特許 6579862 レンチナン含量が高いシイタケ

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6579862

(24)【登録日】2019年9月6日

(45)【発行日】2019年9月25日

(54)【発明の名称】レンチナン含量が高いシイタケ

(51)【国際特許分類】

   C12N 1/14 20060101AFI20190912BHJP

   C12P 1/02 20060101ALI20190912BHJP

   C12Q 1/6895 20180101ALI20190912BHJP

   C12N 15/56 20060101ALI20190912BHJP

   A61K 36/07 20060101ALI20190912BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20190912BHJP

   A61P 37/04 20060101ALI20190912BHJP

   A61K 31/716 20060101ALI20190912BHJP

   C12N 9/24 20060101ALI20190912BHJP

【ＦＩ】

   C12N1/14 FZNA

   C12P1/02 B

   C12Q1/6895 Z

   C12N15/56

   A61K36/07

   A61P35/00

   A61P37/04

   A61K31/716

   C12N9/24

【請求項の数】6

【全頁数】20

(21)【出願番号】特願2015-167693(P2015-167693)

(22)【出願日】2015年8月27日

(65)【公開番号】特開2016-47047(P2016-47047A)

(43)【公開日】2016年4月7日

【審査請求日】2018年4月9日

(31)【優先権主張番号】特願2014-173214(P2014-173214)

(32)【優先日】2014年8月27日

(33)【優先権主張国】JP

【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ ａｎｄ Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ２０１４， Ｖｏｌ．６２， Ｎｏ．３２， ｐ．８１５３−８１５７に発表

【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２３年度、独立行政法人科学技術振興機構研究成果展開事業、研究成果最適展開支援プログラム、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願

【微生物の受託番号】NPMD  NITE P-01865

(73)【特許権者】

【識別番号】390025793

【氏名又は名称】岩手県

(73)【特許権者】

【識別番号】000242024

【氏名又は名称】株式会社北研

(74)【代理人】

【識別番号】100091096

【弁理士】

【氏名又は名称】平木 祐輔

(74)【代理人】

【識別番号】100118773

【弁理士】

【氏名又は名称】藤田 節

(74)【代理人】

【識別番号】100144794

【弁理士】

【氏名又は名称】大木 信人

(72)【発明者】

【氏名】坂本 裕一

(72)【発明者】

【氏名】佐藤 志穂

(72)【発明者】

【氏名】枝 克昌

(72)【発明者】

【氏名】山内 隆弘

(72)【発明者】

【氏名】金野 尚武

(72)【発明者】

【氏名】後藤 史和

【審査官】 福澤 洋光

(56)【参考文献】

【文献】 特開２００７−３１２６１８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００６−２７１２１８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 日本農芸化学会２０１３年度大会講演要旨集（オンライン），２０１３年 ３月 ５日，p. 2C16A05 (WEB ONLY)

【文献】 J. Agric. Food Chem.，２０１０年，Vol. 58，pp. 4331-4335

【文献】 木材保存，２０１３年，Vol.39, No.2，p.60-70

【文献】 神戸大学農学部学術報告，２００２年 ２月，Vol. 26，pp. 39-42

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １／００−１５／９０

Ｃ１２Ｐ １／００−４１／００

Ｃ１２Ｑ １／００− ３／００

ＣＡ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

子実体におけるレンチナン含量が従来品種と比べて増大している、シイタケ菌であって、
ｅｘｏ‐β‐１，３‐グルカナーゼ（ＥＸＧ２）のアミノ酸配列において、７１０番目のアミノ酸残基がアスパラギン酸への置換を含む、変異型ＥＸＧ２を有する、前記シイタケ菌。

【請求項2】

子実体におけるレンチナン含量が従来品種と比べて、２倍以上である、請求項１に記載のシイタケ菌。

【請求項3】

収穫後４日における子実体におけるレンチナン残存率が８０％以上である、請求項１又は２に記載のシイタケ菌。

【請求項4】

ＮＩＴＥ Ｐ−０１８６５として寄託されたものである、請求項１〜３のいずれか１項に記載のシイタケ菌。

【請求項5】

請求項１〜４のいずれか１項に記載のシイタケ菌を栽培して子実体を形成させ、該子実体を回収することを含む、レンチナンの製造方法。

【請求項6】

子実体におけるレンチナン含量が従来品種と比べて増大しているシイタケ菌の検出方法であって、ＥＸＧ２のアミノ酸配列において、７１０番目のアミノ酸残基における置換変異の有無を検出し、７１０番目のアミノ酸残基にアスパラギン酸への置換変異が存在する場合、子実体におけるレンチナン含量が従来品種と比べて増大しているシイタケ菌であると認定する工程を含む、上記方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、子実体におけるレンチナン含量が高いシイタケ菌に関する。

【0002】

また、本発明は、収穫後の子実体におけるレンチナンの分解が抑制されたシイタケ菌に関する。

【背景技術】

【0003】

シイタケ（Ｌｅｎｔｉｎｕｌａ ｅｄｏｄｅｓ）は、担子菌類のキシメジ科シイタケ属に属し、古くから現在に至るまで、優秀な食用菌として用いられ、日本においては古来より栽培されている。

【0004】

シイタケに含まれるβ−１，３−１，６−グルカンであるレンチナンは、摂取により免疫機能を活性化させ、抗癌活性を示すことが知られており（非特許文献１）、今日では抗ガン剤の有効成分として認可され、実際に臨床で使用されている。

【0005】

しかしながら、レンチナンはシイタケの収穫後〜保存過程において、ｅｘｏ‐β‐１，３‐グルカナーゼ（ＥＸＧ２）の働きにより分解されてしまうために、収量が一定しない、又は収量が十分でないといった問題があった。

【0006】

当該分野においては、レンチナンの分解を抑制し、レンチナンを効率的に製造することができる新たな手段が求められていた。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0007】

【非特許文献1】千原吾郎、２．レンチナン．キノコの化学、生化学．水野卓、川合正允編、学会出版センター東京．３２３−３３３（１９９２）

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

本発明は、子実体におけるレンチナン含量が高いシイタケ菌を提供することを目的とする。

【0009】

また、本発明は、収穫後の子実体におけるレンチナンの分解が抑制されたシイタケ菌を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0010】

本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究した結果、変異型のＥＸＧ２を有するシイタケ菌が、子実体における高いレンチナン含量を有すること、並びに、収穫後の子実体におけるレンチナンの分解が抑制されていることを見出し、本発明を完成させるに至った。

【0011】

すなわち、本発明は、以下の特徴を有する。
［１］ 子実体におけるレンチナン含量が従来品種と比べて増大している、シイタケ菌。
［２］ 子実体におけるレンチナン含量が従来品種と比べて、２倍以上である、［１］のシイタケ菌。
［３］ 収穫後４日における子実体におけるレンチナン残存率が８０％以上である、［１］又は［２］のシイタケ菌。
［４］ ｅｘｏ‐β‐１，３‐グルカナーゼ（ＥＸＧ２）のアミノ酸配列において、７１０番目のアミノ酸残基における置換変異を含む、変異型ＥＸＧ２を有する、［１］〜［３］のいずれかのシイタケ菌。
［５］ 変異型ＥＸＧ２が、７１０番目のアミノ酸残基がアスパラギン酸への置換を含む、［４］のシイタケ菌。
［６］ ＮＩＴＥ Ｐ−０１８６５として寄託されたものである、［１］〜［５］のいずれかのシイタケ菌。
［７］ ［１］〜［６］のいずれかのシイタケ菌を栽培して子実体を形成させ、該子実体を回収することを含む、レンチナンの製造方法。
［８］ 子実体におけるレンチナン含量が従来品種と比べて増大しているシイタケ菌の検出方法であって、ＥＸＧ２のアミノ酸配列において、７１０番目のアミノ酸残基における置換変異の有無を検出し、７１０番目のアミノ酸残基に置換変異が存在する場合、子実体におけるレンチナン含量が従来品種と比べて増大しているシイタケ菌であると認定する工程を含む、上記方法。
［９］ ７１０番目のアミノ酸残基における置換変異が、アスパラギン酸への置換である、［８］の方法。

