特許 6581346 精製アルカリプロテアーゼの製造方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6581346

(24)【登録日】2019年9月6日

(45)【発行日】2019年9月25日

(54)【発明の名称】精製アルカリプロテアーゼの製造方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 9/54 20060101AFI20190912BHJP

【ＦＩ】

   C12N9/54

【請求項の数】7

【全頁数】12

(21)【出願番号】特願2014-234192(P2014-234192)

(22)【出願日】2014年11月19日

(65)【公開番号】特開2016-96742(P2016-96742A)

(43)【公開日】2016年5月30日

【審査請求日】2017年9月20日

(73)【特許権者】

【識別番号】000000918

【氏名又は名称】花王株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】110000084

【氏名又は名称】特許業務法人アルガ特許事務所

(74)【代理人】

【識別番号】100077562

【弁理士】

【氏名又は名称】高野 登志雄

(74)【代理人】

【識別番号】100096736

【弁理士】

【氏名又は名称】中嶋 俊夫

(74)【代理人】

【識別番号】100117156

【弁理士】

【氏名又は名称】村田 正樹

(74)【代理人】

【識別番号】100111028

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 博人

(72)【発明者】

【氏名】四方 健一

(72)【発明者】

【氏名】浜 正勝

【審査官】 松田 芳子

(56)【参考文献】

【文献】 特開昭５０−１４１３９９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１２−１７０３５２（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ ９／５４

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＷＰＩＤＳ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

次の工程（１）及び（２）：
（１）アルカリプロテアーゼを含有する溶液を、主鎖のＳＰ値が７〜１１〔（ｃａｌ／ｃｍ³）^1/2〕の範囲内にあり、樹脂母体がポリメタクリル酸メチルで、イオン交換能が１ｍｅｑ／ｇ未満である合成吸着剤に接触させて、アルカリプロテアーゼを合成吸着剤に吸着させる工程、
（２）当該合成吸着剤に、水溶性カルシウム塩を含有し、ＳＰ値が１６〜２２〔（ｃａｌ／ｃｍ³）^1/2〕の範囲内にあるポリオール水溶液を接触させて、アルカリプロテアーゼを溶出させる工程、
を含む、精製アルカリプロテアーゼの製造方法。

【請求項2】

ポリオール水溶液中の水溶性カルシウム塩の濃度が０．０２〜３０ｍＭである請求項１記載の精製アルカリプロテアーゼの製造方法。

【請求項3】

合成吸着剤の平均粒子径が３０〜１０００μｍである請求項１又は２記載の精製アルカリプロテアーゼの製造方法。

【請求項4】

ポリオールがプロピレングリコール又はポリエチレングリコールである請求項１〜３のいずれか１項記載の精製アルカリプロテアーゼの製造方法。

【請求項5】

アルカリプロテアーゼを含有する溶液が水溶性カルシウム塩を含む溶液である請求項１〜４のいずれか１項記載の精製アルカリプロテアーゼの製造方法。

【請求項6】

工程（１）の後且つ工程（２）の前に、水溶性カルシウム塩を含有する洗浄液を通液して合成吸着剤を洗浄する工程を含む、請求項１〜５のいずれか１項記載の精製アルカリプロテアーゼの製造方法。

【請求項7】

水溶性カルシウム塩が塩化カルシウムである請求項１〜６のいずれか１項記載の精製アルカリプロテアーゼの製造方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、精製アルカリプロテアーゼの製造方法に関する。

【背景技術】

【0002】

酵素は、古くから各種産業で利用されてきた。最も工業的に大量に生産されている酵素は衣料洗剤用のアルカリプロテアーゼである。アルカリプロテアーゼは、衣料の汚れに含まれるタンパク質汚れを分解し、界面活性剤による作用を助け、洗浄力を高める働きをする。
衣料洗剤は、その形態により粉末洗剤と液体洗剤に分類され、液体洗剤は、酵素を溶解状態で含む。液体洗剤は、粉末洗剤に比べて水への溶解性に優れ、また、汚れ部分に原液を直接塗布出来るメリットがあり、近年、市場規模が拡大している。

