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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】6578275
(24)【登録日】2019年8月30日
(45)【発行日】2019年9月18日
(54)【発明の名称】チオール標識のための３−アリールプロピオニトリル化合物
(51)【国際特許分類】
C07C 319/18 20060101AFI20190909BHJP
C07K 1/13 20060101ALI20190909BHJP
C07C 255/37 20060101ALI20190909BHJP
C07C 255/42 20060101ALI20190909BHJP
C07C 255/44 20060101ALI20190909BHJP
C07C 255/43 20060101ALI20190909BHJP
C07C 255/35 20060101ALI20190909BHJP
C07C 255/40 20060101ALI20190909BHJP
C07C 255/41 20060101ALI20190909BHJP
C07C 309/42 20060101ALI20190909BHJP
C07C 331/28 20060101ALI20190909BHJP
C07C 335/22 20060101ALI20190909BHJP
C07C 309/13 20060101ALI20190909BHJP
C07C 321/14 20060101ALI20190909BHJP
C07F 5/04 20060101ALI20190909BHJP
C07F 9/54 20060101ALI20190909BHJP
C07F 7/10 20060101ALI20190909BHJP
G01N 33/58 20060101ALI20190909BHJP
C07D 337/04 20060101ALI20190909BHJP
C07D 409/06 20060101ALI20190909BHJP
C07D 249/06 20060101ALI20190909BHJP
C07D 265/38 20060101ALI20190909BHJP
C07D 405/12 20060101ALI20190909BHJP
C07D 207/448 20060101ALI20190909BHJP
G01N 21/64 20060101ALI20190909BHJP
C07C 321/18 20060101ALI20190909BHJP
【ＦＩ】
C07C319/18
C07K1/13
C07C255/37CSP
C07C255/42
C07C255/44
C07C255/43
C07C255/35
C07C255/40
C07C255/41
C07C309/42
C07C331/28
C07C335/22
C07C309/13
C07C321/14
C07F5/04 C
C07F9/54
C07F7/10 J
G01N33/58 A
G01N33/58 Z
C07D337/04
C07D409/06
C07D249/06 501
C07D265/38
C07D405/12
C07D207/448
G01N21/64 F
C07C321/18
【請求項の数】5
【全頁数】100
(21)【出願番号】特願2016-522652(P2016-522652)
(86)(22)【出願日】2014年7月4日
(65)【公表番号】特表2016-536292(P2016-536292A)
(43)【公表日】2016年11月24日
(86)【国際出願番号】EP2014064387
(87)【国際公開番号】WO2015001117
(87)【国際公開日】20150108
【審査請求日】2017年6月22日
(31)【優先権主張番号】13305950.1
(32)【優先日】2013年7月4日
(33)【優先権主張国】EP
(73)【特許権者】
【識別番号】509228260
【氏名又は名称】ユニヴェルシテ・ドゥ・ストラスブール
(73)【特許権者】
【識別番号】500531141
【氏名又は名称】セントレ・ナショナル・デ・ラ・レシェルシェ・サイエンティフィーク
(74)【代理人】
【識別番号】100108453
【弁理士】
【氏名又は名称】村山 靖彦
(74)【代理人】
【識別番号】100110364
【弁理士】
【氏名又は名称】実広 信哉
(74)【代理人】
【識別番号】100133400
【弁理士】
【氏名又は名称】阿部 達彦
(72)【発明者】
【氏名】アラン・ワーグナー
(72)【発明者】
【氏名】オレクサンドル・コニエフ
【審査官】
奥谷 暢子
(56)【参考文献】
【文献】
特表２０１１−５１５６９８（ＪＰ，Ａ）
【文献】
特表２００５−５０３３７２（ＪＰ，Ａ）
【文献】
FURSTNER, Alois, et al.，JOURNAL OF THE AMERICAN CHEMICAL SOCIETY，２００１年，123(48)，pp. 11863-11869
【文献】
LACY, Adam R. , et al.，EUROPEAN JOURNAL OF ORGANIC CHEMISTRY，２０１３年，2013(5)，pp. 869-879
【文献】
GOVINDAPPA, Vasanth Kumar, et al.，DER PHARMA CHEMICA，２０１２年，4(6)，pp. 2283-2287
【文献】
TANCINI, Francesca, et al.，EUROPEAN JOURNAL OF ORGANIC CHEMISTRY，２０１２年，2012(14)，pp. 2756-2765
【文献】
MCINTOSH, Melissa L. , et al.，THE JOURNAL OF ORGANIC CHEMISTRY，２０１２年，77(2)，pp. 1101-1112
【文献】
ESTARELLAS, Carolina, et al.，CHEMPHYSCHEM，２０１１年，12(15)，pp. 2742-2750
【文献】
LUCAS, Xavier, et al.，THE JOURNAL OF PHYSICAL CHEMISTRY A，２０１０年，114(4)，pp. 1926-1930
【文献】
WEBER, Daniela, et al.，Z. Naturforsch，２００７年，62c，pp. 567-570
【文献】
KIM, Joong-Gon, et al.，TETRAHEDRON LETTERS，２００７年，48(13)，pp. 2299-2301
【文献】
WANG, Teng, et al.，ADVANCED SYNTHESIS & CATALYSIS，２０１３年，355(6)，pp. 1207-1210
【文献】
BORIS TROFIMOV; ANASTASIYA MAL'KINA; OLESYA SHEMYAKINA，SYNTHESIS OF FUNCTIONALIZED L-CYSTEINE AND L-METHIONINE BY REACTION WITH 以下備考，SYNTHESIS, [ONLINE]，THIEME CHEMISTRY，２００９年 ７月１０日，VOL:2009, NR:18,，PAGE(S):3136 - 3142，ELECTRON-DEFICIENT ACETYLENES，ＵＲＬ，http://dx.doi.org/10.1055/s-0029-1217602
(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）
Ｃ０７Ｃ ３１９／１８
Ｃ０７Ｃ ２５５／３５
Ｃ０７Ｃ ２５５／３７
Ｃ０７Ｃ ２５５／４０
Ｃ０７Ｃ ２５５／４１
Ｃ０７Ｃ ２５５／４２
Ｃ０７Ｃ ２５５／４３
Ｃ０７Ｃ ２５５／４４
Ｃ０７Ｃ ３０９／１３
Ｃ０７Ｃ ３０９／４２
Ｃ０７Ｃ ３２１／１４
Ｃ０７Ｃ ３２１／１８
Ｃ０７Ｃ ３３１／２８
Ｃ０７Ｃ ３３５／２２
Ｃ０７Ｄ ２０７／４４８
Ｃ０７Ｄ ２４９／０６
Ｃ０７Ｄ ２６５／３８
Ｃ０７Ｄ ３３７／０４
Ｃ０７Ｄ ４０５／１２
Ｃ０７Ｄ ４０９／０６
Ｃ０７Ｆ ５／０４
Ｃ０７Ｆ ７／１０
Ｃ０７Ｆ ９／５４
Ｃ０７Ｋ １／１３
Ｇ０１Ｎ ２１／６４
Ｇ０１Ｎ ３３／５８
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
チオール部位を含む標識化合物の調製のための方法であって、チオール部位を含む化合物を、式（Ｉ）：
式中、Ｒ１〜Ｒ５が、それぞれ：
− 水素原子、
− Ｏ、ＮおよびＳの中から選択された少なくとも１つのヘテロ原子によって場合により中断されたアルキル、アルケンまたはアルキン基、
− アリール基、
− アルコキシ基、
− ハロゲン原子、
− アミノ（−ＮＲＲ’）基、式中、ＲおよびＲ’は、独立して、水素原子、アルキル、アルケン、アルキンまたはアリール基である、
− ヒドロキシルアミン（−ＯＮＨ２）基、
− ヒドラジン（−ＮＨ−ＮＨ２）基、
− ニトロ（−ＮＯ２）基、
− アジド（−Ｎ３）基、
− ジアゾニウム（−Ｎ２＋）基、
− マレイミド基、
− アルキルまたはアリールカルボキシル（−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ）基、
− アルキルまたはアリールカルボニル（−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ）基、
− ヒドロキシル（−ＯＨ）基、
− ホウ酸−Ｂ（ＯＲ”）２基、式中、Ｒ”は水素原子またはアルキル基である、
− ホスフィンまたはホスホニウム基、
− イソシアネート（−Ｎ＝Ｃ＝Ｏ）またはイソチオシアネート（−Ｎ＝Ｃ＝Ｓ）基、
− クロロスルホニル（−ＳＯ２Ｃｌ）基、
− −Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｃ（Ｎ２）−ＣＦ３基または−Ｃ（＝Ｏ）−Ｃ（Ｎ２）−ＣＦ３基、
− −Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨＳ、過フッ素化エステルおよびアシルウレアから選択される活性化エステル、
− −Ｃ≡Ｃ−Ｃ≡Ｎ基、ならびに
− 先に列挙された基の少なくとも１つによって置換されたアルキル基
からなる群から独立して選択され、
Ｒ１〜Ｒ５の少なくとも１つが、場合により、リンカー基を通じてフェニル環に結合し、かつ、抗体、薬物、または蛍光プローブから選択される、タグ部位を含む；
の化合物と接触させることを含む方法。
【化1】
− 水素原子、
− Ｏ、ＮおよびＳの中から選択された少なくとも１つのヘテロ原子によって場合により中断されたアルキル、アルケンまたはアルキン基、
− アリール基、
− アルコキシ基、
− ハロゲン原子、
− アミノ（−ＮＲＲ’）基、式中、ＲおよびＲ’は、独立して、水素原子、アルキル、アルケン、アルキンまたはアリール基である、
− ヒドロキシルアミン（−ＯＮＨ２）基、
− ヒドラジン（−ＮＨ−ＮＨ２）基、
− ニトロ（−ＮＯ２）基、
− アジド（−Ｎ３）基、
− ジアゾニウム（−Ｎ２＋）基、
− マレイミド基、
− アルキルまたはアリールカルボキシル（−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ）基、
− アルキルまたはアリールカルボニル（−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ）基、
− ヒドロキシル（−ＯＨ）基、
− ホウ酸−Ｂ（ＯＲ”）２基、式中、Ｒ”は水素原子またはアルキル基である、
− ホスフィンまたはホスホニウム基、
− イソシアネート（−Ｎ＝Ｃ＝Ｏ）またはイソチオシアネート（−Ｎ＝Ｃ＝Ｓ）基、
− クロロスルホニル（−ＳＯ２Ｃｌ）基、
− −Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｃ（Ｎ２）−ＣＦ３基または−Ｃ（＝Ｏ）−Ｃ（Ｎ２）−ＣＦ３基、
− −Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨＳ、過フッ素化エステルおよびアシルウレアから選択される活性化エステル、
− −Ｃ≡Ｃ−Ｃ≡Ｎ基、ならびに
− 先に列挙された基の少なくとも１つによって置換されたアルキル基
からなる群から独立して選択され、
Ｒ１〜Ｒ５の少なくとも１つが、場合により、リンカー基を通じてフェニル環に結合し、かつ、抗体、薬物、または蛍光プローブから選択される、タグ部位を含む；
の化合物と接触させることを含む方法。
【請求項2】
式（Ｉ）：
式中、Ｒ１〜Ｒ５は、請求項１に定義されている通りである、
の化合物。
【化2】
の化合物。
【請求項3】
以下：
からなる群から選択される、化合物。
【化3-1】
【化3-2】
【化3-3】
【請求項4】
化合物が、以下：
からなる群から選択される、請求項３に記載の化合物。
【化4】
【請求項5】
式（ＩＩＩ）：
式中、Ｒ１〜Ｒ５は、請求項１に記載の通りであり、Ｒ６−Ｓが、少なくとも１つのチオール部位を含むＲ６−ＳＨであるタンパク質に由来する；
の化合物。
【化5】
の化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、チオール部位を含む化合物を３−アリールプロピオニトリル化合物によって標識するための方法、タグ部位によって置換された３−アリールプロピオニトリル化合物、および特定の３−アリールプロピオニトリルリンカーに関する。
【背景技術】
【0002】
ヒトタンパク質の９０％超がシステインを含有する一方で、ヒトプロテオームのコンピュータ内消化では、質量分析（ＭＳ）によって検出可能な全てのヒトトリプシンペプチドのうち約１５％だけが、その配列において、少なくとも１種のシステインを含有することが明らかになった。この観察は、側鎖における高反応性チオール基の存在と組み合わされて、システインを化学標識の魅力的な標的にする。システインは、タンパク質に存在する傾向にあるあらゆる他の求核官能基の反応性を大幅に超える求核スルフヒドリル（またはチオール）基（−ＳＨ）を持つ唯一のコード化アミノ酸である。その結果、化学特異的なシステイン誘導体化は、間違いなく、タンパク質の化学的タグ付けのための最も広く用いられている方法である。これまで文献において報告されている膨大な量の化学的なシステイン修飾方法の中でも、Ｎ−置換マレイミド、４−ビニルピリジンおよびヨードアセトアミドなどの試薬が最も一般的に用いられている。これらはいずれも、この役割には適しているが、システイン標識のための理想的な方法ではないという欠点を持っている。かかる欠点は、主に、特にヨードアセトアミドおよびマレイミドに関する望ましくない副反応が存在すること、ならびに、可逆性のチオール交換および他の副反応に起因して、付加物が生体環境において不安定であるということである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0003】
本発明は、少なくとも１つのチオール部位を含む化合物、例えばシステインを、タグ部位および３−アリールプロピオニトリル部位を含む化合物によって標識するための方法に関する。上記化合物およびシステイン誘導体を含むその付加物は、広範な条件において予想外の安定性を示す。そのため、本発明のチオール部位を含む化合物を標識するための方法は、広範な用途に用いられ得る。
【課題を解決するための手段】
【0004】
本発明の第１目的は、チオール部位を含む標識化合物の調製のための方法であって、チオール部位を含む化合物を式（Ｉ）の化合物：【化1】
【0005】
本発明の別の目的は、式（Ｉ）：【化2】
【0006】
本発明の別の目的は、式（ＩＩ）：【化3】
【0007】
本発明の別の目的は、式（ＩＩＩ）：【化4】
【図面の簡単な説明】
【0008】
【図2c】図２ｃ）：化合物ＡおよびＢ、ＴＡＭＲＡの重ね合わせならびにヘキスト標識によって処理した細胞の顕微鏡写真。核の周囲の白色スポットは、加水分解されたプローブに相当する。Ａ−アリールプロピオニトリルプローブ、Ｂ−マレイミドプローブ。
【化5】
【図4】図４：２５℃、１ｍＭの濃度におけるＰＢＳ（１×、ｐＨ７．６）中のＮ−（４−（シアノエチニル）フェニル）アセトアミド（ｐＮＨＡｃ−ＡＰＮ、１１）の加水分解のＨＰＬＣモニタリング。転換は、出発物質の消失によってモニタリングした；ピークは、最古から最新のものまで
【化6】
【発明を実施するための形態】
【0009】
本発明の第１目的は、チオール部位を含む化合物の標識のための方法であって、チオール部位を含む化合物を、式（Ｉ）：【化7】
− 水素原子、
− Ｏ、ＮおよびＳの中から選択された少なくとも１つのヘテロ原子によって場合により中断されたアルキル、アルケンまたはアルキン基、
− アリール基、
− アルコキシ基、
− ハロゲン原子、
− アミノ（−ＮＲＲ’）基、式中、ＲおよびＲ’は、独立して、水素原子、以下に定義するアルキル、アルケン、アルキンまたはアリール基である、
− ヒドロキシルアミン（−ＯＮＨ２）基、
− ヒドラジン（−ＮＨ−ＮＨ２）基、
− ニトロ（−ＮＯ２）基、
− アジド（−Ｎ３）基、
− 場合により対イオンの存在下にジアゾニウム（−Ｎ２＋）基、
− マレイミド基、
− アルキルまたはアリールカルボキシル（−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ）基、式中、Ｒは、上記の通りである、
− アルキルまたはアリールカルボニル（−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ）基、式中、Ｒは、上記の通りである、
− ヒドロキシル（−ＯＨ）基、
− ホウ酸−Ｂ（ＯＲ”）２基、式中、Ｒ”は水素原子またはアルキル基である、
− ホスフィンまたはホスホニウム基、
− イソシアネート（−Ｎ＝Ｃ＝Ｏ）またはイソチオシアネート（−Ｎ＝Ｃ＝Ｓ）基、
− クロロスルホニル（−ＳＯ２Ｃｌ）基、
− −Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｃ（Ｎ２）−ＣＦ３基または−Ｃ（＝Ｏ）−Ｃ（Ｎ２）−ＣＦ３基、
− 活性化エステル、例えば−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨＳ、式中、ＮＨＳは、Ｎ−ヒドロスクシンイミジル、過フッ素化エステル、およびアクリルウレアを表す、
− −Ｃ≡Ｃ−Ｃ≡Ｎ基、
− タグ、ならびに
− 先に列挙された基の少なくとも１つによって置換されたアルキル基
からなる群から独立して選択され、
Ｒ１〜Ｒ５の少なくとも１つが、タグ部位を含み、好ましくはタグ部位であり、
代替的には、Ｒ１〜Ｒ５のうち２つが、これらが連結するフェニル環の炭素原子と一緒になって、少なくとも１つのヘテロ原子、例えばＰ、ＯまたはＳを場合により含む、飽和、不飽和または芳香族の単または多環式環を形成していてよい；
の化合物と接触させることを含む方法である。
【0010】
式（Ｉ）の化合物から構成されているタグ部位は、フェニル環に直接結合していてよい。また、該タグ部位は、「リンカー」基、例えばＣＯＯ、ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ、ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ、トリアゾール、またはＣＯＮＨ基を通してフェニル環に結合していてもよい。また、該タグ部位は、上記のＲ１〜Ｒ５基の１つの置換基として存在していてもよい。好ましい実施形態において、Ｒ３は、タグ部位を含み、Ｒ３は、好ましくはタグ部位である。
【0011】
本発明において、用語「アルキル」は、１〜２０個の炭素原子、好ましくは１〜６個の炭素原子、特に１〜３個の炭素原子を含む線状、環状または分枝状炭化水素基に関する。アルキル基の中でも、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシルおよびシクロヘキシル基を挙げることができる。本発明によるアルキル基は、Ｓｉ、Ｎ、ＯおよびＳから選択される少なくとも１つのヘテロ原子によって中断されていてよい。少なくとも１つのヘテロ原子によって中断されたアルキル基の中でも、式−（ＯＣＨ２−ＣＨ２）ｎ−ＯＨ：式中、ｎは１〜１０００、好ましくは１〜１００、特に１〜８である；のポリエチレングリコール基を挙げることができる。本発明によるアルキル基は、少なくとも１つのハロゲン原子によって置換されていてよい。
【0012】
用語「アルケン」は、少なくとも１つのＣ＝Ｃ二重結合をさらに含む、先に定義したアルキル基に関する。
【0013】
用語「アルキン」は、少なくとも１つのＣ≡Ｃ三重結合をさらに含む、先に定義したアルキル基に関する。アルキン基の中でも、例えば、アセチレンおよびシクロオクチン基を挙げることができる。
【0014】
用語「アルコキシ」は、分子の残部に酸素原子を介して連結している、先に定義したアルキル基に関する。
【0015】
用語「アリール」は、二重結合および／または非結合二重項からなる共役π系を含む少なくとも１つの平面環を含む基であって、該環の各原子がｐ軌道を含んでおり、ｐ軌道が、互いに重複しており、π電子の非局在化が分子エネルギーを低下させる、上記基に関する。好ましくは、アリール基は、Ｎ、ＯおよびＳから選択される少なくとも１つのヘテロ原子を場合により含む炭化水素アリール基である。好ましくは、アリール基は、フェニル、ピリジル、ピリミジニル、ピラジニル、ピリダジニル、トリアジニル、フラニル、チオフェニル、ピロリル、イミダゾリル、チアゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、ジヒドロイソオキサゾリル、トリアゾリル、ジアジニル、テトラジニル、ピラゾリルおよびナフチル基からなる群から選択される。特に、アリール基は、オキサゾリル、ジヒドロオキサゾリル、トリアゾリル、ジアジニル、テトラジニルおよびピラゾリル基からなる群から選択される。
【0016】
用語「ハロゲン」は、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒおよびＩ原子からなる群から選択される原子に関する。好ましくは、ハロゲンは、ＣｌまたはＢｒ原子である。
【0017】
化合物の光学および幾何異性体、ラセミ体、互変異性体、塩、水和物、溶媒和物ならびにこれらの混合物も、本発明の式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）および（ＩＶ）の範囲に包含される。
【0018】
本発明の化合物は、塩の形態であるとき、好ましくは薬学的に許容可能な塩である。かかる塩として、薬学的に許容可能な酸付加塩、薬学的に許容可能な塩基付加塩、薬学的に許容可能な金属塩、アンモニウムおよびアルキル化アンモニウム塩が挙げられる。酸付加塩として、無機酸および有機酸の塩が挙げられる。好適な無機酸の代表例として、塩化水素酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、リン酸、硫酸、硝酸などが挙げられる。好適な有機酸の代表例として、ギ酸、酢酸、トリクロロ酢酸、トリフルオロ酢酸、プロピオン酸、安息香酸、桂皮酸、クエン酸、フマル酸、グリコール酸、乳酸、マレイン酸、リンゴ酸、マンデル酸、シュウ酸、ピクリン酸、ピルビン酸、サリチル酸、コハク酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、酒石酸、アスコルビン酸、パモン酸、ビスメチレンサリチル酸、エタンジスルホン酸、グルコン酸、シトラコン酸、アスパラギン酸、ステアリン酸、パルミチン酸、ＥＤＴＡ、グリコール酸、ｐ−アミノ安息香酸、グルタミン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩、過塩素酸塩、ホウ酸塩、酢酸塩、安息香酸塩、ヒドロキシナフトエ酸塩、グリセロリン酸塩、ケトグルタル酸塩などが挙げられる。薬学的に許容可能な無機または有機酸の酸付加塩のさらなる例として、J.Pharm.Sci.1977,66,2に列挙されている薬学的に許容可能な塩が挙げられる。好ましくは、当該塩は、いずれのチオール部位も含まない。
【0019】
