特許 6581906 確定因子によるヒト内皮の造血性多系列前駆細胞へのリプログラミング

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6581906

(24)【登録日】2019年9月6日

(45)【発行日】2019年9月25日

(54)【発明の名称】確定因子によるヒト内皮の造血性多系列前駆細胞へのリプログラミング

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/0789 20100101AFI20190912BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20190912BHJP

   C12N 15/12 20060101ALI20190912BHJP

   C12N 15/65 20060101ALI20190912BHJP

   A61K 35/28 20150101ALI20190912BHJP

   A61P 7/00 20060101ALI20190912BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20190912BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20190912BHJP

【ＦＩ】

   C12N5/0789

   C12N5/10ZNA

   C12N15/12

   C12N15/65 Z

   A61K35/28

   A61P7/00

   A61P35/00

   A61P35/02

【請求項の数】25

【全頁数】36

(21)【出願番号】特願2015-552909(P2015-552909)

(86)(22)【出願日】2014年1月15日

(65)【公表番号】特表2016-505266(P2016-505266A)

(43)【公表日】2016年2月25日

(86)【国際出願番号】US2014011575

(87)【国際公開番号】WO2014113415

(87)【国際公開日】20140724

【審査請求日】2017年1月12日

(31)【優先権主張番号】61/752,688

(32)【優先日】2013年1月15日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】508298488

【氏名又は名称】コーネル ユニヴァーシティー

(74)【代理人】

【識別番号】100127926

【弁理士】

【氏名又は名称】結田 純次

(74)【代理人】

【識別番号】100140132

【弁理士】

【氏名又は名称】竹林 則幸

(72)【発明者】

【氏名】ブラジスラヴ・エム・サンドラー

(72)【発明者】

【氏名】シャーイン・ラフィー

【審査官】 市島 洋介

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２０１２／１０９２０８（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特開２０１０−２２０５８１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２００５／１００５４９（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 Blood，２０１２年，Vol.120, No.6，pp.1344-1347

【文献】 Stem Cells，２０１１年，Vol.29, No.7，pp.1158-1164

【文献】 Blood Cancer J.，２０１１年，Vol.1，e36

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

Ｃ１２Ｎ １／００−７／０８

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ヒト内皮細胞（ＥＣ）からヒト造血性多系列前駆細胞（ＨＭＬＰ）を生成する方法であって、（ｉ）フィンケル−ビスキス−ジンキンス（Finkel-Biskis-Jinkins）マウス骨肉腫ウイルスのがん遺伝子ホモログＢ（ＦＯＳＢ）、またはＦＯＳＢと少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するその機能性誘導体、（ｉｉ）成長因子インディペンデント（growth factor independent）１転写リプレッサー（ＧＦＩ１）、またはＧＦＩ１と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するその機能性誘導体、（ｉｉｉ）ルント関連転写因子（Runt-related transcription factor）１（ＲＵＮＸ１）、またはＲＵＮＸ１と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するその機能性誘導体、および（ｉｖ）脾臓病巣形成ウィルスプロウィルス融合がん遺伝子（spleen focus forming virus proviral integration oncogene）（ＳＰＩ１）、またはＳＰＩ１と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するその機能性誘導体のすべてを発現するＥＣを、内皮支持細胞と共に無血清培地中で培養することを含む方法。

【請求項2】

前記ＥＣが、胎児の内皮細胞、新生児の内皮細胞、成人の内皮細胞、または内皮前駆細胞（ＥＰＣ）から選択される、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記ＥＣが、ヒト臍帯血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）または成人皮膚微小血管内皮細胞（ｈＤＭＥＣ）から選択される、請求項２に記載の方法。

【請求項4】

前記内皮支持細胞が、アデノウイルスＥ４オープンリーディングフレーム１（Ｅ４ＯＲＦ１）遺伝子またはＡｋｔ遺伝子のいずれかを発現するために形質転換されたヒト臍帯血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）である、請求項１に記載の方法。

【請求項5】

前記ＥＣが、ＦＯＳＢまたはＦＯＳＢと少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するその機能性誘導体、ＧＦＩ１またはＧＦＩ１と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するその機能性誘導体、ＲＵＮＸ１またはＲＵＮＸ１と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するその機能性誘導体、およびＳＰＩ１またはＳＰＩ１と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するその機能性誘導体の発現を駆動する１つまたはそれ以上のベクターで形質導入される、請求項１に記載の方法。

【請求項6】

前記ベクターの少なくとも１つが選択可能なマーカーを更に含む、請求項５に記載の方法。

【請求項7】

前記選択可能なマーカーが、抗生物質抵抗性マーカー、酵素マーカー、エピトープマーカーまたは視覚マーカーである、請求項６に記載の方法。

【請求項8】

内皮支持細胞の存在下で培養する前に、少なくとも１つの選択可能なマーカーを発現する細胞を選択することによって、前記ＥＣが、ＦＯＳＢ、ＧＦＩ１、ＲＵＮＸ１および／またはＳＰＩ１、またはそれらのいずれかの機能性誘導体の発現に関して富化される、請求項６に記載の方法。

【請求項9】

ＦＯＳＢ、ＧＦＩ１、ＲＵＮＸ１、ＳＰＩ１、またはそれらのいずれかの機能性誘導体の１つまたはそれ以上の発現が誘導性である、請求項５に記載の方法。

【請求項10】

ＦＯＳＢ、ＧＦＩ１、ＲＵＮＸ１、ＳＰＩ１、またはそれらのいずれかの機能性誘導体の１つまたはそれ以上の発現が一過性である、請求項５に記載の方法。

【請求項11】

前記ＨＭＬＰが赤血球系、リンパ系、骨髄系、および巨核球細胞を産生することができる、請求項１に記載の方法。

【請求項12】

ＣＤ４５⁺細胞の選択に基づいて、ＨＭＬＰを単離することを更に含む、請求項１に記載の方法。

【請求項13】

前記ＨＭＬＰがＣＤ４５⁺ＣＤ３４⁺である、請求項１２の方法。

【請求項14】

前記ＨＭＬＰがＣＤ４５⁺Ｌｉｎ^-ＣＤ４５ＲＡ^-ＣＤ３８^-ＣＤ９０⁺ＣＤ３４⁺またはＣＤ４５⁺Ｌｉｎ^-ＣＤ４５ＲＡ^-ＣＤ３８^-ＣＤ９０^-ＣＤ３４⁺である細胞を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項15】

前記ＨＭＬＰが、レシピエントに移植後、造血細胞に分化することができる、請求項１に記載の方法。

【請求項16】

前記ＥＣを少なくとも５日間培養してＨＭＬＰを生成させる、請求項１に記載の方法。

【請求項17】

前記ＥＣを、ｂＦＧＦ、ＥＧＦ、ＳＣＦ、ＦＬＴ３、ＴＰＯおよびＩＬ−６を含む無血清造血培地中、内皮支持細胞の存在下で増殖させる、請求項１に記載の方法。

【請求項18】

前記培地が、ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２およびＩＬ−３を更に含む、請求項１７に記載の方法。

【請求項19】

前記培地が造血幹細胞培地である、請求項１７に記載の方法。

【請求項20】

ＦＯＳＢまたはＦＯＳＢと少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するその機能性誘導体、ＧＦＩ１またはＧＦＩ１と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するその機能性誘導体、ＲＵＮＸ１またはＲＵＮＸ１と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するその機能性誘導体、およびＳＰＩ１またはＳＰＩ１と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するその機能性誘導体の発現を駆動する１つまたはそれ以上のベクターを含むＨＭＬＰの集団。

【請求項21】

薬学的に許容しうる担体中に、請求項２０に記載のＨＭＬＰを含む組成物。

【請求項22】

請求項２０に記載のＨＭＬＰを含む、レシピエントにおける造血障害を治療するための医薬組成物。

【請求項23】

前記造血障害が白血病またはリンパ腫から選択される、請求項２２に記載の医薬組成物。

【請求項24】

前記ＨＭＬＰが前記レシピエントに対して自家である、請求項２２に記載の医薬組成物。

【請求項25】

前記ＨＭＬＰによって前記レシピエントに悪性転換が生じない、請求項２２に記載の医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本願は、２０１３年１月１５日に出願された米国仮出願６１／７５２，６８８号に対する優先権を主張し、それは全体として本明細書に組み込まれる。

【背景技術】

【0002】

体細胞は、核移植（非特許文献１；非特許文献２、非特許文献３）、細胞融合（非特許文献４；非特許文献５；非特許文献６）、および転写因子の強制発現（非特許文献７；非特許文献８）によって多能性状態にリプログラミングされている。また、体細胞は、筋芽細胞（非特許文献９）、マクロファージ様細胞（非特許文献１０）、ベータ細胞（非特許文献１１）、肝細胞様細胞（非特許文献１２）、ニューロン（非特許文献１３）および内皮細胞（非特許文献１４）のような最終分化細胞にもリプログラミングされている。最近、多くのグループが線維芽細胞を神経幹細胞／多系列神経前駆細胞へ直接にリプログラミングすることを報告した（非特許文献１５；非特許文献１６；非特許文献１７）。しかし、体細胞から機能的に移植可能な多系列造血幹細胞・前駆細胞（ＨＳＰＣ）への直接変換は、達成が困難であった（非特許文献１８；非特許文献１９；非特許文献２０）。

【0003】

マウスの発生中、最終的な造血幹細胞（ＨＳＣ）は、大動脈−性腺−中腎（ＡＧＭ）領域内の背部大動脈で生じる（非特許文献２１；非特許文献２２；非特許文献２３）。ゼブラフィッシュ、マウスおよびおそらくヒトを含むこと脊椎動物では、ＨＳＣは、背部大動脈床および臍動脈の内側を覆う造血性血管細胞の層から発生すると考えられる（非特許文献２４；非特許文献２５；非特許文献２６；非特許文献２７）。この過程は、転写因子（ＴＦ）ＲＵＮＸ１の発現によって左右される（非特許文献２８）。受胎産物中の内皮細胞（ＥＣ）およびＨＳＰＣの発生の密接な関連から造血のＥＣ造血移行論（EC-hematopoietic transition theory of hematopoiesis）が導かれている（非特許文献２９）。

【0004】

ＨＳＣおよび最終的な赤血球／骨髄系前駆細胞（ＥＭＰ）は、造血ＥＣを含有する多くの部位から生じることが知られているが、鍵となる分子の同一性およびそれらの活性の順序がわかりにくいままであるため（非特許文献３０）、初期（primitive）造血ＥＣから造血前駆細胞への自発的な個体発生の移行（transition）を駆動する分子プログラムを特徴づけることは困難であった（非特許文献３１；非特許文献３２）。造血ＥＣ子孫におけるＴＦの差次的発現は、最終的なＨＳＰＣまたはＥＣを得るための早期の発生的決定につながっている（非特許文献３３）。しかし、ＴＦがこれらの細胞内運命決定を導くかどうか、または造血ＥＣ中で予め決められたプログラムを単に促進するかどうかは、明らかではない。初期ＨＳＣの生理学的増殖および有効な造血発生には、ＡＧＭ、胎児肝臓および胎盤内のもののような解剖学的に明瞭なニッチによって提供される微小環境キュー（microenvironmental cue）も必要である（非特許文献３４）。

【0005】

血液疾患の最新の治療方法は、健康なＨＳＰＣの移植に依存している。現在、十分な数の同種異系および自己由来ＨＳＰＣを産生する主要な方法は２つあり、それらはいずれも制限がある：（１）ＨＳＰＣのex-vivo増殖（例えば臍帯血からのＨＳＰＣ）；および（２）多能性細胞からＨＳＰＣへの誘導された分化。健康なＨＳＰＣのex-vivo増殖は、ドナーの有効性によって制限されており、そして自家移植の場合、精製方法、そして同種間移植の場合、ＨＬＡ適合によって複雑になる。多能性細胞の誘導された分化は、造血系発生の理解および安定なＥＣの生成によって制限されており、そして十分な量の成体移植可能なＨＳＰＣはまだ得られていない。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0006】

【非特許文献1】Gurdon, J. B. et al., Nature 182:64-65 (1958)

【非特許文献2】Eggan, K. et al., Nature 428:44-49 (2004)

【非特許文献3】Noggle, S. et al, Nature 478:70-75 (2011)

【非特許文献4】Tada, M. et al., Curr Biol 11:1553-1558 (2001)

【非特許文献5】Cowan, C. A. et al., Science 309:1369-1373 (2005)

【非特許文献6】Blau, H. M. et al., Semin Cell Dev Biol 10:267-272 (1999)

【非特許文献7】Takahashi, K. et al., Cell 131:861-872 (2007)

【非特許文献8】Chen, M. J. et al., Cell Stem Cell 9:541-552 (2011)

【非特許文献9】Davis, R. L. et al, Cell 51:987-1000 (1987)

【非特許文献10】Xie, H. et al., Cell 117:663-676 (2004)

【非特許文献11】Zhou, Q. et al., Nature 455:627-632 (2008)

【非特許文献12】Sekiya, S. et al., Nature 475:390-393 (2011)

【非特許文献13】Vierbuchen, T. et al., Nature 463:1035-1041 (2010)

【非特許文献14】Ginsberg, M. et al., Cell 151:559-575 (2012)

【非特許文献15】Han, D. W. et al., Cell Stem Cell 10:465-472 (2012)

【非特許文献16】Lujan, E. et al., Proc Natl Acad Sci U S A 109:2527-2532 (2012)

【非特許文献17】Thier, M. et al., Cell Stem Cell 10:473-479 (2012)

【非特許文献18】Szabo, E. et al. Nature 468:521-526 (2010)

【非特許文献19】Chambers, S. M. et al., Cell 145:827-830 (2011)

【非特許文献20】Pereira, C. F. et al., Cell Stem Cell 13:205-218 (2013)

【非特許文献21】North, T. E. et al., Immunity 16:661-672 (2002)

【非特許文献22】de Bruijn, M. F. et al., EMBO J 192:465-2474 (2000)

【非特許文献23】Medvinsky, A. et al., Cell 86:897-906 (1996)

【非特許文献24】Zovein, A. C. et al., Cell Stem Cell 3:625-636 (2008)

【非特許文献25】Boisset, J. C. et al., Nature 464:116-120 (2010)

【非特許文献26】Bertrand, J. Y. et al., Nature 464:108-111 (2010）

【非特許文献27】Kissa, K. et al., Nature 464:112-115 (2010)

【非特許文献28】Chen, M. J. et al., Nature 457:887-891 (2009)

【非特許文献29】Zovein, A. C. et al., Cell Stem Cell 3:625-636 (2008)

【非特許文献30】Orkin, S. H. et al., Cell 132:631-644 (2008)

【非特許文献31】Chen, M. J. et al., Nature 457:887-891 (2009)

【非特許文献32】North, T. E. et al., Cell 137:736-748 (2009)

【非特許文献33】Chen, M. J. et al. Cell Stem Cell 9:541-552 (2011)

【非特許文献34】Gekas, C. et al., Dev Cell 8:365-375 (2005)

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0007】

本発明は、ＥＣの特定の転写因子の強制発現を実施し、そして無血清培地中、内皮支持細胞の存在下でＥＣを培養することによる、内皮細胞（ＥＣ）からの造血性多系列前駆細胞（ＨＭＬＰ）の生成に関する。本発明に従って生成されるＨＭＬＰは、赤血球系、リンパ系、骨髄系、および巨核球細胞を産生することができる。これらの生成されたＨＭＬＰはマウスに移植可能であり、したがって、造血状態を含む障害の治療的な処置に用いることができる。

【0008】

したがって、本開示は、ヒト内皮細胞（ＥＣ）からヒト造血性多系列前駆細胞（ＨＭＬＰ）を生成する方法を提供する。本方法は、転写因子フィンケル−ビスキス−ジンキンス（Finkel-Biskis-Jinkins）マウス骨肉腫ウイルスのがん遺伝子ホモログＢ（ＦＯＳＢ）
、成長因子インディペンデント（growth factor independent）１転写リプレッサー（ＧＦＩ１）、ルント関連転写因子（Runt-related transcription factor）１（ＲＵＮＸ１）、脾臓病巣形成ウィルスプロウィルス融合がん遺伝子（spleen focus forming virus proviral integration oncogene）（ＳＰＩ１）、またはＦＯＳＢ、ＧＦＩ１、ＲＵＮＸ１およびＳＰＩ１の機能性ホモログまたは誘導体のそれぞれを発現するように形質転換されたＥＣを、内皮支持細胞と共に無血清培地中で培養することを含む。

