特許 6575950 Ｂｒｕｔｏｎ型チロシンキナーゼ（Ｂｔｋ）阻害剤に対する耐性を伴う変異

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6575950

(24)【登録日】2019年8月30日

(45)【発行日】2019年9月18日

(54)【発明の名称】Ｂｒｕｔｏｎ型チロシンキナーゼ（Ｂｔｋ）阻害剤に対する耐性を伴う変異

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/6869 20180101AFI20190909BHJP

   C12Q 1/48 20060101ALI20190909BHJP

   C12N 9/12 20060101ALN20190909BHJP

   C12N 15/54 20060101ALN20190909BHJP

【ＦＩ】

   C12Q1/6869 Z

   C12Q1/48 Z

   !C12N9/12

   !C12N15/54

【請求項の数】22

【全頁数】78

(21)【出願番号】特願2015-524400(P2015-524400)

(86)(22)【出願日】2013年7月23日

(65)【公表番号】特表2015-530080(P2015-530080A)

(43)【公表日】2015年10月15日

(86)【国際出願番号】US2013051741

(87)【国際公開番号】WO2014018567

(87)【国際公開日】20140130

【審査請求日】2016年7月21日

(31)【優先権主張番号】61/675,303

(32)【優先日】2012年7月24日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】61/682,688

(32)【優先日】2012年8月13日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】61/780,652

(32)【優先日】2013年3月13日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】515255733

【氏名又は名称】ファーマサイクリックス エルエルシー

(74)【代理人】

【識別番号】100082072

【弁理士】

【氏名又は名称】清原 義博

(72)【発明者】

【氏名】チャン，ベティー，ワイ．

(72)【発明者】

【氏名】バギー，ジョセフ，ジェイ．

(72)【発明者】

【氏名】ステッゲルダ，スザンヌ，エム．

【審査官】 戸来 幸男

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２００８／０５４８２７（ＷＯ，Ａ２）

【文献】 Proc. Natl. Acad. Sci. USA，２０１０年，vol.107, no.29，pp.13075-13080, Support. Info. pp.1-2

【文献】 J. Med. Chem.，２０１２年 ３月，vol.55, no.10，pp.4539-4550

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｑ １／００−１／７０

Ｃ１２Ｎ ９／１２

Ｃ１２Ｎ １５／５４

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／

ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

癌の処置のためにイブルチニブを投与される被験体が、治療に対する耐性を進行させたか、または、進行させる可能性が高いかどうかをモニタリングする方法であって、
前記方法は、
被験体からのＢＴＫポリペプチドをコード化する核酸分子を含むサンプルを試験し、コード化されたＢＴＫポリペプチドがヒトＢＴＫポリペプチドのアミノ酸配列のアミノ酸位置Ｃ４８１に対応するアミノ酸位置で修飾されているかどうかを決定する工程、及び
被験体が修飾を有している場合、イブルチニブを用いた治療に対して耐性を有する、または、耐性を有するようになるとして、被験体を特徴づけ、ＬＹＮ、ＳＹＫ、ＪＡＫ、ＰＩ３Ｋ、ＰＬＣγ、ＭＡＰＫ、ＭＥＫ及びＮＦκＢの阻害剤からなる群から選択される薬剤での治療の候補として被験体を特徴づける工程
を含む、方法。

【請求項2】

修飾は、ヒトＢＴＫポリペプチドのアミノ酸位置Ｃ４８１に対応するアミノ酸位置で、ロイシン、イソロイシン、バリン、アラニン、グリシン、メチオニン、セリン、トレオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、プロリン、チロシン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、およびグルタミン酸から選択されたアミノ酸に、システインを置換することである、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

修飾は、ヒトＢＴＫポリペプチドのアミノ酸位置Ｃ４８１に対応するアミノ酸位置で、セリンにシステインを置換することである、請求項１または２に記載の方法。

【請求項4】

癌は血液の癌である、請求項１乃至３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項5】

癌の処置のためにイブルチニブを受ける被験体の処置を最適化するための情報を提供する方法であって、該方法は、
（ａ）コード化されたＢＴＫポリペプチドがヒトＢＴＫポリペプチドのアミノ酸配列のアミノ酸位置Ｃ４８１に対応するアミノ酸位置で置換されているかどうかを決定するために、被験体からのＢＴＫポリペプチドをコード化する核酸分子を含むサンプルを試験する工程、及び
（ｂ）被験体が置換を有している場合、ＬＹＮ、ＳＹＫ、ＪＡＫ、ＰＩ３Ｋ、ＰＬＣγ、ＭＡＰＫ、ＭＥＫ及びＮＦκＢの阻害剤からなる群から選択される薬剤での治療の候補として被験体を特徴づける工程
を含む、方法。

【請求項6】

癌は血液の癌である、請求項５に記載の方法。

【請求項7】

置換は、ヒトＢＴＫポリペプチドのアミノ酸位置Ｃ４８１に対応するアミノ酸位置で、ロイシン、イソロイシン、バリン、アラニン、グリシン、メチオニン、セリン、トレオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、プロリン、チロシン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、およびグルタミン酸から選択されたアミノ酸に、システインを置換することである、請求項５または６に記載の方法。

【請求項8】

置換は、ヒトＢＴＫポリペプチドのアミノ酸位置Ｃ４８１に対応するアミノ酸位置で、セリンにシステインを置換することである、請求項５乃至７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項9】

血液の癌はＢ細胞悪性腫瘍である、請求項４または６に記載の方法。

【請求項10】

Ｂ細胞悪性腫瘍は、白血病、リンパ腫、及び骨髄腫からなる群から選択される、請求項９に記載の方法。

【請求項11】

Ｂ細胞悪性腫瘍は、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、活性化したＢ細胞びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＡＢＣ−ＤＬＢＣＬ）、胚中心びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＧＣＢ ＤＬＢＣＬ）、縦隔原発Ｂ細胞リンパ腫（ＰＭＢＬ）、非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、濾胞性リンパ腫、免疫芽球性大細胞型リンパ腫、前駆Ｂリンパ芽球性リンパ腫、前駆Ｂ細胞急性リンパ性白血病、ヘアリーセル白血病、マントル細胞リンパ腫、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、リンパ形質細胞性リンパ腫／ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、脾臓周辺帯リンパ腫、形質細胞性骨髄腫、形質細胞腫、節外性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、節性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、縦隔（胸腺）大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、血管内大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、原発性滲出性リンパ腫、または、リンパ腫様肉芽腫症である、請求項９に記載の方法。

【請求項12】

Ｂ細胞悪性腫瘍は、マントル細胞白血病（ＭＣＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症（ＷＭ）、小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、辺縁帯リンパ腫（ＭＺＬ）からなる群から選択される、請求項９に記載の方法。

【請求項13】

Ｂ細胞悪性腫瘍はＣＬＬである、請求項９に記載の方法。

【請求項14】

Ｂ細胞悪性腫瘍はＳＬＬである、請求項９に記載の方法。

【請求項15】

イブルチニブは、１日当たり４２０ｍｇから１日当たり５６０ｍｇで投与される、請求項１乃至１４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項16】

イブルチニブは、１日当たり４２０ｍｇまたは１日当たり５６０ｍｇで投与される、請求項１乃至１５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項17】

イブルチニブは、１日当たり４２０ｍｇの総量で１日３回投与される、請求項１乃至１６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項18】

イブルチニブは、１日当たり５６０ｍｇの総量で１日４回投与される、請求項１乃至１６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項19】

被験体は、少なくとも1つの以前の癌治療を受けている、請求項１乃至１８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項20】

被験体は、安定な疾患を達成する、請求項１乃至１９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項21】

被験体は、再発を経験しない、請求項１乃至２０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項22】

少なくとも１つの追加の癌療法が被験体にさらに投与可能である、請求項１乃至２１のいずれか１項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

＜相互参照＞
本特許は、２０１２年７月２４日に出願された米国仮出願番号第６１／６７５，３０３号、２０１２年４月１３日に出願された第６１／６８２，６８８号、２０１３年３月１３日に出願された第６１／７８０，６５２号の利益を主張するものであり、それらはすべて参照によりそのまま組み込まれる。

【0002】

＜ＥＦＳ−ウェブを介してテキストファイルとして提出された配列表の引用による取り込み＞
本出願は配列表を含んでおり、配列表は、ＥＦＳ−ＷｅｂによってＡＳＣＩＩフォーマットのコンピューターで読み取り可能なテキストファイルとして提出されており、本明細書で参照することでそのまま組み込まれる。２０１３年７月２２日に作成されたテキストファイルは、２５９２２−８６５−６０１ｓｅｑｌｉｓｔ．ｔｘｔという名前を付けられており、１３０ＫＢの大きさである。

【背景技術】

【0003】

Ｂｒｕｔｏｎ型チロシンキナーゼ（ＢＴＫ）は、Ｂ細胞、骨髄性細胞、およびマスト細胞の成長、分化、および活性化にとって極めて重要な非受容体チロシンキナーゼのＴｅｃファミリーのメンバーである。ＢＴＫ遺伝子は細胞遺伝学的バンドＸｑ２１．３３−ｑ２２に位置し、完全長のＢＴＫタンパク質をコード化する３７ｋｂに及ぶ１９のエキソンを含む。ＢＴＫの変異はヒトにおいて知られており、免疫障害であるＸ連鎖無ガンマグロブリン血症をもたらす。

【0004】

ＢＴＫは、ＰＩＰ３（ホスファチジルイノシトール−３，４，５−三リン酸）の生成とＢＴＫプレクストリン相同（ＰＨ）ドメインへの結合によって刺激された膜への局在化と、ＳｒｃファミリーキナーゼによるＴｙｒ−５５１のトランスリン酸化によって活性化される。活性化されたＢＴＫは、ＰＬＣγ、ＪＮＫ、およびｐ３８ ＭＡＰＫの経路に含まれる多くのシグナル伝達分子のリン酸化に関与し、Ｃａ２＋動員、ｍＲＮＡの安定化、ＮＦ−κＢおよびＡＰ−１転写因子の誘導を引き起こす。ＢＴＫ活性は、ＢＴＫの阻害剤（ＩＢＴＫ）、Ｓａｂ、およびｃ−Ｃｂｌを含む多くのタンパク質によって否定的に制御される。抗原投与の間、古典的ＮＦ−κＢ経路は、ＣＡＲＤ１１、ＭＡＬＴ１、およびＢＣＬ１０からなる「ＣＢＭ」シグナル伝達複合体の形成によって、Ｂ細胞受容体シグナル伝達により強く活性化される。ＣＢＭは、ＢＴＫのＰＬＣγ活性化の下流に位置する。ＣＢＭ経路は、複数のリンパ腫亜型では病的に変えられ、ＣＡＲＤ１１での変異は、下流のＮＦ−κＢシグナル伝達を構成的に活性化することが分かっている。

【0005】

ＢＴＫはＢ細胞受容体（ＢＣＲ）シグナル伝達に必要不可欠であり、ノックアウトマウスモデルでは、その変異はＢ細胞特異的な表現型を備える。ＢＴＫタンパク質およびｍＲＮＡは、正常なＢ細胞と比較すると、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）で著しく過剰に発現される。ＢＴＫはＣＬＬ細胞では必ずしも構成的に活性であるとは限らないが、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）またはＣＤ４０シグナル伝達にはこの経路の有効な活性化が伴う。ＢＴＫ活性は、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、マントル細胞白血病（ＭＣＬ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）およびびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、ならびに、多発性骨髄腫（ＭＭ）といった非ホジキンリンパ腫などのＢ細胞悪性腫瘍の疾患進行に関与する。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

本明細書には、Ｂｒｕｔｏｎ型チロシンキナーゼ（ＢＴＫ）の阻害剤を用いて患者の処置に対して患者の耐性を与える、Ｂ細胞受容体経路の変異の同定が記載されている。いくつかの実施形態では、ＢＴＫ阻害剤は、Ｂｔｋに共有的および／または不可逆的に結合する阻害剤である。いくつかの実施形態では、ＢＴＫ阻害剤は、共有的および／または不可逆的にＢＴＫのシステイン４８１に結合する阻害剤である。いくつかの実施形態において、ＢＴＫ阻害剤はイブルチニブである。いくつかの実施形態では、患者はＢ細胞増殖性疾患を患っている。いくつかの実施形態では、患者はＢ細胞悪性腫瘍を患っている。いくつかの実施形態では、患者は白血病またはリンパ腫を患っている。いくつかの実施形態では、患者は非ホジキンリンパ腫を患っている。いくつかの実施形態では、患者は、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、マントル細胞白血病（ＭＣＬ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、または、多発性骨髄腫（ＭＭ）を患っている。いくつかの実施形態では、患者は、細胞腫または肉腫のような固形腫瘍を患っている。

【0007】

本明細書には、ＢＴＫのシステイン４８１に共有的および／または不可逆的に結合するＢＴＫ阻害剤による阻害に対してキナーゼの耐性を与える、Ｂｒｕｔｏｎ型チロシンキナーゼ（ＢＴＫ）の変異の同定が、記載されている。本明細書には、単離した変異ＢＴＫポリペプチドと、変異ＢＴＫポリペプチドをコード化する単離した核酸が記載されている。本明細書に記載される変異の同定により、ＢＴＫ阻害剤による治療に適した患者を選択し、ＢＴＫ阻害剤治療を受ける患者をモニタリングし、そして、ＢＴＫ阻害剤による治療計画を修飾することができる。本明細書には、変異ＢＴＫポリペプチドと、変異ＢＴＫポリペプチドをコード化する核酸を検知するための診断方法、および、そのような方法の使用が記載されている。同様に、本明細書には、変異ＢＴＫポリペプチドを阻害する第２世代のＢＴＫ阻害剤の同定のための方法も記載されている。

【課題を解決するための手段】

【0008】

本明細書には、特定の実施形態において、被験体が、共有結合のおよび／または不可逆的なＢｒｕｔｏｎ型チロシンキナーゼ（ＢＴＫ）阻害剤による治療に対して、反応しないまたは反応しにくくなるかどうかを決定するための方法が記載されており、該方法は、（ａ）被験体からのＢＴＫポリペプチドをコード化する核酸分子を含むサンプルを試験する工程であって、それによって、コード化されたＢＴＫポリペプチドが、配列番号：１と表記されるアミノ酸配列のアミノ酸位置４８１に対応するアミノ酸位置で修飾されているかどうかを決定する、工程、および、（ｂ）被験体が修飾を有している場合、共有結合のおよび／または不可逆的なＢＴＫ阻害剤による治療に対する耐性を有する、または、耐性を有するようになると、被験体を特徴づける工程、を含む。いくつかの実施形態では、方法は、被験体からサンプルを得る工程をさらに含む。

【0009】

本明細書には、特定の実施形態において、被験体における共有結合のおよび／または不可逆的なＢＴＫ阻害剤を用いた阻害に対して耐性を有しているとしてＢＴＫを特徴づける方法が、記載されており、該方法は、（ａ）被験体からのＢＴＫポリペプチドをコード化する核酸分子を含むサンプルを試験する工程であって、それによって、コード化されたＢＴＫポリペプチドが、配列番号：１と表記されるアミノ酸配列のアミノ酸位置４８１に対応するアミノ酸位置で修飾されているかどうかを決定する、工程、および、（ｂ）被験体が修飾を有している場合、共有結合のおよび／または不可逆的なＢＴＫ阻害剤による阻害に対して耐性を有するとして、被験体を特徴づける工程、を含む。いくつかの実施形態では、方法は、被験体からサンプルを得る工程をさらに含む。

【0010】

本明細書には、特定の実施形態において、癌の処置のために共有結合のおよび／または不可逆的なＢＴＫ阻害剤を投与される被験体が、治療に対する耐性を進行させたか、または、進行させる可能性が高いかどうかをモニタリングする方法が記載されており、該方法は、（ａ）被験体からのＢＴＫポリペプチドをコード化する核酸分子を含むサンプルを試験する工程であって、それによって、コード化されたＢＴＫポリペプチドが配列番号：１と表記されるアミノ酸配列のアミノ酸位置４８１に対応するアミノ酸位置で修飾されているかどうかを決定する工程、および、（ｂ）被験体が修飾を有している場合、共有結合のおよび／または不可逆的なＢＴＫ阻害剤を用いた治療に対して耐性を有する、または、耐性を有するようになるとして、被験体を特徴づける工程、を含む。いくつかの実施形態では、方法は、被験体が修飾を有している場合、ＢＴＫ阻害剤を用いた処置を中止する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、被験体が修飾を有していない場合、ＢＴＫ阻害剤を用いた処置を継続する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、被験体が修飾を有している場合、修飾されたキナーゼを阻害する第２世代のＢＴＫ阻害剤を投与する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、被験体からサンプルを得る工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、被験体が修飾を有している場合、ＬＹＮ、ＳＹＫ、ＪＡＫ、ＰＩ３Ｋ、ＰＬＣγ、ＭＡＰＫ、ＭＥＫ、またはＮＦκＢの阻害剤を投与する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、被験体が修飾を有している場合、Ｃ４８１に結合しないＢＴＫの共有結合阻害剤を投与する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、被験体が修飾を有している場合、ＢＴＫの可逆的な阻害剤を投与する工程をさらに含む。

【0011】

本明細書には、特定の実施形態において、癌の処置のために共有結合のおよび／または不可逆的なＢＴＫ阻害剤を投与される被験体の治療を最適化するための方法が記載されており、該方法は、（ａ）被験体からのＢＴＫポリペプチドをコード化する核酸分子を含むサンプルを試験する工程であって、それによって、コード化されたＢＴＫポリペプチドが配列番号：１と表記されるアミノ酸配列のアミノ酸位置４８１に対応するアミノ酸位置で修飾されているかどうかを決定する工程、および、（ｂ）被験体が修飾を有している場合に、不可逆的なＢＴＫ阻害剤を用いた処置を中止する、あるいは、被験体が修飾を有していない場合に、不可逆的なＢＴＫ阻害剤を用いた処置を継続する工程、を含む。いくつかの実施形態では、方法は、被験体が修飾を有している場合、修飾されたキナーゼを阻害する第２世代のＢＴＫ阻害剤を投与する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、被験体からサンプルを得る工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、被験体が修飾を有している場合、ＬＹＮ、ＳＹＫ、ＪＡＫ、ＰＩ３Ｋ、ＰＬＣγ、ＭＡＰＫ、ＭＥＫ、またはＮＦκＢの阻害剤を投与する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、被験体が修飾を有している場合、Ｃ４８１に結合しないＢＴＫの共有結合阻害剤を投与する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、被験体が修飾を有している場合、ＢＴＫの可逆的な阻害剤を投与する工程をさらに含む。

【0012】

本明細書には、特定の実施形態において、第２世代のＢＴＫ阻害剤による治療のために被験体を選ぶ方法が記載されており、該方法は、（ａ）被験体からのＢＴＫポリペプチドをコード化する核酸分子を含むサンプルを試験する工程であって、それによって、コード化されたＢＴＫポリペプチドが配列番号：１と表記されるアミノ酸配列のアミノ酸位置４８１に対応するアミノ酸位置で修飾されているかどうかを決定する工程、および、（ｂ）被験体が修飾を有している場合に、被験体を、第２世代のＢＴＫ阻害剤による治療を受ける候補であると特徴付ける工程、を含む。いくつかの実施形態では、方法は、被験体が修飾を有している場合、修飾されたキナーゼを阻害する第２世代のＢＴＫ阻害剤を投与する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、被験体からサンプルを得る工程をさらに含む。

【0013】

いくつかの実施形態では、修飾は、ＢＴＫポリペプチドのアミノ酸位置４８１でのアミノ酸の置換または欠失を含む。いくつかの実施形態では、修飾は、ＢＴＫポリペプチドのアミノ酸位置４８１において、ロイシン、イソロイシン、バリン、アラニン、グリシン、メチオニン、セリン、トレオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、プロリン、チロシン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、およびグルタミン酸の中から選択されたアミノ酸に、システインを置換することである。いくつかの実施形態では、修飾は、ＢＴＫポリペプチドのアミノ酸位置４８１において、セリン、メチオニン、またはトレオニンの中から選択されたアミノ酸に、システインを置換することである。いくつかの実施形態では、修飾は、ＢＴＫポリペプチドのアミノ酸位置４８１においてセリンにシステインを置換することである。いくつかの実施形態では、修飾は、ＢＴＫポリペプチドのアミノ酸位置４８１をコード化する核酸の欠失を含む。

【0014】

方法のいくつかの実施形態において、アッセイで使用される核酸分子はＲＮＡまたはＤＮＡである。方法のいくつかの実施形態において、アッセイで使用される核酸分子は、ゲノムＤＮＡである。方法のいくつかの実施形態において、アッセイで使用される核酸分子は、全ＲＮＡである。方法のいくつかの実施形態において、アッセイで使用される核酸分子は、ｍＲＮＡである。方法のいくつかの実施形態において、方法は、ＲＮＡサンプルからｍＲＮＡを単離する工程をさらに含む。

【0015】

方法のいくつかの実施形態において、試験する工程は、ＢＴＫポリペプチドのアミノ酸位置４８１をコード化する核酸のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅を行う工程を含む。いくつかの実施形態では、ＰＣＲ増幅は、ＢＴＫポリペプチドのアミノ酸位置４８１をコード化する領域に隣接する１対のオリゴヌクレオチドプライマーを使用する工程を含む。いくつかの実施形態では、方法は、増幅された核酸の配列を決定する工程を含む。

【0016】

方法のいくつかの実施形態において、試験する工程は、配列特異的な核酸プローブに核酸を接触させる工程を含み、配列特異的な核酸プローブは、（ａ）アミノ酸位置４８１で修飾される修飾ＢＴＫをコード化する核酸に結合し、および、（ｂ）アミノ酸位置４８１でシステインを有する野生型のＢＴＫをコード化する核酸に結合しない。方法のいくつかの実施形態において、試験する工程は、配列特異的な核酸プローブを使用するＰＣＲ増幅を含む。

【0017】

いくつかの実施形態では、方法で使用されるサンプルは、被験体からの１つ以上の腫瘍細胞を含む。いくつかの実施形態では、方法で使用されるサンプルは、循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）を含む。

【0018】

方法のいくつかの実施形態において、方法で使用される核酸は、被験体からの腫瘍細胞サンプルから単離する。いくつかの実施形態では、サンプルは、腫瘍生検サンプル、血液サンプル、血清サンプル、リンパ液サンプル、または骨髄穿刺液である。

【0019】

方法のいくつかの実施形態において、ＢＴＫ阻害剤は、野生型のＢＴＫのシステイン４８１に共有結合する、共有結合のおよび／または不可逆的なＢＴＫ阻害剤である。いくつかの実施形態では、ＢＴＫ阻害剤は、イブルチニブ（ＰＣＩ−３２７６５）、ＰＣＩ−４５２９２、ＰＣＩ−４５４６６、ＡＶＬ−１０１、ＡＶＬ−２９１、ＡＶＬ−２９２、または、ＯＮＯ−ＷＧ−３７の中から選択される。いくつかの実施形態において、ＢＴＫ阻害剤はイブルチニブである。

【0020】

方法のいくつかの実施形態において、被験体は癌を患っている。いくつかの実施形態では、癌は血液の癌である。いくつかの実施形態では、癌はＢ細胞悪性腫瘍である。いくつかの実施形態では、癌は白血病、リンパ腫、または骨髄腫の中から選択される。いくつかの実施形態では、Ｂ細胞悪性腫瘍は、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、活性化したＢ細胞びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＡＢＣ−ＤＬＢＣＬ）、胚中心びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＧＣＢ ＤＬＢＣＬ）、縦隔原発Ｂ細胞リンパ腫（ＰＭＢＬ）、非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、濾胞性リンパ腫、免疫芽球性大細胞型リンパ腫、前駆Ｂリンパ芽球性リンパ腫、前駆Ｂ細胞急性リンパ性白血病、ヘアリーセル白血病、マントル細胞リンパ腫、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、リンパ形質細胞性リンパ腫／ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、脾臓周辺帯リンパ腫、形質細胞性骨髄腫、形質細胞腫、節外性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、節性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、縦隔（胸腺）大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、血管内大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、原発性滲出性リンパ腫、または、リンパ腫様肉芽腫症である。いくつかの実施形態では、被験体は固形腫瘍を患っている。

【0021】

方法のいくつかの実施形態において、被験体は、サンプルを得る前に不可逆的なＢＴＫ阻害剤で処置される。いくつかの実施形態では、サンプルは、不可逆的なＢＴＫ阻害剤の第１の投与後、１週、２週、３週、１か月、２か月、３か月、４か月、５か月、６か月、７か月、８か月、９か月、１０か月、１１か月、１２か月、１４か月、１６か月、１８か月、２０か月、２２か月、または２４か月目に得られる。いくつかの実施形態では、サンプルは、不可逆的なＢＴＫ阻害剤を用いた処置の経過中に、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０回得られる。いくつかの実施形態では、被験体は、不可逆的なＢＴＫ阻害剤が最初に投与されたときに、不可逆的なＢＴＫ阻害剤を用いた処置に反応する。

【0022】

本明細書では、特定の実施形態において、修飾されたＢＴＫを阻害する化合物を選別する方法が記載されており、該方法は、（ａ）修飾されたＢＴＫを提供する工程であって、修飾されたＢＴＫが、配列番号：１と表記されるアミノ酸配列のアミノ酸位置４８１に対応するアミノ酸位置で、修飾されている、工程、（ｂ）修飾したＢＴＫを試験化合物に接触させる工程、および、（ｃ）ＢＴＫ活性の値を検知する工程であって、活性の減少は、化合物が修飾されたＢＴＫを阻害していることを示す、工程、を含む。いくつかの実施形態では、修飾は、ＢＴＫポリペプチドの位置４８１におけるアミノ酸の置換または欠失である。いくつかの実施形態では、修飾は、ＢＴＫポリペプチドのアミノ酸位置４８１において、ロイシン、イソロイシン、バリン、アラニン、グリシン、メチオニン、セリン、トレオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、プロリン、チロシン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、およびグルタミン酸の中から選択されたアミノ酸に、システインを置換することである。いくつかの実施形態では、修飾は、ＢＴＫポリペプチドのアミノ酸位置４８１において、セリン、メチオニン、およびトレオニンの中から選択されたアミノ酸に、システインを置換することである。いくつかの実施形態では、修飾は、ＢＴＫポリペプチドのアミノ酸位置４８１において、セリンにシステインを置換することである。いくつかの実施形態では、ＢＴＫ活性の値の検知は生体外のキナーゼアッセイによって評価される。いくつかの実施形態では、キナーゼアッセイで使用される基質は、ＰＬＣγ、ＥＲＫ１／２、またはＡＫＴである。いくつかの実施形態では、キナーゼアッセイで使用される基質は、ペプチド基質である。いくつかの実施形態では、イブルチニブは陰性対照として使用される。

【0023】

いくつかの実施形態では、修飾されたＢＴＫポリペプチドは、ＢＴＫを試験化合物に接触させる前に、修飾されたＢＴＫポリペプチドを発現する宿主細胞から精製される。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、修飾されたＢＴＫポリペプチドを安定的に発現する。いくつかの実施形態では、修飾されたＢＴＫポリペプチドは、免疫親和性またはクロマトグラフィーによって精製される。いくつかの実施形態では、細胞は、内在性の野生型ＢＴＫの発現には不十分である。いくつかの実施形態では、細胞は、ニワトリＤＴ４０ ＢＴＫ−／−Ｂ細胞、または、ヒトＢＴＫ−／−Ｂ細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は非Ｂ細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は哺乳動物の非Ｂ細胞である。いくつかの実施形態では、細胞はＣＨＯ細胞またはＪｕｒｋａｔＴ細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は非哺乳動物の細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、昆虫細胞、細菌細胞、酵母細胞、または、植物細胞である。

【0024】

本明細書では、特定の実施形態において、配列番号：１と表記されたアミノ酸配列のアミノ酸位置４８１に対応するアミノ酸位置において修飾を含むＢＴＫ活性を備える、単離したＢＴＫポリペプチドまたはその変異体が記載されており、修飾は、共有結合のおよび／または不可逆的なＢＴＫ阻害剤を用いた阻害に対して、修飾されたＢＴＫポリペプチドまたはその変異体の耐性を与える。いくつかの実施形態では、修飾は、共有結合のおよび／または不可逆的なＢＴＫ阻害剤を用いた処置に対して癌細胞の耐性を与える。いくつかの実施形態では、修飾は、配列番号：１で表記される野性型ＢＴＫと比較して、位置４８１におけるアミノ酸の置換を含む。いくつかの実施形態では、置換はＣ４８１Ｓである。いくつかの実施形態では、修飾はアミノ酸位置４８１の欠失を含む。いくつかの実施形態では、ＢＴＫポリペプチドは、配列番号：１と表記される野性型ＢＴＫと比較して、位置４８１におけるアミノ酸の置換と、１つ以上の追加のアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、ＢＴＫポリペプチドは、配列番号：２と表記されるアミノ酸の配列、または、配列番号：２と表記される配列を有するポリペプチドに、少なくとも、または、少なくとも約６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を有する変異体を含み、位置４８１におけるアミノ酸はシステインではない。いくつかの実施形態では、単離したＢＴＫポリペプチドまたはその変異体は、組換えタンパク質である。いくつかの実施形態では、単離したＢＴＫポリペプチドまたはその変異体は、精製されたタンパク質である。いくつかの実施形態では、単離したＢＴＫポリペプチドまたはその変異体は、細胞から精製される。いくつかの実施形態では、細胞は、原核細胞または真核細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、哺乳動物細胞、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞、または両生動物の細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は霊長類の細胞である。いくつかの実施形態では、細胞はヒトの細胞である。いくつかの実施形態では、修飾されたＢＴＫポリペプチドは組換えポリペプチドである。

【0025】

本明細書では、特定の実施形態において、本明細書で提供される修飾されたＢＴＫポリペプチドをコード化する、単離した核酸分子が提供される。いくつかの実施形態では、核酸はＤＮＡまたはＲＮＡの分子である。いくつかの実施形態では、核酸はｃＤＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、核酸は、ＰＣＲ増幅産物である。いくつかの実施形態では、核酸は組換え分子である。いくつかの実施形態では、核酸は合成分子である。いくつかの実施形態では、核酸は、配列番号：３と表記された核酸の配列であって、位置４８１においてアミノ酸をコード化する核酸コドンが修飾され、それによって、コドンがシステインをコード化しない、配列、あるいは、配列番号：３と表記された配列を有するポリペプチドと少なくとも、または、少なくとも約６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を有する変異体を含み、位置４８１でアミノ酸をコード化する核酸コドンはシステインをコード化しない。いくつかの実施形態では、核酸は、配列番号：７と表記された核酸の配列、または、配列番号：７と表記された配列を有する核酸と少なくとも、または、少なくとも約６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を有する変異体を含み、位置４８１でアミノ酸をコード化する核酸コドンは、システインをコード化しない。いくつかの実施形態では、核酸は、配列番号：８と表記された核酸の配列、または、配列番号：８と表記された配列を有する核酸と少なくとも、または、少なくとも約６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を有する変異体を含み、位置４８１でアミノ酸をコード化する核酸コドンは、システインをコード化しない。いくつかの実施形態では、核酸は、配列番号：２２と表記された核酸の配列、または、配列番号：２２と表記された配列を有する核酸と少なくとも、または、少なくとも約６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を有する変異体を含み、位置４８１でアミノ酸をコード化する核酸コドンは、システインをコード化しない。いくつかの実施形態では、核酸は、配列番号：２３と表記された核酸の配列、または、配列番号：２３と表記された配列を有する核酸と少なくとも、または、少なくとも約６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を有する変異体を含み、位置４８１でアミノ酸をコード化する核酸コドンは、システインをコード化しない。いくつかの実施形態では、修飾したＢＴＫポリペプチドは組換えポリペプチドである。

【0026】

本明細書では、特定の実施形態において、本明細書で提供される修飾されたＢＴＫポリペプチドをコード化する核酸分子を含むベクターが記載されている。いくつかの実施形態において、ベクターはウイルスベクターまたはプラスミドベクターである。いくつかの実施形態において、核酸はプロモーターに動作可能に結合する。いくつかの実施形態において、プロモーターは、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターである。本明細書では、特定の実施形態において、本明細書で提供される修飾されたＢＴＫポリペプチドをコード化する核酸分子を含む宿主細胞、あるいは、本明細書で提供される修飾されたＢＴＫポリペプチドをコード化する核酸分子を含むベクターが提供される。いくつかの実施形態では、細胞は原核細胞または真核細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、哺乳動物細胞、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞、または両生動物の細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は霊長類の細胞である。いくつかの実施形態では、細胞はヒトの細胞である。本明細書では、特定の実施形態において、宿主細胞によって発現された変異ＰＴＸ３ＢＴＫポリペプチドが、記載されている。

【0027】

本明細書では、特定の実施形態において、配列番号：１と表記されたアミノ酸配列のアミノ酸位置４８１に対応するアミノ酸位置で修飾を含むＢＴＫ活性を有する変異ＢＴＫポリペプチドまたはその変異体を含むキットが記載されている。いくつかの実施形態では、修飾は、ＢＴＫポリペプチドのアミノ酸位置４８１においてセリンにシステインを置換することである。

【0028】

本明細書では、特定の実施形態において、本明細書で提供される変異ＢＴＫポリペプチド、または、本明細書で提供される修飾されたＢＴＫポリペプチドをコード化する核酸を含むマイクロチップが記載されている。いくつかの実施形態では、修飾は、ＢＴＫポリペプチドのアミノ酸位置４８１においてセリンにシステインを置換することである。

【0029】

本明細書では、特定の実施形態において、本明細書で提供される修飾されたＢＴＫポリペプチドをコード化する単離した核酸、または、そのような核酸を含むベクターを含むキットが、記載されている。いくつかの実施形態では、修飾は、ＢＴＫポリペプチドのアミノ酸位置４８１においてセリンにシステインを置換することである。

【0030】

本明細書では、特定の実施形態において、アミノ酸位置４８１で修飾を含む修飾されたＢＴＫポリペプチドを検知するための１つ以上の試薬を含むキットが記載されている。いくつかの実施形態では、キットは、Ｃ４８１Ｓである修飾を有する変異ＢＴＫポリペプチドを含むマイクロチップを含む。

【0031】

本明細書では、特定の実施形態において、アミノ酸位置４８１で修飾を含む変異ＢＴＫポリペプチドをコード化する核酸を検知するための１つ以上の試薬を含むキットが記載されている。いくつかの実施形態では、キットは、Ｃ４８１Ｓである修飾を有する変異ＢＴＫポリペプチドをコード化する核酸を含むマイクロチップを含んでいる。

【0032】

本明細書では、特定の実施形態において、修飾とアミノ酸位置４８１を有する修飾されたＢＴＫポリペプチドに結合する単離した抗体が記載されており、抗体は、配列番号：１と表記されたアミノ酸の配列を有する野生型のＢＴＫポリペプチドに結合しない、または、低親和性で結合する。いくつかの実施形態では、修飾は、ＢＴＫポリペプチドのアミノ酸位置４８１においてセリンにシステインを置換することである。

【0033】

本明細書では、特定の実施形態において、被験体内での共有結合のおよび／または不可逆的なＢＴＫ阻害剤を用いた阻害に対して耐性を有する修飾されたＢＴＫを検知するためのシステムが記載されており、該システムは、（ａ）被験体からのＢＴＫポリペプチドをコード化する核酸分子を含むサンプル、および、（ｂ）配列番号：１と表記されたアミノ酸配列のアミノ酸位置４８１に対応するアミノ酸位置で修飾される変異ＢＴＫポリペプチドまたはその一部をコード化する核酸を含むマイクロアレイ、を含む。いくつかの実施形態では、マイクロアレイはマイクロチップに含まれる。

【0034】

本明細書では、特定の実施形態において、被験体内での共有結合のおよび／または不可逆的なＢＴＫ阻害剤を用いた阻害に対して耐性を有する修飾されたＢＴＫを検知するためのシステムが記載されており、該システムは、（ａ）被験体からのＢＴＫポリペプチドをコード化する核酸分子を含むサンプル、および、（ｂ）配列特異的な核酸プローブであって、（ｉ）アミノ酸位置４８１で修飾される修飾ＢＴＫをコード化する核酸に結合し、および、（ｉｉ）アミノ酸位置４８１でシステインを有する野生型のＢＴＫをコード化する核酸には結合しない、核酸プローブ、を含む。

【0035】

本明細書では、特定の実施形態において、被験体内での共有結合のおよび／または不可逆的なＢＴＫ阻害剤を用いた阻害に対して耐性を有する修飾されたＢＴＫを検知するためのシステムが記載されており、該システムは、（ａ）被験体からのＢＴＫポリペプチドをコード化する核酸分子を含むサンプル、および、（ｂ）ＢＴＫポリペプチドのアミノ酸４８１をコード化する核酸領域に隣接する一対のオリゴヌクレオチドプライマー、を含む。

【0036】

本明細書には、特定の実施形態において、血液の癌を患っている患者の維持療法の方法が記載されており、方法は：（ａ）治療上有効な量の共有結合のおよび／または不可逆的なＢＴＫ阻害剤の投与を含む維持療法計画を患者に施す工程、および、（ｂ）被験体が、配列番号：１と表記されたアミノ酸配列のアミノ酸位置４８１に対応するアミノ酸位置で修飾をもたらすＢＴＫをコード化する内因性遺伝子の変異を有しているかどうかを決定するために、維持療法計画の経過中にあらかじめ決められた時間間隔で、患者をモニタリングする工程、を含む。いくつかの実施形態において、モニタリングする工程は、（ａ）被験体からのＢＴＫポリペプチドをコード化する核酸分子を含むサンプルを試験する工程であって、それによって、コード化されたＢＴＫポリペプチドが配列番号：１と表記されるアミノ酸配列のアミノ酸位置４８１に対応するアミノ酸位置で修飾されているかどうかを決定する、工程、を含む。いくつかの実施形態では、方法は、被験体が変異を有している場合、維持療法計画を中止する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、被験体が変異を有していない場合、維持療法計画を継続する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、被験体が変異を有している場合、修飾されたＢＴＫを阻害する第２世代のＢＴＫ阻害剤を投与する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、被験体が修飾を有している場合、ＬＹＮ、ＳＹＫ、ＪＡＫ、ＰＩ３Ｋ、ＰＬＣγ、ＭＡＰＫ、ＭＥＫ、またはＮＦκＢの阻害剤を投与する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、被験体が修飾を有している場合、Ｃ４８１に結合しないＢＴＫの共有結合阻害剤を投与する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、被験体が修飾を有している場合、ＢＴＫの可逆的な阻害剤を投与する工程をさらに含む。いくつかの実施形態において、ＢＴＫポリペプチド内の修飾は、Ｃ４８１Ｓである。いくつかの実施形態では、核酸の変異は、配列番号：３と表記されたヌクレオチドの配列の核酸位置１６３５に対応する核酸位置で、シトシンにグアニンを変異させることである。いくつかの実施形態では、核酸の変異は、配列番号：３と表記されたヌクレオチドの配列の核酸位置１６３４に対応する核酸位置で、アデニンにチミンを変異させることである。いくつかの実施形態では、あらかじめ決められた時間間隔は、毎月、２か月ごと、３か月ごと、４か月ごと、５か月ごと、６か月ごと、７か月ごと、８か月ごと、９か月ごと、１０か月ごと、１１か月ごと、または、毎年である。いくつかの実施形態では、サンプルは１以上の癌細胞を含む。いくつかの実施形態では、サンプルはｃｔＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、方法は、不可逆的なＢＴＫ阻害剤を用いた処置の前に、被験体からのサンプルを試験する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、血液の癌は、Ｂ細胞悪性腫瘍である。いくつかの実施形態では、癌は白血病、リンパ腫、または骨髄腫である。いくつかの実施形態では、癌は、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、活性化したＢ細胞びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＡＢＣ−ＤＬＢＣＬ）、胚中心びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＧＣＢ ＤＬＢＣＬ）、縦隔原発Ｂ細胞リンパ腫（ＰＭＢＬ）、非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、濾胞性リンパ腫、免疫芽球性大細胞型リンパ腫、前駆Ｂリンパ芽球性リンパ腫、前駆Ｂ細胞急性リンパ性白血病、ヘアリーセル白血病、マントル細胞リンパ腫、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、リンパ形質細胞性リンパ腫／ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、脾臓周辺帯リンパ腫、形質細胞性骨髄腫、形質細胞腫、節外性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、節性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、縦隔（胸腺）大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、血管内大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、原発性滲出性リンパ腫、または、リンパ腫様肉芽腫症である。いくつかの実施形態では、被験体は固形腫瘍を患っている。いくつかの実施形態では、Ｂ細胞悪性腫瘍は慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）である。いくつかの実施形態では、不可逆的なＢＴＫ阻害剤は、イブルチニブ、ＰＣＩ−４５２９２、ＰＣＩ−４５４６６、ＡＶＬ−１０１、ＡＶＬ−２９１、ＡＶＬ−２９２、またはＯＮＯ−ＷＧ−３７の中から選択される。いくつかの実施形態において、不可逆的なＢＴＫ阻害剤はイブルチニブである。いくつかの実施形態では、イブルチニブは、１日当たり約１０ｍｇから１日当たり約２０００ｍｇ、１日当たり約５０ｍｇから１日当たり約１５００ｍｇ、１日当たり約１００ｍｇから１日当たり約１０００ｍｇ、１日当たり約２５０ｍｇから１日当たり約８５０ｍｇ、または、１日当たり約３００ｍｇから１日当たり約６００ｍｇの１日投与量で投与される。いくつかの実施形態では、イブルチニブは、１日当たり約１４０ｍｇ、１日当たり４２０ｍｇ、１日当たり５６０ｍｇ、または、１日当たり８４０ｍｇの１日投与量で投与される。