「対イオン」は、ジアゾニウム基の電荷を補償するのに適切ないずれのイオンであってもよく、当業者によって容易に選択され得る。例えば、対イオンは、ハロゲン化物、ＢＦ４−、ＮＯ３−、ＨＳＯ４−、ＰＦ６−、ＣＨ３ＣＯＯ−、Ｎ（ＳＯ２ＣＦ３）２−、ＣＦ３ＳＯ３−、ＣＨ３ＳＯ３−、ＣＦ３ＣＯＯ−，（ＣＨ３Ｏ）（Ｈ）ＰＯ２−およびＮ（ＣＮ）２−からなる群から選択されてよい。
【0020】
本発明において、ヒドロキシル（ＯＨ）、アミノ（ＮＨ２またはＮＨＲ）およびカルボキシル（ＣＯＯＨ）基は、適切な保護基によって保護されていてよい。T.W.Green,P.G.M.Wuts,Protective Groups in Organic Synthesis,Wiley-Interscience,New York,1999を参照することができる。
【0021】
ヒドロキシル基のための保護基の中でも、アセチル（Ａｃ）、ベンゾイル（Ｂｚ）、ベンジル（Ｂｎ）、β−メトキシエトキシメチルエーテル（ＭＥＭ）、ジメトキシトリチル、［ビス−（４−メトキシフェニル）フェニルメチル］（ＤＭＴ）、メトキシメチルエーテル（ＭＯＭ）、メトキシトリチル［（４−メトキシフェニル）ジフェニルメチル、ＭＭＴ）、ｐ−メトキシベンジルエーテル（ＰＭＢ）、メチルチオメチルエーテル、ピバロイル（Ｐｉｖ）、テトラヒドロピラニル（ＴＨＰ）、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、およびトリチル（トリフェニルメチル、Ｔｒ）を挙げることができる。
【0022】
アミノ基のための保護基の中でも、カルバミン酸ｔ−ブチル（Ｂｏｃ）、カルバミン酸２−トリメチルシリルエチル（Ｔｅｏｃ）、カルバミン酸１−（１−アダマンチル）−１−メチルエチル（Ａｄｐｏｃ）、カルバミン酸１−メチル−１−（４−ビフェニル）エチル（Ｂｐｏｃ）、カルバミン酸１−（３，５−ジ−ｔ−ブチルフェニル）−１−メチルエチル（ｔ−Ｂｕｍｅｏｃ）、カルバミン酸１−アダマンチル（Ａｄｏｃ）、カルバミン酸ｐ−メトキシベンジル（Ｍｏｚ）、カルバミン酸９−アントリルメチル、カルバミン酸ジフェニルメチル、カルバミン酸９−フルオレニルメチル（Ｆｍｏｃ）、カルバミン酸９−（２−スルホ）フルオレニル(Fluoroenyl)メチル、カルバミン酸９−（２，７−ジブロモ）フルオレニルメチル、カルバミン酸２，７−ジ−ｔ−ブチル−［９−（１０，１０−ジオキソ−１０，１０，１０，１０−テトラヒドロチオキサンチル）］メチル（ＤＢＤ−Ｔｍｏｃ）、カルバミン酸２−（Ｎ，Ｎ−ジシクロヘキシルカルボキシアミド）エチル、カルバミン酸２−ホスホリノ(Phosphonio)エチル（Ｐｅｏｃ）、カルバミン酸２−フェニルエチル、カルバミン酸ベンジル（Ｃｂｚ）、カルバミン酸アリル（Ａｌｌｏｃ）、カルバミン酸１−イソプロピルアリル（Ｉｐａｏｃ）、カルバミン酸４−ニトロシンナミル（Ｎｏｃ）、カルバミン酸８−キノリルおよびＮ−フタルイミドを挙げることができる。
【0023】
カルボキシル基のための保護基の中でも、メチルエステル、ベンジルエステル、ｔｅｒｔ−ブチルエステル、シリルエステル、２，６−ジメチルフェノール、２，６−ジイソプロピルフェノール、および２，６−ジ−ｔｅｒｔ−ブチルフェノールを挙げることができる。
【0024】
用語「タグ」または「タグ部位」は、以下のうち１つまたはいくつかを可能にするのに適切な化学基に関する：− 化合物の検出、
− 化合物による対象薬剤のベクトル化、
− 化合物の可溶化、
− 化合物の安定化、
− 化合物の抽出および／または精製の改善、
− 化合物のＡＤＭＥ（投与、分布、代謝、排泄）パラメータの少なくとも１つの変更；
− 化合物への生物活性の付加；
− クリック化学のための適切な官能性の付加。
【0025】
したがって、かかるタグを含む、本発明の化合物は、検出、対象薬剤のベクトル化、可溶化、安定化、抽出および／もしくは精製の改善、ＡＤＭＥ（投与、分布、代謝、排泄）パラメータの少なくとも１つの変更；生物活性の付加；ならびに／またはクリック化学のための適切な官能性の付加のためのツールとして用いられ得る。
【0026】
本発明の化合物の検出を可能にするのに適切な化学基は、当業者に公知のいずれの分析技術によっても同定および／または定量化され得るいずれの化学基であってもよい。検出のためのタグの中でも、蛍光、例えば蛍光プローブ、例えばフルオレセイン、量子ドット、シアニン染料Cy3（登録商標）およびCy5（登録商標）、Alexa Fluor（登録商標）染料、Dylight fluor（登録商標）染料、IRIS（登録商標）染料、Seta（登録商標）染料、SeTau（登録商標）染料、SRfluor（登録商標）染料、Square（登録商標）染料、Nile red、FL[AM1]またはカルボキシテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）；核磁気共鳴（ＮＭＲ）タグ、例えばキセノンまたはランタノイド（特にテルビウムＴｂまたはユーロピウムＥｕ）；磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）造影剤、例えばＧｄキレート；質量分析タグ、例えばトリス（２，４，６−トリメトキシフェニル）ホスホニウム（ＴＭＰＰ）または同位体コード化タグ；赤外（ＩＲ）タグ；ポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴ）タグ；単光子放出コンピュータ断層撮影（ＳＰＥＣＴ）タグ；三重水素または重水素原子；顕微鏡タグ、例えば金ナノ粒子；消光剤、例えばダブシル（ジメチルアミノアゾベンゼンスルホン酸）を挙げることができる。
【0027】
本発明の化合物によって対象薬剤のベクトル化を可能にするのに適切な化学基は、化合物および／または対象薬剤が適切な組織または器官、例えば肝臓または膀胱に到達するのを助けるのに適切ないずれの化学基または生体部位であってもよい。例えば、ベクトル化タグは、ミセル、逆ミセルもしくはリポソーム、例えば両親媒性化学基、ナノもしくはミクロ粒子、ウイルスベクター、ポリマー、フォレート、アンモニウム基、ペプチド、ＥＧＦＲ（上皮成長因子受容体）リガンドまたは抗体を形成することができる化学基であってよい。
【0028】
化合物の安定化を可能にするのに適切な化学基は、好ましくはインビボで化合物の半減期の増加を提供する化学基である。例えば、安定化タグは、アルブミン、例えばヒト血清アルブミンＨＡＳまたはウシ血清アルブミンＢＳＡであってよい。
【0029】
化合物のＡＤＭＥパラメータの変更を可能にするのに適切な化学基は、例えば、治療剤、薬物、プロドラッグ、式−（ＯＣＨ２−ＣＨ２）ｎ−ＯＲ”のポリエチレングリコール（式中、Ｒ”は水素原子またはアルキル基であり、ｎは、１〜１０００、好ましくは１〜１００、特に１〜８である）、ペプチド、例えばプロリン−アラニン−セリン（Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｓｅｒ）またはポリ−Ｇｌｕ、ポリペプチド、例えばＸＴＥＮ組み換えポリペプチド、脂質、例えばパルミチン酸、炭化水素、ヒドロキシエチルデンプン、核酸、例えばＤＮＡまたはＲＮＡ、特にｓｉＲＮＡであってよい。用語「プロドラッグ」は、薬物にインビボで変換可能な薬物の変異体に関する。用語「ペプチド」は、１〜２０、好ましくは１〜１０のアミノ酸を含むペプチドに関する。
【0030】
適切なタグの選択、例えば、エチレングリコール部位の数の決定は、所望のＡＤＭＥの変更に応じて当業者によって容易に調整され得る。
【0031】
化合物の抽出および／または精製を可能にするのに適切な化学基は、本発明の化合物の抽出および／または精製を好ましいものにするおよび／または促進するいずれの化学基であってもよい。抽出および／または精製タグの中でも、ビオチン、キレートタグ、例えばＤＴＰＡ（ジエチレントリアミン五酢酸）、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸）、ＮＴＡ（ニトリロトリ酢酸）およびＤ４（オクタメチルシクロテトラシロキサン）、タンパク質タグ、例えばポリアルギニンもしくはポリヒスチジンタグ、好ましくはＨｉｓ６またはＨｉｓ１０タグ、ＦＬＡＧ−タグ、Ｓｔｒｅｐ−タグ、ｃ−ｍｙｃ−タグ、Ｓ−タグ、カルモジュリン結合ペプチド、セルロース結合ドメイン、ＳＢＰ−タグ、キチン結合ドメイン、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼタグ、マルトース結合タンパク質、ＮｕｓＡ、ＴｒｘＡおよびＤｓｂＡタグ、ボロン酸タグ、例えば［（３−オキソスピロ［イソベンゾフラン−１（３Ｈ），９’−［９Ｈ］キサンテン］−３’，６’−ジイル）ビス（イミノメチレン−２，１−フェニレン）］ビス−（９Ｃｌ）、パーフルオロアルキル基、イオン性（カチオン性またはアニオン性）基、例えばアンモニウム基、ならびに固体表面、例えばポリマー材料、特にポリエチレンビーズ、ナノ粒子、特に磁気ナノ粒子、チップ、シリカビーズまたはシリカウェハを挙げることができる。
【0032】
生物活性の付加に適切な化学基は、少なくとも１つの放射性同位体、例えば１３１Ｉ、９０Ｙ、８９Ｓｒ、もしくは１５３Ｓｍを含む化学基、またはこれらの誘導体であってよい。
【0033】
クリック化学における反応に適切な化学基は、例えば、アジド（例えば、Ｎ３）および歪みアルキン、特に環状アルキンからなる群から選択される化学基であってよい。環状アルキンの中でも、例えば、ビシクロノニン（ＢＣＮ）およびテトラメチルチエピニウム（ＴＭＴＩ）部位を挙げることができる。
【0034】
実施形態において、Ｒ１〜Ｒ５は、それぞれ：− アルキン基、
− アミノ基、
− ヒドロキシルアミン（−ＯＮＨ２）基、
− ヒドラジン（−ＮＨ−ＮＨ２）基、
− アジド（Ｎ３）基、
− 好ましくは対イオンの存在下にジアゾニウム（Ｎ２＋）基、
− マレイミド基、
− カルボン酸基、
− アルデヒド（−ＣＨＯ）基、
− ホウ酸−Ｂ（ＯＲ”）２基、式中、Ｒ”は上記の通りである、および
− 活性化エステル；からなる群から独立して選択される。
【0035】
好ましい実施形態において、Ｒ１〜Ｒ５のいずれもが、遊離ＳＨ基を含まない。好ましい実施形態において、Ｒ１および／またはＲ５は、アミノ基、ヒドロキシルアミン基、ヒドラジン基またはヒドロキシル基などのいずれの求核基も含まない。
【0036】
特定の実施形態において、Ｒ１〜Ｒ５のうち１、２、３、４または５つが、水素原子とは異なる。
【0037】
特定の実施形態において、Ｒ１〜Ｒ５の少なくとも１つが、チオール（ＳＨ）部位、アミン（ＮＨ２）部位およびカルボン酸（ＣＯＯＨ）部位からなる群から選択される化学基との共有結合をさらに形成するのに適切な少なくとも１つの部位を含む。チオール部位との共有結合を形成するのに適切な部位の中でも、マレイミド部位を挙げることができる。アミン部位との共有結合を形成するのに適切な部位の中でも、ＮＨＳ−エステル部位を挙げることができる。
【0038】
本発明の式（Ｉ）の化合物の中でも、以下の化合物を挙げることができる：【化8-1】
【化8-2】
【化8-3】
【0039】
式（Ｉ）の化合物の中でも、以下の化合物を挙げることもできる：【化9-1】
【化9-2】
【化9-3】
【化9-4】
【0040】
本発明の化合物の合成本発明の式（Ｉ）または（ＩＩ）の化合物は、例えば薗頭カップリングを介してプロパルギルアルコールとのカップリングによって、例えば、対応するヨードアレーンから二工程で合成され得る。カップリングには、好ましくは酸化が続く；例えば、酸化は、アンモニア溶液の存在下にＭｎＯ２によって実施されるタンデム酸化であってよい。代替的には、本発明の化合物は、アリールアルキンのシアノ化によって合成され得る。シアノ化は、例えば、ＣｕＣＮ、アリールイソシアネート、シアノベンゾトリアゾールまたはシアノイミダゾールによって実施されてよい。
【0041】
少なくとも１つのチオール部位を含む化合物の標識式（Ｉ）の化合物は、少なくとも１つのチオールＳＨ部位を含む化合物を標識するための方法において用いられ得る。好ましくは、本発明の方法は、式（Ｉ）の少なくとも１つの化合物を、少なくとも１つのチオールＳＨ部位を含む化合物、またはかかる化合物を含む傾向にあるサンプルと接触させることを含む。好ましくは、サンプルは、生体サンプル、特に水性サンプルである。
【0042】
本発明において用語「標識」は、チオール部位の硫黄原子と式（Ｉ）の化合物のプロピオニトリル部位との間の共有結合の形成を称する。
【0043】
チオール部位（Ｒ６−ＳＨ化合物）を含む化合物は、例えば、フルオロフォア、消光剤、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、酵素、薬物、プロドラッグおよび／または薬物代謝産物であり得る。
【0044】
Ｒ６は、チオール（ＳＨ）基に結合して「チオール部位を含む化合物」を形成するいずれの化学基であってもよい。Ｒ６は、炭素、水素、酸素、窒素、リン、および／または硫黄原子を好ましくは含む。
【0045】
特に、チオール部位を含む化合物は、システイン、または誘導体、例えばそのエステル、または少なくとも１つのシステイン残基を含むペプチドもしくはンパク質であり得る。代替的には、チオール部位を含む化合物は、少なくとも１つの遊離ＳＨ基を与える表面であってよい。
【0046】
式（Ｉ）の化合物によるチオール部位を含む化合物の標識は、多数の用途に用いられ得る。
【0047】
第１実施形態において、式（Ｉ）の化合物によるチオール部位を含む化合物の標識は、サンプルにおけるチオール部位を含む化合物の検出および／または定量化に用いられ得る。検出とは、本発明では、サンプルにおいて所望の化合物の有無を特定することを意味する。サンプルは、少なくとも１つのチオール部位を含む化合物を含む傾向にあるいずれのサンプルであってもよい。例えば、サンプルは、生体サンプル、例えば、生体液、例えば血液、血漿、血清、唾液、尿など、天然産物の抽出物、生体組織、もしくはその一部、または細胞を含む媒体であってよい。
【0048】
第２実施形態において、式（Ｉ）の化合物によるチオール部位を含む化合物の標識は、チオール部位を含む化合物の、その物理化学特性を改善する部位によるコンジュゲーションに用いられ得る。例えば、コンジュゲート部位は、チオール部位を含む化合物の溶解度を改善し、またはその合成および／もしくは精製を改善することができる。
【0049】
第３実施形態において、式（Ｉ）の化合物によるチオール部位を含む化合物の標識は、チオール部位を含む化合物の、対象化合物、例えば薬物、プロドラッグ、炭化水素またはタンパク質によるバイオコンジュゲーションに用いられ得る。
【0050】
例えば、タグとして対象化合物を含む式（Ｉ）の化合物は、少なくとも１つのチオール部位を含む化合物に対する対象化合物の選択的ベクトル化および／または結合を可能にすることができる。
【0051】
本発明の別の目的は、記載した特定の実施形態を含めた、先に定義した式（Ｉ）：【化10】
【0052】
また、本発明は、式（ＩＩ）：【化11】
− 水素原子、
− Ｏ、ＮおよびＳの中から選択された少なくとも１つのヘテロ原子によって場合により中断されたアルキル、アルケンまたはアルキン基、
− アリール基、
− アルコキシ基、
− ハロゲン原子、
− アミノ（−ＮＲＲ’）基、式中、ＲおよびＲ’は、独立して、水素原子、または先に定義したアルキル、アルケン、アルキンもしくはアリール基である、
− ヒドロキシルアミン（−ＯＮＨ２）基、
− ヒドラジン（−ＮＨ−ＮＨ２）基、
− ニトロ（−ＮＯ２）基、
− アジド（−Ｎ３）基、
− 好ましくは対イオンの存在下にジアゾニウム（−Ｎ２＋）基、
− マレイミド基、
− アルキルまたはアリールカルボキシル（−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ）基、
− アルキルまたはアリールカルボニル（−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ）基、
− ヒドロキシル（−ＯＨ）基、
− ホウ酸−Ｂ（ＯＲ”）２基、式中、Ｒ”は水素原子またはアルキル基である、
− ホスフィンまたはホスホニウム基、
− イソシアネート（−Ｎ＝Ｃ＝Ｏ）またはイソチオシアネート（−Ｎ＝Ｃ＝Ｓ）基、
− クロロスルホニル（−ＳＯ２Ｃｌ）基、
− Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｃ（Ｎ２）−ＣＦ３基または−Ｃ（＝Ｏ）−Ｃ（Ｎ２）−ＣＦ３基、
− 活性化エステル、例えば−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨＳ、過フッ素化エステルおよびアクリルウレア、
− タグ、ならびに
− 先に列挙された基の少なくとも１つによって置換されたアルキル基；からなる群から独立して選択される；
の化合物も開示する。
【0053】
式（ＩＩ）の化合物は、上記のように少なくとも１つのタグが付加されて式（Ｉ）の化合物を形成することができるリンカーである。
【0054】
本発明の式（ＩＩ）の化合物の中でも、以下の化合物を挙げることができる：【化12-1】
【化12-2】
【0055】
本発明の式（ＩＩ）の化合物の中でも、以下の化合物を挙げることもできる：【化13-1】
【化13-2】
【化13-3】
【0056】
本発明のチオール部位を含む化合物を標識するための方法は、チオール部位を含む化合物を式（Ｉ）の化合物と接触させる工程の前に、式（ＩＩ）の化合物を、タグ部位を含む化合物またはその前駆体と接触させる、式（Ｉ）の化合物の調製の予備工程をさらに含むことができる。
【0057】
用語「前駆体」は、この場合、式（ＩＩ）の化合物との接触の後に、タグ部位を形成することができる化学基を称する。
【0058】
好ましくは、Ｒ１〜Ｒ５の少なくとも１つが、水素原子とは異なる。
【0059】
本発明の目的は、式（ＩＩ）：式中、Ｒ１〜Ｒ５の少なくとも１つが、マレイミド、アジド（Ｎ３）基、アルキンまたはＮＨＳ−エステル部位を含み、好ましくは、マレイミド、アジド（Ｎ３）基、アルキンまたはＮＨＳ−エステル部位である；の化合物である。
【0060】
マレイミドおよびＮＨＳ−エステル部位は、それぞれ、化合物の、別のチオールまたはアミン基へのさらなる連結を可能にし；Ｎ３基は、化合物の、別のアルキン基へのさらなる連結を可能にし、アルキン基は、化合物の、別のＮ３基へのさらなる連結を可能にする。
【0061】
実施形態において、本発明の式（ＩＩ）の化合物は、以下の化合物から選択される：【化14】
【0062】
本発明はまた、式（Ｉ）または（ＩＩ）の化合物であって、Ｒ１〜Ｒ５の少なくとも１つが、対象化合物にさらに結合している、上記化合物にも関する。
【0063】
対象化合物は、例えば、分子、例えば、フルオロフォア、例えばローダミン、少なくとも１つの放射性原子（例えば１４Ｃ、３Ｈ、もしくは１３１Ｉ）を含む原子の基、公知のマス（マスタグ）の原子の基、リガンド、薬物、治療剤、生体分子、例えば抗体、タンパク質、例えばＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、ＤＮＡフラグメント、ナノ対象物、例えばナノ粒子（すなわち、０．１〜１０００ｎｍの対象物または粒子）、または支持体、例えばポリマーであってよい。
【0064】
本発明の標識方法が、かかる式（Ｉ）または（ＩＩ）：式中、Ｒ１〜Ｒ５の少なくとも１つが対象化合物にさらに結合している；の化合物によって実施されるとき、該方法は、対象化合物とチオール部位を含む化合物との間のコンジュゲートの形成を提供する。
【0065】
実施形態において、対象化合物は、生体分子、例えばタンパク質または抗体であり、チオール部位を含む化合物は、フルオロフォア、例えばＴＡＭＲＡ部位およびチオール部位を含む化合物（ＴＡＭＲＡ−ＳＨ）である。
【0066】
実施形態において、対象化合物は、生体分子、例えばタンパク質または抗体であり、チオール部位を含む化合物は、薬物または治療剤である。本発明の標識方法によって得られるコンジュゲートは、治療抗体である。
【0067】
本発明の別の目的は、式（ＩＩＩ）：【化15】
【化16】
【0068】
本発明の式（ＩＩＩ）の化合物の中でも、以下の化合物を挙げることができる：【化17】
【0069】
式（Ｉ）の化合物は、チオール部位の標識に古典的に用いられている、３−アリールプロピオニトリル部位がマレイミド部位で置き換えられている対応する化合物よりも、水性媒体中でより安定であることが驚くべきことに見出された。例えば、化合物１：【化18】
【化19】
【0070】
また、本発明の式（ＩＩ）の化合物は、遊離チオール部位を含まない他のアミノ酸と比較して、システインに対して顕著な選択性を示した。比較すると、３−アリールプロピオニトリル部位がマレイミド部位によって置き換えられている対応する化合物に関して得られた化学選択性の方が低い。
【0071】
最後に、上記の式（ＩＩＩ）の化合物は、３−アリールプロピオニトリル部位がマレイミド部位によって置き換えられている対応する化合物よりも、生体条件において、高度により安定であることが示された。例えば、化合物：【化20】
【化21】
【化22】
【0072】
本発明を以下の実施例を参照してより詳細に説明するが、本発明は、これらに限定されると見なされると理解されてはならない。
【実施例】
【0073】
実施例１：本発明の化合物の合成式（ＩＩ）の化合物の合成
式（Ｉ）または（ＩＩ）の一連の化合物を以下の手順に従って合成し、特性決定した。
【0074】
一般的なプロトコール：薗頭カップリング
【化23】
Ａ．適当なハロゲン化アリール（１当量、１ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（５ｍＬ）およびＤＩＰＥＡ（１０当量、１０ｍｍｏｌ）脱気溶液に、予め混合したＰｄＣｌ２（ＰＰｈ３）２（０．０３当量、３０μｍｏｌ）およびＣｕＩ（０．０６当量、６０μｍｏｌ）を添加した。得られた反応塊を脱気し、さらに５分間撹拌し、続いてプロパルギルアルコール（１．２当量、１．２ｍｍｏｌ）を添加した。反応塊を１〜２４時間撹拌した（ＴＬＣによってモニタリングした）。１Ｍ ＨＣｌ（５０ｍＬ）を添加し（遊離アミノ基を含有するときには、代わりに５０ｍＬの水を添加し）、反応混合物を酢酸エチル（３×２０ｍＬ）で抽出した。合わせた酢酸エチル画分を水で洗浄し（１×１０ｍＬ）、ＭｇＳＯ４上で乾燥し、蒸発させて粗生成物を得た。生成物をフラッシュクロマトグラフィ（１００％のシクロヘキサンから１００％の酢酸エチルまで２０分の勾配）によって精製した。
【0075】
Ｂ．適当なハロゲン化アリール（１当量、１ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（５ｍＬ）およびＴＥＡ（５ｍＬ）脱気溶液に、予め混合したＰｄＣｌ２（ＰＰｈ３）２（０．０３当量、３０μｍｏｌ）およびＣｕＩ（０．０６当量、６０μｍｏｌ）を添加し、続いてプロパルギルアルコール（２当量、１．２ｍｍｏｌ）を添加した。反応塊を１〜２４時間撹拌した（ＴＬＣによってモニタリングした）。ＴＨＦおよびＴＥＡを蒸発させ、フラッシュクロマトグラフィ（１００％のシクロヘキサンから１００％の酢酸エチルまで２０分の勾配）によって精製した。
【0076】
Ｃ．適当なハロゲン化アリール（１当量、１ｍｍｏｌ）のプロピルアミンまたはピロリジン（３ｍＬ）脱気溶液に、Ｐｄ（ＰＰｈ３）４（０．０５当量、５０μｍｏｌ）を添加した。反応塊を一晩加熱し（３０〜５０℃）、蒸発させ、フラッシュクロマトグラフィ（１００％のシクロヘキサンから１００％の酢酸エチルまで２０分の勾配）によって精製した。
【0077】
高活性なＭｎＯ２の調製７０℃のＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ（１当量、１モル、２００ｇ）の水（２Ｌ）溶液を、フードにおいて６０℃でＫＭｎＯ４（１当量、１モル、１６０ｇ）の水（２Ｌ）溶液に撹拌しながら１０分間で徐々に添加した。激しい反応により、結果として塩素が発生した；懸濁液を２時間撹拌し、室温で一晩保持した。沈殿を濾去し、ｐＨが６．５〜７となるまで水（４Ｌ）で完全に洗浄し、この洗浄により、無視できるほどの塩化物試験を与えた。次いでフィルタケーキを１２０〜１３０℃で１８時間乾燥させ；これにより、チョコブラウン色の高分散アモルファス粉末を得た。