【0003】

酵素溶液は、一般的に微生物の発酵培養液から取得される。培養液から酵素溶液を取得する操作にあたっては、培養液を遠心分離して濁質成分を除去した後、粗酵素溶液の濃縮、可溶化、安定化、膜濾過等の処理を経て、清澄な精製酵素溶液として回収できることが知られている（例えば、特許文献１）。
また、吸着カラムに粗酵素溶液を通液して、酵素を精製回収する方法が検討され、例えば、フェニル基を固定した疎水性吸着カラムに納豆菌に由来するセリンプロテアーゼを含有する溶液を通して、当該プロテアーゼと溶液中の不純物を分離し、プロテーゼを溶出させる納豆菌に由来するセリンプロテアーゼの精製方法が知られている（特許文献２）。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0004】

【特許文献1】特開２０１１−５２３５６２号公報

【特許文献2】特開２０１２−１７０３５２号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

特許文献２のように吸着カラムを用いて酵素を精製回収する方法は、特許文献１に示された方法よりも精製操作の手間が少ない点で優位である。しかしながら、従来の吸着カラムではアルカリプロテアーゼが十分に吸着・溶出されず、低回収率となる場合があることが判明した。
したがって、本発明は、粗酵素溶液から精製アルカリプロテアーゼを高い回収率で製造することのできる方法を提供することに関する。

【課題を解決するための手段】

【0006】

本発明者等は、アルカリプロテアーゼの精製手段について検討したところ、所定の疎水性吸着剤を用い、粗酵素溶液をかかる疎水性吸着剤に接触させた後、これに水溶性カルシウム塩を含む有機溶媒水溶液を通液してアルカリプロテアーゼを溶出させることにより、アルカリプロテアーゼを高収率で回収できることを見出した。

【0007】

すなわち、本発明は、次の工程（１）及び（２）：
（１）アルカリプロテアーゼを含有する溶液を、主鎖のＳＰ値が７〜１１〔（ｃａｌ／ｃｍ³）^1/2〕の範囲内にある合成樹脂を母体とする合成吸着剤に接触させて、アルカリプロテアーゼを合成吸着剤に吸着させる工程、
（２）当該合成吸着剤に水溶性カルシウム塩を含有する有機溶媒水溶液を接触させて、アルカリプロテアーゼを溶出させる工程、
を含む、精製アルカリプロテアーゼの製造方法を提供するものである。

【発明の効果】

【0008】

本発明によれば、簡便な操作で、粗酵素溶液から精製アルカリプロテアーゼを高い回収率で得ることができる。

【発明を実施するための形態】

【0009】

本発明の精製アルカリプロテアーゼの製造方法は、アルカリプロテアーゼを含有する溶液を、主鎖のＳＰ値が７〜１１〔（ｃａｌ／ｃｍ³）^1/2〕の範囲内にある合成樹脂を母体とする合成吸着剤に接触させて、アルカリプロテアーゼを合成吸着剤に吸着させる工程（１）と、当該合成吸着剤に水溶性カルシウム塩を含有する有機溶媒水溶液を接触させて、アルカリプロテアーゼを溶出させる工程（２）、を含むものである。

【0010】

アルカリプロテアーゼは、アルカリ性領域に至適ｐＨを有するプロテアーゼで、動物、植物、微生物等の任意の生物に由来するものが挙げられる。なかでも、活性中心がセリン残基である、セリンプロテアーゼが好ましく、更にバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）に属する微生物（例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｌａｕｓｉｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｌｃａｌｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｉｒｍｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｈａｌｍａｐａｌｕｓ等）が産生するセリンプロテアーゼが好ましい。

