特許 6578400 抗体薬物コンジュゲート

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6578400

(24)【登録日】2019年8月30日

(45)【発行日】2019年9月18日

(54)【発明の名称】抗体薬物コンジュゲート

(51)【国際特許分類】

   A61K 47/68 20170101AFI20190909BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20190909BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20190909BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20190909BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20190909BHJP

【ＦＩ】

   A61K47/68ZNA

   A61P35/00

   A61P35/02

   A61K39/395 L

   A61K39/395 T

   A61K45/00

【請求項の数】4

【外国語出願】

【全頁数】146

(21)【出願番号】特願2018-49209(P2018-49209)

(22)【出願日】2018年3月16日

(62)【分割の表示】特願2016-501584(P2016-501584)の分割

【原出願日】2014年3月12日

(65)【公開番号】特開2018-123141(P2018-123141A)

(43)【公開日】2018年8月9日

【審査請求日】2018年4月10日

(31)【優先権主張番号】61/793,641

(32)【優先日】2013年3月15日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】504389991

【氏名又は名称】ノバルティス アーゲー

(74)【代理人】

【識別番号】100092783

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 浩

(74)【代理人】

【識別番号】100095360

【弁理士】

【氏名又は名称】片山 英二

(74)【代理人】

【識別番号】100120134

【弁理士】

【氏名又は名称】大森 規雄

(74)【代理人】

【識別番号】100141195

【弁理士】

【氏名又は名称】西澤 恵美子

(74)【代理人】

【識別番号】100104282

【弁理士】

【氏名又は名称】鈴木 康仁

(72)【発明者】

【氏名】アブラムス，ティンヤ

(72)【発明者】

【氏名】コーヘン，スティーブン

(72)【発明者】

【氏名】ファントン，クリスティ ピー．

(72)【発明者】

【氏名】フーバー，トーマス

(72)【発明者】

【氏名】ミラー，キャシー

(72)【発明者】

【氏名】シュライヤー，シュウ ホ

(72)【発明者】

【氏名】ティソ−ドゥゲット，カトリーン ウルリケ

(72)【発明者】

【氏名】フィナー，カーティン

【審査官】 参鍋 祐子

(56)【参考文献】

【文献】 米国特許出願公開第２００２／０１９７２６２（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 Mol. Cancer Ther.，２０１０年，Vol.9(10)，pp.2700-2713

【文献】 Journal of Cellular Physiology，１９９４年，Vol.158，pp.545-554

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ４７／６８

Ａ６１Ｋ ３９／３９５

Ａ６１Ｋ ４５／００

Ａ６１Ｐ ３５／００

Ａ６１Ｐ ３５／０２

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

患者におけるｃＫＩＴ陽性がんを処置するための医薬組成物であって、式：

（式中、
Ａｂは、ドメイン１〜３（配列番号１５５）でヒトｃＫＩＴのエピトープに特異的に結合する抗体またはその抗原結合性断片であり；およびｎは１〜１０の整数である）
の抗体薬物コンジュゲートまたはその薬学的に許容される塩を含み、
前記抗体またはその抗原結合性断片が：
（ｉ）（ａ）配列番号７６のＨＣＤＲ１（ＣＤＲ−相補性決定領域）、（ｂ）配列番号７７のＨＣＤＲ２、（ｃ）配列番号７８のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、（ｄ）配列番号８５のＬＣＤＲ１、（ｅ）配列番号８６のＬＣＤＲ２、および（ｆ）配列番号８７のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；
（ｉｉ）（ａ）配列番号２２のＨＣＤＲ１、（ｂ）配列番号２３のＨＣＤＲ２、（ｃ）配列番号２４のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、（ｄ）配列番号３１のＬＣＤＲ１、（ｅ）配列番号３２のＬＣＤＲ２、および（ｆ）配列番号３３のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；
（ｉｉｉ）（ａ）配列番号１３０のＨＣＤＲ１、（ｂ）配列番号１３１のＨＣＤＲ２、（ｃ）配列番号１３２のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、（ｄ）配列番号１３９のＬＣＤＲ１、（ｅ）配列番号１４０のＬＣＤＲ２、および（ｆ）配列番号１４１のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；
（ｉｖ）（ａ）配列番号５８のＨＣＤＲ１、（ｂ）配列番号５９のＨＣＤＲ２、（ｃ）配列番号６０のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、（ｄ）配列番号６７のＬＣＤＲ１、（ｅ）配列番号６８のＬＣＤＲ２、および（ｆ）配列番号６９のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；
（ｖ）（ａ）配列番号４０のＨＣＤＲ１、（ｂ）配列番号４１のＨＣＤＲ２、（ｃ）配列番号４２のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、（ｄ）配列番号４９のＬＣＤＲ１、（ｅ）配列番号５０のＬＣＤＲ２、および（ｆ）配列番号５１のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；
（ｖｉ）（ａ）配列番号９４のＨＣＤＲ１、（ｂ）配列番号９５のＨＣＤＲ２、（ｃ）配列番号９６のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、（ｄ）配列番号１０３のＬＣＤＲ１、（ｄ）配列番号１０４のＬＣＤＲ２、および（ｆ）配列番号１０５のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；
（ｖｉｉ）（ａ）配列番号１１２のＨＣＤＲ１、（ｂ）配列番号１１３のＨＣＤＲ２、（ｃ）配列番号１１４のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、（ｄ）配列番号１２１のＬＣＤＲ１、（ｅ）配列番号１２２のＬＣＤＲ２、および（ｆ）配列番号１２３のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；または
（ｖｉｉｉ）（ａ）配列番号３のＨＣＤＲ１、（ｂ）配列番号４のＨＣＤＲ２、（ｃ）配列番号５のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、（ｄ）配列番号１２のＬＣＤＲ１、（ｅ）配列番号１３のＬＣＤＲ２、および（ｆ）配列番号１４のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域
を含む、組成物。

【請求項2】

前記がんが、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、メラノーマ、肥満細胞白血病（ＭＣＬ）、肥満細胞症、神経線維腫症、乳がん、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）および膵臓がんからなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。

【請求項3】

前記抗体薬物コンジュゲートが、別の治療剤と組み合わせて投与される、請求項１または２に記載の組成物。

【請求項4】

前記抗体薬物コンジュゲートが、イマチニブ、スニチニブ、エベロリムス、ＮＶＰ−ＬＣＬ１６１、ＮＶＰ−ＢＥＺ２３５、ＮＶＰ−ＢＫＭ１２０、ＮＶＰ−ＢＹＬ７１９、ＮＶＰ−ＣＣＧ１６８、ＮＶＰ−ＨＳＰ９９０およびＮＶＰ−ＢＶＢ８０８からなる群から選択される治療剤と組み合わせて投与される、請求項３に記載の組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本開示は、抗ｃ−ＫＩＴ抗体、抗体断片、抗体薬物コンジュゲート、およびがんの処置
のためのその使用に関する。

【背景技術】

【0002】

ｃＫＩＴは、幹細胞因子（ＳＣＦ）というリガンドに結合する１回膜貫通型受容体チロ
シンキナーゼである。ＳＣＦは、そのチロシンキナーゼ活性を活性化するｃＫＩＴのホモ
二量体化を誘導し、ＰＩ３−ＡＫＴとＭＡＰＫ経路の両方を介してシグナル伝達する（Ki
ndblom et al., Am J. Path. 1998 152(5):1259）。ｃＫＩＴはトランケート形態として
ネコ科のレトロウイルスにより発現されるがん遺伝子として初めて発見された（Besmer e
t al., J Virol. 1986; 60(1): 194-203）。対応するヒト遺伝子のクローニングにより、
ｃＫＩＴがＩＩＩ型クラスの受容体チロシンキナーゼのメンバーであり、ファミリーメン
バー、ＦＬＴ３、ＣＳＦ−１受容体およびＰＤＧＦ受容体の一員と見なされることが示さ
れた。

【0003】

ｃＫＩＴについて変異体であるマウスにより、ｃＫＩＴが造血細胞、生殖細胞、肥満細
胞およびメラノサイトの発生にとって必要であることが示されている。ヒトにおいては、
ｃＫＩＴの機能喪失は、難聴ならびに皮膚および毛髪の脱色をもたらし得る。いくつかの
ｃＫＩＴの機能的変異の獲得が、様々ながんにおいて記載されている。そのようながんと
しては、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、小細胞肺がん（Ｓ
ＣＬＣ）、肥満細胞白血病（ＭＣＬ）および膵臓がん（Hirota et al., Science 1998 (2
79):577; Esposito et al., Lab. Invets. 2002 82(11):1481）が挙げられる。

【0004】

ｃＫＩＴががん遺伝子であるというこれらの予備的指示のため、ｃＫＩＴをＡＭＬのマ
ーカーとして同定する抗体が作成された（Gadd et al., Leuk. Res. 1985 (9):1329）。
ＹＢ５．Ｂ８として知られる、このマウスモノクローナルは、ヒト患者に由来する白血病
性芽細胞を使用することにより作成され、ＡＭＬ細胞の表面上に豊富に発現されるｃＫＩ
Ｔを検出したが、正常な血液または骨髄細胞上のｃＫＩＴを検出しなかった（Gadd et al
., supra）。ＳＣＦのｃＫＩＴへの結合を遮断し、かくして、ｃＫＩＴシグナリングを遮
断する第２のｃＫＩＴ抗体（ＳＲ−１）が作成された（Broudy et al., Blood 1992 79(2
):338）。ＳＲ−１抗体の生物学的効果は、ＢＦＵ−ＥおよびＣＦＵ−ＧＭ増殖を阻害す
ることであり、この証拠に基づいて、造血または腫瘍細胞増殖に関するさらなる研究のた
めにそれを使用することを示唆した（Broudy et al., supra）。

【0005】

さらなるがん研究では、調査者は、ｃＫＩＴの低分子阻害剤であるイマチニブによる処
置がＧＩＳＴ細胞系の増殖を有意に減少させることを見出した。しかしながら、イマチニ
ブ処理された細胞は、ｃＫＩＴにおける二次変異のため時間と共に耐性になる（Edris et
al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, Early On-line Edition 2013）。しかしながら、Ｇ
ＩＳＴ細胞を第２の治療剤としてのＳＲ−１抗体で処理した場合、細胞増殖の有意な低下
、および細胞表面上でのｃＫＩＴ発現の低下があった（Edris et al., supra）。かくし
て、裸のＳＲ−１抗体は、ヒトＧＩＳＴ系におけるイマチニブ耐性の問題に対処するのに
有効であり、イマチニブ／抗−ｃＫＩＴ抗体組合せが有用であり得ることを示唆している
。

【0006】

抗体薬物コンジュゲート
抗体薬物コンジュゲート（「ＡＤＣ」）は、がんの処置における細胞毒性剤の局所送達
のために使用されてきた（例えば、Ｌａｍｂｅｒｔ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｉｎ
Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ５：５４３〜５４９，２００５を参照されたい）。ＡＤＣに
より、最小の毒性で最大の効果を達成することができる薬物部分の標的化された送達が可
能になる。ＡＤＣが有望な臨床結果を示すにつれて、がん療法のための新しい治療剤を開
発する必要性が増大する。

【発明の概要】

【0007】

本開示は、式Ａｂ−（Ｌ−（Ｄ）_ｍ）_ｎ（式中、ＡｂはヒトｃＫＩＴのエピトープに特
異的に結合する抗体もしくはその抗原結合性断片であり；Ｌはリンカーであり；Ｄは薬物
部分であり；ｍは１〜８の整数であり；ｎは１〜１０の整数である）またはその薬学的に
許容される塩の抗体薬物コンジュゲートに関する。

【0008】

前記ｎが３または４である、抗体薬物コンジュゲート。

【0009】

前記抗体またはその抗原結合性断片が、ｃＫＩＴの細胞外ドメイン（配列番号１６０）
に特異的に結合する、抗体薬物コンジュゲート。

【0010】

前記抗体または抗原結合性断片が、ドメイン１〜３でヒトｃＫＩＴのエピトープ（配列
番号１５５）に特異的に結合する、抗体薬物コンジュゲート。

【0011】

前記抗体またはその抗原結合性断片が、配列番号１６１および配列番号１６２でヒトｃ
ＫＩＴに特異的に結合する、抗体薬物コンジュゲート。

【0012】

前記抗体またはその抗原結合性断片が、配列番号１６３および配列番号１６４でヒトｃ
ＫＩＴに特異的に結合する、抗体薬物コンジュゲート。

【0013】

前記抗体またはその抗原結合性断片が、（ｉ）（ａ）配列番号７６のＨＣＤＲ１（ＣＤ
Ｒ−相補性決定領域）、（ｂ）配列番号７７のＨＣＤＲ２、（ｃ）配列番号７８のＨＣＤ
Ｒ３を含む重鎖可変領域と、（ｄ）配列番号８５のＬＣＤＲ１、（ｅ）配列番号８６のＬ
ＣＤＲ２、および（ｆ）配列番号８７のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；
（ｉｉ）（ａ）配列番号２２のＨＣＤＲ１、（ｂ）配列番号２３のＨＣＤＲ２、（ｃ）
配列番号２４のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、（ｄ）配列番号３１のＬＣＤＲ１、（
ｅ）配列番号３２のＬＣＤＲ２、および（ｆ）配列番号３３のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変
領域；
（ｉｉｉ）（ａ）配列番号１３０のＨＣＤＲ１、（ｂ）配列番号１３１のＨＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号１３２のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、（ｄ）配列番号１３９のＬＣ
ＤＲ１、（ｅ）配列番号１４０のＬＣＤＲ２、および（ｆ）配列番号１４１のＬＣＤＲ３
を含む軽鎖可変領域；
（ｉｖ）（ａ）配列番号５８のＨＣＤＲ１、（ｂ）配列番号５９のＨＣＤＲ２、（ｃ）
配列番号６０のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、（ｄ）配列番号６７のＬＣＤＲ１、（
ｅ）配列番号６８のＬＣＤＲ２、および（ｆ）配列番号６９のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変
領域；
（ｖ）（ａ）配列番号４０のＨＣＤＲ１、（ｂ）配列番号４１のＨＣＤＲ２、（ｃ）配
列番号４２のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、（ｄ）配列番号４９のＬＣＤＲ１、（ｅ
）配列番号５０のＬＣＤＲ２、および（ｆ）配列番号５１のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領
域；
（ｖｉ）（ａ）配列番号９４のＨＣＤＲ１、（ｂ）配列番号９５のＨＣＤＲ２、（ｃ）
配列番号９６のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、（ｄ）配列番号１０３のＬＣＤＲ１、
（ｄ）配列番号１０４のＬＣＤＲ２、および（ｆ）配列番号１０５のＬＣＤＲ３を含む軽
鎖可変領域；
（ｖｉｉ）（ａ）配列番号１１２のＨＣＤＲ１、（ｂ）配列番号１１３のＨＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号１１４のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、（ｄ）配列番号１２１のＬＣ
ＤＲ１、（ｅ）配列番号１２２のＬＣＤＲ２、および（ｆ）配列番号１２３のＬＣＤＲ３
を含む軽鎖可変領域；または
（ｖｉｉｉ）（ａ）配列番号３のＨＣＤＲ１、（ｂ）配列番号４のＨＣＤＲ２、（ｃ）
配列番号５のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、（ｄ）配列番号１２のＬＣＤＲ１、（ｅ
）配列番号１３のＬＣＤＲ２、および（ｆ）配列番号１４のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領
域
を含む、抗体薬物コンジュゲート。

【0014】

ＣＤＲ内の少なくとも１つのアミノ酸が、表１の別の抗ｃＫＩＴ抗体の対応するＣＤＲ
の対応する残基により置換される、抗体薬物コンジュゲート。

【0015】

ＣＤＲ内の１または２つのアミノ酸が改変、欠失または置換されている、抗体薬物コン
ジュゲート。

【0016】

可変軽鎖または可変重鎖領域のいずれかにわたって少なくとも９０、９１、９２、９３
、９４、９５、９６、９７、９８または９９％の同一性を保持する、抗体薬物コンジュゲ
ート。

【0017】

抗体がモノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト操作抗体（human engineer
ed antibody）、ヒト抗体、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）または抗体断片である、抗体薬物コ
ンジュゲート。

【0018】

前記リンカー（Ｌ）が、切断性リンカー、非切断性リンカー、親水性リンカー、プロチ
ャージリンカー（procharged linker）およびジカルボン酸に基づくリンカー（dicarboxy
lic acid based linker）からなる群から選択される、抗体薬物コンジュゲート。

【0019】

リンカーが、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（Ｓ
ＰＤＰ）、Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）ペンタノエート（ＳＰＰ）
、Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）ブタノエート（ＳＰＤＢ）、Ｎ−ス
クシンイミジル−４−（２−ピリジルジチオ）２−スルホ−ブタノエート（スルホ−ＳＰ
ＤＢ）、Ｎ−スクシンイミジルヨードアセテート（ＳＩＡ）、Ｎ−スクシンイミジル（４
−ヨードアセチル）アミノベンゾエート（ＳＩＡＢ）、マレイミドＰＥＧ ＮＨＳ、Ｎ−
スクシンイミジル４−（マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボキシレート（ＳＭＣＣ
）、Ｎ−スルホスクシンイミジル４−（マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボキシレ
ート（スルホ−ＳＭＣＣ）または２，５−ジオキソピロリジン−１−イル１７−（２，５
−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）−５，８，１１，１４−テ
トラオキソ−４，７，１０，１３−テトラアザヘプタデカン−１−オエート（ＣＸ１−１
）からなる群から選択される架橋試薬から誘導される、抗体薬物コンジュゲート。

【0020】

前記リンカーが、架橋試薬Ｎ−スクシンイミジル４−（マレイミドメチル）シクロヘキ
サンカルボキシレート（ＳＭＣＣ）から誘導される、抗体薬物コンジュゲート。

【0021】

前記薬物部分（Ｄ）が、Ｖ−ＡＴＰａｓｅ阻害剤、プロアポトーシス剤、Ｂｃｌ２阻害
剤、ＭＣＬ１阻害剤、ＨＳＰ９０阻害剤、ＩＡＰ阻害剤、ｍＴｏｒ阻害剤、微小管安定化
剤、微小管脱安定化剤、オーリスタチン、ドラスタチン、メイタンシノイド、ＭｅｔＡＰ
（メチオニンアミノペプチダーゼ）、タンパク質ＣＲＭ１の核輸送の阻害剤、ＤＰＰＩＶ
阻害剤、プロテアソーム阻害剤、ミトコンドリアにおけるホスホリル転移反応の阻害剤、
タンパク質合成阻害剤、キナーゼ阻害剤、ＣＤＫ２阻害剤、ＣＤＫ９阻害剤、キネシン阻
害剤、ＨＤＡＣ阻害剤、ＤＮＡ損傷剤、ＤＮＡアルキル化剤、ＤＮＡ挿入剤、ＤＮＡ副溝
結合剤およびＤＨＦＲ阻害剤からなる群から選択される、抗体薬物コンジュゲート。

【0022】

薬物部分がメイタンシノイドである、抗体薬物コンジュゲート。

【0023】

メイタンシノイドが、Ｎ（２’）−デアセチル−Ｎ（２’）−（３−メルカプト−１−
オキソプロピル）−メイタンシン（ＤＭ１）またはＮ（２’）−デアセチル−Ｎ２−（４
−メルカプト−４−メチル−１−オキソペンチル）−メイタンシン（ＤＭ４）である、抗
体薬物コンジュゲート。

【0024】

別の治療剤と組み合わせた、抗体薬物コンジュゲート。

【0025】

表１６に列挙される治療剤と組み合わせた、抗体薬物コンジュゲート。

【0026】

式：

【0027】

【化1】

（式中、
ＡｂはヒトｃＫＩＴ、および第１級アミンの少なくともｎ数に特異的に結合する抗体ま
たはその抗原結合性断片であり；ｎは１〜１０の整数である）
の抗体薬物コンジュゲート、またはその薬学的に許容される塩。

【0028】

前記抗体または抗原結合性断片が、ドメイン１〜３でヒトｃＫＩＴのエピトープ（配列
番号１５５）に特異的に結合する、抗体薬物コンジュゲート。

【0029】

前記抗体またはその抗原結合性断片が、配列番号１６１および配列番号１６２でヒトｃ
ＫＩＴに特異的に結合する、抗体薬物コンジュゲート。

【0030】

前記抗体またはその抗原結合性断片が、配列番号１６３および配列番号１６４でヒトｃ
ＫＩＴに特異的に結合する、抗体薬物コンジュゲート。

【0031】

前記Ａｂが、（ｉ）（ａ）配列番号７６のＨＣＤＲ１（ＣＤＲ−相補性決定領域）、（
ｂ）配列番号７７のＨＣＤＲ２、（ｃ）配列番号７８のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と
、（ｄ）配列番号８５のＬＣＤＲ１、（ｅ）配列番号８６のＬＣＤＲ２、および（ｆ）配
列番号８７のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；
（ｉｉ）（ａ）配列番号２２のＨＣＤＲ１、（ｂ）配列番号２３のＨＣＤＲ２、（ｃ）
配列番号２４のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、（ｄ）配列番号３１のＬＣＤＲ１、（
ｅ）配列番号３２のＬＣＤＲ２、および（ｆ）配列番号３３のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変
領域；
（ｉｉｉ）（ａ）配列番号１３０のＨＣＤＲ１、（ｂ）配列番号１３１のＨＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号１３２のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、（ｄ）配列番号１３９のＬＣ
ＤＲ１、（ｅ）配列番号１４０のＬＣＤＲ２、および（ｆ）配列番号１４１のＬＣＤＲ３
を含む軽鎖可変領域；
（ｉｖ）（ａ）配列番号５８のＨＣＤＲ１、（ｂ）配列番号５９のＨＣＤＲ２、（ｃ）
配列番号６０のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、（ｄ）配列番号６７のＬＣＤＲ１、（
ｅ）配列番号６８のＬＣＤＲ２、および（ｆ）配列番号６９のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変
領域；
（ｖ）（ａ）配列番号４０のＨＣＤＲ１、（ｂ）配列番号４１のＨＣＤＲ２、（ｃ）配
列番号４２のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、（ｄ）配列番号４９のＬＣＤＲ１、（ｅ
）配列番号５０のＬＣＤＲ２、および（ｆ）配列番号５１のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領
域；
（ｖｉ）（ａ）配列番号９４のＨＣＤＲ１、（ｂ）配列番号９５のＨＣＤＲ２、（ｃ）
配列番号９６のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、（ｄ）配列番号１０３のＬＣＤＲ１、
（ｄ）配列番号１０４のＬＣＤＲ２、および（ｆ）配列番号１０５のＬＣＤＲ３を含む軽
鎖可変領域；
（ｖｉｉ）（ａ）配列番号１１２のＨＣＤＲ１、（ｂ）配列番号１１３のＨＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号１１４のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、（ｄ）配列番号１２１のＬＣ
ＤＲ１、（ｅ）配列番号１２２のＬＣＤＲ２、および（ｆ）配列番号１２３のＬＣＤＲ３
を含む軽鎖可変領域；または
（ｖｉｉｉ）（ａ）配列番号３のＨＣＤＲ１、（ｂ）配列番号４のＨＣＤＲ２、（ｃ）
配列番号５のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、（ｄ）配列番号１２のＬＣＤＲ１、（ｅ
）配列番号１３のＬＣＤＲ２、および（ｆ）配列番号１４のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領
域
を含む抗体またはその抗原結合性断片である、抗体薬物コンジュゲート。

【0032】

ＣＤＲ内の少なくとも１つのアミノ酸が、表１の別の抗ｃＫＩＴ抗体の対応するＣＤＲ
の対応する残基により置換される、抗体薬物コンジュゲート。

【0033】

ＣＤＲ内の１または２つのアミノ酸が改変、欠失または置換されている、抗体薬物コン
ジュゲート。

【0034】

可変軽鎖または可変重鎖領域のいずれかにわたって少なくとも９０、９１、９２、９３
、９４、９５、９６、９７、９８または９９％の同一性を保持する、抗体薬物コンジュゲ
ート。

【0035】

抗体がモノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト操作抗体、ヒト抗体、一本
鎖抗体（ｓｃＦｖ）または抗体断片である、抗体薬物コンジュゲート。

【0036】

前記ｎが２〜８の整数である、抗体薬物コンジュゲート。

【0037】

前記ｎが３〜４の整数である、抗体薬物コンジュゲート。

【0038】

別の治療剤と組み合わせた、抗体薬物コンジュゲート。

【0039】

表１６に列挙される治療剤と組み合わせた、抗体薬物コンジュゲート。

【0040】

抗体薬物コンジュゲートと、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。

【0041】

前記組成物が凍結乾燥物として調製される、医薬組成物。

【0042】

前記凍結乾燥物が、抗体薬物コンジュゲート、コハク酸ナトリウム、およびポリソルベ
ート２０を含む、医薬組成物。

【0043】

抗体薬物コンジュゲート、または医薬組成物を、それを必要とする患者に投与すること
を含む、前記患者におけるｃＫＩＴ陽性がんを処置する方法。

【0044】

前記がんが消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）、急性骨髄性白血
病（ＡＭＬ）、メラノーマ、肥満細胞白血病（ＭＣＬ）、肥満細胞症、神経線維腫症、乳
がん、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）および膵臓がんからなる群から選択される、処置方
法。

【0045】

抗体薬物コンジュゲートまたは医薬組成物が、別の治療剤と組み合わせて投与される、
方法。

【0046】

抗体薬物コンジュゲートまたは医薬組成物が、表１６に列挙される治療剤と組み合わせ
て投与される、方法。

【0047】

医薬としての使用のための、抗体薬物コンジュゲート。

【0048】

ｃＫＩＴ陽性がんの処置における使用のための、抗体薬物コンジュゲート、または医薬
組成物。

【0049】

別の治療剤と組み合わせて投与される、抗体薬物コンジュゲート。

【0050】

表１６に列挙される治療剤と組み合わせて投与される、抗体薬物コンジュゲート。

【0051】

抗体または抗原結合性断片をコードする核酸。

【0052】

核酸を含むベクター。

【0053】

ベクターを含む宿主細胞。

【0054】

宿主細胞を培養し、培養物から抗体を回収することを含む、抗体または抗原結合性断片
を生成するための方法。

【0055】

（ａ）ＳＭＣＣを薬物部分ＤＭ−１に化学的に連結すること；（ｂ）前記リンカー−薬
物を、細胞培養物から回収された抗体にコンジュゲートすること；および（ｃ）抗体薬物
コンジュゲートを精製することを含む、抗ｃＫＩＴ抗体薬物コンジュゲートを生成するた
めの方法。

【0056】

ＵＶ分光光度計を使用して測定される、約３．５の平均メイタンシノイドと抗体との比
（ＭＡＲ）を有する、抗体薬物コンジュゲート。

【0057】

（ｉ）（ａ）配列番号７６のＨＣＤＲ１（ＣＤＲ−相補性決定領域）、（ｂ）配列番号
７７のＨＣＤＲ２、（ｃ）配列番号７８のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、（ｄ）配列
番号８５のＬＣＤＲ１、（ｅ）配列番号８６のＬＣＤＲ２、および（ｆ）配列番号８７の
ＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；
（ｉｉ）（ａ）配列番号２２のＨＣＤＲ１、（ｂ）配列番号２３のＨＣＤＲ２、（ｃ）
配列番号２４のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、（ｄ）配列番号３１のＬＣＤＲ１、（
ｅ）配列番号３２のＬＣＤＲ２、および（ｆ）配列番号３３のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変
領域；
（ｉｉｉ）（ａ）配列番号１３０のＨＣＤＲ１、（ｂ）配列番号１３１のＨＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号１３２のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、（ｄ）配列番号１３９のＬＣ
ＤＲ１、（ｅ）配列番号１４０のＬＣＤＲ２、および（ｆ）配列番号１４１のＬＣＤＲ３
を含む軽鎖可変領域；
（ｉｖ）（ａ）配列番号５８のＨＣＤＲ１、（ｂ）配列番号５９のＨＣＤＲ２、（ｃ）
配列番号６０のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、（ｄ）配列番号６７のＬＣＤＲ１、（
ｅ）配列番号６８のＬＣＤＲ２、および（ｆ）配列番号６９のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変
領域；
（ｖ）（ａ）配列番号４０のＨＣＤＲ１、（ｂ）配列番号４１のＨＣＤＲ２、（ｃ）配
列番号４２のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、（ｄ）配列番号４９のＬＣＤＲ１、（ｅ
）配列番号５０のＬＣＤＲ２、および（ｆ）配列番号５１のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領
域；
（ｖｉ）（ａ）配列番号９４のＨＣＤＲ１、（ｂ）配列番号９５のＨＣＤＲ２、（ｃ）
配列番号９６のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、（ｄ）配列番号１０３のＬＣＤＲ１、
（ｄ）配列番号１０４のＬＣＤＲ２、および（ｆ）配列番号１０５のＬＣＤＲ３を含む軽
鎖可変領域；
（ｖｉｉ）（ａ）配列番号１１２のＨＣＤＲ１、（ｂ）配列番号１１３のＨＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号１１４のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、（ｄ）配列番号１２１のＬＣ
ＤＲ１、（ｅ）配列番号１２２のＬＣＤＲ２、および（ｆ）配列番号１２３のＬＣＤＲ３
を含む軽鎖可変領域；または
（ｖｉｉｉ）（ａ）配列番号３のＨＣＤＲ１、（ｂ）配列番号４のＨＣＤＲ２、（ｃ）
配列番号５のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、（ｄ）配列番号１２のＬＣＤＲ１、（ｅ
）配列番号１３のＬＣＤＲ２、および（ｆ）配列番号１４のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領
域
を含む、抗体またはその抗原結合性断片。

【0058】

標識された抗体またはその抗原結合性断片を含む診断剤。

【0059】

標識が、放射性標識、フルオロフォア、発色団、画像化剤、および金属イオンからなる
群から選択される、診断剤。

【0060】

定義
別途記述しない限り、本明細書で使用される以下の用語および語句は、以下の意味を有
することが意図される。

【0061】

用語「アルキル」とは、特定数の炭素原子を有する一価飽和炭化水素鎖を指す。例えば
、Ｃ_１〜６アルキルとは、１〜６個の炭素原子を有するアルキル基を指す。アルキル基は
、直鎖状または分枝状であってもよい。代表的な分枝状アルキル基は、１、２、または３
個の分枝を有する。アルキル基の例としては、限定されるものではないが、メチル、エチ
ル、プロピル（ｎ−プロピルおよびイソプロピル）、ブチル（ｎ−ブチル、イソブチル、
ｓｅｃ−ブチル、およびｔ−ブチル）、ペンチル（ｎ−ペンチル、イソペンチル、および
ネオペンチル）、ならびにヘキシルが挙げられる。

【0062】

本明細書で使用される用語「抗体」とは、非共有的に、可逆的に、および特異的様式で
対応する抗原に結合することができる免疫グロブリンファミリーのポリペプチドを指す。
例えば、天然のＩｇＧ抗体は、ジスルフィド結合により相互接続された少なくとも２つの
重鎖（Ｈ）と２つの軽鎖（Ｌ）とを含む四量体である。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細
書でＶＨと省略される）と、重鎖定常領域とから構成される。重鎖定常領域は、３つのド
メイン、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３から構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細
書でＶＬと省略される）と、軽鎖定常領域とから構成される。軽鎖定常領域は、１つのド
メイン、ＣＬから構成される。ＶＨおよびＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼
ばれる、より保存された領域が散在する、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変領
域にさらに細分することができる。各ＶＨおよびＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端
に向かって、以下の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、お
よびＦＲ４に配置される３つのＣＤＲと、４つのＦＲから構成される。重鎖および軽鎖の
可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含有する。抗体の定常領域は、免疫系の
様々な細胞（例えば、エフェクター細胞）および古典的補体系の第１成分（Ｃ１ｑ）など
の、宿主組織または因子への免疫グロブリンの結合を媒介することができる。

【0063】

用語「抗体」は、限定されるものではないが、モノクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化
抗体、ラクダ科抗体、キメラ抗体、および抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体（例えば、本
開示の抗体に対する抗Ｉｄ抗体など）を含む。抗体は、任意のアイソタイプ／クラス（例
えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＹ）、またはサブクラス（例
えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）のものであ
ってもよい。

【0064】

「相補性決定ドメイン」または「相補性決定領域（「ＣＤＲ」）」は、ＶＬおよびＶＨ
の超可変領域を互換的に指す。ＣＤＲは、そのような標的タンパク質に対する特異性を担
持する抗体鎖の標的タンパク質結合部位である。各ヒトＶＬまたはＶＨ中には３つのＣＤ
Ｒ（ＣＤＲ１〜３、Ｎ末端から連続的に番号付けられる）が存在し、可変ドメインの約１
５〜２０％を占める。ＣＤＲを、その領域および順序により記載することができる。例え
ば、「ＶＨＣＤＲ１」または「ＨＣＤＲ１」は両方とも、重鎖可変領域の第１のＣＤＲを
指す。ＣＤＲは標的タンパク質のエピトープと構造的に相補的であり、かくして、結合特
異性を直接担う。ＶＬまたはＶＨの残りのストレッチ、いわゆるフレームワーク領域は、
アミノ酸配列の変化をあまり示さない（Kuby, Immunology, 4th ed., Chapter 4. W.H. F
reeman & Co., New York, 2000）。

【0065】

ＣＤＲとフレームワーク領域の位置を、当業界における様々な周知の定義、例えば、Ｋ
ａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、およびＡｂＭ（例えば、Johnson et al., Nucleic Acids Re
s., 29:205-206 (2001); Chothia and Lesk, J. Mol. Biol., 196:901-917 (1987); Chot
hia et al., Nature, 342:877-883 (1989); Chothia et al., J. Mol. Biol., 227:799-8
17 (1992); Al-Lazikani et al., J.Mol.Biol., 273:927-748 (1997)を参照されたい）を
使用して決定することができる。抗原結合部位の定義は、以下にも記載されている：Ruiz
et al., Nucleic Acids Res., 28:219-221 (2000); およびLefranc, M.P., Nucleic Aci
ds Res., 29:207-209 (2001); MacCallum et al., J. Mol. Biol., 262:732-745 (1996);
およびMartin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:9268-9272 (1989); Martin et
al., Methods Enzymol., 203:121-153 (1991); およびRees et al., In Sternberg M.J.
E. (ed.), Protein Structure Prediction, Oxford University Press, Oxford, 141-172
(1996)。

【0066】

軽鎖と重鎖は両方とも、構造的および機能的相同性の領域に分割される。用語「定常」
および「可変」は機能的に使用される。これに関して、軽鎖（ＶＬ）と重鎖（ＶＨ）部分
の両方の可変ドメインポーションが抗原認識および特異性を決定付けることが理解される
。逆に、軽鎖（ＣＬ）および重鎖（ＣＨ１、ＣＨ２またはＣＨ３）の定常ドメインは、分
泌、経胎盤移動、Ｆｃ受容体結合、補体結合などの重要な生物学的特性を付与する。慣例
により、定常領域ドメインの番号付けは、それらが抗体の抗原結合部位またはアミノ末端
からより遠くなるにつれて増大する。Ｎ末端は可変領域であり、Ｃ末端は定常領域である
；ＣＨ３およびＣＬドメインは、それぞれ、重鎖および軽鎖のカルボキシ末端ドメインを
実際に含む。

【0067】

本明細書で使用される用語「抗原結合性断片」とは、抗原のエピトープと特異的に相互
作用する（例えば、結合、立体障害、安定化／脱安定化、空間分布により）能力を保持す
る抗体の１または複数のポーションを指す。結合断片の例としては、限定されるものでは
ないが、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、Ｆａｂ断片、Ｆ
（ａｂ’）断片、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価断片；Ｆ（ａｂ）
２断片、ヒンジ領域でジスルフィド架橋により連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断
片；ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨド
メインからなるＦｖ断片；ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片（Ward et al., Nature 341:
544-546, 1989）；ならびに単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）、または抗体の他のエ
ピトープ結合断片が挙げられる。

【0068】

さらに、Ｆｖ断片の２つのドメイン、ＶＬおよびＶＨは別々の遺伝子によりコードされ
るが、それらを、組換え方法を使用して、ＶＬおよびＶＨ領域が対形成して一価分子（一
本鎖Ｆｖ（「ｓｃＦｖ」）を形成する単一タンパク質鎖として作製することができる合成
リンカーにより連結することができる；例えば、Bird et al., Science 242:423-426, 19
88;およびHuston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 85:5879-5883, 1988を参照されたい
。そのような一本鎖抗体も、用語「抗原結合性断片」内に包含されることが意図される。
これらの抗原結合性断片は、当業者には公知の従来の技術を使用して得られ、その断片は
無傷抗体と同じ様式で有用性についてスクリーニングされる。

【0069】

抗原結合性断片を、単一ドメイン抗体、マキシボディ、ミニボディ、ナノボディ、イン
トラボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ｖ−ＮＡＲおよびビス−ｓｃ
Ｆｖ（例えば、Hollinger and Hudson, Nature Biotechnology 23:1126-1136, 2005を参
照されたい）中に組込むこともできる。抗原結合性断片を、ＩＩＩ型フィブロネクチン（
Ｆｎ３）などのポリペプチドに基づく足場中に移植することができる（フィブロネクチン
ポリペプチドモノボディを記載する米国特許第６，７０３，１９９号を参照されたい）。

【0070】

抗原結合性断片を、相補的軽鎖ポリペプチドと一緒に、抗原結合領域の対を形成する並
列Ｆｖセグメント対（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１）を含む一本鎖分子に組込むことがで
きる（Zapata et al., Protein Eng. 8:1057-1062, 1995; および米国特許第５，６４１
，８７０号）。

【0071】

本明細書で使用される用語「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物
」は、実質的に同一のアミノ酸配列を有するか、または同じ遺伝的起源から誘導される抗
体および抗原結合性断片などのポリペプチドを指す。この用語はまた、単一分子組成の抗
体分子の調製物も含む。モノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープに対する単一の
結合特異性および親和性を示す。

【0072】

本明細書で使用される用語「ヒト抗体」は、フレームワーク領域とＣＤＲ領域の両方が
ヒト起源の配列から誘導される可変領域を有する抗体を含む。さらに、抗体が定常領域を
含有する場合、定常領域はまた、そのようなヒト配列、例えば、ヒト生殖系列配列、また
はヒト生殖系列配列の変異型または例えば、Knappik et al., J. Mol. Biol. 296:57-86,
2000に記載のような、ヒトフレームワーク配列分析から誘導されるコンセンサスフレー
ムワーク配列を含有する抗体から誘導される。

【0073】

本開示のヒト抗体は、ヒト配列によりコードされないアミノ酸残基を含んでもよい（例
えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの無作為もしくは部位特異的突然変異誘発により、またはｉｎ
ｖｉｖｏでの体細胞変異により、または安定性もしくは製造を促進するための保存的置
換により導入される突然変異）。

【0074】

本明細書で使用される用語「認識する」とは、エピトープが線状または立体状であって
も、そのエピトープを発見し、それと相互作用する（例えば、結合する）抗体またはその
抗原結合性断片を指す。用語「エピトープ」とは、本開示の抗体または抗原結合性断片が
特異的に結合する抗原上の部位を指す。エピトープは、タンパク質の三次元折畳みにより
並置される連続的アミノ酸または非連続的アミノ酸の両方から形成させることができる。
連続的アミノ酸から形成されるエピトープは、典型的には、変性溶媒への曝露の際に保持
されるが、三次元折畳みにより形成されるエピトープは典型的には、変性溶媒による処理
の際に失われる。エピトープは、典型的には、ユニークな空間的コンフォメーション中に
少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５個の
アミノ酸を含む。エピトープの空間的コンフォメーションを決定する方法は、当業界にお
ける技術、例えば、ｘ線結晶学および２次元核磁気共鳴を含む（例えば、Epitope Mappin
g Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, G. E. Morris, Ed. (1996)を
参照されたい）。「パラトープ」は、抗原のエピトープを認識する抗体の部分である。

【0075】

抗原（例えば、タンパク質）と抗体、抗体断片、または抗体由来結合剤との間の相互作
用を記述する文脈で使用される場合の語句「特異的に結合する」または「選択的に結合す
る」は、タンパク質および他の生物製剤の異種集団中の、例えば、生物試料、例えば、血
液、血清、血漿または組織試料中の、抗原の存在を決定する結合反応を指す。かくして、
ある特定の指定されたイムノアッセイ条件下では、特定の結合特異性を有する抗体または
結合剤は、バックグラウンドの少なくとも２倍、特定の抗原に結合し、試料中に存在する
他の抗原に有意な量で実質的に結合しない。一態様では、指定のイムノアッセイ条件下で
、特定の結合特異性を有する抗体または結合剤は、バックグラウンドの少なくとも１０倍
、特定の抗原に結合し、試料中に存在する他の抗原に有意な量で実質的に結合しない。そ
のような条件下での抗体または結合剤への特異的結合は、特定のタンパク質に対するその
特異性について抗体または薬剤を選択する必要があってもよい。望ましい場合または適切
な場合、この選択を、他の種（例えば、マウスもしくはラット）または他のサブタイプに
由来する分子と交差反応する抗体を除去することにより達成することができる。あるいは
、いくつかの態様では、ある特定の所望の分子と交差反応する抗体または抗体断片を選択
する。

【0076】

本明細書で使用される用語「親和性」とは、単一の抗原部位での抗体と抗原との相互作
用の強度を指す。それぞれの抗原部位内で、抗体「アーム」の可変領域は、弱い非共有力
を介して、いくつかの部位で抗原と相互作用する；相互作用が大きくなるほど、親和性が
強くなる。

【0077】

用語「単離された抗体」とは、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない
抗体を指す。しかしながら、１つの抗原に特異的に結合する単離された抗体は、他の抗原
との交差反応性を有してもよい。さらに、単離された抗体は、他の細胞材料および／また
は化学物質を実質的に含まなくてもよい。

【0078】

用語「対応するヒト生殖系列配列」とは、ヒト生殖系列免疫グロブリン可変領域配列に
よりコードされる他の全ての既知の可変領域アミノ酸配列と比較して、参照可変領域アミ
ノ酸配列またはサブ配列と最も高い決定されたアミノ酸配列同一性を有するヒト可変領域
アミノ酸配列またはサブ配列をコードする核酸配列を指す。対応するヒト生殖系列配列は
また、他の全ての評価された可変領域アミノ酸配列と比較して、参照可変領域アミノ酸配
列またはサブ配列と最も高いアミノ酸配列同一性を有するヒト可変領域アミノ酸配列また
はサブ配列を指してもよい。対応するヒト生殖系列配列は、フレームワーク領域のみ、相
補性決定領域のみ、フレームワーク領域と相補性決定領域、可変セグメント（上記で定義
されたもの）、または可変領域を含む配列もしくはサブ配列の他の組合せであってもよい
。例えば、ＢＬＡＳＴ、ＡＬＩＧＮ、または当業界で公知の別のアラインメントアルゴリ
ズムを使用して２つの配列を整列させる、本明細書に記載の方法を使用して、配列同一性
を決定することができる。対応するヒト生殖系列核酸またはアミノ酸配列は、参照可変領
域核酸またはアミノ酸配列との少なくとも約９０％、９２％、９３％、９４％、９５％、
９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有してもよい。

【0079】

様々なイムノアッセイ形式を使用して、特定のタンパク質と特異的に免疫反応する抗体
を選択することができる。例えば、タンパク質と特異的に免疫反応する抗体を選択するた
めには、固相ＥＬＩＳＡイムノアッセイが日常的に使用される（例えば、特異的免疫反応
性を決定するのに使用することができるイムノアッセイ形式および条件の説明については
、Harlow & Lane, Using Antibodies, A Laboratory Manual (1998)を参照されたい）。
典型的には、特異的または選択的結合反応は、バックグラウンドシグナルの少なくとも２
倍、より典型的には、バックグラウンドの少なくとも１０〜１００倍のシグナルをもたら
す。

【0080】

用語「平衡解離定数（ＫＤ、Ｍ）」とは、解離速度定数（ｋｄ、時間−１）を結合速度
定数（ｋａ、時間−１、Ｍ−１）で除算したものを指す。当業界における任意の公知の方
法を使用して、平衡解離定数を測定することができる。本開示の抗体は一般に、約１０^−
７または１０^−８Ｍ未満、例えば、約１０^−９Ｍまたは１０^−１０Ｍ未満、いくつかの態
様では、約１０^−１１Ｍ、１０^−１２Ｍまたは１０^−１３Ｍ未満の平衡解離定数を有する
。

【0081】

用語「バイオアベイラビリティ」とは、患者に投与される所与の量の薬物の全身利用能
（すなわち、血液／血漿レベル）を指す。バイオアベイラビリティは、投与される剤形か
ら全身循環に達する薬物の時間（速度）と総量（程度）の両方の尺度を示す絶対項である
。

【0082】

本明細書で使用される語句「から本質的になる」とは、方法または組成物中に含まれる
活性薬剤の属または種、ならびに方法または組成物の意図される目的にとって不活性な任
意の賦形剤を指す。いくつかの態様では、語句「から本質的になる」は、本開示の抗体薬
物コンジュゲート以外の１または複数のさらなる活性剤の含有を明確に排除する。いくつ
かの態様では、語句「から本質的になる」は、本開示の抗体薬物コンジュゲート以外の１
または複数のさらなる活性剤と、第２の同時投与される薬剤との含有を明確に排除する。

【0083】

用語「アミノ酸」とは、天然の、合成の、および非天然のアミノ酸、ならびに天然のア
ミノ酸と類似する様式で機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模倣体を指す。天然アミ
ノ酸は、遺伝子コードによりコードされるもの、ならびに後に改変されるアミノ酸、例え
ば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸、およびＯ−ホスホセリンである
。アミノ酸類似体とは、天然アミノ酸と同じ基本化学構造を有する化合物、すなわち、水
素、カルボキシル基、アミノ基、およびＲ基、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチ
オニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムに結合したα−炭素を指す。そのよ
うな類似体は改変されたＲ基（例えば、ノルロイシン）または改変ペプチド骨格を有する
が、天然アミノ酸と同じ基本化学構造を保持する。アミノ酸模倣体とは、アミノ酸の一般
的化学構造とは異なる構造を有するが、天然アミノ酸と類似する様式で機能する化合物を
指す。

【0084】

用語「保存的に改変されたバリアント」は、アミノ酸配列と核酸配列の両方に適用され
る。特定の核酸配列に関して、保存的に改変されたバリアントとは、同一の、もしくは本
質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸、または核酸がアミノ酸配列をコードしない
場合、本質的に同一の配列を指す。遺伝子コードの縮重性のため、多数の機能的に同一の
核酸が、任意の所与のタンパク質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ
およびＧＣＵは全て、アミノ酸アラニンをコードする。かくして、アラニンがあるコドン
によって特定される全ての位置で、そのコドンを、コードされるポリペプチドを変化させ
ることなく記載される対応するコドンのいずれかに変化させてもよい。そのような核酸変
化は「サイレント変異」であり、保存的に改変されたバリアントの１種である。ポリペプ
チドをコードする全ての核酸配列はまた、核酸の全ての可能なサイレント変異を記述する
。当業者であれば、核酸中のそれぞれのコドン（通常はメチオニンのための唯一のコドン
であるＡＵＧと、通常はトリプトファンのための唯一のコドンであるＴＧＧを除く）を改
変して、機能的に同一の分子を得ることができることを認識できる。従って、ポリペプチ
ドをコードする核酸のそれぞれのサイレント変異は、それぞれ記載される配列中で暗黙的
である。

【0085】

ポリペプチド配列について、「保存的に改変されたバリアント」は、あるアミノ酸の、
化学的に類似するアミノ酸との置換をもたらすポリペプチド配列に対する個々の置換、欠
失または付加を含む。機能的に類似するアミノ酸を提供する保存的置換表は、当業界で周
知である。そのような保存的に改変されたバリアントは、多型バリアント、種間相同体、
および対立遺伝子だけでなく、それを排除しない。以下の８群は、互いに保存的置換であ
るアミノ酸を含有する：１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；２）アスパラギン酸（Ｄ
）、グルタミン酸（Ｅ）；３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；４）アルギニン
（Ｒ）、リシン（Ｋ）；５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、
バリン（Ｖ）；６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；
７）セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）；および８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）
（例えば、Creighton, Proteins (1984)を参照されたい）。いくつかの態様では、用語「
保存的配列改変」は、アミノ酸配列を含有する抗体の結合特性に有意に影響しないか、ま
たはそれを変化させないアミノ酸改変を指すように使用される。

【0086】

本明細書で使用される用語「最適化された」とは、生成細胞または生物、一般には、真
核細胞、例えば、酵母細胞、ピチア（Pichia）細胞、真菌細胞、トリコデルマ（Trichode
rma）細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）またはヒト細胞において好まし
いコドンを使用してアミノ酸配列をコードするように変化させたヌクレオチド配列を指す
。最適化されたヌクレオチド配列は、「親」配列としても知られる、出発ヌクレオチド配
列により元々コードされるアミノ酸配列を完全に、またはできるだけ多く保持するように
操作される。

【0087】

２つ以上の核酸またはポリペプチド配列の文脈における用語「同一であるパーセント」
または「同一性パーセント」とは、２つ以上の配列またはサブ配列が同じである程度を指
す。２つの配列は、それらが比較される領域にわたってアミノ酸またはヌクレオチドの同
じ配列を有する場合、「同一」である。２つの配列が、以下の配列比較アルゴリズムの１
つを使用して、もしくは手動によるアラインメントおよび視覚的検査により測定される比
較ウィンドウ、または指定の領域にわたって最大の一致のために比較および整列された場
合、同じであるアミノ酸残基またはヌクレオチドの特定のパーセンテージ（すなわち、特
定の領域にわたって、または特定されない場合、配列全体にわたって６０％の同一性、任
意選択で、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％の
同一性）を有する場合、２つの配列は「実質的に同一」である。任意選択で、同一性は、
長さ少なくとも約３０ヌクレオチド（または１０アミノ酸）である領域にわたって、また
はより好ましくは、長さ１００〜５００もしくは１０００以上のヌクレオチド（または２
０、５０、２００以上のアミノ酸）である領域にわたって存在する。

【0088】

配列比較のために、典型的には、１つの配列は、試験配列が比較される参照配列として
作用する。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列と参照配列とをコンピュータ
に入力し、サブ配列座標を指定し、必要に応じて、配列アルゴリズムプログラムパラメー
タを指定する。デフォルトプログラムパラメータを使用するか、または代替パラメータを
指定することができる。次いで、配列比較アルゴリズムは、プログラムパラメータに基づ
いて、参照配列と比較した試験配列に関する配列同一性パーセントを算出する。

【0089】

本明細書で使用される場合、「比較ウィンドウ」は、２つの配列を最適に整列させた後
に、配列を同じ数の連続する位置の参照配列と比較することができる、２０〜６００、通
常は約５０〜約２００、より通常は約１００〜約１５０からなる群から選択される連続す
る位置数の任意の１つのセグメントに対する参照を含む。比較のための配列のアラインメ
ントの方法は、当業界で周知である。比較のための配列の最適なアラインメントを、例え
ば、Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482c (1970)の部分相同性アルゴリズムに
より、Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970)の相同性アラインメントア
ルゴリズムにより、Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988)
の類似性検索法により、これらのアルゴリズムのコンピュータ化された実装（Ｗｉｓｃｏ
ｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ
Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗ
ＩにおけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）により、または
手動によるアラインメントおよび視覚的検査（例えば、Brent et al., Current Protocol
s in Molecular Biology, 2003を参照されたい）により行うことができる。

【0090】

配列同一性および配列類似性のパーセントを決定するのに好適であるアルゴリズムの２
つの例は、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムであり、これらは、それぞれ
、Altschul et al., Nuc. Acids Res. 25:3389-3402, 1977；およびAltschul et al., J.
Mol. Biol. 215:403-410, 1990に記載されている。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソ
フトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎにより公共的に利用可能である。このアルゴリズムは、データ
ベース配列中の同じ長さのワードと整列させた場合に、いくつかの正の値の閾値スコアＴ
と一致するか、またはそれを満足する、クエリー配列中の短いワード長Ｗを同定すること
により高スコアリング配列対（ＨＳＰ）を最初に同定することを含む。Ｔは、近隣ワード
スコア閾値と呼ばれる（Altschul et al.、supra）。これらの初期近隣ワードヒットは、
それらを含有するより長いＨＳＰを発見するための検索を開始するための種子として作用
する。ワードヒットは、累積アラインメントスコアを増大させることができる限りそれぞ
れの配列に沿った両方の方向に伸長される。累積スコアを、ヌクレオチド配列については
、パラメータＭ（一致する残基の対に関するリワードスコア；常に＞０）およびＮ（不一
致の残基のためのペナルティスコア；常に＜０）を使用して算出する。アミノ酸配列につ
いては、スコアリングマトリックスを使用して、累積スコアを算出する。それぞれの方向
におけるワードヒットの伸長は、累積アラインメントスコアがその最大達成値から量Ｘ減
少する場合、停止される；１または複数の負のスコアの残基アラインメントの累積のため
、累積スコアはゼロ以下になる；またはいずれかの配列の末端に到達する。ＢＬＡＳＴア
ルゴリズムパラメータＷ、Ｔ、およびＸは、アラインメントの感度および速度を決定する
。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列に関する）は、デフォルトとして、１１の
ワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４および両方の鎖の比較を使用す
る。アミノ酸配列については、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとして、３のワー
ド長、および１０の期待値（Ｅ）、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（
Henikoff and Henikoff, (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915を参照されたい
）、５０のアラインメント（Ｂ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両方
の鎖の比較を使用する。

【0091】

ＢＬＡＳＴアルゴリズムはまた、２つの配列間の類似性の統計分析を実施する（例えば
、Karlin and Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787, 1993を参照された
い）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより提供される類似性の１つの尺度は、２つのヌクレオ
チドまたはアミノ酸配列間の一致が偶然生じる確率の指示を提供する、最小合計確率（Ｐ
（Ｎ））である。例えば、試験核酸と参照核酸との比較における最小合計確率が約０．２
未満、より好ましくは、約０．０１未満、および最も好ましくは、約０．００１未満であ
る場合、核酸は参照配列と類似すると考えられる。

【0092】

２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントを、ＰＡＭ１２０ウェイト残テーブル（weig
ht residue table）、１２のギャップ長ペナルティおよび４のギャップペナルティを使用
して、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれたE. Meyers and W. Mil
ler, Comput. Appl. Biosci. 4:11-17, 1988のアルゴリズムを使用して決定することもで
きる。さらに、２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントを、Ｂｌｏｓｓｏｍ ６２マト
リックスまたはＰＡＭ２５０マトリックス、ならびに１６、１４、１２、１０、８、６、
または４のギャップ重量および１、２、３、４、５または６の長さ重量を使用して、ＧＣ
Ｇソフトウェアパッケージ中のＧＡＰプログラム（ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍで利用可能）
に組み込まれたNeedleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48:444-453, 1970のアルゴリズム
を使用して決定することができる。

【0093】

上記の配列同一性のパーセンテージ以外に、２つの核酸配列またはポリペプチドが実質
的に同一であることの別の指示は、以下に記載のように、第１の核酸によりコードされる
ポリペプチドが、第２の核酸によりコードされるポリペプチドに対して生じた抗体と免疫
学的に交差反応することである。かくして、例えば、２つのペプチドが保存的置換によっ
てのみ異なる場合、ポリペプチドは典型的には第２のポリペプチドと実質的に同一である
。２つの核酸配列が実質的に同一であることの別の指示は、以下に記載のように、２つの
分子またはその相補体が、ストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズすることで
ある。２つの核酸配列が実質的に同一であることのさらに別の指示は、同じプライマーを
使用してその配列を増幅することができることである。

【0094】

用語「核酸」は、本明細書では、用語「ポリヌクレオチド」と互換的に使用され、一本
鎖または二本鎖形態のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドおよびそのポリ
マーを指す。この用語は、合成である、天然である、および非天然である、参照核酸と類
似する結合特性を有する、ならびに参照ヌクレオチドと類似する様式で代謝される、公知
のヌクレオチド類似体または改変された骨格残基もしくは結合を含有する核酸を包含する
。そのような類似体の例としては、限定されるものではないが、ホスホロチオエート（ph
osphorothioate）、ホスホルアミデート（phosphoroamidate）、メチルホスホン酸、キラ
ル−メチルホスホン酸、２−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ペプチド核酸（ＰＮＡ）が挙
げられる。

【0095】

別途指摘しない限り、特定の核酸配列は、保存的に改変されたそのバリアント（例えば
、縮重コドン置換）および相補配列、ならびに明示的に示される配列も暗示的に包含する
。特に、以下に詳述されるように、１または複数の選択された（または全ての）コドンの
第３の位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換された配列を作成する
ことにより、縮重コドン置換を達成することができる（Batzer et al., (1991) Nucleic
Acid Res. 19:5081; Ohtsuka et al., (1985) J. Biol. Chem. 260:2605-2608; およびRo
ssolini et al., (1994) Mol. Cell. Probes 8:91-98）。

【0096】

核酸の文脈における用語「作動可能に連結された」とは、２つ以上のポリヌクレオチド
（例えば、ＤＮＡ）セグメント間の機能的関係を指す。典型的には、それは、転写される
配列に対する転写調節配列の機能的関係を指す。例えば、プロモーターまたはエンハンサ
ー配列が適切な宿主細胞または他の発現系においてコード配列の転写を刺激またはモジュ
レートする場合、それはコード配列に作動可能に連結されている。一般に、転写される配
列に作動可能に連結されたプロモーター転写調節配列は、転写される配列に対して物理的
に連続している、すなわち、それらはｃｉｓ作用性である。しかしながら、エンハンサー
などのいくつかの転写調節配列は、それらが転写を増強するコード配列に対して物理的に
連続しているか、またはそれに近接して位置する必要はない。