【0009】

ＨＭＬＰを生成するために用いることができるＥＣとしては、胎児、新生児、成人および前駆細胞ＥＣが含まれる。いくつかの実施態様では、ＥＣは、ヒト臍帯血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）または成人皮膚微小血管内皮細胞（ｈＤＭＥＣ）から選択される。

【0010】

いくつかの実施態様において、転写因子の強制発現は、ＦＯＳＢ、ＧＦＩ１、ＲＵＮＸ１およびＳＰＩ１の発現を駆動する１つまたはそれ以上のベクターを用いたＥＣの形質導入によって実施される。また、これらのベクターの少なくとも１つとしては、選択可能なマーカー、例えば抗生物質抵抗性マーカー、酵素マーカー、エピトープマーカーまたは視覚マーカーが含まれる。ＥＣは、内皮支持細胞の存在下で培養する前に、少なくとも１つの選択可能なマーカーを発現する細胞を選択することによってＦＯＳＢ、ＧＦＩ１、ＲＵＮＸ１および／またはＳＰＩ１の発現に関して富化することができる。いくつかの実施態様では、ＦＯＳＢ、ＧＦＩ１、ＲＵＮＸ１およびＳＰＩ１の１つまたはそれ以上の発現は、誘導性および／または一過性である。

【0011】

内皮支持細胞は、さまざまなＥＣから選択することができる。いくつかの実施態様において、支持細胞は、アデノウイルスＥ４オープンリーディングフレーム１（Ｅ４ＯＲＦ１）遺伝子またはＡｋｔ遺伝子から選択される遺伝子を発現するように形質転換されたヒト臍帯血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）である。

【0012】

ＥＣは、無血清造血培地、例えば無血清造血幹細胞培地中、内皮支持細胞の存在下で増殖させることができる。無血清造血培地としては、成長因子および／またはサイトカイン、特にｂＦＧＦ、ＥＧＦ、ＳＣＦ、ＦＬＴ３、ＴＰＯおよびＩＬ−６を含めることができる。無血清造血培地としては、ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２およびＩＬ−３を含めることもできる。ＥＣを少なくとも５日間培養してＨＭＬＰを生成することができる。ＨＭＬＰは、ＣＤ４５^＋細胞の選択に基づいて細胞培養液から単離することができる。いくつかの実施態様において、ＨＭＬＰは、ＣＤ４５^＋ＣＤ３４^＋細胞の選択によって選択される。生成されたＨＭＬＰは、典型的に細胞の不均一な混合物であるが、しかし、特定の実施態様において、ＨＭＬＰの混合物は、ＣＤ４５^＋Ｌｉｎ⁻ＣＤ４５ＲＡ⁻ＣＤ３８⁻ＣＤ９０^＋ＣＤ３４^＋および／またはＣＤ４５^＋Ｌｉｎ⁻ＣＤ４５ＲＡ⁻ＣＤ３８⁻ＣＤ９０⁻ＣＤ３４^＋である細胞を含む。

【0013】

さらに、本開示では、開示された方法により産生されたＨＭＬＰの集団、薬学的に許容しうる担体中の請求項１に記載の方法に従って産生されたＨＭＬＰを含む組成物が提供される。

【0014】

また、本明細書では、治療を必要とする対象にＥＣ生成ＨＭＬＰを投与することを含む、造血障害を治療する方法が提供される。ＨＭＬＰは、レシピエントに移植後、造血細胞に分化することができる。造血障害は、例えば、白血病またはリンパ腫から選択することができる。対象に投与されたＨＭＬＰは、対象にとって自家、または対象にとって同種異系であることができる。開示された方法に従って生成されたＨＭＬＰは、レシピエント中で悪性形質転換を生じることがない。

【図面の簡単な説明】

【0015】

【図1A】Ａ．ＨＵＶＥＣから造血性多系列前駆細胞へのリプログラミングプラットフォーム（ｒＥＣ−ＨＭＬＰ）の概要。廃棄された臍帯からＨＵＶＥＣを単離し、表現型的に顕著なＣＤ４５⁻ＣＤ１３３⁻ｃＫｉｔ⁻ＣＤ３１^＋内皮細胞（ＥＣ）の純粋な集団を選別し、そしてさらなる実験のため増殖させた（−１４日目〜０日目）。ＨＵＶＥＣをＦＧＲＳで形質導入し、そして導入遺伝子の発現を安定化させた（１〜３日目）。形質導入されたＨＵＶＥＣを１／６の密度で培養し（４日目）、そして無血清培地中のＥ４ＯＲＦ１^＋ＨＵＶＥＣ（Ｅ４−ＨＵＶＥＣ）の血管性ニッチ様の層上で増殖させた（１２〜４０日目）。血管性ニッチ様の層上で形質導入細胞を播種して約２週間後、明瞭な扁平状コロニーが観察された（１２〜１６日目）。時間と共に（２１〜２９日目）、これらのコロニーのいくつかは、推定ｒＥＣ−ＨＭＬＰを表す三次元ブドウ状構造体を生じた。１カ月（２９〜４０日目）後、ｒＥＣ−ＨＭＬＰは豊富に増殖してプロトタイプ造血コロニーを生じた。リプログラミングの過程は、二相：第Ｉ相−特化および第ＩＩ相−増殖にさらに分割される。増殖培養液を、形態学的変化、細胞数、および汎血球形成マーカーＣＤ４５の発現に関してルーチン的に検査した。灰色のトレースは、ＨＵＶＥＣのｒＥＣ−ＨＭＬＰへのリプログラミングにおける細胞数の動態を表す。黒色の線は、ｈＥＳ−ＥＣ細胞の造血前駆細胞への分化の低い増殖可能性を示す。

【図1B】Ｂ．ＨＵＶＥＣをＴＦのセットで形質導入した２〜３週後、丸くなった造血様ＣＤ４５^＋細胞の発生（白色矢印）。スケールバーは２００μｍである。

【図1C】Ｃ．ＦＧＲＳ形質導入ＨＵＶＥＣからの造血様クラスターの生成は、血管性ニッチおよび無血清環境で共培養することによって増強され、そして血清の存在によって遮断される。

【図1D】Ｄ．ＴＦを１つずつ除去することにより、ＨＵＶＥＣ培養で造血様コロニーを生成可能な最小限の因子セット（ＦＯＳＢ、ＧＦＩ１、ＲＵＮＸ１およびＳＰＩ１）が明らかになった。造血様クラスターの形成を惹起する能力に関して、２６ＴＦマイナス１のセットを評価した。アスタリスクは、ＴＦの完全なセットと比較した、形質導入されたＨＵＶＥＣの造血様クラスターの数の統計的に有意な（ｐ＜０．０５）低下を示す。対照は、非形質導入ＨＵＶＥＣを表す。形質導入された細胞を、無血清造血培地中の非形質導入Ｅ４−ＨＵＶＥＣの層上で培養した。

【図1E】Ｅ．ＦＧＲ因子の１つずつの除去は、長期持続造血様コロニーの生成にとって全４つのＦＧＲＳ因子が必要かつ十分であることを示している。

【図2A】Ａ．混合型ＧＦＰ Ｅ４−ＨＵＶＥＣフィーダー血管性単層およびＧＦＰ^＋ＦＧＲＳ形質導入ＨＵＶＥＣのＦＡＣＳ解析は、ＧＦＰ^＋新生造血細胞がＣＤ３１（成熟した内皮細胞マーカー）の発現を喪失し、そしてＣＤ４５^＋およびＣＤ４５^＋ＣＤ３４^＋造血表現型を獲得したことを示している。灰色フォントのドット−プロットのパーセンテージは、上の左側のドット−プロット（ＧＦＰ^＋細胞）のゲートに相当する。黒色フォントのドット−プロットのパーセンテージは、ＧＦＰ⁻細胞に相当する。

【図2B】Ｂ．ＦＧＲＳリプログラミングＨＵＶＥＣの免疫表現型解析。系列マーカー、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５、ＣＤ３４、ＣＤ９０およびＣＤ３８の発現に関して新生造血細胞を試験した。それぞれ造血幹様性細胞または多能性前駆細胞に関する表現型の基準を満たす、ＣＤ４５^＋Ｌｉｎ⁻ＣＤ４５ＲＡ⁻ＣＤ３８⁻ＣＤ９０^＋ＣＤ３４^＋およびＣＤ４５^＋Ｌｉｎ⁻ＣＤ４５ＲＡ⁻ＣＤ３８⁻ＣＤ９０⁻ＣＤ３４^＋細胞の２つの集団を示す。

【図2C】Ｃ．第Ｉ相終了後、ＦＧＲＳ形質導入および血管性ニッチ誘導の４週後、ＧＦＰＣＤ４５ＣＤ３４細胞を選別し、そしてＣＦＵアッセイのために播種した。ＣＦＵアッセイ（倍率×４）では典型的な造血コロニーが生じた；広視野（左の列）および対応する蛍光画像（右の列）。上部から底部：顆粒球−赤血球−単核球−巨核球（ＧＥＭＭ）、赤血球／骨髄、および顆粒球−マクロファージ（ＧＭ）コロニー。下方のパネル画像は、ヘモグルビン発現したコロニーを示す。グラフは、ＣＦＵアッセイの定量を示す。

【図2D】Ｄ．ＣＦＵアッセイコロニーから得た細胞のサイトスピンのWright-Giemza染色により、分化するｒＥＣ−ＨＭＬＰの系列特化が確認された（倍率×６０）。本発明者らは、赤血球、マクロファージ、顆粒球および巨核球前駆体の典型的な形態学的特徴を有する細胞を検出した。

【図2E】Ｅ．ＣＦＵアッセイで増殖した細胞の免疫表現型解析は、ＣＤ２３５^＋、ＣＤ１１ｂ^＋、ＣＤ１４^＋、ＣＤ８３^＋およびＣＤ４５^＋細胞を示し、ｒＥＣ−ＨＭＬＰが赤血球、マクロファージ、単球および樹状細胞子孫に分化したことを示唆している。

【図3A】Ａ．リプログラミングされた細胞（ＣＤ４５^＋ＧＦＰ^＋細胞１．５×１０^６）を亜致死的に照射された（２７５Ｒａｄ）マウス（ｎ＝９；照射１日後）に眼窩後注射した。

【図3B】Ｂ．２、５、１２および１６週に注射したマウスの末梢血中で循環ヒトＣＤ４５^＋細胞を検出した。２（ｎ＝７；１７．３８±７．７３％）、５（ｎ＝６；１５．１±１３．３９％）、１２（ｎ＝６；１４．１４±５．４４％）、および２２〜４０（ｎ＝６；２１．２３±２２．２７％）週で、循環ヒトＣＤ４５^＋細胞を検出した。脊髄形成異常および線維性変化のさらなる分析のため２２〜４４週（１０ヵ月まで）移植マウスを用いた。

【図3C】Ｃ．移植後１６週の末梢血、骨髄および脾臓の分析は、全３つの組織中のヒトＣＤ４５^＋細胞および末梢血中のｈＣＤ４５⁻ｈＣＤ２３５^＋赤血球細胞の存在を示した。ＢＭの結果を示す。ＢＭおよび脾臓は、小さいが、容易に検出可能な数のＣＤ４１ａ^＋（巨核球）細胞を有するｒＥＣ−ＨＭＬＰ（ＣＤ４５^＋ＣＤ３３^＋）の骨髄系子孫が集合した（populate）。

【図3D】Ｄ．メチルセルロース培養のＦＡＣＳ分析は、ＣＤ４５⁻コンパートメントがＣＤ２３５^＋（グリコホリンＡ）を含み、そしてマウスＴｅｒ１１９＋細胞を含まないことを示し、ＣＦＵアッセイ中のヒトＣＤ４５^＋ＣＤ３４^＋細胞の強い赤血球分化を示唆している。

【図3E】Ｅ．ＣＤ４５^＋Ｌｉｎ⁻ＣＤ４５ＲＡ⁻ＣＤ３８⁻ＣＤ９０⁻ＣＤ３４^＋を表現型的に特徴とし、そして多能性前駆細胞（ＭＰＰ）の定義を満たすヒト細胞の小さな集団を示す、骨髄中にin vivo移植されたｒＥＣ−ＨＭＬＰの表現型分析。

【図3F】Ｆ．単一コロニーレベルにおいてウイルス組込みの同定。Ｌｉｎ⁻ＣＤ４５ＲＡ⁻ＣＤ３８⁻ＣＤ９０⁻ＣＤ３４^＋細胞をＣＦＵアッセイに用いた。ＣＦＵアッセイ開始の１４日後、３つの明瞭な細胞凝集／コロニーを検出した。テンプレートとしてそれらのゲノムＤＮＡを用いてそれぞれ増幅されたコロニーに関して、４回のＰＣＲ反応を実施した。それらは、リプログラミングに用いた全４つのＦＧＲＳウイルスベクターの組込みを示した（下部の画像；文字Ｆ−ＦＯＳＢ、Ｇ−ＧＦＩ１、Ｒ−ＲＵＮＸ１、Ｓ−ＳＰＩ１は、第１のコロニー中のこれらの因子のそれぞれに関して特異的なＰＣＲ生成物を示す）。

【図3G】Ｇ．単細胞レベルにおけるウイルス組込みの同定。移植２２週後に、宿主マウスから単離された２１ヒトＣＤ４５^＋細胞の全ゲノム増幅（ＷＧＡ）。細胞を、Ｐｈｉ２９ベースのＷＧＡのため直接溶菌緩衝液にウェル当たり１細胞で、９６−ウエルプレート中に選別した。ＷＧＡに続いてＣＭＶプロモーターおよび導入遺伝子に特異的なプライマーによるＰＣＲ反応を行った。解析の定量化を示す。１９細胞は、全４つのウイルス（ＦＧＲＳ）の組込みを示した。２細胞が３つのウイルスの組込みを示した：ＦＧＳ（ＲＵＮＸ１は検出不可であった）およびＧＲＳ（ＦＯＳＢは検出不可であった）。

【図4A】Ａ．ｈＤＭＥＣ由来のｒＥＣ−ＨＭＬＰのin vitroおよびin vivo機能検査の図解表示。第Ｉ相終了後、ＦＧＲＳ形質導入の４週後、ｒＥＣ−ＨＭＬＰを選別し、そしてＣＦＵアッセイのため播種した。ＣＦＵアッセイでは典型的な造血コロニーが生じた（スケールバーは２００μｍである）；広視野（上の列）。下のパネル画像は、ヘモグロビンを発現したコロニーを示す。ＣＦＵアッセイコロニー（倍率×６０）から得た細胞のサイトスピンのWright-Giemsa染色を底部の列に示す。右のパネルのグラフは、ＣＦＵアッセイ（ｎ＝３）の定量化を示す。

【図4B】Ｂ．ＣＦＵアッセイにおいて増殖した細胞の免疫表現型解析。右のグラフは、ＣＦＵアッセイ（ｎ＝３）から細胞の表面マーカー発現の定量化を示す。ｈＤＭＥＣは、赤血球ＣＤ２３５^＋、マクロファージＣＤ１１ｂ^＋、単球ＣＤ１４^＋、骨髄ＣＤ３３^＋、内皮ＣＤ１４４^＋および樹状ＣＤ８３^＋細胞子孫を含むいくつかの系列に分化した。

【図4C】Ｃ．２週齢新生仔免疫不全ＮＳＧマウスに亜致死的に照射し（１００Ｒａｄ）、そしてｈＤＭＥＣ由来のｒＥＣ−ＨＭＬＰ（５×１０^４細胞）を移植した。一次移植４、６および１２週後のマウス末梢血の分析は、循環ヒトＣＤ４５^＋ならびにそれらの骨髄系および赤血球系子孫（ｎ＝６）を示した。

