特許 6579709 プロテインＡ固定化有機高分子担体の製造方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6579709

(24)【登録日】2019年9月6日

(45)【発行日】2019年9月25日

(54)【発明の名称】プロテインＡ固定化有機高分子担体の製造方法

(51)【国際特許分類】

   C07K 17/08 20060101AFI20190912BHJP

【ＦＩ】

   C07K17/08

【請求項の数】10

【全頁数】16

(21)【出願番号】特願2015-219939(P2015-219939)

(22)【出願日】2015年11月9日

(65)【公開番号】特開2017-88535(P2017-88535A)

(43)【公開日】2017年5月25日

【審査請求日】2018年8月1日

(73)【特許権者】

【識別番号】000002004

【氏名又は名称】昭和電工株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100141139

【弁理士】

【氏名又は名称】及川 周

(74)【代理人】

【識別番号】100163496

【弁理士】

【氏名又は名称】荒 則彦

(74)【代理人】

【識別番号】100134359

【弁理士】

【氏名又は名称】勝俣 智夫

(74)【代理人】

【識別番号】100064908

【弁理士】

【氏名又は名称】志賀 正武

(74)【代理人】

【識別番号】100094400

【弁理士】

【氏名又は名称】鈴木 三義

(74)【代理人】

【識別番号】100146879

【弁理士】

【氏名又は名称】三國 修

(72)【発明者】

【氏名】内山 直樹

(72)【発明者】

【氏名】小木戸 謙

【審査官】 金田 康平

(56)【参考文献】

【文献】 特開２０１２−１４６２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 BIOTECHNOLOGY AND BIOENGINEERING，２００２年，Vol. 80, No. 5，pp. 481-489

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０７Ｋ １／００−１９／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

エポキシ基を有する有機高分子担体のエポキシ基をアミノ化して担体αを得る工程（Ａ）と、
前記工程（Ａ）で得られた前記担体αのアミノ基をカルボキシル化して担体βを得る工程（Ｂ）と、
前記工程（Ｂ）で得られた前記担体βのカルボキシル基をＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル化して担体γを得る工程（Ｃ）と、
前記工程（Ｃ）で得られた前記担体γに、末端にヒスチジンタグを有するプロテインＡを用いて、前記プロテインＡを固定化して担体δを得る工程（Ｄ）と、
前記工程（Ｄ）で得られた前記担体δをアミド化する工程（Ｅ）と、
を有し、
前記工程（Ｄ）において、ｐＨ６．０以上で前記プロテインＡを固定化することを特徴とするプロテインＡ固定化有機高分子担体の製造方法。

【請求項2】

前記有機高分子担体が多孔質モノリス型担体であることを特徴とする請求項１に記載のプロテインＡ固定化有機高分子担体の製造方法。

【請求項3】

前記有機高分子担体がグリシジルメタクリレートとエチレングリコールジメタクリレートの共重合体からなることを特徴とする請求項１または２に記載のプロテインＡ固定化有機高分子担体の製造方法。

【請求項4】

前記工程（Ａ）において、アンモニアを反応させることにより、前記有機高分子担体をアミノ化することを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載のプロテインＡ固定化有機高分子担体の製造方法。

【請求項5】

前記工程（Ｂ）において、前記担体αのアミノ基に環状酸無水物を反応させることにより、前記担体αをカルボキシル化することを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載のプロテインＡ固定化有機高分子担体の製造方法。

【請求項6】

前記環状酸無水物が５員環状無水物であることを特徴とする請求項５に記載のプロテインＡ固定化有機高分子担体の製造方法。

【請求項7】

前記環状酸無水物が無水コハク酸または２−メチルコハク酸無水物であることを特徴とする請求項５または６に記載のプロテインＡ固定化有機高分子担体の製造方法。

【請求項8】

前記工程（Ｂ）において、前記担体βのカルボキシル基の密度を１５０μｍｏｌ／ｍＬ〜５００μｍｏｌ／ｍＬとすることを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載のプロテインＡ固定化有機高分子担体の製造方法。

【請求項9】

前記工程（Ｃ）において、３５℃〜６０℃で、前記担体βのカルボキシル基をＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル化することを特徴とする請求項１〜８のいずれか１項に記載のプロテインＡ固定化有機高分子担体の製造方法。

【請求項10】

前記工程（Ｅ）において、２−アミノエタノールおよびトリスヒドロキシメチルアミノメタンの少なくともいずれか一方を用いて、前記担体δをアミド化することを特徴とする請求項１〜９のいずれか１項に記載のプロテインＡ固定化有機高分子担体の製造方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、プロテインＡ固定化有機高分子担体の製造方法に関する。

【背景技術】

【0002】

バイオ医薬品は、従来の化学合成の低分子医薬では効果の低かった病気に対し、効果的かつ副作用の少ない医薬品として期待されている。バイオ医薬品の製造工程には、バイオ医薬品を含有する培養液から、その他の不純物を分離する工程が必要とされる。

【0003】

液体クロマトグラフィーは、バイオ医薬品の分離精製に重要な工程である。例えば、抗体医薬品の主成分である免疫グロブリンＧ（以下、「ＩｇＧ」と言う。）を分離する手法としては、例えば、アフィニティクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー等が用いられる。
アフィニティクロマトグラフィーでは、精製対象となる目的物質と、選択的に相互作用する物質（リガンド）とを担体に固定しておき、目的物質をリガンドに特異的に吸着させることにより、不純物と分離している。また、吸着された目的物質は、相互作用を弱めることで溶出され、これを回収することで精製される。ここで、リガンドとしては、一般的にタンパク質が用いられる。特に、リガンドとしてプロテインＡを用いた、プロテインＡアフィニティクロマトグラフィーは、抗体医薬の主成分であるＩｇＧを高い選択性で吸着することが可能である。このプロテインＡアフィニティクロマトグラフィーは、抗体医薬製造工程に広く用いられている。