【発明の効果】

【0012】

本発明によれば、子実体におけるレンチナン含量が高いシイタケ菌を提供することができる。

【0013】

また、本発明によれば、収穫後の子実体におけるレンチナンの分解が抑制されたシイタケ菌を提供することができる。

【図面の簡単な説明】

【0014】

【図1】図１は野生型ＥＸＧ２の立体構造及び７１０番目のアミノ酸残基の位置を示す模式図である。

【図2】図２はＴＩＬＬＩＮＧ法によるｅｘｇ２遺伝子変異株の検出結果を示す。左半分と右半分で同じ菌株に由来するＰＣＴ産物が電気泳動されており、「７００」は蛍光ダイラベルにて５’末端標識したＰＣＲ産物、「８００」は蛍光ダイラベルにて３’末端標識したＰＣＲ産物を示す。丸印は変異の発生を示す。

【図3】図３はＭｕ７８９株のｅｘｇ２遺伝子の塩基配列（配列番号３）を示す。下線は変異部位を示す。

【図4】図４は野生型のＥＸＧ２のアミノ酸配列（配列番号１）とＭｕ７８９株のＥＸＧ２のアミノ酸配列（配列番号２）のアライメント結果を示す。

【図5】図５は、変異検出用プライマーを用いたＰＣＲ法によるｅｘｇ２遺伝子変異株の検出結果を示す。各レーンについて、ＰＣＲに用いたプライマーと菌株を以下に示す。レーン１：変異検出用プライマー、野生型菌株、レーン２：コントロールプライマー、野生型菌株、レーン３：変異検出用プライマー、野生型菌株、レーン４：変異検出用プライマー、野生型菌株、レーン５：変異検出用プライマー、Ｍｕ７８９型菌株、レーン６：コントロールプライマー、Ｍｕ７８９型菌株、レーン７：変異検出用プライマー、Ｍｕ７８９型菌株、レーン８：コントロールプライマー、Ｍｕ７８９型菌株。Ｍ：マーカー。

【図6】図６は、変異型のｅｘｇ２遺伝子をホモに持つ菌株（ａ，ｂおよびｃ）、野生型のｅｘｇ２遺伝子をホモに持つ菌株（ｄ，ｅ，ｆおよびｇ）、ならびにｅｘｇ２の変異をヘテロに持つＭｕ７８９株（ｈ）の子実体の収穫した直後（Ｄ０）及び収穫から４日目（Ｄ４）におけるグルカナーゼ活性の測定結果を示す。

【図7】図７は、変異型のｅｘｇ２遺伝子をホモに持つ菌株（ａ，ｂおよびｃ）、野生型のｅｘｇ２遺伝子をホモに持つ菌株（ｄ，ｅ，ｆおよびｇ）、ならびにｅｘｇ２の変異をヘテロに持つＭｕ７８９株（ｈ）の子実体の収穫から４日目（Ｄ４）におけるＥＸＧ２発現量の測定結果を示す。

【発明を実施するための形態】

【0015】

１．本発明のシイタケ菌
本発明のシイタケ菌は、子実体におけるレンチナン含量が従来品種と比べて増大していることを特徴とする。

【0016】

本発明において「シイタケ菌」とは、特記しない限り、子実体、担子胞子、一次菌糸、二次菌糸等、シイタケの生活環に含まれる任意の形態やその一部（プロトプラストを含む）を意味する。

【0017】

本発明において「子実体におけるレンチナン含量が従来品種と比べて増大している」とは、子実体に含まれるレンチナン量が、従来品種の子実体に含まれるレンチナン量と比べて顕著に高い、例えば、１．５倍以上、１．６倍以上、１．７倍以上、１．８倍以上、１．９倍以上、２倍以上、又はそれ以上であることを意味する。

【0018】

本明細書において「従来品種」とは、従来公知のシイタケ菌が挙げられ、例えば、公知の、市販若しくは登録品種、野生株、突然変異株、及び遺伝子組換え株が挙げられる。従来品種として、例えば、市販株Ｈ６００株、ＳＲ−１株（品種登録番号１８２４７）、ＥＸＧ２抑制遺伝子組換え株（ｉｖｒ−ｅｘｇ２株：特開２００６−２７１２１８号公報）等が挙げられるが、これらに限定はされない。以下、本明細書において「従来品種」とは、同じ意味で使用する。

【0019】

子実体におけるレンチナン含有量はタンパク質定量に用いられる公知の手法（例えば、ウェスタンブロッティング法、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）等）により測定することができる。好ましくは、ＥＬＩＳＡ法を利用する。ＥＬＩＳＡ法にて使用する抗レンチナン抗体はモノクローナル抗体であってもポリクローナル抗体であってもよい。ＥＬＩＳＡ法は、２種類のモノクローナル抗体を使用するサンドイッチＥＬＩＳＡ法を用いてもよい。収穫直後の子実体及び収穫から４日後の子実体をそれぞれ分析試料とし、破砕した分析試料より水系溶媒を用いてタンパク質を抽出し試料原液を得、これを定量性を示す濃度まで希釈（例えば、原液から１０００倍希釈、好ましくは１０倍希釈から１０００倍希釈、より好ましくは原液〜１００倍希釈、さらに好ましくは、原液〜５０倍希釈）してＥＬＩＳＡ法に供することができる。

【0020】

好ましくは、本発明のシイタケ菌は、収穫直後の子実体（乾燥重量）において、およそ６ｍｇ／ｇ以上、およそ７ｍｇ／ｇ以上、およそ８ｍｇ／ｇ以上、およそ９ｍｇ／ｇ以上、又は、およそ１０ｍｇ／ｇ以上の量にてレンチナンを含有する。

【0021】

また、本発明のシイタケ菌は、収穫から４日後の子実体におけるレンチナン残存率がおよそ８０％、およそ８５％、およそ９０％、又はそれ以上である。子実体におけるレンチナン残存率は、収穫直後の子実体におけるレンチナン含量及び、収穫から４日後の子実体におけるレンチナン含量をそれぞれ同様に測定し、求められたこれらの値から残存率を得ることができる。

【0022】

さらに、本発明のシイタケ菌は、変異型ＥＸＧ２を有する。変異型ＥＸＧ２は、７１０番目のアミノ酸残基における置換変異を含む。７１０番目のアミノ酸残基は野生型ＥＸＧ２の立体構造において、活性中心に存在し（図１）、７１０番目のアミノ酸残基における置換変異はＥＸＧ２の活性に影響を及ぼし得る。また、７１０番目のアミノ酸残基における置換変異はＥＸＧ２の発現量を低下させ、それによって子実体におけるＥＸＧ２の活性を低下させ得る。

【0023】

本発明において、変異型ＥＸＧ２は、野生型ＥＸＧ２のアミノ酸配列において７１０番目のアミノ酸残基が、アスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、アルギニン、ヒスチジン、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、アスパラギン、グルタミンに、好ましくは、アスパラギン酸又はグルタミン酸に、特に好ましくはアスパラギン酸に置換されたアミノ酸配列を有する。変異型ＥＸＧ２は７１０番目のアミノ酸残基以外にも、一又は複数のアミノ酸残基が、欠失、置換、挿入及び／又は付加されてなる変異を有していてもよい。

【0024】

本発明における「シイタケ菌」には、子実体におけるレンチナン含量が従来品種と比べて増大している特徴を有する限り、本発明のシイタケ菌と、同一若しくは異なる近交系や従来品種との交配により得られたシイタケ菌も含まれる。