【図4D】Ｄ．一次移植１４週後のマウス脾臓の分析は、ヒトＣＤ４５^＋の存在ならびにそれらのリンパ系（ＣＤ１９^＋およびＣＤ５６^＋）および骨髄系（ＣＤ１１ｂ^＋およびＣＤ４１ａ^＋）子孫（ｎ＝３）を示した。右端のグラフ：第１の列、左手ｙ軸に対して測定されたｈＣＤ４５^＋（％）；次の４つの列、右手ｙ軸に対して測定されたｌｏｇ２（ｈＣＤ４５^＋％）。

【図4E】Ｅ．一次移植１４週後のマウスの骨髄の分析は、それぞれ（ｎ＝３）、ヒトＨＳＣおよび多能性前駆細胞（ＭＰＰ）の表現型定義を満たす、ＣＤ４５^＋Ｌｉｎ⁻ＣＤ４５ＲＡ⁻ＣＤ３８⁻ＣＤ９０^＋ＣＤ３４^＋および／またはＣＤ４５^＋Ｌｉｎ⁻ＣＤ４５ＲＡ⁻ＣＤ３８⁻ＣＤ９０⁻ＣＤ３４^＋細胞の小さな集団を有するヒトＣＤ４５^＋細胞の存在を示した。

【図4F】Ｆ．１２週後、ｈＤＭＥＣ由来のｒＥＣ−ＨＭＬＰで移植されたマウスの全骨髄を、成体（６〜８週齢）ＮＳＧマウスに二次移植した。二次移植３および５週後のマウス末梢血の分析は、循環ヒトＣＤ４５^＋およびそれらの骨髄系子孫（ｎ＝６）を示した。右端のグラフ：最初の２つの列、左手ｙ軸に対して測定されたｈＣＤ４５^＋（％）；最後の列、右手ｙ軸に対して測定されたｈＣＤ３３^＋（％）。

【図5A】Ａ．総合的な遺伝子転写プロファイリングは、ＣＤ４５^＋ｒＥＣ−ＨＬＭＰ中で、およびin vivo移植されたＣＤ４５^＋ＣＤ３４^＋ｒＥＣ−ＨＭＬＰ中で、移植後２２週後、スイッチが入る造血遺伝子および発現抑制される血管性遺伝子を明らかにした。両方の集団を、ＨＵＶＥＣおよびＣＤ３４^＋Ｌｉｎ⁻臍帯血細胞の遺伝子発現と比較する。データは、ｌｏｇ２（転写レベル）として示す。

【図5B】Ｂ．移植後２２週後のＨＵＶＥＣ、ＣＤ４５^＋ｒＥＣ−ＨＬＭＰ、ＣＤ４５^＋ＣＤ３４^＋ｒＥＣ−ＨＭＬＰおよびＣＤ３４^＋Ｌｉｎ⁻細胞におけるプロトタイプ多能性遺伝子の発現と、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）との比較。プロトタイプ多能性遺伝子、例えばＯｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ２およびＭｙｃは、ｈＥＳＣおよびナイーブＨＵＶＥＣと比較してリプログラミングされた細胞中で上方制御されず、これは、ＨＵＶＥＣのｒＥＣ−ＨＭＰＬへのリプログラミングが多能性状態を通して移行することなく達成されたことを示している。

【図5C】Ｃ．ＧＦＩ１と共にＳＰＩ１によって、およびそれとは別にＳＰＩ１によって結合された部位の遺伝子オントロジー（ＧＯ）解析。各グラフは、ＥＣからｒＥＣ−ＨＭＬＰへの細胞独自性（cellular identity）の変更に関与しうるＧＯ遺伝子群を示す。リプログラミング因子および可能な候補に関するコンセンサスＤＮＡ結合モチーフ（ｐ＜０．０１）を各群のグラフの下に示す。上方制御または下方制御された遺伝子のすべての値は、｜ｌｏｇ２（ｒＥＣ−ＨＭＬＰ／ＨＵＶＥＣ）｜≧２である。

【図6A】Ａ．ｒＥＣ−ＨＭＬＰは、ＳＰＩ１の外因性発現なしでＣＤ３^＋、ＣＤ１９^＋およびＣＤ１４^＋造血細胞に分化する。リプログラミングされた細胞は、Delta-like 4（ＯＰ９−ＤＬ４）を発現する骨髄間質細胞（ＯＰ９）層上で移され、そしてＩＬ−７（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−１１（１０ｎｇ／ｍｌ）およびＩＬ−２（５ｎｇ／ｍｌ）で補充され、そしてドキシサイクリンを含まない無血清造血培地（方法を参照のこと）の存在下で増殖させた。

【図6B】Ｂ．ｒＥＣ−ＨＭＬＰから分化したマクロファージは、食作用が可能である。画像は、摂取されたビーズが明確に認識できる堅固なプラスチック付着性のＣＤ１１ｂ^＋ＧＦＰ^＋細胞の群を示す。左から右の画像の列：ＧＦＰ蛍光；ＤＡＰＩで染色された細胞の核、蛍光ビーズ；ＣＤ１１ｂ染色；左の４枚のパネルの合わせた画像。スケールバーは１５μｍである。

【発明を実施するための形態】

【0016】

開示の詳細な説明
本明細書において、内皮細胞（ＥＣ）を造血性多系列前駆細胞（ＨＭＬＰまたはｒＥＣ−ＨＭＬＰ）にリプログラミングする方法が提供される。本方法は、ヒト臍帯静脈ＥＣ（ＨＵＶＥＣ）およびヒト成人皮膚微小血管ＥＣ（ｈＤＭＥＣ）のようなＥＣをＨＭＬＰに有効にリプログラミングする、ＦＯＳＢ、ＧＦＩ１、ＲＵＮＸ１およびＳＰＩ１（ＦＧＲＳ）を含む、転写因子（ＴＦ）のセットを用いてＥＣ細胞を培養することを含む。

【0017】

ヒト造血性多系列前駆細胞（ＨＭＬＰ）は、本明細書において言及するように、多くのタイプの造血系細胞を生成する、またはそれらに分化する能力または可能性を有する細胞である。造血系、およびこれらの系列によって包含される分化細胞は、赤血球、単球、マクロファージ、巨核球、骨髄芽球、樹状細胞および顆粒球（好塩基球、好中球、好酸球およびマスト細胞）を含む骨髄系細胞；ならびにＴリンパ球／Ｔ細胞、Ｂリンパ球／Ｂ細胞、およびナチュラルキラー細胞を含むリンパ系細胞である。本明細書に開示された方法によって生成されるＨＭＬＰは、Ｔ細胞、Ｂ細胞、赤血球、単球、マクロファージ、巨核球、骨髄芽球、樹状細胞および顆粒球を含む、骨髄系およびリンパ系の造血細胞を生成する能力を有する。

【0018】

本明細書に開示されたＨＭＬＰは、移植（レジデンシー（residency）を確立する）能力を有し、そしてレシピエントに移植した後、造血細胞の長期再増殖をもたらす。開示されたＨＭＬＰは、生着後、多系列の可能性を維持しており、そしてまた、１人のレシピエントから１人または複数のさらなるレシピエントまでその後の生着が可能であると同時に、多系列の可能性をなお維持している。長期生着の能力（例えば、移植後、４週、８週、１２週、１６週、もしくは２０週、またはそれよりも長期）、多系列の可能性の維持、および二次的生着は、それぞれ、造血障害の治療に適用する際に細胞集団において非常に望ましい。

【0019】

ＨＭＬＰは、細胞表面マーカーの発現によって定義することができる。ＨＭＬＰは不均一な細胞集団を表すが、細胞は、ＣＤ４５の発現を部分的に特徴としている（すなわち、細胞はＣＤ４５^＋である）。特定の実施態様において、ＨＭＬＰは、ＣＤ４５^＋ＣＤ３４^＋である。ＨＭＬＰは、さらにＣＤ９０^＋かつ／またはＣＤ３８^＋であることができる。

【0020】

本発明に従って生成されるＨＭＬＰは、均一ではなく、そして細胞タイプの混合物を含有しており、それぞれの細胞タイプは、異なる細胞マーカー、異なる形態、および／または異なる分化レベルを示す。特定の実施態様において、ＨＭＬＰは、骨髄系および／またはリンパ系の細胞に分化可能な少なくとも１つの前駆細胞を含有する。特定の実施態様において、ＨＭＬＰの集団は、マーカーＣＤ４５^＋Ｌｉｎ⁻ＣＤ４５ＲＡ⁻ＣＤ３８⁻ＣＤ９０^＋ＣＤ３４^＋を発現する前駆細胞、および／またはマーカーＣＤ４５^＋Ｌｉｎ⁻ＣＤ４５ＲＡ⁻ＣＤ３８⁻ＣＤ９０⁻ＣＤ３４^＋を発現する前駆細胞を、集団中の細胞の総数の少なくとも０．０１％〜少なくとも０．４％、または集団中１００万当たり少なくとも１０細胞〜１００万当たり少なくとも２５０細胞含有する。
ＨＭＬＰを生成する方法

【0021】

本明細書に開示された方法において、ＨＭＬＰは、内皮細胞（ＥＣ）をリプログラミングしてリプログラミングされた内皮細胞由来のＨＭＬＰ（ｒＥＣ−ＨＭＬＰ、本明細書ではＨＭＬＰとも称する）を提供することによって生成される。本明細書に用いるように、「リプログラミング」は、分化した体細胞が、誘導元となるそれらの細胞よりも高い潜在能力を有する脱分化細胞に変換される遺伝過程のことをいう。ＥＣは、細胞の分化状態を造血前駆細胞タイプに変える特定の転写因子の発現を細胞に強制することによってリプログラミングされる。

【0022】

ＨＭＬＰの生成に用いることができる内皮細胞としては、成熟したＥＣ（例えば、新生児、胎児および成人のＥＣ）、および内皮前駆細胞（ＥＰＣ）が含まれる。例示的なＥＣ源としては、成人真皮または新生児包皮からのヒト皮膚微小血管ＥＣ（ＨＤＭＥＣ）、ヒト臍帯静脈／臍帯血ＥＣ（ＨＵＶＥＣ）、ヒト臍動脈ＥＣ（ＨＵＡＥＣ）、ヒト大動脈ＥＣ（ＨＡｏＥＣ）、ヒト冠動脈ＥＣ（ＨＣＡＥＣ）、ヒト肺動脈ＥＣ（ＨＰＡＥＣ）、ヒト伏在静脈ＥＣ（ＨＳＶＥＣ）、ヒト皮膚の血液ＥＣ（ＨＤＢＥＣ）、ヒト皮膚のリンパＥＣ（ＨＤＬＥＣ）、ヒト膀胱微小血管ＥＣ（ＨＢＭＥＣ）、ヒト心臓微小血管ＥＣ（ＨＣＭＥＣ）、ヒト肺微小血管ＥＣ（ＨＰＭＥＣ）、ヒト子宮微小血管ＥＣ（ＨＵＭＥＣ）、ヒト脳微小血管ＥＣ（ＨＢＭＥＣ）および胎児胎盤微小血管ＥＣ（ＨＰＭＥＣ）が含まれる。これらの細胞は、フォン・ウィルブランド因子（ｖＷＦ）陽性、ＣＤ３１陽性、ＣＤ１４４陽性、平滑筋アルファ−アクチン（ＳＭＡ）陰性である。胎児微小血管ＥＣは、マーカーＣＤ３４^＋ＣＤ１３３^＋ＶＥＧＦＲ２^＋ＣＤ４５⁻を有する胎児微小血管細胞としてさらに定義される（Solder E. et al., Microvasc. Res. 84:65-73 (2012)参照）。内皮前駆細胞は、成熟した内皮細胞に分化可能なそれらの前駆細胞を含み、そしてＣＤ３４^＋ＶＥＧＦＲ２^＋、そしてまた、おそらくＣＤ１３３^＋ＣＤ４５⁻を特徴とする（Urbich C. and Dimmeler S., Circ. Res. 95:343-353 (2004)）。好ましい実施態様において、ＥＣは、ＨＵＶＥＣまたはｈＤＭＥＣである。

【0023】

本発明に用いるＥＣは、同種異系（リプログラミングされた細胞を受けることになっているレシピエントと遺伝子的に類似しているが、同一でない、例えば、同種のドナーに由来する）、同系（リプログラミングされた細胞を受けることになっているレシピエントと遺伝子的に同一であるか、または密接に関連があるドナーに由来する）、または自家（ドナーとレシピエントとが同じ個体である）であってもよい。

【0024】

リプログラミング因子
本明細書において確認された転写因子（ＴＦ）の発現（過剰発現および強制発現を含む）は、ＥＣをＨＭＬＰにリプログラムミングすることができる。ＥＣからＨＭＬＰを生成するには、少なくともＦＯＳＢ、ＧＦＩ１、ＲＵＮＸ１およびＳＰＩ１（これらの４つの因子は、本明細書においてひとまとめにして「ＦＧＲＳ」または「リプログラミング因子」と呼ぶ）、またはそれらのそれぞれの機能性ホモログもしくは機能性誘導体の発現が必要である。

【0025】

ＦＯＳＢ（Finkel-Biskis-Jinkinsマウス骨肉腫ウイルスのがん遺伝子ホモログＢ）は、ＪＵＮファミリーのタンパク質と二量体化して転写因子複合体ＡＰ−１を形成するロイシンジッパータンパク質である。また、ＦＯＳＢは、ＡＰ−１、Ｇ０Ｓ３、ＧＯＳ３またはＧＯＳＢとしても知られている。ＦＯＳＢは、少なくとも６つのスプライスバリアントアイソフォームを有する。例として、特定のヒトＦＯＳＢバリアント、ＦＯＳＢアイソフォーム１に関する配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＣＡＧ４６８９８に記載されている。

【0026】

ＧＦＩ１（Growth factor independent 1転写リプレッサー）は、転写リプレッサーとして機能する核亜鉛フィンガータンパク質のファミリーのメンバーである。ＧＦＩファミリー亜鉛フィンガーリプレッサーは、ヒストン脱アセチル化酵素補充を介して多系列血液血液細胞発生の特化（specification）の役割を果たす多くの遺伝子を抑制するＥＨＭＴ２−ＧＦＩ１−ＨＤＡＣ１、ＡＪＵＢＡ−ＧＦＩ１−ＨＤＡＣ１およびＲＣＯＲ−ＧＦＩ−ＫＤＭ１Ａ−ＨＤＡＣのようなヘテロトリマー複合体を形成する。また、ＧＦＩ１は、ＳＣＮ２、ＧＦＩ−１、ＧＦＩ１ＡおよびＺＮＦ１６３としても知られている。ＧＦＩ１には少なくとも４つの知られているスプライスバリアントアイソフォームがある。例として、特定のヒトＧＦＩ１バリアント、アイソフォーム１の配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＡＨ３２７５１に記載されている。

【0027】

ＲＵＮＸ１（Runt-related転写因子１）は、多くのエンハンサーおよびプロモーターのコア要素に結合するヘテロダイマー転写因子であるコア結合因子（ＣＢＦ）のアルファサブユニットである。ＲＵＮＸファミリーには、多くのＣＢＦ結合ＴＦ、例えばＲＵＮＸ２、ＲＵＮＸ３、ＣＢＦＢ、ＣＥＢＰ／Ｚ、ＮＦＹ／Ｂ、ＮＦＡ／Ａ、ＮＦＹ／ＣおよびＲＢＰＪが含まれる。ＲＵＮＸ１には、少なくとも３つのスプライスバリアントアイソフォームがある。また、ＲＵＮＸ１は、ＡＭＬ１、ＡＭＬ１−ＥＶＩ−１、ＡＭＬＣＲ１、ＣＢＦＡ２、ＥＶＩ−１およびＰＥＢＰ２ａＢとしても知られている。例として、特定のヒトＲＵＮＸ１バリアント、アイソフォーム１の配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＡＩ３６３８１に記載されている。