【0037】

本明細書では、特定の実施形態において、癌の処置のためにＢＴＫ阻害剤を投与される被験体が、治療に対する耐性を生じさせたか、または、生じさせる可能性が高いかどうかをモニタリングする方法が記載されており、該方法は、（ａ）被験体からのＰＬＣγ２ポリペプチドをコード化する核酸分子を含むサンプルを試験する工程であって、それによって、コード化されたＰＬＣγ２ポリペプチドが、配列番号：１１と表記されたアミノ酸配列のアミノ酸位置６６５または７０７に対応するアミノ酸位置で修飾されているかどうかを決定する、工程、および、（ｂ）被験体が修飾を有している場合、ＢＴＫ阻害剤による治療に対する耐性を有する、または、有するようになる可能性が高いと被験体を特徴づける工程、を含む。いくつかの実施形態では、方法は、被験体が修飾を有している場合、ＢＴＫ阻害剤を用いた処置を中止する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は被験体が修飾を有していない場合、ＢＴＫ阻害剤を用いた処置を継続する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、被験体からサンプルを得る工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、被験体が修飾を有している場合、ＬＹＮ、ＳＹＫ、ＪＡＫ、ＰＩ３Ｋ、ＭＡＰＫ、ＭＥＫ、またはＮＦκＢの阻害剤を投与する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、修飾は、ＰＬＣγ２中でのＲ６６５ＷまたはＳ７０７Ｆの置換を含む。いくつかの実施形態において、ＢＴＫ阻害剤は、共有結合のまたは不可逆な阻害剤である。

【0038】

本明細書では、特定の実施形態において、癌の処置のために不可逆的なＢＴＫ阻害剤を投与される被験体の治療を最適化するための方法が記載されており、該方法は、（ａ）被験体からのＰＬＣγ２ポリペプチドをコード化する核酸分子を含むサンプルを試験する工程であって、それによって、コード化されたＰＬＣγ２ポリペプチドが、配列番号：１１と表記されたアミノ酸配列のアミノ酸位置６６５に対応するアミノ酸位置で修飾されているかどうかを決定する、工程、および、（ｂ）被験体が修飾を有している場合、不可逆的なＢＴＫ阻害剤を用いた処置を中止するか、または、被験体が修飾を有していない場合、不可逆的なＢＴＫ阻害剤を用いた処置を継続する工程、を含む。いくつかの実施形態では、方法は、被験体が修飾を有している場合、修飾されたキナーゼを阻害する第２世代のＢＴＫ阻害剤を投与する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、被験体からサンプルを得る工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、被験体が修飾を有している場合、ＬＹＮ、ＳＹＫ、ＪＡＫ、ＰＩ３Ｋ、ＭＡＰＫ、ＭＥＫ、またはＮＦκＢの阻害剤を投与する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、修飾は、ＰＬＣγ２中でのＲ６６５ＷまたはＳ７０７Ｆの置換を含む。いくつかの実施形態において、ＢＴＫ阻害剤は、共有結合性のまたは不可逆な阻害剤である。

【0039】

方法のいくつかの実施形態において、アッセイで使用される核酸分子は、ＲＮＡまたはＤＮＡである。方法のいくつかの実施形態において、核酸分子はｃＤＮＡである。いくつかの実施形態において、アッセイで使用される核酸分子はゲノムＤＮＡである。方法のいくつかの実施形態において、アッセイで使用される核酸分子は、全ＲＮＡである。方法のいくつかの実施形態において、アッセイで使用される核酸分子はｍＲＮＡである。方法のいくつかの実施形態において、方法は、核酸サンプルからｍＲＮＡを単離させる工程をさらに含む。

【0040】

方法のいくつかの実施形態において、試験する工程は、ＰＬＣγ２ポリペプチドのアミノ酸位置６６５または７０７をコード化する核酸のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅を行う工程を含む。いくつかの実施形態では、ＰＣＲ増幅は、ＰＬＣγ２ポリペプチドのアミノ酸位置６６５または７０７をコード化する領域に隣接する１対のオリゴヌクレオチドプライマーを使用することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、増幅した核酸の配列を決定する工程を含む。

【0041】

方法のいくつかの実施形態において、試験する工程は、配列特異的な核酸プローブに核酸を接触させる工程であって、配列特異的な核酸プローブが、（ａ）アミノ酸位置６６５で修飾される修飾ＰＬＣγ２をコード化する核酸に結合し、および、（ｂ）アミノ酸位置６６５または７０７でアルギニンを有する野生型ＰＬＣγ２をコード化する核酸に結合しない、工程を含む。方法のいくつかの実施形態において、試験する工程は、配列特異的な核酸プローブを用いるＰＣＲ増幅を含む。

【0042】

いくつかの実施形態では、方法で使用されるサンプルは、被験体からの１つ以上の腫瘍細胞を含む。いくつかの実施形態では、方法で使用されるサンプルは、循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）を含む。

【0043】

方法のいくつかの実施形態において、方法で使用される核酸は、被験体からの腫瘍細胞サンプルから単離される。いくつかの実施形態では、サンプルは、腫瘍生検サンプル、血液サンプル、血清サンプル、リンパ液サンプル、または骨髄穿刺液である。

【0044】

いくつかの実施形態では、ＢＴＫ阻害剤は、イブルチニブ（ＰＣＩ−３２７６５）、ＰＣＩ−４５２９２、ＰＣＩ−４５４６６、ＡＶＬ−１０１、ＡＶＬ−２９１、ＡＶＬ−２９２、またはＯＮＯ−ＷＧ−３７の中から選択される。いくつかの実施形態において、ＰＬＣγ２阻害剤はイブルチニブである。

【0045】

方法のいくつかの実施形態において、被験体は癌を患っている。いくつかの実施形態では、癌は血液の癌である。いくつかの実施形態では、癌はＢ細胞悪性腫瘍である。いくつかの実施形態では、癌は、白血病、リンパ腫、または骨髄腫の中から選択される。いくつかの実施形態では、Ｂ細胞悪性腫瘍は、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、活性化したＢ細胞びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＡＢＣ−ＤＬＢＣＬ）、胚中心びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＧＣＢ ＤＬＢＣＬ）、縦隔原発Ｂ細胞リンパ腫（ＰＭＢＬ）、非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、濾胞性リンパ腫、免疫芽球性大細胞型リンパ腫、前駆Ｂリンパ芽球性リンパ腫、前駆Ｂ細胞急性リンパ性白血病、ヘアリーセル白血病、マントル細胞リンパ腫、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、リンパ形質細胞性リンパ腫／ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、脾臓周辺帯リンパ腫、形質細胞性骨髄腫、形質細胞腫、節外性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、節性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、縦隔（胸腺）大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、血管内大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、原発性滲出性リンパ腫、または、リンパ腫様肉芽腫症である。いくつかの実施形態では、被験体は固形腫瘍を患っている。

【0046】

方法のいくつかの実施形態において、被験体は、サンプルを得る前にＢＴＫ阻害剤で処置される。いくつかの実施形態では、サンプルは、不可逆的なＢＴＫ阻害剤の第１の投与後、１週、２週、３週、１か月、２か月、３か月、４か月、５か月、６か月、７か月、８か月、９か月、１０か月、１１か月、１２か月、１４か月、１６か月、１８か月、２０か月、２２か月、または２４か月目に得られる。いくつかの実施形態では、サンプルは、ＢＴＫ阻害剤を用いた処置の経過中に、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０回得られる。いくつかの実施形態では、被験体は、ＢＴＫ阻害剤が最初に投与されたときに、ＢＴＫ阻害剤を用いた処置に反応する。

【0047】

本明細書では、特定の実施形態において、アミノ酸位置６６５で修飾を含む修飾されたＰＬＣγ２ポリペプチドを検知するための１つ以上の試薬を含むキットが記載されている。いくつかの実施形態では、キットは、Ｒ６６５ＷまたはＳ７０７Ｆである修飾を有する変異ＰＬＣγ２ポリペプチドを含むマイクロチップを含んでいる。

【0048】

本明細書では、特定の実施形態において、アミノ酸位置６６５または７０７で修飾を含む変異ＰＬＣγ２ポリペプチドをコード化する核酸を検知するための１つ以上の試薬を含むキットが記載されている。いくつかの実施形態では、キットは、Ｒ６６５ＷまたはＳ７０７Ｆである修飾を有する変異ＰＬＣγ２ポリペプチドをコード化する核酸を含むマイクロチップを含んでいる。

【0049】

本明細書では、特定の実施形態において、被験体での不可逆的なＢＴＫ阻害剤を用いた阻害に対して耐性を与える修飾されたＰＬＣγ２を検知するためのシステムが記載されており、該システムは、（ａ）被験体からのＰＬＣγ２ポリペプチドをコード化する核酸分子を含むサンプル、および、（ｂ）配列番号：１１と表記されたアミノ酸配列のアミノ酸位置６６５または７０７に対応するアミノ酸位置で修飾される、変異ＰＬＣγ２ポリペプチドまたはその一部をコード化する核酸を含むマイクロアレイ、を含む。いくつかの実施形態では、マイクロアレイはマイクロチップに含まれる。

【0050】

本明細書では、特定の実施形態において、被験体におけるＢＴＫ阻害剤を用いた阻害に対して耐性を与える修飾されたＰＬＣγ２を検知するためのシステムが記載されており、該システムは、（ａ）被験体からのＰＬＣγ２ポリペプチドをコード化する核酸分子を含むサンプル、および、（ｂ）配列特異的な核酸プローブであって、（ｉ）アミノ酸位置６６５または７０７で修飾される修飾ＰＬＣγ２をコード化する核酸に結合し、および、（ｉｉ）アミノ酸位置６６５でアルギニンを、または、位置７０７でセリンを有する野生型のＰＬＣγ２をコード化する核酸には結合しない、核酸プローブ、を含む。

【0051】

本明細書では、特定の実施形態において、被験体のＢＴＫ阻害剤を用いた阻害に対して耐性を与える修飾されたＰＬＣγ２を検知するためのシステムが記載されており、該システムは、（ａ）被験体からのＰＬＣγ２ポリペプチドをコード化する核酸分子を含むサンプル、および、（ｂ）ＰＬＣγ２ポリペプチドのアミノ酸６６５または７０７をコード化する核酸領域に隣接する一対のオリゴヌクレオチドプライマー、を含む。

【0052】

本明細書では、特定の実施形態において、血液の癌を患っている患者の維持療法の方法が記載されており、該方法は、（ａ）治療上有効な量のＢＴＫ阻害剤を投与する工程を含む維持療法計画を患者に施す工程、および、（ｂ）維持療法計画の経過にわたってあらかじめ決められた時間間隔で患者をモニタリングする工程であって、それによって、被験体が、配列番号：１１と表記されたアミノ酸配列のアミノ酸位置６６５または７０７に対応するアミノ酸位置で修飾をもたらすＰＬＣγ２をコード化する内因性遺伝子の変異を有しているかどうかを決定する、工程、を含む。いくつかの実施形態において、モニタリングする工程は、（ａ）被験体からのＰＬＣγ２ポリペプチドをコード化する核酸分子を含むサンプルを試験する工程であって、それによって、コード化されたＰＬＣγ２ポリペプチドが、配列番号：１１と表記されたアミノ酸配列のアミノ酸位置６６５または７０７に対応するアミノ酸位置で修飾されているかどうかを決定する、工程を含む。いくつかの実施形態では、方法は、被験体に変異がある場合、ＢＴＫ阻害剤を用いた処置を中止する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、被験体に変異がない場合、ＢＴＫ阻害剤を用いた処置を継続する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、被験体が修飾を有している場合、ＬＹＮ、ＳＹＫ、ＪＡＫ、ＰＩ３Ｋ、ＭＡＰＫ、ＭＥＫ、またはＮＦκＢの阻害剤を投与する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＰＬＣγ２ポリペプチド中の修飾は、Ｒ６６５ＷまたはＳ７０７Ｆである。いくつかの実施形態では、あらかじめ決められた時間間隔は、毎月、２か月ごと、３か月ごと、４か月ごと、５か月ごと、６か月ごと、７か月ごと、８か月ごとである。

【0053】

いくつかの実施形態では、ＢＴＫ阻害剤は、１日当たり約１０ｍｇから１日当たり約２０００ｍｇ、１日当たり約５０ｍｇから１日当たり約１５００ｍｇ、１日当たり約１００ｍｇから１日当たり約１０００ｍｇ、１日当たり約２５０ｍｇから１日当たり約８５０ｍｇ、または、１日当たり約３００ｍｇから１日当たり約６００ｍｇの１日投与量で投与される。いくつかの実施形態では、イブルチニブは、１日当たり約１４０ｍｇ、１日当たり４２０ｍｇ、１日当たり５６０ｍｇ、または、１日当たり８４０ｍｇの１日投与量で投与される。いくつかの実施形態では、ＢＴＫ阻害剤は共有結合のおよび／または不可逆的なＢＴＫ阻害剤である。いくつかの実施形態では、ＢＴＫ阻害剤は、イブルチニブ（ＰＣＩ−３２７６５）、ＰＣＩ−４５２９２、ＰＣＩ−４５４６６、ＡＶＬ−１０１、ＡＶＬ−２９１、ＡＶＬ−２９２、またはＯＮＯ−ＷＧ−３７の中から選択される。いくつかの実施形態において、ＢＴＫ阻害剤はイブルチニブである。

【0054】

本明細書では、特定の実施形態において、癌の処置のためにＢＴＫ阻害剤を投与される被験体が、治療に対する耐性を生じさせたか、または、生じさせる可能性が高いかどうかをモニタリングする方法が記載されており、該方法は、（ａ）被験体からのＣＡＲＤ１１ポリペプチドをコード化する核酸分子を含むサンプルを試験する工程であって、それによって、コード化されたＣＡＲＤ１１ポリペプチドが、配列番号：１９と表記されたアミノ酸配列のアミノ酸位置２３２に対応するアミノ酸位置で修飾されているかどうかを決定する、工程、および、（ｂ）被験体が修飾を有している場合、ＢＴＫ阻害剤による治療に対する耐性を有する、または、有するようになる可能性が高いと被験体を特徴づける工程、を含む。いくつかの実施形態では、方法は、被験体が修飾を有している場合、ＢＴＫ阻害剤を用いた処置を中止する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、被験体が修飾を有していない場合、ＢＴＫ阻害剤を用いた処置を継続する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、被験体からサンプルを得る工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、被験体が修飾を有している場合、ＬＹＮ、ＳＹＫ、ＪＡＫ、ＰＩ３Ｋ、ＭＡＰＫ、ＭＥＫ、またはＮＦκＢの阻害剤を投与する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、修飾は、ＣＡＲＤ１１でのＬ２３２ＬＬ挿入を含む。いくつかの実施形態において、ＢＴＫ阻害剤は、共有結合性のまたは不可逆な阻害剤である。

【0055】

本明細書では、特定の実施形態において、癌の処置のために不可逆的なＢＴＫ阻害剤を投与される被験体の治療を最適化する方法が記載されており、該方法は、（ａ）被験体からのＣＡＲＤ１１ポリペプチドをコード化する核酸分子を含むサンプルを試験する工程であって、それによって、コード化されたＣＡＲＤ１１ポリペプチドが、配列番号：１９と表記されたアミノ酸配列のアミノ酸位置２３２に対応するアミノ酸位置で修飾されているかどうかを決定する、工程、および、（ｂ）被験体が修飾を有している場合、不可逆的なＢＴＫ阻害剤を用いた処置を中止するか、または、被験体が修飾を有していない場合、不可逆的なＢＴＫ阻害剤を用いた処置を継続する工程、を含む。いくつかの実施形態では、方法は、被験体が修飾を有している場合、修飾されたキナーゼを阻害する第２世代のＢＴＫ阻害剤を投与する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、被験体からサンプルを得る工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、被験体が修飾を有している場合、ＬＹＮ、ＳＹＫ、ＪＡＫ、ＰＩ３Ｋ、ＭＡＰＫ、ＭＥＫ、またはＮＦκＢの阻害剤を投与する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、修飾は、ＣＡＲＤ１１でのＬ２３２ＬＬ挿入を含む。いくつかの実施形態において、ＢＴＫ阻害剤は、共有結合性のまたは不可逆な阻害剤である。

【0056】

方法のいくつかの実施形態において、アッセイで使用される核酸分子は、ＲＮＡまたはＤＮＡである。方法のいくつかの実施形態において、核酸分子はｃＤＮＡである。方法のいくつかの実施形態において、アッセイで使用される核酸分子は、ゲノムＤＮＡである。方法のいくつかの実施形態において、アッセイで使用される核酸分子は、全ＲＮＡである。方法のいくつかの実施形態において、アッセイで使用される核酸分子は、ｍＲＮＡである。方法のいくつかの実施形態において、方法は、ＲＮＡサンプルからｍＲＮＡを単離する工程をさらに含む。

【0057】

方法のいくつかの実施形態において、試験する工程は、ＣＡＲＤ１１ポリペプチドのアミノ酸位置２３２をコード化する核酸のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅を行う工程を含む。いくつかの実施形態では、ＰＣＲ増幅は、ＣＡＲＤ１１ポリペプチドのアミノ酸位置２３２をコード化する領域に隣接する一対のオリゴヌクレオチドプライマーを使用することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、増幅した核酸の配列を決定するを含む。

【0058】

方法のいくつかの実施形態において、試験する工程は、配列特異的な核酸プローブに核酸を接触させる工程であって、配列特異的な核酸プローブが、（ａ）アミノ酸位置２３２で修飾される修飾ＣＡＲＤ１１をコード化する核酸に結合し、および、（ｂ）野生型のＣＡＲＤ１１をコード化する核酸に結合しない、工程、を含む。方法のいくつかの実施形態において、試験する工程は、配列特異的な核酸プローブを使用するＰＣＲ増幅を含む。

【0059】

いくつかの実施形態では、方法で使用されるサンプルは、被験体からの１つ以上の腫瘍細胞を含む。いくつかの実施形態では、方法で使用されるサンプルは、循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）を含む。

【0060】

方法のいくつかの実施形態において、方法で使用される核酸は、被験体からの腫瘍細胞サンプルから単離させる。いくつかの実施形態では、サンプルは、腫瘍生検サンプル、血液サンプル、血清サンプル、リンパ液サンプル、または骨髄穿刺液である。

【0061】

いくつかの実施形態では、ＢＴＫ阻害剤は、イブルチニブ（ＰＣＩ−３２７６５）、ＰＣＩ−４５２９２、ＰＣＩ−４５４６６、ＡＶＬ−１０１、ＡＶＬ−２９１、ＡＶＬ−２９２、またはＯＮＯ−ＷＧ−３７の中から選択される。いくつかの実施形態において、ＢＴＫ阻害剤はイブルチニブである。

【0062】

方法のいくつかの実施形態において、被験体は癌を患っている。いくつかの実施形態では、癌は血液の癌である。いくつかの実施形態では、癌はＢ細胞悪性腫瘍である。いくつかの実施形態では、癌は白血病、リンパ腫、または骨髄腫の中から選択される。いくつかの実施形態では、Ｂ細胞悪性腫瘍は、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、活性化したＢ細胞びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＡＢＣ−ＤＬＢＣＬ）、胚中心びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＧＣＢ ＤＬＢＣＬ）、縦隔原発Ｂ細胞リンパ腫（ＰＭＢＬ）、非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、濾胞性リンパ腫、免疫芽球性大細胞型リンパ腫、前駆Ｂリンパ芽球性リンパ腫、前駆Ｂ細胞急性リンパ性白血病、ヘアリーセル白血病、マントル細胞リンパ腫、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、リンパ形質細胞性リンパ腫／ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、脾臓周辺帯リンパ腫、形質細胞性骨髄腫、形質細胞腫、節外性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、節性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、縦隔（胸腺）大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、血管内大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、原発性滲出性リンパ腫、または、リンパ腫様肉芽腫症である。いくつかの実施形態では、被験体は固形腫瘍を患っている。

【0063】

方法のいくつかの実施形態において、被験体は、サンプルを得る前にＢＴＫ阻害剤で処置される。いくつかの実施形態では、サンプルは、不可逆的なＢＴＫ阻害剤の第１の投与後、１週、２週、３週、１か月、２か月、３か月、４か月、５か月、６か月、７か月、８か月、９か月、１０か月、１１か月、１２か月、１４か月、１６か月、１８か月、２０か月、２２か月、または２４か月目に得られる。いくつかの実施形態では、サンプルは、ＢＴＫ阻害剤を用いた処置の経過中に、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０回得られる。いくつかの実施形態では、被験体は、ＢＴＫ阻害剤が最初に投与されたときに、ＢＴＫ阻害剤を用いた処置に反応する。

【0064】

本明細書では、特定の実施形態において、アミノ酸位置２３２で修飾を含む修飾されたＣＡＲＤ１１ポリペプチドを検知するための１つ以上の試薬を含むキットである。いくつかの実施形態では、キットは、Ｌ２３２ＬＬである修飾を有する変異ＣＡＲＤ１１ポリペプチドを含むマイクロチップを含んでいる。

【0065】

本明細書では、特定の実施形態において、アミノ酸位置２３２で修飾を含む変異ＣＡＲＤ１１ポリペプチドをコード化する核酸を検知するための１つ以上の試薬を含むキットである。いくつかの実施形態では、キットは、Ｌ２３２ＬＬである修飾を有する変異ＣＡＲＤ１１ポリペプチドをコード化する核酸を含むマイクロチップを含んでいる。

【0066】

本明細書では、特定の実施形態において、被験体における不可逆的なＢＴＫ阻害剤を用いた阻害に対して耐性を与える修飾されたＣＡＲＤ１１を検知するためのシステムが記載されており、該システムは、（ａ）被験体からのＣＡＲＤ１１ポリペプチドをコード化する核酸分子を含むサンプル、および、（ｂ）配列番号：１９と表記されたアミノ酸配列のアミノ酸位置２３２に対応するアミノ酸位置で修飾される変異ＣＡＲＤ１１ポリペプチドまたはその一部をコード化する核酸を含むマイクロアレイ、を含む。いくつかの実施形態では、マイクロアレイはマイクロチップに含まれる。

【0067】

本明細書では、特定の実施形態において、被験体のＢＴＫ阻害剤を用いた阻害に対して耐性を与える修飾されたＣＡＲＤ１１を検知するためのシステムが記載されており、該システムは、（ａ）被験体からのＣＡＲＤ１１ポリペプチドをコード化する核酸分子を含むサンプル、および、（ｂ）配列特異的な核酸プローブであって、（ｉ）アミノ酸位置２３２で修飾される修飾ＣＡＲＤ１１をコード化する核酸に結合し、および、（ｉｉ）野生型のＣＡＲＤ１１をコード化する核酸には結合しない、核酸プローブ、を含む。

【0068】

本明細書では、特定の実施形態において、被験体のＢＴＫ阻害剤を用いた阻害に対して耐性を与える修飾されたＣＡＲＤ１１を検知するためのシステムが記載されており、該システムは、（ａ）被験体からのＣＡＲＤ１１ポリペプチドをコード化する核酸分子を含むサンプル、および、（ｂ）ＣＡＲＤ１１ポリペプチドのアミノ酸２３２をコード化する核酸領域に隣接する一対のオリゴヌクレオチドプライマー、を含む。

【0069】

本明細書では、特定の実施形態において、血液の癌を患っている患者の維持療法の方法が記載されており、該方法は、（ａ）治療上有効な量のＢＴＫ阻害剤を投与する工程を含む維持療法計画を患者に施す工程、および、（ｂ）維持療法計画の経過にわたってあらかじめ決められた時間間隔で患者をモニタリングする工程であって、それによって、被験体が、配列番号：１９と表記されたアミノ酸配列のアミノ酸位置２３２に対応するアミノ酸位置で修飾をもたらすＣＡＲＤ１１をコード化する内因性遺伝子の変異を有しているかどうかを決定する、工程、を含む。いくつかの実施形態において、モニタリングする工程は、（ａ）被験体からのＣＡＲＤ１１ポリペプチドをコード化する核酸分子を含むサンプルを試験する工程であって、それによって、コード化されたＣＡＲＤ１１ポリペプチドが、配列番号：１９と表記されたアミノ酸配列のアミノ酸位置２３２に対応するアミノ酸位置で修飾されているかどうかを決定する、工程、を含む。いくつかの実施形態では、方法は、被験体に変異がある場合、ＢＴＫ阻害剤を用いた処置を中止する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、被験体に変異がない場合、ＢＴＫ阻害剤を用いた処置を継続する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、被験体が修飾を有している場合、ＬＹＮ、ＳＹＫ、ＪＡＫ、ＰＩ３Ｋ、ＭＡＰＫ、ＭＥＫ、またはＮＦκＢの阻害剤を投与する工程をさらに含む。いくつかの実施形態において、ＣＡＲＤ１１ポリペプチド中の変異はＬ２３２ＬＬである。いくつかの実施形態では、あらかじめ決められた時間間隔は、毎月、２か月ごと、３か月ごと、４か月ごと、５か月ごと、６か月ごと、７か月ごと、８か月ごとである。

【0070】

いくつかの実施形態では、ＢＴＫ阻害剤は、１日当たり約１０ｍｇから１日当たり約２０００ｍｇ、１日当たり約５０ｍｇから１日当たり約１５００ｍｇ、１日当たり約１００ｍｇから１日当たり約１０００ｍｇ、１日当たり約２５０ｍｇから１日当たり約８５０ｍｇ、または、１日当たり約３００ｍｇから１日当たり約６００ｍｇの１日投与量で投与される。いくつかの実施形態では、イブルチニブは、１日当たり約１４０ｍｇ、１日当たり４２０ｍｇ、１日当たり５６０ｍｇ、または、１日当たり８４０ｍｇの１日投与量で投与される。いくつかの実施形態では、ＢＴＫ阻害剤は共有結合のおよび／または不可逆的なＢＴＫ阻害剤である。いくつかの実施形態では、ＢＴＫ阻害剤は、イブルチニブ（ＰＣＩ−３２７６５）、ＰＣＩ−４５２９２、ＰＣＩ−４５４６６、ＡＶＬ−１０１、ＡＶＬ−２９１、ＡＶＬ−２９２、またはＯＮＯ−ＷＧ−３７の中から選択される。いくつかの実施形態において、ＢＴＫ阻害剤はイブルチニブである。

【図面の簡単な説明】

【0071】

【図1】イブルチニブを含む野生型および変異ＢＴＫの構造モデリングを描く。赤い矢印は破壊された共有結合を指し示している。

【図2A】ＢＴＫ変異がＢＣＲシグナル伝達経路の再活性化と遺伝子発現の変化をもたらすことを実証している。図２Ａは、４つの連続的なサンプルにおけるＢＴＫリン酸化と下流のＢＣＲシグナル伝達の免疫ブロット法を描いている。ＧＡＰＤＨは負荷対照として含まれた。

【図2B】ＢＴＫ変異がＢＣＲシグナル伝達経路の再活性化と遺伝子発現の変化をもたらすことを実証している。図２Ｂは、４つの連続的なサンプルすべてにわたって２７−遺伝子ＢＣＲシグネチャー（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）の発現プロフィールを含むグラフ式のヒートマップを示す。ＲＰＫＭで正常化された発現計算は、以下に示された色基準範囲を使用して、色によって表わされた。

【図2C】ＢＴＫ変異がＢＣＲシグナル伝達経路の再活性化と遺伝子発現の変化をもたらすことを実証している。図２Ｃ：ＲＰＫＭで正常化された発現計算は、ＢＣＲシグネチャーのクラスターにおける個々の遺伝子についてプロットされた。４つの検体の差は一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）によって分析された。＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐｐ＜０．００１。

【図3A】：ＢＴＫ変異により、他のＢＣＲ阻害剤に高感度なままの生体外の細胞増殖が増加した。図３Ａ：患者の臨床経過中のＫｉ６７＋ＣＬＬ細胞の長軸方向の変化。

【図3B】：ＢＴＫ変異により、他のＢＣＲ阻害剤に高感度なままの生体外の細胞増殖が増加した。図３Ｂ：試験管内の間質に引き起こされた増殖は、Ｐｒｅ−Ｒｘおよび反応性のサンプルで、イブルチニブによって除去されたが、再発したサンプル中では除去されなかった。イブルチニブの濃度はそれぞれの欄の上部に示された。ＢｒｄＵ＋細胞の比率はそれぞれのプロットの中で示されている。Ｉｓｏ（アイソタイプ対照）。

【図3C】：ＢＴＫ変異により、他のＢＣＲ阻害剤に高感度なままの生体外の細胞増殖が増加した。図３Ｃ：ＣＬＬ増殖に対する他のキナーゼ阻害剤の効果。実験で使用される濃度が示された。未処置細胞（＋ＮＫ）は対照として役立った。ＰＲＴ０６０３１８（ＳＹＫ阻害剤）；ＰＲＴ０６２０７０（ＳＹＫ／ＪＡＫの二重阻害剤）；ＣＡＬ１０１（ＰＩ３Ｋδ阻害剤）；トファシチニブ（ＪＡＫ阻害剤）；および、ダサチニブ（多標的キナーゼ阻害剤）。

【図4】イブルチニブを用いた処置の後に再発後、増加した増殖を反映する細胞の幅の変化。

【発明を実施するための形態】

【0072】

＜特定の化学用語＞
他に定義されない限り、本明細書で用いられる全ての技術的および科学的な用語は、請求項に係る主題が属する当該分野の知識を有する者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。特許、特許出願、公開された出願および出版物、ＧＥＮＢＡＮＫ配列、ウェブサイト、および他の出版物は、本明細書での開示全体にわたって、他に明記されない限り、引用によりそのまま組み込まれる。本明細書の用語に複数の定義がある場合、この表題の定義が優先される。ＵＲＬまたは他のそのような識別子またはアドレスについて言及する場合、そのような識別子は変更可能であり、とりわけ、インターネット上の特定の情報は変動することがあり得るが、同等の情報はインターネットおよび／または適切なデータベースを検索するなどして、容易に入手することができることが理解されよう。そのようなものについての言及は、そのような情報の利用可能性と好適な普及を証拠づけるものである。一般に、細胞培養、細胞感染症、抗体産生、および分子生物学的方法の手続きは、当該技術で一般に使用される方法である。そのような標準的な技術は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ． （２０００） ａｎｄ Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ． （１９９４）などのレファレンスマニュアルで見られる。

【0073】

本明細書で用いられるように、単数形「ａ、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈で他に明確に指示されていない限り、複数の指示対象を含む。本出願では、単数の使用は、特別に別記しない限り、複数を含んでいる。本明細書で使用されるように、「または」の使用は、特に明記しない限り、「および／または」を意味する。さらに、用語「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」の使用は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「ｉｎｃｌｕｄｅｓ」、および、「含まれる（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」といった他の形態と同じく、限定されない。

【0074】

本明細書で使用されているように、範囲および量は、「約（ａｂｏｕｔ）」特定の値または範囲として表すことができる。「約」は正確な量も含んでいる。従って、「約５μｇ」は「約５μｇ」も「５μｇ」も意味する。一般に、用語「約」は、実験の誤差内であると予想される量を含んでいる。

【0075】

本明細書で使用されているように、Ｂｒｕｔｏｎ型チロシンキナーゼ（ＢＴＫ）ポリペプチドは、限定されないが、組み換え生成されたタンパク質、合成により生成されたタンパク質、天然のＢＴＫタンパク質、および、細胞または組織から抽出されたＢＴＫタンパク質を含む、任意のＢＴＫタンパク質またはポリペプチドを指す。ＢＴＫポリペプチドは、限定されないが、ヒト起源およびヒト以外の起源の動物を含む様々な種からの関連するポリペプチドを含んでいる。ヒト以外の起源のＢＴＫポリペプチドとしては、限定されないが、ヒト以外の霊長類（例えばチンパンジーと類人猿）、マウス（例えばマウスとラット）、イヌ科の動物（ｃａｎｉｎｅ）（イヌ）、ネコ科の動物（ネコ）、ウサギのような動物（ｌｅｐｏｒｉｎｅ）（ウサギ）、鳥類（ａｖｉａｎ）（鳥）、ウシ亜科の動物（雌ウシ）、ヒツジのような動物（ｏｖｉｎｅ）（ヒツジ）、ブタのような動物（ｐｏｒｃｉｎｅ）（ブタ）、ウマ科の動物（ｅｑｕｉｎｅ）（ウマ）、魚類（ｐｉｓｃｉｎｅ）（サカナ）、カエル（ｒａｎｉｎｅ）（カエル）、および、他の哺乳動物または非哺乳動物のＢＴＫポリペプチドが挙げられる。例証的なＢＴＫポリペプチドとしては、例えば、マウス（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＡＢ４７２４６）、イヌ（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＸＰ＿５４９１３９）、ラット（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＰ＿００１００７７９９）、ニワトリ（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＰ＿９８９５６４）、または、ゼブラフィッシュ（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＸＰ＿６９８１１７）からのオルソログと、Ｂｒｕｔｏｎ型チロシンキナーゼの１以上の基質（例えば、アミノ酸配列ＡＶＬＥＳＥＥＥＬＹＳＳＡＲＱ」を有するペプチド基質）に対するキナーゼ活性を示す、前述のいずれかの融合タンパク質が挙げられる。典型的なＢＴＫポリペプチドとしては、限定されないが、配列番号：１、２、および、４−６が挙げられる。ＢＴＫポリペプチドは、野生型のＢＴＫ、対立遺伝子多型アイソフォーム、腫瘍または血液悪性腫瘍で見られる変異を含む体細胞変異、核酸からの合成分子、ヒト組織および細胞から単離したタンパク質、および、その修飾形態が挙げられる。本明細書で提供されるＢＴＫポリペプチドは、１つ以上のアミノ酸の欠失、追加、または置換によって、一次アミノ酸配列を修飾することで、さらに修飾することができる。ＢＴＫポリペプチドは、キナーゼ活性などのＢＴＫ活性を有する、任意のＢＴＫポリペプチドまたはその一部を含んでいる。

【0076】

本明細書で使用されているように、変異ＢＴＫポリペプチド、変異ＢＴＫタンパク質、修飾されたＢＴＫポリペプチドまたは修飾されたＢＴＫタンパク質は、本明細書では交互に使用されており、１つ以上のアミノ酸位置で修飾されるＢＴＫポリペプチドを指す。典型的な修飾は、限定されないが、アミノ酸の置換、欠失、または追加を含んでいる。

【0077】

本明細書で使用されているように、用語「ＢＴＫ阻害剤」または「ＢＴＫアンタゴニスト」は、ＢＴＫポリペプチドの少なくとも１つの活性を阻害するまたは低下させる剤を指す。ＢＴＫ活性は直接的および間接的な活性を含む。典型的な直接的な活性は、限定されないが、標的分子との会合または標的基質のリン酸化（すなわちキナーゼ活性）を含んでいる。典型的な間接的な活性は、限定されないが、例えば、ＮＦ−κＢを媒介とした遺伝子転写の活性化といった、下流の生物学的事象の活性化または阻害を含んでいる。

【0078】

本明細書で使用されているように、用語「不可逆的な阻害剤」は、標的タンパク質（例えばキナーゼ）と接触すると、タンパク質との、または、タンパク質内での、新しい共有結合の形成を引き起こし、それによって、標的タンパク質の生物活性（例えば、リン酸転移酵素活性）の１つ以上が、不可逆的な阻害剤のその後の存在の有無に関わらず減少するまたは破壊される、化合物を指す。

【0079】

本明細書で使用されているように、用語「不可逆的なＢｔｋ阻害剤」は、Ｂｔｋのアミノ酸残基と共有結合を形成することができるＢｔｋの阻害剤を指す。１つの実施形態では、Ｂｔｋの不可逆的な阻害剤は、Ｂｔｋのシステイン残基と共有結合を形成することができる。特定の実施形態では、不可逆的な阻害剤は、Ｂｔｋのシステイン４８１残基（または、そのホモログ）、あるいは、別のチロシンキナーゼの類似の対応する位置のシステイン残基と、共有結合を形成することができる。

【0080】

本明細書で使用されているように、ＢＴＫ活性の阻害は、阻害剤のない状態での同じ活性と比較して、阻害剤のある状態でのＢＴＫ活性の任意の減少を指す。

【0081】

本明細書で使用されているように、「共有結合のおよび／または不可逆的なＢＴＫ阻害剤に対する耐性を与える」との用語は、共有結合のおよび／または不可逆的なＢＴＫ阻害剤による阻害に対するＢＴＫの感受性の任意の減少を指す。本明細書で提供されたいくつかの実施形態において、システイン４８１のＢＴＫの修飾は、共有結合のおよび／または不可逆的なＢＴＫ阻害剤に対する耐性を与える。いくつかの実施形態では、修飾は、ＢＴＫへの阻害剤の結合を防ぐ。いくつかの実施形態において、阻害剤はＢＴＫに可逆的に結合する。いくつかの実施形態では、修飾されたＢＴＫに結合するための阻害剤の親和性は、野生型のＢＴＫへの結合と比較して減少する。

【0082】

本明細書で使用されているように、用語「第２世代のＢＴＫ阻害剤」は、システイン４８１でアミノ酸修飾を含むＢＴＫポリペプチドの少なくとも１つの活性を阻害する剤を指す。いくつかの実施形態では、第２世代のＢＴＫ阻害剤は、野生型のＢＴＫポリペプチドの活性も阻害する。いくつかの実施形態では、第２世代のＢＴＫ阻害剤は、野生型のＢＴＫポリペプチドの活性を阻害しない。

【0083】

本明細書で使用されているように、用語「第１世代のＢＴＫ阻害剤」は、野生型のＢＴＫポリペプチドの活性を阻害するが、システイン４８１でアミノ酸修飾を含むＢＴＫポリペプチドの阻害を減じる剤を指す。いくつかの実施形態では、第１世代のＢＴＫ阻害剤は、共有結合のおよび／または不可逆的なＢＴＫ阻害剤である。

【0084】

「癌」および「癌性の」という用語は、一般に制御されない細胞増殖を特徴とする哺乳動物の生理的な状態のこと指すまたは記載している。癌の例としては、限定されないが、リンパ腫と白血病のようなＢ細胞リンパ増殖性障害（ＢＣＬＤ）、および、固形腫瘍が挙げられる。「Ｂ細胞関連癌」または「Ｂ細胞系統の癌」によって、調節不全のまたは制御されない細胞増殖がＢ細胞に関連付けられる癌の任意の種類を意図している。

【0085】

癌の文脈における「難治性」によって、いて、特定の治療薬を用いる治療に対する耐性を有する、または、該治療に反応しない、特定の癌を意図している。癌は、特定の治療薬を用いた第１の治療期間の間に、あるいは、該治療薬を用いたその後の治療期間中に、特定の治療薬を用いた処置の発症から（すなわち、治療薬への最初の曝露に反応しない）、あるいは、治療薬に対する耐性を進行させた結果として、治療薬を用いた治療に対して難治性であることもある。