【0025】

さらに、本発明のシイタケ菌には、ＮＩＴＥ Ｐ−０１８６５として寄託されたシイタケ菌も含まれる。

【0026】

本発明のシイタケ菌は、シイタケ菌の一般的な栽培方法に従って栽培・繁殖させることができる。

【0027】

２．本発明のシイタケ菌の製造方法
本発明のシイタケ菌は、突然変異誘発法や遺伝子組換え手法を利用して製造することができる。

【0028】

突然変異誘発法を利用する方法においては、担子胞子、または一次菌糸、二次菌糸、若しくはそれらのプロトプラストの形態を有するシイタケ菌を、公知の突然変異誘発処理（例えば、突然変異誘発剤（メタンスルホン酸エチル（ＥＭＳ）、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）等）を用いた化学的処理や、照射線（ＵＶ線、γ線、Ｘ線、重イオンビーム（窒素イオンビーム、炭素イオンビーム、ネオンイオンビーム、アルゴンイオンビームなど））等を用いた物理的処理）に付すことにより行うことができる。

【0029】

突然変異誘発に用いるシイタケ菌は特定の品種に限定されることなく、従来品種又は従来品種に由来するものを利用することができる。シイタケ菌は、二次菌糸又はそのプロトプラストの形態のシイタケ菌を利用することが好ましい。二核菌糸体を用いることで、片核のどちらかのリーサルな遺伝子に変異が入った場合でも、もう一方の核が存在するために生存可能となる確立が増し、強い変異処理を与えることが可能となる。

【0030】

突然変異誘発剤の使用量や照射線の照射条件は、用いる突然変異誘発剤や照射線の種類や対象となるシイタケ菌の形態や量などに応じて適宜決定することができ、突然変異誘発処理されたシイタケ菌の生存率や正常生育率を目安として、決めることができる。例えば、二次菌糸のプロトプラストに対して、ＵＶ線を照射して突然変異誘発処理を行う場合、処理されたシイタケ菌の生存率が１％程度となるように、ＵＶ線を照射することができる。

【0031】

変異誘発処理されたシイタケ菌は通常のシイタケ栽培の手順で栽培することができ、以下に記載する評価選抜方法によって、子実体におけるレンチナン含量が増大されている目的のシイタケ菌を選抜することができる。

【0032】

遺伝子組換え手法を利用する方法においては、シイタケ菌のＥＸＧ２のアミノ酸配列において一又は複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加が生じるように、ＥＸＧ２をコードする遺伝子（以下、「ｅｘｇ２遺伝子」と記載する。）に変異を導入することにより行うことができる。ｅｘｇ２遺伝子に導入される変異は、ＥＸＧ２のアミノ酸配列に上記変異を生じるものである限り特に限定されず、一又は複数の塩基を置換、欠失、挿入、及び／又は付加することにより行うことができる。具体的には、シイタケ菌のＥＸＧ２のアミノ酸配列における７１０番目のアミノ酸残基が、アスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、アルギニン、ヒスチジン、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、アスパラギン、グルタミンに、好ましくは、アスパラギン酸又はグルタミン酸に置換されるように、特に好ましくは、７１０番目のアミノ酸残基がアスパラギン酸に置換されるように、ｅｘｇ２遺伝子の７１０番目のアミノ酸をコードする塩基配列に変異を導入する。

【0033】

ｅｘｇ２遺伝子への変異の導入は相同組換え手法を利用する公知の手法により行うことができる。例えば、相同組換え法によるダブルクロスオーバー等が挙げられる。簡単に説明すると、宿主となるシイタケ菌に由来するｅｘｇ２遺伝子を、遺伝子導入のために当業者に公知である一般的なベクターにクローニングする。シイタケ菌のｅｘｇ２遺伝子は、公開されたデータベース（Ｇｅｎｂａｎｋ等）に開示されており（例えばＡＢ１９２３４５）、本発明においてはこれらの遺伝子配列情報を利用することができる。例えば、本発明において、ｅｘｇ２遺伝子として、以下（ａ）−（ｃ）のポリペプチドをコードする塩基配列を含むか、当該塩基配列よりなるものを利用することができる：
（ａ） 配列番号１で示されるアミノ酸配列を含むか、当該アミノ酸配列よりなるポリペプチド；
（ｂ） 配列番号１で示されるアミノ酸配列において、一又は複数個のアミノ酸の欠失、置換、挿入及び／又は付加を有するアミノ酸配列を含むか当該アミノ酸配列よりなり、かつレンチナン分解活性を有するポリペプチド；
（ｃ） 配列番号１で示されるアミノ酸配列と、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むか当該アミノ酸配列よりなり、かつレンチナン分解活性を有するポリペプチド。

【0034】

ここで、「複数個」とは、１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、または２個を意味する。また、アミノ酸配列の比較は、公知の手法によって行うことができ、例えば、ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ ａｔ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（米国国立生物学情報センターの基本ローカルアラインメント検索ツール））等を例えば、デフォルトの設定で用いて実施できる。さらに、「レンチナン分解活性」は、公知の手法を用いて測定することが可能であり、すなわち、ソモギネルソン法により行うことができる。

【0035】

ｅｘｇ２遺伝子は塩基配列情報に基づいてプライマー又はプローブを設計・合成し、当該プライマー又はプローブを用いて宿主となるシイタケ菌に由来するｃＤＮＡライブラリ又はゲノムライブラリをスクリーニングすることにより得ることができる。

【0036】

ベクターとしては、シイタケ菌の形質転換用として一般的に公知であるベクターであれば良く、例えば、ｐＬＧベクター（特開２０００−０６９９７５号公報、特開２００１−１５７５８６号公報、Ｈｉｒａｎｏ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２６３，１０４７−１０５２、２０００）、ｐＬＴベクター、ｐＣＨＳベクター、ｐＣｈＧベクター（特開２００１−３２１１８２号公報）、ｐＣｈＧ−Ｇａｔｅｗａｙ（農芸化学会２０１３年度大会、２Ｃ１６ａ０５）などを好適に利用できる。

【0037】

クローニングされたｅｘｇ２遺伝子の塩基配列に変異を導入し、変異を有するｅｘｇ２遺伝子を含むＤＮＡ構築物を調製する。変異の導入は例えば、ＰＣＲ法に基づく変異導入法などを利用することができる。このＤＮＡ構築物を宿主となるシイタケ菌に導入することにより、ＤＮＡ構築物上の変異を有するｅｘｇ２遺伝子と当該宿主染色体上のｅｘｇ２遺伝子とが相同組換えを生じ、宿主のｅｘｇ２遺伝子に変異を導入することができる。

【0038】

上記のようにして構築したベクターを宿主となるシイタケ菌へ導入する形質転換法としては、ポリエチレングリコール法、エレクトロポレーション法、ＲＥＭＩ法（Ｓａｔｏ，Ｔ．ｅｔ． ａｌ．，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６２，２３４６−２３５０，（１９９８）、及び特開平１１−１５５５６８号）等、シイタケ菌にベクターを導入することが可能な公知の手法を用いて行うことができる。

【0039】

例えば、本発明において、変異を有するｅｘｇ２遺伝子としては、ＥＸＧ２は７１０番目のアミノ酸残基が、アスパラギン酸に置換されている変異型ＥＸＧ２、すなわち以下（ａ’）−（ｃ’）のポリペプチドをコードする塩基配列を含むか、当該塩基配列よりなるものを利用することができる：
（ａ’） 配列番号２で示されるアミノ酸配列を含むか、当該アミノ酸配列よりなるポリペプチド；
（ｂ’） 配列番号２で示されるアミノ酸配列において、一又は複数個のアミノ酸の欠失、置換、挿入及び／又は付加を有するアミノ酸配列を含むか当該アミノ酸配列よりなるポリペプチド；
（ｃ’） 配列番号２で示されるアミノ酸配列と、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むか当該アミノ酸配列よりなるポリペプチド。

