特許 6578595 抗アセチル化ヒストンＨ４抗体

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6578595

(24)【登録日】2019年9月6日

(45)【発行日】2019年9月25日

(54)【発明の名称】抗アセチル化ヒストンＨ４抗体

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/18 20060101AFI20190912BHJP

   G01N 33/574 20060101ALI20190912BHJP

   G01N 33/53 20060101ALI20190912BHJP

   C12N 15/08 20060101ALN20190912BHJP

   C12P 21/08 20060101ALN20190912BHJP

【ＦＩ】

   C07K16/18ZNA

   G01N33/574 Z

   G01N33/53 D

   G01N33/53 M

   !C12N15/08 100

   !C12P21/08

【請求項の数】5

【全頁数】19

(21)【出願番号】特願2015-169223(P2015-169223)

(22)【出願日】2015年8月28日

(65)【公開番号】特開2017-43579(P2017-43579A)

(43)【公開日】2017年3月2日

【審査請求日】2018年2月19日

(73)【特許権者】

【識別番号】503360115

【氏名又は名称】国立研究開発法人科学技術振興機構

(74)【代理人】

【識別番号】100149548

【弁理士】

【氏名又は名称】松沼 泰史

(74)【代理人】

【識別番号】100163496

【弁理士】

【氏名又は名称】荒 則彦

(74)【代理人】

【識別番号】100161207

【弁理士】

【氏名又は名称】西澤 和純

(74)【代理人】

【識別番号】100147267

【弁理士】

【氏名又は名称】大槻 真紀子

(74)【代理人】

【識別番号】100064908

【弁理士】

【氏名又は名称】志賀 正武

(74)【代理人】

【識別番号】100094400

【弁理士】

【氏名又は名称】鈴木 三義

(72)【発明者】

【氏名】梅原 崇史

(72)【発明者】

【氏名】若森 昌聡

(72)【発明者】

【氏名】蓑田 亜希子

(72)【発明者】

【氏名】坂本 健作

(72)【発明者】

【氏名】松田 貴意

(72)【発明者】

【氏名】横山 茂之

【審査官】 西 賢二

(56)【参考文献】

【文献】 特表２００６−５０１２７９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００９−５３６３３６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００５−５０８３０２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００４−１６６６５９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１３−５０７１１５（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

Ｃ０７Ｋ １／００−１９／００

Ｇ０１Ｎ ３３／４８−３３／９８

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ヒストンＨ４のＬｙｓ５及びＬｙｓ８がアセチル化されたアセチル化ヒストンＨ４を認識し、重鎖可変部及び軽鎖可変部を含み、
前記重鎖可変部が、配列番号５で表されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１と、配列番号６で表されるアミノ酸配列又は配列番号７で表されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２と、配列番号８で表されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３とを有しており、かつ、配列番号１若しくは２で表されるアミノ酸配列、又は、配列番号１若しくは２で表されるアミノ酸配列のうち、第２６〜３５番目、第５０〜６６番目、及び第９８〜１００番目のアミノ酸残基以外の領域のアミノ酸配列と９０％以上１００％未満の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、
前記軽鎖可変部が、配列番号９で表されるアミノ酸配列又は配列番号１０で表されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１と、配列番号１１で表されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２と、配列番号１２で表されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３とを有しており、かつ、配列番号３若しくは４で表されるアミノ酸配列、又は、配列番号３若しくは４で表されるアミノ酸配列のうち、第２４〜３４番目、第５０〜５６番目、及び第８９〜９６番目のアミノ酸残基以外の領域のアミノ酸配列と９０％以上１００％未満の配列同一性を有するアミノ酸配列からなることを特徴とする、抗アセチル化ヒストンＨ４抗体。

【請求項2】

さらに、重鎖定常部及び／又は軽鎖定常部を含む、請求項１に記載の抗アセチル化ヒストンＨ４抗体。

【請求項3】

免疫グロブリン、Ｆａｂフラグメント抗体、Ｆ(ａｂ')_２フラグメント抗体、又は一本鎖抗体である、請求項１又は２に記載の抗アセチル化ヒストンＨ４抗体。

【請求項4】

クロマチンを含む被検試料に対して、請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗アセチル化ヒストンＨ４抗体を用いてクロマチン免疫沈降塩基配列決定法を行うことにより、一のヌクレオソーム中のヒストンＨ４のＬｙｓ５とＬｙｓ８の２箇所が共にアセチル化された状態のクロマチン領域を検出することを特徴とする、クロマチンの解析方法。

【請求項5】

被検者から採取されたクロマチンを含む被検試料に対して、請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗アセチル化ヒストンＨ４抗体を用いてクロマチン免疫沈降塩基配列決定法を行うことにより、一のヌクレオソーム中のヒストンＨ４のＬｙｓ５とＬｙｓ８の２箇所が共にアセチル化された状態のクロマチン領域を検出し、当該クロマチン領域に含まれるゲノムＤＮＡ上にコードされている遺伝子を検出し、がん患者において発現量が高くなっている遺伝子が検出された場合には、前記被験者はがんを発症している可能性が高いと評価することを特徴とする、がん発症可能性を評価することを補助する方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、Ｌｙｓ５（５番目のリジン残基）とＬｙｓ８（８番目のリジン残基）の両方がアセチル化されたヒストンＨ４を識別して認識する抗体に関する。

【背景技術】

【0002】

ヒトを始めとする真核生物では、細胞種ごとにゲノムＤＮＡの凝集構造体であるクロマチンの化学修飾情報（エピジェネティクス情報）が異なっており、これが個体の発生・分化・癌化・老化を制御していることが知られている。個々の細胞においてどのようなエピジェネティクス修飾情報を有しているかについては不明な点も多いが、遺伝子発現とエピジェネティクス修飾の関係について研究が進んでいる。例えば、真核生物の遺伝子発現制御において、ヒストンのリジン残基のアセチル化が重要な役割を果たしていることが知られている。また、遺伝子発現が活性なクロマチン領域は、ヒストン、特にヒストンＨ４のＮ末端領域の４つのリジン残基（Ｌｙｓ５、Ｌｙｓ８、Ｌｙｓ１２、Ｌｙｓ１６）が高アセチル化されていることが知られている。

【0003】

近年、ヒストンＨ４のアセチル化のうち、Ｌｙｓ５とＬｙｓ８の２箇所が両方ともアセチル化されている状態が、ＢＥＴ型ブロモドメインタンパク質（ＢＲＤ４、ＢＲＤＴ等）によって認識され、これが遺伝子発現の引き金となっていることが報告された（例えば、非特許文献１参照。）。ＢＥＴ型ブロモドメインタンパク質は、各種がんで発現が亢進されていたり、機能が活発になっており、その阻害又は検出が、がんの治療や診断に有効であることが期待されている。

【0004】

クロマチンのエピジェネティクス修飾情報を解析する方法として、クロマチン免疫沈降塩基配列決定法（Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ−ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ；ＣｈＩＰ−ｓｅｑ）がある。ＣｈＩＰ−ｓｅｑは、ＣｈＩＰ（クロマチン免疫沈降法）と塩基配列解析を組み合わせた方法であり、特にクロマチンのアセチル化状態の解析によく用いられている。転写活性因子がクロマチンに結合すると、ヒストンに対するアセチル基転移酵素活性を有する転写共役因子がリクルートされる結果、転写活性因子が結合した領域及びその周辺のヒストンがアセチル化される。そこで、細胞からＤＮＡを抽出する前にタンパク質をゲノムＤＮＡに固定化しておき、抽出したＤＮＡを断片化した後に転写活性因子やアセチル化ヒストンを識別する抗体を用いて免疫沈降させ、得られた沈降物中のＤＮＡを解析することにより、アセチル化ヒストンが巻き付いているゲノムＤＮＡ上にコードされている遺伝子を解析することができる。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0005】

