニルスルホローダミン
ＰＯＣｌ₃（２ｍＬ）およびＴＨＦ（２ｍＬ）に溶解したビス（ピペリジンアゼピノ）−３，５−ビススルホローダミン（ＰＢＩ３９０４、７０ｍｇ）の溶液を、１時間攪拌し、次いで、減圧下で濃縮した。さらに３０分攪拌した後、反応混合物を分取ＨＰＬＣ（Ｈ₂Ｏに溶解した０．１％ＴＦＡ中のＡＣＮの勾配）で精製し、青色固形物として標題の化合物（１ｍｇ）を得た：ＭＳは７６９（Ｃ₄₅Ｈ₅₅ＣｌＮ₃Ｏ₆⁺、Ｍ＋）を予期し、実測値は７６９。

【0165】

〔実施例２７〕
ビス（ピペリジンアゼピノ）−５−（（２−（２−（（６−クロロヘキシル）オキシ）エトキシ）エチル）スルホニル）スルホローダミン（ＰＢＩ３９０９）

【化52】

ＰＯＣｌ₃（２ｍＬ）およびＴＨＦ（２ｍＬ）に溶解したビス（ピペリジンアゼピノ）−３，５−ビススルホローダミン（ＰＢＩ３９０４、７０ｍｇ）の溶液を、１時間攪拌し、次いで、減圧下で濃縮した。この粗塩化スルホニルをＣＨ₂Ｃｌ₂（５ｍＬ）に溶解し、トリエチルアミン（０．２３ｍＬ）および２−（２−（（６−クロロヘキシル）オキシ）エトキシ）エチルアミンＨＣｌ（４３ｍｇ）を加えた。３日間攪拌した後、反応混合物を濃縮した。粗生成物をＤＭＦに溶解し、分取ＨＰＬＣ（Ｈ₂Ｏに溶解した０．１％ＴＦＡ中のＡＣＮの勾配）で精製し、青色固形物として標題の化合物（６ｍｇ）を得た：ＭＳは８４０（Ｃ₄₃Ｈ₅₄ＣｌＮ₃Ｏ₈Ｓ₂⁺、Ｍ＋）を予期し、実測値は８４０。

【0166】

〔実施例２８〕
５−メトキシ−２−アミノナフタレン

【化53】

ＤＭＦ（５０ｍＬ）に溶解した６−アミノナフト−１−オール（１．０ｇ）の溶液に、ＮａＨ（鉱物油に溶解した６０％、０．１７ｇ）を加え、反応物を１時間攪拌した。ヨードメタン（０．３９ｍＬ）を加え、反応物をさらに１時間攪拌した。次いで、反応物をＮａＨＣＯ₃（水溶液、１５０ｍＬ）とＥｔＯＡｃ（１００ｍＬ）の間で分割し、層を分離させ、有機層をブラインで洗浄し、乾燥させ（Ｎａ₂ＳＯ₄）、濃縮した。粗反応物をシリカゲル（ヘプタンに溶解したＥｔＯＡｃの勾配）で精製し、オレンジ色の油として標題の化合物（０．８ｇ）を得た：：1H NMR (DMSO-d6) δ 7.81 (d, 1H); 7.16 (dd, 1H), 7.04 (d, 1H), 6.85 (dd, 1H), 6.75 (d, 1H), 6.53 (dd, 1H), 5.32 (s, 2H), 3.86 (s, 3H)。

【0167】

〔実施例２９〕
５−ヒドロキシ−２−（ジメチルアミノ）ナフタレン

【化54】

５−メトキシ−２−アミノナフタレンの精製物から、５−メトキシ−２−（ジメチルアミノ）ナフタレンをまた単離した。この化合物を、８−ヒドロキシ−２，３，４，５−テトラヒドロ−１−エチルベンゾ［ｂ］アゼピンと同様の方法で脱メチル化し、標題の化合物を得た：1H NMR (DMSO-d6) δ 9.72 (s, 1H), 7.93 (d, 1H); 7.10-7.05 (m, 3H), 6.82 (d, 1H), 6.52 (dd, 1H), 2.96 (s, 6H)；ＭＳは１８８（Ｃ₁₂Ｈ₁₃ＮＯ、Ｍ＋１）を予期し、実測値は１８８。

【0168】

〔実施例３０〕
９−ヒドロキシ−１，２，３，５，６，７−ヘキサヒドロベンゾ［ｆ］ピリド［３，２，１−ｉｊ］キノロン

【化55】

標題の化合物を、５−メトキシ−２−アミノナフタレンから合成開始する１１−ヒドロキシ−２，３，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−１Ｈ−アゼピノ［３，２，１−ｉｊ］キノロンと同様の方法で合成した：1H NMR (DMSO-d6) δ 9.55 (s, 1H), 7.55 (s, 1H); 7.08-7.00 (m, 2H), 6.48 (dd, 1H), 3.14 (q, 4H), 2.86 (q, 2H), 2.02-1.86 (m, 4H)；ＭＳは２４０（Ｃ₁₆Ｈ₁₈ＮＯ、Ｍ＋１）を予期し、実測値は２４０。

【0169】

〔実施例３１〕
３−メトキシ−１−（ジメチルアミノ）ナフタレン

【化56】

ＤＭＦ（５ｍＬ）に溶解した３−メトキシ−１−アミノナフタレン（米国特許第７，０１８，４３１ Ｂ２号、０．１３ｇ）の溶液に、Ｋ₂ＣＯ₃（０．３１ｇ）およびヨードメタン（０．０９ｍＬ）を添加した。２４時間攪拌した後、反応物を水（３０ｍＬ）およびＥｔＯＡｃ（３０ｍＬ）の間で分割し、層を分離させ、有機層をブラインで洗浄し、乾燥させ（Ｎａ₂ＳＯ₄）、濃縮した。粗反応物をシリカゲル（ヘプタンに溶解したＥｔＯＡｃの勾配）で精製し、透明な油として標題の化合物（０．１４ｇ）を得た：1H NMR (DMSO-d6) δ 7.99 (d, 1H); 7.74 (d, 1H), 7.40 (ddd, 1H), 7.30 (ddd, 1H), 6.95 (d, 1H), 6.67 (d, 1H), 3.83 (s, 3H), 2.78 (s, 6H)；ＭＳは２０２（Ｃ₁₃Ｈ₁₆ＮＯ、Ｍ＋１）を予期し、実測値は２０２。

【0170】

〔実施例３２〕
３−ヒドロキシ−１−（ジメチルアミノ）ナフタレン

【化57】

標題の化合物は、３−メトキシ−１−（ジメチルアミノ）ナフタレンから合成開始する、１１−ヒドロキシ−２，３，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−１Ｈ−アゼピノ［３，２，１−ｉｊ］キノロンと同様の方法で合成された：1H NMR (DMSO-d6) δ 9.53 (s, 1H), 7.95 (d, 1H); 7.60 (d, 1H), 7.32 (ddd, 1H), 7.21 (ddd, 1H), 6.75 (d, 1H), 6.64 (d, 1H), 2.77 (s, 6H)。

【0171】

〔実施例３３〕
ビス（ピペリジンアゼピノ）−６−（（２−（２−（２−（２−（６−カルボキシアミド−２−シアノベンゾチアゾリル）エトキシ）エトキシ）エトキシ）エチル）カルバモイル）ローダミン（ＰＢＩ５１２２）

【化58】

ＴＨＦ（２５ｍＬ）に溶解したｔ−ｂｏｃ−Ｎ−アミド−ｄＰＥＧ（登録商標）４−酸（Ｑｕａｎｔａ ＢｉｏＤｅｓｉｇｎ、１ｇ）およびＮ−メチルモルホリン（０．３ｍＬ）の溶液に、イソブチルクロロギ酸（０．３６ｍＬ）を添加した。３０分間攪拌した後、６−アミノ−２−シアノベンゾチアゾール（White et. al., J. Am. Chem. Soc. 88, 2015 (1966)、０．４８ｇ）を添加し、反応物を一晩攪拌した。次いで、反応物をろ過し、溶離液を濃縮した。粗反応物をシリカゲル（ＣＨ₂Ｃｌ₂に溶解したＭｅＯＨの勾配）で精製し、透明な油（１．４ｇ）を得た。

【0172】

前述のステップで得た油を、トリフルオロ酢酸（２５ｍＬ）に溶解した１５％チオアニソール中に、０℃で溶解した。反応物を３時間攪拌し、ジエチルエーテルで希釈し、次いで、乾燥するまで濃縮した。次いで、反応物をろ過し、溶離液を濃縮した。粗反応物をシリカゲル（ＣＨ₂Ｃｌ₂に溶解したＭｅＯＨの勾配）で精製し、ただちに次のステップに移った。