【0078】
ＭｎＯ２酸化【化24】
【0079】
置換３−（アリール）プロプ−２−イン−１−オール（１ａ−１２ａ）：【化25】
【表1】
【0080】
３−（２−メトキシフェニル）プロプ−２−イン−１−オール（１ａ）。反応時間：１８時間；収率：７２％。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ７．３６（ｄｄ，Ｊ＝１．５，７．５Ｈｚ，１Ｈ），７．２６−７．３３（ｍ，１Ｈ），６．９７（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，１Ｈ），６．８６−６．９３（ｍ，１Ｈ），４．４３（ｓ，２Ｈ），３．８４（ｓ，３Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ１６１．６，１３４．５，１３１．０，１２１．５，１１３．４，１１２．０，９２．７，８２．０，５６．２，５１．５。
【0081】
３−（３−メトキシフェニル）プロプ−２−イン−１−オール（２ａ）。反応時間：１６時間；収率：８７％。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ７．１５−７．２４（ｐｓｅｕｄｏ−ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），７．００（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），６．９３−６．９８（ｍ，１Ｈ），６．８７（ｄｄ，Ｊ＝２．１３，７．５Ｈｚ，１Ｈ），４．４１（ｓ，２Ｈ），３．７３（ｓ，３Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ１６０．９，１３０．６，１２５．４，１２５．１，１１７．８，１１５．７，８８．８，８５．６，５５．９，５１．４。
【0082】
３−（４−メトキシフェニル）プロプ−２−イン−１−オール（３ａ）。反応時間：１６時間；収率：９２％。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ）δ７．４０（ｄ，Ｊ＝８．７８Ｈｚ，２Ｈ），６．８６（ｄ，Ｊ＝８．７８Ｈｚ，２Ｈ），４．５１（ｄ，Ｊ＝４．９Ｈｚ，２Ｈ），３．８３（ｓ，３Ｈ），１．７８（ｔ，Ｊ＝４．９Ｈｚ，１Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ）δ１５９．８，１３３．２，１１４．６，１１４．０，８５．９，８５．７，５５．３，５１．７。
【0083】
３−（２−アミノフェニル）プロプ−２−イン−１−オール（４ａ）。反応時間：２４時間；収率：６２％。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ７．１９（ｄｄ，Ｊ＝１．２５，７．９Ｈｚ，１Ｈ），７．０３−７．１２（ｍ，１Ｈ），６．７５（ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，１Ｈ），６．５６−６．６５（ｍ，１Ｈ），４．４７（ｓ，２Ｈ），４．２６（ｓ，２Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ１５０．３，１３３．０，１３０．６，１１８．２，１１５．６，９３．８，７８．９，６９．５，５１．０。
【0084】
３−（３−アミノフェニル）プロプ−２−イン−１−オール（５ａ）。反応時間：１８時間；収率：７７％。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ）δ７．０８（ｔ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，１Ｈ），６．８３（ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，１Ｈ），６．７６（ｓ，１Ｈ），６．６４（ｄｄ，Ｊ＝１．５，７．８Ｈｚ，１Ｈ），４．４６（ｓ，２Ｈ），２．１７（ｓ，１Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ）δ１４６．３，１２９．２，１２３．４，１２２．０，１１８．０，１１５．５，８７．０，８５．６，５１．４。
【0085】
３−（４−アミノフェニル）プロプ−２−イン−１−オール（６ａ）。反応時間：１８時間；収率：４２％。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ７．１１−７．２１（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，２Ｈ），６．５３−６．６８（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，２Ｈ），４．３７（ｓ，２Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ１４９．７，１３３．８，１１５．７，１１２．５，８６．７，８５．９，５１．４；
【0086】
３−（２−ニトロフェニル）プロプ−２−イン−１−オール（７ａ）。反応時間：１５時間；収率：３５％。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ）δ７．９７（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），７．５４−７．６０（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），７．４６−７．５４（ｔ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），７．３６−７．４４（ｔ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），４．４９（ｓ，２Ｈ），１．６８（ｂｒ．ｓ．，１Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ）δ１４９．９，１３４．８，１３２．８，１２８．９，１２４．６，１１８．０，９５．２，８０．９，５１．７。
【0087】
４−（３−ヒドロキシプロプ−１−イン−１−イル）−Ｎ−メチルベンズアミド（８ａ）。反応時間：１２時間；収率：９１％。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ７．７２−７．８２（ｍ，Ｊ＝８．２８Ｈｚ，２Ｈ），７．４１−７．５３（ｍ，Ｊ＝８．２８Ｈｚ，２Ｈ），４．４３（ｓ，２Ｈ），２．９２（ｓ，３Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ１６９．９，１３５．２，１３２．７，１２８．３，１２７．６，９１．５，８４．７，５１．３，２７．１。
【0088】
Ｎ−（４−（３−ヒドロキシプロプ−１−イン−１−イル）フェニル）アセトアミド（９ａ）。反応時間：１８時間；収率：８５％。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ７．５６−７．６４（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，２Ｈ），７．４７−７．５６（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，２Ｈ），４．７４（ｓ，２Ｈ），２．０４（ｓ，３Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ１７１．９，１４３．８，１３５．７，１２０．７，１１２．８，１０６．２，８４．５，６２．７，２４．１。
【0089】
３−（ｏ−トリル）プロプ−２−イン−１−オール（１０ａ）。反応時間：５時間；収率：７０％。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ）δ７．４０（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），７．１１−７．２４（ｍ，３Ｈ），４．５４（ｓ，２Ｈ），２．４３（ｓ．，３Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ）δ１３８．２，１３１．２，１２８．４，１２８．０，１１９．３，１１５．３，８６．５，８５．２，５１．２，２１．２。
【0090】
３−（２，６−ジメチルフェニル）プロプ−２−イン−１−オール（１１ａ）。反応時間：２４時間；収率：２５％。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ）δ７．０３（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），６．９５（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ），４．５０（ｓ，２Ｈ），２．３４（ｓ，７Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ）δ１４０．５，１２７．９，１２６．７，１２２．３，９５．６，８３．３，５１．９，２１．１。
【0091】
３−（２，６−ジメトキシフェニル）プロプ−２−イン−１−オール（１２ａ）。反応条件：３０℃、プロピルアミン、１６時間；収率：３８％。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ７．２５（ｔ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），６．６２（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ），４．４６（ｓ，２Ｈ），３．８４（ｓ，６Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ１６３．０，１３１．０，１０４．７，１０２．５，９７．０，７８．１，５６．４，５１．７。
【0092】
置換３−アリール−プロピオニトリル（１−１２）：【化26】
【表2】
【0093】
３−（２−メトキシフェニル）プロピオニトリル（１，ＡＰＮ−ｏ−ＯＭｅ）。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ７．５１−７．６５（ｍ，２Ｈ），７．１２（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，１Ｈ），７．０１（ｔ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，１Ｈ），３．９４（ｓ，４Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ１６４．７，１３６．４，１３５．３，１２２．０，１１２．６，１０７．７，１０６．４，８１．８，６６．７，５６．７；ＩＲ（ニートフィルム，ｃｍ−１）：２９４６，２２６４，２１４２ １５９６，１４９０，１２４５，１１６４，１１２２，１０４７，１０２１，７５２，４９８；ＧＣ−ＥＳＩ−ＨＲＭＳ：１５７．０５２７６；実測値１５７．０５０４４。
【0094】
３−（３−メトキシフェニル）プロピオニトリル（２，ＡＰＮ−ｍ−ＯＭｅ）。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ７．３８（ｔ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，１Ｈ），７．２７（ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，１Ｈ），７．２０−７．２４（ｍ，１Ｈ），７．１２−７．２０（ｍ，１Ｈ），３．８３（ｓ，３Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ１６１．２，１３１．４，１２７．１，１２０．０，１１９．４，１１９．２，１０６．０，８４．１，６２．７，５６．１；ＩＲ（ニートフィルム，ｃｍ−１）：２４９１，２２６４，２１４４，１５９５，１５７３，１４８８，１４６４，１４２０，１３２４，１２９４，１２０７，１１７８，１０４５，７８３，６８１，４９４；ＧＣ−ＥＳＩ−ＨＲＭＳ：１５７．０５２７６；実測値１５７．０５２９８。
【0095】
３−（４−メトキシフェニル）プロピオニトリル（３，ＡＰＮ−ｐ−ＯＭｅ）。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ）δ７．４６−７．７０（ｍ，Ｊ＝８。８Ｈｚ，２Ｈ），６．８６−６．９６（ｍ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，２Ｈ），３．８６（ｓ，３Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ）δ１６１．４，１３４．４，１１３．７，１０８．２，１０４．８，８２．７，６１．５，５４．５；ＩＲ（ニートフィルム，ｃｍ−１）：２９８５，２３５８，２３４２，２２６３，２１７８，２１４９，１６０３，１５１４，１３０７，１２７０，１１８０，１０２８，８３５，８０８，６６９，４２４；ＧＣ−ＥＳＩ−ＨＲＭＳ：１５７．０５２７６；実測値１５７．０５３３７。
【0096】
３−（２，６−ジメトキシフェニル）プロピオニトリル（４，ＡＰＮ−ｏ，ｏ’−ジメトキシ）：１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ）δ７．３８（ｔ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，１Ｈ），６．５３（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，２Ｈ），３．８８（ｓ，６Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ）δ１６４．４，１３３．８，１０６．２，１０３．４，９６．５，７７．７，７０．５，５６．２；ＩＲ（ニートフィルム，ｃｍ−１）：２８４７，２３５９，２２５９，２２０１，２１３９，１９２６，１５８６，１５７４，１４７８，１４３２，１３０２，１２５５，１１８８，１１０９，１０２５，７７８，７２７，６４８，６３２，５４５，５０６，４８８，４２０；ＧＣ−ＥＳＩ−ＨＲＭＳ：１８７．０６３３３；実測値１８４．０６４６５。
【0097】
３−（２−アミノフェニル）プロピオニトリル（５，ＡＰＮ−ｏ−ＮＨ２）。１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ６．８１（ｄ，Ｊ＝７．８８Ｈｚ，１Ｈ），６．６５−６．７６（ｍ，１Ｈ），６．０８−６．１９（ｍ，２Ｈ），３．８５（ｂｒ．ｓ．，１Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ）δ１５１．４，１３４．０，１３３．４，１１８．２，１１５．０，１０５．８，１０１．０，８１．６，６８．５；ＩＲ（ニートフィルム，ｃｍ−１）：３４１３，３３３２，３２１１，２９２５，２８５３，２２５０，２１３６，１６３２，１６００，１５６３，１４８６，１４５２，１３１２，１２７３，１２５２，１１６１，７４０，６７３，４９３；ＧＣ−ＥＳＩ−ＨＲＭＳ：１４２．０５３１０；実測値１４２．０５４５８。
【0098】
３−（３−アミノフェニル）プロピオニトリル（６，ＡＰＮ−ｍ−ＮＨ２）。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ）δ７．１７（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ），６．９９（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ），６．７４−６．８９（ｍ，２Ｈ），３．８５（ｂｒ．ｓ．，２Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ）δ１４６．８，１２９．８，１２３．６，１１８．７，１１８．７，１１８．０，１０５．７，８３．７，６２．３；ＩＲ（ニートフィルム，ｃｍ−１）：３４２６，３３４０，２９２３，２８５２，２２６５，２１４２，１６３０，１５９４，１５７９，１５１３，１４４８，１３２６，１３１３，１３００，１２２０，１１６４，９９３，８８２，８６２，７８４，６８０，５３４，４５６；ＧＣ−ＥＳＩ−ＨＲＭＳ：１４２．０５３１０；実測値１４２．０５１９７。
【0099】
３−（４−アミノフェニル）プロピオニトリル（７，ＡＰＮ−ｐ−ＮＨ２）。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ７．２６（ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，２Ｈ），６．５１（ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，２Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ１５２．５，１３５．１，１１３．６，１０５．６，１０２．３，８６．３，６０．２；ＩＲ（ニートフィルム，ｃｍ−１）：３４３１，３３３３，３２１１，２２５０，２１３２，１６３２，１５９９，１５１３，１４３８，１３０３，１１７８，１０４３，９４９，８２６，８１４，５２６，４９５，４５２；ＧＣ−ＥＳＩ−ＨＲＭＳ：１４２．０５３１０；実測値１４２．０５４６４。
【0100】
３−（ｏ−トリル）プロピオニトリル（８，ＡＰＮ−ｏ−メチル）。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ）δ７．４７（ｄ，Ｊ＝７．７８Ｈｚ，１Ｈ），７．２８−７．３６（ｍ，１Ｈ），７．１８（ｄ，Ｊ＝８．０３Ｈｚ，１Ｈ），７．０８−７．１６（ｍ，１Ｈ），２．３９（ｓ，３Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ）δ１４３．４，１３４．１，１３１．８，１３０．１，１２６．１，１１７．４，１０５．６，８２．４，６６．４，２０．５；ＩＲ（ニートフィルム，ｃｍ−１）：２２９５，２２５７，２１４１，１５９９，１４８４，１４５６，１３８３，１２９１，１１９９，１１６２，１１１６，１０３９，７５７，７１１，６７２，５４８，４９０，４５２；ＧＣ−ＥＳＩ−ＨＲＭＳ：１４１．０５７８５；実測値１４１．０５９２６。
【0101】
３−（２，６−ジメチルフェニル）プロピオニトリル（９，ＡＰＮ−ｏ，ｏ’−ジメチル）。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ）δ７．１２−７．２７（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），７．０１（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ），２．３８（ｓ，６Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ）δ１４３．８，１３１．２，１２７．３，１１７．６，１０５．６，８１．５，７０．２，２０．８；ＩＲ（ニートフィルム，ｃｍ−１）：２９２３，２８５６，２２６１，２１３８，１７３２，１５９５，１４６８，１３８１，１２６５，１１６８，１０３３，７７４，７２８，４９０；ＧＣ−ＥＳＩ−ＨＲＭＳ：１５５．０７３５０；実測値１５５．０７５０７。
【0102】
３−（２−ニトロフェニル）プロピオニトリル（１０，ＡＰＮ−ｏ−ＮＯ２）。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ８．２８−８．３５（ｍ，１Ｈ），７．９６−８．０６（ｍ，１Ｈ），７．８１−７．９０（ｍ，２Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ１５１．９，１３８．３，１３５．２，１３４．１，１２６．６，１１４．２，１０５．７，７９．０，６８．６；ＩＲ（ニートフィルム，ｃｍ−１）：２２６８，１６０４，１５６７，１５２８，１５０２，１４８０，１３４５，８５１，７８７，７４４，７０９，６８７，５３７，４９１；ＧＣ−ＥＳＩ−ＨＲＭＳ：１７２．０２７２８；実測値１７２．０２８６９。
【0103】
Ｎ−（４−（シアノエチニル）フェニル）アセトアミド（１１，ＡＰＮ−ｐ−ＮＨＡｃ）。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ７．５６−７．６３（ｍ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，２Ｈ），７．４９−７．５６（ｍ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，２Ｈ），２．０４（ｓ，３Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ１７１．９，１４３．８，１３５．７，１２０．７，１１２．８，１０６．２，８４．５，６２．７，２４．１；ＩＲ（ニートフィルム，ｃｍ−１）：３３０３，３１７４，３０９８，２２７８，２２６２，２１３９，１６７０，１５９４，１５３５，１４０７，１３６４，１３２１，１２６３，１１７７，８３４，５３４；ＧＣ−ＥＳＩ−ＨＲＭＳ：１８４．０６３６６；実測値１８４．０６２１２。
【0104】
４−（シアノエチニル）−Ｎ−メチルベンズアミド（１２，ＡＰＮ−ｐ−ＣＯＮＨＭｅ）：１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ７．９６−８．０５（ｍ，Ｊ＝７．７８Ｈｚ，２Ｈ），７．８５−７．９３（ｍ，Ｊ＝７．７８Ｈｚ，２Ｈ），３．０３（ｓ，３Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ１６９．１，１３８．３，１３４．９，１２９．０，１２１．６，１０５．９，８３．０，６４．６，２８．８；ＩＲ（ニートフィルム，ｃｍ−１）：３３４８，２２７０，１６４１，１５４９，１５０２，１４０８，１３９２，１３２７，１３０３，１２８３，１１６２，８５４，７６０，６１７，４８８；ＧＣ−ＥＳＩ−ＨＲＭＳ：１８４．０６３６６；実測値１８４．０６４６５。
【0105】
３−（４−ヨードフェニル）プロピオニトリル（１３）：【化27】
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ）δ＝７．７８（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，２Ｈ），７．３２（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，３Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ）δ１３８．１，１３４．４，１１６．８，１０５．２，９９．２，８１．９，６４．２。
化合物１３を本発明による標識方法に用いることができる（放射性同位体１２５Ｉによる）。
【0106】
３−（４−（トリフルオロメチル）フェニル）プロピオニトリル（１４）：【化28】
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ）δ＝７．７６（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，２Ｈ），７．７０（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，２Ｈ）。
化合物１４を、（放射性同位体１８Ｆによる）本発明による標識方法に用いることができる。
【0107】
４−（３−ヒドロキシプロプ−１−イン−１−イル）安息香酸ｔｅｒｔ−ブチル（１５ａ）：【化29】