【0040】

ただし、上記（ｂ’）及び（ｃ’）のポリペプチドは、７１０番目のアミノ酸残基がアスパラギン酸として維持／保持されており、野性型のＥＸＧ２（例えば、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド）と比べて、レンチナン分解活性が低下している、又は欠失している。

【0041】

「レンチナン分解活性が低下している」とは、野性型のＥＸＧ２（例えば、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド）のレンチナン分解活性の６０％以下、５０％以下、４０％以下、３０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下のレンチナン分解活性を有することを意味する。

【0042】

このような変異型ＥＸＧ２をコードする、変異を有するｅｘｇ２遺伝子としては、例えば以下の塩基配列を含むか、当該塩基配列よりなるものを利用することができる：
（ａ’’） 配列番号３で示される塩基配列；
（ｂ’’） 配列番号３で示される塩基配列において、１から数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を有する塩基配列；
（ｃ’’） 配列番号３で示される塩基配列に相補的な配列からなる塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な塩基配列；
（ｄ’’） 配列番号３で示される塩基配列と、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上の同一性を有する塩基配列。

【0043】

ここで「１から数個」の範囲は特には限定されないが、例えば、１から２０個、好ましくは１から１０個、より好ましくは１から７個、さらに好ましくは１から５個、特に好ましくは１から３個、あるいは１個又は２個である。また、「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいい、例えば、ナトリウム濃度が、１０ｍＭ〜３００ｍＭ、好ましくは２０〜１００ｍＭであり、温度が２５℃〜７０℃、好ましくは４２℃〜５５℃での条件をいう。

【0044】

ただし、上記（ｂ’’）、（ｃ’’）及び（ｄ’’）の塩基配列は、２１２８−２１３０番目の塩基からなるコドンはアスパラギン酸をコードするものとして維持／保持されており、野性型のＥＸＧ２（例えば、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド）と比べて、レンチナン分解活性が低下している、又は欠失しているポリペプチドをコードする。

【0045】

このようにして得られた変異が導入された遺伝子組換えシイタケ菌は通常のシイタケ栽培の手順で栽培することができ、以下に記載する評価選抜方法によって、子実体におけるレンチナン含量が増大されている目的のシイタケ菌を得ることができる。

【0046】

３．本発明のシイタケ菌の評価選抜方法
上記手法により製造されたシイタケ菌より、子実体におけるレンチナン含量が増大されている目的のシイタケ菌を以下の手法により評価・選抜することができる。

【0047】

評価・選抜の手法は、目的のシイタケ菌を検出できる方法であればよく、特に限定されないが以下の手法を組み合わせて用いることによって、効率的に目的のシイタケ菌を評価・選抜することができる。

【0048】

（１ｓｔ．スクリーニング：ｅｘｇ２遺伝子における変異の検出）
ｅｘｇ２遺伝子における変異の有無の確認は、塩基配列の解析に用いられる公知の手法を用いて行うことができるが、ＴＩＬＬＩＮＧ（Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｌｏｃａｌ Ｌｅｓｉｏｎｓ Ｉｎ Ｇｅｎｏｍｅｓ）法を用いることによって、多数の検体を処理することが可能であり、集団の中からｅｘｇ２遺伝子に変異を有する菌株が存在するか否かを容易に識別でき、効率的にｅｘｇ２遺伝子に変異を有する菌株を選抜することができる。ＴＩＬＬＩＮＧ法は公知の手法で行うことができる。すなわち、上記手法により製造されたシイタケ菌のＤＮＡを鋳型として、ｅｘｇ２遺伝子に特異的なプライマーを用いてＰＣＲを行い、ｅｘｇ２遺伝子のＤＮＡ断片を得る。得られたｅｘｇ２遺伝子のＤＮＡ断片を、別個の２〜３株より同様に調製されたｅｘｇ２遺伝子のＤＮＡ断片と合わせるか、野生型のｅｘｇ２遺伝子のＤＮＡ断片と合わせ、熱変性して一本鎖とした後、再度アニーリングさせる。この時、変異を有するＤＮＡ断片が存在する場合には、変異型ＤＮＡ断片と野生型ＤＮＡ断片との間で塩基対のミスマッチが生じる。アニーリングさせたＤＮＡ断片をミスマッチ塩基対を認識して切断する酵素（例えばＣＥＬ１等）で処理することによって、塩基対を形成していない部位のみが切断され、増幅したＤＮＡ断片とは異なる長さのＤＮＡ断片が生成される。酵素処理後のＤＮＡ断片を電気泳動し、異なる長さのＤＮＡ断片を検出することによって、ｅｘｇ２遺伝子に変異を有する菌株を選抜することができる。

【0049】

ｅｘｇ２遺伝子に変異を有する菌株を選抜した後、選抜された菌株を以下の２ｎｄ．スクリーニングに付すことにより、目的のシイタケ菌を効率的に評価・選抜することができる。

【0050】

（２ｎｄ．スクリーニング：子実体におけるレンチナン含有量の測定）
子実体におけるレンチナン含有量は、上記手法により測定することができる。本発明においては、収穫直後の従来品種の子実体と比較して、収穫直後の子実体におけるレンチナン含有量が多い場合に、目的のシイタケ菌として評価・選抜することができる。好ましくは上記手法により測定された、収穫直後のレンチナン含有量が、同様に測定された従来品種の収穫直後の子実体におけるレンチナン含有量と比較して、１．５倍以上、１．６倍以上、１．７倍以上、１．８倍以上、１．９倍以上、２倍以上、又はそれ以上であるシイタケ菌を選抜する。

【0051】

あるいは、本発明においては、収穫直後の子実体（乾燥重量）におけるレンチナン含量が、およそ６ｍｇ／ｇ以上、およそ７ｍｇ／ｇ以上、およそ８ｍｇ／ｇ以上、およそ９ｍｇ／ｇ以上、又は、およそ１０ｍｇ／ｇ以上の量にてレンチナンを含有するシイタケ菌を選抜する。

【0052】

また、本発明においては、収穫から４日後の子実体におけるレンチナン残存率が、およそ８０％、およそ８５％、およそ９０％、又はそれ以上であるシイタケ菌を選抜する。

【0053】

このようにして得られた目的のシイタケ菌は通常のシイタケ栽培の手順で栽培することができ自殖交配を行い得られたシイタケ菌に対して、さらに上記の評価選抜を行う。この工程を一以上繰り返すことによって、子実体におけるレンチナン含量が安定して増大されている目的のシイタケ菌系統を得ることができる。

【0054】

４．本発明のシイタケ菌の検出方法
上記手法により製造・確立された後は、本発明のシイタケ菌はＰＣＲ法によりｅｘｇ２遺伝子における変異の有無を確認することによって検出することができる。ｅｘｇ２遺伝子における変異とは、ＥＸＧ２のアミノ酸配列における７１０番目のアミノ酸残基が、アスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、アルギニン、ヒスチジン、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、アスパラギン、グルタミンに、好ましくは、アスパラギン酸又はグルタミン酸に置換される変異、特に好ましくは、７１０番目のアミノ酸残基がアスパラギン酸に置換される変異を意味する。好ましくは、ｅｘｇ２遺伝子における、２１２８番目の塩基置換、より好ましくは２１２８番目の塩基のグアニンへの置換を意味する。