【特許文献1】特許第４５８３６３８号公報

【非特許文献】

【0006】

【非特許文献1】Moriniere et al.，Nature，2009，vol.461，p.664-668

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

一のヌクレオソーム中のヒストンＨ４のＬｙｓ５とＬｙｓ８の２箇所が共にアセチル化された状態は、遺伝子発現が非常に活性なクロマチン領域の目印であることが期待される。しかしながら、現在のところ、ヒストンＨ４のＬｙｓ５とＬｙｓ８の２箇所の両アセチル化を直接的に検出するツールは、存在しない。例えば、ヒストンＨ４のＮ末端の４箇所のリジン残基（Ｌｙｓ５、Ｌｙｓ８、Ｌｙｓ１２、Ｌｙｓ１６）のうちの１つのみがアセチル化されているアセチル化ヒストンＨ４を特異的に認識するモノクローナル抗体は既知であり、市販されてもいる（モノクローナル抗体研究所製、ＭＡＢＩ０４０５、ＭＡＢＩ０４０８など）が、これらの既存抗体では、一のヌクレオソーム中のヒストンＨ４のＬｙｓ５とＬｙｓ８の２箇所が共にアセチル化された状態を検出することはできない。

【0008】

そこで、本発明は、Ｌｙｓ５とＬｙｓ８の両方がアセチル化されたヒストンＨ４を、Ｌｙｓ５はアセチル化されているがＬｙｓ８はアセチル化されていないヒストンＨ４、Ｌｙｓ５はアセチル化されていないがＬｙｓ８はアセチル化されているヒストンＨ４、及びＬｙｓ５とＬｙｓ８の両方ともアセチル化されていないヒストンＨ４から識別して認識する抗体を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0009】

本発明者らは、鋭意研究した結果、Ｌｙｓ５とＬｙｓ８の２箇所が両方ともアセチル化されているヒトのヒストンＨ４の全長タンパク質を抗原として免疫したマウスのリンパ節細胞をハイブリドーマ化してスクリーニングすることにより、ヒストンＨ４のＬｙｓ５とＬｙｓ８の２箇所の両アセチル化を同時に認識するマウスモノクローナル抗体を産生細胞するハイブリドーマ細胞をはじめて取得し、本発明を完成させた。

【0010】

すなわち、本発明に係る抗アセチル化ヒストンＨ４抗体、クロマチンの解析方法、及びがん発症可能性を評価することを補助する方法は、下記［１］〜［５］である。
［１］ヒストンＨ４のＬｙｓ５及びＬｙｓ８がアセチル化されたアセチル化ヒストンＨ４を認識し、重鎖可変部及び軽鎖可変部を含み、
前記重鎖可変部が、配列番号５で表されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１と、配列番号６で表されるアミノ酸配列又は配列番号７で表されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２と、配列番号８で表されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３とを有しており、かつ、配列番号１若しくは２で表されるアミノ酸配列、又は、配列番号１若しくは２で表されるアミノ酸配列のうち、第２６〜３５番目、第５０〜６６番目、及び第９８〜１００番目のアミノ酸残基以外の領域のアミノ酸配列と９０％以上１００％未満の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、
前記軽鎖可変部が、配列番号９で表されるアミノ酸配列又は配列番号１０で表されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１と、配列番号１１で表されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２と、配列番号１２で表されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３とを有しており、かつ、配列番号３若しくは４で表されるアミノ酸配列、又は、配列番号３若しくは４で表されるアミノ酸配列のうち、第２４〜３４番目、第５０〜５６番目、及び第８９〜９６番目のアミノ酸残基以外の領域のアミノ酸配列と９０％以上１００％未満の配列同一性を有するアミノ酸配列からなることを特徴とする、抗アセチル化ヒストンＨ４抗体。
［２］ さらに、重鎖定常部及び／又は軽鎖定常部を含む、前記［１］の抗アセチル化ヒストンＨ４抗体。
［３］ 免疫グロブリン、Ｆａｂフラグメント抗体、Ｆ(ａｂ')_２フラグメント抗体、又は一本鎖抗体である、前記［１］又は［２］の抗アセチル化ヒストンＨ４抗体。
［４］ クロマチンを含む被検試料に対して、前記［１］〜［３］のいずれかの抗アセチル化ヒストンＨ４抗体を用いてクロマチン免疫沈降塩基配列決定法を行うことにより、一のヌクレオソーム中のヒストンＨ４のＬｙｓ５とＬｙｓ８の２箇所が共にアセチル化された状態のクロマチン領域を検出することを特徴とする、クロマチンの解析方法。
［５］ 被検者から採取されたクロマチンを含む被検試料に対して、前記［１］〜［３］のいずれかの抗アセチル化ヒストンＨ４抗体を用いてクロマチン免疫沈降塩基配列決定法を行うことにより、一のヌクレオソーム中のヒストンＨ４のＬｙｓ５とＬｙｓ８の２箇所が共にアセチル化された状態のクロマチン領域を検出し、当該クロマチン領域に含まれるゲノムＤＮＡ上にコードされている遺伝子を検出し、がん患者において発現量が高くなっている遺伝子が検出された場合には、前記被験者はがんを発症している可能性が高いと評価することを特徴とする、がん発症可能性を評価することを補助する方法。

【発明の効果】

【0011】

本発明に係る抗アセチル化ヒストンＨ４抗体は、Ｌｙｓ５とＬｙｓ８の両方がアセチル化されたヒストンＨ４を、Ｌｙｓ５はアセチル化されているがＬｙｓ８はアセチル化されていないヒストンＨ４、Ｌｙｓ５はアセチル化されていないがＬｙｓ８はアセチル化されているヒストンＨ４、及びＬｙｓ５とＬｙｓ８の両方ともアセチル化されていないヒストンＨ４から識別して認識することができる。このため、当該抗アセチル化ヒストンＨ４抗体を用いることにより、一のヌクレオソーム中のヒストンＨ４のＬｙｓ５とＬｙｓ８の両方がアセチル化された状態のクロマチン領域を検出することができる。

【図面の簡単な説明】

【0012】

【図1A】実施例１において行ったＥＬＩＳＡにおいて、取得したクローン１Ａ９Ｄ７のハイブリドーマ培養上清のヒストンＨ４タンパク質に対する結合力価の結果を示した図である。

【図1B】実施例１において行ったＥＬＩＳＡにおいて、取得したクローン２Ａ７Ｄ９のハイブリドーマ培養上清のヒストンＨ４タンパク質に対する結合力価の結果を示した図である。

【図2】実施例１において、各種ヒストンＨ４タンパク質に対して、クローン１Ａ９Ｄ７及びクローン２Ａ７Ｄ９のハイブリドーマ培養上清中の抗体を一次抗体として行ったウェスタンブロットの結果を示した図である。

【図3A】実施例２において行った各抗体を用いたＣｈＩＰ−ｓｅｑにおいて、ＶＤＡＣ２遺伝子の近傍領域で検出されたクロマチン領域ピークを示した図である。

【図3B】実施例２において行った各抗体を用いたＣｈＩＰ−ｓｅｑにおいて、Ｒｕｎｘ１遺伝子、ｃ−Ｍｙｃ遺伝子、及びＮｏｔｃｈ１遺伝子の近傍領域で検出されたクロマチン領域ピークを示した図である。

【図4】実施例３において行ったＥＬＩＳＡにおいて、クローン２Ａ７Ｄ９の培養上清中の抗体を用いて細胞染色を行った染色像である。

【図5A】実施例１において取得したクローン１Ａ９Ｄ７のハイブリドーマ培養上清中の、ヒストンＨ４のＬｙｓ５とＬｙｓ８の両方がアセチル化された状態を認識するマウスモノクローナル抗体の重鎖可変部（ＶＨ）及び軽鎖可変部（ＶＬ）のアミノ酸配列を示した図である。