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ）δ＝７．９３（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，２Ｈ），７．４７（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，２Ｈ），４．５３（ｓ，２Ｈ），１．６０（ｓ，９Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ）δ＝１６５．１，１３１．７，１３１．４，１２９．３，１２６．６，８９．８，８５．１，８１．４，５１．６，２８．１。
【0108】
４−（シアノエチニル）安息香酸ｔｅｒｔ−ブチル（１５）：【化30】
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ＝８．００（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，２Ｈ），７．９４（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，２Ｈ），１．５６（ｓ，９Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ）δ＝１６４．３，１３４．８，１３３．３，１２９．７，１２１．３，１０５．２，８２．２，８１．９，６４．８，２８．１。
【0109】
４−（シアノエチニル）安息香酸（１６）：【化31】
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ＝８．１２（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，３Ｈ），７．８３（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，２Ｈ）。
【0110】
４−（シアノエチニル）安息香酸パーフルオロフェニル（１７）：【化32】
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ＝８．２９（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，２Ｈ），８．０８（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，２Ｈ）。
化合物１７を本発明によるバイオコンジュゲーション法に用いることができる。
【0111】
４−（（４−（シアノエチニル）ベンゾイル）オキシ）−２，３，５，６−テトラフルオロベンゼンスルホン酸ナトリウム（１８）：【化33】
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ＝８．３１（ｄ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，２Ｈ），８．０９（ｄ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，２Ｈ）。
化合物１８を本発明によるバイオコンジュゲーション法に用いることができる。
【0112】
Ｎ−（（１−（４−（シアノエチニル）フェニル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）メチル）−５−（ジメチルアミノ）ナフタレン−１−スルホンアミド（２０）：【化34】
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ＝８．５９（ｂｒ．ｓ．，１Ｈ），８．３４（ｄ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，１Ｈ），８．３３（ｓ，１Ｈ）８．２６（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，１Ｈ），８．１３（ｄ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，１Ｈ），８．００（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，２Ｈ），７．８３（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，２Ｈ），７．６１−７．５１（ｍ，２Ｈ），７．１８（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），４．２１（ｓ，２Ｈ），２．７１（ｓ，６Ｈ）。
１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ＝１５１．２，１４４．８，１３８．４，１３５．７，１３５．６，１２９．４，１２８．９，１２８．８，１２８．６，１２７．８，１２３．４，１２１．３，１１９．９，１１９．０，１１６．０，１１４．９，１０５．３，８２．５，６３．１，４４．９，３７．６。
化合物２０を、本発明による検出方法（例えば、染料による）に用いることができる。
【0113】
３−（４−イソチオシアナトフェニル）プロピオニトリル（２１）：【化35】
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，アセトニトリル−ｄ３）δ＝７．７１（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，２Ｈ），７．３７（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，２Ｈ）。
化合物２１を本発明によるバイオコンジュゲーション法に用いることができる。
【0114】
（１−（（４−（シアノエチニル）フェニル）アミノ）−１−チオキソ−６，９，１２−トリオキサ−２−アザペンタデカン−１５−イル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル（２２）：【化36】
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ＝７．６６（ｓ，４Ｈ），３．６５−３．５４（ｍ，１２Ｈ），３．５０（ｔ，Ｊ＝６．１Ｈｚ，２Ｈ），３．１２（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，２Ｈ），１．９１（ｑｕｉｎ，Ｊ＝６．１Ｈｚ，２Ｈ），１．７２（ｑｕｉｎ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，２Ｈ），１．４５（ｓ，９Ｈ）。
１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ＝１８２．０，１５８．５，１４４．６，１３５．６，１０６．４，８４．８，８０．０，７１．６，７１．５，７１．３，７１．３，７０．０，６８．２，６３．０，３８．８，３１．０，２９．８，２９．０
【0115】
塩化４−（シアノエチニル）ベンゾイル（２３）：【化37】
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ）δ＝８．０８（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，２Ｈ），７．６７（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，２Ｈ）。
化合物２３を本発明によるバイオコンジュゲーション法に用いることができる。
【0116】
（１−（４−（シアノエチニル）フェニル）−１−オキソ−６，９，１２−トリオキサ−２−アザペンタデカン−１５−イル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル（２４）：【化38】
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ＝７．９２（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，２Ｈ），７．８２（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，２Ｈ），３．７２−３．４５（ｍ，１４Ｈ），３．１２（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，２Ｈ），１．９０（ｑｕｉｎ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，２Ｈ），１．７２（ｑｕｉｎ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，２Ｈ），１．４４（ｓ，９Ｈ）。
【0117】
４−（シアノエチニル）−Ｎ−（１５−オキソ−４，７，１０−トリオキサ−１４−アザノナトリアコンタ−２４，２６−ジイン−１−イル）ベンズアミド（２５）：【化39】
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ）δ＝７．９０（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，２Ｈ），７．６７（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，２Ｈ），７．４８（ｂｒ．ｓ，１Ｈ），６．１８（ｂｒ．ｓ，１Ｈ），３．７１−３．４５（ｍ，１４Ｈ），３．３２（ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，２Ｈ），２．２３（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，４Ｈ），２．１５（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ），１．９０（ｔｄ，Ｊ＝６．０，１１．７Ｈｚ，２Ｈ），１．７３（ｑｕｉｎ，Ｊ＝６．１Ｈｚ，２Ｈ），１．６５−１．４２（ｍ，６Ｈ），１．４１−１．３２（ｍ，４Ｈ），１．３２−１．１９（ｍ，２２Ｈ），０．８８（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，３Ｈ）。
化合物２５を、化合物を結合および／または固定化させるための本発明による標識（例えば光標識）方法に用いることができる。
【0118】
（４−（シアノエチニル）フェニル）カルバミン酸エチル（２６）：【化40】
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ）δ＝７．５６（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，２Ｈ），７．４６（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，２Ｈ），６．７９（ｂｒ．ｓ．，１Ｈ），４．２６（ｑ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，２Ｈ），１．３３（ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，３Ｈ）。
【0119】
１−（４−（シアノエチニル）フェニル）−３−（プロプ−２−イン−１−イル）ウレア（２７）：【化41】
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ＝７．６０（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，２Ｈ），７．５２（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，２Ｈ），４．００（ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，２Ｈ），２．６１（ｔ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，１Ｈ）。
化合物２７を本発明によるクリック化学に用いることができる。
【0120】
（４−（シアノエチニル）フェニル）カルバミン酸プロプ−２−イン−１−イル（２８）：【化42】
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ）δ＝７．５７（ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，２Ｈ），７．４８（ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，２Ｈ），４．８０（ｄ，Ｊ＝２．３Ｈｚ，２Ｈ），２．５４（ｔ，Ｊ＝２．３Ｈｚ，１Ｈ）。
化合物２８を、本発明によるクリック化学に用いることができる。
【0121】
（４−（シアノエチニル）フェニル）カルバミン酸ビシクロ［６．１．０］ノナ−４−イン−９−イルメチル（２９）：【化43】
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ）δ＝７．５５（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，２Ｈ），７．４７（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，２Ｈ），７．０９（ｂｒ．ｓ，１Ｈ），２．３８−２．１４（ｍ，６Ｈ），１．６７−１．５１（ｍ，２Ｈ），１．４２（ｑｕｉｎ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，１Ｈ），１．０４−０．９１（ｍ，２Ｈ）
化合物２９を本発明によるクリック化学（例えば、歪促進クリック）に用いることができる。
【0122】
３−（４−（（トリメチルシリル）エチニル）フェニル）プロプ−２−イン−１−オール（３０ａ）：【化44】
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ）δ＝７．４１（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ），７．３６（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ），４．５０（ｄ，Ｊ＝５．５Ｈｚ，２Ｈ），１．８９（ｔ，Ｊ＝５．５Ｈｚ，１Ｈ），０．２５（ｓ，９Ｈ）。
【0123】
３−（４−（（トリメチルシリル）エチニル）フェニル）プロピオニトリル（３０）：【化45】
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ）δ＝７．５５（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ），７．４８（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ），０．２７（ｓ，９Ｈ）。
１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ）δ＝１３３．２，１３２．２，１２６．９，１１７．１，１０５．３，１０３．４，９９．４，８２．３，６４．５，−０．３。
【0124】
３，３’−（５−アミノ−１，３−フェニレン）ジプロピオニトリル（３１）：【化46】
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ）δ＝７．２０（ｔ，Ｊ＝１．３Ｈｚ，１Ｈ），６．９８（ｄ，Ｊ＝１．３Ｈｚ，２Ｈ），４．０２（ｂｒ．ｓ．，２Ｈ）。
１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ）δ＝１４７．１，１２７．５，１２１．６，１１９．５，１０５．０，８１．０，６３．６。
化合物３１を本発明による再架橋（ジＡＰＮ）に用いることができる。
【0125】
３−（４−（４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン−２−イル）フェニル）プロピオニトリル（３２）：【化47】
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ）δ＝７．８４（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，２Ｈ），７．６０（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，２Ｈ），１．３６（ｓ，１２Ｈ）。
【0126】
３，３’−（１，２−フェニレン）ジプロピオニトリル（３３）：【化48】
１，２−ジヨージドベンゼン（１当量、６６１ｍｇ、０．２６２ｍＬ、２ｍｍｏｌ）およびプロパルギルアルコール（２．３当量、２７２μＬ、４．６１ｍｍｏｌ）のブチルアミン（１５．８ｍＬ）脱気溶液にＰｄ（ＰＰｈ３）４（４％，９２．６ｍｇ、０．０８０１ｍｍｏｌ）を添加し、得られた反応塊を一晩還流した。溶媒を蒸発させ、得られた粗生成物をフラッシュクロマトグラフィ（２０分、勾配ＥｔＯＡｃ／シクロヘキサン）によって精製し、３３ａ（１５０ｍｇ、０．８ｍｍｏｌ、４０％）を褐色がかった固体として生成した。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ７．３８−７．５３（ｍ，２Ｈ），７．２５−７．３８（ｍ，２Ｈ），４．４８（ｓ，４Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）ｄ１３５．６，１３１．９，１２９．２，９５．６，８６．６，５３．９；ＥＳＩ−ＭＳ：Ｃ１２Ｈ１１Ｏ２＋［Ｍ＋Ｈ］＋，１８７．１；実測値１８７．１。
【0127】
３３：３，３’−（１，２−フェニレン）ジプロピオニトリル。化合物を標準のＭｎＯ２酸化プロトコールの唯一の生成物として得た。反応時間：７５分間。褐色固体、収率：４２％。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ７．８９（ｄｄ，Ｊ＝３．３０，５．８０Ｈｚ，２Ｈ），７．７３（ｄｄ，Ｊ＝３．３０，５．８０Ｈｚ，２Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ１３６．０，１３３．５，１２６．５，１０５．５，８０．２，６７．２；ＧＣ−ＥＳＩ−ＭＳ：Ｃ１２Ｈ５Ｎ２＋［Ｍ＋Ｈ］＋，１７７．０；実測値１７７．０。
【0128】
３，３’−（１，３−フェニレン）ジプロピオニトリル（３４）：【化49】
３３ａの合成と同じ手段。褐色がかった固体、収率：５５％。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ７．４７（ｓ，１Ｈ），７．３６−７．４３（ｍ，２Ｈ），７．２９−７．３６（ｍ，１Ｈ），４．４１（ｓ，４Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ１３５．３，１３２．５，１２９．８，１２４．８，８９．７，８４．５，５１．２；ＥＳＩ−ＭＳ：Ｃ１２Ｈ１１Ｏ２＋［Ｍ＋Ｈ］＋，１８７．１；実測値１８７．０。
【0129】
３４：３，３’−（１，３−フェニレン）ジプロピオニトリル。化合物を標準のＭｎＯ２酸化プロトコールの唯一の生成物として得た。反応時間：２時間。褐色固体、収率：３５％。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ８．１０（ｄ，Ｊ＝１．５０Ｈｚ，１Ｈ），７．９３（ｄｄ，Ｊ＝１．５０，８．００Ｈｚ，１Ｈ），７．６３（ｔ，Ｊ＝８．００Ｈｚ，２Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ１３９．３，１３７．８，１３１．２，１２０．０，１０５．７，８１．７，６４．２；ＧＣ−ＥＳＩ−ＭＳ：Ｃ１２Ｈ５Ｎ２＋［Ｍ＋Ｈ］＋，１７７．０；実測値１７７．１。
【0130】
３，３’−（１，４−フェニレン）ジプロピオニトリル（３５）：【化50】
３３ａの合成と同じ手段であるが、７２時間還流。褐色がかった固体、収率：３５％。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ７．３９（ｓ，４Ｈ），４．４１（ｓ，４Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ１３２．６，１２４．３，１０１．４，９０．８，８４．９，５１．２；ＥＳＩ−ＭＳ：Ｃ１２Ｈ１１Ｏ２＋［Ｍ＋Ｈ］＋，１８７．１；実測値１８７．１。
【0131】
３５：３，３’−（１，４−フェニレン）ジプロピオニトリル。化合物を標準のＭｎＯ２酸化プロトコールの唯一の生成物として得た。反応時間：２時間。褐色固体、収率：１９％。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ７．９４（ｓ，４Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ１３５．０，１２１．６，１０５．５，８２．０，６５．９；ＧＣ−ＥＳＩ−ＭＳ：Ｃ１２Ｈ５Ｎ２＋［Ｍ＋Ｈ］＋，１７７．０；実測値１７７．０。
化合物３３〜３５を本発明による再架橋（ジＡＰＮ）に用いることができる。
【0132】
（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−（４−（（（トリフルオロメチル）スルホニル）オキシ）フェニル）プロピオン酸ｔｅｒｔ−ブチル（３６ｂ）：【化51】
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ）δ７．０３−７．１８（ｍ，３Ｈ），６．８２−７．０３（ｍ，２Ｈ），４．８７（ｄ，Ｊ＝７．２８Ｈｚ，１Ｈ），４．２４（ｄ，Ｊ＝７．０３Ｈｚ，１Ｈ），２．６５−２．９５（ｍ，２Ｈ），１．１７（ｓ，９Ｈ），１．２１（ｓ，９Ｈ）。
１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ）δ１７０．５，１４８．５，１３７．３，１３１．３，１２１．１，１２０．３，１１７．１，８２．５，８０．０，５４．７，３８．１，２８．３，２７．９。
【0133】
（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−（４−（３−ヒドロキシプロプ−１−イン−１−イル）フェニル）プロピオン酸ｔｅｒｔ−ブチル（３６ａ）：【化52】
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ７．３０−７．４５（ｍ，Ｊ＝７．７８Ｈｚ，２Ｈ），７．１４−７．３０（ｍ，Ｊ＝８．０３Ｈｚ，２Ｈ），４．４０（ｓ，２Ｈ），４．１８−４．３２（ｍ，１Ｈ），３．０６（ｄｄ，Ｊ＝６．２７，１３．８０Ｈｚ，１Ｈ），２．９１（ｄｄ，Ｊ＝８．６６，１３．６８Ｈｚ，１Ｈ），１．４５−１．５３（ｍ，１Ｈ），１．４２（ｄ，Ｊ＝３．２６Ｈｚ，１９Ｈ）。
【0134】
２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−（４−（シアノエチニル）フェニル）プロピオン酸ｔｅｒｔ−ブチル（３６）：【化53】
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ）δ＝７．５４（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，２Ｈ），７．２４（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，２Ｈ），５．０５（ｄ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，１Ｈ），４．４６（ｔｄ，Ｊ＝６．１，７．３Ｈｚ，１Ｈ），３．１４（ｄｄ，Ｊ＝６．１，１３．７Ｈｚ，１Ｈ），３．０５（ｄｄ，Ｊ＝６．１，１３．７Ｈｚ，１Ｈ），１．４２（ｓ，９Ｈ），１．４１（ｓ，９Ｈ）。
１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ）δ＝１７０．３，１５４．９，１４１．４，１３３．４，１３０．１，１１５．９，１０５．５，８２．９，８２．５，７９．９，６３．２，５４．５，３８．８，２８．３，２７．９。
化合物３６を本発明による精製および／または固定化に用いることができる。
【0135】
４−（シアノエチニル）−Ｎ−（２−（２−（２−（５−（（３ａＳ，４Ｓ，６ａＲ）−２−オキソヘキサヒドロ−１Ｈ−チエノ［３，４−ｄ］イミダゾール−４−イル）ペンタンアミド）エトキシ）エトキシ）エチル）ベンズアミド（３７）【化54】