【0173】

ＣＨ２Ｃｌ２（１ｍＬ）に溶解した、ビス（ピペリジンアゼピノ）−６−カルボキシローダミン（７６ｍｇ）とジイソプロピルエチルアミン（０．０４ｍＬ）の溶液に、ＴＳＴＵ（８ｍｇ）を添加した。１５分間攪拌した後、前ステップの粗アミン（６２ｍｇ）を添加した。さらに３０分間、攪拌した後、反応混合物を分取ＨＰＬＣ（Ｈ２Ｏに溶解した０．１％ＴＦＡ中のＡＣＮ勾配）で精製し、青色固形物として標題の化合物（６ｍｇ）を得た：ＭＳは９６７（Ｃ５４Ｈ５９Ｎ６Ｏ９Ｓ＋、Ｍ＋１）を予期し、実測値は９６７。

【0174】

〔実施例３４〕
本発明の色素でオリゴヌクレオチドを標識するための基本的手順。
Ａ．Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル色素でオリゴヌクレオチドを標識する。
ｉ．１マイクロモルのスケール
５´−アミノ標識オリゴヌクレオチドは、５´Ａｍｉｎｏ ｍｏｄｉｆｉｅｒ Ｃ６ ＴＦＡアミダイト（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈより入手）を用いて、ＡＢＩ３９４ＤＮ
Ａ合成機（１マイクロモル）で合成した。脱保護は、濃縮水酸化アンモニウム中で、一晩、６０℃で実施し、５´−アミノヘキシル標識オリゴヌクレオチドを得た。得られたオリゴヌクレオチドを、乾燥するまで脱水させ、１ｍｌの０．５Ｍ ＮａＣｌに再溶解し（対イオン交換のために実施された）、そしてＮＡＰ−１０サイズ排除カートリッジ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で脱塩した。脱塩の後、オリゴヌクレオチドを乾燥するまで蒸発させ、次いで、２００μｌの０．５Ｍ 炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．０）に再溶解した。スクシンイミジルエステル色素（ＰＢＩ４４５１、４５１０、４５７４、４５６３、４５６６および４５０９）を、２０μｌ／ｍｇの濃度でＤＭＦ中に溶解した。色素／ＤＭＦ溶液の２ｘ２０μｌのアリコートを、溶解オリゴヌクレオチドに３０分の間をおいて、添加した。色素／ＤＭＦ溶液の二度目の添加の後、反応物を２０℃で１時間、混合した。１時間後、水で１ｍｌに希釈し、ＮＡＰ−１０カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で脱塩した。ＮＡＰ−１０溶出液を、アセトニトリル／０．１Ｍ ＴＥＡＡ緩衝液系を用いて、Ｐｈｅｎｏｍｏｎｅｘ Ｊｕｐｉｔｅｒ Ｃ１８カラムで逆相ＨＰＬＣにより精製した。ＨＰＬＣ精製オリゴヌクレオチドを乾燥するまで脱水させ、０．０１Ｍ 重炭酸トリエチルアンモニウムに再溶解し、ＮＡＰ−１０カラムで脱塩した。最後の脱塩ステップの後、オリゴヌクレオチドを乾燥するまで脱水し、−２０℃で保存した。

【0175】

ｉｉ．１００マイクロモルのスケール
５´−アミノ標識オリゴヌクレオチドを、５´Ａｍｉｎｏ ｍｏｄｉｆｉｅｒ Ｃ６ ＴＦＡアミダイト（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈより入手）を用いて、ＡＫＴＡ Ｏｌｉ
ｇｏＰｉｌｏｔ（１００マイクロモル）ＤＮＡ合成機で合成した。脱保護は、濃縮水酸化アンモニウム中で、一晩、６０℃で実施し、５´−アミノヘキシル標識オリゴヌクレオチドを得た。得られたオリゴヌクレオチドを、乾燥するまで脱水させ、７５ｍｌの２Ｍ ＮａＣｌに再溶解し、５００ｍｌのＧ−２５カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で脱塩した。脱塩の後、オリゴヌクレオチドを乾燥するまで脱水させ、次いで、５０ｍｌの０．５Ｍ 炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．０）に再溶解した。スクシンイミジルエステル色素（ＰＢＩ４４５１、４５１０、４５７４、４５６３、４５６６および４５０９）を、２０μｌ／ｍｇの濃度でＤＭＦ中に溶解した。２４００μｌの色素／ＤＭＦ溶液を、溶解オリゴヌクレオチドに滴下して加えた。反応物を、室温で１時間、混合した。色素が結合したオリゴヌクレオチドを、酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）溶液で中性化し、２Ｘ体積のエタノールから沈殿させた。沈殿したオリゴヌクレオチドを、６０分間、９０００ｒｐｍで遠心し、上清を移して捨て、得られた固形物を７０ｍｌの水に溶解し、イオン交換クロマトグラフィーで精製した。オリゴヌクレオチドを濃縮し、接線流限外ろ過を用いて脱塩し、次いで、乾燥するまで脱水した。−２０℃で保存した。

【0176】

Ｂ．ホスホルアミダイト色素でオリゴヌクレオチドを標識する。
ｉ．１マイクロモルのスケール
５´標識オリゴヌクレオチドは、アセトニトリル中で０．１Ｍまで溶解した本発明のホスホルアミダイト色素（ＰＢＩ３８８５）を用いて、ＡＢＩ３９４ＤＮＡ合成機（１マイクロモル）で合成した。脱保護は、ｔ−ブチルアミン／ＭｅＯＨ／水（２５／２５／５０）中で、一晩、６０℃で実施し、５´標識オリゴヌクレオチドを得た。得られたオリゴヌクレオチドを、乾燥するまで脱水させ、０．０１Ｍ重炭酸トリエチルアンモニウムに再溶解し、アセトニトリル／０．１Ｍ ＴＥＡＡ緩衝系を用いて、Ｐｈｅｎｏｍｏｎｅｘ Ｊｕｐｉｔｅｒ Ｃ１８カラムで、逆相ＨＰＬＣにより精製した。ＨＰＬＣ精製オリゴヌクレオチドを乾燥するまで脱水し、０．０１Ｍ重炭酸トリエチルアンモニウムに再溶解し、ＮＡＰ−１０カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で脱塩した。最後の脱塩ステップの後、オリゴヌクレオチドを乾燥するまで脱水し、−２０℃で保存した。

【0177】

ｉｉ．１００マイクロモルのスケール
５´標識オリゴヌクレオチドを、アセトニトリル中で０．１Ｍまで溶解した本発明のホスホルアミダイト色素（ＰＢＩ３８８５）を用いて、ＡＫＴＡ ＯｌｉｇｏＰｉｌｏｔＤＮＡ合成機（１００マイクロモル）で合成した。脱保護はｔ−ブチルアミン／ＭｅＯＨ／水（２５／２５／５０）中で、一晩、６０℃で実施し、５´標識オリゴヌクレオチドを得た。得られたオリゴヌクレオチドを、乾燥するまで脱水させ、０．０１Ｍ重炭酸トリエチルアンモニウムに再溶解し、イオン交換ＨＰＬＣにより精製した。得られた精製オリゴヌクレオチドを濃縮し、接線流限外ろ過を用いて脱塩し、乾燥するまで脱水した。標識オリゴヌクレオチドを−２０℃で保存した。

【0178】

〔実施例３５〕
本発明の色素で標識されたオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲおよびマルチプレックスＰＣＲ
本発明の色素で６色素マルチプレックスＰＣＲを実施できることを実証するために、２４ＳＴＲ遺伝子座に対するプライマー対を含むマルチプレックス反応を実施した。

【0179】

マルチプレックス反応のために、２１ＳＴＲ遺伝子座に対する５ｘプライマー対マスターミックス（「５ｘ２１ＳＴＲ Ｐｒｉｍｅｒ Ｍｉｘ」）（表１に概要をまとめる）ならびに、反応緩衝液およびＧｏＴａｑ（登録商標）ＨｏｔＳｔａｒｔＤＮＡポリメラーゼを含有する５ｘリアクションマスターミックス（「「５ｘＲｅａｃｔｉｏｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ」）を作製した。また、２１ＳＴＲ遺伝子座プライマー対に加えて、追加のプライマー対を、本発明の色素を用いて表２に記載するように調製した。これらの追加のプライマー対は、０．１ｍＭのＥＤＴＡを含む１ｍＭ ＭＯＰＳ中で、２５℃、最終ｐＨ約７．５で、１５０μＭで作製された。