【0011】

アルカリプロテアーゼを産生する微生物の培養は、微生物の種類に応じて、一般的な方法に従って行うことができる。
産生されたアルカリプロテアーゼは、培養液、細胞破砕液、無細胞翻訳系等から取得することができる。本発明においては、遠心分離や精密濾過型フィルター等を用いて菌体を分離又は濃縮したその培養上清や溶菌液上清等の溶液を、工程（１）に供するアルカリプロテアーゼを含有する溶液とするのが好ましい。

【0012】

〔工程（１）〕
工程（１）では、アルカリプロテアーゼを含有する溶液を、主鎖のＳＰ値が７〜１１〔（ｃａｌ／ｃｍ³）^1/2〕の範囲内にある合成樹脂を母体とする合成吸着剤に接触させて、アルカリプロテアーゼを合成吸着剤に吸着させる。
アルカリプロテアーゼを含有する溶液のタンパク質濃度は、アルカリプロテアーゼの溶解性と安定性の点から、０．１〜１５ｍｇ／ｍＬが好ましく、０．５〜１２ｍｇ／ｍＬがより好ましく、１〜１０ｍｇ／ｍＬが更に好ましい。

【0013】

アルカリプロテアーゼを含有する溶液には、後述する水溶性カルシウム塩、好ましくは塩化カルシウムを含有させるのが好ましい。アルカリプロテアーゼを含有する溶液に水溶性カルシウム塩を含むことで、工程（２）においてアルカリプロテアーゼの回収率を一層高めることができる。
アルカリプロテアーゼを含有する溶液中の水溶性カルシウム塩の濃度は、アルカリプロテーゼの回収効率の点から、０．０２〜３０ｍＭが好ましく、０．３〜１５ｍＭがより好ましく、１〜１０ｍＭが更に好ましい。

【0014】

また、アルカリプロテアーゼを含有する溶液には、酵素を安定化させる目的で、例えば、ホウ砂、ホウ酸等のホウ素化合物、アミノ酸、硫酸塩、リン酸塩等を含有させてもよい。アルカリプロテアーゼを含有する溶液中のホウ素化合物の含有量は０．０５〜１０ｗｔ％が好ましく、０．０８〜８ｗｔ％がより好ましく、０．１〜５ｗｔ％が更に好ましい。

【0015】

アルカリプロテアーゼを吸着させる合成吸着剤は、主鎖のＳＰ値が７〜１１〔（ｃａｌ／ｃｍ³）^1/2〕の範囲内にある合成樹脂を母体とする。一般に、合成樹脂は不溶性の三次元架橋構造を有し、合成吸着剤を構成する。ここで、「主鎖」は、合成樹脂を構成するポリマー鎖のうち最も長い鎖である。また、本明細書において「ＳＰ値」とは、溶解度パラメーターを意味し、Ｊ．ＢＲＡＮＤＲＵＰ著「ＰＯＬＹＭＥＲ ＨＡＮＤＢＯＯＫ ４ｔｈ」（ＪＯＨＮ ＷＩＬＥＹ＆ＳＯＮＳ，ＩＮＣ １９９９年発行）、ＶＩＩ６８８〜６９４項に示された値、又はＦｅｄｏｒｓの方法に従い、Ｊ．ＢＲＡＮＤＲＵＰ著「ＰＯＬＹＭＥＲ ＨＡＮＤＢＯＯＫ ４ｔｈ」、ＶＩＩ６８５〜６８６項に示されるパラメーターを用いて算出した値を用いることができる。
合成吸着剤は、イオン交換基のような官能基を実質的に持たないもので、そのイオン交換能は１ｍｅｑ／ｇ未満が好ましい。

【0016】

合成樹脂の主鎖のＳＰ値は、アルカリプロテーゼの回収効率の点から、７〜１１〔（ｃａｌ／ｃｍ³）^1/2〕、８〜１０〔（ｃａｌ／ｃｍ³）^1/2〕、更に９〜１０〔（ｃａｌ／ｃｍ³）^1/2〕が好ましい。