【0055】

ＰＣＲ法は、変異検出用のプライマーを用いて行うことができ、変異検出用のプライマーは、フォワードプライマー又はリバースプライマーの３’末端にｅｘｇ２遺伝子における変異塩基を含む。変異検出用のプライマーは、変異塩基の３’側にさらに一又は複数の塩基が付加されていてもよい。ここで「複数」とは２〜３個を意味する。付加される塩基は、プライマーが鋳型ＤＮＡにアニーリングした際に、野生型の鋳型ＤＮＡと塩基対を形成しない塩基が好ましい。プライマーとしては、例えば、下記実施例にて詳述される配列番号１０及び配列番号１１で表わされる塩基配列からなるものを使用することができる。

【0056】

ＰＣＲ条件は、変異型のｅｘｇ２遺伝子を選択的に増幅・検出できる条件であればよく、特に限定されることなく適宜決定することができる。

【実施例】

【0057】

以下に実施例を示し、本発明をさらに詳しく説明する。しかしながら、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。

【0058】

１．変異株の作出
（種菌）
種菌（親株）として、公益財団法人岩手生物工学研究センター保有の交雑株、シイタケ（Ｌｅｎｔｉｎｕｌａ ｅｄｏｄｅｓ）ＳＲ−１株（二核菌糸体）を使用した。

【0059】

種菌は９ｃｍシャーレに作製した０．２５×ＭＹＰＧ寒天培地（０．２５％麦芽エキス，０．１％酵母エキス，０．１％ペプトン，０．５％グルコース，１．５％アガー）に植菌し、２３℃で静置培養を行い、以下の実験に用いた。

【0060】

（プロトプラストの調製）
種菌の菌糸を寒天培地より薄く掻き取り、寒天培地８枚分の菌糸を１００ｍｌの０．２５×ＭＹＰＧ液体培地（２本）へ植菌し２３℃、１７０ｒｐｍにて２週間振とう培養を行った。培養後にガラスフィルター（ガラス濾過器Ｐ２５０、柴田科学）によって菌糸を回収し、０．５×ＭＹＰＧ液体培地（０．５％麦芽エキス，０．２％酵母エキス，０．２％ペプトン，１．０％グルコース）へ移した。

【0061】

次いで、菌糸をポリトロンホモジナイザーを用いて破砕し、φ１００μｍカットのセルストレイナーに通しφ１００μｍ以下の菌糸だけを回収し、それを０．５×ＭＹＰＧ液体培地（０．５％麦芽エキス，０．２％酵母エキス，０．２％ペプトン，１．０％グルコース）中、２５℃にて６日間、静置培養を行った（２５ｍｌ×８枚シャーレ）。

【0062】

静置培養後、菌糸をφ１００μｍカットのセルストレイナーで回収し、５０Ｓ−０．６Ｍバッファー［５０ｍＭコハク酸エステル，０．６Ｍマンニトール（ｐＨ５．６）］で洗浄し、再度φ１００μｍカットのセルストレイナーで菌糸を回収した。

【0063】

回収後の菌糸は重量を測定した後、菌糸１ｇに対して１０ｍｌの酵素液［２．５％Ｃｅｌｌｕｌａｓｅ Ｏｎｏｚｕｋａ ＲＳ（Ｙａｋｕｌｔ）、４．２Ｕ Ｃｈｉｔｉｃａｓｅ（Ｓｉｇｍａ）／５０Ｓ−０．６Ｍ バッファー］を加えて懸濁し、２８℃にて４時間振とうすることで酵素反応を行った。

【0064】

酵素反応後、酵素処理液を４０μｍのセルストレイナーで濾過し、菌糸の残渣を取り除いた後、２７００ｒｐｍの低速で１０分間遠心分離して上清を取り除き、プロトプラストを回収した。

【0065】

回収したプロトプラストを、ＳＴＣバッファー［１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１０ｍＭ ＣａＣｌ_２，１．２Ｍソルビトール］に再懸濁し、プロトプラスト液を得た。

【0066】

プロトプラスト液はヘマトメーターを用いてプロトプラストの計測を行い、最終的に１×１０^７個／１００μｌとなるように調整した。

【0067】

（変異株の作出）
プロトプラスト液に対しＵＶを照射し、変異株を作出した。ＳＲ−１株はプロトプラスト化することで、核の構成をそのまま維持する二核菌糸体と、片方の核が脱落する一核菌糸体が得られるが、本実験では、二核菌糸体を用いた。

【0068】

ＵＶ照射の条件は、プロトプラストの生存率が約１％となるように設定した。一般的に、プロトプラストの再生率は約１％となることから、１×１０^７個のプロトプラストにＵＶを照射し、再生するプロトプラストが１０００個程度となるようなＵＶ照射の条件を設定した。具体的には、東芝社製殺菌ランプ（ＴＯＳＨＩＢＡ ＧＬ１５）を使用し、光源から約４０ｃｍの位置で３分間ＵＶ照射を行った。

【0069】

（ＴＩＬＬＩＮＧ法によるｅｘｇ２遺伝子変異株の検出方法）
菌糸からのゲノムＤＮＡの回収はＤＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いた。手順はＱｉａｇｅｎのプロトコールに従って行った。

【0070】

ＴＩＬＬＩＮＧ用の１ｓｔ ＰＣＲのためのプライマーには、以下のプライマーセットを使用した。

【0071】

プライマーセットの配列は下記の通り。
フォワードプライマー：ＧＣＴＡＣＧＧＡＣＴＧＡＣＣＴＣＧＧＡＣＡＧＣＡＧＣＡＴＧＴＴＴＴＧＣＣＴＣＴＴ （配列番号４）
リバースプライマー：ＣＴＧＡＣＧＴＧＡＴＧＣＴＣＣＴＧＡＣＧＡＣＡＧＧＧＡＣＧＴＣＡＴＴＴＣＧＴＧＴ （配列番号５）

【0072】

１ｓｔ ＰＣＲはＥｘＴａｑ（ＴａＫａＲａ）を用いて行った。組成と反応条件を以下に示す：
ＴＩＬＬＩＮＧ用のＰＣＲ組成［１０×ＥｘＴａｑバッファー ２μｌ、２．５ｍＭ ｄＮＴＰ ｍｉｘ １．６μｌ、フォワードプライマー（１０μＭ）０．２μｌ，リバースプライマー（１０μＭ）０．２μｌ、精製後ＤＮＡ（３μｌ）、１２．９μｌ滅菌水、Ｅｘ Ｔａｑ ０．１μｌ／合計２０μｌ］
ＰＣＲ反応条件：［９５℃ ２分間、（９５℃ １分間、５５℃ １分間、７２℃ １分３０秒間）×３５サイクル、７２℃ ７分間、１０℃にて保管］。

【0073】

１ｓｔ ＰＣＲ後のＰＣＲ産物はｉｌｌｕｓｔｒａ ＥｘｏＰｒｏＳｔａｒ（ＧＥ）を用いて精製した。精製方法を以下に示す。
ＥｘｏＰｒｏＳｔａｒは２０倍に希釈し、使用した。（５０μｌエキソヌクレアーゼＩ、５０μｌアルカリフォスフォターゼ、９００μｌ水）

【0074】

ＰＣＲ産物２μｌと希釈液２μｌを混合し、３７℃で３０分間、酵素反応を行い、その後８５℃で１０分間、酵素を失活させた。反応液に９６μｌの水を加えて２５倍に希釈し、２ｎｄ ＰＣＲのテンプレートとした。

【0075】

２ｎｄ ＰＣＲの蛍光プライマーは以下のプライマーセットを用いた。
プライマーセットの配列は下記の通り。
フォワードプライマー：ＧＣＴＡＣＧＧＡＣＴＧＡＣＣＴＣＧＧＡＣ （配列番号６）
リバースプライマー：ＣＴＧＡＣＧＴＧＡＴＧＣＴＣＣＴＧＡＣＧ （配列番号７）