【0086】

本明細書で使用されているように、「維持療法」は、最初の治療に対する有益な反応（例えば、寛解）後に、再発（癌の再発）のリスクを低下させるのに役立つ化学療法または別の処置の継続使用を意味する。維持療法を進行癌（例えば、治癒することができない癌）の患者に用いて、進行癌がさらに成長して転移するのを防いでもよい。

【0087】

「ＢＴＫを媒介としたシグナル伝達」によって、直接的または間接的にＢＴＫの活性に依存する生物活性のいずれかを意図している。ＢＴＫを媒介としたシグナル伝達の例は、信号である、ＢＴＫ発現細胞の増殖と生存、および、ＢＴＫ発現細胞中の１つ以上のＢＴＫシグナル伝達経路の刺激をもたらすシグナルである。

【0088】

ＢＴＫ「シグナル伝達経路」または「シグナル変換経路」は、ＢＴＫの活性に起因する、少なくとも１つの生化学反応または一群の生化学反応であって、シグナル経路を通って伝達されると、シグナル伝達カスケードで１以上の下流の分子の活性化をもたらすシグナルを生成する反応を意味するように意図されている。シグナル伝達経路は多くのシグナル伝達分子を含んでおり、これは、細胞表面から、細胞の原形質膜を超えて、一連のシグナル伝達分子の１以上を介して、細胞の細胞質を介して、場合によっては、細胞の核へとシグナルを伝達する。本発明にとってとりわけ興味深いことは、ＮＦ−κＢシグナル伝達経路を介したＮＦ−κＢの活性化を制御する（あるいは増強するまたは阻害する）シグナル伝達経路である。

【0089】

用語「核酸」は、一本鎖または二本鎖形態のデオキシリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオシド、リボヌクレオシド、または、リボヌクレオチド、およびこれらのポリマーを指す。特に明記されない限り、この用語は、基準核酸として類似する結合特徴を有し、かつ、自然発生のヌクレオチドに類似する方法で代謝される、天然のヌクレオチドの既知のアナログを含む核酸を包含している。とりわけ他の方法で限定されない限り、この用語は、ＰＮＡ（ペプチド核酸（ｐｅｐｔｉｄｏｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）、アンチセンス技術で使用されるＤＮＡのアナログ（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロアミデート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏａｍｉｄａｔｅｓ））を含むオリゴヌクレオチド・アナログを指す。他の方法で明記されない限り、特定の核酸配列は、保存的に修飾されたその変異体（限定されないが、縮重コドン置換を含む）、および、明示された配列と同様に相補的な配列も暗に含んでいる。具体的には、縮重コドン置換は、１つ以上の選択された（またはすべての）コドンの第３位置が混合基および／またはデオキシイノシンの残基で置換される配列を生成することで達成される（Ｂａｔｚｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ． １９：５０８１； Ｏｈｔｓｕｋａ ｅｔ ａｌ． （１９８５） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６０：２６０５−２６０８； ａｎｄ Ｃａｓｓｏｌ ｅｔ ａｌ． （１９９２）Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｐｒｏｂｅｓ ６， ３２７−３３１； ａｎｄ Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｐｒｏｂｅｓ ８：９１−９８）。

【0090】

用語「アミノ酸」は、アミノ酸アナログ、および、自然発生のアミノ酸に類似した方法で機能するアミノ酸模倣物と同様に、自然発生の、および、非自然発生のアミノ酸も指す。天然にコード化されたアミノ酸は、２０の共通のアミノ酸（アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、および、バリン）と、ピロリジン（ｐｙｒｏｌｙｓｉｎｅ）およびセレノシステインである。アミノ酸アナログは、自然発生のアミノ酸（すなわち、水素、カルボキシル基、アミノ基、および、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルフォキシド、メチオニンメチルスルホニウムなどのＲ基に結合されるα炭素）と同じ基本的な化学構造を有している薬剤を指す。そのようなアナログは、Ｒ基（ノルロイシンなど）を修飾しているか、または、ペプチド主鎖を修飾しているが、自然発生のアミノ酸と同じ基本的な化学構造を保持する。

【0091】

アミノ酸は、その一般に知られた３文字の記号またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名法委員会（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ）によって推奨された１文字の記号によって本明細書では呼ばれる。ヌクレオチドも同様に、その一般に容認された１文字のコードによって呼ばれる。

【0092】

用語「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」は、アミノ酸残基のポリマーを指すために本明細書では交互に使用される。この用語は、自然発生のアミノ酸ポリマーにも、１つ以上のアミノ酸残基が非自然発生のアミノ酸（例えばアミノ酸アナログ）であるアミノ酸ポリマーにも適用される。この用語は、完全長のタンパク質を含む任意の長さのアミノ酸鎖を包含しており、アミノ酸残基は共有結合のペプチド結合によって結合される。

【0093】

本明細書で使用されているように、ポリペプチドのアミノ酸の配列、または、核酸分子中のヌクレオチドの配列の修飾に関する修飾は、アミノ酸とヌクレオチドのそれぞれの欠失、挿入および置換を含んでいる。

【0094】

２つのアミノ酸配列、または、２つの核酸の相同率を測定するために、配列を、最適な比較目的のために位置合わせすることが可能である（例えば、第２のアミノまたは核酸配列との最適なアライメントのために、最初のアミノ酸の配列、または、核酸配列に、ギャップを導入する）。その後、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置でのアミノ酸残基またはヌクレオチドを、比較することができる。第１の配列の位置が、第２の配列の対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドによって占領されている場合、分子はその位置で同一である。２つの配列間の相同率は、配列によって共有される同一の位置の数の関数である（すなわち、％同一性＝同一の位置の＃／位置の合計の＃（例えばオーバーラップする位置）ｘ１００）。いくつかの実施形態において、２つの配列は同じ長さである。

【0095】

２つの配列間の相同率を決定するために、ＫａｒｌｉｎとＡｌｔｓｃｈｕｌのアルゴリズム（１９９０）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８７：２２６４−２２６８， ｍｏｄｉｆｉｅｄ ａｓ ｉｎ Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ （１９９３） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：５８７３−５８７７が用いられる。そのようなアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ， ｅｔ ａｌ． （１９９０） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５：４０３−４１０のＮＢＬＡＳＴとＸＢＬＡＳＴのプログラムへ組み込まれる。ＢＬＡＳＴヌクレオチド探索は、本明細書に記載または開示された核酸分子に相同のヌクレオチド配列を得るために、ＮＢＬＡＳＴプログラム（ｓｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２）を用いて行われる。ＢＬＡＳＴタンパク質探索は、ＸＢＬＡＳＴプログラム（ｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３）で行なわれる。比較目的のためにギャップを入れた（ｇａｐｐｅｄ）アライメントを達成するために、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９７） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５：３３８９−３４０２に記載されるように、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴを利用する。ＢＬＡＳＴおよびＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを利用する際には、それぞれのプログラムのデフォルトのパラメーター（例えばＸＢＬＡＳＴとＮＢＬＡＳＴ）が使用される。より詳細については、全米バイオテクノロジー情報センターのウェブサイトを参照のこと（ワールド・ワイド・ウェブでncbi.nlm.nih.gov）。本明細書に記載の方法で使用するに適しているタンパク質は、本明細書に記載の任意のタンパク質のアミノ酸配列と比較して、１〜１５のアミノ酸変化、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５のアミノ酸の置換、欠失、または追加を有するタンパク質をさらに含んでいる。他の実施形態では、変更したアミノ酸配列は、本明細書に記載の任意のタンパク質のアミノ酸配列と、少なくとも７５％、例えば、７７％、８０％、８２％、８５％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または、１００％同一である。そのような配列を変化させたタンパク質は、変更されたアミノ酸配列が本明細書に記載の組成物および方法において十分な生物活性を機能的に維持する限り、本明細書に記載の方法に適している。アミノ酸置換が行われる場合、置換は保存的なアミノ酸置換でなければならない。共通のアミノ酸の中で、例えば、「保存的なアミノ酸置換」は、以下の基のそれぞれ内部のアミノ酸の中での置換によって例証される：（１）グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、および、イソロイシン、（２）フェニルアラニン、チロシン、および、トリプトファン、（３）セリンおよびトレオニン、（４）アスパラギン酸およびグルタミン酸、（５）グルタミンおよびアスパラギン、ならびに、（６）リジン、アルギニン、および、ヒスチジン。当業者は、一般に、ポリペプチドの必須ではない領域の１つのアミノ酸置換では、生物活性がほとんど変化しないことを認識している（参照、例えば、Ｗａｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｅｎｅ， ４ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ， １９８７， Ｔｈｅ Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ Ｐｕｂ． ｃｏ．， ｐ．２２４を参照）。これに応じて、ＢＬＯＳＵＭ６２表は、関連するタンパク質の５００を超える基の高度に保存された領域を表わす、タンパク質配列部分の約２０００の局所的な多重アライメントに由来するアミノ酸置換行列である（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ｅｔ ａｌ （１９９２） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８９：１０９１５−１０９１９）。したがって、ＢＬＯＳＵＭ６２置換頻度は、実施形態によっては、本明細書で記載または開示されたアミノ酸配列に導入される保存的なアミノ酸置換を定義するために、使用される。化学的性質（上記）だけに基づいてアミノ酸置換を設計することは可能であるが、「保存的なアミノ酸置換」という言葉は、好ましくは、−１よりも大きなＢＬＯＳＵＭ６２値によって表わされる置換を指す。例えば、置換が０、１、２、または３のＢＬＯＳＵＭ６２値を特徴とする場合、アミノ酸置換は保存的である。このシステムによれば、好ましい保存的なアミノ酸置換は少なくとも１（例えば１、２、または３）のＢＬＯＳＵＭ６２値を特徴とするが、より好ましい保存的なアミノ酸置換は、少なくとも２（例えば、２または３）のＢＬＯＳＵＭ６２値を特徴とする。

【0096】

本明細書で使用されているように、対応する残基は位置合わせした座で生じる残基を指す。関連するポリペプチドまたは変異ポリペプチドは、当業者に既知の任意の方法によって位置合わせされる。そのような方法は典型的には一致点を最大にするものであり、手作業のアライメントを使用するような、および、利用可能な（例えばＢＬＡＳＴＰ）、ならびに、当業者に知られている、多くのアライメントプログラムを使用する方法を含んでいる。ポリペプチドの配列を位置合わせすることによって、当業者は、ガイドとして、保存された同一のアミノ酸残基を用いて、対応する残基を同定することができる。対応する位置は、例えば、タンパク質構造のコンピューターでシミュレートされたアライメントを用いることで、構造のアライメントに基づくことができる。他の場合には、対応する領域を同定することができる。

【0097】

本明細書で使用されているように、対立形質の変異体または対立形質の変更形態は、遺伝子（すなわち、対立遺伝子によってコード化される）の基準形態とは異なる遺伝子によってコード化されたポリペプチドを言う。典型的に、遺伝子の基準形態は、種の集団または１つの基準メンバーからのポリペプチドの野性型形態および／または優勢な形態をコード化する。一般に、種の間に変異体を含む対立形質の変異体は、典型的には、同じ種からの野性型および／または優勢な形態と、少なくとも８０％、９０％、またはそれ以上のアミノ酸同一性を有しており、同一性の程度は、遺伝子に依存するとともに、比較が異種間であるか同一種間であるかに依存する。一般に、同一種内の対立形質の変異体は、ポリペプチドの野性型および／または優勢な形態との９６％、９７％、９８％、９９％以上の同一性を含む、野性型および／または優勢な形態との少なくとも約８０％、８５％、９０％、または９５％以上の同一性を有している。

【0098】

本明細書で使用されているように、用語「十分に精製される」は、精製前に対象の成分を通常伴う、または該成分に相互作用する、他の成分を実質的に含まないまたは本質的に含まない対象成分を指している。ほんの一例として、対象成分は、対象成分の調合剤が、汚染成分の（乾重量で）約３０％未満、約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、あるいは、約１％未満を含有している際に、「十分に精製され」得る。したがって、「十分に精製された」対象成分は、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％以上の精製レベルを有することができる。

【0099】

本明細書で使用されているように、種変異体は、種の間の同じポリペプチドの変異体を指す。一般に、異種間の変異体は、ポリペプチドの野性型および／または優勢な形態との９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の同一性を含む、野性型および／または優勢な形態との少なくとも約６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、または９５％以上の同一性を有している。

【0100】

本明細書で使用されているような用語「被験体」は、治療、観察、または実験の対象である動物を指す。ほんの一例として、被験体は、限定されないがヒトを含む哺乳動物であってもよいが、これに限定されない。

【0101】

本明細書で使用されているように、ＩＣ５０は、最大反応を測定するアッセイにおいて、最大反応の５０％阻害、例えば、Ｂｔｋの阻害を達成する、特定の試験化合物の量、濃度、または用量を指す。

【0102】

本明細書で使用されているように、ＥＣ５０は、特定の試験化合物によって誘発され、引き起こされ、または、強められる特定の反応の最大発現の５０％で用量依存性の反応を引き出す、特定の試験化合物の１回分の用量、濃度、または量を指す。

【0103】

本明細書で使用されているように、「処置する（ｔｒｅａｔ）」、「処置している（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」、及び「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」という用語は、および、他の文法的な同等物は、疾患または疾病の１以上の症状を軽減、減少、または改善すること、疾患または疾病の１以上の追加の症状の出現、重症度、または頻度を改善、予防、または、減少させること、疾患または疾病の１以上の症状の根底にある代謝の原因を改善または予防すること、疾患または疾病を抑制すること、例えば、疾患または疾病の進行を停止すること、疾患または疾病を緩和すること、疾患または疾病を退行させること、疾患または疾病により生じる状態を緩和すること、あるいは、疾患または疾病の症状を予防的および／または治療的に抑制すること、を含む。非限定的な例において、予防的な利益については、本明細書に開示された第３世代のＢＴＫ阻害化合物は、特定の障害を進行させる危険のある、特定の障害を進行させやすい、あるいは、障害の生理的な症状の１つ以上を報告している個体に、投与される。いくつかの実施形態では、本明細書に開示された第３世代のＢＴＫ阻害化合物は、１つ以上の治療薬を用いた処置の後に、被験体に投与される。いくつかの実施形態では、本明細書に開示された第３世代のＢＴＫ阻害化合物は、１つ以上の治療薬を用いた処置と組み合わせて被験体に投与される。

【0104】

本明細書で使用されているように、予防または予防法とは、疾患または疾病を進行させる危険性の低下を指す。

【0105】

用語「有効な量」、「治療上有効な量」、または、「薬学的に有効な量」とは、本明細書で使用されるように、障害を処置するのに十分なＢＴＫ阻害剤化合物の量を指す。いくつかの実施形態において、その結果は、障害の徴候、症状、または原因の減少および／または軽減、あるいは、生物系の任意の他の所望の変化である。例えば、治療用途に「有効な量」とは、障害の臨床的に有意な減少をもたらすのに必要とされる、本明細書で開示されるＢＴＫ阻害剤化合物を含む組成物の量である。いかなる個体の場合でも、適切な「有効な」量は、適切な技術（例えば、用量増加試験）を駆使して定められる。

【0106】

本明細書で用いられるような用語「薬学的に許容可能な」とは、本明細書に記載されるＢＴＫ阻害剤化合物の生物学的活性または特性を抑制せず、かつ、比較的無毒である、材料（例えば、担体または希釈剤）を指す（すなわち、この材料は、望ましくない生物学的効果を引き起こさずに、または、物質が含まれる組成物のいかなる成分とも有害な方法では相互作用せずに、個体に投与可能される）。

【0107】

本明細書で使用されているように、対照とは、試験パラメーターで処置されないことを除けば、試験サンプルと実質的に同一であるサンプル、あるいは、それが血漿サンプルである場合、所望の疾病の影響を受けなかった正常なボランティアからのものであり得る、サンプル、のことを指す。対照は内部対照でもあり得る。

【0108】

本明細書で使用されているように、用語「被験体」、「個体」、または、「患者」は、交互に使用される。これらの用語のいずれも、医療専門家（例えば、医者、看護師、医師助手、看護助手、ホスピスの従事者）の監督を必要とするものと解釈されないものとする。本明細書で使用されているように、被験体は、哺乳動物（例えばヒトまたはヒト以外の動物）および非哺乳動物を含む任意の動物であり得る。本明細書で提供される方法および組成物の１つの実施形態において、哺乳動物はヒトである。

【0109】

本明細書で使用されているように、「接触させる」とは、物質に触れる、物質に接触する、または、物質を接近させる行為のことを指す。「接触させる」ことは、流体または半流体の混合物中で成分を混合させることにより達成することができる。

【0110】

＜概観：癌におけるＢＴＫ機能および薬剤耐性＞
薬剤耐性は、感染症と癌を含む、薬物のいくつかの領域に影響する問題である。癌治療の間に、癌細胞集団が分裂を繰り返すことで拡大すると自発的なランダム変異が生じ、そのなかには耐性と、従って生存優位性を与えるものもある。本明細書では、不可逆的なＢＴＫ阻害剤イブルチニブを用いるＣＬＬの患者の処置中に発生したＢＴＫ遺伝子の変異が記載されている。イブルチニブを用いた約１８か月の処置の後に、別々の研究の３人の患者は、リンパ球絶対数（ＡＬＣ）の上昇とリンパ節の大きさの増加を示した。１人の患者でイブルチニブ投与量を１日当たり５６０ｍｇから１日当たり８４０ｍｇまで増やしても、疾患は悪化し続けた。血液サンプルを患者から単離し、ＢＴＫをコード化するｍＲＮＡをサンプルに含まれる細胞から分析した。２人の患者でＢＴＫタンパク質中に変異が生じたことが分かった。１人の患者では、ＢＴＫをコード化する核酸は、システイン−４８１コドン、ＴＧＣ、のＴＣＣ（セリン）への置換をもたらす、グアニン（ｇ）−１６３５からシトシン（ｃ）−１６３５のミスセンス変異を有していた。別の患者では、ＢＴＫをコード化する核酸は、システイン−４８１コドン、ＴＧＣ、のＡＧＣ（セリン）への置換をもたらす、チミン（ｔ）−１６３４からアデニン（ａ）−１６３４へのミスセンス変異を有していた。イブルチニブを用いた処置で同じ患者から初期に採取したサンプルは、これらの変異を含んでいなかった。システイン−４８１コドンの変異は、イブルチニブ処置によって与えられた選択圧に対する腫瘍による適応応答を示唆している。

【0111】

耐性変異の獲得は、イマチニブ（グリベック）およびＥＧＦＲ阻害剤であるゲフィチニブとエルロチニブを含む、腫瘍内科学におけるすべての主なチロシンキナーゼ阻害剤に関して記載されている。重度のＣＭＬでは、患者の６６％はイマチニブで再発し、慢性的なＣＭＬ患者の５％は最初の数年以内に再発する。これらの再発患者の３０−５０％は、標的キナーゼ（ＡＢＬ）中で耐性変異を獲得している。そのような患者は、ダサチニブ、ニロチニブなどを含む他の治療に進むが、患者の大部分は結局新しい耐性変異で再発する。肺癌では、エルロチニブとゲフィチニブは、優れた耐久性のある臨床的な結果をもたらしたが、そのほぼすべては耐性によって１２−１８か月以内に効果がなくなる。このような耐性を有する患者の５０％までが、Ｔ７９０Ｍと呼ばれる標的キナーゼ（ＥＧＦＲ）の中に変異を有しており、これは１つのアミノ酸を変化させる。

【0112】

本明細書には、セリン（Ｃ４８１Ｓ）について野生型のＢＴＫの位置４８１でシステインのアミノ酸置換を含む修飾されたＢＴＫポリペプチドと、そのポリペプチドをコード化する核酸が記載されている。同様に、本明細書には、本明細書に記載の修飾されたＢＴＫ核酸およびポリペプチドを生成する方法も記載されている。同様に、本明細書には、本明細書に記載の修飾されたＢＴＫ核酸およびポリペプチド、ならびに、本明細書に記載の修飾されたＢＴＫ核酸およびポリペプチドを検知するための試薬を含む、組成物、組み合わせ、およびキットが記載されている。同様に、第２世代ＢＴＫ阻害剤を含むＢＴＫ阻害剤を含む、分子に相互作用する変異ＢＴＫを同定するために修飾されたＢＴＫポリペプチドを使用する方法が提供される。同様に、本明細書には、合成核酸である修飾されたＢＴＫ核酸も記載されている。同様に、本明細書には、ｃＤＮＡ分子である修飾されたＢＴＫ核酸も記載されている。同様に、本明細書には、合成核酸である修飾されたＢＴＫ核酸によって生成された修飾されたＢＴＫポリペプチドも記載されている。同様に、本明細書には、ｃＤＮＡ分子である修飾されたＢＴＫ核酸によって生成された修飾されたＢＴＫポリペプチドも記載されている。同様に、本明細書には、ＢＴＫゲノムＤＮＡを含まない修飾されたＢＴＫ核酸も記載されている。同様に、本明細書には、非メチル化した修飾されたＢＴＫ核酸も記載されている。同様に、本明細書には、ＢＴＫイントロン配列を含まない修飾されたＢＴＫ核酸も記載されている。同様に、本明細書には、ＢＴＫのゲノム配列の２つ以上のエキソンからのヌクレオチドの配列を含む修飾されたＢＴＫ核酸も記載されている。いくつかの実施形態では、修飾されたＢＴＫ核酸は、野生型のＢＴＫポリペプチドの位置４８１に対応する位置でセリンをコード化するヌクレオチドの配列を含む。

【0113】

本明細書に記載されるように、例えばＣ４８１Ｓのような、ＢＴＫでのアミノ酸位置４８１での変異の同定により、１つ以上の耐性変異を有する変異ＢＴＫの阻害に有効な阻害剤の設計およびスクリーニングが可能となる。そのような阻害剤は臨床用途や治療用途に役立つ。いくつかの実施形態では、阻害剤は、例えばＢ細胞悪性腫瘍のような血液の癌などの癌の処置に役立つ。

【0114】

本明細書に記載されるように、いくつかの実施形態では、被験体は、例えばＣ４８１ＳなどのＢＴＫ中のアミノ酸位置４８１での変異を同定するために、スクリーニングされる。いくつかの実施形態では、そのような変異の同定により、癌治療の癌治療の処方または変更が可能となる。いくつかの実施形態では、そのような変異の同定を用いて、例えば、変異Ｃ４８１Ｓの活性を抑制する阻害剤（すなわち第２世代のＢＴＫ阻害剤）による治療といった、特定の治療について被験体を階層化する。いくつかの実施形態では、そのような変異の同定を用いて、例えば、Ｂ細胞癌のような血液の癌といったＢＴＫを媒介とした疾患または疾病の再発の危険性の高い被験体を特徴付ける。いくつかの実施形態では、そのような変異の同定を用いて、例えば、イブルチニブなどの共有結合のおよび／または不可逆的なＢＴＫ阻害剤といった、特定のＢＴＫ阻害剤に対して反応しない被験体を特徴づける。

【0115】

本明細書に記載されるように、実施例において、ＢＣＲ経路の下流のタンパク質中の個別の変異は、ＢＴＫ阻害剤による治療を受ける患者においても同定された。例えば、ＰＬＣγ２とＣＡＲＤ１１の変異が同定された。ＰＬＣγ２については、Ｒ６６５とＳ７０７のアミノ酸置換をもたらしたミスセンス変異が見られた（例えばＲ６６５ＷとＳ７０７Ｆ）。ＣＡＲＤ１１については、位置Ｌ２３２でのロイシンの挿入が観察された（すなわちＬ２３２ＬＬ）。このような変異は、それぞれのタンパク質について恒常的な活性をもたらすことが予想される。したがって、本明細書では、治療のための患者を選択するためにそのような変異をスクリーニングし、ＢＴＫ阻害剤治療を受ける患者をモニタリングし、および、維持療法などの処置計画を最適化する方法が提供される。

【0116】

＜変異ＢＴＫポリペプチド＞
本明細書では、変異ＢＴＫポリペプチドが提供される。いくつかの実施形態では、変異ＢＴＫポリペプチドは、単離した変異ＢＴＫポリペプチドである。いくつかの実施形態では、単離した変異ＢＴＫポリペプチドは、非天然の変異ＢＴＫポリペプチドである。いくつかの実施形態では、単離した変異ＢＴＫポリペプチドは、組換え型変異ＢＴＫポリペプチドである。典型的には、本明細書で提供される変異ＢＴＫポリペプチドは、少なくとも１つのＢＴＫ活性を示す。例えば、変異ＢＴＫポリペプチドは、一般に、例えば、標的分子との結合または標的基質（すなわちキナーゼ活性）のリン酸化などのＢＴＫ活性を保持する。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される変異ＢＴＫポリペプチドは、野生型のＢＴＫポリペプチドと比較してキナーゼ活性を減少させた。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される変異ＢＴＫポリペプチドは、野生型のＢＴＫポリペプチドと比較して、キナーゼ活性を増加させた。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される変異ＢＴＫポリペプチドは、野生型のＢＴＫポリペプチドと比較して、同等のキナーゼ活性を有している。いくつかの実施形態では、変異ＢＴＫポリペプチドは、組換えタンパク質である。いくつかの実施形態では、変異ＢＴＫポリペプチドは宿主細胞から精製される。

【0117】

いくつかの実施形態では、変異ＢＴＫポリペプチドは、共有結合のおよび／または不可逆的なＢＴＫ阻害剤による阻害に対して耐性を与える、１つ以上のアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、不可逆的なＢＴＫ阻害剤は、野生型のＢＴＫポリペプチドのキナーゼ活性を阻害する。いくつかの実施形態では、変異ＢＴＫポリペプチドは、配列番号：１と表記される野生型のＢＴＫのアミノ酸位置４８１でシステインに共有結合する共有結合のおよび／または不可逆的なＢＴＫ阻害剤による阻害に対して耐性を与える、１つ以上のアミノ酸置換を含んでいる。いくつかの実施形態では、変異ＢＴＫポリペプチドは、イブルチニブ、ＰＣＩ−４５２９２、ＰＣＩ−４５４６６、ＡＶＬ−１０１、ＡＶＬ−２９１、ＡＶＬ−２９２、またはＯＮＯ−ＷＧ−３７である、共有結合のおよび／または不可逆的なＢＴＫ阻害剤による阻害に対して耐性を与える、１つ以上のアミノ酸置換を含んでいる。いくつかの実施形態では、変異ＢＴＫポリペプチドは、イブルチニブである共有結合のおよび／または不可逆的なＢＴＫ阻害剤による阻害に対して耐性を与える、１つ以上のアミノ酸置換を含んでいる。

【0118】

本明細書では、配列番号：１と表記されるアミノ酸配列のアミノ酸位置４８１に対応するアミノ酸位置で修飾を含むＢＴＫ活性を有する単離したＢＴＫポリペプチドまたはその変異体が提供されており、修飾は、共有結合のおよび／または不可逆的なＢＴＫ阻害剤を用いた阻害にたいする、修飾されたＢＴＫポリペプチドまたは変異体の耐性を与える。

【0119】

いくつかの実施形態では、修飾は、配列番号：１と表記される野性型ＢＴＫと比較して、アミノ酸位置４８１でアミノ酸の置換または欠失を含む。いくつかの実施形態では、修飾は、配列番号：１と表記される野性型ＢＴＫと比較して、位置４８１でアミノ酸の置換を含む。いくつかの実施形態では、修飾は、ＢＴＫポリペプチドのアミノ酸位置４８１で、ロイシン、イソロイシン、バリン、アラニン、グリシン、メチオニン、セリン、トレオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、プロリン、チロシン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、およびグルタミン酸の中から選択されたアミノ酸に、システインを置換することである。いくつかの実施形態では、修飾は、ＢＴＫポリペプチドのアミノ酸位置４８１で、セリン、メチオニンまたはトレオニンの中から選択されたアミノ酸に、システインを置換することである。いくつかの実施形態では、修飾は、ＢＴＫポリペプチドのアミノ酸位置４８１で、セリンにシステインを置換することである。いくつかの実施形態では、置換はＣ４８１Ｓである。いくつかの実施形態では、修飾は、配列番号：１と表記される野生型のＢＴＫポリペプチドのアミノ酸位置４８１の欠失を含む。

【0120】

いくつかの実施形態では、変異ＢＴＫポリペプチドは、配列番号：１と表記される野性型ＢＴＫと比較して、位置４８１でのアミノ酸の置換と、１以上の追加のアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、変異ＢＴＫポリペプチドは、配列番号：２と表記されるアミノ酸の配列、または、配列番号：２と表記される配列を有するポリペプチドと少なくともまたは少なくとも約６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を有する変異体を含み、位置４８１におけるアミノ酸はシステインではない。いくつかの実施形態では、変異ＢＴＫポリペプチドは、配列番号：２と表記されたアミノ酸の配列を含む。いくつかの実施形態では、変異ＢＴＫポリペプチドは、アミノ酸位置４８１に対応する位置でセリンを有し、および、配列番号：２と表記される配列を有するポリペプチドと６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のアミノ酸配列同一性を有しているポリペプチドを含む。

【0121】

いくつかの実施形態では、変異ＢＴＫポリペプチドは、アミノ酸位置４８１で修飾を、および、１つ以上の追加のアミノ酸位置で修飾を含む。いくつかの実施形態では、変異ＢＴＫポリペプチドは、アミノ酸位置４８１で修飾を、および、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０以上アミノ酸位置で修飾を含む。いくつかの実施形態では、変異ＢＴＫポリペプチドは、位置４８１で修飾を、および、１つの追加のアミノ酸位置で修飾を含む。いくつかの実施形態では、変異ＢＴＫポリペプチドは、アミノ酸位置４８１でセリンを、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれ以上の追加のアミノ酸位置で修飾を含む。いくつかの実施形態では、変異ＢＴＫポリペプチドは、位置４８１でセリンを、１つの追加のアミノ酸位置で修飾を含む。いくつかの実施形態では、アミノ酸位置４８１の修飾は、Ｃ４８１Ｓである置換である。

【0122】

いくつかの実施形態では、変異ＢＴＫポリペプチドは、配列番号：２と表記された変異ＢＴＫポリペプチドの一部を含む。いくつかの実施形態では、その一部は、ＢＴＫポリペプチドの活性を示す。いくつかの実施形態では、変異ＢＴＫポリペプチドは、配列番号：２と表記された変異ＢＴＫポリペプチドのアミノ酸位置４８１で修飾を含む、ＢＴＫポリペプチドのキナーゼドメインを含む。

【0123】

いくつかの実施形態では、変異ＢＴＫポリペプチドは、位置４８１での修飾と、例えば、Ｖｉｈｉｎｅｎ ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｈｕｍ． Ｍｕｔａｔ． １３： ２８０−２８５， ｄｅ Ｗｅｅｒ ｅｔ ａｌ． Ｈｕｍ． Ｍｏｌ． Ｇｅｎｅｔ． （１９９４） ３ （１）： １６１−１６６； Ｐｅｒｅｚ ｄｅ Ｄｉｅｇｏ ｅｔ ａｌ． （２００８） Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５２（１）：３３−８； Ｋｅｎｅｇａｎｅ ｅｔ ａｌ． （２０００） Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １２０（３）： ５１２＊５１７， Ｌｉ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ２：４５１−４６０ ａｎｄ Ｂａｒａｌｄｉ ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ７：４４９−４６０に記載されているＢＴＫ修飾の中から選択された修飾を含む。いくつかの実施形態では、アミノ酸位置４８１での修飾はＣ４８１Ｓである置換である。いくつかの実施形態では、１つ以上の追加の修飾は、アミノ酸位置Ｌ１１、Ｋ１２、Ｓ１４、Ｋ１９、Ｆ２５、Ｋ２７、Ｒ２８、Ｒ３３、Ｙ３９、Ｙ４０、Ｅ４１、Ｉ６１、Ｖ６４、Ｒ８２、Ｑ１０３、Ｖ１１３、Ｓ１１５、Ｔ１１７、Ｑ１２７、Ｃ１５４、Ｃ１５５、Ｔ１８４、Ｐ１８９、Ｐ１９０、Ｙ２２３、Ｗ２５１、Ｒ２８８、Ｌ２９５、Ｇ３０２、Ｒ３０７、Ｄ３０８、Ｖ３１９、Ｙ３３４、Ｌ３５８、Ｙ３６１、Ｈ３６２、Ｈ３６４、Ｎ３６５、Ｓ３６６、Ｌ３６９、Ｉ３７０Ｍ、Ｒ３７２、Ｌ４０８、Ｇ４１４、Ｙ４１８、Ｉ４２９、Ｋ４３０、Ｅ４４５、Ｇ４６２、Ｙ４７６、Ｍ４７７、Ｃ５０２、Ｃ５０６、Ａ５０８、Ｍ５０９、Ｌ５１２、Ｌ５１８、Ｒ５２０、Ｄ５２１、Ａ５２３、Ｒ５２５、Ｎ５２６、Ｖ５３５、Ｌ５４２、Ｒ５４４、Ｙ５５１、Ｆ５５９、Ｒ５６２、Ｗ５６３、Ｅ５６７、Ｓ５７８、Ｗ５８１、Ａ５８２、Ｆ５８３、Ｍ５８７、Ｅ５８９、Ｓ５９２、Ｇ５９４、Ｙ５９８、Ａ６０７、Ｇ６１３、Ｙ６１７、Ｐ６１９、Ａ６２２、Ｖ６２６、Ｍ６３０、Ｃ６３３、Ｒ６４１、Ｆ６４４、Ｌ６４７、Ｌ６５２、Ｖ１０６５、およびＡ１１８５での置換の中から選択される。いくつかの実施形態では、１つ以上の追加の修飾は、Ｌ１１Ｐ、Ｋ１２Ｒ、Ｓ１４Ｆ、Ｋ１９Ｅ、Ｆ２５Ｓ、Ｋ２７Ｒ、Ｒ２８Ｈ、Ｒ２８Ｃ、Ｒ２８Ｐ、Ｔ３３Ｐ、Ｙ３Ｓ９、Ｙ４０Ｃ、Ｙ４０Ｎ、Ｅ４１Ｋ、Ｉ６１Ｎ、Ｖ６４Ｆ、Ｖ６４Ｄ、Ｒ８２Ｋ、Ｑ１０３ＱＳＦＳＳＶＲ、Ｖ１１３Ｄ、Ｓ１１５Ｆ、Ｔ１１７Ｐ、Ｑ１２７Ｈ、Ｃ１５４Ｓ、Ｃ１５５Ｇ、Ｔ１８４Ｐ、Ｐ１８９Ａ、Ｙ２２３Ｆ、Ｗ２５１Ｌ、Ｒ２８８Ｗ、Ｒ２８８Ｑ、Ｌ２９５Ｐ、Ｇ３０２Ｅ、Ｒ３０７Ｋ、Ｒ３０７Ｇ、Ｒ３０７Ｔ、Ｄ３０８Ｅ、Ｖ３１９Ａ、Ｙ３３４Ｓ、Ｌ３５８Ｆ、Ｙ３６１Ｃ、Ｈ３６２Ｑ、Ｈ３６４Ｐ、Ｎ３６５Ｙ、Ｓ３６６Ｆ、Ｌ３６９Ｆ、Ｉ３７０Ｍ、Ｒ３７２Ｇ、Ｌ４０８Ｐ、Ｇ４１４Ｒ、Ｙ４１８Ｈ、Ｉ４２９Ｎ、Ｋ４３０Ｅ、Ｅ４４５Ｄ、Ｇ４６２Ｄ、Ｇ４６２Ｖ、Ｙ４７６Ｄ、Ｍ４７７Ｒ、Ｃ５０２Ｆ、Ｃ５０２Ｗ、Ｃ５０６Ｙ、Ｃ５０６Ｒ、Ａ５０８Ｄ、Ｍ５０９Ｉ、Ｍ５０９Ｖ、Ｌ５１２Ｐ、Ｌ５１２Ｑ、Ｌ５１８Ｒ、Ｒ５２０Ｑ、Ｄ５２１Ｇ、Ｄ５２１Ｈ、Ｄ５２１Ｎ、Ａ５２３Ｅ、Ｒ５２５Ｇ、Ｒ５２５Ｑ、Ｎ５２６Ｋ、Ｖ５３５Ｆ、Ｌ５４２Ｐ、Ｒ５４４Ｇ、Ｒ５４４Ｋ、Ｙ５５１Ｆ、Ｆ５５９Ｓ、Ｒ５６２Ｗ、Ｒ５６２Ｐ、Ｗ５６３Ｌ、Ｅ５６７Ｋ、Ｓ５７８Ｙ、Ｗ５８１Ｒ、Ａ５８２Ｖ、Ｆ５８３Ｓ、Ｍ５８７Ｌ、Ｅ５８９Ｄ、Ｅ５８９Ｋ、Ｅ５８９Ｇ、Ｓ５９２Ｐ、Ｇ５９４Ｅ、Ｙ５９８Ｃ、Ａ６０７Ｄ、Ｇ６１３Ｄ、Ｙ６１７Ｅ、Ｐ６１９Ａ、Ｐ６１９Ｓ、Ａ６２２Ｐ、Ｖ６２６Ｇ、Ｍ６３０Ｉ、Ｍ６３０Ｋ、Ｍ６３０Ｔ、Ｃ６３３Ｙ、Ｒ６４１Ｃ、Ｆ６４４Ｌ、Ｆ６４４Ｓ、Ｌ６４７Ｐ、Ｌ６５２Ｐ、Ｖ１０６５Ｉ、およびＡ１１８５Ｖの中から選択される。

【0124】

いくつかの実施形態では、変異ＢＴＫポリペプチドは、配列番号：２と表記された変異ＢＴＫポリペプチドの一部を含む。いくつかの実施形態では、その一部は、ＢＴＫポリペプチドの活性を示す。例えば、いくつかの実施形態において、その一部はキナーゼ活性を示す。いくつかの実施形態では、変異ＢＴＫポリペプチドは、配列番号：２と表記された変異ＢＴＫポリペプチドのアミノ酸位置４８１で修飾を含むＢＴＫポリペプチドのキナーゼドメインを含んでいる。いくつかの実施形態では、変異ＢＴＫポリペプチドは、配列番号：２と表記された変異ＢＴＫポリペプチドのアミノ酸位置４８１で修飾を含むＢＴＫポリペプチドのキナーゼドメインから本質的になる。いくつかの実施形態では、変異ＢＴＫポリペプチドは、配列番号：２と表記された変異ＢＴＫポリペプチドのおよそアミノ酸位置３９７からおよそアミノ酸位置６５２までのアミノ酸の配列を含む。いくつかの実施形態では、変異ＢＴＫポリペプチドは、配列番号：２と表記された変異ＢＴＫポリペプチドのおよそアミノ酸位置４０２かあらおよそアミノ酸位置６５２までアミノ酸の配列を含む。

【0125】

いくつかの実施形態では、ＢＴＫポリペプチドは、異種のポリペプチドに結合された配列番号：１と表記された野生型のＢＴＫポリペプチドのアミノ酸位置４８１で修飾を含むＢＴＫポリペプチドのキナーゼドメインを含む融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、アミノ酸位置４８１での修飾はＣ４８１Ｓであるアミノ酸置換である。融合タンパク質の生成方法は、当該技術では知られており、標準の組換えＤＮＡ技術を含んでいる。例えば、いくつかの実施形態では、異なるポリペプチド配列をコード化するＤＮＡフラグメントは、従来の技術に従って、例えば、ライゲーションのための平滑な末端またはねじれた末端の終端、適切な終端を提供するための制限酵素消化、必要に応じた付着末端の充填、望ましくない結合を防ぐためのアルカリホスファターゼによる処置、および、酵素ライゲーションを採用することによって、インフレームとともに連結される。いくつかの実施形態では、融合遺伝子は、自動ＤＮＡ合成装置を含む従来の技術によって合成することができる。いくつかの実施形態では、遺伝子フラグメントのＰＣＲ増幅はアンカープライマーを使用して実行することができ、アンカープライマーは、キメラ遺伝子配列を生成するために、アニール処理されて再増幅することができる２つの連続する遺伝子フラグメント間の補足的なオーバーハングを生じさせる（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ｅｄｓ． Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ． Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ： １９９２）。いくつかの実施形態では、融合部分（例えば、ＧＳＴポリペプチド）をコード化する発現ベクターは市販で入手可能である。修飾されたＢＴＫポリペプチドをコード化する核酸をそのような発現ベクターにクローン化することができるため、融合部分は修飾されたＢＴＫポリペプチドにインフレームで結合する。