【0097】

用語「ポリペプチド」と「タンパク質」とは、アミノ酸残基のポリマーを指すように本
明細書では互換的に使用される。この用語は、１または複数のアミノ酸残基が対応する天
然アミノ酸の人工化学模倣体であるアミノ酸ポリマー、ならびに天然アミノ酸ポリマーお
よび非天然アミノ酸ポリマーに適用される。別途指摘しない限り、特定のポリペプチド配
列は、保存的に改変されたそのバリアントも暗示的に包含する。

【0098】

本明細書で使用される用語「イムノコンジュゲート」または「抗体薬物コンジュゲート
」は、抗体またはその抗原結合性断片と、化学療法剤、毒素、免疫治療剤、画像化プロー
ブなどの別の薬剤との連結を指す。連結は、共有結合、または静電力などを介する非共有
相互作用であってもよい。当業界で公知の様々なリンカーを使用して、イムノコンジュゲ
ートを形成させることができる。さらに、イムノコンジュゲートを、イムノコンジュゲー
トをコードするポリヌクレオチドから発現させることができる融合タンパク質の形態で提
供することができる。本明細書で使用される場合、「融合タンパク質」とは、別々のタン
パク質（ペプチドおよびポリペプチドを含む）を元々コードしていた２つ以上の遺伝子ま
たは遺伝子断片の連結により作出されるタンパク質を指す。融合遺伝子の翻訳は、元のタ
ンパク質の各々から誘導される機能特性を有する単一のタンパク質をもたらす。

【0099】

用語「対象」は、ヒトおよび非ヒト動物を含む。非ヒト動物は、全ての脊椎動物、例え
ば、哺乳動物および非哺乳動物、例えば、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ニワトリ
、両生類、および爬虫類を含む。注記しない限り、用語「患者」または「対象」は、互換
的に本明細書に使用される。

【0100】

本明細書で使用される用語「毒素」、「細胞毒素」または「細胞毒性剤」は、細胞の成
長および増殖にとって有害であり、細胞または悪性腫瘍を減少させる、阻害する、または
破壊するように作用することができる任意の薬剤を指す。

【0101】

本明細書で使用される用語「抗がん剤」とは、限定されるものではないが、細胞毒性剤
、化学療法剤、放射線療法および放射線療法剤、標的化抗がん剤、ならびに免疫治療剤な
どの、がんなどの細胞増殖障害を処置するために使用することができる任意の薬剤を指す
。

【0102】

本明細書で使用される用語「薬物部分」または「ペイロード」とは、抗体または抗原結
合性断片にコンジュゲートされ、任意の治療剤または診断剤、例えば、抗がん剤、抗炎症
剤、抗感染剤（例えば、抗真菌剤、抗細菌剤、抗寄生虫剤、抗ウイルス剤）、または麻酔
剤を含んでもよい化学部分を指す。特定の態様では、薬物部分は、Ｖ−ＡＴＰａｓｅ阻害
剤、ＨＳＰ９０阻害剤、ＩＡＰ阻害剤、ｍＴｏｒ阻害剤、微小管安定化剤、微小管脱安定
化剤、オーリスタチン、ドラスタチン、メイタンシノイド、ＭｅｔＡＰ（メチオニンアミ
ノペプチダーゼ）、タンパク質ＣＲＭ１の核輸送の阻害剤、ＤＰＰＩＶ阻害剤、ミトコン
ドリアにおけるホスホリル転移反応の阻害剤、タンパク質合成阻害剤、キナーゼ阻害剤、
ＣＤＫ２阻害剤、ＣＤＫ９阻害剤、プロテアソーム阻害剤、キネシン阻害剤、ＨＤＡＣ阻
害剤、ＤＮＡ損傷剤、ＤＮＡアルキル化剤、ＤＮＡ挿入剤、ＤＮＡ副溝結合剤およびＤＨ
ＦＲ阻害剤から選択される。これらの各々を、抗体と適合するリンカーに結合させるため
の方法および本開示の方法は、当業界で公知である。例えば、Singh et al., (2009) The
rapeutic Antibodies: Methods and Protocols, vol. 525, 445-457を参照されたい。さ
らに、ペイロードは、生物物理学的プローブ、フルオロフォア、スピン標識、赤外線プロ
ーブ、親和性プローブ、キレート剤、分光プローブ、放射性プローブ、脂質分子、ポリエ
チレングリコール、ポリマー、スピン標識、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、ペプチド、表
面、抗体、抗体断片、ナノ粒子、量子ドット、リポソーム、ＰＬＧＡ粒子、サッカリドま
たはポリサッカリドであってもよい。

【0103】

用語「メイタンシノイド薬物部分」は、メイタンシノイド化合物の構造を有する抗体薬
物コンジュゲートの下部構造を意味する。メイタンシノイドは、東アフリカの低木メイテ
ナス・セラタ（Maytenus serrata）から初めて単離された（米国特許第３，８９６，１１
１号）。その後、ある特定の微生物も、メイタンシノールおよびＣ−３メイタンシノール
エステルなどのメイタンシノイドを生成することが発見された（米国特許第４，１５１，
０４２号）。合成メイタンシノールおよびメイタンシノール類似体が報告されている。米
国特許第４，１３７，２３０号；第４，２４８，８７０号；第４，２５６，７４６号；第
４，２６０，６０８号；第４，２６５，８１４号；第４，２９４，７５７号；第４，３０
７，０１６号；第４，３０８，２６８号；第４，３０８，２６９号；第４，３０９，４２
８号；第４，３１３，９４６号；第４，３１５，９２９号；第４，３１７，８２１号；第
４，３２２，３４８号；第４，３３１，５９８号；第４，３６１，６５０号；第４，３６
４，８６６号；第４，４２４，２１９号；第４，４５０，２５４号；第４，３６２，６６
３号；および第４，３７１，５３３号、ならびにKawai et al (1984) Chem. Pharm. Bull
. 3441-3451（それぞれ参照により明示的に組み込まれる）を参照されたい。コンジュゲ
ーションにとって有用なメイタンシノイドの特定例としては、ＤＭ１、ＤＭ３およびＤＭ
４が挙げられる。

【0104】

「腫瘍」とは、悪性であっても、または良性であっても、新生物性細胞成長および増殖
、ならびに全ての前がん性およびがん性細胞および組織を指す。

【0105】

用語「抗腫瘍活性」は、腫瘍細胞の増殖、生存能力、または転移活性の速度の低下を意
味する。抗腫瘍活性を示す可能な手段は、腫瘍細胞の成長速度の定価、腫瘍サイズの静止
状態または腫瘍サイズの減少を示すことである。そのような活性を、限定されるものでは
ないが、異種移植片モデル、同種移植モデル、ＭＭＴＶモデル、および抗腫瘍活性を調査
するための当業界で公知の他のモデルなどのｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏ腫瘍
モデルにおいて受け入れられるものを使用して評価することができる。

【0106】

用語「悪性腫瘍」とは、非良性腫瘍またはがんを指す。本明細書で使用される用語「が
ん」は、脱調節された、または制御されない細胞成長を特徴とする悪性腫瘍を含む。例示
的ながんとしては、がん腫、肉腫、白血病、およびリンパ腫が挙げられる。

【0107】

用語「がん」は、原発性悪性腫瘍（例えば、細胞が元の腫瘍部位以外の対象の身体部位
に移動していないもの）および二次悪性腫瘍（例えば、元の腫瘍部位とは異なる第２の部
位への腫瘍細胞の移動である転移から生じるもの）を含む。

【0108】

用語「ｃＫＩＴ」とは、受容体チロシンキナーゼＩＩＩファミリーのメンバーであるチ
ロシンキナーゼ受容体を指す。ｃＫＩＴの核酸およびアミノ酸配列は公知であり、Ｇｅｎ
Ｂａｎｋアクセッション番号Ｘ０６１８２．１、ＥＵ８２６５９４．１、ＧＵ９８３６７
１．１、ＨＭ０１５５２５．１、ＨＭ０１５５２６．１、ＡＫ３０４０３１．１およびＢ
Ｃ０７１５９３．１で公開されている。また、ヒトｃＫＩＴ ｃＤＮＡ配列については配
列番号１を、ヒトｃＫＩＴタンパク質配列については配列番号２も参照されたい。構造的
には、ｃＫＩＴ受容体はＩ型膜貫通タンパク質であり、シグナルペプチド、細胞外ドメイ
ン中の５Ｉｇ様Ｃ２ドメインを含有し、その細胞内ドメイン中にタンパク質キナーゼドメ
インを有し、その完全長にわたって、配列番号２のアミノ酸配列との少なくとも約９０％
、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または
１００％の配列同一性を有する。構造的には、ｃＫＩＴ核酸配列は、その完全長にわたっ
て、配列番号１の核酸配列との少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、
９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する。

【0109】

用語「ｃＫＩＴ発現がん」または「ｃＫＩＴ陽性がん」とは、がん細胞の表面上にｃＫ
ＩＴおよび／または変異形態のｃＫＩＴを発現するがんを指す。

【0110】

本明細書で使用される場合、任意の疾患または障害の用語「処置する」、「処置するこ
と」または「処置」とは、一態様では、疾患または障害を改善すること（すなわち、疾患
または少なくとも１つのその臨床症状の発生を減速させるか、または停止させるか、また
は軽減すること）を指す。別の態様では、「処置する」、「処置すること」または「処置
」とは、患者によって認識できないものを含む少なくとも１つの物理的パラメータを軽減
または改善することを指す。さらに別の態様では、「処置する」、「処置すること」また
は「処置」とは、疾患または障害を、物理的に（例えば、認識できる症状の安定化）、生
理的に（例えば、物理的パラメータの安定化）、またはその両方で調節することを指す。
さらに別の態様では、「処置する」、「処置すること」または「処置」とは、疾患または
障害の開始または発生または進行を防止すること、または遅延させることを指す。

【0111】

用語「治療的に許容される量」または「治療有効用量」は、所望の結果（すなわち、腫
瘍サイズの低下、腫瘍成長の阻害、転移の防止、ウイルス、細菌、真菌または寄生虫感染
の阻害または防止）を得るのに十分な量を互換的に指す。いくつかの態様では、治療的に
許容される量は、望ましくない副作用を誘導しない、または引き起こさない。治療的に許
容される量を、最初は低用量を投与し、次いで、所望の効果が達成されるまでその用量を
徐々に増加させることにより決定することができる。「予防有効用量」および「治療有効
用量」の本開示の分子は、がんと関連する症状などの疾患症状の、それぞれ、開始を防止
するか、またはその重症度の低下をもたらし得る。

【0112】

用語「同時投与する」とは、個体の血液中の２つの活性薬剤の同時的存在を指す。同時
投与される活性薬剤を、同時に、または連続的に送達することができる。

【図面の簡単な説明】

【0113】

【図1】がん細胞系のサブセットにおけるｃＫＩＴ−ＭＣＣ−ＤＭ１ ＡＤＣの活性を示す図である。

【図2】がん細胞系のサブセットにおける９Ｐ３−ＭＣＣ−ＤＭ１、９Ｐ３−ＳＰＤＢ−ＤＭ４および９Ｐ３−ＣＸ１−１−ＤＭ１の活性を示す図である。

【図3】ｃＫＩＴ表面受容体発現のレベルが変化するＡＭＬ、ＧＩＳＴ、メラノーマおよびＳＣＬＣ細胞系のパネルにおける９Ｐ３−ＭＣＣ−ＤＭ１の活性を示す。

【図4】ＧＩＳＴ−Ｔ１（イマチニブ感受性）細胞の増殖を阻害するｃＫＩＴ−ＭＣＣ−ＤＭ１ ＡＤＣの能力を示す図である。

【図5】ＧＩＳＴ４３０（イマチニブ耐性）細胞の増殖を阻害するｃＫＩＴ−ＭＣＣ−ＤＭ１ ＡＤＣの能力を示す図である。

【図6】ＮＣＩ−Ｈ５２６（より高いｃＫＩＴを発現するＳＣＬＣ）細胞の増殖を阻害するｃＫＩＴ−ＭＣＣ−ＤＭ１ ＡＤＣの能力を示す図である。

【図7】ＮＣＩ−Ｈ１０４８（より低いｃＫＩＴを発現するＳＣＬＣ）細胞の増殖を阻害するｃＫＩＴ−ＭＣＣ−ＤＭ１ ＡＤＣの能力を示す図である。

【図8】ＣＭＫ１１−５（高いｃＫＩＴを発現するＡＭＬ）細胞の増殖を阻害するｃＫＩＴ−ＭＣＣ−ＤＭ１ ＡＤＣの能力を示す図である。

【図9】Ｕｋｅ−１（より低いｃＫＩＴを発現するＡＭＬ）細胞の増殖を阻害するｃＫＩＴ−ＭＣＣ−ＤＭ１ ＡＤＣの能力を示す図である。

【図10】測定における標準誤差に対して補正された差異としてプロットされたＨＤｘ−ＭＳ生データである。マイナス値が大きいほど、ｃＫＩＴ抗原への９Ｐ３の結合時の重水素交換からの保護が多くなることを示す。保護の２つの最も有意な領域を、領域１および領域２として示す。

【図11】ＨＤｘ−ＭＳ保護の領域が表面充填を使用してマッピングされることを示す図である：領域１（黒色）および領域２（暗灰色）。ＳＣＦ結合部位を、部位Ｉ（明灰色の球体）、部位ＩＩ（中程度の灰色の球体）、および部位ＩＩＩ（より暗い灰色の球体）として示す。

【図12】１５分後に野生型ｃＫＩＴ細胞系Ｍｏ７ｅ（図１２Ａ）または変異ｃＫＩＴ細胞系ＧＩＳＴ−Ｔ１（図１２Ｂ）におけるｃＫＩＴのリン酸化をモジュレートするＳＣＦ、ＮＥＧ０８５−ＭＣＣ−ＤＭ１、ＮＥＧ０２４−ＭＣＣ−ＤＭ１および２０３７６−ＭＣＣ−ＤＭ１の能力を示すウェスタンブロットの図である。

【図13】ＮＥＧ０８５および２０３７６Ａｂが、ＧＩＳＴ−Ｔ１細胞（Ａ）およびヒト骨髄細胞（Ｂ）上の表面ｃＫＩＴの迅速な内在化を媒介することを示す図である。

【図14】変異ｃＫＩＴ細胞系、ＧＩＳＴ−Ｔ１（図１４Ａ）および野生型ｃＫＩＴ細胞系ＮＣＩ−Ｈ５２６（図１４Ｂ）におけるｃＫＩＴ分解を促進するＳＣＦまたはＮＥＧ０８５−ＭＣＣ−ＤＭ１の能力を示す経時的なウェスタンブロットの図である。

【図15】Ｍｏ７ｅ細胞のＳＣＦ依存的増殖を阻害するＮＥＧ０８５、ＮＥＧ０２４、２０３７６、ＮＥＧ０８５−ＭＣＣ−ＤＭ１の能力を示す図である。

【図16】Ｍｏ７ｅ細胞のＳＣＦ依存的増殖を阻害するＮＥＧ０８５およびＮＥＧ０８５−ＭＣＣ−ＤＭ１の能力を示す図である。

【図17】Ｕｋｅ−１細胞中、ｉｎ ｖｉｔｒｏで非ＡＤＣＣを誘導するＣａｍｐａｔｈ（抗ＣＤ５２ Ａｂ）、ＮＥＧ０８５または２０３７６抗体の能力の評価を示す図である。

【図18】ＮＥＧ０８５および２０３７６が一次ヒト肥満細胞アポトーシスを媒介しないことを示す図である。

【図19】ＮＥＧ０８５および２０３７６が一次ヒト肥満細胞脱顆粒化を媒介しないことを示す図である。

【図20】ＧＩＳＴ Ｔ１異種移植片モデルにおけるＩｇＧ１とＮＥＧ０２７−ＭＣＣ−ＤＭ１の有糸分裂停止の同時局在化を示す図である。

【図21】ｃＫＩＴ ＡＤＣの単回投与後の有糸分裂停止（ｐ−ヒストンＨ３）およびアポトーシス（キャスパーゼ３）の組織切片を示す図である。

【図22】ｃＫＩＴ ＡＤＣの単回投与後の８日目の有糸分裂停止およびアポトーシス誘導を示すグラフである。

【図23】（Ａ）ＧＩＳＴ Ｔ１マウス異種移植片における用量応答効果および（Ｂ）処置経過にわたる体重の変化を示す図である。

【図24】（Ａ）ＧＩＳＴ Ｔ１異種移植片モデルにおける投与後の抗ＤＭ１ ＥＬＩＳＡおよび（Ｂ）ＧＩＳＴ Ｔ１異種移植片モデルにおける投与後の抗ヒトＩｇＧ１ ＥＬＩＳＡを示すグラフである。

【図25】ＧＩＳＴ Ｔ１異種移植片マウスモデルにおけるＮＥＧ０２７−ＭＣＣ−ＤＭ１の用量応答の表である。

【図26】ＧＩＳＴ Ｔ１におけるＮＥＧ０２７−ＭＣＣ−ＤＭ１の用量応答効果の組織切片を示す図である。（Ａ）は第４群のプールされた腫瘍であり、（Ｂ）は第５群のプールされた腫瘍である。

【図27】（Ａ）ＧＩＳＴ Ｔ１異種移植片マウスモデルにおいて０．６２５ｍｇ／ｋｇを使用した場合の効果、（Ｂ）対照に対する腫瘍体積の変化（％Ｔ／Ｃ）および（Ｃ）処置経過にわたる体重の変化を示す図である。

【図28】ＧＩＳＴ Ｔ１異種移植片マウスへの抗ｃＫＩＴ ＡＤＣの単回用量の投与後４１日目のクラスタリングを示す図である。

【図29】ＧＩＳＴ Ｔ１異種移植片モデルにおける低い有効用量でのｃＫＩＴ ＡＤＣの効果の表である。

【図30】（Ａ）ＧＩＳＴ Ｔ１異種移植片マウスモデルにおける抗ｃＫＩＴ ＰＫを示す図である（左パネルは抗ＤＭ１ ＥＬＩＳＡである）、（Ｂ）右パネルは抗ヒトＩｇＧ１ ＥＬＩＳＡである。

【図31】（Ａ）ＳＣＬＣモデルにおけるＮＥＧ０８５−ＭＣＣ−ＤＭ１、ＮＥＧ０２４ＭＣＣ−ＤＭ１およびＮＥＧ０８６−ＭＣＣ−ＤＭ１活性、（Ｂ）処置経過にわたる体重の変化、（Ｃ）腫瘍試料上でのｃＫＩＴの発現を示す図である。

【図32】ＮＣＩ−Ｈ１０４８ ＳＣＬＣにおける抗ｃＫＩＴ−ＡＤＣ効果研究の表である。

【図33】（Ａ）ＮＣＩ−Ｈ１０４８（ＳＣＬＣ）異種移植片モデルにおけるＮＥＧ０８５−ＭＣＣ−ＤＭ１用量応答、（Ｂ）処置経過にわたる体重の変化を示す図である。

【図34】ＮＣＩ−１０４８（ＳＣＬＣ）異種移植片マウスモデルにおけるＮＥＧ０８５−ＭＣＣ−ＤＭ１効果研究を示す表である。

【図35】（Ａ）ＮＣＩ−Ｈ５２６（ＳＣＬＣ）異種移植片マウスモデルにおける２０３７６およびＮＥＧ０２４の効果、（Ｂ）投与後の抗体血清濃度ならびに（Ｃ）Ｈ５２６腫瘍上でのｃＫＩＴレベルの発現を示すｃＫＩＴに関するＩＨＣを示す図である。

【図36】小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）異種移植片モデルにおける抗ｃＫＩＴ ＡＤＣを示す図である。

【図37】ＡＭＬ異種移植片モデル（Ｋａｓｕｍｉ−１）における抗ｃＫＩＴ ＡＤＣ効果を示す図である。

【図38】ＨＭＣ−１肥満細胞症異種移植片マウスモデルにおける抗ｃＫＩＴ ＡＤＣ効果を示す図である。

【図39】（Ａ）用量および腫瘍体積ならびに（Ｂ）処置経過にわたる体重の変化に関する、ＧＩＳＴ Ｔ１異種移植片マウスモデルにおけるマウス交差反応性２０７３６−ＭＣＣ−ＤＭ１の効果を示す図である。

【図40】（Ａ）ＧＩＳＴ Ｔ１異種移植片マウスモデル−ＰＫにおけるマウス交差反応性２０３７６−ＭＣＣ−ＤＭ１の効果および（Ｂ）投与後の抗体血清濃度を示す図である。

【図41】ＧＩＳＴ Ｔ１ ＳＣＩＤベージュマウスにおける用量応答効果研究を示す図である。

【図42】（Ａ）ＧＩＳＴ Ｔ１異種移植片マウスモデルにおける効果（非コンジュゲートについては効果なし）および（Ｂ）処置経過にわたる体重の変化を示す図である。

【図43】ＧＩＳＴ Ｔ１マウス異種移植片モデル（非標識／ＭＣＣ−ＤＭ１／ＳＰＤＢ−ＤＭ４）における効果の比較を示す図である。

【図44】（Ａ）ＳＰＤＢ−ＤＭ４およびＭＣＣ−ＤＭ１を比較するＧＩＳＴ ４３０異種移植片モデルにおける効果ならびに（Ｂ）処置経過にわたる体重の変化を示す図である。

【図45】ＧＩＳＴ ４３０ ＳＣＩＤベージュマウスモデルにおける効果を示す図である。

【図46】ＮＥＧ０８５−ＭＣＣ−ＤＭ１を使用する処置後のｐ−ヒストンＨ３免疫染色の写真である。

【図47】ＮＥＧ０８５−ＭＣＣ−ＤＭ１の投与後のｐ−ヒストンＨ３染色により示される有糸分裂停止のグラフである。

【図48】（Ａ）ＧＩＳＴ Ｔ１腫瘍のｃＫＩＴ染色、（Ｂ）ＧＩＳＴ Ｔ１異種移植片モデルにおけるＮＥＧ０８５−ＭＣＣ−ＤＭ１の用量応答、（Ｃ）ＮＥＧ０８５−ＭＣＣ−ＤＭ１で処置されたマウスの体重の変化を示す図である。

【図49】（Ａ）ＧＩＳＴ ４３０腫瘍のｃＫＩＴ染色、（Ｂ）ＧＩＳＴ ４３０異種移植片モデルにおけるＮＥＧ０８５−ＭＣＣ−ＤＭ１の用量応答、（Ｃ）ＮＥＧ０８５−ＭＣＣ−ＤＭ１で処置されたマウスの体重の変化を示す図である。

【図50】（Ａ）ＮＣＩ−Ｈ５２６腫瘍（小細胞肺がん（ＳＣＬＣ））のｃＫＩＴ染色、（Ｂ）ＮＣＩ−Ｈ５２６異種移植片モデルにおけるＮＥＧ０８５−ＭＣＣ−ＤＭ１の用量応答、（Ｃ）ＮＥＧ０８５−ＭＣＣ−ＤＭ１で処置されたマウスの体重の変化を示す図である。

【図51】（Ａ）ＮＣＩ−Ｈ５２６異種移植片モデルにおけるＮＥＧ０８５−ＭＣＣ−ＤＭ１投与後のＩｇＧ１の量を示す図であり、（Ｂ）ＮＥＧ０８５−ＭＣＣ−ＤＭ１を使用する投与後のＮＣＩ−Ｈ５２６異種移植片モデルにおける抗ＤＭ１ ＥＬＩＳＡのグラフである。

【図52】（Ａ）一次ＡＭＬ異種移植片マウスモデルにおけるＮＥＧ０８５−ＭＣＣ−ＤＭ１の効果を示すグラフであり、（Ｂ）ＮＥＧ０８５−ＭＣＣ−ＤＭ１で処置されたマウスの体重の変化を示す図である。

【図53】ｃＫＩＴドメイン１および２との複合体にあるＮＥＧ０８５ Ｆａｂの結晶構造の表示である。Ｆａｂ重鎖は暗灰色で示され、Ｆａｂ軽鎖は白色で示され、ｃＫＩＴドメインは明灰色で示される。エピトープおよびパラトープは黒色で示される。

【発明を実施するための形態】

【0114】

本開示は、ｃＫＩＴに結合する抗体、抗体断片（例えば、抗原結合性断片）、および抗
体薬物コンジュゲートを提供する。特に、本開示は、ｃＫＩＴに結合し、そのような結合
の際に内在化する抗体および抗体断片（例えば、抗原結合性断片）に関する。本開示の抗
体および抗体断片（例えば、抗原結合性断片）を、抗体薬物コンジュゲートを生成するた
めに使用することができる。さらに、本開示は、望ましい薬物動態特性および他の望まし
い属性を有し、従って、限定されるものではないが、例えば、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ
）、小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、メラノーマ、肥満細胞白
血病（ＭＣＬ）、肥満細胞症、神経線維腫症、乳がん、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）お
よび膵臓がんなどの、ｃＫＩＴを発現するがんを処置するために使用することができる抗
体薬物コンジュゲートを提供する。本開示はさらに、抗体薬物コンジュゲートを含む医薬
組成物、ならびにがんの処置のためにそのような医薬組成物を作製し、使用する方法を提
供する。

【0115】

抗体薬物コンジュゲート
本開示は、ｃＫＩＴに特異的に結合する抗体、抗原結合性断片またはその機能的等価物
が薬物部分に連結された、抗体薬物コンジュゲートを提供する。一態様では、抗体、抗原
結合性断片またはその機能的等価物は、リンカーによる共有結合を介して、抗がん剤であ
る薬物部分に連結される。抗体薬物コンジュゲートは、有効用量の抗がん剤（例えば、細
胞毒性剤）を、ｃＫＩＴを発現する腫瘍組織に選択的に送達し、それによって、より高い
選択性（およびより低い有効用量）を達成することができる。

【0116】

一態様では、本開示は、式（Ｉ）：
Ａｂ−（Ｌ−（Ｄ）_ｍ）_ｎ
（式中、Ａｂは、本明細書に記載のｃＫＩＴ結合抗体または抗体断片（例えば、抗原結合
性断片）を表し；
Ｌはリンカーであり；
Ｄは薬物部分であり；
ｍは１〜８の整数であり；および
ｎは１〜２０の整数である）
のイムノコンジュゲートを提供する。一態様では、ｎは１〜１０、２〜８、または２〜５
の整数である。特定の態様では、ｎは３〜４である。いくつかの態様では、ｍは１である
。いくつかの態様では、ｍは２、３または４である。

【0117】

薬物と抗体の比率は特定のコンジュゲート分子については正確な整数値を有するが（例
えば、式（Ｉ）中でｍを掛けたｎ）、その値は、典型的には、コンジュゲーションステッ
プと関連する、ある程度の不均等性のため、多くの分子を含有する試料を記述するために
使用される場合には平均値であることが多いことを理解されたい。イムノコンジュゲート
の試料に関する平均充填量を、本明細書では薬物と抗体の比率、または「ＤＡＲ」と呼ぶ
。メイタンシノイドの態様では、これをメイタンシノイドと抗体の比率または「ＭＡＲ」
と呼ぶことができる。いくつかの態様では、ＤＡＲは約１〜約５であり、典型的には、約
３、３．５、４、４．５または５である。いくつかの態様では、試料の少なくとも５０重
量％は、平均ＤＡＲ±２を有する化合物であり、好ましくは、試料の少なくとも５０％は
、平均ＤＡＲ±１を含有するコンジュゲートである。他の態様は、ＤＡＲが約３．５であ
るイムノコンジュゲートを含む。いくつかの態様では、「約ｎ」のＤＡＲは、ＤＡＲの測
定値がｎの２０％以内にあることを意味する。

【0118】

本開示は、薬物部分に連結またはコンジュゲートされた、本明細書に開示される抗体、
抗体断片（例えば、抗原結合性断片）およびその機能的等価物を含むイムノコンジュゲー
トを提供する。一態様では、薬物部分Ｄは、構造：

【0119】

【化2】

（式中、波線は抗体薬物コンジュゲートのリンカーへのメイタンシノイドの硫黄原子の共
有結合を示す）
を有するものなどの、メイタンシノイド薬物部分である。Ｒは、出現する毎に、独立にＨ
またはＣ_１〜Ｃ_６アルキルである。アミド基を硫黄原子に結合させるアルキレン鎖は、メ
タニル、エタニル、またはプロパニルであってよい、すなわち、ｍは１、２または３であ
る（米国特許第６３３，４１０号、米国特許第５，２０８，０２０号、Chari et al. (19
92) Cancer Res. 52; 127-131、Lui et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. 93:8618-86
23）。

【0120】

メイタンシノイド薬物部分の全ての立体異性体、すなわち、メイタンシノイドのキラル
炭素でのＲおよびＳ配置の任意の組合せが、開示されるイムノコンジュゲートについて企
図される。一態様では、メイタンシノイド薬物部分は、以下の立体化学を有する。

【0121】

【化3】

【0122】

一態様では、メイタンシノイド薬物部分は、Ｎ^２’−デアセチル−Ｎ^２’−（３−メル
カプト−１−オキソプロピル）−メイタンシン（ＤＭ１としても知られる）である。ＤＭ
１は、以下の構造式により表される。

【0123】

【化4】

【0124】

別の態様では、メイタンシノイド薬物部分は、Ｎ^２’−デアセチル−Ｎ^２’−（４−メ
ルカプト−１−オキソペンチル）−メイタンシン（ＤＭ３としても知られる）である。Ｄ
Ｍ３は、以下の構造式により表される。

【0125】

【化5】

【0126】

別の態様では、メイタンシノイド薬物部分は、Ｎ^２’−デアセチル−Ｎ^２’−（４−メ
チル−４−メルカプト−１−オキソペンチル）−メイタンシン（ＤＭ４としても知られる
）である。ＤＭ４は、以下の構造式により表される。

【0127】

【化6】

【0128】

薬物部分Ｄを、リンカーＬを介して抗体に連結することができる。Ｌは、抗体Ａｂを薬
物部分Ｄに連結することができる任意の化学部分である。リンカーＬは、抗体Ａｂを、共
有結合（複数可）を介して薬物Ｄに結合させる。リンカー試薬は、薬物部分Ｄと抗体Ａｂ
とを連結して抗体薬物コンジュゲートを形成するために使用することができる二官能性ま
たは多官能性部分である。抗体薬物コンジュゲートを、薬物部分Ｄおよび抗体Ａｂへの結
合のための反応性官能基を有するリンカーを使用して調製することができる。システイン
、チオールまたはアミン、例えば、抗体のリシンなどのＮ末端またはアミノ酸側鎖は、リ
ンカー試薬の官能基との結合を形成することができる。

【0129】

一態様では、Ｌは切断性リンカーである。別の態様では、Ｌは非切断性リンカーである
。いくつかの態様では、Ｌは酸不安定リンカー、光不安定リンカー、ペプチダーゼ切断性
リンカー、エステラーゼ切断性リンカー、ジスルフィド結合還元性リンカー、親水性リン
カー、プロチャージリンカー、またはジカルボン酸に基づくリンカーである。

【0130】

薬物部分Ｄ、例えば、メイタンシノイドと、抗体Ａｂとの間で非切断性リンカーを形成
する好適な架橋試薬は当業界で周知であり、硫黄原子（ＳＭＣＣなど）を含む非切断性リ
ンカーまたは硫黄原子を含まないものを形成することができる。薬物部分Ｄ、例えば、メ
イタンシノイドと、抗体Ａｂとの間で非切断性リンカーを形成する好ましい架橋試薬は、
マレイミドまたはハロアセチルに基づく部分を含む。本開示によれば、そのような非切断
性リンカーは、マレイミドまたはハロアセチルに基づく部分から誘導されると言われる。

【0131】

マレイミドに基づく部分を含む架橋試薬としては、限定されるものではないが、Ｎ−ス
クシンイミジル−４−（マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボキシレート（ＳＭＣＣ
）、スルホスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボ
キシレート（スルホ−ＳＭＣＣ）、ＳＭＣＣの「長鎖」類似体（ＬＣ−ＳＭＣＣ）である
Ｎ−スクシンイミジル−４−（マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシ−（
６−アミドカプロエート）、κ−マレイミドウンデカン酸（undeconoic acid）Ｎ−スク
シンイミジルエステル（ＫＭＵＡ）、γ−マレイミド酪酸Ｎ−スクシンイミジルエステル
（ＧＭＢＳ）、ε−マレイミドカプロン酸Ｎ−スクシンイミジルエステル（ＥＭＣＳ）、
ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）、Ｎ−（
α−マレイミドアセトキシ）−スクシンイミドエステル（ＡＭＳＡ）、スクシンイミジル
−６−（β−マレイミドプロピオンアミド）ヘキサノエート（ＳＭＰＨ）、Ｎ−スクシン
イミジル−４−（ｐ−マレイミドフェニル）−ブチレート（ＳＭＰＢ）、Ｎ−（−ｐ−マ
レオミドフェニル）イソシアネート（ＰＭＩＰ）およびＭＡＬ−ＰＥＧ−ＮＨＳなどのポ
リエチレングリコールスペーサを含有するマレイミドに基づく架橋試薬が挙げられる。こ
れらの架橋試薬は、マレイミドに基づく部分から誘導される非切断性リンカーを形成する
。マレイミドに基づく架橋試薬の代表的な構造は、以下に示される。

【0132】

【化7】

【0133】

別の態様では、リンカーＬは、Ｎ−スクシンイミジル−４−（マレイミドメチル）シク
ロヘキサンカルボキシレート（ＳＭＣＣ）、スルホスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミ
ドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（スルホ−ＳＭＣＣ）またはＭＡＬ−
ＰＥＧ−ＮＨＳから誘導される。

【0134】

ハロアセチルに基づく部分を含む架橋試薬としては、Ｎ−スクシンイミジルヨードアセ
テート（ＳＩＡ）、Ｎ−スクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート（
ＳＩＡＢ）、Ｎ−スクシンイミジルブロモアセテート（ＳＢＡ）およびＮ−スクシンイミ
ジル３−（ブロモアセトアミド）プロピオネート（ＳＢＡＰ）が挙げられる。これらの架
橋試薬は、ハロアセチルに基づく部分から誘導される非切断性リンカーを形成する。ハロ
アセチルに基づく架橋試薬の代表的な構造は、以下に示される。

【0135】

【化8】

【0136】

一態様では、リンカーＬは、Ｎ−スクシンイミジルヨードアセテート（ＳＩＡ）または
Ｎ−スクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート（ＳＩＡＢ）から誘導
される。

【0137】

薬物部分Ｄ、例えば、メイタンシノイドと、抗体Ａｂとの間で切断性リンカーを形成す
る好適な架橋試薬は、当業界で周知である。ジスルフィド含有リンカーは、生理的条件下
で起こり得るジスルフィド交換を介して切断可能であるリンカーである。本開示によれば
、そのような切断性リンカーは、ジスルフィドに基づく部分から誘導されると言われる。
好適なジスルフィド架橋試薬としては、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチ
オ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、Ｎ−スクシンイミジル−４−（２−ピリジルジチオ）
ペンタノエート（ＳＰＰ）、Ｎ−スクシンイミジル−４−（２−ピリジルジチオ）ブタノ
エート（ＳＰＤＢ）およびＮ−スクシンイミジル−４−（２−ピリジルジチオ）２−スル
ホ−ブタノエート（スルホ−ＳＰＤＢ）が挙げられ、その構造は以下に示される。これら
のジスルフィド架橋試薬は、ジスルフィドに基づく部分から誘導される切断性リンカーを
形成する。

【0138】

【化9】

Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、

【0139】

【化10】

Ｎ−スクシンイミジル−４−（２−ピリジルジチオ）ペンタノエート（ＳＰＰ）、

【0140】

【化11】

Ｎ−スクシンイミジル−４−（２−ピリジルジチオ）ブタノエート（ＳＰＤＢ）および

【0141】

【化12】

Ｎ−スクシンイミジル−４−（２−ピリジルジチオ）２−スルホ−ブタノエート（スルホ
−ＳＰＤＢ）。

【0142】

一態様では、リンカーＬは、Ｎ−スクシンイミジル−４−（２−ピリジルジチオ）ブタ
ノエート（ＳＰＤＢ）から誘導される。

【0143】

薬物部分Ｄ、例えば、メイタンシノイドと、抗体Ａｂとの間で荷電リンカーを形成する
好適な架橋試薬は、プロチャージ架橋試薬として知られる。一態様では、リンカーＬは、
プロチャージ架橋試薬ＣＸ１−１から誘導される。ＣＸ１−１の構造は、以下の通りであ
る。

【0144】

【化13】

２，５−ジオキソピロリジン−１−イル１７−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−
１Ｈ−ピロール−１−イル）−５，８，１１，１４−テトラオキソ−４，７，１０，１３
−テトラアザヘプタデカン−１−オエート（ＣＸ１−１）。

【0145】

本開示により提供される一態様では、コンジュゲートは、以下の構造式のいずれか１つ
により表される。

【0146】

【化14】

式中、
ＡｂはヒトｃＫＩＴに特異的に結合する抗体またはその抗原結合性断片であり；
アミド結合とＡｂの第１級アミンとの形成を介してＡｂに結合したＤ−Ｌ基の数を示す
ｎは、１〜２０の整数である。一態様において、ｎは１〜１０、２〜８または２〜５の整
数である。特定の態様において、ｎは３または４である。

【0147】

一態様では、コンジュゲート中の薬物（例えば、ＤＭ１またはＤＭ４）と抗体との平均
モル比（すなわち、メイタンシノイド抗体比（ＭＡＲ）としても知られる、平均ｗ値）は
、約１〜約１０、約２〜約８（例えば、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．
４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．
４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２、４．３、４．
４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５．０、５．１、５．２、５．３、５．
４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６．０、６．１、６．２、６．３、６．
４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．
４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８．０または８．１）、約２．５〜約７
、約３〜約５、約２．５〜約４．５（例えば、約２．５、約２．６、約２．７、約２．８
、約２．９、約３．０、約３．１、約３．３、約３．４、約３．５、約３．６、約３．７
、約３．８、約３．９、約４．０、約４．１、約４．２、約４．３、約４．４、約４．５
）、約３．０〜約４．０、約３．２〜約４．２、または約４．５〜５．５（例えば、約４
．５、約４．６、約４．７、約４．８、約４．９、約５．０、約５．１、約５．２、約５
．３、約５．４または約５．５）である。

【0148】

本開示により提供される一態様では、コンジュゲートは実質的に高い純度を有し、以下
の特徴：（ａ）約９０％より多い（例えば、約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％
、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％より多いか、またはそれと等しい）
、好ましくは、約９５％より多いコンジュゲート種が単量体である、（ｂ）コンジュゲー
ト調製物中の非コンジュゲート化リンカーレベルが約１０％未満（例えば、約９％、８％
、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、または０％未満であるか、またはそれと
等しい）である（全リンカーと比較する）、（ｃ）１０％未満（例えば、約９％、８％、
７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、または０％未満またはそれと等しい）のコ
ンジュゲート種が架橋している、（ｄ）コンジュゲート調製物中の遊離薬物（例えば、Ｄ
Ｍ１またはＤＭ４）レベルが約２％未満（例えば、約１．５％、１．４％、１．３％、１
．２％、１．１％、１．０％、０．９％、０．８％、０．７％、０．６％、０．５％、０
．４％、０．３％、０．２％、０．１％または０％未満またはそれと等しい）である（全
細胞毒性剤と比較したｍｏｌ／ｍｏｌ）、のうちの１または複数を有する。

【0149】

本明細書で使用される用語「非コンジュゲート化リンカー」とは、抗体がリンカーを介
して薬物（例えば、ＤＭ１またはＤＭ４）に共有的にカップリングしていない、架橋試薬
（例えば、ＳＭＣＣ、スルホ−ＳＭＣＣ、ＳＰＤＢ、スルホ−ＳＰＤＢまたはＣＸ１−１
）から誘導されるリンカーと共有的に連結された抗体を指す（すなわち、「非コンジュゲ
ート化リンカー」はＡｂ−ＳＭＣＣ、Ａｂ−ＳＰＤＢ、またはＡｂ−ＣＸ１−１で表すこ
とができる）。

【0150】

１．薬物部分
本開示は、ｃＫＩＴに特異的に結合するイムノコンジュゲートを提供する。本開示のイ
ムノコンジュゲートは、薬物部分、例えば、抗がん剤、抗血液障害剤、自己免疫処置剤、
抗炎症剤、抗真菌剤、抗細菌剤、抗寄生虫剤、抗ウイルス剤、または麻酔剤にコンジュゲ
ートされた抗ｃＫＩＴ抗体、抗体断片（例えば、抗原結合性断片）または機能的等価物を
含む。抗体、抗体断片（例えば、抗原結合性断片）または機能的等価物を、当業界で公知
の任意の方法を使用して、いくつかの同一の、または異なる薬物部分にコンジュゲートす
ることができる。

【0151】

ある特定の態様では、本開示のイムノコンジュゲートの薬物部分は、Ｖ−ＡＴＰａｓｅ
阻害剤、プロアポトーシス剤、Ｂｃｌ２阻害剤、ＭＣＬ１阻害剤、ＨＳＰ９０阻害剤、Ｉ
ＡＰ阻害剤、ｍＴｏｒ阻害剤、微小管安定化剤、微小管脱安定化剤、オーリスタチン、ド
ラスタチン、メイタンシノイド、ＭｅｔＡＰ（メチオニンアミノペプチダーゼ）、タンパ
ク質ＣＲＭ１の核輸送の阻害剤、ＤＰＰＩＶ阻害剤、プロテアソーム阻害剤、ミトコンド
リアにおけるホスホリル転移反応の阻害剤、タンパク質合成阻害剤、キナーゼ阻害剤、Ｃ
ＤＫ２阻害剤、ＣＤＫ９阻害剤、キネシン阻害剤、ＨＤＡＣ阻害剤、ＤＮＡ損傷剤、ＤＮ
Ａアルキル化剤、ＤＮＡ挿入剤、ＤＮＡ副溝結合剤およびＤＨＦＲ阻害剤からなる群から
選択される。

【0152】

一態様では、本開示のイムノコンジュゲートの薬物部分は、限定されるものではないが
、ＤＭ１、ＤＭ３またはＤＭ４などのメイタンシノイド薬物部分である。

【0153】

さらに、本開示の抗体、抗体断片（例えば、抗原結合性断片）または機能的等価物を、
所与の生物学的応答を改変する薬物部分にコンジュゲートすることができる。薬物部分は
、古典的な化学療法剤に限定されると解釈されるべきではない。例えば、薬物部分は、所
望の生物活性を有するタンパク質、ペプチド、またはポリペプチドであってもよい。その
ようなタンパク質は、例えば、アブリン、リシンＡ、シュードモナス外毒素、コレラ毒素
、もしくはジフテリア毒素などの毒素、腫瘍壊死因子、α−インターフェロン、β−イン
ターフェロン、神経成長因子、血小板由来成長因子、組織プラスミノーゲン活性化因子、
サイトカイン、アポトーシス剤、抗血管新生剤などのタンパク質、または例えば、リンホ
カインなどの生物応答改変剤を含んでもよい。

【0154】

一態様では、本開示の抗体、抗体断片（例えば、抗原結合性断片）または機能的等価物
は、細胞毒素、薬物（例えば、免疫抑制剤）または放射性毒素などの薬物部分にコンジュ
ゲートされる。細胞毒素の例としては、限定されるものではないが、タキサン（例えば、
国際特許出願（ＰＣＴ）ＷＯ０１／３８３１８およびＰＣＴ／ＵＳ０３／０２６７５を参
照されたい）、ＤＮＡアルキル化剤（例えば、ＣＣ−１０６５類似体）、アントラサイク
リン、ツブリシン（tubulysin）類似体、デュオカルマイシン類似体、オーリスタチンＥ
、オーリスタチンＦ、メイタンシノイド、ならびに反応性ポリエチレングリコール部分（
例えば、Sasse et al., J. Antibiot. (Tokyo), 53, 879-85 (2000)、Suzawa et al., Bi
oorg. Med. Chem., 8, 2175-84 (2000)、Ichimura et al., J. Antibiot. (Tokyo), 44,
1045-53 (1991)、Francisco et al., Blood 2003 15;102(4):1458-65、米国特許第５，４
７５，０９２号、第６，３４０，７０１号、第６，３７２，７３８号、および第６，４３
６，９３１号、米国特許出願公開第２００１／００３６９２３Ａ１号、係属中米国特許出
願第１０／０２４，２９０号および第１０／１１６，０５３号、ならびに国際特許出願（
ＰＣＴ）ＷＯ０１／４９６９８を参照されたい）を含む細胞毒性剤、タキソン、サイトカ
ラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、
テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ｔ．コルヒチン、ドキソルビシン、ダウ
ノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、ア
クチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、糖質コルチコイド、プロカイン、テト
ラカイン、リドカイン、プロプラノロール、およびピューロマイシンならびにその類似体
または相同体が挙げられる。また、治療剤としては、例えば、代謝拮抗剤（例えば、メト
トレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウ
ラシルデカルバジン）、削摩剤（ablating agent）（例えば、メクロレタミン、チオテパ
クロラムブシル、メイファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）およびロムスチン（ＣＣＮＵ
）、シクロホスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、
マイトマイシンＣ、およびｃｉｓ−ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチ
ン、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン（以前はダウノマイシン）およびドキ
ソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（以前はアクチノマイシン）、ブレ
オマイシン、ミトラマイシン、およびアントラマイシン（ＡＭＣ））、ならびに抗有糸分
裂剤（例えば、ビンクリスチンおよびビンブラスチン）も挙げられる（例えば、Seattle
GeneticsのＵＳ２００９０３０４７２１を参照されたい）。

【0155】

本開示の抗体、抗体断片（抗原結合性断片）または機能的等価物にコンジュゲートする
ことができる細胞毒素の他の例としては、デュオカルマイシン、カリケアマイシン、メイ
タンシンおよびオーリスタチン、ならびにその誘導体が挙げられる。

【0156】

治療剤を抗体にコンジュゲートするための様々な型の細胞毒素、リンカーおよび方法は
、当業界で公知であり、例えば、Saito et al., (2003) Adv. Drug Deliv. Rev. 55:199-
215; Trail et al., (2003) Cancer Immunol. Immunother. 52:328-337; Payne, (2003)
Cancer Cell 3:207-212; Allen, (2002) Nat. Rev. Cancer 2:750-763; Pastan and Krei
tman, (2002) Curr. Opin. Investig. Drugs 3:1089-1091; Senter and Springer, (2001
) Adv. Drug Deliv. Rev. 53:247-264を参照されたい。

【0157】

本開示の抗体、抗体断片（例えば、抗原結合性断片）または機能的等価物を、放射性ア
イソトープにコンジュゲートして、放射性イムノコンジュゲートと呼ばれる、細胞毒性放
射性薬剤を作成することもできる。診断的または治療的に使用するために抗体にコンジュ
ゲートすることができる放射性アイソトープの例としては、限定されるものではないが、
ヨウ素−１３１、インジウム−１１１、イットリウム−９０、およびルテチウム−１７７
が挙げられる。放射性イムノコンジュゲートを調製するための方法は、当業界で確立され
ている。放射性イムノコンジュゲートの例は、Ｚｅｖａｌｉｎ（商標）（ＩＤＥＣ Ｐｈ
ａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）およびＢｅｘｘａｒ（商標）（Ｃｏｒｉｘａ Ｐｈａｒｍ
ａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）など、商業的に入手可能であり、同様の方法を使用して、本明細
書に開示される抗体を使用して放射性イムノコンジュゲートを調製することができる。あ
る特定の態様では、大環状キレート剤は、リンカー分子を介して抗体に結合させることが
できる１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−四
酢酸（ＤＯＴＡ）である。そのようなリンカー分子は、当業界で一般に公知であり、それ
ぞれ全体が参照により組み込まれる、Denardo et al., (1998) Clin Cancer Res. 4(10):
2483-90; Peterson et al., (1999) Bioconjug. Chem. 10(4):553-7; およびZimmerman e
t al., (1999) Nucl. Med. Biol. 26(8):943-50に記載されている。

【0158】

本開示の抗体、抗体断片（例えば、抗原結合性断片）または機能的等価物を、異種タン
パク質またはポリペプチド（またはその断片、好ましくは、少なくとも１０、少なくとも
２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも
７０、少なくとも８０、少なくとも９０または少なくとも１００アミノ酸のポリペプチド
）にコンジュゲートして、融合タンパク質を作成することもできる。特に、本開示は、本
明細書に記載の抗体断片（例えば、抗原結合性断片）（例えば、Ｆａｂ断片、Ｆｄ断片、
Ｆｖ断片、Ｆ（ａｂ）２断片、ＶＨドメイン、ＶＨ ＣＤＲ、ＶＬドメインまたはＶＬ
ＣＤＲ）と、異種タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドとを含む融合タンパク質を
提供する。

【0159】

さらなる融合タンパク質を、遺伝子シャッフリング、モチーフシャッフリング、エクソ
ンシャッフリング、および／またはコドンシャッフリング（集合的に、「ＤＮＡシャッフ
リング」と呼ばれる）の技術により作成することができる。ＤＮＡシャッフリングを使用
して、本開示の抗体またはその断片の活性（例えば、より高い親和性およびより低い解離
速度を有する抗体またはその断片）を変化させることができる。一般に、米国特許第５，
６０５，７９３号、第５，８１１，２３８号、第５，８３０，７２１号、第５，８３４，
２５２号、および第５，８３７，４５８号; Patten et al., (1997) Curr. Opinion Biot
echnol. 8:724-33; Harayama, (1998) Trends Biotechnol. 16(2):76-82; Hansson et al
., (1999) J. Mol. Biol. 287:265-76; およびLorenzo and Blasco, (1998) Biotechniqu
es 24(2):308-313（これらの特許および刊行物の各々は、その全体が参照により本明細書
に組み込まれる）を参照されたい。抗体もしくはその断片、またはコードされた抗体もし
くはその断片は、組換え前に変異性ＰＣＲ、無作為ヌクレオチド挿入または他の方法によ
り無作為突然変異誘発にかけることにより変化させることができる。抗原に特異的に結合
する抗体またはその断片をコードするポリヌクレオチドを、１または複数の異種分子の、
１または複数の成分、モチーフ、セクション、部分、ドメイン、断片などと組み換えるこ
とができる。

【0160】

さらに、本開示の抗体、抗体断片（例えば、抗原結合性断片）または機能的等価物を、
ペプチドなどのマーカー配列にコンジュゲートして、精製を容易にすることができる。好
ましい態様では、マーカーアミノ酸配列は、特に、ｐＱＥベクター（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎ
ｃ．，９２５９ Ｅｔｏｎ Ａｖｅｎｕｅ，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ，９１３１１）
に提供されるタグなどのヘキサ−ヒスチジンペプチドであり、その多くが商業的に入手可
能である。Gentz et al., (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:821-824に記載のよう
に、例えば、ヘキサ−ヒスチジンは、融合タンパク質の好都合の精製を提供する。精製に
とって有用な他のペプチドタグとしては、限定されるものではないが、インフルエンザヘ
マグルチニンタンパク質から誘導されるエピトープに対応するヘマグルチニン（「ＨＡ」
）タグ（Wilson et al., (1984) Cell 37:767）、および「ＦＬＡＧ」タグ（A. Einhauer
et al., J. Biochem. Biophys. Methods 49: 455-465, 2001）が挙げられる。本開示に
記載されるように、抗体または抗原結合性断片を、腫瘍浸透ペプチドにコンジュゲートし
て、その効果を増強することもできる。

【0161】

他の態様では、本開示の抗体、抗体断片（例えば、抗原結合性断片）または機能的等価
物は、診断剤または検出剤にコンジュゲートされる。そのようなイムノコンジュゲートは
、特定の療法の効果の決定などの、臨床試験手順の一部として疾患または障害の開始、発
生、進行および／または重症度をモニタリングまたは予後診断するのに有用であり得る。
そのような診断および検出を、限定されるものではないが、西洋わさびペルオキシダーゼ
、アルカリホスファターゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラ
ーゼなどの様々な酵素；限定されるものではないが、ストレプトアビジン／ビオチンおよ
びアビジン／ビオチンなどの補欠分子族；限定されるものではないが、Ａｌｅｘａ Ｆｌ
ｕｏｒ ３５０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４０５、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４３０、
Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５００、Ａｌｅｘａ Ｆｌ
ｕｏｒ ５１４、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５３２、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６、
Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５６８、Ａｌｅｘａ Ｆｌ
ｕｏｒ ５９４、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６１０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６３３、
Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６６０、Ａｌｅｘａ Ｆｌ
ｕｏｒ ６８０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７００、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７５０、
ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、
ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリドまたはフィコエリトリン
などの蛍光材料；限定されるものではないが、ルミノールなどの発光材料；限定されるも
のではないが、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリンなどの生物発光材料；
限定されるものではないが、ヨウ素（^１３１Ｉ、^１２５Ｉ、^１２３Ｉ、および^１２１Ｉ）
、炭素（^１４Ｃ）、硫黄（^３５Ｓ）、トリチウム（^３Ｈ）、インジウム（^１１５Ｉｎ、^１
１３Ｉｎ、^１１２Ｉｎ、および^１１１Ｉｎ）、テクネチウム（^９９Ｔｃ）、タリウム（^２
０１Ｔｉ）、ガリウム（^６８Ｇａ、^６７Ｇａ）、パラジウム（^１０３Ｐｄ）、モリブデン
（^９９Ｍｏ）、キセノン（^１３３Ｘｅ）、フッ素（^１８Ｆ）、^１５３Ｓｍ、^１７７Ｌｕ、
^１５９Ｇｄ、^１４９Ｐｍ、^１４０Ｌａ、^１７５Ｙｂ、^１６６Ｈｏ、^９０Ｙ、^４７Ｓｃ、^１
８６Ｒｅ、^１８８Ｒｅ、^１４２Ｐｒ、^１０５Ｒｈ、^９７Ｒｕ、^６８Ｇｅ、^５７Ｃｏ、^６５
Ｚｎ、^８５Ｓｒ、^３２Ｐ、^１５３Ｇｄ、^１６９Ｙｂ、^５１Ｃｒ、^５４Ｍｎ、^７５Ｓｅ、^６
４Ｃｕ、^１１３Ｓｎ、および^１１７Ｓｎなどの放射性材料；ならびに様々なポジトロン放
出断層撮影を使用するポジトロン放出金属、および非放射性常磁性金属イオンなどの、検
出可能物質に抗体をカップリングさせることにより達成することができる。

【0162】

本開示の抗体、抗体断片（例えば、抗原結合性断片）または機能的等価物を、標的抗原
のイムノアッセイまたは精製にとって特に有用である固相支持体に結合することもできる
。そのような固相支持体としては、限定されるものではないが、ガラス、セルロース、ポ
リアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニルまたはポリプロピレンが挙
げられる。

【0163】

２．リンカー
本明細書で使用される場合、「リンカー」は、薬物部分などの別の部分に、抗体、抗体
断片（例えば、抗原結合性断片）または機能的等価物を連結することができる任意の化学
部分である。リンカーは、化合物または抗体が活性を保持する条件下で、酸誘導性切断、
光誘導性切断、ペプチダーゼ誘導性切断、エステラーゼ誘導性切断、およびジスルフィド
結合切断などの切断の影響を受けやすいものであってもよい（切断性リンカー）。あるい
は、リンカーは、切断に対して実質的に耐性であってもよい（例えば、安定性リンカーま
たは非切断性リンカー）。いくつかの態様では、リンカーは、プロチャージリンカー、親
水性リンカー、またはジカルボン酸に基づくリンカーである。

【0164】

一態様では、使用されるリンカーは、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチ
オ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、Ｎ−スクシンイミジル−４−（２−ピリジルジチオ）
ペンタノエート（ＳＰＰ）、Ｎ−スクシンイミジル−４−（２−ピリジルジチオ）ブタノ
エート（ＳＰＤＢ）、Ｎ−スクシンイミジル−４−（２−ピリジルジチオ）−２−スルホ
−ブタノエート（スルホ−ＳＰＤＢ）、Ｎ−スクシンイミジルヨードアセテート（ＳＩＡ
）、Ｎ−スクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート（ＳＩＡＢ）、マ
レイミドＰＥＧ ＮＨＳ、Ｎ−スクシンイミジル４−（マレイミドメチル）シクロヘキサ
ンカルボキシレート（ＳＭＣＣ）、Ｎ−スルホスクシンイミジル４−（マレイミドメチル
）シクロヘキサンカルボキシレート（スルホ−ＳＭＣＣ）または２，５−ジオキソピロリ
ジン−１−イル１７−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イ
ル）−５，８，１１，１４−テトラオキソ−４，７，１０，１３−テトラアザヘプタデカ
ン−１−オエート（ＣＸ１−１）などの架橋試薬から誘導される。別の態様では、使用さ
れるリンカーは、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（
ＳＰＤＰ）、Ｎ−スクシンイミジル４−（マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボキシ
レート（ＳＭＣＣ）、Ｎ−スルホスクシンイミジル４−（マレイミドメチル）シクロヘキ
サンカルボキシレート（スルホ−ＳＭＣＣ）、Ｎ−スクシンイミジル−４−（２−ピリジ
ルジチオ）−２−スルホ−ブタノエート（スルホ−ＳＰＤＢ）または２，５−ジオキソピ
ロリジン−１−イル１７−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１
−イル）−５，８，１１，１４−テトラオキソ−４，７，１０，１３−テトラアザヘプタ
デカン−１−オエート（ＣＸ１−１）などの架橋剤から誘導される。