【表6】

【0180】

【表7】

【0181】

次いで、マルチプレックス反応を以下のように準備した。
Ａ．マルチプレックス１ミックス（１０反応用）：
５ｘ２１−ＳＴＲプライマーミックス：５０μｌ
５ｘリアクションマスターミックス：５０μｌ
４５１０−Ｄ２２Ｓ１０４５プライマー対（０．６μＭ）：１μｌ
４５１０−Ｄ２Ｓ４４１プライマー対（０．６μＭ）：１μｌ
４５１０−ＤＹＳ３９１プライマー対（０．６μＭ）：１μｌ
ヌクレアーゼなしの水：１３７μｌ
Ｂ．マルチプレックス２ミックス（１０反応用）：
５ｘ２１−ＳＴＲプライマーミックス：５０μｌ
５ｘリアクションマスターミックス：５０μｌ
４５６３−Ｄ２２Ｓ１０４５プライマー対（０．６μＭ）：１μｌ
４５６３−Ｄ２Ｓ４４１プライマー対（０．６μＭ）：１μｌ
４５６３−ＤＹＳ３９１プライマー対（０．６μＭ）：１μｌ
ヌクレアーゼなしの水：１３７μｌ
Ｃ．マルチプレックス３ミックス（１０反応用）：
５ｘ２１−ＳＴＲプライマーミックス：５０μｌ
５ｘリアクションマスターミックス：５０μｌ
４５７４−Ｄ２２Ｓ１０４５プライマー対（０．６μＭ）：１μｌ
４５７４−Ｄ２Ｓ４４１プライマー対（０．６μＭ）：１μｌ
４５７４−ＤＹＳ３９１プライマー対（０．６μＭ）：１μｌ
ヌクレアーゼなしの水：１３７μｌ
Ｄ．マルチプレックス４ミックス（１０反応用）：
５ｘ２１−ＳＴＲプライマーミックス：５０μｌ
５ｘリアクションマスターミックス：５０μｌ
４５１０−Ｄ２２Ｓ１０４５プライマー対（２．４μＭ）：４μｌ
４５１０−Ｄ２Ｓ４４１プライマー対（２．４μＭ）：４μｌ
４５１０−ＤＹＳ３９１プライマー対（２．４μＭ）：４μｌ
ヌクレアーゼなしの水：１２８μｌ
Ｅ．マルチプレックス５ミックス（１０反応用）：
５ｘ２１−ＳＴＲプライマーミックス：５０μｌ
５ｘリアクションマスターミックス：５０μｌ
４５６３−Ｄ２２Ｓ１０４５プライマー対（２．４μＭ）：４μｌ
４５６３−Ｄ２Ｓ４４１プライマー対（２．４μＭ）：４μｌ
４５６３−ＤＹＳ３９１プライマー対（２．４μＭ）：４μｌ
ヌクレアーゼなしの水：１２８μｌ
Ｆ．マルチプレックス３ミックス（１０反応用）：
５ｘ２１−ＳＴＲプライマーミックス：５０μｌ
５ｘリアクションマスターミックス：５０μｌ
４５７４−Ｄ２２Ｓ１０４５プライマー対（２．４μＭ）：４μｌ
４５７４−Ｄ２Ｓ４４１プライマー対（２．４μＭ）：４μｌ
４５７４−ＤＹＳ３９１プライマー対（２．４μＭ）：４μｌ
ヌクレアーゼなしの水：１２８μｌ

【0182】

次いで、各マルチプレックスミックスを２４μｌ、９６ウェルＰＣＲプレートのウェルに加えた。１ｎｇ／μＬの男性ＤＮＡ（２８００Ｍ Ｐｒｏｍｅｇａカタログ番号ＤＤ７１０１または９９４８ Ｐｒｏｍｅｇａカタログ番号ＤＤ２０６Ａ）を１μｌ、または０．５ｎｇ／μＬの男性ＤＮＡ（Ｃ２７４またはＱＣ２；Ｐｒｏｍｅｇａ）を１μｌ、各ウェルに加えた。様々な単一源の男性ＤＮＡ試料を用いて、様々な対立遺伝子パターンでの色素のバランスおよび裏抜け／ブリッジングの変動を測定した。次いで、以下のサイクル条件を用いて、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ９７００サーマルサイクラーで反応を実行した：９６℃を１分、次いで、９４℃で１０秒、５９℃で１分、７２℃で３０秒を３０サイクル、６０℃で１０分、そして４℃で維持。次いで、反応をＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３５００ｘＬ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒで分析した（図４〜８）。

【0183】

この実施例により、本発明の色素が、マルチプレックスＰＣＲにおいて、良好なシグナルを有し、そして裏抜けまたはブリッジングがほとんどなく、非常によく機能することが実証されている。

【0184】

〔実施例３６〕
本発明の色素を用いた細胞標識
本発明の色素を細胞標識に用いることができるかどうかを測定するために、色素を、ＨａｌｏＴａｇ（登録商標）リガンド（Ｐｒｏｍｅｇａ）に結合させ、ＨａｌｏＴａｇ（登録商標）タンパク質またはＨａｌｏＴａｇ（登録商標）融合タンパク質の活性／運動をモニターした。細胞標識に対して、リガンド番号３７８０、３７８１、３７８２、３７８３、３９０５、３９０６、３９５４、４３５６および４３５７を用いた（表３）。ＨａｌｏＴａｇ（登録商標）タンパク質を核内で安定的に発現しているＵ２ＯＳ細胞（ＨＴ−ＮＬＳ）を用いて、リガンドの細胞透過性を検証した。一部の例において、結合しなかったリガンドの除去効率もまた、測定された。ＨＴ−ＮＬＳ撮像が明らかなリガンド除去問題を示さなかったリガンドは、さらに、ｐ６５−ＨａｌｏＴａｇ（登録商標）融合（ｐ６５−ＨＴ）を用いて、細胞質でＨａｌｏＴａｇ（登録商標）タンパク質を安定的に発現している細胞およびＨａｌｏＴａｇ（登録商標）タンパク質を発現していないＵ２ＯＳ細胞で検証された。Ｕ２ＯＳ ｐ６５−ＨＴ安定細胞を用いて、中〜低発現融合タンパク質に対する撮像パラメーターを確立した。次いで、これらの同じパラメーターを用いて、ＨａｌｏＴａｇを発現していないＵ２ＯＳ細胞における非結合リガンドの除去を分析した。全てのリガンドは、細胞での使用の前に、ＤＭＳＯで１０ｍＭにまで希釈された。

【表8】

【0185】

すべての撮像実験のために、Ｕ２ＯＳ細胞を、仕切りのあるＬａｂ−Ｔｅｋ ＩＩ ＣＧ（Ｎｕｎｃ）カバースリップに播種し、一晩、３７℃＋５％ＣＯ₂に置き、付着させた。迅速標識プロトコールで、１μＭのリガンドに細胞を曝した。簡潔に言うと、ＡＴＣＣ推奨完全培地の存在下で、１５分間、３７℃＋５％ＣＯ₂および８００μｇ／ｍｌのＧ４１８（Ｐｒｏｍｅｇａ）でリガンドに細胞を曝した。標識の後、細胞を完全培地で３回リンスし、３０分間、３７℃＋５％ＣＯ₂でインキュベートした。次いで、培地を新しい完全培地と交換し、細胞を、撮像のために共焦点顕微鏡へと移した。

【0186】

一部の例において、ＨＴ−ＮＬＳを安定的に発現しているＵ２ＯＳ細胞を、無洗浄プロトコールで標識した。簡潔に言うと、細胞を１００ｎＭのリガンドに一晩、３７℃＋５％ＣＯ₂に曝した。これらの例の場合、リガンドを、細胞播種時に添加した。翌日、リガンドを含有する培地を、新しい完全培地と交換し、細胞を、撮像のために共焦点顕微鏡へと移した。

【0187】

共焦点像は、３７℃＋ＣＯ₂の人口気候室（Ｓｏｌｅｎｔ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｌｔｄ．，ＵＫ）および適切なフィルターセットを備えられたＯｌｙｍｐｕｓ Ｆｌｕｏｖｉｅｗ ＦＶ５００共焦点顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ、ＵＳＡ）を用いて得た（図９〜１６を参照のこと）。

【0188】

リガンドの標識効率を定量化するために、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を実施した。簡潔に言うと、細胞を撮像のために上述のように播種し、最初に１μＭのリガンドで、１５分間、３７℃＋５％ＣＯ₂で標識した。リガンド含有培地を、次いで、５μＭのＨａｌｏＴａｇ（登録商標）ＴＭＲリガンド（Ｐｒｏｍｅｇａ；カタログ番号Ｇ８２５２）を含有する培地と交換し、１５分間、３７℃＋５％ＣＯ₂でインキュベートした。次いで、細胞を３回リンスし、３０分間、３７℃＋５％ＣＯ₂で洗浄した。次いで、細胞を１ｘＰＢＳで１回リンスし、１ｘＳＤＳゲルローディング緩衝液（４ｘ緩衝液（０．２４Ｍトリス、２％ＳＤＳ、５０．４％グリセロール、０．４Ｍ ＤＴＴ、３ｍＭ ブロモフェノールブルーおよび塩酸でｐＨ６．８に調整）水で希釈）中で回収し、９５℃、５分間静置し、４〜２０％のトリス−グリシンプレキャストゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上に負荷した。次いで、ゲルを、Ｔｙｐｈｏｏｎ ９４１０（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてスキャンした（図１７）。