【0126】

いくつかの実施形態では、配列番号：１と表記された野生型のＢＴＫポリペプチドのアミノ酸位置４８１での修飾を含むＢＴＫポリペプチドは、ペプチドタグに結合する。いくつかの実施形態では、ペプチドタグは、タグ特異的な抗体によって認識されたエピトープタグである。いくつかの実施形態において、タグは、限定されないが、ｃ−ｍｙｃ、Ｖ−５、ヘマグルチニン（ＨＡ）、ＦＬＡＧ、タグのようなエピトープタグである。いくつかの実施形態において、タグは、限定されないが、ビオチン、ｓｔｒｅｐ−タグ、キチン結合タンパク質（ＣＢＰ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、グルタチオン−Ｓ−転移酵素（ＧＳＴ）、または、ポリ（Ｈｉｓ）タグなどのアフィニティータグである。いくつかの実施形態では、配列番号：１と表記された野生型のＢＴＫポリペプチドのアミノ酸位置４８１で修飾を含むＢＴＫポリペプチドは、検知可能なタンパク質または実体、例えば、発光、化学発光、生物発光、または、蛍光のタンパク質または実体に結合される。いくつかの実施形態では、蛍光タンパク質は、緑（ＧＦＰ）、赤（ＲＦＰ）、シアン（ＣＦＰ）、黄色（ＹＦＰ）、または青（ＢＦＰ）の蛍光タンパク質である。いくつかの実施形態では、配列番号：１と表記された野生型のＢＴＫポリペプチドのアミノ酸位置４８１で修飾を含むＢＴＫポリペプチドは、酵素、例えば、ルシフェラーゼ、または、β−ガラクトシダーゼに結合する。

【0127】

いくつかの実施形態では、本明細書では、本明細書で提供される変異ＢＴＫポリペプチドを含むアレイが提供される。いくつかの実施形態では、変異ＢＴＫポリペプチドはマイクロチップに結合される。いくつかの実施形態では、変異ＢＴＫポリペプチドは、マイクロチップに直接結合される。いくつかの実施形態では、変異ＢＴＫポリペプチドは、リンカーによってマイクロチップに間接的に結合される。いくつかの実施形態では、本明細書では、本明細書で提供される変異ＢＴＫポリペプチドを含むマイクロチップ・アレイが提供されている。

【0128】

＜変異ＢＴＫポリペプチドをコード化する核酸＞
本明細書では、変異ＢＴＫポリペプチドをコード化する核酸が提供される。本明細書では、本明細書に記載の変異ＢＴＫポリペプチドのいずれかをコード化する核酸が本明細書で提供されている。特定のポリペプチドをコード化する核酸を推定する方法は、当該技術では知られており、標準的な分子生物学的技術を含んでいる。本明細書で提供される変異ＢＴＫポリペプチドをコード化する典型的な核酸が提供されている。遺伝子コードの縮重により、同じポリペプチドをコード化する多くの変異体核酸が存在すると理解されている。本明細書で提供される変異ＢＴＫポリペプチドをコード化する核酸は、そのような変異体を包含する。いくつかの実施形態では、変異ＢＴＫ核酸は合成核酸である。いくつかの実施形態では、変異ＢＴＫ核酸はｃＤＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、変異ＢＴＫ核酸はゲノムＤＮＡを包含していない。いくつかの実施形態では、変異ＢＴＫ核酸は非メチル化される。いくつかの実施形態では、変異ＢＴＫ核酸は、ＢＴＫのゲノムイントロン配列を包含していない。いくつかの実施形態では、変異ＢＴＫ核酸は、ＢＴＫポリペプチドの位置４８１をコード化するコドン配列を含む核酸を含む、ＢＴＫのゲノム配列の２つ以上のエキソンからのヌクレオチドの配列を含む。いくつかの実施形態では、変異ＢＴＫ核酸は、野生型のＢＴＫポリペプチドの位置４８１に対応する位置でセリンをコード化するヌクレオチドの配列を含む。

【0129】

いくつかの実施形態では、本明細書で提供される修飾されたＢＴＫポリペプチドをコード化する核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡの分子である。いくつかの実施形態では、変異ＢＴＫポリペプチドをコード化する核酸は、コード化されたポリペプチドが、配列番号：１と表記される野生型のＢＴＫポリペプチドのアミノ酸位置４８１に対応する位置でアミノ酸であるシステインの置換を含む修飾を含んでいる。いくつかの実施形態では、核酸は、配列番号：３と表記される核酸の配列であって、位置４８１でアミノ酸をコード化する核酸コドンは修飾され、それによって、コドンがシステインをコード化しない、配列、あるいは、配列番号：３と表記される配列を有するポリペプチドと少なくともまたは少なくとも約６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有している変異体であって、位置４８１でアミノ酸をコード化する核酸コドンがシステインをコード化しない、変異体を含む。

【0130】

いくつかの実施形態において、核酸修飾は、ミスセンス変異、または、ＢＴＫポリペプチドをコード化する１つ以上のコドンの欠失である。いくつかの実施形態では、修飾は、ＢＴＫポリペプチドのアミノ位置４８１でシステインをコード化する核酸コドンを変化させるミスセンス変異である。いくつかの実施形態では、ＢＴＫポリペプチドのアミノ位置４８１でシステインをコード化する核酸コドンは、ＴＧＣまたはＴＧＴである。いくつかの実施形態では、ＢＴＫポリペプチドのアミノ位置４８１でシステインをコード化する核酸コドンは、ＴＧＣである。いくつかの実施形態では、ＢＴＫポリペプチドのアミノ位置４８１でシステインをコード化する核酸コドンは、ＴＧＴである。いくつかの実施形態では、修飾は、ＴＧＣから、セリンをコード化する核酸コドンまで、ＢＴＫポリペプチドのアミノ位置４８１でシステインをコード化する核酸コドンを変化させる。いくつかの実施形態では、修飾は、ＴＧＴから、セリンをコード化する核酸コドンまで、ＢＴＫポリペプチドのアミノ位置４８１でシステインをコード化する核酸コドンを変化させる。いくつかの実施形態では、セリンをコード化する核酸コドンは、ＴＣＴ、ＴＣＣ、ＴＣＡ、ＴＣＧ、ＡＧＴ、またはＡＧＣの中から選択される。

【0131】

いくつかの実施形態では、修飾は、配列番号：３と表記される核酸中の核酸位置１６３４でアデニン（ａ）の代わりにチミン（ｔ）の置換を含むミスセンス変異である。いくつかの実施形態では、修飾は、ＴＧＣからＡＧＣ（セリン）まで、ＢＴＫポリペプチドのアミノ位置４８１でシステインをコード化する核酸コドンを変化させる。いくつかの実施形態では、変異ＢＴＫポリペプチドをコード化する核酸は、配列番号：７はまたは２２と表記されるヌクレオチドの配列を含む。

【0132】

いくつかの実施形態では、修飾は、配列番号：３と表記される核酸中の核酸位置１６３５でシトシン（ｇ）の代わりにグアニン（ｇ）の置換を含むミスセンス変異である。いくつかの実施形態では、修飾は、ＴＧＣからＴＣＣ（セリン）まで、ＢＴＫポリペプチドのアミノ位置４８１でシステインをコード化する核酸コドンを変化させる。いくつかの実施形態では、変異ＢＴＫポリペプチドをコード化する核酸は、配列番号８はまたは２３と表記されるヌクレオチドの配列を含む。

【0133】

いくつかの実施形態において、変異ＢＴＫポリペプチドをコード化する核酸は、配列番号：７または２２と表記されるヌクレオチドの配列を有する核酸と６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のヌクレオチド酸配列同一性を有する核酸を含み、コード化された変異ＢＴＫポリペプチドは、アミノ酸位置４８１に対応する位置で野生型のＢＴＫポリペプチドに対する修飾を含んでいる。いくつかの実施形態において、変異ＢＴＫポリペプチドをコード化する核酸は、配列番号：８または２３と表記されるヌクレオチドの配列を有する核酸と６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のヌクレオチド酸配列同一性を有する核酸を含み、コード化された変異ＢＴＫポリペプチドは、アミノ酸位置４８１に対応する位置で野生型のＢＴＫポリペプチドに対する修飾を含む。いくつかの実施形態において、変異ＢＴＫポリペプチドをコード化する核酸は、配列番号：７または２２と表記されるヌクレオチドの配列を有する核酸と６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のヌクレオチド酸配列同一性を有する核酸を含み、コード化された変異ＢＴＫポリペプチドは、アミノ酸位置４８１に対応する位置でシステインを含まない。いくつかの実施形態において、変異ＢＴＫポリペプチドをコード化する核酸は、配列番号：８または２３と表記されるヌクレオチドの配列を有する核酸と６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のヌクレオチド酸配列同一性を有する核酸を含み、コード化された変異ＢＴＫポリペプチドは、アミノ酸位置４８１に対応する位置でシステインを含まない。いくつかの実施形態において、変異ＢＴＫポリペプチドをコード化する核酸は、配列番号：７または２２と表記されるヌクレオチドの配列を有する核酸と６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のヌクレオチド酸配列同一性を有する核酸を含み、コード化された変異ＢＴＫは、アミノ酸位置４８１に対応する位置でセリンを含む。いくつかの実施形態において、変異ＢＴＫポリペプチドをコード化する核酸は、配列番号：８または２３と表記されるヌクレオチドの配列を有する核酸と６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のヌクレオチド酸配列同一性を有する核酸を含み、コード化された変異ＢＴＫは、アミノ酸位置４８１に対応する位置でセリンを含む。

【0134】

いくつかの実施形態では、変異ＢＴＫポリペプチドをコード化する本明細書で提供される核酸は、単離した核酸である。いくつかの実施形態では、変異ＢＴＫポリペプチドをコード化する本明細書で提供される核酸は、ＤＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、変異ＢＴＫポリペプチドをコード化する本明細書で提供され核酸は、ｃＤＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、変異ＢＴＫポリペプチドをコード化する本明細書で提供される核酸は、ＲＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、変異ＢＴＫポリペプチドをコード化する本明細書で提供される核酸は、阻害性のＲＮＡ分子（すなわちＲＮＡｉ）である。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される核酸は、相補的であるか、あるいは、変異ＢＴＫポリペプチドをコード化する核酸に結合する、核酸分子である。

【0135】

いくつかの実施形態では、変異ＢＴＫポリペプチドをコード化する本明細書で提供される核酸は、アミノ酸位置４８１を含む本明細書で提供される変異ＢＴＫポリペプチドの一部をコード化する。いくつかの実施形態では、コドンは、システインでないアミノ酸をコード化する。いくつかの実施形態では、コドンは、セリンであるアミノ酸をコード化する。いくつかの実施形態では、変異ＢＴＫポリペプチドをコード化する本明細書で提供される核酸は、本明細書で提供される変異ＢＴＫポリペプチドの１つ以上のドメインをコード化する。いくつかの実施形態では、変異ＢＴＫポリペプチドをコード化する本明細書で提供される核酸は、本明細書で提供される変異ＢＴＫポリペプチドのキナーゼドメインをコード化する。

【0136】

いくつかの実施形態では、変異ＢＴＫポリペプチドまたはその一部をコード化する本明細書で提供される核酸は、位置４８１でシステインでないアミノ酸をコード化する核酸を含む。いくつかの実施形態では、変異ＢＴＫポリペプチドまたはその一部をコード化する本明細書で提供される核酸は、アミノ酸位置４８１でセリンをコード化する核酸を含む。

【0137】

いくつかの実施形態では、本明細書で提供される核酸は、変異ＢＴＫポリペプチドの一部をコード化するオリゴヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される核酸は、アミノ酸位置４８１に対応するアミノ酸をコード化するヌクレオチドコドンを含む変異ＢＴＫポリペプチドの一部をコード化するオリゴヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、コドンは、システインではないアミノ酸をコード化する。いくつかの実施形態では、コドンは、セリンであるアミノ酸をコード化する。

【0138】

いくつかの実施形態では、本明細書で提供される核酸は、本明細書で提供される修飾されたＢＴＫポリペプチドをコード化する核酸分子を含むベクターである。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される核酸は、本明細書で提供される変異ＢＴＫポリペプチドをコード化する核酸を含むベクター（発現ベクター）である。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される変異ＢＴＫポリペプチドをコード化する核酸は、プロモーターに動作可能に結合する。いくつかの実施形態において、プロモーターは、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターである。いくつかの実施形態では、本明細書では、本明細書で提供される修飾されたＢＴＫポリペプチドをコード化するベクターまたは核酸分子を含む宿主細胞が提供されている。いくつかの実施形態では、細胞は原核細胞または真核細胞である。同様に、本明細書では、宿主細胞によって発現される変異ＢＴＫポリペプチドも記載されている。

【0139】

いくつかの実施形態において、ベクターはウイルスベクターまたはプラスミドベクターである。いくつかの実施形態において、ウイルスベクターはＤＮＡウイルスベクターまたはＲＮＡウイルスベクターである。典型的なウイルスベクターとしては、限定されないが、ワクシニア、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）、レトロウイルス、または、ヘルペスウィルスのベクターが挙げられる。

【0140】

いくつかの実施形態では、本明細書では、本明細書で提供される変異ＢＴＫポリペプチドのいずれかをコード化する核酸を含むアレイが提供される。いくつかの実施形態では、変異ＢＴＫ核酸はマイクロチップに結合される。いくつかの実施形態では、変異ＢＴＫ核酸はマイクロチップに直接的に結合される。いくつかの実施形態では、変異ＢＴＫ核酸は、リンカーによってマイクロチップに間接的に結合される。いくつかの実施形態では、本明細書では、本明細書で提供される変異ＢＴＫポリペプチドのいずれかをコード化する核酸を含むマイクロチップ・アレイが提供される。

【0141】

＜核酸とポリペプチドの産生＞
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される変異ＢＴＫポリペプチドをコード化する単離した核酸分子は、標準的な組換え方法によって生成される。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される変異ＢＴＫポリペプチドをコード化する単離した核酸分子は、ゲノムＤＮＡからの変異ＢＴＫ配列の増幅によって生成される。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される変異ＢＴＫポリペプチドをコード化する単離した核酸分子は、ＢＴＫ配列特異的なプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応によって生成される。いくつかの実施形態では、変異ＢＴＫポリペプチドをコード化する単離した核酸分子

【0142】

いくつかの実施形態では、本明細書で提供される変異ＢＴＫポリペプチドをコード化する単離した核酸分子は、発現ベクターに挿入され、宿主細胞または非細胞抽出液中で発現する。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される変異ＢＴＫポリペプチドをコード化する単離した核酸分子は、細胞または非細胞の抽出液中でコード化ポリペプチドを発現させるためにプロモーターに動作可能に結合する。いくつかの実施形態において、プロモーターは、構成的プロモーターである。いくつかの実施形態において、プロモーターは、誘導性プロモーターである。

【0143】

いくつかの実施形態では、本明細書で提供される変異ＢＴＫポリペプチドをコード化する核酸分子は、細胞に対して「外因性」であり、このことは、それが、ベクターが導入されようとしている細胞に対して異質なものであるか、あるいは、配列が、細胞内ではあるが、配列が通常は見られない宿主細胞の核酸内の位置にある配列に相同であることを意味している。ベクターとしては、プラスミド、コスミド、ウイルス（バクテリオファージ、動物ウイルス、および植物ウイルス）、および、人工染色体（例えは、ＹＡＣ）が挙げられる。当業者は、共に引用により本明細書に組み込まれるＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， １９８９ ａｎｄ Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， １９９６に記載される標準的な組換え技術によってベクターを構築するために十分な知識を身につけているだろう。

【0144】

細胞中のタンパク質の発現のための方法は、当該技術において周知であり、細胞、例えば、動物と植物の細胞内での発現を含んでいる。本明細書で提供される変異ＢＴＫポリペプチドの発現のための典型的な動物細胞は、限定されないが、細菌、酵母菌、昆虫細胞、両生動物および哺乳動物の細胞（例えば、ヒト、霊長類、げっ歯類、ウシ、および、ヒツジの細胞）を含む。いくつかの実施形態では、変異ＢＴＫをコード化する核酸は、宿主細胞のゲノムに統合される。

【0145】

いくつかの実施形態では、本明細書で提供される変異ＢＴＫポリペプチドの発現のための方法は、変異ＢＴＫポリペプチドが細胞によって産生されるように、変異ＢＴＫポリペプチドをコード化する発現ベクターを含む宿主細胞を培養する工程を含む。いくつかの方法では、変異ポリペプチドとしての核酸コード化は、シグナル配列が変異ＢＴＫポリペプチドを含む融合ペプチドとして発現されるように、シグナル配列をコード化する核酸に接続される。いくつかの実施形態では、シグナル配列は、宿主細胞による変異ＢＴＫポリペプチドの分泌を可能にする。

【0146】

いくつかの実施形態において、変異ＢＴＫポリペプチドは、変異ポリペプチドを発現する宿主細胞から単離される。いくつかの実施形態において、抽出物は宿主細胞から調製され、変異ＢＴＫポリペプチドは、限定されないが、ＢＴＫポリペプチドに特異的な、または、とりわけ変異ＢＴＫポリペプチドに特異的な抗体を用いるクロマトグラフィーまたは免疫親和性などの精製法によって単離される。

【0147】

＜抗体＞
本明細書では、アミノ酸位置４８１で修飾を有する修飾されたＢＴＫポリペプチドに結合する単離した抗体が与えられ、抗体は、配列番号：１と表記されたアミノ酸の配列を有する野生型のＢＴＫポリペプチドに対して結合しないか、または、低親和性で結合する。いくつかの実施形態では、修飾は、ＢＴＫポリペプチドのアミノ酸位置４８１においてセリンにシステインを置換することである。

【0148】

いくつかの実施形態では、本明細書で提供される変異ＢＴＫポリペプチドは、変異ＢＴＫポリペプチドを特異的に認識するが野生型のＢＴＫポリペプチドを認識しない抗体を用いて、検知される。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される変異ＢＴＫポリペプチドは、アミノ酸位置４８１でセリンを有する変異ＢＴＫポリペプチドを特異的に認識するが、野生型のＢＴＫポリペプチドを認識しない抗体を用いて、検知される。いくつかの実施形態では、抗体は、本明細書で提供される変異ＢＴＫポリペプチドの１つ以上の対立形質形態に対して作成される。ペプチドまたはタンパク質上でエピトープを特異的に認識する抗体を誘発するために抗原として特異的なタンパク質またはオリゴペプチドを使用する技術は周知である。１つの実施形態では、標的遺伝子の所望の対立形質形態のＤＮＡ配列は、適切な発現ベクターへの挿入によってクローン化され、原核生物または真核生物の宿主細胞中のタンパク質に翻訳される。タンパク質は回復し、抗原として使用されて特異的な抗体の産生を誘発する。別の実施形態では、標的遺伝子の所望の対立形質形態のＤＮＡは、ＰＣＲ技術によって増幅され、その後、特異的な抗体の産生を誘発するために抗原として使用されるタンパク質にインビトロで翻訳される。別の実施形態では、代替的な対立遺伝子のＤＮＡ配列は、特異的な抗体の産生を誘発するために抗原として使用される対立遺伝子のアミノ酸配列を表わす合成ペプチドの生成を基礎として使用される。

【0149】

いくつかの実施形態では、抗体は、標準的なモノクローナル抗体技術によって生成されるか、あるいは、組換えベースの発現システムによって生成される。一般にＡｂｂａｓ， Ｌｉｃｈｔｍａｎ， ａｎｄ Ｐｏｂｅｒ， Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， Ｗ． Ｂ． Ｓａｕｎｄｅｒｓ Ｃｏ． （１９９１）を参照する。用語「抗体」は、抗原に特異的に結合することができるＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２といった抗体のフラグメントまたは誘導体と同様に、無処置の抗体分子も含むように意図している。そのようにして産生された抗体は、抗体を作成するために抗原として使用された対立形質形態内で作られた変異タンパク質のみを優先的に結合する。対立遺伝子に特異的な抗体を生成する方法は、米国特許第６，２００，７５４号と、米国特許第６，０５４，２７３号とに記載されており、これに含まれるものはすべて引用によって本明細書に組み込まれる。

【0150】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗体はヒト化した抗体を含む。「ヒト化した抗体」は、ヒト以外のドナーの免疫グロブリンに由来するそのＣＤＲを有する操作した抗体の一種のことを言い、分子の残りの免疫グロブリンに由来する部分は１つ以上のヒト免疫グロブリンに由来している。いくつかの実施形態では、フレームワーク支持残基は、結合親和性を保存するために変更される（例えば、Ｑｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ， ８６：１００２９−１００３２ （１９８９）， Ｈｏｄｇｓｏｎ ｅｔ ａｌ． Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ９：４２１ （１９９１）を参照）。いくつかの実施形態では、適切なヒト受容体抗体は、ドナー抗体のヌクレオチドおよびアミノ酸配列への相同によって、従来のデータベース、例えば、ＫＡＢＡＴＲデータベース、Ｌｏｓ Ａｌａｍｏｓデータベース、Ｓｗｉｓｓ Ｐｒｏｔｅｉｎデータベースから選ばれた抗体である。いくつかの実施形態では、（アミノ酸ベースで）ドナー抗体のフレームワーク領域への相同によって特徴付けられるヒト化した抗体は、ドナーＣＤＲの挿入のための重鎖定常領域および／または重鎖可変フレームワーク領域を提供するのに適している。いくつかの実施形態では、軽鎖定常または可変のフレームワーク領域を提供することができる適切な受容体抗体が、同様のやり方で選択される。いくつかの実施形態では、受容体抗体の重鎖と軽鎖は、同じ受容体抗体から始まる。いくつかの実施形態では、受容体抗体の重鎖と軽鎖は、異なる受容体抗体から始まる。先行技術は、そのようなヒト化した抗体を産生する複数のの方法を記載している。例えば、ＥＰ−Ａ−０２３９４００およびＥＰ−Ａ−０５４９５１を参照。

【0151】

いくつかの実施形態では、本明細書で提供される変異ＢＴＫポリペプチドに特異的な抗体を用いて、当該技術分野の既知の技術を駆使して、サンプル（例えば、分析サンプル、細胞サンプル、細胞抽出液、生体サンプル、患者のサンプル）中で、本明細書で提供される変異ＢＴＫポリペプチドの存在を検知する。これらの技術は、例えば、ウェスタンブロット、免疫組織化学的検査、間接免疫蛍光法、および抗体マイクロアレイを含んでいる。いくつかの実施形態では、変異ＢＴＫポリペプチドを特異的に認識する抗体は、第２世代のＢＴＫ阻害剤である。いくつかの実施形態では、変異ＢＴＫポリペプチドの生物活性を抑制するために変異ＢＴＫポリペプチドを特異的に認識する抗体の能力は、第２世代のＢＴＫ阻害剤の同定について本明細書に記載の方法を使用するので決定することができる。

【0152】

＜変異ＢＴＫポリペプチドと変異ＢＴＫポリペプチドをコード化する核酸を検知するための診断アッセイ＞
本明細書では、被験体中の変異ＢＴＫポリペプチドと被験体中の変異ＢＴＫポリペプチドをコード化する核酸の検出を含む診断方法が提供される。いくつかの実施形態では、被験体はＢＴＫ媒介性の疾患または疾病を患っている。いくつかの実施形態では、被験体はＢＴＫを媒介とした疾患を有しており、これはＢ細胞癌である。いくつかの実施形態では、診断方法は、共有結合のおよび／または不可逆的なＢＴＫ阻害剤を用いる治療に対する耐性を有するＢ細胞癌を患っている被験体をスクリーニングうすること、共有結合のおよび／または不可逆的なＢＴＫ阻害剤を用いた処置について被験体を特定すること、共有結合のおよび／または不可逆的なＢＴＫ阻害剤を用いた処置に応答しそうなまたは応答しそうにない被験体を特定すること、共有結合のおよび／または不可逆的なＢＴＫ阻害剤を用いた処置に対して耐性を進行させる可能性の高い被験体であるかどうか予測すること、共有結合のおよび／または不可逆的なＢＴＫ阻害剤による治療を受ける被験体の治療をモニタリングすること、共有結合のおよび／または不可逆的なＢＴＫ阻害剤による治療を受ける被験体の治療を最適化すること、および、この組み合わせのために用いられる。いくつかの実施形態では、方法は、第２世代のＢＴＫ阻害剤による治療を受ける被験体を選択する工程を含む。いくつかの実施形態では、方法は、変異ＢＴＫを阻害する第２世代のＢＴＫ阻害剤を被験体に投与する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＢＴＫ修飾は、共有結合のおよび／または不可逆的なＢＴＫ阻害剤を用いた処置に対して癌細胞の耐性を与える。

【0153】

いくつかの実施形態では、検知された変異ＢＴＫポリペプチドは、配列番号：１と表記された野生型のＢＴＫポリペプチドのアミノ酸位置４８１に対応する位置で修飾を含む。いくつかの実施形態では、検知された変異ＢＴＫポリペプチドは、配列番号：１と表記された野生型のＢＴＫポリペプチドのアミノ酸位置４８１に対応する位置でセリンへのアミノ酸システインの置換を含む。いくつかの実施形態では、アミノ酸位置４８１で修飾を含む変異ＢＴＫポリペプチドを有する被験体は、共有結合のおよび／または不可逆的なＢＴＫ阻害剤を用いた阻害に対して耐性を有する。いくつかの実施形態では、アミノ酸位置４８１で修飾を含む変異ＢＴＫポリペプチドを有する被験体は、イブルチニブである共有結合のおよび／または不可逆的なＢＴＫ阻害剤を用いた阻害に対して耐性を有する。いくつかの実施形態では、アミノ酸位置４８１で修飾を含む変異ＢＴＫポリペプチドを有する被験体は、野生型のＢＴＫのシステイン４８１に共有結合する共有結合のおよび／または不可逆的なＢＴＫ阻害剤を用いた阻害に対して耐性を有する。いくつかの実施形態では、アミノ酸位置４８１で修飾を含む変異ＢＴＫポリペプチドを有する被験体は、共有結合のおよび／または不可逆的なＢＴＫ阻害剤（すなわち、イブルチニブ、ＰＣＩ−４５２９２、ＰＣＩ−４５４６６、ＡＶＬ−１０１、ＡＶＬ−２９１、ＡＶＬ−２９２、または、ＯＮＯ−ＷＧ−３７）による阻害に対して耐性を有する。いくつかの実施形態では、アミノ酸位置４８１で修飾を含む変異ＢＴＫポリペプチドを有する被験体は、イブルチニブである共有結合のおよび／または不可逆的なＢＴＫ阻害剤を用いた阻害に対して耐性を有する。

【0154】

いくつかの実施形態では、被験体が共有結合のおよび／または不可逆的なＢＴＫ阻害剤による治療にあまり反応しない、または、反応しなくなる可能性が高いかどうかを決定する方法が提供され、該方法は、（ａ）被験体からのＢＴＫポリペプチドをコード化する核酸分子を含むサンプルを試験する工程であって、それによって、コード化されたＢＴＫポリペプチドが配列番号：１と表記されるアミノ酸配列のアミノ酸位置４８１に対応するアミノ酸位置で修飾されているかどうかを決定する工程、および、（ｂ）被験体が修飾を有している場合、共有結合のおよび／または不可逆的なＢＴＫ阻害剤による治療に対する耐性を有する、または、耐性を有するようになると、被験体を特徴づける工程、を含む。いくつかの実施形態では、工程（ａ）はエキソビボで行なわれる。いくつかの実施形態では、方法は、被験体が修飾を有していない場合、ＢＴＫ阻害剤を用いた処置を継続する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、被験体が修飾を有している場合、修飾されたキナーゼを阻害する第２世代のＢＴＫ阻害剤を投与する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、被験体が修飾を有している場合、ＬＹＮ、ＳＹＫ、ＪＡＫ、ＰＩ３Ｋ、ＰＬＣγ、ＭＡＰＫ、ＭＥＫ、またはＮＦκＢの阻害剤を投与する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、被験体が修飾を有している場合、Ｃ４８１に結合しないＢＴＫの共有結合阻害剤を投与する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、被験体が修飾を有している場合、ＢＴＫの可逆的な阻害剤を投与する工程をさらに含む。方法のいくつかの実施形態において、被験体は癌を患っている。いくつかの実施形態では、癌は血液の癌である。いくつかの実施形態では、癌はＢ細胞悪性腫瘍である。典型的なＢ細胞悪性腫瘍が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、癌は白血病、リンパ腫、または骨髄腫の中から選択される。いくつかの実施形態において、方法は、被験体からサンプルを得る工程をさらに含む。

【0155】

いくつかの実施形態では、被験体中での共有結合のおよび／または不可逆的なＢＴＫ阻害剤を用いた阻害に対して耐性を有するものとしてＢＴＫを特徴づける方法が提供されており、該方法は、（ａ）被験体からのＢＴＫポリペプチドをコード化する核酸分子を含むサンプルを試験する工程であって、それによって、コード化されたＢＴＫポリペプチドが配列番号：１と表記されるアミノ酸配列のアミノ酸位置４８１に対応するアミノ酸位置で修飾されているかどうかを決定する工程、および、（ｂ）被験体が修飾を有している場合、共有結合のおよび／または不可逆的なＢＴＫ阻害剤による阻害に対して耐性を有するとして、被験体を特徴づける工程、を含む。いくつかの実施形態では、工程（ａ）はエキソビボで行なわれる。いくつかの実施形態では、方法は、被験体が修飾を有していない場合、ＢＴＫ阻害剤を用いた処置を継続する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、被験体が修飾を有している場合、修飾されたキナーゼを阻害する第２世代のＢＴＫ阻害剤を投与する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、被験体が修飾を有している場合、ＬＹＮ、ＳＹＫ、ＪＡＫ、ＰＩ３Ｋ、ＰＬＣγ、ＭＡＰＫ、ＭＥＫ、またはＮＦκＢの阻害剤を投与する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、被験体が修飾を有している場合、Ｃ４８１に結合しないＢＴＫの共有結合阻害剤を投与する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、被験体が修飾を有している場合、ＢＴＫの可逆的な阻害剤を投与する工程をさらに含む。方法のいくつかの実施形態において、被験体は癌を患っている。いくつかの実施形態では、癌は血液の癌である。いくつかの実施形態では、癌はＢ細胞悪性腫瘍である。典型的なＢ細胞悪性腫瘍が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、癌は白血病、リンパ腫、または骨髄腫の中から選択される。いくつかの実施形態において、方法は、被験体からサンプルを得る工程をさらに含む。

【0156】

いくつかの実施形態では、癌の処置のために共有結合のおよび／または不可逆的なＢＴＫ阻害剤を投与される被験体が、治療に対する耐性を進行させたか、または、進行させる可能性が高いかどうかをモニタリングする方法が記載されており、該方法は、（ａ）被験体からのＢＴＫポリペプチドをコード化する核酸分子を含むサンプルを試験する工程であって、それによって、コード化されたＢＴＫポリペプチドが配列番号：１と表記されるアミノ酸配列のアミノ酸位置４８１に対応するアミノ酸位置で修飾されているかどうかを決定する工程、および、（ｂ）被験体が修飾を有している場合、共有結合のおよび／または不可逆的なＢＴＫ阻害剤を用いた治療に対して耐性を有する、または、耐性を有するようになるとして、被験体を特徴づける工程、を含む。いくつかの実施形態では、工程（ａ）はエキソビボで行なわれる。いくつかの実施形態では、方法は、被験体が修飾を有している場合、ＢＴＫ阻害剤を用いた処置を中止する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、被験体が修飾を有していない場合、ＢＴＫ阻害剤を用いた処置を継続する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、被験体が修飾を有している場合、修飾されたキナーゼを阻害する第２世代のＢＴＫ阻害剤を投与する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、被験体が修飾を有している場合、ＬＹＮ、ＳＹＫ、ＪＡＫ、ＰＩ３Ｋ、ＰＬＣγ、ＭＡＰＫ、ＭＥＫ、またはＮＦκＢの阻害剤を投与する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、被験体が修飾を有している場合、Ｃ４８１に結合しないＢＴＫの共有結合阻害剤を投与する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、被験体が修飾を有している場合、ＢＴＫの可逆的な阻害剤を投与する工程をさらに含む。方法のいくつかの実施形態において、被験体は癌を患っている。いくつかの実施形態では、癌は血液の癌である。いくつかの実施形態では、癌はＢ細胞悪性腫瘍である。典型的なＢ細胞悪性腫瘍が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、癌は白血病、リンパ腫、または骨髄腫の中から選択される。いくつかの実施形態において、方法は、被験体からサンプルを得る工程をさらに含む。

【0157】

いくつかの実施形態では、癌の処置のために共有結合のおよび／または不可逆的なＢＴＫ阻害剤を投与される被験体の治療を最適化する方法が提供され、該方法は、（ａ）被験体からのＢＴＫポリペプチドをコード化する核酸分子を含むサンプルを試験する工程であって、それによって、コード化されたＢＴＫポリペプチドが配列番号：１と表記されるアミノ酸配列のアミノ酸位置４８１に対応するアミノ酸位置で修飾されているかどうかを決定する工程、および、（ｂ）被験体が修飾を有している場合、不可逆的なＢＴＫ阻害剤を用いた処置を中止するか、または、被験体が修飾を有していない場合、不可逆的なＢＴＫ阻害剤を用いた処置を継続する工程、を含む。いくつかの実施形態では、方法は、被験体が修飾を有している場合、修飾されたキナーゼを阻害する第２世代のＢＴＫ阻害剤を投与する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、工程（ａ）はエキソビボで行なわれる。いくつかの実施形態では、方法は、被験体が修飾を有している場合、ＬＹＮ、ＳＹＫ、ＪＡＫ、ＰＩ３Ｋ、ＰＬＣγ、ＭＡＰＫ、ＭＥＫ、またはＮＦκＢの阻害剤を投与する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、被験体が修飾を有している場合、Ｃ４８１に結合しないＢＴＫの共有結合阻害剤を投与する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、被験体が修飾を有している場合、ＢＴＫの可逆的な阻害剤を投与する工程をさらに含む。方法のいくつかの実施形態において、被験体は癌を患っている。いくつかの実施形態では、癌は血液の癌である。いくつかの実施形態では、癌はＢ細胞悪性腫瘍である。典型的なＢ細胞悪性腫瘍が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、癌は白血病、リンパ腫、または骨髄腫の中から選択される。いくつかの実施形態において、方法は、被験体からサンプルを得る工程をさらに含む。

【0158】

いくつかの実施形態では、第２世代のＢＴＫ阻害剤による治療を受ける被験体を選ぶ方法が提供され、該方法は、（ａ）被験体からのＢＴＫポリペプチドをコード化する核酸分子を含むサンプルを試験する工程であって、それによって、コード化されたＢＴＫポリペプチドが配列番号：１と表記されるアミノ酸配列のアミノ酸位置４８１に対応するアミノ酸位置で修飾されているかどうかを決定する工程、および、（ｂ）被験体が修飾を有している場合に、被験体を、第２世代のＢＴＫ阻害剤による治療を受ける候補であると特徴付ける工程、を含む。いくつかの実施形態では、方法は、被験体が修飾を有している場合、修飾されたキナーゼを阻害する第２世代のＢＴＫ阻害剤を投与する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、工程（ａ）はエキソビボで行なわれる。方法のいくつかの実施形態において、被験体は癌を患っている。いくつかの実施形態では、癌は血液の癌である。いくつかの実施形態では、癌はＢ細胞悪性腫瘍である。典型的なＢ細胞悪性腫瘍が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、癌は白血病、リンパ腫、または骨髄腫の中から選択される。いくつかの実施形態において、方法は、被験体からサンプルを得る工程をさらに含む。

【0159】

いくつかの実施形態では、修飾は、ＢＴＫポリペプチド中のアミノ酸位置４８１におけるアミノ酸の置換または欠失を含む。いくつかの実施形態では、修飾は、ＢＴＫポリペプチドのアミノ酸位置４８１で、ロイシン、イソロイシン、バリン、アラニン、グリシン、メチオニン、セリン、トレオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、プロリン、チロシン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、およびグルタミン酸の中から選択されたアミノ酸に、システインを置換することである。いくつかの実施形態では、修飾は、ＢＴＫポリペプチドのアミノ酸位置４８１で、セリン、メチオニンまたはトレオニンの中から選択されたアミノ酸に、システインを置換することである。いくつかの実施形態では、修飾は、ＢＴＫポリペプチドのアミノ酸位置４８１においてセリンにシステインを置換することである。いくつかの実施形態では、修飾は、ＢＴＫポリペプチドのアミノ酸位置４８１をコード化する核酸の欠失を含む。

【0160】

方法のいくつかの実施形態において、アッセイで使用される核酸分子はＲＮＡまたはＤＮＡである。方法のいくつかの実施形態において、アッセイで使用される核酸分子はゲノムＤＮＡである。方法のいくつかの実施形態において、アッセイで使用される核酸分子は全ＲＮＡである。方法のいくつかの実施形態において、アッセイで使用される核酸分子はｍＲＮＡである。方法のいくつかの実施形態において、方法は、ＲＮＡサンプルからｍＲＮＡを単離する工程をさらに含む。方法のいくつかの実施形態において、アッセイで使用される核酸分子はｃＤＮＡである。方法のいくつかの実施形態において、方法は、ｃＤＮＡへ核酸サンプルを逆転写する工程をさらに含む。方法のいくつかの実施形態において、方法は、ｃＤＮＡを分析する工程を含む。いくつかの実施形態では、サンプルは、循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）、核酸（ｃｔＲＮＡ）またはマイクロＲＮＡを含む血漿または血清のサンプルである（例えば、Ｃｈａｎ ｅｔ ａｌ． （２００７） Ｂｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ． ９６（５）：６８１−５を参照）。

【0161】

いくつかの実施形態では、ゲノムの核酸サンプルは核酸増幅方法によって増幅される。いくつかの実施形態では、核酸増幅方法はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）である。いくつかの実施形態では、ゲノムの核酸サンプルは、ＢＴＫ遺伝子に特異的な１セットのヌクレオチドプライマーを使用して増幅される。いくつかの実施形態では、ヌクレオチドプライマーのセットは、ＢＴＫポリペプチドのアミノ酸位置４８１をコード化する核酸配列に隣接する。いくつかの実施形態では、増幅生成物は、ＢＴＫポリペプチドのアミノ酸位置４８１をコード化する核酸である。いくつかの実施形態では、配列特異的なプライマーは、蛍光標識、生物発光標識、化学発光標識、放射性同位体、酵素標識、検知可能な基質、または、第２の検知可能な分子と結合するペプチドまたは分子といった、検知可能な分子に共役する。

【0162】

変異ＢＴＫポリペプチドをコード化する核酸中の１つの点突然変異と、サンプル中のＢＴＫポリペプチドのアミノ酸変化とを検知するために、当該技術分野では様々な方法が利用可能である。核酸中の変異と変異ポリペプチドを検出するための以下の方法は、典型的なものであり、排他的であることを意味していない。

【0163】

方法のいくつかの実施形態において、サンプルを試験する工程は、ＢＴＫポリペプチドのアミノ酸位置４８１をコード化する核酸のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅を行う工程を含む。いくつかの実施形態では、ＰＣＲ増幅は、ＢＴＫポリペプチドのアミノ酸位置４８１をコード化する領域に隣接する１対のオリゴヌクレオチドプライマーを使用すること、および、アミノ酸位置４８１を含むＢＴＫポリペプチドまたはその一部をコード化する核酸配列を増幅することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、増幅された核酸の配列を決定する工程を含む。いくつかの実施形態では、方法は、配列特異的なプライマーを使用して、増幅された核酸の配列を決定する工程を含む。いくつかの実施形態では、方法は、増幅したＰＣＲフラグメントをベクターに連結し、その後、アミノ酸位置４８１を含むＢＴＫポリペプチドまたはその一部をコード化する核酸の配列を決定する工程を含む。いくつかの実施形態では、方法は、ベクター配列に特異的プライマーを使用して、増幅した核酸の配列を決定する工程を含む。