【0004】

しかしながら、粒子充填型の液体クロマトグラフィーを用いた場合、粒子表面のメソポア中でのバイオマクロ分子の拡散律速を考慮せねばならず、精製を十分に行うためには、精製工程に長時間を要する。
精製工程に長時間を要すると、単位時間当たりの生産性が抑制され、また、バイオ医薬品の凝集体の生成等が懸念される。

【0005】

一方、多孔質モノリス型クロマトグラフィーは、行き止まりのない貫通型の大きな流路を有する多孔体を分離媒体としたクロマトグラフィーである。この分離媒体は、バイオマクロ分子の分離に不利なメソポアを排除した構造を取っており、分子の自然拡散に依存しないため、高速での分離精製が可能である。
例えば、特許文献１および特許文献２では、細孔径を高度に調整した多孔質シリカモノリス型担体を分離媒体とし、表面にプロテインＡを固定化して、高流速・短時間でＩｇＧ精製を試みている。

【0006】

しかしながら、多孔質シリカモノリス型担体は強アルカリの溶液に曝すことができないため、ＩｇＧ精製後の後洗浄工程において汎用的に用いられる苛性ソーダ水溶液を用いることができないという課題がある。このような課題から、分離媒体として用いられる担体は有機高分子担体であることが望ましい。

【0007】

ＢＩＡ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ ｄ．ｏ．ｏ株式会社製のＣＩＭ（登録商標）ｒ−Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ（商品名）は、多孔質モノリス型有機高分子担体にプロテインＡを固定化したアフィニティクロマトグラフィーであり、５ＣＶ／ｍｉｎ〜８ＣＶ／ｍｉｎという超高流速で、精製対象となるＩｇＧの吸着・溶出を行なうことが可能である。
しかしながら、ＣＩＭ（登録商標）ｒ−Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ（商品名）は、粒子充填型の液体クロマトグラフィーと比較して動的吸着容量 （以下、「ＤＢＣ」と言う。） が低く、およそ１０ｍｇ／ｍＬ−ゲル程度である。そのため、高速性を生かしても、単位時間当たりの生産コストは十分に優れているとは言い難い。ＩｇＧの工業的な精製工程に用いるには、これよりも高いＤＢＣが要求される。なお、「ｍｇ／ｍＬ−ゲル」は、ゲルの単位体積当たりの吸着量（ｍｇ）を示す。

【0008】

多孔質モノリス型有機高分子担体のＤＢＣを向上させるには、多孔質モノリス型有機高分子担体へのアフィニティリガンドの導入効率を向上させる必要がある。しかしながら、多孔質モノリス型有機高分子担体へのアフィニティリガンドの導入を検討した事例は、粒子状担体と比較して著しく少ない。
例えば、非特許文献１では、市販の多孔質モノリス型有機高分子担体 ＣＩＭ（登録商標） ｅｐｏｘｙ ｄｉｓｋ（ＢＩＡ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ ｄ．ｏ．ｏ株式会社製）へのプロテインＡの固定化を検討し、評価を行なっている。しかしながら、ＩｇＧのＤＢＣは９ｍｇ／ｍＬ−ゲルに留まっており、ＤＢＣが十分とは言い難かった。
このように、従来、多孔質モノリス型有機高分子担体へのプロテインＡの固定化法を最適化することは十分に検討されていなかった。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0009】

【特許文献1】特開２０１５−２００８号公報

【特許文献2】特開２０１２−１４６２号公報

【非特許文献】

【0010】

【非特許文献1】Ｊ．Ｓｅｐ．Ｓｃｉ．２００４，２７，ｐ８１１−８１８

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0011】

本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、多孔質モノリス型有機高分子担体の表面修飾効率を向上するプロテインＡ固定化有機高分子担体の製造方法を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0012】

本発明者等は、上記課題を解決するため、多孔質モノリス型有機高分子担体への表面修飾工程の詳細な検討を行なった。その結果、本発明者等は、エポキシ基を有する有機高分子担体のエポキシ基をアミノ化して担体αを得る工程（Ａ）と、工程（Ａ）で得られた前記担体αのアミノ基をカルボキシル化して担体βを得る工程（Ｂ）と、工程（Ｂ）で得られた前記担体βのカルボキシル基をＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル化して担体γを得る工程（Ｃ）と、工程（Ｃ）で得られた担体γに、末端にヒスチジンタグを有するプロテインＡを用いて、プロテインＡを固定化して担体δを得る工程（Ｄ）と、工程（Ｄ）で得られた担体δをアミド化する工程（Ｅ）と、を有し、工程（Ｄ）において、ｐＨ６．０以上でプロテインＡを固定化することにより、プロテインＡの固定化効率が著しく向上することを見出しし、本発明を完成するに至った。

【0013】

［１］エポキシ基を有する有機高分子担体のエポキシ基をアミノ化して担体αを得る工程（Ａ）と、前記工程（Ａ）で得られた前記担体αのアミノ基をカルボキシル化して担体βを得る工程（Ｂ）と、前記工程（Ｂ）で得られた前記担体βのカルボキシル基をＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル化して担体γを得る工程（Ｃ）と、前記工程（Ｃ）で得られた前記担体γに、末端にヒスチジンタグを有するプロテインＡを用いて、前記プロテインＡを固定化して担体δを得る工程（Ｄ）と、前記工程（Ｄ）で得られた前記担体δをアミド化する工程（Ｅ）と、を有し、前記工程（Ｄ）において、ｐＨ６．０以上で前記プロテインＡを固定化することを特徴とするプロテインＡ固定化有機高分子担体の製造方法。