【0017】

ＳＰ値が７〜１１〔（ｃａｌ／ｃｍ³）^1/2〕の範囲内にある主鎖（括弧内はＳＰ値を示す）としては、例えば、ポリスチレン鎖（８．５）、ポリメタクリル酸メチル鎖（９．１）、ポリメタクリル酸エチル鎖（９．０）、アクリル酸エチル鎖（９．５）等が挙げられる。
これらの主鎖を有する合成樹脂は、単独重合体、共重合体、架橋重合体等のいずれでもよいが、架橋重合体であることが好ましい。

【0018】

なかでも、合成吸着剤は、アルカリプロテーゼの回収効率の点から、その樹脂母体が、ポリスチレン、架橋ポリスチレン等のスチレン系樹脂、アクリル系樹脂、メタクリル系樹脂であることが好ましく、更にスチレン−ジビニルベンゼン共重合体、ポリメタクリル酸メチルであることが好ましい。
また、合成吸着剤は、その樹脂母体が、側鎖にブロモ基やブチル基、フェニル基等の疎水性の官能基を有さないことが好ましい。
これらの例としては、例えば、アンバーライトＸＡＤ４、アンバーライトＸＡＤ１６ＨＰ、アンバーライトＸＡＤ１１８０、アンバーライトＸＡＤ２０００（以上、オルガノ社）、ダイヤイオンＨＰ２０、ダイヤイオンＨＰ２０ＳＳ、ダイヤイオンＨＰ２１、セパビーズＳＰ８５０、セパビーズＳＰ８２５、セパビーズＳＰ７００、セパビーズＳＰ７０（以上、三菱化学社）、ＶＰＯＣ１０６２（Ｂａｙｅｒ社）等のスチレン系合成吸着剤；ダイヤイオンＨＰ１ＭＧ、ダイヤイオンＨＰ２ＭＧ、セパビーズＳＰ２ＭＧＳ（以上、三菱化学社）等のメタクリル系合成吸着剤；アンバーライトＸＡＤ７ＨＰ（オルガノ社）等のアクリル系合成吸着剤が挙げられる。
合成吸着剤の形態は、球形、不均一形状等のいずれの形状であってもよいが、分離効率の点から、球形が好ましい。

【0019】

合成樹脂の平均粒子径（Ｄ３２）は、アルカリプロテーゼの回収効率の点から、３０〜１０００μｍが好ましく、更に５０〜５００μｍ、更に７０〜２５０μｍが好ましい。ここで、本明細書において「平均粒子径」とは、レーザー回折・散乱法により測定したものであって、ザウター粒子径（Ｄ３２）を平均粒子径としたものである。

【0020】

アルカリプロテアーゼを含有する溶液と合成吸着剤との接触は、バッチ方式、連続方式のいずれも用いることができる。工業的には、合成吸着剤を充填したカラムにアルカリプロテアーゼを含有する溶液を通液して接触させる連続方式を採用することが好ましい。

【0021】

合成吸着剤を充填したカラムにアルカリプロテアーゼを含有する溶液を通液する前においては、予め吸着剤を洗浄して、合成吸着剤中の不純物を除去するのが好ましい。
例えば、通液速度（空間速度、ＳＶ）が０．５〜５／ｈｒ、合成吸着剤の全容量に対する通液倍数（ＢＶ）が４〜１０の通液条件で水をカラムに通液して洗浄する方法が挙げられる。また、有機溶媒水溶液を通液した後、水を通液してもよい。洗浄に用いる有機溶媒水溶液は、１０〜９０％（ｖ／ｖ）エタノール水溶液が好ましい。

【0022】

合成吸着剤の使用量は、アルカリプロテーゼの回収効率と使用する液量の点から、アルカリプロテアーゼを含有する溶液のタンパク質量に対して、１〜５０ｍｇタンパク質／ｍＬ−吸着剤が好ましく、１０〜４０ｍｇタンパク質／ｍＬ−吸着剤がより好ましく、１５〜３０ｍｇタンパク質／ｍＬ−吸着剤が更に好ましい。