【図5B】実施例１において取得したクローン２Ａ７Ｄ９のハイブリドーマ培養上清中の、ヒストンＨ４のＬｙｓ５とＬｙｓ８の両方がアセチル化された状態を認識するマウスモノクローナル抗体の重鎖可変部（ＶＨ）及び軽鎖可変部（ＶＬ）のアミノ酸配列を示した図である。

【図6A】実施例４において、クローン１Ａ９Ｄ７が分泌生産する抗体のＦａｂフラグメントとヒストンＨ４のテイルペプチドとの複合体（１Ａ９Ｄ７−Ｆａｂペプチド複合体）の結晶構造を示した図である。

【図6B】実施例４において、クローン２Ａ７Ｄ９が分泌生産する抗体のＦａｂフラグメントとヒストンＨ４のテイルペプチドとの複合体（２Ａ７Ｄ９−Ｆａｂペプチド複合体）の結晶構造を示した図である。

【図7A】図６Ａの結晶構造のうち、ヒストンＨ４のテイルペプチドのＮ末端付近の拡大図である。

【図7B】図６Ｂの結晶構造のうち、ヒストンＨ４のテイルペプチドのＮ末端付近の拡大図である。

【発明を実施するための形態】

【0013】

本発明に係る抗アセチル化ヒストンＨ４抗体は、Ｌｙｓ５とＬｙｓ８の両方がアセチル化されたヒストンＨ４を認識し、特異的に結合する抗体である。このため、本発明に係る抗アセチル化ヒストンＨ４抗体を用いることにより、Ｌｙｓ５とＬｙｓ８の両方がアセチル化されたヒストンＨ４を、Ｌｙｓ５はアセチル化されているがＬｙｓ８はアセチル化されていないヒストンＨ４、Ｌｙｓ５はアセチル化されていないがＬｙｓ８はアセチル化されているヒストンＨ４、及びＬｙｓ５とＬｙｓ８の両方ともアセチル化されていないヒストンＨ４から識別して検出することができる。

【0014】

なお、本発明及び本願明細書中、特に記載のない限り、「Ｌｙｓ５」は、ヒストンＨ４がヒトのヒストンＨ４の場合にはＮ末端から５番目のリジン残基を意味し、ヒストンＨ４がヒト以外の生物種由来のヒストンＨ４の場合には、ヒトヒストンＨ４の５番目のリジン残基に相当するリジン残基を意味する。同様に、「Ｌｙｓ８」は、ヒストンＨ４がヒトのヒストンＨ４の場合にはＮ末端から８番目のリジン残基を意味し、ヒストンＨ４がヒト以外の生物種由来のヒストンＨ４の場合には、ヒトヒストンＨ４の８番目のリジン残基に相当するリジン残基を意味する。

【0015】

本発明に係る抗アセチル化ヒストンＨ４抗体は、特定のアミノ酸配列を含む重鎖可変部と、特定のアミノ酸配列を含む軽鎖可変部の少なくとも一方を含む。本発明に係る抗アセチル化ヒストンＨ４抗体としては、抗体の重鎖可変部と軽鎖可変部を少なくとも１つずつ含むものが好ましい。

【0016】

重鎖可変部と軽鎖可変部は、いずれも３つのＣＤＲ（相補性決定領域）と４つのＦＲ（フレームワーク領域）がある。重鎖可変部の３つのＣＤＲは、Ｎ末端側から順にＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３という。軽鎖可変部の３つのＣＤＲは、Ｎ末端側から順にＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３という。後記実施例におけるＸ線結晶構造解析の結果に示すように、本発明に係る抗アセチル化ヒストンＨ４抗体は、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３において、Ｌｙｓ５とＬｙｓ８の両方がアセチル化されたヒストンＨ４を特異的に認識して結合する。

【0017】

本発明に係る抗アセチル化ヒストンＨ４抗体が含む重鎖可変部は、配列番号５で表されるアミノ酸配列（ＧＹＴＦＴＤＹＳＭＨ）からなるＣＤＲＨ１と、配列番号８で表されるアミノ酸配列（ＲＤＹ）からなるＣＤＲＨ３を有している。また、本発明に係る抗アセチル化ヒストンＨ４抗体が含む軽鎖可変部は、配列番号１１で表されるアミノ酸配列（ＹＴＳＴＬＱＰ）からなるＣＤＲＬ２と、配列番号１２で表されるアミノ酸配列（ＬＱＹＤＮＬＲＴ）からなるＣＤＲＬ３を有している。本発明に係る抗アセチル化ヒストンＨ４抗体は、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３がこれらの特定のアミノ酸配列からなることにより、Ｌｙｓ５とＬｙｓ８の両方がアセチル化されたヒストンＨ４を特異的に認識できる。

【0018】

本発明に係る抗アセチル化ヒストンＨ４抗体が含む重鎖可変部のＣＤＲＨ２としては、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３による、Ｌｙｓ５とＬｙｓ８の両方がアセチル化されたヒストンＨ４に対する結合特異性（以下、「Ｋ５ａｃＫ８ａｃ結合特異性」ということがある。）を損なわないペプチドであれば特に限定されるものではない。ＣＤＲＨ２としては、例えば、配列番号６で表されるアミノ酸配列（ＷＩＮＴＥＴＧＥＰＴＹＡＤＤＦＫＧ）からなるペプチド、又は配列番号７で表されるアミノ酸配列（ＷＩＮＴＡＴＧＥＰＴＹＡＤＤＦＫＧ）からなるペプチド等が挙げられる。

【0019】

本発明に係る抗アセチル化ヒストンＨ４抗体が含む軽鎖可変部のＣＤＲＬ１としては、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３によるＫ５ａｃＫ８ａｃ結合特異性を損なわないペプチドであれば特に限定されるものではない。ＣＤＲＬ１としては、例えば、配列番号９で表されるアミノ酸配列（ＲＡＳＱＤＩＮＮＹＩＡ）からなるペプチド、又は配列番号１０で表されるアミノ酸配列（ＫＡＳＱＤＩＮＫＹＩＡ）からなるペプチド等が挙げられる。

【0020】

本発明に係る抗アセチル化ヒストンＨ４抗体が含む重鎖可変部のＦＲとしては、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３によるＫ５ａｃＫ８ａｃ結合特異性を損なわず、かつＦＲとして機能するポリペプチドであれば特に限定されるものではない。当該ＦＲとしては、例えば、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ウマ、ウシ等の様々な動物のＢ細胞又は形質細胞が産生する抗体の重鎖可変部のＦＲをそのまま用いることができる。また、これらの天然由来の重鎖可変部のＦＲの１又は複数のアミノ酸残基を欠失、置換又は付加したポリペプチドであってもよい。欠失等させるアミノ酸残基の数は、１０個以下が好ましく、５個以下がより好ましい。また、欠失等させるアミノ酸残基の数は、これらの天然由来の重鎖可変部のＦＲのアミノ酸配列と、８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列となるように調節することが好ましく、８５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列となるように調節することがより好ましく、９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列となるように調節することがさらに好ましく、９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列となるように調節することがよりさらに好ましい。