【0164】

本明細書で提供される方法で使用される典型的な配列決定方法は、当該技術において周知であり、限定されないが、ジデオキシまたは連鎖停止法、Ｍａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ配列、大規模並列処理シグネチャー配列決定（ｍａｓｓｉｖｅｌｙ ｐａｒａｌｌｅｌ ｓｉｇｎａｔｕｒｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）（またはＭＰＳＳ）、ポロニー配列決定法（ｐｏｌｏｎｙ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）、ピロシーケンシング、Ｉｌｌｕｍｉｎａ染色シーケンシング（ｄｙｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）、ＳＯＬｉＤ（または、連結による配列決定）配列決定、イオン半導体シーケンシング、ＤＮＡナノボールシーケンシング、ｈｅｌｉｓｃｏｐｅシーケンシング、および一分子リアルタイム（ＳＭＲＴ）シーケンシングを含んでいる。

【0165】

方法のいくつかの実施形態において、サンプルを試験する工程は、ピロシーケンシングを含む。ピロシーケンシングは合成による配列決定に基づく。ピロシーケンシングは、ジデオキシヌクレオチドによる連鎖停止よりもむしろ、ヌクレオチドの取り込み時のピロリン酸放出の検知に依存するという点で、サンガーシーケンシングとは異なる。「合成によって配列決定する」ことは、配列決定されるＤＮＡの一本鎖を取り、その後、その相補鎖を酵素的に合成することを含んでいる。ピロシーケンシング方法は、別の化学発光酵素を用いてＤＮＡポリメラーゼ（ＤＮＡ合成酵素）の活性を検知することに基づく。該方法を用いて、ＤＮＡの一本鎖に沿って相補鎖を、一度に１つの塩基対で合成することによりＤＮＡの一本鎖の配列を決定し、どの塩基対がそれぞれの工程で実際に加えられたかを検知することができる。鋳型ＤＮＡは不動であり、Ａ、Ｃ、Ｇ、およびＴのヌクレオチドの溶液を連続して加えて、反応から取り除く。ヌクレオチド溶液が鋳型の第１の不対塩基を補完するときにのみ、光が生成される。化学発光シグナルを生成する溶液の配列により、鋳型の配列を決定することができる。該方法は、混合種個体群への多重対立形質の変異が変異を測定することができ、白血病細胞の不均質な集団中の変異を検知することができる。

【0166】

方法のいくつかの実施形態において、サンプルを試験する工程は、配列特異的な核酸プローブに核酸を接触させる工程であって、配列特異的な核酸プローブが、（ａ）アミノ酸位置４８１で修飾される修飾ＢＴＫをコード化する核酸に結合し、（ｂ）アミノ酸位置４８１でシステインを有する野生型のＢＴＫをコード化する核酸に結合しない、工程を含む。いくつかの実施形態では、サンプルを試験する工程は、（ａ）変異ＢＴＫ核酸配列に特異的なオリゴヌクレオチドプローブにサンプルを接触させる工程であって、それによって、変異核酸配列がサンプル中に存在する場合に、プローブＤＮＡ複合体が形成される、工程、および、（ｂ）プローブＤＮＡ複合体を検知する工程、を含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドプローブは、ＢＴＫポリペプチドのアミノ酸４８１に対応する位置でセリンをコード化する核酸に特異的である。いくつかの実施形態では、配列特異的なプローブは、蛍光標識、生物発光標識、化学発光標識、放射性同位体、酵素標識、検知可能な基質、または、第２の検知可能な分子と結合するペプチドまたは分子といった、検知可能な分子に共役する。

【0167】

方法のいくつかの実施形態において、試験する工程は、対立遺伝子に特異的なＰＣＲを使用する工程を含む。いくつかの実施形態では、単一のヌクレオチド変化は、ＰＣＲベースの切断された多形配列（ＣＡＰＳ）マーカーを用いてＰＣＲによって検知可能であり、該マーカーは、変異配列（Ｍｉｃｈａｅｌｓ ｅｔ ａｌ （１９９８） Ｐｌａｎｔ Ｊ． １４（３）：３８１−５）、または、限定されないが、フルオロフォアなどの検知可能な部分に付着した配列特異的なヘアピンプローブ（Ｍｈｌａｎｇａ ａｎｄ Ｍａｌｍｂｅｒｇ （２００１） Ｍｅｔｈｏｄｓ ２５：４６３−４７１）中に制限部位を形成する。いくつかの実施形態では、配列特異的なプローブは、蛍光標識、生物発光標識、化学発光標識、放射性同位体、酵素標識、検知可能な基質、または、第２の検知可能な分子と結合するペプチドまたは分子といった、検知可能な分子に共役する。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドプローブは、ＢＴＫポリペプチドのアミノ酸４８１に対応する位置でセリンをコード化する核酸に特異的である。

【0168】

いくつかの実施形態において、変異ＢＴＫをコード化するＤＮＡは、ＢＥＡＭｉｎｇ（ビーズ、増幅、エマルジョン、磁気）ＰＣＲ配列決定方法によって評価される（例えば、Ｌｉ ｅｔ ａｌ． （２００６） Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ． ３（２）：９５−７； Ｌｉ ｅｔ ａｌ． （２００６） Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ． ３（７）：５５１−９； ａｎｄ Ｄｉｅｈｌ ｅｔ ａｌ． （２００８） Ｎａｔ Ｍｅｄ． １４（９）： ９８５−９９０を参照）。ＢＥＡＭｉｎｇは、個々のＤＮＡ分子を油中水型乳剤中の電磁ビーズに付着させ、その後、区画化したＰＣＲ増幅にさらす技術である。ビーズに結合したＤＮＡの変異状態は、変異または野生型のＢＴＫについて、蛍光の対立遺伝子に特異的なプローブに対するハイブリダイゼーションによって決定される。その後、フローサイトメトリーを用いて、血漿または血清中に存在する変異ＤＮＡの値の量を定量化する（例えば、Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｔ ａｌ． （２０１２） Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １８： ３４６２−３４６９を参照）

【0169】

いくつかの実施形態では、サンプルを試験する工程は、高速液体クロマトグラフィー（Ｄ−ＨＰＬＣ）を変性させる工程を含む。Ｄ−ＨＰＬＣは、電解質勾配に対する電荷密度に従って、ＤＮＡフラグメントを分離するために設計されたカートリッジ・マトリックス内のヘテロ二本鎖／ホモ二本鎖ＤＮＡ種の差次的な保持動態に依存する。（例えば、Ｆｒｕｅｈ ｅｔ ａｌ （２００３） Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ Ｌａｂ Ｍｅｄ． ４１（４）：４５２−６１を参照）。

【0170】

いくつかの実施形態では、サンプルを試験する工程は、アミノ酸位置システイン４８１で不可逆的なＢＴＫ阻害剤に共有結合した野生型のＢＴＫポリペプチド、および、不可逆的なＢＴＫ阻害剤に共有結合しない変異Ｃ４８１Ｓ ＢＴＫポリペプチドにおけるｐＩ差を測定するためにＮａｎｏＰｒｏを使用する工程を含む。ＮａｎｏＰｒｏは、等電点の小さな差に基づいてタンパク質を分離することができる器具である。共役していない変異ＢＴＫと比較して、不可逆的なＢＴＫ阻害剤によるシステイン４８１の共有結合修飾は、ＢＴＫに対する薬物の結合を検知するために使用されるその等電点を変化させる。

【0171】

いくつかの実施形態において、サンプルを試験する工程は、マイクロアレイを使用する工程を含む。いくつかの実施形態では、変異ＢＴＫをコード化するＤＮＡの存在は、オリゴヌクレオチドアレイを用いて評価される（例えば、Ｈａｓｔｉａ ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｊ Ｍｅｄ Ｇｅｎｅｔ． ３６（１０）：７３０−６を参照）。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドアレイはマイクロチップに含まれる。いくつかの実施形態では、１つのヌクレオチドの変化はマイクロチップを用いて検知可能である。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される変異ＢＴＫポリペプチドまたはその一部をコード化する核酸は、位置４８１でシステインでないアミノ酸をコード化する核酸を含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される変異ＢＴＫポリペプチドまたはその一部をコード化する核酸は、アミノ酸位置４８１でセリンをコード化する核酸を含む。

【0172】

方法のいくつかの実施形態において、変異ＢＴＫを検出するためのサンプルは、ＢＴＫポリペプチドを含むタンパク質サンプルである。そのような実施例において、試験する工程は、変異ＢＴＫポリペプチドに特異的な抗体を用いて変異を検知する工程を含む。いくつかの実施形態では、変異ＢＴＫポリペプチドを検知する方法は、被験体からサンプルを提供する工程であって、サンプルがＢＴＫポリペプチドを含む、工程と、変異ＢＴＫポリペプチドとの結合に特異的であり、野生型のＢＴＫポリペプチドとは結合しないか、低親和性でしか結合しない抗体に、サンプルを接触させることによって、変異ＢＴＫポリペプチドが存在しているかどうかについてサンプルを試験する工程であって、変異ＢＴＫポリペプチドが存在すると、抗体変異ＢＴＫポリペプチド複合体が作成される、工程を含む。いくつかの実施形態では、該方法は、抗体変異ＢＴＫポリペプチド複合体を検知する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、検出試薬を用いて抗体変異ＢＴＫポリペプチド複合体を検知する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、変異ＢＴＫ特異抗体は、蛍光標識、生物発光標識、化学発光標識、放射性同位体、酵素標識、検知可能な基質、または、第２の検知可能なタンパク質（例えば第２の抗体）に結合するペプチドまたは分子といった、検知可能な分子に共役する。いくつかの実施形態では、変異ＢＴＫ特異抗体の結合は、検知可能な分子をアッセイすることにより検知される。いくつかの実施形態では、変異ＢＴＫ特異抗体の結合は、第２の（例えば、抗ＩｇＧ）抗体を使用することにより検知される。

【0173】

方法のいくつかの実施形態において、被験体はＢＴＫを媒介とした疾患または障害を患っている。方法のいくつかの実施形態において、被験体はＢ細胞増殖性障害を患っている。方法のいくつかの実施形態において、被験体は癌を患っている。いくつかの実施形態では、癌は血液の癌である。いくつかの実施形態では、癌はＢ細胞悪性腫瘍である。いくつかの実施形態では、癌は白血病、リンパ腫、または骨髄腫の中から選択される。いくつかの実施形態では、Ｂ細胞悪性腫瘍は、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、活性化したＢ細胞びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＡＢＣ−ＤＬＢＣＬ）、胚中心びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＧＣＢ ＤＬＢＣＬ）、縦隔原発Ｂ細胞リンパ腫（ＰＭＢＬ）、非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、濾胞性リンパ腫、免疫芽球性大細胞型リンパ腫、前駆Ｂリンパ芽球性リンパ腫、前駆Ｂ細胞急性リンパ性白血病、ヘアリーセル白血病、マントル細胞リンパ腫、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、リンパ形質細胞性リンパ腫／ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、脾臓周辺帯リンパ腫、形質細胞性骨髄腫、形質細胞腫、節外性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、節性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、縦隔（胸腺）大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、血管内大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、原発性滲出性リンパ腫、または、リンパ腫様肉芽腫症である。いくつかの実施形態では、被験体は固形腫瘍を患っている。

【0174】

いくつかの実施形態では、被験体は固形腫瘍を患っている。いくつかの実施形態では、被験体は肉腫、細胞腫、神経線維腫症（ｎｅｕｒｏｆｉｂｒｏｍａｔｏｍａ ）、または、リンパ腫を患っている。

【0175】

いくつかの実施形態において、被験体は、肺、胸、結腸、脳、前立腺、肝臓、膵臓、食道、腎臓、胃、甲状腺、膀胱、子宮、子宮頚部、または卵巣の癌を患っている。いくつかの実施形態では、被験体は転移性癌を患っている。いくつかの実施形態では、被験体は、急性リンパ芽球性白血病、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、急性前骨髄球性白血病、腺癌、腺腫、副腎癌、副腎皮質癌、エイズ関連の癌、エイズ関連リンパ腫、肛門癌、垂癌、星細胞腫、基底細胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、骨肉腫／悪性線維性組織球腫、脳幹神経膠腫、脳腫瘍、細胞腫、小脳星細胞腫、大脳星細胞腫／悪性神経膠腫、脳室上衣細胞腫、髄芽腫、テント上方原始神経外胚葉性腫瘍、視覚路または視床下部の神経膠腫、乳癌、気管支腺腫／カルチノイド、バーキットリンパ腫、カルチノイド腫瘍、細胞腫、中枢神経系リンパ腫、子宮頚部癌、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄増殖性疾患、結腸癌、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、線維形成性小円形細胞腫瘍、子宮内膜癌、脳室上衣細胞腫、類表皮癌、食道癌、ユーイング肉腫、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、肝臓外胆管癌、目癌／眼球内黒色腫、目癌／網膜芽細胞腫、胆嚢癌、胆石腫瘍、胃癌、消化管カルチノイド腫瘍、胃腸間質性腫瘍、巨細胞腫、多形神経膠芽腫、神経膠腫、毛様細胞腫瘍、頭頚部癌、心臓癌、肝細胞癌／肝臓癌、ホジキンリンパ腫、増殖、過形成性角膜神経腫瘍、上皮内癌、下咽頭癌、腸の神経節腫、島細胞腫、カポージ肉腫、腎臓／腎細胞の癌、喉頭癌、平滑筋腫腫瘍、唇および口腔の癌、脂肪肉腫、肝臓癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、リンパ腫、マクログロブリン血症、悪性カルチノイド、骨の悪性線維性組織球症、悪性高カルシウム血症、悪性黒色腫、マルファン症候群様の体質腫瘍（ｍａｒｆａｎｏｉｄ ｈａｂｉｔｕｓ ｔｕｍｏｒ）、髄様癌、メラノーマ、メルケル細胞癌、中皮腫、転移性皮膚癌、転移性頸部扁平上皮癌、口腔癌、粘膜神経腫、多発性骨髄腫、菌状息肉腫、骨髄異形成症候群、骨髄腫、骨髄増殖性疾患、鼻腔および副鼻腔の癌、上咽頭癌、頚部癌、神経組織癌、神経芽腫、口腔癌、口腔咽頭癌、骨肉腫、卵巣癌、卵巣上皮性腫瘍、卵巣胚細胞腫、膵癌、副甲状腺癌、陰茎癌、咽頭癌、褐色細胞腫、松果体星細胞腫、松果体胚腫、松果体芽腫、下垂体腺腫、胸膜肺芽腫、真性赤血球増加、原発性脳腫瘍、前立腺癌、直腸癌、腎細胞腫瘍、細網肉腫、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺癌、セミノーマ、セザリー症候群、皮膚癌、小腸癌、軟部組織肉腫、扁平上皮癌、頚部扁平上皮癌、胃癌、テント上方原始神経外胚葉性腫瘍、精巣癌、咽喉癌、胸腺腫、甲状腺癌、局所皮膚病変、栄養膜腫瘍、尿道癌、子宮癌／子宮内膜癌、子宮肉腫、膣癌、外陰癌、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、または、ウィルムス腫瘍である癌を患っている。

【0176】

いくつかの実施形態では、被験体は再発した癌を患っている。いくつかの実施形態では、被験体は難治性癌を患っている。いくつかの実施形態では、被験体は難治性癌を患っており、共有結合のおよび／または不可逆的なＢＴＫ阻害剤を用いた処置が癌には効かない。いくつかの実施形態では、被験体は難治性癌を患っており、被験体は、共有結合のおよび／または不可逆的なＢＴＫ阻害剤を用いた処置に対する感受性の低下を示している。いくつかの実施形態では、被験体は難治性癌を患っており、被験体は、共有結合のおよび／または不可逆的なＢＴＫ阻害剤の特定の投与量に対する感受性の低下を示している。いくつかの実施形態では、被験体は難治性癌を患っており、被験体は、重症化、または、癌の１つ以上の症状の出現（すなわち疾患の進行）を示している。いくつかの実施形態では、被験体は、癌の退行の低下を示す。いくつかの実施形態では、退行は癌の停滞である。いくつかの実施形態では、被験体は再発性または難治性の液の癌を患っている。いくつかの実施形態では、被験体は再発性または難治性のＢ細胞悪性腫瘍を患っている。

【0177】

いくつかの実施形態において、被験体は、血液の癌を患っている疑いがあるか、または、血液の癌を患う危険性が高い。いくつかの実施形態において、被験体は、Ｂ細胞悪性腫瘍を有している疑いがあるか、または、Ｂ細胞悪性腫瘍を患う危険性が高い。いくつかの実施形態において、被験体は、白血病、リンパ腫、または骨髄腫を患っている疑いがあるか、または、その危険性が高い。

【0178】

いくつかの実施形態では、被験体は、血液の癌の１つ以上の症状を示す。いくつかの実施形態では、被験体は、Ｂ細胞悪性腫瘍の１つ以上の症状を示す。いくつかの実施形態では、被験体は、白血病、リンパ腫、または骨髄腫の１つ以上の症状を示す。いくつかの実施形態では、被験体は、限定されないが、異常なＢ細胞機能、異常なＢ細胞の大きさまたは形状、異常なＢ細胞の数、疲労、発熱、寝汗、頻繁な感染、リンパ節腫大、蒼白さ、貧血、出血または打撲が起きやすいこと、食欲低下、体重減少、骨または関節の痛、頭痛、および、点状出血（ｐｅｔｅｃｈｉｅ）などの１つ以上の症状を示す。

【0179】

いくつかの実施形態では、被験体は、自己免疫性疾患、例えば、炎症性腸疾患、関節炎、狼瘡、関節リウマチ、乾癬性関節炎、変形性関節症、スチル病、若年性関節炎、糖尿病、重症筋無力症、橋本病、オード甲状腺炎（Ｏｒｄ’ｓ ｔｈｙｒｏｉｄｉｔｉｓ）、グレーブス病、シェーグレン症候群、多発性硬化症、ギラン−バレー症候群、急性散在性脳脊髄膜炎、アジソン病、オプソクローヌスミオクローヌス症候群、強直性脊椎炎（ｓｐｏｎｄｙｌｉｔｉｓｉｓ）、抗リン脂質抗体症候群、再生不良性貧血、自己免疫性肝炎、セリアック病、グッドパスチャー症候群、特発性血小板減少性紫斑病、視神経炎、強皮症、原発性胆汁性肝硬変、ライター症候群、高安動脈炎、側頭動脈炎、温式自己免疫溶血性貧血、ヴェーゲナー肉芽腫症、乾癬、全身性脱毛症、ベーチェット病、慢性疲労、自律神経異常症、子宮内膜症、間質性膀胱炎、神経ミオトニー、強皮症、または、外陰部痛に苛まされている。

【0180】

他の実施形態では、被験体は、異種免疫疾病または疾患、例えば、移植片対宿主病、移植、輸血、アナフィラキシー、アレルギー、１型過敏症、アレルギー性結膜炎、アレルギー性鼻炎、または、アトピー性皮膚炎に苦しんでいる。

【0181】

特定の実施形態では、被験体は、炎症性疾患、例えば、喘息、虫垂炎、眼瞼炎、細気管支炎、気管支炎、滑液包炎、子宮頚管炎、胆管炎、胆嚢炎、大腸炎、結膜炎、膀胱炎、涙腺炎、皮膚炎、皮膚筋炎、脳炎、心内膜炎、子宮内膜炎、腸炎、全腸炎、顆炎、精巣上体炎、筋膜炎、結合組織炎、胃炎、胃腸炎、肝炎、化膿性汗腺炎、喉頭炎、乳腺炎、髄膜炎、脊髄炎、心筋炎、筋炎、腎炎、卵巣炎、精巣炎、骨炎、耳炎、膵炎、耳下腺炎、心膜炎、腹膜炎、咽頭炎、胸膜炎、静脈炎、間質性肺炎、肺炎、直腸炎、前立腺炎、腎盂腎炎、鼻炎、卵管炎、副鼻腔炎、口内炎、滑膜炎、腱炎、扁桃炎、ぶどう膜炎、膣炎、血管炎、または、外陰部炎に苛まされている。

【0182】

さらなる実施形態において、被験体は、血栓塞栓障害、例えば、心筋梗塞、狭心症、血管形成後の再閉塞、血管形成後の再狭窄、大動脈冠動脈バイパス後の再閉塞、大動脈冠動脈バイパス後の再狭窄、脳卒中、一過性虚血、末梢動脈閉塞性障害、肺塞栓症、または深部静脈血栓症に苦しんでいる。

【0183】

いくつかの実施形態では、被験体は、疾患または疾病の処置のために、１つ以上の治療薬を投与されるか、または、投与されている。いくつかの実施形態では、被験体は、疾患または疾病の処置のために、ＢＴＫ阻害剤を投与されるか、または、投与されている。いくつかの実施形態では、被験体は、疾患または疾病の処置のために、ＢＴＫ阻害剤に加えて、１つ以上の治療薬を投与されるか、または、投与されている。

【0184】

いくつかの実施形態では、被験体は、疾患または疾病の処置のために、１つ以上の化学療法剤を投与されるか、または、投与されている。いくつかの実施形態では、被験体は、癌の処置のために、ＢＴＫ阻害剤を投与されるか、または、投与されている。いくつかの実施形態では、被験体は、癌の処置のために、ＢＴＫ阻害剤に加えて、１つ以上の化学療法剤を投与されるか、または、投与されている。

【0185】

いくつかの実施形態では、方法で使用されるサンプルは、生物からの任意の組織または流体からのものである。サンプルは、限定されないが、全血、分離した骨髄、骨髄穿刺液、胸膜液、腹水、中央の髄液、腹部の流体、膵液、脳脊髄液、脳液、腹水、心膜液、尿、唾液、気管支洗浄液、汗、涙、耳流体、痰、陰嚢水腫流体、精液、膣液、ミルク、羊水、および、呼吸器、腸管、または尿生殖路の分泌物を含んでいる。特定の実施形態において、サンプルは腫瘍生検サンプルである。特定の実施形態では、サンプルは、リンパ系または循環系の一部であるかそれに関連する流体または組織からのものである。いくつかの実施形態では、サンプルは、静脈、動脈、末梢、組織、臍帯血のサンプルである、血液サンプルである。特定の実施形態では、サンプルは、１つ以上の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を含む血液細胞サンプルである。いくつかの実施形態では、サンプルは、１つ以上の循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）を包含している。いくつかの実施形態では、サンプルは、１つ以上の播種性腫瘍細胞（ＤＴＣ、例えば、骨髄穿刺液サンプル中）を含む。

【0186】

組織および流体サンプルに含まれる細胞から核酸およびタンパク質を単離するための方法は、当該技術において周知である。特定の実施形態では、被験体から得られたサンプルは、被験体から腫瘍生検に含まれる細胞から単離される。特定の実施形態では、被験体から得られたサンプルは、骨髄穿刺液中の細胞から単離される。特定の実施形態では、被験体から得られたサンプルは、血清サンプル中に含まれる細胞から単離される。特定の実施形態では、被験体から得られたサンプルは、リンパサンプル中に含まれる細胞から単離される。特定の実施形態では、サンプルは、細胞には含まれない循環腫瘍核酸を含む。

【0187】

いくつかの実施形態では、サンプルは、周知のかつ所定の臨床的な方法を用いてサンプルを得る任意の適切な手段によって、被験体から得られる。被験体から流体サンプルを得るための手続きは周知である。例えば、全血とリンパを採取して処理する手続きは周知のものであり、提供される方法で使用されるサンプルを得るために使用することができる。典型的には、血液サンプルの採取については、抗凝固剤（例えば、ＥＤＴＡ、あるいは、クエン酸およびヘパリン、または、ＣＰＤ（クエン酸、リン酸、デキストロース）、または、匹敵する物質）は、血液の凝固を防ぐためにサンプルに加えられる。いくつかの実施例において、血液サンプルは、血液サンプルの凝固を防ぐために、ＥＤＴＡの量を含む採取チューブに集められる。

【0188】

いくつかの実施形態では、サンプルは、組織生検であり、例えば、針生検、ＣＴで誘導された針生検、吸引生検、内視鏡生検、気管支鏡生検、気管支洗浄、切開生検、切採生検、細切採取法、薄片生検、皮膚生検、骨髄生検、および、ループ式電気焼灼切除法（ＬＥＥＰ）によって得られる。典型的には、壊死していない無菌の生検または検体は、１００ｍｇ以上で得られるが、１００ｍｇ未満、５０ｍｇ以下、１０ｍｇ以下、または、５ｍｇ以下などのようにより少なくてもよく、あるいは、１００ｍｇ以上、２００ｍｇ以上、または５００ｍｇ以上、１ｇｍ以上、２ｇｍ以上、３ｇｍ以上、４ｇｍ以上、または、５ｇｍ以上など、より大きくてもよい。アッセイのために抽出されるサンプルの大きさは、限定されないが、行なわれるアッセイの数、組織サンプルの健康、癌の種類、および、患者の状態を含む多くの因子に依存する。いくつかの実施形態では、組織は、無菌のチューブまたは培養皿のような無菌の容器に置かれ、適切な培地に随意に浸される。一般に、当該技術において周知のように、細胞は、機械的な手段および／または酵素処置によって、細胞懸濁液へと分離される。一般に、細胞は集められ、その後、核酸を単離するための標準的な手順に移されて、アッセイされる。

【0189】

いくつかの実施形態では、被験体からのサンプルの採取は、等間隔で、例えば、１日、２日、３日、４日、５日、６日、１週、２週、３週、４週、１か月、２か月、３か月、４か月、５か月、６か月、１年、毎日、毎週、日刊新聞、週刊誌、隔月、３カ月毎、２年毎、１年毎に行なわれる。

【0190】

いくつかの実施形態では、サンプルの採取は、１つ以上の抗癌剤を用いて処置と比べて、あらかじめ決められた時間、または、規則的な間隔で行なわれる。いくつかの実施形態では、抗癌剤は、白血病、リンパ腫、または骨髄腫の処置のために投与される。白血病、リンパ腫、または骨髄腫の処置のための典型的な抗癌剤は、アドリアマイシン（ドキソルビシン）、ベグザー、ベンダムスチン、ブレオマイシン、ブレノキサン（ｂｌｅｎｏｘａｎｅ）、ボルテゾミブ、ダカルバジン、デルタゾン（ｄｅｌｔａｓｏｎｅ）、シスプラチン、シクロホスファミド、シトキサン、ＤＴＩＣダカルバジン、ダサチニブ、ドキソルビシン、エトポシド、フルダラビン、グラニセトロン、カイトリル、レナリドミド、マチュレーン（ｍａｔｕｌａｎｅ）、メクロレタミン、ムスタルゲン（ｍｕｓｔａｒｇｅｎ）、ムスチン（ｍｕｓｔｉｎｅ）、ナツラン、リツキサン（リツキシマブ、抗ＣＤ２０抗体）、ＶＣＲ、ネオサール（ｎｅｏｓａｒ）、ナイトロジェンマスタード、オンコビン、オンダンセトロン、オラゾン（ｏｒａｓｏｎｅ）、プレドニゾン、プロカルバジン、サリドマイド、ＶＰ−１６、ベルバン（ｖｅｌｂａｎ）、ベルベ（ｖｅｌｂｅ）、ベルサール（ｖｅｌｓａｒ）、ベペシド（ＶｅＰｅｓｉｄ）、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ゼバリン（登録商標）、ゾフラン（ｚｏｆｒａｎ）、幹細胞移植、放射線療法または併用療法、例えば、ＡＢＶＤ（アドリアマイシン、ブレオマイシン、ビンブラスチン、およびダカルバジン）、ＣｈｌｖＰＰ（クロラムブシル、ビンブラスチン、プロカルバジン、およびプレドニゾロン）、Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ｖ（ムスチン）、ドキソルビシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ブレオマイシン、エトポシド、および、ステロイド）、ＢＥＡＣＯＰＰ（ブレオマイシン、エトポシド、ドキソルビシン、シクロホスファミド、ビンクリスチン、プロカルバジン、およびプレドニゾロン）、ＢＥＡＭ（カルムスチン（ＢｉＣＮＵ）エトポシド、シタラビン（Ａｒａ−Ｃ、サイトシンアラビノサイド）、およびメルファラン）、ＣＨＯＰ（シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、および、プレドニゾン）、Ｒ−ＣＨＯＰ（リツキシマブ、ドキソルビシン、シクロホスファミド、ビンクリスチン、およびプレドニゾン）、ＥＰＯＣＨ（エトポシド、ビンクリスチン、ドキソルビシン、シクロホスファミド、およびプレドニゾン）、ＣＶＰ（シクロホスファミド、ビンクリスチン、およびプレドニゾン）、ＩＣＥ（イホスファミド−カルボプラチン−エトポシド）、Ｒ−ＡＣＶＢＰ（リツキシマブ、ドキソルビシン、シクロホスファミド、ビンデシン、ブレオマイシン、およびプレドニゾン）、ＤＨＡＰ（デキサメタゾン、高用量シタラビン、（ＡｒａＣ）、シスプラチン）、Ｒ−ＤＨＡＰ（リツキシマブ、デキサメタゾン、高用量シタラビン（Ａｒａ Ｃ）、シスプラチン）、ＥＳＨＡＰ（エトポシド（ＶＰ−１６）、メチル−プレドニゾロン、および、高用量シタラビン（Ａｒａ−Ｃ）、シスプラチン）、ＣＤＥ（シクロホスファミド、ドキソルビシン、およびエトポシド）、ベルケイド（登録商標）（ボルテゾミブ）とドキシル（登録商標）（リポソームドキソルビシン）、レブラミド（登録商標）（レナリドミド）とデキサメタゾン、および、ボルテゾミブとデキサメタゾンを含む。いくつかの実施形態では、抗癌剤は、フルダラビンである。いくつかの実施形態では、抗癌剤は、ベンダムスチンである。いくつかの実施形態では、抗癌剤は、リツキサンである。いくつかの実施形態では、抗癌剤は、ダサチニブである。いくつかの実施形態では、サンプルは、処置の前、最中、後、あるいは、抗癌剤を用いた連続的な処置の間に、あらかじめ決められた時間に、または、規則的な時間間隔で、採取される。特定の実施例において、サンプルは、抗癌治療を施す前に、かつ、処置が行われた後の規則的な間隔で、被験体から得られる。

【0191】

いくつかの実施形態では、サンプルの採取は、共有結合のおよび／または不可逆的なＢＴＫ阻害剤を用いた処置と比較して、あらかじめ決められた時間に、または、規則的な時間間隔で行なわれる。例えば、サンプルは、処置の前、最中、後、あるいは、連続的な処置の間に、あらかじめ決められた時間に、または、規則的な時間間隔で、採取される。特定の実施例において、サンプルは、共有結合のおよび／または不可逆的なＢＴＫ阻害剤の投与前に、および、不可逆的なＢＴＫ阻害剤を用いた処置が行われた後に、規則的な間隔で、被験体から得られる。いくつかの実施形態では、被験体は、共有結合のおよび／または不可逆的なＢＴＫ阻害剤と１つ以上の追加の抗癌剤を投与される。いくつかの実施形態では、被験体は、共有結合のおよび／または不可逆的なＢＴＫ阻害剤と、不可逆的なＢＴＫ阻害剤でない１つ以上の追加の抗癌剤を投与される。いくつかの実施形態では、被験体は、１つ以上の不可逆的なＢＴＫ阻害剤を投与される。いくつかの実施形態では、被験体は、野生型のＢＴＫのシステイン４８１に共有結合する１つ以上の不可逆的なＢＴＫ阻害剤を投与される。いくつかの実施形態では、不可逆的なＢＴＫ阻害剤は、イブルチニブ、ＰＣＩ−４５２９２、ＰＣＩ−４５４６６、ＡＶＬ−１０１、ＡＶＬ−２９１、ＡＶＬ−２９２、またはＯＮＯ−ＷＧ−３７である。いくつかの実施形態において、不可逆的なＢＴＫ阻害剤はイブルチニブである。

【0192】

本明細書で提供される方法のいずれかで使用される追加のＢＴＫ阻害剤は、例えば、米国特許第７，５４７，６８９、７，９６０，３９６、および、米国特許公開第２００９−０１９７８５３ Ａ１、および、米国特許公開第２０１２−００６５２０１ Ａ１で見られ、これらはすべて参照することでそのまま組み込まれる。本明細書で提供される方法のいずれかで使用されるの追加のＢＴＫ阻害剤は、例えば、ＵＳ２０１０００２９６１０、ＷＯ０９０５１８２２、ＷＯ１０１２３８７０、ＷＯ０９１５８５７１、ＷＯ１１０３４９０７、ＷＯ１２０２１４４４、ＷＯ１１０２９０４６、ＷＯ０８１１０６２４、ＷＯ１００８０４８１、ＷＯ１０１４４６４７、ＷＯ１００５６８７５、ＷＯ０５０４７２９０、ＷＯ０６０５３１２１、ＷＯ０６０９９０７５、ＷＯ０８０３３８３４、ＷＯ０８０３３８５７、ＷＯ０８０３３８５８、ＷＯ０９１３７５９６、ＷＯ１００５６８７５、ＷＯ１００６８７８８、ＷＯ１００６８８０６、ＷＯ１００６８８１０、ＷＯ１１１４０４８８、ＷＯ１２０３０９９０、ＷＯ１２０３１００４、ＷＯ２０１００５６８７５、ＷＯ０５０６６１５６、ＷＯ１００５６８７５、ＵＳ２０１２０３１６１４８、ＷＯ０９０４８３０７、ＷＯ０９１４７１９０、ＷＯ１１１６２５１５、ＷＯ１１１６２５１５、ＷＯ０６０３６９４１、ＷＯ１０１２６９６０、ＷＯ０７１３６７９０、ＷＯ１２０２５１８６、ＷＯ２０１３０１０３８０、ＷＯ２０１３０１０８６８、ＷＯ２０１３０１０８６９、ＷＯ２０１３００８０９５、ＷＯ１１１５２３５１、ＷＯ２０１３０６００９８、ＷＯ２０１３０６００９８、ＷＯ０７００２３２５、ＷＯ０７００２４３３、ＷＯ０７０１３８９６、ＷＯ０９１４３０２４、ＷＯ１００６５８９８、ＷＯ２０１２１５８７６４、ＷＯ２０１２１５８７８５、ＷＯ２０１２１５８７９５、ＷＯ２０１２１５８８１０、ＷＯ０９０５３２６９、ＷＯ０９１５６２８４、ＷＯ２０１２０２０００８、ＷＯ２０１２１５６３３４、ＷＯ２０１３０２４０７８、ＷＯ０８０５７２５２、ＷＯ０３０８１２１０、ＷＯ０３０８７０５１、ＵＳ２０１３００５９８４７Ａ１、ＷＯ０６０６５９４６、ＷＯ０７０２７５９４、および、ＷＯ０８０９２１９９で見られ、これらはすべて参照することでそのまま本明細書に組み込まれる。

【0193】

いくつかの実施形態では、被験体は、１つ以上の可逆的なＢＴＫ阻害剤と組み合わせて、野生型のＢＴＫのシステイン４８１に共有結合する共有結合のおよび／または不可逆的なＢＴＫ阻害剤を投与される。例えば、いくつかの実施形態では、被験体は、結合に関してシステイン４８１に依存しない１つ以上の可逆的なＢＴＫ阻害剤と組み合わせて、野生型のＢＴＫのシステイン４８１に共有結合する共有結合のおよび／または不可逆的なＢＴＫ阻害剤を投与される。可逆的なＢＴＫ阻害剤は当該技術で知られており、限定されないが、ダサチニブ、ＰＣ−００５、ＲＮ４８６、ＰＣＩ−２９７３２、または、テレイン酸（ｔｅｒｒｅｉｃ ａｃｉｄ）を含んでいる。特定の実施形態では、不可逆的なＢＴＫ阻害剤イブルチニブは、可逆的なＢＴＫ阻害剤ダサチニブと組み合わせて投与される。

【0194】

いくつかの実施形態では、サンプルは、不可逆的なＢＴＫ阻害剤の第１の投与後、１週、２週、３週、１か月、２か月、３か月、４か月、５か月、６か月、７か月、８か月、９か月、１０か月、１１か月、１２か月、１４か月、１６か月、１８か月、２０か月、２２か月、２４か月、２６か月、２８か月、３０か月、３２か月、３４か月、３６か月目、またはそれよりも後に得られる。いくつかの実施形態では、サンプルは、不可逆的なＢＴＫ阻害剤にまだ曝露していない被験体に不可逆的なＢＴＫ阻害剤の第１の投与後、１週、２週、３週、１か月、２か月、３か月、４か月、５か月、６か月、７か月、８か月、９か月、１０か月、１１か月、１２か月、１４か月、１６か月、１８か月、２０か月、２２か月、２４か月、２６か月、２８か月、３０か月、３２か月、３４か月、３６か月以上後に、得られる。いくつかの実施形態では、サンプルは、再発性または難治性の癌を患っている被験体に不可逆的なＢＴＫ阻害剤の第１の投与後、１週、２週、３週、１か月、２か月、３か月、４か月、５か月、６か月、７か月、８か月、９か月、１０か月、１１か月、１２か月、１４か月、１６か月、１８か月、２０か月、２２か月、２４か月、２６か月、２８か月、３０か月、３２か月、３４か月、３６か月以上後に、得られる。いくつかの実施形態では、サンプルは、不可逆的なＢＴＫ阻害剤を用いた処置の間に、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０回以上得られる。いくつかの実施形態では、被験体は、不可逆的なＢＴＫ阻害剤が最初に投与される際の不可逆的なＢＴＫ阻害剤を用いた処置に反応する。

【0195】

＜維持療法＞
本明細書では、Ｂ細胞増殖性障害を患っている被験体の維持療法のための方法が提供される。いくつかの実施形態では、Ｂ細胞細胞増殖性疾患は癌である。いくつかの実施形態では、癌は血液の癌である。いくつかの実施形態では、維持療法のための方法は、最初の治療期間にわたって共有結合のおよび／または不可逆的なＢＴＫ阻害剤を用いて血液の癌を処置する工程と、その後の維持療法計画を含む。いくつかの実施形態では、維持療法のための方法は、６か月以上にわたって、例えば、６か月、７か月、８か月、９か月、１０か月、１１か月、１２か月、１３か月、１４か月、１５か月、１６か月、１７か月、１８か月、１９か月、２０か月、２１か月、２２か月、２３か月、２４か月、２５か月、２６か月、２７か月、２８か月、２９か月、３０か月、３１か月、３２か月、３３か月、３４か月、３５か月、３年、４年、５年、６年、７年、８年、９年、１０年以上にわたって、共有結合のおよび／または不可逆的なＢＴＫ阻害剤で血液の癌を処置する工程を含む。いくつかの実施形態では、不可逆的なＢｔｋ阻害剤は、野生型のＢｔｋのシステイン４８１と共有結合する。いくつかの実施形態では、不可逆的なＢＴＫ阻害剤は、イブルチニブ、ＰＣＩ−４５２９２、ＰＣＩ−４５４６６、ＡＶＬ−１０１、ＡＶＬ−２９１、ＡＶＬ−２９２、またはＯＮＯ−ＷＧ−３７の中から選択される。いくつかの実施形態において、不可逆的なＢＴＫ阻害剤はイブルチニブである。

【0196】

典型的な方法では、血液の癌を患っている被験体は、治療上の有効な量の共有結合のおよび／または不可逆的なＢＴＫ阻害剤で処置され、被験体は、被験体がＢＴＫのシステイン４８１で修飾をもたらすＢＴＫをコード化する内因性遺伝子の変異を獲得するかどうかを決定するために、あらかじめ決められた時間間隔でモニタリングされる。いくつかの実施形態において、モニタリングは、被験体からのＢＴＫポリペプチドをコード化する核酸分子を含むサンプルを試験する工程であって、それによって、コード化されたＢＴＫポリペプチドが配列番号：１と表記されるアミノ酸配列のアミノ酸位置４８１に対応するアミノ酸位置で修飾されているかどうかを決定する工程、を含む。いくつかの実施形態では、修飾はＣ４８１Ｓである。いくつかの実施形態では、サンプルは１つ以上の癌細胞またはｃｔＤＮＡを包含している。いくつかの実施形態では、１つ以上の癌細胞またはｃｔＤＮＡを包含しているサンプルは、被験体が、共有結合のおよび／または不可逆的なＢＴＫ阻害剤を用いた処置の前に、または、その処置の初期に、野性型ＢＴＫを発現するかどうかを決めるために、不可逆的なＢＴＫ阻害剤を用いた処置の前に、または、不可逆的なＢＴＫ阻害剤を用いた処置の初期に（例えば、約１週から約２か月後に）、被験体から得られる。