【0165】

非切断性リンカーは、安定な、共有的な様式でメイタンシノイドなどの薬物を、抗体に
連結することができ、切断性リンカーについて上記に列挙されたカテゴリーの下から外れ
ない任意の化学部分である。かくして、非切断性リンカーは、酸誘導性切断、光誘導性切
断、ペプチダーゼ誘導性切断、エステラーゼ誘導性切断およびジスルフィド結合切断に対
して実質的に耐性である。さらに、非切断性とは、メイタンシノイドなどの薬物または抗
体がその活性を喪失しない条件下で、酸、光不安定性切断剤、ペプチダーゼ、エステラー
ゼ、またはジスルフィド結合を切断する化学的もしくは生理的化合物により誘導される切
断に耐える、リンカー中の、またはリンカーに隣接する化学的結合の能力を指す。

【0166】

酸不安定リンカーは、酸性ｐＨで切断可能なリンカーである。例えば、エンドソームお
よびリソソームなどの特定の細胞内区画は、酸性ｐＨ（ｐＨ４〜５）を有し、酸不安定リ
ンカーを切断するのに好適な条件を提供する。

【0167】

光不安定リンカーは、光に接近可能である体表面で、および多くの体腔において有用で
あるリンカーである。さらに、赤外線は組織に浸透することができる。

【0168】

いくつかのリンカーは、ペプチダーゼ、すなわち、ペプチダーゼ切断性リンカーにより
切断することができる。特定のペプチドのみが、細胞の内部または外部で容易に切断され
る。例えば、Trout et al., 79 Proc. Natl. Acad.Sci. USA, 626-629 (1982)およびUmem
oto et al. 43 Int. J. Cancer, 677-684 (1989)を参照されたい。さらに、ペプチドは、
α−アミノ酸と、化学的には、あるアミノ酸のカルボキシレート基と、第２のアミノ酸の
アミノ基との間のアミド結合であるペプチド結合とから構成される。リシンのカルボキシ
レート基およびε−アミノ基との間の結合などの他のアミド結合は、ペプチド結合ではな
いと理解され、非切断性であると考えられる。

【0169】

いくつかのリンカーは、エステラーゼにより切断することができる、すなわち、エステ
ラーゼ切断性リンカーである。再度、特定のエステルのみを、細胞の内部または外部に存
在するエステラーゼにより切断することができる。エステルは、カルボン酸とアルコール
との縮合により形成される。単純エステルは、脂肪族アルコール、ならびに小環状および
低分子芳香族アルコールなどの、単純アルコールを使用して生成されるエステルである。

【0170】

プロチャージリンカーは、抗体薬物コンジュゲートへの組込み後にその電荷を保持する
荷電した架橋試薬から誘導される。プロチャージリンカーの例を、ＵＳ２００９／０２７
４７１３に見出すことができる。

【0171】

３．ＡＤＣのコンジュゲーションおよび調製
本開示のコンジュゲートを、米国特許第７，８１１，５７２号、第６，４１１，１６３
号、第７，３６８，５６５号、および第８，１６３，８８８号、ならびに米国特許出願公
開第２０１１／０００３９６９号、第２０１１／０１６６３１９号、第２０１２／０２５
３０２１号および第２０１２／０２５９１００号に記載のものなどの当業界で公知の任意
の方法により調製することができる。これらの特許および特許出願公開の全教示は、参照
により本明細書に組み込まれる。

【0172】

１ステッププロセス
一態様では、本開示のコンジュゲートを、１ステッププロセスによって調製することが
できる。このプロセスは、実質的に水性の媒体中で抗体、薬物および架橋剤を混合するこ
と、任意選択で、好適なｐＨで１または複数の共溶媒を含有させることを含む。一態様で
は、プロセスは、本開示の抗体を、薬物（例えば、ＤＭ１またはＤＭ４）と接触させて、
抗体と薬物とを含む第１の混合物を形成させるステップ、次いで、約４〜約９のｐＨを有
する溶液中で、抗体と薬物とを含む第１の混合物を、架橋剤（例えば、ＳＭＣＣ、スルホ
−ＳＭＣＣ、ＳＰＤＢ、スルホ−ＳＰＤＢまたはＣＸ１−１）と接触させて、（ｉ）コン
ジュゲート（例えば、Ａｂ−ＭＣＣ−ＤＭ１、Ａｂ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４、またはＡｂ−Ｃ
Ｘ１−１−ＤＭ１）、（ｉｉ）遊離薬物（例えば、ＤＭ１またはＤＭ４）、および（ｉｉ
ｉ）反応副生成物を含む混合物を提供するステップを含む。

【0173】

一態様では、１ステッププロセスは、約６以上（例えば、約６〜約９、約６〜約７、約
７〜約９、約７〜約８．５、約７．５〜約８．５、約７．５〜約８．０、約８．０〜約９
．０、または約８．５〜約９．０）のｐＨを有する溶液中で、抗体を、薬物（例えば、Ｄ
Ｍ１またはＤＭ４）、次いで、架橋剤（例えば、ＳＭＣＣ、スルホ−ＳＭＣＣ、ＳＰＤＢ
、スルホ−ＳＰＤＢまたはＣＸ１−１）と接触させることを含む。例えば、プロセスは、
約６．０、約６．１、約６．２、約６．３、約６．４、約６．５、約６．６、約６．７、
約６．８、約６．９、約７．０、約７．１、約７．２、約７．３、約７．４、約７．５、
約７．６、約７．７、約７．８、約７．９、約８．０、約８．１、約８．２、約８．３、
約８．４、約８．５、約８．６、約８．７、約８．８、約８．９または約９．０のｐＨを
有する溶液中で、細胞結合剤を、薬物（ＤＭ１またはＤＭ４）、次いで、架橋剤（例えば
、ＳＭＣＣ、スルホ−ＳＭＣＣ、ＳＰＤＢ、スルホ−ＳＰＤＢまたはＣＸ１−１）と接触
させることを含む。別の態様では、プロセスは、約７．８のｐＨ（例えば、７．６〜８．
０のｐＨまたは７．７〜７．９のｐＨ）を有する溶液中で、細胞結合剤を、薬物（例えば
、ＤＭ１またはＤＭ４）、次いで、架橋剤（例えば、ＳＭＣＣ、スルホ−ＳＭＣＣ、ＳＰ
ＤＢ、スルホ−ＳＰＤＢまたはＣＸ１−１）と接触させることを含む。

【0174】

１ステッププロセス（すなわち、抗体を薬物（例えば、ＤＭ１またはＤＭ４）、次いで
、架橋剤（例えば、ＳＭＣＣ、スルホ−ＳＭＣＣ、ＳＰＤＢ、スルホ−ＳＰＤＢまたはＣ
Ｘ１−１）と接触させること）を、当業界で公知の任意の好適な温度で実行することがで
きる。例えば、１ステッププロセスは、約２０℃以下（例えば、約−１０℃（例えば、細
胞毒性剤および二官能性架橋試薬を溶解するために使用される有機溶媒の存在によって、
溶液の凍結が防止されるという条件で）〜約２０℃、約０℃〜約１８℃、約４℃〜約１６
℃）、または室温（例えば、約２０℃〜約３０℃もしくは約２０℃〜約２５℃）、または
高温（例えば、約３０℃〜約３７℃）で行ってもよい。一態様では、１ステッププロセス
は、約１６℃〜約２４℃（例えば、約１６℃、約１７℃、約１８℃、約１９℃、約２０℃
、約２１℃、約２２℃、約２３℃、約２４℃、または約２５℃）の温度で行う。別の態様
では、１ステッププロセスは、約１５℃以下（例えば、約−１０℃〜約１５℃、または約
０℃〜約１５℃）の温度で実行される。例えば、プロセスは、例えば、架橋剤（例えば、
ＳＭＣＣ、スルホ−ＳＭＣＣ、スルホ−ＳＰＤＢ、ＳＰＤＢ、またはＣＸ１−１）を溶解
するために使用される有機溶媒（複数可）の存在によって、溶液の凍結が防止されるとい
う条件で、約１５℃、約１４℃、約１３℃、約１２℃、約１１℃、約１０℃、約９℃、約
８℃、約７℃、約６℃、約５℃、約４℃、約３℃、約２℃、約１℃、約０℃、約−１℃、
約−２℃、約−３℃、約−４℃、約−５℃、約−６℃、約−７℃、約−８℃、約−９℃、
または約−１０℃の温度で、抗体を、薬物（例えば、ＤＭ１またはＤＭ４）、次いで、架
橋剤（例えば、ＳＭＣＣ、スルホ−ＳＭＣＣ、ＳＰＤＢ、スルホ−ＳＰＤＢ、またはＣＸ
１−１）と接触させることを含む。一態様では、プロセスは、約−１０℃〜約１５℃、約
０℃〜約１５℃、約０℃〜約１０℃、約０℃〜約５℃、約５℃〜約１５℃、約１０℃〜約
１５℃、または約５℃〜約１０℃の温度で、抗体を、薬物（例えば、ＤＭ１またはＤＭ４
）、次いで、架橋剤（例えば、ＳＭＣＣ、スルホ−ＳＭＣＣ、ＳＰＤＢ、スルホ−ＳＰＤ
ＢまたはＣＸ１−１）と接触させることを含む。別の態様では、プロセスは、約１０℃の
温度（例えば、８℃〜１２℃の温度または９℃〜１１℃の温度）で、抗体を、薬物（例え
ば、ＤＭ１またはＤＭ４）、次いで、架橋剤（例えば、ＳＭＣＣ、スルホ−ＳＭＣＣ、Ｓ
ＰＤＢ、スルホ−ＳＰＤＢまたはＣＸ１−１）と接触させることを含む。

【0175】

一態様では、上記の接触は、抗体を提供した後、該抗体を薬物（例えば、ＤＭ１または
ＤＭ４）と接触させて、抗体と薬物（例えば、ＤＭ１またはＤＭ４）とを含む第１の混合
物を形成させ、次いで、抗体と薬物（例えば、ＤＭ１またはＤＭ４）とを含む第１の混合
物を、架橋剤（例えば、ＳＭＣＣ、スルホ−ＳＭＣＣ、ＳＰＤＢ、スルホ−ＳＰＤＢまた
はＣＸ１−１）と接触させることにより行われる。例えば、一態様では、抗体を反応容器
中に提供し、薬物（例えば、ＤＭ１またはＤＭ４）を反応容器に添加し（それによって、
抗体を接触させる）、次いで、架橋剤（例えば、ＳＭＣＣ、スルホ−ＳＭＣＣ、ＳＰＤＢ
、スルホ−ＳＰＤＢまたはＣＸ１−１）を、抗体と薬物（例えば、ＤＭ１またはＤＭ４）
とを含む混合物に添加する（それによって、抗体と薬物とを含む混合物を接触させる）。
一態様では、抗体を反応容器中に提供し、抗体を容器に提供する直後に、薬物（例えば、
ＤＭ１またはＤＭ４）を反応容器に添加する。別の態様では、抗体を反応容器中に提供し
、抗体を容器に提供した後の時間間隔後（例えば、細胞結合剤を空間に提供した後約５分
、約１０分、約２０分、約３０分、約４０分、約５０分、約１時間、約１日以上後）に、
薬物（例えば、ＤＭ１またはＤＭ４）を反応容器に添加する。薬物（例えば、ＤＭ１また
はＤＭ４）を、迅速に（すなわち、約５分、約１０分などの短い時間間隔以内に）または
ゆっくりと（ポンプを使用するなど）添加することができる。

【0176】

次いで、抗体を薬物（例えば、ＤＭ１もしくはＤＭ４）と接触させた直後に、または抗
体を薬物（例えば、ＤＭ１もしくはＤＭ４）と接触させた後のいくらか後の時点で（例え
ば、約５分〜約８時間以上）、抗体と薬物（例えば、ＤＭ１またはＤＭ４）を含む混合物
を、架橋剤（例えば、ＳＭＣＣ、スルホ−ＳＭＣＣ、ＳＰＤＢ、スルホ−ＳＰＤＢまたは
ＣＸ１−１）と接触させることができる。例えば、一態様では、抗体を含む反応容器への
薬物（例えば、ＤＭ１またはＤＭ４）の添加の直後に、架橋剤（例えば、ＳＭＣＣ、スル
ホ−ＳＭＣＣ、ＳＰＤＢ、スルホ−ＳＰＤＢまたはＣＸ１−１）を、抗体と薬物（例えば
、ＤＭ１またはＤＭ４）とを含む混合物に添加する。あるいは、抗体を薬物（例えば、Ｄ
Ｍ１またはＤＭ４）と接触させた後、約５分、約１０分、約２０分、約３０分、約１時間
、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間、約８時間以上で、抗
体と薬物（例えば、ＤＭ１またはＤＭ４）とを含む混合物を、架橋剤（例えば、ＳＭＣＣ
、スルホ−ＳＭＣＣ、ＳＰＤＢ、スルホ−ＳＰＤＢまたはＣＸ１−１）と接触させること
ができる。

【0177】

抗体と薬物（例えば、ＤＭ１またはＤＭ４）とを含む混合物を架橋剤（例えば、ＳＭＣ
Ｃ、スルホ−ＳＭＣＣ、ＳＰＤＢ、スルホ−ＳＰＤＢまたはＣＸ１−１）と接触させた後
、反応を約１時間、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間、約
８時間、約９時間、約１０時間、約１１時間、約１２時間、約１３時間、約１４時間、約
１５時間、約１６時間、約１７時間、約１８時間、約１９時間、約２０時間、約２１時間
、約２２時間、約２３時間、約２４時間以上（例えば、約３０時間、約３５時間、約４０
時間、約４５時間、または約４８時間）進行させる。

【0178】

一態様では、１ステッププロセスは、未反応の薬物（例えば、ＤＭ１もしくはＤＭ４）
および／または未反応の架橋剤（例えば、ＳＭＣＣ、スルホ−ＳＭＣＣ、ＳＰＤＢ、スル
ホ−ＳＰＤＢもしくはＣＸ１−１）をクエンチするためのクエンチングステップをさらに
含む。クエンチングステップは、典型的には、コンジュゲートの精製前に行われる。一態
様では、混合物をクエンチング試薬と接触させることにより、混合物をクエンチする。本
明細書で使用される場合、「クエンチング試薬」とは、遊離薬物（例えば、ＤＭ１もしく
はＤＭ４）および／または架橋剤（例えば、ＳＭＣＣ、スルホ−ＳＭＣＣ、ＳＰＤＢ、ス
ルホ−ＳＰＤＢまたはＣＸ１−１）と反応する試薬を指す。一態様では、４−マレイミド
酪酸、３−マレイミドプロピオン酸、Ｎ−エチルマレイミド、ヨードアセトアミド、また
はヨードアセトアミドプロピオン酸などのマレイミドまたはハロアセトアミドクエンチン
グ試薬を使用して、薬物（例えば、ＤＭ１またはＤＭ４）中の任意の未反応の基（チオー
ルなど）がクエンチされたことを確保することができる。クエンチングステップは、薬物
（例えば、ＤＭ１）の二量体化を防止するのに役立ち得る。二量体化したＤＭ１は、除去
するのが困難であり得る。極性の荷電したチオールクエンチング試薬（４−マレイミド酪
酸または３−マレイミドプロピオン酸など）を使用するクエンチングの際に、過剰の未反
応のＤＭ１は、精製ステップの間に共有的に連結したコンジュゲートから容易に分離する
ことができる極性の荷電した水溶性付加物に変換される。非極性および中性チオールクエ
ンチング試薬を使用するクエンチングを使用することもできる。一態様では、混合物を、
未反応の架橋剤（例えば、ＳＭＣＣ、スルホ−ＳＭＣＣ、ＳＰＤＢ、スルホ−ＳＰＤＢま
たはＣＸ１−１）と反応するクエンチング試薬と接触させることにより、混合物をクエン
チする。例えば、求核試薬を混合物に添加して、任意の未反応のＳＭＣＣをクエンチする
ことができる。好ましくは、求核試薬は、リシン、タウリンおよびヒドロキシルアミンな
どの、アミノ基含有求核試薬である。

【0179】

別の態様では、反応（すなわち、抗体を、薬物（例えば、ＤＭ１またはＤＭ４）、次い
で、架橋剤（例えば、ＳＭＣＣ、スルホ−ＳＭＣＣ、ＳＰＤＢ、スルホ−ＳＰＤＢまたは
ＣＸ１−１）と接触させること）を、混合物をクエンチング試薬と接触させた後、完了ま
で進行させる。これに関して、抗体と薬物（例えば、ＤＭ１またはＤＭ４）とを含む混合
物を架橋剤（例えば、ＳＭＣＣ、スルホ−ＳＭＣＣ、ＳＰＤＢ、スルホ−ＳＰＤＢまたは
ＣＸ１−１）と接触させた後、クエンチング試薬を約１時間〜約４８時間（例えば、約１
時間、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間、約８時間、約９
時間、約１０時間、約１１時間、約１２時間、約１３時間、約１４時間、約１５時間、約
１６時間、約１７時間、約１８時間、約１９時間、約２０時間、約２１時間、約２２時間
、約２３時間、約２４時間または約２５時間〜約４８時間）混合物に添加する。

【0180】

あるいは、混合物のｐＨを約５．０（例えば、４．８、４．９、５．０、５．１または
５．２）に低下させることにより、混合物をクエンチする。別の態様では、ｐＨを６．０
未満、５．５未満、５．０未満、４．８未満、４．６未満、４．４未満、４．２未満、４
．０未満に低下させることにより、混合物をクエンチする。あるいは、ｐＨを、約４．０
（例えば、３．８、３．９、４．０、４．１または４．２）〜約６．０（例えば、５．８
、５．９、６．０、６．１または６．２）、約４．０〜約５．０、約４．５（例えば、４
．３、４．４、４．５、４．６または４．７）〜約５．０に低下させる。一態様では、混
合物のｐＨを４．８に低下させることにより、混合物をクエンチする。別の態様では、混
合物のｐＨを５．５に低下させることにより、混合物をクエンチする。

【0181】

一態様では、１ステッププロセスは、不安定に結合したリンカーを抗体から遊離させる
ための保持ステップをさらに含む。保持ステップは、コンジュゲートの精製前（例えば、
反応ステップの後、反応ステップとクエンチングステップの間、またはクエンチングステ
ップの後）に混合物を保持することを含む。例えば、プロセスは、（ａ）抗体を薬物（例
えば、ＤＭ１またはＤＭ４）と接触させて、抗体と薬物（例えば、ＤＭ１またはＤＭ４）
とを含む混合物を形成させるステップ；次いで、約４〜約９のｐＨを有する溶液中で、抗
体と薬物（例えば、ＤＭ１またはＤＭ４）とを含む混合物を、架橋剤（例えば、ＳＭＣＣ
、スルホ−ＳＭＣＣ、ＳＰＤＢ、スルホ−ＳＰＤＢまたはＣＸ１−１）と接触させて、（
ｉ）コンジュゲート（例えば、Ａｂ−ＭＣＣ−ＤＭ１、Ａｂ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４またはＡ
ｂ−ＣＸ１−１−ＤＭ１）、（ｉｉ）遊離薬物（例えば、ＤＭ１またはＤＭ４）、および
（ｉｉｉ）反応副生成物を含む混合物を提供するステップ、（ｂ）ステップ（ａ）で調製
された混合物を保持して、不安定に結合したリンカーを細胞結合剤から遊離させるステッ
プ、ならびに（ｃ）混合物を精製して、精製されたコンジュゲートを提供するステップを
含む。

【0182】

別の態様では、プロセスは、（ａ）抗体を薬物（例えば、ＤＭ１またはＤＭ４）と接触
させて、抗体と薬物（例えば、ＤＭ１またはＤＭ４）とを含む混合物を形成させるステッ
プ；次いで、約４〜約９のｐＨを有する溶液中で、抗体と薬物（例えば、ＤＭ１またはＤ
Ｍ４）とを含む混合物を、架橋剤（例えば、ＳＭＣＣ、スルホ−ＳＭＣＣ、ＳＰＤＢ、ス
ルホ−ＳＰＤＢまたはＣＸ１−１）と接触させて、（ｉ）コンジュゲート、（ｉｉ）遊離
薬物（例えば、ＤＭ１またはＤＭ４）、および（ｉｉｉ）反応副生成物を含む混合物を提
供するステップ、（ｂ）ステップ（ａ）で調製された混合物をクエンチして、任意の未反
応の薬物（例えば、ＤＭ１もしくはＤＭ４）および／または未反応の架橋剤（例えば、Ｓ
ＭＣＣ、スルホ−ＳＭＣＣ、ＳＰＤＢ、スルホ−ＳＰＤＢまたはＣＸ１−１）をクエンチ
するステップ、（ｃ）ステップ（ｂ）で調製された混合物を保持して、不安定に結合した
リンカーを細胞結合剤から遊離させるステップ、ならびに（ｄ）混合物を精製して、精製
されたコンジュゲート（例えば、Ａｂ−ＭＣＣ−ＤＭ１、Ａｂ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４または
Ａｂ−ＣＸ１−１−ＤＭ１）を提供するステップを含む。

【0183】

あるいは、保持ステップを、コンジュゲートの精製後に実施した後、さらなる精製ステ
ップを行うことができる。

【0184】

別の態様では、保持ステップの前に反応を完了まで進行させる。これに関して、保持ス
テップを、抗体と薬物（例えば、ＤＭ１またはＤＭ４）とを含む混合物を架橋剤（例えば
、ＳＭＣＣ、スルホ−ＳＭＣＣ、ＳＰＤＢ、スルホ−ＳＰＤＢまたはＣＸ１−１）と接触
させた後、約１時間〜約４８時間（例えば、約１時間、約２時間、約３時間、約４時間、
約５時間、約６時間、約７時間、約８時間、約９時間、約１０時間、約１１時間、約１２
時間、約１３時間、約１４時間、約１５時間、約１６時間、約１７時間、約１８時間、約
１９時間、約２０時間、約２１時間、約２２時間、約２３時間、約２４時間または約２４
時間〜約４８時間）実施することができる。

【0185】

保持ステップは、好適な期間（例えば、約１時間〜約１週間、約１時間〜約２４時間、
約１時間〜約８時間、または約１時間〜約４時間）にわたって好適な温度（例えば、約０
℃〜約３７℃）で溶液を維持して、安定に結合したリンカーを抗体から実質的に遊離させ
ないが、不安定に結合したリンカーを抗体から遊離させることを含む。一態様では、保持
ステップは、約２０℃以下（例えば、約０℃〜約１８℃、約４℃〜約１６℃）、室温（例
えば、約２０℃〜約３０℃もしくは約２０℃〜約２５℃）、または高温（例えば、約３０
℃〜約３７℃）で溶液を維持することを含む。一態様では、保持ステップは、約１６℃〜
約２４℃（例えば、約１５℃、約１６℃、約１７℃、約１８℃、約１９℃、約２０℃、約
２１℃、約２２℃、約２３℃、約２４℃、または約２５℃）の温度で溶液を維持すること
を含む。別の態様では、保持ステップは、約２℃〜約８℃（例えば、約０℃、約１℃、約
２℃、約３℃、約４℃、約５℃、約６℃、約７℃、約８℃、約９℃、または約１０℃）の
温度で溶液を維持することを含む。別の態様では、保持ステップは、約３７℃（例えば、
約３４℃、約３５℃、約３６℃、約３７℃、約３８℃、約３９℃、または約４０℃）の温
度で溶液を維持することを含む。

【0186】

保持ステップの持続期間は、保持ステップが行われる温度およびｐＨに依存する。例え
ば、保持ステップの持続期間は、高温で保持ステップを行うことにより実質的に減少させ
ることができ、その最大温度は細胞結合剤−細胞毒性剤コンジュゲートの安定性によって
制限される。保持ステップは、約１時間〜約１日（例えば、約１時間、約２時間、約３時
間、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間、約８時間、約９時間、約１０時間、約１
２時間、約１４時間、約１６時間、約１８時間、約２０時間、約２２時間、または約２４
時間）、約１０時間〜約２４時間、約１２時間〜約２４時間、約１４時間〜約２４時間、
約１６時間〜約２４時間、約１８時間〜約２４時間、約２０時間〜約２４時間、約５時間
〜約１週間、約２０時間〜約１週間、約１２時間〜約１週間（例えば、約１２時間、約１
６時間、約２０時間、約２４時間、約２日、約３日、約４日、約５日、約６日、または約
７日）または約１日〜約１週間にわたって溶液を維持することを含んでもよい。

【0187】

一態様では、保持ステップは、少なくとも約１２時間から最大で１週間までの期間にわ
たって約２℃〜約８℃の温度で溶液を維持することを含む。別の態様では、保持ステップ
は、一晩（例えば、約１２〜約２４時間、好ましくは、約２０時間）、約２℃〜約８℃の
温度で溶液を維持することを含む。

【0188】

保持ステップのためのｐＨ値は、好ましくは、約４〜約１０である。一態様では、保持
ステップのためのｐＨ値は、約４以上であるが、約６未満である（例えば、４〜５．９）
か、または約５以上であるが、約６未満である（例えば、５〜５．９）。別の態様では、
保持ステップのためのｐＨ値は、約６〜約１０の範囲（例えば、約６．５〜約９、約６〜
約８）である。例えば、保持ステップのためのｐＨ値は、約６、約６．５、約７、約７．
５、約８、約８．５、約９、約９．５、または約１０であってもよい。

【0189】

他の態様では、保持ステップは、約１２時間〜約１週間にわたって、約６〜７．５のｐ
Ｈで２５℃で混合物をインキュベートすること、約５時間〜約５日間にわたって、約４．
５〜５．９のｐＨで４℃で混合物をインキュベートすること、または約５時間〜約１日間
にわたって、約４．５〜５．９のｐＨで２５℃で混合物をインキュベートすることを含ん
でもよい。

【0190】

１ステッププロセスは、任意選択で、コンジュゲートの可溶性および回収を増加させる
ための反応ステップへのスクロースの添加を含んでもよい。望ましくは、約０．１％（ｗ
／ｖ）〜約２０％（ｗ／ｖ）（例えば、約０．１％（ｗ／ｖ）、１％（ｗ／ｖ）、５％（
ｗ／ｖ）、１０％（ｗ／ｖ）、１５％（ｗ／ｖ）、または２０％（ｗ／ｖ））の濃度でス
クロースを添加する。好ましくは、約１％（ｗ／ｖ）〜約１０％（ｗ／ｖ）（例えば、約
０．５％（ｗ／ｖ）、約１％（ｗ／ｖ）、約１．５％（ｗ／ｖ）、約２％（ｗ／ｖ）、約
３％（ｗ／ｖ）、約４％（ｗ／ｖ）、約５％（ｗ／ｖ）、約６％（ｗ／ｖ）、約７％（ｗ
／ｖ）、約８％（ｗ／ｖ）、約９％（ｗ／ｖ）、約１０％（ｗ／ｖ）、または約１１％（
ｗ／ｖ））の濃度でスクロースを添加する。さらに、反応ステップはまた、緩衝剤の添加
をも含んでもよい。当業界で公知の任意の好適な緩衝剤を使用することができる。好適な
緩衝剤としては、例えば、クエン酸バッファー、酢酸バッファー、コハク酸バッファー、
およびリン酸バッファーが挙げられる。一態様では、緩衝剤は、ＨＥＰＰＳＯ（Ｎ−（２
−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−（２−ヒドロキシプロパンスルホン酸））、Ｐ
ＯＰＳＯ（ピペラジン−１，４−ビス−（２−ヒドロキシ−プロパン−スルホン酸）無水
物）、ＨＥＰＥＳ（４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−エタンスルホン酸）
、ＨＥＰＰＳ（ＥＰＰＳ）（４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−プロパンス
ルホン酸）、ＴＥＳ（Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］−２−アミノエタンス
ルホン酸）、およびその組合せからなる群から選択される。

【0191】

１ステッププロセスは、混合物を精製して、精製されたコンジュゲート（例えば、Ａｂ
−ＭＣＣ−ＤＭ１、Ａｂ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４またはＡｂ−ＣＸ１−１−ＤＭ１）を提供す
るステップをさらに含んでもよい。当業界で公知の任意の精製方法を使用して、本開示の
コンジュゲートを精製することができる。一態様では、本開示のコンジュゲートは、タン
ジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）、非吸着クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィ
ー、吸着濾過、選択的沈降、または任意の他の好適な精製プロセス、ならびにその組合せ
を使用する。別の態様では、コンジュゲートを上記の精製プロセスにかける前に、１また
は複数のＰＶＤＦ膜を通してコンジュゲートを最初に濾過する。あるいは、コンジュゲー
トを上記の精製プロセスにかけた後に、１または複数のＰＶＤＦ膜を通してコンジュゲー
トを濾過する。例えば、一態様では、コンジュゲートを１または複数のＰＶＤＦ膜を通し
て濾過した後、タンジェンシャルフロー濾過を使用して精製する。あるいは、コンジュゲ
ートをタンジェンシャルフロー濾過を使用して精製した後、１または複数のＰＶＤＦ膜を
通して濾過する。

【0192】

Ｐｅｌｌｉｃｏｎ（登録商標）型システム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ
、ＭＡ）、Ｓａｒｔｏｃｏｎ（登録商標）Ｃａｓｓｅｔｔｅシステム（Ｓａｒｔｏｒｉｕ
ｓ ＡＧ、Ｅｄｇｅｗｏｏｄ、ＮＹ）、およびＣｅｎｔｒａｓｅｔｔｅ（登録商標）型シ
ステム（Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐ．、Ｅａｓｔ Ｈｉｌｌｓ、ＮＹ）などの、任意の好適なＴ
ＦＦシステムを精製のために使用することができる。

【0193】

任意の好適な吸着クロマトグラフィー樹脂を、精製のために使用することができる。好
ましい吸着クロマトグラフィー樹脂としては、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー
、疎水性電荷誘導クロマトグラフィー（ＨＣＩＣ）、疎水性相互作用クロマトグラフィー
（ＨＩＣ）、イオン交換クロマトグラフィー、混合様式イオン交換クロマトグラフィー、
固定化金属親和性クロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）、染料リガンドクロマトグラフィー、
親和性クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、およびその組合せが挙げられる。
好適なヒドロキシアパタイト樹脂の例としては、セラミックヒドロキシアパタイト（ＣＨ
Ｔ Ｔｙｐｅ ＩおよびＴｙｐｅ ＩＩ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、
Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）、ＨＡ Ｕｌｔｒｏｇｅｌ（登録商標）ヒドロキシアパタイト
（Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐ．、Ｅａｓｔ Ｈｉｌｌｓ、ＮＹ）、およびセラミックフルオロア
パタイト（ＣＦＴ Ｔｙｐｅ ＩおよびＴｙｐｅ ＩＩ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）が挙げられる。好適なＨＣＩＣ樹脂の例は、Ｍ
ＥＰ Ｈｙｐｅｒｃｅｌ（登録商標）樹脂（Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐ．、Ｅａｓｔ Ｈｉｌｌ
ｓ、ＮＹ）である。好適なＨＩＣ樹脂の例としては、ブチル−セファロース、ヘキシル−
セファロース、フェニル−セファロース、およびオクチルセファロース樹脂（全てＧＥ
Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪから）、ならびにＭａｃｒｏ−ｐｒ
ｅｐ（登録商標）メチルおよびＭａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ（登録商標）ｔ−ブチル樹脂（Ｂｉ
ｏｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）が挙げられる。好適な
イオン交換樹脂の例としては、ＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）、ＣＭ−Ｓｅｐｈ
ａｒｏｓｅ（登録商標）、およびＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）樹脂（全てＧＥ
Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪから）、ならびにＵｎｏｓｐｈｅｒ
ｅ（登録商標）Ｓ樹脂（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ
、ＣＡ）が挙げられる。好適な混合様式イオン交換体の例としては、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ
（登録商標）ＡＢｘ樹脂（ＪＴ Ｂａｋｅｒ、Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ、ＮＪ）が挙げ
られる。好適なＩＭＡＣ樹脂の例としては、Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（
登録商標）樹脂（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）およびＰ
ｒｏｆｉｎｉｔｙ（登録商標）ＩＭＡＣ樹脂（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅ
ｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）が挙げられる。好適な染料リガンド樹脂の例としては、ブ
ルーセファロース樹脂（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）お
よびＡｆｆｉ−ｇｅｌブルー樹脂（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒ
ｃｕｌｅｓ、ＣＡ）が挙げられる。好適な親和性樹脂の例としては、プロテインＡセファ
ロース樹脂（例えば、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔ
ａｗａｙ、ＮＪ）および抗体が適切なレクチン結合部位を担持する、レクチン親和性樹脂
、例えば、Ｌｅｎｔｉｌ Ｌｅｃｔｉｎ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）樹脂（ＧＥ
Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）が挙げられる。好適な逆相樹脂の
例としては、Ｃ４、Ｃ８、およびＣ１８樹脂（Ｇｒａｃｅ Ｖｙｄａｃ、Ｈｅｓｐｅｒｉ
ａ、ＣＡ）が挙げられる。

【0194】

任意の好適な非吸着クロマトグラフィー樹脂を、精製のために使用することができる。
好適な非吸着クロマトグラフィー樹脂の例としては、限定されるものではないが、ＳＥＰ
ＨＡＤＥＸ（商標）Ｇ−２５、Ｇ−５０、Ｇ−１００、ＳＥＰＨＡＣＲＹＬ（商標）樹脂
（例えば、Ｓ−２００およびＳ−３００）、ＳＵＰＥＲＤＥＸ（商標）樹脂（例えば、Ｓ
ＵＰＥＲＤＥＸ（商標）７５およびＳＵＰＥＲＤＥＸ（商標）２００）、ＢＩＯ−ＧＥＬ
（登録商標）樹脂（例えば、Ｐ−６、Ｐ−１０、Ｐ−３０、Ｐ−６０、およびＰ−１００
）、ならびに当業者には公知の他のものが挙げられる。

【0195】

２ステッププロセスおよび１ポットプロセス
一態様では、本開示のコンジュゲートを、米国特許第７，８１１，５７２号および米国
特許出願公開第２００６／０１８２７５０号に記載のように調製することができる。この
プロセスは、（ａ）本開示の抗体を、架橋剤（例えば、ＳＭＣＣ、スルホ−ＳＭＣＣ、Ｓ
ＰＤＢ、スルホ−ＳＰＤＢまたはＣＸ１−１）と接触させて、リンカー（すなわち、Ａｂ
−ＳＭＣＣ、Ａｂ−ＳＰＤＢまたはＡｂ−ＣＸ１−１）を抗体に共有結合させることによ
って、リンカーが結合した抗体を含む第１の混合物を調製するステップ；（ｂ）任意選択
で、第１の混合物を精製プロセスにかけて、リンカーが結合した抗体の精製された第１の
混合物を調製するステップ；（ｃ）約４〜約９のｐＨを有する溶液中で、リンカーが結合
した抗体を薬物（例えば、ＤＭ１またはＤＭ４）と反応させることにより、薬物（例えば
、ＤＭ１またはＤＭ４）を、第１の混合物中のリンカーが結合した抗体にコンジュゲート
して、（ｉ）コンジュゲート（例えば、Ａｂ−ＭＣＣ−ＤＭ１、Ａｂ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４
またはＡｂ−ＣＸ１−１−ＤＭ１）、（ｉｉ）遊離薬物（例えば、ＤＭ１またはＤＭ４）
；および（ｉｉｉ）反応副生成物を含む第２の混合物を調製するステップ；ならびに（ｄ
）第２の混合物を精製プロセスにかけて、第２の混合物の他の成分からコンジュゲートを
精製するステップを含む。あるいは、精製ステップ（ｂ）を省略してもよい。本明細書に
記載の任意の精製方法を、ステップ（ｂ）および（ｄ）のために使用することができる。
一実施形態では、ＴＦＦをステップ（ｂ）と（ｄ）の両方のために使用する。別の実施形
態では、ＴＦＦをステップ（ｂ）のために使用し、吸着クロマトグラフィー（例えば、Ｃ
ＨＴ）をステップ（ｄ）のために使用する。

【0196】

１ステップ試薬およびｉｎ ｓｉｔｕプロセス
一態様では、米国特許第６，４４１，１６３号および米国特許出願公開第２０１１／０
００３９６９号および第２００８／０１４５３７４号に記載のように、予め形成された薬
物−リンカー化合物（例えば、ＳＭＣＣ−ＤＭ１、スルホ−ＳＭＣＣ−ＤＭ１、ＳＰＤＢ
−ＤＭ４またはＣＸ１−１−ＤＭ１）を、本開示の抗体にコンジュゲートした後、精製ス
テップを行うことにより、本開示のコンジュゲートを調製することができる。本明細書に
記載の任意の精製方法を使用することができる。薬物（例えば、ＤＭ１またはＤＭ４）を
、架橋剤（例えば、ＳＭＣＣ、スルホ−ＳＭＣＣ、ＳＰＤＢ、スルホ−ＳＰＤＢまたはＣ
Ｘ１−１）と反応させることにより、薬物−リンカー化合物を調製する。任意選択で、薬
物−リンカー化合物（例えば、ＳＭＣＣ−ＤＭ１、スルホ−ＳＭＣＣ−ＤＭ１、ＳＰＤＢ
−ＤＭ４またはＣＸ１−１−ＤＭ１）を精製にかけた後、抗体にコンジュゲートする。

【0197】

４．望ましい抗体および抗体薬物コンジュゲートの特性評価および選択
本開示の抗体、抗体断片（例えば、抗原結合性断片）または抗体薬物コンジュゲートを
、当業界で公知の様々なアッセイにより、その物理的／化学的特性および／または生物学
的活性について特性評価し、選択することができる。

【0198】

例えば、本開示の抗体を、ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳ、Ｂｉａｃｏｒｅまたはウェスタンブ
ロットなどの公知の方法により、その抗原結合活性について試験することができる。

【0199】

トランスジェニック動物および細胞系は、腫瘍関連抗原および細胞表面受容体のがん過
剰発現の予防的または治療的処置としての潜在能力を有する抗体薬物コンジュゲート（Ａ
ＤＣ）をスクリーニングするのに特に有用である。有用なＡＤＣのスクリーニングは、ト
ランスジェニック動物に、一定範囲の用量にわたって候補ＡＤＣを投与すること、および
評価される疾患または障害に対するＡＤＣの効果（複数可）について、様々な時点でアッ
セイすることを含んでもよい。あるいは、またはさらに、該当する場合、疾患の誘導因子
への曝露の前に、またはそれと同時に、薬物を投与することができる。候補ＡＤＣを、中
効率または高効率スクリーニング形式の下で、連続的および個々に、または同時にスクリ
ーニングすることができる。

【0200】

一態様は、（ａ）ｃＫＩＴを発現する安定ながん細胞系またはヒト患者腫瘍（例えば、
ＧＩＳＴ細胞系または腫瘍断片、メラノーマ細胞系または腫瘍断片、ＡＭＬ一次細胞）を
、非ヒト動物に移植すること、（ｂ）ＡＤＣ薬物候補を非ヒト動物に投与すること、およ
び（ｃ）移植された細胞系からの腫瘍の成長を阻害する候補の能力を決定することを含む
スクリーニング方法である。本開示はまた、（ａ）ｃＫＩＴを発現する安定ながん細胞系
に由来する細胞を、薬物候補と接触させること、および（ｂ）安定な細胞系の成長を阻害
するＡＤＣ候補の能力を評価することを含む、ｃＫＩＴの過剰発現を特徴とする疾患また
は障害の処置のためのＡＤＣ候補をスクリーニングする方法も包含する。

【0201】

別の態様は、（ａ）ｃＫＩＴを発現する安定ながん細胞系に由来する細胞を、ＡＤＣ薬
物候補と接触させること、および（ｂ）ｃＫＩＴのリガンド活性化を遮断するＡＤＣ候補
の能力を評価することを含むスクリーニング方法である。別の態様では、リガンドにより
刺激されたチロシンリン酸化を遮断するＡＤＣ候補の能力を評価する。

【0202】

さらなる態様は、（ａ）ｃＫＩＴを発現する安定ながん細胞系に由来する細胞を、ＡＤ
Ｃ薬物候補と接触させること、および（ｂ）細胞死を誘導するＡＤＣ候補の能力を評価す
ることを含むスクリーニング方法である。一態様では、アポトーシスを誘導するＡＤＣ候
補の能力を評価する。

【0203】

一定範囲の用量にわたってトランスジェニック動物に投与し、化合物に対する動物の生
理学的応答を経時的に評価することにより、候補ＡＤＣをスクリーニングすることができ
る。いくつかの場合、化合物を、化合物の効果を増強するコファクターと共に投与するこ
とが適切であり得る。対象トランスジェニック動物から誘導される細胞系を使用して、ｃ
ＫＩＴの過剰発現と関連する様々な障害を処置するのに有用なＡＤＣについてスクリーニ
ングする場合、適切な時間に試験ＡＤＣを細胞培養培地に添加し、ＡＤＣに対する細胞応
答を、適切な生化学的および／または組織学的アッセイを使用して経時的に評価する。

【0204】

かくして、本開示は、腫瘍細胞上のｃＫＩＴ、およびｃＫＩＴ過剰発現を特異的に標的
化し、これに結合するＡＤＣを同定するためのアッセイを提供する。

【0205】

ｃＫＩＴ抗体
本開示は、ヒトｃＫＩＴに特異的に結合する抗体または抗体断片（例えば、抗原結合性
断片）を提供する。本開示の抗体または抗体断片（例えば、抗原結合性断片）としては、
限定されるものではないが、以下の実施例に記載のように単離された、ヒトモノクローナ
ル抗体またはその断片が挙げられる。

【0206】

ある特定の態様では、本開示は、ｃＫＩＴに特異的に結合する抗体または抗体断片（例
えば、抗原結合性断片）であって、配列番号９、２８、４６、６４、８２、１００、１１
８または１３６に記載のアミノ酸配列を有するＶＨドメインを含む、前記抗体または抗体
断片（例えば、抗原結合性断片）（表１）を提供する。本開示はまた、ｃＫＩＴに特異的
に結合する抗体または抗体断片（例えば、抗原結合性断片）であって、表１に列挙される
ＶＨ ＣＤＲのいずれか１つのアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲを含む、前記抗体また
は抗体断片（例えば、抗原結合性断片）も提供する。特定の態様では、本開示は、ｃＫＩ
Ｔに特異的に結合する抗体または抗体断片（例えば、抗原結合性断片）であって、以下の
表１に列挙されるＶＨ ＣＤＲのいずれかのアミノ酸配列を有する１、２、３、４、５以
上のＶＨ ＣＤＲを含む（またはあるいは、からなる）前記抗体を提供する。

【0207】

本開示は、ｃＫＩＴに特異的に結合する抗体または抗体断片（例えば、抗原結合性断片
）であって、配列番号１８、３７、５５、７３、９１、１０９、１２７または１４５のア
ミノ酸配列を有するＶＬドメインを含む前記抗体または抗体断片（例えば、抗原結合性断
片）（表１）を提供する。本開示はまた、ｃＫＩＴに特異的に結合する抗体または抗体断
片（例えば、抗原結合性断片）であって、以下の表１に列挙されるＶＬ ＣＤＲのいずれ
か１つのアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲを含む、前記抗体または抗体断片（例えば、
抗原結合性断片）も提供する。特に、ｃＫＩＴに特異的に結合する抗体または抗体断片（
例えば、抗原結合性断片）であって、表１に列挙されるＶＬ ＣＤＲのいずれかのアミノ
酸配列を有する１、２、３以上のＶＬ ＣＤＲを含む（またはあるいは、からなる）前記
抗体または抗体断片（例えば、抗原結合性断片）を提供する。

【0208】

本開示の他の抗体または抗体断片（例えば、抗原結合性断片）は、変異しているが、表
１に記載の配列に記載のＣＤＲ領域と、ＣＤＲ領域において少なくとも６０、７０、８０
、９０または９５パーセントの同一性を有するアミノ酸を含む。いくつかの態様では、そ
れは、表１に記載の配列に記載のＣＤＲ領域と比較した場合、１、２、３、４または５個
以下のアミノ酸がＣＤＲ領域中で変異しているアミノ酸配列変異体を含む。

【0209】

本開示はまた、ｃＫＩＴに特異的に結合する抗体のＶＨ、ＶＬ、完全長重鎖、および完
全長軽鎖をコードする核酸配列も提供する。そのような核酸配列を、哺乳動物細胞中での
発現のために最適化することができる。

【0210】

【表1】

【0211】

本開示の他の抗体としては、アミノ酸またはアミノ酸をコードする核酸が変異している
が、表１に記載の配列に対する少なくとも６０、７０、８０、９０または９５パーセント
の同一性を有するものが挙げられる。いくつかの態様では、それは、表１に記載の配列に
記載の可変領域と比較した場合、１、２、３、４または５個以下のアミノ酸が可変領域中
で変異しているが、実質的に同じ治療活性を保持するアミノ酸配列変異体を含む。

【0212】

これらの抗体はそれぞれｃＫＩＴに結合することができるため、ＶＨ、ＶＬ、完全長軽
鎖、および完全長重鎖配列（アミノ酸配列およびアミノ酸配列をコードするヌクレオチド
配列）を「混合および一致」させて、他のｃＫＩＴ結合抗体を作出することができる。そ
のような「混合および一致」したｃＫＩＴ結合抗体を、当業界で公知の結合アッセイ（例
えば、ＥＬＩＳＡ、および実施例のセクションに記載の他のアッセイ）を使用して試験す
ることができる。これらの鎖を混合および一致させる場合、特定のＶＨ／ＶＬ対に由来す
るＶＨ配列を、構造的に類似するＶＨ配列と置き換えるべきである。同様に、特定の完全
長重鎖／完全長軽鎖対に由来する完全長重鎖配列を、構造的に類似する完全長重鎖配列と
置き換えるべきである。同様に、特定のＶＨ／ＶＬ対に由来するＶＬ配列を、構造的に類
似するＶＬ配列と置き換えるべきである。同様に、特定の完全長重鎖／完全長軽鎖対に由
来する完全長軽鎖配列を、構造的に類似する完全長軽鎖配列と置き換えるべきである。従
って、一態様では、本開示は、抗体がｃＫＩＴに特異的に結合する、配列番号９、２８、
４６、６４、８２、１００、１１８または１３６（表１）からなる群から選択されるアミ
ノ酸配列を含む重鎖可変領域；および配列番号１８、３７、５５、７３、９１、１０９、
１２７または１４５（表１）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を有する単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合領域を提供する。

【0213】

別の態様では、本開示は、（ｉ）配列番号１１、２９、４７、６５、８３、１０１、１
１９、もしくは１３７からなる群から選択される哺乳動物細胞中での発現のために最適化
されたアミノ酸配列を含む完全長重鎖；および配列番号２０、２１、３８、５６、７４、
９２、１１０、１２８もしくは１４６からなる群から選択される哺乳動物細胞中での発現
のために最適化されたアミノ酸配列を含む完全長軽鎖を有する単離されたモノクローナル
抗体；または（ｉｉ）その抗原結合ポーションを含む機能的タンパク質を提供する。

【0214】

別の態様では、本開示は、表１に記載の重鎖および軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤ
Ｒ３、またはその組合せを含むｃＫＩＴ結合抗体を提供する。抗体のＶＨ ＣＤＲ１のア
ミノ酸配列を、配列番号３、２２、４０、５８、７６、９４、１１２および１３０に示す
。抗体のＶＨ ＣＤＲ２のアミノ酸配列を、配列番号４、２３、４１、５９、７７、９５
、１１３および１３１に示す。抗体のＶＨ ＣＤＲ３のアミノ酸配列を、配列番号５、２
４、４２、６０、７８、９６、１１４および１３２に示す。抗体のＶＬ ＣＤＲ１のアミ
ノ酸配列を、配列番号１２、３１、４９、６７、８５、１０３、１２１および１３９に示
す。抗体のＶＬ ＣＤＲ２のアミノ酸配列を、配列番号１３、３２、５０、６８、８６、
１０４、１２２および１４０に示す。抗体のＶＬ ＣＤＲ３のアミノ酸配列を、配列番号
１４、３３、５１、６９、８７、１０５、１２３および１４１に示す。

【0215】

これらの抗体がそれぞれｃＫＩＴに結合することができ、抗原結合特異性が主にＣＤＲ
１、２および３領域によって提供されることを考慮して、ＶＨ ＣＤＲ１、２および３配
列と、ＶＬ ＣＤＲ１、２および３配列とを、「混合および一致」させることができる（
すなわち、異なる抗体に由来するＣＤＲを混合および一致させることができるが、それぞ
れの抗体はＶＨ ＣＤＲ１、２および３と、ＶＬ ＣＤＲ１、２および３とを含有し、他
のＣ５結合結合分子を作出しなければならない）。そのような「混合および一致」したｃ
ＫＩＴ結合抗体を、当業界で公知の結合アッセイおよび実施例に記載のアッセイ（例えば
、ＥＬＩＳＡ）を使用して試験することができる。ＶＨ ＣＤＲ配列を混合および一致さ
せる場合、特定のＶＨ配列に由来するＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３配列を
、構造的に類似するＣＤＲ配列（複数可）と置き換えるべきである。同様に、ＶＬ ＣＤ
Ｒ配列を混合および一致させる場合、特定のＶＬ配列に由来するＣＤＲ１、ＣＤＲ２およ
び／またはＣＤＲ３配列を、構造的に類似するＣＤＲ配列（複数可）と置き換えるべきで
ある。新規ＶＨおよびＶＬ配列を、１または複数のＶＨおよび／またはＶＬ ＣＤＲ領域
配列を、本開示のモノクローナル抗体について本明細書に示されるＣＤＲ配列に由来する
構造的に類似する配列と置換することにより、新しいＶＨおよびＶＬ配列を作出すること
ができることが当業者には容易に明らかである。

【0216】

従って、本開示は、抗体がｃＫＩＴに特異的に結合する、配列番号３、２２、４０、５
８、７６、９４、１１２および１３０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖
ＣＤＲ１；配列番号４、２３、４１、５９、７７、９５、１１３および１３１からなる群
から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２；配列番号５、２４、４２、６０、７８
、９６、１１４および１３２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３
；配列番号１２、３１、４９、６７、８５、１０３、１２１および１３９からなる群から
選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１；配列番号１３、３２、５０、６８、８６、
１０４、１２２および１４０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２
；ならびに配列番号１４、３３、５１、６９、８７、１０５、１２３および１４１からな
る群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む、単離されたモノクローナル
抗体またはその抗原結合領域を提供する。

【0217】

特定の態様では、ｃＫＩＴに特異的に結合する抗体または抗体断片（例えば、抗原結合
性断片）は、配列番号３の重鎖ＣＤＲ１、配列番号４の重鎖ＣＤＲ２、配列番号５の重鎖
ＣＤＲ３、配列番号１２の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１３の軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号
１４の軽鎖ＣＤＲ３を含む。

【0218】

特定の態様では、ｃＫＩＴに特異的に結合する抗体または抗体断片（例えば、抗原結合
性断片）は、配列番号２２の重鎖ＣＤＲ１、配列番号２３の重鎖ＣＤＲ２、配列番号２４
の重鎖ＣＤＲ３、配列番号３１の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号３２の軽鎖ＣＤＲ２、および配
列番号３３の軽鎖ＣＤＲ３を含む。

【0219】

特定の態様では、ｃＫＩＴに特異的に結合する抗体または抗体断片（例えば、抗原結合
性断片）は、配列番号４０の重鎖ＣＤＲ１、配列番号４１の重鎖ＣＤＲ２、配列番号４２
の重鎖ＣＤＲ３、配列番号４９の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５０の軽鎖ＣＤＲ２、および配
列番号５１の軽鎖ＣＤＲ３を含む。

【0220】

特定の態様では、ｃＫＩＴに特異的に結合する抗体または抗体断片（例えば、抗原結合
性断片）は、配列番号５８の重鎖ＣＤＲ１、配列番号５９の重鎖ＣＤＲ２、配列番号６０
の重鎖ＣＤＲ３、配列番号６７の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号６８の軽鎖ＣＤＲ２、および配
列番号６９の軽鎖ＣＤＲ３を含む。

【0221】

特定の態様では、ｃＫＩＴに特異的に結合する抗体または抗体断片（例えば、抗原結合
性断片）は、配列番号７６の重鎖ＣＤＲ１、配列番号７７の重鎖ＣＤＲ２、配列番号７８
の重鎖ＣＤＲ３、配列番号８５の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号８６の軽鎖ＣＤＲ２、および配
列番号８７の軽鎖ＣＤＲ３を含む。

【0222】

特定の態様では、ｃＫＩＴに特異的に結合する抗体または抗体断片（例えば、抗原結合
性断片）は、配列番号９４の重鎖ＣＤＲ１、配列番号９５の重鎖ＣＤＲ２、配列番号９６
の重鎖ＣＤＲ３、配列番号１０３の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１０４の軽鎖ＣＤＲ２、およ
び配列番号１０５の軽鎖ＣＤＲ３を含む。

【0223】

特定の態様では、ｃＫＩＴに特異的に結合する抗体または抗体断片（例えば、抗原結合
性断片）は、配列番号１１２の重鎖ＣＤＲ１、配列番号１１３の重鎖ＣＤＲ２、配列番号
１１４の重鎖ＣＤＲ３、配列番号１２１の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１２２の軽鎖ＣＤＲ２
、および配列番号１２３の軽鎖ＣＤＲ３を含む。

【0224】

特定の態様では、ｃＫＩＴに特異的に結合する抗体または抗体断片（例えば、抗原結合
性断片）は、配列番号１３０の重鎖ＣＤＲ１、配列番号１３１の重鎖ＣＤＲ２、配列番号
１３２の重鎖ＣＤＲ３、配列番号１３９の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１４０の軽鎖ＣＤＲ２
、および配列番号１４１の軽鎖ＣＤＲ３を含む。

【0225】

ある特定の態様では、ｃＫＩＴに特異的に結合する抗体は、表１に記載される抗体また
は抗体断片（例えば、抗原結合性断片）である。

【0226】

１．エピトープおよび同エピトープに結合する抗体の同定
本開示は、ｃＫＩＴ受容体の細胞外ドメイン内のエピトープに結合する抗体および抗体
断片（例えば、抗原結合性断片）を提供する。ある特定の態様では、抗体および抗体断片
は、ｃＫＩＴ細胞外ドメインのドメイン１〜３を含むエピトープに結合することができる
。

【0227】

本開示はまた、表１に記載の抗ｃＫＩＴ抗体と同じエピトープに結合する抗体および抗
体断片（例えば、抗原結合性断片）も提供する。従って、さらなる抗体および抗体断片（
例えば、抗原結合性断片）を、ｃＫＩＴ結合アッセイにおいて他の抗体と交差競合する（
例えば、統計的に有意な様式で、その結合を競合的に阻害する）その能力に基づいて同定
することができる。ｃＫＩＴタンパク質（例えば、ヒトｃＫＩＴ）への本開示の抗体およ
び抗体断片（例えば、抗原結合性断片）の結合を阻害する試験抗体の能力は、試験抗体が
ｃＫＩＴへの結合について抗体または抗体断片（例えば、抗原結合性断片）と競合するこ
とができることを示す；そのような抗体は、非限定的理論によれば、それが競合する抗体
または抗体断片（例えば、抗原結合性断片）と、ｃＫＩＴタンパク質上の同じか、または
関連する（例えば、構造的に類似するか、または空間的に近い）エピトープに結合するこ
とができる。ある特定の態様では、本開示の抗体または抗体断片（例えば、抗原結合性断
片）と同じｃＫＩＴ上のエピトープに結合する抗体は、ヒトまたはヒト化モノクローナル
抗体である。そのようなヒトまたはヒト化モノクローナル抗体を、本明細書に記載のよう
に調製および単離することができる。

【0228】

２．Ｆｃ領域のフレームワークのさらなる変化
本開示は、部位特異的標識イムノコンジュゲートを提供する。これらのイムノコンジュ
ゲートは、例えば、抗体の特性を改善するための、ＶＨおよび／またはＶＬ内のフレーム
ワーク残基に対する改変をさらに含む改変された抗体またはその抗原結合性断片を含んで
もよい。典型的には、そのようなフレームワーク改変を行って、抗体の免疫原性を低下さ
せる。例えば、１つの手法は、１または複数のフレームワーク残基を、対応する生殖系列
配列に「復帰変異」させることである。より特には、体細胞変異を受けた抗体は、抗体が
誘導される生殖系列配列とは異なるフレームワーク残基を含有してもよい。抗体フレーム
ワーク配列を、抗体が誘導される生殖系列配列と比較することにより、そのような残基を
同定することができる。フレームワーク領域配列をその生殖系列構成に戻すために、例え
ば、部位特異的突然変異誘発により、体細胞変異を生殖系列配列に「復帰変異」させるこ
とができる。そのような「復帰変異」した抗体もまた、包含されることが意図される。

【0229】

別の型のフレームワーク改変は、フレームワーク領域内、またはさらには、１もしくは
複数のＣＤＲ領域内の１または複数の残基を変異させて、Ｔ細胞エピトープを除去するこ
とによって、抗体の潜在的な免疫原性を低下させることを含む。この手法はまた、「脱免
疫化」とも呼ばれ、Carr et al.による米国特許出願公開第２００３／０１５３０４３号
にさらに詳細に記載されている。