【0021】

本発明に係る抗アセチル化ヒストンＨ４抗体が含む重鎖可変部としては、具体的には、配列番号１若しくは２で表されるアミノ酸配列、又は、配列番号１若しくは２で表されるアミノ酸配列のうち、第２６〜３５番目及び第９８〜１００番目のアミノ酸残基以外の領域において１若しくは数個のアミノ酸が置換、付加、若しくは欠失したアミノ酸配列と８０％以上１００％未満の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドが挙げられる。また、配列番号１若しくは２で表されるアミノ酸配列のうち、第２６〜３５番目、第５０〜６６番目、及び第９８〜１００番目のアミノ酸残基以外の領域において１若しくは数個のアミノ酸が置換、付加、若しくは欠失したアミノ酸配列と８０％以上１００％未満の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドも挙げられる。なお、配列番号１若しくは２で表されるアミノ酸配列のうち、第２６〜３５番目のアミノ酸からなる領域はＣＤＲＨ１であり、第５０〜６６番目のアミノ酸からなる領域はＣＤＲＨ２であり、第９８〜１００番目のアミノ酸からなる領域はＣＤＲＨ３である。

【0022】

本発明に係る抗アセチル化ヒストンＨ４抗体が含む軽鎖可変部のＦＲとしては、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３によるＫ５ａｃＫ８ａｃ結合特異性を損なわず、かつＦＲとして機能するポリペプチドであれば特に限定されるものではない。当該ＦＲとしては、例えば、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ウマ、ウシ等の様々な動物のＢ細胞又は形質細胞が産生する抗体の軽鎖可変部のＦＲをそのまま用いることができる。また、これらの天然由来の軽鎖可変部のＦＲの１又は複数のアミノ酸残基を欠失、置換又は付加したポリペプチドであってもよい。欠失等させるアミノ酸残基の数は、１０個以下が好ましく、５個以下がより好ましい。また、欠失等させるアミノ酸残基の数は、これらの天然由来の軽鎖可変部のＦＲのアミノ酸配列と、８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列となるように調節することが好ましく、８５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列となるように調節することがより好ましく、９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列となるように調節することがさらに好ましく、９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列となるように調節することがよりさらに好ましい。

【0023】

本発明に係る抗アセチル化ヒストンＨ４抗体が含む軽鎖可変部としては、具体的には、配列番号３若しくは４で表されるアミノ酸配列、又は、配列番号３若しくは４で表されるアミノ酸配列のうち、第５０〜５６番目及び第８９〜９６番目のアミノ酸残基以外の領域において１若しくは数個のアミノ酸が置換、付加、若しくは欠失したアミノ酸配列と８０％以上１００％未満の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドが挙げられる。また、配列番号３若しくは４で表されるアミノ酸配列のうち、第２４〜３４番目、第５０〜５６番目、及び第８９〜９６番目のアミノ酸残基以外の領域において１若しくは数個のアミノ酸が置換、付加、若しくは欠失したアミノ酸配列と８０％以上１００％未満の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドも挙げられる。なお、配列番号３若しくは４で表されるアミノ酸配列のうち、第２４〜３４番目のアミノ酸からなる領域はＣＤＲＬ１であり、第５０〜５６番目のアミノ酸からなる領域はＣＤＲＬ２であり、第８９〜９６番目のアミノ酸からなる領域はＣＤＲＬ３である。

【0024】

本発明に係る抗アセチル化ヒストンＨ４抗体は、重鎖可変部と軽鎖可変部がペプチドリンカーにより連結された一本鎖抗体のように、定常部を有さない抗体であってもよい。当該ペプチドリンカーのアミノ酸残基数、アミノ酸配列は、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３によるＫ５ａｃＫ８ａｃ結合特異性を損なわないものであれば特に限定されるものではない。一般的には、当該ペプチドリンカーは、１０〜３０アミノ酸、好ましくは１５〜２５アミノ酸からなる。Ｌｙｓ５とＬｙｓ８の両方がアセチル化されたヒストンＨ４を認識して結合する一本鎖抗体としては、例えば、配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと、配列番号３又は４で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをペプチドリンカーで連結したポリペプチドが挙げられる。

【0025】

本発明に係る抗アセチル化ヒストンＨ４抗体は、重鎖可変部及び軽鎖可変部に加えて、さらに、重鎖定常部又はその一部を含んでいてもよく、軽鎖定常部又はその一部を含んでいてもよい。例えば、本発明に係る抗アセチル化ヒストンＨ４抗体としては、Ｂ細胞又は形質細胞から産生される免疫グロブリン（２本の重鎖と２本の軽鎖がジスルフィド結合により連結された抗体）であってもよく、免疫グロブリンをパパインで消化して得られるＦａｂフラグメント抗体であってもよく、免疫グロブリンをペプシンで消化して得られるＦ(ａｂ')_２フラグメント抗体であってもよい。なお、Ｌｙｓ５とＬｙｓ８の両方がアセチル化されたヒストンＨ４を認識して結合するＦａｂフラグメント抗体としては、例えば、既知のリコンビナントモノクローナルＦａｂフラグメント抗体の重鎖可変部を配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列に、軽鎖可変部を配列番号３又は４で表されるアミノ酸配列にそれぞれ置換したタンパク質をコードする塩基配列を含む発現ベクターを作製し、当該発現ベクターを大腸菌等の発現系に導入してリコンビナントタンパク質を製造させることによって得られる。発現ベクターの作製及びリコンビナントタンパク質の製造は、リコンビナントモノクローナル抗体を製造する際に一般的に用いられる方法により行うことができる。

【0026】

本発明に係る抗アセチル化ヒストンＨ４抗体が重鎖定常部又はその一部を含む場合、当該重鎖定常部は、α、δ、ε、γ、μのいずれのタイプであってもよい。また、本発明に係る抗アセチル化ヒストンＨ４抗体が軽鎖定常部又はその一部を含む場合、当該軽鎖定常部は、κ、λのいずれのタイプであってもよい。

【0027】

本発明に係る抗アセチル化ヒストンＨ４抗体が重鎖定常部又はその一部を含む場合、当該重鎖定常部としては、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３によるＫ５ａｃＫ８ａｃ結合特異性を損なわず、かつ重鎖定常部として機能するポリペプチドであれば特に限定されるものではない。当該重鎖定常部としては、例えば、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ウマ、ウシ等の様々な動物のＢ細胞又は形質細胞が産生する抗体の重鎖定常部をそのまま用いることができる。また、これらの天然由来の重鎖定常部の１又は複数のアミノ酸残基を欠失、置換又は付加したポリペプチドであってもよい。欠失等させるアミノ酸残基の数は、１０個以下が好ましく、５個以下がより好ましい。また、欠失等させるアミノ酸残基の数は、これらの天然由来の重鎖定常部のアミノ酸配列と、８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列となるように調節することが好ましく、８５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列となるように調節することがより好ましく、９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列となるように調節することがさらに好ましく、９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列となるように調節することがよりさらに好ましい。

【0028】

本発明に係る抗アセチル化ヒストンＨ４抗体が軽鎖定常部又はその一部を含む場合、当該軽鎖定常部としては、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３によるＫ５ａｃＫ８ａｃ結合特異性を損なわず、かつ軽鎖定常部として機能するポリペプチドであれば特に限定されるものではない。当該軽鎖定常部としては、例えば、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ウマ、ウシ等の様々な動物のＢ細胞又は形質細胞が産生する抗体の軽鎖定常部をそのまま用いることができる。また、これらの天然由来の軽鎖定常部の１又は複数のアミノ酸残基を欠失、置換又は付加したポリペプチドであってもよい。欠失等させるアミノ酸残基の数は、１０個以下が好ましく、５個以下がより好ましい。また、欠失等させるアミノ酸残基の数は、これらの天然由来の軽鎖定常部のアミノ酸配列と、８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列となるように調節することが好ましく、８５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列となるように調節することがより好ましく、９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列となるように調節することがさらに好ましく、９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列となるように調節することがよりさらに好ましい。