【0189】

標識後の細胞の生存能力を測定するために、細胞を、白色組織培養処置Ｃｏｓｔａｒ９６ウェルプレート（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に播種した。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ ＡｓｓａｙおよびＨａｌｏＴａｇ（登録商標）タンパク質アレイの両方を、メーカーのプロトコール（Ｐｒｏｍｅｇａ）に従い実施した。簡潔に言うと、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏアッセイについては、１００μｌのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ試薬を、細胞を含有する培地１００μｌに添加した。内容物は、軌道振とう器上で２分間、混合し、室温で１０分間インキュベートした。発光は、ＧｌｏＭａｘ（登録商標）Ｍｕｌｔｉ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて測定された。生成された発光シグナルは、試料中に存在するＡＴＰの量（培養物中に存在する細胞数に正比例する）に正比例した。

【0190】

ゲルベースの分析に対するリガンド３７８２の活用を評価するために、その性能を、ＨａｌｏＴａｇ（登録商標）ＴＭＲリガンド（Ｐｒｏｍｅｇａカタログ番号Ｇ８２５２）のものと比較した。これを行うに、セルなしの系中で発現されたタンパク質を標識するための標準Ｐｒｏｍｅｇａプロトコールを使用した。簡潔に言うと、各リガンドを、１ｘＰＢＳ中で１０μＭにまで希釈し、大腸菌から精製された２μｌの各ＨａｌｏＴａｇ（登録商標）−ＧＳＴ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、またはＨａｌｏＴａｇ（登録商標）−プロテインＧに各リガンド１μｌを添加した。次いで、１ｘＰＢＳを７μｌ、総体積１０μｌで各標識反応物に添加し、反応物を、室温で３０分間、遮光してインキュベートした。次いで５μｌの各標識反応物を、５μｌの２ｘＳＤＳゲルローディング緩衝液に加え、２分間、７０℃に加熱した。次いで、試料をＳＤＳポリアクリルアミドゲルに負荷し、泳動して、上述のように蛍光スキャナーを用いて可視化した（図１８および１９）。

【0191】

〔実施例３７〕
５−（（２−（４−（３−ｔｅｒｔ−ブチル−５−（３−フェニルウレイド）−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）ベンジルアミノ）−２−オキソエチル）カルバモイル）−２−ビス（ピペリジンアゼピノ）ローダミン（ＰＢＩ４８３８）の合成

【化59】

ＰＢＩ４８３８

【0192】

標題の化合物は、ＰＢＩ−３７８１（実施例２１）と同様の方法で、ビス（ピペリジンアゼピノ）−６−カルボキシローダミンおよび１−（１−（４−（（２−アミノアセトアミド）メチル）フェニル）−３−ｔｅｒｔ−ブチル−１Ｈ−ピラゾール−５−イル）−３−フェニルウレア（Tecle et al. 2009, Chem. Biol.. Drug Des., 74:547-559）を用いて合成された：ＭＳは８１５（Ｃ₅₈Ｈ₆₁Ｎ₈Ｏ₆⁺、Ｍ＋）を予期し、実測値は８１５。

【0193】

〔実施例３８〕
ＰＢＩ４８２８を用いた生物発光共鳴エネルギー転移（ＢＲＥＴ）
本発明の色素をＢＲＥＴ用途に用いることが出来ることを実証するために、本発明の色素（ＰＢＩ４８３８）を含有する蛍光色素トレーサーを作製し、生きている細胞内で、既知の薬剤のキナーゼ標的への結合をモニターした。この実施例においては、ｐ３８アルファキナーゼ阻害剤（ＢＩＲＢ７９６）を足場として用いて、ＰＢＩ４８３８を含有する不活性ｐ３８アルファキナーゼに対する蛍光トレーサーを作製した（Tecle et al. 2009. Chem Biol Drug Des: 74: 547-559;図２０）。次いで、そのトレーサーを、ＮａｎｏＬｕｃルシフェラーゼ−ｐ３８アルファキナーゼ融合タンパク質を発現している生きている細胞または溶解した細胞に適用した。ＮａｎｏＬｕｃルシフェラーゼに対するフリマジン（ｆｕｒｉｍａｚｉｎｅ）基質を添加すると、用量依存的なＢＲＥＴが生細胞および溶解細胞の両方で測定された。

【0194】

ＨＥＫ２９３細胞（９６ウェルフォーマットで、２０，０００細胞／ウェル）を、ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）ルシフェラーゼ−ｐ３８アルファキナーゼ融合タンパク質をコードするｐＦ５プラスミドＤＮＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）で一過性にトランスフェクト（Ｆｕｇｅｎｅ ＨＤ， Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）した。陰性対照として、一部の細胞は、ＮａｎｏＬｕｃルシフェラーゼ−ＰＫＣアルファ融合タンパク質をコードするｐＦ５プラスミドＤＮＡでトランスフェクトした。トランスフェクト後２日目に、細胞培地を、５０ｕｇ／ｍｌのジギトニンを含む、または含まない無血清Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と交換した。

【0195】

トレーサー飽和実験のために、モル過剰のＢＩＲＢ７９６（最終１０ｕＭ）の存在下または非存在下、段階希釈したＰＢＩ４８３８で細胞を処置した。

【0196】

ＢＩＲＢ７９６競合実験に対しては、段階希釈したＢＩＲＢ７９６を、０．５ｕＭ ＰＢＩ４８３８（最終濃度）の存在下または非存在下で、細胞に適用した。

【0197】

次いで、細胞を３７℃で２時間、トレーサーおよびＢＩＲＢ７９６で平衡させた。ＮａｎｏＬｕｃルシフェラーゼに対する基質である、フリマジン基質（ＰＢＩ３９３９）を、次いで、最終濃度２０ｕＭまで細胞に添加した。ＢＲＥＴ比は、Ｖａｒｉｏｓｋａｎ照度計を用いて、以下の波長で記録した：６３０ｎｍ（アクセプター）／４５０ｎｍ（ドナー）。アクセプター／ドナー値を用いて、ＢＲＥＴ比を決定した（図２１および２２）。

【0198】

データより、本発明の色素は、ＢＲＥＴ用途に用いることが出来ることが実証された。トレーサー飽和実験においては、ＮａｎｏＬｕｃ−ｐ３８アルファを発現している生細胞または透過化細胞を、段階希釈したＰＢＩ４８３８とインキュベートし、ＢＲＥＴの用量依存的な増加が得られた。その結果より、生細胞中で、ＰＢＩ４８３８がＮａｎｏＬｕｃ融合タンパク質に結合していることが示唆される。極度にモル過剰な非標識ＢＩＲＢ７９６の存在下では、ＢＲＥＴシグナルは完全に阻害され、このことから、ＮａｎｏＬｕｃ−ｐ３８アルファとＰＢＩ４８３８の間のほぼ全てのＢＲＥＴシグナルが特異的なものであることが示される。ＢＩＲＢ７９６競合実験については、データより、非標識ＢＩＲＢ７９６と用量依存的に、ＰＢＩ−４８３８の固定濃度が競合的に置き換えることが出来ることを示している。対照実験によりさらに、ＰＢＩ４８３８とＮａｎｏＬｕｃｐ３８アルファとの間の特異的ＢＲＥＴシグナルの特異性が、支持される。これにより、無関係のキナーゼに融合したＮａｎｏＬｕｃを発現する細胞の使用が実証される。対照実験において、ＮａｎｏＬｕｃ−ＰＫＣアルファを発現している細胞は、ＰＢＩ４８３８の存在下で、ごく微量のＢＲＥＴシグナルを示すのみであり、非標識ＢＩＲＢ７９６の影響を受けない。

【0199】

〔実施例３９〕
ＰＢＩ３７８１を用いた、生物発光共鳴エネルギー転移（ＢＲＥＴ）
本発明の色素をＢＲＥＴ応用に用いることが出来ることを実証するために、本発明の蛍光色素を、実施例２１に記載のようにクロロアルカンに結合させた。色素−クロロアルカン複合体ＰＢＩ３７８１が、共有結合的にＨａｌｏＴａｇ（登録商標）タンパク質またはＨａｌｏＴａｇ（登録商標）融合タンパク質に結合することによって、ＨａｌｏＴａｇまたはＨａｌｏＴａｇ（登録商標）融合タンパク質を検出および／または測定することができる。ＰＢＩ３７８１をＨａｌｏＴａｇ（登録商標）およびＮａｎｏＬｕｃ融合タンパク質と組み合わせて用いて、生きている細胞中でのタンパク質−タンパク質相互作用を、ＢＲＥＴを介して測定した。

【0200】

この実施例において、ラパマイシン介在性の、ＮａｎｏＬｕｃルシフェラーゼ−ｍＴＯＲ（Ｆｒｂ）のＦＫ５０６結合ドメイン融合物および、ＨａｌｏＴａｇ−ＦＫＢＰ１２融合物（ＦＫ５０６結合タンパク質）の間の相互作用を用いて、誘導性タンパク質−タンパク質相互作用を実証した。相互作用は、ＮａｎｏＬｕｃ−ＦＲＢ融合物（ドナー）とＰＢＩ３７８１に結合したＨａｌｏＴａｇ−ＦＫＢＰ１２融合物（アクセプター）の間に発生するラパマイシン依存性のＢＲＥＴの増加として計測された（図２３Ａ）。