【0230】

フレームワークまたはＣＤＲ領域内で作製される改変に加えて、またはその代わりに、
Ｆｃ領域内に改変を含む、典型的には、血清半減期、補体固定化、Ｆｃ受容体結合、およ
び／または抗原依存的細胞性細胞毒性などの、抗体の１または複数の機能的特性を変化さ
せるように、抗体を操作することができる。さらに、抗体を化学的に改変する（例えば、
１もしくは複数の化学的部分を抗体に結合することができる）か、または改変してそのグ
リコシル化を変化させ、再度、抗体の１または複数の機能的特性を変化させることができ
る。これらの態様はそれぞれ、以下にさらに詳細に記載される。

【0231】

一態様では、ヒンジ領域中のシステイン残基の数が変化する、例えば、増加するか、ま
たは減少するように、ＣＨ１のヒンジ領域を改変する。この手法は、Bodmer et al.によ
る米国特許第５，６７７，４２５号にさらに記載されている。ＣＨ１のヒンジ領域中のシ
ステイン残基の数を変化させて、例えば、軽鎖および重鎖の集合を容易にするか、または
抗体の安定性を増加もしくは減少させる。

【0232】

別の態様では、抗体のＦｃヒンジ領域を変異させて、抗体の生物学的半減期を減少させ
る。より特には、抗体が天然のＦｃ−ヒンジドメインＳｐＡ結合と比較して弱いスタフィ
ロコッカス（Staphylococcyl）タンパク質Ａ（ＳｐＡ）結合を有するように、１または複
数のアミノ酸変異をＦｃ−ヒンジ断片のＣＨ２−ＣＨ３ドメイン境界領域中に導入する。
この手法は、Ward et al.による米国特許第６，１６５，７４５号にさらに詳細に記載さ
れている。

【0233】

さらに他の態様では、少なくとも１つのアミノ酸残基を、異なるアミノ酸残基と置き換
えて、抗体のエフェクター機能を変化させることにより、Ｆｃ領域を変化させる。例えば
、抗体がエフェクターリガンドに対する変化した親和性を有するが、親抗体の抗原結合能
力を保持するように、１または複数のアミノ酸を、異なるアミノ酸残基と置き換えること
ができる。親和性を変化させるエフェクターリガンドは、例えば、Ｆｃ受容体または補体
のＣ１成分であってもよい。この手法は、例えば、両方ともWinter et al.による米国特
許第５，６２４，８２１号および第５，６４８，２６０号に記載されている。

【0234】

別の態様では、抗体が変化したＣ１ｑ結合および／または低下した、もしくは無効化さ
れる補体依存的細胞毒性（ＣＤＣ）を有するように、アミノ酸残基から選択される１また
は複数のアミノ酸を、異なるアミノ酸残基と置き換えることができる。

【0235】

別の態様では、１または複数のアミノ酸残基を変化させることによって、補体を固定す
る抗体の能力を変化させる。この手法は、例えば、Bodmer et al.によるＰＣＴ公開第Ｗ
Ｏ９４／２９３５１号に記載されている。特定の態様では、本開示の抗体またはその抗原
結合性断片の１または複数のアミノ酸を、１または複数のアロタイプアミノ酸残基により
、ＩｇＧ１サブクラスおよびカッパアイソタイプに置き換える。アロタイプアミノ酸残基
としては、限定されるものではないが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２およびＩｇＧ３サブクラスの
重鎖の定常領域、ならびにJefferis et al., MAbs. 1:332-338 (2009)により記載された
ようなカッパアイソタイプの軽鎖の定常領域も挙げられる。

【0236】

さらに別の態様では、Ｆｃ領域を改変して、抗体依存的細胞性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を
媒介する抗体の能力を増加させる、および／または１もしくは複数のアミノ酸を改変する
ことによりＦｃγ受容体に対する抗体の親和性を増加させる。この手法は、例えば、Pres
taによるＰＣＴ公開第ＷＯ００／４２０７２号に記載されている。さらに、ＦｃγＲＩ、
ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩおよびＦｃＲｎに対するヒトＩｇＧ１上の結合部位がマッ
ピングされており、結合が改善されたバリアントが記載されている（Shields et al., J.
Biol. Chem. 276:6591-6604, 2001を参照されたい）。

【0237】

さらに別の態様では、抗体のグリコシル化を改変する。例えば、無グリコシル化抗体を
作製することができる（すなわち、抗体はグリコシル化を欠く）。グリコシル化を変化さ
せて、例えば、「抗原」に対する抗体の親和性を増加させることができる。そのような炭
水化物改変を、例えば、抗体配列内の１または複数のグリコシル化部位を変化させること
により達成することができる。例えば、１または複数の可変領域フレームワークグリコシ
ル化部位の除去をもたらす１または複数のアミノ酸置換を作製することによって、その部
位でのグリコシル化を除去することができる。そのような無グリコシル化は、抗原に対す
る抗体の親和性を増加させることができる。そのような手法は、例えば、Co et al.によ
る米国特許第５，７１４，３５０号および第６，３５０，８６１号に記載されている。

【0238】

さらに、またはあるいは、フコシル残基の量が減少した低フコシル化抗体またはバイセ
クテイングＧｌｃＮａｃ構造が増加した抗体などの、変化した型のグリコシル化を有する
抗体を作製することができる。そのような変化したグリコシル化パターンは、抗体のＡＤ
ＣＣ能力を増加させることが証明されている。そのような炭水化物改変を、例えば、グリ
コシル化機構が変化した宿主細胞中で抗体を発現させることにより達成することができる
。グリコシル化機構が変化した細胞は当業界で記載されており、組換え抗体を発現させる
ことによって、グリコシル化が変化した抗体を生成する宿主細胞として使用することがで
きる。例えば、Hang et al.によるＥＰ１，１７６，１９５は、フコシルトランスフェラ
ーゼをコードするＦＵＴ８遺伝子が機能的に破壊された細胞系を記載し、そのような細胞
系中で発現された抗体は低グリコシル化を示す。PrestaによるＰＣＴ公開第ＷＯ０３／０
３５８３５号は、フコースをＡｓｎ（２９７）に連結された炭水化物に結合させる能力が
低下し、その宿主細胞中で発現される抗体の低フコシル化をももたらす、バリアントＣＨ
Ｏ細胞系、Ｌｅｃｌ３細胞を記載している（Shields et al., (2002) J. Biol. Chem. 27
7:26733-26740も参照されたい）。Umama et al.によるＰＣＴ公開第ＷＯ９９／５４３４
２号は、操作された細胞系中で発現される抗体が、抗体のＡＤＣＣ活性の増加をもたらす
バイセクテイングＧｌｃＮａｃ構造の増加を示すように、糖タンパク質改変グリコシルト
ランスフェラーゼ（例えば、ベータ（１，４）−Ｎアセチルグルコサミニルトランスフェ
ラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ））を発現するように操作された細胞系を記載している（Um
ana et al., Nat. Biotech. 17:176-180, 1999も参照されたい）。

【0239】

別の態様では、抗体をその生物学的半減期を増加させるように改変する。様々な手法が
可能である。例えば、Wardの米国特許第６，２７７，３７５号に記載のような、１または
複数の以下の変異を導入することができる：Ｔ２５２Ｌ、Ｔ２５４Ｓ、Ｔ２５６Ｆ。ある
いは、生物学的半減期を増加させるために、Presta et al.による米国特許第５，８６９
，０４６号および第６，１２１，０２２号に記載のように、ＩｇＧのＦｃ領域のＣＨ２ド
メインの２つのループから取られたサルベージ受容体結合エピトープを含有するように、
抗体をＣＨ１またはＣＬ領域内で変化させることができる。

【0240】

抗体のＡＤＣＣ活性を最小化するために、Ｆｃ領域中の特異的変異は、エフェクター細
胞との最小の相互作用を有する「Ｆｃサイレント」抗体をもたらす。一般に、「ＩｇＧ
Ｆｃ領域」を使用して、天然配列Ｆｃ領域およびバリアントＦｃ領域などの、免疫グロブ
リン重鎖のＣ末端領域を定義する。ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は一般に、ＩｇＧ抗体の位置
Ｃ２２６から、または位置Ｐ２３０からカルボキシル末端までのアミノ酸残基を含むと定
義される。Ｆｃ領域中の残基の番号は、ＫａｂａｔのＥＵインデックスのものである。Ｆ
ｃ領域のＣ末端リシン（残基Ｋ４４７）を、例えば、抗体の生成または精製の間に除去す
ることができる。

【0241】

サイレント化されたエフェクター機能は、抗体のＦｃ領域中の変異により取得すること
ができ、当業界で記載されている：ＬＡＬＡおよびＮ２９７Ａ（Strohl, W., 2009, Curr
. Opin. Biotechnol. vol. 20(6):685-691)；ならびにＤ２６５Ａ（Baudino et al., 200
8, J. Immunol. 181 : 6664-69)、Heusser et al., ＷＯ２０１２０６５９５０も参照さ
れたい。サイレントＦｃ ＩｇＧ１抗体の例は、ＩｇＧ１ Ｆｃアミノ酸配列中にＬ２３
４ＡおよびＬ２３５Ａ変異を含むＬＡＬＡ変異体である。サイレントＩｇＧ１抗体の別の
例は、ＤＡＰＡ（Ｄ２６５Ａ、Ｐ３２９Ａ）変異（米国特許第６，７３７，０５６号）で
ある。別のサイレントＩｇＧ１抗体は、Ｎ２９７Ａ変異を含み、無グリコシル化／非グリ
コシル化抗体をもたらす。

【0242】

Ｆｃサイレント抗体は、ＡＤＣＣ活性がないか、または低く、これは、Ｆｃサイレント
抗体が特異的細胞溶解が５０％未満であるＡＤＣＣ活性を示すことを意味し、ＡＤＣＣ活
性がないことは、Ｆｃサイレント抗体が１％未満であるＡＤＣＣ活性（特異的細胞溶解）
を示すことを意味する。

【0243】

３．ｃＫＩＴ抗体の生成
限定されるものではないが、組換え発現、化学的合成、および抗体四量体の酵素的消化
などの、当業界で公知の任意の手段によって抗ｃＫＩＴ抗体およびその抗体断片（例えば
、抗原結合性断片）を生成することができるが、完全長モノクローナル抗体を、例えば、
ハイブリドーマまたは組換え生成によって取得することができる。組換え発現は、当業界
で公知の任意の適切な宿主細胞、例えば、哺乳動物宿主細胞、細菌宿主細胞、酵母宿主細
胞、昆虫宿主細胞などに由来するものであってよい。

【0244】

本開示は、本明細書に記載の抗体をコードするポリヌクレオチド、例えば、本明細書に
記載のような重鎖もしくは軽鎖可変領域または相補性決定領域を含むセグメントをコード
するポリヌクレオチドをさらに提供する。いくつかの態様では、重鎖可変領域をコードす
るポリヌクレオチドは、配列番号３０、４８、６６、８４、１０２、１２０および１３７
からなる群から選択されるポリヌクレオチドとの少なくとも８５％、８９％、９０％、９
１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１０
０％の核酸配列同一性を有する。いくつかの態様では、軽鎖可変領域をコードするポリヌ
クレオチドは、配列番号３９、５７、７５、９３、１１１、１２９および１４７からなる
群から選択されるポリヌクレオチドとの少なくとも８５％、８９％、９０％、９１％、９
２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の核
酸配列同一性を有する。

【0245】

いくつかの態様では、重鎖をコードするポリヌクレオチドは、配列番号３０、４８、６
６、８４、１０２、１２０のポリヌクレオチドとの少なくとも８５％、８９％、９０％、
９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１
００％の核酸配列同一性を有する。いくつかの態様では、軽鎖をコードするポリヌクレオ
チドは、配列番号３９、５７、７５、９３、１１１、１２９および１４７のポリヌクレオ
チドとの少なくとも８５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％
、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の核酸配列同一性を有する。

【0246】

本開示のポリヌクレオチドは、抗ｃＫＩＴ抗体の可変領域配列のみをコードしてもよい
。それらはまた、抗体の可変領域と定常領域との両方をコードしてもよい。いくつかのポ
リヌクレオチド配列は、例示的抗ｃＫＩＴ抗体の１つの重鎖と軽鎖の両方の可変領域を含
むポリペプチドをコードする。いくつかの他のポリヌクレオチドは、マウス抗体の１つの
重鎖と軽鎖の可変領域とそれぞれ実質的に同一である２つのポリペプチドセグメントをコ
ードする。

【0247】

ポリヌクレオチド配列を、抗ｃＫＩＴ抗体またはその結合断片をコードする存在する配
列（例えば、以下の実施例に記載の配列）のｄｅ ｎｏｖｏ固相ＤＮＡ合成によるか、ま
たはＰＣＲ突然変異誘発により生成することができる。Narang et al., Meth. Enzymol.
68:90, 1979のホスホトリエステル法；Brown et al., Meth. Enzymol. 68:109, 1979のホ
スホジエステル法；Beaucage et al., Tetra. Lett., 22:1859, 1981のジエチルホスホロ
アミダイト法；および米国特許第４，４５８，０６６号の固相支持体法などの、当業界で
公知の方法により、核酸の直接化学合成を達成することができる。ＰＣＲによるポリヌク
レオチド配列への変異の導入を、例えば、PCR Technology: Principles and Application
s for DNA Amplification, H.A. Erlich (Ed.), Freeman Press, NY, NY, 1992; PCR Pro
tocols: A Guide to Methods and Applications, Innis et al. (Ed.), Academic Press,
San Diego, CA, 1990; Mattila et al., Nucleic Acids Res. 19:967, 1991; およびEck
ert et al., PCR Methods and Applications 1:17, 1991に記載のように実施することが
できる。

【0248】

また、上記の抗ｃＫＩＴ抗体を生成するための発現ベクターおよび宿主細胞も、本開示
において提供される。様々な発現ベクターを使用して、抗ｃＫＩＴ抗体鎖または結合断片
をコードするポリヌクレオチドを発現させることができる。ウイルスに基づく発現ベクタ
ーと非ウイルス発現ベクターの両方を使用して、哺乳動物宿主細胞中で抗体を生成するこ
とができる。非ウイルスベクターおよび系としては、典型的には、タンパク質またはＲＮ
Ａを発現させるための発現カセットを含む、プラスミド、エピソームベクター、およびヒ
ト人工染色体（例えば、Harrington et al., Nat Genet 15:345, 1997を参照されたい）
が挙げられる。例えば、哺乳動物（例えば、ヒト）細胞中での抗ｃＫＩＴポリヌクレオチ
ドおよびポリペプチドの発現にとって有用な非ウイルスベクターとしては、ｐＴｈｉｏＨ
ｉｓ Ａ、ＢおよびＣ、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｉｓ、ｐＥＢＶＨｉｓＡ、ＢおよびＣ（Ｉ
ｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、ＭＰＳＶベクター、ならびに他のタ
ンパク質を発現させるための当業界で公知のいくつかの他のベクターが挙げられる。有用
なウイルスベクターとしては、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、
ヘルペスウイルスに基づくベクター、ＳＶ４０に基づくベクター、パピローマウイルス、
ＨＢＰエプスタイン・バーウイルス、ワクシニアウイルスベクターおよびセムリキ森林熱
ウイルス（ＳＦＶ）が挙げられる。Brent et al., supra; Smith, Annu. Rev. Microbiol
. 49:807, 1995; およびRosenfeld et al., Cell 68:143, 1992を参照されたい。

【0249】

発現ベクターの選択は、ベクターを発現させる意図される宿主細胞に依存する。典型的
には、発現ベクターは、抗ｃＫＩＴ抗体鎖または断片をコードするポリヌクレオチドに作
動可能に連結されるプロモーターおよび他の調節配列（例えば、エンハンサー）を含有す
る。いくつかの態様では、誘導性プロモーターを使用して、誘導条件下以外では挿入され
た配列の発現を防止する。誘導性プロモーターとしては、例えば、アラビノース、ｌａｃ
Ｚ、メタロチオネインプロモーターまたは熱ショックプロモーターが挙げられる。形質転
換された生物の培養物を、発現生成物が宿主細胞によってより良好に許容されるコード配
列について集団を偏らせることなく、非誘導条件下で拡張することができる。プロモータ
ーに加えて、他の調節エレメントも、抗ｃＫＩＴ抗体鎖または断片の効率的発現にとって
必要とされるか、または望まれる。これらのエレメントは、典型的には、ＡＴＧ開始コド
ンおよび隣接するリボソーム結合部位または他の配列を含む。さらに、発現の効率を、使
用において細胞系にとって適切なエンハンサーの含有により増強することができる（例え
ば、Scharf et al., Results Probl. Cell Differ. 20:125, 1994；およびBittner et al
., Meth. Enzymol., 153:516, 1987を参照されたい）。例えば、ＳＶ４０エンハンサーま
たはＣＭＶエンハンサーを使用して、哺乳動物宿主細胞中での発現を増加させることがで
きる。

【0250】

発現ベクターはまた、挿入される抗ｃＫＩＴ抗体配列によりコードされるポリペプチド
との融合タンパク質を形成するための分泌シグナル配列位置も提供することができる。よ
り頻繁には、挿入される抗ｃＫＩＴ抗体配列を、ベクター中に含有させる前にシグナル配
列に連結する。抗ｃＫＩＴ抗体軽鎖および重鎖可変ドメインをコードする配列を受容する
ために使用されるベクターは、その定常領域または部分もコードすることがある。そのよ
うなベクターにより、定常領域との融合タンパク質としての可変領域の発現が可能になり
、それにより、無傷抗体またはその断片の生成がもたらされる。典型的には、そのような
定常領域はヒトである。

【0251】

抗ｃＫＩＴ抗体鎖を担持および発現させるための宿主細胞は、原核または真核であって
もよい。大腸菌（E.coli）は、本開示のポリヌクレオチドをクローニングし、発現させる
のに有用な１つの原核宿主である。使用にとって好適な他の微生物宿主としては、バチル
ス・サブチリス（Bacillus subtilis）などの桿菌、ならびにサルモネラ（Salmonella）
、セラチア（Serratia）、および様々なシュードモナス（Pseudomonas）種などの他の腸
内細菌科が挙げられる。これらの原核宿主においては、当業者であれば、典型的には宿主
細胞と適合する発現制御配列（例えば、複製起点）を含有する発現ベクターを作製するこ
ともできる。さらに、ラクトースプロモーター系、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモータ
ー系、ベータ−ラクタマーゼプロモーター系、またはラムダファージに由来するプロモー
ター系などの、任意数の様々な周知のプロモーターが存在する。プロモーターは、典型的
には、任意選択でオペレーター配列と共に発現を制御し、転写および翻訳を開始および完
了させるためのリボソーム結合部位配列などを有する。酵母などの他の微生物を使用して
、抗ｃＫＩＴポリペプチドを発現させることもできる。バキュロウイルスベクターと組み
合わせた昆虫細胞を使用することもできる。

【0252】

他の態様では、哺乳動物宿主細胞を使用して、本開示の抗ｃＫＩＴポリペプチドを発現
および生成させる。例えば、それらは、内因性免疫グロブリン遺伝子を発現するハイブリ
ドーマ細胞系（例えば、実施例に記載のミエローマハイブリドーマクローン）または外因
性発現ベクターを担持する哺乳動物細胞系（例えば、以下に例示されるＳＰ２／０ミエロ
ーマ細胞）であってもよい。これらのものは、任意の正常な死滅する、または正常もしく
は異常な不死の動物もしくはヒト細胞を含む。例えば、ＣＨＯ細胞系、様々なＣＯＳ細胞
系、ＨｅＬａ細胞、ミエローマ細胞系、形質転換されたＢ細胞およびハイブリドーマなど
の、無傷の免疫グロブリンを分泌することができるいくつかの好適な宿主細胞系が開発さ
れている。ポリペプチドを発現させるための哺乳動物組織細胞培養の使用は、例えば、Wi
nnacker, From Genes to Clones, VCH Publishers, N.Y., N.Y., 1987で一般的に考察さ
れている。哺乳動物宿主細胞のための発現ベクターは、複製起点、プロモーター、および
エンハンサーなどの発現制御配列（例えば、Queen et al., Immunol. Rev. 89:49-68, 19
86を参照されたい）、ならびにリボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニ
ル化部位、および転写ターミネーター配列などの必要なプロセッシング情報部位を含んで
もよい。これらの発現ベクターは通常、哺乳動物遺伝子または哺乳動物ウイルスから誘導
されるプロモーターを含有する。好適なプロモーターは、構成的である、細胞型特異的で
ある、段階特異的である、および／またはモジュレート可能もしくは調節可能であっても
よい。有用なプロモーターとしては、限定されるものではないが、メタロチオネインプロ
モーター、構成的アデノウイルス主要後期プロモーター、デキサメタゾン誘導性ＭＭＴＶ
プロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＭＲＰ ｐｏｌＩＩＩプロモーター、構成的ＭＰ
ＳＶプロモーター、テトラサイクリン誘導性ＣＭＶプロモーター（ヒト極初期ＣＭＶプロ
モーターなど）、構成的ＣＭＶプロモーター、および当業界で公知のプロモーター−エン
ハンサーの組合せが挙げられる。

【0253】

対象のポリヌクレオチド配列を含有する発現ベクターを導入するための方法は、細胞宿
主の型に応じて変化する。例えば、原核細胞のためには塩化カルシウムトランスフェクシ
ョンが一般的に使用されるが、他の細胞宿主のためにはリン酸カルシウム処理またはエレ
クトロポレーションを使用してもよい（一般的には、Sambrook et al., supraを参照され
たい）。他の方法としては、例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム処理、
リポソーム媒介性形質転換、インジェクションおよびマイクロインジェクション、弾道法
、ビロソーム、イムノリポソーム、ポリカチオン：核酸コンジュゲート、ネイキッドＤＮ
Ａ、人工ビリオン、ヘルペスウイルス構造タンパク質ＶＰ２２との融合（Elliot and O'H
are, Cell 88:223, 1997）、ＤＮＡの薬剤増強性取込み、およびｅｘ ｖｉｖｏでの形質
導入が挙げられる。組換えタンパク質の長期的な、高収率の生成のためには、安定な発現
が望ましいことが多い。例えば、抗ｃＫＩＴ抗体鎖または結合断片を安定に発現する細胞
系を、ウイルスの複製起点または内因性発現エレメントと、選択マーカー遺伝子とを含有
する発現ベクターを使用して調製することができる。ベクターの導入後、細胞を富化培地
中で１〜２日間成長させた後、選択培地に切替えることができる。選択マーカーの目的は
、選択に対する耐性を付与することであり、その存在により、選択培地中で導入された配
列を上手く発現する細胞の成長が可能となる。耐性の安定にトランスフェクトされた細胞
を、細胞型にとって適切な組織培養技術を使用して増殖させることができる。

【0254】

治療的および診断的使用
本開示の抗体、抗体断片（例えば、抗原結合性断片）、および抗体薬物コンジュゲート
は、限定されるものではないが、固形がんなどのがんの処置などの様々な適用において有
用である。ある特定の態様では、抗体、抗体断片（例えば、抗原結合性断片）、および抗
体薬物コンジュゲートは、腫瘍成長の阻害、分化の誘導、腫瘍体積の減少、および／また
は腫瘍の発がん性の低下にとって有用である。使用方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖ
ｉｖｏ、またはｉｎ ｖｉｖｏでの方法であってもよい。

【0255】

一態様では、抗体、抗体断片（例えば、抗原結合性断片）、および抗体薬物コンジュゲ
ートは、生物試料中のｃＫＩＴの存在を検出するのに有用である。本明細書で使用される
用語「検出すること」は、定量的または定性的検出を包含する。ある特定の態様では、生
物試料は細胞または組織を含む。ある特定の態様では、そのような組織は、他の組織と比
較してより高いレベルでｃＫＩＴを発現する正常および／またはがん性組織を含む。

【0256】

一態様では、本開示は、生物試料中のｃＫＩＴの存在を検出する方法を提供する。ある
特定の態様では、この方法は、抗体の抗原への結合を可能にする条件下で、生物試料を抗
ｃＫＩＴ抗体と接触させること、および抗体と抗原との間で複合体が形成されるかどうか
を検出することを含む。

【0257】

また、ｃＫＩＴの発現の増加と関連する障害を診断する方法も含まれる。ある特定の態
様では、この方法は、試験細胞を抗ｃＫＩＴ抗体と接触させること；抗ｃＫＩＴ抗体のｃ
ＫＩＴ抗原への結合を検出することにより試験細胞上でのｃＫＩＴの発現レベルを決定す
ること（定量的または定性的に）；および試験細胞中でのｃＫＩＴの発現レベルを、対照
細胞（例えば、試験細胞と同じ組織起源の正常細胞またはそのような正常細胞と同等のレ
ベルでｃＫＩＴを発現する細胞）中でのｃＫＩＴの発現レベルと比較することを含み、対
照細胞と比較して、試験細胞上でのｃＫＩＴの発現レベルが高い場合、ｃＫＩＴの発現の
増加と関連する障害の存在を示す。ある特定の態様では、試験細胞は、ｃＫＩＴの発現の
増加と関連する障害を有することが疑われる個体から得られる。ある特定の態様では、障
害は、がんまたは腫瘍などの細胞増殖性障害である。

【0258】

ある特定の態様では、上記のものなどの診断または検出の方法は、細胞表面上で、また
は表面上にｃＫＩＴを発現する細胞から得られる膜調製物中で発現されるｃＫＩＴへの抗
ｃＫＩＴ抗体の結合を検出することを含む。細胞表面上に発現されるｃＫＩＴへの抗ｃＫ
ＩＴ抗体の結合を検出するための例示的アッセイは、「ＦＡＣＳ」アッセイである。

【0259】

ある特定の他の方法を使用して、ｃＫＩＴへの抗ｃＫＩＴ抗体の結合を検出することが
できる。そのような方法としては、限定されるものではないが、ウェスタンブロット、ラ
ジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）、「サンドイッチ」イム
ノアッセイ、免疫沈降アッセイ、蛍光イムノアッセイ、プロテインＡイムノアッセイ、お
よび免疫組織化学（ＩＨＣ）などの、当業界で周知である抗原結合アッセイが挙げられる
。

【0260】

ある特定の態様では、抗ｃＫＩＴ抗体を標識する。標識としては、限定されるものでは
ないが、直接検出される標識または部分（蛍光、発色、高電子密度、化学発光、および放
射性標識など）、ならびに例えば、酵素反応または分子相互作用を介して間接的に検出さ
れる、酵素またはリガンドなどの部分が挙げられる。

【0261】

ある特定の態様では、抗ｃＫＩＴ抗体を、不溶性マトリックス上に固定する。固定は、
溶液中で遊離したままである任意のｃＫＩＴタンパク質から抗ｃＫＩＴ抗体を分離するこ
とを必要とする。これは、水に不溶性のマトリックスもしくは表面への吸着（Bennich et
al, 米国特許第３，７２０，７６０号）により、もしくは共有カップリング（例えば、
グルタルアルデヒド架橋を使用する）により、アッセイ手順の前に抗ｃＫＩＴ抗体を不溶
化することによって、または例えば、免疫沈降により、抗ｃＫＩＴ抗体とｃＫＩＴタンパ
ク質との複合体の形成後に抗ｃＫＩＴ抗体を不溶化することによって、都合良く達成され
る。

【0262】

診断または検出の上記態様のいずれかを、抗ｃＫＩＴ抗体の代わりに、またはそれに加
えて、本開示のイムノコンジュゲートを使用して実行することができる。

【0263】

一態様では、本開示は、抗体、抗体断片（例えば、抗原結合性断片）、および抗体薬物
コンジュゲートを患者に投与することによって、疾患を処置することを含む、疾患を処置
、防止または改善する方法を提供する。ある特定の態様では、抗体、抗体断片（例えば、
抗原結合性断片）、および抗体薬物コンジュゲートを使用して処置される疾患は、がんで
ある。処置および／または防止することができる疾患の例としては、限定されるものでは
ないが、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）、急性骨髄性白血病（
ＡＭＬ）、メラノーマ、肥満細胞白血病（ＭＣＬ）、肥満細胞症、神経線維腫症、乳がん
、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、および膵臓がんが挙げられる。ある特定の態様では、
がんは、抗体、抗体断片（例えば、抗原結合性断片）、および抗体薬物コンジュゲートが
特異的に結合することができる、ｃＫＩＴ発現細胞を特徴とする。

【0264】

本開示は、治療有効量の抗体、抗体断片（例えば、抗原結合性断片）、または抗体薬物
コンジュゲートを投与することを含む、がんを処置する方法を提供する。ある特定の態様
では、がんは固形がんである。ある特定の態様では、対象はヒトである。

【0265】

ある特定の態様では、腫瘍成長を阻害する方法は、対象に、治療有効量の抗体、抗体断
片（例えば、抗原結合性断片）、または抗体薬物コンジュゲートを投与することを含む。
ある特定の態様では、対象はヒトである。ある特定の態様では、対象は腫瘍を有するか、
または腫瘍が除去されている。

【0266】

ある特定の態様では、腫瘍は、抗ｃＫＩＴ抗体が結合するｃＫＩＴを発現する。ある特
定の態様では、腫瘍はヒトｃＫＩＴを過剰発現する。

【0267】

疾患の処置のために、抗体、抗体断片（例えば、抗原結合性断片）、または抗体薬物コ
ンジュゲートの適切な用量は、処置しようとする疾患の種類、疾患の重症度および経過、
疾患の応答性、以前の療法、患者の病歴などの様々な因子に依存する。抗体または薬剤を
１回で、または数日から数カ月継続する一連の処置にわたって、または治癒が行われるか
、もしくは疾患状態の縮小（例えば、腫瘍サイズの減少）が達成されるまで投与すること
ができる。最適な投薬スケジュールは、患者の体内での薬物蓄積の測定値から算出するこ
とができ、個々の抗体、抗体断片（例えば、抗原結合性断片）、または抗体薬物コンジュ
ゲートの相対的効力に応じて変化する。ある特定の態様では、用量は０．０１ｍｇ〜１０
ｍｇ（例えば、０．０１ｍｇ、０．０５ｍｇ、０．１ｍｇ、０．５ｍｇ、１ｍｇ、２ｍｇ
、３ｍｇ、４ｍｇ、５ｍｇ、７ｍｇ、８ｍｇ、９ｍｇ、または１０ｍｇ）／ｋｇ体重であ
り、１日、１週間、１カ月または１年に１回またはそれ以上投与することができる。ある
特定の態様では、本開示の抗体、抗体断片（例えば、抗原結合性断片）、または抗体薬物
コンジュゲートは、２週間毎に１回または３週間毎に１回投与される。処置する医師であ
れば、体液または組織中での測定された滞留時間および薬物濃度に基づいて、投与のため
の反復速度を見積もることができる。

【0268】

組合せ療法
ある特定の例では、本開示の抗体、抗体断片（例えば、抗原結合性断片）、または抗体
薬物コンジュゲートを、他の抗がん剤、抗アレルギー剤、抗嘔吐剤（または制吐剤）、疼
痛緩和剤、細胞保護剤、およびその組合せなどの他の治療剤と組み合わせる。

【0269】

組合せ療法における使用のために考えられる一般的な化学療法剤としては、アナストロ
ゾール（Ａｒｉｍｉｄｅｘ（登録商標））、ビカルタミド（Ｃａｓｏｄｅｘ（登録商標）
）、硫酸ブレオマイシン（Ｂｌｅｎｏｘａｎｅ（登録商標））、ブスルファン（Ｍｙｌｅ
ｒａｎ（登録商標））、ブスルファン注射液（Ｂｕｓｕｌｆｅｘ（登録商標））、カペシ
タビン（Ｘｅｌｏｄａ（登録商標））、Ｎ４−ペントキシカルボニル−５−デオキシ−５
−フルオロシチジン、カルボプラチン（Ｐａｒａｐｌａｔｉｎ（登録商標））、カルムス
チン（ＢｉＣＮＵ（登録商標））、クロラムブシル（Ｌｅｕｋｅｒａｎ（登録商標））、
シスプラチン（Ｐｌａｔｉｎｏｌ（登録商標））、クラドリビン（Ｌｅｕｓｔａｔｉｎ（
登録商標））、シクロホスファミド（Ｃｙｔｏｘａｎ（登録商標）またはＮｅｏｓａｒ（
登録商標））、シタラビン、シトシンアラビノシド（Ｃｙｔｏｓａｒ−Ｕ（登録商標））
、シタラビンリポソーム注射液（ＤｅｐｏＣｙｔ（登録商標））、ダカルバジン（ＤＴＩ
Ｃ−Ｄｏｍｅ（登録商標））、ダクチノマイシン（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ Ｄ、Ｃｏｓ
ｍｅｇａｎ）、塩酸ダウノルビシン（Ｃｅｒｕｂｉｄｉｎｅ（登録商標））、クエン酸ダ
ウノルビシンリポソーム注射液（ＤａｕｎｏＸｏｍｅ（登録商標））、デキサメタゾン、
ドセタキセル（Ｔａｘｏｔｅｒｅ（登録商標））、塩酸ドキソルビシン（Ａｄｒｉａｍｙ
ｃｉｎ（登録商標）、Ｒｕｂｅｘ（登録商標））、エトポシド（Ｖｅｐｅｓｉｄ（登録商
標））、リン酸フルダラビン（Ｆｌｕｄａｒａ（登録商標））、５−フルオロウラシル（
Ａｄｒｕｃｉｌ（登録商標）、Ｅｆｕｄｅｘ（登録商標））、フルタミド（Ｅｕｌｅｘｉ
ｎ（登録商標））、テザシチビン、ゲムシタビン（ジフルオロデオキシシチジン）、ヒド
ロキシウレア（Ｈｙｄｒｅａ（登録商標））、イダルビシン（Ｉｄａｍｙｃｉｎ（登録商
標））、イフォスファミド（ＩＦＥＸ（登録商標））、イリノテカン（Ｃａｍｐｔｏｓａ
ｒ（登録商標））、Ｌ−アスパラギナーゼ（ＥＬＳＰＡＲ（登録商標））、ロイコボリン
カルシウム、メルファラン（Ａｌｋｅｒａｎ（登録商標））、６−メルカプトプリン（Ｐ
ｕｒｉｎｅｔｈｏｌ（登録商標））、メトトレキサート（Ｆｏｌｅｘ（登録商標））、ミ
トキサントロン（Ｎｏｖａｎｔｒｏｎｅ（登録商標））、マイロターグ、パクリタキセル
（Ｔａｘｏｌ（登録商標））、フェニックス（イットリウム９０／ＭＸ−ＤＴＰＡ）、ペ
ントスタチン、カルムスチンインプラントを含むポリフェプロサン２０（Ｇｌｉａｄｅｌ
（登録商標））、クエン酸タモキシフェン（Ｎｏｌｖａｄｅｘ（登録商標））、テニポシ
ド（Ｖｕｍｏｎ（登録商標））、６−チオグアニン、チオテパ、チラパザミン（Ｔｉｒａ
ｚｏｎｅ（登録商標））、注射用塩酸トポテカン（Ｈｙｃａｍｐｔｉｎ（登録商標））、
ビンブラスチン（Ｖｅｌｂａｎ（登録商標））、ビンクリスチン（Ｏｎｃｏｖｉｎ（登録
商標））、およびビノレルビン（Ｎａｖｅｌｂｉｎｅ（登録商標））が挙げられる。

【0270】

一態様では、本開示の抗体、抗体断片（例えば、抗原結合性断片）、または抗体薬物コ
ンジュゲートを、抗がん特性を有する第２の化合物との組合せ療法として組合せ医薬製剤
、または用量レジメン中で組み合わせる。組合せ医薬製剤または用量レジメンの第２の化
合物は、それらが互いに有害に作用しないような、抗体または組合せのイムノコンジュゲ
ートに対する相補的活性を有してもよい。例えば、本開示の抗体、抗体断片（例えば、抗
原結合性断片）、または抗体薬物コンジュゲートを、限定されるものではないが、化学療
法剤、チロシンキナーゼ阻害剤、例えば、イマチニブ、および他のｃＫＩＴ経路阻害剤と
組み合わせて投与することができる。

【0271】

本明細書で使用される用語「組合せ医薬」とは、１つの単位剤形中の固定的組合せ、ま
たは２つ以上の治療剤を同時に独立に、もしくは特に、組合せパートナーが協調的な、例
えば、相乗効果を示すことができる時間間隔内で別々に投与することができる非固定的組
合せもしくは組み合わせ投与のための部分のキットを指す。

【0272】

用語「組合せ療法」とは、本開示に記載の治療状態または障害を処置するための２つ以
上の治療剤の投与を指す。そのような投与は、固定比の活性成分を有する単一のカプセル
などの、実質的に同時的な様式でのこれらの治療剤の同時投与を包含する。あるいは、そ
のような投与は、それぞれの活性成分について、複数の、または別々の容器（例えば、カ
プセル、粉末、および液体）中での同時投与を包含する。粉末および／または液体を、投
与前に所望の用量に再構成または希釈することができる。さらに、そのような投与はまた
、ほぼ同時に、または異なる時間に、連続的様式でのそれぞれの種類の治療剤の使用も包
含する。いずれかの場合、処置レジメンは、本明細書に記載の状態または障害の処置にお
いて組合せ薬物の有益な効果を提供する。

【0273】

組合せ療法は、「相乗作用」を提供し、「相乗的」であることがわかってもよい、すな
わち、活性成分を一緒に使用した場合に達成される効果は、化合物を別々に使用すること
から得られる効果の合計よりも大きい。活性成分が（１）組み合わせた単位用量製剤中で
同時製剤化および投与されるか、もしくは同時に送達される；（２）別々の製剤として交
互に、もしくは同時に送達される；または（３）いくつかの他のレジメンによるものであ
る場合、相乗効果を達成することができる。交互療法において送達される場合、化合物が
例えば、別々の注射筒中の異なる注射液により連続的に投与または送達される場合、相乗
効果を達成することができる。一般に、交互療法中では、有効用量の各活性成分は連続的
に、すなわち、順次投与されるが、組合せ療法においては、有効用量の２つ以上の活性成
分は一緒に投与される。

【0274】

一態様では、本開示は、限定されるものではないが、ＥＧＦＲ阻害剤、Ｈｅｒ２阻害剤
、Ｈｅｒ３阻害剤、ＩＧＦＲ阻害剤、およびＭｅｔ阻害剤などの１または複数のチロシン
キナーゼ阻害剤と組み合わせた抗体薬物コンジュゲートを、それを必要とする対象に投与
することにより、がんを処置する方法を提供する。

【0275】

例えば、チロシンキナーゼ阻害剤としては、限定されるものではないが、塩酸エルロチ
ニブ（Ｔａｒｃｅｖａ（登録商標））；リニファニブ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈから入手可能
なＡＢＴ８６９としても知られる、Ｎ−［４−（３−アミノ−１Ｈ−インダゾール−４−
イル）フェニル］−Ｎ’−（２−フルオロ−５−メチルフェニル）ウレア）；リンゴ酸ス
ニチニブ（Ｓｕｔｅｎｔ（登録商標））；ボスチニブ（ＳＫＩ−６０６としても知られ、
米国特許第６，７８０，９９６号に記載された、４−［（２，４−ジクロロ−５−メトキ
シフェニル）アミノ］−６−メトキシ−７−「３−（４−メチルピペラジン−１−イル）
プロポキシ］キノリン−３−カルボニトリル）；ダサチニブ（Ｓｐｒｙｃｅｌ（登録商標
））；パゾパニブ（Ｖｏｔｒｉｅｎｔ（登録商標））；ソラフェニブ（Ｎｅｘａｖａｒ（
登録商標））；ザクチマ（ＺＤ６４７４）；ニロチニブ（Ｔａｓｉｇｎａ（登録商標））
；レゴラフェニブ（Ｓｔｉｖａｒｇａ（登録商標））およびイマチニブまたはメシル酸イ
マチニブ（Ｇｉｌｖｅｃ（登録商標）およびＧｌｅｅｖｅｃ（登録商標））が挙げられる
。

【0276】

上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）阻害剤としては、限定されるものではないが、塩酸エ
ルロチニブ（Ｔａｒｃｅｖａ（登録商標））、ゲフィチニブ（Ｉｒｅｓｓａ（登録商標）
）；Ｎ−［４−［（３−クロロ−４−フルオロフェニル）アミノ］−７−［［（３’’Ｓ
’’）−テトラヒドロ-3-フラニル］オキシ］−６−キナゾリニル］−４（ジメチルアミ
ノ）−２−ブテナミド、Ｔｏｖｏｋ（登録商標））；バンデタニブ（Ｃａｐｒｅｌｓａ（
登録商標））；ラパチニブ（Ｔｙｋｅｒｂ（登録商標））；（３Ｒ，４Ｒ）−４−アミノ
−１−（（４−（（３−メトキシフェニル）アミノ）ピロロ［２，１−ｆ］［１，２，４
］トリアジン−５−イル）メチル）ピペリジン−３−オール（ＢＭＳ６９０５１４）；カ
ネルチニブ二塩酸塩（ＣＩ−１０３３）；６−［４−［（４−エチル−１−ピペラジニル
）メチル］フェニル］−Ｎ−［（１Ｒ）−１−フェニルエチル］−７Ｈ−ピロロ［２，３
−ｄ］ピリミジン−４−アミン（ＡＥＥ７８８、ＣＡＳ４９７８３９−６２−０）；ムブ
リチニブ（ＴＡＫ１６５）；ペリチニブ（ＥＫＢ５６９）；アファチニブ（ＢＩＢＷ２９
９２）；ネラチニブ（ＨＫＩ−２７２）；Ｎ−［４−［［１−［（３−フルオロフェニル
）メチル］−１Ｈ−インダゾール−５−イル］アミノ］−５−メチルピロロ［２，１−ｆ
］［１，２，４］トリアジン−６−イル］−カルバミン酸、（３Ｓ）−３−モルホリニル
メチルエステル（ＢＭＳ５９９６２６）；Ｎ−（３，４−ジクロロ−２−フルオロフェニ
ル）−６−メトキシ−７−［［（３ａα，５β，６ａα）−オクタヒドロ−２−メチルシ
クロペンタ［ｃ］ピロール−５−イル］メトキシ］−４−キナゾリナミン（ＸＬ６４７、
ＣＡＳ７８１６１３−２３−８）；および４−［４−［［（１Ｒ）−１−フェニルエチル
］アミノ］−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−６−ｙｌ］−フェノール（ＰＫＩ
１６６、ＣＡＳ１８７７２４−６１−４）が挙げられる。

【0277】

ＥＧＦＲ抗体としては、限定されるものではないが、セツキシマブ（Ｅｒｂｉｔｕｘ（
登録商標））；パニツムマブ（Ｖｅｃｔｉｂｉｘ（登録商標））；マツズマブ（ＥＭＤ−
７２０００）；ニモツズマブ（ｈＲ３）；ザルツムマブ；ＴｈｅｒａＣＩＭ ｈ−Ｒ３；
ＭＤＸ０４４７（ＣＡＳ３３９１５１−９６−１）；およびｃｈ８０６（ｍＡｂ−８０６
、ＣＡＳ９４６４１４−０９−１）が挙げられる。

【0278】

ヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２受容体）（Ｎｅｕ、ＥｒｂＢ−２、ＣＤ３４０、
またはｐ１８５としても知られる）阻害剤としては、限定されるものではないが、トラス
ツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標））；ペルツズマブ（Ｏｍｎｉｔａｒｇ（登録
商標））；ネラチニブ（ＨＫＩ−２７２、（２Ｅ）−Ｎ−［４−［［３−クロロ−４−［
（ピリジン−２−イル）メトキシ］フェニル］アミノ］−３−シアノ−７−エトキシキノ
リン−６−イル］−４−（ジメチルアミノ）ブタ−２−エンアミド、ＰＣＴ公開第ＷＯ０
５／０２８４４３号に記載）；ラパチニブまたはラパチニブジトシレート（ditosylate）
（Ｔｙｋｅｒｂ（登録商標））；（３Ｒ，４Ｒ）−４−アミノ−１−（（４−（（３−メ
トキシフェニル）アミノ）ピロロ［２，１−ｆ］［１，２，４］トリアジン−５−イル）
メチル）ピペリジン−３−オール（ＢＭＳ６９０５１４）；（２Ｅ）−Ｎ−［４−［（３
−クロロ−４−フルオロフェニル）アミノ］−７−［［（３Ｓ）−テトラヒドロ−３−フ
ラニル］オキシ］−６−キナゾリニル］−４−（ジメチルアミノ）−２−ブテナミド（Ｂ
ＩＢＷ−２９９２、ＣＡＳ８５０１４０−７２−６）；Ｎ−［４−［［１−［（３−フル
オロフェニル）メチル］−１Ｈ−インダゾール−５−イル］アミノ］−５−メチルピロロ
［２，１−ｆ］［１，２，４］トリアジン−６−イル］−カルバミン酸、（３Ｓ）−３−
モルホリニルメチルエステル（ＢＭＳ５９９６２６、ＣＡＳ７１４９７１−０９−０２）
；カネルチニブ二塩酸塩（ＰＤ１８３８０５またはＣＩ−１０３３）；およびＮ−（３，
４−ジクロロ−２−フルオロフェニル）−６−メトキシ−７−［［（３ａα，５β，６ａ
α）−オクタヒドロ−２−メチルシクロペンタ［ｃ］ピロール−５−イル］メトキシ］−
４−キナゾリナミン（ＸＬ６４７、ＣＡＳ７８１６１３−２３−８）が挙げられる。

【0279】

ＨＥＲ３阻害剤としては、限定されるものではないが、ＬＪＭ７１６、ＭＭ−１２１、
ＡＭＧ−８８８、ＲＧ７１１６、ＲＥＧＮ−１４００、ＡＶ−２０３、ＭＰ−ＲＭ−１、
ＭＭ−１１１、およびＭＥＨＤ−７９４５Ａが挙げられる。

【0280】

ＭＥＴ阻害剤としては、限定されるものではないが、カボザンチニブ（ＸＬ１８４、Ｃ
ＡＳ８４９２１７−６８−１）；フォレチニブ（ＧＳＫ１３６３０８９、以前はＸＬ８８
０、ＣＡＳ８４９２１７−６４−７）；チバンチニブ（ＡＲＱ１９７、ＣＡＳ１０００８
７３−９８−２）；１−（２−ヒドロキシ−２−メチルプロピル）−Ｎ−（５−（７−メ
トキシキノリン−４−イルオキシ)ピリジン−２−イル）−５−メチル−３−オキソ−２
−フェニル−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボキサミド（ＡＭＧ４５８
）；クリゾチニブ（Ｘａｌｋｏｒｉ（登録商標）、ＰＦ−０２３４１０６６）；（３Ｚ）
−５−（２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インドール−１−イルスルホニル）−３−（｛３，５
−ジメチル−４−［（４−メチルピペラジン−１−イル）カルボニル］−１Ｈ−ピロール
−２−イル｝メチレン）−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−インドール−２−オン（ＳＵ１１２
７１）；（３Ｚ）−Ｎ−（３−クロロフェニル）−３−（｛３，５−ジメチル−４−［（
４−メチルピペラジン−１−ｙｌ）カルボニル］−１Ｈ−ピロール−２−イル｝メチレン
）−Ｎ−メチル−２−オキソインドリン−５−スルホンアミド（ＳＵ１１２７４）；（３
Ｚ）−Ｎ−（３−クロロフェニル）−３−｛［３，５−ジメチル−４−（３−モルホリン
−４−イルプロピル）−１Ｈ−ピロール−２−イル］メチレン｝−Ｎ−メチル−２−オキ
ソインドリン−５−スルホンアミド（ＳＵ１１６０６）；６−［ジフルオロ［６−（１−
メチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１，２，４−トリアゾロ［４，３−ｂ］ピリダ
ジン−３−イル］メチル］−キノリン（ＪＮＪ３８８７７６０５、ＣＡＳ９４３５４０−
７５−８）；２−［４−［１−（キノリン−６−イルメチル）−１Ｈ−［１，２，３］ト
リアゾロ［４，５−ｂ］ピラジン−６−イル］−１Ｈ−ピラゾール−１−イル］エタノー
ル（ＰＦ０４２１７９０３、ＣＡＳ９５６９０５−２７−４）；Ｎ−（（２Ｒ）−１，４
−ジオキサン−２−イルメチル）−Ｎ−メチル−Ｎ’−［３−（１−メチル−１Ｈ−ピラ
ゾール−４−イル）−５−オキソ−５Ｈ−ベンゾ［４，５］シクロヘプタ［１，２−ｂ］
ピリジン−７−イル］スルファミド（ＭＫ２４６１、ＣＡＳ９１７８７９−３９−１）；
６−［［６−（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１，２，４−トリアゾロ［
４，３−ｂ］ピリダジン−３−イル］チオ］−キノリン（ＳＧＸ５２３、ＣＡＳ１０２２
１５０−５７−７）；および（３Ｚ）−５−［［（２，６−ジクロロフェニル）メチル］
スルホニル］−３−［［３，５−ジメチル−４−［［（２Ｒ）−２−（１−ピロリジニル
メチル）−１−ピロリジニル］カルボニル］−１Ｈ−ピロール−２−イル］メチレン］−
１，３−ジヒドロ−２Ｈ−インドール−２−オン（ＰＨＡ６６５７５２、ＣＡＳ４７７５
７５−５６−７）が挙げられる。

【0281】

ＩＧＦ１Ｒ阻害剤としては、限定されるものではないが、ＢＭＳ−７５４８０７、ＸＬ
−２２８、ＯＳＩ−９０６、ＧＳＫ０９０４５２９Ａ、Ａ−９２８６０５、ＡＸＬ１７１
７、ＫＷ−２４５０、ＭＫ０６４６、ＡＭＧ４７９、ＩＭＣＡ１２、ＭＥＤＩ−５７３、
およびＢＩ８３６８４５が挙げられる。概説については、例えば、Yee, JNCI, 104; 975
(2012)を参照されたい。

【0282】

別の態様では、本開示は、限定されるものではないが、ＭＥＫ阻害剤、Ｂｒａｆ阻害剤
、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ阻害剤、ＳＨＰ２阻害剤、およびまたｍＴｏｒ阻害剤などの、１また
は複数のＦＧＦ下流シグナリング経路阻害剤と組み合わせた抗体薬物コンジュゲートを、
それを必要とする対象に投与することにより、がんを処置する方法を提供する。

【0283】

例えば、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＥＫ）阻害剤としては、限定され
るものではないが、ＸＬ−５１８（ＡＣＣ Ｃｏｒｐ．から入手可能な、ＧＤＣ−０９７
３、Ｃａｓ Ｎｏ．１０２９８７２−２９−４としても知られる）；２−［（２−クロロ
−４−ヨードフェニル）アミノ］−Ｎ−（シクロプロピルメトキシ）−３，４−ジフルオ
ロ−ベンザミド（ＣＩ−１０４０またはＰＤ１８４３５２としても知られ、ＰＣＴ公開第
ＷＯ２００００３５４３６号に記載されている）；Ｎ−［（２Ｒ）−２，３−ジヒドロキ
シプロポキシ］−３，４−ジフルオロ−２−［（２−フルオロ−４−ヨードフェニル）ア
ミノ］−ベンザミド（ＰＤ０３２５９０１としても知られ、ＰＣＴ公開第ＷＯ２００２０
０６２１３号に記載されている）；２，３−ビス［アミノ［（２−アミノフェニル）チオ
］メチレン］−ブタンジニトリル（Ｕ０１２６としても知られ、米国特許第２，７７９，
７８０号に記載されている）；Ｎ−［３，４−ジフルオロ−２−［（２−フルオロ−４−
ヨードフェニル）アミノ］−６−メトキシフェニル］−１−［（２Ｒ）−２，３−ジヒド
ロキシプロピル］−シクロプロパンスルホンアミド（ＲＤＥＡ１１９またはＢＡＹ８６９
７６６としても知られ、ＰＣＴ公開第ＷＯ２００７０１４０１１号に記載されている）；
（３Ｓ，４Ｒ，５Ｚ，８Ｓ，９Ｓ，１１Ｅ）−１４−（エチルアミノ）−８，９，１６−
トリヒドロキシ−３，４−ジメチル−３，４，９，１９−テトラヒドロ−１Ｈ−２−ベン
ゾオキサシクロテトラデシン−１，７（８Ｈ）−ジオン］（Ｅ６２０１としても知られ、
ＰＣＴ公開第ＷＯ２００３０７６４２４号に記載されている）；２’−アミノ−３’−メ
トキシフラボン（Ｂｉａｆｆｉｎ ＧｍｂＨ ＆ Ｃｏ．，ＫＧ，Ｇｅｒｍａｎｙから入
手可能なＰＤ９８０５９としても知られる）；ベムラフェニブ（ＰＬＸ−４０３２、ＣＡ
Ｓ９１８５０４−６５−１）；（Ｒ）−３−（２，３−ジヒドロキシプロピル）−６−フ
ルオロ−５−（２−フルオロ−４−ヨードフェニルアミノ）−８−メチルピリド［２，３
−ｄ］ピリミジン−４，７（３Ｈ，８Ｈ）−ジオン（ＴＡＫ−７３３、ＣＡＳ１０３５５
５５−６３−５）；ピマセルチブ（ＡＳ−７０３０２６、ＣＡＳ１２０４５３１−２６−
９）；およびトラメチニブジメチルスルホキシド（ＧＳＫ−１１２０２１２、ＣＡＳ１２
０４５３１−２５−８０）が挙げられる。

【0284】

ホスホイノシチド３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）阻害剤としては、限定されるものではない
が、４−［２−（１Ｈ−インダゾール−４−イル）−６−［［４−（メチルスルホニル）
ピペラジン−１−イル］メチル］チエノ［３，２−ｄ］ピリミジン−４−イル］モルホリ
ン（ＧＤＣ０９４１としても知られ、ＰＣＴ公開第ＷＯ０９／０３６０８２号および第Ｗ
Ｏ０９／０５５７３０号に記載されている）；２−メチル−２−［４−［３−メチル−２
−オキソ−８−（キノリン−３−イル）−２，３−ジヒドロイミダゾ［４，５−ｃ］キノ
リン−１−イル］フェニル］プロピオニトリル（ＢＥＺ２３５またはＮＶＰ−ＢＥＺ２３
５としても知られ、ＰＣＴ公開第ＷＯ０６／１２２８０６号に記載されている）；４−（
トリフルオロメチル）−５−（２，６−ジモルホリノピリミジン−４−イル）ピリジン−
２−アミン（ＢＫＭ１２０またはＮＶＰ−ＢＫＭ１２０としても知られ、ＰＣＴ公開第Ｗ
Ｏ２００７／０８４７８６号に記載されている）；トザセルチブ（ＶＸ６８０またはＭＫ
−０４５７、ＣＡＳ６３９０８９−５４−６）；（５Ｚ）−５−［［４−（４−ピリジニ
ル）−６−キノリニル］メチレン］−２，４−チアゾリジンジオン（ＧＳＫ１０５９６１
５、ＣＡＳ９５８８５２−０１−２）；（１Ｅ，４Ｓ，４ａＲ，５Ｒ，６ａＳ，９ａＲ）
−５−（アセチルオキシ）−１−［（ジ−２−プロペニルアミノ）メチレン］−４，４ａ
，５，６，６ａ，８，９，９ａ−オクタヒドロ−１１−ヒドロキシ−４−（メトキシメチ
ル）−４ａ，６ａ−ジメチル−シクロペンタ［５，６］ナフト［１，２−ｃ］ピラン−２
，７，１０（１Ｈ）−トリオン（ＰＸ８６６，ＣＡＳ５０２６３２−６６−８）；および
８−フェニル−２−（モルホリン−４−イル）−クロメン−４−オン（ＬＹ２９４００２
、ＣＡＳ１５４４４７−３６−６）が挙げられる。

【0285】

ｍＴｏｒ阻害剤としては、限定されるものではないが、テムシロリムス（Ｔｏｒｉｓｅ
ｌ（登録商標））；リダホロリムス（以前はデフェロリムス、（１Ｒ，２Ｒ，４Ｓ）−４
−［（２Ｒ）−２［（１Ｒ，９Ｓ，１２Ｓ，１５Ｒ，１６Ｅ，１８Ｒ，１９Ｒ，２１Ｒ，
２３Ｓ，２４Ｅ，２６Ｅ，２８Ｚ，３０Ｓ，３２Ｓ，３５Ｒ）−１，１８−ジヒドロキシ
−１９，３０−ジメトキシ−１５，１７，２１，２３，２９，３５−ヘキサメチル−２，
３，１０，１４，２０−ペンタオキソ−１１，３６−ジオキサ−４−アザトリシクロ［３
０．３．１．０^４，９］ヘキサトリアコンタ−１６，２４，２６，２８−テトラエン−１
２−イル］プロピル］−２−メトキシシクロヘキシルジメチルホスフィネートとして知ら
れ、ＡＰ２３５７３およびＭＫ８６６９としても知られ、ＰＣＴ公開第ＷＯ０３／０６４
３８３号に記載されている）；エベロリムス（Ａｆｉｎｉｔｏｒ（登録商標）またはＲＡ
Ｄ００１）；ラパマイシン（ＡＹ２２９８９、Ｓｉｒｏｌｉｍｕｓ（登録商標））；シマ
ピモッド（ＣＡＳ１６４３０１−５１−３）；（５−｛２，４−ビス［（３Ｓ）−３−メ
チルモルホリン−４−イル］ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−７−イル｝−２−メトキ
シフェニル）メタノール（ＡＺＤ８０５５）；２−アミノ−８−［ｔｒａｎｓ−４−（２
−ヒドロキシエトキシ）シクロヘキシル］−６−（６−メトキシ−３−ピリジニル）−４
−メチル−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−７（８Ｈ）−オン（ＰＦ０４６９１５０２
、ＣＡＳ１０１３１０１−３６−４）；およびＮ^２−［１，４−ジオキソ−４−［［４−
（４−オキソ−８−フェニル−４Ｈ−１−ベンゾピラン−２−イル）モルホリニウム−４
−イル］メトキシ］ブチル］−Ｌ−アルギニルグリシル−Ｌ−α−アスパルチルＬ−セリ
ン−、内塩（ＳＦ１１２６、ＣＡＳ９３６４８７−６７−１）が挙げられる。