【0014】

［２］前記有機高分子担体が多孔質モノリス型担体である［１］に記載のプロテインＡ固定化有機高分子担体の製造方法。

【0015】

［３］前記有機高分子担体がグリシジルメタクリレートとエチレングリコールジメタクリレートの共重合体からなる［１］または［２］に記載のプロテインＡ固定化有機高分子担体の製造方法。

【0016】

［４］前記工程（Ａ）において、アンモニアを反応させることにより、前記有機高分子担体をアミノ化する［１］〜［３］のいずれかに記載のプロテインＡ固定化有機高分子担体の製造方法。

【0017】

［５］前記工程（Ｂ）において、前記担体αのアミノ基に環状酸無水物を反応させることにより、前記担体αをカルボキシル化する［１］〜［４］のいずれかに記載のプロテインＡ固定化有機高分子担体の製造方法。

【0018】

［６］前記環状酸無水物が５員環状無水物である［５］に記載のプロテインＡ固定化有機高分子担体の製造方法。

【0019】

［７］前記環状酸無水物が無水コハク酸または２−メチルコハク酸無水物である［５］または［６］に記載のプロテインＡ固定化有機高分子担体の製造方法。

【0020】

［８］前記工程（Ｂ）において、前記担体βのカルボキシル基の密度を１５０μｍｏｌ／ｍＬ〜５００μｍｏｌ／ｍＬとする［１］〜［７］のいずれかに記載のプロテインＡ固定化有機高分子担体の製造方法。

【0021】

［９］前記工程（Ｃ）において、３５℃〜６０℃で、前記担体βのカルボキシル基をＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル化する［１］〜［８］のいずれかに記載のプロテインＡ固定化有機高分子担体の製造方法。

【0022】

［１０］前記工程（Ｅ）において、２−アミノエタノールおよびトリスヒドロキシメチルアミノメタンの少なくともいずれか一方を用いて、前記担体δをアミド化する［１］〜［９］のいずれかに記載のプロテインＡ固定化有機高分子担体の製造方法。

【発明の効果】

【0023】

本発明によれば、ＤＢＣの高いプロテインＡ固定化有機高分子担体を製造することができる。このプロテインＡ固定化有機高分子担体を用いることにより、ＩｇＧの分離精製を、高速・短時間で行なうことが可能となる。

【図面の簡単な説明】

【0024】

【図1】末端にヒスチジンタグを有するプロテインＡとＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル化多孔質モノリス型有機高分子担体との反応機構を示す模式図である。

【発明を実施するための形態】

【0025】

本発明のプロテインＡ固定化有機高分子担体の製造方法の実施の形態について説明する。
なお、本実施の形態は、発明の趣旨をより良く理解させるために具体的に説明するものであり、特に指定のない限り、本発明を限定するものではない。

【0026】

［プロテインＡ固定化有機高分子担体の製造方法］
本実施形態のプロテインＡ固定化有機高分子担体の製造方法は、エポキシ基を有する有機高分子担体のエポキシ基をアミノ化して担体αを得る工程（Ａ）と、前記工程（Ａ）で得られた前記担体αのアミノ基をカルボキシル化して担体βを得る工程（Ｂ）と、前記工程（Ｂ）で得られた前記担体βのカルボキシル基をＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル化して担体γを得る工程（Ｃ）と、前記工程（Ｃ）で得られた前記担体γに、末端にヒスチジンタグを有するプロテインＡを用いて、前記プロテインＡを固定化して担体δを得る工程（Ｄ）と、前記工程（Ｄ）で得られた前記担体δをアミド化する工程（Ｅ）と、を有し、前記工程（Ｄ）において、ｐＨ６．０以上で前記プロテインＡを固定化する。

【0027】

「工程（Ａ）」
本実施形態で用いられる有機高分子担体は、エポキシ基を有する。エポキシ基の由来は、特に限定されないが、グリシジルメタクリレート等のエポキシ含有化合物を単量体とする共重合体であることが好ましい。有機高分子担体におけるエポキシ基の含有量は、所望のプロテインＡ固定化量を得るために十分な量であることが好ましく、１μｍｏｌ／ｍＬ−ゲル〜３０００μｍｏｌ／ｍＬ−ゲルであることが好ましく、１０００μｍｏｌ／ｍＬ−ゲル〜２０００μｍｏｌ／ｍＬ−ゲルであることがより好ましい。

【0028】

本実施形態で用いられる有機高分子担体は、貫通型の流路を有する多孔質モノリス型有機高分子担体であることが好ましい。
多孔質モノリス型有機高分子担体の流路径は、特に限定されないが、５００ｎｍ〜１μｍであることが好ましい。
多孔質モノリス型有機高分子担体の流路径が５００ｎｍ以上であれば、カラムの背圧が上昇して高速性が失われることがない。一方、多孔質モノリス型有機高分子担体の流路径が１μｍ以下であれば、多孔質モノリス型有機高分子担体の表面積が少なくなり過ぎて、抗体の回収量が低下することがない。
上記の流路径は、細孔径分布測定器（商品名：Ｐａｓｃａｌ ４４０、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて、水銀圧入法により測定した値である。

【0029】

これらの特徴を有する多孔質モノリス型有機高分子担体としては、具体的には、ＢＩＡ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ ｄ．ｏ．ｏ株式会社製の ＣＩＭ（登録商標） ｅｐｏｘｙ（商品名）が挙げられる。
ＣＩＭ（登録商標） ｅｐｏｘｙは、グリシジルメタクリレート（単量体）とエチレングリコールジメタクリレート（架橋剤）の共重合体である。また、ＣＩＭ（登録商標） ｅｐｏｘｙは、平均流路６００ｎｍ〜７５０ｎｍの貫通型の流路を有する。