【0023】

アルカリプロテアーゼを含有する溶液と合成吸着剤との連続方式での接触条件は、アルカリプロテーゼの回収効率の点から、ＳＶが０．２５〜１０／ｈｒであり、ＢＶが１〜２０であることが好ましく、更にＳＶが１〜５／ｈｒであり、ＢＶが２〜１０であることが好ましい。これにより、アルカリプロテアーゼを合成吸着剤に十分吸着させることができる。

【0024】

〔洗浄工程〕
アルカリプロテアーゼを合成吸着剤に吸着させた後は、工程（２）の前に、合成吸着剤を洗浄液で洗浄する工程を行うのが好ましい。合成吸着剤を洗浄する洗浄液には、水、有機溶媒水溶液を使用できるが、後述する水溶性カルシウム塩、好ましくは塩化カルシウムを含有する洗浄液を用いるのが、溶解性の点から好ましい。
洗浄液中の水溶性カルシウム塩の濃度は、アルカリプロテーゼの回収効率の点から、０．０２〜３０ｍＭ、更に０．３〜１５ｍＭ、更に１〜１０ｍＭが好ましい。
また、洗浄液として有機溶媒水溶液を用いる場合の有機溶媒の種類としては、ＳＰ値が１２〜２０〔（ｃａｌ／ｃｍ³）^1/2〕の範囲内のアルコール、ポリオール類等が挙げられ、エタノール、メタノール、エチレングリコールが好ましい。洗浄液中の有機溶媒の濃度は、アルカリプロテーゼの脱離の点から、１０％（ｖ／ｖ）以下が好ましい。
洗浄の回数は、１回又は複数回行ってもよいが、アルカリプロテーゼの脱離の点から１回が好ましい。

【0025】

〔工程（２）〕
工程（２）では、アルカリプロテアーゼを吸着した合成吸着剤に水溶性カルシウム塩を含有する有機溶媒水溶液を接触させて、アルカリプロテアーゼを溶出させる。
水溶性カルシウム塩を含有する有機溶媒水溶液を溶離液として使用することにより、アルカリプロテアーゼを高収率で回収できる。

【0026】

本発明で用いられる水溶性カルシウム塩は、水溶液に溶解するカルシウム塩であり、例えば、乳酸カルシウム、グルコン酸カルシウム、酢酸カルシウム等の有機塩；硝酸カルシウム、塩化カルシウム等の無機塩が挙げられる。
なかでも、溶解性の点から、塩化カルシウムが好ましい。

【0027】

有機溶媒水溶液中の水溶性カルシウム塩の濃度は、０．０２〜３０ｍＭ、更に０．３〜１５ｍＭ、更に１〜１０ｍＭが好ましい。

【0028】

有機溶媒水溶液における有機溶媒としては、ポリオール、炭素数４以下の一価アルコール等が挙げられる。なかでも、アルカリプロテーゼの回収効率と安定性の点から、ポリオールが好ましい。
ポリオールは、炭化水素の２個以上の水素を水酸基で置換したアルコール類の総称であり、例えば、エチレングリコール、プロピレングリコール、１，３−プロパンジオール、１，３−ブタンジオール等のアルキレングリコール類；ジエチレングリコール、ジプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール等のポリアルキレングリコール類；グリセリン、ジグリセリン、トリグリセリン等のグリセリン類等が挙げられる。ポリエチレングリコールの重量平均分子量は、２００〜２０，０００のものが好ましい。
なかでも、ポリオールは、ＳＰ値が７〜２０〔（ｃａｌ／ｃｍ³）^1/2〕の範囲内、好ましくはＳＰ値が９〜１８〔（ｃａｌ／ｃｍ³）^1/2〕の範囲内にあるポリオールが好ましい。
このようなポリオール（括弧内はＳＰ値を示す）としては、プロピレングリコール（１２．６）、ポリエチレングリコール４００（９．４）、グリセリン（１６．５）が好ましく、更にプロピレングリコール（１２．６）、ポリエチレングリコール４００（９．４）が好ましい。