【0028】

ＳＰＩ１（脾臓フォーカス形成ウイルス（ＳＦＦＶ）プロウイルス組込み癌遺伝子）は、ＥＴＳドメイン転写因子である。ＳＰＩ１は、ＳＰＩＢ、ＥＴＶ６、ＥＴＳ１、ＥＴＶ２およびＥＲＧを含む転写因子をコードするＥＴＳドメインのファミリーに属する。ＳＰＩ１には、少なくとも３つのスプライスバリアントがある。また、ＳＰＩ１は、ｈＣＧ＿２５１８１、ＯＦ、ＰＵ．１、ＳＦＰＩ１、ＳＰＩ−１およびＳＰＩ−Ａとしても知られている。例として、特定のヒトＳＰＩ１バリアント、アイソフォーム１の配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＥＡＷ６７９２４に記載されている。

【0029】

本明細書において具体的に参照された転写因子の機能性誘導体およびホモログは、開示された方法に使用することをさらに意図している。本明細書に用いるように、「機能性誘導体」は、本明細書に開示されたＴＦの生物学的機能を発揮する能力を有する分子、すなわち、例えば、ＥＣをＨＭＬＰにリプログラミングする際に、開示されたＴＦに関して機能的に置換することができる分子である。機能性誘導体としては、融合タンパク質を含む、天然、合成または組換え供給源からの断片、部分、区分、同等物、類似体、突然変異体、ミメティックが挙げられる。誘導体は、アミノ酸の挿入、欠失または置換から誘導してもよい。アミノ酸挿入誘導体は、アミノおよび／またはカルボキシル末端の融合ならびに単一または複数のアミノ酸の配列内挿入を含む。生成した生成物の適したスクリーニングによりランダム挿入も可能であるが、挿入性アミノ酸配列変異体は、１つまたはそれ以上のアミノ酸残基がタンパク質中の所定の部位に導入されたものである。欠失変異体は、配列から１つまたはそれ以上のアミノ酸の除去を特徴とする。置換アミノ酸変異体は、配列中の少なくとも１つの残基が除去され、そしてその位置に異なる残基が挿入されたものである。アミノ酸配列への付加には、他のペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質との融合が含まれる。

【0030】

分子の変異体は、構造および機能において分子全体、またはそのフラグメントのいずれかと実質的に類似した分子のことを意味する。したがって、変異体という用語が本明細書に用いられるときは、２つの分子は、たとえ分子の一方の構造がもう一方で見いだされなくても、またはアミノ酸残基の配列が同一でなくても、それらが類似の活性を有する場合、互いの変異体である。変異体という用語は、例えば、遺伝子のスプライスバリアントまたはアイソフォームを含む。同等物は、機能性類似体またはアゴニストとして作用することができる分子への言及を含むことを理解すべきである。同等物は、必ずしも対象分子から誘導されなくてもよいが、しかし、特定の立体配置的類似性を共有してもよい。同等物には、ペプチドミミックも含まれる。

【0031】

「ホモログ」は、一般的な祖先ＤＮＡ配列からの下降によって第２のタンパク質に関連したタンパク質である。同じタンパク質ファミリー（例えば、ＦＯＳファミリー、ＧＦＩファミリー、ＳＰＩファミリーまたはＲＵＮＸファミリー）のメンバーは、ホモログであることができる。「機能性ホモログ」は、所望の遺伝子の生物活性を発揮することが可能であり、すなわち、ＥＣをＨＭＬＰにリプログラミングするにあたって開示されたＴＦに関して機能的に置換することができる関連タンパク質またはその断片である。本明細書に企図されるホモログおよび機能性ホモログは、異なる種から誘導されたタンパク質が含まれるが、それらに限定されるわけではない。

【0032】

機能性誘導体またはホモログは、知られているＦＯＳＢ、ＧＦＩ１、ＲＵＮＸ１もしくはＳＰＩ１アミノ酸配列に対して７５％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくはそれ以上のアミノ酸配列同一性、またはＦＯＳＢ、ＧＦＩ１、ＲＵＮＸ１またはＳＰＩ１ファミリーメンバーもしくはその変異体に対して７５％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくはそれ以上のアミノ酸配列同一性を有することができる。ＦＯＳＢ機能性誘導体またはホモログは、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＣＡＧ４６８９８に対して７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはそれ以上のアミノ酸配列同一性を有することができる。ＧＦＩ１機能性誘導体またはホモログは、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＡＨ３２７５１に対して７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはそれ以上のアミノ酸配列同一性を有することができる。ＲＵＮＸ１機能性誘導体またはホモログは、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＡＩ３６３８１に対して７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはそれ以上のアミノ酸配列同一性を有することができる。ＳＰＩ１機能性誘導体またはホモログは、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＥＡＷ６７９２４に対して７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはそれ以上のアミノ酸配列同一性を有することができる。

【0033】

ＦＧＲＳリプログラミング因子に加えて、他のＴＦを用いることができる。例えば、ＦＧＲＳに加えて、以下のＴＦの１つまたはそれ以上のいずれかを用いることができる：ＺＰＦ３６（亜鉛フィンガータンパク質トリステロラプロリン）、ＦＯＳ（ＦＢＪマウス骨肉腫ウイルスのがん遺伝子ホモログ）、ＪＵＮＢ（jun Bプロトオンコジーン）、ＧＭＦＧ（グリア成熟因子、ガンマ）、ＫＬＦ２（クッペル様因子２）、ＮＦＥ２（核因子、赤血球２）、ＫＬＦ１（クッペル様因子１）、ＫＬＦ４（クッペル様因子４）、ＬＹＬ１（リンパ芽球性白血病由来配列１）、ＬＭＯ２（LIM domain only 2）、ＴＡＬ１（Ｔ細胞急性リンパ性白血病１）、ＧＡＴＡ１（ＧＡＴＡ結合タンパク質１）、ＩＫＺＦ１（ＩＫＡＲＯＳファミリー亜鉛フィンガー１）、ＧＦＩ１Ｂ（成長因子インディペンデント 1B転写リプレッサー）、ＶＡＶ２（vav 2グアニンヌクレオチド交換因子）、ＭＥＩＳ１（Meisホメオボックス１）、ＭＹＢ（v-myb鳥骨髄芽球症ウイルスのがん遺伝子ホモログ）、ＭＬＬＴ３（骨髄系／リンパ系または混合系白血病（trithoraxホモログ、ショウジョウバエ）；転位させる、３）、ＨＬＦ（hepatic leukemia factor）、ＢＥＸ１（brain expressed, X-linked 1）、ＢＥＸ２（brain expressed, X-linked 2）、および／またはＰＢＸ１（プレＢ細胞白血病ホメオボックス１）、またはこれらのＴＦのいずれかの機能性誘導体もしくはホモログ。

【0034】

リプログラミング因子の発現のためのベクター
リプログラミング因子ＦＧＲＳの発現は、外来性核酸をＥＣ中に導入してＥＣ中で所望の因子の発現を駆動することによって実施される。それぞれのリプログラミング因子は、ＥＣ中でポリヌクレオチドの発現を駆動することができる異種プロモーターに作動可能に連結されたリプログラミング因子をコードするベクター内のポリヌクレオチド導入遺伝子としてＥＣに導入することができる。

【0035】

標的哺乳動物細胞に外来遺伝子を導入するのに有用な多くのベクターは、入手可能である。ベクターは、エピソーム、例えばプラスミドもしくはウイルス由来のベクター、例えばサイトメガロウィルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター（ＡＡＶ）、などであってもよく、またはベクターは、組込み、例えば、相同組換えもしくはランダムインテグレーションを通してリプログラミング遺伝子を標的細胞ゲノム中に組み込む、例えばレトロウイルス由来のベクター、例えばＭＭＬＶ（モロニーマウス白血病ウイルス）、ＨＩＶ−１、ＡＬＶ（トリ白血病ウイルス）、もしくはレンチウイルスベクターであってもよい。特定の実施態様において、ベクターはレンチウイルスベクターである。

【0036】

一実施態様において、リプログラミング因子を発現するためのベクターは、リプログラミング因子遺伝子に作動可能に連結されたプロモーターを含む。本明細書に用いる「作動可能に連結された」または「転写調節下」という成句は、ポリヌクレオチドのＲＮＡポリメラーゼおよび発現によって転写の開始を調節するポリヌクレオチドに関して、プロモーターが正確な位置および向きにあることを意味する。ＲＮＡポリメラーゼＩプロモーター、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーター、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター、およびサイトメガロウィルス（ＣＭＶ）プロモーターを含むが、それらに限定されるわけではないいくつかのプロモーターは、リプログラミング因子を発現するベクターに使用するために適している。他の有用なプロモーターは、当業者に識別可能である。いくつかの実施態様では、プロモーターは、リプログラミング因子が発現したときに制御を可能にする誘導性プロモーターである。誘導性プロモーターの適した例には、グルココルチコイドまたはエストロゲン受容体由来のステロイド調節プロモーターおよびテトラサイクリン調節プロモーター（ｔｅｔオン（tet on）またはｔｅｔオフ（tet off））が含まれる。ＴＦの構成的発現は、例えば、ＣＭＶ、ＣＡＧ（ＣＭＶエンハンサーを有するニワトリベータ−アクチンプロモーター）、またはＰＧＫ（ホスホグリセレートキナーゼ１）プロモーターを有する発現ベクターを用いて達成することができる。ＴＦの誘導性発現は、例えば、テトラサイクリン反応性プロモーター、例えばＴＲＥ３ＧＶ（Ｔｅｔ−反応要素第３世代（Tet-response element 3rd generation））誘導性プロモーター（Clontech Laboratories, Mountain View, CA）用いて達成することができる。別法として、導入遺伝子に作動可能に連結されたプロモーターは、特定の細胞タイプにおいておよび／または特定の発生地点で活性化されるプロモーターであってもよい。

【0037】

使用したプロモーターに応じて、ＦＧＲＳリプログラミング因子のいずれか１つまたはすべての発現は、構成的（因子の連続的な発現）または誘導性（オンおよびオフが可能）であることができる。また、発現は、一過性、すなわち、限られた時間スパンにわたるＥＣ中の興味の再プログラミング遺伝子の一時的な発現であることができる。一過性発現は、非組込み（non-integrative）ベクターの使用によって達成してもよく、その際、ベクターは時間と共に細胞または細胞集団から失われ、またはしばらくしてリプログラミング遺伝子の発現を中止するため操作することができる組込みもしくは非組込みベクター中の誘導性プロモーターの使用によって達成してもよい。特定の実施態様において、ＦＧＲＳリプログラミング因子の１つまたはそれ以上の一過性発現は、３日を超えない、５日を超えない、１０日を超えない、または１、２もしくは３週を超えない間、発現を起こさせるために利用する。

【0038】

適したベクターは、形質転換細胞を同定および／または選択するためのマーカーを含有することができる。選択可能なマーカーの例としては、可視マーカー、例えば緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、またはフルオレセイン；エピトープマーカー、例えばＨｉｓ、ｃ−ｍｙｃ、ＧＳＴ、フラグまたはＨＡタグ；酵素／栄養マーカー、例えばＤＨＦＲ（ジヒドロ葉酸還元酵素）；または抗生物質抵抗性マーカー、例えばネオマイシン、プロマイシン、ブラスチシジンもしくはハイグロマイシンが含まれる。

【0039】

リプログラミング因子による内皮細胞の形質転換
リプログラミング因子を用いて内皮細胞をトランスフェクトまたは形質導入するなんらかの適した手段を、用いることができる。哺乳動物細胞の形質転換またはトランスフェクションのさまざまな技術に関して、Keown et al., 1990, Methods Enzymol. 185: 527-37; Sambrook et al., 2001, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y.を参照のこと。ＦＯＳＢ、ＧＦＩ１、ＲＵＮＸ１およびＳＰＩ１を担持するベクターは、リポソーム介在性トランスフェクション、ポリブレン介在性トランスフェクション、ＤＥＡＥデキストラン介在性トランスフェクション、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、マイクロインジェクションまたは微粒子銃を含むが、それらに制限されるわけではない当分野で知られている標準的な方法を用いて細胞中にトランスフェクトすることができる。同様に、ＦＯＳＢ、ＧＦＩ１、ＲＵＮＸ１およびＳＰＩ１は、レンチウイルス、アデノウイルス、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルスまたはヘルペスウイルス送達系のようなウイルス送達系を用いて内皮細胞に送達することができる。好ましい実施態様において、ＥＣは、ＦＯＳＢ、ＧＦＩ１、ＲＵＮＸ１およびＳＰＩ１の発現を駆動する１つ、２つ、３つまたは４つのレンチウイルスベクターによってトランスフェクトされる。

【0040】

ＦＧＲＳリプログラミング因子の１つ、２つ、３つまたは全４つを発現するＥＣは、形質転換細胞を示すマーカーを発現する細胞に関して選択することによって集団中で富化することができる。例えば、それぞれのリプログラミング因子は、異なる選択マーカーを有する別々のベクター中に配置することができる（例えば、ベクターは異なる抗生物質、異なる可視マーカーおよび／または異なる栄養マーカーに対する抵抗性を提供することができる）。異なるベクターによる形質転換を表す各マーカーに関する選択によって、全４つの因子で形質転換されたＥＣの集団を増加させることができる。特定の例において、各ベクターが異なるリプログラミング因子をコードする異なるベクターは、それぞれ、抗生物質抵抗性または緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）によって標識される。

【0041】

ＥＣリプログラミングの培養条件
ＦＧＲＳで形質転換されたＥＣは、培地中で血清を最少にするか、または含まずに（「無血清」培地）、培養することが好ましい。培地の血清の存在はＨＭＬＰの産生を低減することが、本発明者らによって見いだされている。形質転換されたＥＣは、造血細胞の培養および増殖に適した無血清培地中で培養することができる。このような培地は、例えば、イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）または他の適した培地に基づくことができ、そして補充物、例えば標準ウシ血清アルブミン、インスリン、２−メルカプトエタノール、および／またはトランスフェリン（例えば、STEMSPAN SFEM、Stemcell Technologies、バンクーバー、カナダ）を含むことができる。さらなる補充物としては、未分化細胞の成長のための定義済みを含む製剤血清置換補充物、例えば、KNOCKOUT serum replacement（GIBCO）を含むことができる。ＥＣを３日、５日、１０日、１２日、１週、２週、もしくは３週、またはそれ以上の間、培養してＥＣをＨＭＬＰにリプログラミングすることができる。

【0042】

ＥＣリプログラミングを達成するためのさらなる培地補充物は、成長因子および／またはサイトカイン、例えば２〜８ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ、５〜１５ｎｇ／ｍｌのＥＧＦ、１５〜２５ｎｇ／ｍｌのＳＣＦ、１５〜２５ｎｇ／ｍｌのＦＬＴ３、１５〜２５ｎｇ／ｍｌのＴＰＯ、１５〜２５ｎｇ／ｍｌのＩＧＦ−１、５〜１５ｎｇ／ｍｌのＩＧＦ−２、５〜１５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−３、および／または５〜１５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−６を含むことができる。好ましい実施例において、培地は、２〜８ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ、５〜１５ｎｇ／ｍｌのＥＧＦ、１５〜２５ｎｇ／ｍｌのＳＣＦ、１５〜２５ｎｇ／ｍｌのＦＬＴ３、１５〜２５ｎｇ／ｍｌのＴＰＯ、および５〜１５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−６を含む。

【0043】

内皮支持細胞
少なくともＦＧＲＳ因子を発現するＥＣを、内皮支持細胞と共に培養する。これらの支持細胞は、ＥＣプログラミングが起こる生理環境に似たＡＧＭ様の（大動脈−性腺−中腎様の）ニッチ環境を提供する。好ましくは、内皮支持細胞を増殖させて組織培養容器の底面にコンフルエントな単層を形成し、次いで、培養容器に、形質転換されたＥＣを播種する。任意の内皮細胞、例えば成熟したＥＣ（例えば、新生児、胎児および成人ＥＣ）、および内皮前駆細胞（ＥＰＣ）を支持細胞として用いることができる。例示的なＥＣ源としては、成人真皮または新生児包皮からのヒト皮膚微小血管ＥＣ（ｈＤＭＥＣ）、ヒト臍帯静脈／臍帯血ＥＣ（ＨＵＶＥＣ）、および胎児胎盤微小血管ＥＣ（ｈＰＭＥＣ）が含まれる。好ましい実施態様では、ＨＵＶＥＣが内皮支持細胞として用いられる。