【0076】

蛍光ラベルしたプライマーはＵｎｉ Ｌａｂ Ｕ２は７００の蛍光ダイラベル（ＩＲＤ）にて５’末端へ標識し、Ｕｎｉ Ｌａｂ Ｌ２は８００の蛍光ダイラベル（ＩＲＤ）にて５’末端標識した。２ｎｄ ＰＣＲを行う際には、Ｕｎｉ Ｌａｂ Ｕ２の蛍光ラベル：非ラベル＝３：７、Ｕｎｉ Ｌａｂ Ｌ２の蛍光ラベル：非ラベル＝４：６に混合した物を用いた。

【0077】

２ｎｄ ＰＣＲはＥｘＴａｑ（ＴａＫａＲａ）を用いて行った。組成と反応条件を以下に示す：
ＴＩＬＬＩＮＧ用のＰＣＲ組成［１０×ＥｘＴａｑバッファー ２μｌ、２．５ｍＭ ｄＮＴＰ ｍｉｘ １．６μｌ、フォワードプライマー（１０μＭ）０．４μｌ，リバースプライマー（１０μＭ）０．４μｌ、精製後ＤＮＡ（４μｌ）、１１．５μｌ滅菌水、Ｅｘ Ｔａｑ ０．０６μｌ／合計２０μｌ］
ＰＣＲ反応条件：［９５℃ ２分間、（９５℃ １分間、５５℃ １分間、７２℃ １分３０秒間）×３５サイクル、７２℃ ７分間、次いで、（９９℃ １０分間、７０℃ ０．２〜０．３分間）×７０サイクル、１０℃にて保管］。

【0078】

ＰＣＲ後の産物は以下のとおり、ＣＥＬ Ｉヌクレアーゼで処理した（９６穴プレートを使用）。

【0079】

ＣＥＬ Ｉ酵素液：滅菌水１８００μｌ、ＣＥＬＩバッファー ３１５μｌ（ＣＥＬ Ｉバッファーは１Ｍ ＭｇＳＯ_４、１Ｍ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、２Ｍ ＫＣｌ、ｄＨ_２Ｏ／１００ｍｌをオートクレーブ滅菌した後に１０％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ（ｗ／ｖ）２００μｌ、ＢＳＡ（２０ｍｇ／ｍｌ）１μｌを添加したものを用いた）、ＣＥＬ Ｉ酵素７．５μｌ／９６サンプル。

【0080】

上記ＰＣＲ産物に上記のＣＥＬ Ｉ酵素液（２０μｌ）を添加した。シェーカーにて軽く混合し、４５℃で１５分間、酵素反応を行い、その後、０．１５ＭのＥＤＴＡ（５μｌ）を添加して、酵素反応を停止した。

【0081】

ＣＥＬ Ｉヌクレアーゼ処理反応後のサンプルは水膨潤Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ５０によって精製を行った。水膨潤Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ５０は次の通り調製を行った。

【0082】

Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ５０を適量カラムローダー上に加え、付属のヘラで広げながら充填していき、余分なＳｅｐｈａｄｅｘは取り除いた。カラムローダー上部に、精製用９６穴プレート（Ｍｉｌｉｐｏｒｅ社 ＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎ ＨＴＳ）をガイドピンに合わせて逆さにセットし、ローダーとプレートをしっかり手で固定したままひっくり返し、Ｓｅｐｈａｄｅｘをカラムプレート側へ移した。Ｓｅｐｈａｄｅｘが充填されたプレートカラムへ、３４６μｌの水を加え室温で１時間放置し、ゲルを膨潤させた。プレートホルダー（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社 Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｆｒａｍｅ）を用いてカラムプレートをセットし、４６０ｘｇで５分間遠心し、余分な水分を除去することで作製した。

【0083】

カラムプレートの下にサンプル回収用の９６ｗｅｌｌ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｐｌａｔｅをセットし、ＣＥＬ Ｉヌクレアーゼ処理反応後のサンプルをゲルの中央にのせ、４６０ｘｇで２間遠心し、サンプルを精製した。

【0084】

次いで、サンプルを１×Ｔｉｌｌｉｎｇローディングバッファー（脱イオンホルムアミド２５ｍｌ、０．５Ｍ ＥＤＴＡ ５００μｌ、ＢＰＢ ６ｍｇ）３．５μｌと混合し、８５℃で１時間、加熱・乾燥させ、液量を１５μｌ程度として、これを電気泳動へ用いた。

【0085】

電気泳動用のゲルは、ＫＢｐｌｕｓ Ｇｅｌ Ｍａｔｒｉｘ（ＫＢ＋６．５％ Ｇｅｌ Ｍａｔｒｉｘ ５００ｍｌ ＬＩ−ＣＯＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）２０ｍｌ、１５０μｌ １０％ＡＰＳ、１５μｌ ＴＥＭＥＤを混合して作製した。電気泳動バッファーにはＴＢＥ（１０８ｇ Ｔｒｉｓ、５５ｇホウ酸、９．２ｇ ＥＤＴＡ）を使用した。

【0086】

電気泳動及び波形の解析はＬＩ−ＣＯＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社のＤＮＡ Ａｎａｌｙｚｅｒを使用して行った。

【0087】

（結果）
本研究では、ＵＶ照射したプロトプラストから再生した二核菌糸体９３５株（Ｍｕ００１株〜Ｍｕ９３５株）を得ることができた。

【0088】

得られた菌糸体よりゲノムＤＮＡを抽出し、抽出したＤＮＡを３菌株ずつ等量ずつ混合して、ＴＩＬＬＩＮＧ用のテンプレートとした。上記のとおり、フォワードプライマー、及びリバースプライマーをプライマーセットとして上記ＴＩＬＬＩＮＧ用のＰＣＲ（上記１ｓｔ及び２ｎｄ ＰＣＲ）を行い、得られたＰＣＲ産物をＣＥＬＩヌクレアーゼにより処理し、電気泳動を行った。

【0089】

その結果、Ｍｕ５９７、Ｍｕ６９３、Ｍｕ７８９株より抽出したゲノムＤＮＡを含むテンプレートに関して、他のテンプレートとは異なるバンドパターンが得られた。さらに、Ｍｕ５９７株、Ｍｕ６９３株、Ｍｕ７８９株より抽出したゲノムＤＮＡを個別にテンプレートとして用いて、上記ＴＩＬＬＩＮＧ用ＰＣＲ（上記１ｓｔ及び２ｎｄ ＰＣＲ）に付して得られた産物を電気泳動したところ、Ｍｕ７８９株より抽出したゲノムＤＮＡにのみ、特異的なバンドパターンが得られた（図２）。

【0090】

次に、Ｍｕ７８９株より抽出したゲノムＤＮＡをテンプレートに、標識されていないフォワードプライマー、及びリバースプライマーを使用するＰＣＲを行い、得られたバンドを精製し、塩基配列を決定した。親株であるＳＲ−１株では、ｅｘｇ２遺伝子の２１２８番目の塩基がチミジンであるのに対して、Ｍｕ７８９株のｅｘｇ２遺伝子では２１２８番目の塩基がグアニンに置換されていることが明らかになった（図３）。Ｍｕ７８９株のｅｘｇ２遺伝子の塩基配列について、アミノ酸変換したところ、Ｍｕ７８９株における２１２８番目の塩基置換は、ＥＸＧ２タンパク質における７１０番目のアミノ酸置換を伴うものであり、７１０番目のアミノ酸残基がチロシンよりアスパラギン酸に変異していることが明らかとなった（図４）。

【0091】

なお、本発明者らはＭｕ７８９株を、２０１４年６月６日に独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（〒２９２−０８１８ 日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８ １２２号室）に受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−０１８６５として寄託した。

【0092】

２．子実体の保存試験
（子実体の形成及びサンプリング）
植菌後１０３日間２３℃の恒温室で菌糸を培養した後、一晩菌床全体を水に浸漬し、次いで、湿度９０％以上の１２時間日長、１５℃のインキュベーター内に静置して発生操作を行った。菌傘の膜が切れた段階で子実体を収穫し、２５℃のデシケーター内に保存して、保存試験を行った。