【0286】

さらに別の態様において、本開示は、限定されるものではないが、ＩＡＰ阻害剤、Ｂｃ
ｌ２阻害剤、ＭＣｌ１阻害剤、Ｔｒａｉｌ剤、Ｃｈｋ阻害剤などの１または複数のプロア
ポトーシス剤と組み合わせた抗体薬物コンジュゲートを、それを必要とする対象に投与す
ることによりがんを処置する方法を提供する。

【0287】

例えば、ＩＡＰ阻害剤としては、限定されるものではないが、ＮＶＰ−ＬＣＬ１６１、
ＧＤＣ−０９１７、ＡＥＧ−３５１５６、ＡＴ４０６、およびＴＬ３２７１１が挙げられ
る。ＩＡＰ阻害剤の他の例としては、限定されるものではないが、ＷＯ０４／００５２８
４、ＷＯ０４／００７５２９、ＷＯ０５／０９７７９１、ＷＯ０５／０６９８９４、ＷＯ
０５／０６９８８８、ＷＯ０５／０９４８１８、ＵＳ２００６／００１４７００、ＵＳ２
００６／００２５３４７、ＷＯ０６／０６９０６３、ＷＯ０６／０１０１１８、ＷＯ０６
／０１７２９５、およびＷＯ０８／１３４６７９（これらは全て参照により本明細書に組
み込まれる）に開示されたものが挙げられる。

【0288】

ＢＣＬ−２阻害剤としては、限定されるものではないが、４−［４−［［２−（４−ク
ロロフェニル）−５，５−ジメチル−１−シクロヘキセン−１−イル］メチル］−１−ピ
ペラジニル］−Ｎ−［［４−［［（１Ｒ）−３−（４−モルホリニル）−１−［（フェニ
ルチオ）メチル］プロピル］アミノ］−３−［（トリフルオロメチル）スルホニル］フェ
ニル］スルホニル］ベンザミド（ＡＢＴ−２６３としても知られ、ＰＣＴ公開第ＷＯ０９
／１５５３８６号に記載されている）；テトロカルシンＡ；アンチマイシン；ゴシポール
（（−）ＢＬ−１９３）；オバトクラックス；エチル−２−アミノ−６−シクロペンチル
−４−（１−シアノ−２−エトキシ−２−オキソエチル）−４Ｈクロモン−３−カルボキ
シレート（ＨＡ１４−１）；オブリメルセン（Ｇ３１３９、Ｇｅｎａｓｅｎｓｅ（登録商
標））；Ｂａｋ ＢＨ３ペプチド；（−）−ゴシポール酢酸（ＡＴ−１０１）；４−［４
−［（４’−クロロ［１，１’−ビフェニル］−２−イル）メチル］−１−ピペラジニル
］−Ｎ−［［４−［［（１Ｒ）−３−（ジメチルアミノ）−１−［（フェニルチオ）メチ
ル］プロピル］アミノ］−３−ニトロフェニル］スルホニル］−ベンザミド（ＡＢＴ−７
３７、ＣＡＳ８５２８０８−０４−９）；およびナビトクラックス（ＡＢＴ−２６３、Ｃ
ＡＳ９２３５６４−５１−６）が挙げられる。

【0289】

ＤＲ４（ＴＲＡＩＬＲ１）およびＤＲ５（ＴＲＡＩＬＲ２）などのプロアポトーシス受
容体アゴニスト（ＰＡＲＡ）としては、限定されるものではないが、デュラネルミン（Ａ
ＭＧ−９５１、ＲｈＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ）；マパツムマブ（ＨＲＳ−ＥＴＲ１、ＣＡ
Ｓ ６５８０５２−０９−６）；レキサツムマブ（ＨＧＳ−ＥＴＲ２、ＣＡＳ８４５８１
６−０２−６）；アポマブ（Ａｐｏｍａｂ（登録商標））；コナツムマブ（ＡＭＧ６５５
、ＣＡＳ８９６７３１−８２−１）；およびチガツズマブ（ＣＳ１００８、ＣＡＳ９４６
４１５−３４−５、Ｄａｉｉｃｈｉ Ｓａｎｋｙｏから入手可能）が挙げられる。

【0290】

チェックポイントキナーゼ（ＣＨＫ）阻害剤としては、限定されるものではないが、７
−ヒドロキシスタウロスポリン（ＵＣＮ−０１）；６−ブロモ−３−（１−メチル−１Ｈ
−ピラゾール−４−イル）−５−（３Ｒ）−３−ピペリジニル−ピラゾロ［１，５−ａ］
ピリミジン−７−アミン（ＳＣＨ９００７７６、ＣＡＳ８９１４９４−６３−６）；５−
（３−フルオロフェニル）−３−ウレイドチオフェン−２−カルボン酸Ｎ−［（Ｓ）−ピ
ペリジン−３−イル］アミド（ＡＺＤ７７６２、ＣＡＳ８６０３５２−０１−８）；４−
［（（３Ｓ）−１−アザビシクロ［２．２．２］オクタ−３−イル）アミノ］−３−（１
Ｈ−ベンズイミダゾール−２−イル）−６−クロロキノリン−２（１Ｈ）−オン（ＣＨＩ
Ｒ１２４、ＣＡＳ４０５１６８−５８−３）；７−アミノダクチノマイシン（７−ＡＡＤ
）、イソグラヌラチミド、デブロモヒメニアルジシン；Ｎ−［５−ブロモ−４−メチル−
２−［（２Ｓ）−２−モルホリニルメトキシ］−フェニル］−Ｎ’−（５−メチル−２−
ピラジニル）ウレア（ＬＹ２６０３６１８、ＣＡＳ９１１２２２−４５−２）；スルホラ
ファン（ＣＡＳ４４７８−９３−７、４−メチルスルフィニルブチルイソチオシアネート
）；９，１０，１１，１２−テトラヒドロ−９，１２−エポキシ−１Ｈ−ジインドロ［１
，２，３−ｆｇ：３’，２’，１’−ｋｌ］ピロロ［３，４−ｉ］［１，６］ベンゾジア
ゾシン−１，３（２Ｈ）−ジオン（ＳＢ−２１８０７８、ＣＡＳ１３５８９７−０６−２
）；およびＴＡＴ−Ｓ２１６Ａ（Sha et al., Mol. Cancer. Ther 2007; 6(1):147-153）
、およびＣＢＰ５０１（（ｄ−Ｂｐａ）ｓｗｓ（ｄ−Ｐｈｅ−Ｆ５）（ｄ−Ｃｈａ）ｒｒ
ｒｑｒｒ）が挙げられる。

【0291】

一態様では、本開示は、１または複数のＦＧＦＲ阻害剤と組み合わせた抗体薬物コンジ
ュゲートを、それを必要とする対象に投与することにより、がんを処置する方法を提供す
る。例えば、ＦＧＦＲ阻害剤としては、限定されるものではないが、アラニン酸ブリバニ
ブ（ＢＭＳ−５８２６６４、（Ｓ）−（（Ｒ）−１−（４−（４−フルオロ−２−メチル
−１Ｈ−インドール−５−イルオキシ）−５−メチルピロロ［２，１−ｆ］［１，２，４
」トリアジン−６−イルオキシ）プロパン−２−イル）２−アミノプロパノエート）；バ
ルガテフ（ＢＩＢＦ１１２０、ＣＡＳ９２８３２６−８３−４）；二酪酸ドビチニブ（Ｔ
ＫＩ２５８、ＣＡＳ８５２４３３−８４−２）；３−（２，６−ジクロロ−３，５−ジメ
トキシ−フェニル）−１−｛６−［４−（４−エチル−ピペラジン−１−イル）−フェニ
ルアミノ］−ピリミジン−４−イル｝−１−メチル−ウレア（ＢＧＪ３９８、ＣＡＳ８７
２５１１−３４−７）；ダヌセルチブ（ＰＨＡ−７３９３５８）；および（ＰＤ１７３０
７４、ＣＡＳ２１９５８０−１１−７）が挙げられる。特定の態様において、本開示は、
３−（２，６−ジクロロ−３，５−ジメトキシフェニル）−１−（６（（４−（４−エチ
ルピペラジン−１−イル）フェニル）アミノ）ピリミジン−４−イル）−１−メチルウレ
ア（ＢＧＪ−３９８としても知られる）；または４−アミノ−５−フルオロ−３−（５−
（４−メチルピペラジン１−イル）−１Ｈ−ベンゾ［ｄ］イミダゾール−２−イル）キノ
リン−２（１Ｈ）−オン（ドビチニブもしくはＴＫＩ−２５８としても知られる）、ＡＺ
Ｄ４５４７（Gavine et al., 2012, Cancer Research 72, 2045-56、Ｎ−［５−［２−（
３，５−ジメトキシフェニル）エチル］−２Ｈ−ピラゾール−３−イル］−４−（３Ｒ，
５Ｓ）−ジメチルピペラジン−１−イル）ベンザミド）、ポナチニブ（ＡＰ２４５３４；
Gozgit et al., 2012, Mol Cancer Ther., 11; 690-99；３−［２−（イミダゾ［１，２
−ｂ］ピリダジン−３−イル）エチニル］−４−メチル−Ｎ−｛４−［（４−メチルピペ
ラジン−１−イル）メチル］−３−（トリフルオロメチル）フェニル｝ベンザミド、ＣＡ
Ｓ９４３３１９−７０−８）などのＦＧＦＲ２阻害剤と組み合わせた抗体薬物コンジュゲ
ートを、それを必要とする対象に投与することにより、がんを処置する方法を提供する。

【0292】

医薬組成物
イムノコンジュゲートを含む医薬組成物または滅菌組成物を調製するために、本開示の
イムノコンジュゲートを、薬学的に許容される担体または賦形剤と混合する。組成物は、
消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）
、メラノーマ、肥満細胞白血病（ＭＣＬ）、肥満細胞症、神経線維腫症、乳がん、非小細
胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）および膵臓がんなどのがんを処置または防止するのに好適である
１または複数の他の治療剤をさらに含有してもよい。

【0293】

治療剤および診断剤の製剤を、例えば、凍結乾燥粉末、スラリー、水性溶液、ローショ
ン、または懸濁液の形態で生理的に許容される担体、賦形剤、または安定化剤と混合する
ことにより調製することができる（例えば、Hardman et al., Goodman and Gilman's The
Pharmacological Basis of Therapeutics, McGraw-Hill, New York, N.Y., 2001; Genna
ro, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott, Williams, and W
ilkins, New York, N.Y., 2000; Avis, et al. (eds.), Pharmaceutical Dosage Forms:
Parenteral Medications, Marcel Dekker, NY, 1993; Lieberman, et al. (eds.), Pharm
aceutical Dosage Forms: Tablets, Marcel Dekker, NY, 1990; Lieberman, et al. (eds
.) Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems, Marcel Dekker, NY, 1990; Weine
r and Kotkoskie, Excipient Toxicity and Safety, Marcel Dekker, Inc., New York, N
.Y., 2000を参照されたい）。

【0294】

特定の態様では、本開示の抗体薬物コンジュゲートの臨床サービス形態（ＣＳＦ）は、
ＡＤＣ、コハク酸ナトリウム、およびポリソルベ−ト２０を含有するバイアル中の凍結乾
燥物である。凍結乾燥物を注射用水で再構成させることができ、その溶液はＡＤＣ、コハ
ク酸ナトリウム、スクロース、およびポリソルベート２０、ｐＨ約５．０を含む。その後
の静脈内投与のために、得られる溶液は通常、担体溶液中にさらに希釈される。

【0295】

治療剤のための投与レジメンの選択は、実体の血清または組織代謝回転率、症状のレベ
ル、実体の免疫原性および生物学的マトリックス中の標的細胞の接近可能性などのいくつ
かの因子に依存する。ある特定の態様において、投与レジメンは、許容される副作用レベ
ルと一致する患者に送達される治療剤の量を最大化する。従って、送達される生物製剤の
量は、特定の実体および処置される状態の重症度に一部依存する。適切な用量の抗体、サ
イトカイン、および小分子を選択する際の指針が利用可能である（例えば、Wawrzynczak,
Antibody Therapy, Bios Scientific Pub. Ltd, Oxfordshire, UK, 1996; Kresina (ed.
), Monoclonal Antibodies, Cytokines and Arthritis, Marcel Dekker, New York, N.Y.
, 1991; Bach (ed.), Monoclonal Antibodies and Peptide Therapy in Autoimmune Dise
ases, Marcel Dekker, New York, N.Y., 1993; Baert et al., New Engl. J. Med. 348:6
01-608, 2003; Milgrom et al., New Engl. J. Med. 341:1966-1973, 1999; Slamon et a
l., New Engl. J. Med. 344:783-792, 2001; Beniaminovitz et al., New Engl. J. Med.
342:613-619, 2000; Ghosh et al., New Engl. J. Med. 348:24-32, 2003; Lipsky et a
l., New Engl. J. Med. 343:1594-1602, 2000を参照されたい）。

【0296】

適切な用量の決定は、例えば、処置に影響するか、または処置に影響すると予測される
ことが当業界で公知の、または疑われるパラメータまたは因子を使用して、医師によって
行われる。一般に、用量は最適用量よりもいくらか低い量から開始し、その後、任意の負
の副作用と比較して所望の、または最適な効果が達成されるまで少しずつ増加させる。重
要な診断尺度は、例えば、生成される炎症性サイトカインの炎症またはレベルの症状のも
のを含む。

【0297】

医薬組成物抗体薬物コンジュゲート中の活性成分の急性用量レベルを、患者にとって毒
性とならないように、特定の患者、組成物、および投与様式に対する所望の治療応答を達
成するのに有効である活性成分の量を得るために変化させることができる。選択される用
量レベルは、使用される本開示の特定の組成物、またはそのエステル、塩もしくはアミド
の活性、投与経路、投与の時間、使用される特定の化合物の排出速度、処置の持続期間、
使用される特定の組成物と共に使用される他の薬物、化合物および／または材料、処置さ
れる患者の年齢、性別、体重、状態、一般的健康および以前の病歴、ならびに医学界で公
知の同様の因子を含む様々な薬物動態因子に依存する。

【0298】

抗体またはその断片を含む組成物を、連続輸注により、または例えば、１日、１週間、
もしくは週に１〜７回の間隔での用量により提供することができる。用量を、静脈内、皮
下、局所、経口、経鼻、直腸、筋肉内、大脳内で、または吸入により提供することができ
る。特定の用量プロトコールは、有意な望ましくない副作用を回避する最大用量または用
量頻度を含むものである。

【0299】

本開示のイムノコンジュゲートに関して、患者に投与される用量は、０．０００１ｍｇ
／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ患者体重であってもよい。用量は、０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜
２０ｍｇ／ｋｇ、０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜
５ｍｇ／ｋｇ、０．０００１〜２ｍｇ／ｋｇ、０．０００１〜１ｍｇ／ｋｇ、０．０００
１ｍｇ／ｋｇ〜０．７５ｍｇ／ｋｇ、０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜０．５ｍｇ／ｋｇ、０．
０００１ｍｇ／ｋｇ〜０．２５ｍｇ／ｋｇ、０．０００１〜０．１５ｍｇ／ｋｇ、０．０
００１〜０．１０ｍｇ／ｋｇ、０．００１〜０．５ｍｇ／ｋｇ、０．０１〜０．２５ｍｇ
／ｋｇまたは０．０１〜０．１０ｍｇ／ｋｇ患者体重であってもよい。抗体またはその断
片の用量を、キログラム患者体重（ｋｇ）に、ｍｇ／ｋｇで投与される用量を掛けたもの
を使用して算出することができる。

【0300】

イムノコンジュゲートの用量を反復し、投与を少なくとも１日、２日、３日、５日、１
０日、１５日、３０日、４５日、２カ月、７５日、３カ月、または少なくとも６カ月空け
てもよい。特定の態様においては、本開示のイムノコンジュゲートの用量を、３週間毎に
反復する。

【0301】

特定の患者のための有効量は、処置される状態、患者の全体的な健康、投与の方法、経
路および用量ならびに副作用の重症度などの因子に応じて変化してもよい（例えば、Mayn
ard et al., A Handbook of SOPs for Good Clinical Practice, Interpharm Press, Boc
a Raton, Fla., 1996; Dent, Good Laboratory and Good Clinical Practice, Urch Publ
., London, UK, 2001を参照されたい）。

【0302】

投与経路は、例えば、局所もしくは皮膚適用、静脈内、腹腔内、大脳内、筋肉内、眼内
、動脈内、脳脊髄内、病変内による注射もしくは輸注、または持続放出系もしくは埋込み
体によるものであってもよい（例えば、Sidman et al., Biopolymers 22:547-556, 1983;
Langer et al., J. Biomed. Mater. Res. 15:167-277, 1981; Langer, Chem. Tech. 12:
98-105, 1982; Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688-3692, 1985; Hwa
ng et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4030-4034, 1980; 米国特許第６，３５０，
４６６号および第６，３１６，０２４号を参照されたい）。必要に応じて、組成物はまた
、可溶化剤または注射部位での疼痛を軽減するためのリドカインなどの局所麻酔剤、また
はその両方を含んでもよい。さらに、例えば、吸入器または噴霧器、およびエアゾール化
剤を含む製剤の使用により、肺投与を使用することもできる。例えば、米国特許第６，０
１９，９６８号、第５，９８５，３２０号、第５，９８５，３０９号、第５，９３４，２
７２号、第５，８７４，０６４号、第５，８５５，９１３号、第５，２９０，５４０号、
および第４，８８０，０７８；ならびにＰＣＴ公開第ＷＯ９２／１９２４４号、第ＷＯ９
７／３２５７２号、第ＷＯ９７／４４０１３号、第ＷＯ９８／３１３４６号、および第Ｗ
Ｏ９９／６６９０３号（それぞれ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参
照されたい。

【0303】

本開示の組成物を、１または複数の当業界で公知の様々な方法を使用して、１または複
数の投与経路により投与することもできる。当業者であれば理解できるように、投与の経
路および／または様式は、所望の結果に応じて変化する。イムノコンジュゲートのために
選択される投与経路としては、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、皮下、脊髄または例えば
、注射もしくは輸注による他の非経口投与経路が挙げられる。非経口投与は、通常は注射
による、腸内投与および局所投与以外の投与様式であってよく、限定されるものではない
が、静脈内、筋肉内、動脈内、鞘内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮
下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内、硬膜外および胸骨内注射および輸注が
挙げられる。あるいは、本開示の組成物を、局所、表皮または粘膜投与経路などの非経口
経路により、例えば、鼻内的、経口的、経膣的、直腸的、舌下的または局所的に投与する
ことができる。一態様において、本開示のイムノコンジュゲートは、輸注により投与され
る。別の態様において、イムノコンジュゲートは皮下投与される。

【0304】

本開示のイムノコンジュゲートを制御放出系または持続放出系において投与する場合、
ポンプを使用して制御放出または持続放出を達成することができる（Langer, supra; Sef
ton, CRC Crit. Ref Biomed. Eng. 14:20, 1987; Buchwald et al., Surgery 88:507, 19
80; Saudek et al., N. Engl. J. Med. 321:574, 1989を参照されたい）。ポリマー材料
を使用して、イムノコンジュゲートの療法の制御放出または持続放出を達成することがで
きる（例えば、Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.)
, CRC Pres., Boca Raton, Fla., 1974; Controlled Drug Bioavailability, Drug Produ
ct Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York, 1984; Ranger
and Peppas, J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61, 1983を参照されたい；
また、Levy et al., Science 228:190, 1985; During et al., Ann. Neurol. 25:351, 19
89; Howard et al., J. Neurosurg. 7 1:105, 1989; 米国特許第５，６７９，３７７号；
米国特許第５，９１６，５９７号；米国特許第５，９１２，０１５号；米国特許第５，９
８９，４６３号；米国特許第５，１２８，３２６号；ＰＣＴ公開第ＷＯ９９／１５１５４
号；およびＰＣＴ公開第ＷＯ９９／２０２５３号も参照されたい）。持続放出製剤におい
て使用されるポリマーの例としては、限定されるものではないが、ポリ（２−ヒドロキシ
エチルメタクリレート）、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（アクリル酸）、ポリ（
エチレン−コ−ビニルアセテート）、ポリ（メタクリル酸）、ポリグリコリド（ＰＬＧ）
、ポリ無水物、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリアクリ
ルアミド、ポリ（エチレングリコール）、ポリラクチド（ＰＬＡ）、ポリ（ラクチド−コ
−グリコリド）（ＰＬＧＡ）、およびポリオルトエステルが挙げられる。一態様において
、持続放出製剤において使用されるポリマーは、不活性であり、浸出性不純物を含まず、
保存時に安定であり、無菌であり、および生分解性である。制御放出系または持続放出系
を、予防または治療標的の近くに置き、かくして、全身用量のほんの一部のみを要するよ
うにすることができる（例えば、Goodson, in Medical Applications of Controlled Rel
ease, supra, vol. 2, pp. 115-138, 1984を参照されたい）。

【0305】

制御放出系は、Langer, Science 249:1527-1533, 1990による概説で考察されている。
当業者には公知の任意の技術を使用して、本開示の１または複数のイムノコンジュゲート
を含む持続放出製剤を生成することができる。例えば、米国特許第４，５２６，９３８号
、ＰＣＴ公開第ＷＯ９１／０５５４８号、ＰＣＴ公開第ＷＯ９６／２０６９８号、Ning e
t al., Radiotherapy & Oncology 39:179-189, 1996；Song et al., PDA Journal of Pha
rmaceutical Science & Technology 50:372-397, 1995；Cleek et al., Pro. Int'l. Sym
p. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:853-854, 1997；およびLam et al., Proc. Int'l.
Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24:759-760, 1997（それぞれ、その全体が参照に
より本明細書に組み込まれる）を参照されたい。

【0306】

本開示のイムノコンジュゲートを局所投与する場合、それらを軟膏、クリーム、経皮パ
ッチ、ローション、ゲル、シャンプー、スプレー、エアゾール、溶液、乳濁液の形態、ま
たは当業者には周知の他の形態で製剤化することができる。例えば、Remington's Pharma
ceutical Sciences and Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms, 19th ed., Mac
k Pub. Co., Easton, Pa. (1995)を参照されたい。非スプレー可能局所剤形については、
局所適用と適合する担体または１もしくは複数の賦形剤を含み、いくつかの場合、水より
も高い動的粘度を有する粘性から半固体または固体の形態が典型的に使用される。好適な
製剤としては、限定されるものではないが、必要に応じて、滅菌されるか、または例えば
、浸透圧などの様々な特性に影響を及ぼすための補助剤（例えば、保存剤、安定化剤、湿
潤剤、バッファー、もしくは塩）と混合される、溶液剤、懸濁液剤、乳濁液剤、クリーム
剤、軟膏剤、散剤、リミネント剤、蝋膏剤（salve）などが挙げられる。他の好適な局所
剤形としては、いくつかの場合、固体または液体の不活性担体と組み合わせた活性成分が
、加圧された揮発性物質（例えば、フレオンなどの気体噴射剤）との混合物中、またはス
クイーズボトル中に充填される、スプレー可能なエアゾール調製物が挙げられる。必要に
応じて、モイスチャライザーまたは保湿剤（humectant）を医薬組成物および剤形に添加
することもできる。そのような追加の成分の例は、当業界で周知である。

【0307】

イムノコンジュゲートを含む組成物を鼻内投与する場合、それをエアゾール形態、スプ
レー、ミストまたは液滴の形態で製剤化することができる。特に、本開示による使用のた
めの予防剤または治療剤を、好適な噴射剤（例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリク
ロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の好適な気体
）の使用と共に、加圧パックまたは噴霧器からのエアゾールスプレー提示物の形態で都合
良く送達することができる。加圧エアゾールの場合、一定量を送達するためのバルブを提
供することにより、用量単位を決定することができる。化合物と、ラクトースまたはデン
プンなどの好適な粉末基剤との粉末混合物を含有する、吸入器または散布器における使用
のためのカプセルおよびカートリッジ（例えば、ゼラチンから構成される）を製剤化する
ことができる。

【0308】

第２の治療剤、例えば、サイトカイン、ステロイド、化学療法剤、抗生物質、または放
射線療法との同時投与または処置のための方法は、当業界で公知である（例えば、Hardma
n et al., (eds.) (2001) Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therap
eutics, 10.sup.th ed., McGraw-Hill, New York, N.Y.; Poole and Peterson (eds.) (2
001) Pharmacotherapeutics for Advanced Practice:A Practical Approach, Lippincott
, Williams & Wilkins, Phila., Pa.; Chabner and Longo (eds.) (2001) Cancer Chemot
herapy and Biotherapy, Lippincott, Williams & Wilkins, Phila., Pa.を参照されたい
）。治療剤の有効量は、症状を少なくとも１０％；少なくとも２０％；少なくとも約３０
％；少なくとも４０％、または少なくとも５０％減少させることができる。

【0309】

イムノコンジュゲートと共に投与することができるさらなる療法（例えば、予防剤また
は治療剤）を、本開示のイムノコンジュゲートから５分未満空けて、３０分未満空けて、
１時間空けて、約１時間空けて、約１〜約２時間空けて、約２時間〜約３時間空けて、約
３時間〜約４時間空けて、約４時間〜約５時間空けて、約５時間〜約６時間空けて、約６
時間〜約７時間空けて、約７時間〜約８時間空けて、約８時間〜約９時間空けて、約９時
間〜約１０時間空けて、約１０時間〜約１１時間空けて、約１１時間〜約１２時間空けて
、約１２時間〜約１８時間空けて、１８時間〜２４時間空けて、２４時間〜３６時間空け
て、３６時間〜４８時間空けて、４８時間〜５２時間空けて、５２時間〜６０時間空けて
、６０時間〜７２時間空けて、７２時間〜８４時間空けて、８４時間〜９６時間空けて、
または９６時間〜１２０時間空けて投与することができる。２つ以上の療法を、１回の同
じ患者訪問のうちに投与してもよい。

【0310】

ある特定の態様では、イムノコンジュゲートを、ｉｎ ｖｉｖｏでの適切な分布を確保
するように製剤化することができる。例えば、血液脳関門（ＢＢＢ）は多くの高親水性化
合物を排除する。本開示の治療化合物がＢＢＢを通過することを確保するために（必要に
応じて）、それらを、例えば、リポソーム中で製剤化することができる。リポソームを製
造する方法については、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号；第５，３７４，５４
８号；および第５，３９９，３３１号を参照されたい。リポソームは、特定の細胞または
臓器中に選択的に輸送される１または複数の部分を含み、かくして、標的化薬物送達を増
強してもよい（例えば、Ranade, (1989) J. Clin. Pharmacol. 29:685を参照されたい）
。標的化部分の例としては、葉酸またはビオチン（例えば、Low et al.の米国特許第５，
４１６，０１６号を参照されたい）；マンノシド（Umezawa et al., (1988) Biochem. Bi
ophys. Res. Commun. 153:1038）；抗体（Bloeman et al., (1995) FEBS Lett. 357:140;
Owais et al., (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39:180）；界面活性プロテイン
Ａ受容体（Briscoe et al., (1995) Am. J. Physiol. 1233:134）；ｐ１２０（Schreier
et al, (1994) J. Biol. Chem. 269:9090）が挙げられ、K. Keinanen; M. L. Laukkanen
(1994) FEBS Lett. 346:123; J. J. Killion; I. J. Fidler (1994) Immunomethods 4:27
3も参照されたい。

【0311】

本開示は、単独で、または他の療法と組み合わせたイムノコンジュゲートを含む医薬組
成物を、それを必要とする対象に投与するためのプロトコールを提供する。組合せ療法（
例えば、予防剤または治療剤）を、同時的または連続的に対象に投与することができる。
組合せ療法の療法（例えば、予防剤または治療剤）を、周期的に投与することもできる。
周期的療法は、療法（例えば、薬剤）の１つに対する耐性の発生を軽減するため、療法（
例えば、薬剤）の１つの副作用を回避もしくは軽減する、および／または療法の効果を改
善するための、一定期間、第１の療法（例えば、第１の予防剤または治療剤）の投与、次
いで、一定期間、第２の療法（例えば、第２の予防剤または治療剤）の投与、およびこの
連続的投与の反復、すなわち、周期を含む。

【0312】

本開示の組合せ療法の療法（例えば、予防剤または治療剤）を、対象に同時に投与する
ことができる。

【0313】

用語「同時に」は、正確に同時の療法（例えば、予防剤または治療剤）の投与に限定さ
れないが、むしろ、抗体またはその断片を含む医薬組成物が対象に連続して、およびイム
ノコンジュゲートが他の療法（複数可）と一緒に作用して、それらを別途投与した場合よ
りも増大した利益を提供し得るような時間間隔で投与されることを意味する。例えば、そ
れぞれの療法を同時に、または異なる時点で任意の順序で連続的に投与することができる
；しかしながら、同時に投与しない場合、それらを十分に近い時間で投与して、所望の治
療または予防効果を提供するべきである。それぞれの療法を、任意の適切な形態で、およ
び任意の好適な経路により、別々に対象に投与することができる。様々な態様において、
療法（例えば、予防剤または治療剤）を、１５分未満空けて、３０分未満空けて、１時間
未満空けて、約１時間空けて、約１〜約２時間空けて、約２時間〜約３時間空けて、約３
時間〜約４時間空けて、約４時間〜約５時間空けて、約５時間〜約６時間空けて、約６時
間〜約７時間空けて、約７時間〜約８時間空けて、約８時間〜約９時間空けて、約９時間
〜約１０時間空けて、約１０時間〜約１１時間空けて、約１１時間〜約１２時間空けて、
２４時間空けて、４８時間空けて、７２時間空けて、または１週間空けて対象に投与する
。他の態様において、２以上の療法（例えば、予防剤または治療剤）を、同じ患者訪問の
うちに投与する。

【0314】

組合せ療法の予防剤または治療剤を、同じ医薬組成物中で対象に投与することができる
。あるいは、組合せ療法の予防剤または治療剤を、別々の医薬組成物中、対象に同時に投
与することができる。予防剤または治療剤を、同じか、または異なる投与経路により対象
に投与してもよい。
実施例

【実施例1】

【0315】

ハイブリドーマ技術によるｃＫＩＴ Ａｂの作成
抗原および他のタンパク質
ヒトｃＫＩＴタンパク質を分泌する一過的発現細胞系を、２９３Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ（
商標）細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａ）のトランスフェクション
により作成した。簡単に述べると、Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ（商標）培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇ
ｅｎ）中で培養した細胞を、２９３Ｆｅｃｔｉｎ（商標）トランスフェクション試薬およ
びヒトｃＫＩＴ ｃＤＮＡのＥＣＤと、配列のＣ末端のＨｉｓ６タグ、またはマウスＦｃ
（ｐＦＵＳＥ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）とを含有する組換え
プラスミドを使用してトランスフェクトした。４８〜７２時間後、培地を遠心分離して細
胞を除去し、滅菌濾過し、透明化された溶解物をタンパク質精製のために使用する。

【0316】

Ｈｉｓ６タグ付ｃＫＩＴについて、得られる濃縮液を０．５ｍＬ／ｍｉｎでＮｉＮＴＡ
Ｈｉｓ−Ｂｉｎｄ Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗカラムに印加した。ＰＢＳを使用するベースラ
イン洗浄の後、結合した材料を、イミダゾールの段階的勾配（１０〜５００ｍＭ）を含む
ＰＢＳで溶出させた。得られる溶出液をＰＢＳ、ｐＨ７．３に対して透析し、滅菌濾過し
、アリコートした。Ｆｃ−ｃＫｉｔ融合物について、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ ｆａｓｔＦｌ
ｏｗカラムを上記に概略されたように使用し（ＮｉＮＴＡの代わりに）、ｐＨ３グリシン
バッファーを使用して溶出し、Ｔｒｉｓ、ｐＨ８で中和した。

【0317】

ハイブリドーマの作成
マウスの免疫化およびハイブリドーマの生成
精製されたｃＫＩＴを、Ｆｒｅｕｎｄ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ａｄｊｕｖａｎｔで１：１
に希釈した後、Ｂｃｌ−２トランスジェニックマウス（Ｃ５７ＢＬ／６−Ｔｇｎ（ｂｃｌ
−２）２２ Ｗｅｈｉ株）を免疫した。マウスを、Ｒｅｐｅｔｉｔｉｖｅ Ｉｍｍｕｎｉ
ｚａｔｉｏｎ ａｔ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｓｉｔｅｓ（ＲＩＭＭＳ）（McIntyre GD., Hy
bridoma, 1997）をコールする手順を使用して免疫した。簡単に述べると、末梢リンパ節
（ＰＬＮ）に近い８つの特定部位で１〜３μｇの抗原をマウスに注射した。この手順を、
１２日間にわたって８回繰り返した。１２日目に、試験血液を採取し、血清抗体力価をＥ
ＬＩＳＡにより分析した。プールしたＰＬＮを１５日目に高力価マウスから取り出した。
リンパ球を収獲するために、ＰＬＮをプレーンＤＭＥＭで２回洗浄した後、０．２２ミク
ロンのスクリーン（Ｆａｌｃｏｎ＃３５２３５０、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｓａｎ
Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を通す濾過により分離させた。得られるリンパ球をさらに２回洗浄し
た後、融合した。Ｆ０ミエローマ細胞を、２．５のリンパ球と１のＦ０細胞との比でリン
パ球と混合した。細胞混合物を遠心分離した後、１ｍＬのＰＥＧ１５００を１ｍｉｎ、滴
下しながら細胞ペレットに添加した。３０秒後、１ｍＬのＤＭＥＭをゆっくり添加し、１
ｍｉｎ後、１９ｍＬのＤＭＥＭを５ｍｉｎ添加した。融合した細胞を沈降させ、２ｘ１０
^５細胞／ｍＬの密度でＨＡＴ培地（ＤＭＥＭ＋２０％ＦＢＳ、Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ／Ｇｌ
ｕ、１ｘＮＥＡＡ、１ｘＨＡＴ、０．５ｘＨＦＣＳ）中に懸濁し、１ｈ、３７℃に入れた
。次いで、細胞を、６０μＬ／ウェルで３８４ウェルプレート中に播種した。

【0318】

ｃＫＩＴに対する抗体を分泌するハイブリドーマのスクリーニング
融合の１０日後に、ハイブリドーマプレートを、ｃＫＩＴ特異的抗体の存在についてス
クリーニングした。ＥＬＩＳＡスクリーンのために、Ｍａｘｉｓｏｒｐ ３８４ウェルプ
レート（Ｎｕｎｃ＃４６４７１８）を、５０μＬのｃＫＩＴ（ＰＢＳ中で１５ｎｇ／ウェ
ルに希釈）で被覆し、４℃で一晩インキュベートした。残存するタンパク質を吸引し、ウ
ェルをＰＢＳ中の１％ＢＳＡで遮断した。室温で３０ｍｉｎインキュベートした後、ＰＢ
Ｓ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ（ＰＢＳＴ）で４回、ウェルを洗浄した。１５μＬのハイブリ
ドーマ上清をＥＬＩＳＡプレートに移した。ＰＬＮ除去の時点で取った１５μＬのマウス
血清を、ＰＢＳ中で１：１０００に希釈し、陽性対照として添加した。５０μＬの二次抗
体（ヤギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ＃
１１５−０３５−０７１、Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）、ＰＢＳ中で１：５０００に希
釈）を、ＥＬＩＳＡプレート上の全ウェルに添加した。室温で１ｈのインキュベーション
後、プレートをＰＢＳＴで８回洗浄した。２５μＬのＴＭＢ（ＫＰＬ＃５０−７６−０５
）を添加し、室温で３０ｍｉｎのインキュベーション後、プレートを６０５ｎｍの吸光度
で読取った。陽性ウェルからの細胞を、ＨＴ培地（ＤＭＥＭ＋２０％ＦＢＳ、Ｐｅｎ／Ｓ
ｔｒｅｐ／Ｇｌｕ、１ｘＮＥＡＡ、１ｘＨＴ、０．５ｘＨＦＣＳ）中、２４ウェルプレー
ト中で増殖させた。

【0319】

抗体の精製
ｃＫＩＴ抗体を含有する上清を、プロテインＧ（Ｕｐｓｔａｔｅ＃１６−２６６（Ｂｉ
ｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ））を使用して精製した。上清を充填する前に、樹脂を１０倍カラ
ム容量のＰＢＳで平衡化させた。試料の結合後、カラムを１０倍カラム容量のＰＢＳで洗
浄した後、抗体を５倍カラム容量の０．１Ｍグリシン、ｐＨ２．０で溶出させた。カラム
画分を１／１０倍容量のＴｒｉｓ ＨＣｌ、ｐＨ９．０ですぐに中和した。画分のＯＤ２
８０を測定し、陽性画分をプールし、ＰＢＳ、ｐＨ７．２に対して一晩透析した。

【実施例2】

【0320】

抗ｃＫＩＴ抗体のヒト化および親和性成熟
ヒト化の設計
ハイブリドーマ由来抗ｃＫＩＴ抗体９Ｐ３のＶＨおよびＶＬ配列は、それぞれ、配列番
号９および配列番号１８である。完全なＩｇＧ１を作成するために使用されるヒトＩｇＧ
１定常ドメインのアミノ酸配列は、重鎖については配列番号１０、軽鎖については配列番
号１９である。抗ｃＫＩＴ抗体９Ｐ３に由来する３つのＣＤＲ領域（ＧＦＴＦＳＤＹＹＭ
Ａ（配列番号１４８））、（ＮＩＮＹＤＧＳＳＴＹＹＬＤＳ（配列番号１４９））および
（ＧＤＹＹＧＴＴＹＷＹＦＤＶ（配列番号１５０））を、ヒト生殖系列アクセプターフレ
ームワークＶＨ３＿３−０７（ｖＢＡＳＥデータベース）上に移植することにより、重鎖
のヒト化を達成した。抗ｃＫＩＴ抗体９Ｐ３に由来する３つのＣＤＲ領域（ＲＡＳＱＤＩ
ＳＮＹＬＮ（配列番号１５１））、（ＹＴＳＲＬＱＳ（配列番号１５２））および（ＱＱ
ＧＫＫＬＷＳ（配列番号１５３））を、ヒト生殖系列アクセプターフレームワークＶＫ３
−Ｌ２５（ｖＢＡＳＥデータベース）上に移植するか、または２つのＣＤＲ領域（配列番
号１５２および配列番号１５３）をヒト生殖系列アクセプターフレームワークＶＫ１−Ｏ
１２（ｖＢＡＳＥデータベース）上に移植することにより、軽鎖のヒト化を達成した。Ｃ
ＤＲ領域に加えて、可変軽鎖ドメインの１つのフレームワーク残基、すなわち、ＶＬ＃７
１およびＶＫ３−Ｌ２５の場合、ＶＬ＃７９（配列番号２１に基づく残基番号）を、９Ｐ
３配列から保持した。さらに、ヒトＪエレメントＪＨ４およびＪＫ４を、それぞれ、重鎖
および軽鎖のために使用した。ヒト化抗体重鎖の得られるアミノ酸配列は配列番号１１で
あり、２つの軽鎖については配列番号２０（ＶＫ１−Ｏ１２）および配列番号２１（ＶＫ
３−Ｌ６）である。

【0321】

本発明者らは、アミノ酸モチーフ、アスパラギン酸、次いで、グリシン（ＤＧ）は、翻
訳後改変（イソ−アスパラギン酸形成）を受けやすく、ＣＤＲ内のリシンは抗体−薬物コ
ンジュゲーション後に活性抗体の画分を減少させ得ると仮定した。無作為突然変異誘発（
すなわち、変異性ＰＣＲ）と定方向突然変異誘発との組合せを適用して、ヒト化抗体を最
適化した。

【0322】

ヒト化配列の作成
ホモ・サピエンス（homo sapiens）のためのコドン最適化を含む、ヒト化ＶＬおよびＶ
ＨドメインをコードするＤＮＡ配列を、ＧｅｎｅＡｒｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｋｏｇ
ｉｅｓ Ｉｎｃ．Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に注文した。ＶＬおよびＶＨ
ドメインをコードする配列を、哺乳動物細胞中での分泌にとって好適な発現ベクター中に
ＧｅｎｅＡｒｔ由来ベクターからの切断および貼付によりサブクリーニングした。重鎖お
よび軽鎖を個々の発現ベクター中にクローニングして、同時トランスフェクションを可能
にした。発現ベクターのエレメントとしては、プロモーター（サイトメガロウイルス（Ｃ
ＭＶ）エンハンサー−プロモーター）、分泌を容易にするためのシグナル配列、ポリアデ
ニル化シグナルおよび転写ターミネーター（ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）遺伝子）、エピ
ソーム複製および原核生物中での複製を可能にするエレメント（例えば、ＳＶ４０起源お
よびＣｏｌＥ１または当業界で公知の他のもの）ならびに選択を可能にするエレメント（
アンピシリン耐性遺伝子およびゼオシンマーカー）が挙げられる。

【0323】

ヒト化抗体の発現および精製
ＳＶ４０ラージＴ抗原を構成的に発現するヒト胚性腎細胞（ＨＥＫ２９３−Ｔ ＡＴＣ
Ｃ１１２６８）は、ヒト化および／または最適化されたＩｇＧタンパク質の一過的発現の
ための好ましい宿主細胞系の１つである。トランスフェクションを、トランスフェクショ
ン試薬としてＰＥＩ（ポリエチレンイミン、ＭＷ２５．０００線状、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎ
ｃｅｓ、ＵＳＡカタログ番号２３９６６）を使用して実施する。９００ｍｌの細胞培養等
級の水に室温（ＲＴ）で１ｇのＰＥＩを注意深く溶解することにより、ＰＥＩストック溶
液を調製する。ＰＥＩの溶解を容易にするために、ＨＣｌをｐＨ３〜５となるように添加
することにより溶液を酸性化した後、ＮａＯＨで７．０５の最終ｐＨとなるように中和し
た。最後に、容量を１Ｌに調整し、溶液を０．２２μｍフィルターを通して濾過し、アリ
コートし、さらなる使用まで−８０℃で凍結した。一度解凍したら、アリコートを−２０
℃で３回まで再凍結してもよいが、−２０℃では長期保存すべきではない。ＨＥＫ２９３
Ｔ細胞を、細胞のトランスフェクションおよび増殖のためのＮｏｖａｒｔｉｓに特許のあ
る無血清培養培地、および生成／供給培地としてのＥｘＣｅｌｌ ＶＰＲＯ無血清培養培
地（ＳＡＦＣ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＵＳＡ、カタログ番号２４５６１Ｃ）を使用し
て培養する。一過的トランスフェクションのために調製された細胞を、懸濁培養で培養す
る。小規模（＜５Ｌ）トランスフェクションのためには、細胞を、５％ＣＯ２で加湿され
たインキュベータ中、オービタルシェーカー（１００〜１２０ｒｐｍ）上のＣｏｒｎｉｎ
ｇ振とうフラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｔｅｗｋｓｂｕｒｙ、ＭＡ）中で成長させる（種フ
ラスコ）。種培養中の細胞を、指数増殖期（５ｘ１０^５〜３ｘ１０^６／ｍＬの細胞密度）
に維持すべきであり、トランスフェクションのためには９０％を超える生存能力を示すべ
きである。この範囲の外側の細胞密度は、希釈後に遅滞期またはトランスフェクション効
率の低下をもたらす。小規模（＜５Ｌ）トランスフェクションのために、細胞のアリコー
トを種培養から取り、Ｎｏｖａｒｔｉｓ無血清培養培地を使用して最終容量の３６％中、
１．４ｘ１０^６細胞／ｍＬに調整する。最終培養容量の７％中にＤＮＡを１ｍｇ／Ｌ（最
終容量）に希釈した後、穏やかに混合することにより、ＤＮＡ溶液（溶液１：１Ｌのトラ
ンスフェクションのために０．５ｍｇの重鎖および０．５ｍｇの軽鎖発現プラスミド）を
調製する。細菌汚染を防止するために、この溶液を０．２２μｍフィルター（例えば、Ｍ
ｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｔｅｒｉｃｕｐ）を使用して濾過する。次いで、３ｍｇ／Ｌ（最終
容量）のＰＥＩ溶液も、最終培養容量の７％中に希釈し、穏やかに混合した（溶液２）。
両溶液を、室温（ＲＴ）で５〜１０ｍｉｎインキュベートする。その後、溶液２を、穏や
かに混合しながら溶液１に添加し、室温でさらに５〜１５分間インキュベートする。次い
で、トランスフェクション混合物を細胞に添加し、細胞の培養を４〜６時間継続する。最
後に、残りの５０％の全生成容量を、ＥｘＣｅｌｌ（登録商標）ＶＰＲＯ無血清培養培地
の添加により達成する。細胞培養を、トランスフェクション後１１日間継続する。培養物
を４℃で２０分間、４５００ｒｐｍでの遠心分離により収獲する（Ｈｅｒａｅｕｓ（登録
商標）、Ｍｕｌｔｉｆｕｇｅ ３ Ｓ−Ｒ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏ
ｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）。回収された細胞上清を、ｓｔｅｒｉｃｕｐフィルター（０．２２
μｍ）を通して滅菌濾過し、さらなるプロセッシングまで４℃で保存する。

【0324】

新鮮に消毒された（０．２５Ｍ ＮａＯＨ）ＨｉＴｒａｐ ＰｒｏｔＡ ＭａｂＳｅｌ
ｅｃｔ（登録商標）ＳｕＲｅ、５ｍｌカラムを使用して、冷却キャビネット中、４℃で「
ＡＫＴＡ １００ ｅｘｐｌｏｒｅｒ Ａｉｒ」クロマトグラフィーシステム上で、精製
を実施した。カラムを５倍カラム容量（ＣＶ）のＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃ
ｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）で平衡化した後、滅菌濾過された上清（
２Ｌ）を４．０ｍｌ／ｍｉｎで充填した。カラムを８ＣＶのＰＢＳで洗浄して、未結合の
試料を溶出させ、５ＣＶのＰＢＳで再度洗浄した。抗体を、５ＣＶの５０ｍＭクエン酸、
７０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ３．２で溶出させた。溶出液を３ｍｌ画分で収集し、画分をプ
ールし、１Ｍ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ ｐＨ１０でｐＨ７に調整した。プールをプールし、滅
菌濾過（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｔｅｒｉｆｌｉｐ、０．２２ｕｍ）し、ＯＤ２８０ｎｍ
をＳｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ ＮＤ−１０００（ＮａｎｏＤｒｏｐ）中で測定
し、タンパク質濃度を配列データに基づいて算出した。溶出液を、凝集（ＳＥＣ−ＭＡＬ
Ｓ）および純度（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＬＡＬおよびＭＳ）について試験した。２回目の精
製ステップのために、必要に応じて、１回目の精製からのプールを、新鮮に消毒された（
０．５Ｍ ＮａＯＨ）ＳＰＸ（Ｈｉ Ｌｏａｄ １６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００
グレード１２０ｍＬ（ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）中に充填した。カラムをＰＢＳで平
衡化し、１ｍｌ／ｍｉｎでＰＢＳバッファーを使用して泳動を行い、溶出液を１．２ｍｌ
画分中に収集し、１回目の精製ステップについて記載されたように分析した。

【実施例3】

【0325】

抗ｃＫＩＴ抗体のスクリーニング
ＨｕＣＡＬ ＰＬＡＴＩＮＵＭ（登録商標）パンニング
ヒトｃＫＩＴを認識する抗体の選択のために、複数のパンニング戦略を使用した。抗体
バリアントタンパク質の供給源として商業的に入手可能なファージディスプレイライブラ
リー、Ｍｏｒｐｈｏｓｙｓ ＨｕＣＡＬ ＰＬＡＴＩＮＵＭ（登録商標）ライブラリー（
Ｍｏｒｐｈｏｓｙｓ、Ｍｕｎｉｃｈ ＤＥ）を使用して、高い親和性結合親和性を有する
クローンの選択により、ヒトｃＫＩＴタンパク質に対する治療抗体を作成した。このファ
ージミドライブラリーは、ＨｕＣＡＬ（登録商標）コンセプト（Knappik et al., (2000)
J Mol Biol 296: 57-86）に基づくものであり、ファージ表面上にＦａｂを展示するため
にＣｙｓＤｉｓｐｌａｙ（登録商標）技術を使用する（Lohning、ＷＯ０１／０５９５０
）。抗ｃＫＩＴ抗体の単離のために、標準的なパンニング戦略を、固相、溶液、全細胞お
よび示差的全細胞パンニング手法を使用して実施した。

【0326】

ｃＫＩＴに対する固相パンニング
９６ウェルＭａｘｉＳｏｒｐ（商標）プレートを、４℃でｏ／ｎ、ヒトまたはマウスｃ
ＫＩＴ Ｆｃ融合タンパク質で被覆した。それぞれのパンニングのために、約４ｘ１０^１
３のＨｕＣＡＬ ＰＬＡＴＩＮＵＭ（登録商標）ファージ抗体を、被覆された各抗原に添
加し、マイクロタイタープレート振とう器上、ＲＴで２ｈインキュベートした。その後、
非特異的に結合したファージを数回の洗浄ステップにより洗浄除去し、特異的に結合した
ファージを１０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ ｐＨ８中の２５ｍＭ ＤＴＴを使用して溶出さ
せた。

【0327】

溶出液を１４ｍｌの大腸菌（E.coli）細菌中に移し、ファージ感染のためにインキュベ
ートした。感染した細菌を２ｘＹＴ培地中に再懸濁し、ＬＢ／Ｃａｍ寒天プレート上に塗
布し、ｏ／ｎインキュベートした。コロニーをプレートから擦り取り、ファージレスキュ
ー、選択されたクローンのポリクローナル増幅、およびファージ生成のために使用した。
精製されたファージについて、次のパンニングラウンドを開始した。

【0328】

２回目および３回目のラウンドの固相パンニングを、抗原量の減少およびよりストリン
ジェントな洗浄条件以外は１回目のラウンドのプロトコールに従って実施した。

【0329】

ｃＫＩＴに対する捕捉パンニング
捕捉パンニングのために、抗原ｃＫＩＴ／マウスＦｃ融合タンパク質を、ヤギ抗マウス
Ｆｃ捕捉抗体により９６ウェルＭａｘｉｓｏｒｐ（商標）プレート上に固定した。ファー
ジ遮断の間に、ヒトおよびマウスγグロブリンを遮断バッファーに添加して、捕捉抗体お
よび抗原のマウスＦｃ部分に対する抗体の選択を回避した。捕捉パンニングにおける抗原
被覆およびファージ遮断手順を、固相パンニングプロトコール（上記参照）に記載のよう
に実施した。

【0330】

ストレプトアビジン結合磁気ビーズを有する溶液パンニングプロトコール
溶液パンニングを、２つの異なる様式（「古典的」および「代替的」）で実施した。そ
れぞれのパンニングについて、約４ｘ１０^１３のＨｕＣＡＬ ＰＬＡＴＩＮＵＭ（登録商
標）ファージ抗体を、等量の２ｘ Ｃｈｅｍｉｂｌｏｃｋｅｒ／０．１％Ｔｗｅｅｎ２０
で遮断した。ストレプトアビジン−またはビーズ−結合ファージの除去のために、遮断し
たファージ粒子の予備吸着を、それぞれ１ｍｇの遮断したストレプトアビジンビーズを使
用して２回実施した。

【0331】

ａ）「古典的」様式：ビオチン化１６Ｐ２３ ｍＡｂをヒトｃＫＩＴ ＥＣＤ−Ｈｉｓ
タンパク質と共にインキュベートし、遮断したファージ粒子に添加した。１６Ｐ２３抗体
は、内部的に作成されたハイブリドーマであり、ｃＫＩＴのＥＣＤ上に異なるドメインを
露出させるための捕捉抗体として様々なスクリーニングプロトコールにおいて使用された
。１６Ｐ２３抗体を、抗体ビニング（binning）目的のためにも使用した。インキュベー
ション後、ファージ−抗原複合体を、ストレプトアビジンビーズを使用して捕捉し、スト
レプトアビジンビーズに結合したファージ粒子を、磁気分離装置を使用して収集した。

【0332】

ｂ）「代替的」様式：ビオチン化された１６Ｐ２３ ｍＡｂをストレプトアビジンビー
ズに添加し、抗体−ビーズ混合物をＲＴで３０ｍｉｎ、回転装置上でインキュベートした
。ビーズを洗浄し、ヒトｃＫＩＴ ＥＣＤ−Ｈｉｓタンパク質を含有するＰＢＳ中に再懸
濁した。続いて、ファージを添加し、抗体−ビーズ−抗原−ファージ複合体を、回転装置
上、ＲＴでさらに１ｈ、回転させた。この最後のインキュベーションステップの後、ビー
ズを磁気分離装置を使用して捕捉し、上清を廃棄した。

【0333】

両方のディスプレイ方法を使用して、非特異的に結合したファージをＰＢＳ／０．０５
％ Ｔｗｅｅｎ２０およびＰＢＳを使用する数回の洗浄ステップにより洗浄除去した。１
０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ ｐＨ８中の２５ｍＭ ＤＴＴを使用することにより、ストレ
プトアビジンビーズから特異的に結合したファージを溶出させた。次いで、ファージ感染
およびファージ生成を、固相パンニングプロトコールに従って実施した。

【0334】

２回目および３回目のラウンドの溶液パンニングを、抗原量の減少およびよりストリン
ジェントな洗浄条件以外は１回目のラウンドのプロトコールに従って実施した。

【0335】

ｃＫＩＴに対する全細胞パンニング
ヒト、マウスまたはラットｃＫＩＴ抗原を発現する標的細胞を抗原として使用し、パン
ニングのためにＨｕＣＡＬ ＰＬＡＴＩＮＵＭ（登録商標）ファージ−抗体と接触させた
。ファージ−細胞複合体を、ＰＢＳ／５％ＦＣＳ中で３回洗浄した。標的細胞からの特異
的に結合したファージの溶出を、０．１Ｍグリシン−ＨＣｌ／０．５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ
２．２を使用して実施した。次いで、ファージ感染およびファージ生成を、固相パンニン
グプロトコールに従って実施した。２回目および３回目のラウンドの全細胞パンニングを
、１回目のラウンドのプロトコールに従って実施した。

【0336】

ｃＫＩＴに対する示差的全細胞パンニング
示差的全細胞パンニングでは、細胞および精製されたタンパク質上で交互に選択を行っ
た。精製された抗原上での選択ラウンドを、固相パンニングプロトコールに記載のように
実施した。細胞上での選択ラウンドについては、ｃＫＩＴに対する全細胞パンニングのセ
クション中の手順を参照されたい。

【0337】

成熟パンニング
親和性が増大した特異的抗体を取得するために、成熟パンニングを実施した（Prassler
et al., Future Med. Immuno. 2009 1(4):571-583）。この目的のために、ｃＫＩＴ特異
的結合について既に試験された配列決定されたクローンを、ＬＣＤＲ３またはＨＣＤＲ２
カセット交換のために使用した。その後、２ラウンドの固相パンニングを、固相パンニン
グプロトコールに記載のようにヒトおよび／またはマウスｃＫＩＴ Ｆｃ融合タンパク質
を使用して実施した。

【0338】

ａ）ＬＣＤＲ３ ＲａｐＭＡＴ（登録商標）：ファージ由来ｐＭＯＲＰＨ３０（登録商
標）ベクターＤＮＡ（Ｍｏｒｐｈｏｓｙｓ、Ｍｕｎｉｃｈ ＤＥ）のＦａｂコード断片を
酵素的に消化し、挿入物をＴＲＩＭ（商標）ＬＣＤＲ３成熟カセット（Virnekaes et al.
, NAR 1994 22(25):5600-5607）と置き換えた。続いて、１．２５μｇのｐＭＯＲＰＨ３
０（登録商標）ディスプレイベクターを、多様化されたＬＣＤＲ３を担持する挿入物断片
とライゲーションした。

【0339】

ｂ）ＨＣＤＲ２ ＲａｐＭＡＴ（登録商標）：２回目のラウンドのパンニングの後、フ
ァージ由来ｐＭＯＲＰＨ３０（登録商標）ベクターＤＮＡのＦａｂコード断片を酵素的に
消化し、挿入物をＴＲＩＭ（商標）ＨＣＤＲ２成熟カセット（Virnekas et al., supra）
と置き換えた。続いて、１．２５μｇのｐＭＯＲＰＨ３０（登録商標）ディスプレイベク
ターを、多様化されたＨＣＤＲ２を担持する挿入物断片とライゲーションした。

【0340】

作成されたライブラリーを増幅し、ストリンジェンシーを増大させ、抗原濃度を減少さ
せるか、またはヒトおよびマウスｃＫＩＴ抗原を変化させて２ラウンドのパンニングにか
けて、親和性が改善されたクローンを同定した。