【0044】

支持細胞は、好ましくは、無血清環境中で増殖および生存させて無血清培地中でＥＣによる培養を可能にすることができる。内皮細胞の多くのタイプは、血清がない場合、培養を維持することができない。無血清培養で支持細胞として生存および増殖を可能にする内皮細胞の改変により、その他の場合には血清を必要とする内皮細胞において、この障壁を克服することができる。

【0045】

内皮細胞は、例えば、血清がない場合に成長および増殖を駆動する遺伝子による細胞の形質転換によって改変することができる。血清なしの培養において内皮細胞の生存を支持する遺伝子の例としては、Ａｋｔ（プロテインキナーゼＢまたはＰＫＢ）遺伝子およびアデノウイルスＥ４ＯＲＦ１遺伝子が含まれる。特定の実施態様において、ＨＵＶＥＣは形質転換されてＡｋｔまたはアデノウイルスＥ４ＯＲＦ１遺伝子から選択される遺伝子を発現する。Ｅ４ＯＲＦ１によるＨＵＶＥＣの形質転換は、米国特許第８,４６５,７３２号に開示されており、その内容は、参照により本明細書に組み込まれている。ＡｋｔによるＨＵＶＥＣの形質転換は、例えば、Fujio and Walsh, J. Biol. Chem. 274:16349-16354 (1999)に開示されており、その内容は、参照により本明細書に組み込まれている。

【0046】

無血清環境中で生存および増殖を促進する遺伝子を用いて内皮細胞をトランスフェクトまたは形質導入する任意の適した手段を用いることができる。例えば、Ｅ４ＯＲＦ１またはＡｋｔ遺伝子は、限定されるわけではないが、リポソーム介在性トランスフェクション、ポリブレン介在性トランスフェクション、ＤＥＡＥデキストラン介在性トランスフェクション、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、マイクロインジェクション、または微粒子銃を含む当分野で知られている標準的な方法を用いて細胞中にトランスフェクトすることができる。同様に、Ｅ４ＯＲＦ１またはＡｋｔ遺伝子は、レンチウイルス、アデノウイルス、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルスまたはヘルペスウイルス送達系のようなウイルス送達系を用いて内皮細胞に送達することができる。一実施態様において、Ｅ４ＯＲＦ１またはＡｋｔ遺伝子は、レンチウイルス遺伝子送達系を用いて内皮細胞に送達される。

【0047】

支持細胞は、１０〜３０％ウシ胎児血清（Omega Scientific）、１５〜２５μｇ／ｍｌ内皮細胞補充物（例えばBiomedical Technologiesから入手可能: #BT-203）、０．５〜２×Pen/Strep、および１５〜２５単位／ｍｌのヘパリン（例えばSigma: # H3149-100KU）を含む内皮成長培地（例えば、Medium 199, Thermo Scientific: #FB-01）中で培養することができる。支持細胞は、培養容器の表面上に層で培養することができ、そして好ましくは、支持細胞のコンフルエントな層が培養容器上に確立されたら、内皮増殖培地を無血清培地と交換し、そしてリプログラミング因子を発現するＥＣを支持細胞層上で培養することができる。

【0048】

例えば、成熟したＨＵＶＥＣ（または、ｈＤＭＥＣ）をＦＧＲＳリプログラミング因子により形質導入し、次いで、２〜３日後、洗浄し、そしてＥ４−ＨＵＶＥＣフィーダーの確立された単層上で再び培養することができる。５×１０^４の成熟したＥＣの形質導入により、Ｅ４−ＨＵＶＥＣによる無血清共培養中にＨＭＬＰの多数の明瞭なコロニーを生成することができる。

【0049】

培養液からのＨＭＬＰの単離
ＨＭＬＰは、さらなる使用のため培養液から単離することができる。一実施態様において、ＨＭＬＰは、ＣＤ４５^＋細胞を単離することによって単離される。別の実施態様において、ＨＭＬＰは、ＣＤ４５^＋ＣＤ３４^＋細胞を単離することによって単離される。例えば、ＨＭＬＰは、ＨＭＬＰと内皮支持細胞（これはＣＤ４５⁻である）との共培養液からＣＤ４５^＋細胞を細胞選別および分離することによって単離することができる。

【0050】

ＨＭＬＰは、不均一な／混合集団（例えば、集団中の異なる細胞がＣＤ４５^＋またはＣＤ４５^＋ＣＤ３４^＋の発現以外の異なるマーカーを発現する細胞の集団）として、または比較的均一な／実質的に純粋な集団（例えば、細胞の集団が５０％を超える、６０％を超える、７０％を超える、７５％を超える、８０％を超える、８５％を超える、９０％を超える、９５％を超える、または９８％を超える細胞が、ＣＤ４５^＋またはＣＤ４５^＋ＣＤ３４^＋の発現に加えてマーカーの共通なセットを発現する）として培養液から単離することができる。

【0051】

医薬組成物および治療方法
さらに、本開示は、薬学的に許容しうる担体を含むＥＣ生成ＨＭＬＰの医薬組成物を提供する。このような医薬組成物は、細胞に加えて、生理学的に許容しうるマトリックス（matrix）または生理学的に許容しうるビヒクル（vehicle）を含有してもよい。マトリックスおよび／またはビヒクルのタイプは、とりわけ意図する投与経路に左右される。適したマトリックスおよび／またはビヒクルは、当分野で知られている。このような組成物は、例えば、幹細胞または臍帯血細胞を保存するための確立された方法を用いて、液体窒素中に凍結および保存することができる。好ましい例では、医薬組成物は、患者に静脈内注入のために提供される。

【0052】

さらに、本明細書に開示されたＥＣ生成ＨＭＬＰおよび医薬組成物を利用する治療方法が提供される。本明細書に提供されるＨＭＬＰは、対象における造血細胞の再構成または所望の造血細胞タイプが富化された細胞集団の提供に適している。本発明のＨＭＬＰは、限定されるわけではないが、放射線治療および化学療法のような治療の後に、免疫不全の対象における十分な範囲の造血細胞の再構成に用いることができる。例えば、対象への注入または移植による開示されたＨＭＬＰの投与は、肝臓、膵臓、腎臓、肺、神経系、筋肉系、骨、骨髄、胸腺または脾臓の幹細胞または前駆細胞を増大または交換することができる。ＨＭＬＰ移植は、適合および不適合ＨＬＡタイプの造血移植を含む、自家または同種異系であることができる。ドナー細胞の免疫拒絶を低減するために宿主を処置する必要がありうることが認められている。

【0053】

対象または個体は、細胞ベースの治療を必要とする任意の動物であることができる。いくつかの実施態様において、個体は哺乳動物である。哺乳動物としては、ヒト、ヒト以外の霊長類、マウス、ウシ、ウマ、イヌ、ネコおよび同類が含まれるが、それらに限定されるわけではない。好ましい実施態様において、哺乳動物はヒトである。

【0054】

本明細書に提供される増殖された細胞を患者に投与することに関して、増殖された細胞の有効量は、数百またはそれ未満の少ないものから数１００万またはそれ以上の多いものまでの範囲であってもよい。投与される増殖された細胞の数は、医学専門家によく知られた他の因子の中でも治療するサイズまたは総容積、ならびにレシピエントの必要性および状態を含むが、それらに限定されるわけではない、治療する障害の詳細に応じて変化することになるのは理解されるであろう。いくつかの実施態様では、１００ｋｇの人当たり１０^３〜１０^１０の細胞が対象または個体に投与または移植される。投与または移植の方法は、当分野でよく知られており、そして、例えば、注入が含まれる。本明細書において提供される増殖された細胞は、例えば、静脈内注入によって投与することができる。

【0055】

一実施態様において、ＨＭＬＰは、骨髄移植において骨髄細胞を増大させる、または交換するために用いられる。現在、白血病、リンパ腫および他の生命にかかわる障害といったような疾患の治療としてヒト自家および同種骨髄移植が用いられる。しかし、これらの手法の欠点は、生着に必要な細胞を確保するために大量のドナー骨髄を取り出さなければならないということである。本発明は、レシピエントへの注入または移植に関して骨髄提供をＥＣ生成ＨＭＬＰで代用または補充することによって大量の骨髄提供の必要性を低減または排除する。

【0056】

いくつかの実施態様では、細胞の単回投与が提供される。別の実施態様では、多回投与が用いられる。多回投与は、連続３〜７日の初期治療計画のような定期的な期間にわたって提供し、次いで、他の時に繰り返すことができる。

【実施例】

【0057】

細胞培養。ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）は、Goldberg, A. D. et al., (Cell)
140:678-691 (2010)に記載されたとおり得た。ＨＵＶＥＣは、Endothelial Growth Media（ＥＭ）：Medium 199（Thermo Scientific: #FB-01）、２０％ウシ胎児血清（Omega Scientific）、２０μｇ／ｍｌ内皮細胞補充物（Biomedical Technologies: #BT-203）、1X Pen/Strepおよび２０単位／ｍｌのヘパリン（Sigma: # H3149-100KU）中で培養した。成人初代ヒト皮膚微小血管内皮細胞（ｈＤＭＥＣ）は、ScienCell Research Laboratories（cat #2020）から購入した。無血清造血培地は、StemSpan SFEM（Stemcell Technologies）、１０％のKnockOut Serum Replacement（Invitrogen）、５ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ、１０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦ、２０ｎｇ／ｍｌのＳＣＦ、２０ｎｇ／ｍｌのＦＬＴ３、２０ｎｇ／ｍｌのＴＰＯ、２０ｎｇ／ｍｌのＩＧＦ−１、１０ｎｇ／ｍｌのＩＧＦ−２、１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−３、１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−６（すべてInvitrogen、eBioscienceまたはPeprotechから）でできていた。

【0058】

ヒト臍帯血前駆細胞の精製。ヒト臍帯血を、ＩＲＢプロトコール”Stage Specific Differentiation of Hematopoietic Stem Cells into Functional Hemangiogenic Tissue”（Weill Cornell Medical College IRB # 09060010445）の下で得た。臍帯血単核細胞を、Ficoll-Paque（ＧＥ）を用いる密度勾配によって精製し、そして抗ＣＤ３４ミクロビーズ（Miltenyi）を用いる磁気分離を用いて、ＣＤ３４^＋前駆細胞に関して富化した。Human Progenitor Cell Enrichment Kit（StemCell Technologies）を用いるＬｉｎ^＋細胞の陰性選択によってさらなる精製を達成した。Arcturus PicoPure RNA単離キット（Applied Biosystems；このキットは、すべてのＲＮＡ抽出手順に用いた）を用いるＦＡＣＳによって、単離されたＬｉｎ⁻ＣＤ３４^＋ＣＤ４５^＋細胞からＲＮＡを抽出した。

【0059】

フローサイトメトリー。フローサイトメトリー分析をBecton Dickenson LSRII SORPにおいて実施し、そして蛍光標識細胞分取（fluorescence activated cell sorting）（ＦＡＣＳ）をAria II SORPにおいて実施した。使用した抗体は、ヒトＣＤ４５、ＣＤ３４、ＣＤ１４、ＣＤ３１、ＣＤ４３、ＣＤ９０、ＣＤ４１ａ、ＣＤ３３、ＣＤ１９、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２３５、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ８３、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ３８、ＬＩＮカクテル、ＣＤ１１７、ＣＤ１３３、ＣＤ１４４（BD Pharmingen, eBioscience）またはマウスＣＤ４５（eBioscience.）に対して高めた。電圧調整および補正は、CompBeads（BD Pharmingen）を用いて行い、そしてフルオロフォアマイナス１対照（ＦＭＯ）および非染色対照においてゲーティングを実施した。

【0060】

内皮細胞と造血前駆細胞との間で異なって発現される転写因子の同定。造血特化に不可欠である状態を確認するため、本発明者らは、新たに単離されたＨＵＶＥＣおよびＬｉｎ⁻ＣＤ３４^＋ヒト臍帯血造血前駆細胞においてＲＮＡ−シークエンシングを実施して、異なって発現されたＴＦを同定した。異なって発現された２６個のＴＦを確認した（表１）。

【0061】

【表1】

【0062】

レンチウイルスベクター。転写因子候補をpLVX-IRES-Zs Green1レンチベクター（Clontech）、pLOCレンチベクター（OpenBiosystems）、またはLV105レンチベクター（Genecopoeia）のいずれかにサブクローニングした。レンチウイルス粒子は、Sandler, V. M. et al., PLoS One 6:e18265 (2011)に記載されたとおりパックした。簡潔には、ヒト胎生腎293FT（HEK293FT）細胞をレンチベクターおよび２つのヘルパープラスミド（ｐｓＰＡＸ２）およびｐＭＤ２．Ｇ（Addgeneを通してTrono Lab）と等モル比で共トランスフェクトした。形質移入４８〜５２時間後に、上清を集め、濾過し、そしてLenti-X濃縮器（Clontech）を用いて濃縮した。ウイルス価は、標的細胞としてＨＵＶＥＣを用いて限界希釈実験で決定した。本発明者らは、体積当たりの感染ウイルス粒子の数に対する読み出しとして、ＧＦＰ^＋細胞の数、または選択抗生物質（プロマイシン）の存在下で形成されたコロニーの数のいずれかを用いた。本発明者らは、ＨＵＶＥＣまたはｈＥＳ細胞由来のＥＣについてはＭＯＩ５〜１０、そして線維芽細胞の感染については１０〜２５を用いた。

【0063】

ＨＵＶＥＣおよびＨＥＦ（ヒト胚線維芽細胞）を、ＳＰＩ１を発現するレンチウイルスにより形質導入し、そしてプロマイシン（０．５〜１μｇ／ｍｌ）の存在下で１０〜１４日間増殖させて十分な数の細胞を得た。全４つのＦＧＲＳを発現するレンチウイルスを内皮細胞培地中に再懸濁し、そして支持細胞に加えた。１２〜２４時間後、形質導入されたＥＣを、さらなるＥＣ培地と共に供給した。形質導入後の２〜３日後、形質導入されたＥＣを、支持細胞上で再び培養した。

【0064】

本発明者らは、２６個の確定されたＴＦのさまざまな組合せをスクリーニングして、ＨＵＶＥＣを造血細胞にリプログラミング可能なものを確定した。造血細胞による出発ＨＵＶＥＣ培養液の潜在的汚染を排除するため、本発明者らは、新たに単離されたＨＵＶＥＣを選別して成熟したＣＤ４５⁻ＣＤ１３３⁻ｃＫｉｔ⁻ＣＤ３１^＋ＥＣ（図１Ａ）を得た。外因的に発現されたＴＦがない場合、これらのＨＵＶＥＣは、決してＣＤ４５^＋造血細胞を生じることがない。したがって、本発明者らは、最初の読出しとしてＣＤ３４^＋ＣＤ４５^＋細胞の発生を用いて、血液学的可能性を獲得した細胞を確定した。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）マーカーまたはプロマイシン抵抗性遣伝子のいずれかを有する、確定されたＴＦを発現するレンチウイルスベクターを用いてＨＵＶＥＣを形質導入した（図１Ａ）。次いで、形質導入されたＨＵＶＥＣを、造血サイトカイン（ＴＰＯ、ＫＩＴＬ、ＦＬＴ３Ｌ；方法を参照のこと）の存在下、血清なしで増殖させた。形質導入の約２週間後、ＨＵＶＥＣ培養液は、丸いＧＦＰ^＋ＣＤ４５^＋細胞の発生（図１Ｂ）および内皮単層から発生が始まったＧＦＰ^＋ＣＤ４５^＋細胞の丸いブドウ状コロニー（図１Ａ、１２日目〜１６日目）を示した。