【0029】

本発明に係る抗アセチル化ヒストンＨ４抗体がヒトの体内に直接投与される場合、当該抗体に含まれる重鎖定常部及び軽鎖定常部は、ヒトのＢ細胞等が産生する抗体の重鎖定常部及び軽鎖定常部であることが好ましい。また、当該抗体に含まれる重鎖可変部及び軽鎖可変部のＦＲは、ヒトのＢ細胞等が産生する抗体の重鎖可変部のＦＲ及び軽鎖可変部のＦＲであることが好ましい。

【0030】

本発明に係る抗アセチル化ヒストンＨ４抗体は、例えば、Ｌｙｓ５とＬｙｓ８の２箇所が両方ともアセチル化されているヒストンＨ４の全長タンパク質を抗原としてモノクローナル抗体を製造することによって得られる。モノクローナル抗体の製造は、抗原タンパク質をマウス、ラット、ウサギ等の動物に免疫し、抗体産生細胞をハイブリドーマ化した後、目的の抗体を産生するハイブリドーマをスクリーニングする常法により行うことができる。また、遺伝子組換え技術を用いて、大腸菌、酵母、糸状菌、昆虫細胞、哺乳細胞等の発現系を利用してリコンビナントタンパク質として製造することもできる。例えば、既知の抗体のＣＤＲを組み換えることによっても製造できる。具体的には、アミノ酸配列が既知である抗体を、ＣＤＲＨ１を配列番号５で表されるアミノ酸配列に、ＣＤＲＨ２を配列番号６又は７で表されるアミノ酸配列に、ＣＤＲＨ３を配列番号８で表されるアミノ酸配列に、ＣＤＲＬ１を配列番号９又は１０で表されるアミノ酸配列に、ＣＤＲＬ２を配列番号１１で表されるアミノ酸配列に、ＣＤＲＬ３を配列番号１２で表されるアミノ酸配列に、それぞれ置換させたポリペプチドを大腸菌等の発現系で発現させることによって、Ｌｙｓ５とＬｙｓ８の２箇所が両方ともアセチル化されているヒストンＨ４を特異的に認識する抗体を製造できる。

【0031】

本発明に係る抗アセチル化ヒストンＨ４抗体は、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３によるＫ５ａｃＫ８ａｃ結合特異性を損なわない範囲において、アセチル化ヒストンＨ４との結合には関与しない他の機能分子を含んでいてもよい。当該他の機能分子としては、ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリフォスファターゼ（ＡＰ）等の酵素、蛍光物質、ビオチン等の低分子、ポリエチレングリコール等の高分子等が挙げられる。重鎖可変部、軽鎖可変部等のアセチル化ヒストンＨ４と結合する領域と当該他の機能分子は、直接連結されていてもよく、適当な長さのペプチドリンカーによって連結されていてもよい。また、本発明に係る抗アセチル化ヒストンＨ４抗体は、ビーズ、チップ等の固相担体に、直接又は間接的に結合されていてもよい。

【0032】

本発明に係る抗アセチル化ヒストンＨ４抗体は、他の抗体と同様に、ウェスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ法、免疫沈降法、免疫染色法、ＣｈＩＰ等の免疫反応を利用した様々な方法に使用することができる。これらの方法は、本発明に係る抗アセチル化ヒストンＨ４抗体を用いる以外は、常法により行うことができる。なお、ヒストンＨ４のＮ末端（１〜２０番目）は、ヒト、マカク、ヒヒ、マウス、ラット、カエル等の動物のみならず、シロイヌナズナ、タバコ等の植物、線虫、分裂酵母、出芽酵母等の微生物において、広く保存されている。このため、本発明に係る抗アセチル化ヒストンＨ４抗体は、ヒトを含むほぼ全ての真核生物種に由来するアセチル化ヒストンＨ４（Ｌｙｓ５とＬｙｓ８の２箇所が両方ともアセチル化されているヒストンＨ４）の検出に使用できる。

【0033】

本発明に係る抗アセチル化ヒストンＨ４抗体を用いてＣｈＩＰ−ｓｅｑ法を行うことにより、クロマチン中の一のヌクレオソーム内のＬｙｓ５とＬｙｓ８の両方がアセチル化されたヒストンＨ４と特異的に結合して検出できる。すなわち、本発明に係る抗アセチル化ヒストンＨ４抗体により、ゲノム中のヒストンＨ４がＬｙｓ５とＬｙｓ８の両方がアセチル化された状態を、一のヌクレオソーム分解能で高感度に検出することができる。このため、本発明に係る抗アセチル化ヒストンＨ４抗体は、エピジェネティクス解析、クロマチンの構造解析、遺伝子発現解析等の基礎研究分野におけるクロマチン解析ツールとして非常に有用である。

【0034】

特に、ヒストンＨ４のＬｙｓ５とＬｙｓ８の両方のアセチル化は、遺伝子発現が非常に活発なクロマチン領域で観察されることから、本発明に係る抗アセチル化ヒストンＨ４抗体を用いたＣｈＩＰ−ｓｅｑ法により、特定細胞のゲノムにおいて遺伝子発現が非常に活発なクロマチン領域（超活性クロマチン領域）、当該領域にコードされる構造遺伝子、遺伝子発現制御領域（エンハンサー等）等を検出し解析することができる。具体的には、クロマチンを含む被検試料に対して、本発明に係る抗アセチル化ヒストンＨ４抗体を用いてＣｈＩＰ−ｓｅｑ法を行うことにより、一のヌクレオソーム中のヒストンＨ４のＬｙｓ５とＬｙｓ８の２箇所が共にアセチル化された状態のクロマチン領域を検出することにより、クロマチンを解析することができる。

【0035】

特定の疾患では、特定の遺伝子の発現量が高くなる傾向にある。このため、各種がん細胞や疾患関連細胞から抽出されたクロマチンについて、本発明に係る抗アセチル化ヒストンＨ４抗体を用いたＣｈＩＰ−ｓｅｑ法を行い、超活性クロマチン領域及び当該領域にコードされている遺伝子を調べることにより、がんやエピジェネティクス異常が関わる疾病の診断バイオマーカーとしても有用である。本発明に係る抗アセチル化ヒストンＨ４抗体が診断バイオマーカーとして用いられるがんとしては、肺癌、ＮＭＣ（ナット正中癌）、多発性骨髄腫等のエピジェネティクス関連の難治性がん等が挙げられる。

【0036】

具体的には、被検者から採取されたクロマチンを含む被検試料に対して、本発明に係る抗アセチル化ヒストンＨ４抗体を用いてＣｈＩＰ−ｓｅｑ法を行うことにより、一のヌクレオソーム中のヒストンＨ４のＬｙｓ５とＬｙｓ８の２箇所が共にアセチル化された状態のクロマチン領域を検出し、当該クロマチン領域に含まれるゲノムＤＮＡ上にコードされている遺伝子を検出する。がん患者において発現量が高くなっている遺伝子が検出された場合には、当該被験者はがんを発症している可能性が高いと評価できる。ＣｈＩＰ−ｓｅｑ法は常法により行うことができる。

【実施例】

【0037】

次に、実施例等により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの例によって限定されるものではない。