【0030】

工程（Ａ）において、有機高分子担体のエポキシ基をアミノ化して、エポキシ基をアミノ化した有機高分子担体（以下、「担体α」と言う。）を得る方法は、特に限定されず、如何なる方法も用いられる。なお、有機高分子担体のエポキシ基をアミノ化するとは、有機高分子担体にアミノ基を導入することである。有機高分子担体のエポキシ基をアミノ化する方法としては、例えば、５％〜２８％アンモニア水、塩化アンモニウム、酢酸アンモニウム、硫酸アンモニウム等をアミノ化剤として用いる方法が用いられる。

【0031】

有機高分子担体へのアミノ基の導入は、イオンクロマトグラフィーによって確認、定量する。有機高分子担体のエポキシ基をアミノ化処理して担体αとした後、担体αを希塩酸で洗浄してアミノ基を塩化アンモニウムとする。続いて、担体αを水酸化ナトリウム水溶液で洗浄し、その洗液の塩化物イオン濃度をイオンクロマトグラフィーで測定することにより、アミノ基を定量する。

【0032】

「工程（Ｂ）」
工程（Ｂ）において、工程（Ａ）で得られた担体αのアミノ基をカルボキシル化して担体βを得る方法は、特に限定されず、如何なる方法も用いられる。担体αのアミノ基をカルボキシル化する方法としては、一般的に、担体αのアミノ基とカルボキシル基との間にスペーサーを導入する方法が挙げられる。なお、担体αのアミノ基をカルボキシル化するとは、担体αにカルボキシル基を導入することである。
担体αのアミノ基をカルボキシル化する方法としては、担体αのアミノ基に環状酸無水物を反応させることが好ましい。
環状酸無水物としては、無水コハク酸、２−メチルコハク酸無水物、２，２−ジメチルコハク酸無水物、ｏ−アセチル−リンゴ酸無水物、ジアセチル−酒石酸無水物等の５員環状無水物、グルタル酸無水物、３−メチルグルタル酸無水物、ジグリコール酸無水物等の６員環状無水物等が挙げられる。これらの中でも、カルボキシル基の導入効率が優れている点から、５員環状無水物であることが好ましく、無水コハク酸または２−メチルコハク酸無水物であることがより好ましい。
これらの環状酸無水物を用いた開環反応により、担体αにカルボキシル基を導入する。

【0033】

工程（Ｂ）において、担体βのカルボキシル基の密度を１００μｍｏｌ／ｍＬ〜５００μｍｏｌ／ｍＬとすることが好ましく、１５０μｍｏｌ／ｍＬ〜３００μｍｏｌ／ｍＬとすることがより好ましい。
担体βのカルボキシル基の密度を上記の範囲とすることにより、カルボキシル基のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル化の効率を増大させることができる。

【0034】

担体αへのカルボキシル基の導入は、イオンクロマトグラフィーによって確認、定量する。上記アミノ基の定量法と同様にして、担体αのアミノ基量を定量し、カルボキシル基導入工程前のアミノ基量と、同工程後のアミノ基量を比較し、同工程後に減少したアミノ基量が、環状酸無水物と反応した量と判断する。

【0035】

「工程（Ｃ）」
工程（Ｃ）において、工程（Ｂ）で得られた担体βのカルボキシル基をＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル化して担体γを得る方法は、特に限定されず、如何なる方法も用いられる。
担体βのカルボキシル基をＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル化する方法としては、例えば、縮合剤とＮ−ヒドロキシスクシンイミドを溶媒に溶解した反応溶液を、担体βに接触させる方法が挙げられる。

【0036】

縮合剤としては、例えば、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルカルボジイミド、Ｎ，Ｎ−ジシクロヘキシルカルボジイミド等のカルボジイミド型縮合剤、ｏ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート、ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート等のウロニウム型縮合剤、クロロトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスファート、（ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ）トリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスファート等のホスホニウム型縮合剤等が挙げられる。これらの中でも、溶媒への溶解性を考慮して、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルカルボジイミドが特に好ましい。

【0037】

カルボジイミド型縮合剤を用いる際、縮合剤とＮ−ヒドロキシスクシンイミドを溶媒に溶解してから１０分以内に、反応溶液を担体βに接触させることが好ましい。調整後１０分以内の反応溶液を用いれば、縮合剤が分解することがないため、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル化の効率が低下することを防止できる。なお、縮合剤の分解の反応機構は、非特許文献 （Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９８７，２６，２１５５−２１６１．）に記載されている。

【0038】

工程（Ｃ）において、加熱条件下で担体βのカルボキシル基をＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル化することが好ましい。加熱温度は、３５℃〜６０℃であることが好ましく、４０℃〜５０℃であることがより好ましい。
３５℃〜６０℃で、担体βのカルボキシル基をＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル化することにより、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル化効率を増大させることができる。

【0039】

担体βのカルボキシル基のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル化の進行は、担体βのカルボキシル基をＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル化処理して得られた担体γをアルカリ加水分解し、分解の際に生じるＮ−ヒドロキシスクシンイミドをサイズ排除クロマトグラフィーで定量することにより確認する。