【0201】

Ｆｒｂ−ＮａｎｏＬｕｃまたはＦＲＫＢＰ１２−ＨａｌｏＴａｇ（登録商標）融合タンパク質の発現を目的として、メーカーの説明書（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）に従って、ＦｕＧＥＮＥ（登録商標）ＨＤ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔを用いて、ＨｅＬａ細胞を、ｐＦ５ベースの構築物（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）と共トランスフェクトした。次いで、細胞を、一晩、３７℃、５％ＣＯ₂でインキュベートした。

【0202】

トランスフェクションの１日後、細胞を回収し、９６ウェルの白い組織培養プレートのウェルに、１００μＬ ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳで、２００，０００細胞／ウェルで再播種し、３７℃、５％ＣＯ₂で２４時間インキュベートした。

【0203】

トランスフェクションの２日後、増殖培地を、５００ｎＭのＰＢＩ３７８１を含有するフェノールレッドなしのＤＭＥＭ＋５％ＦＢＳと交換し、細胞を、３７℃、５％ＣＯ₂で１２０分間インキュベートした。次いで、細胞をフェノールレッドなしのＤＭＥＭに溶解し連続希釈したラパマイシン５０μＬで処置し、室温で１５分間インキュベートした。フェノールレッドなしのＤＭＥＭに溶解した４０ｍＭフリマジンを５０μＬ加え、Ｔｈｅｒｍｏ Ｖａｒｉｏｓｋａｎプレートリーダーを用いてＢＲＥＴを測定した（５００ミリ秒の積分時間；ドナーチャンネル発光４５０／６０ バンドパスフィルター；アクセプターチャンネル発光６１０ｎｍ ロングパスカラーグラスフィルター）（図２４）。

【0204】

本実験により、ラパマイシンの連続希釈添加後の完全ＢＲＥＴシグナルの濃度依存性の変化が実証される。また、色素−クロロアルカンＨａｌｏＴａｇ（登録商標）リガンド（たとえば、ＰＢＩ３７８１）を組み合わせた、ＮａｎｏＬｕｃとＨａｌｏＴａｇ（登録商標）融合タンパク質の適切なペアを用いて、本実験は、本発明の色素が、他の細胞内タンパク質−タンパク質相互作用の検出に用いることができることを実証する。

【0205】

〔実施例４０〕
色素−シアノベンゾチアゾール複合体の使用に関する予測実施例。
たとえば、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）に対する上皮増殖因子（ＥＧＦ）等のリガンドの相互作用を、全細胞群で計測することができる。そのような例において、ＨａｌｏＴａｇとＥＧＦタンパク質ドメインの間のＴＥＶプロテアーゼ開裂部位（ＴＥＶプロテアーゼ開裂部位の最終残基はシステイン残基をコードする）を含有するＨａｌｏＴａｇ−ＥＧＦ融合タンパク質を用いることができる。ＴＥＶプロテアーゼでの開裂で、Ｃｙｓ−ＥＧＦタンパク質が生成され、たとえばＰＢＩ５１２２等のＣＢＴ標識化合物と反応しうる（実施例３３）。ＰＢＩ５１２２−Ｃｙｓ−ＥＧＦは、生細胞中で発現されるＮａｎｏＬｕｃ−ＥＧＦＲ融合タンパク質に結合することができるプローブとして使用することができる。ごく近接して結合することで、エネルギー転移（ＢＲＥＴ）が発生し得、色素発光の増加がもたらされる。別の構成において、非標識ＥＧＦ、または類似の結合メカニズムのリガンドは、ＰＢＩ５１２２−ＥＧＦ：ＮａｎｏＬｕｃ−ＥＧＦＲの複合体を妨害し、エネルギー転移の減少をもたらす。これらの標識化学物質の適合性およびエネルギー転移法により、全細胞で創出されるリガンドと受容体のリガンド結合事象を定量化することができる。
本発明のまた別の態様は、以下のとおりであってもよい。
〔１〕式（Ｉａ）または式（Ｉｂ）：

に記載の化合物であって、式中、
Ｒ¹およびＲ¹¹は、独立して、ＨまたはＣ_1-4アルキル、Ｌ−ＲもしくはＬ−Ｃ_Sであり、
Ｌは、１〜１６の非水素原子を有する、直鎖もしくは分枝状、環状もしくは複素環式の飽和または不飽和である共有結合であり、当該結合が、エステル、酸、アミン、アミド、アルコール、エーテル、チオエーテルもしくはハロゲン基のうちの組み合わせを含有するものであるか、または、一重、二重、三重もしくは芳香族の炭素−炭素結合であり、
Ｒは、反応基であり、
Ｃ_Sは、結合物質であり、
Ｒ²、Ｒ⁵、Ｒ¹²およびＲ¹⁵は、独立して、Ｈ、アルキル、アリール、ヘテロアリール、ＣＯ₂Ｈ、ＳＯ₃Ｈ、Ｌ−ＣＯ₂Ｈ、Ｌ−ＳＯ₃Ｈ、Ｌ−ＲまたはＬ−Ｃ_Sであり、
Ｒ²⁰、Ｒ²¹、Ｒ²²、Ｒ²³、Ｒ²⁴、Ｒ²⁵およびＲ²⁶は、独立して、ＨまたはＣ_1-6アルキルであるか、または、Ｒ²⁰およびＲ²¹、Ｒ²¹およびＲ²²、Ｒ²²およびＲ²³、Ｒ²⁴およびＲ²⁵、Ｒ²⁵およびＲ²⁶、ならびにＲ²⁶およびＲ²³の一つ以上が、アリール環、ヘテロアリール環、炭素環または複素環を共に形成し、
Ｒ¹およびＲ²、ならびに／または、Ｒ¹¹およびＲ¹²は、炭素環、複素環、アリール環、またはヘテロアリール環を共に形成してもよく、
Ｒ^6-10は、独立して、Ｈ、ハロ、ＯＨ、アルキル、アリール、ヘテロアリール、ＣＯ₂Ｈ、ＳＯ₃Ｈ、Ｌ−ＣＯ₂Ｈ、Ｌ−ＳＯ₃Ｈ、Ｌ−ＲまたはＬ−Ｃ_Sであり、
各Ｘは、独立して、ＣＨＲ²³、Ｏ、ＳまたはＮＲ³⁰であり、および、
Ｒ³⁰は、Ｈ、Ｃ_1-4アルキルまたは−Ｃ（Ｏ）Ｃ_1-4アルキルである、化合物。
〔２〕式（ＩＩａ）または式（ＩＩｂ）：

に記載の化合物であって、式中、
Ｒ¹およびＲ¹¹は、独立して、ＨまたはＣ_1-4アルキル、Ｌ−ＲもしくはＬ−Ｃ_Sであり、
Ｌは、１〜１６の非水素原子を有する、直鎖もしくは分枝状、環状もしくは複素環式の飽和または不飽和である共有結合であり、当該結合が、エステル、酸、アミン、アミド、アルコール、エーテル、チオエーテルもしくはハロゲン基のうちの組み合わせを含有するものであるか、または、一重、二重、三重もしくは芳香族の炭素−炭素結合であり、
Ｒは、反応基であり、
Ｃ_Sは、結合物質であり、
Ｒ²、Ｒ³、Ｒ⁴、Ｒ⁵、Ｒ¹²、Ｒ¹³、Ｒ¹⁴およびＲ¹⁵は、独立して、Ｈ、アルキル、アリール、ヘテロアリール、ＣＯ₂Ｈ、ＳＯ₃Ｈ、Ｌ−ＣＯ₂Ｈ、Ｌ−ＳＯ₃Ｈ、Ｌ−ＲまたはＬ−Ｃ_Sであり、
Ｒ²⁰、Ｒ²¹、Ｒ²²、Ｒ²³、Ｒ²⁴、Ｒ²⁵およびＲ²⁶は、独立して、ＨまたはＣ_1-6アルキルであるか、または、Ｒ²⁰およびＲ²¹、Ｒ²¹およびＲ²²、Ｒ²²およびＲ²³、Ｒ²⁴およびＲ²⁵、Ｒ²⁵およびＲ²⁶、ならびにＲ²⁶およびＲ²³の一つ以上が、アリール環、ヘテロアリール環、炭素環または複素環を共に形成し、
Ｒ¹およびＲ²、ならびに／または、Ｒ¹¹およびＲ¹²は、炭素環、複素環、アリール環、またはヘテロアリール環を共に形成してもよく、
Ｒ^6-10は、独立して、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＯＨ、アルキル、アリール、ヘテロアリール、ＣＯ₂Ｈ、ＳＯ₃Ｈ、Ｌ−ＣＯ₂Ｈ、Ｌ−ＳＯ₃Ｈ、Ｌ−ＲまたはＬ−Ｃ_Sであり、 各Ｘは、独立して、ＣＨＲ²³、Ｏ、ＳまたはＮＲ³⁰であり、および、
Ｒ³⁰は、Ｈ、Ｃ_1-4アルキルまたは、−Ｃ（Ｏ）Ｃ_1-4アルキルである、化合物。
〔３〕Ｒ¹²およびＲ¹³が、共に環を形成する、前記〔２〕に記載の化合物。
〔４〕Ｒ¹⁴およびＲ¹⁵が、共に環を形成する、前記〔２〕または前記〔３〕に記載の化合物。
〔５〕Ｒ²⁴が、Ｈである、前記〔１〕〜〔４〕のいずれか１項に記載の化合物。
〔６〕Ｒ²⁵が、Ｈである、前記〔１〕〜〔５〕のいずれか１項に記載の化合物。
〔７〕Ｒ²⁶が、Ｈである、前記〔１〕〜〔６〕のいずれか１項に記載の化合物。
〔８〕式（ＩＩＩａ）、式（ＩＩＩｂ）または式（ＩＩＩｃ）：