【0038】

［実施例１］
＜モノクローナル抗体の作製＞
Ｌｙｓ５とＬｙｓ８の２箇所が両方ともアセチル化されているヒトのヒストンＨ４（以下、「ヒトのヒストンＨ４のうち、アセチル化されていないもの」は単に「Ｈ４」ということがある。）の全長タンパク質を抗原として、マウスモノクローナル抗体を作製した。
具体的には、抗原タンパク質として、Ｌｙｓ５とＬｙｓ８の２箇所が両方ともアセチル化されているヒストンＨ４（以下、「Ｈ４−Ｋ５ａｃＫ８ａｃ」ということがある。）のＨｉｓタグ付き全長タンパク質を用いた。Ｈ４−Ｋ５ａｃＫ８ａｃは、向井らの方法（Mukai, T. et al., Biochemical and biophysical research communications, vol.411, p.757-761，doi:Doi 10.1016/J.Bbrc.2011.07.020 (2011)）に従い、大腸菌由来抽出液を用いた無細胞タンパク質発現系で製造した。得られた抗原タンパク質を、１ｍｇ／ｍＬの濃度で５０μＬずつ、マウスに免疫した。免疫から２４日間後に、免疫したマウスのリンパ節細胞を用いてハイブリドーマライブラリーを作製した。これらのハイブリドーマクローンのうち、Ｈ４−Ｋ５ａｃＫ８ａｃに特異的に結合する抗体を産生するクローンの有無を調べるために、ＥＬＩＳＡプレートにＨｉｓタグ付きヒストンＨ４タンパク質を固定し、各培養上清のＥＬＩＳＡ反応性がアセチル化リジンの位置及び組み合わせに特異的かどうかを調べた。ＥＬＩＳＡプレートへのＨｉｓタグ付きヒストンＨ４タンパク質の固定化は、Ｈ４、Ｌｙｓ５のみがアセチル化されているＨ４（以下、「Ｈ４−Ｋ５ａｃ」ということがある。）、Ｌｙｓ８のみがアセチル化されているヒストンＨ４（以下、「Ｈ４−Ｋ８ａｃ」ということがある。）、Ｈ４−Ｋ５ａｃＫ８ａｃ、及びＬｙｓ８とＬｙｓ１２の２箇所が両方ともアセチル化されているヒストンＨ４（以下、「Ｈ４−Ｋ８ａｃＫ１２ａｃ」ということがある。）の５種類のヒトのヒストンＨ４タンパク質のＨｉｓタグ付き全長タンパク質について、それぞれＰＢＳバッファーに溶解したタンパク質溶液（１μｇ／ｍＬ）を調製し、各タンパク質溶液をＥＬＩＳＡプレートに１日静置することにより行った。また、培養ハイブリドーマ上清の１００倍希釈溶液をそれぞれ調製し、それをさらに３倍ずつ希釈系列を作製し、前記の各種のヒストンＨ４を固定したＥＬＩＳＡプレートを用いてハイブリドーマ培養上清のヒストンＨ４に対する結合力価を調べた。この結果、Ｈ４−Ｋ５ａｃＫ８ａｃに対してのみ特異的に結合するマウスモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマとして、１Ａ９Ｄ７株及び２Ａ７Ｄ９株の２種類のクローンを得た。取得したハイブリドーマの１Ａ９Ｄ７株及び２Ａ７Ｄ９株のそれぞれの結果を図１に示す。図１Ａ及び図１Ｂの横軸は、培養上清の希釈倍率を示し、縦軸は４９５ｎｍの吸光度値を示す。図１に示すように、クローン１Ａ９Ｄ７及びクローン２Ａ７Ｄ９の培養上清抗体が、Ｈ４−Ｋ５ａｃＫ８ａｃに対して特異的に反応した。

【0039】

＜ウェスタンブロッティング法によるＨ４−Ｋ５ａｃＫ８ａｃの検出＞
クローン１Ａ９Ｄ７及びクローン２Ａ７Ｄ９の培養上清抗体が、ウェスタンブロッティング法でＨ４−Ｋ５ａｃＫ８ａｃタンパク質を特異的に検出できることを示した。
まず、抗原タンパク質として、Ｈ４（非アセチル化タンパク質）、Ｈ４−Ｋ５ａｃ、Ｈ４−Ｋ８ａｃ、Ｈ４−Ｋ５ａｃＫ８ａｃ、Ｌｙｓ８とＬｙｓ１２とＬｙｓ１６の３箇所が全てアセチル化されているヒストンＨ４（以下、「Ｈ４−Ｋ８ａｃＫ１２ａｃＫ１６ａｃ」ということがある。）、Ｌｙｓ５とＬｙｓ１２とＬｙｓ１６の３箇所が全てアセチル化されているヒストンＨ４（以下、「Ｈ４−Ｋ５ａｃＫ１２ａｃＫ１６ａｃ」ということがある。）、及びＬｙｓ５とＬｙｓ８とＬｙｓ１２とＬｙｓ１６の４箇所が全てアセチル化されているヒストンＨ４（以下、「Ｈ４−Ｋ５ａｃＫ８ａｃＫ１２ａｃＫ１６ａｃ」ということがある。）のＨｉｓタグ付き全長タンパク質を大腸菌由来抽出液を用いた無細胞タンパク質発現系で製造した。それぞれのＨ４タンパク質をＮｉアフィニティーレジン及び陽イオン交換カラムクロマトグラフィーにより精製したのち、１００ｎｇずつをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより展開した後にＰＶＤＦ膜へ転写した。このＰＶＤＦ膜に、クローン１Ａ９Ｄ７又は２Ａ７Ｄ９のハイブリドーマ細胞の培養上清を１００倍希釈した一次抗体を用いてウェスタンブロッティングを行い、アセチル化Ｈ４タンパク質の検出を実施した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより展開したゲルのＣＢＢ染色像とウェスタンブロットの結果を図２に示す。図２中、「１Ａ９Ｄ７」は、クローン１Ａ９Ｄ７の培養上清中の抗体を一次抗体としたウェスタンブロットの結果であり、「２Ａ７Ｄ９」は、クローン２Ａ７Ｄ９の培養上清中の抗体を一次抗体としたウェスタンブロットの結果である。また、各図中、各レーンに泳動したタンパク質は次の通りである；レーン１：Ｈ４（非アセチル化タンパク質）、レーン２：Ｈ４−Ｋ５ａｃ、レーン３：Ｈ４−Ｋ８５ａｃ、レーン４：Ｈ４−Ｋ５ａｃＫ８ａｃ、レーン５：Ｈ４−Ｋ８ａｃＫ１２ａｃＫ１６ａｃ、レーン６：Ｈ４−Ｋ５ａｃＫ１２ａｃＫ１６ａｃ、レーン７：Ｈ４−Ｋ５ａｃＫ８ａｃＫ１２ａｃＫ１６ａｃ。図２に示すように、作製した２つのクローンが産生する抗体は、ともに、ヒストンＨ４のＬｙｓ５とＬｙｓ８の一方がアセチル化されているタンパク質に対しては結合しないか若しくは結合しても極めて弱く、Ｌｙｓ５とＬｙｓ８が両方ともアセチル化されているタンパク質に特異的に強く結合した。