【0093】

デシケーターには、飽和塩化アンモニウム水溶液を入れて、デシケーター内が湿度約８０％になるようにした。子実体は収穫した直後（収穫０日目）、収穫から４日目（収穫４日目）でサンプリングを行った。子実体は、柄、傘、ひだに分けてサンプリングし、液体窒素で凍結させた。ｍＲＮＡ抽出用のサンプルは、乳鉢で細かく粉砕した後、Ｆａｓｔ Ｒｅｄ Ｐｒｏ用のチューブ（Ｌｙｓｉｎｇ Ｍａｔｒｉｘ Ｃ；Ｑ−Ｂｉｏ ｇｅｎｅ）に入れて−８０℃で保存した。

【0094】

（レンチナンの測定）
サンプリング後の子実体（柄、傘、ひだを含む）を、凍結乾燥後、乳ばちでパウダー状になるまですりつぶした。０．５ｇを測りとった後、１０倍量の水を加え、オートクレーブで１２１℃にて２０分間、熱水抽出した。抽出液をろ紙一枚、ガーゼ３枚を重ねたガラスフィルター（ガラス濾過器Ｐ２５０、柴田科学）で吸引ろ過し、ろ液に等量のエタノールを加えて、一時間以上４℃でエタノール沈澱を行った。遠心後、ペレットを１００％エタノールで２回洗浄し、ペレットを凍結乾燥した。ペレットの総重量を測り、細かく砕いた後、１ｍｇを測りとり、１時間以上２０ｍｌの水で膨潤させた後、オートクレーブで１２１℃、１５分処理して完全に溶解させ、抗原溶液とした。

【0095】

５０μｇ／ｍｌ抗原溶液（１００μｌ）をマイクロプレート（ＥＬＩＳＡ用）に入れ、３７℃にて２時間静置して、抗原を吸着させたのち、プレートに入っている抗原溶液を捨てて、ＰＢＳ−Ｔ（０．０２％ Ｔｗｅｅｎ ２０を含むＰＢＳ：ＮａＣｌ １３７ｍＭ；ＮａＨＰＯ_２ ８．１ｍＭ；ＫＣｌ ２．６８ｍＭ；ＫＨ_２ＰＯ_４ １．４７ｍＭ）で３回洗浄した。

【0096】

そこに、１％のブロッキング溶液（１％スキムミルクを含むＰＢＳ）を各２００μｌ入れ、２０℃にて１２０分間インキュベーションしてブロッキングを行った。

【0097】

一方、抗原溶液（適当な希釈系列と、発色用ポジティブコントロールとしてレンチナンを入れないものを作っておく）と等量の一次抗体（レンチナン抗体：１００倍希釈）をまぜ、５℃（氷上）で３０分インキュベーションを行い、一次抗体を抗原溶液中の抗原と事前に反応させ、抗原−抗体溶液を得た。

【0098】

プレートのブロッキング溶液を捨てて、ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した。このプレートに抗原−抗体溶液を各１００μｌ分注し、２０℃で６０分間インキュベーションし、事前の反応で結合しなかった抗体とプレート上の抗原とを反応させた。抗原−抗体溶液を捨て、ＰＢＳ−Ｔで洗浄した後、二次抗体（ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ抗体：２０００倍希釈）を２００μｌ入れ、２０℃で９０分インキュベーションして、一次抗体と二次抗体を反応させた。

【0099】

二次抗体の反応後、基質溶液［ｏ−フェニレンジアミン５ｍｇ，３０％Ｈ_２０_２ ５μｌを含む０．１Ｍクエン酸バッファー（ｐＨ５．０），１０ｍｌ］１００μｌを分注し、発色用ポジティブコントロールが発色するまで５〜１０分間、２０℃の暗所でインキュベーションした。反応停止液（４Ｎ Ｈ_２ＳＯ_４）５０μｌを分注し、酵素反応を停止させ、マイクロプレートリーダーで４９２ｎｍの吸光度を測定し、子実体におけるレンチナン量を求めた。

【0100】

（結果）
Ｍｕ７８９株の子実体を上記のとおり形成し、そのレンチナン量及び収穫後のレンチナン量を測定した。比較対象として、収穫後のレンチナン分解が明らかになっている市販株（Ｈ６００株）、Ｍｕ７８９株の親株であるＳＲ−１株、ＳＲ−１株においてｅｘｇ２株をＲＮＡｉ法により抑制したｉｖｒ−ｅｘｇ２株（ＥＸＧ２抑制モデル株：特開２００６−２７１２１８号公報）の子実体におけるレンチナン量を、同様に測定した。結果を表１に示す。

【0101】

【表1】

【0102】

市販株、親株及びＥＸＧ２抑制モデル株の収穫直後のレンチナン量がおよそ５ｍｇ／ｇ程度であったのに対し、Ｍｕ７８９株の収穫直後のレンチナン量はおよそ１０ｍｇ／ｇと他の菌株よりレンチナン量が顕著に多いことが明らかになった。

【0103】

また、保存後（収穫から４日後）のレンチナン残存率は、市販株及び親株において５０〜６０％程度となり、ＥＸＧ２抑制モデル株においておよそ７５％程度であった。一方、Ｍｕ７８９株のレンチナン残存率はおよそ９０％程度であった。

【0104】

Ｍｕ７８９株は、従来の公知の株と比べて、レンチナン含量が高いと共に、収穫後のレンチナン残存率も高いことが明らかとなった。これらの結果は、Ｍｕ７８９株におけるＥＸＧ２の活性は顕著に抑制されていることを示す。

【0105】

３．ＰＣＲによる変異株検出
Ｍｕ７８９株を育種親として利用するために、単胞子由来の菌株から、Ｍｕ７８９株と同様に変異を有する菌株を選抜する手法の確立を試みた。

【0106】

Ｍｕ７８９株の子実体をひだを下にして薬包紙に静置し、落下した胞子を回収した。回収した胞子は滅菌水で適当な濃度に希釈して、ＭＹＰＧ培地に播種し、発芽した菌糸を単胞子分離株として単離した。

【0107】

得られた単胞子分離株の菌糸を楊枝で回収し、ＫＡＰＡ ３Ｇ ｐｌａｎｔ ＰＣＲ ｋｉｔにより、ダイレクトＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応液の調製及びＰＣＲ条件はＫＡＰＡ ３Ｇ ｐｌａｎｔ ＰＣＲ ｋｉｔ（日本ジェネティクス株式会社）のプロトコールに従った。使用したプライマーの配列は下記の通り。
フォワードプライマー：ＡＧＣＡＧＣＡＴＧＴＴＴＴＧＣＣＴＣＴＴ （配列番号８）
リバースプライマー：ＡＣＡＧＧＧＡＣＧＴＣＡＴＴＴＣＧＴＧＴ （配列番号９）

【0108】

変異検出用のプライマーは、フォワードプライマーの３’末端側に上記２１２８番目の塩基変異を含み、さらに、野生型の配列では増幅されないように、その３’末端側に、野生型のｅｘｇ２遺伝子における対応する位置にある塩基とは異なる、さらにもう一塩基を追加したプライマーを設計した。すなわち、フォワードプライマーは野生株とは３’末端が２塩基置換され、Ｍｕ７８９株とは３’末端が１塩基置換されている。変異検出用の各プライマーの配列は下記のとおり。コントロールのプライマーは、下線部に野生型に由来するＴＡを有するものを用いた。
フォワードプライマー：ＴＧＡＡＣＡＧＧＴＧＣＣＧＧＡＣＴＴＧＣ （配列番号１０）
リバースプライマー：ＴＧＴＡＣＡＧＧＧＡＣＧＴＣＡＴＴＴＣＧ （配列番号１１）
（下線は野生型ではＴＡ）