に記載の化合物であって、式中、
Ｒ¹¹は、独立して、ＨまたはＣ_1-4アルキル、Ｌ−ＲもしくはＬ−Ｃ_Sであり、
Ｌは、１〜１６の非水素原子を有する、直鎖もしくは分枝状、環状もしくは複素環式の飽和または不飽和である共有結合であり、当該結合が、エステル、酸、アミン、アミド、アルコール、エーテル、チオエーテルもしくはハロゲン基のうちの組み合わせを含有するものであるか、または、一重、二重、三重もしくは芳香族の炭素−炭素結合であり、
Ｒは、反応基であり、
Ｃ_Sは、結合物質であり、
Ｒ²およびＲ¹⁶は、独立して、Ｈ、アルキル、アリール、ヘテロアリール、ＣＯ₂Ｈ、ＳＯ₃Ｈ、Ｌ−ＣＯ₂Ｈ、Ｌ−ＳＯ₃Ｈ、Ｌ−ＲまたはＬ−Ｃ_Sであり、
Ｒ³およびＲ⁴は、Ｈ、アルキル、Ｌ−Ｒ、Ｌ−Ｃ_S、Ｌ−ＣＯ₂Ｈ、Ｌ−ＳＯ₃Ｈであるか、または、炭素環、アリール環、ヘテロアリール環もしくは複素環を共に形成し、
あるいは、Ｒ²およびＲ³、ならびに、独立して、Ｒ⁴およびＲ¹⁶は、炭素環、複素環、アリール環、またはヘテロアリール環を共に形成し、
Ｒ⁵、Ｒ¹²、Ｒ¹³、Ｒ¹⁴およびＲ¹⁵は、独立して、Ｈ、アルキル、アリール、ヘテロアリール、ＣＯ₂Ｈ、ＳＯ₃Ｈ、Ｌ−ＣＯ₂Ｈ、Ｌ−ＳＯ₃Ｈ、Ｌ−ＲまたはＬ−Ｃ_Sであり、 Ｒ²⁰、Ｒ²¹、Ｒ²²およびＲ²³は、独立して、ＨまたはＣ_1-6アルキルであるか、または、Ｒ²⁰およびＲ²¹、Ｒ²¹およびＲ²²、Ｒ²²およびＲ²³の一つ以上が、アリール環、ヘテロアリール環、炭素環または複素環を共に形成し、
Ｒ¹¹およびＲ¹²は炭素環、複素環、アリール環、またはヘテロアリール環を共に形成してもよく、
Ｒ^6-10は、独立して、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＯＨ、アルキル、アリール、ヘテロアリール、ＣＯ₂Ｈ、ＳＯ₃Ｈ、Ｌ−ＣＯ₂Ｈ、Ｌ−ＳＯ₃Ｈ、Ｌ−ＲまたはＬ−Ｃ_Sであり、 Ｘは、ＣＨＲ²³、Ｏ、ＳまたはＮＲ³⁰であり、および、
Ｒ³⁰は、Ｈ、Ｃ_1-4アルキルまたは、−Ｃ（Ｏ）Ｃ_1-4アルキルである、化合物。
〔９〕Ｘが、ＣＨ₂である、前記〔１〕〜〔８〕のいずれかに記載の化合物。
〔１０〕Ｒ¹が、Ｃ_1-4アルキル前記〔１〕〜〔４〕または前記〔５〕〜〔９〕のいずれか１項に記載の化合物。
〔１１〕Ｒ¹が、メチルまたはエチルである、前記〔１０〕に記載の化合物。
〔１２〕Ｒ¹およびＲ²が、５〜７員炭素環を形成する、前記〔１〕〜〔４〕または前記〔５〕〜〔９〕のいずれか１項に記載の化合物。
〔１３〕前記環が、６員環である、前記〔１２〕に記載の化合物。
〔１４〕Ｒ¹¹が、Ｃ_1-4アルキルである、前記〔１〕〜〔１３〕のいずれかに記載の化合物。
〔１５〕Ｒ¹¹が、メチルまたはエチルである、前記〔１４〕に記載の化合物。
〔１６〕Ｒ¹²が、Ｈ、ＣｌまたはＯＭｅである、前記〔１〕〜〔１５〕のいずれかに記載の化合物。
〔１７〕Ｒ¹¹およびＲ¹²が、５〜７員炭素環を形成する、前記〔１〕〜〔１３〕のいずれか１項に記載の化合物。
〔１８〕前記環が、６員環である、前記〔１７〕に記載の化合物。
〔１９〕Ｒ²⁰が、Ｈである、前記〔１〕〜〔１８〕のいずれか１項に記載の化合物。
〔２０〕Ｒ²¹が、Ｈである、前記〔１〕〜〔１９〕のいずれか１項に記載の化合物。
〔２１〕Ｒ²²が、Ｈである、前記〔１〕〜〔２０〕のいずれか１項に記載の化合物。
〔２２〕Ｒ²³が、Ｈである、前記〔１〕〜〔２１〕のいずれか１項に記載の化合物。
〔２３〕式（ＩＶ）：

に記載の化合物であって、式中、
Ｒ²およびＲ¹⁶は、独立して、Ｈ、アルキル、アリール、ヘテロアリール、ＣＯ₂Ｈ、ＳＯ₃Ｈ、Ｌ−ＣＯ₂Ｈ、Ｌ−ＳＯ₃Ｈ、Ｌ−ＲまたはＬ−Ｃ_Sであってもよく、
Ｌは、１〜１６の非水素原子を有する、直鎖もしくは分枝状、環状もしくは複素環式の飽和または不飽和である共有結合であり、当該結合が、エステル、酸、アミン、アミド、アルコール、エーテル、チオエーテルもしくはハロゲン基のうちの組み合わせを含有するものであるか、または、一重、二重、三重もしくは芳香族の炭素−炭素結合であり、
Ｒは、反応基であり、
Ｃ_Sは、結合物質であり、
Ｒ³およびＲ⁴は、Ｈまたはアルキルであるか、または、炭素環、アリール環、ヘテロアリール環もしくは複素環を共に形成し、
あるいは、Ｒ²およびＲ³、ならびに、独立して、Ｒ⁴およびＲ¹⁶は、炭素環、複素環、アリール環、またはヘテロアリール環を共に形成し、
Ｒ⁵およびＲ¹⁵は、独立して、Ｈ、アルキル、アリール、ヘテロアリール、ＣＯ₂Ｈ、ＳＯ₃Ｈ、Ｌ−ＣＯ₂Ｈ、Ｌ−ＳＯ₃Ｈ、Ｌ−ＲまたはＬ−Ｃ_Sであり、
Ｒ²²およびＲ²³は、独立して、ＨまたはＣ_1-6アルキルであるか、または、アリール環、ヘテロアリール環、炭素環もしくは複素環を共に形成し、および、
Ｒ^6-10は、独立して、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＯＨ、アルキル、アリール、ヘテロアリール、ＣＯ₂Ｈ、ＳＯ₃Ｈ、Ｌ−ＣＯ₂Ｈ、Ｌ−ＳＯ₃Ｈ、Ｌ−ＲまたはＬ−Ｃ_Sである、化合物。
〔２４〕式（Ｖ）：