【0040】

［実施例２］
ヒト肺がん由来培養細胞株であるＨ２３細胞から抽出されたクロマチンに対して、実施例１において取得されたクローン１Ａ９Ｄ７及びクローン２Ａ７Ｄ９の培養上清抗体を用いて、ＣｈＩＰ−ｓｅｑを行った。
まず、培養皿内の約１×１０^６個のＨ２３細胞を１％ホルムアルデヒド溶液で浸漬させ、１０分間クロスリンクさせた。次いで、当該培養皿内の細胞から細胞核を分離した後、超音波ホモジナイザーＣｏｖａｒｉｓ Ｓ２２０（Ｃｏｖａｒｉｓ社製）を用いてクロマチンＤＮＡの平均ＤＮＡ長が２００ｂｐになるように細胞核中のＤＮＡを剪断した。断片化したクロマチンＤＮＡを洗浄した後、実施例１において取得されたクローン１Ａ９Ｄ７又はクローン２Ａ７Ｄ９の培養上清抗体を用いてクロマチンＤＮＡを免疫沈降させた。
次いで、次世代シークエンサー技術用のＤＮＡライブラリー調製は、ＮｕＧＥＮ Ｍｏｎｄｒｉａｎ装置を用いて２ｎｇのＤＮＡを１０サイクル増幅して行った。このＤＮＡライブラリーを用いたＤＮＡの塩基配列決定は、シークエンサーＨｉＳｅｑ２５００（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社製）を用いた。マッピングとピークコーリングは、それぞれＢＷＡとＭＡＣＳ２を用いて解析した。
ＣｈＩＰ−ｓｅｑ法では、比較対照のために、抗Ｈ４−Ｋ５ａｃ抗体（製品番号：ＭＡＢＩ０４０５）、抗Ｈ４−Ｋ８ａｃ抗体（製品番号：ＭＡＢＩ０４０８）、及び抗Ｈ３Ｋ２７ａｃ抗体（いずれも、株式会社医学生物学研究所製）を用いて同様に実験した。なお、「Ｈ３Ｋ２７ａｃ」は、「Ｌｙｓ２７がアセチル化されているヒストンＨ３」を表す。

【0041】

各抗体を用いた実験は、それぞれ独立して２回行った。この結果、抗体で免疫沈降されたＤＮＡが基準より３０倍以上濃縮されたピーク（遺伝子）が、クローン１Ａ９Ｄ７の培養上清抗体では、１回目の実験では１２８２ピーク、２回目の実験では１０１７ピークであり、クローン２Ａ７Ｄ９の培養上清抗体では、１回目の実験では１５６４ピーク、２回目の実験では９７２であった。それぞれのピークに対して、ピークが存在するヒト染色体の名称、ピークの開始位置と終止位置、濃縮の度合い（ｆｏｌｄ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）、転写開始位置（＋１）に最も近い遺伝子の名称とその転写開始位置との距離（ｂｐ）等を調べた。

【0042】

図３Ａ及び３Ｂに、クローン１Ａ９Ｄ７の培養上清抗体で検出されたクロマチン領域ピークの検出例として、ＶＤＡＣ２遺伝子、Ｒｕｎｘ１遺伝子、ｃ−Ｍｙｃ遺伝子、及びＮｏｔｃｈ１遺伝子の近傍領域を示した。これらの結果から、クローン１Ａ９Ｄ７及びクローン２Ａ７Ｄ９の培養上清抗体が、どちらも、ＣｈＩＰ−ｓｅｑを実施可能なほど抗原に対する認識特異性と感度が高く、肺がん細胞で活性化したクロマチンの位置を高感度で識別できることが示された。

【0043】

［実施例３］
ヒトグリオブラストーマ由来培養細胞株であるＵ８７−ＭＧ細胞に対して、実施例１において取得されたクローン１Ａ９Ｄ７及びクローン２Ａ７Ｄ９の培養上清抗体を用いて、細胞免疫染色を行い、Ｌｙｓ５とＬｙｓ８の２箇所が両方ともアセチル化されている状態のヒストンＨ４タンパク質の細胞内局在を調べた。
接着培養したＵ８７−ＭＧ細胞に対して、培養上清を除去した後に４％ パラホルムアルデヒド溶液で３０分間処理することにより固定化した。この固定化細胞をＰＢＳバッファーで洗浄した後、０．４％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で処理することにより、細胞を膜透過性にした。膜透過処理後の細胞を、クローン２Ａ７Ｄ９の培養上清を１／３００倍に希釈した抗体溶液と混合して室温で約１２時間静置した後、ＰＢＳバッファーで３回洗浄した。洗浄後の細胞を、１／３００倍に希釈したａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、製品番号：１１００３）溶液にＤＡＰＩを添加した溶液と混合して室温で２時間、暗所で静置した後、ＰＢＳバッファーで３回洗浄した。洗浄後の細胞を、共焦点顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ ５１０）で可視化してデジタル画像を取得した。図４に、クローン２Ａ７Ｄ９の培養上清抗体による染色像（左図）、ＤＡＰＩによる核染色像（中図）、及び透過光画像（右図）を示す。図４に示すように、クローン２Ａ７Ｄ９の培養上清抗体により染色されたＨ４−Ｋ５ａｃＫ８ａｃは、細胞内局在が細胞核に限局され、細胞核内領域の大部分と一致した。

【0044】

［実施例４］
実施例１において取得されたクローン１Ａ９Ｄ７及びクローン２Ａ７Ｄ９の培養上清抗体と、Ｈ４−Ｋ５ａｃＫ８ａｃのＮ末端のテイルペプチドとのＸ線結晶構造解析を行った。

【0045】

＜Ｆａｂフラグメント抗体の調製＞
ハイブリドーマ（クローン１Ａ９Ｄ７及びクローン２Ａ７Ｄ９）を５００ｍＬのＧＩＴ培地で培養し、その培養上清に含まれるＩｇＧをＰｒｏｔｅｉｎ Ｇカラムで回収した。溶出は、０．１ Ｍ Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ（ｐＨ ２．７）で行い、１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ９．０）を加えて中和した。次に、純度を高めるために、ＩｇＧを陰イオン交換カラム（ＨｉＴｒａｐ Ｑ）で精製した。陰イオン交換では、吸着したＩｇＧをＡバッファー［２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５），１０ｍＭ ＮａＣｌ］で洗浄した後、Ｂバッファー［２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５），１０００ｍＭ ＮａＣｌ］へ０〜１００％、２０ＣＶのグラジエントをかけて、ＩｇＧを溶出させた。次に、ＩｇＧのパパイン消化を行った。予めシステインを添加して活性化したパパインビーズをＩｇＧに添加して、３７℃で９時間反応を行った。反応終了後、反応液を６０００ｒｐｍで１０分間遠心分離処理した後、０．４５μｍのフィルターを通すことによってパパインビーズを除去した。パパイン消化物をＰｒｏｔｅｉｎ Ａカラムに通し、素通り画分を回収することでＦａｂフラグメントを得た。最後にＦａｂフラグメントをゲルろ過カラム（Ｈｉｌｏａｄ １６／６００ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００）で精製した。溶媒は、Ｃバッファー［２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），１５０ｍＭ ＮａＣｌ］を用いた。精製したＦａｂフラグメントを限外ろ過で濃縮したものを、以降の結晶化実験に用いた。

【0046】

＜軽鎖可変部（ＶＬ）と重鎖可変部（ＶＨ）のアミノ酸配列の同定＞
クローン１Ａ９Ｄ７及びクローン２Ａ７Ｄ９から得られたＦａｂフラグメントのうち、ＶＬとＶＨのアミノ酸配列を、ｃＤＮＡの塩基配列解析により決定した。図５Ａにクローン１Ａ９Ｄ７が分泌生産するマウスモノクローナル抗体の重鎖可変部（配列番号１）と軽鎖可変部のアミノ酸配列（配列番号３）を、図５Ｂにクローン２Ａ７Ｄ９が分泌生産するマウスモノクローナル抗体の重鎖可変部（配列番号２）と軽鎖可変部（配列番号４）のアミノ酸配列を、それぞれ示す。この結果、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３は、両クローン由来の抗体で同一のアミノ酸配列であったが、ＣＤＲＨ２は、５番目のアミノ酸が、クローン１Ａ９Ｄ７の抗体ではグルタミン酸（Ｅ）であり、クローン２Ａ７Ｄ９ではアラニン（Ａ）であり、１個のアミノ酸が相違していた。また、ＣＤＲＬ１も、１番目のアミノ酸が、クローン１Ａ９Ｄ７の抗体ではアルギニン（Ｒ）であり、クローン２Ａ７Ｄ９ではリジン（Ｋ）であり、８番目のアミノ酸が、クローン１Ａ９Ｄ７の抗体ではアスパラギン（Ｎ）であり、クローン２Ａ７Ｄ９ではリジン（Ｋ）であり、２個のアミノ酸が相違していた。