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ＝７．９２（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，２Ｈ），７．８１（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，２Ｈ），４．４９（ｄｄ，Ｊ＝４．８，７．８Ｈｚ，１Ｈ），４．３０（ｄｄ，Ｊ＝４．５，７．８Ｈｚ，１Ｈ），３．７１−３．５６（ｍ，８Ｈ），３．５４（ｔ，Ｊ＝５．５Ｈｚ，２Ｈ），３．３４（ｔ，Ｊ＝５．５Ｈｚ，２Ｈ），３．２４−３．１４（ｍ，１Ｈ），２．９２（ｄｄ，Ｊ＝４．８，１２．８Ｈｚ，１Ｈ），２．７０（ｄ，Ｊ＝１２．８Ｈｚ，１Ｈ），２．１９（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，２Ｈ），１．７８−１．５０（ｍ，４Ｈ），１．４８−１．３５（ｍ，２Ｈ）。
１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ＝１７６．３，１６８．８，１６６．２，１３８．９，１３５．０，１２９．１，１２１．５，１０５．９，８３．１，７１．５，７１．４，７０．７，７０．６，６４．６，６３．５，６１．８，５７．１，４１．２，４０．４，３６．９，２９．９，２９．６，２７．０。
【0136】
２−（（４−（（４−（シアノエチニル）フェニル）アミノ）−４−オキソブチル）−アミノ）−２−オキソエチル）トリス（２，４，６−トリメトキシフェニル）ホスホニウムトリフルオロアセテート（３８）：【化55】
Ｂｏｃ−ＧＡＢＡ（１当量、０．９２８ｇ、４．５７ｍｍｏｌ）、ＴＥＡ（３当量、１．３９ｇ、１．９ｍＬ、１３．７ｍｍｏｌ）およびＤＭＡＰ（０．０５当量、０．０２７９ｇ、０．２２８ｍｍｏｌ）の０℃に冷却したＤＣＭ（１１．７ｍＬ）溶液に、ＥＤＣ（１当量、０．８７５ｇ、４．５７ｍｍｏｌ）を添加した。得られた反応塊をさらに１０分間０℃で撹拌し、氷浴を除去し、ｐ−ヨードアニリン（１当量、１ｇ、４．５７ｍｍｏｌ）を添加し、反応物を２５℃で一晩放置した。得られた反応塊を１Ｍ ＨＣｌ（２×２０ｍＬ）、水（１×２０ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥して３８ｄ（１１２５ｍｇ、２．７９ｍｍｏｌ、６１％）を得、これをさらに精製することなく用いた。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ）δ９．０４（ｂｒ．ｓ．，１Ｈ），７．５８−７．７２（ｍ，Ｊ＝８．５０Ｈｚ，２Ｈ），７．３７−７．５１（ｍ，Ｊ＝８．５０Ｈｚ，２Ｈ），４．８１（ｂｒ．ｓ．，１Ｈ），３．２７（ｍ，２Ｈ），２．３０−２．５０（ｍ，２Ｈ），１．８８（ｍ，２Ｈ），１．４９（ｓ，９Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ）δ１７４．２，１５７．４，１３７．８，１２０．９，１２０．０，８７．３，７７．０，３３．１，３２．８，２８．４，２６．０；ＥＳＩ−ＭＳ：Ｃ１５Ｈ２２Ｎ２Ｏ３＋［Ｍ＋Ｈ］＋，４０５．０；実測値４０５．１。
【0137】
３８ｃ：（４−（（４−（３−ヒドロキシプロプ−１−イン−１−イル）フェニル）−アミノ）−４−オキソブチル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル。薗頭カップリングのプロトコールＢに従って合成した。黄色がかった固体、収率：７９％。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ７．５４−７．５８（ｍ，Ｊ＝８．５０Ｈｚ，２Ｈ），７．３４−７．３８（ｍ，Ｊ＝８．５０Ｈｚ，２Ｈ），４．４０（ｓ，２Ｈ），３．１３（ｔ，Ｊ＝６．９０Ｈｚ，２Ｈ），２．４１（ｔ，Ｊ＝７．４０Ｈｚ，２Ｈ），１．８１−１．８９（ｍ，２Ｈ），１．４４（ｓ，９Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ１７４．０，１５８．６，１４０．１，１３３．２，１２０．８，１１９．５，８８．３，８５．３，８０．１，５１．３，４０．９，３５．３，２８．８，２７．１；ＥＳＩ−ＭＳ：Ｃ１８Ｈ２５Ｎ２Ｏ４＋［Ｍ＋Ｈ］＋，３３２．１；実測値３３２．０。
【0138】
３８ｂ：（４−（（４−（シアノエチニル）フェニル）アミノ）−４−オキソブチル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル。ＭｎＯ２酸化のプロトコールを用いて合成した。反応時間：１時間。白色固体、収率：８５％。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ７．６１−７．６５（ｍ，Ｊ＝８．８０Ｈｚ，２Ｈ），７．５４−７．５９（ｍ，Ｊ＝８．５０Ｈｚ，２Ｈ），３．０４（ｔ，Ｊ＝６．８５Ｈｚ，２Ｈ），２．３４（ｔ，Ｊ＝７．４０Ｈｚ，２Ｈ），１．７４−１．８１（ｍ，２Ｈ），１．３４（ｓ，９Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ１７４．３，１５９．１，１４３．８，１３５．７，１２０．８，１１２．８，１０６．３，８４．６，６２．７，４０．８，３５．３，３４．８，２８．８，２６．９；ＥＳＩ−ＭＳ：Ｃ１８Ｈ２２Ｎ３Ｏ３＋［Ｍ＋Ｈ］＋，３２８．１；実測値３２８．１。
【0139】
３８ａ：４−（（４−（シアノエチニル）フェニル）アミノ）−４−オキソブタン−１−アミニウムトリフルオロアセテート。３８ｂ（１当量、６２．８ｍｇ、０．１９２ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（１ｍＬ）懸濁液に、ＴＦＡ（２０当量、２８５μＬ、３．８３ｍｍｏｌ）を添加し、得られた２５℃で３０分間撹拌した。反応塊の蒸発後に標的生成物３８ａ（ＴＦＡ塩、６５．０ｍｇ、０．１９ｍｍｏｌ、９９％）を得、さらに精製することなく次の工程に用いた。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ７．７１−７．７９（ｍ，Ｊ＝９．１５Ｈｚ，２Ｈ），７．６３−７．７０（ｍ，Ｊ＝９．１５Ｈｚ，２Ｈ），３．０４（ｔ，Ｊ＝６．８０Ｈｚ，２Ｈ），２．６（ｔ，Ｊ＝７．０５Ｈｚ，２Ｈ），１．９８−２．０８（ｍ，２Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ１７３．１，１４３．６，１３５．７，１２０．７，１１２．９，１０６．２，８４．５，６２．７，４０．４，３４．５，２４．０；ＥＳＩ−ＭＳ：Ｃ１３Ｈ１４Ｎ３Ｏ＋［Ｍ＋Ｈ］＋，２２８．１；実測値２２８．１。
【0140】
３８：（２−（（４−（（４−（シアノエチニル）フェニル）アミノ）−４−オキソブチル）アミノ）−２−オキソエチル）トリス（２，４，６−トリメトキシフェニル）ホスホニウムトリフルオロアセテート。３８ａ（１当量、１０．１ｍｇ、０．０２９６ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（２５０μＬ）溶液に、ＴＥＡ（１当量、４μＬ、０．０２９６ｍｍｏｌ）を添加した。ＴＭＰＰ−Ａｃ−ＯＳｕ（１当量、２２．７ｍｇ、０．０２９６ｍｍｏｌ）を得られた溶液に添加し、反応塊を１５分間室温で。粗生成物をＨＰＬＣによって精製し、３８（９．９ｍｇ、０．０１２６ｍｍｏｌ、４２％）を主生成物として単離した。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ７．４４−７．５９（ｍ，４Ｈ），６．１３（ｄ，Ｊ＝４．５２Ｈｚ，６Ｈ），３．７５（ｓ，９Ｈ），３．５０（ｓ，１８Ｈ），３．００（ｔｄ，Ｊ＝７．９１，１５．３１Ｈｚ，２Ｈ），２．２６（ｔ，Ｊ＝６．９０Ｈｚ，２Ｈ），１．６４−１．７５（ｍ，２Ｈ），１．２５−１．４３（ｍ，２Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ１７４．２，１６７．４，１６７．４，１６５．３，１４３．６，１３５．８，１２０．６，１１２．８，１０６．３，９２．２（ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ），８４．５，６２．７，５６．５，５６．２，３７．５，２９．４（ｄ，Ｊ＝６４Ｈｚ），２７．９，２７．７，２４．９；ＥＳＩ−ＨＲＭＳ：Ｃ４２Ｈ４７Ｎ３Ｏ１１Ｐ＋［Ｍ］＋，８００．２９４２７；実測値８００．２９４０１。
【0141】
（５−（（４−（シアノエチニル）フェニル）アミノ）−５−オキソペンチル）トリス（２，４，６−トリメトキシフェニル）ホスホニウムブロミド（３９）：【化56】
５−ブロモペンタン酸（１当量、２．８５ｇ、１５．７ｍｍｏｌ）およびＳＯＣｌ２（１当量、１．８７ｇ、１．１４ｍＬ、１５．７ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（５０ｍＬ）脱気溶液を３時間還流した。得られた反応塊を減圧下で蒸発させて３９ｄ（３．１１ｇ、１００％）を黄色がかった油として得た。粗生成物を精製することなく次の工程に用いた。
【0142】
３９ｃ：５−ブロモ−Ｎ−（４−ヨードフェニル）ペンタンアミド。３９ｄ（１当量、３．１１ｇ、１５．７ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（５０ｍＬ）溶液を、４−ヨードアニリン（１当量、３．４５ｇ、１５．７ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（１当量、２．０３ｇ、２．６ｍＬ、１５．７ｍｍｏｌ）の−７８℃に冷却したＤＣＭ（５０ｍＬ）溶液に注いだ。得られた反応塊を室温まで加温させ、さらに３０分間撹拌し、１Ｎ ＨＣｌ（２ｘ２５ｍＬ）、水（１×２５ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、蒸発させて、３９ｃ（５．６０ｇ、１４．６６ｍｍｏｌ、９３％）を褐色固体として得た。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ７．６２−７．６６（ｍ，２Ｈ），７．３８−７．４３（ｍ，２Ｈ），３．５０（ｔ，Ｊ＝６．５３Ｈｚ，２Ｈ），２．４２（ｔ，Ｊ＝７．２８Ｈｚ，２Ｈ），１．８１−１．９８（ｍ，４Ｈ），１．３７−１．４２（ｍ，１Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ１７４．０，１４０．５，１３８．９，１２３．１，８７．６，３６．９，３３．８，３３．４，２５．３；ＥＳＩ−ＭＳ：Ｃ１１Ｈ１４ＢｒＩＮＯ＋［Ｍ＋Ｈ］＋，３８１．９；実測値３８１．８。
【0143】
３９ｂ：５−ブロモ−Ｎ−（４−（３−ヒドロキシプロプ−１−イン−１−イル）フェニル）ペンタンアミド：薗頭カップリングのプロトコールＡに従って合成した。褐色固体、収率：９２％。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ７．４９−７．６３（ｍ，Ｊ＝８．５３Ｈｚ，２Ｈ），７．３２−７．４３（ｍ，Ｊ＝８．５３Ｈｚ，２Ｈ），４．４０（ｓ，２Ｈ），４．２６（ｓ，１Ｈ），３．５０（ｔ，Ｊ＝６．５３Ｈｚ，２Ｈ），２．４３（ｔ，Ｊ＝７．１５Ｈｚ，２Ｈ），１．９０−２．０４（ｍ，２Ｈ），１．７４−１．９０（ｍ，２Ｈ），１．３２（ｓ，１Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ１７３．９，１４０．０，１３３．１，１２０．７，１１９．６，８８．２，８５．２，５１．２，３６．８，３３．７，３３．３，２５．３；ＥＳＩ−ＭＳ：Ｃ１４Ｈ１７ＢｒＮＯ＋［Ｍ＋Ｈ］＋，３１０．０；実測値３１０．０。
【0144】
３９ａ：５−ブロモ−Ｎ−（４−（シアノエチニル）フェニル）ペンタンアミド。ＮＨ３（４当量、９４．８ｍｇ、５．５６ｍｍｏｌ）のＩＰＡ溶液（２Ｍ）および無水ＭｇＳＯ４（１５当量、２５１１ｍｇ、２０．９ｍｍｏｌ）を３９ｂ（１当量、４３１ｍｇ、１．３９ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（３．４２ｍＬ）撹拌溶液に添加した。この溶液に活性化したＭｎＯ２（１５当量、１８１４ｍｇ、２０．９ｍｍｏｌ）を添加し、得られた混合物を室温で４時間撹拌し（ＴＬＣによって制御、さらなる出発アルコールなし；ＮＢ：反応時間が長すぎて加水分解生成物が得られた）、ＤＣＭ（１３ｍＬ）で希釈した。混合物を濾過し、ＤＣＭで完全に洗浄し、合わせた濾液を減圧下に濃縮させた。固体残渣をフラッシュクロマトグラフィ（ＥｔＯＡｃ−シクロヘキサン、２０分間勾配、０〜１００％のＥｔＯＡｃ）によって精製し、３９を白色固体として得た（２８８ｍｇ、０．９４６ｍｍｏｌ、６８％）。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ７．６９−７．７９（ｍ，Ｊ＝８．７８Ｈｚ，２Ｈ），７．５９−７．６９（ｍ，Ｊ＝８．７８Ｈｚ，２Ｈ），３．５０（ｔ，Ｊ＝６．５３Ｈｚ，２Ｈ），１．７９−１．９９（ｍ，４Ｈ），１．２６（ｔ，Ｊ＝７．１５Ｈｚ，２Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ１７４．３，１４３．８，１３５．７，１２０．７，１１２．８，１０６．２，１０１．４，８４．６，３７．０，３３．７，３３．４，２５．２。ＥＳＩ−ＭＳ：Ｃ１４Ｈ１４ＢｒＮ２Ｏ＋［Ｍ＋Ｈ］＋，３０４．０；実測値３０４．０。
【0145】
３９：（５−（（４−（シアノエチニル）フェニル）アミノ）−５−オキソペンチル）トリス（２，４，６−トリメトキシ−フェニル）ホスホニウムブロミド。３９ａ（１当量、２０ｍｇ、０．０６５５ｍｍｏｌ）およびトリス（２，４，６−トリメトキシ−フェニル）ホスファン（ＴＭＰＰ、１．２当量、４１．９ｍｇ、０．０７８６ｍｍｏｌ）を乾燥トルエン（１ｍＬ）に溶解し、室温で一晩撹拌した。３９（ＴＦＡ塩、２２ｍｇ、３９％）を逆相ＨＰＬＣ後に白色固体として得た。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ７．５１−７．５５（ｍ，４Ｈ），６．１３（ｄ，Ｊ＝４．７７Ｈｚ，６Ｈ），３．７５（ｓ，９Ｈ），３．５０（ｓ，１８Ｈ），３．００（ｔｄ，Ｊ＝６．９０，１５．３１Ｈｚ，２Ｈ），２．２６（ｔ，Ｊ＝６．９０Ｈｚ，２Ｈ），１．７３（ｍ，２Ｈ），１．２２−１．４５（ｍ，２Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ１７４．２，１６７．４，１６５．３，１４３．６，１３５．８，１２０．６，１１２．８，１０６．２，９３．６，９２．３，９２．２，８４．５，６２．７，５６．３，３７．５，２９．７，２７．７，２４．９；ＥＳＩ−ＨＲＭＳ：Ｃ４１Ｈ４６Ｎ２Ｏ１０Ｐ＋［Ｍ］＋，７５７．２８８４６；実測値７５７．２９５５２。
【0146】
（４−（４−（シアノエチニル）ベンズアミド）ブチル）トリス（２，４，６−トリメトキシフェニル）ホスホニウムトリフルオロアセテート（４０）：【化57】
４−ヨード安息香酸（１当量、１．４５ｇ、５．８５ｍｍｏｌ）をＳＯＣｌ２（９当量、３．８ｍＬ、５２．６ｍｍｏｌ）中１１０℃で完全に溶解するまで（およそ１５分）加熱した。過剰のＳＯＣｌ２を真空中で除去し、得られた固体をＤＣＭ（１５ｍＬ）に注ぎ、−７８℃に冷却し、ＤＩＰＥＡ（３．１当量、３ｍＬ、１８．２ｍｍｏｌ）を激しい撹拌下に添加した。得られた反応塊に３−ブロモプロピルアミンヒドロブロミド（１．５当量、１．９０ｇ、８．７７ｍｍｏｌ）を添加し、−７８℃で５分間撹拌したままにし、さらに２０分間撹拌しながら室温まで加温させた。酢酸エチル（１００ｍＬ）を１Ｍ ＨＣｌ（５ｍＬ）と共に添加し、得られた固体を濾過し（生成物）、水で洗浄し、乾燥して４０ｃ（２．０９ｇ、５．６７ｍｍｏｌ、９７％）を白色固体として生成した。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ７．８５（ｍ，Ｊ＝８．４０Ｈｚ，２Ｈ），７．５８（ｍ，Ｊ＝８．４０Ｈｚ，２Ｈ），３．４８−３．５６（ｍ，４Ｈ），２．１２−２．２３（ｍ，２Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ１６０．１，１３９．２，１３６．０，１３２．８，１０２．４，５０．１，４３．２，２３．０；ＥＳＩ−ＭＳ：Ｃ１０Ｈ１２ＢｒＩＮＯ＋［Ｍ＋Ｈ］＋，３６７．９；実測値３６８．０。
【0147】
４０ｂ：Ｎ−（４−ブロモブチル）−４−（３−ヒドロキシプロプ−１−イン−１−イル）ベンズアミド。薗頭カップリングのプロトコールＢに従って合成した。褐色固体、収率：８１％。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ７．７３（ｍ，Ｊ＝８．４０Ｈｚ，２Ｈ），７．３８（ｍ，Ｊ＝８．４０Ｈｚ，２Ｈ），４．３７（ｔ，Ｊ＝５．３０Ｈｚ，２Ｈ），４．３４（ｓ，２Ｈ），３．５１（ｔ，Ｊ＝５．８０Ｈｚ，２Ｈ），１．９２−１．９８（ｍ，２Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ１５９．２，１３４．２，１３２．４，１２８．２，１２７．１，９１．２，８４．８，６７．２，５１．２，４３．３，２２．５；ＥＳＩ−ＭＳ：Ｃ１３Ｈ１５ＢｒＮＯ２＋［Ｍ＋Ｈ］＋，２９５．０；実測値２９５．０。
【0148】
４０ａ：Ｎ−（３−ブロモプロピル）−４−（シアノエチニル）ベンズアミド。ＭｎＯ２酸化のプロトコールを用いて合成した。反応時間：４５分間。褐色固体、収率：５２％。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ７．９０（ｍ，Ｊ＝８．５０Ｈｚ，２Ｈ），７．８０（ｍ，Ｊ＝８．５０Ｈｚ，２Ｈ），３．４２−３．５５（ｍ，２Ｈ），３．２５−３．３５（ｍ，２Ｈ），２．１３−２．２３（ｍ，２Ｈ），１．９２−１．９８（ｍ，２Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ１６８．７，１３８．８，１３４．９，１２８．９，１２１．４，１０５．８，８３．０，６７．３，４１．９，３９．８，２２．８；ＥＳＩ−ＭＳ：Ｃ１３Ｈ１２ＢｒＮ２Ｏ＋［Ｍ＋Ｈ］＋，２９１．０；実測値２９１．２。
【0149】
４０：（４−（４−（シアノエチニル）ベンズアミド）ブチル）トリス（２，４，６−トリメトキシフェニル）ホスホニウムトリフルオロアセテート。４０ａ（１当量、３０ｍｇ、０．１０３ｍｍｏｌ）およびトリス（２，４，６−トリメトキシフェニル）ホスファン（ＴＭＰＰ、１当量、５４．９ｍｇ、０．１０３ｍｍｏｌ）を乾燥トルエン（２ｍＬ）に溶解させた。得られた溶液を室温で一晩放置した。沈殿を濾過し、ＤＭＳＯに再溶解させ、ＨＰＬＣによって精製し、４０（３５ｍｇ、０．０４０９ｍｍｏｌ、４０％）を白色固体として得た。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ７．７５（ｄ，Ｊ＝８．５０Ｈｚ，２Ｈ），７．６９（ｄ，Ｊ＝８．５０Ｈｚ，２Ｈ），６．１６（ｄ，Ｊ＝４．７０Ｈｚ，２Ｈ），３．７６（ｓ，９Ｈ），３．５１（ｓ，１８Ｈ），３．３５（ｔ，Ｊ＝７．１０Ｈｚ，２Ｈ），２．９８−３．１０（ｍ，２Ｈ），１．５３−１．６４（ｍ，２Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ１６８．５，１６７．５，１６５．３，１３８．７，１３４．９，１２８．８，１２１．２，１０５．８，９４．０，９２．９，９２．３，８２．９，６４．５，５６．５，４１．７，２７．８，２５．７；ＥＳＩ−ＨＲＭＳ：Ｃ４０Ｈ４４Ｎ２Ｏ１０Ｐ＋［Ｍ］＋，７４３．２２７２８；実測値７４３．２３９４６。
化合物３８〜４０を本発明による検出および／または分離方法に用いることができる。
【0150】
３−（４−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）フェニル）プロピオニトリル（４１）：【化58】
７（１当量、７６．８ｍｇ、０．５４１ｍｍｏｌ）のアセトン（２ｍＬ）溶液に、無水マレイン酸（２当量、１０６ｍｇ、１．０８ｍｍｏｌ）を添加した。約７時間の撹拌後、黄色がかった固体を得た。反応塊を蒸発させ、過剰の無水マレイン酸およびマレイン酸をメタノールで洗浄した。４１ａ（１２７ｍｇ、０．５３ｍｍｏｌ、９８％）を黄色がかった固体として得、さらに精製する必要はなかった。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１２．９０（ｂｒ．ｓ．，１Ｈ），１０．７０（ｓ，１Ｈ），７．６２−７．９０（ｍ，４Ｈ），６．５０（ｄ，Ｊ＝１１．９０Ｈｚ，１Ｈ），６．３４（ｄ，Ｊ＝１１．９０Ｈｚ，１Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１６６．８，１６３．８，１４２．４，１３５．０，１３１．７，１３０．１，１１９．３，１１０．２，１０５．６，８４．３，６１．９；ＥＳＩ−ＭＳ：Ｃ１３Ｈ７Ｎ２Ｏ３−［Ｍ−Ｈ］−，２３９．０；実測値２３９．０。
【0151】
４１：３−（４−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）フェニル）−プロピオニトリル。４１ａ（１当量、７５ｍｇ、０．３１２ｍｍｏｌ）の乾燥ＤＭＦ（１．２１ｍＬ）溶液に、無水トリフルオロ酢酸（２当量、８６．９μＬ、０．６２４ｍｍｏｌ）を添加した。室温でさらに５分間撹拌を継続し、Ｋ２ＣＯ３（３当量、１２９ｍｇ、０．９３７ｍｍｏｌ）を添加した。反応塊をさらに６０分間撹拌し、次いでＨＰＬＣによって直接精製し、４１（６５．９ｍｇ、０．２９７ｍｍｏｌ、９５％）を僅かに黄色の固体として得た。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ７．８１（ｍ，Ｊ＝８．５０Ｈｚ，２Ｈ），７．５２（ｍ，Ｊ＝８．５０Ｈｚ，２Ｈ），６．９６（ｓ，２Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１６９．０，１３４．４，１３４．０，１２６．０，１１７．３，１１７．０，８２．２，７８．５，６２．３；ＥＳＩ−ＭＳ：Ｃ１３Ｈ７Ｎ２Ｏ２＋［Ｍ＋Ｈ］＋，２２３．０；実測値２２９．９。
化合物４１を本発明によるバイオコンジュゲーション法に用いることができる。
【0152】
５−（（４−（シアノエチニル）−フェニル）−アミノ）−５−オキソペンタン酸２，５−ジオキソピロリジン−１−イル（４２）：【化59】
７（１当量、２００ｍｇ、１．４１ｍｍｏｌ）のアセトン（１ｍＬ）溶液に、無水グルタル酸（２当量、３２１ｍｇ、２．８１ｍｍｏｌ）を添加した。得られた溶液を２４時間室温で撹拌した。アセトンを蒸発させ、粗生成物をＩＰＡ−シクロヘキサンから再結晶し、４２ａ（３２４ｍｇ、１．２７ｍｍｏｌ、９０％）を灰色固体として得た。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１０．２１（ｓ，１Ｈ），８．１５（ｂｒ．ｓ．，１Ｈ），７．６０（ｄ，Ｊ＝８．７２Ｈｚ，２Ｈ），７．５２（ｄ，Ｊ＝８．７２Ｈｚ，２Ｈ），２．５２−２．６２（ｍ，４Ｈ），２．２２−２．３２（ｍ，２Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１７０．０，１６８．５，１４０．９，１３４．２，１１９．０，１１１．９，１０５．４，８４．１，６３．３，３０．１，２９．０，２１．２；ＥＳＩ−ＭＳ：Ｃ１４Ｈ１１Ｎ２Ｏ３−［Ｍ−Ｈ］−，２５５．１；実測値２５５．１。
【0153】