【0040】

「工程（Ｄ）」
本実施形態で用いられるプロテインＡは、末端にヒスチジンタグを有していること以外、特に構造が限定されない。末端にヒスチジンタグを有するプロテインＡとしては、例えば、非特許文献（Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１９９５，２０，２８５−２８６）に記載されているような遺伝子合成法により得られる。入手可能な末端にヒスチジンタグを有するプロテインＡとしては、例えば、Ｂｉｏ Ｖｉｓｉｏｎ株式会社製のＰｒｏｔｅｉｎ Ａ（Ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ）（製品名）等が挙げられる。

【0041】

工程（Ｄ）において、工程（Ｃ）で得られた担体γに、末端にヒスチジンタグを有するプロテインＡを用いて、プロテインＡを固定化して担体δを得る方法としては、例えば、次のような方法が挙げられる。末端にヒスチジンタグを有するプロテインＡと、担体γの表面のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルとを接触させることにより、プロテインＡのアミノ基とＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルとがアミド結合を形成することで、共有結合により、担体γにプロテインＡを固定する。

【0042】

担体γにプロテインＡを固定化する際、ヒスチジン側鎖のイミダゾール基が、図１に示す反応機構により、プロテインＡに含まれるアミノ基とＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルが反応を促進していると想定される。これにより、プロテインＡが、ＩｇＧとの相互作用能を損なうことなく、担体γに効率的に固定化される。

【0043】

工程（Ｄ）において、担体γにプロテインＡを固定化するとき、すなわち、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルと、ヒスチジンタグを含むプロテインＡとを反応させるとき、ｐＨ６．０以上、好ましくはｐＨ６．０〜ｐＨ１１．０の条件で行う。なお、この反応には、ｐＨ６．０〜ｐＨ１１．０の炭酸緩衝液を用いることが好ましい。
ｐＨ６．０未満で反応させると、プロテインＡの反応性が低下し、プロテインＡの固定化効率が低下する傾向がある。一方、ｐＨ１１を超えた条件で反応させると、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルの分解、プロテインＡの分解、または、プロテインＡの異性化を誘発し、プロテインＡの固定化効率が低下する場合がある。

【0044】

担体γへのプロテインＡの固定化量は、高速液体クロマトグラフィー （Ｈｉｇｈ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、ＨＰＬＣ）およびＵＶ検出器により定量する。
反応後の反応液に含まれるプロテインＡの量をＵＶ検出器で測定し、算出されたプロテインＡ量を、反応開始前のプロテインＡの量から差し引くことにより、担体γに固定化されたプロテインＡの量（プロテインＡ固定化量）を定量する。

【0045】

「工程（Ｅ）」
末端にヒスチジンタグを有するプロテインＡを担体γに固定化した後における、担体γの表面のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルは、ＩｇＧ精製工程において、試料に含まれる不純物と非特異的に反応する可能性が懸念される。そのため、プロテインＡを担体γに固定化する工程（Ｄ）の後、工程（Ｅ）では、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルと、アミノ基を有する化合物とを結合させてアミド化することにより、反応性の低いアミドへと変換することが好ましい。

【0046】

工程（Ｅ）において、例えば、２−アミノエタノールおよびトリスヒドロキシメチルアミノメタンの少なくともいずれか一方を溶解した水溶液を調製し、この水溶液と担体δとを接触させることにより、未反応のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルが、親水性が高く、反応性の低い官能基へと変換される。

【0047】

以上の工程（Ａ）〜工程（Ｅ）を経て、プロテインＡ固定化有機高分子担体を得る。

【0048】

本実施形態のプロテインＡ固定化有機高分子担体の製造方法によれば、ＤＢＣの高いプロテインＡ固定化有機高分子担体を製造することができる。このプロテインＡ固定化有機高分子担体を用いることにより、ＩｇＧの分離精製を、高速・短時間で行なうことが可能となる。

【実施例】

【0049】

以下、実施例および比較例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

【0050】

［実施例１］
「エポキシ基のアミノ化」
ゲル容量１ｍＬのＣＩＭ（登録商標） ｅｐｏｘｙ（商品名）−１ｍＬ（ＢＩＡ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ ｄ．ｏ．ｏ株式会社製）を出発基材とした。ＣＩＭ（登録商標） ｅｐｏｘｙは、グリシジルメタクリレートを単量体、エチレングリコールジメタクリレートを架橋剤とした共重合体である。ＣＩＭ（登録商標） ｅｐｏｘｙは、エポキシ基を１．８ｍｍｏｌ／ｍＬの密度で含有する平均流路径６００ｎｍ〜７５０ｎｍの多孔質モノリス型有機高分子担体である。
多孔質モノリス型有機高分子担体をペリスタティックポンプに接続し、０．５ｍＬ／ｍｉｎの流速で２５％ＮＨ_３水溶液を３時間送液した後、水を送液し、多孔質モノリス型有機高分子担体を洗浄した。これにより、アミノ化した多孔質モノリス型有機高分子担体（担体α）を得た。
多孔質モノリス型有機高分子担体へのアミノ基の導入量を、以下の手順で定量した。
まず、反応後の多孔質モノリス型有機高分子担体を２０ＣＶの０．１ｍｏｌ／Ｌ塩酸で洗浄し、続いて、多孔質モノリス型有機高分子担体を３０ＣＶの水で洗浄した。
その後、水で洗浄した多孔質モノリス型有機高分子担体を２０ＣＶの０．１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液で洗浄し、その洗液を回収し、洗液中に含まれる塩化物イオンをイオンクロマトグラフィーで測定した。イオンクロマトグラフィカラムとしてはＳＩ−５０（商品名、昭和電工株式会社製）、検出器としてはＣＤＤ−１０Ａ（商品名、島津製作所株式会社製） を用いた。