【0341】

ＥＬＩＳＡスクリーニングのためのＦａｂ含有細菌溶解物の調製
初期スクリーニングおよび特性評価のために、個々のＦａｂを発現する大腸菌（E.coli
）クローンのｏ／ｎ培養物を、リゾチーム、４ｍＭ ＥＤＴＡおよび１０Ｕ／μｌベンゾ
ナーゼを使用して溶解した。Ｆａｂ含有大腸菌（E.coli）溶解物を、ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣ
ＳおよびＳＥＴスクリーニングのために使用した。

【0342】

Ｆａｂ含有生細菌溶解物のスクリーニング
ＥＬＩＳＡスクリーニング
ＥＬＩＳＡスクリーニングを使用して、単一のＦａｂクローンを、標的抗原への結合に
ついてパンニングアウトプットから同定する。Ｆａｂを、Ｆａｂを含有する粗大腸菌（E.
coli）溶解物を使用して試験する。

【0343】

Ｆａｂ発現チェックＥＬＩＳＡ
調製された大腸菌（E.coli）溶解物中でのＦａｂ発現の検証のために、Ｍａｘｉｓｏｒ
ｐ（商標）３８４ウェルプレート（Ｎｕｎｃ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏ
ｕｉｓ ＭＯ）を、ＰＢＳ中で１：１０００に希釈したＦｄ断片特異的ヒツジ抗ヒトＩｇ
Ｇで被覆した。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ中の５％スキムミルク粉末で
遮断した後、Ｆａｂ含有大腸菌（E.coli）溶解物を添加した。続いて、結合したＨｕＣＡ
Ｌ（登録商標）−Ｆａｂ断片を、アルカリホスファターゼにコンジュゲートされたＦ（ａ
ｂ）_２特異的ヤギ抗ヒトＩｇＧ（１：５０００希釈）と共にインキュベーション後、Ａｔ
ｔｏＰｈｏｓ（登録商標）蛍光基質（Ｒｏｃｈｅ、＃１１６８１９８２００１、Ｍａｎｎ
ｈｅｉｍ、ＤＥ）を添加することにより検出した。５３５ｎｍでの蛍光放出を、４３０ｎ
ｍで励起して記録した。

【0344】

直接被覆された抗原に対するＥＬＩＳＡスクリーニング
Ｍａｘｉｓｏｒｐ（商標）３８４ウェルプレートを、ＰＢＳ中の１０μｇ／ｍｌの濃度
のｍＦｃタグ付ヒトｃＫＩＴ ＥＣＤタンパク質で被覆した。ＰＢＳ中の５％スキムミル
ク粉末でプレートを遮断した後、Ｆａｂ含有大腸菌（E.coli）溶解物を添加した。Ｆａｂ
の結合を、Ａｔｔｏｐｈｏｓ（登録商標）蛍光基質（Ｒｏｃｈｅ、＃１１６８１９８２０
０１、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、ＤＥ）を使用してアルカリホスファターゼにコンジュゲートさ
れたＦ（ａｂ）_２特異的ヤギ抗ヒトＩｇＧ（１：５０００希釈）により検出した。５３５
ｎｍでの蛍光放出を、４３０ｎｍで励起して記録した。

【0345】

Ｆａｂ ＢＥＬ溶解物を使用するエピトープビニング
親和性成熟の前に潜在的なリガンド結合競合因子を同定するために、Ｆａｂ大腸菌（E.
coli）溶解物と、公知のリガンド結合競合因子である１６Ｐ２３抗体とを使用する競合Ｅ
ＬＩＳＡスクリーニングを実施した。この目的のために、Ｍａｘｉｓｏｒｐ（商標）３８
４ウェルプレートを、ｍＦｃタグ付ヒトｃＫＩＴ ＥＣＤタンパク質で被覆し、上記（直
接被覆された抗原に対するＥＬＩＳＡスクリーニング）のように遮断した。

【0346】

１６Ｐ２３ ｍＡｂを、５μｇ／ｍｌの最終濃度で添加した後、Ｆａｂ含有大腸菌（E.
coli）溶解物と共にインキュベーションした。最後に、Ｆａｂの結合を、Ａｔｔｏｐｈｏ
ｓ（登録商標）蛍光基質（Ｒｏｃｈｅ、＃１１６８１９８２００１）を使用して抗ＦＬＡ
Ｇアルカリホスファターゼコンジュゲート抗体（Ｓｉｇｍａ Ａ−９４６９、１：１００
００に希釈）を使用して検出した。５３５ｎｍでの蛍光放出を、４３０ｎｍで励起して記
録した。

【0347】

ＦＡＣＳスクリーニング
ＦＡＣＳスクリーニングでは、細胞表面に発現された抗原を結合する単一のＦａｂクロ
ーンを、パンニングアウトプットから同定する。Ｆａｂを、Ｆａｂを含有する粗大腸菌（
E.coli）溶解物を使用して試験する。

【0348】

ＦＡＣＳスクリーニングを、９６または３８４ウェルプレート形式で実施した。

【0349】

ａ）ＢＤ ＦＡＣＳアレイ装置を使用する９６ウェルプレート形式では、１００μｌの
細胞懸濁液を新鮮な９６ウェルプレート中に移した（１ｘ１０^５細胞／ウェルが得られる
）。標的細胞懸濁液を含有するプレートを遠心分離し、上清を廃棄した。残りの細胞ペレ
ットを再懸濁し、５０μｌのＦａｂ含有ＢＥＬ抽出物を対応するウェルに添加した。プレ
ートを氷上で１時間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を沈降させ、２０
０μｌのＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ、３％ＦＣＳ）で３回洗浄した。各洗浄ステップの
後、細胞を遠心分離し、注意深く再懸濁した。二次検出抗体（ＰＥコンジュゲートヤギ抗
ヒトＩｇＧ；Ｄｉａｎｏｖａ、Ｈａｍｂｕｒｇ、ＤＥ）を添加し、試料を氷上でインキュ
ベートした後、Ｆａｂインキュベーションに従って洗浄した。最後に、細胞ペレットを、
ウェルあたり１５０μｌのＦＡＣＳバッファーに再懸濁し、試料をＢＤ ＦＡＣＳアレイ
において分析した。

【0350】

ｂ）ＢＤ Ｃａｌｉｂｕｒ（登録商標）ＨＴＳ装置（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、
Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を使用する３８４ウェルプレート形式では、２０μｌの細胞懸
濁液を、新鮮な３８４ラウンドウェルプレートに移した（４ｘ１０^４細胞／ウェルが得ら
れる）。標的細胞懸濁液を含有するプレートを遠心分離し、上清を廃棄した。残りの細胞
ペレットを再懸濁し、２０μｌのＦａｂ含有抽出物を対応するウェルに添加した。プレー
トを４℃で１時間振とうしながらインキュベートした。インキュベーション後、細胞を沈
降させ、４０μｌのＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ、３％ＦＣＳ）で３回洗浄した。各洗浄
ステップの後に、細胞を遠心分離し、注意深く再懸濁した。４０μｌのＰＥコンジュゲー
トヤギ抗ヒト検出抗体を添加し、試料を氷上でインキュベートした後、Ｆａｂインキュベ
ーションに従って洗浄した。最後に、細胞ペレットをウェルあたり３５μｌのＦＡＣＳバ
ッファー中に再懸濁し、試料をＢＤ ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ／ＨＴＳ装置を使用して
測定した。

【0351】

親和性の決定
Ｋ_Ｄの決定のために、抗体タンパク質の単量体画分を使用した（少なくとも９０％の単
量体含量であり、それぞれ、Ｆａｂについては、分析的ＳＥＣ；Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５
ＰＣ３．２／３０（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）、また
はＩｇＧについてはＴｏｓｏｈ ＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ ＳＷ_ＸＬ（７．８ｍｍ／３
０．０ｃｍ）（Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ＧｍｂＨ、Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ、Ｄ
Ｅ）により分析される）。

【0352】

Ｓｅｃｔｏｒ Ｉｍａｇｅｒ ６０００（ＭＳＤ）を使用するＫＤ決定のための溶液平
衡滴定（ＳＥＴ）法
溶液中での親和性決定を、基本的には文献（Friquet et al., J. Immuno. Meth. 1985;
77:305-319）に記載のように実施した。ＳＥＴ法の感度および精度を改善するために、
それを古典的ＥＬＩＳＡからＥＣＬに基づく技術に移行させた（Haenel et al., Anal. B
iochem. 2005 339(1):182-4）。１ｍｇ／ｍｌのヤギ抗ヒト（Ｆａｂ）_２断片特異的抗体
（Ｄｉａｎｏｖａ）を、製造業者の説明書に従ってＭＳＤ Ｓｕｌｆｏ−ＴＡＧ（商標）
ＮＨＳ−Ｅｓｔｅｒ（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂ
ｕｒｇ、ＭＤ、ＵＳＡ）で標識した。ＭＳＤプレートを抗原で被覆し、平衡化された試料
をこれらのプレートに移した。洗浄後、ウェルあたり３０μｌのＭＳＤ−Ｓｕｌｆｏ−タ
グ標識された検出抗体（抗ヒト（Ｆａｂ）_２）をＭＳＤプレートに添加し、振とう器上で
インキュベートした。ＭＳＤプレートを洗浄し、３０μｌ／ウェルのＭＳＤ Ｒｅａｄ
Ｂｕｆｆｅｒ Ｔを界面活性剤と共に添加した後、電気化学発光シグナルをＳｅｃｔｏｒ
Ｉｍａｇｅｒ ６０００（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、Ｇａｉｔｈｅ
ｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ、ＵＳＡ）を使用して検出した。

【0353】

データを、カスタマイズされた適合モデルを適用するＸＬｆｉｔ（ＩＤＢＳ）ソフトウ
ェアを使用して評価した。Ｆａｂ分子のＫ_Ｄ決定のために、以下の適合モデルを使用した
（（Abraham et al., J. Mol. Recogn 1996; 9:456-461）に従って改変された、（Haenel
et al., Anal. Biochem 2005;339(1):182-184）に従う）：

【0354】

【数1】

（［Ｆａｂ］_ｔ：適用される全Ｆａｂ濃度
ｘ：適用される全可溶性抗原濃度（結合部位）
Ｂ_ｍａｘ：抗原を含まないＦａｂの最大シグナル
Ｋ_Ｄ：親和性
である）。

【0355】

ＩｇＧ分子のＫ_Ｄ決定のために、ＩｇＧのための以下の適合モデルを使用した（（Pieh
ler et al., 1997）に従って改変される）：

【0356】

【数2】

（［ＩｇＧ］：適用される全ＩｇＧ濃度
ｘ：適用される全可溶性抗原濃度（結合部位）
Ｂ_ｍａｘ：抗原を含まないＩｇＧの最大シグナル
Ｋ_Ｄ：親和性
である）。

【0357】

実験設定：
ＨｕＣＡＬ（登録商標）抗ｃＫＩＴ ＩｇＧのＫ_Ｄ決定を、基本的には以下のように実
施した：ヒトｃＫＩＴ−Ｆｃを、標準ＭＳＤプレート上、４℃でｏ／ｎ、ＰＢＳ／ストレ
プトアビジンＭＳＤプレート上、ＲＴで１ｈ、アッセイバッファー中、０．１μｇ／ｍｌ
で被覆した。続いて、ＭＳＤプレートをＲＴで１ｈ、３％ＢＳＡを含むＰＢＳで遮断した
。ストレプトアビジンプレートを、５％ＢＳＡを含むＰＢＳで４℃でｏ／ｎ遮断した後、
抗原被覆を行った。抗原の滴定のために、ヒトｃＫＩＴ−Ｈｉｓを適用した。

【0358】

続いて、未結合のＦａｂの濃度を、Ｓｅｃｔｏｒ Ｉｍａｇｅｒ ６０００（Ｍｅｓｏ
Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ、ＵＳＡ）を使用
するＥＣＬ検出により定量した。親和性を見積もり、かくして、成熟によって最も改善さ
れたクローンを同定するために対応する適合モデルを適用するＸＬｆｉｔ（ＩＤＢＳ）ソ
フトウェアを使用して、結果をプロセッシングした。

【0359】

ｉｎ ｖｉｔｒｏ生化学アッセイ（交差反応性およびドメイン結合分析）
精製されたＩｇＧを、ヒト、カニクイザルおよびマウスｃＫＩＴ完全長ＥＣＤタンパク
質ならびにヒトｃＫＩＴ ＥＣＤドメイン構築物Ｄ１−３およびＤ４−５への結合につい
て、ＥＬＩＳＡにおいて試験した。この目的のために、プレートを、４℃で一晩、ＰＢＳ
中の５μｇ／ｍｌの濃度の抗原で被覆した。ＩｇＧの結合を、基質としてＡｔｔｏｐｈｏ
ｓ（登録商標）を使用するアルカリホスファターゼにコンジュゲートした抗ヒトまたは抗
マウスＦ（ａｂ）_２（１％ＭＰＢＳ中で１：５０００に希釈）により検出した。蛍光放出
を、４３０ｎｍの励起および５３５ｎｍの放出で測定した。

【0360】

精製されたＩｇＧのエピトープビニング
精製されたＩｇＧ候補を、ｃＫＩＴの細胞外ドメイン上の個々のビンを規定することが
以前に示された、内部的に作成されたツール抗体との競合について試験した。この目的の
ために、ＩｇＧをＭａｘｉｓｏｒｐ（商標）プレート上で一定量で被覆し、溶液中の増加
量の競合因子ＩｇＧとの競合について試験した。陽性対照として、被覆されたＩｇＧを、
溶液中のそれ自身との競合について分析した。全ての試験したＩｇＧを、溶液中、ＲＴで
１ｈ、５０倍過剰量のグリコビオチン化ヒトｃＫＩＴ−Ｆｃ融合物と共に予備インキュベ
ートした。次いで、抗原／抗体複合体を、被覆された抗体に添加し、結合した複合体の検
出をビオチン化抗原により行った。一般に、高いＩｇＧ濃度でのシグナルは、被覆された
ＩｇＧが、溶液中の試験したＩｇＧと異なる抗原上の接近可能なエピトープに結合するこ
とができた場合にのみ得ることができる（すなわち、非競合抗体）。対照的に、競合抗体
、部分的に重複するエピトープを有する抗体または立体障害によりエピトープを遮断する
抗体については、高いＩｇＧ濃度での結合シグナルは、対照とは反対に有意に低下した。

【0361】

Ｍａｘｉｓｏｒｐ（商標）プレートのそれぞれのウェルを、ＰＢＳ中の１．２μｇ／ｍ
ｌの濃度の２０μｌ／ウェルのＩｇＧ希釈液で被覆し、４℃で一晩インキュベートした後
、ＰＢＳＴで３回洗浄した。プレートを、ＲＴで１ｈ、９０μｌの３％ＢＳＡ／ＰＢＳで
よく遮断し、ＰＢＳＴで３回洗浄した。

【0362】

ＦＡＣＳによる細胞上でのＥＣ５０の決定
精製されたＩｇＧを、単一の濃度で試験するか、またはＦＡＣＳにおいて滴定して、細
胞表面に発現されたヒト、マウスまたはラットｃＫＩＴへの結合についてＥＣ５０値を決
定した。この目的のために、Ｍｏ７ｅ、Ｐ８１５またはＲＢＬ−２Ｈ３細胞を、Ａｃｃｕ
ｔａｓｅ（登録商標）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ
）を使用して収獲し、ＦＡＣＳバッファー中で１ｘ１０^６／ｍｌに希釈した。その後の全
てのステップは氷上で行って、受容体の内在化を防止した。細胞懸濁液を９６ウェルＵ底
プレート中に１００μｌ／ウェルで充填した。４℃で５ｍｉｎ、２１０ｇで遠心分離した
後、バッファーを廃棄した。次いで、ウェルあたり、ＦＡＣＳバッファー中に希釈された
１００μｌの特異的ｍＡｂを、１５μｇ／ｍｌの濃度で、または抗体濃度の連続希釈液（
１５μｇ／ｍｌの濃度から出発する１：３希釈段階）での滴定実験において添加した。氷
上で１ｈインキュベーション後、細胞を１５０μｌのＦＡＣＳバッファーで３回洗浄した
。二次ＰＥコンジュゲートヤギ抗ヒト検出抗体（ＦＡＣＳバッファー中で１：２００に希
釈）を、１００μｌ／ウェルで細胞に添加し、氷上で１ｈインキュベートした。細胞を１
５０μｌのＦＡＣＳバッファーで３回洗浄した。最後に、細胞ペレットを、ウェルあたり
２００μｌのＦＡＣＳバッファー中に再懸濁し、試料をＢＤ ＦＡＣＳアレイ中で分析し
た。

【0363】

ｉｎ ｖｉｔｒｏバイオアッセイ
ＳＣＦ依存的増殖アッセイ
増殖アッセイを、安定グルタミン（ＰＡＮ＃Ｐ０４−１８５００）、１０％ＦＣＳおよ
び１０ｎｇ／ｍｌ ＳＣＦ（Ｒ＆Ｄ ＣＡＴ＃２５５−ＳＣ；Ｌｏｔ＃ＣＭ２８１００６
１、Ｒ＆Ｄ Ｃｏｒｐ、Ｂｅｒｋｅｌｅｙ ＣＡ）を含むＲＰＭＩ１６４０中で培養され
たＭｏ７ｅ細胞系（ヒト急性巨核芽球性白血病、ＤＳＭＺ番号ＡＣＣ１０４）上で実施し
た。

【0364】

ＳＣＦ依存的増殖アッセイでは、精製されたＩｇＧまたはＩｇＧを含有する細胞培養上
清を試験した。両実験設定では、細胞を収獲し、０．５ｘ１０^６細胞／ｍｌの濃度で５０
ｍｌの飢餓培地（ＳＣＦを含まない培養培地）中に再懸濁し、３７℃で１８ｈインキュベ
ートした。次いで、６０ｎｇ／ｍｌのＳＣＦを含む飢餓培地中に１ｘ１０^６細胞／ｍｌの
濃度で細胞を再懸濁した（２倍濃縮、抗体の添加後の最終濃度は３０ｎｇ／ｍｌである）
。透明な底部の白い９６ウェルのプレートのウェルあたり、５０μｌの細胞（５ｘ１０^４
細胞／ウェル）および５０μｌの２倍濃縮された精製された抗体または希釈されていない
細胞培養上清を添加した。陰性および陽性対照のために、ＳＣＦを含まない細胞および抗
体を含まない細胞またはＳＣＦを含む細胞および抗体を含まない細胞を含有させた。プレ
ートを３７℃で４８ｈインキュベートし、最後に製造業者の説明書に従ってＣｅｌｌＴｉ
ｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ ＃Ｇ７５７１、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄ
ｉｓｏｎ、ＷＩ）を使用して細胞数を決定した。

【0365】

Ｆａｂ−ＺＡＰ Ｐｉｇｇｙｂａｃｋアッセイ
受容体結合後に抗体が内在化する能力を試験するために、Ｆａｂ−ＺＡＰ試薬（ヤギ抗
ｈｕ−ｍＡｂ−サポリン結合；ＡＴＳ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｃａｔ＃ＩＴ−５
１−２５０、ＡＴＳ Ｂｉｏ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を、精製されたＩｇＧまたは
ＩｇＧを含有する細胞培養上清と混合するＡＤＣアッセイを実施した。がん細胞系ＣＭＫ
−１１−５（ＲＰＭＩ１６４０＋１０％ＦＣＳ中で培養された、急性巨核芽球性白血病細
胞）はｃＫＩＴの高い発現を示すため、これらの細胞に関して細胞毒性能力を試験した。

【0366】

培養物中の細胞を計数し、１ｘ１０^５細胞／ｍｌの濃度となるように培地中に希釈した
。５０μｌの細胞懸濁液（５０００細胞／ウェル）を、９６ウェルプレート（Ｆｌａｔ
Ｃｌｅａｒ Ｂｏｔｔｏｍ Ｗｈｉｔｅ Ｐｌａｔｅ ＴＣ−Ｔｒｅａｔｅｄ、Ｃｏｒｎ
ｉｎｇ Ｃａｔ＃３９０３、Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｔｅｗｋｓｂｕｒｙ、ＭＡ）に移した。別
のプレート（９６ウェルＶ底、Ｎｕｎｃ、Ｃａｔ＃２４９９４６、Ｎｕｎｃ Ｓｉｇｍａ
−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）中で、ＩｇＧを培地中に希釈した。ＩｇＧ
を含有する細胞培養上清を１：１２５に希釈し、０．４ｎＭの濃度にＩｇＧを精製し、６
０μｌ／ウェルの全量を得た。５ｎｍの濃度で等量のＦａｂＺＡＰ溶液を添加し、プレー
トを３７℃で６０ｍｉｎインキュベートした。５０μｌの抗体／Ｆａｂ−ＺＡＰコンジュ
ゲートをＣＭＫ−１１−５細胞に移した（全量１００μｌ）。対照のために、細胞のみを
含むウェル（＝１００％生存能力対照）およびＦａｂ−ＺＡＰと共にインキュベートした
だけの細胞（二次試薬の非特異的殺傷についてチェックするため）を調製した。Ｆａｂ−
ＺＡＰの最終濃度は１．２５ｎＭであった。プレートを３７℃および５％ＣＯ_２で７２ｈ
インキュベートした。製造業者の説明書に従ってＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標
）（Ｐｒｏｍｅｇａ ＃Ｇ７５７１）を使用して、細胞数を決定した。生存能力を、細胞
のみの対照に対して正規化した。

【0367】

まとめ
ｃＫＩＴ抗体に関するスクリーニングでは、２つの異なる戦略を実施した：

【0368】

戦略１：
ヒト／カニクイザルｘ反応性を有する候補（２１７のＨＣＤＲ３ファミリー）を高親和
性に関して選択し、ＩｇＧ変換後、クローンをＣＭＫ−１１−５ ＦａｂＺＡＰ ＡＤＣ
アッセイおよびＭｏ７ｅ増殖アッセイにおいて機能についてスクリーニングした。機能的
活性および多様性に基づいて、候補を診査規模での発現について選択した。

【0369】

戦略２：
ヒト／カニクイザル／マウスｘ反応性を有する候補（５のＨＣＤＲ３ファミリー）を親
和性成熟させ、ＩｇＧ変換後、候補を発現について選択した。

【0370】

まとめると、戦略１および２からの８２の精製されたＩｇＧ候補を、徹底的な特性評価
にかけた。８２のこのプールから、２６のＩｇＧ候補を、大規模生成、毒素コンジュゲー
ションならびにｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでの実験における抗体薬物コンジ
ュゲートとしてのその後の試験のために選択した。

【0371】

徹底的特性評価の際に、１６の異なるＨＣＤＲ３ファミリーに属する２６の抗体（戦略
１に由来する１４の候補および戦略２に由来する１２の候補）を、大規模生成および抗体
−ＤＭ１コンジュゲートとしての試験のために選択した。候補を、以下の基準に従って選
択した：１）ナノモル濃度以下から低ナノモル濃度の範囲のＥＣ５０でのＦａｂ−ＤＭ１
ｐｉｇｇｙｂａｃｋアッセイにおける野生型および変異型ｃＫＩＴを発現する細胞の強
力な殺傷、２）カニクイザルｃＫＩＴに関する２４／２６のＩｇＧのＫＤ値がヒトｃＫＩ
Ｔについて決定されたものの３倍の範囲内にあること。さらに、１２／２６のＩｇＧが、
細胞上に発現されたマウスおよびラットｃＫＩＴと交差反応した。

【0372】

このスクリーニングから選択された候補を、異なるエピトープビンに割り当てることが
できる：１）１９／２６のＩｇＧはビン１またはビン６に属する（ｃＫＩＴ Ｄ１−３、
リガンド結合ドメインに結合する）、２）６／２６のＩｇＧはビン８に属する（ｃＫＩＴ
Ｄ４−５、二量体化ドメインに結合する）、３）１／２６のＩｇＧは、ヒトｃＫＩＴに
対する高い親和性を有するが、カニクイザルｃＫＩＴに対しては弱い親和性しか有さない
、ビン２に属する。この型のスクリーニングプロトコールから来る抗体の例は、抗体２０
３７６である。

【実施例4】

【0373】

ヒト、カニクイザル、マウスおよびラットｃＫＩＴ ＥＣＤタンパク質のための構築物
ヒト、マウスおよびラットｃＫＩＴ細胞外ドメインを、ＧｅｎＢａｎｋまたはＵｎｉｐ
ｒｏｔデータベースからのアミノ酸配列に基づいて遺伝子合成した（以下の表２を参照さ
れたい）。カニクイザルｃＫＩＴおよび１つのＥＣＤ ｃＤＮＡ鋳型を、様々なカニクイ
ザル組織からのｍＲＮＡを使用して作成されたアミノ酸配列情報に基づいて遺伝子合成し
た（例えば、Ｚｙａｇｅｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ；以下の表２）。全ての合成され
たＤＮＡ断片を、適切な発現ベクター、例えば、精製を可能にするためのＣ末端タグを有
するｈＥＦ１−ＨＴＬＶに基づくベクター（ｐＦＵＳＥ−ｍＩｇＧ２Ａ−Ｆｃ２）中にク
ローニングした。

【0374】

【表2】

【0375】

【表3】

【0376】

組換えｃＫＩＴタンパク質の発現
所望のｃＫＩＴ組換えタンパク質を、懸濁培養に予め適合させたＨＥＫ２９３由来細胞
系（２９３ＦＳ）中で発現させ、無血清培地ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ−２９３（Ｇｉｂｃｏ、
カタログ番号１２３３８０１８）中で成長させた。小規模および大規模の両方のタンパク
質生成は一過的トランスフェクションによるものであり、プラスミド担体として２９３Ｆ
ｅｃｔｉｎ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１２３４７０１９）を
使用して、それぞれ１Ｌまで、複数の振とうフラスコ（Ｎａｌｇｅｎｅ）中で行った。全
ＤＮＡおよび２９３Ｆｅｃｔｉｎを、１：１．５（ｗ：ｖ）の比で使用した。ＤＮＡと培
養物の比は、１ｍｇ／Ｌであった。細胞培養上清を、トランスフェクションの３〜４日後
に収獲し、遠心分離し、精製前に滅菌濾過した。

【実施例5】

【0377】

ヒト、カニクイザル、マウスおよびラットｃＫＩＴ ＥＣＤタンパク質、ならびにｃＫ
ＩＴサブドメイン１〜３、および４〜５の精製
タグ付タンパク質精製
組換えＦｃタグ付ｃＫＩＴ細胞外ドメインタンパク質（例えば、ヒトｃＫＩＴ ＥＣＤ
−Ｆｃ、ヒトｃＫＩＴ（ＥＣＤサブドメイン１〜３、４〜５）−Ｆｃ、カニクイザルｃＫ
ＩＴ−ｍＦｃ、ラットｃＫＩＴ−ｍＦｃ、マウスｃＫＩＴ−ｍＦｃ）を、細胞培養上清か
ら精製した。清澄化された上清を、ＰＢＳで平衡化させたプロテインＡセファロースカラ
ム上に通過させた。ベースラインまで洗浄した後、結合した材料を、Ｐｉｅｒｃｅ Ｉｍ
ｍｕｎｏｐｕｒｅ ｌｏｗ ｐＨ Ｅｌｕｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ、または１００ｍＭグ
リシン（ｐＨ２．７）で溶出し、１／８溶出容量の１Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ９を使用してす
ぐに中和した。必要に応じて、１０ｋＤまたは３０ｋＤの名目分子量カットオフを有する
Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ １５ｍＬ遠心分離濃縮装置を使用して、プールされたタンパ
ク質を濃縮した。次いで、プールを、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ２６／６０カラムを使
用するＳＥＣにより精製し、凝集体を除去した。次いで、精製されたタンパク質をＳＤＳ
−ＰＡＧＥおよびＳＥＣ−ＭＡＬＬＳ（多角度レーザー光散乱）により特性評価した。Ｖ
ｅｃｔｏｒ ＮＴＩにより配列から算出された理論吸光係数を使用して、２８０ｎＭでの
吸光度により、濃度を決定した。

【実施例6】

【0378】

ｃＫＩＴ ＥＣＤサブドメインへのｃＫＩＴ Ａｂの結合
ｃＫＩＴ Ａｂの結合部位を規定するのを助けるために、ヒトｃＫＩＴ ＥＣＤをサブ
ドメイン１〜３（リガンド結合ドメイン）およびサブドメイン４〜５（二量体化ドメイン
）に分割した。どのサブドメインが結合したかを決定するために、サンドイッチＥＬＩＳ
Ａアッセイを使用した。ｃＫＩＴサブドメイン１〜３、サブドメイン４〜５または完全長
ｃＫＩＴ ＥＣＤに対応する１Ｘリン酸緩衝生理食塩水中に希釈した１μｇ／ｍｌのＥＣ
Ｄを、９６ウェルＩｍｍｕｌｏｎ ４−ＨＢＸプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉ
ｆｉｃ Ｃａｔ＃３８５５、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）上に被覆し、４℃で一晩インキュ
ベートした。プレートを洗浄バッファー（０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０（Ｂｉｏ−Ｒａｄ
１０１−０７８１）を含む１Ｘリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ））で３回洗浄した。プ
レートを、室温で２ｈ、１ＸＰＢＳ中に希釈した２８０μｌ／ウェルの３％ウシ血清アル
ブミンで遮断した。プレートを洗浄バッファーで３回洗浄した。抗体を、８点について５
倍希釈で洗浄バッファー中２μｇ／ｍｌで調製し、３組の１００μｌ／ウェルでＥＬＩＳ
Ａプレートに添加した。プレートを室温で１ｈ、２００ｒｐｍで振とうしながらオービタ
ルシェーカー上でインキュベートした。アッセイプレートを洗浄バッファーで３回洗浄し
た。二次抗体Ｆ（ａｂ’）_２断片ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍ
ｕｎｏｒｅａｒｃｈ Ｃａｔ＃１０９−０３６−０８８、Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）
を、洗浄バッファー中で１：１０，０００で調製し、１００μｌ／ウェルでＥＬＩＳＡプ
レートに添加した。プレートを、オービタルシェーカー上で２００ｒｐｍで振とうしなが
ら室温で１ｈ、二次抗体と共にインキュベートした。アッセイプレートを洗浄バッファー
で３回洗浄した。ＥＬＩＳＡシグナルを生じさせるために、１００μｌ／ウェルのＳｕｒ
ｅ ｂｌｕｅ（登録商標）ＴＭＢ基質（ＫＰＬ Ｃａｔ＃５２−００−０３、Ｇａｉｔｈ
ｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）をプレートに添加し、室温で１０ｍｉｎインキュベートした。反
応を停止させるために、５０μｌの１Ｎ塩酸を各ウェルに添加した。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｄｅｖｉｃｅｓ ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ５プレートリーダーを使用して、４５０ｎ
Ｍで吸光度を測定した。それぞれの抗体の結合応答を決定するために、光密度測定値を平
均し、標準偏差値を作成し、Ｅｘｃｅｌを使用してグラフ化した。それぞれ個々の抗ｃＫ
ＩＴ抗体の結合ドメインは、以下の表５に見出される。

【実施例7】

【0379】

ｃＫＩＴ Ａｂの親和性測定
ｃＫＩＴ種オーソログおよびまたｃＫＩＴに対する抗体の親和性を、Ｂｉａｃｏｒｅ（
登録商標）２０００装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）
およびＣＭ５センサーチップを使用するＳＰＲ技術を使用して決定した。

【0380】

簡単に述べると、２％Ｏｄｙｓｓｅｙ（登録商標）遮断バッファー（Ｌｉ−Ｃｏｒ Ｂ
ｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｌｉｎｃｏｌｎ、ＮＥ）を添加したＨＢＳ−Ｐ（０．０１Ｍ Ｈ
ＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．００５％ＳｕｒｆａｃｔａｎｔＰ２
０）を、全ての実験について泳動バッファーとして使用した。固定化レベルおよび分析物
の相互作用を、応答単位（ＲＵ）により測定した。パイロット実験を行って、抗ヒトＦｃ
抗体（カタログ番号ＢＲ１００８３９、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒ
ｇｈ、ＰＡ）の固定化および試験抗体の捕捉の実現可能性を試験および確認した。

【0381】

動的測定のために、抗体を固定された抗ヒトＦｃ抗体によりセンサーチップ表面に捕捉
する実験を行い、遊離溶液中で結合するｃＫＩＴタンパク質の能力を決定した。簡単に述
べると、２５μｇ／ｍｌの抗ヒトfFｃ抗体を、ｐＨ５で、２つ全部のフローセル上、５μ
ｌ／分の流速でのアミンカップリングによりＣＭ５センサーチップ上に固定し、１０，５
００ＲＵを達成した。次いで、０．１〜１μｇ／ｍｌの試験抗体を１０μｌ／ｍｉｎで１
分間注入した。抗体の捕捉されるレベルを、一般には２００ＲＵより下に保持した。続い
て、３．１２５〜５０ｎＭのｃＫＩＴ受容体細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を、２倍系列で希
釈し、参照および試験フローセルの両方上に４０μｌ／ｍｉｎの流速で３ｍｉｎ注入した
。試験したＥＣＤの表を以下に列挙する。結合の解離を、１０ｍｉｎ行った。それぞれの
注入サイクルの後、チップ表面を１０μｌ／ｍｉｎの３Ｍ ＭｇＣｌ_２で３０ｓ再生した
。全ての実験を２５℃で行い、応答データを、単純な１：１相互作用モデルを使用して全
体的に適合させた（結合速度（ｋ_ａ）、解離速度（ｋ_ｄ）および親和性（Ｋ_Ｄ）の見積も
りを得るためにＳｃｒｕｂｂｅｒ２（登録商標）ソフトウェアバージョン２．０ｂ（Ｂｉ
ｏＬｏｇｉｃ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を使用する）。

【0382】

【表4】

【0383】

表５は、ドメイン結合および親和性を列挙する。この表に示されるように、抗体９ｐ３
、ＮＥＧ０２４、ＮＥＧ０２７、ＮＥＧ０８５、ＮＥＧ０８６、ＮＥＧ０８７および２０
３７６は全て、ナノモル濃度レベルでヒトｃＫＩＴと反応し、カニクイザルＥＣＤに対し
て試験されたものに対して同様の親和性を有する。しかしながら、２０３７６のみが、マ
ウスと交差反応した。試験した抗体はいずれも、ラットｃＫＩＴと交差反応しなかった。

【0384】

【表5】

【実施例8】

【0385】

ＡＤＣの調製
１ステッププロセルによるＤＭ１コンジュゲートの調製
個々のｃＫＩＴ抗体を、コンジュゲーション反応を開始する前にタンジェンシャルフロ
ー濾過（ＴＦＦ＃１）により反応バッファー（１５ｍＭリン酸カリウム、２ｍＭ ＥＤＴ
Ａ、ｐＨ７．６）中で透析濾過した。続いて、ｃＫＩＴ抗体（約５．０ｍｇ／ｍＬ）をＤ
Ｍ１（抗体量に対して５．６倍モル過剰）、次いで、ＳＭＣＣ（抗体量に対して約５．０
倍過剰）と混合した。反応を、２ｍＭ ＥＤＴＡおよび１０％ＤＭＡを含有する１５ｍＭ
リン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．６）中、２０℃で約１６時間行った。１Ｍ酢酸を添
加してｐＨを５．０に調整することにより反応をクエンチした。ｐＨ調整後、反応混合物
を多層（０．４５／０．２２μｍ）ＰＶＤＦフィルターを通して濾過し、精製し、タンジ
ェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ＃２）を使用して８．２２％スクロースを含有する２０ｍ
Ｍコハク酸バッファー（ｐＨ５．０）中で透析濾過した。タンジェンシャルフロー濾過の
ための装置パラメータの例を、以下の表６に列挙する。

【0386】

【表6】

【0387】

上記のプロセスから得られたコンジュゲートを、細胞毒性剤ローディング（メイタンシ
ノイドと抗体の比、ＭＡＲ）についてはＵＶ分光法；コンジュゲート単量体の決定につい
てはＳＥＣ−ＨＰＬＣ；および遊離メイタンシノイドパーセンテージについては逆相ＨＰ
ＬＣまたは疎水性保護相（Ｈｉｓｅｐ）−ＨＰＬＣにより分析した。

【0388】

ｉｎ ｓｉｔｕプロセスによるＤＭ１コンジュゲートの調製
以下の手順によるｉｎ ｓｉｔｕプロセスによって、抗ｃＫＩＴ抗体をコンジュゲート
することもできる。ｃＫＩＴ抗体を、スルホスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチ
ル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（スルホ−ＳＭＣＣ）リンカーを使用して、
ＤＭ１にコンジュゲートした。ＤＭ１およびスルホ−ＳＭＣＣヘテロ二官能性リンカーの
ストック溶液を、ＤＭＡ中で調製した。スルホ−ＳＭＣＣとＤＭ１チオールとを一緒に混
合して、４０％ｖ／ｖの水性５０ｍＭコハク酸バッファー、２ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ５．
０を含有するＤＭＡ中で、ＤＭ１とリンカーとの比１．３：１モル当量およびＤＭ１の最
終濃度１．９５ｍＭで、２５℃で１０分間反応させた。次いで、抗体を反応のアリコート
と反応させて、５０ｍＭ ＥＰＰＳ、ｐＨ８．０および１０％ＤＭＡ（ｖ／ｖ）中、２．
５ｍｇ／ｍＬのＡｂの最終コンジュゲーション条件下で、約６．５：１のＳＭＣＣとＡｂ
とのモル当量比を得た。２５℃で約１８時間後、コンジュゲーション反応混合物を、１０
ｍＭコハク酸塩、２５０ｍＭグリシン、０．５％スクロース、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０
、ｐＨ５．５で平衡化させたＳＥＰＨＡＤＥＸ（商標）Ｇ２５カラムを使用して精製した
。

【0389】

いずれかの方法は、抗体のコンジュゲーションにおいて有用である。以下の表は、ｃＫ
ＩＴ ＡＤＣの例を提供する。

【0390】

【表7】

【0391】

ＳＰＤＢリンカーを使用するＡＤＣの調製
抗ｃＫＩＴ抗体、例えば、抗体９Ｐ３（８ｍｇ／ｍｌ）を、５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ、および５％ＤＭＡを含有する５０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７
．５）中、２５℃で１２０分間、Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）ブタ
ノエート（ＳＰＤＢ、それぞれ、５．０、５．５および４．９倍モル過剰）を使用して改
変した。次いで、精製されていない改変Ａｂを、５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡ
、および５％ＤＭＡを含有する５０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．５）中、４
ｍｇ／ｍＬの最終改変抗体濃度で、２５℃で１８時間、ＤＭ４（未結合のリンカーに対し
て１．７倍モル過剰）にコンジュゲートした。コンジュゲーション反応混合物を、１０ｍ
Ｍコハク酸塩、２５０ｍＭグリシン、０．５％スクロース、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０、
ｐＨ５．５で平衡化および溶出させるＳＥＰＨＡＤＥＸ（商標）Ｇ２５カラムを使用して
精製した。

【0392】

ＣＸ１−１リンカーを使用するＡＤＣの調製
抗ｃＫＩＴ抗体、例えば、抗体９Ｐ３（５．０ｍｇ／ｍＬ）を、ＤＭ１（抗体量に対し
て７．１５倍モル過剰）、次いで、ＣＸ１−１（抗体量に対して５．５倍過剰）と混合し
た。反応を、２ｍＭ ＥＤＴＡおよび５％ＤＭＡを含有する６０ｍＭ ＥＰＰＳ［４−（
２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンプロパンスルホン酸］バッファー（ｐＨ８．５
）中、２５℃で約１６時間行った。次いで、反応混合物を、１０ｍＭコハク酸塩、２５０
ｍＭグリシン、０．５％スクロース、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ５．５中で平衡化
および溶出させるＳＥＰＨＡＤＥＸ（商標）Ｇ２５カラムを使用して精製した。

【0393】

抗体−ＭＣＣ−ＤＭ１、抗体−ＳＰＤＢ−ＤＭ４および抗体−ＣＸ１−１−ＤＭ１のｉ
ｎ ｖｉｔｒｏでの効果を比較する例を、図２に示す。

【実施例9】

【0394】

親抗体と比較したＡＤＣの親和性
ＳＭＣＣ−ＤＭ１にコンジュゲーション後のｃＫＩＴに対する抗体の親和性を、上記の
実施例７に記載のものと同様の方法を使用して、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）Ｔ１００装
置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）およびＣＭ５センサー
チップを使用するＢｉａｃｏｒｅ技術を使用して決定した。

【0395】

評価した抗体に関して、親非コンジュゲート化抗体と比較してＳＭＣＣ−ＤＭ１コンジ
ュゲート化抗体について、ヒトｃＫＩＴへの結合に関して類似する親和性見積もり値が得
られたが、これはコンジュゲーションが抗体結合に感知できるほど影響しないことを示唆
している（表８）。

【0396】

【表8】

【実施例10】

【0397】

細胞系のパネルに対する９Ｐ３−ＭＣＣ−ＤＭ１、９Ｐ３−ＳＰＤＢ−ＤＭ４および９
Ｐ３−ＣＸ１−１−ＤＭ１の活性
ＭＣＣ−ＤＭ１リンカー−ペイロードへのコンジュゲーション後、ＡＭＬ、ＳＣＬＣ、
ＧＩＳＴ、およびメラノーマ細胞系の増殖を阻害する抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）
の能力を決定した。ＧＩＳＴ−Ｔ１細胞系は、Ｄｒ．Ｔａｋａｈｉｒｏ Ｔａｇｕｃｈｉ
、Ｋｏｃｈｉ Ｕ．、Ｊａｐａｎにより提供していただいたものであった。ＧＩＳＴ４３
０およびＧＩＳＴ８８２細胞系は、Ｄｒ．Ｊｏｎａｔｈａｎ Ｆｌｅｔｃｈｅｒ、Ｂｒｉ
ｇｈａｍおよびＷｏｍｅｎ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡにより提供して
いただいたものであった。

【0398】

小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）については、ＮＣＩ−Ｈ５２６およびＮＣＩ−Ｈ１０４８細
胞系を使用した。ＮＣＩ−Ｈ５２６は、ｃＫＩＴを高く発現し、ＡＴＣＣ（ＣＲＬ−５８
１１、ＡＴＣＣ Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から得られた。ＮＣＩ−Ｈ１０４８は、低レ
ベルでｃＫＩＴを発現し、これもＡＴＣＣ（ＣＲＬ−５８５３）から得られた。ＣＭＫ−
１１−５は、高レベルのｃＫＩＴを発現するＡＭＬ系（（ＪＣＲＢ Ｃａｔ＃ＩＦＯ５０
４３０、Ｊａｐａｎ）、Nagano et al., Int. J. Hematol. 1992; 56:67-78も参照された
い））である。ＵＫＥ−１もまたＡＭＬ細胞系であり、少量のｃＫＩＴを発現する。ＵＫ
Ｅ−１細胞系は、Ｐｒｏｆｅｓｓｏｒ Ｗａｌｔｅｒ Ｆｉｅｄｌｅｒ、Ｕｎｉｖｅｒｓ
ｉｔｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、Ｈａｍｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙによ
り提供していただいたものであった。Ｋａｓｕｍｉ １は、ＡＴＣＣ（ＣＲＬ−２７２４
）から得られたものであった。Ｋａｓｕｍｉ−６はＡＴＣＣ（ＣＲＬ−２７７５）から得
られたものであった。ＭＤＡ−ＭＢ−４５３は、ＡＴＣＣ（ＨＴＢ−１３１）から得られ
たものであった。ＮＣＩ−Ｈ８８９およびＮＣＩ−Ｈ１９３０系は、ＡＴＣＣ（それぞれ
、ＣＲＬ−５８１７およびＣＲＬ−５９０６）から購入したものであった。Ｈｅｌ９２．
１．７細胞は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｃａｔ＃９２１１１７０６−ＩＶＬ、Ｓｉ
ｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から得られたものであった。Ｍ−０
７ｅおよびＳＫＮＯ１細胞は、それぞれ、ＤＳＭＺ、ＡＣＣ−１０４およびＡＣＣ−６９
０（ＤＳＭＺ、Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、ＤＥ）から購入したものであった。ＯＣＩ−
Ｍ１細胞系もＤＳＭＺ（ＡＣＣ−５２９）からのものである。

【0399】

簡単に述べると、細胞を、供給業者により推奨される培養培地中、５％ＣＯ_２と共に３
７℃で組織培養インキュベータ中で培養した。アッセイの当日に、細胞をＰＢＳ（Ｃｅｌ
ｌｇｒｏ、Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｔｅｗｋｓｂｕｒｙ ＭＡ（カタログ番号２１−０３１−Ｃ
Ｖ））で２回洗浄した後、５ｍｉｎ、０．１％トリプシン−ＥＤＴＡ（社内技術サービス
）で処理し、推奨される培養培地中に再懸濁した。次いで、細胞を計数し、１００μｌの
細胞培養培地中、２，０００〜１０，０００細胞／ウェルの密度で９６ウェルプレート（
Ｃｏｓｔａｒカタログ番号３６０３、Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｔｅｗｋｓｂｕｒｙ、ＭＡ）中に
播種した。２組のプレートを０日目の測定のために作成し、すべてのプレートを５％ＣＯ
_２と共に３７℃で一晩、組織培養インキュベータ中でインキュベートした。また、培地の
みのウェルを作成して陰性対照として作用させた。このインキュベーションの後、１００
μｌ／ウェルのＣｅｌｌ ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏ（登録商標）試薬（Ｐｒｏｍｅｇａカタロ
グ番号Ｇ７５７３、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を０日目のプレートに添加した後、２ｍｉｎ
穏やかに振とうし、１０ｍｉｎインキュベートし、得られた発光強度をＰｅｒｋｉｎ Ｅ
ｌｍｅｒ Ｗａｌｌａｃ Ｍｉｃｒｏｂｅｔａ Ｔｒｉｌｕｘ（登録商標）プレートリー
ダー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を使用して測定した。試験Ａ
ＤＣを、適切な細胞培養培地中で３Ｘストック溶液に連続希釈し、５０μｌの３Ｘ連続希
釈されたＡＤＣを添加（最終アッセイ濃度０．０００２〜６８ｎＭ ＤＭ１等価物）した
後、５％ＣＯ_２と共に３７℃で５日間、組織培養インキュベータ中でインキュベーション
した。このインキュベーション期間の後、相対細胞生存能力を、上記のようなＣｅｌｌ
ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏ（登録商標）試薬の添加により決定した。細胞増殖に対するＡＤＣの
効果を、以下のように２組の平均を使用して算出した：（阻害率％＝（ＡＤＣ処理−未処
理）／（未処理−０日目）^＊１００）。阻害率％のデータを、４パラメータロジスティッ
ク式に適合させ、ＧＩ_５０値を決定した。

【0400】

図１に示されるように、ｃＫＩＴ ＡＤＣを、ＧＩＳＴ（ＧＩＳＴ Ｔ−１、ＧＩＳＴ
８８２、ＧＩＳＴ４３０）、ＳＣＬＣ（ＮＣＩ−Ｈ５２６、ＮＣＩ−Ｈ１０４８）および
ＡＭＬ（Ｋａｓｕｍｉ−６、Ｋａｓｕｍｉ−１）細胞系のパネル上での増殖アッセイにお
いて試験した。ＩＣ５０および最大殺傷値を、表に列挙する。ＭＤＡ−ＭＢ４５３（乳が
ん細胞系）はｃＫＩＴを発現しない。ＩｇＧ−ＭＣＣ−ＤＭ１は、アイソタイプ対照であ
る。図１により示されるように、ｃＫＩＴ ＡＤＣは全て、使用した７つの系においてナ
ノモル濃度からナノモル濃度以下のＩＣ５０を有していた。これは、ｃＫＩＴ ＡＤＣは
広範囲の適応症を有し、腫瘍が適切なレベルのｃＫＩＴを発現している場合はどこでも使
用することができることを示している。

【0401】

ＳＰＤＢ−ＤＭ４およびＣＸ１−１−ＤＭ１リンカー−ペイロードによりコンジュゲー
トした抗ｃＫＩＴ抗体（９Ｐ３）の能力も評価し、図２に示す。上記のように行われたこ
れらの試験により、評価した抗ｃＫＩＴ ＡＤＣがＳＰＤＢ−ＤＭ４またはＣＸ１−１−
ＤＭ１を使用する細胞増殖の強力な阻害剤でもあることが示されたが、これは、細胞を殺
傷する毒素を上手く送達するその能力がＭＣＣ−ＤＭ１に限定されないことを示唆してい
る。図１および図２は共に、ナノモル濃度からナノモル濃度以下の範囲で有効であるｃＫ
ＩＴ ＡＤＣを提供する。

【0402】

さらに、図３は、ｃＫＩＴ受容体レベル、および適応症（ＡＭＬ、ＧＩＳＴ、メラノー
マおよびＳＣＬＣ）に対する抗ｃＫＩＴ ＡＤＣ ＧＩ５０のプロットである。図３に示
されるように、抗ｃＫＩＴ ＡＤＣは、全ての列挙された適応症にわたって有効である。

【実施例11】

【0403】

ＧＩＳＴ、ＳＣＬＣおよびＡＭＬ細胞系に対するｃＫＩＴ−ＭＣＣ−ＤＭ１ ＡＤＣの
ｉｎ ｖｉｔｒｏでの活性
ＭＣＣ−ＤＭ１リンカー−ペイロードへのコンジュゲーション後、ＡＭＬ、ＳＣＬＣお
よびＧＩＳＴ細胞系の増殖を阻害する抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）の能力を決定し
た。供給業者によりこれらの実験において使用された細胞の一覧については、上記の実施
例１０を参照されたい。

【0404】

簡単に述べると、細胞を、供給業者により推奨されるように培養培地中、５％ＣＯ_２と
共に３７℃で組織培養インキュベータ中で培養した。アッセイの当日、細胞をＰＢＳ（Ｃ
ｅｌｌｇｒｏ、Ｃａｔ＃２１−０３１−ＣＶ、Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｔｅｗｋｓｂｕｒｙ、Ｍ
Ａ）で２回洗浄した後、０．１％トリプシン−ＥＤＴＡ（社内技術サービス）で５ｍｉｎ
処理し、推奨される培養培地中に再懸濁した。次いで、細胞を計数し、１００μｌの細胞
培養培地中、ＡＭＬおよびＳＣＬＣ細胞については５，０００細胞／ウェルならびにＧＩ
ＳＴ細胞については１０，０００細胞／ウェルの密度で９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａ
ｒカタログ番号３６０３、Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｔｅｗｋｓｂｕｒｙ、ＭＡ）に播種した。２
組のプレートを０日目の測定のために作成し、全てのプレートを、５％ＣＯ_２と共に３７
℃で一晩、組織培養インキュベータ中でインキュベートした。このインキュベーションの
後、１００μｌ／ウェルのＣｅｌｌ ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏ（登録商標）試薬（Ｐｒｏｍｅ
ｇａカタログ番号Ｇ７５７３、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を０日目のプレ
ートに添加した後、２ｍｉｎ穏やかに振とうし、１０ｍｉｎインキュベートし、得られた
発光強度を、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｗａｌｌａｃ Ｍｉｃｒｏｂｅｔａ（登録商標
）Ｔｒｉｌｕｘプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）
を使用して測定した。試験ＡＤＣを、適切な細胞培養培地中、３Ｘストック溶液に連続希
釈し、５０μｌの３Ｘ連続希釈されたＡＤＣを添加（０．０００２〜６８ｎＭ ＤＭ１等
価物の最終アッセイ濃度）した後、５％ＣＯ_２と共に３７℃で５〜８日間、組織培養イン
キュベータ中でインキュベーションした。このインキュベーション期間の後、相対細胞生
存能力を、上記のようなＣｅｌｌ ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏ（登録商標）試薬の添加により決
定した。細胞増殖に対するＡＤＣの効果を、以下のように２組の平均を使用して算出した
：（最大作用率％（Ａ_ＭＡＸ）＝（未処理−処理された最も高いＡＤＣ濃度）^＊１００）
。

【0405】

阻害率％のデータを、４パラメータロジスティック式に適合させ、ＧＩ_５０値を決定し
た。このデータを図４〜９に示す。グラフに示されるように、ＩｇＧ−ＭＣＣ−ＤＭ１コ
ンジュゲートを対照として使用する。試験したＡＤＣは全て、対照抗体よりも高い活性を
有する。図４〜９中の曲線により示されるように、抗ｃＫＩＴ ＡＤＣ、例えば、ＮＥＧ
０８５、ＮＥＧ０２４および２０７３６抗体は、細胞増殖の減少において非常に有効であ
り、かくして、ＧＩＳＴ、ＡＭＬおよびＳＣＬＣの処置において有効である。

【実施例12】

【0406】

ＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞選別）による細胞系上でのｃＫＩＴ表面受容体密度の定量
Ｑｕａｎｔｕｍ Ｓｉｍｐｌｙ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｅａｄｓ（Ｂａｎｇｓ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ．カタログ番号８１５、Ｆｉｓｈｅｒｓ、ＩＮ）を、標準と
して使用した。ビーズ標準の抗体結合能力は、０〜約３１０，０００の範囲である。ビー
ズまたは５０００００個の細胞を遠心分離し、１００μｌ／試料のＦＡＣＳバッファー（
ＰＢＳ、０．２％ＢＳＡ、０．１％ＮａＡｚ）で２回洗浄した。それぞれの洗浄ステップ
の後、ビーズまたは細胞を遠心分離し、注意深く再懸濁した。洗浄後、ＦＡＣＳバッファ
ーを添加し、１０μｇ／ｍｌのＡＰＣ−マウス抗ヒトＣＤ１１７（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎ
ｇｅｎカタログ番号５５０４１２、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、
ＣＡ）または１０μｇ／ｍｌのＡＰＣ−マウスＩｇＧκアイソタイプ対照（ＢＤ Ｐｈａ
ｒｍｉｎｇｅｎカタログ番号５５４６８１）を対応するウェルに、１００μｌ／試料の最
終容量のために添加した。

【0407】

次いで、細胞−抗体懸濁液を氷上で１時間インキュベートした。インキュベーション後
、細胞を沈降させ、１００μｌのＦＡＣＳバッファーで２回洗浄した。それぞれの洗浄ス
テップの後、ビーズまたは細胞を遠心分離し、注意深く再懸濁した。

【0408】

非生細胞を、１００μｌ／試料の７−ＡＡＤ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎカタログ番
号５５９９２５）を含有するＦＡＣＳバッファー中での再懸濁により排除した。試料を氷
上で１０分間インキュベートし、ＢＤ ＦＡＣＳ ＣａｎｔｏＩＩ（登録商標）（ＢＤ
Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）中で分析した。試料あたりのシグナ
ルの幾何平均を、ＦｌｏｗＪｏ（登録商標）ソフトウェアを使用して決定し、抗原密度を
Ｑｕａｎｔｕｍ Ｓｉｍｐｌｙ Ｃｅｌｌｕｌａｒマニュアルに記載のように決定した。
ＡＤＣに対する細胞系の感度および細胞系の受容体密度のｉｎ ｖｉｔｒｏでの分析を、
ＴＩＢＣＯ Ｓｐｏｔｆｉｒｅ ４．０において行った。

【0409】

この受容体密度を、図３のＹ軸上に示す。受容体密度分析は、患者層別化のための初期
バイオマーカーとして本態様において有用である。例えば、図３において、高い受容体密
度は、Ｘ軸上に示される抗ｃＫＩＴ ＡＤＣ ＧＩ５０の効果と相関している。受容体密
度の分析は、どの患者が抗ｃＫＩＴ ＡＤＣ治療剤を受けるべきかを決定するための、臨
床設定において有用である。

【実施例13】

【0410】

重水素交換質量分析（ＨＤｘ−ＭＳ）による９Ｐ３抗体へのｃＫＩＴのエピトープマッ
ピング
重水素交換質量分析（ＨＤｘ−ＭＳ）は、タンパク質のアミド骨格への重水素取込みを
測定するものである。これらの測定値は、アミドの溶媒接近性および骨格アミドの水素結
合ネットワークの変化に対して高感度である。ＨＤｘ−ＭＳは、アポおよびリガンド結合
などの２つの異なる状態のタンパク質を比較するために使用されることが多く、ペプシン
による迅速な消化とカップリングする。そのような実験において、当業者であれば、２つ
の異なる状態間で異なる重水素取込みを示す領域、典型的には、１０〜１５アミノ酸を見
つけることができる。保護される領域は、リガンド結合に直接関与するか、またはリガン
ドへの抗体の結合によりアロステリックに影響される。

【0411】

これらの実験では、ｃＫＩＴ細胞外ドメイン（配列番号１６０、下記参照）の重水素取
込みを、治療的ｍＡｂ、９Ｐ３の非存在下および存在下で測定した。抗体の結合時に重水
素取込みの低下を示すｃＫＩＴ中の領域はエピトープ中に含まれる可能性が高いが、測定
の性質のため、直接的な結合部位から遠い変化を検出することも可能である（アロステリ
ック効果）。通常、最も多い量の保護を有する領域は、直接結合に関与するが、これは常
に当てはまるわけではない。アロステリック効果に由来する直接結合事象を解明するため
には、直交測定（例えば、Ｘ線結晶分析、アラニン突然変異誘発）が必要である。