４２：５−（（４−（シアノエチニル）フェニル）−アミノ）−５−オキソペンタン酸２，５−ジオキソピロリジン−１−イル。４２ａ（１当量、１８ｍｇ、０．０７０２ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（１ｍＬ）溶液に、ＤＣＣ（１．０２当量、１４．８ｍｇ、０．０７１６ｍｍｏｌ）およびＴＥＡ（１当量、６．５２ｍｇ、０．００８９５ｍＬ、０．０６４４ｍｍｏｌ）を添加した。得られた反応塊を５分間撹拌し、ＮＨＳ（１当量、８．０８ｍｇ、０．０７０２ｍｍｏｌ）を添加した。得られた溶液をさらに２時間室温で撹拌した。粗生成物をフラッシュクロマトグラフィ（シクロヘキサン−ＥｔＯＡｃ）によって精製し、４２（６．４５ｍｇ、０．０１８３ｍｍｏｌ、２６％）を白色固体として得た。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ）δ８．２７（ｂｒ．ｓ．，１Ｈ），７．６４（ｄ，Ｊ＝８．７８Ｈｚ，２Ｈ），７．５７（ｄ，Ｊ＝８．７８Ｈｚ，２Ｈ），２．９４（ｓ，４Ｈ），２．７４（ｔ，Ｊ＝６．５３Ｈｚ，２Ｈ），２．５２（ｔ，Ｊ＝６．９０Ｈｚ，２Ｈ），２．２３（ｍ，２Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ）ｄ１７０．３，１６９．５，１６８．２，１４１．３，１３４．６，１１９．４，１１２．４，１０５．７，８３．２，６２．９，３５．６，２９．９，２５．７，２１．２；ＥＳＩ−ＭＳ：Ｃ１８Ｈ１６Ｎ３Ｏ５＋［Ｍ＋Ｈ］＋，３５３．１；実測値３５３．２。
化合物４２を本発明によるバイオコンジュゲーション法に用いることができる。
【0154】
３−（４−アジドフェニル）プロピオニトリル（４３）：【化60】
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，アセトニトリル−ｄ３）δ７．５８−７．８１（ｍ，Ｊ＝８．７８Ｈｚ，２Ｈ），７．１１−７．２６（ｍ，Ｊ＝８．７８Ｈｚ，２Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，アセトニトリル−ｄ３）δ１４４．９，１３６．０，１２０．４，１１３．６，１０５．９，８３．４，６２．９；ＧＣ−ＥＳＩ−ＭＳ：Ｃ９Ｈ５Ｎ４＋［Ｍ＋Ｈ］＋，１６９．０；実測値１６９．０。
【0155】
５−アジド−Ｎ−（４−（シアノエチニル）フェニル）ペンタンアミド（４４）：【化61】
５−アジドペンタン酸（１当量、１．１ｇ、６．９９ｍｍｏｌ）をＳＯＣｌ２（１０当量、５．１ｍＬ、６９．９ｍｍｏｌ）中で３０分間還流した。過剰のＳＯＣｌ２を真空中で除去し、得られた粗固体を精製することなく次の工程に用いた。
【0156】
４４：５−アジド−Ｎ−（４−（シアノエチニル）フェニル）ペンタンアミド。７（１当量、１６．１ｍｇ、０．１１３ｍｍｏｌ）およびＴＥＡ（１．５当量、２４μＬ、０．１７ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（３ｍＬ）に溶解させ、−７８℃に冷却し、４４ａ（１．１当量、２０．１ｍｇ、０．１２５ｍｍｏｌ）を反応混合物に添加し、次いで、これを、さらに１時間撹拌しながら室温まで加温させた。反応塊を１Ｍ ＨＣｌ（２×１ｍＬ）、水（２ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、蒸発させて粗生成物を得、これををフラッシュクロマトグラフィによって精製し、４４（２５．５ｍｇ、０．１０１ｍｍｏｌ、８９％）を灰色固体として得た。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ７．５８−７．６７（ｍ，Ｊ＝８．７０Ｈｚ，２Ｈ），７．４０−７．５８（ｍ，Ｊ＝８．７０Ｈｚ，２Ｈ），３．２３−３．２８（ｍ，２Ｈ），２．３４（ｔ，Ｊ＝７．２８Ｈｚ，２Ｈ），１．６１−１．７２（ｍ，２Ｈ），１．４９−１．６１（ｍ，２Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ１７３．０，１４４．０，１３５．７，１３４．３，１２０．７，１１３．０，１０６．２，８４．５，４０．４，３４．４，２８．８，２４．０；ＥＳＩ−ＭＳ：Ｃ１４Ｈ１４Ｎ５Ｏ＋［Ｍ＋Ｈ］＋，２６８．１；実測値２６８．１。
【0157】
１−［４−（シアノエチニル）ベンジル］−３，３，６，６−テトラメチル−４，５−ジデヒドロ−２，３，６，７−テトラヒドロチエピニウムトリフラート（４５）：【化62】
薗頭カップリングのプロトコールＡを用いて合成した。黄色がかった固体、収率：８８％。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，アセトニトリル−ｄ３）δ７．２５−７．４９（ｍ，Ｊ＝８．０３Ｈｚ，２Ｈ），７．０４−７．２５（ｍ，Ｊ＝８．０３Ｈｚ，２Ｈ），４．３４（ｄ，Ｊ＝６．０２Ｈｚ，２Ｈ），３．３１（ｔ，Ｊ＝６．０２Ｈｚ，１Ｈ），２．３２（ｓ，３Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，アセトニトリル−ｄ３）δ１３９．８，１３２．４，１３０．３，１２０．８，８８．８，８５．１，５１．２，２１．５；ＥＳＩ−ＭＳ：Ｃ１０Ｈ１１Ｏ＋［Ｍ＋Ｈ］＋，１４６．１；実測値１４６．０。
【0158】
４５ｂ：３−（ｐ−トリル）プロピオニトリル。化合物を標準のＭｎＯ２酸化プロトコールの唯一の生成物として得た。反応時間：３時間。白色固体、収率：６７％。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ７．３７−７．５９（ｍ，Ｊ＝８．０３Ｈｚ，２Ｈ），７．０２−７．３１（ｍ，Ｊ＝８．０３Ｈｚ，２Ｈ），２．２９（ｓ，３Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）１４３．２，１３３．３，１２９．５，１１４．０，１０４．８，８３．２，６１．３，２０．４；ＥＳＩ−ＭＳ：Ｃ１０Ｈ８Ｎ＋［Ｍ＋Ｈ］＋，１４１．１；実測値１４１．０。
【0159】
４５ａ：３−（４−（ブロモメチル）フェニル）プロピオニトリル。４５ｂ（１当量、６８ｍｇ、０．４８２ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（１ｍＬ）脱気溶液を５分間ＭＷ照射した（１００℃）。反応混合物を蒸発させ、粗生成物を分取ＨＰＬＣによって精製し、４５ａ（４２．４ｍｇ、０．１９３ｍｍｏｌ、４０％）を黄色がかった固体として得た。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ）δ７．５６−７．７１（ｍ，Ｊ＝８．２８Ｈｚ，２Ｈ），７．４０−７．４９（ｍ，Ｊ＝８．２８Ｈｚ，２Ｈ），４．４８（ｓ，２Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ）１４１．８，１３３．９，１２９．５，１１７．５，１０５．３，８２．３，６３．７，３１．８；ＧＣ−ＥＳＩ−ＭＳ：Ｃ１０Ｈ７ＢｒＮ＋［Ｍ＋Ｈ］＋，２１９．０；実測値２１９．０。
【0160】
４５：１−［４−（シアノエチニル）ベンジル］−３，３，６，６−テトラメチル−４，５−ジデヒドロ−２，３，６，７−テトラヒドロチエピニウムトリフラート。４５ａ（１当量、４３．７ｍｇ、０．１９９ｍｍｏｌ）およびＴＭＴＨ（１．２９当量、４３ｍｇ、０．２５５ｍｍｏｌ；上述の手順８３１に従って合成した）のＤＣＭ（１．３４ｍＬ）脱気溶液に、ＬｉＯＴｆ（１１．６当量、３６０ｍｇ、２．３１ｍｍｏｌ）の蒸留かつ脱気したＨ２Ｏ（０．６６８ｍＬ）溶液を添加した。得られた二相混合物を２５℃で５日間激しく撹拌した（１日に１回脱気）。二相を分離し、有機相をＤＣＭ（５×２ｍＬ）で洗浄した。合わせた有機分を蒸発させ、粗生成物をＨＰＬＣによって精製し、４５（４６．９ｍｇ、０．１１１ｍｍｏｌ、５６％）を無色油として得た（０℃でゆっくりと結晶化して白色固体を生成した）。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ）δ７．６５−７．７３（ｍ，Ｊ＝８．０３Ｈｚ，２Ｈ），７．５６−７．６５（ｍ，Ｊ＝８．０３Ｈｚ，２Ｈ），５．０７（ｓ，２Ｈ），４．１２（ｄ，Ｊ＝１２．３０Ｈｚ，２Ｈ），３．７２（ｄ，Ｊ＝１２．３０Ｈｚ，２Ｈ），１．３６（ｓ，６Ｈ），１．３０（ｓ，６Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１３５．１，１３３．６，１３１．９，１１７．８，１０６．４，１０５．８，８３．３，６３．６，６０．１，４３．２，３４．６，２６．４，２５．４；ＨＲ−ＥＳＩ−ＭＳ：Ｃ２０Ｈ２２ＮＳ＋［Ｍ］＋，３０８．１；実測値３０８．１。
化合物４３〜４５を本発明によるクリック化学（例えば、反応クリック−アジド）に用いることができる。
化合物４５を本発明による歪促進クリックに用いることができる。
【0161】
１‐（｛４‐［１‐｛［２‐（｛３‐カルボキシラト‐４‐［６‐（ジメチルアミノ）‐３‐（ジメチルイミニウミル）‐３Ｈ‐キサンテン‐９−イル］フェニル｝ホルムアミド）エチル］スルファニル｝‐２‐シアノエタ‐１‐エン‐１‐イル］フェニル｝メチル）‐３，３，６，６‐テトラメチル‐１‐チアシクロヘプタ‐４‐イン‐１‐イウムトリフルオロアセテート（４６）：【化63】
ＴＡＭＲＡ−５’−ＣＯＯＨ（１当量、６８．３ｍｇ、０．１５９ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（０．２２８ｍＬ）溶液に、ＨＡＴＵ（１当量、６０．３ｍｇ、０．１５９ｍｍｏｌ）、ＤＩＰＥＡ（６当量、１２３ｍｇ、０．１５７ｍＬ、０．９５２ｍｍｏｌ）および二塩化シスタミン（５当量、１７８ｍｇ、０．７９３ｍｍｏｌ）を続けて添加した；得られた溶液塊を一晩撹拌した。ＤＴＴ（５当量、１２２ｍｇ、０．１１８ｍＬ、０．７９３ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（０．９１１ｍＬ）溶液を反応塊に添加し、撹拌を２時間継続させた。溶媒を蒸発させた；得られた粗塊をＨＰＬＣによって精製し、４６ａ（３３．５ｍｇ、０．０５５５ｍｍｏｌ、３５％）を暗紫色固体として生成した。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ９．０６（ｔ，Ｊ＝５．４Ｈｚ，１Ｈ，８．７０（ｄ，Ｊ＝１．８Ｈｚ，１Ｈ），８．３０（ｄｄ，Ｊ＝１．８，８．０Ｈｚ，１Ｈ），７．５９（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），７．０８−７．０２（ｍ，４Ｈ），６．９５（ｓ，２Ｈ），３．５２−３．４２（ｍ，２Ｈ），３．２６（ｓ，１２Ｈ），２．７２（ｄｔ，Ｊ＝６．８，８．０Ｈｚ，２Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１６６．０，１６４．７，１５６．８，１５６．６，１３５．９，１３１．２，１３０．６，１１４．６，９６．３，４２．９，４０．５，２３．３；ＨＲ−ＥＳＩ−ＭＳ：Ｃ２７Ｈ２７Ｎ３Ｏ４Ｓ：４８９．１７２２；実測値４８９．１７２３。
【0162】
４６：１‐（｛４‐［（１Ｚ）‐１‐｛［２‐（｛３‐カルボキシラト‐４‐［６‐（ジメチルアミノ）‐３‐（ジメチルイミニウミル）‐３Ｈ‐キサンテン‐９−イル］フェニル｝ホルムアミド）エチル］スルファニル｝‐２‐シアノエタ‐１‐エン‐１‐イル］フェニル｝メチル）‐３，３，６，６‐テトラメチル‐１‐チアシクロヘプタ‐４‐イン‐１‐イウムトリフルオロアセテート（ＴＡＭＲＡ−ＡＰＮ−ＴＭＴＩ）。４５（１当量、６．７４ｍｇ、０．０１６ｍｍｏｌ）のＡＣＮ（１ｍＬ）溶液を４６ａ（１当量、９．６４ｍｇ、０．０１６ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（１ｍＬ）溶液と混合させた。次いでＤＩＰＥＡ（５当量、１３２μＬ、０．０８ｍｍｏｌ）を添加し、得られた反応塊を５分の反応後にＨＰＬＣに注入し、４６（１１．９ｍｇ、０．０１４９ｍｍｏｌ、９３％）を暗紫色固体として生成した。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ８．９８（ｔ，Ｊ＝５．４０Ｈｚ，１Ｈ），８．３０（ｄ，Ｊ＝８．２８Ｈｚ，１Ｈ），８．１０−８．２０（ｍ，１Ｈ），７．８５（ｓ，１Ｈ），７．５７−７．６９（ｍ，４Ｈ），６．９７−７．１５（ｍ，５Ｈ），６．０７（ｓ，１Ｈ），４．８５（ｓ，２Ｈ），２．８１−２．９０（ｍ，４Ｈ），３．２８（ｂｒ．ｓ．，１６Ｈ），１．２５（ｓ，６Ｈ），１．０５（ｓ，６Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）−情報なし（低い分割シグナル）；ＨＲ−ＥＳＩ−ＭＳ：Ｃ４７Ｈ４９Ｎ４Ｏ４Ｓ２＋，７９７．３１８９７；実測値７９７．３２７３９。
【0163】
１‐（｛４‐［２‐シアノ‐１‐［（２‐｛４‐［（Ｅ）‐２‐［４−（ジメチルアミノ）フェニル］ジアゼン‐１‐イル］ベンゼンスルホンアミド｝エチル）スルファニル］エタ‐１‐エン−１‐イル］フェニル｝メチル）‐３，３，６，６‐テトラメチル‐１‐チアシクロヘプタ‐４‐イン‐１‐イウム（４７，ＢＨＱ２−ＡＰＮ−ＴＭＴＩ）：【化64】
塩化ダブシル（１当量、１００ｍｇ、０．３０９ｍｍｏｌ）の０℃に冷却した乾燥ＡＣＮ（３ｍＬ）溶液に、ＴＥＡ（７当量、２１８ｍｇ、０．３ｍＬ、２．１６ｍｍｏｌ）および二塩酸シスタミン（５当量、３４７ｍｇ、１．５４ｍｍｏｌ）を続いて添加した。２時間の撹拌後、ＤＴＴ（６当量、２８５ｍｇ、０．２７５ｍＬ、１．８５ｍｍｏｌ）を反応塊に添加した。得られた溶液をさらに２時間撹拌し、蒸発させ、得られた粗生成物をフラッシュクロマトグラフィ（シクロヘキサン−ＥｔＯＡｃ）によって精製して４７ａ（１０５．９ｍｇ、９４％）を橙色固体として生成した。
【0164】
４７：１‐（｛４‐［（２‐シアノ‐１‐［（２‐｛４‐［（Ｅ）‐２‐［４‐（ジメチルアミノ）フェニル］ジアゼン‐１‐イル］ベンゼンスルホンアミド｝エチル）スルファニル］エタ‐１‐エン‐１‐イル］フェニル｝メチル）‐３，３，６，６‐テトラメチル‐１‐チアシクロヘプタ‐４‐イン‐１‐イウムトリフルオロアセテート。４６の合成と同じ手順。収率：９４％。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ８．０３（ｔ，Ｊ＝４．８９Ｈｚ，１Ｈ），７．９１（ｄ，Ｊ＝８．５３Ｈｚ，２Ｈ），７．８０−７．８７（ｍ，Ｊ＝９．０４Ｈｚ，２Ｈ），７．７２−７．７９（ｍ，Ｊ＝８．５３Ｈｚ，２Ｈ），７．６８（ｓ，４Ｈ），６．８７（ｄ，Ｊ＝９．０４Ｈｚ，２Ｈ），６．０８（ｓ，１Ｈ），４．８６（ｓ，２Ｈ），３．９２（ｄ，Ｊ＝１２．０５Ｈｚ，２Ｈ），３．８４（ｄ，Ｊ＝１２．３０Ｈｚ，２Ｈ），３．１０（ｓ，６Ｈ），２．７１−２．８７（ｍ，４Ｈ），１．３２（ｓ，６Ｈ），１．１７（ｓ，６Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１６０．２，１５８．６，１５８．３，１５５．１，１５３．７，１４３．１，１４０．３，１３６．８，１３１．９，１３１．３，１２９．５，１２８．２，１２５．９，１２２．８，１１７．２，１１２．１，１０６．４，９９．４，６０．０，４３．３，４２．９，３４．５，２６．４，２５．３；ＨＲ−ＥＳＩ−ＭＳ：Ｃ３６Ｈ４２Ｎ５Ｏ２Ｓ３＋，６７２．２４９５１；実測値６７２．２５０４２。
化合物４６〜４７を、他の場合には到達可能でない化合物（ＴＭＴＩ）の調製に用いることができる。
【0165】
５‐（３‐｛４‐［１‐（４‐｛［４‐（２‐シアノエタ‐１‐イン‐１‐イル）フェニル］カルバモイル｝ブチル）‐１Ｈ‐１，２，３‐トリアゾール‐４−イル］ブタンアミド｝プロピル）‐２‐［（Ｅ）‐２‐［４‐ヒドロキシ‐２‐（２‐｛２‐［２‐（２‐｛５‐［（４Ｓ）‐２‐オキソ‐ヘキサヒドロ‐１Ｈ‐チエノ［３，４‐ｄ］イミダゾリジン‐４−イル］ペンタンアミド｝エトキシ）エトキシ］エトキシ｝エトキシ）フェニル］ジアゼン‐１‐イル］安息香酸（４８，ＡＰＮ−ＨＡＺＡ−ビオチン）：【化65】
【0166】
４８ａ：２−（６−（ジメチルアミノ）−３−（ジメチルイミニオ）−３Ｈ−キサンテン−９−イル）−５−（（２−メルカプトエチル）カルバモイル）ベンゾエート。この化合物を、先に報告したプロトコールに従って合成した。
【0167】
４８：５‐（３‐｛４‐［１‐（４‐｛［４‐（２‐シアノエタ‐１‐イン‐１‐イル）フェニル］カルバモイル｝ブチル）−１Ｈ‐１，２，３‐トリアゾール‐４−イル］ブタンアミド｝プロピル）‐２‐［（Ｅ）‐２‐［４‐ヒドロキシ‐２‐（２‐｛２‐［２‐（２‐｛５‐［（４Ｓ）‐２‐オキソ‐ヘキサヒドロ‐１Ｈ‐チエノ［３，４‐ｄ］イミダゾリジン‐４−イル］ペンタンアミド｝エトキシ）エトキシ］エトキシ｝エトキシ）フェニル］ジアゼン‐１‐イル］安息香酸（ＡＰＮ−ＨＡＺＡ−ビオチン）。４８ａ（１当量、１０ｍｇ、０．０１２３ｍｍｏｌ）および７７（１当量、３．１２ｍｇ、０．０１２３ｍｍｏｌ）のＤＭＳＯ（０．４７２ｍＬ）溶液に、アスコルビン酸ナトリウム（１０当量、２４．４ｍｇ、０．１２３ｍｍｏｌ）およびＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ（５当量、１５．４ｍｇ、０．０６１７ｍｍｏｌ）の水溶液を添加した。得られた反応塊を脱気し、２５℃で一晩撹拌した。反応塊をＨＰＬＣによって直接精製し、４８（８．３ｍｇ、０．００７８ｍｍｏｌ、６３％）を黄色固体として得た。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ７．７８（ｂｒ．ｓ．，２Ｈ），７．７２（ｄ，Ｊ＝８．２８Ｈｚ，１Ｈ），７．６７（ｓ，１Ｈ），７．５８（ｄ，Ｊ＝８．７８Ｈｚ，２Ｈ），７．５０（ｄ，Ｊ＝８．７８Ｈｚ，２Ｈ），７．２９（ｄ，Ｊ＝８．２８Ｈｚ，１Ｈ），７．２５（ｄ，Ｊ＝８．５３Ｈｚ，１Ｈ），６．２９（ｄ，Ｊ＝７．７８Ｈｚ，１Ｈ），３．７０−３．８１（ｍ，８Ｈ），３．６２（ｄ，Ｊ＝４．７７Ｈｚ，２Ｈ），３．５８（ｄ，Ｊ＝５．０２Ｈｚ，２Ｈ），３．４８−３．５３（ｍ，２Ｈ），３．４１−３．４８（ｍ，２Ｈ），３．０１−３．０７（ｍ，６Ｈ），２．８９−３．００（ｍ，１０Ｈ），２．７８（ｄｄ，Ｊ＝４．８９，１２．９３Ｈｚ，１Ｈ），２．５２−２．６７（ｍ，８Ｈ），２．３３（ｔ，Ｊ＝７．２８Ｈｚ，２Ｈ），２．０９−２．１９（ｍ，２Ｈ），１．８１−１．９１（ｍ，４Ｈ），１．６５−１．７８（ｍ，２Ｈ），１．５２−１．６３（ｍ，２Ｈ），１．４２−１．５２（ｍ，１Ｈ），１．２３−１．３１（ｍ，１Ｈ）；ＨＲ−ＥＳＩ−ＭＳ：Ｃ５６Ｈ６７Ｎ１１Ｏ１１Ｓ，１０７７．４７４２２；実測値１０７７．４５９３１。
【0168】
２−（（４−（シアノエチニル）フェニル）アミノ）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル−２−オキソエタン−１−アミニウムトリフルオロアセテート（４９）：【化66】
VasselおよびSkelly（１０．１００２／０４７１２６４１８０．ｏｓ０３５．０９）によって先に記載されているように合成した。
【0169】
４９：２−（（４−（シアノエチニル）フェニル）アミノ）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル−２−オキソエタン−１−アミニウムトリフルオロアセテート。３−（４−アミノフェニル）プロプ−２−インニトリル（１当量、６６．３ｍｇ、０．４６６ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（１．１当量、６６．３ｍｇ、０．０８４８ｍＬ、０．５１３ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（１ｍＬ）溶液に、（２−クロロ−２−オキソエチル）トリメチルアザニウムクロリド（１．１当量、８８．３ｍｇ、０．５１３ｍｍｏｌ）の−２０℃に冷却したＤＭＦ（１ｍＬ）溶液を添加した。得られた反応塊を２５℃で１０時間撹拌し、ＲＰフラッシュクロマトグラフィによって精製し、４９を黄色がかった固体として得た（３９ｍｇ、０．１１０ｍｍｏｌ、２４％）。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，アセトニトリル−ｄ３）δ１１．１４（ｂｒ．ｓ．，１Ｈ），７．７０−７．８３（ｍ，Ｊ＝８．７８Ｈｚ，２Ｈ），７．５６−７．７０（ｍ，Ｊ＝８．７８Ｈｚ，２Ｈ），４．３３（ｓ，２Ｈ），３．２８（ｓ，９Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，アセトニトリル−ｄ３）δ１６３．５，１４２．５，１３５．８，１２１．２，１１３．５，１０６．５，８４．４，６６．３，６３．１，５５．２；ＥＳＩ−ＭＳ：Ｃ１４Ｈ１６Ｎ３Ｏ＋［Ｍ］＋，２４２．１３；実測値２４２．１３。
【0170】
３−（１−（１−（４−（シアノエチニル）フェニル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）−２，５，８，１１，１４−ペンタオキサヘプタデカン−１７−アミド）ペンタン二酸（５０）：【化67】
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，アセトニトリル−ｄ３）δ８．４１（ｓ，１Ｈ），７．９５−８．０２（ｍ，２Ｈ），７．８８−７．９４（ｍ，２Ｈ），６．８６（ｄ，Ｊ＝７．７８Ｈｚ，１Ｈ），４．７１（ｓ，２Ｈ），４．４９（ｔｄ，Ｊ＝６．７１，８．４１Ｈｚ，１Ｈ），３．６８−３．７６（ｍ，３Ｈ），３．４９−３．６８（ｍ，２１Ｈ），２．５３−２．６４（ｍ，５Ｈ），１．９７（ｔｄ，Ｊ＝２．４２，４．９６Ｈｚ，１５Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，アセトニトリル−ｄ３）δ１８８．７，１７３．３，１６１．６，１４６．５，１３５．１，１３１．３，１３０．８，１２２．５，１２１．０，１１７．９，１１５．４，６４．２，４０．４，３９．５，３６．７，３０．６；ＥＳＩ−ＭＳ：Ｃ２８Ｈ３４Ｎ５Ｏ１０−［Ｍ−Ｈ］−，６００．２１；実測値６００．２３。
【0171】
Ｎ１，Ｎ５−ビス（２３−アミノ−３，６，９，１２，１５，１８，２１−ヘプタオキサトリコシル）−３−（１−（１−（４−（シアノエチニル）フェニル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）−２，５，８，１１，１４−ペンタオキサヘプタデカン−１７−アミド）ペンタンジアミド（５１）：【化68】
ＥＳＩ−ＨＲＭＳ：Ｃ６０Ｈ１０３Ｎ９Ｏ２２，１３０１．７２１７７；実測値１３０１．７２２０４。
【0172】
Ｎ−（１７−アミノ−３，６，９，１２，１５−ペンタオキサヘプタデシル）−１−（１−（４−（シアノエチニル）フェニル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）−２，５，８，１１，１４−ペンタオキサヘプタデカン−１７−アミド（５２）：【化69】
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，アセトニトリル−ｄ３）δ８．４２（ｓ，１Ｈ），７．９５−８．０２（ｍ，Ｊ＝９．０３Ｈｚ，２Ｈ），７．８６−７．９５（ｍ，Ｊ＝８．７８Ｈｚ，２Ｈ），７．３０（ｂｒ．ｓ．，２Ｈ），７．１９（ｂｒ．ｓ．，１Ｈ），４．７１（ｓ，２Ｈ），３．７３−３．７９（ｍ，２Ｈ），３．６５−３．７３（ｍ，７Ｈ），３．５４−３．６５（ｍ，２９Ｈ），３．５１（ｔ，Ｊ＝５．４０Ｈｚ，２Ｈ），３．３４（ｑ，Ｊ＝５．３５Ｈｚ，２Ｈ），３．１３（ｄ，Ｊ＝４．５２Ｈｚ，２Ｈ），２．３７−２．４６（ｍ，２Ｈ），１．９２−２．０１（ｍ，５Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ）δ１７７．５，１５１．３，１４４．６，１４０．７，１４０．７，１４０．６，１２７．２，１２６．０，１２５．９，１２５．８，１２２．４，１１０．５，８７．２，７５．４，７５．３，７５．３，７５．２，７５．２，７５．１，７５．１，７５．１，７５．０，７４．９，７４．８，７４．８，７２．２，７１．９，６８．９，６８．５，４５．０，４４．２，４１．６；ＥＳＩ−ＭＳ：Ｃ３５Ｈ５５Ｎ６Ｏ１１＋［Ｍ＋Ｈ］＋，７３５．３９；実測値７３５．２０。
【0173】
１−（４−（シアノエチニル）フェニル）−３−（３−（ジメチルアミノ）プロピル）ウレア（５３）：【化70】