【0051】

「カルボキシル基の導入」
アミノ化を終了した後、多孔質モノリス型有機高分子担体に、２０ｍＬ以上のジメチルホルムアミドをペリスタティックポンプで送液し、無水コハク酸２．０ｇおよび４−ジメチルアミノピリジン１２２ｍｇをジメチルホルムアミド１０ｍＬに溶解させた反応液を、ペリスタティックポンプで０．５ｍＬ／ｍｉｎの流速で約２０時間循環させた。
反応終了後、多孔質モノリス型有機高分子担体に対して、ジメチルホルムアミドによる洗浄、水による洗浄をこの順に行った。
多孔質モノリス型有機高分子担体へのカルボキシル基の導入量を、以下の手順で算出した。
アミノ基の導入量の定量法と同様にして、アミノ基の残存量を測定した。測定値より、反応前後のアミノ基消費量を算出し、カルボキシル基の導入量とした。
多孔質モノリス型有機高分子担体には、カルボキシル基が１５０μｍｏｌ／ｍＬの密度で導入されていることを確認した。

【0052】

「残存エポキシ基のジオール化」
カルボキシル基を導入した多孔質モノリス型有機高分子担体に対し、０．５ｍｏｌ／Ｌ硫酸水溶液をペリスタティックポンプで０．５ｍＬ／ｍｉｎの流速で４時間循環させ、残存エポキシ基をジオール化させた。
反応終了後、多孔質モノリス型有機高分子担体に対して、水による洗浄、０．５ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液による洗浄、水による洗浄をこの順に行った。それぞれの洗浄において、水および水酸化ナトリウム水溶液を２０ｍＬ以上送液した。

【0053】

「カルボキシル基のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル化」
カルボキシル基を導入し、残存エポキシ基をジオール化した多孔質モノリス型有機高分子担体に対し、水、０．１ｍｏｌ／Ｌ塩酸、水、ジメチルホルムアミドをそれぞれこの順に２０ｍＬ以上送液した。
多孔質モノリス型有機高分子担体、および、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド１．１５ｇを溶解させたジメチルホルムアミド２０ｍＬを５０℃に加熱した。
５０℃に加熱したＮ−ヒドロキシスクシンイミドのジメチルホルムアミド溶液に、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルカルボジイミド１．４ｍＬを溶解させ、その溶液を５０℃のまま多孔質モノリス型有機高分子担体に３ｍＬ／ｍｉｎの流速で１５ｍＬ送液した。
その後、多孔質モノリス型有機高分子担体を５０℃で１０時間静置した。反応後、多孔質モノリス型有機高分子担体を室温にし、ジメチルホルムアミドで洗浄した。

【0054】

「末端にヒスチジンタグを有するプロテインＡの固定化」
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル化した多孔質モノリス型有機高分子担体に、水、０．２ｍｏｌ／ＬＮａＨＣＯ_３− ０．５ｍｏｌ／ＬＮａＣｌ水溶液を送液した。
Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ（Ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ）（Ｂｉｏ Ｖｉｓｉｏｎ株式会社製）１８ｍｇを２ｍＬの０．２ｍｏｌ／ＬＮａＨＣＯ_３− ０．５ｍｏｌ／ＬＮａＣｌ水溶液に溶解した反応溶液を、０．２ｍＬ／ｍｉｎの流速で多孔質モノリス型有機高分子担体に送液した後、多孔質モノリス型有機高分子担体を４℃に保った。
２４時間経過後、２ｍＬの０．２ｍｏｌ／ＬＮａＨＣＯ_３− ０．５ｍｏｌ／ＬＮａＣｌ（ｐＨ７．８）水溶液を１０ｍＬ送液し、未反応のプロテインＡの洗浄および回収を行なった。
多孔質モノリス型有機高分子担体へのプロテインＡの固定化量を、以下の手法で定量した。
プロテインＡの固定化反応終了後、洗浄液中に含まれるプロテインＡの量はＨＰＬＣおよびＵＶ検出器により算出した。
例えば、昭和電工株式会社製のＫＷ−４０２．５（商品名）で洗浄液を分析し、プロテインＡのＵＶピーク面積を測定することにより、洗浄液中のプロテインＡの含有量が算出した。算出したプロテインＡの含有量を、反応開始前のプロテイン量から差し引くことで、多孔質モノリス型有機高分子担体に固定化されたプロテインＡの量を算出した。

【0055】

「未反応Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルのアミド基への変換」
プロテインＡを固定化した多孔質モノリス型有機高分子担体に対し、水を１０ｍＬ送液した後、０．５ｍｏｌ／Ｌ ２−アミノエタノール−２０ｍＭトリス緩衝液を１０ｍＬ送液し、１０分間静置することで、残存したＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルをアミド基へと変換した。
反応後、水、２０％エタノール−２０ｍＭトリス緩衝液の順にそれぞれ２０ｍＬ以上送液した後、多孔質モノリス型有機高分子担体を４℃に保った。
以上により、実施例１のプロテインＡ固定化多孔質モノリス型有機高分子担体を得た。

【0056】

「プロテインＡ固定化多孔質モノリス型有機高分子担体のＤＢＣ測定」
クロマトグラフィーシステム（ＡＫＴＡ ａｖａｎｔ１５０、ＧＥヘルスケア・ジャパン社製）を用いて、実施例１のプロテインＡ固定化多孔質モノリス型有機高分子担体について、ＩｇＧヒト血清由来（Ａｌｄｒｉｃｈ株式会社製、以下、「ＩｇＧ」と略す。）の吸着・溶出試験を行なった。
ＩｇＧの吸着および溶出を、以下の条件で行なった。