【0029】

有機溶媒水溶液における有機溶媒の濃度は、アルカリプロテーゼの回収効率と安定性の点から、２０〜８０％（ｖ／ｖ）、更に４０〜８０％（ｖ／ｖ）が好ましい。
また、有機溶媒水溶液のＳＰ値は１５〜２２〔（ｃａｌ／ｃｍ³）^1/2〕、更に１６〜２０〔（ｃａｌ／ｃｍ³）^1/2〕であることが好ましい。

【0030】

有機溶媒水溶液の通液条件は、アルカリプロテーゼの回収効率と液量の点から、ＳＶが０．２５〜１０／ｈｒであり、ＢＶが１〜１０であることが好ましく、更にＳＶが１〜５／ｈｒであり、ＢＶが２〜８であることが好ましい。

【0031】

溶出工程は、１回又は複数回行うことができる。
溶出工程を複数回行う場合、各溶出工程で使用する有機溶媒水溶液における有機溶媒の濃度は、順次高めることが好ましく、例えば、１段階目の溶出工程を２０〜６０％（ｖ／ｖ）の有機溶媒水溶液を用いて行い、２段階目の溶出工程を４０〜８０％（ｖ／ｖ）の有機溶媒水溶液を用いて行う手法などが好ましい。
なお、溶出工程を複数回行う場合も、全ての溶出段階で前述した水溶性カルシウム塩を含有する有機溶媒水溶液を使用することが好ましい。

【0032】

このような処理の結果、アルカリプロテアーゼが精製され、清澄な精製アルカリプロテアーゼが得られる。精製アルカリプロテアーゼは、そのまま、又は濃縮・希釈してもよい。
精製アルカリプロテアーゼは、好ましくは４５％以上、より好ましくは５０％以上、更に好ましくは６０％以上という高い収率で回収することができる。なお、収率の上限は特に限定されず、１００％であってもよい。

【0033】

本発明で得られる精製アルカリプロテアーゼは、様々な製品に使用することができる。とりわけ、洗剤用酵素、更に液体洗剤用酵素として有用である。

【実施例】

【0034】

〔平均粒径の測定〕
合成樹脂の平均粒子径の測定には、レーザ回折・散乱法粒度分布測定装置ＬＳ １３ ３２０（ベックマン・コールター製）を用い、ザウターの平均粒子径を使用した。

【0035】

〔タンパク質濃度の測定〕
粗酵素溶液又は精製酵素溶液を蒸留水で任意に希釈したものを、クイックプロテインアッセイキット（バイオラッド製）にて測定した。標準タンパク質として、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）を用いて濃度の算出を行った。

【0036】

〔アルカリプロテアーゼ回収率の算出方法〕
アルカリプロテアーゼ回収率の算出については、粗酵素溶液、精製酵素溶液のタンパク質の定量結果を基に、粗酵素溶液に含まれるタンパク質はほとんどがアルカリプロテアーゼであったため、以下の算出式（１）にて算出を行った。
アルカリプロテアーゼの回収率（％）＝｛（精製酵素溶液のタンパク質濃度）×（精製酵素溶液の回収量）｝／｛（粗酵素溶液のタンパク質濃度）×（粗酵素溶液の通液量）｝×１００ （１）

【0037】

〔吸着工程、水洗工程のアルカリプロテアーゼ回収率の算出方法〕
吸着工程、水洗工程のアルカリプロテアーゼ回収率の算出は以下の算出式（２）〜（３）にて算出を行った。
吸着工程のアルカリプロテアーゼ回収率（％）＝１００−｛（吸着工程透過液のタンパク質濃度）×（吸着工程透過液の回収量）｝／｛（粗酵素溶液のタンパク質濃度）×（粗酵素溶液の通液量）｝×１００ （２）
水洗工程のアルカリプロテアーゼ回収率（％）＝吸着工程のアルカリプロテアーゼ回収率−｛（水洗工程透過液のタンパク質濃度）×（水洗工程透過液の回収量）｝／｛（粗酵素溶液のタンパク質濃度）×（粗酵素溶液の通液量）｝×１００ （３）