【0065】

ＥＣをリプログラミングするために必要な転写因子の確定。表１で確定したように、異なるＴＦを欠如させたそれぞれの形質転換により、一度に２５ＴＦを用いてＨＵＶＥＣを形質転換させた。ＴＦ候補をこのように系統的に「１つずつ脱落」させて、造血リプログラミングにはＦＯＳＢ、ＧＦＩ１、ＲＵＮＸ１およびＳＰＩ１の強制発現が必要であることを示した（この組合せを「ＦＧＲＳ」と呼ぶ）（図１Ｄ、ｎ＝３）。他のＴＦ候補は、必要なかった。本発明者らは、造血様コロニーの生成にはＦＧＲＳ ＴＦのみで十分であることを見いだした（図１Ｅ、ｎ＝３）。いずれか１つのＦＧＲＳ因子を除去しても、造血様クラスターの形成が完全に排除されることはなかったが、しかし、クラスター数はかなり減少し（ｐ＜０．０５）そして新生造血様細胞は活発に分裂しなかった。

【0066】

ＦＧＲＳ形質導入ＥＣの成長を増強および持続させる支持細胞層のデザイン。ＥＣおよびＨＳＰＣは、大動脈−性腺−中腎（ＡＧＭ）領域で共発生する（co-develop）。初生ＨＳＣは、発育中の胎児中の増殖に適したニッチを必要とするため、血管性ニッチ支持細胞は、新生造血様細胞の生存を増強し、そして特化を持続しうる。この仮説を調べるため、本発明者らは、Butler, J. M. et al., (Blood) 120:1344-1347 (2012)によって記載されたように、アデノウイルスＥ４複合体（Ｅ４−ＨＵＶＥＣ）のＥ４ＯＲＦ１遺伝子の発現によって、ＨＵＶＥＣの血清および成長因子を含まない培養を可能にするための血管性ニッチのin vitroモデルを用いた。本発明者らのグループおよびその他は、Ｅ４−ＨＵＶＥＣは、初生造血細胞、マウスｃＫｉｔ^＋Ｌｉｎ⁻Ｓｃａ１^＋ＣＤ３４⁻Ｆｌｔ３⁻およびヒトＬｉｎ⁻ＣＤ４５ＲＡ⁻ＣＤ３８⁻ＣＤ３４^＋ＣＤ４９ｆ^＋ＨＳＰＣに対するそれらのニッチ様支持体を維持しており、それらは、致死的に照射を受けた一次および二次レシピエントに移植することができることを示している。

【0067】

この血管性ニッチ共培養系を用いて、本発明者らは、成熟したＨＵＶＥＣ（またはｈＤＭＥＣ）をＦＧＲＳリプログラミング因子で形質導入し、次いで、２〜３日後、洗浄し、そしてＥ４−ＨＵＶＥＣフィーダーの確立された単層上で再び培養する、生体異物を含まないプラットフォームを考案した。５×１０^４成熟したＨＵＶＥＣの形質導入により、Ｅ４−ＨＵＶＥＣを用いる無血清共培養中に３２．３±１０．５（ｎ＝８）の明瞭なコロニーを得たが、しかし、血清を加えた場合、コロニーは観察されなかった。ナイーブＨＵＶＥＣは、１〜２週間を超える間、無血清培養において生存することができないため、血管性ニッチとして適しておらず、ＦＧＲＳ−ＥＣが、リプログラミング中に血管性ニッチ支持体から利益を得るのを妨げる。実際に、ナイーブＨＵＶＥＣを用いた共培養から発生するＧＦＰ＋造血様コロニー（形質導入されたＨＵＶＥＣ５×１０^４当たり３．４±３．２のコロニー；ｎ＝５）は、支持細胞がない場合のＦＧＲＳ−ＥＣから成長（outgrowth）とは、まったく共通していなかった。

【0068】

Ｅ４−ＨＵＶＥＣは、ＦＧＲＳ−ＥＣを培養するのに必要な環境を提供する。ＦＧＲＳ形質導入ＥＣ（ＦＧＲＳ−ＥＣ）とＥ４−ＨＵＶＥＣとの共培養は、造血様コロニーの収率および持続性を著しく高め、それにより最終的にｒＥＣ−ＨＭＬＰの形態学的および分子的特徴が明らかになった。したがって、ＦＧＲＳ−ＥＣからの造血細胞の効率的生成には、ニッチ様の機能を有するＥＣからの長期的な支えとなるシグナルが必要である。

【0069】

これらの理由のため、本発明者らは、ＦＧＲＳ形質導入ＥＣの造血リプログラミングのさらなる特徴づけのための血管性ニッチフィーダープラットフォーム、Ｅ４−ＨＵＶＥＣを用いた。５×１０^４ＥＣの２日間の形質導入およびその後のＥ４−ＨＵＶＥＣを用いた３週間の共培養により、３２．３±１０．５（ｎ＝８）の明瞭なコロニーが発生した（図１Ｃ）。これらのデータは、ＦＧＲＳ形質導入ＥＣからの造血細胞の発生には、支えとなる血管細胞が不可欠であることを示唆している。

【0070】

培養された細胞のＦＧＲＳ ＴＦの発現の確認。ナイーブＥＣ中に導入されたＦＧＲＳの適当な化学量論を考慮しない場合、リプログラミングの効率は、非常に低く、０．０７％未満に近かった。したがって、リプログラミングの効率を改善するため、本発明者らは、ＴＦの適当な化学量論を用いた形質導入されたＦＧＲＳ形質導入ＥＣのそれらのサブセットを選択する戦略を開発した。本発明者らは、最初に、ＧＦＩ１、ＳＰＩ１およびＦＯＳＢ ＴＦの適当な化学量論を用いてＥＣを生成することに焦点を合わせたが、それは、ＥＣ中のそれらの天然の発現がごくわずかであるためである（表１を参照のこと）。これを行うため、本発明者らは、プロマイシン抵抗性（ＳＰＩ１）またはＧＦＰ（ＦＯＳＢおよびＧＦＩ１）によって標識されたＦＧＲＳレンチウイルス「カクテル」を用いて５×１０^６ＥＣを形質導入した。次いで、本発明者らは、プロマイシン選択を２日間適用してＳＰＩ１発現細胞を富化し、そしてＧＦＰ発現のためそれらを選別してＳＰＩ１^＋ＧＦＰ^＋（ＦＯＳＢ／ＧＦＩ１）ＥＣを富化した。次いで、本発明者らは、これらのＧＦＰ^＋細胞を１２−ウェルプレート中に播種し、そして無血清培養で２日間それらを増殖させた（プレート当たり１０^５細胞、ｎ＝３）。

【0071】

次いで、本発明者らは、造血培地のＥ４−ＨＵＶＥＣ支持細胞層上でＧＦＰ^＋プロマイシン耐性細胞１０^４を再び培養し、そして共培養の約２０日後、造血クラスターの数を定量化した。本発明者らは、これらのＧＦＰ^＋、プロマイシン耐性細胞により、再培養細胞１０^４当たり造血様コロニー１５６．０±３．６（ｎ＝３）が得られたことを見いだしており、リプログラミングの効率が少なくとも１．５％であったことを示唆している。この計算は、各コロニーが単一のリプログラミングされた細胞から生じており、そして本発明者らが、因子（ＳＰＩ１およびＦＯＳＢまたはＧＦＩ１のいずれか／両方）の２つを発現することを知っている、形質導入されたＥＣが、それぞれ全４つのＦＧＲＳ ＴＦを発現すると仮定している。効率は、各因子の適当な化学量論量を発現する細胞において、おそらくはるかに高い。したがって、本発明者らのリプログラミングアプローチが、ＨＵＶＥＣ単層内に存在する造血／血管芽細胞ＥＣの非常にまれな既存集団の自発分化のためである可能性は低い。

【0072】

支えとなる血管性ニッチは、ＦＧＲＳ−ＥＣの増殖性多系列、赤血球−巨核球−骨髄系前駆細胞へのリプログラミングを促進する。Ｅ４−ＨＵＶＥＣとの共培養の３〜４週間以内に、ＦＧＲＳ−ＥＣは、急激に増殖を開始し、Ｅ４−ＨＵＶＥＣ単層に部分的に付着したＧＦＰ＋ブドウ状クラスターを形成し始めた。ブドウ状クラスターのWright-Giemsa染色は、造血前駆細胞およびそれらの子孫を形態学的に暗示する細胞を示した（図１Ｂ、右のパネル）。また、本発明者らは、時々、発達中の造血コロニーがそれらの周囲から物理的に分離された大きなマルチコロニーニッチ様の構造体の形成を観察した（ｎ＝４）。フローサイトメトリーは、ほとんどのＦＧＲＳ−ＥＣ子孫（ＧＦＰ^＋細胞）が、成熟したＥＣマーカー、ＣＤ３１の発現を喪失し、そしてサブセットが、共発現されたＣＤ３４と共に汎血球形成マーカーＣＤ４５の発現を獲得したことを示した（図２Ａ、ｎ＝９）。対照的に、ＧＦＰ Ｅ４−ＨＵＶＥＣは、高レベルＣＤ３１発現を保持しており、そしてＣＤ３４^＋ＣＤ４５⁻のままであった。ＧＦＰ^＋ＣＤ４５^＋ＦＧＲＳ−ＥＣ子孫のサブセットは、他の造血マーカー、例えばＣＤ４３^＋（８．９６％±２．３；ｎ＝３）、ＣＤ９０^＋（Ｔｈｙ−１^＋）（６．１５％±１．１３；ｎ＝３）、およびＣＤ１４^＋（４０．０％±４．９５；ｎ＝３）を発現した。ＧＦＰ^＋細胞の増殖は、Ｅ４−ＨＵＶＥＣとの４〜５週間の共培養の終了近くで増加し、入力ＥＣの約４００倍の増殖となる最大２０×１０^６のＧＦＰ＋ＣＤ４５^＋細胞が生成することになった。（図３Ａ；１７．２×１０^６±２．４；ｎ＝６）。３〜５日後、増殖速度および生細胞数の両方が急激に減少したが、ＧＦＰ^＋ＣＤ４５^＋の生成は、減少した速度で続いた。したがって、Ｅ４−ＨＵＶＥＣ細胞の支えとなる血管性ニッチは、ＦＧＲＳ−ＥＣの増殖性多系列、赤血球−巨核球−骨髄系前駆細胞（ｒＥＣ−ＨＭＬＰ）へのリプログラミングを促進する。

【0073】

ｒＥＣ−ＨＭＬＰは、赤血球、マクロファージ、顆粒球および巨核球前駆体細胞を生成することができる。ｒＥＣ−ＨＭＬＰの機能を評価するため、本発明者らは、標準メチルセルロースアッセイを用いてコロニー形成単位（ＣＦＵ）アッセイを実施した。ＨＵＶＥＣが、機能性ｒＥＣ−ＨＭＬＰに実際に変換された場合、これらの細胞は、ＣＦＵアッセイにおいて少なくとも２つの明瞭な造血系に分化することができるはずである。ＦＧＲＳによるＨＵＶＥＣの形質導入および血管性ニッチ共培養の４週間後、ＧＦＰ＋ＣＤ４５＋ＣＤ３４＋ｒＥＣ−ＨＭＰＬを選別し、そしてＣＦＵアッセイ（ｎ＝３）のため１２００〜１６００細胞／ｃｍ^２（５０００〜７０００細胞／３５ｍｍプレート）の密度で播種した。１４日以内に、細胞からは、形態学的に似ているＧＦＰ細胞集合ＣＦＵ−ＧＭ（顆粒球／マクロファージコロニー形成単位）、ＣＦＵ−ＧＥＭＭ（顆粒球／赤血球／単球／巨核球コロニー形成単位）、および部分的にヘモグロビンを発現したＢＦＵ−Ｅタイプ造血コロニー（バースト形成単位−赤血球、赤血球前駆細胞タイプ）が生じた（図２Ｃ）。ＣＦＵアッセイにおける系列特化は、コロニーをWright-Giemsaで染色することによって検証した（図２Ｄ）。本発明者らは、Beutler, E., 編, Williams Hematology; McGraw Hill, Inc. (第5版, 1995)に定義されたような赤血球、マクロファージ、顆粒球、および巨核球前駆体の典型的な形態学的特徴を有する細胞を検出することができた。

【0074】

メチルセルロース培養から得られたコロニーの免疫表現型解析は、ＣＤ２３５、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ８３およびＣＤ４５細胞の存在を示し、ｒＥＣ−ＨＭＬＰが、赤血球、マクロファージ、単球および樹状細胞子孫に分化したことを示唆している。また、ＣＤ２３５^＋（グリコホリンＡ）細胞は、ＣＤ４５⁻であり、赤血球分化を示唆している（図２Ｅ）。

【0075】

ヒト成人皮膚の微小血管内皮細胞は、自家ＨＳＣを形成可能である。本発明者らの方法が、ＨＵＶＥＣとは別のＥＣのリプログラミングに適用できるかどうか調べるため、本発明者らは、ヒト成人皮膚微小血管内皮細胞（ｈＤＭＥＣ）を用いた。ｈＤＭＥＣの移植可能なｒＥＣ−ＨＭＬＰへのリプログラミングは、骨髄再構成のために移植可能な自家造血前駆細胞の生成が可能となりうるため、将来な臨床適用の可能性にとってより重要である。さらに、成人ＥＣが、減少して低い数の造血ＥＣを含みうる場合、このアプローチは、造血または血管芽細胞ＥＣでなく、成熟したＥＣが、造血細胞にリプログラミングされていることを示している。

【0076】

ｈＤＭＥＣを、ＦＧＲＳ因子で形質導入し、そして無血清環境中で血管誘導を受けさせた（ＨＵＶＥＣリプログラミングに用いたのと同じプロトコール）。リプログラミングされたｈＤＭＥＣのin vitro機能を評価するため、本発明者らは、ＣＦＵアッセイを実施した。ＦＧＲＳによるｈＤＭＥＣの形質導入の４週間後、ＧＦＰ^＋ＣＤ４５^＋ＣＤ３４^＋細胞を選別し、そしてＣＦＵアッセイ（ｎ＝３）のため１２００〜１６００細胞／ｃｍ^２の密度で播種した。１２〜１４日以内に細胞からは、形態学的に似ている細胞集合ＣＦＵ−ＧＭ、ＣＦＵ−ＧＥＭＭ、部分的にヘモグロビンを発現するＢＦＵ−Ｅ、および混合コロニーが生じた（図４Ａ）。ＣＦＵアッセイにおける系列特化は、コロニーをWright-Giemsaで染色することによって検証した。本発明者らは、典型的な赤血球、マクロファージ、顆粒球および巨核球の前駆体形態を有する細胞を検出することができた（図４Ａ）。メチルセルロース培養から得られたコロニーの免疫表現型解析は、ｈＤＭＥＣから誘導されたｒＥＣ−ＨＭＬＰの、赤血球ＣＤ２３５^＋（５８．６６±３．４７％）、マクロファージＣＤ１１ｂ^＋（１０．３９±３．０５％）、単球ＣＤ１４^＋（１０．８７±１．２８）、および樹状ＣＤ８３^＋（７．９４±０．８０％）細胞子孫を含むいくつかの系列に分化する能力を示した（図４Ｂ）。

【0077】

ＨＵＶＥＣは、ｒＥＣ−ＨＭＬＰ様細胞を自発的に生成することができない。ＨＵＶＥＣが、ｒＥＣ−ＨＭＬＰ様細胞を自発的に生成できる造血または血管芽細胞を含むことがありうる可能性を排除するため、本発明者らは、２セットの実験を実施した。

【0078】

最初に、本発明者らは、ウェル当たり１細胞、２細胞、５細胞および１０細胞の密度で表現型的に著しく成熟したＨＵＶＥＣを選別することによってクローン培養を生成した。これを達成するため、本発明者らは、多色フローサイトメトリーを実施し、そしてＣＤ１４４（ＶＥ−カドヘリン）^＋ＣＤ３１^＋Ｅ−セレクチン^＋ＣＤ４５⁻ＨＵＶＥＣを、１、２、５および１０細胞の配置で、９６−ウエルプレート中に選別した。Ｅ−セレクチン（ＣＤ６２Ｅ）は、成熟したＥＣ上でしか発現されず、そして任意の造血または非血管性細胞上には存在しない。次いで、これらのコロニーは、＞１００００細胞培養液（５および１０−細胞クローンに関して）、＞５０００細胞（１−細胞＃１クローンおよび２−細胞クローン）、および＞３０００細胞（１−細胞＃２クローン）に増殖した。ＦＧＲＳによる１−細胞培養液、２−細胞、５−細胞および１０−細胞培養液の形質導入、続いてＥ４−ＨＵＶＥＣとの共培養の結果、混合ＨＵＶＥＣ培養実験において観察されたコロニーと類似した造血様コロニーが発生した。Ｅ−セレクチンは、最終的に分化した成熟した活性化ＥＣ上でしか発現しないため、ＦＧＲＳ形質導入ＨＵＶＥＣのクローン集団中に、「造血または血管芽」ＥＣの混入が存在し、造血細胞を生じているかもしれない可能性は低い。