【0412】

【表9】

【0413】

ｃＫＩＴエピトープマッピング実験を、ＬＥＡＰ（登録商標）ロボットシステム、ｎａ
ｎｏＡＣＱＵＩＴＹ（登録商標）ＵＰＬＣ Ｓｙｓｔｅｍ、およびＳｙｎａｐｔ（登録商
標）Ｇ２質量分析計を含む、Ｗａｔｅｒｓ Ｓｙｎａｐｔ（登録商標）Ｇ２ ＨＤｘ−Ｍ
Ｓプラットフォーム上で行う。この方法においては、３組の対照実験を以下のように実行
する。３００ｐｍｏｌ（１．４ｍｇ／ｍｌ）のｃＫＩＴ抗原を、１１０μｌの９５％重水
素化ＰＢＳバッファー（ｐＨ７．４）中に希釈し、ベンチローテータ上、室温で２５分間
インキュベートする（％Ｄ＝８５．５％）。重水素交換を、氷上で５ｍｉｎ、冷クエンチ
バッファー（６Ｍ尿素および１Ｍ ＴＣＥＰ ｐＨ＝２．５）で１：１希釈することによ
りクエンチする。クエンチした後、チューブをＬＥＡＰシステム（サーモボックスは２℃
に設定する）上に移し、クエンチした試料を、分析のためにＬＥＡＰシステムによりＵＰ
ＬＣシステム上に注入する。ＵＰＬＣシステムは、１２℃に維持された固定化ペプシンカ
ラム２．１ｍｍ ｘ ３０ｍｍ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ２−３１３１−
００）を組み込む。８分で２〜３５％のアセトニトリル勾配およびＷａｔｅｒｓ ＵＰＬ
Ｃ ＣＳＨ Ｃ１８ １．０ｘ１００ｍｍカラムを分離のために使用する。次に、３組の
実験を、抗体を使用して実行する。３００ｐｍｏｌの９Ｐ３抗体を、標準的な技術を使用
してプロテインＧアガロースビーズ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃａｔ＃２
２８５１）上に固定する。簡単に述べると、抗体を遠心分離して、保存バッファーを除去
する。次いで、２００μｌのＰＢＳバッファー（ｐＨ７．４）および３００ｐｍｏｌのｃ
ＫＩＴを、固定されたＡｂに添加し、室温で３０ｍｉｎインキュベートする。インキュベ
ーション後、複合体を遠心分離し、２００μｌのＰＢＳバッファーで洗浄し、再度遠心分
離する。重水素交換のために、２００μｌの重水素化ＰＢＳを、室温で２５分間のインキ
ュベーションのために抗原−抗体複合体に添加する（％Ｄ＝８５．５％）。次いで、重水
素バッファーを除去し、すぐに、１２５μｌの氷冷クエンチバッファーを添加する。５分
間クエンチした後、カラムを遠心分離し、流出液を、予め冷却したＨＰＬＣバイアルに移
す。対照実験として同じオンラインペプシン消化／ＬＣ−ＭＳ設定を使用して、試料を分
析する。

【0414】

これらの測定の結果を、図１０および図１１にまとめる。図１０は、対照と９Ｐ３抗体
に結合した試料との間のベースライン補正された差異を、測定の標準誤差で除算したもの
を示す。このプロットにおいて、負の値が大きいほど、ｃＫＩＴ抗原への９Ｐ３抗体の結
合時に所与の領域における保護の量が大きいことを示す。ｃＫＩＴへの９Ｐ３の結合時に
、本発明者らは、以下の２つのｃＫＩＴの領域：ＶＦＶＲＤＰＡＫＬＦＬ（（領域１、１
０９〜１１９（配列番号１６１））およびＨＣＳＶＤＱＥＧＫＳＶＬＳＥ（（領域２、１
８５〜１９８（配列番号１６２））において最も有意な量の保護を観察する。領域１は、
残基１０９〜１１９を含み、Ｄ１およびＤ２ドメインの一部である。領域２は、残基１８
５〜１９８を含み、Ｄ２ドメインの一部である。図１１において、本発明者らは、ｃＫＩ
Ｔ細胞外ドメインの結晶構造上に２つの最も保護された領域（図１０を参照されたい）（
ＰＤＢ ＩＤ ２ｅ９ｗ）をマッピングした。さらに、本発明者らはまた、文献の値を使
用して部位Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩとしてｃＫＩＴ上のＳＣＦ結合部位を標識した（Yuzawa
et al., Cell 2007;130: 323-334）。図１１から２つの重要な知見が存在する。第１に
、領域１および２は、それらが一次配列空間において遠く離れていたとしても、結晶構造
中では非常に近接している。この観察は、その両方がエピトープの一部である可能性があ
り、そうだとすれば、９Ｐ３のエピトープは非連続的であることを示唆する。第２に、領
域１および２は、文献中で報告されたＳＣＦ結合部位からは離れている。９Ｐ３抗体はリ
ガンド結合を直接阻害しないことを示唆するため、これは重要な観察である。その代わり
に、抗体は、リガンド結合および／またはリガンド結合の際の受容体の二量体化を立体的
に阻害し得る。ＥＬＩＳＡおよびＦＡＣＳを使用する別々の競合アッセイにおいて、本発
明者らは、９Ｐ３によるｃＫＩＴへのＳＣＦ結合の部分的遮断を観察したが、それは部分
的な立体干渉であると考えられる。結論として、ＨＤｘ−ＭＳデータは、９Ｐ３抗体のエ
ピトープは、ＳＣＦ結合部位から遠い不連続なエピトープからなることを示している。Ｎ
ＥＧ０２４、ＮＥＧ０８５、ＮＥＧ０８６、ＮＥＧ０２７およびＮＥＧ０８７は、同じ作
用機構を有すると期待される。

【実施例14】

【0415】

アゴニストとして作用するｃＫＩＴ ＡＤＣの能力を、ｃＫＩＴ野生型細胞系Ｍｏ７ｅ
およびｃＫＩＴ変異細胞系ＧＩＳＴ Ｔ−１を使用して評価した
ｃＫＩＴ ＡＤＣの潜在的なアゴニスト特性を評価するために、２ｘ１０^６個のＧＩＳ
Ｔ Ｔ−１（Ｄｒ．Ｔａｋａｈｉｒｏ Ｔａｇｕｃｈｉ、Ｋｏｃｈｉ Ｕ．、Ｊａｐａｎ
により提供していただいた）またはＭｏ７ｅ（ＤＳＭＺ、ＡＣＣ−１０４）細胞を、６ウ
ェルプレート（ＮＵＮＣカタログ番号１４０６７）中、５％ＣＯ_２と共に３７℃で一晩血
清飢餓させた（０．１％ＦＢＳを添加した、ＧＩＳＴ Ｔ−１についてはＤＭＥＭおよび
Ｍｏ７ｅについてはＲＰＭＩ）。細胞を、３７℃で１５分間、１０ｎｇ／ｍｌのｒｈ−Ｓ
ＣＦ（Ｒ＆Ｄ、Ｃａｔ＃２５５−ＳＣ、Ｒ＆Ｄ、Ｂｅｒｋｅｌｅｙ、ＣＡ）、５μｇ／ｍ
ｌのＮＥＧ０８５−ＭＣＣ−ＤＭ１、ＮＥＧ０２４−ＭＣＣ−ＤＭ１、および２０３７６
−ＭＣＣ−ＤＭ１で処理した。１個のウェルを未処理（ＵＴ）と指定した。細胞を１ｍｌ
のＰＢＳ中に収獲した。細胞ペレットを氷上で６０ｍｉｎ、３０μｌの溶解バッファー：
２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ；ｐＨ７．５、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、１％Ｔｒｉｔｏｎ
Ｘ−１００、１５％グリセロール、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤中で溶解さ
せた。次いで、溶解物を、４℃、１２，０００ｒｐｍで４０ｍｉｎ、沈降させた。２０μ
ｇの各試料を７５℃で１０ｍｉｎ沸騰させ、１２ウェルＮｕＰＡＧＥ（登録商標）４〜１
２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＮＰ０３２２ＢＯＸ
、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）上に充填した。タンパク質を膜ブロットに転移させた後、膜
を室温で１時間、ＴＢＳＴ−５％ミルク中で遮断した後、４℃で一晩、一次抗体を使用し
てプローブ化した。ブロットを、次の日、ＴＢＳＴ（４ｘ５ｍｉｎ）中で洗浄した。ブロ
ットを二次抗体（ヤギ抗ウサギＨＲＰ １：３０，０００、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）中、
室温で１ｈインキュベートした。ブロットをＴＢＳＴ（４ｘ５ｍｉｎ）中で洗浄し、現像
した。

【0416】

ウェスタンブロッティングに使用した一次抗体は、α−ｃＫＩＴ、Ｔｙｒ７０３（Ｃｅ
ｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃａｔ＃３０７３、Ｂｅｖｅｒｌｙ
、ＭＡ）、α−ｃＫＩＴ Ｔｙｒ７２１（ＮＯＶＵＳ、Ｃａｔ＃ＮＢＰ１−５１４１２、
Ｎｏｖｕｓ、Ｌｉｔｔｌｅｔｏｎ、ＣＯ）、ＡＫＴ Ｓｅｒ４７３（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎ
ａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃａｔ＃９２７１）、ＡＫＴ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎ
ａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃａｔ＃４６９１）、ＥＲＫ Ｔｈｒ２０２／Ｔｙ
ｒ２０４（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃａｔ＃９１０１）
、ＥＲＫ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃａｔ＃９１０２）
、およびＧＡＰＤＨ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃａｔ＃
３６８３）であった。

【0417】

図１２に示されるように、ｃＫＩＴ抗体ＮＥＧ０８５、ＮＥＧ０２４および２０３７６
は、リガンド（ＳＣＦ）の非存在下でｃＫＩＴのリン酸化を媒介することができる。しか
しながら、シグナルはホスホＥＲＫまたはホスホロＡＫＴに伝達しないため、下流のシグ
ナリング経路は影響されない。

【実施例15】

【0418】

フローサイトメトリーにより決定されるＧＩＳＴ−Ｔ１細胞上での表面ｃＫＩＴのｃＫ
ＩＴ Ａｂ媒介性内在化
ｃＫＩＴ抗体により媒介される内在化の動力学を、温度シフト法およびフローサイトメ
トリー読出しを使用して、細胞単層中の抗体で処理することにより評価した。ＧＩＳＴ−
Ｔ１（Ｄｒ．Ｔａｋａｈｉｒｏ Ｔａｇｕｃｈｉ、Ｋｏｃｈｉ Ｕ．、Ｊａｐａｎにより
提供していただいた）細胞を、５つの１２ウェル組織培養処理プレート（ＢＤ Ｆａｌｃ
ｏｎ ３５３０４３）中に２．５ｘ１０Ｅ５細胞／ウェルで播種した。細胞を、５％ＣＯ
_２と共に３７℃で一晩、組織培養インキュベータ中でインキュベートした。次の日、培地
を除去し、４５０μｌの新鮮な培地と置き換えた。ｃＫＩＴ抗体ＮＥＧ０８５、２０３７
６およびアイソタイプ対照を、適切な細胞培養培地中１０Ｘ １０μｇ／ｍｌ濃度で調製
し、ウェルあたり５０μｌの試験ｃＫＩＴ抗体またはアイソタイプを、１０μｇ／ｍｌの
最終濃度で添加した。全ての細胞を氷上で１ｈインキュベートした後、１ｍＬの１Ｘリン
酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄し、５００μｌの細胞培養培地中に再懸濁した。
プレート＃２〜５を３７℃に移し、５％ＣＯ_２と共に３７℃で、３０ｍｉｎ、２ｈ、４ｈ
および２４ｈの時点で収獲した。１００μｌの細胞解離バッファー（Ｇｉｂｃｏ Ｃａｔ
＃１３１５０−０１６、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ
）をプレート＃１（４℃結合対照）に添加し、細胞が剥離するまで３７℃でインキュベー
トした。細胞を１００μｌの培地で中和し、９６ウェルＶ底組織培養処理プレート（Ｃｏ
ｓｔａｒ ３８９４）に移した。細胞を遠心分離し、ＦＡＣＳバッファー（１Ｘリン酸緩
衝生理食塩水、２％ウシ胎仔血清、０．１％ナトリウムアジド）で２回洗浄した。フィコ
エリトリンコンジュゲートヤギ抗ヒトＩｇＧ二次Ａｂ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｈ１０１
０４、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を、ＦＡＣＳバ
ッファー中で１〜１００の比で調製した。二次抗体を１００μｌ／ウェルで細胞に添加し
、氷上で４５ｍｉｎ、細胞と共にインキュベートした。インキュベーション期間の終わり
に、細胞を遠心分離し、ＦＡＣＳバッファーで３回洗浄した。細胞を１００μｌ／ウェル
の１％パラホルムアルデヒドで固定し、暗室中、４℃で保存した。様々な時点で３７℃で
インキュベートされた細胞について、細胞解離、二次抗体インキュベーションおよび固定
化ステップを反復する。次の日、全試料を、ＨＴＳシステム（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃ
ｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を使用するＢＤ ＦＡＣＳＣａｎｔｏＩＩ（登録商標）
装置を使用して分析した。試料をＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用して分析して、フィコ
エリトリンチャネルについて蛍光の幾何平均値を得た。図１３Ａは、初期細胞表面結合の
％と幾何平均−ＰＥ４℃結合／幾何平均−ＰＥ３７℃の時点ｘ１００のプロットである。
図１３Ａに示されるように、ＮＥＧ０８５抗体と２０３７６抗体は両方とも、細胞表面上
のｃＫＩＴに結合し、細胞中に迅速に内在化される。これは、開示されるｃＫＩＴ ＡＤ
Ｃは迅速に内在化され、かくして、毒素を細胞中に効率的に送達することを示している。

【0419】

別の内在化実験では、ｃＫＩＴ受容体レベルに対するＮＥＧ０８５の影響を、ヒト骨髄
細胞上で評価した。正常ヒトＣＤ３４＋骨髄細胞（Ａｌｌ Ｃｅｌｌｓ、Ｃａｔ＃ＡＢＭ
０２２Ｆ、Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ、ＣＡ）を解凍し、１０ｍＬのＳｔｅｍＰｒｏ（登録商
標）−３４ ＳＦＭ培地（Ｇｉｂｃｏ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌ
ｓｂａｄ、ＣＡ）で洗浄した。細胞を１．２５ｍＬのＳｔｅｍＰｒｏ−３４ ＳＦＭ培地
中に４ｘ１０^５細胞／ｍＬで再懸濁し、２本のチューブに等量に分割した。一方のチュー
ブは未処理とし、他方のチューブは１０μｇ／ｍｌのＮＥＧ０８５で処理し、両方を３７
℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。１００μＬの細胞懸濁液を、それぞれの条件から
それぞれの時点（０、１５、３０、６０、１２０、および２４０ｍｉｎ）で採取し、氷冷
採取チューブ中に入れて、内在化を停止させた。細胞を、３ｍＬの氷冷ＦＢＳ染色バッフ
ァーで洗浄し、１００μＬのＦＢＳ染色バッファー中に再懸濁した。５ｍＬの１０４Ｄ２
−ＢＶ４２１（マウス抗ヒトＩｇＧ１κ、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃ
Ａ）をそれぞれのチューブに添加し、氷上で１時間インキュベートした。ＦＢＳ染色バッ
ファーでもう１回洗浄した後、ＦＡＣＳ ＣａｎｔｏＩＩ（登録商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓ
ｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）上でＢＶ４２１の平均蛍光強度を評価するこ
とによるフローサイトメトリーによって、全ｃＫＩＴ受容体を測定した。

【0420】

図１３Ｂに示されるように、ｃＫＩＴは、ＮＥＧ０８５の結合の際に迅速に内在化され
、大量の内在化が迅速に（１５分）起こった後、４時間の終点まで表面上のｃＫＩＴの量
は一定的に減少し続ける。

【実施例16】

【0421】

野生型ｃＫＩＴ細胞系（ＮＣＩ−Ｈ５２６）または変異型ｃＫＩＴ細胞系（ＧＩＳＴ−
Ｔ１）におけるｃＫＩＴ分解をモジュレートするＮＥＧ０８５−ＭＣＣ−ＤＭ１の能力の
決定
５ｘ１０^６個のＧＩＳＴ−Ｔ１（Ｄｒ．Ｔａｋａｈｉｒｏ Ｔａｇｕｃｈｉ、Ｋｏｃｈ
ｉ Ｕ．、Ｊａｐａｎにより提供していただいた）またはＮＣＩ−Ｈ５２６（ＡＴＣＣ
ＣＲＬ−５８１１）細胞を、５％ＣＯ_２と共に３７℃の前の夜に、成長培地（ＧＩＳＴ
Ｔ−１についてはＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳおよびＮＣＩ−Ｈ５２６についてはＲＰＭＩ、
１０％ＦＢＳ）中に播種した。次いで、細胞を、メチオニン非含有培地（ＧＩＢＣＯ：Ｄ
ＭＥＭ、２１０１３−０２４；ＲＰＭＩ、Ａ１４５１７−０１、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏ
ｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）中の１００ｍＭシクロヘキシミド（ＣＨＸ）（
Ｃａｔ＃０９０Ｍ４００９、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）で
処理した。細胞を、５％ＣＯ_２と共に３７℃で１、４または６時間、５μｇ／ｍｌのＡＤ
Ｃ（ＮＥＧ０８５−ＭＣＣ−ＤＭ１）、１０ｎｇ／ｍｌのｒｈ−ＳＣＦ（Ｒ＆Ｄ、２５５
−ＳＣ）、またはＡＤＣとｒｈ−ＳＣＦの両方で処理した。処理後１時間、４時間、およ
び６時間で、１ｍｌのＰＢＳ中に細胞を収獲した。細胞ペレットを氷上で６０ｍｉｎ、５
０μｌの溶解バッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ；ｐＨ７．５、１３７ｍＭ Ｎａ
Ｃｌ、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１５％グリセロール、プロテアーゼおよびホスフ
ァターゼ阻害剤）中で溶解させた。次いで、溶解物を４℃、１２０００ｒｐｍで４０ｍｉ
ｎ、沈降させた。５μｇの各試料を、７５℃で１０ｍｉｎ沸騰させ、１５ウェルＮｕＰＡ
ＧＥ（登録商標）４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（ＮＰ０３２３ＢＯＸ Ｌｉｆｅ Ｔ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）上に充填した。膜ブロットにタンパ
ク質を転移した後、膜を室温で１時間、ＴＢＳＴ−５％ミルク中で遮断した後、４℃で一
晩、抗ｃＫＩＴ抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃａｔ＃
３０７４、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）を使用してプローブ化した。次の日、ブロットをＴＢ
ＳＴ（４ｘ５ｍｉｎ）で洗浄した。プロットを二次抗体（ヤギ抗ウサギＨＲＰ １：３０
，０００、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｄａｌｌａｓ、Ｔ
Ｘ）中、室温で１時間インキュベートした。ブロットをＴＢＳＴ（４ｘ５ｍｉｎ）中で洗
浄し、現像した。ウェスタンブロッティングのために使用された一次抗体は、抗ｃＫＩＴ
（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃａｔ＃３０７４）およびＧ
ＡＰＤＨ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃａｔ＃３６８３）
であった。図１４Ａ／Ｂは、ＮＥＧ０８５−ＭＣＣ−ＤＭ１により媒介されるｃＫＩＴ受
容体分解の時間経過を示す。分解は迅速で、レベルは６時間後には非常に低い／検知不能
になった。ｃＫＩＴ受容体の分解は変異型ｃＫＩＴ受容体を発現するＧＩＳＴ Ｔ１細胞
中ではＮＥＧ０８５−ＭＣＣ−ＤＭ１を含むＳＣＦよりも速く起こることに留意されたい
（パネル１４Ａ）。また、ＮＥＧ０８５−ＭＣＣ−ＤＭ１およびＳＣＦの添加は、図１４
Ｂに見られるように、より速い分解を提供するため、ＮＥＧ０８５−ＭＣＣ−ＤＭ１は、
ＳＣＦの結合からｃＫＩＴ受容体を遮断しない。ＮＥＧ０８５−ＭＣＣ−ＤＭ１がリガン
ド遮断剤であった場合、ＮＥＧ０８５−ＭＣＣ−ＤＭ１と、ＳＣＦを含むＮＥＧ０８５−
ＭＣＣ−ＤＭ１との間に差異はなかった。

【実施例17】

【0422】

非コンジュゲート化ＮＥＧ０８５および２０３７６は、Ｍｏ７ｅ、ＳＣＦ依存的細胞系
の増殖を阻害しない
ネイキッド抗体の潜在的なアンタゴニスト特性およびｃＫＩＴ発現細胞系の増殖を阻害
する抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）の能力を評価するために、Ｍｏ７ｅ（ＤＳＭＺ、
カタログ番号ＡＣＣ−１０４、Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、ＤＥ）を、生存のために、ｃ
ＫＩＴリガンド、幹細胞因子（ＳＣＦ）の存在下または非存在下で成長させた。ＭＯ７ｅ
細胞を、１０ｎｇ／ｍｌのヒト顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子ＧＭ−ＣＳＦ（
Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｃａｔ＃２１５−ＧＭ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）また
は１０ｎｇ／ｍｌのヒト幹細胞因子ＳＣＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｃａｔ＃２５５−
ＳＣ）中で成長させた後、９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ Ｃａｔ＃３９０４、Ｃｏ
ｒｎｉｎｇ、Ｔｅｗｋｓｂｕｒｙ、ＭＡ）中に、１００μｌの希釈媒体中５０００細胞／
ウェルで播種した。２組のプレートを０日目の測定のために作成し、全てのプレートを５
％ＣＯ_２と共に３７℃で一晩、組織培養インキュベータ中でインキュベートした。このイ
ンキュベーションの後、さらに５０μｌの希釈媒体を添加し、次いで、９０μｌ／ウェル
のＣｅｌｌ ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏ（登録商標）試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃａｔ＃Ｇ７５７
３、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を、指定の「０日目」のプレートの各ウェルに添加した。ア
ッセイプレートを２０ｍｉｎ穏やかに振とうし、得られた発光強度を、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅ
ｌｍｅｒ １４５０ Ｍｉｃｒｏｂｅｔａ ＴｒｉＬｕｘ（登録商標）プレートリーダー
（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を使用して測定した。試験ネイキ
ッドＡｂおよびＡＤＣを、適切な細胞培養培地中、３Ｘ濃度；３０μｇ／ｍｌで調製し、
８点について５倍連続希釈した。培地のみのウェルも作成して、陰性対照として作用させ
た。５０μｌの３Ｘ連続希釈された抗体またはＡＤＣを添加（最終アッセイ濃度０．００
０９〜６８ｎＭ）した後、５％ＣＯ_２と共に３７℃で５日間、組織培養インキュベータ中
でインキュベーションした。このインキュベーション期間の後、相対細胞生存能力を、上
記のＣｅｌｌ ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏ試薬の添加により決定した。細胞増殖に対するＡＤＣ
の効果を、以下のように２組の平均を使用して算出した：（阻害率％＝（処理されたＡＤ
ＣまたはＡｂ）／（未処理）^＊１００）。阻害率％のデータを４パラメータロジスティッ
ク式に適合させ、ＩＣ_５０値を決定した。

【0423】

図１５および図１６に示されるように、ネイキッド抗ｃＫＩＴ抗体は、細胞増殖を阻害
しない。図１５では、ＮＥＧ０８５−ＭＣＣ−ＤＭ１を、非コンジュゲート化ＮＥＧ０８
５、ＮＥＧ０２４および２０３７６と比較する。グラフに明確に示されるように、ＮＥＧ
０８５−ＭＣＣ−ＤＭ１は、低濃度でＭ０７ｅ細胞の細胞増殖を阻害するが、非コンジュ
ゲート化抗体はこの効果を有さない。ＩｇＧ−ＭＣＣ−ＤＭ１対照は、非コンジュゲート
化ＮＥＧ０８５、ＮＥＧ０２４または２０３７６よりも高い抗増殖効果を有する。

【0424】

実験が、ＳＣＦリガンドが有するｃＫＩｔ受容体に対する内在化効果を否定するために
ＳＣＦよりもむしろＧＭ−ＣＳＦを使用する場合、これも図１６中に見られる。図１６中
の結果は、図１５のものと一致し、非コンジュゲート化ＮＥＧ０８５抗体は、非コンジュ
ゲート化ＩｇＧ対照と同様、細胞増殖に対する有害な効果を有さない。まとめると、図１
５および図１６に示される結果は、細胞増殖の低下が抗ＣＫＩＴ抗体と毒素とのコンジュ
ゲーションに起因することを示す。

【実施例18】

【0425】

ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＡＤＣＣ活性の評価
抗体依存的細胞性細胞毒性を媒介する非コンジュゲート化抗ｃＫＩＴ抗体（ＮＥＧ０８
５、２０３７６）の能力を、ＮＫ３．３細胞（キラー細胞またはエフェクター細胞；Ｓａ
ｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙのＪａｃｋｙ Ｋｏｒｎｂｌｕｔｈ氏により
提供していただいた）との同時インキュベーションにおいてＵｋｅ−１細胞（標的細胞；
Ｐｒｏｆｅｓｓｏｒ Ｗａｌｔｅｒ Ｆｉｅｄｌｅｒ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｏｓｐ
ｉｔａｌ Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、Ｈａｍｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙにより提供していただ
いた）に対して決定した。簡単に述べると、カルセインアセトキシ−メチルエステル（カ
ルセイン−ＡＭ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈカタログ番号１７７８３−５ＭＧ、Ｓｔ．
Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）でＵｋｅ−１細胞を染色し、２回洗浄し、ウェルあたり５０００個の
細胞の濃度で９６ウェルマイクロタイタープレート（９６ウェル、Ｕ底、透明プラスチッ
ク製；Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ、カタログ番号６５０１６０、Ｔｅｗｋｓｂｕｒｙ
、ＭＡ）中にピペットで取り、上記の抗体およびタンパク質の連続希釈液（１ｍｌあたり
５０，０００〜０．００３μｇ）と共に１０ｍｉｎ予備インキュベートした後、エフェク
ターと標的の比２０：１で１時間、エフェクターＮＫ３．３細胞を添加した。標的細胞の
抗体特異的溶解を算出するために、抗体またはエフェクター細胞を含まない標的細胞のみ
の同時的インキュベーションは、ベースラインおよび陰性対照として役立つが、陽性対照
または最大溶解または１００％の特異的溶解を、１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００溶液を含む
標的細胞のみの溶解により決定した。さらなる陽性対照として、Ｕｋｅ−１細胞上のＣＤ
５２を認識するＭａｂＣａｍｐａｔｈ（登録商標）（Ｓａｎｏｆｉ、Ｐａｒｉｓ、ＦＲ）
を使用した。標的とエフェクター細胞との同時インキュベーション後に、マイクロタイタ
ープレートを遠心分離し、上清液体のアリコートを別のマイクロタイタープレート（９６
ウェル、平底、黒色、透明の底部；（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ、カタログ番号３９
０４、Ｔｅｗｋｓｂｕｒｙ、ＭＡ））に移し、溶液中の遊離カルセインの濃度を、蛍光計
数器（Ｖｉｃｔｏｒ３（登録商標）マルチラベル計数器、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、Ｗ
ａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を使用して決定した。

【0426】

結果を、図１７に提示する。抗体依存的細胞媒介性細胞毒性（ＡＤＣＣ）は、細胞媒介
性免疫の機構であり、それによりエフェクター細胞は特異的抗体により結合した標的細胞
を溶解する。この実験では、ＭａｂＣａｍｐａｔｈ（登録商標）ならびに抗ｃＫＩＴ抗体
２０３７６およびＮＥＧ０８５は、非コンジュゲート化ヒトＩｇＧ１抗体である。図１７
に示されるように、ＭａｂＣａｍｐａｔｈ抗体だけが、標的細胞のＡＤＣＣ殺傷を媒介し
た。２０３７６とＮＥＧ０８５は両方とも、高濃度でもＡＤＣＣを誘導することができな
かった。そのようなものとして、ＡＤＣの１つ、例えば、ＮＥＧ０８５−ＭＣＣ−ＤＭ１
を使用する場合に見られる任意の細胞殺傷は、ＡＤＣＣ作用機構に起因しない。

【実施例19】

【0427】

肥満細胞アポトーシスを引き起こすＮＥＧ０８５および２０３７６の能力を、一次ヒト
肥満細胞を用いて調査した。
一次ヒト肥満細胞を、Saito et al., Nature Protocols 2006;1(4):2178-2183により記
載された方法に従ってヒト末梢血から培養した。最小で１週間、液体培養にあった肥満細
胞を、３７℃で４８ｈ、１．６ｎＭ ｒｈＳＣＦ（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ、Ｃａｔ＃Ｚ００
４００、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）の存在下で、増加する濃度（０．０５〜１００ｎ
Ｍ）の抗ヒトｃＫＩＴ Ａｂ、ＮＥＧ０８５および２０３７６、またはアイソタイプ対照
ＩｇＧと共にインキュベートした後、Ｃａｓｐａｓｅ−Ｇｌｏ（登録商標）３／７試薬（
Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｃａｔ＃Ｇ８０９３、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を添加してアポトーシス
を測定した。ＲＴで３０ｍｉｎインキュベーション後、ＢｉｏＴｅｋ（登録商標）Ｓｙｎ
ｅｒｇｙプレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ、Ｗｉｎｏｏｓｋｉ、ＶＴ）上で発光を記録し
た。

【0428】

ｃＫＩＴは肥満細胞上で発現されるため、治療的抗ｃＫＩＴ抗体は、肥満細胞の枯渇を
引き起こすべきではない。図１８は、１．６ｎＭのｒｈＳＣＦの存在下での、抗ヒトｃＫ
ＩＴ Ａｂまたはアイソタイプ対照Ａｂを使用する処理後の一次ヒト肥満細胞を使用する
アポトーシスアッセイを示す。一次ヒト肥満細胞を、増加する濃度の抗ｃＫＩＴ抗体、Ｎ
ＥＧ０８５および２０３７６、またはアイソタイプ対照ＩｇＧと共にインキュベートした
。図１８に見られるように、ＮＥＧ０８５と２０３７６非コンジュゲート化抗体は両方と
も、ｅｘ ｖｉｖｏでヒト一次肥満細胞のアポトーシスを誘導しない。

【実施例20】

【0429】

肥満細胞脱顆粒化を媒介するＮＥＧ０８５および２０３７６の能力を一次ヒト肥満細胞
を使用して決定した。
一次ヒト肥満細胞を、Saito et al.,(supra)により記載された方法に従ってヒト末梢血
から培養した。最小で１週間、液体培養中にあった肥満細胞を、３７℃で５日間、５％Ａ
ｇ特異的ＩｇＥ ＪＷ８（社内バッチＡＣＥ２７２８３）、９５％非特異的モノクローナ
ルヒトＩｇＥ（Ａｂｂｉｏｔｅｃ、Ｃａｔ＃１２０３０６３５、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃ
Ａ）および１０ｎｇ／ｍＬのｒｈＩＬ−４（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｃａｔ＃２０４−
ＩＬ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）で予備処理した。次いで、細胞を、３７℃で９０
ｍｉｎ、ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）Ｆｃ特異的Ａｂ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲ
ｅｓｅａｒｃｈ、Ｃａｔ＃１０９−００５−００８−ＪＩＲ、Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ、Ｐ
Ａ）の存在下で、増加する濃度（０．０５〜１００ｎＭ）のアイソタイプ対照ＩｇＧ抗体
、抗ヒトｃＫＩＴ Ａｂ、２０３７６およびＮＥＧ０８５、抗ＩｇＥ Ａｂ、ＬＥ２７、
またはＮＩＰ（５）ＢＳＡ抗原と共にインキュベートした。次いで、細胞を遠心分離し、
上清を９６ウェル黒壁プレート中に移した後、β−ヘキソサミニダーゼ基質を添加した。
３７℃で９０ｍｉｎインキュベーション後、トリス塩基（Ｓｉｇｍａ、Ｃａｔ＃Ｔ１５０
３−５００Ｇ、ｐＨ１２、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）の添加により反応を停止させ、Ｅｎ
ｖｉｓｉｏｎ（登録商標）プレートリーダー上で蛍光強度を記録した。

【0430】

実施例１９中の以前の実験と同様、肥満細胞に対する抗ｃＫＩＴ抗体の任意の有害な効
果を評価することが重要である。以前の実験が肥満細胞のアポトーシスを検査した場合、
ここでの実験は肥満細胞脱顆粒化に関するものである。図１９に示されるように、陽性対
照ＮＩＰ（５）およびＬＥ２７は、高レベルの肥満細胞脱顆粒化を示す。対照的に、抗ｃ
ＫＩＴ抗体ＮＥＧ０８５および２０３７６は、ｅｘ ｖｉｖｏでヒト一次肥満細胞の肥満
細胞脱顆粒化を誘導しない。

【実施例21】

【0431】

ｃＫＩＴ ＡＤＣによるｉｎ ｖｉｖｏでの的確な薬力学的マーカーモジュレーション
変異型ｃＫＩＴを発現するＧＩＳＴ Ｔ１腫瘍異種移植片における細胞分裂停止の薬力
学（ＰＤ）事象に対するＮＥＧ０２７抗体の同時局在化の検査を含む、ｉｎ ｖｉｖｏで
薬力学的マーカーをモジュレートするｃＫＩＴ ＡＤＣ ＮＥＧ０２７−ＭＣＣ−ＤＭ１
の能力を評価するための研究を行った。これらの研究の目的は、Ｇ２／Ｍ細胞周期停止の
程度および持続期間を評価することであった。

【0432】

免疫組織化学的手法を使用して、腫瘍中でヒトＩｇＧ抗体（マウスにおいてはＮＥＧ０
２７である）を検出することにより、ＡＤＣの存在を間接的に見積もった。親和性精製さ
れたウサギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）を、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｃａｔ＃３０９−００５−０８２、Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ
、ＰＡ）から入手した。この抗体は、全分子ヒトＩｇＧおよび他のヒト免疫グロブリンの
軽鎖と反応し、マウス血清タンパク質との交差反応は最小限である。簡単に述べると、Ｉ
ＨＣプロトコールは、Ｖｅｎｔａｎａ Ｃｅｌｌ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ ＃１抗原
回収試薬（Ｖｅｎｔａｎａ、Ｔｕｃｓｏｎ、ＡＺ）への熱曝露および標準曝露を含んでい
た。一次抗体を、２μｇ／ｍｌの作用濃度に希釈し、室温で３２分間インキュベートした
。続いて、Ｖｅｎｔａｎａ ＵｌｔｒａＭａｐ予備希釈ＨＲＰコンジュゲート化抗ウサギ
抗体（Ｃａｔ＃７６０−４３１５、Ｖｅｎｔａｎａ、Ｔｕｃｓｏｎ、ＡＺ）とのインキュ
ベーションを３２分間行った。

【0433】

免疫組織化学により評価される、ｐＨＨ３陽性核の蓄積を、Ｇ２／Ｍ停止のマーカーと
して使用した。ヒトヒストンＨ３（ｐＨＨ３）のＳｅｒ１０の周囲の残基に対応する合成
ホスホペプチドで動物を免疫することにより生成されるウサギポリクローナル抗体を、Ｃ
ｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｄａｎｖｅｒｓ、ＭＡ、Ｃａｔ＃
９７０１）から入手した。簡単に述べると、ＩＨＣプロトコールは、Ｖｅｎｔａｎａ Ｃ
ｅｌｌ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ ＃１抗原回収試薬への熱曝露および標準曝露を含ん
でいた。一次抗体を１：５０に希釈し、室温で６０分間インキュベートした。続いて、Ｊ
ａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓのヤギ抗ウサ
ギビオチン化二次抗体（Ｃａｔ＃１１１−０６５−１４４、Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ
）とのインキュベーションを３２分間行った。

【0434】

ＧＩＳＴ Ｔ１皮下腫瘍異種移植片モデルにおける抗ｃＫＩＴ ＡＤＣ誘導性ＰＤマー
カー変化を評価するために、メスのＳＣＩＤ−ベージュマウスに、ハンクス平衡化塩溶液
中に５０％Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含有する懸濁
液中の１０ｘ１０^６個の細胞を皮下的に埋め込んだ。懸濁液中に細胞を含有する全注入容
量は、２００μｌであった。腫瘍が３００〜５００ｍｍ^３に到達したら、単回ｉ．ｖ．用
量のＮＥＧ０２７−ＭＣＣ−ＤＭ１（２．５ｍｇ／ｋｇ）、非特異的ＩｇＧ１−ＭＣＣ−
ＤＭ１アイソタイプ対照（２．５ｍｇ／ｋｇ）またはトリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ；５
ｍｌ／ｋｇ）を受容するように、マウスを無作為に割当てた（ｎ＝３匹／群）。ヒトＩｇ
Ｇに関する免疫染色は、ＮＥＧ０２７が位置することを示し、これは、より高い密度のｐ
ＨＨ３免疫染色の領域と相関する（代表的な画像を図２０に示し、薬力学的効果を有する
抗体の同時局在化のための支援を提供する）。メイタンシノイドペイロードの予想される
作用機構と一致して、ＮＥＧ０２７−ＭＣＣ−ＤＭ１は、ｐＨＨ３陽性性について陽性で
ある細胞のパーセンテージの顕著な時間依存的増加をもたらし、非特異的アイソタイプＩ
ｇＧ１−ＭＣＣ−ＤＭ１またはＰＢＳ処理された対照と比較して投与後３３および４８ｈ
でピークに達し、シグナルは約１週間でベースラインまで戻った（代表的な画像を図２１
に示し、グラフを図２２に示す）。切断されたキャスパーゼ３における時間依存的変化も
評価した。これらの研究において、ヒトキャスパーゼ−３中の（Ａｓｐ１７５）に隣接す
るアミノ末端残基に対応する合成ペプチドで動物を免疫することにより生成されるウサギ
ポリクローナル抗体を、ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（Ｃａｔ＃ＰＣ６７９）から入手し
た。ＩＨＣプロトコールは、Ｖｅｎｔａｎａ Ｃｅｌｌ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ ＃
１抗原回収試薬への熱曝露および標準曝露を含んでいた。一次抗体を２０μｇ／ｍｌに希
釈し、室温で３２分間インキュベートした。続いて、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅ
ｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓのヤギ抗ウサギビオチン化二次抗体（Ｃａｔ＃
１１１−０６５−１４４、Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）とのインキュベーションを３２
分間行った。

【0435】

ｐＨＨ３と同様、切断されたキャスパーゼ３の時間依存的変化も観察した（代表的な画
像を図２１に示し、グラフを図２２に示す）。これらのデータは、ｃＫＩＴ ＡＤＣ Ｎ
ＥＧ０２７−ＭＣＣ−ＤＭ１が、メイタンシノイドペイロードの作用機構と一致して強固
なｉｎ ｖｉｖｏでの細胞性ＰＤ効果を惹起することができることを示している。

【0436】

ＧＩＳＴ Ｔ１腫瘍に関するｃＫＩＴ免疫染色の代表的な写真を、この異種移植片モデ
ル中での染色パターンを可視化するために示す（図２１）。ｃＫＩＴの細胞質ｃ末端部分
のアミノ酸９６３〜９７６に対応する合成ペプチドで動物を免疫することにより生成され
るウサギポリクローナル抗体を、Ｄａｋｏ（Ｃａｔ＃Ａ４５０２）から入手した。簡単に
述べると、ＩＨＣプロトコールは、Ｖｅｎｔａｎａ Ｃｅｌｌ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎ
ｇ ＃１抗原回収試薬への熱曝露および標準曝露を含んでいた。一次抗体を１４μｇ／ｍ
ｌの作用濃度に希釈し、室温で６０分間インキュベートした。続いて、Ｖｅｎｔａｎａ
ＵｌｔｒａＭａｐ予備希釈ＨＲＰコンジュゲート化抗ウサギ抗体（Ｃａｔ＃７６０−４３
１５）を用いるインキュベーションを、１６分間行った。

【実施例22】

【0437】

マウスにおける消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）に対する抗ｃＫＩＴ ＡＤＣのｉｎ ｖｉ
ｖｏでの効果
抗ｃＫＩＴ ＡＤＣの抗腫瘍活性を、いくつかの腫瘍異種移植片モデルにおいて評価し
た。非マウスｃＫＩＴ交差反応性抗ヒトｃＫＩＴ ＡＤＣ ＮＥＧ０２７−ＭＣＣ−ＤＭ
１の用量依存的抗腫瘍活性および薬物動態（ＰＫ）を、変異型ｃＫＩＴを発現するＧＩＳ
Ｔ Ｔ１皮下腫瘍異種移植片モデルにおいて評価した。メスのＳＣＩＤ−ベージュマウス
に、ハンクス平衡化塩溶液中に５０％Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅ
ｎｃｅｓ）を含有する１０ｘ１０^６個の細胞を皮下的に埋め込んだ。懸濁液中に細胞を含
有する全注入容量は２００μｌであった。

【0438】

マウスを、２０７ｍｍ^３の平均腫瘍体積を埋め込んだ１０日後に研究に登録した。５群
（ｎ＝９匹／群）の１つに無作為に割り当てた後、マウスに単回ｉ．ｖ．用量のＴＢＳ、
ＡＤＣビヒクル（５ｍl／ｋｇ）、非特異的アイソタイプ対照ＩｇＧ１−ＭＣＣ−ＤＭ１
（２．５ｍｇ／ｋｇ）、またはＮＥＧ０２７−ＭＣＣ−ＤＭ１（０．６２５、１．２５も
しくは２．５ｍｇ／ｋｇ）を投与した。腫瘍体積および体重を週に２回測定した。対照Ｉ
ｇＧ１−ＭＣＣ−ＤＭ１は、２．５ｍｇ／ｋｇでは有意な活性を示さなかった。０．６２
５でのＮＥＧ０２７−ＭＣＣ−ＤＭ１は、ＴＢＳ処置群と比較して統計的に有意な効果を
示したが、１．２５および２．５ｍｇ／ｋｇはさらにより高い効果を誘導し、両方ともカ
リパス測定により類似する腫瘍体積静止状態を誘導したが、組織学的評価は腫瘍細胞の存
在を示さなかった。その代わり、結合組織、脂肪組織ならびに末梢神経および横紋筋のセ
グメントの混合物が、これらの切片における主要な組織成分であった。これは、腫瘍の組
織学的退縮を支持する（図２３〜２６）。

【0439】

この研究から、投与後１時間、２４時間ならびに４、７、１１および２１日で血清も採
取して、それぞれ、抗ヒトＩｇＧ１ＥＬＩＳＡおよび抗ＤＭＥＬＩＳＡを使用して経時的
に抗体／ＡＤＣ濃度を測定した。ＰＫパラメータを評価するために、血清を後眼窩採血に
より採取し、ＥＬＩＳＡにより分析した。全抗体ＰＫアッセイは、比色ＥＬＩＳＡにより
ＤＭ１を含む／含まない全抗体濃度を測定する。プレートを抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ特異的）
で被覆し、抗ヒトＩｇＧ−ＨＲＰで検出した後、適切なプレートリーダー上で読み取る。
コンジュゲートＰＫアッセイは、比色ＥＬＩＳＡにより少なくとも１つのＤＭ１分子に結
合する抗体を測定する。この形式では、プレートを抗メイタンシン抗体で被覆し、抗ヒト
ＩｇＧ−ＨＲＰで検出する。ＰＫは、およそ７日間の血清半減期で用量に比例する（図２
３〜２４）。

【0440】

０．６２５ｍｇ／ｋｇの単回用量のＮＥＧ０２７−ＭＣＣ−ＤＭ１のみがＧＩＳＴ Ｔ
１腫瘍成長遅延を引き起こし、かくして、異なるＡＤＣ活性を評価するための動的範囲を
提供したため、密接に関連し、また、元のマウス９Ｐ３−ＭＣＣ−ＤＭ１ ＡＤＣから誘
導されるＡＤＣのセットの効果を評価するために、この用量レベルを選択した。メスのＳ
ＣＩＤ−ベージュマウスに、ハンクス平衡化塩溶液中に５０％Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）
（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を含有する１０ｘ１０^６個
の細胞を皮下的に埋め込んだ。懸濁液中に細胞を含有する全注入容量は２００μｌであっ
た。マウスを、１９５ｍｍ^３の平均腫瘍体積を埋め込んだ１０日後に研究に登録した。群
（ｎ＝８匹／群）に無作為に割り当てた後、マウスに単回ｉ．ｖ．用量のＴＢＳ（８ｍｌ
／ｋｇ）、非特異的アイソタイプ対照ＩｇＧ１−ＭＣＣ−ＤＭ１（１０ｍｇ／ｋｇ）、Ｎ
ＥＧ０８５−ＭＣＣ−ＤＭ１（０．６２５ｍｇ／ｋｇ）、ＮＥＧ０８６−ＭＣＣ−ＤＭ１
（０．６２５ｍｇ／ｋｇ）、ＮＥＧ０８７−ＭＣＣ−ＤＭ１（０．６２５ｍｇ／ｋｇ）、
ＮＥＧ０２４−ＭＣＣ−ＤＭ１（０．６２５ｍｇ／ｋｇ）、またはＮＥＧ０２６−ＭＣＣ
−ＤＭ１（０．６２５ｍｇ／ｋｇ）を投与した。腫瘍体積および体重は週に２回測定した
（図２７〜２９）。対照ＩｇＧ１−ＭＣＣ−ＤＭ１は、１０ｍｇ／ｋｇの高用量でも活性
ではなかった。０．６２５ｍｇ／ｋｇで投与した抗ｃＫＩＴ ＡＤＣは、互いに統計的に
異ならなかった。ＮＥＧ０８５−ＭＣＣ−ＤＭ１およびＮＥＧ０２４−ＭＣＣ−ＤＭ１処
置群は、狭い範囲で最も小さい腫瘍体積を有していた。この研究から、投与後１時間、２
４時間ならびに３、７、１０、１４および２１日で血清も採取して、それぞれ、抗ヒトＩ
ｇＧ１ＥＬＩＳＡおよび抗ＤＭＥＬＩＳＡを使用して経時的に抗体／ＡＤＣ濃度を測定し
た。ＰＫパラメータを評価するために、後眼窩採血により血清を採取し、ＥＬＩＳＡによ
り分析した。全抗体ＰＫアッセイは、比色ＥＬＩＳＡによりＤＭ１を含む／含まない全抗
体濃度を測定する。プレートを抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ特異的）で被覆し、抗ヒトＩｇＧ−Ｈ
ＲＰで検出した後、適切なプレートリーダー上で読み取る。コンジュゲートＰＫアッセイ
は、比色ＥＬＩＳＡにより少なくとも１つのＤＭ１分子に結合する抗体を測定する。この
形式では、プレートを抗メイタンシン抗体で被覆し、抗ヒトＩｇＧ−ＨＲＰで検出する。
これらのＡＤＣは、類似する血清曝露を示した（図３０）。

【実施例23】

【0441】

マウスにおける小細胞肺がんに対する抗ｃＫＩＴ ＡＤＣのｉｎ ｖｉｖｏでの効果
ＡＤＣのセットの抗腫瘍活性を、ＧＩＳＴ Ｔ１腫瘍異種移植片と比較してより高い異
種性を示す中程度のｃＫＩＴ免疫染色を使用してNＣＩ−Ｈ１０４８小細胞肺がん異種移
植片モデルにおいて評価した（図２１〜図３０）。ＮＥＧ０８５−ＭＣＣ−ＤＭ１を、ｃ
ＫＩＴシグナリングの強力なアンタゴニストであるｃＫＩＴ ＡＤＣのセットと比較した
ところ、いずれもマウスｃＫＩＴに結合しない。メスのＳＣＩＤ−ベージュマウスに、ハ
ンクス平衡化塩溶液中に５０％Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ
ｓ）を含有する１０ｘ１０^６個の細胞を皮下的に埋め込んだ。懸濁液中に細胞を含有する
全注入容量は２００μｌであった。マウスを、約１２０ｍｍ^３の平均腫瘍体積を埋め込ん
だ１５日後に研究に登録した。全ての処置群は、２ｍｇ／ｋｇの単回静脈内用量を受けた
。群（ｎ＝８匹／群）に無作為に割り当てた後、マウスに単回ｉ．ｖ．用量のＴＢＳ（５
ｍｌ／ｋｇ）、非特異的アイソタイプ対照ＩｇＧ１−ＭＣＣ−ＤＭ１（２ｍｇ／ｋｇ）、
ＮＥＧ０２４−ＭＣＣ−ＤＭ１、ＮＥＧ０８５−ＭＣＣ−ＤＭ１およびＮＥＧ０８６−Ｍ
ＣＣ−ＤＭ１を投与した。腫瘍体積および体重を週に２回測定した（図３１、３２）。対
照ＩｇＧ１−ＭＣＣ−ＤＭ１は活性ではなかった。ＮＥＧ０８５−ＭＣＣ−ＤＭ１は９％
の低いΔＴ／ΔＣの効果に向かう傾向があったが、この２ｍｇ／ｋｇ用量ではビヒクルと
統計的に異ならなかった。ＮＥＧ０２４−ＭＣＣ−ＤＭ１およびＮＥＧ０２６−ＭＣＣ−
ＤＭ１は有意に有効であった。

【0442】

ｃＫＩＴ ＡＤＣの抗腫瘍効果もＮＣＩ−Ｈ１０４８小細胞肺がん異種移植片モデルに
おいて評価し、ＮＥＧ０８５−ＭＣＣ−ＤＭ１の用量依存的抗腫瘍活性を評価した。メス
のＳＣＩＤ−ベージュマウスに、ハンクス平衡化塩溶液中に５０％Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商
標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含有する１０ｘ１０^６個の細胞を皮下的に埋め
込んだ。懸濁液中に細胞を含有する全注入容量は２００μｌであった。マウスを、約１５
０〜２００ｍｍ^３の平均腫瘍体積を埋め込んだ１１日後に研究に登録した。群（ｎ＝８匹
／群）に無作為に割り当てた後、マウスに単回ｉ．ｖ．用量のＴＢＳ（５ｍｌ／ｋｇ）、
非特異的アイソタイプ対照ＩｇＧ１−ＭＣＣ−ＤＭ１（１０ｍｇ／ｋｇ）、またはＮＥＧ
０８５−ＭＣＣ−ＤＭ１（２．５、５および１０ｍｇ／ｋｇ）を投与した。腫瘍体積およ
び体重を週に２回測定した（図３３、３４）。対照ＩｇＧ１−ＭＣＣ−ＤＭ１は活性では
なく、２．５ｍｇ／ｋｇの用量のＮＥＧ０８５−ＭＣＣ−ＤＭ１も活性ではなかった。し
かしながら、５および１０ｍｇ／ｋｇの用量は、有意に有効であった。

【0443】

２つの抗ｃＫＩＴ ＡＤＣの抗腫瘍活性を、ＧＩＳＴ Ｔ１腫瘍異種移植片と同様、よ
り高いｃＫＩＴレベルを有する第２の小細胞肺がん異種移植片モデルにおいて評価した（
図２１上に代表的な写真および図３５中にグラフを示す）。メスのＳＣＩＤ−ベージュマ
ウスに、ハンクス平衡化塩溶液中に５０％Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃ
ｉｅｎｃｅｓ）を含有する６ｘ１０^６個の細胞を皮下的に埋め込んだ。懸濁液中に細胞を
含有する全注入容量は２００μｌであった。マウスを、約１５０ｍｍ^３の平均腫瘍体積を
埋め込んだ６日後に研究に登録した。群（ｎ＝９匹／群）に無作為に割り当てた後、マウ
スに単回ｉ．ｖ．用量のＴＢＳ（８ｍｌ／ｋｇ）、非特異的アイソタイプ対照ＩｇＧ１−
ＭＣＣ−ＤＭ１（１０ｍｇ／ｋｇ）、ＮＥＧ０２４−ＭＣＣ−ＤＭ１（２．５、５および
１０ｍｇ／ｋｇ）およびマウス交差反応性ＡＤＣ ２０３７６−ＭＣＣ−ＤＭ１（１０ｍ
ｇ／ｋｇ）を投与した。腫瘍体積および体重を週に２回測定した（図３５および図３６）
。対照ＩｇＧ１−ＭＣＣ−ＤＭ１は活性ではなかった。１０ｍｇ／ｋｇの２０３７６−Ｍ
ＣＣ−ＤＭ１は最初は腫瘍を退縮させたが、初期の退縮の後、腫瘍の再発が見られた。３
つの用量のＮＥＧ０２４−ＭＣＣ−ＤＭ１に関して有意な用量依存的効果が観察され、１
０ｍｇ／ｋｇでは長期的退縮が持続し、６０日後には腫瘍が再成長を開始したが、これは
、２０３７６−ＭＣＣ−ＤＭ１がこの研究で投与された単回用量よりも多くを必要とし得
ることを示唆している。１０ｍｇ／ｋｇ用量の２０３７６−ＭＣＣ−ＤＭ１およびＮＥＧ
０２４−ＭＣＣ−ＤＭ１の血清曝露はほぼ同等であった。

【実施例24】

【0444】

マウスにおける急性骨髄性白血病に対する抗ｃＫＩＴ ＡＤＣのｉｎ ｖｉｖｏでの効
果
抗ｃＫＩＴ ＡＤＣマウス９Ｐ３−ＭＣＣ−ＤＭ１および９Ｐ３−ＳＰＤＢ−ＤＭ４の
用量依存的抗腫瘍活性を、変異型ｃＫＩＴを発現する急性骨髄性白血病Ｋａｓｕｍｉ−１
皮下腫瘍異種移植片モデルにおいて評価した。メスのＳＣＩＤ−ベージュマウスに、Ｍａ
ｔｒｉｇｅｌ（商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含有する２〜３片の１ｍｍ^３
に断片化されたＫａｓｕｍｉ−１腫瘍組織を右脇腹に皮下的に埋め込んだ。Ｋａｓｕｍｉ
−１腫瘍を有するマウスを、１５０ｍｍ^３の平均腫瘍体積を埋め込んだ２１日後に研究に
登録した。８群の１つ（ｎ＝８匹／群）に無作為に割り当てた後、マウスに単回ｉ．ｖ．
用量のＰＢＳ（２００μｌ）、非特異的アイソタイプ対照ＩｇＧ１−ＳＰＤＢ−ＤＭ４（
１０ｍｇ／ｋｇ）、９Ｐ３−ＭＣＣ−ＤＭ１（１０ｍｇ／ｋｇ）および９Ｐ３−ＳＰＤＢ
−ＤＭ４（１または５ｍｇ／ｋｇ）を投与した。腫瘍体積および体重を週に３回測定した
（図３７）。対照ＩｇＧ１−ＳＰＤＢ−ＤＭ４は、１０ｍｇ／ｋｇでは有意に活性ではな
かった。腫瘍成長の退縮は５ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇの用量で９Ｐ３−ＳＰＤＢ
−ＤＭ４に関して観察された。

【0445】

【表10】

【実施例25】

【0446】

マウスにおける肥満細胞症に対する抗ｃＫＩＴ ＡＤＣのｉｎ ｖｉｖｏでの効果
抗ｃＫＩＴ ＡＤＣマウス９Ｐ３−ＭＣＣ−ＤＭ１および９Ｐ３−ＳＰＤＢ−ＤＭ４の
抗腫瘍活性を、変異型ｃＫＩＴを発現するＨＭＣ−１．２皮下腫瘍異種移植片モデルにお
いて評価した。ＨＭＣ−１．２細胞系は、Ｄｒ．Ｊｏｓｅｐｈ Ｂｕｔｔｅｒｆｉｅｌｄ
、Ｍａｙｏ Ｃｌｉｎｉｃ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＭＮにより提供していただいた。メス
のＦｏｘｎ−１ヌードマウスに、ＦＢＳ非含有ＤＭＥＭ培地中に５０％Ｍａｔｒｉｇｅｌ
（商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含有する３、５および１０ｘ１０^６個の細
胞を皮下的に埋め込んだ。懸濁液中に細胞を含有する全注入容量は１００μｌであった。

【0447】

この研究におけるＨＭＣ−１．２腫瘍担持マウスを、１００ｍｍ^３の平均腫瘍体積を埋
め込んだ３３日後に登録した。３群（ｎ＝４匹／群）の１つに無作為に割り当てた後、マ
ウスに、単回ｉ．ｖ．用量のＰＢＳ（２００μｌ）、９Ｐ３−ＭＣＣ−ＤＭ１（１０ｍｇ
／ｋｇ）または９Ｐ３−ＳＰＤＢ−ＤＭ４（１０ｍｇ／ｋｇ）を投与した。腫瘍体積およ
び体重を週に３回測定した（図３８）。腫瘍退縮は１０ｍｇ／ｋｇで９Ｐ３−ＳＰＤＢ−
ＤＭ４および９Ｐ３−ＭＣＣ−ＤＭ１に関して観察された。

【0448】

【表11】

【実施例26】

【0449】

マウス交差反応性ｃＫＩＴ ＡＤＣ２０３７６−ＭＣＣ−ＤＭ１のｉｎ ｖｉｖｏでの
効果
マウスｃＫＩＴ交差反応性抗ヒトｃＫＩＴ ＡＤＣ２０３７６−ＭＣＣ−ＤＭ１の容量
依存的抗腫瘍活性および薬物動態（ＰＫ）を、変異型ｃＫＩＴを発現するＧＩＳＴ Ｔ１
皮下腫瘍異種移植片モデルにおいて評価した。メスのＳＣＩＤ−ベージュマウスを、約２
００ｍｍ^３の平均腫瘍体積を埋め込んだ１０日後に研究に登録した。５群（ｎ＝９匹／群
）の１つに無作為に割り当てた後、マウスに、単回ｉ．ｖ．用量のＴＢＳ（５ｍｌ／ｋｇ
）、非特異的アイソタイプ対照ＩｇＧ１−ＭＣＣ−ＤＭ１（１０ｍｇ／ｋｇ）、ＮＥＧ０
８５−ＭＣＣ−ＤＭ１（０．６２５ｍｇ／ｋｇ）または２０３７６−ＭＣＣ−ＤＭ１（０
．６２５、２．５、５または１０ｍｇ／ｋｇ）を投与した。腫瘍体積および体重を週に２
回測定した（図３９〜４１）。対照ＩｇＧ１−ＭＣＣ−ＤＭ１は、１０ｍｇ／ｋｇでは有
意に活性ではなかった。２０３７８６−ＭＣＣ−ＤＭ１も有効ではなかったが、０．６２
５でのＮＥＧ０８５−ＭＣＣ−ＤＭ１は低い効果を示したが、統計的に有意なものではな
かった。２．５、５および１０ｍｇ／ｋｇでの２０３７６−ＭＣＣ−ＤＭ１は全て有意に
有効であった。