【0109】

ダイレクトＰＣＲの結果得られたＰＣＲ産物を鋳型として、変異検出ＰＣＲを行った。ＰＣＲはＥｘＴａｑ（ＴａＫａＲａ）を用いて行った。組成と反応条件を以下に示す：
変異検出ＰＣＲの組成［１０×ＥｘＴａｑバッファー １μｌ、２．５ｍＭ ｄＮＴＰ ｍｉｘ ０．８μｌ、フォワードプライマー（１０μＭ）０．２μｌ，リバースプライマー（１０μＭ）０．２μｌ、精製後ＤＮＡ（２μｌ）、５．７７μｌ滅菌水、Ｅｘ Ｔａｑ ０．０３μｌ／合計１０μｌ］
ＰＣＲ反応条件：［９５℃ ２分間、（９５℃ １分間、６０℃ １分間、７２℃ ３０分間）×３５サイクル、７２℃ ７分間、１０℃にて保管］。

【0110】

菌株の対照として、野生型であるＳＲ−１株を用いて、同様の操作を行った。
ダイレクトＰＣＲの結果得られた各ＰＣＲ産物を電気泳動した結果を、図５に示す。野生型に対し、変異検出用のプライマーを用いた場合（レーン１及び３）においては、コントロールのプライマーを用いた場合（レーン２及び４）と比較して明瞭なバンドが確認されなかった。一方、変異株であるＭｕ７８９株に対し、変異検出用のプライマーを用いた場合（レーン５及び７）においては、Ｍｕ７８９株に対しコントロールのプライマーを用いた場合（レーン６及び８）と比較して明瞭なバンドが確認された。すなわち、変異検出用のプライマーを用いたＰＣＲを行うことによって変異株を検出できることが明らかとなった。

【0111】

４．変異型のｅｘｇ２遺伝子をホモに持つ菌株の解析
（Ｉ）方法
（ｉ）子実体の形成及びサンプリング
Ｍｕ７８９株の子実体より単胞子分離を行い、変異型のｅｘｇ２遺伝子をホモに持つ菌株と野生型のｅｘｇ２遺伝子をホモに持つ菌株の作出を行った。すなわち、上記「２．子実体の保存試験」で得られたＭｕ７８９株の子実体より、落下した胞子を回収し、滅菌水に懸濁した。得られた懸濁液を最小寒天培地に塗布した後、再生した菌糸を分離した。再生した菌糸については、顕微鏡下でクランプ結合の有無を確認し、クランプ結合のない一核菌糸のみを単離した（単胞子分離株）。

【0112】

得られた単胞子分離株について、上記「３．ＰＣＲによる変異株検出」に記載の変異検出手法を用いて、変異型のｅｘｇ２遺伝子を持つ菌株と野生型のｅｘｇ２遺伝子を持つ菌株とに分けた。次いで、変異型のｅｘｇ２遺伝子を持つ菌株同士、および野生型のｅｘｇ２遺伝子を持つ菌株同士でそれぞれ交配を行い、クランプ結合を確認することで交配した二核菌糸をそれぞれ得た。

【0113】

得られた二核菌糸を上記「２．子実体の保存試験」と同様の手法を用いて子実体の形成及びサンプリング、ならびに、保存試験を行った。

【0114】

（ｉｉ）グルカナーゼ活性の測定
収穫した直後（収穫０日目）、及び収穫から４日目（収穫４日目）の子実体のヒダ部分を液体窒素で粉砕したのち、２００ｍＭ酢酸ナトリウムを加えて、グルカナーゼの抽出を行った。得られた抽出液を遠心分離し、上澄みを酵素液とした。グルカナーゼ活性は、酵素液と１％ラミナリン基質液を混合し、３７℃にて３０分間反応を行い、生成された還元糖量を４−ヒドロキシ−ベンゾヒドラジド(ＰＡＨＢＡＨ)法を用いて測定した。なお、グルカナーゼ活性は、酵素液中のタンパク質をブラッドフォード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）法を用いて定量し、タンパク質１ｍｇあたりのｕｎｉｔ（Ｕ／ｍｇタンパク質）であらわす。

【0115】

（ｉｉｉ）ＥＸＧ２発現量の測定
前記酵素液を用いてウ_エスタンブロッティングを行い、ＥＸＧ２発現量を確認した。はじめに、全ての酵素液のタンパク質濃度が等しくなるように、２００ｍＭ酢酸ナトリウムで調整し、調整した酵素液とＳＤＳサンプルバッファーを混合、煮沸し、５〜２０％グラジエントＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。泳動したタンパク質はｉＢｌｏｔ（登録商標）Ｇｅｌ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｄｅｖｉｃｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．）を使用し、ゲルからメンブレンに転写した。抗体反応には、一次抗体にＥＸＧ２−ｒａｂｂｉｔ抗体、二次抗体にａｎｔｉ−Ｒａｂｂｉｔ抗体を用いた。検出はＥＣＬ Ｐｒｉｍｅ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＧＥヘルスケア）を使用し、化学発光法にてバンドを確認した。

【0116】

（ＩＩ）結果
交配により、変異型のｅｘｇ２遺伝子をホモに持つ菌株を３菌株（ａ，ｂおよびｃと記載する）、野生型のｅｘｇ２遺伝子をホモに持つ菌株を４菌株（ｄ，ｅ，ｆおよびｇと記載する）を得、それぞれより子実体を得た。これら子実体と、ｅｘｇ２の変異をヘテロに持つＭｕ７８９株（ｈと記載する）の子実体について、収穫した直後、及び収穫から４日目のグルカナーゼ活性の測定を行った。

【0117】

結果を図６に示す。
結果、野生型のｅｘｇ２遺伝子をホモに持つ菌株（ｄ，ｅ，ｆおよびｇ）の全てにおいて、収穫直後（Ｄ０）よりも収穫から４日目（Ｄ４）のグルカナーゼ活性が高くなった。

【0118】

一方、変異型のｅｘｇ２遺伝子をホモに持つ菌株（ａ，ｂおよびｃ）では、収穫から４日目のグルカナーゼ活性は、収穫直後と比較してほとんど変化せず、またその活性は野生型のｅｘｇ２遺伝子をホモに持つ菌株（ｄ，ｅ，ｆおよびｇ）の収穫から４日目のグルカナーゼ活性と比較して、著しく低い活性を示した。

【0119】

また、ｅｘｇ２の変異をヘテロに持つＭｕ７８９株（ｈ）の収穫から４日目のグルカナーゼ活性には、変異型のｅｘｇ２遺伝子をホモに持つ菌株（ａ，ｂおよびｃ）より高く、野生型のｅｘｇ２遺伝子をホモに持つ菌株（ｄ，ｅ，ｆおよびｇ）より低い値を示した。

【0120】

次いで、各菌株の子実体について、収穫から４日目のＥＸＧ２発現量の測定を行った。
結果を図７に示す。
結果、全ての菌株でＥＸＧ２の発現が確認できたが、変異型のｅｘｇ２遺伝子をホモに持つ菌株（ａ，ｂおよびｃ）では、野生型のｅｘｇ２遺伝子をホモに持つ菌株（ｄ，ｅ，ｆおよびｇ）に比べてＥＸＧ２発現量が少なかった。

【0121】

以上の結果より、変異型のｅｘｇ２遺伝子により、ＥＸＧ２の発現が抑制され、それによりグルカナーゼ活性が低下することが示された。すなわち、Ｍｕ７８９株においては、ｅｘｇ２遺伝子の変異に起因してＥＸＧ２の発現が抑制され、その結果、子実体におけるレンチナン含量及び収穫後のレンチナン残存率の増大を生じることが示された。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]