【0197】

いくつかの実施形態では、血液の癌を患っている患者における維持療法の方法が提供され、該方法は、（ａ）治療上有効な量の共有結合のおよび／または不可逆的なＢＴＫ阻害剤の投与を含む維持療法計画を患者に施す工程、および、（ｂ）維持療法計画の経過にわたってあらかじめ決められた時間間隔で患者をモニタリングする工程であってそれによって、被験体が、配列番号：１と表記されたアミノ酸配列のアミノ酸位置４８１に対応するアミノ酸位置で修飾をもたらすＢＴＫをコード化する内因性遺伝子の変異を有しているかどうかを決定する、工程を含む。いくつかの実施形態において、モニタリングする工程は、被験体からのＢＴＫポリペプチドをコード化する核酸分子を含むサンプルを試験する工程であって、それによって、コード化されたＢＴＫポリペプチドが配列番号：１と表記されるアミノ酸配列のアミノ酸位置４８１に対応するアミノ酸位置で修飾されているかどうかを決定する工程、を含む。いくつかの実施形態では、修飾はＣ４８１Ｓである。いくつかの実施形態では、サンプルは１つ以上の癌細胞またはｃｔＤＮＡを包含している。いくつかの実施形態では、１つ以上の癌細胞またはｃｔＤＮＡを包含しているサンプルは、被験体が、共有結合のおよび／または不可逆的なＢＴＫ阻害剤を用いた処置の前に、または、その処置の初期に、野性型ＢＴＫを発現するかどうかを決めるために、不可逆的なＢＴＫ阻害剤を用いた処置の前に、または、不可逆的なＢＴＫ阻害剤を用いた処置の初期に（例えば、約１週から約２か月後に）、被験体から得られる。

【0198】

いくつかの実施形態では、方法は、被験体が修飾を有している場合、ＢＴＫ阻害剤を用いた処置を中止する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、被験体が修飾を有していない場合、ＢＴＫ阻害剤を用いた処置を継続する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、被験体が修飾を有している場合、修飾されたキナーゼを阻害する第２世代のＢＴＫ阻害剤を投与する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、被験体が修飾を有している場合、ＬＹＮ、ＳＹＫ、ＪＡＫ、ＰＩ３Ｋ、ＰＬＣγ、ＭＡＰＫ、ＭＥＫ、またはＮＦκＢの阻害剤を投与する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、被験体が修飾を有している場合、Ｃ４８１に結合しないＢＴＫの共有結合阻害剤を投与する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、被験体が修飾を有している場合、ＢＴＫの可逆的な阻害剤を投与する工程をさらに含む。

【0199】

いくつかの実施形態では、変異は、ＢＴＫのシステイン４８１をコード化するコドン中のミスセンス変異である。いくつかの実施形態において、変異は、アミノ酸位置４８１で別のアミノ酸とのシステインの置換をもたらすミスセンス変異である。いくつかの実施形態において、変異は、アミノ酸位置４８１でセリンに対するシステインの置換をもたらすミスセンス変異である。いくつかの実施形態では、変異は、システイン−４８１コドン、ＴＧＣ、からＴＣＣ（セリン）への置換をもたらす、グアニン−１６３５からシトシン−１６３５へのミスセンス変異である。いくつかの実施形態では、変異は、システイン−４８１コドン、ＴＧＣ、からＡＧＣ（セリン）への置換をもたらす、チミン（ｔ）−１６３４からアデニン（ａ）−１６３４へのミスセンス変異である。

【0200】

いくつかの実施形態では、被験体が、ＢＴＫポリペプチドのシステイン４８１で修飾をもたらすＢＴＫをコード化する内因性の遺伝子コ中に変異を獲得するかどうかを決定するために、被験体は、毎月、２か月ごと、３か月ごと、４か月ごと、５か月ごと、６か月ごと、７か月ごと、８か月ごと、９か月ごと、１０か月ごと、１１か月ごと、または、毎年、モニタリングされる。

【0201】

いくつかの実施形態では、血液の癌は、Ｂ細胞悪性腫瘍である。いくつかの実施形態では、癌は白血病、リンパ腫、または骨髄腫の中から選択される。いくつかの実施形態では、Ｂ細胞悪性腫瘍は、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、活性化したＢ細胞びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＡＢＣ−ＤＬＢＣＬ）、胚中心びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＧＣＢ ＤＬＢＣＬ）、縦隔原発Ｂ細胞リンパ腫（ＰＭＢＬ）、非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、濾胞性リンパ腫、免疫芽球性大細胞型リンパ腫、前駆Ｂリンパ芽球性リンパ腫、前駆Ｂ細胞急性リンパ性白血病、ヘアリーセル白血病、マントル細胞リンパ腫、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、リンパ形質細胞性リンパ腫／ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、脾臓周辺帯リンパ腫、形質細胞性骨髄腫、形質細胞腫、節外性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、節性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、縦隔（胸腺）大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、血管内大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、原発性滲出性リンパ腫、または、リンパ腫様肉芽腫症である。いくつかの実施形態では、被験体は固形腫瘍を患っている。いくつかの実施形態では、Ｂ細胞悪性腫瘍は慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）である。

【0202】

いくつかの実施形態では、維持療法は、多サイクルの投与を含む。いくつかの実施形態では、投与のサイクルは、１か月、２か月、３か月、４か月、６か月、６か月、７か月、８か月、９か月、１０か月、１１か月、１２か月以上である。いくつかの実施形態では、投与のサイクルは、そのサイクルにわたって、不可逆的なＢＴＫ阻害剤の１回の治療与量の投与を含む。いくつかの実施形態では、投与のサイクルは、サイクルにわたって、不可逆的なＢＴＫ阻害剤の２回以上の異なる投与量を含む。いくつかの実施形態では、不可逆的なＢＴＫ阻害剤の投与量は、連続するサイクルの間、異なる。いくつかの実施形態では、不可逆的なＢＴＫ阻害剤の投与量は、連続するサイクルの間、増加する。いくつかの実施形態では、不可逆的なＢＴＫ阻害剤の投与量は、連続するサイクルの間、同じである。

【0203】

いくつかの実施形態では、維持療法は、不可逆的なＢＴＫ阻害剤の一日の投与量の投与を含む。いくつかの実施形態では、投与される不可逆的なＢＴＫ阻害剤の一日の投与量は、１日当たり１０ｍｇから１日当たり約２０００ｍｇ、例えば、１日当たり約５０ｍｇから１日当たり約１５００ｍｇ、例えば、１日当たり約１００ｍｇから１日当たり約１０００ｍｇ、例えば１日当たり約２５０ｍｇから１日当たり約８５０ｍｇ、例えば１日当たり約３００ｍｇから１日当たり約６００ｍｇで投与される。特定の実施形態では、不可逆的なＢＴＫ阻害剤の維持量は１日当たり約８４０ｍｇである。特定の実施形態では、不可逆的な阻害剤がイブルチニブである場合、維持量は１日当たり約８４０ｍｇのイブルチニブである。特定の実施形態では、不可逆的なＢＴＫ阻害剤の維持量は１日当たり約５６０ｍｇである。特定の実施形態では、不可逆的な阻害剤がイブルチニブである場合、維持量は１日当たり約５６０ｍｇのイブルチニブである。特定の実施形態では、維持量は１日当たり約４２０ｍｇである。特定の実施形態では、不可逆的な阻害剤がイブルチニブである場合、維持量は１日当たり約４２０ｍｇのイブルチニブである。特定の実施形態では、不可逆的なＢＴＫ阻害剤の維持量は１日当たり約１４０ｍｇである。特定の実施形態では、不可逆的な阻害剤がイブルチニブである場合、維持量は１日当たり約１４０ｍｇのイブルチニブである。

【0204】

いくつかの実施形態では、不可逆的なＢＴＫ阻害剤は、１日１回、１日２回、１日３回、または、それ以上頻繁に投与される。特定の実施形態では、不可逆的なＢＴＫ阻害剤は、１日当たり１回投与される。いくつかの実施形態では、イブルチニブである不可逆的なＢＴＫ阻害剤は、１日１回、１日２回、１日３回、またはそれ以上頻繁に投与される。特定の実施形態では、イブルチニブである不可逆的なＢＴＫ阻害剤は１日１回投与される。

【0205】

いくつかの実施形態では、不可逆的なＢＴＫ阻害剤の投与量は経時的に増加する。いくつかの実施形態では、イブルチニブである不可逆的なＢＴＫ阻害剤の投与量は経時的に増加する。いくつかの実施形態では、不可逆的なＢＴＫ阻害剤の投与量は、あらかじめ決められた時間にわたって、約１．２５ｍｇ／ｋｇ／日から、約１２．５ｍｇ／ｋｇ／日に増加する。いくつかの実施形態では、イブルチニブである不可逆的なＢＴＫ阻害剤の投与量は、あらかじめ決められた時間にわたって、約１．２５ｍｇ／ｋｇ／日から、約１２．５ｍｇ／ｋｇ／日に増加する。いくつかの実施形態において、あらかじめ決められた時間は、１か月以上、２か月以上、３か月以上、４か月以上、５か月以上、６か月以上、７か月以上、８か月以上、９か月以上、１０か月以上、１１か月以上、１２か月以上、１８か月以上、２４か月以上、またはそれ以上である。

【0206】

いくつかの実施形態では、投与のサイクルは、追加の治療薬と組み合わせて、不可逆的なＢＴＫ阻害剤の投与を含む。いくつかの実施形態において、追加の治療薬は、不可逆的なＢＴＫ阻害と同時に、連続して、または、断続的に投与される。いくつかの実施形態において、追加の治療薬は抗ガン剤である。いくつかの実施形態において、追加の治療薬は、白血病、リンパ腫、または骨髄腫の処置のための抗癌剤である。共有結合のおよび／または不可逆的なＢＴＫ阻害剤と組み合わせて投与される典型的な抗癌剤は、本明細書にわたって提供される。特定の実施形態では、抗癌剤は抗ＣＤ２０抗体（例えば、リツキサン）である。特定の実施形態中では、抗癌剤はベンダムスチンである。いくつかの実施形態において、追加の抗癌剤は、不可逆的なＢＴＫ阻害剤である。いくつかの実施形態では、追加の抗癌剤は、ＢＴＫとの結合に関してシステイン４８１に依存しない、可逆的なＢＴＫ阻害剤である。いくつかの実施形態において、追加の抗癌剤はダサチニブである。

【0207】

いくつかの実施形態では、血液の癌の処置のために共有結合のおよび／または不可逆的なＢＴＫ阻害剤を用いた維持療法を受ける被験体が、治療に対する耐性を進行させたか、あるいは、進行させる可能性が高いかどうかをモニタリングする方法が提供されており、該方法は、（ａ）被験体からのＢＴＫポリペプチドをコード化する核酸分子を含むサンプルを試験する工程であって、それによって、コード化されたＢＴＫポリペプチドが配列番号：１と表記されるアミノ酸配列のアミノ酸位置４８１に対応するアミノ酸位置で修飾されているかどうかを決定する工程、および、（ｂ）被験体が修飾を有している場合、共有結合のおよび／または不可逆的なＢＴＫ阻害剤を用いた治療に対して耐性を有する、または、耐性を有するようになるとして、被験体を特徴づける工程、を含む。いくつかの実施形態では、工程（ａ）はエキソビボで行なわれる。いくつかの実施形態では、方法は、被験体が修飾を有している場合、ＢＴＫ阻害剤を用いた処置を中止する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、被験体が修飾を有していない場合、ＢＴＫ阻害剤を用いた処置を継続する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、被験体が修飾を有している場合、修飾されたキナーゼを阻害する第２世代のＢＴＫ阻害剤を投与する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、被験体が修飾を有している場合、ＬＹＮ、ＳＹＫ、ＪＡＫ、ＰＩ３Ｋ、ＰＬＣγ、ＭＡＰＫ、ＭＥＫ、またはＮＦκＢの阻害剤を投与する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、被験体が修飾を有している場合、Ｃ４８１に結合しないＢＴＫの共有結合阻害剤を投与する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、被験体が修飾を有している場合、ＢＴＫの可逆的な阻害剤を投与する工程をさらに含む。方法のいくつかの実施形態において、被験体は癌を患っている。いくつかの実施形態では、血液の癌は、Ｂ細胞悪性腫瘍である。典型的なＢ細胞悪性腫瘍が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、癌は白血病、リンパ腫、または骨髄腫の中から選択される。いくつかの実施形態において、方法は、被験体からのサンプルを得る工程をさらに含む。

【0208】

いくつかの実施形態では、血液の癌の処置のために共有結合のおよび／または不可逆的なＢＴＫ阻害剤を用いた維持療法を受ける被験体の治療を最適化する方法が提供され、該方法は、（ａ）被験体からのＢＴＫポリペプチドをコード化する核酸分子を含むサンプルを試験する工程であって、それによって、コード化されたＢＴＫポリペプチドが配列番号：１と表記されるアミノ酸配列のアミノ酸位置４８１に対応するアミノ酸位置で修飾されているかどうかを決定する工程、（ｂ）被験体が修飾を有している場合、共有結合のおよび／または不可逆的なＢＴＫ阻害剤を用いた処置を中止するか、あるいは、被験体が修飾を有していない場合、共有結合のおよび／または不可逆的なＢＴＫ阻害剤を用いた処置を継続する、工程を含む。いくつかの実施形態では、方法は、被験体が修飾を有している場合、修飾されたキナーゼを阻害する第２世代のＢＴＫ阻害剤を投与する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、被験体が修飾を有している場合、ＬＹＮ、ＳＹＫ、ＪＡＫ、ＰＩ３Ｋ、ＰＬＣγ、ＭＡＰＫ、ＭＥＫ、またはＮＦκＢの阻害剤を投与する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、被験体が修飾を有している場合、Ｃ４８１に結合しないＢＴＫの共有結合阻害剤を投与する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、被験体が修飾を有している場合、ＢＴＫの可逆的な阻害剤を投与する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、工程（ａ）はエキソビボで行なわれる。いくつかの実施形態では、血液の癌は、Ｂ細胞悪性腫瘍である。典型的なＢ細胞悪性腫瘍が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、癌は白血病、リンパ腫、または骨髄腫の中から選択される。いくつかの実施形態では、方法は、被験体からサンプルを得る工程をさらに含む。

【0209】

＜変異ＢＴＫと相互作用する分子の同定＞
本明細書では、変異ＢＴＫポリペプチドと相互に作用する薬剤のスクリーニングに、変異ＢＴＫポリペプチドを使用する方法が提供されている。いくつかの実施形態では、変異ＢＴＫポリペプチドと相互に作用する薬剤も変異ＢＴＫを阻害する。したがって、本明細書では、変異ＢＴＫ（すなわち、第２世代ＢＴＫ阻害剤）を阻害する薬剤のスクリーニングに、変異ＢＴＫポリペプチドを使用する方法が提供されている。いくつかの実施形態では、方法は、Ｂ細胞癌の処置のために第２世代のＢＴＫ阻害剤を同定するべく使用される。いくつかの実施形態では、方法は、例えば、イブルチニブのような共有結合のおよび／または不可逆的なＢＴＫ阻害剤を用いた処置に対して耐性を有するＢ細胞癌などの癌の処置のために、第２世代のＢＴＫ阻害剤の同定に使用される。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法を使用して同定された第２世代のＢＴＫ阻害剤は、野生型のＢＴＫポリペプチドも阻害する。したがって、いくつかの実施形態では、提供される方法を使用して同定された第２世代のＢＴＫ阻害剤は、変異ＢＴＫポリペプチドおよび野生型のＢＴＫポリペプチドを阻害する。いくつかの実施形態では、第２世代のＢＴＫ阻害剤は、野生型のＢＴＫポリペプチドの活性を抑制しない。

【0210】

いくつかの実施形態では、第２世代のＢＴＫ阻害剤を同定する方法は、（ａ）修飾されたＢＴＫを提供する工程であって、修飾されたＢＴＫが、配列番号：１と表記されたアミノ酸配列のアミノ酸位置４８１に対応するアミノ酸位置で修飾される、工程、（ｂ）修飾したＢＴＫを試験化合物に接触させる工程、および、（ｃ）ＢＴＫ活性の値を検知する工程であって、活性の減少は、化合物が修飾されたＢＴＫを阻害していることを示す、工程、を含む。いくつかの実施形態において、細胞は、ＢＴＫ活性の値を検知する前に、約１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、８時間、１０時間、１２時間、１４時間、１６時間、１８時間、２０時間、２２時間、２４時間以上、試験化合物と接触する。

【0211】

いくつかの実施形態では、ＢＴＫ中の修飾は、ＢＴＫポリペプチドのアミノ酸位置４８１でのアミノ酸の置換または欠失である。いくつかの実施形態では、修飾は、ＢＴＫポリペプチドのアミノ酸位置４８１で、ロイシン、イソロイシン、バリン、アラニン、グリシン、メチオニン、セリン、トレオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、プロリン、チロシン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、およびグルタミン酸の中から選択されたアミノ酸に、システインを置換することである。いくつかの実施形態では、修飾は、ＢＴＫポリペプチドのアミノ酸位置４８１において、セリン、メチオニン、およびトレオニンの中から選択されたアミノ酸に、システインを置換することである。いくつかの実施形態では、修飾は、ＢＴＫポリペプチドのアミノ酸位置４８１においてセリンにシステインを置換することである。したがって、いくつかの実施形態では、提供される方法を使用して同定された第２世代のＢＴＫ阻害剤は、ＢＴＫポリペプチドのアミノ酸位置４８１で修飾を有する変異ＢＴＫポリペプチドを阻害する。いくつかの実施形態では、提供される方法を使用して同定された第２世代のＢＴＫ阻害剤は、ＢＴＫポリペプチドのアミノ酸位置４８１でセリンを有する変異ＢＴＫポリペプチドを阻害する。いくつかの実施形態では、提供される方法を使用して同定された第２世代のＢＴＫ阻害剤は、野生型のＢＴＫポリペプチドを阻害する。

【0212】

いくつかの実施形態では、ＢＴＫ活性の値を検知することは、生体外のキナーゼアッセイによって評価される。いくつかの実施形態では、キナーゼアッセイで使用される基質はＰＬＣγである。いくつかの実施形態では、キナーゼアッセイで使用される基質は、ペプチド基質である。いくつかの実施形態では、修飾されたＢＴＫがイブルチニブのような特定の不可逆的な阻害剤を用いた阻害に対して耐性を有する場合、阻害剤は比較のための対照として使用される。いくつかの実施形態では、野生型のＢＴＫポリペプチドは比較のために使用される。

【0213】

いくつかの実施形態では、ＢＴＫ活性の値の検知は、ＢＴＫの直接の基質のリン酸化の値、または、細胞内のＢＴＫキナーゼ・カスケード中のリン酸化した標的の値を測定することによって評価される、いくつかの実施形態では、細胞はＢリンパ球、単球、またはマクロファージである。いくつかの実施形態では、細胞は、リンパ腫、白血病、または骨髄腫細胞株のような癌細胞株である。いくつかの実施形態では、細胞株は、ＭＣＬ、ＤＢＣＬ、または濾胞性リンパ腫細胞株である。いくつかの実施形態では、細胞株は、ＤＴ４０ ＢＴＫノックアウト細胞株のようなＢＴＫノックアウトＢリンパ腫細胞株である。いくつかの実施形態では、リン光体に特異的な抗体は、試験化合物のある状態またはない状態で、細胞中のＰＬＣγ、ＥＲＫ１／２（ＭＡＰＫ）、および、ＡＫＴなどの特定のＢＴＫ標的のリン酸化の値を検知するために使用される。いくつかの実施形態では、細胞はまず、試験化合物への曝露の前、最中に、後に、ＢＣＲシグナル伝達経路を活性化するために刺激される。いくつかの実施形態において、細胞は、試験化合物への曝露の前、最中に、後に、ＢＣＲシグナル伝達経路を活性化するために、抗ＩｇＭまたは抗ＩｇＧ治療で最初に刺激される。リン酸化されたタンパク質を検知する方法は当該技術では知られており、例えば、ウェスタンブロット法または免疫組織化学法を含んでいる。

【0214】

いくつかの実施形態では、修飾されたＢＴＫポリペプチドは、修飾されたＢＴＫポリペプチドを発現する宿主細胞から精製される。いくつかの実施形態では、修飾されたＢＴＫポリペプチドは組換えタンパク質である。いくつかの実施形態では、精製されたＢＴＫは、ＢＴＫ活性の値を試験するために使用される。いくつかの実施形態では、修飾されたＢＴＫポリペプチドは、免疫親和性またはクロマトグラフィーによって精製される。

【0215】

いくつかの実施形態では、修飾されたＢＴＫポリペプチドをコード化する核酸でトランスフェクトされ得、かつ、ＢＴＫ活性をモニタリングすることができる宿主細胞株が、該方法で使用される。いくつかの実施形態では、宿主細胞は野生型のＢＴＫを発現しない。いくつかの実施形態では、宿主細胞は内因性の野生型のＢＴＫの発現には不十分である。いくつかの実施形態では、修飾されたＢＴＫポリペプチドを発現する宿主細胞は、修飾されたＢＴＫポリペプチドを安定的に発現する。いくつかの実施形態では、修飾されたＢＴＫポリペプチドをコード化する核酸は、細胞のゲノムに統合される。

【0216】

いくつかの実施形態では、宿主細胞は、ニワトリのＤＴ４０ ＢＴＫ−／−Ｂ細胞またはヒトＢＴＫ−／−Ｂ細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は非Ｂ細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は哺乳動物の非Ｂ細胞である。いくつかの実施形態では、細胞はＣＨＯ細胞またはＪｕｒｋａｔＴ細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は非哺乳動物の細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、昆虫細胞、細菌細胞、酵母細胞、または、植物細胞である。

【0217】

いくつかの実施形態では、ＢＴＫ活性の値は、共有結合のおよび／または不可逆的なＢＴＫ阻害剤を用いた処置に対して耐性を有する細胞株を使用して評価される。いくつかの実施形態では、細胞株は、共有結合のおよび／または不可逆的なＢＴＫ阻害剤を用いた長期的な曝露による耐性について選択された、耐性を有するＭＣＬ（例えば、ＭｉｎｏまたはＪｅｋｏ）、ＤＬＢＣＬ（例えば、ＯＣＩ−Ｌｙ１、ＯＣＩ−Ｌｙ２、ＯＣＩ−Ｌｙ３、ＯＣＩ−Ｌｙ４、ＯＣＩ−Ｌｙ６、ＯＣＩ−Ｌｙ７、ＯＣＩ−Ｌｙ１０、ＯＣＩ−Ｌｙ１８、ＯＣＩ−Ｌｙ１９、Ｕ２９３２、ＨＢＬ−１、ＲＩＶＡまたはＴＭＤ８）、または、濾胞性リンパ腫（例えば、ＤｏＨＨ２、Ｇｒａｎｔａ ５１９、またはＨＦ−１）細胞株である。いくつかの実施形態では、選択はインビトロで行われる。いくつかの実施形態では、選択は、癌細胞を投与された動物モデルにおいてインビボで行なわれる。いくつかの実施形態では、耐性を有するＭＣＬまたはＤＬＢＣＬ細胞株は、アミノ酸位置Ｃ４８１でのＢＴＫの修飾を包含している。いくつかの実施形態では、修飾はＣ４８１Ｓである。

【0218】

Ｂｔｋ阻害のための細胞機能性アッセイは、様々な濃度の候補であるＢｔｋ阻害剤化合物の不在下または存在下で、細胞株におけるＢｔｋ媒介性の経路を刺激すること（例えば、ラモス細胞のＢＣＲ活性化）に反応して１つ以上の細胞のエンドポイントを測定することを含んでいる。ＢＣＲ活性化に対する反応を決定するための有用なエンドポイントは、例えば、Ｂｔｋの自己リン酸化、Ｂｔｋ標的タンパク質（例えばＰＬＣ−γ）のリン酸化、および、細胞質のカルシウム流出を含んでいる。

【0219】

いくつかの実施形態では、下流の転写標的アッセイは、試験化合物の存在下または不在下で、ＢＴＫ活性を決定するために使用される。いくつかの実施形態では、下流の転写標的アッセイは、ＮＦ−κＢベースのアッセイである。いくつかの例において、レポータータンパク質をコード化する遺伝子は、ＢＣＲ経路シグナル伝達に高感度なＮＦ−κＢ反応性プロモーターに動作可能に結合され、ＢＴＫが阻害されると阻害される。いくつかの実施形態では、レポーター遺伝子は、ルシフェラーゼの中から選択されたタンパク質、蛍光タンパク質、生物発光タンパク質、または酵素をコード化する。いくつかの実施形態では、アッセイは、レポーターおよび変異ＢＴＫを含む宿主細胞を含んでいる。試験化合物の存在下または不在下で遺伝子発現の値を検出することは、試験化合物が変異ＢＴＫの存在下でＢＣＲ経路を阻害するかどうか示している。いくつかの実施形態では、試験化合物は変異ＢＴＫを直接阻害する。

【0220】

多くの無細胞生化学的アッセイ（例えばキナーゼアッセイ）と、細胞機能性アッセイ（例えばカルシウム流出）のためのハイスループットアッセイが、当業者に周知である。さらに、ハイスループットスクリーニング・システムは、市販で入手可能である（例えば Ｚｙｍａｒｋ Ｃｏｒｐ．， Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ， ＭＡ； Ａｉｒ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ， Ｍｅｎｔｏｒ， ＯＨ； Ｂｅｃｋｍａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ， Ｉｎｃ． Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ， ＣＡ； Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｉｎｃ．， Ｎａｔｉｃｋ， ＭＡ等を参照）。これらのシステムは、一般に、アッセイに適切な検出器における、サンプルと試薬のピペッティング、液体の分注、時間制限を設けたインキュベーション、マイクロプレートの最終的な数値のリード数を含む、全体の手順を自動化する。自動化システムによって、過度に努力することなく、多くのＢｔｋ阻害剤化合物の同定と特徴付けを可能にする。

【0221】

いくつかの実施形態では、ＢＴＫ活性の値の検知はインビボのアッセイによって評価される。いくつかの実施形態では、ＢＴＫ活性の値の検知は、動物モデルで評価される。いくつかの実施形態において、動物モデルは、白血病のマウスモデルの１つである。そのような動物モデルは当該技術では知られており、例えば、ＡＭＬおよびＣＬＬのマウスモデルを含んでいる（例えば、Ｚｕｂｅｒ， （２００９） Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ２３（７）：８７７−８９ ａｎｄ Ｐｅｋａｒｓｋｙ ｅｔ ａｌ． （２００７） Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ． １００（５）：１１０９−１８を参照）。いくつかの実施形態において、動物モデルは、システイン４８１で修飾される修飾されたＢＴＫを発現する遺伝子導入動物である。いくつかの実施形態では、試験化合物は、システイン４８１で修飾される修飾されたＢＴＫを発現する遺伝子導入動物に投与され、ＢＴＫの活性は本明細書に記載の１つ以上のアッセイによって評価される。いくつかの実施形態では、アッセイは、試験化合物を投与された遺伝子導入動物から単離したＢＴＫポリペプチド用いて行なわれるキナーゼアッセイであり、対照と比較された。いくつかの実施形態では、１つ以上のＢＴＫ標的のリン酸化の値は、試験化合物を投与された遺伝子導入動物からのＢ細胞サンプル中で評価され、対照と比較された。いくつかの実施形態では、対照は、試験化合物を投与されていない動物からのサンプルである。いくつかの実施形態では、対照は、共有結合のおよび／または不可逆的なＢＴＫ阻害剤を投与された動物からのサンプルである。

【0222】

＜キット製品＞
本明細書に記載の診断および治療用途で使用するために、キットおよび製品も本明細書中で記載される。このようなキットは、例えば、バイアル、チューブなどの１以上の容器を収容するために仕切られた運搬装置、包装、あるいは、容器を含み、容器の各々は、本明細書に記載の方法で使用される個別の要素の１つを含む。適切な容器としては、例えば、ボトル、バイアル、注射器、および、試験管を含む。容器は、例えば、ガラスまたはプラスチックなどの任意の許容可能な物質から形成される。

【0223】

いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるキットは、被験体中の修飾されたＢＴＫポリペプチドをコード化する核酸を検知するためにしようされるか、あるいは、被験体中の修飾されたＢＴＫポリペプチドを検出するために使用される。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるキットは、１つ以上の共有結合のおよび／または不可逆的なＢＴＫ阻害剤を用いて診断に役立つガイドとして使われる。いくつかの実施形態において、キットは、第２世代のＢＴＫアンタゴニストを用いた処置について患者を選択するために、共有結合のおよび／または不可逆的なＢＴＫ阻害剤に対する耐性を有するとして、または、耐性を有する可能性が高いとして被験体を識別するために、共有結合のおよび／または不可逆的なＢＴＫ阻害剤に対する耐性の進行をモニタリングするために、あるいは、これらの組み合わせのために、用いられる。本明細書で提供されるキットは、修飾されたＢＴＫポリペプチドをコード化する核酸を検出するために、修飾されたＢＴＫポリペプチドを検出するために、被験体からの細胞のＢＴＫ活性を検出するために、生体外またはインビボでＢＴＫ活性を検出するために、あるいは、これらの組み合わせのために、１つ以上の試薬を含む。典型的な試薬は、限定されないが、オリゴヌクレオチド、ＰＣＲ試薬、緩衝液、抗体、キナーゼ活性を決定するためのＢＴＫ基質、酵素の染色のための基質、色素原（ｃｈｒｏｍａｇｅｎｓ）または他の材料、例えば、スライド、容器、マイクロタイタープレート、および、随意に、方法を実施するための指示書を含む。当業者は、様々な材料を接触させるために使用することができる他の多くの可能な容器およびプレートおよび試薬を認識するであろう。キットはさらに対照サンプル、例えば、核酸またはタンパク質、例えば、本明細書で提供される変異ＢＴＫポリペプチド、本明細書で提供される修飾されたＢＴＫポリペプチドをコード化する核酸などを含むことができる。いくつかの実施形態では、キットは、変異ＢＴＫ発現の検出のためのオリゴヌクレオチドプライマーの１以上のセットを含む。

【0224】

いくつかの実施形態では、容器は、本明細書に記載の方法によって同定された１つ以上の共有結合のおよび／または不可逆的なＢＴＫ阻害剤、あるいは、１つ以上の第２世代のＢＴＫ阻害剤を、随意に、本明細書に開示されるように、組成物中において、または、別の薬剤と組み合わせて、含むことができる。容器は、随意に、投与のためのシリンジ、針、投薬カップまたはバイアルのような材料を有している。このようなキットは随意に、本明細書中に記載の方法での使用に関する、同定についての記載、ラベル、または取扱説明書とともに、化合物を含む。

【0225】

いくつかの実施形態では、キットは、配列番号：１と表記されたアミノ酸配列のアミノ酸位置４８１に対応するアミノ酸位置で修飾を含むＢＴＫ活性を有する修飾されたＢＴＫポリペプチドまたはその変異体を含む。いくつかの実施形態では、修飾は、ＢＴＫポリペプチドのアミノ酸位置４８１においてセリンにシステインを置換することである。いくつかの実施形態では、キットは、本明細書で提供される修飾されたＢＴＫポリペプチドをコード化する単離した任意の核酸、または、そのような核酸を含むベクターを含んでいる。いくつかの実施形態では、修飾は、ＢＴＫポリペプチドのアミノ酸位置４８１においてセリンにシステインを置換することである。

【0226】

いくつかの実施形態において、キットは、本明細書で提供される修飾されたＢＴＫポリペプチド、または、本明細書で提供される修飾されたＢＴＫポリペプチドをコード化する核酸を含むマイクロチップを含んでいる。いくつかの実施形態では、修飾は、ＢＴＫポリペプチドのアミノ酸位置４８１においてセリンにシステインを置換することである。

【0227】

＜共有結合のおよび／または不可逆的なＢＴＫ阻害剤を用いた処置に対して耐性を有する細胞株の産生＞
本明細書では、共有結合のおよび／または不可逆的なＢＴＫ阻害剤を用いた処置に対して耐性を有するＢ細胞癌細胞株を産生する方法が提供される。いくつかの実施形態では、Ｂ細胞癌細胞株は、野生型のＢＴＫのシステイン４８１に共有結合する共有結合のおよび／または不可逆的なＢＴＫ阻害剤を用いた処置に対して耐性を有する。いくつかの実施形態では、Ｂ細胞癌細胞株は、イブルチニブ、ＰＣＩ−４５２９２、ＰＣＩ−４５４６６、ＡＶＬ−１０１、ＡＶＬ−２９１、ＡＶＬ−２９２、またはＯＮＯ−ＷＧ−３７を用いた処置に対して耐性を有する。いくつかの実施形態では、Ｂ細胞癌細胞株はイブルチニブを用いた処置に対して耐性を有する。いくつかの実施形態では、提供される方法によって生成された耐性を有する細胞株は、修飾されたＢＴＫタンパク質を発現する。いくつかの実施形態では、ＢＴＫタンパク質は、配列番号：１と表記されたアミノ酸配列のアミノ酸位置４８１に対応するアミノ酸位置で修飾される。

【0228】

いくつかの実施形態では、方法は、共有結合のおよび／または不可逆的なＢＴＫ阻害剤にＢ細胞癌細胞株（すなわち親の細胞株）を接触させる工程と、あらかじめ決められた時間にわたって細胞を培養する工程を含む。いくつかの実施形態では、方法は、あらかじめ決められた時間にわたって、不可逆的なＢＴＫ阻害剤の濃度を増加させて細胞を培養する工程を含む。いくつかの実施形態では、不可逆的なＢＴＫ阻害剤の濃度は、約０．０１μＭから約１００μＭ、例えば、０．１μＭから約１０μＭまでに及ぶ。いくつかの実施形態では、細胞は、不可逆的なＢＴＫ阻害剤の約０．０５μＭ、０．１μＭ、０．５μＭ、および１μＭで培養されている。いくつかの実施形態では、不可逆的なＢＴＫ阻害剤の濃度は、２、３、４、５、６、７、８、９または１０倍以上増加させる。いくつかの実施形態では、不可逆的なＢＴＫ阻害剤の濃度を３倍増加させる。いくつかの実施形態では、細胞は、不可逆的なＢＴＫ阻害剤の存在下で、１日、２日、３日、４日、５日、６日、１週、２週、３週、４週、１か月、１．５か月、２か月、２．５か月、３か月以上、培養される。いくつかの実施形態では、細胞は、２日ごと、３日ごと、４日ごと、５日ごと、６日ごと、毎週、または、それ以上に、分けられ、再度蒔かれる。いくつかの実施形態では、不可逆的なＢＴＫ阻害剤を含む培地は、毎日、２日ごとに、３日ごとに、４日ごとに、５日ごとに、６日ごとに、毎週、または、それ以上に、一新する。いくつかの実施形態では、不可逆的なＢｔｋ阻害剤は、野生型のＢｔｋのシステイン４８１と共有結合する。いくつかの実施形態では、不可逆的なＢＴＫ阻害剤は、イブルチニブ、ＰＣＩ−４５２９２、ＰＣＩ−４５４６６、ＡＶＬ−１０１、ＡＶＬ−２９１、ＡＶＬ−２９２、またはＯＮＯ−ＷＧ−３７である。いくつかの実施形態において、不可逆的なＢＴＫ阻害剤はイブルチニブである。

【0229】

いくつかの実施例において、親のＢ細胞癌細胞株は、白血病、リンパ腫、または骨髄腫の細胞株である。いくつかの実施例において、親のＢ細胞癌細胞株は、ＤＬＢＣＬ細胞株である。典型的なＤＬＢＣＬ細胞株は、限定されないが、ＯＣＩ−ＬＹ１０、ＯＣＩ−Ｌｙ３、Ｕ２９３２、ＲＩＶＡ、ＨＢＬ−１またはＴＭＤ８細胞株を含むＡＢＣ−ＤＬＢＣＬ細胞株、および、限定されないが、ＯＣＩ−Ｌｙ１９またはＯＣＩ−Ｌｙ７を含むＧＣＢ−ＤＬＢＣＬ細胞株を含んでいる。いくつかの実施例において、親のＢ細胞癌細胞株はＭＣＬ細胞株である。一般的なＭＣＬ細胞株は、限定されないが、ＭｉｎｏおよびＪｅｋｏ細胞株を含む。いくつかの実施例において、親のＢ細胞癌細胞株は、濾胞性リンパ腫細胞株である。典型的な濾胞性リンパ腫細胞株は、限定されないが、ＤｏＨＨ２、Ｇｒａｎｔａ ５１９、および、ＨＦ−１細胞株を含んでいる。

【0230】

いくつかの実施形態では、耐性を有する細胞株は、Ｂ細胞受容体経路活性化の増加によって同定される。いくつかの実施形態では、Ｂ細胞受容体経路活性化の増加は、処置された細胞株の下流の標的が、イブルチニブの存在下の親の細胞株と比較して、イブルチニブの存在下でリン酸化の増加を示すかどうかを試験することによって、同定される。いくつかの実施例において、リン酸化された下流の標的は、リン酸化されたＲＡＦまたはリン酸化されたＭＥＫである。いくつかの実施形態では、耐性を有する細胞株は、イブルチニブのみを用いた処置に対して耐性を有するが、イブルチニブとＭＥＫ阻害剤を用いた処置には感度が高い。

【0231】

＜イブルチニブ耐性を有する患者における非ＢＴＫ変異−その検出、組成物、およびその用途＞
本明細書に記載されるように、特定の例において、ＢＴＫ以外のタンパクの変異は、例えば、共有結合のおよび／または不可逆阻害剤のようなＢＴＫ阻害剤を用いた処置に対して患者の耐性をもたらす。いくつかの実施形態では、変異は、ＢＴＫ経路の下流のエフェクタータンパク質にある。いくつかの実施形態では、変異は機能獲得型変異である。いくつかの実施形態では、変異は、ＢＴＫ経路の下流のエフェクタータンパク質の構成的な活性化を生じさせる。

【0232】

ＰＬＣγ

【0233】

いくつかの実施形態では、下流のエフェクタータンパク質は、ホスホリパーゼＣγ２（ＰＬＣγ２）である。ＰＬＣは、リン脂質ホスファチジルイノシトール４，５−ビスリン酸（ＰＩＰ２）を切断して、ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）とイノシトール１，４，５−トリスホスファート（ＩＰ３）にする。ＤＡＧは、薄膜に結合したままであり、ＩＰ３は可溶性構造として細胞質ゾルに放出される。その後、ＩＰ３は細胞質ゾルを介して拡散し、ＩＰ３受容体、滑面小胞体（ＥＲ）中の特定のカルシウムチャネルに結合する。これにより、カルシウムの細胞質ゾルの濃度は増加し、細胞内の変化および活性のカスケードが生じる。加えて、カルシウムとＤＡＧは一緒に作用してプロテインキナーゼＣを活性化し、これが他の分子ＢＴＫキナーゼ経路をリン酸化して、細胞活動を変化させる。いくつかの実施形態では、変異ＰＬＣγ２ポリペプチドは、構造的に活性である（すなわち、ＢＴＫによるリン酸化を必要としない）。

【0234】

いくつかの実施形態では、ＰＬＣγ２内の変異は、ＢＴＫ阻害剤を用いた処置に対して患者の耐性をもたらす。いくつかの実施形態では、変異はＰＬＣγ２中の機能獲得型変異である。いくつかの実施形態では、変異はＰＬＣγ２の構成的な活性化をもたらす。いくつかの実施形態では、ＰＬＣγ２の構成的な活性化は、細胞内のカルシウムの動員、細胞外のシグナル制御されたキナーゼ（ＥＲＫ）の活性化、および、ｃ−Ｊｕｎ ＮＨ２末端基キナーゼ（ＪＮＫ）マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）経路をもたらす。いくつかの実施形態では、ＰＬＣγ２中の変異は、ＰＬＣγ２中の位置Ｒ６６５に対応するアミノ酸中のアミノ酸置換をもたらす。いくつかの実施形態では、ＰＬＣγ２中の変異は、トリプトファン（Ｒ６６５Ｗ）へのアルギニンの置換をもたらす。いくつかの実施形態では、ＰＬＣγ２中の変異は、ＰＬＣγ２中の位置Ｓ７０７に対応するアミノ酸中のアミノ酸置換をもたらす。いくつかの実施形態では、ＰＬＣγ２中の変異は、フェニルアラニン（Ｓ７０７Ｆ）へのセリンの置換をもたらす。