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ７．４５−７．５０（ｍ，２Ｈ），７．４１−７．４５（ｍ，２Ｈ），３．２３−３．２５（ｍ，１Ｈ），３．０４−３．１１（ｍ，２Ｈ），２．８０（ｓ，６Ｈ），１．７７−１．９１（ｍ，２Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ１５６．５，１４３．７，１３４．４，１１８．０，１０９．３，１０５．０，８３．７，６１．０，５５．２，４２．１，３５．９，２５．３；ＥＳＩ−ＭＳ：Ｃ１５Ｈ２０Ｎ４Ｏ＋［Ｍ＋Ｈ］＋，２７１．１６；実測値２７１．１５。
【0174】
３−（（３−（３−（４−（シアノエチニル）フェニル）ウレイド）プロピル）ジメチルアンモニオ）プロパン−１−スルホネート（５４）：【化71】
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，酸化重水素）δ７．４５−７．６７（ｍ，２Ｈ），７．３３（ｂｒ．ｓ．，２Ｈ），３．６１（ｂｒ．ｓ．，４Ｈ），３．５３（ｂｒ．ｓ．，１Ｈ），３．３９（ｂｒ．ｓ．，２Ｈ），３．３１（ｂｒ．ｓ．，２Ｈ），３．２５（ｂｒ．ｓ．，２Ｈ），３．０３（ｂｒ．ｓ．，７Ｈ），２．８９（ｂｒ．ｓ．，７Ｈ），２．１３（ｂｒ．ｓ．，１Ｈ），１．８９（ｂｒ．ｓ．，７Ｈ），１．０８（ｂｒ．ｓ．，２Ｈ）；ＥＳＩ−ＨＲＭＳ：Ｃ１８Ｈ２４Ｎ４Ｏ４Ｓ，３９２．１５１８３；実測値３９２．１５２５４。
化合物４９〜５４を、例えばＡＤＭＥパラメータを変更するための（可溶化剤）本発明によるコンジュゲーション法に用いることができる。
【0175】
３−（４−（４−（ヒドロキシメチル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−１−イル）フェニル）プロピオニトリル（５５）：【化72】
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＭｅＯＤ）δ８．５８（ｓ，１Ｈ），８．０４（ｄ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，２Ｈ），７．９３（ｄ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，２Ｈ），４．７７（ｓ，２Ｈ）；ＥＳＩ−ＭＳ：Ｃ１２Ｈ９Ｎ４Ｏ＋［Ｍ＋Ｈ］＋，２２５．０８；実測値２２５．０５。
【0176】
３−（４−（４−（ブロモメチル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−１−イル）フェニル）プロピオニトリル（５６）：【化73】
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，アセトニトリル−ｄ３）δ８．４４（ｓ，１Ｈ），７．７８−８．０３（ｍ，５Ｈ），４．７４（ｓ，２Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ）δ１５０．９，１４４．３，１４０．６，１４０．５，１２６．０，１２５．９，１１０．４，８７．１，６８．５，２７．０；ＥＳＩ−ＭＳ：Ｃ１２Ｈ８ＢｒＮ４＋［Ｍ＋Ｈ］＋，２８６．９９；実測値２８７．０８。
化合物５６を本発明によるバイオコンジュゲーション法に用いることができる。
【0177】
１−（｛１−［４−（シアノエチニル）フェニル］−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル｝メチル）−３，３，６，６−テトラメチル−４，５−ジデヒドロ−２，３，６，７−テトラヒドロチエピニウムトリフルオロアセテート（５７）：【化74】
ＥＳＩ−ＨＲＭＳ：Ｃ２２Ｈ２３Ｎ４Ｓ，３７５．１６４３４；実測値３７５．１６４９７。
化合物５７を本発明によるクリック化学（歪促進クリック）に用いることができる。
【0178】
４−（（（１−（４−（シアノエチニル）フェニル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）メチル）カルバモイル）−２−（６−（ジメチルアミノ）−３−（ジメチルイミニオ）−３Ｈ−キサンテン−９−イル）ベンゾエート（５８）：【化75】
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ８．５１（ｓ，１Ｈ），８．３３（ｄ，Ｊ＝８．２８Ｈｚ，１Ｈ），８．１６（ｄｄ，Ｊ＝１．５１，８．２８Ｈｚ，１Ｈ），７．８６−８．０２（ｍ，２Ｈ），７．６４−７．８６（ｍ，３Ｈ），７．０２−７．１２（ｍ，２Ｈ），６．８４−７．０２（ｍ，４Ｈ），４．５８−４．７１（ｍ，２Ｈ）；ＥＳＩ−ＨＲＭＳ：Ｃ３７Ｈ２９Ｎ７Ｏ４，６３５．２２８１１；実測値６３５．２２８６１。
【0179】
３−（９−（ジエチルアミノ）−５−オキソ−５Ｈ−ベンゾ［ａ］フェノキサジン−２−イル）プロピオニトリル（５９）：【化76】
ＥＳＩ−ＨＲＭＳ：Ｃ２１Ｈ１７Ｆ３Ｎ２Ｏ５Ｓ，４６６．０８１０３；実測値４６６．０８２２１。
【0180】
５９ａ：不活性雰囲気下、ＤＩＰＥＡ（２当量、１６．１ｍｇ、０．０２０６ｍＬ、０．１２４ｍｍｏｌ）およびプロパルギルアルコール（１．５当量、５．２３ｍｇ、０．００５５１ｍＬ、０．０９３３ｍｍｏｌ）を５９ｂ（１当量、２９ｍｇ、０．０６２２ｍｍｏｌ）、ＰｄＣｌ２（ＰＰｈ３）２（５％、２．１８ｍｇ、０．００３１１ｍｍｏｌ）およびＣｕＩ（１０％、１．１８ｍｇ、０．００６２２ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（１ｍＬ）溶液に添加した。９０℃で２時間撹拌後、溶媒を減圧下で除去した。粗生成物をフラッシュクロマトグラフィ（ＤＣＭ−メチルＯＨ１００−０〜８０−２０）によって精製した。ＥＳＩ−ＨＲＭＳ：Ｃ２３Ｈ２０Ｎ２Ｏ３，３７２．１４７３９；実測値３７２．１４７３５。
【0181】
５９：５９ａ（１当量、１０ｍｇ、０．０２６９ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（０．１２１ｍＬ）溶液にＭｇＳＯ４（１５当量、４８．５ｍｇ、０．４０３ｍｍｏｌ）、ＮＨ３（４当量、２Ｍ、０．０５３７ｍＬ、０．１０７ｍｍｏｌ）およびＭｎＯ２（１５当量、３５ｍｇ、０．４０３ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温で１５分間撹拌し、続いてＨＰＬＣに供した。完了後、混合物を、セライトを通して濾過し、ＴＨＦで完全に洗浄した。濾液の蒸発により粗生成物５９（９．４７ｍｇ、０．０２５８ｍｍｏｌ、９６％）を得、これをＨＰＬＣによって精製した。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ）δ８．９１（ｓ，１Ｈ），８．２６（ｄ，Ｊ＝８．０３Ｈｚ，１Ｈ），７．７９（ｄｄ，Ｊ＝１．５１，８．０３Ｈｚ，１Ｈ），７．６２（ｄ，Ｊ＝９．２９Ｈｚ，１Ｈ），６．７４（ｄｄ，Ｊ＝２．６３，９．１６Ｈｚ，１Ｈ），６．５１（ｄ，Ｊ＝２．５１Ｈｚ，１Ｈ），６．３５（ｓ，１Ｈ），５．３１（ｓ，２Ｈ），３．４９（ｑ，Ｊ＝７．１１Ｈｚ，４Ｈ），１．０９−１．３６（ｍ，６Ｈ）；ＥＳＩ−ＨＲＭＳ：Ｃ２３Ｈ１７Ｎ３Ｏ２，３６７．１３２０８；実測値３６７．１３１４５。
【0182】
（Ｅ）−３−（４−（（４−（ジメチルアミノ）フェニル）ジアゼニル）フェニル）プロピオニトリル（６０）：【化77】
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ）δ７．９１（ｄ，Ｊ＝９．０３Ｈｚ，２Ｈ），７．８２−７．８８（ｍ，Ｊ＝８．５３Ｈｚ，２Ｈ），７．６２−７．７７（ｍ，Ｊ＝８．５３Ｈｚ，２Ｈ），６．７７（ｄ，Ｊ＝９．０３Ｈｚ，２Ｈ），３．０８−３．１８（ｍ，６Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ）δ１５４．７，１５３．２，１４３．７，１３４．４，１２５．８，１２２．５，１１７．３，１１１．６，１０５．６，８３．３，６４．２，４０．３；ＥＳＩ−ＨＲＭＳ：Ｃ１７Ｈ１４Ｎ４，２７４．１２１８５；実測値２７４．１２２４７。
化合物５８〜６０を、本発明による検出方法方法に用いることができる。
【0183】
（（１−（４−（シアノエチニル）フェニル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）メチル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル（６１）：【化78】
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ）δ７．９７（ｓ，１Ｈ），７．７４−７．８１（ｍ，Ｊ＝８．７８Ｈｚ，２Ｈ），７．６７−７．７４（ｍ，Ｊ＝８．７８Ｈｚ，２Ｈ），４．４１（ｄ，Ｊ＝６．０２Ｈｚ，２Ｈ），１．３２−１．４１（ｍ，９Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ）δ１３９．０，１３５．１，１２０．４，１１７．８，１０７．２，１０５．１，８１．３，６４．５，２８．４；ＥＳＩ−ＭＳ：Ｃ１７Ｈ１８Ｎ５Ｏ２＋［Ｍ＋Ｈ］＋，３２３．１４；実測値３２３．１３。
【0184】
（１−（４−（シアノエチニル）フェニル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）メタンアミニウムトリフルオロアセテート（６２）：【化79】
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ８．７４（ｓ，１Ｈ），７．９９−８．１５（ｍ，２Ｈ），７．８５−７．９７（ｍ，２Ｈ），４．２５−４．４５（ｍ，２Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ１４１．２，１３８．９，１３５．２，１２２．３，１２０．３，１１７．７，１０４．４，８１．１，６２．９，３４．０；ＥＳＩ−ＭＳ：Ｃ１２Ｈ１０Ｎ５＋［Ｍ］＋，２２７．０９；実測値２２７．１０。
【0185】
Ｎ−（（１−（４−（シアノエチニル）フェニル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）メチル）−４−（３−（トリフルオロメチル）−３Ｈ−ジアジリン−３−イル）ベンズアミド（６３）：【化80】
ＥＳＩ−ＨＲＭＳ：Ｃ２１Ｈ１２Ｆ３Ｎ７Ｏ，４３５．１０５５４；実測値４３５．１０５１２。
化合物６３を、例えばタンパク質の光標識のための本発明による標識方法に用いることができる。
【0186】
（２−（（２−（４−（シアノエチニル）ベンズアミド）エチル）ジスルファニル）エチル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル（６４）：【化81】
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ７．７４−７．８４（ｍ，Ｊ＝８．５３Ｈｚ，２Ｈ），７．５８−７．７４（ｍ，Ｊ＝８．５３Ｈｚ，２Ｈ），３．６０（ｔ，Ｊ＝６．７８Ｈｚ，２Ｈ），３．２３−３．３５（ｍ，２Ｈ），２．８５（ｔ，Ｊ＝６．７８Ｈｚ，２Ｈ），２．７１（ｔ，Ｊ＝６．９０Ｈｚ，２Ｈ），１．３２（ｓ，９Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ１６７．３，１５７．０，１３７．３，１３３．５，１２７．５，１２０．１，１０４．４，８１．５，７８．８，６３．１，３９．３，３９．１，３７．８，２７．４，２６．６；ＥＳＩ−ＭＳ：Ｃ１９Ｈ２４Ｎ３Ｏ３Ｓ２＋［Ｍ＋Ｈ］＋，４０６．１２；実測値４０６．１０。
【0187】
２−（（２−（４−（シアノエチニル）ベンズアミド）エチル）ジスルファニル）エタン−１−アミニウムトリフルオロアセテート（６５）：【化82】
ＥＳＩ−ＨＲＭＳ：Ｃ１４Ｈ１６Ｎ３ＯＳ２＋，３０６．０７２９３；実測値３０６．０７３１２。
【0188】
２−（（２−（４−（シアノエチニル）ベンズアミド）エチル）ジスルファニル）エタン−１−アミニウムトリフルオロアセテート（６６）：【化83】
ＥＳＩ−ＨＲＭＳ：Ｃ２８Ｈ３５Ｎ９Ｏ７＋，６０９．２６５９４；実測値６０９．２６４１７。
化合物６６をキレート剤として用いることができる。
【0189】
５−（（４−（（４−（２−シアノ−１−（（２−（４−（（４−（（Ｅ）−（２，５−ジメトキシ−４−（（Ｅ）−（４−ニトロフェニル）ジアゼニル）フェニル）ジアゼニルフェニル）−（メチル）アミノ）ブタンアミド）エチル）チオ）ビニル）フェニル）アミノ）−４−オキソブチル）カルバモイル）−２−（６−（ジメチルアミノ）−３−（ジメチルイミニオ）−３Ｈ−キサンテン−９−イル）ベンゾエート（Ａ）：【化84】
FastBlackKヘミ（塩化亜鉛）塩（実用等級、約３０％の染料分）（７．７６ｇ）を冷水（１５０．０ｍＬ、０℃）に懸濁させ、２０分間撹拌した。懸濁液を濾過し、赤色溶液を、水アセトン混合物（１：１）（１５０．０ｍＬ）中の４−（メチル（フェニル）アミノ）ブタン酸（１．３３ｇ、６．８８ｍｍｏｌ）、濃塩酸（３．１ｍＬ）および酢酸ナトリウム（３．６ｇ、４３．９０ｍｍｏｌ）の冷（０℃）混合物に滴加した。反応混合物を１０℃で１５分間および室温で２時間撹拌した。次いで、反応粗生成物を酢酸エチル（３×１５０ｍＬ）で抽出し、合わせた有機層をＮａ２ＳＯ４上で乾燥した。粗生成物をシリカゲル上のカラムクロマトグラフィ（１００％ＥｔＯＡｃ、次いで１００％ＤＣＭ〜ＤＣＭ／ＭｅＯＨ（９５：５））によって精製した。ＢＨＱ−２（１．３６ｇ、３９％）を暗紫色固体として得た。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ８．３１（ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，２Ｈ），８．００（ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，２Ｈ），７．８６（ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，２Ｈ），７．４５（ｓ，１Ｈ），７．４０（ｓ，１Ｈ），６．７７（ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，２Ｈ），４．０５（ｓ，３Ｈ），４．００（ｓ，３Ｈ），３．５（ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，２Ｈ），２．３６（ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，２Ｈ），１．９８−１．９０（ｍ，２Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ１７６．２，１５７．１，１５４．３，１５３．０，１５１．４，１４９．０，１４７．４，１４５．０，１４２．６，１２６．９，１２５．３，１２４．２，１１２．１，１０１．７，１００．７，５７．２，５２．３，３９．０，３１．６，２２．９。
【0190】
６５ｂ：４−（（４−（（Ｅ）−（２，５−ジメトキシ−４−（（Ｅ）−（４−ニトロフェニル）ジアゼニル）フェニル）ジアゼニル）フェニル）（メチル）アミノ）−Ｎ−（２−メルカプトエチル）ブタンアミド（（ＢＨＱ−２）−ＳＨ）。ＢＨＱ−２（１当量、９２．２ｍｇ、０．１８２ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（５ｍＬ）およびＤＣＭ（１０ｍＬ）の混合物に溶解させた。ＴＥＡ（６当量、１５２μＬ、１．０９ｍｍｏｌ）および二塩化シスタミン（５当量、２０４ｍｇ、０．９１ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を０℃に冷却し、ＨＢＴＵ（１当量、６９ｍｇ、０．１８２ｍｍｏｌ）を添加した。溶液を室温に到達させ、１５時間撹拌した。全て転換したら、ＤＴＴ（６当量、１６８ｍｇ、０．１６２ｍＬ、１．０９ｍｍｏｌ）を添加した。得られた混合物を室温で１０分間撹拌した後、粗生成物を飽和ＮａＨＣＯ３溶液（７５ｍＬ）で希釈し、ＥｔＯＡｃ（２×５０ｍＬ）で抽出した。有機層を合わせ、水（５０ｍＬ）、塩水（５０ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥した。粗生成物をシリカゲル上のカラムクロマトグラフィ（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ、１００：０〜９５：５）によって精製して（ＢＨＱ−２）−ＳＨ（６０．７ｍｇ、０．１０７ｍｍｏｌ、５９％）を暗紫色固体として生成した。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ）δ８．３３（ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，２Ｈ），８．０（ｄ，Ｊ＝９．１Ｈｚ，２Ｈ），７．９（ｄ，Ｊ＝９．１Ｈｚ，２Ｈ），７．４２（ｓ，１Ｈ），７．４２（ｓ，１Ｈ），６．７５（ｄ，Ｊ＝９．００Ｈｚ，２Ｈ），５．９０（ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，１Ｈ），４．０６（ｓ，３Ｈ），４．０１（ｓ，３Ｈ），３．４９（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，２Ｈ），３．４１（ｄｔ，Ｊ＝６．２，６．４Ｈｚ，２Ｈ），２．６４（ｔｄ，Ｊ＝６．４，８．４７Ｈｚ，２Ｈ），２．２４（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，２Ｈ），２．０１−１．９４（ｍ，２Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ）δ１７２．２，１５６．６，１５３．８，１５２．４，１５１．１，１４８．５，１４７．０，１４４．７，１４２．３，１２６．４，１２４．９，１２３．７，１１１．６，１０１．２，１００．３，５７．０，５６．９，５１．８，４２．５，３８．７，３３．４，２４．９，２３．０；ＨＲ−ＥＳＩ−ＭＳ：Ｃ２７Ｈ３１Ｎ７Ｏ５Ｓ，５６５．２１０７；実測値５６５．２１０５。
【0191】
６７：５−（（４−（（４−（シアノエチニル）フェニル）アミノ）−４−オキソブチル）カルバモイル）−２−（６−（ジメチルアミノ）−３−（ジメチルイミニオ）−３Ｈ−キサンテン−９−イル）ベンゾエート。６２ａ（１当量、１７．３ｍｇ、０．０５０７ｍｍｏｌ）およびＴＡＭＲＡ−５’−ＣＯＯＨ（１当量、２１．８ｍｇ、０．０５０７ｍｍｏｌ）の０℃に冷却したＤＭＦ（１．４ｍＬ）脱気溶液に、ＨＢＴＵ（１当量、１９．２ｍｇ）を０℃で添加した。得られた反応塊を５分間撹拌し、ＴＥＡを添加した。反応塊を２５℃で１時間撹拌し、蒸発させ、ＨＰＬＣによって精製し、６５ａ（２２ｍｇ、６８％）を暗紫色固体として生成した。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ８．８（ｂｒ．ｓ，１Ｈ），８．７（ｓ，１Ｈ），８．０８−８．１６（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ），７．６０−７．７０（ｄ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，２Ｈ），７．４９−７．５８（ｄ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，２Ｈ），７．３２−７．３９（ｄ，Ｊ＝８．２，１Ｈ），δ７．０１（ｓ，４Ｈ），６．９３（ｓ，２Ｈ），３．４８−３．５８（ｍ，２Ｈ），３．２６（ｓ，１２Ｈ），２．４４−２．５４（ｔ，Ｊ＝７．１７Ｈｚ，２Ｈ），１．９８−２．１２（ｍ，２Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）−情報なし；ＨＲ−ＥＳＩ−ＭＳ：６３９．２４８１７；実測値６３９．２４３１０。
【0192】
Ａ：５−（（４−（（４−（２−シアノ−１−（（２−（４−（（４−（（Ｅ）−（２，５−ジメトキシ−４−（（Ｅ）−（４−ニトロフェニル）ジアゼニル）フェニル）ジアゼニルフェニル）−（メチル）アミノ）ブタンアミド）エチル）チオ）ビニル）フェニル）アミノ）−４−オキソブチル）カルバモイル）−２−（６−（ジメチルアミノ）−３−（ジメチルイミニオ）−３Ｈ−キサンテン−９−イル）ベンゾエート。ＢＨＱ−ＳＨ（１．１３当量、２ｍｇ、０．００３５４ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（０．５ｍＬ）脱気溶液に、６７（１当量、２ｍｇ、０．００３１３ｍｍｏｌ）のメタノール（０．５ｍＬ）脱気溶液を添加した。ＴＥＡ（４．６当量、２μＬ、０．０１４４ｍｍｏｌ）を添加し、得られた反応塊を２５℃で一晩放置した。溶媒を蒸発させ；粗生成物をＤＭＳＯ（０．５ｍＬ）に再溶解させ、ＨＰＬＣによって精製し、ＢＨＱ−ＡＰＮ−ＴＡＭＲＡ（Ａ，２．７ｍｇ、０．００２２５ｍｍｏｌ、７２％）を暗紫色固体として得た。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ８．６３（ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，１Ｈ），８．３４（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，２Ｈ），８．２２（ｄｄ，Ｊ＝７．８，２．０Ｈｚ，１Ｈ），８．００（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，２Ｈ），７．７５（ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，２Ｈ），７．６９（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，２Ｈ），７．５３（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），７．３９（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，２Ｈ），７．３４（ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，２Ｈ），６．７５−６．８６（ｍ，８Ｈ），５．４８（ｓ，１Ｈ），４．０２（ｓ，３Ｈ），３．９２（ｓ，３Ｈ），３．５８−３．６３（ｍ，２Ｈ），３．４５−３．５２（ｍ，２Ｈ），３．２１（ｓ，１２Ｈ），３．１６（ｔ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，２Ｈ），３．０８（ｓ，３Ｈ），２．７１（ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，２Ｈ），２．５５（ｔ，Ｊ＝６．２Ｈｚ，２Ｈ），２．２２（ｔ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，２Ｈ），２．０８−２．１６（ｍ，２Ｈ），１．８８−１．９６（ｍ，２Ｈ），１．６１（ｂｒ．ｓ，１Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）−情報なし；ＨＲ−ＥＳＩ−ＭＳ：Ｃ６５Ｈ６５Ｎ１２Ｏ１０Ｓ＋［Ｍ＋Ｈ］＋，１２０５．４６６１８；実測値１２０５．４６７４８。
【0193】
５−（（３−（３−（（２−（４−（（４−（（Ｅ）−（２，５−ジメトキシ−４−（（Ｅ）−（４−ニトロフェニル）ジアゼニル）フェニル）ジアゼニル）フェニル）（メチル）アミノ）ブタンアミド）エチル）チオ）−２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）プロピル）カルバモイル）−２−（６−（ジ−メチルアミノ）−３−（ジメチルイミニオ）−３Ｈ−キサンテン−９−イル）ベンゾエート（Ｂ）：【化85】
この化合物を先に記載した手順に従って合成した。８４５
【0194】