【0079】

実験の第２のセットにおいて、本発明者らは、リプログラミング実験に用いた無血清培地中でＨＵＶＥＣを増殖させた。本発明者らは、血清除去および培地中の造血サイトカインのコンビナトリアル添加に反応したＨＵＶＥＣにおける増殖ならびにＣＤ４５およびＣＤ３４発現を比較した。血清不使用も造血サイトカインの最適カクテルの添加もないと、ＨＵＶＥＣ中にＣＤ４５の任意の検出可能な発現を生じなかった。しかし、血清不使用単独および／またはそれとＴＧＦシグナル伝達阻害との組み合わせは、いずれもそれらの血管の独自性（vascular identity）を持続させる、ＨＵＶＥＣ中のＣＤ３４発現の有意な上方制御を生じた。まとめると、これらのデータは、ＦＧＲＳがＨＵＶＥＣ内の既存の造血または血管芽前駆細胞をリプログラミングする可能性が低いというよりも、むしろＦＧＲＳ ＴＦ＋血管性誘導プロトコールが、最終的に分化したＣＤ１４４^＋ＣＤ３１^＋Ｅ−セレクチン^＋ＣＤ４５⁻ＥＣの造血細胞への変換を誘導することを示している。

【0080】

ｒＥＣ−ＨＭＬＰは、表現型的に正しいＨＳＰＣおよび多能性前駆細胞を生成することができる。ｒＥＣ−ＨＭＬＰのより詳細な表現型解析は、ＣＤ４５^＋Ｌｉｎ⁻ＣＤ４５ＲＡ⁻ＣＤ３８⁻ＣＤ９０^＋ＣＤ３４^＋またはＣＤ４５^＋Ｌｉｎ⁻ＣＤ４５ＲＡ⁻ＣＤ３８⁻ＣＤ９０⁻ＣＤ３４^＋である細胞の小さな集団を示し、したがって、それぞれ、Chao, M. P. et al., (Cold Spring Harb Symp Quant Biol) 73:439-449 (2008)によって定義されたような、表現型的に顕著なＨＳＰＣまたは多能性前駆細胞の基準を満たしている（図２Ｂ、ｎ＝３）。

【0081】

ＣＤ４５^＋細胞は、増殖の可能性を有する。本発明者らは、無血清造血培地中のＣＤ４５^＋およびＣＤ４５⁻細胞の増殖可能性を比較した。ＣＤ４５^＋（１２×１０^３）およびＣＤ４５⁻（６０×１０^３）細胞を個々のウェル中に選別し、そして２日間増殖させた。本発明者らは、ＣＤ４５^＋細胞の５倍増殖（５６．６×１０^３±７．９×１０^３；ｎ＝３）およびＣＤ４５⁻細胞の劇的な減少（４．６×１０^３±１．０×１０^３；ｎ＝３）を観察した。クローン増殖に関するＣＤ４５^＋およびＣＤ４５⁻細胞の可能性を調べるため、それらを１または２細胞／ウェルの密度で９６−ウエルプレートに選別した。７日培養後、本発明者らは、１−細胞ソートの６．３±２．１ウェル（９３．１±１４．５細胞／ウェル）および２−細胞ソート（ｎ＝３）の２９．０±４．３ウェル（１１２．１±２１．２細胞／ウェル）においてＣＤ４５^＋細胞増殖を観察した。１および２−細胞ソートにおける細胞数／ウェルの間の違いは、統計学的に有意でなく（ｐ＝０．７８）検出された細胞増殖を有するウェルの数の違いが、ウェル中に選別された細胞数の反映というよりも選別された細胞の生存のためであったことを示唆している。本発明者らは、ＣＤ４５⁻細胞の有意な増殖をなんら検出しなかった。

【0082】

ヒト胚性幹細胞の分化およびリプログラミングの試み。本発明者らは、Rafii, S. et al., Blood 121:770-780 (2013)に記載されたように、ヒトＶＥ−カドヘリンプロモーターの断片によって駆動された蛍光レポーターを介して、分化されたＥＣ誘導体を特異的に確認するトランスジェニックｈＥＳＣレポーター系統を用いた。内皮の関与を増大させるため、血管支持細胞との共培養においてｈＥＳＣ分化を開始した。簡潔には、Seandel, M. et al., Proc Natl Acad Sci U S A 105:19288-19293 (2008)に記載されたように、ＨＵＶＥＣを単離し、レンチウイルスＡｄＥ４ＯＲＦ１により形質導入した。分化を開始するためにｈＥＳＣを培養する１日前、ＭＥＦ馴化培地を、ＦＧＦ−２を含まず、かつ２ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４で補充されたｈＥＳＣ培地で置き換えた。その翌日、ｈＥＳＣを、ｈＥＳＣ培地（ＦＧＦ−２なし、２ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４を加えた）中のＥ４ＯＲＦ１＋ＥＣの８０％コンフルエント層上で直接培養し、そして４８時間静置した。この培養地点を、分化０日目とみなした。以下の順序で組換えサイトカインを用いて細胞を順に刺激した：０〜７日目−１０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４を補充した；２〜１４日目−１０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦＡを補充した；２〜１４日目−５ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ−２を補充した；７〜１４日目−１０μＭのＳＢ−４３１５４２を補充した。血管特異的レポーターおよびＣＤ３１を共発現するｈＥＳＣ由来細胞の分画を、ＦＡＣＳによって１４日目に収集した。これらの細胞をＦＧＲＳカクテルで形質導入し、そして２〜３日後、Ｅ４ＯＲＦ１ ＨＵＶＥＣの層上で培養した。リプログラミングの程度を、フローサイトメトリーによって評価した。

【0083】

ヒト胚性幹細胞は、高度に増殖性のＨＳＣを形成する能力が欠如している。現在、胚性幹細胞（ＥＳ）および人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を含む多能性幹細胞の、再増殖する造血細胞への分化は、限定された成功を示している。したがって、ＦＧＲＳは、ヒトＥＳ由来のＥＣのＨＳＣへの分化を増強することができる欠損因子（missing factors）となりうる。この目的で、本発明者らは、ｈＥＳをＥＣ（ｈＥＳ−ＥＣ）３８に分化させた。次いで、本発明者らは、ＶＥＧＦＲ２陽性ｈＥＳ−ＥＣを精製し、そしてそれらをＦＧＲＳで形質導入した。特に、ＦＧＲＳ形質導入ｈＥＳ−ＥＣは、かなりの数のＣＤ４５^＋ＣＤ１４４⁻細胞を生成することができた。しかし、これらのＣＤ４５^＋ＣＤ１４４⁻細胞は、明瞭な安定な造血様コロニーの形成に失敗し、そして高増殖成長相に入らなかった。これらの結果は、ｈＥＳ−ＥＣは、ｒＥＣ−ＨＭＰＬにリプログラミングされる際にＨＵＶＥＣほど許容的ではないことを示している。

【0084】

ＥＣから生成されたｒＥＣ−ＨＭＬＰは、移植され、in vivoで機能して造血細胞と入れ替わることができる。ｒＥＣ−ＨＭＬＰがin vivo生着可能であるかどうかを決定するため、本発明者らは、亜致死照射された（２７５Ｒａｄ）免疫不全状態のＮＯＤ−ＳＣＩＤ−ＩＬ２−受容体欠損（ＮＳＧ）成体マウス（ｎ＝９；照射１日後）に、眼窩後注射を介してＣＤ４５^＋ＧＦＰ^＋ｒＥＣ−ＨＭＬＰ １．５×１０^６を移植した。ヒトＣＤ４５^＋細胞の存在に関して、移植の２、５、１２、１６および２２〜４４週後に、注射されたマウスの末梢血を検査した（図３Ｂ）。本発明者らは、２（ｎ＝７；１７．３８±７．７３％）、５（ｎ＝６；１５．１±１３．３９％）、１２（ｎ＝６；１４．１４±５．４４％）、１６（ｎ＝６；２２．３６±１７．９５％）および２２〜４４（ｎ＝６、２１．２３±２２．２７％）週に循環ヒトＣＤ４５^＋細胞を検出した。移植１６週後の末梢血、骨髄（ＢＭ）および脾臓の分析は、全３つの組織中のヒトＣＤ４５^＋細胞および末梢血中のヒトＣＤ４５⁻ＣＤ２３５^＋赤血球細胞の存在を示した。ＢＭおよび脾臓は、小さいが検出可能な数のＣＤ４１ａ＋（巨核球）細胞を有するｒＥＣ−ＨＭＬＰ（ＣＤ４５^＋ＣＤ３３^＋）の骨髄系子孫が集合していた（図３Ｃ）。

【0085】

移植されたｒＥＣ−ＨＭＬＰは、赤血球、巨核球、マクロファージ、単球および樹状細胞子孫を生成するそれらの能力を保持している。宿主から単離された移植されたｒＥＣ−ＨＭＬＰが、それらの多系列可能性を保持しているかどうか決定するため、本発明者らは、二次的ＣＦＵアッセイを実施した。本発明者らは、移植の２２（ｎ＝１）および２４（ｎ＝４）週後に、移植されたマウスの骨髄からヒトＣＤ４５^＋（ｈＣＤ４５^＋）を単離した。これらの細胞をin vitroで２４時間増殖させ、そしてＣＦＵアッセイのためにｈＣＤ４５^＋ｈＣＤ３４^＋細胞を選別した。１４日以内に、培養された細胞から、ＣＦＵ−ＧＭ、ＣＦＵ−ＧＥＭＭおよびＢＦＵ−Ｅと類似した形態を有するコロニーが生じた。細胞のサイトスピンのWright-Giemsa染色は、測定された細胞のヒト骨髄系子孫の典型的な形態を示した。メチルセルロース培養の免疫表現型解析は、ヒトＣＤ４５^＋コンパートメントが、ＣＤ４１ａ^＋、ＣＤ１４^＋、ＣＤ８３^＋およびＣＤ３３^＋細胞を含むことを示し、巨核球、マクロファージ、単球および樹状細胞子孫の存在を示唆している。ＣＤ４５⁻コンパートメントは、ＣＤ２３５^＋を含み、マウスＴｅｒ１１９^＋細胞を含んでおらず、ＣＦＵアッセイにおけるヒトＣＤ４５^＋ＣＤ３４^＋細胞の強い赤血球分化を示唆している（図３Ｅ）。

【0086】

ＮＳＧマウスの骨髄に移植されたｒＥＣ−ＨＭＬＰの分析は、ヒト多能性前駆細胞の定義を満たすＬｉｎ⁻ＣＤ４５ＲＡ⁻ＣＤ３８⁻ＣＤ９０⁻ＣＤ３４^＋細胞の小集団を示した（図３Ｅ）。これらの細胞がそれらの多系列の可能性を保持しており、そしてリプログラミングされたｒＥＣ−ＨＭＬＰの誘導体であることを検証するため、本発明者らは、ＣＦＵアッセイのためにそれらを培養し、そして単一コロニー中のウイルス組込みをチェックした。４つのリプログラミング因子の存在に関して、個々のコロニーから単離されたゲノムＤＮＡを分析した。すべての試験コロニー（ｎ＝３）は、ＦＯＳＢ、ＧＦＩ１、ＲＵＮＸ１およびＳＰＩ１を発現するレンチウイルスベクターに関して陽性であった（図３Ｆ）。単細胞レベルでのウイルス組込みの頻度を定量化するため、本発明者らは、宿主骨髄からのヒトＣＤ４５^＋細胞を分析した。全ゲノム増幅（ＷＧＡ）のため、細胞を９６−ウエルプレート（１細胞／ウェル）中に選別した。増幅されたゲノムＤＮＡを、ウイルス組込みに関して試験した。すべての細胞（ｎ＝２１）は、ウイルスベクター組込みに関して陽性であった。２つの細胞は、リプログラミングに用いられる４つのウイルスのうち３つの組込み（検出不可能なＲＵＮＸ１を有するＦＧＳおよび検出不可能なＦＯＳＢを有するＧＲＳ）を示した（図３Ｇ）。１細胞および単一コロニーウイルス組込みの結果から、宿主マウスから単離されたヒト造血細胞は、ＮＳＧマウスに移植されたｒＥＣ−ＨＭＬＰから生じることが確認された。

【0087】

移植されたｒＥＣ−ＨＭＬＰは、ゲノム完全性を保持している。ＣＤ４５^＋ｒＥＣ−ＨＭＬＰ（形質導入後３５日目）、およびＮＳＧマウスの骨髄に移植されたＣＤ４５^＋ＣＤ３４^＋ｒＥＣ−ＨＭＬＰ（移植２４週後）のゲノム完全性を評価するため、本発明者らは、Agilent SurePrint G3 Human CGH Microarray（１Ｍプローブ）を用いて比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）解析を実施した。解析は遺伝的異常を示さず、増殖性ｒＥＣ−ＨＬＭＰがin vitroおよびin vivoの両方において遺伝子的に安定のままであることを示唆している。

【0088】

移植されたｒＥＣ−ＨＭＬＰは、in vivoで悪性形質転換に至らなかった。骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）に素因を含む、移植されたｒＥＣ−ＨＭＬＰの悪性形質転換の可能性についての懸念に対処するため、本発明者らは、移植後の最大１０ヵ月間、レシピエントマウスの骨髄、脾臓および肝臓を分析した（図３Ａ）。循環ＣＤ４５^＋細胞の存在に関して、末梢血を最初に分析した。生着を示すマウスを屠殺し、そしてＭＤＳの徴候に関して、それらの脾臓、肝臓および脛骨を分析した。マウスは、白血病およびリンパ腫、例えばリンパ節症、脾腫または臓器肥大の肉眼的な証拠をなんら示さなかった。本発明者らは、ｒＥＣ−ＨＭＬＰ移植されたマウスの骨髄、脾臓および肝臓上の染色パネルを用いることによって総合的分析を実施した。本発明者らは、コラーゲンまたはデスミンの過剰沈着のなんらかの徴候を観察しなかった。また、骨髄の微視的な構造は、骨髄異形成症候群を暗示する線維性リモデリングの証拠を示さなかった。骨芽細胞、血管および血管周囲領域は、形態学的に無傷であった。本発明者らは、本発明者らのアプローチが、白血病誘発可能性を有する造血細胞の誘導に至らないと結論付けた。

【0089】

移植されたｒＥＣ−ＨＭＬＰは、リンパ系細胞を生成する。ＨＵＶＥＣ由来の移植されたｒＥＣ−ＨＭＬＰのリンパ系子孫の数（脾臓、骨髄および末梢血中）は、無視できるほど小さく、移植されたｒＥＣ−ＨＭＬＰがin vivoでＴ細胞キメラ現象に十分に関与しなかったことを示唆している。ＳＰＩ１の構成的残留発現が、ｒＥＣ−ＨＭＬＰがＴ細胞に分化することを妨げる可能性に対処するため、本発明者らは、構成的に発現されたＦＧＲ因子と誘導性ＳＰＩ１との組合せ（ＳＰＩ１−Ｔｅｔ−Ｏｎ）を用いた。ＨＵＶＥＣを、ＦＧＲ＋ＳＰＩ１−Ｔｅｔ−Ｏｎレンチウイルスで形質導入し、そしてドキシサイクリンの存在下、ＨＵＶＥＣフィーダー単層の層上で２７日間増殖させた。本発明者らは、造血様コロニーの形成およびＣＤ４５^＋細胞の数の増加を観察した。ＨＵＶＥＣフィーダーは、ドキシサイクリンに抵抗性であり、そして新生造血細胞の誘導を通してそれらの血管性ニッチ機能を維持した。次に、リプログラミングされた細胞を、Delta-like 4（ＯＰ９−ＤＬ４）を発現する骨髄間質細胞（ＯＰ９）の層上に移し、そしてＩＬ−７（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−１１（１０ｎｇ／ｍｌ）およびＩＬ−２（５ｎｇ／ｍｌ）を補充した無血清造血培地の存在下で増殖させた。ＣＤ３、ＣＤ１９およびＣＤ１４の発現に関して細胞を試験した（３週間のＯＰ９−ＤＬ４共培養；図６Ａ）。特に、本発明者らは、小分画のＣＤ３^＋細胞（０．１６±０．０１％；ｎ＝３）、より多数のＣＤ１９^＋（１．１７±０．１３％；ｎ＝３）およびＣＤ１４を発現する細胞の非常に有意な集団（１６．４６±１．０２％；ｎ＝３）を確実に検出することができ、Ｔ細胞の生成を示している。