【0038】

実施例１
バチルス エスピーＫＳＭ−９８６５（ＦＥＲＭ Ｐ−１８５６６号）を培養し、アルカリプロテアーゼの生産を行った。培養液を遠心分離して菌体を分離した後、精密ろ過膜モジュール（中空糸状精密濾過膜、旭化成（株）、ＰＳＰ−１１３Ｌ）により除菌し、粗酵素溶液を得た。粗酵素溶液のタンパク質濃度は３．１６ｍｇ／ｍＬであった。

【0039】

カラム（内径２３ｍｍ、高さ３．６ｃｍ、体積１５ｍＬ）に吸着剤としてセパビーズＳＰ２ＭＧＳ（三菱化学（株）製）をスラリー充填法にて１５ｍＬ充填した。蒸留水を流量０．５ｍＬ／分、ＳＶ＝２／ｈｒ、ＢＶ＝５で通液し、平衡化を行った。
次いで、塩化カルシウムを２ｍＭ添加溶解させた粗酵素溶液９０ｍＬを平衡化後のカラムに対して流量０．５ｍＬ／分、ＳＶ＝２／ｈｒ、ＢＶ＝６で通液し、吸着を行った。吸着工程のアルカリプロテアーゼ回収率は９９．４％であった。
次いで、洗浄液として２ｍＭ塩化カルシウム水溶液１５ｍＬを、流量０．５ｍＬ／分、ＳＶ＝２／ｈｒ、ＢＶ＝１で通液し水洗を行った。水洗工程のアルカリプロテアーゼ収率は９９．４％であった。

【0040】

水洗後のカラムに対して、溶出液として、２ｍＭ塩化カルシウムを含む４０％（ｖ／ｖ）プロピレングリコール（ＰＧ）水溶液（ＳＰ値１９．１）４５ｍＬ、２ｍＭ塩化カルシウムを含む８０％（ｖ／ｖ）プロピレングリコール水溶液（ＳＰ値１９．９）４５ｍＬをそれぞれ流量０．５ｍＬ／分、ＳＶ＝２／ｈｒ、ＢＶ＝３で順次通液し、脱離を行い、精製酵素溶液を回収した。粗酵素溶液からの精製アルカリプロテアーゼの回収率は９０．７％であった。

【0041】

実施例２
粗酵素溶液中及びプロピレングリコール水溶液中の塩化カルシウムの濃度を０．５ｍＭに変更した以外は実施例１と同様の操作を行い、精製酵素溶液を回収した。粗酵素溶液からの精製アルカリプロテアーゼの回収率は８０．２％であった。

【0042】

実施例３
粗酵素溶液中及びプロピレングリコール水溶液中の塩化カルシウムの濃度を１０ｍＭに変更した以外は実施例１と同様の操作を行い、精製酵素溶液を回収した。粗酵素溶液からの精製アルカリプロテアーゼの回収率は９５．２％であった。

【0043】

実施例４
粗酵素溶液、洗浄液及びプロピレングリコール水溶液に、さらにホウ砂１（ｗ／ｖ）％をそれぞれ添加した以外は実施例１と同様の操作を行い、精製酵素溶液を回収した。粗酵素溶液からの精製アルカリプロテアーゼの回収率８４．４％であった。

【0044】

実施例５
４０％（ｖ／ｖ）プロピレングリコール水溶液を４０％（ｖ／ｖ）ポリエチレングリコール４００（ＰＥＧ４００）水溶液（ＳＰ値１７．８）、８０％（ｖ／ｖ）プロピレングリコール水溶液を８０％（ｖ／ｖ）ポリエチレングリコール４００水溶液（ＳＰ値１８．９）に変更した以外は実施例１と同様の操作を行い、精製酵素溶液を回収した。粗酵素溶液からの精製アルカリプロテアーゼの回収率は１００％であった。