【0235】

修飾されたＢＴＫポリペプチドの検出のための本明細書で提供される方法のいずれかは、ＰＬＣγ２ポリペプチドの検出に適用することができる。例えば、変異ＰＬＣγ２ポリペプチドは、変異ＰＬＣγ２ポリペプチドの検出のために、ゲノムまたはＰＬＣγ２の変異特異的な抗体において体細胞変異を検出するために変異特異的な核酸を使用して、ＰＣＲ方法によって検知することができる。

【0236】

いくつかの実施形態では、変異ＰＬＣγ２ポリペプチドをコード化する核酸が提供される。いくつかの実施形態では、変異ＰＬＣγ２ポリペプチドをコード化する核酸ベクターが提供される。いくつかの実施形態において、ベクターはウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、変異ＰＬＣγ２ポリペプチドをコード化する核酸を含む宿主細胞が提供される。いくつかの実施形態では、発現されたＰＬＣγ２ポリペプチドを含む宿主細胞が提供される。

【0237】

本明細書で提供される方法、および、核酸発現ベクターと宿主細胞の使用を含む、本明細書で提供される修飾されたＢＴＫポリペプチドと核酸の産生の技術で知られている方法のいずれかは、本明細書に提供される変異ＰＬＣγ２ポリペプチドと核酸の産生にも適用することができる。

【0238】

本明細書では、変異ＰＬＣγ２ポリペプチドが提供される。いくつかの実施形態では、変異ＰＬＣγ２ポリペプチドは組換えタンパク質である。いくつかの実施形態では、変異ＰＬＣγ２ポリペプチドは宿主細胞から精製される。

【0239】

いくつかの実施形態では、変異ＰＬＣγ２ポリペプチドは、ＢＴＫ阻害剤による阻害に対して耐性を与える、１つ以上のアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、変異ＰＬＣγ２ポリペプチドは、イブルチニブ、ＰＣＩ−４５２９２、ＰＣＩ−４５４６６、ＡＶＬ−１０１、ＡＶＬ−２９１、ＡＶＬ−２９２、またはＯＮＯ−ＷＧ−３７である、共有結合のおよび／または不可逆的なＢＴＫ阻害剤による阻害に対して耐性を与える、１つ以上のアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、変異ＰＬＣγ２ポリペプチドは、ＢＴＫ阻害剤による阻害に対して耐性を与える、１つ以上のアミノ酸置換を包含している。

【0240】

本明細書では、配列番号：１１と表記されたアミノ酸配列のアミノ酸位置６６５または７０７に対応するアミノ酸位置で修飾を含むＰＬＣγ２活性を有する単離したＰＬＣγ２ポリペプチドまたはその変異体が提供される。

【0241】

いくつかの実施形態では、修飾は、配列番号：１１と表記された野性型ＰＬＣγ２と比較して、アミノ酸位置６６５または７０７でアミノ酸の置換または欠失を含む。いくつかの実施形態では、修飾は、配列番号：１１と表記された野性型ＰＬＣγ２と比較して、位置６６５または７０７でアミノ酸の置換を含む。いくつかの実施形態では、修飾は、ＰＬＣγ２ポリペプチドのアミノ酸位置６６５で、ロイシン、イソロイシン、バリン、アラニン、グリシン、メチオニン、システイン、トレオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、リジン、セリン、ヒスチジン、プロリン、チロシン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、および、グルタミン酸の中から選択されたアミノ酸へ、位置６６５でアルギニンを置換することである。いくつかの実施形態では、修飾は、ＰＬＣγ２ポリペプチドのアミノ酸位置６６５においてトリプトファンへアルギニンを置換することである。いくつかの実施形態では、置換はＲ６６５Ｗである。いくつかの実施形態では、修飾は、ＰＬＣγ２ポリペプチドのアミノ酸位置７０７で、ロイシン、イソロイシン、バリン、アラニン、グリシン、メチオニン、システイン、トレオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、プロリン、チロシン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、および、グルタミン酸の中から選択されたアミノ酸へ、位置７０７でアルギニンを置換することである。いくつかの実施形態では、修飾は、ＰＬＣγ２ポリペプチドのアミノ酸位置７０７においてフェニルアラニンへセリンを置換することである。いくつかの実施形態では、置換はＳ７０７Ｗである。

【0242】

いくつかの実施形態では、変異ＰＬＣγ２ポリペプチドは、配列番号：１１と表記された野性型ＰＬＣγ２と比較して、位置６６５または７０７でアミノ酸の置換と、１つ以上の追加のアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、変異ＰＬＣγ２ポリペプチドは、アミノ酸位置６６５または７０７での修飾と、１つ以上の追加のアミノ酸位置での修飾を含む。いくつかの実施形態では、変異ＰＬＣγ２ポリペプチドは、アミノ酸位置６６５または７０７での修飾と、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７の、１８、１９、または２０以上アミノ酸位置での修飾とを含む。いくつかの実施形態では、アミノ酸位置６６５での修飾は、Ｒ６６５Ｗである置換である。いくつかの実施形態では、アミノ酸位置７０７での修飾は、Ｓ７０７Ｆである置換である。

【0243】

いくつかの実施形態では、ＰＬＣγ２ポリペプチドは、配列番号：１１と表記された野生型のＰＬＣγ２ポリペプチドのアミノ酸位置６６５または７０７での修飾を含み、ペプチドタグに結合する。いくつかの実施形態では、ペプチドタグは、タグに特異的な抗体によって認識されるエピトープタグである。いくつかの実施形態において、タグは、エピトープタグ、例えば、限定されないが、ｃ−ｍｙｃ、Ｖ−５、ヘマグルチニン（ＨＡ）、ＦＬＡＧ、タグである。いくつかの実施形態において、タグは、アフィニティータグ、例えば、限定されないが、ビオチン、ｓｔｒｅｐ−タグ、キチン結合タンパク質（ＣＢＰ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、グルタチオン−Ｓ−転移酵素（ＧＳＴ）、または、ポリ（Ｈｉｓ）タグである。いくつかの実施形態では、ＰＬＣγ２ポリペプチドは、配列番号：１１と表記された野生型のＰＬＣγ２ポリペプチドのアミノ酸位置６６５または７０７での修飾を含み、検知可能なタンパク質または部分、例えば、発光、化学発光、生物発光、蛍光のタンパク質または部分に結合する。いくつかの実施形態では、蛍光タンパク質は、緑（ＧＦＰ）、赤（ＲＦＰ）、シアン（ＣＦＰ）、黄色（ＹＦＰ）、または青（ＢＦＰ）の蛍光のタンパク質である。いくつかの実施形態では、ＰＬＣγ２ポリペプチドは、配列番号：１１と表記された野生型のＰＬＣγ２ポリペプチドのアミノ酸位置６６５または７０７での修飾を含み、酵素（例えば、ルシフェラーゼ、または、β−ガラクトシダーゼ）に結合する。

【0244】

本明細書では、変異ＰＬＣγ２ポリペプチドをコード化する核酸が提供される。本明細書では、本明細書に記載される変異ＰＬＣγ２ポリペプチドのいずれかをコード化する核酸が提供される。特定のポリペプチドをコード化する核酸を推定する方法は、当該技術では知られており、標準的な分子生物学技術を含んでいる。本明細書で提供される変異ＰＬＣγ２ポリペプチドをコード化する典型的な核酸が提供されている。遺伝子コードの縮重により、同じポリペプチドをコード化する多くの変異体核酸が存在すると理解されている。本明細書で提供される変異ＰＬＣγ２ポリペプチドをコード化する核酸は、そのような変異体を含んでいる。

【0245】

いくつかの実施形態では、本明細書で提供される修飾されたＰＬＣγ２ポリペプチドをコード化する核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡの分子である。いくつかの実施形態では、変異ＰＬＣγ２ポリペプチドをコード化する核酸は、コード化されたポリペプチドが配列番号：１１と表記される野生型のＰＬＣγ２ポリペプチドのアミノ酸位置６６５または７０７に対応する位置でアミノ酸アルギニンの置換を含む修飾を含んでいる。いくつかの実施形態では、核酸は、配列番号：１２と表記される核酸の配列を含み、位置６６５でアミノ酸をコード化する核酸コドンは修飾され、それによって、コドンは、アルギニン、または、配列番号：１２と表記される配列を有するポリペプチドと少なくともまたは少なくとも約６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を有する変異体を、コード化せず、位置６６５でアミノ酸をコード化する核酸コドンは、アルギニンををコード化せず、あるいは、位置７０７でアミノ酸をコード化する核酸コドンはセリンをコード化しない。

【0246】

いくつかの実施形態において、核酸修飾は、ミスセンス変異であるか、または、ＰＬＣγ２ポリペプチドをコード化する１つ以上のコドンの欠失である。いくつかの実施形態では、修飾は、ＰＬＣγ２ポリペプチドのアミノの位置６６５でアルギニンをコード化する核酸コドンを変更するミスセンス変異である。いくつかの実施形態では、修飾は、ＰＬＣγ２ポリペプチドのアミノの位置７０７でセリンをコード化する核酸コドンを変更するミスセンス変異である。

【0247】

いくつかの実施形態では、ＰＬＣγ２ポリペプチドのアミノの位置６６５でアルギニンをコード化する核酸コドンは、ＣＧＴ、ＣＧＣ、ＣＧＡ、ＣＧＧ、ＡＧＡ、またはＡＧＧである。いくつかの実施形態では、修飾は、ＰＬＣγ２ポリペプチドのアミノの位置６６５でアルギニンをコード化する核酸コドンを、トリプトファンをコード化する核酸コドンに変更する。いくつかの実施形態では、トリプトファンをコード化する核酸コドンは、ＴＧＧである。

【0248】

いくつかの実施形態では、ＰＬＣγ２ポリペプチドのアミノの位置７０７でセリンをコード化する核酸コドンは、ＴＣＴ、ＴＣＣ、ＴＣＡ、ＴＣＧ、ＡＧＴ、またはＡＧＣである。いくつかの実施形態では、修飾は、ＰＬＣγ２ポリペプチドのアミノの位置７０７でセリンをコード化する核酸コドンを、フェニルアラニンをコード化する核酸コドンに変更する。いくつかの実施形態では、フェニルアラニンをコード化する核酸コドンは、ＴＴＴまたはＴＴＣである。

【0249】

いくつかの実施形態では、方法は、被験体が、ＢＴＫ阻害剤を用いた治療に反応しないか、または、反応しなくなる可能性が高いかどうかを決定し、該方法は、（ａ）被験体からのＰＬＣγ２ポリペプチドをコード化する核酸分子を含むサンプルを試験する工程であって、それによって、コード化されたＰＬＣγ２ポリペプチドが、配列番号：１１と表記されたアミノ酸配列のアミノ酸位置６６５または７０７に対応するアミノ酸位置で修飾されているかどうかを決定する、工程、および、（ｂ）被験体が修飾を有している場合、被験体がＢＴＫ阻害剤による治療に対する耐性を有するか、あるいは、耐性を有するようになる可能性が高いとして被験体を特徴づける工程、を含む。いくつかの実施形態では、方法は、被験体からサンプルを得る工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、修飾は、ＰＬＣγ２中にＲ６６５ＷまたはＳ７０７Ｆの置換を含む。いくつかの実施形態において、ＢＴＫ阻害剤は、共有結合性のまたは不可逆な阻害剤である。

【0250】

本明細書では、特定の実施形態において、癌の処置のためにＢＴＫ阻害剤を投与される被験体が、治療に対する耐性を生じさせたか、または、生じさせる可能性が高いかどうかをモニタリングする方法が記載されており、該方法は、（ａ）被験体からのＰＬＣγ２ポリペプチドをコード化する核酸分子を含むサンプルを試験する工程であって、それによって、コード化されたＰＬＣγ２ポリペプチドが、配列番号：１１と表記されたアミノ酸配列のアミノ酸位置６６５または７０７に対応するアミノ酸位置で修飾されているかどうかを決定する、工程、および、（ｂ）被験体が修飾を有している場合、ＢＴＫ阻害剤による治療に対する耐性を有する、または、有するようになる可能性が高いと被験体を特徴づける工程、を含む。いくつかの実施形態では、方法は、被験体が修飾を有している場合、ＢＴＫ阻害剤を用いた処置を中止する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、被験体が修飾を有していない場合、ＢＴＫ阻害剤を用いた処置を継続する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、被験体からサンプルを得る工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、被験体が修飾を有している場合、ＬＹＮ、ＳＹＫ、ＪＡＫ、ＰＩ３Ｋ、ＭＡＰＫ、ＭＥＫ、またはＮＦκＢの阻害剤を投与する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、修飾は、ＰＬＣγ２中にＲ６６５ＷまたはＳ７０７Ｆの置換を含む。いくつかの実施形態において、ＢＴＫ阻害剤は、共有結合性のまたは不可逆な阻害剤である。

【0251】

本明細書では、特定の実施形態において、癌の処置のために不可逆的なＢＴＫ阻害剤を投与される被験体の治療を最適化する方法が記載されており、該方法は、（ａ）被験体からのＰＬＣγ２ポリペプチドをコード化する核酸分子を含むサンプルを試験する工程であって、それによって、コード化されたＰＬＣγ２ポリペプチドが、配列番号：１１と表記されたアミノ酸配列のアミノ酸位置６６５に対応するアミノ酸位置で修飾されているかどうかを決定する、工程、および、（ｂ）被験体が修飾を有している場合、不可逆的なＢＴＫ阻害剤を用いた処置を中止するか、または、被験体が修飾を有していない場合、不可逆的なＢＴＫ阻害剤を用いた処置を継続する工程、を含む。いくつかの実施形態では、方法は、被験体が修飾を有している場合、修飾されたキナーゼを阻害する第２世代のＢＴＫ阻害剤を投与する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、被験体からサンプルを得る工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は被験体が修飾を有している場合、ＬＹＮ、ＳＹＫ、ＪＡＫ、ＰＩ３Ｋ、ＭＡＰＫ、ＭＥＫ、またはＮＦκＢの阻害剤を投与する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、修飾は、ＰＬＣγ２中にＲ６６５ＷまたはＳ７０７Ｆの置換を含む。いくつかの実施形態において、ＢＴＫ阻害剤は、共有結合性のまたは不可逆な阻害剤である。

【0252】

方法のいくつかの実施形態において、アッセイで使用される核酸分子は、ＲＮＡまたはＤＮＡである。方法のいくつかの実施形態において、核酸分子は、方法のｃＤＮＡである。いくつかの実施形態において、アッセイで使用される核酸分子はゲノムＤＮＡである。方法のいくつかの実施形態において、アッセイで使用される核酸分子は全ＲＮＡである。方法のいくつかの実施形態において、アッセイで使用される核酸分子はｍＲＮＡである。方法のいくつかの実施形態において、方法は、ＲＮＡサンプルからｍＲＮＡを単離する工程をさらに含む。

【0253】

方法のいくつかの実施形態において、試験する工程は、ＰＬＣγ２ポリペプチドのアミノ酸位置６６５または７０７をコード化する核酸のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅を行う工程を含む。いくつかの実施形態では、ＰＣＲ増幅は、ＰＬＣγ２ポリペプチドのアミノ酸位置６６５または７０７をコード化する領域に隣接する１対のオリゴヌクレオチドプライマーを使用することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、増幅された核酸の配列を決定する工程を含む。

【0254】

方法のいくつかの実施形態において、試験する工程は、配列特異的な核酸プローブに核酸を接触させる工程であって、配列特異的な核酸プローブが、（ａ）アミノ酸位置６６５または７０７で修飾される修飾ＰＬＣγ２をコード化する核酸に結合し、および、（ｂ）アミノ酸位置６６５または７０７でアルギニンを有する野生型ＰＬＣγ２をコード化する核酸に結合しない、工程を含む。方法のいくつかの実施形態において、試験する工程は、配列特異的な核酸プローブを使用するＰＣＲ増幅を含む。

【0255】

いくつかの実施形態では、方法で使用されるサンプルは、被験体からの１つ以上の腫瘍細胞を含む。いくつかの実施形態では、方法で使用されるサンプルは、循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）を含む。

【0256】

方法のいくつかの実施形態において、方法で使用される核酸は、被験体からの腫瘍細胞サンプルから単離される。いくつかの実施形態では、サンプルは、腫瘍生検サンプル、血液サンプル、血清サンプル、リンパ液サンプル、または骨髄穿刺液である。

【0257】

いくつかの実施形態では、ＢＴＫ阻害剤は、イブルチニブ（ＰＣＩ−３２７６５）、ＰＣＩ−４５２９２、ＰＣＩ−４５４６６、ＡＶＬ−１０１、ＡＶＬ−２９１、ＡＶＬ−２９２、またはＯＮＯ−ＷＧ−３７の中から選択される。いくつかの実施形態において、ＰＬＣγ２はイブルチニブである。

【0258】

方法のいくつかの実施形態において、被験体は癌を患っている。いくつかの実施形態では、癌は血液の癌である。いくつかの実施形態では、癌はＢ細胞悪性腫瘍である。いくつかの実施形態では、癌は白血病、リンパ腫、または骨髄腫の中から選択される。いくつかの実施形態では、Ｂ細胞悪性腫瘍は、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、活性化したＢ細胞びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＡＢＣ−ＤＬＢＣＬ）、胚中心びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＧＣＢ ＤＬＢＣＬ）、縦隔原発Ｂ細胞リンパ腫（ＰＭＢＬ）、非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、濾胞性リンパ腫、免疫芽球性大細胞型リンパ腫、前駆Ｂリンパ芽球性リンパ腫、前駆Ｂ細胞急性リンパ性白血病、ヘアリーセル白血病、マントル細胞リンパ腫、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、リンパ形質細胞性リンパ腫／ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、脾臓周辺帯リンパ腫、形質細胞性骨髄腫、形質細胞腫、節外性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、節性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、縦隔（胸腺）大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、血管内大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、原発性滲出性リンパ腫、または、リンパ腫様肉芽腫症である。いくつかの実施形態では、被験体は固形腫瘍を患っている。

【0259】

方法のいくつかの実施形態において、被験体は、サンプルを得る前にＢＴＫ阻害剤で処置される。いくつかの実施形態では、サンプルは、不可逆的なＢＴＫ阻害剤の１回目の投与後、１週、２週、３週、１か月、２か月、３か月、４か月、５か月、６か月、７か月、８か月、９か月、１０か月、１１か月、１２か月、１４か月、１６か月、１８か月、２０か月、２２か月、または２４か月目に得られる。いくつかの実施形態では、サンプルは、ＢＴＫ阻害剤を用いた処置の経過中に、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０回得られる。いくつかの実施形態では、被験体は、ＢＴＫ阻害剤が最初に投与されたときに、ＢＴＫ阻害剤を用いた処置に反応する。

【0260】

本明細書では、特定の実施形態において、アミノ酸位置６６５で修飾を含む修飾されたＰＬＣγ２ポリペプチドを検知するための１つ以上の試薬を含むキットが記載されている。いくつかの実施形態では、キットは、Ｒ６６５ＷまたはＳ７０７Ｆである修飾を有する変異ＰＬＣγ２ポリペプチドを含むマイクロチップを含んでいる。

【0261】

本明細書では、特定の実施形態において、アミノ酸位置６６５または７０７で修飾を含む変異ＰＬＣγ２ポリペプチドをコード化する核酸を検知するための１つ以上の試薬を含むキットが記載されている。いくつかの実施形態では、キットは、Ｒ６６５ＷまたはＳ７０７Ｆである修飾を有する変異ＰＬＣγ２ポリペプチドをコード化する核酸を含むマイクロチップを含んでいる。

【0262】

本明細書では、特定の実施形態において、被験体中で不可逆的なＢＴＫ阻害剤を用いた阻害に対して耐性を与える、修飾されたＰＬＣγ２を検知するためのシステムが記載されており、該システムは、（ａ）被験体からのＰＬＣγ２ポリペプチドをコード化する核酸分子を含むサンプル、および、および、配列番号：１１と表記されたアミノ酸配列のアミノ酸位置６６５または７０７に対応するアミノ酸位置で修飾される、変異ＰＬＣγ２ポリペプチドまたはその一部をコード化する核酸を含むマイクロアレイ、を含む。いくつかの実施形態では、マイクロアレイはマイクロチップに含まれる。

【0263】

本明細書では、特定の実施形態において、被験体においてＢＴＫ阻害剤を用いた阻害に対して耐性を与える修飾されたＰＬＣγ２を検知するためのシステムが記載されており、該システムは、（ａ）被験体からのＰＬＣγ２ポリペプチドをコード化する核酸分子を含むサンプル、および、および、（ｂ）配列特異的な核酸プローブであって、（ｉ）アミノ酸位置６６５または７０７で修飾される修飾ＰＬＣγ２をコード化する核酸に結合し、および、（ｉｉ）アミノ酸位置６６５でアルギニンを、または、位置７０７でセリンを有する野生型のＰＬＣγ２をコード化する核酸には結合しない、核酸プローブ、を含む。

【0264】

本明細書では、特定の実施形態において、被験体のＢＴＫ阻害剤を用いた阻害に対して耐性を与える修飾されたＰＬＣγ２を検知するためのシステムが記載されており、該システムは、（ａ）被験体からのＰＬＣγ２ポリペプチドをコード化する核酸分子を含むサンプル、および、（ｂ）ＰＬＣγ２ポリペプチドのアミノ酸６６５または７０７をコード化する核酸領域に隣接する一対のオリゴヌクレオチドプライマー、を含む。

【0265】

本明細書では、特定の実施形態において、血液の癌を患っている患者における維持療法の方法が提供され、該方法は、（ａ）治療上有効な量のＢＴＫ阻害剤を投与する工程を含む維持療法計画を患者に施す工程、および、（ｂ）維持療法計画の経過にわたってあらかじめ決められた時間間隔で患者をモニタリングする工程であって、それによって、被験体が、配列番号：１１と表記されたアミノ酸配列のアミノ酸位置６６５または７０７に対応するアミノ酸位置で修飾をもたらすＰＬＣγ２をコード化する内因性遺伝子の変異を有しているかどうかを決定する、工程、を含む。いくつかの実施形態において、モニタリングする工程は、（ａ）被験体からのＰＬＣγ２ポリペプチドをコード化する核酸分子を含むサンプルを試験する工程であって、それによって、コード化されたＰＬＣγ２ポリペプチドが、配列番号：１１と表記されたアミノ酸配列のアミノ酸位置６６５または７０７に対応するアミノ酸位置で修飾されているかどうかを決定する、工程、を含む。いくつかの実施形態では、方法は、被験体に変異がある場合、ＢＴＫ阻害剤を用いた処置を中止する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、被験体に変異がない場合、ＢＴＫ阻害剤を用いた処置を継続する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、被験体が修飾を有している場合、ＬＹＮ、ＳＹＫ、ＪＡＫ、ＰＩ３Ｋ、ＭＡＰＫ、ＭＥＫ、またはＮＦκＢの阻害剤を投与する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＰＬＣγ２ポリペプチド中の修飾は、Ｒ６６５ＷまたはＳ７０７Ｆである。いくつかの実施形態では、あらかじめ決められた時間間隔は、毎月、２か月ごと、３か月ごと、４か月ごと、５か月ごと、６か月ごと、７か月ごと、８か月ごとである。

【0266】

いくつかの実施形態では、ＢＴＫ阻害剤は、１日当たり約１０ｍｇから１日当たり約２０００ｍｇ、１日当たり約５０ｍｇから１日当たり約１５００ｍｇ、１日当たり約１００ｍｇから１日当たり約１０００ｍｇ、１日当たり約２５０ｍｇから１日当たり約８５０ｍｇ、または、１日当たり約３００ｍｇから１日当たり約６００ｍｇの１日投与量で投与される。いくつかの実施形態では、イブルチニブは、１日当たり約１４０ｍｇ、１日当たり４２０ｍｇ、１日当たり５６０ｍｇ、または、１日当たり８４０ｍｇの１日投与量で投与される。いくつかの実施形態では、ＢＴＫ阻害剤は、共有結合のおよび／または不可逆的なＢＴＫ阻害剤である。いくつかの実施形態では、ＢＴＫ阻害剤は、イブルチニブ（ＰＣＩ−３２７６５）、ＰＣＩ−４５２９２、ＰＣＩ−４５４６６、ＡＶＬ−１０１、ＡＶＬ−２９１、ＡＶＬ−２９２、またはＯＮＯ−ＷＧ−３７の中から選択される。いくつかの実施形態において、ＢＴＫ阻害剤はイブルチニブである。

【0267】

ＣＡＲＤ１１

【0268】

いくつかの実施形態では、下流のエフェクタータンパク質は、ＣＡＲＤを含むＭＡＧＵＫタンパク質１（Ｃａｒｍａ１）としても知られているカスパーゼ動員ドメインを含むタンパク質１１（ＣＡＲＤ１１）である。ＣＡＲＤ１１は、一般に多重タンパク質複合体の組立において分子のスキャフォールドとして機能するＭＡＧＵＫ（薄膜関連グアニル酸キナーゼ）ファミリーに属する。ＭＡＧＵＫ家族は、ＳＨ３ドメイン、ＰＤＺドメイン、および、グアニル酸キナーゼに相同のＧｕＫドメインを含む。加えて、ＣＡＲＤ１１は、アミノ末端ＣＡＲＤドメイン（カスパーゼ動員ドメイン）を含んでいる。このドメインは、アポトーシスとＮＦ−κＢ活性化の制御に関与するＣＡＲＤドメインを含む多くのタンパク質との相互作用を形成する際に、重要な役割を果たしている。ＣＡＲＤ１１はリンパ球において優勢的に発現し、Ｂｃｌ１０のＣＡＲＤドメインと結合する。過剰発現されると、ＣＡＲＤ１１は、Ｂｃｌ１０のリン酸化とＮＦ−κＢの活性化をもたらす。

【0269】

いくつかの実施形態では、ＣＡＲＤ１１での変異は、ＢＴＫ阻害剤を用いた処置に対して患者の耐性をもたらす。いくつかの実施形態では、変異はＣＡＲＤ１１での機能獲得型変異である。いくつかの実施形態では、変異はＮＦ−κＢを媒介とする転写の構成的な活性化をもたらす。いくつかの実施形態では、ＣＡＲＤ１１の変異は、ＣＡＲＤ１１においてアミノ酸位置２３２でアミノ酸挿入をもたらす。いくつかの実施形態では、ＣＡＲＤ１１の変異は、アミノ酸位置Ｌ２３２でロイシンの挿入をもたらす。いくつかの実施形態では、修飾はＬ２３２ＬＬである。いくつかの実施形態では、ＣＡＲＤ１１の変異は、アミノ酸位置Ｌ２３２でイソロイシンの挿入につながる。いくつかの実施形態では、修飾は、Ｌ２３２ＩＬまたはＬ２３２ＬＩである。

【0270】

修飾されたＢＴＫポリペプチドを検知するための本明細書で提供される方法のいずれかは、ＣＡＲＤ１１ポリペプチドの検出にも適用することができる。例えば、変異ＣＡＲＤ１１ポリペプチドは、ゲノム中の体細胞変異の検出のために変異特異的な核酸を、または、変異ＣＡＲＤ１１ポリペプチドの検出のためにＣＡＲＤ１１変異特異的な抗体を使用することによって、ＰＣＲ方法により検知することができる。

【0271】

いくつかの実施形態では、変異ＣＡＲＤ１１ポリペプチドをコード化する核酸が提供されている。いくつかの実施形態では、変異ＣＡＲＤ１１ポリペプチドをコード化する核酸ベクターが提供されている。いくつかの実施形態において、ベクターはウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、変異ＣＡＲＤ１１ポリペプチドをコード化する核酸を含む宿主細胞が提供されている。いくつかの実施形態では、発現されたＣＡＲＤ１１ポリペプチドを含む宿主細胞が提供されている。

【0272】

核酸発現ベクターと宿主細胞の使用を含む、本明細書で提供される修飾されたＢＴＫポリペプチドおよび核酸の産生のための当該技術中で知られている本明細書で提供される方法のいずれかは、本明細書で提供される変異ＣＡＲＤ１１ポリペプチドと核酸の産生にも適用することができる。

【0273】

本明細書では、変異ＣＡＲＤ１１ポリペプチドが提供される。いくつかの実施形態では、変異ＣＡＲＤ１１ポリペプチドは、組換えタンパク質である。いくつかの実施形態では、変異ＣＡＲＤ１１ポリペプチドは宿主細胞から精製される。

【0274】

いくつかの実施形態では、変異ＣＡＲＤ１１ポリペプチドは、ＢＴＫ阻害剤による阻害に対して耐性を与える、１つ以上のアミノ酸置換を包含している。いくつかの実施形態では、変異ＣＡＲＤ１１ポリペプチドは、共有結合のおよび／または不可逆的なＢＴＫ阻害剤による阻害に対して耐性を与える、１つ以上のアミノ酸置換を包含している。いくつかの実施形態では、変異ＣＡＲＤ１１ポリペプチドは、イブルチニブ、ＰＣＩ−４５２９２、ＰＣＩ−４５４６６、ＡＶＬ−１０１、ＡＶＬ−２９１、ＡＶＬ−２９２、またはＯＮＯ−ＷＧ−３７である共有結合のおよび／または不可逆的なＢＴＫ阻害剤による阻害に対して耐性を与える、１つ以上のアミノ酸置換を包含している。いくつかの実施形態では、変異ＣＡＲＤ１１ポリペプチドは、ＢＴＫ阻害剤による阻害に対して耐性を与える１つ以上のアミノ酸置換を包含している。

【0275】

本明細書では、配列番号：１９と表記されたアミノ酸配列のアミノ酸位置Ｌ２３２に対応するアミノ酸位置で修飾を含むＣＡＲＤ１１活性を有する単離したＣＡＲＤ１１ポリペプチドまたはその変異体が提供される。

【0276】

いくつかの実施形態では、修飾は、配列番号：１９と表記された野性型ＣＡＲＤ１１と比較して、アミノ酸位置Ｌ２３２でアミノ酸の置換または欠失を含む。いくつかの実施形態では、修飾は、配列番号：１９と表記された野性型ＣＡＲＤ１１と比較して、位置Ｌ２３２でアミノ酸の置換を含む。いくつかの実施形態では、修飾は、ＣＡＲＤ１１ポリペプチド（例えば、Ｌ２３２ＬＬ）のアミノ酸２３２でのロイシンの挿入である。

【0277】

いくつかの実施形態では、変異ＣＡＲＤ１１ポリペプチドは、配列番号：１９と表記された野性型ＣＡＲＤ１１と比較して、ＣＡＲＤ１１ポリペプチドのアミノ酸２３２でのロイシンの挿入と、１以上の追加のアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、変異ＣＡＲＤ１１ポリペプチドは、アミノ酸２３２でのロイシンの挿入と、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０以上のアミノ酸位置での修飾を含む。いくつかの実施形態では、アミノ酸位置２３２での修飾はＬ２３２ＬＬである。

【0278】

いくつかの実施形態では、ＣＡＲＤ１１ポリペプチドは、配列番号：１９と表記された野生型のＣＡＲＤ１１ポリペプチドのアミノ酸位置２３２で修飾を含み、ペプチドタグに結合する。いくつかの実施形態では、ペプチドタグは、タグに特異的な抗体によって認識されるエピトープタグである。いくつかの実施形態において、タグは、限定されないが、ｃ−ｍｙｃ、Ｖ−５、ヘマグルチニン（ＨＡ）、ＦＬＡＧ、タグなどのエピトープタグである。いくつかの実施形態において、タグは、アフィニティータグ、例えば、限定されないが、ビオチン、ｓｔｒｅｐ−タグ、キチン結合タンパク質（ＣＢＰ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、グルタチオン−Ｓ−転移酵素（ＧＳＴ）、または、ポリ（Ｈｉｓ）タグである。いくつかの実施形態では、ＣＡＲＤ１１ポリペプチドは、配列番号：１９と表記された野生型のＣＡＲＤ１１ポリペプチドのアミノ酸位置２３２で修飾を含み、検知可能なタンパク質または部分、例えば、発光、化学発光、生物発光、蛍光のタンパク質または部分に結合する。いくつかの実施形態では、蛍光のタンパク質は、緑（ＧＦＰ）、赤（ＲＦＰ）、シアン（ＣＦＰ）、黄色（ＹＦＰ）また、は青（ＢＦＰ）の蛍光のタンパク質である。いくつかの実施形態では、ＣＡＲＤ１１ポリペプチドは、配列番号：１９と表記された野生型のＣＡＲＤ１１ポリペプチドのアミノ酸位置２３２で修飾を含み、酵素（例えば、ルシフェラーゼ、または、β−ガラクトシダーゼ）に結合する。

【0279】

本明細書では、変異ＣＡＲＤ１１ポリペプチドをコード化する核酸が提供される。本明細書では、本明細書に記載の変異ＣＡＲＤ１１ポリペプチドのいずれかをコード化する核酸が提供される。特定のポリペプチドをコード化する核酸を推定する方法は、当該技術では知られており、標準的な分子生物学技術を含んでいる。本明細書で提供される変異ＣＡＲＤ１１ポリペプチドをコード化する典型的な核酸が提供されている。遺伝子コードの縮重により、同じポリペプチドをコード化する多くの変異体核酸が存在すると理解されている。本明細書で提供される変異ＣＡＲＤ１１ポリペプチドをコード化する核酸は、そのような変異体を包含する。

【0280】

いくつかの実施形態では、本明細書で提供される修飾されたＣＡＲＤ１１ポリペプチドをコード化する核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡの分子である。いくつかの実施形態では、変異ＣＡＲＤ１１ポリペプチドをコード化する核酸は、コード化されたポリペプチドが、配列番号：１９と表記される野生型のＣＡＲＤ１１ポリペプチドのアミノ酸位置２３２に対応する位置でアミノ酸の挿入を含む、修飾を含んでいる。いくつかの実施形態では、核酸は、配列番号：２０と表記された核酸の配列、または、配列番号２０と表記された配列を有するポリペプチドと少なくともまたは少なくとも約６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を有する変異体を含んでいる。

【0281】

いくつかの実施形態では、方法は、被験体が、ＢＴＫ阻害剤を用いた治療に反応しないか、または、反応しなくなる可能性が高いかどうかを決定し、該方法は、（ａ）被験体からのＣＡＲＤ１１ポリペプチドをコード化する核酸分子を含むサンプルを試験する工程であって、それによって、コード化されたＣＡＲＤ１１ポリペプチドが、配列番号：１９と表記されたアミノ酸配列のアミノ酸位置２３２に対応するアミノ酸位置で修飾されているかどうかを決定する、工程、および、（ｂ）被験体が修飾を有している場合、被験体がＢＴＫ阻害剤による治療に対する耐性を有するか、あるいは、耐性を有するようになる可能性が高いとして被験体を特徴づける工程、を含む。いくつかの実施形態では、方法は、被験体からサンプルを得る工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、修飾は、ＣＡＲＤ１１中のＬ２３２ＬＬ挿入を含む。いくつかの実施形態において、ＢＴＫ阻害剤は、共有結合性のまたは不可逆な阻害剤である。

【0282】

本明細書では、特定の実施形態において、癌の処置のためにＢＴＫ阻害剤を受ける被験体が、治療に対する耐性を生じさせたか、または、生じさせる可能性が高いかどうかをモニタリングする方法が記載されており、該方法は、（ａ）被験体からのＣＡＲＤ１１ポリペプチドをコード化する核酸分子を含むサンプルを試験する工程であって、それによって、コード化されたＣＡＲＤ１１ポリペプチドが、配列番号：１９と表記されたアミノ酸配列のアミノ酸位置２３２に対応するアミノ酸位置で修飾されているかどうかを決定する、工程、（ｂ）被験体が修飾を有している場合、ＢＴＫ阻害剤による治療に対する耐性を有する、または、有するようになる可能性が高いと被験体を特徴づける工程、を含む。いくつかの実施形態では、方法は、被験体が修飾を有している場合、ＢＴＫ阻害剤を用いた処置を中止する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、被験体が修飾を有していない場合、ＢＴＫ阻害剤を用いた処置を継続する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、被験体からサンプルを得る工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は被験体が修飾を有している場合、ＬＹＮ、ＳＹＫ、ＪＡＫ、ＰＩ３Ｋ、ＭＡＰＫ、ＭＥＫ、またはＮＦκＢの阻害剤を投与する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、修飾は、ＣＡＲＤ１１中のＬ２３２ＬＬ挿入を含む。いくつかの実施形態において、ＢＴＫ阻害剤は、共有結合性のまたは不可逆な阻害剤である。

【0283】

本明細書では、特定の実施形態において、癌の処置のために不可逆的なＢＴＫ阻害剤を受ける被験体の治療を最適化する方法が記載されており、該方法は、（ａ）被験体からのＣＡＲＤ１１ポリペプチドをコード化する核酸分子を含むサンプルを試験する工程であって、それによって、コード化されたＣＡＲＤ１１ポリペプチドが、配列番号：１９と表記されたアミノ酸配列のアミノ酸位置２３２に対応するアミノ酸位置で修飾されているかどうかを決定する、工程、および、（ｂ）被験体が修飾を有している場合、不可逆的なＢＴＫ阻害剤を用いた処置を中止するか、または、被験体が修飾を有していない場合、不可逆的なＢＴＫ阻害剤を用いた処置を継続する工程、を含む。いくつかの実施形態では、方法は、被験体が修飾を有している場合、修飾されたキナーゼを阻害する第２世代のＢＴＫ阻害剤を投与する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、被験体からサンプルを得る工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は被験体が修飾を有している場合、ＬＹＮ、ＳＹＫ、ＪＡＫ、ＰＩ３Ｋ、ＭＡＰＫ、ＭＥＫ、またはＮＦκＢの阻害剤を投与する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、修飾は、ＣＡＲＤ１１中のＬ２３２ＬＬ挿入を含む。いくつかの実施形態において、ＢＴＫ阻害剤は、共有結合性のまたは不可逆な阻害剤である。

【0284】

方法のいくつかの実施形態において、アッセイで使用される核酸分子は、ＲＮＡまたはＤＮＡである。方法のいくつかの実施形態において、核酸分子は、方法のｃＤＮＡである。いくつかの実施形態において、アッセイで使用される核酸分子はゲノムＤＮＡである。方法のいくつかの実施形態において、アッセイで使用される核酸分子は全ＲＮＡである。方法のいくつかの実施形態において、アッセイで使用される核酸分子はｍＲＮＡである。方法のいくつかの実施形態において、方法は、ＲＮＡサンプルからｍＲＮＡを単離する工程をさらに含む。

【0285】

方法のいくつかの実施形態において、試験する工程は、ＣＡＲＤ１１ポリペプチドのアミノ酸位置２３２をコード化する核酸のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅を行うことを含む。いくつかの実施形態では、ＰＣＲ増幅は、ＣＡＲＤ１１ポリペプチドのアミノ酸位置２３２をコード化する領域に隣接する一対のオリゴヌクレオチドプライマーを使用することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、増幅された核酸の配列を決定する工程を含む。

【0286】

方法のいくつかの実施形態において、試験する工程は、配列特異的な核酸プローブで核酸を接触させる工程であって、配列特異的な核酸プローブが、（ａ）アミノ酸位置２３２で修飾される修飾ＣＡＲＤ１１をコード化する核酸に結合し、および、（ｂ）野生型のＣＡＲＤ１１をコード化する核酸に結合しない、工程、を含む。方法のいくつかの実施形態において、試験する工程は、配列特異的な核酸プローブを使用するＰＣＲ増幅を含む。

【0287】

いくつかの実施形態では、方法で使用されるサンプルは、被験体からの１つ以上の腫瘍細胞を包含している。いくつかの実施形態では、方法で使用されるサンプルは、循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）を包含している。

【0288】

方法のいくつかの実施形態において、方法で使用される核酸は、被験体からの腫瘍細胞サンプルから単離される。いくつかの実施形態では、サンプルは、腫瘍生検サンプル、血液サンプル、血清サンプル、リンパ液サンプル、または骨髄穿刺液である。