Ｂ−３：（３−（（３ａＲ，７ａＳ）−１，３−ジオキソ−３ａ，４，７，７ａ−テトラヒドロ−１Ｈ−４，７−エポキシイソインドール−２（３Ｈ）−イル）プロピル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル。Ｂ−４（１当量、１．７６ｇ、１０．７ｍｍｏｌ）およびＮ−（３−ブロモプロピル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル（２当量、５．０７ｇ、２１．３ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（２０ｍＬ）溶液に、Ｋ２ＣＯ３（１．２当量、１．７７ｇ、１２．８ｍｍｏｌ）を添加した。得られた反応塊を５０℃で１８時間加熱した。溶液を冷却させ；固体残渣を濾過してＤＭＦで洗浄した。合わせた有機分を蒸発させ、ヘキサン（５０ｍＬ）を添加してスラリー塊を得た。得られた懸濁液をさらなる時間にわたって撹拌し、濾過し、ヘキサンで洗浄してＢ−３（３．３６ｇ、１０．４ｍｍｏｌ、９８％）を白色固体として得た。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ）δ６．４９（ｓ，２Ｈ），５．２３（ｓ，２Ｈ），３．５２（ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，２Ｈ），２．９６−３．０９（ｍ，２Ｈ），２．８２（ｓ，２Ｈ），１．６６−１．７５（ｍ，２Ｈ），１．４１（ｓ，９Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ）δ１７６．５，１５５．９，１３６．５，８１．０，７９．３，４７．５，３７．１，３６．０，２８．４，２７．８。
【0195】
Ｂ−２：１−（３−アミノプロピル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン（ＴＦＡ塩）。６６ｃ（１当量、２４３ｍｇ、０．７５４ｍｍｏｌ）のトルエン（２５ｍＬ）溶液を３時間還流した。トルエンを蒸発させ；得られた白色粗生成物をＤＣＭ（５ｍＬ）に再溶解させ、ＴＦＡ（０．５ｍＬ）を添加した。撹拌を出発物質が完全に消失するまで（ＴＬＣによって制御）２時間継続させた。メタノール（３ｍＬ）によって反応をクエンチした後、溶媒を蒸発させた。得られた１−（３−アミノプロピル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン（Ｂ−２、ＴＦＡ塩、１９０ｍｇ、９４％）をさらに精製することなく用いた。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ６．７６（ｓ，２Ｈ），３．５２（ｔ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，２Ｈ），２．８０−２．８８（ｍ，２Ｈ），１．７６−１．８８（ｍ，２Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ１７０．６，１３５．６，３８．５，３５．４，２８．０。
【0196】
Ｂ−１：２−（６−（ジメチルアミノ）−３−（ジメチルイミニオ）−３Ｈ−キサンテン−９−イル）−５−（（３−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）プロピル）カルバモイル）ベンゾエート（ＴＡＭＲＡ−マレイミド）：ＴＡＭＲＡ−５’−ＣＯＯＨ（１当量、７１．５ｍｇ、０．１６６ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（３．２１ｍＬ）溶液に、ＴＥＡ（２．５当量、５７．７μＬ、０．４１５ｍｍｏｌ）およびＨＡＴＵ（１．１２当量、７０．７ｍｇ、０．１８６ｍｍｏｌ）を添加した。得られた反応塊をさらに５分間撹拌し、Ｂ−２（１当量、７１．５ｍｇ、０．１６６ｍｍｏｌ）を添加した。撹拌を２５分間継続し、反応塊を約１ｍＬの体積になるまで減圧下で蒸発させ、反応塊を分取ＨＰＬＣによって精製してＴＡＭＲＡ−マレイミド（Ｂ−１、３４．８ｍｇ、０．０６１５ｍｍｏｌ、３７％）を桃色固体として得た。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ８．６６（ｄ，Ｊ＝１．８Ｈｚ，１Ｈ），８．１４（ｄｄ，Ｊ＝１．８，８．０Ｈｚ，２Ｈ），７．４１（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，２Ｈ），７．０２（ｄ，Ｊ＝９．５Ｈｚ，１Ｈ），６．９２（ｄｄ，Ｊ＝９．５，２．２Ｈｚ，２Ｈ），６．８１（ｄ，Ｊ＝２．２Ｈｚ，２Ｈ），６．７２（ｓ，２Ｈ），３．５２（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，２Ｈ），３．３４（ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，２Ｈ），３．１７（ｓ，１２Ｈ），１．８０−１．９０（ｍ，２Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ１７２．５，１６８．２，１６７．４，１６０．６，１５９．０，１５８．９，１３８．１，１３７．７，１３７．６，１３５．５，１３２．９，１３２．３，１３２．０，１３１．４，１１５．６，１１４．８，９７．５，８２．４，４１．０，３８．６，３６．４，２９．３。ＨＲ−ＥＳＩ−ＭＳ：Ｃ３２Ｈ３０Ｎ４Ｏ６，５６６．２１６５３；実測値５６６．２１６５４。
【0197】
Ｂ：５−（（３−（３−（（２−（４−（（４−（（Ｅ）−（２，５−ジメトキシ−４−（（Ｅ）−（４−ニトロ−フェニル）ジアゼニル）フェニル）ジアゼニル）フェニル）（メチル）アミノ）ブタンアミド）エチル）チオ）−２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）プロピル）カルバモイル）−２−（６−（ジメチルアミノ）−３−（ジメチルイミニオ）−３Ｈ−キサンテン−９−イル）ベンゾエート。ＢＨＱ−ＳＨ（１．１５当量、４．６ｍｇ、０．００８１２ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（０．５ｍＬ）脱気溶液に、ＴＡＭＲＡ−マレイミド（Ｂ−１）（１当量、４ｍｇ、０．００３１３ｍｍｏｌ）のメタノール（０．５ｍＬ）脱気溶液を添加した。ＴＥＡ（５当量、５μＬ、０．０３５３ｍｍｏｌ）を添加し、得られた反応塊を２５℃で一晩放置した。溶媒を蒸発させ；粗生成物をＤＭＳＯ（０．５ｍＬ）に再溶解し、ＨＰＬＣによって精製してＢ（７ｍｇ、０．００６２１ｍｍｏｌ、８８％）を暗紫色固体として得た。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ８．９１（ｔ，Ｊ＝６．１Ｈｚ，１Ｈ），８．６８（ｓ，１Ｈ），８．４３（ｄ，Ｊ＝９．１Ｈｚ，２Ｈ），８．３１（ｄ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，１Ｈ），８．０１−８．１０（ｍ，３Ｈ），７．７７（ｄ，Ｊ＝９．１Ｈｚ，２Ｈ），７．６０（ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，１Ｈ），７．３９（ｓ，１Ｈ），７．３３（ｓ，１Ｈ），６．９９（ｓ，３Ｈ），６．８９（ｓ，１Ｈ），６．８５（ｄ，Ｊ＝９．１Ｈｚ，２Ｈ），４．０４（ｄｄ，Ｊ＝３．９，８．９Ｈｚ，１Ｈ），３．９８（ｓ，３Ｈ），３．９２（ｓ，３Ｈ），３．４１−３．４５（ｍ，２Ｈ），３．２７−３．３８（ｍ，６Ｈ），３．２３（ｍ，１２Ｈ），３．０６（ｓ，３Ｈ），２．８５−２．９５（ｍ，１Ｈ），２．７２−２．８１（ｍ，１Ｈ），２．５２−２．５６（ｍ，２Ｈ），２．１７（ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，２Ｈ），１．７４−１．８８（ｍ，４Ｈ）。ＨＲ−ＥＳＩ−ＭＳ：Ｃ５９Ｈ６２Ｎ１１Ｏ１１Ｓ＋［Ｍ＋Ｈ］＋，１１３２．４３４５５；実測値１１３２．４３３８４。
【0198】
実施例２：本発明の化合物によるシステイン誘導体の標識【化86】
９８５μＬのＰＢＳ（１×、ｐＨ７．６）を含有するバイアルに、５μＬのベンズアミド原液（水中１０ｍＭ）、５μＬのアリールプロピオニトリル原液（１−１２、ＤＭＳＯ中１０ｍＭ）および５μＬのＡｃＣｙｓＮＨＢｎ原液（７ｍ、ＤＭＳＯ中１０ｍＭ）を続けて添加した。反応混合物（５０μＬ）のアリコートをＨＰＬＣ（反応の０および３０分で注入）によって分析した。出発物質および加水分解生成物のピーク下の面積を内部標準のピークの面積に従って正規化した。
【0199】
結果得られた結果を以下の表２にまとめる。表２は、５０μＭの濃度の各試薬において２５℃で７ｍの存在下に３０分での化合物１〜１２の転化率を提示する。反応は、プロピオニトリル基に対してオルト位の置換基に由来する立体障害（エントリー１、５、８〜９、４）、ならびに置換基：−Ｉおよび−Ｍ置換基；の電子効果の増加（エントリー１０および１２）に対して極めて感受性であるが、＋Ｍ置換基は、化合物の反応性を低下させる（エントリー３および７）。
【表3】
【0200】
実施例３：式（Ｉ）の化合物の加水分解安定性およびフェニルマレイミドとの比較９８０μＬのＰＢＳ（１×、ｐＨ７．６）を含有するバイアルに、１０μＬのベンズアミド原液および１０μＬの求電子剤原液（フェニルマレイミド１または
【化87】
【0201】
得られた結果を図４および５に提示する。顕著な加水分解はフェニルマレイミド１についてのみ観察された（ＰｈＭａｌ、ｋｏｂｓ＝７×１０−５ｓ−１）。１１は、検出可能な濃度変化を示さなかった。
【0202】
実施例４：式（ＩＩＩ）の化合物の安定性種々の条件における以下の化合物の安定性
「付加物」
【化88】
【0203】
以下の表３は、種々の媒体中の１時間での「付加物」の転化率を示す。【表4】
【0204】
この実験は、付加物が安定であり、広範な条件、特に０〜１４の範囲のｐＨにおいて非常に僅かな分解しか経験しないことを明確に示している。
【0205】
また、付加物が、過剰の別のチオール、例えばフェニルチオールまたはグルタチオンを含む媒体に１時間暴露されたとき、いずれのチオール交換もほとんど観察されない。
【0206】
式（ＩＩＩ）の化合物の安定性およびマレイミドとの比較以下の化合物Ａ（本発明による）およびＢ（参照化合物）の安定性を種々の生体条件において調査した。
【化89】
【0207】
細胞培養：マウスからの正常な肝臓ＢＮＬ ＣＬ．２細胞を、１０％ウシ胎児血清（Perbio,Brebieres,France）、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（Eurobio）を補充した１ｇ／ｌのグルコース（Eurobio,Les Ulis,France）を含むダルベッコＭＥＭ培地において成長させた。細胞を３７℃で５％ＣＯ２湿気環境に維持した。
【0208】
顕微鏡実験の２４時間前に、ウエルあたり２．５×１０４のＢＮＬ ＣＬ．２細胞を８ウエルのLab-Tek IIチャンバーカバーガラス（参照番号１５５４０９，Nunc,Naperville,IL,USA）に播種した。所要量のプローブＡおよびＢをＭＥＭ完全培地において３００μｌまで希釈して１μＭの最終濃度を得、次いで、上記細胞上に添加した。５μｇ／ｍｌのHoechst118溶液を核マーカーとして用いた。細胞を、１０％ＦＢＳフェノールレッドフリーイーグルＭＥＭ培地で洗浄した後、共焦点Leica TSC SPE II顕微鏡によって観察した。
【0209】
サイトメトリー：実験前日、ＢＮＬ ＣＬ．２細胞をダルベッコＭＥＭ完全培地中２．０×１０４細胞／ウエルで９６プレート（Greiner Bio One,Frickenhausen,Germany）に播種した。両方のプローブ（ＡおよびＢ）をダルベッコＭＥＭ完全培地中１μＭの濃度で調製し、種々の時間（２、６および２４時間）の間、細胞上に添加した。ＰＢＳ（Eurobio）で洗浄し、４０μｌのトリプシンで５分間インキュベーションし、１６０μＬのＰＢＳ ＥＤＴＡ（５ｍＭ）を添加した後、細胞を、緑色レーザーによるPCA-96Guavaサイトメーター（Guava Technologies Merck Millipore,Billerica,MA,USA）におけるフローサイトメトリーによって分析した。
【0210】
第１に、化合物Ａは、ヒト血漿において化合物Ｂよりもはるかに安定であった（図１参照）。第２に、化合物Ａは、インセルロにおいて、化合物Ｂよりも、はるかに安定であった（図２参照）。
【0211】
実施例４：チオール部位に対する本発明の化合物の選択性選択性についてのスクリーニングを、非保護アミノ酸のベンジルアミドにおいて行った。アミノ酸（ＴＦＡ塩の形態）のベンジルアミドおよび求電子剤（フェニルプロピオニトリルおよびフェニルマレイミド）の１００ｍＭの原液をＤＭＳＯ中で調製し、−２０℃で保存した。１００ｍＭのベンズアミド原液（内部標準として使用）を蒸留水中で調製し、−２０℃で保存した。反応混合物の分析をShimadzu LC with SunFire（商標）Ｃ１８（５μＭの４．６×１５０ｍｍのカラム）によって行った（Waters）。ＨＰＬＣパラメータは以下の通りであった：流量：１ｍＬ／分、勾配：５〜９５％の移動相Ｂ、０〜２０分、続いて９５％の移動相で５分、およびポスト時間５分。移動相Ａは０．０５％ＴＦＡ水溶液（ｍＱ）（ｖ／ｖ）であり、移動相Ｂはアセトニトリル（ＨＰＬＣ等級）であった。データを、Shimadzu分析ソフトウェアを用いて分析した。シグナルを、内部標準（ベンズアミド）のピークの面積に従って正規化した。アミノ酸ベンジルアミドのピーク下の面積を用いて反応の際の転化率を算出した。
【0212】
１０μＬのアミノ酸ベンズアミド原液および２．５μＬのベンズアミド原液を、９７７．５μＬのＰＢＳ（１×、ｐＨ７．６）を含有するバイアルに添加した。溶液を撹拌し、１０μＬの求電子剤原液を添加して１ｍＭの最終濃度の試薬および０．２５ｍＭの濃度のベンズアミドを得た。反応混合物（５０μＬ）のアリコートを１時間の加水分解（０、３０および６０分で注入）でＨＰＬＣによって分析した。出発物質および加水分解生成物のピーク下の面積を内部標準のピークの面積に従って正規化した。フェニルプロピオニトリルの場合、いずれのアミノ酸モデルも１．６％超の転化率を得られなかった（以下の表３を参照）。逆に、フェニルマレイミドを試験したとき、いくつかのアミノ酸ベンジルアミドが最大で８．５％の転化率を示した。対応するアダクトの塊をいくつかの場合において（表４の太字を参照）質量分析（ＥＳＩ−ＬＣＭＳ）によって検出した。
【0213】
以下の表４は、フェニルプロピオニトリル（１）の存在下、ＰＢＳ（１×、ｐＨ７．６）中１時間でのベンジルアミドの転化率を提示する。【表5】
【0214】
以下の表５は、フェニルマレイミドの存在下、ＰＢＳ（１×、ｐＨ７．６）中１時間でのベンジルアミドの転化率を提示する。太字の値は、対応するアダクトの塊がＥＳＩ−ＬＣＭＳによって検出されたものに相当する。【表6】
【0215】
結論として、チオール部位に対する本発明の化合物の選択性は、他の部位と比較したとき、プロピオニトリル部位がマレイミド部位で置き換えられている対応する化合物について得られた選択性よりも明らかに高い。
【0216】
実施例５：毒性試験以下の式（ＩＩ）の「リンカー」化合物の毒性をＨａＣａＴ細胞株におけるＭＴＴアッセイによって検討した：
【化90】
【0217】
ＭＴＴ試験の結果を図５に提示する。式（ＩＩ）の化合物は毒性でなく、そのため、例えば生体用途に用いられ得ることが明確に示されている。
【0218】
実施例６：式（Ｉ）の化合物によるリゾチームの標識：リゾチームのトリプシン消化物の標識
１ｎｍｏｌのリゾチームをＮＨ４ＨＣＯ３（２５ｍＭ）に可溶化させ、１時間の間５７℃で１ｍＭのＴＣＥＰによって還元した。ＡＰＮ−ＴＭＰＰの溶液（ＤＭＳＯ中１ｍＭ）を１：２００のモル比でタンパク質に添加した。次いで、標識タンパク質をブタトリプシン（Promega V5111）によるタンパク質分解に供した。サンプルを２５ｍＭ重炭酸アンモニウム中１：１００（ｗ／ｗ）トリプシンによって３５℃で一晩消化させた。反応に続いてナノＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析を行った。得られたペプチド混合物を、ナノエレクトロスプレー源を備えたQ-TOF maXis（Bruker Daltonics,Bremen,Germany）質量分析器に連結されたnanoACQUITY Ultra-Performance-LC system（Waters,Milford,MA）においてＣ１８逆相ナノＨＰＬＣによって分析した。クロマトグラフィ分離をnanoACQUITY Ultra-Performance-LCにおいて実施した。ペプチドをACQUITY UPLC（登録商標）BEH130 C18カラム（Waters Corp.）（７５μｍ×２００ｍｍ、１．７μｍ粒径）において分離した。溶媒系は、０．１％ギ酸の水溶液（溶媒Ａ）および０．１％ギ酸のアセトニトリル溶液（溶媒Ｂ）からなった。トラッピングを、９９％の溶媒Ａおよび１％の溶媒Ｂによって５μＬ／分で３分間、２０×０．１８ｍｍの５μｍのSymmetry C18プレカラム（Waters Corp.）において実施した。溶離を、１〜５０％勾配の溶媒Ｂを用いて３００ｎＬ／分の流量で５０℃において３０分、続いて、８０％（５分間）の溶媒Ｂにおいて高速上昇で実施した。完全系をHystar 3.2（Bruker Daltonics）によって完全に制御した。Q-TOF機器を以下の設定で操作した：電源温度を２００℃に設定し、乾燥気体流量が４ｌ／時間であり、ナノエレクトロスプレー電圧が４ｋＶであった。ＴＯＦの質量検量線を５０〜２２００ｍ／ｚの範囲においてポジティブモードでES-TOF Tuning Mix（Agilent Technologies）を用いて得た。タンデムＭＳ実験では、系をｍ／ｚ範囲［５０〜２２００］においてＭＳおよびＭＳ／ＭＳモードの両方の間での自動切り替えによって操作した。ＭＳにおいて、総時間は０．２秒であった。ＭＳ／ＭＳにおいて、総時間は、親イオン強度の関数において０．２秒と１．４秒との間で加重した。２つの最も豊富なペプチド（強度閾値４００ａｕ）、好ましくは２、３、４または５つの電荷を有するイオンを各ＭＳスペクトルにおいて選択してさらに単離し、衝突エネルギープロファイルを用いて設定された２つのエネルギーによりＣＩＤフラグメント化した。衝突ガスとしてアルゴンを用いてフラグメント化を実施した。トリプシンペプチドを（初めから）手動で配列決定してその配列を確認し、APN-TMPPプローブによってタグ付けされたシステインを位置付けた。ペプチドを、算出されたペプチド配列のモノアイソトピック質量に基づいて、抽出されたイオンクロマトグラム（ＥＩＣ）を用いて同定した。
【0219】
ＡＰＮ−ＴＭＰＰ化学選択性の評価を、ＡＰＮ−ＴＭＰＰ（１μＭ）対タンパク質のモル比２００：１（システイン部位に対しておよそ１０：１）で、室温で１時間のトリプシン消化物による反応の研究によって実施した。化学的誘導体化によらずおよびこれによって得られたペプチド混合物をＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって分析した。全ての検出可能なシステイン含有ペプチドは、システイン不含ペプチドが影響を受けることなく、プローブと反応し、遅延された。標識効率を、ＬＣ−ＭＳによる、標識および非標識ペプチドの強度間の比に基づいて評価した。検出されたペプチドのうち９８％超が完全に標識された。ＬＣ−ＭＳ結果により、システイン含有ペプチドは、疎水性ＴＭＰＰ基の添加に起因して保持時間が増加する一方で、他の全てのペプチドの保持時間は変化しないということが明確に示されている（表６）。
【0220】
以下の表６は、ＡＰＮ−ＴＭＰＰとの反応前後のリゾチームのトリプシン消化物のＬＣ−ＭＳ分析の結果を示す。【表7】
【0221】
実施例７：ＣＤ３８Ａ２７５Ｃ突然変異体による可溶化ＡＰＮ試薬（４９〜５４）のコンジュゲーション。（４９によるＣＤ３８突然変異体の修飾の例における）実験の一般スキームを図６に示す。
３００μＬのＣＤ３８Ｃ２７５溶液（１ｍｇ／ｍＬ）に可溶化ＡＰＮ試薬（４９〜５４）の６μＬの５０ｍＭ ＤＭＳＯ溶液を添加した。平行して、対照として、３００μＬのＣＤ３８Ｃ２７５に、６μＬのＤＭＳＯを添加した。両方のサンプルを２５℃で１５時間インキュベートし、次いで５回透析し（メンブレンカットオフ１０ｋ）、最終体積が３０μＬ（１０ｍｇ／ｍＬ）のそれぞれを得た。凝集物のサイズをＤＬＳによって測定した。
【0222】
実施例８：ＣＤ３８−ＣＤ３７５突然変異体の標識およびマレイミドとの比較ａ）本発明の化合物および対応するマレイミドの安定性
以下の化合物を合成した:
【化91】
【0223】
ｂ）ＣＤ３８突然変異体との反応両方の化合物をＣＤ３８−Ｃ３７５突然変異体の２μＭ溶液と反応させた。
精製後のゲル電気泳動により、対応するマレイミド化合物によってよりも、本発明の化合物によって、より高い標識速度が得られ得ることが示された。図７は、精製前後に本発明の化合物およびマレイミドによって得られたゲル電気泳動を提示する。
【0224】
実施例９：化合物１８を用いたトラスツズマブおよびＴＡＭＲＡのコンジュゲーション実験の一般スキームを図８に示す。
トラスツズマブの溶液（１００ｕＬ、５０ｍＭホウ酸緩衝液ｐＨ８．５中１０ｍｇ／ｍＬ）に１８の溶液（ＤＭＳＯ中１０ｍｇ／ｍＬ）１．７４μＬを添加した。２５℃で１時間インキュベーション後、０．６９μＬのＴＡＭＲＡ−ＳＨ（ＤＭＳＯ中１００ｍＭ）を添加した。混合物を２５℃で１６時間インキュベートし、コンジュゲートをサイズ排除クロマトグラフィによって精製した。
１８の代わりに４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＳＭＣＣ）を用いて比較実験を行った。
得られたコンジュゲート（図９）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により、化合物１８がＳＭＣＣと比較して高いレベルのコンジュゲーションを可能にすることが示された。
１８を用いて調製したコンジュゲートのネイティブＥＳＩ−ＭＳ分析（図１０、図１１）により、抗体あたり平均１分子のＴＡＭＲＡがコンジュゲートしたことが示された。
ＳＭＣＣを用いて調製したコンジュゲートのネイティブＥＳＩ−ＭＳ分析（図１２、図１３）により、識別不能な種の複合混合物が示された。
実験により、化合物１８が、一般に適用されるＳＭＣＣと比較して、より高いレベルのコンジュゲーションを可能にし、よりクリーンなコンジュゲート集団を与えることが示されている。
【0225】
実施例１０：部分還元トラスツズマブへの化合物５８の直接コンジュゲーション。実験の一般スキームを図１４に示す。
トラスツズマブの溶液（１００ｕＬ、１０ｍＭのＥＤＴＡを含む５０ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中１０ｍｇ／ｍＬ）をＴＣＥＰの溶液（水中１０ｍＭ、１．１または２．２当量）に添加した。混合物を３７℃で２時間インキュベートし、次いで、５８の溶液（８．２５μＬ、ＤＭＳＯ中１０ｍＭ）を添加した。混合物を２５℃で１６時間インキュベートし、コンジュゲートをサイズ排除クロマトグラフィによって精製した。
得られたコンジュゲートのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（図１５）により、化合物５８が抗体に共有結合したことが示された。ＥＳＩ−ＭＳ分析により、２．２当量のＴＣＥＰを用いて抗体あたり平均４分子がコンジュゲートしたことが示された。
【0226】
実施例１１：化合物３３および３４を用いた抗体フラグメントの再架橋。実験の一般スキームを図１６に示す。
トラスツズマブの溶液（１００ｕＬ、１０ｍＭのＥＤＴＡを含む５０ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中１０ｍｇ／ｍＬ）を、ＴＣＥＰの溶液（水中１０ｍＭ、５当量）に添加した。混合物を３７℃で２時間インキュベートし、次いで、３３または３４の溶液（ＤＭＳＯ中１０ｍＭ、１５当量）を添加した。得られた溶液を２５℃で１６時間インキュベートし、次いで、還元条件においてＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により、抗体フラグメントが化合物３３および３４によって成功裏に架橋されたことが示された（図１７）。