【0057】

「ＤＢＣ測定」
＜吸着ステップ＞
・ＩｇＧ濃度：０．４ｍｇ／ｍＬ〜０．５ｍｇ／ｍＬ
・吸着緩衝液：１×ＰＢＳ
・流速：６．９ＣＶ／ｍｉｎ
＜洗浄ステップ１＞
・洗浄緩衝液：１×ＰＢＳ
・流速：６．９ＣＶ／ｍｉｎ
・送液量：５ＣＶ
＜洗浄ステップ２＞
・洗浄緩衝液：１×ＰＢＳ＋０．４ｍｏｌ／ＬＮａＣｌ
・流速：６．９ＣＶ／ｍｉｎ
・送液量：５ＣＶ
＜溶出ステップ＞
・溶出液：０．１ｍｏｌ／Ｌグリシン塩酸塩水溶液（ｐＨ２．０）
・流速：６．９ＣＶ／ｍｉｎ
・送液量：７ＣＶ

【0058】

吸着ステップで、溶液に含まれるＩｇＧの１０％がカラムから漏出してきた時点、および、溶液に含まれるＩｇＧの５０％がカラムから漏出してきた時点において、実施例１のプロテインＡ固定化多孔質モノリス型有機高分子担体に吸着されたＩｇＧの容量（ＤＢＣ１０およびＤＢＣ５０）をそれぞれ算出した。ＤＢＣ１０およびＤＢＣ５０は、下記式により算出した。
ＤＢＣ１０（ｍｇ／ｍＬ）＝１０％漏出時点での送液量×ＩｇＧ濃度／プロテインＡ固定化多孔質モノリス型有機高分子担体の体積
ＤＢＣ５０（ｍｇ／ｍＬ）＝５０％漏出時点での送液量×ＩｇＧ濃度／プロテインＡ固定化多孔質モノリス型有機高分子担体の体積
ここで、１０％漏出時点および５０％漏出時点とは、カラム未装着時にＩｇＧ溶液を送液した際のＵＶ吸収値を１００％漏出とし、その吸収値の１０％の吸収値が観測された時点を１０％漏出時点、５０％の吸収値が観測された時点を５０％漏出時点とした。

【0059】

「結果」
ＩｇＧのＤＢＣ１０は１８ｍｇ／ｍＬ−ゲル、ＩｇＧのＤＢＣ５０は２０ｍｇ／ｍＬ−ゲルであった。
以上の結果から、末端にヒスチジンタグを有するプロテインＡを用いることでプロテインＡの固定化効率が向上し、ＩｇＧの吸着容量を向上したことが分かった。結果を表１に示す。

【0060】

［実施例２］
カルボキシル基の導入を、無水コハク酸２．０ｇの代わりに、メチルコハク酸無水物２．３ｇを用いて行ったこと以外は、実施例１と同様にして、実施例２のプロテインＡ固定化多孔質モノリス型有機高分子担体を得た。

【0061】

「ＤＢＣ測定、結果」
実施例１と同様にして、実施例２のプロテインＡ固定化多孔質モノリス型有機高分子担体について、ＩｇＧの吸着・溶出試験を行なった。
その結果、ＩｇＧのＤＢＣ１０は１３ｍｇ／ｍＬ−ゲル、ＩｇＧのＤＢＣ５０は１６ｍｇ／ｍＬ−ゲルであった。
以上の結果から、末端にヒスチジンタグを有するプロテインＡを用いることでプロテインＡの固定化効率が向上し、ＩｇＧの吸着容量を向上したことが分かった。結果を表１に示す。

【0062】

［実施例３］
２５％ＮＨ_３水溶液の送液時間を６時間としたこと以外は、実施例１と同様にして、実施例３のプロテインＡ固定化多孔質モノリス型有機高分子担体を得た。

【0063】

「ＤＢＣ測定、結果」
実施例１と同様にして、実施例３のプロテインＡ固定化多孔質モノリス型有機高分子担体について、ＩｇＧの吸着・溶出試験を行なった。
その結果、ＩｇＧのＤＢＣ１０は１８ｍｇ／ｍＬ−ゲル、ＩｇＧのＤＢＣ５０は１９ｍｇ／ｍＬ−ゲルであった。
以上の結果から、末端にヒスチジンタグを有するプロテインＡを用いることでプロテインＡの固定化効率が向上し、ＩｇＧの吸着容量を向上したことが分かった。結果を表１に示す。

【0064】

［実施例４］
エポキシのアミノ化に用いるアミノ化試薬をＨ２Ｏ−２５％ＮＨ_３水溶液＝３：１（ｖ／ｖ）としたこと以外は、実施例１と同様にして、実施例４のプロテインＡ固定化多孔質モノリス型有機高分子担体を得た。

【0065】

「ＤＢＣ測定、結果」
実施例１と同様にして、実施例４のプロテインＡ固定化多孔質モノリス型有機高分子担体について、ＩｇＧの吸着・溶出試験を行なった。
その結果、ＩｇＧのＤＢＣ１０は１４ｍｇ／ｍＬ−ゲル、ＩｇＧのＤＢＣ５０は１６ｍｇ／ｍＬ−ゲルであった。
以上の結果から、末端にヒスチジンタグを有するプロテインＡを用いることでプロテインＡの固定化効率が向上し、ＩｇＧの吸着容量を向上したことが分かった。結果を表１に示す。

【0066】

［実施例５］
２５％ＮＨ_３水溶液の送液時間を１５時間としたこと以外は、実施例１と同様にして、実施例５のプロテインＡ固定化多孔質モノリス型有機高分子担体を得た。カルボキシル基は６００μｍｏｌ／ｍＬ−ゲルの密度で導入されていることが確認された。