【0090】

移植されたｒＥＣ−ＨＭＬＰは、機能性マクロファージを生成する。ｒＥＣ−ＨＭＬＰから分化したマクロファージの機能性評価を実施するため、本発明者らは、食作用アッセイを実施した。ｒＥＣ−ＨＭＬＰを、Ｅ４−ＨＵＶＥＣ支持細胞層なしで、Ｍ−ＣＳＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＳＣＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）、Ｆｌｔ−３（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＴＰＯ（１０ｎｇ／ｍｌ）および１０％ＦＢＳの存在下、２週間培養した。本発明者らは、サイズの増加および培養細胞の粒状度を観察した。培養物をＰＢＳで２回洗浄して非接着細胞を除去した。１μｌ／ｍｌの低濃度で赤色蛍光ビーズと混合した成長培地を、付着細胞に３７℃で１時間適用した。インキュベーション後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、そして生細胞をＣＤ１１ｂ抗体で染色した。細胞を固定し、そして核可視化のためＤＡＰＩで染色した。共焦点顕微鏡検査は、明らかに視認できる摂取されたビーズを有するしっかりと付着したＣＤ１１ｂ^＋ＧＦＰ^＋細胞の群を示した（図６Ｂ）。したがって、ｒＥＣ−ＨＭＬＰは、機能性マクロファージを生じることができる。

【0091】

ｈＤＭＥＣから生成されたｒＥＣ−ＨＭＬＰは、移植して、in vivoで機能して造血細胞を交換することができる。ｈＤＭＥＣから生成されたｒＥＣ−ＨＭＬＰがin vivoで生着可能かどうかを決定するため、本発明者らは、亜致死的に照射された（１００Ｒａｄ）２週齢新生児ＮＳＧマウスに、眼窩後注射を介してＣＤ４５^＋ＧＦＰ^＋ｒＥＣ−ＨＭＬＰ
１×１０^５を移植した。ヒトＣＤ４５^＋細胞の存在に関して、移植４、６および１２週後に、注射されたマウスの末梢血を試験した（図４Ｃ）。本発明者らは、４（２．０９±１．２７％、ｎ＝６）、６（４．４６±３．６６％、ｎ＝６）および１２（４．０５±３．５０％、ｎ＝６）週に循環ヒトＣＤ４５^＋細胞を検出した。移植１４週後の末梢血、骨髄および脾臓の分析は、全３つの組織中のヒトＣＤ４５^＋細胞および末梢血中のヒトＣＤ４５⁻ＣＤ２３５^＋赤血球細胞の存在を示した（図４Ｃ、Ｄ、Ｅ）。移植１４週後の脾臓の分析は、リンパ系子孫のＣＤ１９^＋（１０．１３±４．９８％；Ｂ細胞）およびＣＤ５６^＋（１．６２±０．６７％；ＮＫ細胞）細胞の小さいが明瞭な集団を示した。これらは、ＣＤ１１ｂ^＋（２７．６６±８．９２％；マクロファージ）およびＣＤ４１ａ^＋（４．９０±１．５１％；巨核球）骨髄性細胞に加えて、存在した（図４Ｄ）。

【0092】

また、移植されたｈＤＭＥＣ由来のｒＥＣ−ＨＭＬＰは、in vivoで機能性ＨＳＣ様細胞を生成する能力を保持する。移植されたｈＤＭＥＣ由来のｒＥＣ−ＨＭＬＰが、in vivoで機能性ＨＳＣ様細胞を生成したかどうかを機能的に試験するため、本発明者らは、二次移植を実施した。本発明者らは、移植１２週後に、一次移植されたマウスの大腿から全骨髄を移植した（ｎ＝１０）。一次移植の１４週後にドナーマウスの骨髄中に移植されたｒＥＣ−ＨＭＬＰの表現型解析は、それぞれヒトＨＳＰＣおよび多能性前駆細胞（ＭＰＰ）の表現型定義を満たす、ＣＤ４５^＋Ｌｉｎ⁻ＣＤ４５ＲＡ⁻ＣＤ３８⁻ＣＤ９０^＋ＣＤ３４^＋（１０．３７±２．５５％）およびＣＤ４５^＋Ｌｉｎ⁻ＣＤ４５ＲＡ⁻ＣＤ３８⁻ＣＤ９０⁻ＣＤ３４^＋（１３．８３±２．１４％）細胞の両方の有意な集団を示した（図４Ｅ）。本発明者らは、骨髄系子孫の有意な集団（ｎ＝６；４４．３２±２３．２１％）による移植の３（ｎ＝６；１４．６１±１５．７％）および５（ｎ＝６；２．０１±１．５％）週後の二次レシピエントのＰＢ（末梢血）中にｈＣＤ４５＋を検出した（図４Ｆ）。長期的な一次生着および成功した二次短期生着は、リプログラミングされたｈＤＭＥＣの集団中のＨＳＰＣ様細胞／自己再生ＭＰＰの存在を支持している。

【0093】

ｒＥＣ−ＨＭＬＰは、造血遺伝子の上方制御および血管遺伝子の下方制御を示す。次に、本発明者らは、培養されたＨＵＶＥＣの遺伝子発現プロファイルに対するｒＥＣ−ＨＭＬＰの全ゲノム転写プロファイルおよび新たに単離されたＣＤ３４^＋ＣＤ４５Ｌｉｎ⁻臍帯血造血細胞を比較して全ゲノムトランスクリプトームレベルでリプログラミングの程度を評価した（図５Ａ）。本解析は、ナイーブＨＵＶＥＣおよびＬｉｎ⁻ＣＤ３４^＋ＣＢ細胞と比較したとき、移植前のＣＤ４５細胞および移植２２週後のＣＤ４５^＋ＣＤ３４^＋ｒＥＣ−ＨＭＬＰにおける造血遺伝子の上方制御および血管遺伝子発現のサイレンシングを示した。プロトタイプの多能性遺伝子、例えばＯｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ２およびＭｙｃは、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）およびナイーブＨＵＶＥＣと比較してリプログラミングされた細胞中で上方制御されず、これは、ＨＵＶＥＣのｒＥＣ−ＨＭＰＬへのリプログラミングが多能性状態を通して移行することなく達成されたことを示している（図５Ｂ）。移植後２２週後のＨＵＶＥＣ、ＣＤ４５^＋ｒＥＣ−ＨＭＬＰ、ＣＤ４５^＋ＣＤ３４^＋ｒＥＣ−ＨＭＬＰ全トランスクリプトームおよびＣＤ４５^＋ＣＤ３４^＋ｒＥＣ−ＨＭＬＰのよりタイトなクラスタリングを伴うＣＤ３４^＋Ｌｉｎ⁻細胞およびＣＢ細胞の階層的クラスタリングは、ｒＥＣ−ＨＭＬＰのさらなるin vivo「培養（education）／リプログラミング」を示唆した。

【0094】

ChIP-Seqおよびデータ分析。ChIP-Seqは、Goldberg, A. D. et al., Cell 140:678-691
(2010)に記載されたとおり実施した。簡潔には、細胞を１％パラホルムアルデヒド中で１５分間架橋させ、洗浄し、そして溶解した。Bioruptorを用いてクロマチンを約１５０塩基対の断片に切断し、洗浄し、そして溶出した。溶出されたクロマチンを脱架橋し（reverse-cross-link）、そしてカラム精製した（ＳＰＩ１およびＧＦＩ抗体は、Santa Cruz Biotechnologyから得た；カタログ番号ｓｃ−３５２およびｓｃ−８５５８）。標準調製プロトコールに従ってIllumina TruSeq DNA Sample Preparation Kitを用いて、シークエンシングのため、ChIPサンプルを調製した（Illumina）。Illumina Hiseq 2000シーケンサーにおいて、標準Illuminaプロトコールに従ってシークエンシングサービスを実施した。ＢＷＡプログラム（Li, H. et al., Bioinformatics 25:1754-1760 (2009)）を用いて、ChIP-seq読み取りデータを参照ヒトゲノム（hg19, NCBI Build 37）に対して整列させ、そしてPicard（sourceforgeからオンラインで入手可能）によってＰＣＲ重複を除去した。ＳＰＩ１およびＧＦＩ１結合のゲノム全体の分布を生成するため、そしてピークの同定のため、２つを超えるミスマッチを含まない単一の最も適合する部位に位置づけられた独特の読み取りデータを残し、そして用いた。ＦＤＲ＜０．００５を有するＳＰＩ１およびＧＦＩ１ChIPシグナルのゲノム富化を確認するため、ソフトウェアChIPseeqer 2.0（Giannopoulou, E. G. et al., BMC Bioinformatics 12:277 (2011)）を、対照として入力ＤＮＡからのシークエンシングデータを有するChIP-Seqデータに適用した。転写開始点（ＴＳＳ）から＋／−２ｋｂ内の富化をプロモーターピークとして定義した。ＤＡＶＩＤによる遺伝子オントロジー（ＧＯ）解析（National Institute of Allergy and Infectious Diseases（ＮＩＡＩＤ）、ＮＩＨ）からオンラインで入手可能である）およびＨＯＭＥＲによるモチーフ解析（biowhat、University of California、San Diegoからオンラインで入手可能）のため、選択された遺伝子を提示した。

【0095】

ＳＰＩ１およびＧＦＩ１のＤＮＡ結合部位の同定。ＥＣのｒＥＣ−ＨＭＬＰへの転写ＦＧＲＳ介在性リプログラミングの可能な機構を明らかにするため、本発明者らは、クロマチン免疫沈降結合大規模シークエンシング（ChIP-Seq）を用いて、ＨＵＶＥＣ中のＳＰＩ１およびＧＦＩ１の全ゲノムＤＮＡ結合を比較した。本発明者らは、転写開始部位（ＴＳＳ）から＋／−２ｋｂプロモーター領域に２３５８７ＳＰＩ１−結合および１０９９９ＧＦＩ１−結合ゲノム部位を確認した。特に、ＧＦＩ１結合ＴＳＳ（１０９９９の１００７９）の９１．６％は、ＳＰＩ１結合ＴＳＳと重なっていた。しかし、ＳＰＩ１結合プロモーターの５７．３％は、ＧＦＩによって占有されなかった。ＳＰＩ１、ＧＦＩ１またはＳＰＩ１およびＧＦＩ１によって共に結合された遺伝子（共通の標的または「ＣＴ」）の転写レベルの比較は、ＧＦＩ１単独によって結合されたほとんどの遺伝子が発現レベルの低下を示したが、が、ＳＰＩ１単独、またはＧＦＩ１と組み合わせてＳＰＩ１によって結合された遺伝子は、上方制御された。結合部位の遺伝子オントロジー（ＧＯ）解析は、ＥＣからｒＥＣ−ＨＭＬＰへの細胞同一性の変更に関与することができた多くの遺伝子クラスターを明らかにした（図５Ｃ）。ＧＯは、上方制御されたＣＴ（ｌｏｇ２（ｒＥＣ−ＨＭＬＰ／ＨＵＶＥＣ）≧２）が、造血系発生および骨髄系分化において知られている機能を有する遺伝子のクラスターに属したことを示したが、多数の下方制御されたＣＴは、血管系発生に関与することが知られている（図５Ｃ）。ＳＰＩ１およびＧＦＩ１ ＴＳＳ標的によって占有されたモチーフを結合する知られているＤＮＡの探索は、下方制御されたＣＴ（（ｌｏｇ２（ＨＵＶＥＣ／ｒＥＣ−ＨＭＬＰ）≧２）が、ＧＦＩ１ｂ（７２遺伝子、ｐ＝０．００１）およびＦＯＳＢ結合モチーフ（６４遺伝子、ｐ＝０．０００１）を有する遺伝子のサブセットを含むことを示した。ＳＰＩ１によって結合された上方制御された（ｌｏｇ２（ｒＥＣ−ＨＭＬＰ／ＨＵＶＥＣ）≧２）遺伝子のＴＳＳのサブセットは、ＲＵＮＸ１（１３３遺伝子、ｐ＝０．０００１）およびＦＬＩ１（２６４遺伝子、ｐ＝０．０１）の知られているＤＮＡ結合モチーフを含んだ。さらに、ＣＴのサブセットは、知られているＥＢＦ（early B-cell factor）ＤＮＡ結合モチーフ（１３０遺伝子、ｐ＝０．０１）を含んだ。

【0096】

ＤＮＡ結合モチーフ探索および全トランスクリプトーム発現分析と組み合わせたＳＰＩ１およびＧＦＩ１の全ゲノム結合プロファイルは、ＳＰＩ１単独およびＧＦＩ１と組み合わせたＳＰＩ１は、造血遺伝子の発現を上方制御することを示唆している。特に、血管性遺伝子の発現は、ＳＰＩ１およびＧＦＩ１ならびにおそらくＦＯＳＢによって抑制された。造血遺伝子の上方制御は、ＲＵＮＸ１およびＦＬＩ１の発現と協同するＳＰＩ１の発現に左右される。注目すべきことに、ＦＬＩ１は、移植２２週後のナイーブＨＵＶＥＣ、ＣＤ４５^＋ｒＥＣ−ＨＭＬＰ、ＣＤ４５^＋ＣＤ３４^＋ｒＥＣ−ＨＭＬＰ、およびＬｉｎ⁻ＣＤ３４^＋ＣＢ細胞中でも同様に発現される；標準化された発現は、それぞれ７．４、７．９、７．２、および７．６である。

【0097】

ＦＧＲＳ誘導リプログラミングがＦＧＲＳ ＴＦの内因性発現を誘発するかどうかを決定するため、本発明者らは、RNA-Seqによる５’および３’非翻訳領域（ＵＴＲ）の発現を明らかにした。リプログラミングに用いられたレンチウイルス構築物は、ＵＴＲなしにＦＧＲＳ因子のオープンリーディングフレームを発現するため、本発明者らは、内因的に発現された転写物を、それらのＵＴＲ配列の存在によって確認することができた。全トランスクリプトームRNA-Seqを用いた移植されたヒトｒＥＣ−ＨＭＬＰの５’および３’ＦＧＲＳ因子の解析は、全４つのＦＧＲＳ因子の内因性発現の活性化を示した。ＦＧＲＳ ＴＦの内因性発現は、分画（％）＝ＵＴＲ／（ＵＴＲ＋ＯＲＦ）としてＵＴＲに由来するＲＮＡ−Ｓｅｑ読み取りデータの分画として算出され、ここで、ＵＴＲは、５’および３’ＵＴＲに整列させたRNA-seqの読み取りデータの数である。ＯＲＦは、興味の遺伝子のオープンリーディングフレームに整列させたRNA-seq読み取りデータの数である。この解析は、ＦＧＲＳ因子の内因性発現がin vitro（ＣＤ４５^＋ｒＥＣ−ＨＭＬＰ）およびin vivo微小環境介在性培養期間後（ＣＤ４５^＋ＣＤ３４^＋in vivo）の両方でリプログラミングされた細胞を活性化することを示唆している。

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図1D】

【図1E】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図2D】

【図2E】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図3D】

【図3E】

【図3F】

【図3G】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図4D】

【図4E】

【図4F】

【図5A】

【図5B】

【図5C】

【図6A】

【図6B】