【0450】

この研究から、投与後１時間、２４時間ならびに４、７、１１および２１日で血清も採
取し、それぞれ、抗ヒトＩｇＧ１ ＥＬＩＳＡおよび抗ＤＭ ＥＬＩＳＡを使用して経時
的に抗体／ＡＤＣ濃度を測定した。ＰＫパラメータを評価するために、後眼窩採血により
血清を採取し、ＥＬＩＳＡにより分析した。全抗体ＰＫアッセイは、比色ＥＬＩＳＡによ
りＤＭ１を含む／含まない全抗体濃度を測定する。プレートを抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ特異的
）で被覆し、抗ヒトＩｇＧ−ＨＲＰで検出した後、適切なプレートリーダー上で読み取る
。コンジュゲートＰＫアッセイは、比色ＥＬＩＳＡにより少なくとも１つのＤＭ１分子に
結合する抗体を測定する。この形式では、プレートを抗メイタンシン抗体で被覆し、抗ヒ
トＩｇＧ−ＨＲＰで検出する。マウスｃＫＩＴ交差反応性ＡＤＣ ２０３７６−ＭＣＣ−
ＤＭ１に関して、曝露（組織媒介性薬物体内動態）に影響する正常組織中でのＡＤＣ結合
マウスｃＫＩＴのため、ＰＫは用量比例的ではなく、かくして、２０３７６−ＭＣＣ−Ｄ
Ｍ１と、非マウスｃＫＩＴ交差反応性ＡＤＣ ＮＥＧ０８５−ＭＣＣ−ＤＭ１との間に血
清濃度の明確な差異がある（図４０）。これは、０．６２５ｍｇ／ｋｇの低用量で２つの
ＡＤＣの間での効果差の原因となる。より高い用量では、組織媒介性薬物体内動態効果は
あまり顕著ではなく、効果はマウスにおけるＧＩＳＴ Ｔ１腫瘍異種移植片モデルにおい
て明らかとなる。
［実施例２８］

【0451】

消化管間質腫瘍に対するＳＰＤＢ−ＤＭ４リンカー／ペイロードを含むｃＫＩＴ ＡＤ
Ｃのｉｎ ｖｉｖｏでの効果
ＭＣＣ−ＤＭ１（非切断性）およびＳＰＤＢ−ＤＭ４（切断性）リンカー／ペイロード
を含むマウス９Ｐ３ ＡＤＣ（ＮＥＧ０２４およびＮＥＧ０８５が誘導される）の用量依
存的抗腫瘍活性を、変異型ｃＫＩＴを発現するＧＩＳＴ Ｔ１皮下腫瘍異種移植片モデル
において比較した。メスのＳＣＩＤ−ベージュマウスを、約１７０ｍｍ^３の平均腫瘍体積
を埋め込んだ１８日後に研究に登録した。群（ｎ＝８匹／群）に無作為に割り当てた後、
マウスに、単回ｉ．ｖ．用量のＴＢＳ（５ｍｌ／ｋｇ）、非コンジュゲート化マウス９Ｐ
３抗体（１０ｍｇ／ｋｇ）、非特異的アイソタイプ対照ＩｇＧ１−ＭＣＣ−ＤＭ１（５ｍ
ｇ／ｋｇ）、非特異的アイソタイプ対照ＩｇＧ１−ＭＣＣ−ＤＭ１（５ｍｇ／ｋｇ）、非
特異的アイソタイプ対照ＩｇＧ１−ＳＰＤＢ−ＤＭ４（１０ｍｇ／ｋｇ）、９Ｐ３−ＭＣ
Ｃ−ＤＭ１（５および１０ｍｇ／ｋｇ）または９Ｐ３−ＳＰＤＢ−ＤＭ４（２．５および
５ｍｇ／ｋｇ）を投与した。腫瘍体積および体重を週に２回測定した（図４２、４３）。
対照非特異的ＩｇＧ１ ＡＤＣも、非コンジュゲート化９Ｐ３も有効ではなかった。９Ｐ
３ ＡＤＣは全て、試験した用量レベルで有効であったが、２．５ｍｇ／ｋｇの９Ｐ３−
ＳＰＤＢ−ＤＭ４で処置した群に由来する腫瘍は、他の群よりもわずかに有効性が低いと
考えられた。

【0452】

ＭＣＣ−ＤＭ１（非切断性）およびＳＰＤＢ−ＤＭ４（切断性）リンカー／ペイロード
を含むマウス９Ｐ３ ＡＤＣ（ＮＥＧ０２４およびＮＥＧ０８５が誘導される）の用量依
存的抗腫瘍活性を、変異型ｃＫＩＴを発現する消化管間質腫瘍の第２の腫瘍異種移植片モ
デル、ＧＩＳＴ４３０において比較した。メスのＳＣＩＤ−ベージュマウスを、約２００
ｍｍ^３の平均腫瘍体積を埋め込んだ１１日後に研究に登録した。群（ｎ＝９匹／群）に無
作為に割り当てた後、マウスに、単回ｉ．ｖ．用量のＴＢＳ（５ｍｌ／ｋｇ）、非コンジ
ュゲート化マウス９Ｐ３抗体（１０ｍｇ／ｋｇ）、非特異的アイソタイプ対照ＩｇＧ１−
ＭＣＣ−ＤＭ１（５ｍｇ／ｋｇ）、非特異的アイソタイプ対照ＩｇＧ１−ＭＣＣ−ＤＭ１
（１０ｍｇ／ｋｇ）、非特異的アイソタイプ対照ＩｇＧ１−ＳＰＤＢ−ＤＭ４（５ｍｇ／
ｋｇ）、９Ｐ３−ＭＣＣ−ＤＭ１（１０ｍｇ／ｋｇ）または９Ｐ３−ＳＰＤＢ−ＤＭ４（
５ｍｇ／ｋｇ）を投与した。腫瘍体積および体重を週に２回測定した（図４４、４５）。
いずれの対照非特異的ＩｇＧ１ ＡＤＣも、有効ではなかった。しかしながら、両方の９
Ｐ３ ＡＤＣが、試験した用量レベルで同様に有効であった。
［実施例２９］

【0453】

製剤
ＡＤＣの臨床サービス形態（ＣＳＦ）は、５０ｍｇの抗ｃＫＩＴ−ＭＣＣ−ＤＭ１、１
６．２ｍｇのコハク酸ナトリウム、４１０．８ｍｇのスクロースおよび１ｍｇのポリソル
ベート２０を含有するバイアル中の凍結乾燥物（宣言された含量の離脱を可能にするため
に１０％の過充填を考慮しない）である。５ｍＬの注射用水で凍結乾燥物を再構成させた
後、１０ｍｇ／ｍＬの抗ｃＫＩＴ−ＭＣＣ−ＤＭ１、２０ｍＭのコハク酸ナトリウム、２
４０ｍＭのスクロースおよび０．０２％のポリソルベート２０、ｐＨ５．０を含有する溶
液が得られる。

【0454】

その後の静脈内投与のために、得られた溶液を、通常、担体溶液中にさらに希釈して、
輸注用のすぐに使えるＡＤＣ溶液にする。

【0455】

ＣＳＦについては、予備安定性試験に基づいて、１０ｍｇ／ｍＬのＡＤＣ濃度を選択し
た。等張性製剤を作出し、不定形の凍結乾燥ケーキ構造を維持し、タンパク質安定化を得
るために、２４０ｍＭのスクロース濃度を選択した。

【0456】

最も安定な製剤を選択するための重要な安定性指示分析方法は、特に、凝集レベルを決
定するためのサイズ排除クロマトグラフィー、肉眼では見ることができない粒子状物質の
試験、遊離毒素の決定および効力試験を包含していた。

【0457】

予備スクリーニング研究により、０．０２％の濃度のポリソルベート２０が機械的スト
レスに対する十分な安定を提供することが示された。リアルタイムおよび加速安定性条件
（２５℃および４０℃）での液体および凍結乾燥安定性研究により、ｐＨ５．０のコハク
酸製剤が全体として最良の保存安定性を提供することが示された。最も顕著には、この製
剤において、凝集と遊離毒素の放出との間の試験した全ての製剤の最良のバランスが満た
される。４０℃で３カ月後、分解生成物の特筆すべき増加を決定することはできなかった
。
［実施例３０］

【0458】

ｃＫＩＴ ＡＤＣによるｉｎ ｖｉｖｏでの的確な薬力学的マーカーモジュレーション
変異型ｃＫＩＴを発現するＧＩＳＴ Ｔ１腫瘍異種移植片における細胞分裂停止の薬力
学（ＰＤ）事象に対するＮＥＧ０８５抗体の同時局在化の検査を含む、ｉｎ ｖｉｖｏで
薬力学的マーカーをモジュレートするｃＫＩＴ ＡＤＣ ＮＥＧ０８５−ＭＣＣ−ＤＭ１
の能力を評価するための研究を行った。これらの試験の目的は、Ｇ２／Ｍ細胞周期停止の
程度および持続期間を評価することであった。

【0459】

免疫組織化学により評価される、ホスホ−ヒストンＨ３（ｐＨＨ３）陽性核の蓄積を、
Ｇ２／Ｍ停止のマーカーとして使用した。ヒトヒストンＨ３（ｐＨＨ３）のＳｅｒ１０の
周囲の残基に対応する合成ホスホペプチドで動物を免疫することにより生成されるウサギ
ポリクローナル抗体を、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｄａｎ
ｖｅｒｓ、ＭＡ、Ｃａｔ＃９７０１）から入手した。簡単に述べると、ＩＨＣプロトコー
ルは、Ｖｅｎｔａｎａ Ｃｅｌｌ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ ＃１抗原回収試薬（Ｖｅ
ｎｔａｎａ、Ｔｕｃｓｏｎ、ＡＺ）への熱曝露および標準曝露を含んでいた。一次抗体を
１：５０に希釈し、室温で６０分間インキュベートした。続いて、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍ
ｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓのヤギ抗ウサギビオチン化二次抗
体（Ｃａｔ＃１１１−０６５−１４４、Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）とのインキュベー
ションを３２分間行った。

【0460】

ＧＩＳＴ Ｔ１皮下腫瘍異種移植片モデルにおける抗ｃＫＩＴ ＡＤＣ誘導性ＰＤマー
カー変化を評価するために、メスのＳＣＩＤ−ベージュマウスに、ハンクス平衡化塩溶液
中に５０％Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含有する懸濁
液中の１０ｘ１０^６個の細胞を皮下的に埋め込んだ。懸濁液中に細胞を含有する全注入容
量は、２００μｌであった。腫瘍が２００〜３００ｍｍ^３に到達したら、単回ｉ．ｖ．用
量のＮＥＧ０８５−ＭＣＣ−ＤＭ１（５ｍｇ／ｋｇ）、非特異的ＩｇＧ１−ＭＣＣ−ＤＭ
１アイソタイプ対照（５ｍｇ／ｋｇ）またはトリスバッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ、８０ｍＭ ＮａＣｌ、３．５％スクロース、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０ ｐＨ７．
５）を受容するように、マウスを無作為に割り当てた（ｎ＝３匹／群）。

【0461】

メイタンシノイドペイロードの予想される作用機構と一致して、ＮＥＧ０８５−ＭＣＣ
−ＤＭ１は、ｐＨＨ３陽性性について陽性である細胞のパーセンテージの顕著な時間依存
的増加、かくして、細胞周期停止をもたらした。ｐＨＨ３陽性性は、非特異的アイソタイ
プＩｇＧ１−ＭＣＣ−ＤＭ１またはＴｒｉｓバッファーで処理された対照と比較して投与
後１〜２日でピークに達し、処理の４日後にシグナルは低下した（代表的な画像を図４６
に示し、グラフを図４７に示す）。
［実施例３１］

【0462】

マウスにおける消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）に対する抗ｃＫＩＴ ＡＤＣのｉｎ ｖｉ
ｖｏでの効果
抗ｃＫＩＴ ＡＤＣ ＮＥＧ０８５−ＭＣＣ−ＤＭ１の抗腫瘍活性を、２つのＧＩＳＴ
腫瘍異種移植片モデルにおいて評価した。メスのＳＣＩＤ−ベージュマウスに、ハンクス
平衡化塩溶液中に５０％Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を
含有する１０ｘ１０^６個の細胞を皮下的に埋め込んだ。懸濁液中に細胞を含有する全注入
容量は２００μｌであった。

【0463】

ＧＩＳＴ Ｔ１およびＧＩＳＴ４３０腫瘍に関するｃＫＩＴ免疫染色の代表的な写真を
、これらの異種移植片モデルにおける染色パターンを可視化するために示す（それぞれ、
図４８Ａおよび４９Ａ）。ｃＫＩＴの細胞質ｃ末端部分のアミノ酸９６３〜９７６に対応
する合成ペプチドで動物を免疫することにより生成されるウサギポリクローナル抗体を、
Ｄａｋｏ（Ｃａｔ＃Ａ４５０２）から入手した。簡単に述べると、ＩＨＣプロトコールは
、Ｖｅｎｔａｎａ Ｃｅｌｌ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ ＃１抗原回収試薬（Ｖｅｎｔ
ａｎａ、Ｔｕｃｓｏｎ、ＡＺ）への熱曝露および標準曝露を含んでいた。一次抗体を１４
μｇ／ｍｌの作用濃度に希釈し、室温で６０分間インキュベートした。続いて、Ｖｅｎｔ
ａｎａ ＵｌｔｒａＭａｐ予備希釈ＨＲＰコンジュゲート化抗ウサギ抗体（Ｃａｔ＃７６
０−４３１５）とのインキュベーションを、１６分間行った。

【0464】

ＧＩＳＴ Ｔ１効果研究のために、約１１８ｍｍ^３〜２３４ｍｍ^３の平均腫瘍体積を埋
め込んだ１８日後にマウスを研究に登録した。５群（ｎ＝９匹／群）の１つに無作為に割
り当てた後、マウスに、単回ｉ．ｖ．用量のＴｒｉｓバッファー（ＡＤＣビヒクル）、非
特異的アイソタイプ対照ＩｇＧ１−ＭＣＣ−ＤＭ１（５ｍｇ／ｋｇ）、またはＮＥＧ０８
５−ＭＣＣ−ＤＭ１（１．２５、２．５もしくは５ｍｇ／ｋｇ）を投与した。腫瘍体積お
よび体重を週に２回測定した（図４８Ｂおよび図４８Ｃ）。対照ＩｇＧ１−ＭＣＣ−ＤＭ
１は、５ｍｇ／ｋｇでは有意に活性ではなかった。１．２５、２．５および５ｍｇ／ｋｇ
のＮＥＧ０８５−ＭＣＣ−ＤＭ１で処置したマウスは、それぞれ、６３、１１および１２
％のトリスバッファーで処置された対照（ΔＴ／ΔＣ）と比較した腫瘍体積の平均変化率
（％）を示す腫瘍を有していたが、このデータの概要を表１２に示す。ＮＥＧ０８５−Ｍ
ＣＣ−ＤＭ１処置は、全用量レベルで良好に許容された。

【0465】

【表12】

【0466】

ＧＩＳＴ４３０の効果研究のために、１２５ｍｍ^３〜２００ｍｍ^３の平均腫瘍体積を埋
め込んだ１２日後にマウスを研究に登録した。群（ｎ＝８匹／群）に無作為に割り当てた
後、マウスに、単回ｉ．ｖ．用量のトリスバッファー（ＡＤＣビヒクル）、非特異的アイ
ソタイプ対照ＩｇＧ１−ＭＣＣ−ＤＭ１（１０ｍｇ／ｋｇ）、非コンジュゲート化ＮＥＧ
０８５抗体またはＮＥＧ０８５−ＭＣＣ−ＤＭ１（２．５、５もしくは１０ｍｇ／ｋｇ）
を投与した。腫瘍体積および体重を週に２回測定した（図４９Ｂおよび図４９Ｃ）。対照
ＩｇＧ１−ＭＣＣ−ＤＭ１および非コンジュゲート化ＮＥＧ０８５は、１０ｍｇ／ｋｇで
は活性ではなかった。２．５および５ｍｇ／ｋｇのＮＥＧ０８５−ＭＣＣ−ＤＭ１で処置
したマウスは、有意に活性ではなく（それぞれ、７８％および５６％のΔＴ／ΔＣ）、Ｓ
ＣＩＤ−ベージュマウスにおいて１００ｍｇ／ｋｇ用量レベルでは許容性が低いため、最
初は１００ｍｇ／ｋｇで投与し、８０ｍｇ／ｋｇまで用量を低下させた比較剤イマチニブ
（４７％のΔＴ／ΔＣ）も有意に活性ではなかった。図４９Ｂにグラフとして示され、表
１３にまとめられるように、１０ｍｇ／ｋｇは有意に有効であった（１９％のΔＴ／ΔＣ
）。ＮＥＧ０８５−ＭＣＣ−ＤＭ１処置は、全用量レベルで良好に許容された。

【0467】

【表13】

［実施例３２］

【0468】

マウスにおける小細胞肺がんに対する抗ｃＫＩＴ ＡＤＣのｉｎ ｖｉｖｏでの効果
抗ｃＫＩＴ ＡＤＣ ＮＥＧ０８５−ＭＣＣ−ＤＭ１の抗腫瘍活性を、ＮＣＩ−Ｈ５２
６小細胞肺がん異種移植片モデルにおいて評価した。メスのＳＣＩＤ−ベージュマウスに
、ハンクス平衡化塩溶液中に５０％Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎ
ｃｅｓ）を含有する１０ｘ１０^６個の細胞を皮下的に埋め込んだ。懸濁液中に細胞を含有
する全注入容量は２００μｌであった。

【0469】

ＮＣＩ−Ｈ５２６腫瘍に関するｃＫＩＴ免疫染色の代表的写真を、この異種移植片モデ
ルにおける染色パターンを可視化するために示す（図５０Ａ）。ｃＫＩＴの細胞質ｃ末端
部分のアミノ酸９６３〜９７６に対応する合成ペプチドで動物を免疫することにより生成
されるウサギポリクローナル抗体を、Ｄａｋｏ（Ｃａｔ＃Ａ４５０２）から入手した。簡
単に述べると、ＩＨＣプロトコールは、Ｖｅｎｔａｎａ Ｃｅｌｌ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ
ｉｎｇ ＃１抗原回収試薬（Ｖｅｎｔａｎａ、Ｔｕｃｓｏｎ、ＡＺ）への熱曝露および標
準曝露を含んでいた。一次抗体を１４μｇ／ｍｌの作用濃度に希釈し、室温で６０分間イ
ンキュベートした。続いて、Ｖｅｎｔａｎａ ＵｌｔｒａＭａｐ予備希釈ＨＲＰコンジュ
ゲート化抗ウサギ抗体（Ｃａｔ＃７６０−４３１５）とのインキュベーションを、１６分
間行った。

【0470】

マウスを、約１８０ｍｍ^３の平均腫瘍体積を埋め込んだ６日後に研究に登録した。群（
ｎ＝９匹／群）に無作為に割り当てた後、マウスに単回ｉ．ｖ．用量のＴｒｉｓバッファ
ー（ＡＤＣビヒクル）、非特異的アイソタイプ対照ＩｇＧ１−ＭＣＣ−ＤＭ１（５ｍｇ／
ｋｇ）、またはＮＥＧ０８５−ＭＣＣ−ＤＭ１（１．２５、２．５および５ｍｇ／ｋｇ）
を投与した。腫瘍体積および体重を週に２回測定した（図５０Ｂおよび図５０Ｃ）。対照
ＩｇＧ１−ＭＣＣ−ＤＭ１は活性ではなかった。１．２５ｍｇ／ｋｇのＮＥＧ０８５−Ｍ
ＣＣ−ＤＭ１は、最初は腫瘍体積の静止状態を誘導した後、腫瘍の再成長を誘導した。２
．５および５ｍｇ／ｋｇの処置は、有意に有効であり、腫瘍退縮（それぞれ、７４％およ
び９６％の退縮）を誘導したが、これを図５０Ｂに示し、表１４にまとめる。これらの用
量での処置は、単回処置後約３週間で腫瘍再成長を示した。全てのＮＥＧ０８５−ＭＣＣ
−ＤＭ１処置は良好に許容された。

【0471】

【表14】

【0472】

この研究から、投与後１時間、２４時間ならびに５、７、９、１４、２１および２８日
で血清も採取して、それぞれ、抗ヒトＩｇＧ１ ＥＬＩＳＡおよび抗ＤＭ ＥＬＩＳＡを
使用して経時的に抗体／ＡＤＣ濃度を測定した。ＰＫパラメータを評価するために、血清
を後眼窩採血により採取し、ＥＬＩＳＡにより分析した。全抗体ＰＫアッセイは、比色Ｅ
ＬＩＳＡによりＤＭ１を含む／含まない全抗体濃度を測定する。プレートを抗ヒトＩｇＧ
（Ｆｃ特異的）で被覆し、抗ヒトＩｇＧ−ＨＲＰで検出した後、適切なプレートリーダー
上で読み取る。コンジュゲートＰＫアッセイは、比色ＥＬＩＳＡにより少なくとも１つの
ＤＭ１分子に結合する抗体を測定する。この形式では、プレートを抗メイタンシン抗体で
被覆し、抗ヒトＩｇＧ−ＨＲＰで検出する。ＮＥＧ０８５−ＭＣＣ−ＤＭ１に関して、こ
の研究における用量依存的効果は、抗全抗体および抗メイタンシンＥＬＩＳＡにより測定
されるように、全抗体およびＡＤＣの用量依存的血清曝露と相関していた（それぞれ、図
５１Ａおよび図５１Ｂ）。
［実施例３３］

【0473】

マウスにおける急性骨髄性白血病に対する抗ｃＫＩＴ ＡＤＣのｉｎ ｖｉｖｏでの効
果
抗ｃＫＩＴ ＡＤＣ ＮＥＧ０８５−ＭＣＣ−ＤＭ１の抗腫瘍活性を、Ｎｏｖａｒｔｉ
ｓで確立されたＨＡＭＬＸ５３４３全身性原発性ＡＭＬ（急性骨髄性白血病）異種移植片
モデルにおいて評価した。メスのＮＳＧマウスに、リン酸緩衝生理食塩水中の５ｘ１０^６
個の細胞を全身的に（尾静脈注射による）埋め込んだ。懸濁液中に細胞を含有する全注入
容量は２００μｌであった。

【0474】

マウスを、約１４．８％のＣＤ４５陽性末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の平均白血性組織
量（burden）を埋め込んだ４３日後に研究に登録した。群（ｎ＝６匹／群）に無作為に割
り当てた後、マウスを未処置のままにするか、またはＡＲＡ−Ｃ（シタラビン）を６日間
にわたって毎日腹腔内投与するか、もしくはＮＥＧ０８５−ＭＣＣ−ＤＭ１（１０ｍｇ／
ｋｇ）を２週間毎に１回静脈内投与した。白血性組織量をフローサイトメトリーにより測
定した。毎週、血液を、尾を介して全研究動物から採取した。赤血球を溶解し、残存する
ＰＭＢＣを抗ｈＣＤ４５抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ、Ｃ
ａｔ＃Ｐ／Ｎ１７−９４５９−４２）で染色した。染色された細胞を、ＦＡＣＳ Ｃａｎ
ｔｏフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上で分析した（図５２Ａ）
。体重を週に２回測定した（図５２Ｂ）。ＡＲＡ−Ｃは、３匹の動物中では有効であった
が、他の３匹の動物中では毒性が高く、２０％を超える体重低下を引き起こした。１０ｍ
ｇ／ｋｇでのＮＥＧ０８５−ＭＣＣ−ＤＭ１処置は、２回目の投与後の短時間の退縮を含
む、腫瘍進行の遅延をもたらした（図５２Ａ）。ＮＥＧ０８５−ＭＣＣ−ＤＭ１処置は、
図５２および表１５に示されるように、未処置の対照と比較して有意に有効であった。Ｎ
ＥＧ０８５−ＭＣＣ−ＤＭ１の処置は良好に許容された（図５２Ｂ）。

【0475】

【表15】

［実施例３４］

【0476】

組合せ療法におけるＮＥＧ０８５−ＭＣＣ−ＤＭ１
異なる用量マトリックスを使用して、ＮＥＧ０８５−ＭＣＣ−ＤＭ１を低分子阻害剤と
組み合わせて試験した。用量の組合せ毎に、細胞生存能力の相対的阻害を算出した。Ｃｈ
ａｌｉｃｅソフトウェア（Ｚａｌｉｃｕｓ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ ＭＡ）またはＣｏｍｂ
ｏＥｘｐｌｏｒｅｒアプリケーション（Ｎｏｖａｒｔｉｓ、Ｂａｓｅｌ ＣＨ）のいずれ
かを使用して、薬物自体の用量加算性に関して広く使用されているＬｏｅｗｅのモデル（
Lehar et al. Nat. Biotechnol. (2009) 27: 659-666; Zimmermann et al., Drug Discov
. Today (2007) 12: 34-42）に対する、組合せの応答を、その単剤と比較した。加算性と
比較した過剰の阻害を、完全用量マトリックスチャートとしてプロットして、相乗作用が
生じる薬物濃度を可視化することができる。相乗的組合せは、用量マトリックス内で過剰
の阻害の領域をもたらした。表１６は、いくつかのＮＥＧ０８５−ＭＣＣ−ＤＭ１／組合
せのデータを示す。組合せが、単剤自体による応答と比較した場合に細胞生存能力応答の
同じ阻害をもたらした場合、「加算性」が認められた。細胞生存能力の阻害が自身と比較
して単剤の応答よりも高い場合、「相乗作用」が示された。あるいは、５未満のＬｏｅｗ
ｅスコアについて「加算性」が示され、５より高いＬｏｅｗｅスコアにより「相乗作用」
が示された。

【0477】

ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ Ｇｌｏ発光アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）
を使用して、細胞ＡＴＰ含量を測定することにより、細胞生存能力を決定した。薬物添加
の１日前に、２つの異なる細胞系に由来する２５０〜５００個のＧＩＳＴ細胞を、２０μ
ｌの成長培地中、３８４ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ、Ｍｏｎｒｏｅ、ＮＣ）に播種
した。ＧＩＳＴ４３０細胞は、Ｇｌｉｖｅｃ（登録商標）（イマチニブ）に対して部分的
に耐性にするｃＫＩＴ中の二重変異を含有する。ＧＩＳＴ８８２細胞は、ｃＫＩＴ中に単
一の変異を有し、Ｇｌｉｖｅｃ（登録商標（イマチニブ）に対して感受性である。次いで
、様々な濃度の、単剤としてのＮＥＧ０８５−ＭＣＣ−ＤＭ１、単剤化合物またはＮＥＧ
０８５−ＭＣＣ−ＤＭ１／化合物組合せと共に細胞を１２０ｈインキュベートした後、Ｃ
ｅｌｌＴｉｔｅｒ Ｇｌｏ試薬を各ウェルに添加し、Ｅｎｖｉｓｉｏｎプレートリーダー
（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ ＭＡ）上で発光を記録した。発光値を使
用して、ＤＭＳＯ処理された細胞（０％阻害）と比較した細胞生存能力の阻害を算出した
。

【0478】

【表16】

【0479】

まとめると、本明細書に開示される抗ｃＫＩＴ抗体は、処置のためのより多くの選択肢
をもたらす他の分子と組み合わせて使用した場合、相乗効果を有する。例えば、ＮＥＧ０
８５−ＭＣＣ−ＤＭ１を、相乗効果を得るための療法としてＩＡＰ阻害剤（例えば、ＮＶ
Ｐ−ＬＣＬ１６１）と同時に投与することができる。
［実施例３５］

【0480】

ＮＥＧ０８５のエピトープマッピング
ｉｎ ｓｉｔｕ限定的タンパク質分解
ヒトｃＫＩＴ（受託コードＮＭ＿０００２２２ドメイン１（Ｄ１）−ドメイン３（Ｄ３
）細胞外ドメイン（ＥＣＤ）タンパク質を、残基Ｑ２６−Ｇ３１１（Ｎ１３０Ｓ、Ｎ１４
５Ｓ−これらの変化は、タンパク質を無グリカン形態で発現させるためのグリコシル化欠
損をもたらす）と共に作製した。等モル比のヒトｃＫＩＴ Ｄ１−Ｄ３ ＥＣＤおよびＮ
ＥＧ０８５ Ｆａｂを混合し、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５および１００ｍ
Ｍ ＮａＣｌで平衡化された最終ゲル濾過ステップにかけ、２０ｍｇ／ｍｌに濃縮した。
トリプシンをタンパク質複合体結晶化試料に添加して、１：１００ｗ／ｗ希釈液を作出し
た。プロテアーゼ／試料混合物を室温で３０分間インキュベートした後、結晶化実験を設
定した。

【0481】

結晶化
ｃＫＩＴ ＥＣＤ／ＮＥＧ０８５ Ｆａｂ複合体の回折結晶を、４℃で、Ｐｒｏｔｅｉ
ｎ Ｃｏｍｐｌｅｘ Ｓｕｉｔｅ Ｆ５（０．１Ｍ ＮａＣｌ、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ ｐ
Ｈ８．０、８％ＰＥＧ２０ｋ；Ｑｉａｇｅｎ）から直接取得し、小規模最適化後、社内で
５Åに回折する結晶を誘導した。データ収集のために使用された結晶を、シッティングド
ロップ蒸気拡散法により、等量のタンパク質（２０ｍｇ／ｍＬ）およびリザーバ溶液（０
．１Ｍ ＮａＣｌ、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０、１０％ＰＥＧ２０ｋ）を平衡化す
ることにより４℃で成長させた。データ収集の前に、結晶を、３０％グリセロールを含有
するリザーバ溶液中で凍結防止し、液体窒素中で急速冷却した。

【0482】

データ収集
データを、ＡＤＳＣ ＱＵＡＮＴＵＭ ３１５検出器（ＡＤＳＣ、Ｐｏｗａｙ ＣＡ）
およびＡｄｖａｎｃｅｄ Ｌｉｇｈｔ Ｓｏｕｒｃｅの５．０．２のビーム線でシンクロ
トロン放射（λ＝１．００００Å）を使用して１００Ｋに冷却した単結晶上で収集した。
ｃＫＩＴ ＥＣＤ／ＮＥＧ０８５ Ｆａｂの結晶は、３．１Å解像度に回折し、ユニット
セルパラメータａ＝２１３．７６Å、ｂ＝１１７．４８Å、ｃ＝１７１．９２Å、α＝９
０°、β＝１１８．４７°、γ＝９０°を有する空間群Ｃ２に属していた。結晶は、非対
称ユニット中に４コピーのｃＫＩＴ ＥＣＤ／ＮＥＧ０８５ Ｆａｂ複合体を含有し、溶
媒含量は６６％と算出された。データを、ａｕｔｏＰＲＯＣ（Ｇｌｏｂａｌ Ｐｈａｓｉ
ｎｇ Ｌｔｄ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ ＵＫ）を使用してプロセッシングした。

【0483】

構造決定および改良
ｃＫＩＴ ＥＣＤ／ＮＥＧ０８５ Ｆａｂ複合体の構造を、出発モデルとしてｃＫＩＴ
ＥＣＤの公開された結晶構造（ＰＤＢ ＩＤコード：２ＥＣ８）（Yuzawa et al., Cel
l 2007; 130 (2):323-34）および抗α１β１インテグリンＩ Ｆａｂ（ＰＤＢ ＩＤコー
ド：１ＭＨＰ）（Karpusas et al., J. Mol. Biol. 2003; 327 (5):1031-41）を使用して
、ＰＨＡＳＥＲ（McCoy et al., J. Appl. Crystallogr. 2007; 40(4): 658-74）との分
子置き換えにより３．１Å解像度で分解した。ＮＥＧ０８５ Ｆａｂ断片のＣＤＲループ
を、Ｐｈｅｎｉｘ（Adams et al., Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 2010; 66
(2): 213-21）に実装されたシミュレート化アニーリングコンポジットオミットマップを
使用してＣＯＯＴ（Emsley and Cowtan, Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 200
4; 60 (12): 2126-32）中で手動で再構築した。Ｐｈｅｎｉｘ．ｒｅｆｉｎｅプログラム
を使用するモデル構築および改良のその後のラウンドを、収束まで実行した。

【0484】

結果：ＮＥＧ０８５のＦａｂ断片との複合体中のヒトｃＫＩＴ Ｄ１−Ｄ２の構造
ｃＫＩＴ Ｄ１−Ｄ３／ＮＥＧ０８５ Ｆａｂ共構造は、ＮＥＧ０８５が、ドメイン１
、２およびそれらの間のリンカー残基内に含まれる多数の残基と特異的に相互作用するこ
とにより、ｃＫＩＴの細胞外膜遠位ドメインを認識し、これに結合することを示している
。従って、ＮＥＧ０８５により認識されるｃＫＩＴエピトープを、
ｃＫＩＴドメイン１残基：Ｒ４９、Ｖ５０
ｃＫＩＴドメイン２残基：Ｑ１５２、Ｇ１５３、Ｈ１８５およびループＱ１９０−Ｅ１
９８
ドメイン１と２の間のリンカー：Ｄ１１３〜Ｌ１１７
と定義することができる。ＮＥＧ０８５は、全てのＣＤＲ（Ｈ１〜Ｈ３およびＬ１〜Ｌ３
）を使用してｃＫＩＴ Ｄ１−Ｄ２に結合する（図５３）。図５３は、Ｆａｂ重鎖（暗灰
色）、Ｆａｂ軽鎖（白色）、およびＫｉｔ Ｄ１−Ｄ２（明灰色）ドメインを示すＫｉｔ
Ｄ１−Ｄ２／ＮＥＧ０８５ Ｆａｂ複合体の３．１Å結晶構造を示す。エピトープおよ
びパラトープは黒色である。ＮＥＧ０８５／ｃＫＩＴ境界面は、合計約１８９０Å２の溶
媒接近可能表面積を埋める（それぞれ、Ｈ鎖およびＬ鎖からの１２１１Å２および６７９
Å２）。エピトープは、ｃＫＩＴ Ｄ１−Ｄ２リンカー領域Ｄ１１３−Ｌ１１７（配列番
号１６３）とループＱ１９０−Ｅ１９８（配列番号１６４）の中心にあり、これらの残基
は表２、配列番号１５５中で太字および下線付きで示される。これらのエピトープは一次
配列中では不連続であるが、結晶構造中では非常に近接していることに留意されたい。こ
れらのエピトープ相互作用は、Ｒ４９、Ｖ５０、Ｑ１５２、Ｇ１５３、およびＨ１８５と
の末梢相互作用により補完される（図５３）。ｃＫＩＴ Ｄ１−Ｄ２とＮＥＧ０８５ Ｆ
ａｂとの分子間相互作用を、ＰＩＳＡ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ、Ｓｕｒ
ｆａｃｅ ａｎｄ Ａｓｓｅｍｂｌｉｅｓ）（Krissinel and Henrick, J. Mol. Biol. 2
007, 372(3):774-97）を使用して検査した。このデータを、表１７に示す。

【0485】

二量体ｃＫＩＴ／ＳＣＦシグナリング複合体（Yuzawa et al. Cell 2007; 130 (2);323
-34）およびｃＫＩＴ／ＮＥＧ０８５複合体中のｃＫＩＴの重ね合わせは、ＮＥＧ０８５
およびＳＣＦがｃＫＩＴへの結合について互いに競合しないと考えられることを示してい
る。ＮＥＧ０８５は、ＳＣＦ結合を担う結合エピトープとは異なるエピトープに結合する
。従って、ｃＫＩＴへのＮＥＧ０８５の結合は、ＳＣＦとの会合について直接競合しない
。

【0486】

【表17】

【0487】

ＮＥＧ０８５ Ｆａｂ ＶＨおよびＶＬ残基は、その線状アミノ酸配列に基づいて番号
付けられる。ｃＫＩＴ残基は、受託コードＮＭ＿０００２２２に基づいて番号付けられる
。分子間相互作用を、ＰＩＳＡ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ、Ｓｕｒｆａｃ
ｅ ａｎｄ Ａｓｓｅｍｂｌｉｅｓ）（Krissinel and Henrick, J. Mol. Biol. 2007, 3
72(3):774-97）を使用して検査した。

【0488】

本明細書に記載の実施例および態様は例示目的に過ぎず、それに照らして様々な改変ま
たは変更が当業者に対して示唆され、本出願および添付の特許請求の範囲の精神および範
囲の中に含まれることが理解される。

本発明は以下の態様を含み得る。
［１］
式：
Ａｂ−（Ｌ−（Ｄ）_ｍ）_ｎ
（式中、
ＡｂはヒトｃＫＩＴのエピトープに特異的に結合する抗体またはその抗原結合性断片で
あり；
Ｌはリンカーであり；
Ｄは薬物部分であり；
ｍは１〜８の整数であり；および
ｎは１〜１０の整数である）
の抗体薬物コンジュゲート、またはその薬学的に許容される塩。
［２］
前記ｎが３または４である、請求項１に記載の抗体薬物コンジュゲート。
［３］
前記抗体またはその抗原結合性断片が、ｃＫＩＴの細胞外ドメイン（配列番号１６０）
に特異的に結合する、請求項１または２に記載の抗体薬物コンジュゲート。
［４］
前記抗体または抗原結合性断片が、ドメイン１〜３でヒトｃＫＩＴのエピトープ（配列
番号１５５）に特異的に結合する、請求項１または２に記載の抗体薬物コンジュゲート。
［５］
前記抗体またはその抗原結合性断片が、配列番号１６１および配列番号１６２でヒトｃ
ＫＩＴに特異的に結合する、請求項１または２に記載の抗体薬物コンジュゲート。
［６］
前記抗体またはその抗原結合性断片が、
（ｉ）（ａ）配列番号７６のＨＣＤＲ１（ＣＤＲ相補性決定領域）、（ｂ）配列番号７
７のＨＣＤＲ２、（ｃ）配列番号７８のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、（ｄ）配列番
号８５のＬＣＤＲ１、（ｅ）配列番号８６のＬＣＤＲ２、および（ｆ）配列番号８７のＬ
ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；
（ｉｉ）（ａ）配列番号２２のＨＣＤＲ１、（ｂ）配列番号２３のＨＣＤＲ２、（ｃ）
配列番号２４のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、（ｄ）配列番号３１のＬＣＤＲ１、（
ｅ）配列番号３２のＬＣＤＲ２、および（ｆ）配列番号３３のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変
領域；
（ｉｉｉ）（ａ）配列番号１３０のＨＣＤＲ１、（ｂ）配列番号１３１のＨＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号１３２のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、（ｄ）配列番号１３９のＬＣ
ＤＲ１、（ｅ）配列番号１４０のＬＣＤＲ２、および（ｆ）配列番号１４１のＬＣＤＲ３
を含む軽鎖可変領域；
（ｉｖ）（ａ）配列番号５８のＨＣＤＲ１、（ｂ）配列番号５９のＨＣＤＲ２、（ｃ）
配列番号６０のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、（ｄ）配列番号６７のＬＣＤＲ１、（
ｅ）配列番号６８のＬＣＤＲ２、および（ｆ）配列番号６９のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変
領域；
（ｖ）（ａ）配列番号４０のＨＣＤＲ１、（ｂ）配列番号４１のＨＣＤＲ２、（ｃ）配
列番号４２のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、（ｄ）配列番号４９のＬＣＤＲ１、（ｅ
）配列番号５０のＬＣＤＲ２、および（ｆ）配列番号５１のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領
域；
（ｖｉ）（ａ）配列番号９４のＨＣＤＲ１、（ｂ）配列番号９５のＨＣＤＲ２、（ｃ）
配列番号９６のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、（ｄ）配列番号１０３のＬＣＤＲ１、
（ｅ）配列番号１０４のＬＣＤＲ２、および（ｆ）配列番号１０５のＬＣＤＲ３を含む軽
鎖可変領域；
（ｖｉｉ）（ａ）配列番号１１２のＨＣＤＲ１、（ｂ）配列番号１１３のＨＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号１１４のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、（ｄ）配列番号１２１のＬＣ
ＤＲ１、（ｅ）配列番号１２２のＬＣＤＲ２、および（ｆ）配列番号１２３のＬＣＤＲ３
を含む軽鎖可変領域；または
（ｖｉｉｉ）（ａ）配列番号３のＨＣＤＲ１、（ｂ）配列番号４のＨＣＤＲ２、（ｃ）
配列番号５のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、（ｄ）配列番号１２のＬＣＤＲ１、（ｅ
）配列番号１３のＬＣＤＲ２、および（ｆ）配列番号１４のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領
域
を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗体薬物コンジュゲート。
［７］
ＣＤＲ内の少なくとも１つのアミノ酸が、表１中の別の抗ｃＫＩＴ抗体の対応するＣＤ
Ｒの対応する残基により置換される、先行請求項のいずれか１項に記載の抗体薬物コンジ
ュゲート。
［８］
ＣＤＲ内の１または２つのアミノ酸が改変、欠失または置換されている、先行請求項の
いずれか１項に記載の抗体薬物コンジュゲート。
［９］
可変軽鎖または可変重鎖領域のいずれかにわたって少なくとも９０、９１、９２、９３
、９４、９５、９６、９７、９８または９９％の同一性を保持する、先行請求項のいずれ
か１項に記載の抗体薬物コンジュゲート。
［１０］
前記抗体がモノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト操作抗体、ヒト抗体、
一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）または抗体断片である、先行請求項のいずれか１項に記載の抗体
薬物コンジュゲート。
［１１］
前記リンカー（Ｌ）が、切断性リンカー、非切断性リンカー、親水性リンカー、プロチ
ャージリンカーおよびジカルボン酸に基づくリンカーからなる群から選択される、請求項
１〜１０のいずれか１項に記載の抗体薬物コンジュゲート。
［１２］
前記リンカーが、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート
（ＳＰＤＰ）、Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）ペンタノエート（ＳＰ
Ｐ）、Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）ブタノエート（ＳＰＤＢ）、Ｎ
−スクシンイミジル−４−（２−ピリジルジチオ）２−スルホ−ブタノエート（スルホ−
ＳＰＤＢ）、Ｎ−スクシンイミジルヨードアセテート（ＳＩＡ）、Ｎ−スクシンイミジル
（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート（ＳＩＡＢ）、マレイミドＰＥＧ ＮＨＳ、
Ｎ−スクシンイミジル４−（マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボキシレート（ＳＭ
ＣＣ）、Ｎ−スルホスクシンイミジル４−（マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボキ
シレート（スルホ−ＳＭＣＣ）または２，５−ジオキソピロリジン−１−イル１７−（２
，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）−５，８，１１，１４
−テトラオキソ−４，７，１０，１３−テトラアザヘプタデカン−１−オエート（ＣＸ１
−１）からなる群から選択される架橋試薬から誘導される、請求項１１に記載の抗体薬物
コンジュゲート。
［１３］
前記リンカーが、架橋試薬Ｎ−スクシンイミジル４−（マレイミドメチル）シクロヘキ
サンカルボキシレート（ＳＭＣＣ）から誘導される、請求項１２に記載の抗体薬物コンジ
ュゲート。
［１４］
前記薬物部分（Ｄ）が、Ｖ−ＡＴＰａｓｅ阻害剤、プロアポトーシス剤、Ｂｃｌ２阻害
剤、ＭＣＬ１阻害剤、ＨＳＰ９０阻害剤、ＩＡＰ阻害剤、ｍＴｏｒ阻害剤、微小管安定化
剤、微小管脱安定化剤、オーリスタチン、ドラスタチン、メイタンシノイド、ＭｅｔＡＰ
（メチオニンアミノペプチダーゼ）、タンパク質ＣＲＭ１の核輸送の阻害剤、ＤＰＰＩＶ
阻害剤、プロテアソーム阻害剤、ミトコンドリアにおけるホスホリル転移反応の阻害剤、
タンパク質合成阻害剤、キナーゼ阻害剤、ＣＤＫ２阻害剤、ＣＤＫ９阻害剤、キネシン阻
害剤、ＨＤＡＣ阻害剤、ＤＮＡ損傷剤、ＤＮＡアルキル化剤、ＤＮＡ挿入剤、ＤＮＡ副溝
結合剤およびＤＨＦＲ阻害剤からなる群から選択される、請求項１〜１３のいずれか１項
に記載の抗体薬物コンジュゲート。
［１５］
前記薬物部分がメイタンシノイドである、請求項１４に記載の抗体薬物コンジュゲート
。
［１６］
前記メイタンシノイドが、Ｎ（２’）−デアセチル−Ｎ（２’）−（３−メルカプト−
１−オキソプロピル）−メイタンシン（ＤＭ１）またはＮ（２’）−デアセチル−Ｎ２−
（４−メルカプト−４−メチル−１−オキソペンチル）−メイタンシン（ＤＭ４）である
、請求項１５に記載の抗体薬物コンジュゲート。
［１７］
別の治療剤と組み合わせた、先行請求項のいずれか一項に記載の抗体薬物コンジュゲー
ト。
［１８］
表１６に列挙される治療剤と組み合わせた、先行請求項のいずれか一項に記載の抗体薬
物コンジュゲート。
［１９］
式：

【化15】

（式中、
ＡｂはヒトｃＫＩＴ、および少なくともｎ個の第１級アミンに特異的に結合する抗体ま
たはその抗原結合性断片であり；ｎは１〜１０の整数である）
の抗体薬物コンジュゲート、またはその薬学的に許容される塩。
［２０］
前記抗体または抗原結合性断片が、ドメイン１〜３でヒトｃＫＩＴのエピトープ（配列
番号１５５）に特異的に結合する、請求項１９に記載の抗体薬物コンジュゲート。
［２１］
前記抗体またはその抗原結合性断片が、配列番号１６１および配列番号１６２でヒトｃ
ＫＩＴに特異的に結合する、請求項１９に記載の抗体薬物コンジュゲート。
［２２］
前記Ａｂが、
（ｉ）（ａ）配列番号７６のＨＣＤＲ１（ＣＤＲ−相補性決定領域）、（ｂ）配列番号
７７のＨＣＤＲ２、（ｃ）配列番号７８のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、（ｄ）配列
番号８５のＬＣＤＲ１、（ｅ）配列番号８６のＬＣＤＲ２、および（ｆ）配列番号８７の
ＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；
（ｉｉ）（ａ）配列番号２２のＨＣＤＲ１、（ｂ）配列番号２３のＨＣＤＲ２、（ｃ）
配列番号２４のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、（ｄ）配列番号３１のＬＣＤＲ１、（
ｅ）配列番号３２のＬＣＤＲ２、および（ｆ）配列番号３３のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変
領域；
（ｉｉｉ）（ａ）配列番号１３０のＨＣＤＲ１、（ｂ）配列番号１３１のＨＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号１３２のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、（ｄ）配列番号１３９のＬＣ
ＤＲ１、（ｅ）配列番号１４０のＬＣＤＲ２、および（ｆ）配列番号１４１のＬＣＤＲ３
を含む軽鎖可変領域；
（ｉｖ）（ａ）配列番号５８のＨＣＤＲ１、（ｂ）配列番号５９のＨＣＤＲ２、（ｃ）
配列番号６０のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、（ｄ）配列番号６７のＬＣＤＲ１、（
ｅ）配列番号６８のＬＣＤＲ２、および（ｆ）配列番号６９のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変
領域；
（ｖ）（ａ）配列番号４０のＨＣＤＲ１、（ｂ）配列番号４１のＨＣＤＲ２、（ｃ）配
列番号４２のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、（ｄ）配列番号４９のＬＣＤＲ１、（ｅ
）配列番号５０のＬＣＤＲ２、および（ｆ）配列番号５１のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領
域；
（ｖｉ）（ａ）配列番号９４のＨＣＤＲ１、（ｂ）配列番号９５のＨＣＤＲ２、（ｃ）
配列番号９６のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、（ｄ）配列番号１０３のＬＣＤＲ１、
（ｄ）配列番号１０４のＬＣＤＲ２、および（ｆ）配列番号１０５のＬＣＤＲ３を含む軽
鎖可変領域；
（ｖｉｉ）（ａ）配列番号１１２のＨＣＤＲ１、（ｂ）配列番号１１３のＨＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号１１４のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、（ｄ）配列番号１２１のＬＣ
ＤＲ１、（ｅ）配列番号１２２のＬＣＤＲ２、および（ｆ）配列番号１２３のＬＣＤＲ３
を含む軽鎖可変領域；または
（ｖｉｉｉ）（ａ）配列番号３のＨＣＤＲ１、（ｂ）配列番号４のＨＣＤＲ２、（ｃ）
配列番号５のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、（ｄ）配列番号１２のＬＣＤＲ１、（ｅ
）配列番号１３のＬＣＤＲ２、および（ｆ）配列番号１４のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領
域
を含む抗体またはその抗原結合性断片である、請求項１９に記載の抗体薬物コンジュゲー
ト。
［２３］
ＣＤＲ内の少なくとも１つのアミノ酸が、表１の別の抗ｃＫＩＴ抗体の対応するＣＤＲ
の対応する残基により置換される、先行請求項のいずれか１項に記載の抗体薬物コンジュ
ゲート。
［２４］
ＣＤＲ内の１または２つのアミノ酸が改変、欠失または置換されている、先行請求項の
いずれか１項に記載の抗体薬物コンジュゲート。
［２５］
可変軽鎖または可変重鎖領域のいずれかにわたって少なくとも９０、９１、９２、９３
、９４、９５、９６、９７、９８または９９％の同一性を保持する、先行請求項のいずれ
か１項に記載の抗体薬物コンジュゲート。
［２６］
抗体がモノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト操作抗体、ヒト抗体、一本
鎖抗体（ｓｃＦｖ）または抗体断片である、請求項１９〜２５のいずれか１項に記載の抗
体薬物コンジュゲート。
［２７］
前記ｎが２〜８の整数である、請求項１９〜２５のいずれか１項に記載の抗体薬物コン
ジュゲート。
［２８］
前記ｎが３〜４の整数である、請求項１９〜２５のいずれか１項に記載の抗体薬物コン
ジュゲート。
［２９］
別の治療剤と組み合わせた、請求項１９〜２８のいずれか１項に記載の抗体薬物コンジ
ュゲート。
［３０］
表１６に列挙される治療剤と組み合わせた、請求項１９〜２８のいずれか１項に記載の
抗体薬物コンジュゲート。
［３１］
請求項１〜２８のいずれか１項に記載の抗体薬物コンジュゲートと、薬学的に許容され
る担体とを含む医薬組成物。
［３２］
凍結乾燥物として調製される、請求項３１に記載の医薬組成物。
［３３］
前記凍結乾燥物が、請求項１〜２８のいずれか１項に記載の抗体薬物コンジュゲート、
コハク酸ナトリウム、およびポリソルベート２０を含む、請求項３２に記載の医薬組成物
。
［３４］
それを必要とする患者におけるｃＫＩＴ陽性がんを処置する方法であって、請求項１〜
２８のいずれか１項に記載の抗体薬物コンジュゲート、または請求項３１〜３３に記載の
医薬組成物を、前記患者に投与することを含む、方法。
［３５］
前記がんが、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）、急性骨髄性白
血病（ＡＭＬ）、メラノーマ、肥満細胞白血病（ＭＣＬ）、肥満細胞症、神経線維腫症、
乳がん、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）および膵臓がんからなる群から選択される、請求
項３４に記載の方法。
［３６］
前記抗体薬物コンジュゲートまたは前記医薬組成物が、別の治療剤と組み合わせて投与
される、請求項３５に記載の方法。
［３７］
前記抗体薬物コンジュゲートまたは前記医薬組成物が、表１６に列挙される治療剤と組
み合わせて投与される、請求項３６に記載の方法。
［３８］
医薬としての使用のための請求項１〜２８のいずれか１項に記載の抗体薬物コンジュゲ
ート。
［３９］
ｃＫＩＴ陽性がんの処置における使用のための、請求項１〜２８のいずれか１項に記載
の抗体薬物コンジュゲート、または請求項３１〜３３のいずれか１項に記載の医薬組成物
。
［４０］
別の治療剤と組み合わせて投与される、請求項３９に記載の抗体薬物コンジュゲート。
［４１］
表１６に列挙される治療剤と組み合わせて投与される、請求項４０に記載の抗体薬物コ
ンジュゲート。
［４２］
請求項１〜２８のいずれか１項に記載の抗体または抗原結合性断片をコードする核酸。
［４３］
請求項４２に記載の核酸を含むベクター。
［４４］
請求項４３に記載のベクターを含む宿主細胞。
［４５］
請求項４４に記載の宿主細胞を培養すること、および培養物から抗体を回収することを
含む、抗体または抗原結合性断片を生成するための方法。
［４６］
（ａ）ＳＭＣＣを薬物部分ＤＭ−１に化学的に連結すること；
（ｂ）前記リンカー−薬物を、請求項４５に記載の細胞培養物から回収された抗体にコ
ンジュゲートすること；および
（ｃ）抗体薬物コンジュゲートを精製すること
を含む、抗ｃＫＩＴ抗体薬物コンジュゲートを生成するための方法。
［４７］
ＵＶ分光光度計を使用して測定される、約３．５の平均メイタンシノイドと抗体との比
（ＭＡＲ）を有する、請求項４６に従って作製される抗体薬物コンジュゲート。
［４８］
（ｉ）（ａ）配列番号７６のＨＣＤＲ１（ＣＤＲ−相補性決定領域）、（ｂ）配列番号
７７のＨＣＤＲ２、（ｃ）配列番号７８のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、（ｄ）配列
番号８５のＬＣＤＲ１、（ｅ）配列番号８６のＬＣＤＲ２、および（ｆ）配列番号８７の
ＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；
（ｉｉ）（ａ）配列番号２２のＨＣＤＲ１、（ｂ）配列番号２３のＨＣＤＲ２、（ｃ）
配列番号２４のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、（ｄ）配列番号３１のＬＣＤＲ１、（
ｅ）配列番号３２のＬＣＤＲ２、および（ｆ）配列番号３３のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変
領域；
（ｉｉｉ）（ａ）配列番号１３０のＨＣＤＲ１、（ｂ）配列番号１３１のＨＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号１３２のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、（ｄ）配列番号１３９のＬＣ
ＤＲ１、（ｅ）配列番号１４０のＬＣＤＲ２、および（ｆ）配列番号１４１のＬＣＤＲ３
を含む軽鎖可変領域；
（ｉｖ）（ａ）配列番号５８のＨＣＤＲ１、（ｂ）配列番号５９のＨＣＤＲ２、（ｃ）
配列番号６０のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、（ｄ）配列番号６７のＬＣＤＲ１、（
ｅ）配列番号６８のＬＣＤＲ２、および（ｆ）配列番号６９のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変
領域；
（ｖ）（ａ）配列番号４０のＨＣＤＲ１、（ｂ）配列番号４１のＨＣＤＲ２、（ｃ）配
列番号４２のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、（ｄ）配列番号４９のＬＣＤＲ１、（ｅ
）配列番号５０のＬＣＤＲ２、および（ｆ）配列番号５１のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領
域；
（ｖｉ）（ａ）配列番号９４のＨＣＤＲ１、（ｂ）配列番号９５のＨＣＤＲ２、（ｃ）
配列番号９６のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、（ｄ）配列番号１０３のＬＣＤＲ１、
（ｄ）配列番号１０４のＬＣＤＲ２、および（ｆ）配列番号１０５のＬＣＤＲ３を含む軽
鎖可変領域；
（ｖｉｉ）（ａ）配列番号１１２のＨＣＤＲ１、（ｂ）配列番号１１３のＨＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号１１４のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、（ｄ）配列番号１２１のＬＣ
ＤＲ１、（ｅ）配列番号１２２のＬＣＤＲ２、および（ｆ）配列番号１２３のＬＣＤＲ３
を含む軽鎖可変領域；または
（ｖｉｉｉ）（ａ）配列番号３のＨＣＤＲ１、（ｂ）配列番号４のＨＣＤＲ２、（ｃ）
配列番号５のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、（ｄ）配列番号１２のＬＣＤＲ１、（ｅ
）配列番号１３のＬＣＤＲ２、および（ｆ）配列番号１４のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領
域
を含む、抗体またはその抗原結合性断片。
［４９］
標識された請求項４８に記載の抗体またはその抗原結合性断片を含む診断剤。
［５０］
標識が、放射性標識、フルオロフォア、発色団、画像化剤、および金属イオンからなる
群から選択される、請求項４９に記載の診断剤。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27】

【図28】

【図29】

【図30】

【図31】

【図32】

【図33】

【図34】

【図35】

【図36】

【図37】

【図38】

【図39】

【図40】

【図41】

【図42】

【図43】

【図44】

【図45】

【図46】

【図47】

【図48】

【図49】

【図50】

【図51】

【図52】

【図53】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]