【0289】

いくつかの実施形態では、ＢＴＫ阻害剤は、イブルチニブ（ＰＣＩ−３２７６５）、ＰＣＩ−４５２９２、ＰＣＩ−４５４６６、ＡＶＬ−１０１、ＡＶＬ−２９１、ＡＶＬ−２９２、またはＯＮＯ−ＷＧ−３７の中から選択される。いくつかの実施形態において、ＣＡＲＤ１１阻害剤はイブルチニブである。

【0290】

方法のいくつかの実施形態において、被験体は癌を患っている。いくつかの実施形態では、癌は血液の癌である。いくつかの実施形態では、癌はＢ細胞悪性腫瘍である。いくつかの実施形態では、癌は白血病、リンパ腫、または骨髄腫の中から選択される。いくつかの実施形態では、Ｂ細胞悪性腫瘍は、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、活性化したＢ細胞びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＡＢＣ−ＤＬＢＣＬ）、胚中心びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＧＣＢ ＤＬＢＣＬ）、縦隔原発Ｂ細胞リンパ腫（ＰＭＢＬ）、非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、濾胞性リンパ腫、免疫芽球性大細胞型リンパ腫、前駆Ｂリンパ芽球性リンパ腫、前駆Ｂ細胞急性リンパ性白血病、ヘアリーセル白血病、マントル細胞リンパ腫、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、リンパ形質細胞性リンパ腫／ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、脾臓周辺帯リンパ腫、形質細胞性骨髄腫、形質細胞腫、節外性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、節性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、縦隔（胸腺）大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、血管内大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、原発性滲出性リンパ腫、または、リンパ腫様肉芽腫症である。いくつかの実施形態では、被験体は固形腫瘍を患っている。

【0291】

方法のいくつかの実施形態において、被験体はサンプルを得る前にＢＴＫ阻害剤で処置される。いくつかの実施形態では、サンプルは、不可逆的なＢＴＫ阻害剤の第１の投与後、１週、２週、３週、１か月、２か月、３か月、４か月、５か月、６か月、７か月、８か月、９か月、１０か月、１１か月、１２か月、１４か月、１６か月、１８か月、２０か月、２２か月、または２４か月目に得られる。いくつかの実施形態では、サンプルは、ＢＴＫ阻害剤を用いた処置の経過中に、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０回得られる。いくつかの実施形態では、被験体は、ＢＴＫ阻害剤が最初に投与されたときに、ＢＴＫ阻害剤を用いた処置に反応する。

【0292】

本明細書では、特定の実施形態において、アミノ酸位置２３２で修飾を含む修飾されたＣＡＲＤ１１ポリペプチドを検出するための１つ以上の試薬を含むキットである。いくつかの実施形態では、キットは、Ｌ２３２ＬＬである修飾を有する変異ＣＡＲＤ１１ポリペプチドを含むマイクロチップを含んでいる。

【0293】

本明細書では、特定の実施形態において、アミノ酸位置２３２で修飾を含む変異ＣＡＲＤ１１ポリペプチドをコード化する核酸を検知するための１つ以上の試薬を含むキットである。いくつかの実施形態では、キットは、Ｌ２３２ＬＬである修飾を有する変異ＣＡＲＤ１１ポリペプチドをコード化する核酸を含むマイクロチップを含んでいる。

【0294】

本明細書では、特定の実施形態において、被験体の不可逆的なＢＴＫ阻害剤を用いた阻害に対して耐性を与える、修飾されたＣＡＲＤ１１を検知するためのシステムが記載されており、該システムは、（ａ）被験体からのＣＡＲＤ１１ポリペプチドをコード化する核酸分子を含むサンプル、および、（ｂ）配列番号：１９と表記されたアミノ酸配列のアミノ酸位置２３２に対応するアミノ酸位置で修飾される変異ＣＡＲＤ１１ポリペプチドまたはその一部をコード化する核酸を含むマイクロアレイ、を含む。いくつかの実施形態では、マイクロアレイはマイクロチップに含まれる。

【0295】

本明細書では、特定の実施形態において、被験体のＢＴＫ阻害剤を用いた阻害に対して耐性を与える修飾されたＣＡＲＤ１１を検知するためのシステムが記載されており、該システムは、（ａ）被験体からのＣＡＲＤ１１ポリペプチドをコード化する核酸分子を含むサンプル、および、（ｂ）配列特異的な核酸プローブであって、（ｉ）アミノ酸位置２３２で修飾される修飾ＣＡＲＤ１１をコード化する核酸に結合し、および、（ｉｉ）野生型のＣＡＲＤ１１をコード化する核酸には結合しない、核酸プローブ、を含む。

【0296】

本明細書では、特定の実施形態において、被験体のＢＴＫ阻害剤を用いた阻害に対して耐性を与える修飾されたＣＡＲＤ１１を検知するためのシステムが記載されており、該システムは、（ａ）被験体からのＣＡＲＤ１１ポリペプチドをコード化する核酸分子を含むサンプル、および、（ｂ）ＣＡＲＤ１１ポリペプチドのアミノ酸２３２をコード化する核酸領域に隣接する一対のオリゴヌクレオチドプライマー、を含む。

【0297】

本明細書では、特定の実施形態において、血液の癌を患っている患者における維持療法の方法が提供され、該方法は、（ａ）治療上有効な量のＢＴＫ阻害剤を投与する工程を含む維持療法計画を患者に施す工程、および、（ｂ）維持療法計画の経過にわたってあらかじめ決められた時間間隔で患者をモニタリングする工程であって、それによって、被験体が、配列番号：１９と表記されたアミノ酸配列のアミノ酸位置２３２に対応するアミノ酸位置で修飾をもたらすＣＡＲＤ１１をコード化する内因性遺伝子の変異を有しているかどうかを決定する、工程、を含む。いくつかの実施形態において、モニタリングする工程は、（ａ）被験体からのＣＡＲＤ１１ポリペプチドをコード化する核酸分子を含むサンプルを試験する工程であって、それによって、コード化されたＣＡＲＤ１１ポリペプチドが、配列番号：１９と表記されたアミノ酸配列のアミノ酸位置２３２に対応するアミノ酸位置で修飾されているかどうかを決定する、工程、を含む。いくつかの実施形態では、方法は、被験体に変異がある場合、ＢＴＫ阻害剤を用いた処置を中止する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、被験体に変異がない場合、ＢＴＫ阻害剤を用いた処置を継続する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、被験体が修飾を有している場合、ＬＹＮ、ＳＹＫ、ＪＡＫ、ＰＩ３Ｋ、ＭＡＰＫ、ＭＥＫ、またはＮＦκＢの阻害剤を投与する工程をさらに含む。いくつかの実施形態において、ＣＡＲＤ１１ポリペプチドの修飾はＬ２３２ＬＬである。いくつかの実施形態では、あらかじめ決められた時間間隔は、毎月、２か月ごと、３か月ごと、４か月ごと、５か月ごと、６か月ごと、７か月ごと、８か月ごとである。

【0298】

いくつかの実施形態では、ＢＴＫ阻害剤は、１日当たり約１０ｍｇから１日当たり約２０００ｍｇ、１日当たり約５０ｍｇから１日当たり約１５００ｍｇ、１日当たり約１００ｍｇから１日当たり約１０００ｍｇ、１日当たり約２５０ｍｇから１日当たり約８５０ｍｇ、または、１日当たり約３００ｍｇから１日当たり約６００ｍｇの１日投与量で投与される。いくつかの実施形態では、イブルチニブは、１日当たり約１４０ｍｇ、１日当たり４２０ｍｇ、１日当たり５６０ｍｇ、または、１日当たり８４０ｍｇの１日投与量で投与される。いくつかの実施形態では、ＢＴＫ阻害剤は、共有結合のおよび／または不可逆的なＢＴＫ阻害剤である。いくつかの実施形態では、ＢＴＫ阻害剤は、イブルチニブ（ＰＣＩ−３２７６５）、ＰＣＩ−４５２９２、ＰＣＩ−４５４６６、ＡＶＬ−１０１、ＡＶＬ−２９１、ＡＶＬ−２９２、またはＯＮＯ−ＷＧ−３７の中から選択される。いくつかの実施形態において、ＢＴＫ阻害剤はイブルチニブである。

【実施例】

【0299】

これらの実施例は、説明目的で提供されるものに過ぎず、本明細書で提供される特許請求の範囲を制限するものではない。

【0300】

＜実施例１＞
この実施例において、Ｂｒｕｔｏｎ型チロシンキナーゼ（ＢＴＫ）の変異は、共有結合のＢＴＫ阻害剤イブルチニブを用いた治療を受ける白血病患者で同定された。

【0301】

慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）に苦しむ患者は、１日当たり５６０ｍｇの投与量で、複数サイクルのイブルチニブ治療で処置された。約１８か月の処置の後、１人の患者は臨床的な疾患進行を示した。進行は、リンパ球絶対数（ＡＬＣ）の上昇とリンパ節のサイズの増加を特徴としていた。その後、イブルチニブの投与量を、１日当たり５６０ｍｇから８４０ｍｇに増やした。しかしながら、投与量の増加では疾患進行を阻害しなかった。その後の研究のもう一人の患者は、ベンダムスチンとリツキサンを組み合わせて４２０ｍｇのイブルチニブのサイクルで処置した。この患者も約１２か月の処置の後に臨床的な疾患進行を示した。

【0302】

全血は、研究の前に、処置中に、そして、設定されたＩＷＣＬＬ評価基準により患者が疾患を進行させたとみなされたときに、採取した。全血は、血液凝固薬としてクエン酸ナトリウムを用いて、ＢＤバキュテナー細胞調製チューブ（ＣＰＴ）へと集められた。集めた全血を採決後４８時間以内に分析部位に送り、そこで、ＣＰＴ採取チューブをすぐに、ＲＴで１８００のＲＣＦで水平ローター遠心分離機で２０分間、遠心分離した。血漿層下の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）層は、上部の血漿成分の吸入後に、ピペットで注意深く集めた。集めた細胞を５分間、Ｓｉｇｍａ Ｒｅｄ Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｌｌ（ＲＢＣ）Ｌｙｓｉｎｇバッファー（Ｃａｔ Ｎｏ．Ｒ７７５７）中で再懸濁して、余ったＲＢＣを取り除き、その後、ＰＢＳで２度洗浄して溶解を止め、遠心分離にかけて細胞ペレットを集めた。いくつかの例において、ＰＢＭＣペレットは、この時点でＢ細胞、Ｔ細胞、または単球の濃縮のために、電磁ビーズで選別した。以下に記載の核酸アッセイのために、ＰＢＭＣ細胞ペレットをＱｉａｇｅｎ ＲＬＴ Ｌｙｓｉｓバッファー中で再懸濁し、分析まで−８０°Ｃの冷凍庫に入れた。その後のアッセイで保存して使用するために、細胞ペレットを生細胞として凍らせ、９０％のＦＢＳと、ペレットに優しくゆっくりと液滴で加えられた１０％ＤＭＳＯ溶液で再懸濁した。これらのバイアルは、Ｍｉｎｉｓｔｅｒ Ｆｒｏｓｔｙの容器（Ｎａｌｇｅｎｅ（登録商標））の中であらかじめ冷やしておき、液体窒素タンクで永久的に保存する２４時間前に−８０°Ｃの冷凍庫に置いた。

【0303】

全ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびタンパク質を、Ｑｉａｇｅｎ Ａｌｌ Ｐｒｅｐキットを使用して、ＰＢＭＣから単離した。ＢＴＫ ｍＲＮＡの第１鎖のｃＤＮＡを、以下の逆方向ＢＴＫプライマー（ＢＴＫ＃２Ｒと呼ぶ）：５’−ａａｇｔｇａａａｔｔｇｇｇｇｃｔｔｇｔｇ−３’（配列番号：９）を使用して、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ｃａｔａｌｏｇ＃６００１８４）から購入されたキットを用いて、逆転写によって合成した。反応についてはメーカーの指示に従った。鋳型ＲＮＡ、遺伝子に特異的なプライマー、ｄＮＴＰ混合物、および、バッファーをミクロチューブで混合した。混合物を５分間６５°Ｃで変性させ、プライマーを５分間２５°Ｃでアニール処理した。その後、ＤＴＴおよびＡｃｃｕＳｃｒｉｐｔ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ逆転写酵素を加え、ＤＮＡを３０〜９０分間４２°Ｃで伸長させ、４°Ｃまで冷やし、その後、−２０°Ｃで維持した。

【0304】

逆転写反応からのｍＲＮＡ−ｃＤＮＡハイブリッドを、その後、Ａｇｉｌｅｎｔ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓからのＰｆｕＵｌｔｒａ ＩＩ ＨＳポリメラーゼを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅させた。１〜３マイクロリットルの逆転写反応をＰＣＲ反応で使用した。同じ逆方向プライマーＢＴＫ＃２Ｒを、順方向プライマー：（ＢＴＫ＃２Ｆと呼ばれる）５’−ａｇｔｃｃｃａｃｃｔｔｃｃａａｇｔｃｃｔ−３’（配列番号：１０）と共に使用した。サーモサイクラーを使用する増幅には、以下のＰＣＲプロトコルを用いた：工程１−２分間９５°Ｃで変性させる、工程２−３０秒間９５°Ｃで変性させ、３０秒間５５°でアニール処理し、１．２５分間６８°Ｃで伸長させる、工程３−工程２を３９回繰り返す、工程４−５分間６８°Ｃで伸長させ、４°Ｃに冷やし、その後、−２０°Ｃで維持する。ＰＣＲ生成物の１０％は、エチジウムブロマイド・アガロースゲル電気泳動によって分析した。その後、サンプルの残りを、ＱｉａＱｕｉｃｋ ＰＣＲ生成物精製キットを用いて精製した。

【0305】

ＢＴＫオープンリーディングフレーム全体の両方の鎖の配列の決定は、Ｓｅｑｕｅｔｅｃｈによって設計され合成されたプライマーを使用して、Ｓｅｑｕｅｔｅｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（カリフォルニア州マウンテンビュー）で行なわれた。ＢＴＫ（受入番号ＮＭ＿００００６１．２）の野性型ｍＲＮＡ配列は、配列番号：３と表記される。耐性を有する患者＃１のＤＮＡ配列（２００−００４／２００−００７）は、配列番号：７と表記される。耐性を有する患者＃２のＤＮＡ配列（３５０−１０５）は配列番号：８と表記される。配列決定によると、処置でイブルチニブ／初期に受ける前に、２人の患者から集めた細胞中のｍＲＮＡ配列は野生型であり、すなわち、ＲＮＡは、ＢＴＫのアミノ酸タンパク質配列の位置４８１で正常なシステインをコード化することが明らかとなった。耐性を有する患者からの処置における研究終了時（ＥＯＳ）／後期からの細胞では、ｍＲＮＡの配列は、ｍＲＮＡがＢＴＫの位置４８１でシステインの代わりにセリンをコード化するように、変更される。耐性を有する患者＃１はチミン（ｔ）−１６３４からアデニン（ａ）−１６３４でミスセンス変異を有していた（すなわち、ｔ１６３４ａ）。この変異は、システイン−４８１コドン（ＴＧＣ）をＡＧＣ（セリン）に変化させる。耐性を有する患者＃２は、グアニン（ｇ）−１６３５からシトシン（ｃ）−１６３５でミスセンス変異を有していた（すなわち、ｇ１６３５ｃ）。この変異は、システイン−４８１コドン（ＴＧＣ）をＴＣＣ（セリン）に変化させる。

【0306】

非常に高感度な対立遺伝子に特異的なＰＣＲアッセイ（１％の分析感度）は、再発したサンプルのゲノムＤＮＡでの変異の存在をさらに確認し、これは、変異が患者の処置中に取得されたことを示唆するものであった。ゲノムＢＴＫ ＤＮＡのＰＣＲについては、以下の４つのプライマーが使用された：ＢＴＫｇ−Ｆ１：ＴＧＡＴＧＧＧＣＴＣＣＡＡＡＴＣＣＣＴＧ（配列番号：１３）、ＢＴＫｇ−Ｒ１：ＡＡＴＧＡＴＧＧＣＡＣＣＡＧＣＡＧＣ（配列番号：１４）、ＢＴＫｇ−Ｆ２：ＡＡＴＣＣＣＴＧＣＴＴＧＣＴＴＣＣＡＣＡ（配列番号：１５）、ＢＴＫｇ−Ｒ２：ＴＴＧＡＴＧＧＧＣＴＣＡＧＣＡＣＴＧＧ（配列番号：１６）。

【0307】

配列を決定するためのサンプルの調製のための別の方法では、全ＲＮＡは、ＱＩＡａｍｐ ＲＮＡ Ｂｌｏｏｄ ＭｉｎｉＫｉｔを使用して、処置の前、および、疾患進行の後に、患者のＰＢＭＣから単離した。ｍＲＮＡはｐｏｌｙＡ選択を用いて最初に精製され、グロビンＲＮＡ（発現分析）のために取り除き、その後、化学的に断片化した。ｍＲＮＡフラグメントは、逆転写のランダムヘキサマープライマーを用いて、一本鎖ｃＤＮＡに変換した。次に、第２の鎖を生成して二本鎖のｃＤＮＡを作成し、その後、末端を修復し、分子のそれぞれの末端で単一のＡ塩基を追加した。その後、フローセル表面への付着を可能にするアダプターは、フラグメントの各末端に連結される。アダプターは、独特のインデックス配列（発現分析）を包含しており、これにより、多重化の間にライブラリをプールすることができる。その後、ＰＣＲを行って連結した材料を増幅して濃縮することでｃＤＮＡライブラリを作成し、その後、クラスターの生成と、ＴｒｕＳｅｑ ＳＢＳキットを用いる直接的なＩｌｌｕｍｉｎａ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ ２０００）合成による配列決定が続く。対の末端の配列決定は、個別の配列決定レーン中で、それぞれのサンプルを用いて行われた。平均して８８ｘ範囲／サンプルで１億以上のリード数がもたらされた。

【0308】

＜実施例２＞
この実施例において、ＢＴＫ Ｃ４８１Ｓ変異を発現する細胞株が生成される。ＢＴＫ Ｃ４８１Ｓ変異をコード化する核酸は、発現ベクター構築物に挿入され、それによって、核酸はプロモーターに動作可能に結合されて、変異タンパク質が発現される。ＢＴＫ Ｃ４８１Ｓ構築物は、組換えタンパク質産生のために昆虫細胞などの細胞株に、または、ＣＨＯ細胞またはＪｕｒｋａｔＴ細胞、または、ニワトリＤＴ４０ ＢＴＫ−／−Ｂ細胞株、または、ヒトＢＴＫノックアウトＢ細胞株などのＢＴＫを欠く細胞株に安定的にトランスフェクトされる。

【0309】

細胞株は、第２世代の化合物をスクリーニングするために、または、キナーゼアッセイのような生体外のアッセイで使用される精製されたタンパク質を産生するために、使用される。

【0310】

生体外のアッセイについては、Ｃ４８１Ｓ ＢＴＫ組換えタンパク質は、昆虫細胞などの細胞の中で生成され、均一になるまで精製され、および、普遍的なタンパク質または特定の下流の基質（ＰＬＣγなど）を含む様々な基質に対するそのチロシンキナーゼに特異的な活性について評価し、そして、生体外のキナーゼアッセイにさらした（Ｃ４８１Ｓ、ＡＴＰ、補助因子Ｍｇ／Ｍｎ、ペプチド基質）。ＰＣｉ−３２７６５（イブルチニブ）は陰性対照として使用される。

【0311】

ニワトリＤＴ４０ＢＴＫ−／−またはヒトＢＴＫ−／−は、野性型ＢＴＫまたはＣ４８１Ｓ ＢＴＫのいずれかで安定的にトランスフェクトされ、ＨＴＳタイプの機能アッセイで用いられる。１つの実施例では、細胞を抗ＩｇＭ／Ｇで刺激して、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）を、したがって、これらの細胞株の下流のＢＴＫを連結して活性化する。１８時間の刺激の後、表面ＣＤ６９活性化は、連続する希釈した化合物を用いて、および、この化合物を用いずに、これらの細胞の中で評価される。Ｃ４８１Ｓに共有結合するＢＴＫ阻害剤は、細胞洗い出し実験後に、ＣＤ６９を阻害し減少させることが予想される。

【0312】

＜実施例３＞
イブルチニブは、キナーゼ活性の強力かつ不可逆な阻害をもたらす活性部位におけるＣ４８１のスルフヒドリル基を用いたマイケル付加によって、ＢＣＲシグナル伝達の本質的な成分であるＢＴＫに共有結合する（Ｈｏｎｉｇｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ， ＰＮＡＳ １０７（２９）： １３０７５−１３０８０）。構造モデルは、Ｃ４８１Ｓ変異がこの共有結合を破壊させるが、酵素の活性部位（図１）に適合するイブルチニブの能力までは破壊しないことを実証している。ＢＣＲシグナル伝達に応じて、ＬＹＮとＳＹＫはＹ５５１でＢＴＫをリン酸化し、キナーゼの活性化につながるＹ２２３でのＢＴＫ自己リン酸化を引き起こす。したがって、Ｙ２２３のリン酸化はこのようにしてＢＴＫ酵素活性を反映する。免疫ブロット法分析によると、患者がイブルチニブに応答する際には、ｐ−ＢＴＫ（Ｙ２２３）は基準と比較して減少し、疾患再発とともに増加した（図２Ａ、レーン３および４）ことが示された。ｐ−ＥＲＫの変化はｐ−ＢＴＫと同様の傾向を示しており、患者の臨床反応中に減少し、その後、疾患再発時に基準よりも上昇し、４週間後に再評価した際にはさらに増加していた。他方では、ｐ−ＡＫＴは、イブルチニブの処置で増加し、臨床経過に依存しては変化しなかった。全体として、ｐ−ＢＴＫとｐ−ＥＲＫの値の変化は互いに相関しており、変異によりイブルチニブの存在下でＢＣＲシグナル伝達が可能となることを示唆している。

【0313】

典型的な方法では、部位Ｙ５５１のＢＴＫリン酸化、および、特定の関連するシグナル伝達の事象は、ヒトＢＴＫをコード化するプラスミドでトランスフェクトされる培養細胞（例えば、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞）を用いてフローサイトメトリーアッセイによりモニタリングされる。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の発現は、ＢＴＫ中のＹ５５１部位の構成的なリン酸化を生じさせ、これは、蛍光結合した抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ｃａｔａｌｏｇ ＃５５８１３４）を用いて、フローサイトメトリーによってこれは検知可能である。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞中のＢＴＫの発現によっても、Ｔ２０２／Ｙ２０４でのＥｒｋのリン酸化をもたらし、これは、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ｃａｔａｌｏｇ ＃６１２５６６を用いて、フローサイトメトリーによって検知可能である。ＢＴＫ中のＹ５５１とＥｒｋ中のＴ２０２／Ｙ２０４のリン酸化は、イブルチニブ（および、ダサチニブ）を用いた処置によって用量依存的に阻害され、ＢＴＫのキナーゼ不活性変異が野性型またはＣ４８１Ｓ ＢＴＫの代わりに発現されると、構成的なリン酸化は生じず、このことは、このようなリン酸化事象が生じるには、ＢＴＫキナーゼ活性が必要であることを示している。全ＢＴＫのの発現レベルは、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ｃａｔａｌｏｇ＃５５８５２７を用いて、フローサイトメトリーによってモニタリングされる。

【0314】

細胞を調製するための典型的な手順は、以下のとおりである：ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を１０ｃｍのプレートに播種し、一晩中付着させる。ＣＭＶプロモーターによる制御下で、ヒト野性型またはＣ４８１Ｓ変異ＢＴＫ、あるいは、Ｃ４８１Ａ変異ＢＴＫまたはＫ４３０Ａ変異ＢＴＫ（カルボキシル末端６Ｈｉｓ融合）を含むプラスミドを用いたリン酸カルシウム法を駆使して、この細胞をトランスフェクトする。トランスフェクションの約１６時間後、細胞を分離させ、マルチウェルプレートに播種する。約２４時間後、細胞をイブルチニブまたは他の阻害剤で処置し、パラホルムアルデヒドでもとの場所で固定するか、あるいは、あるいは、機械的に分離させ、新鮮な薬剤を含まない培地に洗い流し、１．５時間インキュベートして、その後、固定した。透過処理した細胞を、指定のＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓの蛍光標識した抗体で染色し、ＢＤ ＣａｎｔｏＩＩフロサイトメーター上で分析した。ＦｌｏｗＪｏソフトウェアとＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−ｍｉｎｕｓ−ｏｎｅ対照を用いて、陽性細胞集団上でゲート制御し、ゲートはそれぞれのサンプルに等しく適用される。全陽性細胞数はＢＴＫ発現細胞の比率として得られる。

【0315】

＜実施例４＞
この実施例において、患者の遺伝子発現データを分析した。確立している２７遺伝子のＢＣＲ発現シグネチャー（Ｂｌｏｏｄ． ２０１１ Ｊａｎ １３；１１７（２）：５６３−７４）を用いる遺伝子発現のＲＮＡ−Ｓｅｑデータは、応答する患者のＢＣＲ特性が基準となる前処置と比較してダウンレギュレートしたことを実証している（図２Ｂ）。しかしながら、遺伝子のこのクラスターの発現は、初期の評価時と４週間後の両方の再発段階で増加した。

【0316】

ＲＮＡ−Ｓｅｑを実現するために、ＱＩＡａｍｐ ＲＮＡ Ｂｌｏｏｄ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔを用いて、全ＲＮＡを処置の前と疾患進行の後に、患者のＰＢＭＣから単離した。ｐｏｌｙＡの選択を用いてｍＲＮＡをまず精製し、グロビンＲＮＡ（発現分析）のために取り除き、その後、化学的に断片化した。ｍＲＮＡフラグメントを、逆転写のランダムヘキサマープライマーを用いて、一本鎖ｃＤＮＡに変換した。次に、第２の鎖を生成して二本鎖のｃＤＮＡを作成し、その後、末端を修復して、分子のそれぞれの末端で単一のＡ塩基を追加した。フローセル表面への付着を可能にするアダプターをその後、フラグメントのそれぞれの末端に連結する。アダプターは、独特のインデックス配列（発現分析）を包含しており、これにより、多重化の間にライブラリをプールすることができる。その後、ＰＣＲを行って、連結した材料を増幅して濃縮することでｃＤＮＡライブラリを作成し、その後、クラスターの生成と、ＴｒｕＳｅｑ ＳＢＳキットを用いる直接的なＩｌｌｕｍｉｎａ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ ２０００）合成による配列決定が続く。対の末端の配列決定は、個別の配列決定レーン中で、それぞれのサンプルを用いて行われた。 平均して８８ｘ範囲／サンプルで１億以上のリード数がもたらされた。リード数は、Ｂｏｗｔｉｅ２アライナー を含むＴｏｐＨａｔ ｐａｃｋａｇｅを用いて、ＨＧ１９ゲノムアセンブリに位置合わせした。ゲノムまたは潜在的なＰＣＲ複製物にマッピングされないリード数は、ｓａｍｔｏｏｌｓを用いて除外された。カフスリンクとｃｕｆｆｍｅｒｇｅは、転写物発現の値を定量化するために用いられた。１００万のマップされたリード数（ＲＰＫＭ）当たりの１キロベース当たりのリード数が計算され、それぞれの転写物配列にマッピングされたリード数は、ｋｂの鋳型長さによって正常化され、全体のトランスクリプトームマップするリード数によって分割された。ＢＣＲシグネチャー遺伝子の階層的クラスター分析は、Ｃｌｕｓｔｅｒ３．０ソフトウェアを使用して実行され、ヒートマップはＴｒｅｅＶｉｅｗを用いて生成された。

【0317】

顕著に、遺伝子発現の変化の傾向は、ｐ−ＢＴＫおよびｐ−ＥＲＫの変化の傾向と類似していた。総合すれば、変異分析、シグナル伝達、および、遺伝子発現解析プロファイリングからのデータは、１）ＢＴＫ Ｃ４８１Ｓ変異を獲得することにより、イブルチニブの存在下でＣＬＬ細胞のＢＣＲシグナル伝達が可能となること、および、２）処置の経過にわたってＢＣＲシグナル伝達活性は、患者の疾患の状態と相互に関連することを、強く示唆したものである。

【0318】

＜実施例５＞
この実施例は、イブルチニブが、応答する患者の末梢血からのＣＬＬ細胞の増殖を阻害するが、ＢＴＫ Ｃ４８１Ｓ変異で再発した患者からの細胞の増殖を阻害しないということを実証している。Ｋｉ−６７＋細胞の数と細胞の大きさは、応答する患者においてイブルチニブによる処置の経過中に減少したが、変異で再発した患者の処置ではそうではなかった。現在の患者からの一連のサンプルの分析は、応答しているサンプル中に、４．５％から０．５３％までのＫｉ−６７＋陽性細胞の割合の減少を示した。再発１において、Ｋｉ−６７＋細胞の数は５．３％に増え、その後、再発２の８．０％まで増加した（図３Ａ）。増殖に対するイブルチニブの影響を立証するさらなる証拠として、再発後の増殖の増加を反映する細胞の大きさの変化も実証された（図４）。現在の研究では、増殖性のＣＬＬ集団の大きさは、再発したサンプルでは、１９−２０％から３５−３６％まで増加した（図３Ｂ、第２の欄）。イブルチニブ（２５０または５００ｎＭ）による患者のＣＬＬ細胞の処置は、事前のＲｘおよび応答性のサンプルにおけるＢｒｄＵの取り込みを完全に遮断した（図３Ｂ、上の二列、第３と第４の欄ＶＳ第２の欄）。しかしながら、再発したサンプルでは、いくつかの増殖性のＣＬＬ細胞は残った（図３Ｂ、下の二列、第２、第３、第４欄ＶＳ第１欄）。したがって、イブルチニブに対するＣＬＬの生体外での増殖反応は、イブルチニブ処置に対して患者の臨床経過および獲得した耐性に一致する。

【0319】

フローサイトメトリーで使用される抗体は、ＢＤ（カリフォルニア州サンノゼ）から購入され、説明書に従って使用した：ＣＤ３−Ｖ５００、ＣＤ１９−ＡＰＣＣｙ７、ＣＤ１９−ＡＰＣ、ＣＤ５−ＰｅｒＣＰＣｙ５．５、ＣＤ５−ＦＩＴＣ、ＣＸＣＲ４−ＰＥＣｙ７、ＣＸＣＲ４−ＰＥ、ＣＤ３８−ＰＥ、ＣＤ６２Ｌ−ＰＥ、ＣＣＲ７−Ｖ４５０、ＣＸＣＲ３−Ａｌｅｘａ４８８、ＣＸＣＲ５−Ａｌｅｘａ６４７、ＣＤ４９ｄ−ＡＰＣ、ＣＤ２９−ＰＥ、ＣＤ４４−Ｖ４５０、ＣＤ５４−ＰＥ、ＣＤ１１ａ−ＡＰＣ、ＣＤ１１ｃ−Ｖ４５０、ＣＤ１８−ＦＩＴＣ、ＣＤ４０−ＰＥＣｙ７、Ｋｉ６７−Ａｌｅｘａ４８８、Ｉｇ ｋ軽鎖ＡＰＣ、Ｉｇ ｌ軽鎖ＦＩＴＣ。ウェスタンブロット法に使用された抗体：ＥＲＫ１と２に対するｐｈｏｓｐｈｏ−ｐ４４／４２ＭＡＰ キナーゼ［Ｔ２０２／Ｙ２０４］、ＰＫＢ／ＡＫＴに対するｐｈｏｓｐｈｏ−ＡＫＴ［Ｓｅｒ４７３］（マサチューセッツ州イプスウィッチのＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｋａｂｓ）、ＢＴＫに対するｐｈｏｓｐｈｏ−ＢＴＫ［Ｙ５５１］（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＢＴＫに対するｐｈｏｓｐｈｏ−ＢＴＫ［Ｙ２２３］（カリフォルニア州バーリンゲームのＥｐｉｔｏｍｉｃｓ）、および、ＰＬＣγ２に対するｐｈｏｓｐｈｏＰＬＣγ２［Ｙ７５９］（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、抗ＥＲＫ２（Ｃ−１４；カリフォルニア州サンタクルーズのＳａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、抗ＡＫＴ（Ｈ−１３６；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、抗ＢＴＫ（クローン５３；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ヤギＦ（ａｂ）’２、抗ヒトＩｇＭ（ＬＥ／ＡＦ；アラバマ州バーミンガムのＳｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）−結合したウサギ抗マウス、および、ＨＲＰ結合したヤギ抗ウサギ（ヒューストン州テキサスのＤＡＫＯ）。

【0320】

＜実施例６＞
この実施例は、ＢＣＲまたは代替的な経路の他の阻害剤が、ＣＬＬ増殖を抑止し、Ｃ４８１Ｓ変異によって引き起こされた耐性を無効にすることができることを実証している。生体外のＣＬＬ増殖モデルを用いて、イブルチニブに加えて、ＧＳ−１１０１（ＣＡＬ−１０１、ＰＩ３Ｋｄｅｌｔａ阻害剤）、ダサチニブ（下流のＢＣＲはＬＹＮおよびＢＴＫを標的とする）、ＰＲＴ０６２０７０（ＳＹＫ／ＪＡＫの二重阻害剤）、ＰＲＴ０６０３１８（非常に特異的なＳＹＫ阻害剤、ｒｅｆ）、および、トファシチニブ（ＪＡＫ阻害剤）で、細胞を処置した。図３Ｃは、イブルチニブとＧＳ−１１０１が増殖を３１％から１２−１４％に減少させたこと、その一方で、トファシチニブが増殖を２１％までしか減らせなかったことを示している。ダサチニブ、および、ＳＹＫに対する活性を有する２つの阻害剤（ＰＲＴ０６２０７０とＰＲＴ０６０３１８）は、増殖を完全に阻害した。これらの結果は、ＢＴＫ変異ＣＬＬ細胞は、ＢＣＲ阻害に高感度なままであることを示唆するものである。したがって、ＬＹＮ、ＳＹＫ、ＪＡＫ、ＰＩ３Ｋ、ＰＬＣγ、ＭＡＰＫ、ＭＥＫ、ＮＦκＢの追加または代替的な阻害剤、ＢＴＫの他の共有結合阻害剤、または、ＢＴＫの他の可逆的な阻害剤も、Ｃ４８１Ｓ変異を有する患者に有効であると予想される。

【0321】

＜実施例７＞
イブルチニブ単独のまたは組み合わせた治療の初期の治験には、平均して１４か月イブルチニブを投与された２４６人のＣＬＬ患者が登録された。ゲノムの比較分析の前のＲＮＡｓｅｑと全エクソームの配列（ＷＥＳ）の配列決定は、基準時に、かつ、進行性の疾患（ＰＤ）の再発後に行なわれ、３人の患者のサンガーシーケンシングによって、イブルチニブに対する耐性を獲得したことが確認された。ＲＮＡｓｅｑとＷＥＳのデータは、ＴｏｐＨａｔおよびＢＷＡソフトウェアを用いて揃えた。１つのヌクレオチド変化（ＳＮＶ）が、ＳＡＭｔｏｏｌｓ ｍｐｉｌｅｕｐを使用して同定された。従来の化学療法によって再発した患者と比較すると、最小のゲノムの変化は、相対的なゲノムの安定を反映する、イブルチニブに対する耐性を有する患者において得られた。ＳＮＶは再発サンプルに特有の３人の患者で発見された。３人の患者のうちの２人が、ＢＴＫの位置４８１でシステインからセリンへの置換をそれぞれコード化する異なるＳＮＶを有していた（Ｃ４８１Ｓ）。ＢＭＸ、ＩＴＫ、ＴＥＣ、および、ＢＬＫ中の相同するシステイン残基は、野生型であった（ＷＴ）。イブルチニブによる組換えＣ４８１Ｓの阻害は、ＷＴの１／２５倍の効能しかなく、細胞の中で発現したＣ４８１Ｓを共有結合することができない。第３の患者は、ＷＴ ＢＴＫを有していたが、潜在的な機能獲得型、すなわち、構成的なＰＬＣγ２活性化と一貫して、ＢＴＫの基質であるＲ６６５Ｗ置換をコード化する、ＰＬＣγ２のエキソン１９中にｃ１９９３ｔを獲得した。

【0322】

イブルチニブに初期に応答し、その後、薬剤耐性を有するようになった患者に関する後の研究では、２つの追加の変異が同定された。核酸の配列決定により、処置の初めに得られた患者の血液サンプルは野生型であり、一方で、医師の指定する疾患の信号に採取されたサンプルは、以下の部位で変化したことが明らかになった：１）１人の患者はＰＬＣγ２の変異を獲得したことが分かった。変異はインフレームの単一ヌクレオチド点突然変異：ｃ２１２０ｔ（すなわち、ＰＬＣγ２コード化領域のシトシンの代わりに、位置２１２０でのチミン）である。変異は、コドン７０７におけるセリンのフェニルアラニンへの置換を含むＰＬＣγ２タンパク質をもたらす（Ｓ７０７Ｆ）。２）１人の患者はＣＡＲＤ１１の変異を獲得したことが分かった。変異は、ＣＡＲＤ１１コード化領域のヌクレオチド位置６９４と６９５の間での３つのチミンヌクレオチドの挿入である。変異は６９４＿６９５ｉｎｓＴＴＴと名付けられた。変異は、ロイシン−２３２とリジン−２３３の間のロイシン・コドンの挿入を含むＣＡＲＤ１１タンパク質をもたらす。変異はＬ２３２＿Ｋ２３３ｉｎｓＬまたはＬ２３２ＬＬと呼ばれる（ＣＡＲＤ１１ ｍＲＮＡの翻訳のための代替的な開始部位があることに注意する。いくつかの例においては、この部位におけるＣＡＲＤ１１変異は、２３２の代わりに位置２２５として知られている）。

【0323】

Ｓ７０７Ｆ変異は、ＰＬＣγ２タンパク質の恒常的活性をもたらす機能獲得型変異であると予想される。ＰＬＣγ２中の同様の変異（Ｓ７０７Ｙ）は、Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ． ｉｎ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ （２０１２） ９１；７１３−７２０で記載されており、ＰＬＣγ２タンパク質に恒常的活性を与え、自己炎症性および免疫不全性の疾患をもたらす。Ｒ６６５Ｗ変異のように、Ｓ７０７Ｆは、自己抑制的なカルボキシル末端ＳＨ２ドメインにある。ＰＬＣγ２がＢＴＫの下流にあると仮定すると、機能獲得型の構成的なＰＬＣγ２活性を与える効果により、イブルチニブに対する耐性を有する薬剤が支持される。

【0324】

ＣＡＲＤ１１ Ｌ２３２ＬＬ変異タンパク質は、恒常的活性を有すると予想される。同様の変異は、Ｌｅｎｚ ｅｔ ａｌ． ｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ （２００８） ３１９； １６７６−１６７９で記載されるように、Ｂ細胞リンパ腫患者のサンプル（２３２と２３３の間のイソロイシン挿入）で見られた。Ｌｅｎｚらによって記載されたように、変異は、下流のＮＦ−ｋＢ経路の恒常的活性を与え、細胞の生存を高めた。ＰＬＣγ２のように、ＣＡＲＤ１１は、Ｂｔｋの下流で活性化されるタンパク質である。ＣＡＲＤ１１は、ＢｔｋとＰＬＣｇ２の下流のエフェクターであるＰＫＣｂｅｔａによって、リン酸化および活性化される。したがって、恒常的活性を与えるＣＡＲＤ１１中の機能獲得型変異は、Ｂｔｋを迂回し、イブルチニブのようなＢｔｋ阻害剤の存在下で細胞が成長と抗アポトーシス性のシグナル伝達経路を活性化することを可能にすることもある。Ｌ２３２ＬＬ変異は、ＣＡＲＤ１１オリゴマー化とＮＦ−ｋＢの活性化にとって重要なアミノ末端コイルドコイルドメインにあり、ここではＣＡＲＤ１１の複数の異なる変異がＢ細胞リンパ腫の患者の検体で見つかっている。

【0325】

本明細書中に記載される例および実施形態は、例示を目的に過ぎず、当業者に提示される様々な改良または変更は、本出願の精神と範囲に、および、添付の請求項の範囲に含まれるものとする。

【図1】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図4】