に記載の化合物であって、式中、
Ｒ²およびＲ¹⁶は、独立して、Ｈ、アルキル、アリール、ヘテロアリール、ＣＯ₂Ｈ、ＳＯ₃Ｈ、Ｌ−ＣＯ₂Ｈ、Ｌ−ＳＯ₃Ｈ、Ｌ−ＲまたはＬ−Ｃ_Sであってもよく、
Ｌは、１〜１６の非水素原子を有する、直鎖もしくは分枝状、環状もしくは複素環式の飽和または不飽和である共有結合であり、当該結合が、エステル、酸、アミン、アミド、アルコール、エーテル、チオエーテルもしくはハロゲン基のうちの組み合わせを含有するものであるか、または、一重、二重、三重もしくは芳香族の炭素−炭素結合であり、
Ｒは、反応基であり、
Ｃ_Sは、結合物質であり、
Ｒ³およびＲ⁴は、Ｈまたはアルキルであるか、または、炭素環、複素環、アリール環もしくはヘテロアリール環を共に形成し、
あるいは、Ｒ²およびＲ³、ならびに、独立して、Ｒ⁴およびＲ¹⁶は、炭素環、複素環、アリール環、またはヘテロアリール環を共に形成してもよく、
Ｒ⁵およびＲ¹⁵は、独立して、Ｈ、アルキル、アリール、ヘテロアリール、ＣＯ₂Ｈ、ＳＯ₃Ｈ、Ｌ−ＣＯ₂Ｈ、Ｌ−ＳＯ₃Ｈ、Ｌ−ＲまたはＬ−Ｃ_Sであり、
Ｒ²⁰およびＲ²¹は、独立して、ＨまたはＣ_1-6アルキルであるか、または、アリール環、ヘテロアリール環、炭素環もしくは複素環を共に形成し、および、
Ｒ^6-10は、独立して、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＯＨ、アルキル、アリール、ヘテロアリール、ＣＯ₂Ｈ、ＳＯ₃Ｈ、Ｌ−ＣＯ₂Ｈ、Ｌ−ＳＯ₃Ｈ、Ｌ−ＲまたはＬ−Ｃ_Sである、化合物。
〔２５〕Ｒ²が、Ｈ、ＣｌまたはＯＭｅである、前記〔１〕〜〔２４〕のいずれかに記載の化合物。
〔２６〕Ｒ³が、Ｃ_1-4アルキルである、前記〔２〕〜〔２５〕のいずれか１項に記載の化合物。
〔２７〕Ｒ³が、メチルまたはエチルである、前記〔２６〕に記載の化合物。
〔２８〕Ｒ⁴が、Ｃ_1-4アルキルである、前記〔２〕〜〔２７〕のいずれか１項に記載の化合物。
〔２９〕Ｒ⁴が、メチルまたはエチルである、前記〔２８〕に記載の化合物。
〔３０〕Ｒ³が、複素環の一部である、前記〔２〕〜〔２５〕、〔２８〕または〔２９〕のいずれか１項に記載の化合物。
〔３１〕前記複素環が、ピペラジンである、前記〔３０〕に記載の化合物。
〔３２〕Ｒ⁴が、複素環の一部である、前記〔２〕〜〔２７〕のいずれか１項に記載の化合物。
〔３３〕前記複素環が、ピペラジンである、前記〔３２〕に記載の化合物。
〔３４〕Ｒ¹⁶が、Ｈ、ＣｌまたはＯＭｅである、前記〔２３〕〜〔３３〕のいずれか１項に記載の化合物。
〔３５〕式（ＶＩ）：

に記載の化合物であって、式中、
Ｒ⁵およびＲ¹⁵は、独立して、Ｈ、アルキル、アリール、ヘテロアリール、ＣＯ₂Ｈ、ＳＯ₃Ｈ、Ｌ−ＣＯ₂Ｈ、Ｌ−ＳＯ₃Ｈ、Ｌ−ＲまたはＬ−Ｃ_Sであり、
Ｌは、１〜１６の非水素原子を有する、直鎖もしくは分枝状、環状もしくは複素環式の飽和または不飽和である共有結合であり、当該結合が、エステル、酸、アミン、アミド、アルコール、エーテル、チオエーテルもしくはハロゲン基のうちの組み合わせを含有するものであるか、または、一重、二重、三重もしくは芳香族の炭素−炭素結合であり、
Ｒは、反応基であり、
Ｃ_Sは、結合物質であり、
Ｒ²²、Ｒ²³、Ｒ²⁶およびＲ²⁷は、独立して、ＨまたはＣ_1-6アルキルであるか、または、Ｒ²²およびＲ²³およびＲ²⁶およびＲ²⁷のうち一つ以上が、アリール環、ヘテロアリール環、炭素環、または複素環を共に形成し、および、
Ｒ^6-10は、独立して、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＯＨ、アルキル、アリール、ヘテロアリール、ＣＯ₂Ｈ、ＳＯ₃Ｈ、Ｌ−ＣＯ₂Ｈ、Ｌ−ＳＯ₃Ｈ、Ｌ−ＲまたはＬ−Ｃ_Sである、化合物。
〔３６〕Ｒ²⁶が、Ｈである、前記〔３５〕に記載の化合物。
〔３７〕Ｒ²⁷が、Ｈである、前記〔３５〕または前記〔３６〕に記載の化合物。
〔３８〕式（ＶＩＩ）：

に記載の化合物であって、式中、
Ｒ⁵およびＲ¹⁵は、独立して、Ｈ、アルキル、アリール、ヘテロアリール、ＣＯ₂Ｈ、ＳＯ₃Ｈ、Ｌ−ＣＯ₂Ｈ、Ｌ−ＳＯ₃Ｈ、Ｌ−ＲまたはＬ−Ｃ_Sであり、
Ｌは、１〜１６の非水素原子を有する、直鎖もしくは分枝状、環状もしくは複素環式の飽和または不飽和である共有結合であり、当該結合が、エステル、酸、アミン、アミド、アルコール、エーテル、チオエーテルもしくはハロゲン基のうちの組み合わせを含有するものであるか、または、一重、二重、三重もしくは芳香族の炭素−炭素結合であり、
Ｒは、反応基であり、
Ｃ_Sは、結合物質であり、
Ｒ²⁰、Ｒ²¹、Ｒ²⁴およびＲ²⁵は、独立して、ＨまたはＣ_1-6アルキルであるか、または、Ｒ²⁰およびＲ²¹およびＲ²⁴およびＲ²⁵のうち一つ以上が、アリール環、ヘテロアリール環、炭素環、または複素環を共に形成し、および、
Ｒ^6-10は、独立して、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＯＨ、アルキル、アリール、ヘテロアリール、ＣＯ₂Ｈ、ＳＯ₃Ｈ、Ｌ−ＣＯ₂Ｈ、Ｌ−ＳＯ₃Ｈ、Ｌ−ＲまたはＬ−Ｃ_Sである、化合物。
〔３９〕Ｒ²⁴が、Ｈである、前記〔３８〕に記載の化合物。
〔４０〕Ｒ²⁵が、Ｈである、前記〔３８〕または前記〔３９〕に記載の化合物。
〔４１〕Ｒ²⁰が、Ｈである、前記〔２４〕〜〔３４〕または前記〔３８〕〜〔４０〕のいずれか１項に記載の化合物。
〔４２〕Ｒ²¹が、Ｈである、前記〔２４〕〜〔３４〕または前記〔３８〕〜〔４１〕のいずれか１項に記載の化合物。
〔４３〕Ｒ²²が、Ｈである、前記〔２３〕または前記〔２５〕〜〔３７〕のいずれか１項に記載の化合物。
〔４４〕Ｒ²³が、Ｈである、前記〔２３〕または前記〔２５〕〜〔３７〕または前記〔４３〕のいずれか１項に記載の化合物。
〔４５〕Ｒ⁵が、Ｈである、前記〔１〕〜〔４４〕のいずれか１項に記載の化合物。
〔４６〕Ｒ¹⁵が、Ｈである、前記〔１〕〜〔４５〕のいずれかに記載の化合物。
〔４７〕Ｒ⁶が、Ｈまたはハロゲンである、前記〔１〕〜〔４６〕のいずれかに記載の化合物。
〔４８〕Ｒ⁹が、Ｈまたはハロゲンである、前記〔１〕〜〔４７〕のいずれか１項に記載の化合物。
〔４９〕Ｒ¹⁰が、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、ＣＯ₂ＨまたはＳＯ₂Ｈである、前記〔１〕〜〔４８〕のいずれか１項に記載の化合物。
〔５０〕Ｒ₇およびＲ₈のうち一方が、−Ｌ−Ｒ、−Ｌ−ＣＯ₂Ｈまたは−Ｌ−Ｃ_Sであり、他方がＨ、ＣｌまたはＦである、前記〔１〕〜〔４９〕のいずれか１項に記載の化合物。
〔５１〕Ｌが、−ＣＯ−または−ＳＣＨ₂ＣＯ−または−ＳＯ₂−である、前記〔１〕〜〔５０〕のいずれかに記載の化合物。
〔５２〕Ｌが、自己犠牲リンカーである、前記〔１〕〜〔５０〕のいずれか１項に記載の化合物。
〔５３〕Ｒが、