【0047】

＜Ｆａｂフラグメントの結晶化＞
ヒトヒストンＨ４の第１〜１２番目のアミノ酸からなり、Ｌｙｓ５とＬｙｓ８がいずれもアセチル化されているペプチド（ＳＧＲＧＫａｃＧＧＫａｃＧＬＧＫ：Ｋａｃは側鎖アセチル化のリジンを示す。）を、化学合成で合成した。合成されたテイルペプチドとＦａｂフラグメントを２：１のモル比で混合して結晶化を行った。結晶化は、市販の結晶化スクリーニングキットを用いて行った。複数の条件で結晶が得られたが、以下の条件で得られた結晶が最も高い分解能を示したため、これらを構造解析に用いた。

【0048】

クローン１Ａ９Ｄ７が分泌生産する抗体のＦａｂフラグメントとテイルペプチドとの複合体（１Ａ９Ｄ７−Ｆａｂペプチド複合体）の結晶化条件：０．１Ｍ Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ（ｐＨ６．５）, ０．１５Ｍ Ｚｉｎｃ ａｃｅｔａｔｅ,１７．５％（ｗ／ｖ） ＰＥＧ３０００。
クローン２Ａ７Ｄ９が分泌生産する抗体のＦａｂフラグメントとテイルペプチドとの複合体（２Ａ７Ｄ９−Ｆａｂペプチド複合体）の結晶化条件：０．１Ｍ ＢｉｓＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），０．２Ｍ Ａｍｍｏｎｉｕｍ ａｃｅｔａｔｅ，２５％（ｗ／ｖ） ＰＥＧ３３５０。

【0049】

＜Ｘ線結晶構造解析＞
得られた複合体の結晶について、放射光施設ＳＰｒｉｎｇ−８のビームラインＢＬ２６Ｂ２にて反射データを測定した。データセット測定のパラメーターは以下の通りである。
カメラ長：１５０ｍｍ、
波長：１Å、
照射時間：４秒間、０−１８０度（０．５度きざみ）。

【0050】

回折データの指数付けからスケーリングまでは、ＨＫＬ２０００プログラムを用いて行った。位相は、ＰＤＢ ＩＤ：１ＦＪ１をモデルとして、Ｐｈａｓｅｒ ＭＲプログラムを用いて分子置換法によって決定した。構造の精密化は、Ｐｈｅｎｉｘ ＲｅｆｉｎｅとＣｏｏｔプログラムで行った。精密化した結晶構造の分解能は、１Ａ９Ｄ７−Ｆａｂペプチド複合体が１．９Å、２Ａ７Ｄ９−Ｆａｂペプチド複合体が１．８Åであった。１Ａ９Ｄ７−Ｆａｂペプチド複合体の結晶構造を図６Ａに、２Ａ７Ｄ９−Ｆａｂペプチド複合体の結晶構造を図６Ｂに、それぞれ示す。また、図６Ａ及び図６Ｂの結晶構造のうち、ヒストンＨ４のテイルペプチドのＮ末端付近の拡大図を、それぞれ図７Ａ及び図７Ｂに示す。

【0051】

両者の構造解析の結果から、クローン１Ａ９Ｄ７が分泌生産する抗体とクローン２Ａ７Ｄ９が分泌生産する抗体のいずれも、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３において、ヒストンＨ４のＬｙｓ５及びＬｙｓ８がアセチル化された領域を認識して結合することがわかった。複合体の結晶では、両抗体でアミノ酸配列が異なっていたＣＤＲＨ２及びＣＤＲＬ１は、いずれも、ヒストンＨ４のテイルペプチドから離れた位置に存在した。

【0052】

また、図７Ｂに示すように、クローン２Ａ７Ｄ９の抗体のＦａｂフラグメントは、ヒストンＨ４テイルペプチドの１番目のセリン（Ｓ１）から８番目のアセチル化されたリジン（Ｋ８ａｃ）までの領域を認識していた。また、クローン２Ａ７Ｄ９の抗体の重鎖可変部の５３番目のスレオニン（Ｔ５３）のアミノ基は、ヒストンＨ４テイルペプチドＮ末端の１番目のセリンの側鎖と水素結合しており、軽鎖可変部の５２番目のアスパラギン（Ｎ５２）の側鎖は、ヒストンＨ４テイルペプチドＮ末端の１番目のセリンのアミノ基と水素結合している。このように、ヒストンＨ４テイルの１番目のセリンの認識に特異的に関わるクローン２Ａ７Ｄ９が分泌生産する抗体中のアミノ酸が特定できた。

【0053】

図７Ａに示すように、クローン１Ａ９Ｄ７の抗体のＦａｂフラグメントは、ヒストンＨ４テイルペプチドの４番目のグリシン（Ｇ４）から８番目のアセチル化されたリジン（Ｋ８ａｃ）までの領域を認識していた。ヒストンＨ４ペプチドのＮ末端の領域（１〜３番目のアミノ酸残基）を認識しないのは、重鎖可変部の５４番目のアミノ酸残基が、クローン２Ａ７Ｄ９の抗体ではアラニン（Ａ５４）であるのに対して、クローン１Ａ９Ｄ７の抗体ではグルタミン酸（Ｅ５４）であるため、ヒストンＨ４テイルペプチドのＮ末端が入り込みにくい構造を形成しているためである。

【0054】

クローン２Ａ７Ｄ９が分泌生産する抗体のほうが、クローン１Ａ９Ｄ７が分泌生産する抗体よりもヒストンＨ４のＮ末端の認識領域が広いため、Ｌｙｓ５及びＬｙｓ８がアセチル化されたヒストンＨ４に対する結合特異性がより優れていると期待できる。

【0055】

＜Ｆａｂフラグメントの全長のアミノ酸配列の決定＞
クローン１Ａ９Ｄ７及びクローン２Ａ７Ｄ９から得られたＦａｂフラグメントについて、マウスモノクローナル抗体アイソタイプ判定試薬（ＩｓｏＱｕｉｃｋ（登録商標） Ｋｉｔ ｆｏｒ ｍｏｕｓｅ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ｉｓｏｔｙｐｉｎｇ；ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ社製、製品番号：ＩＳ０Ｑ５−１ＫＴ）を用いて判定したところ、両ＦａｂフラグメントともＩｇＧ２ｂ／κのサブクラスと決定した。そこで、各フラグメントと抗原ペプチドとの複合体血漿構造を、ＩｇＧ２ｂ／κのＦａｂ（ＰＤＢＩＤ：１ＦＪ１）をサーチモデルとして分子置換法で決定した結果、両Ｆａｂフラグメントの電子密度マップのアミノ酸配列は、ＰＤＢＩＤ：１ＦＪ１のＣＨ１及びＣＬのアミノ酸配列とどちらも齟齬がなく、完全に一致した。従って、クローン１Ａ９Ｄ７及びクローン２Ａ７Ｄ９から得られたＦａｂフラグメントのＣＨ１及びＣＬのアミノ酸配列は、マウスＩｇＧ２ｂ／κのアミノ酸配列と同一と決定した。クローン１Ａ９Ｄ７とクローン２Ａ７Ｄ９から得られたＦａｂフラグメントのうち、重鎖（ＶＨ−ＣＨ１）（ＩｇＧ２ｂ）と軽鎖（κ）のアミノ酸配列をそれぞれ表１に示す。

【0056】

【表1】

【図1A】

【図1B】

【図2】

【図3A】

【図3B】

【図4】

【図5A】

【図5B】

【図6A】

【図6B】

【図7A】

【図7B】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]