【0067】

「ＤＢＣ測定、結果」
実施例１と同様にして、実施例５のプロテインＡ固定化多孔質モノリス型有機高分子担体について、ＩｇＧの吸着・溶出試験を行なった。
その結果、ＩｇＧのＤＢＣ１０は９ｍｇ／ｍＬ−ゲル、ＩｇＧのＤＢＣ５０は１０ｍｇ／ｍＬ−ゲルであった。
以上の結果から、カルボキシル基の密度を６００μｍｏｌ／ｍＬ−ゲルとすると、末端にヒスチジンタグを有するプロテインＡの固定化効率が若干低下した。結果を表１に示す。

【0068】

［実施例６］
カルボキシル基のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル化の反応温度を２５℃としたこと以外は、実施例１と同様にして、実施例６のプロテインＡ固定化多孔質モノリス型有機高分子担体を得た。

【0069】

「ＤＢＣ測定、結果」
実施例１と同様にして、実施例６のプロテインＡ固定化多孔質モノリス型有機高分子担体について、ＩｇＧの吸着・溶出試験を行なった。
その結果、ＩｇＧのＤＢＣ１０は１２ｍｇ／ｍＬ−ゲル、ＩｇＧのＤＢＣ５０は１３ｍｇ／ｍＬ−ゲルであった。
以上の結果から、カルボキシル基のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル化の反応温度を２５℃とすると、末端にヒスチジンタグを有するプロテインＡの固定化効率が若干低下した。結果を表１に示す。

【0070】

［比較例１］
ＣＩＭ（登録商標） ｒ−Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ（商品名）を用いて、実施例１と同様にして、ＩｇＧの吸着・溶出試験を行なった。
その結果、ＩｇＧのＤＢＣ１０は８．３ｍｇ／ｍＬ−ゲル、ＩｇＧのＤＢＣ５０は１１ｍｇ／ｍＬ−ゲルであった。結果を表２に示す。

【0071】

［比較例２］
多孔質モノリス型有機高分子担体に固定化するプロテインＡとして、ヒスチジンタグを含まないｒＳＰＡ（商品名、Ｒｅｐｌｉｇｅｎ株式会社製）を用いたこと以外は、実施例１と同様にして、比較例２のプロテインＡ固定化多孔質モノリス型有機高分子担体を得た。

【0072】

「ＤＢＣ測定、結果」
実施例１と同様にして、比較例２のプロテインＡ固定化多孔質モノリス型有機高分子担体について、ＩｇＧの吸着・溶出試験を行なった。
その結果、ＩｇＧのＤＢＣ１０は３．５ｍｇ／ｍＬ−ゲル、ＩｇＧのＤＢＣ５０は４．６ｍｇ／ｍＬ−ゲルであった。
以上の結果から、ヒスチジンタグを含まないプロテインＡは固定化効率が低く、ＤＢＣ向上効果がないことが分かった。結果を表２に示す。

【0073】

［比較例３］
末端にヒスチジンタグを有するプロテインＡの固定化反応を、酸性溶液（５０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸−１．３５ｍｏｌ／ＬＮａＣｌ水溶液（ｐＨ３．０））中で行なった。詳細を以下に示す。

【0074】

「末端にヒスチジンタグを有するプロテインＡの固定化」
実施例１と同様にして、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル化した多孔質モノリス型有機高分子担体に、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ（Ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ）（Ｂｉｏ Ｖｉｓｉｏｎ株式会社製）を酸性溶液（５０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸−１．３５ｍｏｌ／ＬＮａＣｌ水溶液）に０．６ｍｇ／ｍＬに溶解した反応溶液１５ｍＬを、０．３ｍＬ／ｍｉｎの流速で送液した。
多孔質モノリス型有機高分子担体からプロテインＡが破過するまで溶液を送液した後、多孔質モノリス型有機高分子担体を３０℃で２４時間静置し、プロテインＡを固定化した。
反応後、反応溶液、水の順にそれぞれ２０ｍＬ以上送液し、多孔質モノリス型有機高分子担体を洗浄した。
プロテインＡの固定化量を、実施例１と同様の手法で算出した。

【0075】

「未反応Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルのアミド基への変換」
プロテインＡを固定化した多孔質モノリス型有機高分子担体に対し、水を１０ｍＬ送液した後、０．５ｍｏｌ／Ｌ エタノールアミン−２０ｍＭトリス緩衝液を１０ｍＬ送液し、１０分間静置することで、残存したＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルをアミド基へと変換した。
反応後、水、２０％エタノール−２０ｍＭトリス緩衝液の順にそれぞれ２０ｍＬ以上送液した後、多孔質モノリス型有機高分子担体を４℃に保った。
以上により、比較例３のプロテインＡ固定化多孔質モノリス型有機高分子担体を得た。

【0076】

「ＤＢＣ測定、結果」
実施例１と同様にして、比較例３のプロテインＡ固定化多孔質モノリス型有機高分子担体について、ＩｇＧの吸着・溶出試験を行なった。
その結果、ＩｇＧのＤＢＣ１０は５．４ｍｇ／ｍＬ−ゲル、ＩｇＧのＤＢＣ５０は６．３ｍｇ／ｍＬ−ゲルであった。
以上の結果から、プロテインＡの固定化反応時の反応溶液を酸性にすると、末端にヒスチジンタグを有するプロテインＡの固定化効率が低下し、ＤＢＣ向上効果がないことが分かった。結果を表２に示す。

【0077】

【表1】

【0078】

【表2】

【産業上の利用可能性】

【0079】

本発明のプロテインＡ固定化有機高分子担体の製造方法は、多孔質モノリス型有機高分子担体の表面修飾効率を向上することができるため、バイオ医薬品分野において好適に用いられる。

【図1】