または−Ｃｌである、前記〔１〕〜〔５２〕のいずれか１項に記載の化合物。
〔５４〕Ｃ_Sが、ＮＨＣＨ₂ＣＨ₂（ＯＣＨ₂ＣＨ₂）_n（ＣＨ₂）₆Ｃｌであり、ここで、ｎが２〜６である、前記〔１〕〜〔５３〕のいずれか１項に記載の化合物。
〔５５〕Ｃ_Sが、ヌクレオシドを含有する、前記〔１〕〜〔５３〕のいずれか１項に記載の化合物。
〔５６〕Ｃ_Sが、オリゴヌクレオチドを含有する、前記〔１〕〜〔５３〕のいずれか１項に記載の化合物。
〔５７〕前記〔１〕〜〔５６〕のいずれか１項に記載の化合物を含む、標識生体分子。
〔５８〕前記生体分子が、ビーズ、固形支持体、樹脂粒子、アッセイプレート、タンパク質、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、リガンド、酵素基質、抗体、ナノボディ、ポリペプチド、ポリペプチドベースの毒素、アミノ酸、ペプチド、脂質、炭水化物、ハプテン、小分子、薬剤、薬剤化合物またはイオン錯化剤である、前記〔５７〕に記載の標識生体分子。
〔５９〕前記生体分子が小分子、薬剤または薬剤化合物である、前記〔５８〕に記載の標識生体分子。
〔６０〕前記生体分子がリガンドである、前記〔５７〕に記載の標識生体分子。
〔６１〕前記リガンドが、クロロアルカンリガンドである、前記〔６０〕に記載の化合物。
〔６２〕前記標識生体分子がトレーサーである、前記〔５９〕に記載の標識生体分子。
〔６３〕生体分子と対象のタンパク質の間の相互作用を検出する方法であって、前記対象のタンパク質を、前記〔５７〕〜〔６２〕の標識生体分子と接触させること、および前記相互作用を検出することとを含む、方法。
〔６４〕前記対象のタンパク質が、レポータータンパク質に融合されている、前記〔６３〕に記載の方法。
〔６５〕前記レポータータンパク質が、ルシフェラーゼタンパク質である、前記〔６４〕に記載の方法。
〔６６〕前記標識生体分子がトレーサーである、前記〔６３〕に記載の方法。
〔６７〕前記相互作用が、生物発光共鳴エネルギー転移により検出される、前記〔６３〕〜〔６６〕の方法。
〔６８〕前記対象のタンパク質が細胞で発現されている、前記〔６３〕〜〔６７〕の方法。
〔６９〕試料中の選択分子を検出する方法であって、
ａ）選択分子を含有すると思われる試料を、前記〔１〕〜〔５６〕のいずれか１項に記載の化合物および前記選択分子に対するリガンドを含む複合体を含有する組成物と接触させ、混合物を得ること、および
ｂ）前記混合物中の前記化合物の存在または量を検出すること、
を含む、方法。
〔７０〕前記複合体が、前記〔１〕〜〔５７〕のいずれか１項に記載の化合物を含み、ここで、−Ｌ−Ｃ_Sが、−リンカー−Ａ−Ｘであり、前記リンカーが、任意選択的に１つ以上のＮ、ＳまたはＯ原子を含む多原子の炭素直鎖もしくは炭素分枝鎖であり、ここで、−Ａ−Ｘが、デハロゲナーゼの基質であり、Ｘがハロゲンである、前記〔６８〕に記載の方法。
〔７１〕前記リガンドが、オリゴヌクレオチドである、前記〔６８〕に記載の方法。
〔７２〕試料中の核酸ポリマーの存在を検出する方法であって、
ａ）核酸ポリマーを含有すると思われる試料を、前記〔１〕〜〔５６〕のいずれか１項に記載の化合物とオリゴヌクレオチドとを含む複合体を含有する組成物と接触させること、
ｂ）前記試料中の前記化合物の存在または量を検出すること、
を含む、方法。
〔７３〕１回の反応で、２つ以上の核酸ポリマーを検出する、前記〔７１〕に記載の方法。
〔７４〕
ａ）選択生体分子を含有すると思われる試料と、前記〔１〕〜〔５６〕のいずれか１項に記載の化合物を含有する組成物を接触させ、混合物を得ること、および、
ｂ）前記混合物中の前記標識生体分子の存在または量を検出すること、
を含む、生体分子を標識する方法。
〔７５〕前記化合物が、シアノベンゾチアゾールを含有する、前記〔７３〕に記載の方法。
〔７６〕前記生体分子が、タンパク質である、前記〔７３〕に記載の方法。
〔７７〕前記生体分子が、固形支持体である、前記〔７３〕に記載の方法。
〔７８〕前記〔１〕〜〔５６〕のいずれか１項に記載の化合物または、前記〔５７〕〜〔６２〕に記載の標識生体分子、および使用説明書を含む、キット。
〔７９〕対象のタンパク質を含有する融合タンパク質を発現するためのベクター、または、対象のタンパク質を含有する融合タンパク質を発現する細胞をさらに含む、前記〔７７〕に記載のキット。
〔８０〕前記対象のタンパク質が、レポータータンパク質に融合されている、前記〔７８〕に記載のキット。
〔８１〕前記レポータータンパク質が、ルシフェラーゼタンパク質である、前記〔７９〕に記載のキット。
〔８２〕式（ＶＩＩＩａ）または式（ＶＩＩＩｂ）：

の化合物であって、式中、
Ｒ¹¹は、ＨまたはＣ_1-4アルキル、Ｌ−ＲもしくはＬ−Ｃ_Sであり、
Ｌは、１〜１６の非水素原子を有する、直鎖もしくは分枝状、環状もしくは複素環式の飽和または不飽和である共有結合であり、当該結合が、エステル、酸、アミン、アミド、アルコール、エーテル、チオエーテルもしくはハロゲン基のうちの組み合わせを含有するものであるか、または、一重、二重、三重もしくは芳香族の炭素−炭素結合であり、
Ｒは、反応基であり、
Ｃ_Sは、結合物質であり、
Ｒ¹²およびＲ¹⁵は、独立して、Ｈ、アルキル、アリール、ＣＯ₂Ｈ、ＳＯ₃Ｈ、Ｌ−ＣＯ₂Ｈ、Ｌ−ＳＯ₃Ｈ、Ｌ−ＲまたはＬ−Ｃ_Sであり、
Ｒ²⁰、Ｒ²¹、Ｒ²²およびＲ²³は、独立して、ＨまたはＣ_1-6アルキルであるか、または、Ｒ²⁰およびＲ²¹、Ｒ²¹およびＲ²²、ならびにＲ²²およびＲ²³のうち一つ以上が、縮合アリール環を共に形成し、
Ｒ¹¹およびＲ¹²は、任意選択的に置換された環において、共に連結されても良く、
Ｒ^6-10は、独立して、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＯＨ、アルキル、アリール、ＣＯ₂Ｈ、ＳＯ₃Ｈ、Ｌ−ＣＯ₂Ｈ、Ｌ−ＳＯ₃Ｈ、Ｌ−ＲまたはＬ−Ｃ_Sであり、
Ｘは、ＣＨＲ²³、Ｏ、ＳまたはＮＲ³⁰であり、および、
Ｒ³⁰は、Ｈ、Ｃ_1-4アルキルまたは−Ｃ（Ｏ）Ｃ_1-4アルキルである、化合物。
〔８３〕式（ＩＸａ）または式（ＩＸｂ）：

に記載の化合物であって、式中、
Ｒ¹¹は、ＨまたはＣ_1-4アルキル、Ｌ−ＲもしくはＬ−Ｃ_Sであり、
Ｌは、１〜１６の非水素原子を有する、直鎖もしくは分枝状、環状もしくは複素環式の飽和または不飽和である共有結合であり、当該結合が、エステル、酸、アミン、アミド、アルコール、エーテル、チオエーテルもしくはハロゲン基のうちの組み合わせを含有するものであるか、または、一重、二重、三重もしくは芳香族の炭素−炭素結合であり、
Ｒは、反応基であり、
Ｃ_Sは、結合物質であり、
Ｒ¹²およびＲ¹⁵は、独立して、Ｈ、アルキル、アリール、ＣＯ₂Ｈ、ＳＯ₃Ｈ、Ｌ−ＣＯ₂Ｈ、Ｌ−ＳＯ₃Ｈ、Ｌ−ＲまたはＬ−Ｃ_Sであり、
Ｒ²⁰、Ｒ²¹、Ｒ²²およびＲ²³は、独立して、ＨまたはＣ_1-6アルキルであるか、または、Ｒ²⁰およびＲ²¹、Ｒ²¹およびＲ²²、ならびにＲ²²およびＲ²³のうち一つ以上が、縮合アリール環を共に形成し、
Ｒ¹¹およびＲ¹²は、任意選択的に置換された環において、共に連結されても良く、
Ｒ^6-10は、独立して、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＯＨ、アルキル、アリール、ＣＯ₂Ｈ、ＳＯ₃Ｈ、Ｌ−ＣＯ₂Ｈ、Ｌ−ＳＯ₃Ｈ、Ｌ−ＲまたはＬ−Ｃ_Sであり、
Ｘは、ＣＨＲ²³、Ｏ、ＳまたはＮＲ³⁰であり、および、
Ｒ³⁰は、Ｈ、Ｃ_1-4アルキルまたは−Ｃ（Ｏ）Ｃ_1-4アルキルである、化合物。
〔８４〕

からなる群から選択される、化合物。

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図1D】

【図1E】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図2D】

【図2E】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図3D】

【図3E】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21A】

【図21B】

【図22A】

【図22B】

【図23】

【図24】