【0045】

実施例６
４０％（ｖ／ｖ）プロピレングリコール水溶液を４０％（ｖ／ｖ）グリセリン水溶液（ＳＰ値２０．６）、８０％（ｖ／ｖ）プロピレングリコール水溶液を８０％（ｖ／ｖ）グリセリン水溶液（ＳＰ値２１．２）に変更した以外は実施例１と同様の操作を行い、精製酵素溶液を回収した。粗酵素溶液からの精製アルカリプロテアーゼの回収率は６６．５％であった。

【0046】

実施例７
粗酵素溶液、吸着後の洗浄液に塩化カルシウムを添加しないこと以外は実施例１と同様の操作を行い、精製酵素溶液を回収した。粗酵素溶液からの精製アルカリプロテアーゼの回収率は８３．２％であった。

【0047】

比較例１
粗酵素溶液、吸着後の洗浄液及び溶出液に塩化カルシウムを添加しないこと以外は実施例１と同様の操作を行い、精製酵素溶液を回収した。粗酵素溶液からの精製アルカリプロテアーゼの回収率は７．０％であった。

【0048】

実施例８
合成吸着剤としてダイヤイオンＨＰ２ＭＧ（三菱化学（株）製）を用いた以外は実施例１と同様の操作を行い、精製酵素溶液を回収した。粗酵素溶液からの精製アルカリプロテアーゼの回収率は６９．１％であった。

【0049】

実施例９
合成吸着剤としてダイヤイオンＨＰ２ＭＧ（三菱化学（株）製）を用いた以外は実施例４と同様の操作を行い、精製酵素溶液を回収した。粗酵素溶液からの精製アルカリプロテアーゼの回収率は７２．５％であった。

【0050】

比較例２
合成吸着剤としてダイヤイオンＨＰ２ＭＧ（三菱化学（株）製）を用いた以外は比較例１と同様の操作を行い、精製酵素溶液を回収した。粗酵素溶液からの精製アルカリプロテアーゼの回収率は２５．９％であった。

【0051】

実施例１０
吸着剤としてダイヤイオンＨＰ２０ＳＳ（三菱化学（株）製）を用いた以外は実施例１と同様の操作を行い、精製酵素溶液を回収した。粗酵素溶液からの精製アルカリプロテアーゼの回収率は４８．６％であった。

【0052】

実施例１１
吸着剤としてダイヤイオンＨＰ２０ＳＳ（三菱化学（株）製）を用いた以外は実施例４と同様の操作を行い、精製酵素溶液を回収した。粗酵素溶液からの精製アルカリプロテアーゼの回収率は６１．３％であった。

【0053】

比較例３
吸着剤としてダイヤイオンＨＰ２０ＳＳ（三菱化学（株）製）を用いた以外は比較例１と同様の操作を行い、精製酵素溶液を回収した。粗酵素溶液からの精製アルカリプロテアーゼの回収率は３２．６％であった。

【0054】

比較例４
吸着剤としてセルファインフェニル（ＪＮＣ（株）製）（母体の主鎖はセルロース、側鎖はフェニル基）を用いた以外は実施例１と同様の操作を行い、精製酵素溶液を回収した。粗酵素溶液からの精製アルカリプロテアーゼの回収率は４１．２％であった。

【0055】

実施例及び比較例における製造条件、各工程でのアルカリプロテアーゼの回収率を表１及び表２に示す。

【0056】

【表1】

【0057】

【表2】

【0058】

表１及び表２より明らかなように、所定の疎水性合成吸着剤を用い、水溶性カルシウム塩を含む有機溶媒水溶液を通液してアルカリプロテアーゼを溶出させることにより、粗酵素溶液から精製アルカリプロテアーゼを高収率で回収できることが確認された。実施例１と実施例７の対比より、粗酵素溶液にも水溶性カルシウム塩を添加することで、より高収率で精製アルカリプロテアーゼを回収できることが確認された。
また、小粒径の合成吸着剤を用いることが好ましいことが確認された。